癌胎児抗原をコードする合成遺伝子およびその使用
ヒト癌胎児抗原（ＣＥＡ）をコードし、ヒト細胞環境において発現するためにコドンが最適化されている合成ポリヌクレオチドを提供する。ＣＥＡをコードする遺伝子は通常、ヒト癌の発症に関連する。本発明は、異常なＣＥＡ発現が癌またはその発症に関連するので、ＣＥＡ腫瘍関連抗原によって発現する蛋白質産物に対する免疫を惹起し、または増強する組成物および方法を提供する。本発明は、具体的には、コドンを最適化したヒトＣＥＡを有するアデノウイルスベクターおよびプラスミド構築物を提供し、癌を予防および治療するためのワクチンおよび医薬品組成物におけるそれらの使用を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に癌の治療に関する。より具体的には、本発明は、本明細書でｈＣＥＡｏｐｔと称するヒト腫瘍関連癌胎児抗原をコードする合成ポリヌクレオチドに関し、該ポリペプチドはヒト細胞環境で発現するためにコドンが最適化されている。本発明はまた、組換えベクターおよび前記合成ポリヌクレオチドを含む宿主を提供する。本発明はまた、ｈＣＥＡｏｐｔを有するアデノウイルスベクターおよびプラスミド構築物並びに癌の予防および治療のためのワクチンにおけるそれらの使用並びに医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、様々な機能を備えた蛋白質をコードする数多くの遺伝子から構成され、その機能の１つが細胞間接着である。ＩｇＳＦ蛋白質は、適切な分子間結合相互作用を維持するために重要なＩｇ関連ドメインを少なくとも１つ含有する。このような相互作用は、ＩｇＳＦ構成要素の様々な生物学的機能に不可欠なので、多くのＩｇＳＦ接着分子の破壊または異常発現は、多くのヒト疾患と相関してきた。
【０００３】
癌胎児抗原（ＣＥＡ）は、細胞表面糖蛋白質を構成するＩｇスーパーファミリーに属する。ＣＥＡサブファミリーの構成要素は、ＣＥＡ関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）として知られている。最近の科学文献では、ＣＥＡ遺伝子はＣＥＡＣＡＭ５と改名されたが、蛋白質の名称はＣＥＡのままである。機能的には、ＣＥＡＣＡＭはホモタイプおよびヘテロタイプ両方の細胞間接着分子として作用することが示された（Ｂｅｎｃｈｉｍｏｌ他、Ｃｅｌｌ ５７：３２７〜３３４（１９８９））。細胞接着に加えて、ＣＥＡは細胞外マトリックスからの細胞脱離によって生じる細胞死を阻害し、Ｂｃｌ２およびＣ−Ｍｙｃなどのある種のプロトオンコジーンに関連した細胞形質転換の一因となり得る（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２０（８）：２１９７〜２２０７参照）。
【０００４】
ＣＥＡの正常な発現は、胎児の発育中および成人結腸粘膜で検出された。ＣＥＡ過剰発現は、３０年以上前にヒト結腸癌において最初に検出され（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２１：４３９〜４６２（１９６５））、その後ほとんど全ての結腸直腸癌で見いだされてきた。さらに、ＣＥＡ過剰発現は、膵臓、胸および肺の腺癌の高い割合で検出可能である。これらの種類の腫瘍ではＣＥＡ発現が一般的なので、ＣＥＡはこれらの癌の管理および予後において広く臨床的に使用されている。
【０００５】
ヒトＣＥＡをコードする配列は、クローニングされ、特徴付けられている（米国特許第５２７４０８７号、米国特許第５５７１７１０号および米国特許第５８４３７６１号。Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２２１〜３２３０（１９８７）、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：９２０〜９２４（１９８７）。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（９）：２９６５〜６９（１９８７））。
【０００６】
ＣＥＡ発現と転移増殖との間の相関関係によって、結腸直腸癌治療のための分子的および免疫学的介入の標的としての存在価値が引き出された。ＣＥＡを標的とする１つの治療的取り組みは、抗ＣＥＡ抗体の使用であり（Ｃｈｅｓｔｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ８〜Ｓ１２（２０００）参照）、もう１つはＣＥＡをベースとしたワクチンを使用してＣＥＡ発現腫瘍を攻撃する免疫系を活性化することである（概説としてはＢｅｒｉｎｓｔｅｉｎ、前述参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
多くのワクチンの開発および商品化は、宿主生物をうまく形質転換する外来遺伝子を高い発現濃度で獲得するのに伴う困難さのために、妨げられている。したがって、前述のＣＥＡ蛋白質をコード化する野生型ヌクレオチド配列が同定されたにも関わらず、効率的で、自己寛容によって妨害されない癌ワクチンの開発が可能になる、企図する宿主細胞で発現するために最適化されたＣＥＡをコードするヌクレオチド配列を利用するヒトＣＥＡ蛋白質の容易に再生可能な材料を開発することが強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、直腸結腸癌を含めた数多くの腺癌に関連してきたＣＥＡ遺伝子によって発現した蛋白質生成物に対する免疫を惹起するか、または増強する組成物および方法に関する。具体的に、本発明は、ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドはヒト細胞において高レベルで発現するようにコドンが最適化されている。本発明はさらに、合成ポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターおよびプラスミドをベースとしたベクターを提供し、ＣＥＡに関連した癌を予防し、かつ／または治療するための免疫原性組成物およびワクチンにおける前記ベクターの使用を開示する。
【０００９】
本発明はまた、配列番号２に記載されているヒト癌胎児抗原（以後ｈＣＥＡ）をコードするヌクレオチドの配列を含む合成核酸分子（ポリヌクレオチド）に関し、前記合成核酸分子は、ヒト細胞において高レベルで発現するようにコドンが最適化されている（以後、ｈＣＥＡｏｐｔ）。本明細書で開示された核酸分子は、選択した宿主細胞にトランスフェクトすることができ、該組換え宿主細胞は、十分な濃度で機能的ｈＣＥＡ蛋白質（配列番号２）を発現させるための原料となる。
【００１０】
本発明はさらに、ヒトＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする合成核酸分子に関し、このＤＮＡ分子は本明細書で配列番号１として開示したヌクレオチド配列を含む。本発明のこの部分の好ましい態様は、ｈＣＥＡ蛋白質（配列番号２または配列番号１６）をコードするＤＮＡ分子（配列番号１）を示す図１に開示される。本発明の好ましい核酸分子は、ヒト細胞において高レベルで発現するようにコドンが最適化されている。
【００１１】
本発明の他の好ましいＤＮＡ分子は、ヒト完全長ＣＥＡ（配列番号２）のアミノ酸約６７９からアミノ酸約７０２に位置するＣ末端アンカードメイン（ＡＤ）が欠失したヒトＣＥＡをコードするヌクレオチドの配列を含み、ヌクレオチドの前記配列はヒト細胞において高レベルで発現するようにコドンが最適化されている。アンカードメインを切断されたＣＥＡ変種をコードするＤＮＡ分子の例を図１５に示す（図１０Ａを参照）。ｈＣＥＡ−ΔＡＤの対応するアミノ酸配列は、配列番号１６に記載する（図１０Ｂを参照）。
【００１２】
本発明はまた、この明細書を通じて開示した核酸分子を含有する組換えベクター、並びに原核細胞および真核細胞両方の組換え宿主細胞に関する。
【００１３】
本発明はさらに、（ａ）配列番号１または配列番号１５で表した核酸分子を含むベクターを適切な宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記コドン最適化ヒト蛋白質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞におけるコドン最適化ヒトＣＥＡ蛋白質の発現方法に関する。
【００１４】
本発明の他の態様は、合成核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳類に投与することを含む癌の予防または治療方法であり、該合成核酸分子は配列番号２または配列番号１６で表したヒト癌胎児抗原（ｈＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチドの配列を含み、該合成核酸分子はヒト細胞において高濃度に発現するようにコドンが最適化されている。
【００１５】
本発明はさらに、Ｅ１領域に欠失を有し、及びＥ１領域に挿入部分を有するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターに関し、前記挿入部分は、（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、（ｂ）ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む発現カセットを含む。
【００１６】
本発明はまた、プラスミド部分と発現カセット部分とを含むワクチンプラスミドに関し、該発現カセット部分は、（ａ）ヒト細胞において最適に発現させるためにコドンを最適化した、ヒトＣＥＡ蛋白質をコードする合成ポリヌクレオチドと、（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む。
【００１７】
本発明の他の態様は、（ａ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターを含む第１のベクターを哺乳類に導入すること、（ｂ）予め決定された時間経過させること、および（ｃ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターを含む第２のベクターを該哺乳類に導入することを含む、前記哺乳類を癌から予防もしくは癌を治療するか、またはＣＥＡに関連した癌に罹患した前記哺乳類を治療する方法である。
【００１８】
明細書および添付の特許請求の範囲を通じて使用したように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明白に別段の指定がない限り、複数を指すことを含む。
【００１９】
明細書および添付の特許請求の範囲を通じて使用したように、以下の定義および略語を適用する。
【００２０】
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ鎖の認識部位のことである。該プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼとの開始複合体を形成し、転写活動を開始し、推進する。該複合体は、「エンハンサー」と称する活性化配列または「サイレンサー」と称する阻害配列によって変更することができる。
【００２１】
「カセット」という用語は、発現させるべき核酸配列を含有する本発明の配列のことである。該カセットは、カセットテープの概念と同じで、各カセットは独自の配列を有する。したがって、カセットを交換することによって、ベクターは異なる配列を発現する。５′および３′末端に制限部位があるために、該カセットは容易に挿入したり、除去したり、他のカセットで置換したりすることができる。
【００２２】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片を宿主生物または宿主組織に導入することができるいくつかの手段を意味する。ベクターには、プラスミド、（アデノウイルスを含む）ウイルス、バクテリオファージおよびコスミドを含む様々な種類がある。
【００２３】
アデノウイルスベクターに関して使用したような「第１世代」という用語は、複製に欠陥のある前記アデノウイルスベクターを意味する。一般的に、第１世代アデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子領域が欠失しているか、または不活性化しており、好ましくはＥ３遺伝子領域が欠失しているか、または不活性化している。
【００２４】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ」という呼称は、イントロンＡを有するヒトＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、完全長コドン最適化ヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化配列および転写終止配列並びに最小ｐＵＣ主鎖を含む、本明細書で開示したプラスミド構築物である（実施例２参照）。前述のように、「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ」という呼称は、構築物がコドン最適化ヒトＣＥＡ遺伝子の代わりに野生型ヒトＣＥＡ遺伝子を含むこと以外は前述のような構築物を意味する。
【００２５】
「ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ」および「ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡ」という呼称は、Ｅ１およびＥ３領域に欠失があるＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む、本明細書で開示した２種類の構築物を意味する。「ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ」構築物においては、Ｅ１領域は、イントロンＡを含まないヒトＣＭＶプロモーターの制御下でＥ１と平行したコドン最適化ヒトＣＥＡ遺伝子およびそれに続くウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって置換されている。「ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡ」構築物は、Ａｄ５ゲノムのＥ１領域が野生型ヒトＣＥＡ配列と置換していること以外は、本質的に前述の通りである（実施例２参照）。
【００２６】
「有効量」という用語は、免疫応答を生じるように、十分なワクチン組成物が適切な濃度のポリペプチドの産生を誘導することを意味する。当業者は、この濃度は変化し得ることを承知している。
【００２７】
「保存的アミノ酸置換」とは、１個のアミノ酸残基がもう１個の化学的に類似したアミノ酸残基によって置換されることを意味する。このような保存的置換の例は、１疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）と他の残基との置換、１極性残基と電荷が同じ他の１極性残基との置換（たとえば、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸）である。
【００２８】
「ｈＣＥＡ」は、ヒト癌胎児抗原を意味し、「ｈＣＥＡｏｐｔ」は、コドン最適化ヒト癌胎児抗原を意味する。
【００２９】
「ｈＣＥＡ−ΔＡＤ」という用語は、ヒト完全長ＣＥＡ（配列番号２）のアミノ酸約６７９からアミノ酸約７０２に位置するＣ末端アンカードメイン（ＡＤ）を欠失したヒトＣＥＡの変種を意味する。本発明のｈＣＥＡ−ΔＡＤをコードするヌクレオチド配列は、ヒト細胞環境において高レベルで発現するようにコドンが最適化されている（本明細書では、ｈＣＥＡｏｐｔ−ΔＡＤ”と称する）。アンカードメインを切断されたＣＥＡ変種をコードするＤＮＡ分子の例を図１５に示す（図１０Ａを参照）。ｈＣＥＡ−ΔＡＤの対応するアミノ酸配列は配列番号１６に記載する（図１０Ｂを参照）。ｈＣＥＡ−ΔＡＤをコードするヌクレオチドは、癌の治療および／または予防のための癌ワクチンの開発に有用である。
【００３０】
「哺乳類」という用語は、人類を含めた任意の哺乳類を意味する。
【００３１】
略語「Ａｇ」は、抗原のことである。
【００３２】
略語「Ａｂ」は抗体を意味し、「ｍＡｂ」はモノクローナル抗体を意味する。
【００３３】
略語「ＯＲＦ］は、遺伝子のオープンリーディングフレームを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
癌胎児抗原（ＣＥＡ）は通常、腺癌の発症に関連する。本発明は、異常なＣＥＡ発現が癌または癌の発症に関連するＣＥＡ腫瘍関連抗原によって発現した蛋白質生成物に対する免疫を惹起するか、または高める組成物および方法に関する。異常なＣＥＡ発現は腫瘍開始時に存在し、腫瘍進行後まで検出されなくてもよく、その逆であってもよいので、異常なＣＥＡ発現と癌との関連には、ＣＥＡ蛋白質が腫瘍組織において、その発症の全ての時点において発現されていることは必要ではない。
【００３５】
このために、ヒトＣＥＡ蛋白質をコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。好ましい実施形態ではヒト細胞である計画した宿主細胞に好まれるコドンを使用するように、合成分子のコドンを設計する。抗体の中和および細胞性免疫によって、ＣＥＡ関連癌に対する効果的な免疫予防を提供する組換えアデノウイルスワクチンまたはプラスミドをベースとしたワクチンを開発するために、該合成分子を使用することができる。該合成分子は、免疫原組成物として使用することができる。本発明は、霊長類およびヒトなどの哺乳類を含めた脊椎動物に直接インビボで導入すると、該動物でコード化された蛋白質の発現を誘導するポリペプチドを提供する。
【００３６】
野生型ヒトＣＥＡヌクレオチド配列は報告されている（たとえば、米国特許第５２７４０８７号、米国特許第５５７１７１０号および米国特許第５８４３７６１号参照）。本発明は、ヒトＣＥＡ蛋白質をコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。本発明の合成分子は、いくつかはヒト細胞によって好まれるコドンを使用するように変更されており、したがってヒト宿主細胞においてＣＥＡを高濃度で発現することが可能であるヌクレオチドの配列を含む。該合成分子は、抗体の中和および細胞性免疫によってＣＥＡ関連癌に対する効果的な免疫予防を提供する癌ワクチンで使用することができる、ＣＥＡ蛋白質の材料として使用することができる。
【００３７】
４種類の可能なヌクレオチド塩基の「３連」コドンは、６０個を上回る変種の形で存在することが可能である。これらのコドンは、異なるアミノ酸２０個（および転写開始および終止）のみの情報を提供するので、いくつかのアミノ酸は、複数のコドンによってコードされることが可能で、コドン重複として公知の現象である。完全には理解されていない理由のために、他のコドンは異なる種類の細胞の内在ＤＮＡに均一に存在することはない。実際に、ある種の細胞においてある種のコドンには様々な天然の階層または「選択性」が存在するようである。１例として、アミノ酸ロイシンはＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡおよびＴＴＧを含めた６種類のＤＮＡコドンのいずれかによって特定される。微生物のゲノムコドン出現頻度の徹底的な分析によって、Ｅ．コリの内在性ＤＮＡは極めて一般的に、ＣＴＧロイシン指定コドンを含有し、一方酵母および粘菌のＤＮＡは極めて一般的にＴＴＡロイシン指定コドンを含むことが明らかになった。この階層的観点から、Ｅ．コリ宿主によってロイシンリッチなポリペプチドの高濃度発現が得られる可能性は、使用したコドンの頻度にある程度左右されることが一般に信じられている。たとえば、ＴＴＡコドンに富んだ遺伝子はＥ．コリでは十分に発現せず、一方ＣＴＧに富んだ遺伝子はおそらくこの宿主で高く発現するようである。同様に、酵母宿主細胞でロイシンに富んだポリペプチドの発現に好まれるコドンはＴＴＡである。
【００３８】
組換えＤＮＡ技術に対するコドン選択現象の意味は一目瞭然で、該現象によって、形質転換が成功した宿主生物において外来遺伝子の高濃度発現を実現できなかったかつての多くの失敗を説明することができ、あまり「好ましくない」コドンを挿入遺伝子内に反復して存在させて、宿主細胞の発現機構をあまり効率よく作動できないようにすることが可能である。この現象は、計画した宿主細胞に好まれるコドンを含むように設計された合成遺伝子は、組換えＤＮＡ技術を実施するために最適な形態の外来遺伝子材料となることを示唆する。したがって、本発明の１態様は、ヒト細胞で発現するためにコドンを最適化したヒトＣＥＡ遺伝子である。本発明の好ましい実施形態では、同じ蛋白質配列をコードする他のコドンを使用することによって、ヒト細胞における外来ＣＥＡ蛋白質発現の制約を取り除くことができることが見いだされた。
【００３９】
本発明によれば、本明細書に参照により組み込まれた、Ｌａｔｈｅの「アミノ酸配列データから推測されたオリゴヌクレオチドプローブ：理論および実際の考察（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ」Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８３：１〜１２（１９８５）に記載されたように、ヒトＣＥＡ遺伝子配列は、同じ翻訳配列を有するが他のコドンを使用したポリヌクレオチドに変換された。この方法は一般的に、高発現のヒト遺伝子に通常関連しない野生型配列のコドンを同定すること、およびこのコドンとヒト細胞において高く発現するために最適なコドンとを置換することから構成される。次に、新規配列について、これらのコドン置換によって生じた望ましくない配列を調べる（たとえば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライシング認識部位の偶発的な発生、望ましくない制限酵素部位など）。所望しない配列は、同一アミノ酸をコードする異なるコドンで既存のコドンを置換することによって除去される。次に、合成遺伝子部分の発現が改善されているかを調べる。
【００４０】
前述の方法を使用してヒトＣＥＡの合成遺伝子配列を作製して、高い発現濃度に最適化したコドンを含む遺伝子が生じた。前記の方法は、癌ワクチンで使用するコドン最適化遺伝子を設計するための方法を要約したものであるが、該方法を少し変更するか、または配列を少し変化させることによって、同様のワクチンの有効性または遺伝子発現の増加を実現することは、当業者に理解されている。当業者はまた、ＤＮＡ分子のほんの一部のコドンをコドン最適化して、ヒト細胞において高濃度のＣＥＡ発現をもたらす他のＤＮＡ分子を構築できることを理解するであろう。
【００４１】
したがって、本発明は、ヒトＣＥＡ蛋白質（配列番号２）、またはｈＣＥＡ−ΔＡＤ（配列番号１６）を含むがそれだけに限定されないヒトＣＥＡ蛋白質の生物学的に活性のある断片または変異型をコードするヌクレオチドの配列を含む合成ポリヌクレオチドに関し、該ポリヌクレオチド配列はヒト宿主で発現するために最適化されたコドンを含む。ＣＥＡ蛋白質の前記変異型は、本明細書で集合的に「変種」として称される保存的アミノ酸置換、アミノ末端切断、カルボキシ末端切断、欠失または添加を含むが、それだけに限定されない。このような生物学的活性のある断片および／または変異体はいずれも、配列番号２で示したようなＣＥＡ蛋白質の免疫学的特性を少なくとも実質的に模倣した蛋白質または蛋白質断片をコードする。本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療用または予防用癌ワクチンを開発するのに有用であるように、機能的なヒトＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００４２】
前述したように、本発明は、ヒトＣＥＡ蛋白質（配列番号２）をコードするヌクレオチドまたはそれらの生物学的に活性のある断片または変異型に関する。このために、本発明は、Ｃ末端アンカー配列が欠失したヒトＣＥＡ蛋白質を含むｈＣＥＡ−ΔＡＤ（配列番号１６、図１０Ｂ）をコードするヌクレオチドを提供する。ｈＣＥＡ−ΔＡＤをコードする本発明の核酸分子は、ヒト細胞での発現を高めるためにコドンが最適化されている。ｈＣＥＡ−ΔＡＤをコードする核酸配列の例は、配列番号１５で示したヌクレオチドの配列を含む（図１０Ａ）。
