癌罹病の検定に使用するデータの収集方法
【課題】リンパ球に結合したヘマトポルフィリン誘導体量を測定する技術を含む信頼性のより高い癌罹病検定用データの収集方法を提供する。
【解決手段】癌罹病の検定に使用するデータを収集する方法であって、被検者から採取したリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を定量することにより第一のデータを得る工程と、被検者から採取した前記リンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞)とＣＤ８抗原をもつＴ細胞(ＣＤ８＋Ｔ細胞)を定量し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞）を算出することにより第二のデータを得る工程とを含み、第一のデータであるポルフィリン系化合物量と、第二のデータであるＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞の値の少なくとも一方が、各々に設定された所定値以上である場合に、被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断する検定を特徴とするデータの収集方法。
【解決手段】癌罹病の検定に使用するデータを収集する方法であって、被検者から採取したリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を定量することにより第一のデータを得る工程と、被検者から採取した前記リンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞)とＣＤ８抗原をもつＴ細胞(ＣＤ８＋Ｔ細胞)を定量し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞）を算出することにより第二のデータを得る工程とを含み、第一のデータであるポルフィリン系化合物量と、第二のデータであるＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞の値の少なくとも一方が、各々に設定された所定値以上である場合に、被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断する検定を特徴とするデータの収集方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌罹病の簡便な体外診断に使用可能な癌罹病検定用データの収集方法に関するものであり、詳しくは、被検者から採取したリンパ球から得られる２種類のデータの組合せにより、被検者が癌を罹患している可能性を判断する検定に使用する信頼性の高いデータの収集方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌の診断・治療方法として、光感受性物質であるヘマトポルフィリン誘導体（hematoporphyrin derivative : HPD）の腫瘍に対する親和性及び蓄積性を応用した技術の研究・開発が進められてきた。具体的には、ＨＰＤを体内に投与し、長時間かけて腫瘍に蓄積させた後、光照射により励起三重項状態を経て誘起される活性酸素による酸化反応によって癌細胞を破壊する研究や（例えば、非特許文献１を参照）、ＨＰＤ染色した癌細胞が蛍光を発することから、癌組織の有無を判定する体内診断に応用することが行われている（例えば、非特許文献２を参照）。しかしながら、これらはいずれも生体内測定であり、腫瘍に蓄積するまでに３日程度かかり、多くの手間がかかる上、患者の苦痛を伴うものであった。また、活性酸素による癌細胞の破壊においては、活性酸素の過剰な生成により皮膚や目に対して様々な副作用を引き起こすという問題点も指摘されていた（例えば、非特許文献３、４を参照）。
【０００３】
一方、非侵襲の癌の体外診断技術として、例えば特許文献１には、ＨＰＤが生体外に取り出した癌細胞やリンパ球によっても摂取されることに着目し、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）装置を用いて癌診断への応用を図った技術が開示されている。しかし、かかる技術は、細胞分離法が確立されておらず、またＨＰＤ染色などの前処理が煩雑であったこと、また細胞の管理、保存技術が確立されていなかったこと、更にＥＳＲ装置を用いた観測では、ＨＰＤの選択的な測定をしていたものではなく、光励起によりＨＰＤが生成する各種活性酸素により生成したリンパ球表面酸化物量を見ていたにすぎない。故に診断判定のためのＥＳＲスペクトルの解釈が難しい、などの理由により実用化に至っていない。
【０００４】
かかる背景技術に鑑み、簡便且つ実用的な非侵襲の癌の体外診断技術として、特許文献２には、ＨＰＤが癌患者由来のリンパ球に選択的に結合する性質を利用し、リンパ球に結合したＨＰＤ量を直接的に測定する技術を含む癌罹病検定用データの収集方法が開示されている。癌の早期発見のために、かかるデータ収集技術を利用したより信頼性の高い癌の診断システムの確立が所望されている。
【特許文献１】特開昭６０−１３５７６５号公報
【特許文献２】特開２００７−１７８２３７号公報
【非特許文献１】Poto, L. & Berki.T. Investigation on the free radical producing effect of hematoporphyrin: a spin trapping study. Acta Physiol. Hung. 74, 285- (1989).
【非特許文献２】Dougherty, T.J.等、Photodynamic Therapy. J. Natl. Cancer Inst., 90, 889-905 (1998).
【非特許文献３】He, D., Soter, N.A., & Lim.H.W. The late phase of hematoporphyrin derivative-induced phototoxicity in mice: Release of hisitamine and histogic changes. Photochem. Photobiol., 50, 91- (1989).
【非特許文献４】Hawkins, C.W. Bickkers, D.R.Mukhter, H. & Elemets, C.A. Cutaneour Photosensitization: murine ear swelling as a marker of acute response. J. Invest. Dermatol. 86, 638- (1986).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、かかる背景技術に鑑み、癌罹病の簡便な体外診断に使用し得る、信頼性の高い癌罹病検定用データの収集方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、リンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞とＣＤ８抗原をもつＴ細胞に着目し、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、リンパ球に結合したＨＰＤを定量することにより得られるデータと組合せて使用することにより、信頼性の高い癌罹病の体外診断を可能とする新たなデータの収集技術を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、被検者が癌を罹患している可能性を判断する検定に使用されるデータとして、被検者から採取したリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を定量することにより得られる第一のデータと、同じリンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞)とＣＤ８抗原をもつＴ細胞(ＣＤ８＋Ｔ細胞)を定量し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞）を算出することにより得られる第二のデータとを組合せて判断することにより、より信頼性の高い判断が可能となることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明により、
癌罹病の検定に使用するデータを収集する方法であって、
被検者から採取したリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を定量することにより第一のデータを得る工程と、被検者から採取した前記リンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞)とＣＤ８抗原をもつＴ細胞(ＣＤ８＋Ｔ細胞)を定量し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞）を算出することにより第二のデータを得る工程とを含み、
第一のデータであるポルフィリン系化合物量と、第二のデータであるＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞の値の少なくとも一方が、各々に設定された所定値以上である場合に、被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断する検定において使用されることを特徴とする、癌罹病の検定に使用するデータの収集方法が提供される。
【０００９】
本発明の一態様において、第一のデータ取得工程におけるポルフィリン系化合物の前記定量は、
（ａ） 被検者から採取したリンパ球にポルフィリン系化合物を加える工程と、
（ｂ） 工程（ａ）で得られた混合物に特定波長の光を照射してリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を励起し、化学反応を起こすことにより発光を生じさせる工程と、
（ｃ） 工程（ｂ）で発生した発光量を測定する工程と、
を含む手段により行われる。
【００１０】
また、本発明の他の態様において、第二のデータ取得工程におけるＣＤ４抗原をもつＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）とＣＤ８抗原をもつＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）の定量は、フローサイトメトリー又は免疫蛍光法により測定される。
また、本発明の他の態様において、前記ポルフィリン系化合物は、ヘマトポルフィリン及び／又はその誘導体である。
また、本発明の他の態様において、前記工程（ｂ）においてポルフィリン系化合物が結合するリンパ球はＢ細胞リンパ球である。
【００１１】
また、本発明の他の態様において、前記工程（ｂ）において生じる発光は、一重項酸素由来のものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、患者の身体的・経済的な負担を増大させることなく、癌罹病の簡便な体外診断に使用可能な、信頼性の高いデータの収集方法が提供された。これにより癌の早期発見が更に促進され、また術後の経過診断及び癌再発防止のための治療にも有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る癌罹病検定用データの収集方法は、上述したように、被検者から採取したリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を定量することにより第一のデータを得る工程と、被検者から採取した前記リンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞(以下、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」ともいう。）とＣＤ８抗原をもつＴ細胞（以下、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」ともいう。)を定量し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞）を算出することにより第二のデータを得る工程とを含み、第一のデータと第二のデータとの組合せにおいて、癌罹病の検定に使用されることを特徴とする。すなわち、第一のデータであるポルフィリン系化合物量と、第二のデータであるＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞の値の少なくとも一方が、各々に設定された所定値以上である場合に、被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断する検定において使用される。
【００１４】
第一のデータ取得工程におけるポルフィリン系化合物の定量は、ポルフィリン系化合物が健常人由来のリンパ球よりも、罹癌者由来のリンパ球により選択的に取り込まれるという特異的な性質を利用したものであり、本発明においては罹癌者由来のリンパ球とかかる特異的結合を示すすべてのポルフィリン系化合物が用いられ得る。具体的には、ポルフィリン系化合物にはヘマトポルフィリン、及び、その重合体やアセチル化体などの誘導体が含まれる。
【００１５】
ポルフィリン系化合物の定量は、一態様において、被検者から採取したリンパ球にポルフィリン系化合物を加える工程と、前記工程で得られた混合物に特定波長の光を照射してポルフィリン系化合物を励起させ、化学反応を起こすことで発光を生じさせる工程と、前記工程で発生した発光量を測定する工程とを含む手段により行われ得る。すなわち、ポルフィリン系化合物に特定波長の光を照射することにより発生するポルフィリン系化合物由来の一重項酸素を化学発光計測器で測定することにより、リンパ球に結合したポルフィリン系化合物を直接的に定量するものである。ヘマトポルフィリン系化合物は、その殆どがＢ細胞リンパ球に取り込まれることがわかっている。したがって、本発明のデータの収集方法は、ヘマトポルフィリン系化合物が結合するリンパ球Ｂ細胞と、ＣＤ４抗原及びＣＤ８抗原を含むリンパ球Ｔ細胞における相互のデータを利用することにより、癌罹病の簡便な体外診断の精度を上げたものということができる。
【００１６】
次に、第二のデータ取得工程について説明する。
第二のデータ収集工程では、被検者から採取したリンパ球に含まれるＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞が定量され、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞（以下において、「ＣＤ４／ＣＤ８」と表記する。））が算出される。リンパ球の中でもＴ細胞は細胞性免疫に関与し、ウイルス感染細胞を殺したり、他の白血球の活性を調整したりする働きをもっている。Ｔ細胞を特異的に結合するＣＤ４及びＣＤ８を用いた研究により、罹癌者と健常人とではＣＤ４とＣＤ８に結合される細胞の割合が異なるという報告があるが、本発明者等による鋭意研究の結果、上述したポルフィリン系化合物量に関わる第一のデータと組み合わせて癌罹病の検定用データとして用いることにより、信頼性がより高まることが見出された。
【００１７】
そして、第一のデータ取得工程において得られるポルフィリン系化合物量と、第二のデータ取得工程において得られるＣＤ４／ＣＤ８の値は、以下のように利用される。すなわち、被検者における少なくとも一方の値が、第一及び第二のデータ各々に設定された所定値以上である場合に、被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断される。第一のデータであるポルフィリン系化合物量および第二のデータであるＣＤ４／ＣＤ８値に設定される各所定値は、一義的に決定されるものではなく、例えば母集団となる検体の測定データの数などに応じて適宜決定される。
【００１８】