【００４３】
本発明は、配列番号２に記載されている新規ｈＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列を含む合成核酸分子（ポリヌクレオチド）に関し、前記合成核酸分子は、ヒト宿主細胞で高レベルで発現するようにコドンが最適化されている。本発明の核酸分子は、実質的に他の核酸を含まない。
【００４４】
本発明はまた、この明細書を通じて開示した核酸分子を含有する組換えベクター並びに原核細胞および真核細胞の両方の組換え宿主細胞に関する。該合成ＤＮＡ分子、関連ベクターおよび本発明の宿主は、癌ワクチンの開発に有用である。
【００４５】
本発明の好ましいＤＮＡ分子は、配列番号２として表した、図２に示したヒトＣＥＡ蛋白質をコードする、本明細書で配列番号１として開示した、図１に示したヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
本発明のさらに好ましいＤＮＡ分子は、配列番号１６として表した、図１０Ｂに示したＣ末端アンカー配列を欠失したヒトＣＥＡ変種をコードする、本明細書で配列番号１５として開示した、図１０Ａに示したヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
本発明はまた、ヒトＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１の生物学的に活性のある断片または変異体を含む。このような生物学的活性のある断片および／または変異体は、配列番号２で表したｈＣＥＡ蛋白質を含むが、それだけに限定されないｈＣＥＡ蛋白質の薬理学的特性を少なくとも実質的に模倣した蛋白質または蛋白質断片のいずれかをコードする。このようなポリヌクレオチドはいずれも、ヌクレオチド置換、欠失、添加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断を含むが、必ずしもそれだけに限定されない。本発明の変異体は、癌ワクチンの開発に有用であるように真核細胞において機能的ｈＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００４８】
本発明はまた、合成ＤＮＡのヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド配列とは著しく異なるが、まだ配列番号２で表したｈＣＥＡ蛋白質をコードする合成コドン最適化ＤＮＡ分子に関する。このような合成ＤＮＡは、本発明の範囲内にあるものとする。したがって、本発明は、同一の蛋白質を発現する数多くのＤＮＡ分子をもたらすことができるコドン重複を開示する。本発明の範囲内にはまた、発現した蛋白質の基本的な物理特性を実質的に変更しないＤＮＡ配列の変異が含まれる。たとえば、ロイシンをバリンに、リジンをアルギニンに、またはグルタミンをアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機能に変化は生じる可能性はない。
【００４９】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然に生じるペプチドと異なる特性を有するペプチドをコードするために改変することができることが知られている。ＤＮＡ配列の改変方法は、部位特異的変異誘発を含むが、それだけに限定されない。改変された特性の例は、基質に対する酵素またはリガンドに対する受容体の親和性の変化を含むが、それだけに限定されない。
【００５０】
本発明はまた、ＧＦＰ（緑の蛍光蛋白質）、ＭＹＣエピトープ、ＧＳＴおよびＦｃを含むが、それだけに限定されない様々なマーカーに結合させたヒトＣＥＡ蛋白質の一部を発現する融合構築物を含むが、それだけに限定されないｈＣＥＡｏｐｔ融合構築物に関する。このような融合構築物はいずれも、関心のある細胞系で発現することが可能で、本明細書で開示したヒトＣＥＡ蛋白質の修飾因子のスクリーニングに使用することが可能である。ＤＯＭおよびｈｓｐ７０並びにＬＴＢを含むが、それだけに限定されない、ヒトＣＥＡに対する免疫応答を高めるために構築された融合蛋白質もまた、企図する。
【００５１】
本発明はさらに、この明細書を通じて開示した合成核酸分子を含む組換えベクターに関する。これらのベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成されることが可能である。ほとんどのクローニングのためには、ＤＮＡベクターが好まれる。一般的なベクターは、プラスミド、改変ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母の人工的染色体、およびｈＣＥＡ蛋白質をコードすることができるその他の形態のエピソームＤＮＡまたは統合ＤＮＡを含む。特定の遺伝子輸送またはその他の用途に適切なベクターを決定することは、十分当業者の範囲内である。
【００５２】
ｈＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化ＤＮＡを含有する発現ベクターは、組換え宿主細胞においてｈＣＥＡを高濃度に発現するために使用することができる。発現ベクターは、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミドまたはウイルスを含むが、それだけに限定されない。また、所望するならば、様々な細菌発現ベクターを使用して、細菌細胞で組換えｈＣＥＡを発現することができる。さらに、様々な真菌細胞発現ベクターを使用して、真菌細胞で組換えｈＣＥＡを発現することができる。さらに、様々な昆虫細胞発現ベクターを使用して、昆虫細胞で組換え蛋白質を発現することができる。
【００５３】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞に関する。組換え宿主細胞は、Ｅ．コリなどの細菌、酵母などの真菌細胞を含めるがそれだけに限定されない原核細胞または真核細胞、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類由来の細胞系を含むがそれだけに限定されない哺乳類細胞、並びにショウジョウバエおよびカイコ由来の細胞系を含むがそれだけに限定されない昆虫細胞であってよい。このような組換え宿主細胞は、ｈＣＥＡまたは生物学的に等価な形態を生成するために適した条件下で培養することができる。本発明の好ましい実施形態では、該宿主細胞はヒトである。本明細書で定義したように、「宿主細胞」という用語は、遺伝子を組み換えたヒトの体、ヒト胎児またはヒト胚における宿主細胞を含むものではない。
【００５４】
前述のように、ｈＣＥＡ蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターは、組換え宿主細胞においてｈＣＥＡを発現するために使用することができる。したがって、本発明の他の態様は、（ａ）配列番号１または配列番号１５で表した核酸を含むベクターを適切なヒト宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記ヒトＣＥＡ蛋白質またはＣＥＡ蛋白質変種の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞におけるヒトＣＥＡ蛋白質または蛋白質変種の発現方法である。
【００５５】
宿主細胞でｈＣＥＡが発現した後、ｈＣＥＡ蛋白質を回収して、活性型ｈＣＥＡ蛋白質を提供することができる。いくつかのｈＣＥＡ蛋白質精製方法が有用で、使用に適している。組換えｈＣＥＡ蛋白質は、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの様々な組み合わせ、または個々の適用によって細胞溶解物および抽出物から精製することができる。さらに、組換えｈＣＥＡ蛋白質は、完全長ｈＣＥＡ蛋白質またはｈＣＥＡのポリペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体で作製した免疫親和性カラムを使用することによって、その他の細胞蛋白質から分離することができる。
【００５６】
本発明の核酸は、ヒト細胞において蛋白質の効果的な発現をもたらすように設計された配列を含む発現カセットに組み込むことができる。
【００５７】
該カセットは、コドンを最適化した完全長ｈＣＥＡ遺伝子と共に、プロモーターなど、それに操作可能に結合された転写および翻訳制御配列並びに終止配列を含有することが好ましい。好ましい実施形態では、該プロモーターはイントロンＡ配列（ＣＭＶ）を含まないサイトメガロウイルスプロモーターであるが、当業者であれば、強力なイムノグロブリンなどの多数のその他の公知のプロモーター、またはその他の真核細胞遺伝子プロモーターを使用できることを認識するであろう。好ましい転写終結区は、ウシ成長ホルモン終結区であるが、その他の公知の転写終結区もまた使用することができる。ＣＭＶ−ＢＧＨ終結区の組み合わせは特に好ましい。
【００５８】
本発明によれば、ｈＣＥＡｏｐｔ発現カセットは、ベクターに挿入される。該ベクターは、好ましくはアデノウイルスベクターであるが、プロモーターに結合した線状ＤＮＡまたはその他のベクター、たとえば、アデノ関連ウイルスまたは改変ワクチンウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターもまた使用することができる。
【００５９】
選択したベクターがアデノウイルスの場合、ベクターがいわゆる第１世代アデノウイルスベクターであることが好ましい。これらのアデノウイルスベクターは、非機能性Ｅ１遺伝子領域を有することが特徴で、好ましくはアデノウイルスＥ１遺伝子領域が欠失していることが好ましい。いくつかの実施形態では、該発現カセットは、Ｅ１遺伝子が通常位置する位置に挿入される。さらに、これらのベクターは、場合によって非機能性Ｅ３領域を有するか、Ｅ３領域を欠失している。使用したアデノウイルスゲノムは、Ｅ１およびＥ３領域の両方が欠失していること（ΔＥ１ΔＥ３）が好ましい。該アデノウイルスは、ウイルスＥ１遺伝子を発現する公知の細胞系、たとえば、２９３細胞、またはＰＥＲＣ．６細胞、または一時的にもしくは安定して形質転換して外来蛋白質を発現する２９３またはＰＥＲＣ．６から得られた細胞系で増殖することができる。たとえば、テトラサイクリン制御プロモーター系などの遺伝子発現が制御された構築物を使用するとき、該細胞系は、制御系に関連した成分を発現することができる。このような細胞系の１例は、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３であり、その他は当業者に公知である。
【００６０】
アデノウイルスベクターの操作に便利なように、該アデノウイルスはシャトルプラスミド型であることが可能である。本発明はまた、プラスミド部分およびアデノウイルス部分を含むシャトルプラスミドベクターを対象としており、該アデノウイルス部分はＥ１が欠失し、場合によってＥ３も欠失したアデノウイルスゲノムを含み、コドン最適化ヒトＣＥＡを含む発現カセットが挿入されている。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが容易に除去され得るようにプラスミドのアデノウイルス部分に隣接して制限部位がある。該シャトルプラスミドは、原核細胞または真核細胞で複製することができる。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、発現カセットはｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０アデノウイルスプラスミド（本明細書に参照により組み込まれた、Ｅｍｉｎｉ他、ＷＯ０２／２２０８０参照）に挿入する。このプラスミドは、Ｅ１およびＥ３領域が欠失したＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む。ｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０プラスミドの設計は、５’シス作用パッキング領域をＥ１遺伝子にさらに伸長し、ウイルスパッケージングを最適化するために重要であることが発見された要素をとりこみ、ウイルス増幅の増強をもたらすことによって、以前のアデノウイルスベクターより改良された。有利なことに、この増強されたアデノウイルスは、何度か継代増殖させた後でも遺伝子安定性を維持することができる。
【００６２】
ＤＮＡ構築物を調製および精製する分子生物学の標準的技術によって、本発明のアデノウイルス、シャトルプラスミドおよびＤＮＡ免疫原を調製することが可能である。
【００６３】
本発明によって、ヒト細胞において高レベルで発現するようにコドンが最適化された本明細書で説明した合成ｃＤＮＡ分子（配列番号１）は、対応する野生型配列よりも効率的に発現することが測定された。驚くべきことに、コドンを最適化したｈＣＥＡのｃＤＮＡは、野生型配列よりも効率的にｈＣＥＡに対する寛容を打破する。さらに、本明細書では、ｈＣＥＡｏｐｔはｈＣＥＡよりも免疫原性が高く、細胞性および体液性両方の免疫応答をより効果的に惹起することが示された。
【００６４】
したがって、前述のベクターは、異常なＣＥＡ発現に関連した腺癌の発症の予防および／または既存の癌の治療のための免疫原性組成物およびワクチンに使用することができる。本発明のベクターは、うまく形質転換した宿主生物において外来性ＣＥＡを高濃度に発現させることに伴う問題を排除し、ワクチン開発および商品化を可能にする。このために、本発明の１態様は、配列番号２に記載されているヒトＣＥＡ蛋白質をコードするヌクレオチドの配列を含むコドン最適化合成核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳類に投与することを含む癌の予防および治療方法である。
【００６５】
前述の方法によれば、該ワクチンベクターはいかなる哺乳類の癌の治療または予防のためにも投与することができる。本発明の好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。
【００６６】
さらに、当業者は説明した治療方法および予防方法で使用するための任意の形態のベクターを選択することができる。好ましくは、該ベクターはアデノウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。本発明の好ましい実施形態では、該ベクターはアデノウイルスＥ１領域中に欠失を有し、及びアデノウイルスＥ１領域中に挿入部分を有するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであり、前記挿入は、（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む発現カセットを含む。
【００６７】
本発明はさらに、Ｅ１領域中に欠失を有し、及びＥ１領域中に挿入部分を有するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターに関し、前記挿入は、（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む発現カセットを含む。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態では、該アデノウイルスベクターはＡｄ５ベクターである。
【００６９】
本発明の他の好ましい実施形態では、該アデノウイルスベクターはＡｄ６ベクターである。
【００７０】
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、該アデノウイルスベクターはＡｄ２４ベクターである。
【００７１】
他の態様では、本発明は、プラスミド部分と発現カセット部分とを含むワクチンプラスミドに関し、該発現カセット部分は、（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはその変種をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む。
【００７２】
本発明のある実施形態では、本明細書で開示した組換えアデノウイルスワクチンは、増強された免疫応答を誘導するため、プラスミドをベースとしたポリヌクレオチドワクチンによる様々な初期／追加免疫の組み合わせで使用される。この場合、この２種類のベクターが「初期および追加免疫」計画で投与される。たとえば、第１の種類のベクターを投与し、次に所与の時間を経た後、たとえば、２週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、６ヶ月後またはその他の適切な間隔を空けて、第２の種類のベクターを投与する。好ましくは、該ベクターは同一のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせをコードする発現カセットを有する。プラスミドＤＮＡもまた使用する実施形態では、該ベクターは哺乳類細胞または昆虫細胞によって認識される１種または複数のプロモーターを含有することが好ましい。好ましい実施形態では、該プラスミドは強力なプロモーターを含有し、たとえば、ＣＭＶプロモーターであるが、それだけに限定されない。該合成ヒトＣＥＡ遺伝子または発現すべきその他の遺伝子は、このようなプロモーターに結合される。このようなプラスミドの例は、前述のような哺乳類発現プラスミドＶ１Ｊｎｓである（本明細書に参照により組み込まれた、Ｊ．Ｓｈｉｖｅｒ他、ＤＮＡ Ｖａｃｃｈｉｎｅｓ、Ｍ．Ｌｉｕ他著、Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｎ．Ｙ．，７７２：１９８〜２０８（１９９６））。
【００７３】
前述のように、アデノウイルスベクターワクチンおよびプラスミドワクチンは、免疫応答を惹起する単一の治療計画の一部として脊椎動物に投与することができる。このために、本発明は、（ａ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはヒトＣＥＡ蛋白質変種をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む第１のベクターを哺乳類に導入すること、（ｂ）予め決定された時間経過させること、および（ｃ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはヒトＣＥＡ蛋白質変種をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む第２のベクターを該哺乳類に導入することを含む、前記哺乳類を癌から防御する方法に関する。
【００７４】
前述の防御方法の１実施形態において、第１のベクターはプラスミドであり、第２のベクターはアデノウイルスベクターである。他の実施形態では、第１のベクターはアデノウイルスベクターであり、第２のベクターはプラスミドである。
【００７５】
本発明はさらに、（ａ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはヒトＣＥＡ蛋白質変種をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む第１のベクターを哺乳類に導入すること、（ｂ）予め決定された時間経過させること、および（ｃ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはヒトＣＥＡ蛋白質変種をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む第２のベクターを該哺乳類に導入することを含む、腺癌に罹患した哺乳類を治療する方法に関する。
【００７６】
前述の治療方法の１実施形態において、第１のベクターはプラスミドであり、第２のベクターはアデノウイルスベクターである。他の実施形態では、第１のベクターはアデノウイルスベクターであり、第２のベクターはプラスミドである。
【００７７】
ワクチン受容体に導入すべき発現可能なＤＮＡまたは転写されたＲＮＡの量は、使用したプロモーターの強度および発現遺伝子産物の免疫原性に部分的に左右される。一般的に、免疫学的または予防的に有効な用量、約１ｎｇから１００ｍｇ、好ましくは約１０μｇから３００μｇのプラスミドワクチンベクターを直接筋肉組織に投与する。組換えアデノウイルスの有効量は、粒子約１０６個から１０１２個で、好ましくは約１０７個から１０１１個である。皮下注射、皮内注射、皮膚からの圧入およびその他の投与様式、たとえば、腹腔内、静脈内または吸入送達もまた企図される。追加免疫ワクチン接種を行うこともまた、企図される。本発明のワクチンの非経口的導入と同時に、またはその後で、アジュバント、たとえば、インターロイキン１２蛋白質を非経口的に、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下またはその他の投与手段で投与することもまた、有利である。
【００７８】
本発明のワクチンは、裸であること、すなわち、いかなる蛋白質、アジュバントまたは受容対象の免疫系に影響を与えるその他の薬剤を伴わないことが可能である。この場合、ワクチンベクターは生理学的に許容される溶液、たとえば、滅菌生理食塩水または滅菌緩衝生理食塩水に入れることが望ましい。あるいは、本発明のワクチンまたは免疫原組成物と共に免疫賦活剤、たとえば、アジュバント、サイトカイン、蛋白質、またはその他の担体を投与することが有利であり得る。したがって、本発明は、本発明の組成物および方法と組み合わせてこのような免疫賦活剤を使用することを含む。本明細書で使用した免疫賦活剤とは、外来抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞性）を増強または助長する本質的に任意の物質である。前記免疫賦活剤は、ＤＮＡまたは蛋白質の形態で投与することができる。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、破傷風毒素、ＩＬ１２、Ｂ７．１、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１を含むが、それだけに限定されない様々な免疫賦活剤はいずれも、本発明のワクチンおよび免疫組成物と組み合わせて使用することができる。前記免疫賦活剤は、当業界で周知である。
【００７９】
ＤＮＡの細胞による摂取を助ける薬剤、たとえば、それだけに限定されないがカルシウムイオンはまた、使用することができる。これらの薬剤は一般的に、トランスフェクションを容易にする試薬および薬剤として許容される担体のことである。当業者であれば、特定の免疫賦活剤または薬剤として許容される担体並びに適切な時間および投与様式を決定することができる。
【００８０】
本明細書で記載した刊行物は全て、本発明と関連づけて使用することが可能な方法および材料を記載し、開示するために参照により組み込まれる。本発明が先行技術の効力によってその開示が先行する資格を有していないことを許容したと解釈すべきでない。
【００８１】
添付した図面を参考にして、本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明はそれらの厳密な実施形態に限定されるのではなく、添付の特許請求の範囲で定義した本発明の範囲または精神を逸脱することなく、当業者が様々な変更および修正を実行できることを理解されたい。
【００８２】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、限定するものではない。
【実施例１】
【００８３】
コドン最適化ヒトＣＥＡ配列
完全なｈＣＥＡｏｐｔコーディング配列を合成して、ＢＩＯＮＥＸＵＳ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）によって構築した。５’末端に最適化したＫｏｚａｋ配列を有するｈＣＥＡｏｐｔｃＤＮＡは、ＰＣＲによって構築したオリゴヌクレオチドを使用して構築した。構築したｃＤＮＡは、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に挿入して、ｐＣＲ−ｈＣＥＡｏｐｔを得た。ｈＣＥＡｏｐｔｃＤＮＡの強度は、両鎖を配列決定することによって測定した。
【実施例２】
【００８４】