一態様において、母集団として十分な数（例えば数千程度）の検体の測定データがある場合には、ポルフィリン系化合物量及びＣＤ４／ＣＤ８値に関する健常人のデータの平均値（ｍ）と偏差値（ＳＤ）を用いて所定値を設定することができる。その一例として、健常人のデータの平均値（ｍ）＋３ＳＤなどが挙げられる。
【００１９】
また、他の態様において、所定の母集団におけるポルフィリン系化合物量およびＣＤ４／ＣＤ８値の各々の中央値を所定値として用いることもできる。ここで、中央値とは、測定母数における、ポルフィリン系化合物量、及びＣＤ４／ＣＤ８値の各々が中間の順番に当る人のポルフィリン系化合物量、ＣＤ４／ＣＤ８値をいい、例えば、母数が７人の場合は４番目のポルフィリン系化合物量又はＣＤ４／ＣＤ８値を有する人のポルフィリン系化合物量又はＣＤ４／ＣＤ８値をいう。
【００２０】
また、所定の母集団としては、健常人から構成される母集団のみならず、罹癌者を含む母集団であってもよく、後掲の実施例では、術前の癌患者１９人から構成される母集団が用いられている。
【００２１】
本発明において第一のデータを収集するために使用し得る装置は、特定波長の光照射手段と、低雑音で高感度に発光スペクトルを観測できる微弱発光測定手段とを具備することが必要である。図１は、本発明の癌罹病検定用装置の一態様を示すものであり、試料セル１と、試料セルを収容する試料室２と、試料セル１に収容されるべき試料に光を照射するための光照射手段１０と、試料から発生する発光強度を測定する発光測定手段１１と、前記発光測定手段１１との間に設けられた光学フィルター１２と、前記試料室の下方に設けられた加熱手段１３とを具備し、更に前記試料室２は、該試料室内の雰囲気をガス雰囲気に置換するためのガス入口３及びガス出口４を備えている。
【００２２】
前記光学フィルター１２は、分光機構の一例であり、ＨＰＤに特異的な発光を測定するために６００ｎｍ以上の光を通す光学フィルターが用いられる。また、分光機構の他の例としては、６００ｎｍ以上の光を通す分光器又は受光素子が挙げられ、分光器としては例えばグレーティングなどが好適に用いられる。
【００２３】
また、前記試料セル１及び／又は試料室２は、照射される光により励起される物質を含まない材料、すなわち、高純度物質から形成されていることが好ましく、例えば、ＳｉＯ２、高純度ガラス、高純度石英ガラス、ステンレス、Ｓｉ、ＳｉＣなどが具体例として挙げられる。
【００２４】
また、光照射手段１０としてレーザー光源が使用され得、レーザー光の波長は、ＨＰＤ由来の発光を誘発すべく、３００ｎｍ〜４５０ｎｍであることが好ましく、３３０ｎｍ〜４２０ｎｍがより好ましい。更に、レーザー光の照射出力が高すぎると大量の活性酸素が生成し、細胞死を招いて自己発光を誘起するおそれがある。このため、照射出力の調整が必要であり、その上限は平均出力１０ｍＷ以下とすることが好ましい。なお、レーザーは直線光であるため、拡散レンズ（非球面）を通すことにより、光を拡散させ照射面積を大きくすることもできる。また、パルスレーザーでも前記条件を満たすものであれば本発明において好適に使用することができる。パルスレーザーの場合、送信と受信との同期をとる周期増幅方式を受光源にも適用でき、ノイズ軽減に役立てることができる。
【００２５】
本発明の癌罹病検定用装置における、特に光照射手段と、分光機構と、発光強度測定手段とにより構成される態様について、図１とは異なる他の態様を、模式的に示した図を参照しながら以下に説明する。
【００２６】
図２は、特定波長の光を通す光学フィルターを用いた装置の一態様であり、光学フィルター１１２により、光照射手段１００から照射された光が反射される一方、６００ｎｍ以上の光を通すことにより、ヘマトポルフェリン及び／又はその誘導体由来の励起発光の発光量が発光強度測定手段１１１により測定される。
【００２７】
図３は、特定波長の光を通す分光器としてグレーティングを用いた装置の一態様であり、光照射手段２００から照射された光を受けて試料から発生した励起発光から、グレーティング２１２により６００ｎｍ以上の光が取り出されることにより、ヘマトポルフェリン及び／又はその誘導体由来の励起発光の発光量が発光強度測定手段２１１により測定される。
【００２８】
また、図４に示すような構成（多検体測定装置）とすることにより、複数の試料を連続的に測定することができる。すなわち、試料室（図示せず）内に設けられた移動手段３５０（例えば、ターンテーブル）の上に、複数の試料セル３０１を載荷する。ターンテーブルの場合、試料セル３０１は図４に示すように円状に配置する。このような構成を採用した場合、移動手段３５０を移動（回転）させることにより試料３０２を発光強度測定手段３１１の下へ移動し、光照射手段３００が光を試料３０２に照射しながら、６００ｎｍ以上の光を通す分光機構３１２を介した試料からの励起発光を測定することにより、ヘマトポルフィリン及び／又はその誘導体由来の励起発光の発光量が測定される。このような操作を繰り返すことにより、複数の試料を連続的に測定することができる。ここで、移動手段３５０及び試料セル３０１は照射光が当たっても光りにくい素材のものが用いられる。また、このような移動手段３５０を用いることなく試料室内に置かれた複数の試料について一度に測定することも、照射が均一になるよう複数の光照射手段を用いる、ＣＣＤカメラのような受光素子を利用した発光強度測定、など工夫次第で可能である。
【００２９】
本発明において第二のデータを収集するために使用し得る手段・装置としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の定量が可能な公知の手段・装置を用いることができる。一態様として、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を利用することができる。フローサイトメトリーにより、蛍光色素を抗体分子に標識することで、目的とする細胞を測定することが可能であり、染色を行うことでリンパ球の中でもＴ細胞を特異的に測定することができる。他の態様として、フローサイトメトリー以外に免疫蛍光法により測定することもできる。
【実施例】
【００３０】
（１）検体
本実施例で用いた検体は、乳がん手術前後の検体を含む以下の通りである。
【表１】
【００３１】
（２）血液分離
被検者から採取した血液１４ｍｌに対するリンパ球の分離は、LYMPHOPREP Tube（第一化学薬品株式会社製）を用いて以下の手順に従い行った。
【００３２】
１．血液をチューブに入れ、血液と等量のＰＢＳを加え転倒混和する。
【００３３】
２．１１００ｇで１０分間遠心する。
【００３４】
３．新しいチューブに単核球層を回収し、１０ｍｌとなるようにＰＢＳを加え懸濁する。
【００３５】
４．２５０ｇで１０分間遠心する。
【００３６】
５．上清を捨て、沈殿物にＰＢＳを１０ｍｌ加え、懸濁する。
【００３７】
６．２５０ｇで１０分間遠心する。
【００３８】
７．上清を捨て、沈殿物にＰＢＳを１ｍｌ加える。
【００３９】
８．チュルク氏液４５μｌと、細胞懸濁液５μｌとあわせる。
【００４０】
９．リンパ球を数え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにハンクス液で調整する。
【表２】
【００４１】
（３）ＨＰＤ染色
ＨＰＤ染色は、以下の手順に従い行った。
【００４２】
１．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌのリンパ球液３ｍｌに対し、５ｍｇ／ｍｌのＨＰＤを１５０μｌ添加する。
【００４３】
２．３７℃で１０分間温める。
【００４４】
３．４２０ｇで１０分間遠心する。
【００４５】
４．上清を捨て、ＰＢＳを５ｍｌ加え懸濁する。
【００４６】
５．４２０ｇで１０分間遠心する。
【００４７】
６．沈殿物にＰＢＳ１ｍｌを加える。
【００４８】
７．チュルク氏液４５μｌと、細胞懸濁液５μｌとあわせる。
【００４９】
８．リンパ球を数え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにハンクス液で調整する。
【００５０】
（４）化学発光量の測定
化学発光検出（Chemiluminescence detection: CL-detection）は、室温において、励起発光計測装置としてＣＬＡ−ＦＳ３(東北電子産業株式会社製）を用い、以下の条件及び手順に従い行った。
【００５１】
励起発光計測装置：ＣＬアナライザー ＣＬＡ−ＦＳ３(東北電子産業株式会社製）
レーザー：４０５ｎｍＬＤ、２．６ｍＷ
フィルター：Ｎｅｕｔｒａｌ−Ｄｅｎｓｉｔｙ（ＮＤ）フィルター１０−３＋５００high pass (ＨＰ)フィルター＋６００ＨＰフィルター、又はＮＤフィルター１０−３＋５００ＨＰフィルター＋６２０ＨＰフィルター、gain：１００
１．ＨＰＤ染色したリンパ球液又はＨＰＤ染色しないリンパ球液６０μｌ（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を石英丸溝試料管に入れる。
【００５２】
２．レーザーを照射しながら発光を測定する。
【００５３】
３．ＨＰＤ染色したリンパ球の発光強度からＨＰＤ染色しないリンパ球の発光強度を引いた値を発光量とする。それぞれの測定は２回行い、平均値を使用する。
【００５４】
（５）ＣＤ４−ＦＩＴＣ／ＣＤ８−ＰＥ標識抗体を用いたＴ細胞の染色
標識抗体としてDual Color Kit「イムノテック」ＣＤ４／ＣＤ８（ベックマン・コールター株式会社製）を用い、以下の手順に従いＴ細胞を染色しＦＣＭ測定試料を作成した。
【００５５】
なお、ＣＤ４−ＦＩＴＣはインデューサー／ヘルパーＴ細胞で発現するＣＤ４抗原を認識し、ＣＤ８−ＰＥはサプレッサー／細胞障害性Ｔ細胞で発現するＣＤ８抗原を認識する。
【００５６】
１．１０５〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したリンパ球液１００μｌに対し、ＣＤ４−ＦＩＴＣ／ＣＤ８−ＰＥ標識抗体を２０μｌ添加する。
【００５７】
２．氷上で３０分間置く。
【００５８】
３．ＰＢＳ（０．１Ｍ ＰＢ、０．９％ＮａＣｌ）を２ｍｌ添加し、懸濁する。
【００５９】
４．２０１ｇで１５分間遠心する。
【００６０】
５．上清を捨て、ＰＢＳを２ｍｌ添加する。
【００６１】
６．２０１ｇで１５分間遠心する。
【００６２】
７．上清を捨て、ＰＢＳを０．５ｍｌ添加し、ＦＣＭ測定試料とする。
【００６３】
（６）ＦＣＭによる測定
ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の定量は、以下の装置及び手順に従い行った。
【００６４】
フローサイトメーター：Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（ベックマン・コールター株式会社製）
レーザー：Ａｒ ４８８ｎｍ
検出器：ＦＬ１（ＦＩＴＣ、５２５ｎｍ）、ＦＬ２（ＰＥ、５７５ｎｍ）
１．ＣＤ４−ＦＩＴＣ／ＣＤ８−ＰＥ標識抗体で染色したリンパ球５００μｌを試料管に入れ、測定を行う。
【００６５】
２．ＦＬ１で検出されたＣＤ４＋Ｔ細胞の値をＦＬ２で検出されたＣＤ８＋Ｔ細胞の値で割ることにより、ＣＤ４／ＣＤ８を計算する。測定は２回行い、平均値をデータとして用いる。（但し、細胞が少なかった試料については１回のみの測定データを使用している。）
（７）結果
（７−１）ＣＤ４／ＣＤ８とＣＬ強度の測定値
ＣＤ４／ＣＤ８とＣＬ強度の測定値を表３−１〜３−３に示す。
【表３−１】
【００６６】
【表３−２】
【００６７】
【表３−３】
（７−２）ＣＤ４／ＣＤ８値とＣＬ強度の相関関係
ＣＤ４／ＣＤ８値とＣＬ強度の相関関係をグラフにしたものを図５に示す。グラフ中の囲み線は、術前罹癌者１９人中のＣＬ強度、及びＣＤ４／ＣＤ８値の中央値を示す。ＣＬ強度、ＣＤ４／ＣＤ８値の中央値は、ＣＬ強度：２９３０８６(検体Ｎｏ．１０)、ＣＤ４／ＣＤ８値：２．８(検体Ｎｏ．１２)であった。図５から、術前の罹癌者におけるＣＬ強度及びＣＤ４／ＣＤ８値の各中央値をしきい値とすることにより、被検者が癌を罹患しているか否かの診断が高い確率で可能であることがわかる。
【表４】
【００６８】
表４に示す相関グラフの結果から、術前の罹癌者では中央値領域外に８９．５％、領域内に１０．５％の確率で存在することから、９割程度の確率で癌を発見することが可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明において第一のデータ取得に好適な装置の一態様を模式的に示す図。
【図２】本発明において第一のデータ取得に好適な装置の他の態様を模式的に示す図。
【図３】本発明において第一のデータ取得に好適な装置の他の態様を模式的に示す図。
【図４】本発明において第一のデータ取得に好適な装置の他の態様を模式的に示す図。
【図５】ＣＤ４／ＣＤ８値とＣＬ強度の相関関係を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌罹病の簡便な体外診断に使用可能な癌罹病検定用データの収集方法に関するものであり、詳しくは、被検者から採取したリンパ球から得られる２種類のデータの組合せにより、被検者が癌を罹患している可能性を判断する検定に使用する信頼性の高いデータの収集方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌の診断・治療方法として、光感受性物質であるヘマトポルフィリン誘導体（hematoporphyrin derivative : HPD）の腫瘍に対する親和性及び蓄積性を応用した技術の研究・開発が進められてきた。具体的には、ＨＰＤを体内に投与し、長時間かけて腫瘍に蓄積させた後、光照射により励起三重項状態を経て誘起される活性酸素による酸化反応によって癌細胞を破壊する研究や（例えば、非特許文献１を参照）、ＨＰＤ染色した癌細胞が蛍光を発することから、癌組織の有無を判定する体内診断に応用することが行われている（例えば、非特許文献２を参照）。しかしながら、これらはいずれも生体内測定であり、腫瘍に蓄積するまでに３日程度かかり、多くの手間がかかる上、患者の苦痛を伴うものであった。また、活性酸素による癌細胞の破壊においては、活性酸素の過剰な生成により皮膚や目に対して様々な副作用を引き起こすという問題点も指摘されていた（例えば、非特許文献３、４を参照）。
【０００３】
一方、非侵襲の癌の体外診断技術として、例えば特許文献１には、ＨＰＤが生体外に取り出した癌細胞やリンパ球によっても摂取されることに着目し、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）装置を用いて癌診断への応用を図った技術が開示されている。しかし、かかる技術は、細胞分離法が確立されておらず、またＨＰＤ染色などの前処理が煩雑であったこと、また細胞の管理、保存技術が確立されていなかったこと、更にＥＳＲ装置を用いた観測では、ＨＰＤの選択的な測定をしていたものではなく、光励起によりＨＰＤが生成する各種活性酸素により生成したリンパ球表面酸化物量を見ていたにすぎない。故に診断判定のためのＥＳＲスペクトルの解釈が難しい、などの理由により実用化に至っていない。
【０００４】
かかる背景技術に鑑み、簡便且つ実用的な非侵襲の癌の体外診断技術として、特許文献２には、ＨＰＤが癌患者由来のリンパ球に選択的に結合する性質を利用し、リンパ球に結合したＨＰＤ量を直接的に測定する技術を含む癌罹病検定用データの収集方法が開示されている。癌の早期発見のために、かかるデータ収集技術を利用したより信頼性の高い癌の診断システムの確立が所望されている。
【特許文献１】特開昭６０−１３５７６５号公報
【特許文献２】特開２００７−１７８２３７号公報
【非特許文献１】Poto, L. & Berki.T. Investigation on the free radical producing effect of hematoporphyrin: a spin trapping study. Acta Physiol. Hung. 74, 285- (1989).