プラスミド構築物およびアデノウイルスベクター
ｐＶＩＪ／ｈＣＥＡｏｐｔ：プラスミドｐＣＲ−ｈＣＥＡｏｐｔは、ＥｃｏＲＩで３７℃で１時間消化した。得られた２１５６ｂｐ挿入物を精製して、プラスミドｐＶ１ＪｎｓＢのＥｃｏＲＩ部位にクローニングした（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ他、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２（９）：７７７〜８３（１９９３））。
【００８５】
ｐＶｌＪ／ｈＣＥＡ：プラスミドｐＣＩ／ｈＣＥＡ（Ｓｏｎｇ他、ＤＮＡをベースとしたワクチン接種および非ウイルス性サイトカイン遺伝子移入の組み合わせによるＴヘルパー１対Ｔヘルパー２活性の制御および腫瘍免疫の増強（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−１ ｖｅｒｓｕｓ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−２ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｎｖｉｒａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４８１〜４９２（２０００））は、ＥｃｏＲＩで消化した。得られた２１０９ｂｐ挿入物は、プラスミドｐＶ１ＪｎｓＡ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ他、前述）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【００８６】
Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ：プラスミドｐＣＲ−ｈＣＥＡｏｐｔは、ＥｃｏＲＩで消化した。得られた２１５６ｂｐ挿入物は、精製してｐｏｌｙＭＲＫ−Ａｄ５シャトルプラスミドのＥｃｏＲＩにクローニングした（本明細書に参照により組み込まれた、Ｅｍｉｎｉ他、ＷＯ０２／２２０８０参照）。
【００８７】
Ａｄ５／ＣＥＡ：Ａｄ５ベクターを生成するためのシャトルプラスミドｐＭＲＫ−ｈＣＥＡは、プラスミドｐＤｅｌｔａ ｓｐ１Ｂ／ｈＣＥＡをＳｓｐＩおよびＥｃｏＲＶで消化することによって得られた。次に、該９．５２ｋｂ断片は、プラスミドポリＭＲＫから得られた１２７２ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩで制限した、クレノウ処理生成物と連結した。ｈＣＥＡの発現カセットおよびＥ１隣接Ａｄ５領域を含有するｐＭＲＫ−ｈＣＥＡおよびｐＭＲＫ−ｈＣＥＡｏｐｔのＰａｃＩ／ＳｔｕＩ断片は、ＢＪ５１８３ Ｅ．コリ細胞においてＣｌａＩ直線化プラスミドｐＡｄ５に結合し直した。得られたプラスミドはそれぞれ、ｐＡｄ５−ｈＣＥＡおよびｐＡｄ５−ｈＣＥＡｏｐｔであった。両プラスミドをＰａｃＩで切断して、Ａｄ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を遊離し、ＰｅｒＣ−６細胞にトランスフェクトした。Ａｄ５ベクター増幅は、一連の手順によって実施した。ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡおよびＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔは、標準的なＣｓＣｌ勾配精製法によって精製し、Ａ１０５緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、スクロース ５％、０．００５ Ｔｗｅｅｎ ２０）によって集中的に透析した。
【実施例３】
【００８８】
ＣＥＡの発現および検出
プラスミドおよびＡｄベクターによるｈＣＥＡの発現は、ウエスタンブロット分析によってモニターした。プラスミドは、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によってＨｅｌａ細胞またはＰｅｒＣ．６細胞にトランスフェクトした。ＰｅｒＣ．６のアデノウイルス感染は、血清を含まない培地中で、３７℃で３０分間実施し、その後新鮮な培地を添加した。４８時間インキュベートした後、全細胞溶解物および培養上清を収集した。細胞溶解物中に存在するＣＥＡ蛋白質は、ウサギポリクローナル抗血清を使用したウエスタンブロット分析によって検出した。該蛋白質は、１８０ｋＤａから２００ｋＤａのバンドとして検出された。分泌型ＣＥＡは、Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｌｉｓａ ＣＥＡキット（ＤＢＣ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．，Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、細胞上清中および注射したマウス（注射後３日目）の末梢血中に検出された。
【実施例４】
【００８９】
マウスの免疫
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｌｅｃｃｏ、Ｉｔａｌｙ）から購入した。ＣＥＡ．ｔｇマウス（Ｈ−２ｂ）は、Ｊ．Ｐｒｉｍｕｓ（Ｖａｎｄｅｒｂｌｉｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から恵与され、標準的条件で維持した。既に記載されたように（Ｒｉｚｚｕｔｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（１１）：６４１７〜２２（１９９９））、プラスミドＤＮＡ ５０マイクログラムをマウスの大腿４頭筋に５０μｌの用量で電気注射した。Ａｄ注射は、５０μｌの用量でマウスの大腿４頭筋に実施した。体液性および細胞性免疫応答は、指定した時点で分析した。
【実施例５】
【００９０】
ｈＣＥＡのコドン最適化ｃＤＮＡはｈＣＥＡ発現を有意に増加させた。
【００９１】
ヒトＣＥＡ（ｈＣＥＡｏｐｔ）の合成遺伝子は、各アミノ酸（以後ａａ）残基についてヒトに好ましい（ヒト化）コドンを組み込むために設計した。コドン最適化ｃＤＮＡは、元々のクローンに対して７６．８％のヌクレオチド同一性を維持するように改変された（図１参照）。該コドン最適化ｃＤＮＡは、ｐＶ１Ｊベクター（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ他、前述）のＫｏｚａｋ最適化配列（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’、配列番号１３）の前、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）／イントロンＡプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）終止シグナルの制御下に配置してクローニングした。該構築物は、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ（実施例２参照）と命名した。さらに、アデノウイルス５型ベクターは、ＣＭＶ／イントロンＡプロモーターおよびＢＧＨ終止シグナルの隣接したｈＣＥＡｏｐｔ配列を有するように構築した（Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ）。比較のために、同等のプラスミドおよびＶ５ベクターは、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡおよびＡｄ５／ｈＣＥＡを生じる野生型ｈＣＥＡ配列を有するように構築した。コドン最適化ｃＤＮＡを含有するものと同様に、これらのベクターは、ＣＭＶ／ｉｎｔ Ａプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）終止シグナルの制御下に野生型遺伝子を有する。
【００９２】
プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞のウエスタンブロット分析では、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ構築物でトランスフェクトした細胞で検出された大きさと区別できない大分子量（１８０ｋＤａから２００ｌＤａ）の蛋白質が生じた。同様に、Ａｄ５／ｈＣＥＡまたはＡｄ５Ｈ７ｈ／ｈＣＥＡｏｐｔで感染させたＰｅｒＣ−６細胞溶解物で検出される蛋白質の大きさには、明らかな差は検出できなかった（データは示さなかった）。
【００９３】
ｈＣＥＡ発現に対するｈＣＥＡｏｐｔ発現の効率を比較するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０匹の群の大腿４頭筋に１ｘ１０７から１ｘ１０４ｐｆｕの範囲の様々な用量のＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔを注射した。注射して３日後に、ＣＥＡ蛋白質濃度を測定して、同用量のＡｄ５／ｈＣＥＡを注射した対照群の濃度と比較した。Ａｄ５／ｈＣＥＡを注射したマウスと比較してＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ １ｘ１０７ｐｆｕ（４８．２μｇ／ｌ）の注射では、ｈＣＥＡ濃度の相乗平均値の６倍の増加が認められたが、一方、同ウイルスを１ｘ１０６ｐｆｕ（１０．９μｇ／ｌ）で注射すると蛋白質濃度の１０倍の増加が認められた（図２Ａ）。対照的に、低用量のＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔを注射しても、Ａｄ５／ｈＣＥＡと比較して循環ＣＥＡ濃度の実質的な増加は生じなかった。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡと比較して、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐ、２５μｇまたは５０μｇを電気注射すると、たとえ低い範囲であっても、ＣＥＡ蛋白質濃度の増強がまた、示された（図２Ｂ）。したがって、これらの結果から、利用した遺伝子輸送媒体とは関係なく、コドン最適化ｃＤＮＡは対応する野生型配列よりも効果的に発現することが示された。
【実施例６】
【００９４】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ測定法
滅菌ＰＢＳで２．５μｇ／ｍｌに希釈した精製ラット抗マウスＩＦＮ−γ（ＩｇＧ１、Ｒ４−６Ａ２クローン、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）１００μｌ／ウェルで、９６ウェルＭＡＩＰプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）をコーティングした。ＰＢＳで洗浄後、プレートのブロックはＲ１０培地２００μｌ／ウェルで３７℃で２時間実施した。
【００９５】
脾細胞は、安楽死させたマウスから滅菌的に脾臓を取り出すことによって得た。脾臓破砕は、金属格子上で切断した脾臓をすりつぶすことによって実施した。細胞ペレットに０．１ＸＰＢＳ １ｍｌを添加し１５秒以上激しく撹拌して、浸透圧溶解することによって赤血球細胞を除去した。次に、２ＸＰＢＳ １ｍｌを添加し、１ＸＰＢＳで体積を４ｍｌにした。室温で１２００ｒｐｍで１０分間遠心することによって細胞をペレットにし、該ペレットをＲ１０培地１ｍｌに再懸濁した。生細胞をチュルク染色を使用して計数した。
【００９６】
脾細胞は、５ｘ１０５および２ｘ１０５細胞／ウェルで２連で播種し、各ペプチドの懸濁液１μｇ／ｍｌと共に３７℃で２０分間インキュベートした。各マウスの陽性内部対照としてコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を５μｇ／ｍｌで使用した。ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、測定用緩衝液で１：２５００に希釈したビオチン結合ラット抗マウスＩＦＮγ（ＲａｔＩｇＧ１、ＸＭＧ１．２クローン、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）５０μｇ／ウェルをプレートに入れて、４℃でＯ／Ｎインキュベートした。集中的に洗浄した後、プレートにＮＢＴ／Ｂ−ＣＩＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を添加して、スポットがはっきりと視認できるほどになるまで発色させた。蒸留水で徹底的にプレートを洗浄することによって反応を停止させた。プレートを空気乾燥して、次にスポットは自動化ＥＬＩＳＰＯＴ読み取り機を使用して計数した。
【実施例７】
【００９７】
細胞内サイトカイン染色
ＲＰＭＩ １０％ＦＣＳ １ｍｌに溶かした１００万個から２００万個のマウス脾細胞またはＰＢＭＣを、ペプチド収集物（各ペプチドの最終濃度５μｇから６μｇ／ｍｌ）およびブレフェルジンＡ（１μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５０２８／２３００ｋｋ）と共に、３７℃で５％ＣＯ２で１２時間から１６時間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ １％ ＦＢＳ、ＮａＮ３ ０．０１％）で洗浄して、精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２Ｆｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５３１４２）と共に４℃で１５分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄して、表面抗体、ＣＤ４−ＰＥ結合抗マウス（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５３０４９）、ＰｅｒｃＰ ＣＤ８結合抗マウス（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５３０３６）およびＡＰＣ−結合抗マウスＣＤ３ｅ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５３０６６）によって暗所で室温で３０分間染色した。洗浄後、細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ−Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５０２８／２３００ｋｋ）で暗所において４℃で２０分間透過させた。ＰｅｒｍＷａｓｈ溶液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５０２８／２３００ｋｋ）で洗浄した後、細胞をＩＦＮγ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共にインキュベートした。次に、細胞を洗浄して、ホルムアルデヒドの１％ＰＢＳ溶液で固定して、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーで、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して分析した。
【実施例８】
【００９８】
ＣＥＡ特異的Ｔ細胞を直接列挙するためのエピトープ含有ペプチドの同定および特徴付け
マウスにおいて、ＣＥＡに対する遺伝子ワクチンによって惹起された免疫応答をよりよく特徴付けるために、ＥＬＩＳＰＯＴ分析をＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスについて実施し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＥＡ特異的エピトープを同定した。このために、完全な蛋白質を網羅する個々のペプチドに対する応答の同定に利用できる強く免疫されたマウスの作製について、異なる免疫様式を比較した。プラスミドＤＮＡ初期免疫−Ａｄ追加免疫の様式を利用することによって、高濃度の細胞性免疫をウイルス抗原および細菌抗原に対して誘導することができることを示した最近の報告を考慮して、同様の免疫方法を本研究に使用した。異なる計画、ｉ）Ａｄ／ｈＣＥＡの１ｘ１０９ｖｐを２回投与（Ａｄ／Ａｄ）、ｉｉ）プラスミドｐ１Ｊ／ｈＣＥＡを２回投与（ＤＮＡ／ＤＮＡ）およびｉｉｉ）プラスミドＤＮＡ１回投与した後Ａｄ／ｈＣＥＡを投与（ＤＮＡ／Ａｄ）でマウスを筋肉内で免疫した。免疫間隔は、２週間とした。
【００９９】
異なる免疫計画によって惹起された細胞性免疫は、追加免疫２週間後にＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。異なるワクチン接種計画の免疫原効果を比較するために、１１個のａａが重複し、ａａ４９７から７０３を網羅した１５マーペプチドの収集物（プールＤ）を使用して、脾細胞の抗原特異的サイトカイン分泌を刺激した。ＳＦＣの高い相乗平均値によって示される最強の応答は、ＤＮＡ／Ａｄを注射した群のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスで認められた（図４）。したがって、この計画を利用して免疫応答をさらに分析した。
【０１００】
該免疫応答が、完全なＣＥＡ蛋白質に対して等しく分布するかどうかを測定するために、免疫したＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、完全な蛋白質配列を集合的に包含する１個から４個の１５マーペプチドの収集物によってインビトロで刺激した。各収集物は、１１個の残基によって重複するアミノ酸長１５個のペプチドから構成された。凍結乾燥したｈＣＥＡペプチドは、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに４０ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。プールＤに加えて、プールＡ（ａａ１から１４７）、Ｂ（ａａ１３７から２３７）およびＣ（ａａ３１７から５０７）を本研究で使用した。最終濃度は以下の通りである。プールＡ＝１．２ｍｇ／ｍｌ、プールＢ＝０．８９ｍｇ／ｍｌ、プールＣ＝０．８９ｍｇ／ｍｌｍプールＤ＝０．８ｍｇ／ｍｌ。ペプチドは−８０℃で保存した。
【０１０１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＤＮＡ／Ａｄワクチン接種計画によって惹起された免疫応答は、主に蛋白質のＣ末端領域に偏っていた（図５Ａ参照）。有意なＳＦＣ値はペプチドプールＣおよびＤで得られ（それぞれの相乗平均値、１７０および２４４ＳＦＣ／１０６脾細胞）、一方、プールＡおよびＢではかなり低い値が得られた（それぞれ、１０および２７ＳＦＣ／１０６脾細胞）。対照的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫応答は、プールＢで最も高いが（相乗平均値、１２３６ＳＦＣ／１０６脾細胞）、プールＡ、ＣおよびＤでは有意に高いＳＦＣ値が示された（それぞれ、９３、３６４および３４４）。関連のないペプチドのプールに対する応答は、いずれの群のマウスでも示されなかった（データは示さなかった）。
【０１０２】
応答を惹起するペプチド収集物に存在する個々のペプチドを同定するために、ＤＮＡ／Ａｄワクチン接種計画によって免疫した４種類のマウスの脾細胞を、有意な免疫応答が認められたプールを含む個々のペプチドそれぞれに対するＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ測定法で分析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞は、プールＣおよびＤに含まれるペプチド８０から１７３に対して調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞は、プールＢ、ＣおよびＤを含むペプチド３５から１７３に対して調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＥＡ特異的応答は、重複した配列を有する１５マーペプチドの４種類の組み合わせに位置づけた（ａａ４３１から４３５および４２５から４３９；５２９から５４３および５３３から５４７；５６５から５７９および５６９から５９３；６１３から６２７および６１７から６３１）（図６Ａ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＥＡに対する免疫応答は、２２個のペプチドに位置づけられ、そのウチの１７個は配列が重複している（ａａ２１３から２２７および２１３および２２７；２２９から２４３および２３３から２４７；４０９から４２３および４１３から４２７；４２１から４３５および４２５から４３９；５６５から５７９および５６９から５８３；５７３から５８７；６１３から６２７および６１７から６３１並びに６２１から６３５および６２５から６３９；６３７から６５１および６４１から６５５）（図６Ｂ）。
【０１０３】
選択したペプチド内に含有されるエピトープのＴ細胞特異性を確認するために、注射したマウスの脾細胞についてＩＦＮγ細胞内染色測定法を実施した。得られた結果を図７に示す。該データは、Ｔリンパ球の循環濃度を定量するために使用することができるＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウス両方について、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋特異的エピトープが同定されたことを示す。
【実施例９】
【０１０４】
コドンを最適化したｈＣＥＡ ｃＤＮＡは、ｈＣＥＡトランスジェニックマウスにおける寛容を打破する
コドンを最適化したｈＣＥＡのｃＤＮＡの増強された免疫原性がヒトＣＥＡに対する寛容を効果的に打破するかどうかを測定するために、ｈＣＥＡトランスジェニックマウスを野生型またはコドン最適化ｈＣＥＡ配列のいずれかを有するベクターで免疫した。これらのトランスジェニックマウスは、完全なヒトＣＥＡ遺伝子および隣接配列を有し、盲腸および結腸においてｈＣＥＡ蛋白質を発現する。したがって、このマウス系は、この腫瘍の自己抗原を対象とする免疫治療計画の安全性および効率を研究するための有用なモデルである（Ｃｌａｒｋｅ他、「免疫治療のモデルとしてのヒトＣＥＡ遺伝子組換えマウス（Ｍｉｃｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＣＥＡ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４６９〜７７（１９９８））。
【０１０５】
第１の試験として、トランスジェニックマウス１０匹のうち５匹にプラスミドＤＮＡ５０μｇを４回電気注射し、次いで最終的にアデノウイルス１ｘ１０１０ｐｐを注射した。ｈＣＥＡに対する免疫応答は、注射したマウス４匹から収集した脾細胞についてＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ測定を行うことによって分析した。ｈＣＥＡに対する免疫応答は、ｈＣＥＡｏｐｔｃＤＮＡで免疫したマウスの脾細胞のみで検出された（図８参照）。該免疫応答は、ペプチド１４３およびプールＤで検出されたので、免疫によってＣ末端エピトープに対する有意なＣＤ８＋応答が惹起されたことが示唆された。
【０１０６】
ｈＣＥＡのコドン最適化ｃＤＮＡの増強された免疫原性はまた、アデノウイルスベクター１ｘ１０１０ｐｐを２週間間隔で２回注射したトランスジェニックマウスで試験した。ＣＥＡ特異的免疫応答は、４種類の免疫マウスから収集したＰＢＭＣをＩＦＮγ細胞内染色することによって測定した。ｈＣＥＡに対する免疫応答は、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔで免疫したマウスのみに検出された（図９）。ＤＮＡおよびＡｄコホートで認められたように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導はペプチドプールＤで検出されたが、有意なＣＤ８＋応答はまた、ペプチドプールＡで示された。したがって、これらの結果は、ｈＣＥＡのコドン最適化ｃＤＮＡは、野生型配列よりも免疫原性が高く、ｈＣＥＡに対する寛容を効率的に打破することを示す。