【非特許文献２】Dougherty, T.J.等、Photodynamic Therapy. J. Natl. Cancer Inst., 90, 889-905 (1998).
【非特許文献３】He, D., Soter, N.A., & Lim.H.W. The late phase of hematoporphyrin derivative-induced phototoxicity in mice: Release of hisitamine and histogic changes. Photochem. Photobiol., 50, 91- (1989).
【非特許文献４】Hawkins, C.W. Bickkers, D.R.Mukhter, H. & Elemets, C.A. Cutaneour Photosensitization: murine ear swelling as a marker of acute response. J. Invest. Dermatol. 86, 638- (1986).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、かかる背景技術に鑑み、癌罹病の簡便な体外診断に使用し得る、信頼性の高い癌罹病検定用データの収集方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、リンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞とＣＤ８抗原をもつＴ細胞に着目し、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、リンパ球に結合したＨＰＤを定量することにより得られるデータと組合せて使用することにより、信頼性の高い癌罹病の体外診断を可能とする新たなデータの収集技術を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、被検者が癌を罹患している可能性を判断する検定に使用されるデータとして、被検者から採取したリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を定量することにより得られる第一のデータと、同じリンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞)とＣＤ８抗原をもつＴ細胞(ＣＤ８＋Ｔ細胞)を定量し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞）を算出することにより得られる第二のデータとを組合せて判断することにより、より信頼性の高い判断が可能となることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明により、
癌罹病の検定に使用するデータを収集する方法であって、
被検者から採取したリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を定量することにより第一のデータを得る工程と、被検者から採取した前記リンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞)とＣＤ８抗原をもつＴ細胞(ＣＤ８＋Ｔ細胞)を定量し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞）を算出することにより第二のデータを得る工程とを含み、
第一のデータであるポルフィリン系化合物量と、第二のデータであるＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞の値の少なくとも一方が、各々に設定された所定値以上である場合に、被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断する検定において使用されることを特徴とする、癌罹病の検定に使用するデータの収集方法が提供される。
【０００９】
本発明の一態様において、第一のデータ取得工程におけるポルフィリン系化合物の前記定量は、
（ａ） 被検者から採取したリンパ球にポルフィリン系化合物を加える工程と、
（ｂ） 工程（ａ）で得られた混合物に特定波長の光を照射してリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を励起し、化学反応を起こすことにより発光を生じさせる工程と、
（ｃ） 工程（ｂ）で発生した発光量を測定する工程と、
を含む手段により行われる。
【００１０】
また、本発明の他の態様において、第二のデータ取得工程におけるＣＤ４抗原をもつＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）とＣＤ８抗原をもつＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）の定量は、フローサイトメトリー又は免疫蛍光法により測定される。
また、本発明の他の態様において、前記ポルフィリン系化合物は、ヘマトポルフィリン及び／又はその誘導体である。
また、本発明の他の態様において、前記工程（ｂ）においてポルフィリン系化合物が結合するリンパ球はＢ細胞リンパ球である。
【００１１】
また、本発明の他の態様において、前記工程（ｂ）において生じる発光は、一重項酸素由来のものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、患者の身体的・経済的な負担を増大させることなく、癌罹病の簡便な体外診断に使用可能な、信頼性の高いデータの収集方法が提供された。これにより癌の早期発見が更に促進され、また術後の経過診断及び癌再発防止のための治療にも有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る癌罹病検定用データの収集方法は、上述したように、被検者から採取したリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を定量することにより第一のデータを得る工程と、被検者から採取した前記リンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞(以下、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」ともいう。）とＣＤ８抗原をもつＴ細胞（以下、「ＣＤ８＋Ｔ細胞」ともいう。)を定量し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞）を算出することにより第二のデータを得る工程とを含み、第一のデータと第二のデータとの組合せにおいて、癌罹病の検定に使用されることを特徴とする。すなわち、第一のデータであるポルフィリン系化合物量と、第二のデータであるＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞の値の少なくとも一方が、各々に設定された所定値以上である場合に、被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断する検定において使用される。
【００１４】
第一のデータ取得工程におけるポルフィリン系化合物の定量は、ポルフィリン系化合物が健常人由来のリンパ球よりも、罹癌者由来のリンパ球により選択的に取り込まれるという特異的な性質を利用したものであり、本発明においては罹癌者由来のリンパ球とかかる特異的結合を示すすべてのポルフィリン系化合物が用いられ得る。具体的には、ポルフィリン系化合物にはヘマトポルフィリン、及び、その重合体やアセチル化体などの誘導体が含まれる。
【００１５】
ポルフィリン系化合物の定量は、一態様において、被検者から採取したリンパ球にポルフィリン系化合物を加える工程と、前記工程で得られた混合物に特定波長の光を照射してポルフィリン系化合物を励起させ、化学反応を起こすことで発光を生じさせる工程と、前記工程で発生した発光量を測定する工程とを含む手段により行われ得る。すなわち、ポルフィリン系化合物に特定波長の光を照射することにより発生するポルフィリン系化合物由来の一重項酸素を化学発光計測器で測定することにより、リンパ球に結合したポルフィリン系化合物を直接的に定量するものである。ヘマトポルフィリン系化合物は、その殆どがＢ細胞リンパ球に取り込まれることがわかっている。したがって、本発明のデータの収集方法は、ヘマトポルフィリン系化合物が結合するリンパ球Ｂ細胞と、ＣＤ４抗原及びＣＤ８抗原を含むリンパ球Ｔ細胞における相互のデータを利用することにより、癌罹病の簡便な体外診断の精度を上げたものということができる。
【００１６】
次に、第二のデータ取得工程について説明する。
第二のデータ収集工程では、被検者から採取したリンパ球に含まれるＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞が定量され、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞（以下において、「ＣＤ４／ＣＤ８」と表記する。））が算出される。リンパ球の中でもＴ細胞は細胞性免疫に関与し、ウイルス感染細胞を殺したり、他の白血球の活性を調整したりする働きをもっている。Ｔ細胞を特異的に結合するＣＤ４及びＣＤ８を用いた研究により、罹癌者と健常人とではＣＤ４とＣＤ８に結合される細胞の割合が異なるという報告があるが、本発明者等による鋭意研究の結果、上述したポルフィリン系化合物量に関わる第一のデータと組み合わせて癌罹病の検定用データとして用いることにより、信頼性がより高まることが見出された。
【００１７】
そして、第一のデータ取得工程において得られるポルフィリン系化合物量と、第二のデータ取得工程において得られるＣＤ４／ＣＤ８の値は、以下のように利用される。すなわち、被検者における少なくとも一方の値が、第一及び第二のデータ各々に設定された所定値以上である場合に、被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断される。第一のデータであるポルフィリン系化合物量および第二のデータであるＣＤ４／ＣＤ８値に設定される各所定値は、一義的に決定されるものではなく、例えば母集団となる検体の測定データの数などに応じて適宜決定される。
【００１８】
一態様において、母集団として十分な数（例えば数千程度）の検体の測定データがある場合には、ポルフィリン系化合物量及びＣＤ４／ＣＤ８値に関する健常人のデータの平均値（ｍ）と偏差値（ＳＤ）を用いて所定値を設定することができる。その一例として、健常人のデータの平均値（ｍ）＋３ＳＤなどが挙げられる。
【００１９】
また、他の態様において、所定の母集団におけるポルフィリン系化合物量およびＣＤ４／ＣＤ８値の各々の中央値を所定値として用いることもできる。ここで、中央値とは、測定母数における、ポルフィリン系化合物量、及びＣＤ４／ＣＤ８値の各々が中間の順番に当る人のポルフィリン系化合物量、ＣＤ４／ＣＤ８値をいい、例えば、母数が７人の場合は４番目のポルフィリン系化合物量又はＣＤ４／ＣＤ８値を有する人のポルフィリン系化合物量又はＣＤ４／ＣＤ８値をいう。
【００２０】
また、所定の母集団としては、健常人から構成される母集団のみならず、罹癌者を含む母集団であってもよく、後掲の実施例では、術前の癌患者１９人から構成される母集団が用いられている。
【００２１】
本発明において第一のデータを収集するために使用し得る装置は、特定波長の光照射手段と、低雑音で高感度に発光スペクトルを観測できる微弱発光測定手段とを具備することが必要である。図１は、本発明の癌罹病検定用装置の一態様を示すものであり、試料セル１と、試料セルを収容する試料室２と、試料セル１に収容されるべき試料に光を照射するための光照射手段１０と、試料から発生する発光強度を測定する発光測定手段１１と、前記発光測定手段１１との間に設けられた光学フィルター１２と、前記試料室の下方に設けられた加熱手段１３とを具備し、更に前記試料室２は、該試料室内の雰囲気をガス雰囲気に置換するためのガス入口３及びガス出口４を備えている。
【００２２】
前記光学フィルター１２は、分光機構の一例であり、ＨＰＤに特異的な発光を測定するために６００ｎｍ以上の光を通す光学フィルターが用いられる。また、分光機構の他の例としては、６００ｎｍ以上の光を通す分光器又は受光素子が挙げられ、分光器としては例えばグレーティングなどが好適に用いられる。
【００２３】
また、前記試料セル１及び／又は試料室２は、照射される光により励起される物質を含まない材料、すなわち、高純度物質から形成されていることが好ましく、例えば、ＳｉＯ２、高純度ガラス、高純度石英ガラス、ステンレス、Ｓｉ、ＳｉＣなどが具体例として挙げられる。
【００２４】
また、光照射手段１０としてレーザー光源が使用され得、レーザー光の波長は、ＨＰＤ由来の発光を誘発すべく、３００ｎｍ〜４５０ｎｍであることが好ましく、３３０ｎｍ〜４２０ｎｍがより好ましい。更に、レーザー光の照射出力が高すぎると大量の活性酸素が生成し、細胞死を招いて自己発光を誘起するおそれがある。このため、照射出力の調整が必要であり、その上限は平均出力１０ｍＷ以下とすることが好ましい。なお、レーザーは直線光であるため、拡散レンズ（非球面）を通すことにより、光を拡散させ照射面積を大きくすることもできる。また、パルスレーザーでも前記条件を満たすものであれば本発明において好適に使用することができる。パルスレーザーの場合、送信と受信との同期をとる周期増幅方式を受光源にも適用でき、ノイズ軽減に役立てることができる。
【００２５】
本発明の癌罹病検定用装置における、特に光照射手段と、分光機構と、発光強度測定手段とにより構成される態様について、図１とは異なる他の態様を、模式的に示した図を参照しながら以下に説明する。
【００２６】
図２は、特定波長の光を通す光学フィルターを用いた装置の一態様であり、光学フィルター１１２により、光照射手段１００から照射された光が反射される一方、６００ｎｍ以上の光を通すことにより、ヘマトポルフェリン及び／又はその誘導体由来の励起発光の発光量が発光強度測定手段１１１により測定される。
【００２７】
図３は、特定波長の光を通す分光器としてグレーティングを用いた装置の一態様であり、光照射手段２００から照射された光を受けて試料から発生した励起発光から、グレーティング２１２により６００ｎｍ以上の光が取り出されることにより、ヘマトポルフェリン及び／又はその誘導体由来の励起発光の発光量が発光強度測定手段２１１により測定される。
【００２８】