【実施例１０】
【０１０７】
抗体検出および力価測定
抗体力価測定用の血清は、眼窩後方出血によって得られた。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐＴＭ）は、ＣＥＡ蛋白質１００ｎｇ／ウェルでコーティングして（高純度ＣＥＡ、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｉｒｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ ＭＡ）でコーティングして、コーティング緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４）で希釈して、４℃でＯ／Ｎインキュベートした。次に、プレートを５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで３７℃で１時間ブロックした。マウス血清は、ＰＢＳ５％ＢＳＡ（血清転換率の評価には１／５０の希釈度、力価測定には１：１０から１：３１２１５０までの希釈度）で希釈した。予備免疫血清は、背景として使用した。希釈した血清は、４℃でＯ／Ｎインキュベートした。洗浄は、ＰＢＳ１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で実施した。２次抗体（ヤギ抗マウス、ＩｇＧペルオキシダーゼ、Ｓｉｇｍａ）は、ＰＢＳ、５％ＢＳＡで１／２０００に希釈して、室温で２時間から３時間、振盪機上でインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質１００μｌ／ウェル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で発色させた。該反応は、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液２５μｌ／ウェルで停止し、プレートは４５０ｎｍ／６２０ｎｍで読み取った。抗ＣＥＡ血清力価は、同じ希釈度の自己由来予備免疫血清の吸収より少なくとも３倍大きな吸収を生じる血清の限界希釈の逆数として算出した。
【実施例１１】
【０１０８】
ｈＣＥＡｏｐｔの高い免疫原性
野生型およびコドン最適化ＣＥＡ発現ベクターによって誘導されるインビボでの免疫応答を調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１ｘ１０５から１ｘ１０３ｐｆｕの範囲の様々な用量のＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔを筋肉内注射して免疫した。マウスに３週間間隔で２回注射を行った。２回目の免疫を行ってから２週間後に脾細胞を各マウスから単離した。アデノウイルスによる免疫によって生じるＩＦＮγ分泌型ＣＥＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞前駆体発生頻度を定量するために、Ｈ−２ｂ制限Ｔ細胞エピトープＣＧＩＱＮＳＶＳＡ（配列番号１４、以下参照）についてＥＬＩＳＰＯＴ測定法を使用した。１ｘ１０４ｐｆｕで免疫すると、測定可能な免疫応答を惹起し、ＣＧＩＯＮＳＶＳＡエピトープ（配列番号１４）に特異的な５３個のＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ、相乗平均値）が生じたが、一方１ｘ１０３ｐｆｕの注射ではごくわずかなＳＦＣ値しか惹起しなかった（図３Ａ）。Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ １ｘ１０５ｐｆｕで免疫した群において、ＳＦＣは３０２個まで増加した。対照的に、１ｘ１０６ｐｆｕの用量で免疫したマウスの群において、ＳＦＣを１６８まで増加させる有意なＣＤ８Ｔ−細胞前駆体頻度を惹起するために、Ａｄ５／ｈＣＥＡは少なくとも１ｘ１０５ｐｆｕ必要であった。ペプチド特異的ＩＦＮγＳＦＣは、Ａｄ５免疫マウスでは検出されなかった（データは示さなかった）。
【０１０９】
それぞれのｈＣＥＡアデノウイルスベクター１ｘ１０５ｐｆｕで免疫したマウスの血清は、基質として精製ヒトＣＥＡ蛋白質を使用してＥＬＩＳＡで試験した。Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔで免疫したマウスのＣＥＡ特異的抗体の力価は、免疫したマウス全てにおいて検出され、Ａｄ力価の相乗平均値は４６４７４であった。対照的に、Ａｄ５／ｈＣＥＡ免疫群は、ＣＥＡ特異的抗体の約１００倍低い相乗平均力価を示した（４５４）。したがって、これらの結果は、ＣＥＡのコドン最適化ｃＤＮＡは細胞性および体液性免疫応答をより効率的に惹起することを示す。
【実施例１２】
【０１１０】
統計解析
指示した場合は、結果はスチューデントｔ検定によって解析した。ｐ値＜０．０５は、有意とみなされた。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】野生型ヒトＣＥＡｃＤＮＡ（配列番号３）およびコドン最適化クローン（ｈＣＥＡｏｐｔ、配列番号１）のヌクレオチド配列を示す図である。推定アミノ酸配列を上部に示す（配列番号２）。合成コドン最適化ｃＤＮＡの置換ヌクレオチドをｈＣＥＡｃＤＮＡ配列の下に示す。実施例２参照。
【図１Ａ】野生型ヒトＣＥＡｃＤＮＡ（配列番号３）およびコドン最適化クローン（ｈＣＥＡｏｐｔ、配列番号１）のヌクレオチド配列を示す図である。推定アミノ酸配列を上部に示す（配列番号２）。合成コドン最適化ｃＤＮＡの置換ヌクレオチドをｈＣＥＡｃＤＮＡ配列の下に示す。実施例２参照。
【図１Ｂ】野生型ヒトＣＥＡｃＤＮＡ（配列番号３）およびコドン最適化クローン（ｈＣＥＡｏｐｔ、配列番号１）のヌクレオチド配列を示す図である。推定アミノ酸配列を上部に示す（配列番号２）。合成コドン最適化ｃＤＮＡの置換ヌクレオチドをｈＣＥＡｃＤＮＡ配列の下に示す。実施例２参照。
【図２Ａ】注射したマウスにおけるｈＣＥＡの発現を示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０匹の群において、様々な用量のＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡおよびＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ（パネルＡ）または２５マイクログラムもしくは５０マイクログラムのプラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡおよびｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ（パネルＢ）のいずれかを大腿４頭筋に注射した。注射して３日後に血液試料を収集し、ＣＥＡ濃度を測定した。塗りつぶされた三角形は個々のマウスのＣＥＡ測定値を表す。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。
【図２Ｂ】注射したマウスにおけるｈＣＥＡの発現を示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０匹の群において、様々な用量のＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡおよびＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ（パネルＡ）または２５マイクログラムもしくは５０マイクログラムのプラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡおよびｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ（パネルＢ）のいずれかを大腿４頭筋に注射した。注射して３日後に血液試料を収集し、ＣＥＡ濃度を測定した。塗りつぶされた三角形は個々のマウスのＣＥＡ測定値を表す。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。
【図３Ａ】コドン最適化がヒトＣＥＡに対する免疫応答を増強することを示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス８匹の群において、様々な用量のＭＲＫＡｄ５−ｈＣＥＡおよびＭＲＫＡｄ５−ｈＣＥＡｏｐｔのいずれかを大腿４頭筋に注射した。ウイルス注射は、０日目と２１日目に実施した。パネルＡ。追加免疫注射の２週間後に、ａａ５６９から５８３を含みＣＤ８＋エピトープを含むペプチド１４３を使用したＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、個々のマウスの脾細胞でｈＣＥＡに特異的なＣＤ８＋ＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数を測定した（塗りつぶされた三角形）。２種類の異なる量の脾細胞（２．５ｘ１０５および５ｘ１０５）で、脾細胞のそれぞれの試験料について２回反復した。平均値は、ペプチド無しで測定した背景濃度を差し引くことによって算出し（一般的に１０ＳＦＣ／１０６全脾細胞）、結果はＳＦＣの数／１０６全脾細胞として表した。個々のマウスの値（塗りつぶされた三角形）および相乗平均値（塗りつぶされた丸）を示した。パネルＢ。個々のマウスの血清中の抗ＣＥＡ抗体力価（塗りつぶされた三角形）は、追加免疫１０日後の血清試料を使用して測定した。相乗平均力価（ＧＭＴ）（塗りつぶされた丸）もまた示す。Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔはＡｄ／ｈＣＥＡと有意に異なる。
【図３Ｂ】コドン最適化がヒトＣＥＡに対する免疫応答を増強することを示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス８匹の群において、様々な用量のＭＲＫＡｄ５−ｈＣＥＡおよびＭＲＫＡｄ５−ｈＣＥＡｏｐｔのいずれかを大腿４頭筋に注射した。ウイルス注射は、０日目と２１日目に実施した。パネルＡ。追加免疫注射の２週間後に、ａａ５６９から５８３を含みＣＤ８＋エピトープを含むペプチド１４３を使用したＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、個々のマウスの脾細胞でｈＣＥＡに特異的なＣＤ８＋ＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数を測定した（塗りつぶされた三角形）。２種類の異なる量の脾細胞（２．５ｘ１０５および５ｘ１０５）で、脾細胞のそれぞれの試験料について２回反復した。平均値は、ペプチド無しで測定した背景濃度を差し引くことによって算出し（一般的に１０ＳＦＣ／１０６全脾細胞）、結果はＳＦＣの数／１０６全脾細胞として表した。個々のマウスの値（塗りつぶされた三角形）および相乗平均値（塗りつぶされた丸）を示した。パネルＢ。個々のマウスの血清中の抗ＣＥＡ抗体力価（塗りつぶされた三角形）は、追加免疫１０日後の血清試料を使用して測定した。相乗平均力価（ＧＭＴ）（塗りつぶされた丸）もまた示す。Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔはＡｄ／ｈＣＥＡと有意に異なる。
【図４Ａ】異なる免疫計画の比較を示した図である。プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ（５０μｇ／大腿４頭筋に電気注射した用量）およびＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡ（１ｘ１０９ｐｐ／用量）の様々な組み合わせで、Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ）またはＢＡＬＢ／ｃ（Ｂ）マウスの群を免疫した。個々のマウスの脾細胞におけるＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数は、材料および方法および図３の凡例で説明したようにａａ４９７から７０３（プールＤ）に亘るペプチドのプールを使用して測定した。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。Ｄ／ＤおよびＤ／Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＡｄ／Ａｄ群と有意に異なる。３群は全て、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて有意に異なる。
【図４Ｂ】異なる免疫計画の比較を示した図である。プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ（５０μｇ／大腿４頭筋に電気注射した用量）およびＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡ（１ｘ１０９ｐｐ／用量）の様々な組み合わせで、Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ）またはＢＡＬＢ／ｃ（Ｂ）マウスの群を免疫した。個々のマウスの脾細胞におけるＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数は、材料および方法および図３の凡例で説明したようにａａ４９７から７０３（プールＤ）に亘るペプチドのプールを使用して測定した。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。Ｄ／ＤおよびＤ／Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＡｄ／Ａｄ群と有意に異なる。３群は全て、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて有意に異なる。
【図５Ａ】ｈＣＥＡ蛋白質の選択領域に対するＴ細胞応答のマッピングの結果を示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６（パネルＡ）またはＢＡＬＢ／ｃ（パネルＢ）マウスの群は、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡで免疫し、３週間後にＡｄ／ｈＣＥＡ １ｘ１０９で追加免疫した。個々のマウスの脾細胞におけるＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数は、材料および方法および図３の凡例で説明したように、完全な蛋白質を網羅したペプチドのプールを使用して追加免疫の２週間後に測定した。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。
【図５Ｂ】ｈＣＥＡ蛋白質の選択領域に対するＴ細胞応答のマッピングの結果を示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６（パネルＡ）またはＢＡＬＢ／ｃ（パネルＢ）マウスの群は、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡで免疫し、３週間後にＡｄ／ｈＣＥＡ １ｘ１０９で追加免疫した。個々のマウスの脾細胞におけるＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数は、材料および方法および図３の凡例で説明したように、完全な蛋白質を網羅したペプチドのプールを使用して追加免疫の２週間後に測定した。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。
【図６Ａ】ｈＣＥＡの免疫応答ペプチドの同定を示した図である。４匹の免疫したＣ５７／ＢＬ／６（パネルＡ）またはＢＡＬＢ／ｃ（パネルＢ）マウスから収集した脾細胞の指定したペプチドそれぞれに対するＩＦＮγ分泌について、ＥＬＩＳＰＯＴ測定法を使用して測定した（実施例８参照）。
【図６Ｂ】ｈＣＥＡの免疫応答ペプチドの同定を示した図である。４匹の免疫したＣ５７／ＢＬ／６（パネルＡ）またはＢＡＬＢ／ｃ（パネルＢ）マウスから収集した脾細胞の指定したペプチドそれぞれに対するＩＦＮγ分泌について、ＥＬＩＳＰＯＴ測定法を使用して測定した（実施例８参照）。
【図７】Ｃ５７ＢＬ／６マウス（パネルＡ）およびＢＡＬＢ／ｃマウス（パネルＢ）におけるＣＥＡのペプチドを含有するエピトープの配列を示した図である（実施例ｘｘ参照）。右に挙げたのは、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋（ＣＤ４＋）ＣＤ３＋細胞の割合である。
【図８】実施例９で説明したような免疫したＣＥＡトランスジェニックマウスのＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ測定法から得られた結果を示した図である。マウスは、１週間間隔でプラスミドＤＮＡを４回電気注射し、さらにアデノウイルス注射を１回行って免疫した。各免疫原について、３回注射したマウスから収集した脾細胞でデータを採った。ＣＤ８特異的応答は、ペプチド１４３を使用して測定した。
【図９】免疫したＣＥＡ．ｔｇマウスのＩＦＮγ細胞内染色を示した図である。マウスは、２週間間隔でアデノウイルス１ｘ１０１０ｖｐを２回注射して免疫した。３回注射したマウスから収集した脾細胞で得られたデータを示す。右に挙げたのは、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋細胞の割合である。
【図１０Ａ】パネルＡは、配列番号１５で表したアンカードメインを切断したＣＥＡ変種をコードするコドン最適化ＤＮＡ分子の例を示した図である。ｈＣＥＡｏｐｔ−ΔＡＤの対応するアミノ酸配列をパネルＢに示す（配列番号１６）。
【図１０Ｂ】パネルＡは、配列番号１５で表したアンカードメインを切断したＣＥＡ変種をコードするコドン最適化ＤＮＡ分子の例を示した図である。ｈＣＥＡｏｐｔ−ΔＡＤの対応するアミノ酸配列をパネルＢに示す（配列番号１６）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に癌の治療に関する。より具体的には、本発明は、本明細書でｈＣＥＡｏｐｔと称するヒト腫瘍関連癌胎児抗原をコードする合成ポリヌクレオチドに関し、該ポリペプチドはヒト細胞環境で発現するためにコドンが最適化されている。本発明はまた、組換えベクターおよび前記合成ポリヌクレオチドを含む宿主を提供する。本発明はまた、ｈＣＥＡｏｐｔを有するアデノウイルスベクターおよびプラスミド構築物並びに癌の予防および治療のためのワクチンにおけるそれらの使用並びに医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、様々な機能を備えた蛋白質をコードする数多くの遺伝子から構成され、その機能の１つが細胞間接着である。ＩｇＳＦ蛋白質は、適切な分子間結合相互作用を維持するために重要なＩｇ関連ドメインを少なくとも１つ含有する。このような相互作用は、ＩｇＳＦ構成要素の様々な生物学的機能に不可欠なので、多くのＩｇＳＦ接着分子の破壊または異常発現は、多くのヒト疾患と相関してきた。
【０００３】
癌胎児抗原（ＣＥＡ）は、細胞表面糖蛋白質を構成するＩｇスーパーファミリーに属する。ＣＥＡサブファミリーの構成要素は、ＣＥＡ関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）として知られている。最近の科学文献では、ＣＥＡ遺伝子はＣＥＡＣＡＭ５と改名されたが、蛋白質の名称はＣＥＡのままである。機能的には、ＣＥＡＣＡＭはホモタイプおよびヘテロタイプ両方の細胞間接着分子として作用することが示された（Ｂｅｎｃｈｉｍｏｌ他、Ｃｅｌｌ ５７：３２７〜３３４（１９８９））。細胞接着に加えて、ＣＥＡは細胞外マトリックスからの細胞脱離によって生じる細胞死を阻害し、Ｂｃｌ２およびＣ−Ｍｙｃなどのある種のプロトオンコジーンに関連した細胞形質転換の一因となり得る（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２０（８）：２１９７〜２２０７参照）。
【０００４】
ＣＥＡの正常な発現は、胎児の発育中および成人結腸粘膜で検出された。ＣＥＡ過剰発現は、３０年以上前にヒト結腸癌において最初に検出され（Ｇｏｌｄ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄｍａｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２１：４３９〜４６２（１９６５））、その後ほとんど全ての結腸直腸癌で見いだされてきた。さらに、ＣＥＡ過剰発現は、膵臓、胸および肺の腺癌の高い割合で検出可能である。これらの種類の腫瘍ではＣＥＡ発現が一般的なので、ＣＥＡはこれらの癌の管理および予後において広く臨床的に使用されている。
【０００５】
ヒトＣＥＡをコードする配列は、クローニングされ、特徴付けられている（米国特許第５２７４０８７号、米国特許第５５７１７１０号および米国特許第５８４３７６１号。Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：３２２１〜３２３０（１９８７）、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：９２０〜９２４（１９８７）。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（９）：２９６５〜６９（１９８７））。
【０００６】
ＣＥＡ発現と転移増殖との間の相関関係によって、結腸直腸癌治療のための分子的および免疫学的介入の標的としての存在価値が引き出された。ＣＥＡを標的とする１つの治療的取り組みは、抗ＣＥＡ抗体の使用であり（Ｃｈｅｓｔｅｒ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ８〜Ｓ１２（２０００）参照）、もう１つはＣＥＡをベースとしたワクチンを使用してＣＥＡ発現腫瘍を攻撃する免疫系を活性化することである（概説としてはＢｅｒｉｎｓｔｅｉｎ、前述参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
多くのワクチンの開発および商品化は、宿主生物をうまく形質転換する外来遺伝子を高い発現濃度で獲得するのに伴う困難さのために、妨げられている。したがって、前述のＣＥＡ蛋白質をコード化する野生型ヌクレオチド配列が同定されたにも関わらず、効率的で、自己寛容によって妨害されない癌ワクチンの開発が可能になる、企図する宿主細胞で発現するために最適化されたＣＥＡをコードするヌクレオチド配列を利用するヒトＣＥＡ蛋白質の容易に再生可能な材料を開発することが強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、直腸結腸癌を含めた数多くの腺癌に関連してきたＣＥＡ遺伝子によって発現した蛋白質生成物に対する免疫を惹起するか、または増強する組成物および方法に関する。具体的に、本発明は、ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドはヒト細胞において高レベルで発現するようにコドンが最適化されている。本発明はさらに、合成ポリヌクレオチドを含むアデノウイルスベクターおよびプラスミドをベースとしたベクターを提供し、ＣＥＡに関連した癌を予防し、かつ／または治療するための免疫原性組成物およびワクチンにおける前記ベクターの使用を開示する。
【０００９】
本発明はまた、配列番号２に記載されているヒト癌胎児抗原（以後ｈＣＥＡ）をコードするヌクレオチドの配列を含む合成核酸分子（ポリヌクレオチド）に関し、前記合成核酸分子は、ヒト細胞において高レベルで発現するようにコドンが最適化されている（以後、ｈＣＥＡｏｐｔ）。本明細書で開示された核酸分子は、選択した宿主細胞にトランスフェクトすることができ、該組換え宿主細胞は、十分な濃度で機能的ｈＣＥＡ蛋白質（配列番号２）を発現させるための原料となる。
【００１０】
本発明はさらに、ヒトＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする合成核酸分子に関し、このＤＮＡ分子は本明細書で配列番号１として開示したヌクレオチド配列を含む。本発明のこの部分の好ましい態様は、ｈＣＥＡ蛋白質（配列番号２または配列番号１６）をコードするＤＮＡ分子（配列番号１）を示す図１に開示される。本発明の好ましい核酸分子は、ヒト細胞において高レベルで発現するようにコドンが最適化されている。
【００１１】
本発明の他の好ましいＤＮＡ分子は、ヒト完全長ＣＥＡ（配列番号２）のアミノ酸約６７９からアミノ酸約７０２に位置するＣ末端アンカードメイン（ＡＤ）が欠失したヒトＣＥＡをコードするヌクレオチドの配列を含み、ヌクレオチドの前記配列はヒト細胞において高レベルで発現するようにコドンが最適化されている。アンカードメインを切断されたＣＥＡ変種をコードするＤＮＡ分子の例を図１５に示す（図１０Ａを参照）。ｈＣＥＡ−ΔＡＤの対応するアミノ酸配列は、配列番号１６に記載する（図１０Ｂを参照）。
【００１２】
本発明はまた、この明細書を通じて開示した核酸分子を含有する組換えベクター、並びに原核細胞および真核細胞両方の組換え宿主細胞に関する。
【００１３】
本発明はさらに、（ａ）配列番号１または配列番号１５で表した核酸分子を含むベクターを適切な宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記コドン最適化ヒト蛋白質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞におけるコドン最適化ヒトＣＥＡ蛋白質の発現方法に関する。
【００１４】
本発明の他の態様は、合成核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳類に投与することを含む癌の予防または治療方法であり、該合成核酸分子は配列番号２または配列番号１６で表したヒト癌胎児抗原（ｈＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチドの配列を含み、該合成核酸分子はヒト細胞において高濃度に発現するようにコドンが最適化されている。
【００１５】
本発明はさらに、Ｅ１領域に欠失を有し、及びＥ１領域に挿入部分を有するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターに関し、前記挿入部分は、（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、（ｂ）ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む発現カセットを含む。
【００１６】
本発明はまた、プラスミド部分と発現カセット部分とを含むワクチンプラスミドに関し、該発現カセット部分は、（ａ）ヒト細胞において最適に発現させるためにコドンを最適化した、ヒトＣＥＡ蛋白質をコードする合成ポリヌクレオチドと、（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む。
【００１７】
本発明の他の態様は、（ａ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターを含む第１のベクターを哺乳類に導入すること、（ｂ）予め決定された時間経過させること、および（ｃ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドおよび（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターを含む第２のベクターを該哺乳類に導入することを含む、前記哺乳類を癌から予防もしくは癌を治療するか、またはＣＥＡに関連した癌に罹患した前記哺乳類を治療する方法である。
【００１８】
明細書および添付の特許請求の範囲を通じて使用したように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明白に別段の指定がない限り、複数を指すことを含む。
【００１９】
明細書および添付の特許請求の範囲を通じて使用したように、以下の定義および略語を適用する。
【００２０】
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ鎖の認識部位のことである。該プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼとの開始複合体を形成し、転写活動を開始し、推進する。該複合体は、「エンハンサー」と称する活性化配列または「サイレンサー」と称する阻害配列によって変更することができる。
【００２１】
「カセット」という用語は、発現させるべき核酸配列を含有する本発明の配列のことである。該カセットは、カセットテープの概念と同じで、各カセットは独自の配列を有する。したがって、カセットを交換することによって、ベクターは異なる配列を発現する。５′および３′末端に制限部位があるために、該カセットは容易に挿入したり、除去したり、他のカセットで置換したりすることができる。
【００２２】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片を宿主生物または宿主組織に導入することができるいくつかの手段を意味する。ベクターには、プラスミド、（アデノウイルスを含む）ウイルス、バクテリオファージおよびコスミドを含む様々な種類がある。
【００２３】
アデノウイルスベクターに関して使用したような「第１世代」という用語は、複製に欠陥のある前記アデノウイルスベクターを意味する。一般的に、第１世代アデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子領域が欠失しているか、または不活性化しており、好ましくはＥ３遺伝子領域が欠失しているか、または不活性化している。
【００２４】
「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ」という呼称は、イントロンＡを有するヒトＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター、完全長コドン最適化ヒトＣＥＡ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化配列および転写終止配列並びに最小ｐＵＣ主鎖を含む、本明細書で開示したプラスミド構築物である（実施例２参照）。前述のように、「ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ」という呼称は、構築物がコドン最適化ヒトＣＥＡ遺伝子の代わりに野生型ヒトＣＥＡ遺伝子を含むこと以外は前述のような構築物を意味する。
【００２５】
「ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ」および「ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡ」という呼称は、Ｅ１およびＥ３領域に欠失があるＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む、本明細書で開示した２種類の構築物を意味する。「ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ」構築物においては、Ｅ１領域は、イントロンＡを含まないヒトＣＭＶプロモーターの制御下でＥ１と平行したコドン最適化ヒトＣＥＡ遺伝子およびそれに続くウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって置換されている。「ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡ」構築物は、Ａｄ５ゲノムのＥ１領域が野生型ヒトＣＥＡ配列と置換していること以外は、本質的に前述の通りである（実施例２参照）。
【００２６】
「有効量」という用語は、免疫応答を生じるように、十分なワクチン組成物が適切な濃度のポリペプチドの産生を誘導することを意味する。当業者は、この濃度は変化し得ることを承知している。
【００２７】
「保存的アミノ酸置換」とは、１個のアミノ酸残基がもう１個の化学的に類似したアミノ酸残基によって置換されることを意味する。このような保存的置換の例は、１疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）と他の残基との置換、１極性残基と電荷が同じ他の１極性残基との置換（たとえば、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸）である。
【００２８】
「ｈＣＥＡ」は、ヒト癌胎児抗原を意味し、「ｈＣＥＡｏｐｔ」は、コドン最適化ヒト癌胎児抗原を意味する。
【００２９】
「ｈＣＥＡ−ΔＡＤ」という用語は、ヒト完全長ＣＥＡ（配列番号２）のアミノ酸約６７９からアミノ酸約７０２に位置するＣ末端アンカードメイン（ＡＤ）を欠失したヒトＣＥＡの変種を意味する。本発明のｈＣＥＡ−ΔＡＤをコードするヌクレオチド配列は、ヒト細胞環境において高レベルで発現するようにコドンが最適化されている（本明細書では、ｈＣＥＡｏｐｔ−ΔＡＤ”と称する）。アンカードメインを切断されたＣＥＡ変種をコードするＤＮＡ分子の例を図１５に示す（図１０Ａを参照）。ｈＣＥＡ−ΔＡＤの対応するアミノ酸配列は配列番号１６に記載する（図１０Ｂを参照）。ｈＣＥＡ−ΔＡＤをコードするヌクレオチドは、癌の治療および／または予防のための癌ワクチンの開発に有用である。
【００３０】
「哺乳類」という用語は、人類を含めた任意の哺乳類を意味する。
【００３１】
略語「Ａｇ」は、抗原のことである。
【００３２】
略語「Ａｂ」は抗体を意味し、「ｍＡｂ」はモノクローナル抗体を意味する。
【００３３】
略語「ＯＲＦ］は、遺伝子のオープンリーディングフレームを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
癌胎児抗原（ＣＥＡ）は通常、腺癌の発症に関連する。本発明は、異常なＣＥＡ発現が癌または癌の発症に関連するＣＥＡ腫瘍関連抗原によって発現した蛋白質生成物に対する免疫を惹起するか、または高める組成物および方法に関する。異常なＣＥＡ発現は腫瘍開始時に存在し、腫瘍進行後まで検出されなくてもよく、その逆であってもよいので、異常なＣＥＡ発現と癌との関連には、ＣＥＡ蛋白質が腫瘍組織において、その発症の全ての時点において発現されていることは必要ではない。
【００３５】
このために、ヒトＣＥＡ蛋白質をコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。好ましい実施形態ではヒト細胞である計画した宿主細胞に好まれるコドンを使用するように、合成分子のコドンを設計する。抗体の中和および細胞性免疫によって、ＣＥＡ関連癌に対する効果的な免疫予防を提供する組換えアデノウイルスワクチンまたはプラスミドをベースとしたワクチンを開発するために、該合成分子を使用することができる。該合成分子は、免疫原組成物として使用することができる。本発明は、霊長類およびヒトなどの哺乳類を含めた脊椎動物に直接インビボで導入すると、該動物でコード化された蛋白質の発現を誘導するポリペプチドを提供する。
【００３６】
野生型ヒトＣＥＡヌクレオチド配列は報告されている（たとえば、米国特許第５２７４０８７号、米国特許第５５７１７１０号および米国特許第５８４３７６１号参照）。本発明は、ヒトＣＥＡ蛋白質をコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。本発明の合成分子は、いくつかはヒト細胞によって好まれるコドンを使用するように変更されており、したがってヒト宿主細胞においてＣＥＡを高濃度で発現することが可能であるヌクレオチドの配列を含む。該合成分子は、抗体の中和および細胞性免疫によってＣＥＡ関連癌に対する効果的な免疫予防を提供する癌ワクチンで使用することができる、ＣＥＡ蛋白質の材料として使用することができる。
【００３７】
４種類の可能なヌクレオチド塩基の「３連」コドンは、６０個を上回る変種の形で存在することが可能である。これらのコドンは、異なるアミノ酸２０個（および転写開始および終止）のみの情報を提供するので、いくつかのアミノ酸は、複数のコドンによってコードされることが可能で、コドン重複として公知の現象である。完全には理解されていない理由のために、他のコドンは異なる種類の細胞の内在ＤＮＡに均一に存在することはない。実際に、ある種の細胞においてある種のコドンには様々な天然の階層または「選択性」が存在するようである。１例として、アミノ酸ロイシンはＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡおよびＴＴＧを含めた６種類のＤＮＡコドンのいずれかによって特定される。微生物のゲノムコドン出現頻度の徹底的な分析によって、Ｅ．コリの内在性ＤＮＡは極めて一般的に、ＣＴＧロイシン指定コドンを含有し、一方酵母および粘菌のＤＮＡは極めて一般的にＴＴＡロイシン指定コドンを含むことが明らかになった。この階層的観点から、Ｅ．コリ宿主によってロイシンリッチなポリペプチドの高濃度発現が得られる可能性は、使用したコドンの頻度にある程度左右されることが一般に信じられている。たとえば、ＴＴＡコドンに富んだ遺伝子はＥ．コリでは十分に発現せず、一方ＣＴＧに富んだ遺伝子はおそらくこの宿主で高く発現するようである。同様に、酵母宿主細胞でロイシンに富んだポリペプチドの発現に好まれるコドンはＴＴＡである。
【００３８】
組換えＤＮＡ技術に対するコドン選択現象の意味は一目瞭然で、該現象によって、形質転換が成功した宿主生物において外来遺伝子の高濃度発現を実現できなかったかつての多くの失敗を説明することができ、あまり「好ましくない」コドンを挿入遺伝子内に反復して存在させて、宿主細胞の発現機構をあまり効率よく作動できないようにすることが可能である。この現象は、計画した宿主細胞に好まれるコドンを含むように設計された合成遺伝子は、組換えＤＮＡ技術を実施するために最適な形態の外来遺伝子材料となることを示唆する。したがって、本発明の１態様は、ヒト細胞で発現するためにコドンを最適化したヒトＣＥＡ遺伝子である。本発明の好ましい実施形態では、同じ蛋白質配列をコードする他のコドンを使用することによって、ヒト細胞における外来ＣＥＡ蛋白質発現の制約を取り除くことができることが見いだされた。
【００３９】
本発明によれば、本明細書に参照により組み込まれた、Ｌａｔｈｅの「アミノ酸配列データから推測されたオリゴヌクレオチドプローブ：理論および実際の考察（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ」Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８３：１〜１２（１９８５）に記載されたように、ヒトＣＥＡ遺伝子配列は、同じ翻訳配列を有するが他のコドンを使用したポリヌクレオチドに変換された。この方法は一般的に、高発現のヒト遺伝子に通常関連しない野生型配列のコドンを同定すること、およびこのコドンとヒト細胞において高く発現するために最適なコドンとを置換することから構成される。次に、新規配列について、これらのコドン置換によって生じた望ましくない配列を調べる（たとえば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライシング認識部位の偶発的な発生、望ましくない制限酵素部位など）。所望しない配列は、同一アミノ酸をコードする異なるコドンで既存のコドンを置換することによって除去される。次に、合成遺伝子部分の発現が改善されているかを調べる。
【００４０】
前述の方法を使用してヒトＣＥＡの合成遺伝子配列を作製して、高い発現濃度に最適化したコドンを含む遺伝子が生じた。前記の方法は、癌ワクチンで使用するコドン最適化遺伝子を設計するための方法を要約したものであるが、該方法を少し変更するか、または配列を少し変化させることによって、同様のワクチンの有効性または遺伝子発現の増加を実現することは、当業者に理解されている。当業者はまた、ＤＮＡ分子のほんの一部のコドンをコドン最適化して、ヒト細胞において高濃度のＣＥＡ発現をもたらす他のＤＮＡ分子を構築できることを理解するであろう。
【００４１】
したがって、本発明は、ヒトＣＥＡ蛋白質（配列番号２）、またはｈＣＥＡ−ΔＡＤ（配列番号１６）を含むがそれだけに限定されないヒトＣＥＡ蛋白質の生物学的に活性のある断片または変異型をコードするヌクレオチドの配列を含む合成ポリヌクレオチドに関し、該ポリヌクレオチド配列はヒト宿主で発現するために最適化されたコドンを含む。ＣＥＡ蛋白質の前記変異型は、本明細書で集合的に「変種」として称される保存的アミノ酸置換、アミノ末端切断、カルボキシ末端切断、欠失または添加を含むが、それだけに限定されない。このような生物学的活性のある断片および／または変異体はいずれも、配列番号２で示したようなＣＥＡ蛋白質の免疫学的特性を少なくとも実質的に模倣した蛋白質または蛋白質断片をコードする。本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療用または予防用癌ワクチンを開発するのに有用であるように、機能的なヒトＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００４２】
前述したように、本発明は、ヒトＣＥＡ蛋白質（配列番号２）をコードするヌクレオチドまたはそれらの生物学的に活性のある断片または変異型に関する。このために、本発明は、Ｃ末端アンカー配列が欠失したヒトＣＥＡ蛋白質を含むｈＣＥＡ−ΔＡＤ（配列番号１６、図１０Ｂ）をコードするヌクレオチドを提供する。ｈＣＥＡ−ΔＡＤをコードする本発明の核酸分子は、ヒト細胞での発現を高めるためにコドンが最適化されている。ｈＣＥＡ−ΔＡＤをコードする核酸配列の例は、配列番号１５で示したヌクレオチドの配列を含む（図１０Ａ）。
【００４３】
本発明は、配列番号２に記載されている新規ｈＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列を含む合成核酸分子（ポリヌクレオチド）に関し、前記合成核酸分子は、ヒト宿主細胞で高レベルで発現するようにコドンが最適化されている。本発明の核酸分子は、実質的に他の核酸を含まない。
【００４４】
本発明はまた、この明細書を通じて開示した核酸分子を含有する組換えベクター並びに原核細胞および真核細胞の両方の組換え宿主細胞に関する。該合成ＤＮＡ分子、関連ベクターおよび本発明の宿主は、癌ワクチンの開発に有用である。
【００４５】
本発明の好ましいＤＮＡ分子は、配列番号２として表した、図２に示したヒトＣＥＡ蛋白質をコードする、本明細書で配列番号１として開示した、図１に示したヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
本発明のさらに好ましいＤＮＡ分子は、配列番号１６として表した、図１０Ｂに示したＣ末端アンカー配列を欠失したヒトＣＥＡ変種をコードする、本明細書で配列番号１５として開示した、図１０Ａに示したヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
本発明はまた、ヒトＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡをコードする配列番号１の生物学的に活性のある断片または変異体を含む。このような生物学的活性のある断片および／または変異体は、配列番号２で表したｈＣＥＡ蛋白質を含むが、それだけに限定されないｈＣＥＡ蛋白質の薬理学的特性を少なくとも実質的に模倣した蛋白質または蛋白質断片のいずれかをコードする。このようなポリヌクレオチドはいずれも、ヌクレオチド置換、欠失、添加、アミノ末端切断およびカルボキシ末端切断を含むが、必ずしもそれだけに限定されない。本発明の変異体は、癌ワクチンの開発に有用であるように真核細胞において機能的ｈＣＥＡ蛋白質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００４８】
本発明はまた、合成ＤＮＡのヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド配列とは著しく異なるが、まだ配列番号２で表したｈＣＥＡ蛋白質をコードする合成コドン最適化ＤＮＡ分子に関する。このような合成ＤＮＡは、本発明の範囲内にあるものとする。したがって、本発明は、同一の蛋白質を発現する数多くのＤＮＡ分子をもたらすことができるコドン重複を開示する。本発明の範囲内にはまた、発現した蛋白質の基本的な物理特性を実質的に変更しないＤＮＡ配列の変異が含まれる。たとえば、ロイシンをバリンに、リジンをアルギニンに、またはグルタミンをアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機能に変化は生じる可能性はない。
【００４９】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然に生じるペプチドと異なる特性を有するペプチドをコードするために改変することができることが知られている。ＤＮＡ配列の改変方法は、部位特異的変異誘発を含むが、それだけに限定されない。改変された特性の例は、基質に対する酵素またはリガンドに対する受容体の親和性の変化を含むが、それだけに限定されない。
【００５０】
本発明はまた、ＧＦＰ（緑の蛍光蛋白質）、ＭＹＣエピトープ、ＧＳＴおよびＦｃを含むが、それだけに限定されない様々なマーカーに結合させたヒトＣＥＡ蛋白質の一部を発現する融合構築物を含むが、それだけに限定されないｈＣＥＡｏｐｔ融合構築物に関する。このような融合構築物はいずれも、関心のある細胞系で発現することが可能で、本明細書で開示したヒトＣＥＡ蛋白質の修飾因子のスクリーニングに使用することが可能である。ＤＯＭおよびｈｓｐ７０並びにＬＴＢを含むが、それだけに限定されない、ヒトＣＥＡに対する免疫応答を高めるために構築された融合蛋白質もまた、企図する。
【００５１】
本発明はさらに、この明細書を通じて開示した合成核酸分子を含む組換えベクターに関する。これらのベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成されることが可能である。ほとんどのクローニングのためには、ＤＮＡベクターが好まれる。一般的なベクターは、プラスミド、改変ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母の人工的染色体、およびｈＣＥＡ蛋白質をコードすることができるその他の形態のエピソームＤＮＡまたは統合ＤＮＡを含む。特定の遺伝子輸送またはその他の用途に適切なベクターを決定することは、十分当業者の範囲内である。
【００５２】
ｈＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化ＤＮＡを含有する発現ベクターは、組換え宿主細胞においてｈＣＥＡを高濃度に発現するために使用することができる。発現ベクターは、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミドまたはウイルスを含むが、それだけに限定されない。また、所望するならば、様々な細菌発現ベクターを使用して、細菌細胞で組換えｈＣＥＡを発現することができる。さらに、様々な真菌細胞発現ベクターを使用して、真菌細胞で組換えｈＣＥＡを発現することができる。さらに、様々な昆虫細胞発現ベクターを使用して、昆虫細胞で組換え蛋白質を発現することができる。
【００５３】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞に関する。組換え宿主細胞は、Ｅ．コリなどの細菌、酵母などの真菌細胞を含めるがそれだけに限定されない原核細胞または真核細胞、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類由来の細胞系を含むがそれだけに限定されない哺乳類細胞、並びにショウジョウバエおよびカイコ由来の細胞系を含むがそれだけに限定されない昆虫細胞であってよい。このような組換え宿主細胞は、ｈＣＥＡまたは生物学的に等価な形態を生成するために適した条件下で培養することができる。本発明の好ましい実施形態では、該宿主細胞はヒトである。本明細書で定義したように、「宿主細胞」という用語は、遺伝子を組み換えたヒトの体、ヒト胎児またはヒト胚における宿主細胞を含むものではない。