また、図４に示すような構成（多検体測定装置）とすることにより、複数の試料を連続的に測定することができる。すなわち、試料室（図示せず）内に設けられた移動手段３５０（例えば、ターンテーブル）の上に、複数の試料セル３０１を載荷する。ターンテーブルの場合、試料セル３０１は図４に示すように円状に配置する。このような構成を採用した場合、移動手段３５０を移動（回転）させることにより試料３０２を発光強度測定手段３１１の下へ移動し、光照射手段３００が光を試料３０２に照射しながら、６００ｎｍ以上の光を通す分光機構３１２を介した試料からの励起発光を測定することにより、ヘマトポルフィリン及び／又はその誘導体由来の励起発光の発光量が測定される。このような操作を繰り返すことにより、複数の試料を連続的に測定することができる。ここで、移動手段３５０及び試料セル３０１は照射光が当たっても光りにくい素材のものが用いられる。また、このような移動手段３５０を用いることなく試料室内に置かれた複数の試料について一度に測定することも、照射が均一になるよう複数の光照射手段を用いる、ＣＣＤカメラのような受光素子を利用した発光強度測定、など工夫次第で可能である。
【００２９】
本発明において第二のデータを収集するために使用し得る手段・装置としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の定量が可能な公知の手段・装置を用いることができる。一態様として、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を利用することができる。フローサイトメトリーにより、蛍光色素を抗体分子に標識することで、目的とする細胞を測定することが可能であり、染色を行うことでリンパ球の中でもＴ細胞を特異的に測定することができる。他の態様として、フローサイトメトリー以外に免疫蛍光法により測定することもできる。
【実施例】
【００３０】
（１）検体
本実施例で用いた検体は、乳がん手術前後の検体を含む以下の通りである。
【表１】
【００３１】
（２）血液分離
被検者から採取した血液１４ｍｌに対するリンパ球の分離は、LYMPHOPREP Tube（第一化学薬品株式会社製）を用いて以下の手順に従い行った。
【００３２】
１．血液をチューブに入れ、血液と等量のＰＢＳを加え転倒混和する。
【００３３】
２．１１００ｇで１０分間遠心する。
【００３４】
３．新しいチューブに単核球層を回収し、１０ｍｌとなるようにＰＢＳを加え懸濁する。
【００３５】
４．２５０ｇで１０分間遠心する。
【００３６】
５．上清を捨て、沈殿物にＰＢＳを１０ｍｌ加え、懸濁する。
【００３７】
６．２５０ｇで１０分間遠心する。
【００３８】
７．上清を捨て、沈殿物にＰＢＳを１ｍｌ加える。
【００３９】
８．チュルク氏液４５μｌと、細胞懸濁液５μｌとあわせる。
【００４０】
９．リンパ球を数え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにハンクス液で調整する。
【表２】
【００４１】
（３）ＨＰＤ染色
ＨＰＤ染色は、以下の手順に従い行った。
【００４２】
１．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌのリンパ球液３ｍｌに対し、５ｍｇ／ｍｌのＨＰＤを１５０μｌ添加する。
【００４３】
２．３７℃で１０分間温める。
【００４４】
３．４２０ｇで１０分間遠心する。
【００４５】
４．上清を捨て、ＰＢＳを５ｍｌ加え懸濁する。
【００４６】
５．４２０ｇで１０分間遠心する。
【００４７】
６．沈殿物にＰＢＳ１ｍｌを加える。
【００４８】
７．チュルク氏液４５μｌと、細胞懸濁液５μｌとあわせる。
【００４９】
８．リンパ球を数え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにハンクス液で調整する。
【００５０】
（４）化学発光量の測定
化学発光検出（Chemiluminescence detection: CL-detection）は、室温において、励起発光計測装置としてＣＬＡ−ＦＳ３(東北電子産業株式会社製）を用い、以下の条件及び手順に従い行った。
【００５１】
励起発光計測装置：ＣＬアナライザー ＣＬＡ−ＦＳ３(東北電子産業株式会社製）
レーザー：４０５ｎｍＬＤ、２．６ｍＷ
フィルター：Ｎｅｕｔｒａｌ−Ｄｅｎｓｉｔｙ（ＮＤ）フィルター１０−３＋５００high pass (ＨＰ)フィルター＋６００ＨＰフィルター、又はＮＤフィルター１０−３＋５００ＨＰフィルター＋６２０ＨＰフィルター、gain：１００
１．ＨＰＤ染色したリンパ球液又はＨＰＤ染色しないリンパ球液６０μｌ（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を石英丸溝試料管に入れる。
【００５２】
２．レーザーを照射しながら発光を測定する。
【００５３】
３．ＨＰＤ染色したリンパ球の発光強度からＨＰＤ染色しないリンパ球の発光強度を引いた値を発光量とする。それぞれの測定は２回行い、平均値を使用する。
【００５４】
（５）ＣＤ４−ＦＩＴＣ／ＣＤ８−ＰＥ標識抗体を用いたＴ細胞の染色
標識抗体としてDual Color Kit「イムノテック」ＣＤ４／ＣＤ８（ベックマン・コールター株式会社製）を用い、以下の手順に従いＴ細胞を染色しＦＣＭ測定試料を作成した。
【００５５】
なお、ＣＤ４−ＦＩＴＣはインデューサー／ヘルパーＴ細胞で発現するＣＤ４抗原を認識し、ＣＤ８−ＰＥはサプレッサー／細胞障害性Ｔ細胞で発現するＣＤ８抗原を認識する。
【００５６】
１．１０５〜１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したリンパ球液１００μｌに対し、ＣＤ４−ＦＩＴＣ／ＣＤ８−ＰＥ標識抗体を２０μｌ添加する。
【００５７】
２．氷上で３０分間置く。
【００５８】
３．ＰＢＳ（０．１Ｍ ＰＢ、０．９％ＮａＣｌ）を２ｍｌ添加し、懸濁する。
【００５９】
４．２０１ｇで１５分間遠心する。
【００６０】
５．上清を捨て、ＰＢＳを２ｍｌ添加する。
【００６１】
６．２０１ｇで１５分間遠心する。
【００６２】
７．上清を捨て、ＰＢＳを０．５ｍｌ添加し、ＦＣＭ測定試料とする。
【００６３】
（６）ＦＣＭによる測定
ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の定量は、以下の装置及び手順に従い行った。
【００６４】
フローサイトメーター：Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（ベックマン・コールター株式会社製）
レーザー：Ａｒ ４８８ｎｍ
検出器：ＦＬ１（ＦＩＴＣ、５２５ｎｍ）、ＦＬ２（ＰＥ、５７５ｎｍ）
１．ＣＤ４−ＦＩＴＣ／ＣＤ８−ＰＥ標識抗体で染色したリンパ球５００μｌを試料管に入れ、測定を行う。
【００６５】
２．ＦＬ１で検出されたＣＤ４＋Ｔ細胞の値をＦＬ２で検出されたＣＤ８＋Ｔ細胞の値で割ることにより、ＣＤ４／ＣＤ８を計算する。測定は２回行い、平均値をデータとして用いる。（但し、細胞が少なかった試料については１回のみの測定データを使用している。）
（７）結果
（７−１）ＣＤ４／ＣＤ８とＣＬ強度の測定値
ＣＤ４／ＣＤ８とＣＬ強度の測定値を表３−１〜３−３に示す。
【表３−１】
【００６６】
【表３−２】
【００６７】
【表３−３】
（７−２）ＣＤ４／ＣＤ８値とＣＬ強度の相関関係
ＣＤ４／ＣＤ８値とＣＬ強度の相関関係をグラフにしたものを図５に示す。グラフ中の囲み線は、術前罹癌者１９人中のＣＬ強度、及びＣＤ４／ＣＤ８値の中央値を示す。ＣＬ強度、ＣＤ４／ＣＤ８値の中央値は、ＣＬ強度：２９３０８６(検体Ｎｏ．１０)、ＣＤ４／ＣＤ８値：２．８(検体Ｎｏ．１２)であった。図５から、術前の罹癌者におけるＣＬ強度及びＣＤ４／ＣＤ８値の各中央値をしきい値とすることにより、被検者が癌を罹患しているか否かの診断が高い確率で可能であることがわかる。
【表４】
【００６８】