【００５４】
前述のように、ｈＣＥＡ蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターは、組換え宿主細胞においてｈＣＥＡを発現するために使用することができる。したがって、本発明の他の態様は、（ａ）配列番号１または配列番号１５で表した核酸を含むベクターを適切なヒト宿主細胞に導入すること、および（ｂ）前記ヒトＣＥＡ蛋白質またはＣＥＡ蛋白質変種の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞におけるヒトＣＥＡ蛋白質または蛋白質変種の発現方法である。
【００５５】
宿主細胞でｈＣＥＡが発現した後、ｈＣＥＡ蛋白質を回収して、活性型ｈＣＥＡ蛋白質を提供することができる。いくつかのｈＣＥＡ蛋白質精製方法が有用で、使用に適している。組換えｈＣＥＡ蛋白質は、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーの様々な組み合わせ、または個々の適用によって細胞溶解物および抽出物から精製することができる。さらに、組換えｈＣＥＡ蛋白質は、完全長ｈＣＥＡ蛋白質またはｈＣＥＡのポリペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体で作製した免疫親和性カラムを使用することによって、その他の細胞蛋白質から分離することができる。
【００５６】
本発明の核酸は、ヒト細胞において蛋白質の効果的な発現をもたらすように設計された配列を含む発現カセットに組み込むことができる。
【００５７】
該カセットは、コドンを最適化した完全長ｈＣＥＡ遺伝子と共に、プロモーターなど、それに操作可能に結合された転写および翻訳制御配列並びに終止配列を含有することが好ましい。好ましい実施形態では、該プロモーターはイントロンＡ配列（ＣＭＶ）を含まないサイトメガロウイルスプロモーターであるが、当業者であれば、強力なイムノグロブリンなどの多数のその他の公知のプロモーター、またはその他の真核細胞遺伝子プロモーターを使用できることを認識するであろう。好ましい転写終結区は、ウシ成長ホルモン終結区であるが、その他の公知の転写終結区もまた使用することができる。ＣＭＶ−ＢＧＨ終結区の組み合わせは特に好ましい。
【００５８】
本発明によれば、ｈＣＥＡｏｐｔ発現カセットは、ベクターに挿入される。該ベクターは、好ましくはアデノウイルスベクターであるが、プロモーターに結合した線状ＤＮＡまたはその他のベクター、たとえば、アデノ関連ウイルスまたは改変ワクチンウイルス、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターもまた使用することができる。
【００５９】
選択したベクターがアデノウイルスの場合、ベクターがいわゆる第１世代アデノウイルスベクターであることが好ましい。これらのアデノウイルスベクターは、非機能性Ｅ１遺伝子領域を有することが特徴で、好ましくはアデノウイルスＥ１遺伝子領域が欠失していることが好ましい。いくつかの実施形態では、該発現カセットは、Ｅ１遺伝子が通常位置する位置に挿入される。さらに、これらのベクターは、場合によって非機能性Ｅ３領域を有するか、Ｅ３領域を欠失している。使用したアデノウイルスゲノムは、Ｅ１およびＥ３領域の両方が欠失していること（ΔＥ１ΔＥ３）が好ましい。該アデノウイルスは、ウイルスＥ１遺伝子を発現する公知の細胞系、たとえば、２９３細胞、またはＰＥＲＣ．６細胞、または一時的にもしくは安定して形質転換して外来蛋白質を発現する２９３またはＰＥＲＣ．６から得られた細胞系で増殖することができる。たとえば、テトラサイクリン制御プロモーター系などの遺伝子発現が制御された構築物を使用するとき、該細胞系は、制御系に関連した成分を発現することができる。このような細胞系の１例は、Ｔ−Ｒｅｘ−２９３であり、その他は当業者に公知である。
【００６０】
アデノウイルスベクターの操作に便利なように、該アデノウイルスはシャトルプラスミド型であることが可能である。本発明はまた、プラスミド部分およびアデノウイルス部分を含むシャトルプラスミドベクターを対象としており、該アデノウイルス部分はＥ１が欠失し、場合によってＥ３も欠失したアデノウイルスゲノムを含み、コドン最適化ヒトＣＥＡを含む発現カセットが挿入されている。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが容易に除去され得るようにプラスミドのアデノウイルス部分に隣接して制限部位がある。該シャトルプラスミドは、原核細胞または真核細胞で複製することができる。
【００６１】
本発明の好ましい実施形態では、発現カセットはｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０アデノウイルスプラスミド（本明細書に参照により組み込まれた、Ｅｍｉｎｉ他、ＷＯ０２／２２０８０参照）に挿入する。このプラスミドは、Ｅ１およびＥ３領域が欠失したＡｄ５アデノウイルスゲノムを含む。ｐＭＲＫＡｄ５−ＨＶ０プラスミドの設計は、５’シス作用パッキング領域をＥ１遺伝子にさらに伸長し、ウイルスパッケージングを最適化するために重要であることが発見された要素をとりこみ、ウイルス増幅の増強をもたらすことによって、以前のアデノウイルスベクターより改良された。有利なことに、この増強されたアデノウイルスは、何度か継代増殖させた後でも遺伝子安定性を維持することができる。
【００６２】
ＤＮＡ構築物を調製および精製する分子生物学の標準的技術によって、本発明のアデノウイルス、シャトルプラスミドおよびＤＮＡ免疫原を調製することが可能である。
【００６３】
本発明によって、ヒト細胞において高レベルで発現するようにコドンが最適化された本明細書で説明した合成ｃＤＮＡ分子（配列番号１）は、対応する野生型配列よりも効率的に発現することが測定された。驚くべきことに、コドンを最適化したｈＣＥＡのｃＤＮＡは、野生型配列よりも効率的にｈＣＥＡに対する寛容を打破する。さらに、本明細書では、ｈＣＥＡｏｐｔはｈＣＥＡよりも免疫原性が高く、細胞性および体液性両方の免疫応答をより効果的に惹起することが示された。
【００６４】
したがって、前述のベクターは、異常なＣＥＡ発現に関連した腺癌の発症の予防および／または既存の癌の治療のための免疫原性組成物およびワクチンに使用することができる。本発明のベクターは、うまく形質転換した宿主生物において外来性ＣＥＡを高濃度に発現させることに伴う問題を排除し、ワクチン開発および商品化を可能にする。このために、本発明の１態様は、配列番号２に記載されているヒトＣＥＡ蛋白質をコードするヌクレオチドの配列を含むコドン最適化合成核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳類に投与することを含む癌の予防および治療方法である。
【００６５】
前述の方法によれば、該ワクチンベクターはいかなる哺乳類の癌の治療または予防のためにも投与することができる。本発明の好ましい実施形態では、哺乳類はヒトである。
【００６６】
さらに、当業者は説明した治療方法および予防方法で使用するための任意の形態のベクターを選択することができる。好ましくは、該ベクターはアデノウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。本発明の好ましい実施形態では、該ベクターはアデノウイルスＥ１領域中に欠失を有し、及びアデノウイルスＥ１領域中に挿入部分を有するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであり、前記挿入は、（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む発現カセットを含む。
【００６７】
本発明はさらに、Ｅ１領域中に欠失を有し、及びＥ１領域中に挿入部分を有するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターに関し、前記挿入は、（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む発現カセットを含む。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態では、該アデノウイルスベクターはＡｄ５ベクターである。
【００６９】
本発明の他の好ましい実施形態では、該アデノウイルスベクターはＡｄ６ベクターである。
【００７０】
本発明のさらに他の好ましい実施形態では、該アデノウイルスベクターはＡｄ２４ベクターである。
【００７１】
他の態様では、本発明は、プラスミド部分と発現カセット部分とを含むワクチンプラスミドに関し、該発現カセット部分は、（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはその変種をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む。
【００７２】
本発明のある実施形態では、本明細書で開示した組換えアデノウイルスワクチンは、増強された免疫応答を誘導するため、プラスミドをベースとしたポリヌクレオチドワクチンによる様々な初期／追加免疫の組み合わせで使用される。この場合、この２種類のベクターが「初期および追加免疫」計画で投与される。たとえば、第１の種類のベクターを投与し、次に所与の時間を経た後、たとえば、２週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、６ヶ月後またはその他の適切な間隔を空けて、第２の種類のベクターを投与する。好ましくは、該ベクターは同一のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組み合わせをコードする発現カセットを有する。プラスミドＤＮＡもまた使用する実施形態では、該ベクターは哺乳類細胞または昆虫細胞によって認識される１種または複数のプロモーターを含有することが好ましい。好ましい実施形態では、該プラスミドは強力なプロモーターを含有し、たとえば、ＣＭＶプロモーターであるが、それだけに限定されない。該合成ヒトＣＥＡ遺伝子または発現すべきその他の遺伝子は、このようなプロモーターに結合される。このようなプラスミドの例は、前述のような哺乳類発現プラスミドＶ１Ｊｎｓである（本明細書に参照により組み込まれた、Ｊ．Ｓｈｉｖｅｒ他、ＤＮＡ Ｖａｃｃｈｉｎｅｓ、Ｍ．Ｌｉｕ他著、Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｎ．Ｙ．，７７２：１９８〜２０８（１９９６））。
【００７３】
前述のように、アデノウイルスベクターワクチンおよびプラスミドワクチンは、免疫応答を惹起する単一の治療計画の一部として脊椎動物に投与することができる。このために、本発明は、（ａ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはヒトＣＥＡ蛋白質変種をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む第１のベクターを哺乳類に導入すること、（ｂ）予め決定された時間経過させること、および（ｃ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはヒトＣＥＡ蛋白質変種をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む第２のベクターを該哺乳類に導入することを含む、前記哺乳類を癌から防御する方法に関する。
【００７４】
前述の防御方法の１実施形態において、第１のベクターはプラスミドであり、第２のベクターはアデノウイルスベクターである。他の実施形態では、第１のベクターはアデノウイルスベクターであり、第２のベクターはプラスミドである。
【００７５】
本発明はさらに、（ａ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはヒトＣＥＡ蛋白質変種をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む第１のベクターを哺乳類に導入すること、（ｂ）予め決定された時間経過させること、および（ｃ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはヒトＣＥＡ蛋白質変種をコードするコドン最適化合成ポリヌクレオチドと、（ｉｉ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターとを含む第２のベクターを該哺乳類に導入することを含む、腺癌に罹患した哺乳類を治療する方法に関する。
【００７６】
前述の治療方法の１実施形態において、第１のベクターはプラスミドであり、第２のベクターはアデノウイルスベクターである。他の実施形態では、第１のベクターはアデノウイルスベクターであり、第２のベクターはプラスミドである。
【００７７】
ワクチン受容体に導入すべき発現可能なＤＮＡまたは転写されたＲＮＡの量は、使用したプロモーターの強度および発現遺伝子産物の免疫原性に部分的に左右される。一般的に、免疫学的または予防的に有効な用量、約１ｎｇから１００ｍｇ、好ましくは約１０μｇから３００μｇのプラスミドワクチンベクターを直接筋肉組織に投与する。組換えアデノウイルスの有効量は、粒子約１０６個から１０１２個で、好ましくは約１０７個から１０１１個である。皮下注射、皮内注射、皮膚からの圧入およびその他の投与様式、たとえば、腹腔内、静脈内または吸入送達もまた企図される。追加免疫ワクチン接種を行うこともまた、企図される。本発明のワクチンの非経口的導入と同時に、またはその後で、アジュバント、たとえば、インターロイキン１２蛋白質を非経口的に、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下またはその他の投与手段で投与することもまた、有利である。
【００７８】
本発明のワクチンは、裸であること、すなわち、いかなる蛋白質、アジュバントまたは受容対象の免疫系に影響を与えるその他の薬剤を伴わないことが可能である。この場合、ワクチンベクターは生理学的に許容される溶液、たとえば、滅菌生理食塩水または滅菌緩衝生理食塩水に入れることが望ましい。あるいは、本発明のワクチンまたは免疫原組成物と共に免疫賦活剤、たとえば、アジュバント、サイトカイン、蛋白質、またはその他の担体を投与することが有利であり得る。したがって、本発明は、本発明の組成物および方法と組み合わせてこのような免疫賦活剤を使用することを含む。本明細書で使用した免疫賦活剤とは、外来抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞性）を増強または助長する本質的に任意の物質である。前記免疫賦活剤は、ＤＮＡまたは蛋白質の形態で投与することができる。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、破傷風毒素、ＩＬ１２、Ｂ７．１、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ−１を含むが、それだけに限定されない様々な免疫賦活剤はいずれも、本発明のワクチンおよび免疫組成物と組み合わせて使用することができる。前記免疫賦活剤は、当業界で周知である。
【００７９】
ＤＮＡの細胞による摂取を助ける薬剤、たとえば、それだけに限定されないがカルシウムイオンはまた、使用することができる。これらの薬剤は一般的に、トランスフェクションを容易にする試薬および薬剤として許容される担体のことである。当業者であれば、特定の免疫賦活剤または薬剤として許容される担体並びに適切な時間および投与様式を決定することができる。
【００８０】
本明細書で記載した刊行物は全て、本発明と関連づけて使用することが可能な方法および材料を記載し、開示するために参照により組み込まれる。本発明が先行技術の効力によってその開示が先行する資格を有していないことを許容したと解釈すべきでない。
【００８１】
添付した図面を参考にして、本発明の好ましい実施形態を説明したが、本発明はそれらの厳密な実施形態に限定されるのではなく、添付の特許請求の範囲で定義した本発明の範囲または精神を逸脱することなく、当業者が様々な変更および修正を実行できることを理解されたい。
【００８２】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、限定するものではない。
【実施例１】
【００８３】
コドン最適化ヒトＣＥＡ配列
完全なｈＣＥＡｏｐｔコーディング配列を合成して、ＢＩＯＮＥＸＵＳ（Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）によって構築した。５’末端に最適化したＫｏｚａｋ配列を有するｈＣＥＡｏｐｔｃＤＮＡは、ＰＣＲによって構築したオリゴヌクレオチドを使用して構築した。構築したｃＤＮＡは、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に挿入して、ｐＣＲ−ｈＣＥＡｏｐｔを得た。ｈＣＥＡｏｐｔｃＤＮＡの強度は、両鎖を配列決定することによって測定した。
【実施例２】
【００８４】
プラスミド構築物およびアデノウイルスベクター
ｐＶＩＪ／ｈＣＥＡｏｐｔ：プラスミドｐＣＲ−ｈＣＥＡｏｐｔは、ＥｃｏＲＩで３７℃で１時間消化した。得られた２１５６ｂｐ挿入物を精製して、プラスミドｐＶ１ＪｎｓＢのＥｃｏＲＩ部位にクローニングした（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ他、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２（９）：７７７〜８３（１９９３））。
【００８５】
ｐＶｌＪ／ｈＣＥＡ：プラスミドｐＣＩ／ｈＣＥＡ（Ｓｏｎｇ他、ＤＮＡをベースとしたワクチン接種および非ウイルス性サイトカイン遺伝子移入の組み合わせによるＴヘルパー１対Ｔヘルパー２活性の制御および腫瘍免疫の増強（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−１ ｖｅｒｓｕｓ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ−２ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｎｖｉｒａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４８１〜４９２（２０００））は、ＥｃｏＲＩで消化した。得られた２１０９ｂｐ挿入物は、プラスミドｐＶ１ＪｎｓＡ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ他、前述）のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【００８６】
Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ：プラスミドｐＣＲ−ｈＣＥＡｏｐｔは、ＥｃｏＲＩで消化した。得られた２１５６ｂｐ挿入物は、精製してｐｏｌｙＭＲＫ−Ａｄ５シャトルプラスミドのＥｃｏＲＩにクローニングした（本明細書に参照により組み込まれた、Ｅｍｉｎｉ他、ＷＯ０２／２２０８０参照）。
【００８７】
Ａｄ５／ＣＥＡ：Ａｄ５ベクターを生成するためのシャトルプラスミドｐＭＲＫ−ｈＣＥＡは、プラスミドｐＤｅｌｔａ ｓｐ１Ｂ／ｈＣＥＡをＳｓｐＩおよびＥｃｏＲＶで消化することによって得られた。次に、該９．５２ｋｂ断片は、プラスミドポリＭＲＫから得られた１２７２ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩで制限した、クレノウ処理生成物と連結した。ｈＣＥＡの発現カセットおよびＥ１隣接Ａｄ５領域を含有するｐＭＲＫ−ｈＣＥＡおよびｐＭＲＫ−ｈＣＥＡｏｐｔのＰａｃＩ／ＳｔｕＩ断片は、ＢＪ５１８３ Ｅ．コリ細胞においてＣｌａＩ直線化プラスミドｐＡｄ５に結合し直した。得られたプラスミドはそれぞれ、ｐＡｄ５−ｈＣＥＡおよびｐＡｄ５−ｈＣＥＡｏｐｔであった。両プラスミドをＰａｃＩで切断して、Ａｄ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を遊離し、ＰｅｒＣ−６細胞にトランスフェクトした。Ａｄ５ベクター増幅は、一連の手順によって実施した。ＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡおよびＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔは、標準的なＣｓＣｌ勾配精製法によって精製し、Ａ１０５緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ８．０、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、スクロース ５％、０．００５ Ｔｗｅｅｎ ２０）によって集中的に透析した。
【実施例３】
【００８８】
ＣＥＡの発現および検出
プラスミドおよびＡｄベクターによるｈＣＥＡの発現は、ウエスタンブロット分析によってモニターした。プラスミドは、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によってＨｅｌａ細胞またはＰｅｒＣ．６細胞にトランスフェクトした。ＰｅｒＣ．６のアデノウイルス感染は、血清を含まない培地中で、３７℃で３０分間実施し、その後新鮮な培地を添加した。４８時間インキュベートした後、全細胞溶解物および培養上清を収集した。細胞溶解物中に存在するＣＥＡ蛋白質は、ウサギポリクローナル抗血清を使用したウエスタンブロット分析によって検出した。該蛋白質は、１８０ｋＤａから２００ｋＤａのバンドとして検出された。分泌型ＣＥＡは、Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｌｉｓａ ＣＥＡキット（ＤＢＣ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．，Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、細胞上清中および注射したマウス（注射後３日目）の末梢血中に検出された。
【実施例４】
【００８９】
マウスの免疫
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｌｅｃｃｏ、Ｉｔａｌｙ）から購入した。ＣＥＡ．ｔｇマウス（Ｈ−２ｂ）は、Ｊ．Ｐｒｉｍｕｓ（Ｖａｎｄｅｒｂｌｉｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から恵与され、標準的条件で維持した。既に記載されたように（Ｒｉｚｚｕｔｏ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（１１）：６４１７〜２２（１９９９））、プラスミドＤＮＡ ５０マイクログラムをマウスの大腿４頭筋に５０μｌの用量で電気注射した。Ａｄ注射は、５０μｌの用量でマウスの大腿４頭筋に実施した。体液性および細胞性免疫応答は、指定した時点で分析した。
【実施例５】
【００９０】
ｈＣＥＡのコドン最適化ｃＤＮＡはｈＣＥＡ発現を有意に増加させた。
【００９１】
ヒトＣＥＡ（ｈＣＥＡｏｐｔ）の合成遺伝子は、各アミノ酸（以後ａａ）残基についてヒトに好ましい（ヒト化）コドンを組み込むために設計した。コドン最適化ｃＤＮＡは、元々のクローンに対して７６．８％のヌクレオチド同一性を維持するように改変された（図１参照）。該コドン最適化ｃＤＮＡは、ｐＶ１Ｊベクター（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ他、前述）のＫｏｚａｋ最適化配列（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’、配列番号１３）の前、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）／イントロンＡプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）終止シグナルの制御下に配置してクローニングした。該構築物は、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ（実施例２参照）と命名した。さらに、アデノウイルス５型ベクターは、ＣＭＶ／イントロンＡプロモーターおよびＢＧＨ終止シグナルの隣接したｈＣＥＡｏｐｔ配列を有するように構築した（Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ）。比較のために、同等のプラスミドおよびＶ５ベクターは、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡおよびＡｄ５／ｈＣＥＡを生じる野生型ｈＣＥＡ配列を有するように構築した。コドン最適化ｃＤＮＡを含有するものと同様に、これらのベクターは、ＣＭＶ／ｉｎｔ Ａプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）終止シグナルの制御下に野生型遺伝子を有する。
【００９２】
プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔでトランスフェクトしたＨｅｌａ細胞のウエスタンブロット分析では、ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ構築物でトランスフェクトした細胞で検出された大きさと区別できない大分子量（１８０ｋＤａから２００ｌＤａ）の蛋白質が生じた。同様に、Ａｄ５／ｈＣＥＡまたはＡｄ５Ｈ７ｈ／ｈＣＥＡｏｐｔで感染させたＰｅｒＣ−６細胞溶解物で検出される蛋白質の大きさには、明らかな差は検出できなかった（データは示さなかった）。
【００９３】
ｈＣＥＡ発現に対するｈＣＥＡｏｐｔ発現の効率を比較するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０匹の群の大腿４頭筋に１ｘ１０７から１ｘ１０４ｐｆｕの範囲の様々な用量のＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔを注射した。注射して３日後に、ＣＥＡ蛋白質濃度を測定して、同用量のＡｄ５／ｈＣＥＡを注射した対照群の濃度と比較した。Ａｄ５／ｈＣＥＡを注射したマウスと比較してＡｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ １ｘ１０７ｐｆｕ（４８．２μｇ／ｌ）の注射では、ｈＣＥＡ濃度の相乗平均値の６倍の増加が認められたが、一方、同ウイルスを１ｘ１０６ｐｆｕ（１０．９μｇ／ｌ）で注射すると蛋白質濃度の１０倍の増加が認められた（図２Ａ）。対照的に、低用量のＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔを注射しても、Ａｄ５／ｈＣＥＡと比較して循環ＣＥＡ濃度の実質的な増加は生じなかった。ｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡと比較して、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐ、２５μｇまたは５０μｇを電気注射すると、たとえ低い範囲であっても、ＣＥＡ蛋白質濃度の増強がまた、示された（図２Ｂ）。したがって、これらの結果から、利用した遺伝子輸送媒体とは関係なく、コドン最適化ｃＤＮＡは対応する野生型配列よりも効果的に発現することが示された。
【実施例６】
【００９４】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ測定法
滅菌ＰＢＳで２．５μｇ／ｍｌに希釈した精製ラット抗マウスＩＦＮ−γ（ＩｇＧ１、Ｒ４−６Ａ２クローン、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）１００μｌ／ウェルで、９６ウェルＭＡＩＰプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）をコーティングした。ＰＢＳで洗浄後、プレートのブロックはＲ１０培地２００μｌ／ウェルで３７℃で２時間実施した。
【００９５】
脾細胞は、安楽死させたマウスから滅菌的に脾臓を取り出すことによって得た。脾臓破砕は、金属格子上で切断した脾臓をすりつぶすことによって実施した。細胞ペレットに０．１ＸＰＢＳ １ｍｌを添加し１５秒以上激しく撹拌して、浸透圧溶解することによって赤血球細胞を除去した。次に、２ＸＰＢＳ １ｍｌを添加し、１ＸＰＢＳで体積を４ｍｌにした。室温で１２００ｒｐｍで１０分間遠心することによって細胞をペレットにし、該ペレットをＲ１０培地１ｍｌに再懸濁した。生細胞をチュルク染色を使用して計数した。
【００９６】
脾細胞は、５ｘ１０５および２ｘ１０５細胞／ウェルで２連で播種し、各ペプチドの懸濁液１μｇ／ｍｌと共に３７℃で２０分間インキュベートした。各マウスの陽性内部対照としてコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を５μｇ／ｍｌで使用した。ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、測定用緩衝液で１：２５００に希釈したビオチン結合ラット抗マウスＩＦＮγ（ＲａｔＩｇＧ１、ＸＭＧ１．２クローン、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）５０μｇ／ウェルをプレートに入れて、４℃でＯ／Ｎインキュベートした。集中的に洗浄した後、プレートにＮＢＴ／Ｂ−ＣＩＰ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を添加して、スポットがはっきりと視認できるほどになるまで発色させた。蒸留水で徹底的にプレートを洗浄することによって反応を停止させた。プレートを空気乾燥して、次にスポットは自動化ＥＬＩＳＰＯＴ読み取り機を使用して計数した。
【実施例７】
【００９７】
細胞内サイトカイン染色
ＲＰＭＩ １０％ＦＣＳ １ｍｌに溶かした１００万個から２００万個のマウス脾細胞またはＰＢＭＣを、ペプチド収集物（各ペプチドの最終濃度５μｇから６μｇ／ｍｌ）およびブレフェルジンＡ（１μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５０２８／２３００ｋｋ）と共に、３７℃で５％ＣＯ２で１２時間から１６時間インキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ １％ ＦＢＳ、ＮａＮ３ ０．０１％）で洗浄して、精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２Ｆｃブロック（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５３１４２）と共に４℃で１５分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄して、表面抗体、ＣＤ４−ＰＥ結合抗マウス（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５３０４９）、ＰｅｒｃＰ ＣＤ８結合抗マウス（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５３０３６）およびＡＰＣ−結合抗マウスＣＤ３ｅ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５３０６６）によって暗所で室温で３０分間染色した。洗浄後、細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ−Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５０２８／２３００ｋｋ）で暗所において４℃で２０分間透過させた。ＰｅｒｍＷａｓｈ溶液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ カタログ番号５５０２８／２３００ｋｋ）で洗浄した後、細胞をＩＦＮγ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共にインキュベートした。次に、細胞を洗浄して、ホルムアルデヒドの１％ＰＢＳ溶液で固定して、ＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーで、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して分析した。
【実施例８】
【００９８】
ＣＥＡ特異的Ｔ細胞を直接列挙するためのエピトープ含有ペプチドの同定および特徴付け
マウスにおいて、ＣＥＡに対する遺伝子ワクチンによって惹起された免疫応答をよりよく特徴付けるために、ＥＬＩＳＰＯＴ分析をＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＢＡＬＢ／ｃマウスについて実施し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＥＡ特異的エピトープを同定した。このために、完全な蛋白質を網羅する個々のペプチドに対する応答の同定に利用できる強く免疫されたマウスの作製について、異なる免疫様式を比較した。プラスミドＤＮＡ初期免疫−Ａｄ追加免疫の様式を利用することによって、高濃度の細胞性免疫をウイルス抗原および細菌抗原に対して誘導することができることを示した最近の報告を考慮して、同様の免疫方法を本研究に使用した。異なる計画、ｉ）Ａｄ／ｈＣＥＡの１ｘ１０９ｖｐを２回投与（Ａｄ／Ａｄ）、ｉｉ）プラスミドｐ１Ｊ／ｈＣＥＡを２回投与（ＤＮＡ／ＤＮＡ）およびｉｉｉ）プラスミドＤＮＡ１回投与した後Ａｄ／ｈＣＥＡを投与（ＤＮＡ／Ａｄ）でマウスを筋肉内で免疫した。免疫間隔は、２週間とした。
【００９９】
異なる免疫計画によって惹起された細胞性免疫は、追加免疫２週間後にＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。異なるワクチン接種計画の免疫原効果を比較するために、１１個のａａが重複し、ａａ４９７から７０３を網羅した１５マーペプチドの収集物（プールＤ）を使用して、脾細胞の抗原特異的サイトカイン分泌を刺激した。ＳＦＣの高い相乗平均値によって示される最強の応答は、ＤＮＡ／Ａｄを注射した群のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスで認められた（図４）。したがって、この計画を利用して免疫応答をさらに分析した。
【０１００】
該免疫応答が、完全なＣＥＡ蛋白質に対して等しく分布するかどうかを測定するために、免疫したＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、完全な蛋白質配列を集合的に包含する１個から４個の１５マーペプチドの収集物によってインビトロで刺激した。各収集物は、１１個の残基によって重複するアミノ酸長１５個のペプチドから構成された。凍結乾燥したｈＣＥＡペプチドは、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ）から購入し、ＤＭＳＯに４０ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。プールＤに加えて、プールＡ（ａａ１から１４７）、Ｂ（ａａ１３７から２３７）およびＣ（ａａ３１７から５０７）を本研究で使用した。最終濃度は以下の通りである。プールＡ＝１．２ｍｇ／ｍｌ、プールＢ＝０．８９ｍｇ／ｍｌ、プールＣ＝０．８９ｍｇ／ｍｌｍプールＤ＝０．８ｍｇ／ｍｌ。ペプチドは−８０℃で保存した。
【０１０１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＤＮＡ／Ａｄワクチン接種計画によって惹起された免疫応答は、主に蛋白質のＣ末端領域に偏っていた（図５Ａ参照）。有意なＳＦＣ値はペプチドプールＣおよびＤで得られ（それぞれの相乗平均値、１７０および２４４ＳＦＣ／１０６脾細胞）、一方、プールＡおよびＢではかなり低い値が得られた（それぞれ、１０および２７ＳＦＣ／１０６脾細胞）。対照的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫応答は、プールＢで最も高いが（相乗平均値、１２３６ＳＦＣ／１０６脾細胞）、プールＡ、ＣおよびＤでは有意に高いＳＦＣ値が示された（それぞれ、９３、３６４および３４４）。関連のないペプチドのプールに対する応答は、いずれの群のマウスでも示されなかった（データは示さなかった）。
【０１０２】
応答を惹起するペプチド収集物に存在する個々のペプチドを同定するために、ＤＮＡ／Ａｄワクチン接種計画によって免疫した４種類のマウスの脾細胞を、有意な免疫応答が認められたプールを含む個々のペプチドそれぞれに対するＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ測定法で分析した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞は、プールＣおよびＤに含まれるペプチド８０から１７３に対して調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞は、プールＢ、ＣおよびＤを含むペプチド３５から１７３に対して調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＥＡ特異的応答は、重複した配列を有する１５マーペプチドの４種類の組み合わせに位置づけた（ａａ４３１から４３５および４２５から４３９；５２９から５４３および５３３から５４７；５６５から５７９および５６９から５９３；６１３から６２７および６１７から６３１）（図６Ａ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＥＡに対する免疫応答は、２２個のペプチドに位置づけられ、そのウチの１７個は配列が重複している（ａａ２１３から２２７および２１３および２２７；２２９から２４３および２３３から２４７；４０９から４２３および４１３から４２７；４２１から４３５および４２５から４３９；５６５から５７９および５６９から５８３；５７３から５８７；６１３から６２７および６１７から６３１並びに６２１から６３５および６２５から６３９；６３７から６５１および６４１から６５５）（図６Ｂ）。
【０１０３】
選択したペプチド内に含有されるエピトープのＴ細胞特異性を確認するために、注射したマウスの脾細胞についてＩＦＮγ細胞内染色測定法を実施した。得られた結果を図７に示す。該データは、Ｔリンパ球の循環濃度を定量するために使用することができるＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウス両方について、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋特異的エピトープが同定されたことを示す。
【実施例９】
【０１０４】
コドンを最適化したｈＣＥＡ ｃＤＮＡは、ｈＣＥＡトランスジェニックマウスにおける寛容を打破する
コドンを最適化したｈＣＥＡのｃＤＮＡの増強された免疫原性がヒトＣＥＡに対する寛容を効果的に打破するかどうかを測定するために、ｈＣＥＡトランスジェニックマウスを野生型またはコドン最適化ｈＣＥＡ配列のいずれかを有するベクターで免疫した。これらのトランスジェニックマウスは、完全なヒトＣＥＡ遺伝子および隣接配列を有し、盲腸および結腸においてｈＣＥＡ蛋白質を発現する。したがって、このマウス系は、この腫瘍の自己抗原を対象とする免疫治療計画の安全性および効率を研究するための有用なモデルである（Ｃｌａｒｋｅ他、「免疫治療のモデルとしてのヒトＣＥＡ遺伝子組換えマウス（Ｍｉｃｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＣＥＡ ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４６９〜７７（１９９８））。
【０１０５】
第１の試験として、トランスジェニックマウス１０匹のうち５匹にプラスミドＤＮＡ５０μｇを４回電気注射し、次いで最終的にアデノウイルス１ｘ１０１０ｐｐを注射した。ｈＣＥＡに対する免疫応答は、注射したマウス４匹から収集した脾細胞についてＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ測定を行うことによって分析した。ｈＣＥＡに対する免疫応答は、ｈＣＥＡｏｐｔｃＤＮＡで免疫したマウスの脾細胞のみで検出された（図８参照）。該免疫応答は、ペプチド１４３およびプールＤで検出されたので、免疫によってＣ末端エピトープに対する有意なＣＤ８＋応答が惹起されたことが示唆された。
【０１０６】
ｈＣＥＡのコドン最適化ｃＤＮＡの増強された免疫原性はまた、アデノウイルスベクター１ｘ１０１０ｐｐを２週間間隔で２回注射したトランスジェニックマウスで試験した。ＣＥＡ特異的免疫応答は、４種類の免疫マウスから収集したＰＢＭＣをＩＦＮγ細胞内染色することによって測定した。ｈＣＥＡに対する免疫応答は、Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔで免疫したマウスのみに検出された（図９）。ＤＮＡおよびＡｄコホートで認められたように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導はペプチドプールＤで検出されたが、有意なＣＤ８＋応答はまた、ペプチドプールＡで示された。したがって、これらの結果は、ｈＣＥＡのコドン最適化ｃＤＮＡは、野生型配列よりも免疫原性が高く、ｈＣＥＡに対する寛容を効率的に打破することを示す。
【実施例１０】
【０１０７】
抗体検出および力価測定
抗体力価測定用の血清は、眼窩後方出血によって得られた。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ ｍａｘｉｓｏｒｐＴＭ）は、ＣＥＡ蛋白質１００ｎｇ／ウェルでコーティングして（高純度ＣＥＡ、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｉｒｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ ＭＡ）でコーティングして、コーティング緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．４）で希釈して、４℃でＯ／Ｎインキュベートした。次に、プレートを５％ＢＳＡを含有するＰＢＳで３７℃で１時間ブロックした。マウス血清は、ＰＢＳ５％ＢＳＡ（血清転換率の評価には１／５０の希釈度、力価測定には１：１０から１：３１２１５０までの希釈度）で希釈した。予備免疫血清は、背景として使用した。希釈した血清は、４℃でＯ／Ｎインキュベートした。洗浄は、ＰＢＳ１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で実施した。２次抗体（ヤギ抗マウス、ＩｇＧペルオキシダーゼ、Ｓｉｇｍａ）は、ＰＢＳ、５％ＢＳＡで１／２０００に希釈して、室温で２時間から３時間、振盪機上でインキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質１００μｌ／ウェル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で発色させた。該反応は、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液２５μｌ／ウェルで停止し、プレートは４５０ｎｍ／６２０ｎｍで読み取った。抗ＣＥＡ血清力価は、同じ希釈度の自己由来予備免疫血清の吸収より少なくとも３倍大きな吸収を生じる血清の限界希釈の逆数として算出した。
【実施例１１】
【０１０８】
ｈＣＥＡｏｐｔの高い免疫原性
野生型およびコドン最適化ＣＥＡ発現ベクターによって誘導されるインビボでの免疫応答を調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを１ｘ１０５から１ｘ１０３ｐｆｕの範囲の様々な用量のＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔを筋肉内注射して免疫した。マウスに３週間間隔で２回注射を行った。２回目の免疫を行ってから２週間後に脾細胞を各マウスから単離した。アデノウイルスによる免疫によって生じるＩＦＮγ分泌型ＣＥＡ特異的ＣＤ８Ｔ細胞前駆体発生頻度を定量するために、Ｈ−２ｂ制限Ｔ細胞エピトープＣＧＩＱＮＳＶＳＡ（配列番号１４、以下参照）についてＥＬＩＳＰＯＴ測定法を使用した。１ｘ１０４ｐｆｕで免疫すると、測定可能な免疫応答を惹起し、ＣＧＩＯＮＳＶＳＡエピトープ（配列番号１４）に特異的な５３個のＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ、相乗平均値）が生じたが、一方１ｘ１０３ｐｆｕの注射ではごくわずかなＳＦＣ値しか惹起しなかった（図３Ａ）。Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔ １ｘ１０５ｐｆｕで免疫した群において、ＳＦＣは３０２個まで増加した。対照的に、１ｘ１０６ｐｆｕの用量で免疫したマウスの群において、ＳＦＣを１６８まで増加させる有意なＣＤ８Ｔ−細胞前駆体頻度を惹起するために、Ａｄ５／ｈＣＥＡは少なくとも１ｘ１０５ｐｆｕ必要であった。ペプチド特異的ＩＦＮγＳＦＣは、Ａｄ５免疫マウスでは検出されなかった（データは示さなかった）。
【０１０９】
それぞれのｈＣＥＡアデノウイルスベクター１ｘ１０５ｐｆｕで免疫したマウスの血清は、基質として精製ヒトＣＥＡ蛋白質を使用してＥＬＩＳＡで試験した。Ａｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔで免疫したマウスのＣＥＡ特異的抗体の力価は、免疫したマウス全てにおいて検出され、Ａｄ力価の相乗平均値は４６４７４であった。対照的に、Ａｄ５／ｈＣＥＡ免疫群は、ＣＥＡ特異的抗体の約１００倍低い相乗平均力価を示した（４５４）。したがって、これらの結果は、ＣＥＡのコドン最適化ｃＤＮＡは細胞性および体液性免疫応答をより効率的に惹起することを示す。
【実施例１２】
【０１１０】
統計解析
指示した場合は、結果はスチューデントｔ検定によって解析した。ｐ値＜０．０５は、有意とみなされた。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】野生型ヒトＣＥＡｃＤＮＡ（配列番号３）およびコドン最適化クローン（ｈＣＥＡｏｐｔ、配列番号１）のヌクレオチド配列を示す図である。推定アミノ酸配列を上部に示す（配列番号２）。合成コドン最適化ｃＤＮＡの置換ヌクレオチドをｈＣＥＡｃＤＮＡ配列の下に示す。実施例２参照。
【図１Ａ】野生型ヒトＣＥＡｃＤＮＡ（配列番号３）およびコドン最適化クローン（ｈＣＥＡｏｐｔ、配列番号１）のヌクレオチド配列を示す図である。推定アミノ酸配列を上部に示す（配列番号２）。合成コドン最適化ｃＤＮＡの置換ヌクレオチドをｈＣＥＡｃＤＮＡ配列の下に示す。実施例２参照。
【図１Ｂ】野生型ヒトＣＥＡｃＤＮＡ（配列番号３）およびコドン最適化クローン（ｈＣＥＡｏｐｔ、配列番号１）のヌクレオチド配列を示す図である。推定アミノ酸配列を上部に示す（配列番号２）。合成コドン最適化ｃＤＮＡの置換ヌクレオチドをｈＣＥＡｃＤＮＡ配列の下に示す。実施例２参照。
【図２Ａ】注射したマウスにおけるｈＣＥＡの発現を示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０匹の群において、様々な用量のＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡおよびＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ（パネルＡ）または２５マイクログラムもしくは５０マイクログラムのプラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡおよびｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ（パネルＢ）のいずれかを大腿４頭筋に注射した。注射して３日後に血液試料を収集し、ＣＥＡ濃度を測定した。塗りつぶされた三角形は個々のマウスのＣＥＡ測定値を表す。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。