表４に示す相関グラフの結果から、術前の罹癌者では中央値領域外に８９．５％、領域内に１０．５％の確率で存在することから、９割程度の確率で癌を発見することが可能であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明において第一のデータ取得に好適な装置の一態様を模式的に示す図。
【図２】本発明において第一のデータ取得に好適な装置の他の態様を模式的に示す図。
【図３】本発明において第一のデータ取得に好適な装置の他の態様を模式的に示す図。
【図４】本発明において第一のデータ取得に好適な装置の他の態様を模式的に示す図。
【図５】ＣＤ４／ＣＤ８値とＣＬ強度の相関関係を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌罹病の検定に使用するデータを収集する方法であって、被検者から採取したリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を定量することにより第一のデータを得る工程と、被検者から採取した前記リンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞)とＣＤ８抗原をもつＴ細胞(ＣＤ８＋Ｔ細胞)を定量し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞）を算出することにより第二のデータを得る工程とを含み、
第一のデータであるポルフィリン系化合物量と、第二のデータであるＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞の値の少なくとも一方が、各々に設定された所定値以上である場合に、被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断する検定において使用されることを特徴とする、癌罹病の検定に使用するデータの収集方法。
【請求項２】
第一のデータ取得工程におけるポルフィリン系化合物の前記定量が、
（ａ） 被検者から採取したリンパ球にポルフィリン系化合物を加える工程と、
（ｂ） 工程（ａ）で得られた混合物に特定波長の光を照射してリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を励起し、化学反応を起こすことにより発光を生じさせる工程と、
（ｃ） 工程（ｂ）で発生した発光量を測定する工程と、
を含む手段により行われることを特徴とする、請求項１に記載の癌罹病の検定に使用するデータの収集方法。
【請求項３】
第二のデータ取得工程におけるＣＤ４抗原をもつＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）とＣＤ８抗原をもつＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）の定量が、フローサイトメトリー又は免疫蛍光法により測定される、請求項１又は２に記載の癌罹病の検定に使用するデータの収集方法。
【請求項４】
前記ポルフィリン系化合物が、ヘマトポルフィリン及び／又はその誘導体であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の癌罹病の検定に使用するデータの収集方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）においてポルフィリン系化合物が結合するリンパ球がＢ細胞リンパ球である、請求項２乃至４のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）において生じる発光が、一重項酸素由来のものであることを特徴とする、請求項２乃至５のいずれか１項に記載の癌罹病の検定に使用するデータの収集方法。
【請求項１】
癌罹病の検定に使用するデータを収集する方法であって、被検者から採取したリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を定量することにより第一のデータを得る工程と、被検者から採取した前記リンパ球に含まれるＣＤ４抗原をもつＴ細胞(ＣＤ４＋Ｔ細胞)とＣＤ８抗原をもつＴ細胞(ＣＤ８＋Ｔ細胞)を定量し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比（ＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞）を算出することにより第二のデータを得る工程とを含み、
第一のデータであるポルフィリン系化合物量と、第二のデータであるＣＤ４＋Ｔ細胞／ＣＤ８＋Ｔ細胞の値の少なくとも一方が、各々に設定された所定値以上である場合に、被検者が癌を罹患している可能性が高いと判断する検定において使用されることを特徴とする、癌罹病の検定に使用するデータの収集方法。
【請求項２】
第一のデータ取得工程におけるポルフィリン系化合物の前記定量が、
（ａ） 被検者から採取したリンパ球にポルフィリン系化合物を加える工程と、
（ｂ） 工程（ａ）で得られた混合物に特定波長の光を照射してリンパ球に結合したポルフィリン系化合物を励起し、化学反応を起こすことにより発光を生じさせる工程と、
（ｃ） 工程（ｂ）で発生した発光量を測定する工程と、
を含む手段により行われることを特徴とする、請求項１に記載の癌罹病の検定に使用するデータの収集方法。
【請求項３】
第二のデータ取得工程におけるＣＤ４抗原をもつＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）とＣＤ８抗原をもつＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）の定量が、フローサイトメトリー又は免疫蛍光法により測定される、請求項１又は２に記載の癌罹病の検定に使用するデータの収集方法。
【請求項４】
前記ポルフィリン系化合物が、ヘマトポルフィリン及び／又はその誘導体であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の癌罹病の検定に使用するデータの収集方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）においてポルフィリン系化合物が結合するリンパ球がＢ細胞リンパ球である、請求項２乃至４のいずれか１項に記載のデータ取得方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）において生じる発光が、一重項酸素由来のものであることを特徴とする、請求項２乃至５のいずれか１項に記載の癌罹病の検定に使用するデータの収集方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−５４３０５（Ｐ２０１０−５４３０５Ａ）
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１８６８７（Ｐ２００８−２１８６８７）
【出願日】平成２０年８月２７日（２００８．８．２７）
【出願人】（０００２２２０２６）東北電子産業株式会社 (11)
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２７日（２００８．８．２７）
【出願人】（０００２２２０２６）東北電子産業株式会社 (11)
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
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