【図２Ｂ】注射したマウスにおけるｈＣＥＡの発現を示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０匹の群において、様々な用量のＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡおよびＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡｏｐｔ（パネルＡ）または２５マイクログラムもしくは５０マイクログラムのプラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡおよびｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡｏｐｔ（パネルＢ）のいずれかを大腿４頭筋に注射した。注射して３日後に血液試料を収集し、ＣＥＡ濃度を測定した。塗りつぶされた三角形は個々のマウスのＣＥＡ測定値を表す。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。
【図３Ａ】コドン最適化がヒトＣＥＡに対する免疫応答を増強することを示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス８匹の群において、様々な用量のＭＲＫＡｄ５−ｈＣＥＡおよびＭＲＫＡｄ５−ｈＣＥＡｏｐｔのいずれかを大腿４頭筋に注射した。ウイルス注射は、０日目と２１日目に実施した。パネルＡ。追加免疫注射の２週間後に、ａａ５６９から５８３を含みＣＤ８＋エピトープを含むペプチド１４３を使用したＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、個々のマウスの脾細胞でｈＣＥＡに特異的なＣＤ８＋ＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数を測定した（塗りつぶされた三角形）。２種類の異なる量の脾細胞（２．５ｘ１０５および５ｘ１０５）で、脾細胞のそれぞれの試験料について２回反復した。平均値は、ペプチド無しで測定した背景濃度を差し引くことによって算出し（一般的に１０ＳＦＣ／１０６全脾細胞）、結果はＳＦＣの数／１０６全脾細胞として表した。個々のマウスの値（塗りつぶされた三角形）および相乗平均値（塗りつぶされた丸）を示した。パネルＢ。個々のマウスの血清中の抗ＣＥＡ抗体力価（塗りつぶされた三角形）は、追加免疫１０日後の血清試料を使用して測定した。相乗平均力価（ＧＭＴ）（塗りつぶされた丸）もまた示す。Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔはＡｄ／ｈＣＥＡと有意に異なる。
【図３Ｂ】コドン最適化がヒトＣＥＡに対する免疫応答を増強することを示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウス８匹の群において、様々な用量のＭＲＫＡｄ５−ｈＣＥＡおよびＭＲＫＡｄ５−ｈＣＥＡｏｐｔのいずれかを大腿４頭筋に注射した。ウイルス注射は、０日目と２１日目に実施した。パネルＡ。追加免疫注射の２週間後に、ａａ５６９から５８３を含みＣＤ８＋エピトープを含むペプチド１４３を使用したＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、個々のマウスの脾細胞でｈＣＥＡに特異的なＣＤ８＋ＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数を測定した（塗りつぶされた三角形）。２種類の異なる量の脾細胞（２．５ｘ１０５および５ｘ１０５）で、脾細胞のそれぞれの試験料について２回反復した。平均値は、ペプチド無しで測定した背景濃度を差し引くことによって算出し（一般的に１０ＳＦＣ／１０６全脾細胞）、結果はＳＦＣの数／１０６全脾細胞として表した。個々のマウスの値（塗りつぶされた三角形）および相乗平均値（塗りつぶされた丸）を示した。パネルＢ。個々のマウスの血清中の抗ＣＥＡ抗体力価（塗りつぶされた三角形）は、追加免疫１０日後の血清試料を使用して測定した。相乗平均力価（ＧＭＴ）（塗りつぶされた丸）もまた示す。Ａｄ／ｈＣＥＡｏｐｔはＡｄ／ｈＣＥＡと有意に異なる。
【図４Ａ】異なる免疫計画の比較を示した図である。プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ（５０μｇ／大腿４頭筋に電気注射した用量）およびＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡ（１ｘ１０９ｐｐ／用量）の様々な組み合わせで、Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ）またはＢＡＬＢ／ｃ（Ｂ）マウスの群を免疫した。個々のマウスの脾細胞におけるＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数は、材料および方法および図３の凡例で説明したようにａａ４９７から７０３（プールＤ）に亘るペプチドのプールを使用して測定した。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。Ｄ／ＤおよびＤ／Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＡｄ／Ａｄ群と有意に異なる。３群は全て、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて有意に異なる。
【図４Ｂ】異なる免疫計画の比較を示した図である。プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡ（５０μｇ／大腿４頭筋に電気注射した用量）およびＭＲＫＡｄ５／ｈＣＥＡ（１ｘ１０９ｐｐ／用量）の様々な組み合わせで、Ｃ５７ＢＬ／６（Ａ）またはＢＡＬＢ／ｃ（Ｂ）マウスの群を免疫した。個々のマウスの脾細胞におけるＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数は、材料および方法および図３の凡例で説明したようにａａ４９７から７０３（プールＤ）に亘るペプチドのプールを使用して測定した。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。Ｄ／ＤおよびＤ／Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＡｄ／Ａｄ群と有意に異なる。３群は全て、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて有意に異なる。
【図５Ａ】ｈＣＥＡ蛋白質の選択領域に対するＴ細胞応答のマッピングの結果を示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６（パネルＡ）またはＢＡＬＢ／ｃ（パネルＢ）マウスの群は、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡで免疫し、３週間後にＡｄ／ｈＣＥＡ １ｘ１０９で追加免疫した。個々のマウスの脾細胞におけるＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数は、材料および方法および図３の凡例で説明したように、完全な蛋白質を網羅したペプチドのプールを使用して追加免疫の２週間後に測定した。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。
【図５Ｂ】ｈＣＥＡ蛋白質の選択領域に対するＴ細胞応答のマッピングの結果を示した図である。Ｃ５７ＢＬ／６（パネルＡ）またはＢＡＬＢ／ｃ（パネルＢ）マウスの群は、プラスミドｐＶ１Ｊ／ｈＣＥＡで免疫し、３週間後にＡｄ／ｈＣＥＡ １ｘ１０９で追加免疫した。個々のマウスの脾細胞におけるＩＦＮγ分泌型Ｔ細胞の数は、材料および方法および図３の凡例で説明したように、完全な蛋白質を網羅したペプチドのプールを使用して追加免疫の２週間後に測定した。相乗平均値もまた示す（塗りつぶされた丸）。
【図６Ａ】ｈＣＥＡの免疫応答ペプチドの同定を示した図である。４匹の免疫したＣ５７／ＢＬ／６（パネルＡ）またはＢＡＬＢ／ｃ（パネルＢ）マウスから収集した脾細胞の指定したペプチドそれぞれに対するＩＦＮγ分泌について、ＥＬＩＳＰＯＴ測定法を使用して測定した（実施例８参照）。
【図６Ｂ】ｈＣＥＡの免疫応答ペプチドの同定を示した図である。４匹の免疫したＣ５７／ＢＬ／６（パネルＡ）またはＢＡＬＢ／ｃ（パネルＢ）マウスから収集した脾細胞の指定したペプチドそれぞれに対するＩＦＮγ分泌について、ＥＬＩＳＰＯＴ測定法を使用して測定した（実施例８参照）。
【図７】Ｃ５７ＢＬ／６マウス（パネルＡ）およびＢＡＬＢ／ｃマウス（パネルＢ）におけるＣＥＡのペプチドを含有するエピトープの配列を示した図である（実施例ｘｘ参照）。右に挙げたのは、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋（ＣＤ４＋）ＣＤ３＋細胞の割合である。
【図８】実施例９で説明したような免疫したＣＥＡトランスジェニックマウスのＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ測定法から得られた結果を示した図である。マウスは、１週間間隔でプラスミドＤＮＡを４回電気注射し、さらにアデノウイルス注射を１回行って免疫した。各免疫原について、３回注射したマウスから収集した脾細胞でデータを採った。ＣＤ８特異的応答は、ペプチド１４３を使用して測定した。
【図９】免疫したＣＥＡ．ｔｇマウスのＩＦＮγ細胞内染色を示した図である。マウスは、２週間間隔でアデノウイルス１ｘ１０１０ｖｐを２回注射して免疫した。３回注射したマウスから収集した脾細胞で得られたデータを示す。右に挙げたのは、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋細胞の割合である。
【図１０Ａ】パネルＡは、配列番号１５で表したアンカードメインを切断したＣＥＡ変種をコードするコドン最適化ＤＮＡ分子の例を示した図である。ｈＣＥＡｏｐｔ−ΔＡＤの対応するアミノ酸配列をパネルＢに示す（配列番号１６）。
【図１０Ｂ】パネルＡは、配列番号１５で表したアンカードメインを切断したＣＥＡ変種をコードするコドン最適化ＤＮＡ分子の例を示した図である。ｈＣＥＡｏｐｔ−ΔＡＤの対応するアミノ酸配列をパネルＢに示す（配列番号１６）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載されているヒト癌胎児抗原（ＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチドの配列を含み、ヒト細胞において高レベルで発現するためにコドンが最適化されている合成核酸分子。
【請求項２】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の合成核酸分子。
【請求項３】
前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１に記載の合成核酸分子。
【請求項４】
前記核酸がｃＤＮＡである、請求項１に記載の合成核酸分子。
【請求項５】
前記ヌクレオチドの配列が配列番号１で表したヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載の合成核酸分子。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
（ａ）請求項１に記載の核酸を含むベクターを適切な宿主細胞中に導入すること、および
（ｂ）前記ヒトＣＥＡ蛋白質の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養すること、を含む、組換え宿主細胞中でヒト癌胎児抗原（ＣＥＡ）蛋白質を発現する方法。
【請求項９】
配列番号２で表したヒト癌胎児抗原（ｈＣＥＡ）蛋白質または配列番号１６で表したＣＥＡ蛋白質変種をコードするヌクレオチドの配列を含むコドン最適化合成核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳類に投与することを含む、癌の予防または治療方法。
【請求項１０】
前記哺乳類がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターがアデノウイルスベクターまたはプラスミドベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターが、Ｅ１領域中に欠失を有し、及び前記Ｅ１領域中に挿入部分を有するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであり、
前記挿入部分が、
（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む発現カセットを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターが、
プラスミド部分と、
（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド、および
（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターを含む発現カセットと、
を含むプラスミドワクチンベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
Ｅ１領域中に欠失を有し、及び前記Ｅ１領域中に挿入部分を有するアデノウイルスゲノムを含み、
前記挿入部分が、
（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む発現カセットを含む、アデノウイルスワクチンベクター。
【請求項１５】
Ａｄ５ベクターである、請求項１４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１６】
Ａｄ６ベクターである、請求項１４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
Ａｄ２４ベクターである、請求項１４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１８】
プラスミド部分と発現カセット部分を含み、
前記発現カセット部分が、
（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む、ワクチンプラスミド。
【請求項１９】
（ａ）（ｉ）ヒト癌胎児抗原（ＣＥＡ）蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む第１のベクターを哺乳類に導入すること、
（ｂ）予め決定された時間経過させること、および
（ｃ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む第２のベクターを前記哺乳類に導入すること、
を含む、前記哺乳類を癌から防御する方法。
【請求項２０】
前記第１のベクターがプラスミドであり、前記第２のベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のベクターがアデノウイルスベクターであり、前記第２のベクターがプラスミドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む第１のベクターを哺乳類に導入すること、
（ｂ）予め決定された時間経過させること、および
（ｃ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む第２のベクターを前記哺乳類に導入すること、
を含む、結腸癌に罹患した前記哺乳類の治療方法。
【請求項２３】
前記第１のベクターがプラスミドであり、前記第２のベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のベクターがアデノウイルスベクターであり、前記第２のベクターがプラスミドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号１６に記載されているヒト癌胎児抗原（ＣＥＡ）蛋白質変種をコードするヌクレオチドの配列を含み、ヒト細胞において高レベルで発現するためにコドンが最適化されている合成核酸分子。
【請求項２６】
前記ヌクレオチドの配列が配列番号１５で表したヌクレオチドの配列を含む、請求項２５に記載の合成核酸分子。
【請求項２７】
請求項２５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１】
配列番号２に記載されているヒト癌胎児抗原（ＣＥＡ）蛋白質をコードするヌクレオチドの配列を含み、ヒト細胞において高レベルで発現するためにコドンが最適化されている合成核酸分子。
【請求項２】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の合成核酸分子。
【請求項３】
前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１に記載の合成核酸分子。
【請求項４】
前記核酸がｃＤＮＡである、請求項１に記載の合成核酸分子。
【請求項５】
前記ヌクレオチドの配列が配列番号１で表したヌクレオチドの配列を含む、請求項１に記載の合成核酸分子。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
（ａ）請求項１に記載の核酸を含むベクターを適切な宿主細胞中に導入すること、および
（ｂ）前記ヒトＣＥＡ蛋白質の発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養すること、を含む、組換え宿主細胞中でヒト癌胎児抗原（ＣＥＡ）蛋白質を発現する方法。
【請求項９】
配列番号２で表したヒト癌胎児抗原（ｈＣＥＡ）蛋白質または配列番号１６で表したＣＥＡ蛋白質変種をコードするヌクレオチドの配列を含むコドン最適化合成核酸分子を含むワクチンベクターを哺乳類に投与することを含む、癌の予防または治療方法。
【請求項１０】
前記哺乳類がヒトである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベクターがアデノウイルスベクターまたはプラスミドベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベクターが、Ｅ１領域中に欠失を有し、及び前記Ｅ１領域中に挿入部分を有するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスベクターであり、
前記挿入部分が、
（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む発現カセットを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターが、
プラスミド部分と、
（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチド、および
（ｂ）該ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターを含む発現カセットと、
を含むプラスミドワクチンベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
Ｅ１領域中に欠失を有し、及び前記Ｅ１領域中に挿入部分を有するアデノウイルスゲノムを含み、
前記挿入部分が、
（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む発現カセットを含む、アデノウイルスワクチンベクター。
【請求項１５】
Ａｄ５ベクターである、請求項１４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１６】
Ａｄ６ベクターである、請求項１４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
Ａｄ２４ベクターである、請求項１４に記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１８】
プラスミド部分と発現カセット部分を含み、
前記発現カセット部分が、
（ａ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む、ワクチンプラスミド。
【請求項１９】
（ａ）（ｉ）ヒト癌胎児抗原（ＣＥＡ）蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む第１のベクターを哺乳類に導入すること、
（ｂ）予め決定された時間経過させること、および
（ｃ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む第２のベクターを前記哺乳類に導入すること、
を含む、前記哺乳類を癌から防御する方法。
【請求項２０】
前記第１のベクターがプラスミドであり、前記第２のベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のベクターがアデノウイルスベクターであり、前記第２のベクターがプラスミドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む第１のベクターを哺乳類に導入すること、
（ｂ）予め決定された時間経過させること、および
（ｃ）（ｉ）ヒトＣＥＡ蛋白質またはそれらの変種をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドに操作可能に結合されたプロモーターと、
を含む第２のベクターを前記哺乳類に導入すること、
を含む、結腸癌に罹患した前記哺乳類の治療方法。
【請求項２３】
前記第１のベクターがプラスミドであり、前記第２のベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のベクターがアデノウイルスベクターであり、前記第２のベクターがプラスミドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
配列番号１６に記載されているヒト癌胎児抗原（ＣＥＡ）蛋白質変種をコードするヌクレオチドの配列を含み、ヒト細胞において高レベルで発現するためにコドンが最適化されている合成核酸分子。
【請求項２６】
前記ヌクレオチドの配列が配列番号１５で表したヌクレオチドの配列を含む、請求項２５に記載の合成核酸分子。
【請求項２７】
請求項２５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【図１】
【図７】
【図８】
【図９】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５２３６１０（Ｐ２００７−５２３６１０Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０５３８２（Ｐ２００６−５０５３８２）
【出願日】平成１６年５月３日（２００４．５．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４８０２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９２４７
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月３日（２００４．５．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４８０２
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９２４７
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
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