癌診断のための方法、システム、および組成物
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）、例えば、脳脊髄液、脳もしくは脊髄組織試料、または他の生体液における遺伝子またはタンパク質発現の変化を検出することによって、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するための方法、システムおよび組成物を特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌のリスク評価、同定、診断、予後診断、および／またはモニタリング、ならびに早期治療的介入のための、方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
早期診断および同時に行われる早期治療的介入がほとんどのヒト疾患の治療および／または管理の成功の鍵となることは自明である。しかし、多くの疾患は、現在、病的過程がすでに進行してしまってからしか診断することができないか、または診断されない。例えば、多くの固形腫瘍は触診または組織イメージング技法によって可視化できるようになるまでは（すなわち、固形腫瘍のサイズが少なくとも０．５ｃｍとなるまで）、通常臨床的に検出不可能であり、それまでに何年も異常増殖が存在しているという可能性がある。同様に、糖尿病（空腹時血漿血糖値上昇または高血糖）の診断基準は、耐糖能障害（高血糖の根本原因）がすでに存在する場合に、疾患を同定する。別の例では、関節リウマチ（ＲＡ）は、関節硬直および関節痛の存在ならびに陽性のリウマチ因子の存在によって診断され、ＲＡを示す因子は全てすでに存在し、進行している可能性がある。
【０００３】
神経系の１つの主な機能は、ある閾値に到達する信号を感知し反応することにより、恒常性を維持することである。中枢神経系（ＣＮＳ）は、免疫系等の以前は無関係とみなされていた他の系から出る信号を感知し反応することができる（Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ａｎｄ ｄｅｌ Ｒｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １７（１）：６４−１０２（１９９６）（非特許文献１）、Ｔｒａｃｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ４２０（６９１７）：８５３−８５９（２００２）（非特許文献２）、Ｂｌａｌｏｃｋ， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． ２５７（２）：１２６−１３８（２００５）（非特許文献３）、Ａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３４５（８９４２）：９９−１０３（１９９５）（非特許文献４）、Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５（６）５７５−５８１（２００４）（非特許文献５））。例えば、脳は、免疫性末梢信号を感知し、視床下部−下垂体−副腎軸の活性化により反応することができ、その結果、進行中の免疫応答の調整をもたらす（Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１， ５６４（１９８３）（非特許文献６）； Ａ． Ｖ． Ｔｕｒｎｂｕｌｌ， Ｃ． Ｌ． Ｒｉｖｉｅｒ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７９，１（１９９９）（非特許文献７））。末梢信号は、液性、または迷走神経活性化等の、近年発見された神経経路により脳に影響を与えることができ、ＣＮＳと末梢との間の伝達の新しい経路が、いまだに発見されていないという考えを支持する（Ｔｒａｃｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ４２０（６９１７）：８５３−８５９（２００２）（非特許文献８）； Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｎ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８５（１−３）：４９−５９（２０００）（非特許文献９））。
【０００４】
癌は、先進工業国において、いまだに主な死亡原因である。患者生存の大幅な改善は、主に、まだ除去が可能である早期疾病検出により達成されており、可能な限り早期の段階に癌の存在を検出する必要性を強調する（Ｅｔｚｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ３（４）：２４３−２５２（２００３）（非特許文献１０））。
【０００５】
癌の進行は、高いゲノムの不安定性および高い突然変異率により特徴付けられ、各突然変異は、新しい遺伝子クローンを生成する（Ｋｈｏｎｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３（１１）：９９９−１００５（２００２）（非特許文献１１））。
【０００６】
機能的ゲノミクスおよびプロテオミクス等の高スループットスクリーニング方法の開発は、種々の疾患に関連する分子を探索する新たな生物学的基盤を提供している。マイクロアレイ分析に基づいた遺伝子−発現プロファイルは、肺癌患者の生存率を予測するのに幾分か有用となっている（Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８（８）：８１６−２４（２００２）（非特許文献１２））。同様の方法は、併用化学療法後のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の臨床成績を予測するのに有用であると言われた遺伝子群を同定した（Ｓｈｉｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８（１）：６８−７４（２００２）（非特許文献１３））。また、卵巣癌患者または前立腺癌患者と非癌ボランティアのプロテオミクスプロファイルの比較は、早期癌検出に有用である可能性のある一連の血清タンパク質を提供すると言われた（Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５９（９３０６）：５７２−７（２００２）（非特許文献１４）； Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９４（２０）：１５７６−８（２００２）（非特許文献１５））。
【０００７】
現在では、癌のほとんどの機能的ゲノミクス研究は、患者から得られる癌試料を使用して、（ゲノミクスまたはプロテオミクス方法によって）癌関連遺伝子発現プロファイルを生成している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ａｎｄ ｄｅｌ Ｒｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １７（１）：６４−１０２（１９９６）
【非特許文献２】Ｔｒａｃｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ４２０（６９１７）：８５３−８５９（２００２）
【非特許文献３】Ｂｌａｌｏｃｋ， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． ２５７（２）：１２６−１３８（２００５）
【非特許文献４】Ａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３４５（８９４２）：９９−１０３（１９９５）
【非特許文献５】Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５（６）５７５−５８１（２００４）
【非特許文献６】Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１， ５６４（１９８３）
【非特許文献７】Ａ． Ｖ． Ｔｕｒｎｂｕｌｌ， Ｃ． Ｌ． Ｒｉｖｉｅｒ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７９，１（１９９９）
【非特許文献８】Ｔｒａｃｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ４２０（６９１７）：８５３−８５９（２００２）
【非特許文献９】Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｎ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８５（１−３）：４９−５９（２０００）
【非特許文献１０】Ｅｔｚｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ３（４）：２４３−２５２（２００３）
【非特許文献１１】Ｋｈｏｎｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３（１１）：９９９−１００５（２００２）
【非特許文献１２】Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８（８）：８１６−２４（２００２）
【非特許文献１３】Ｓｈｉｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８（１）：６８−７４（２００２）
【非特許文献１４】Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５９（９３０６）：５７２−７（２００２）
【非特許文献１５】Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９４（２０）：１５７６−８（２００２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載する方法およびシステムは、少なくとも一部で、中枢神経系（ＣＮＳ）が、末梢（非ＣＮＳ）癌の存在に応答した遺伝子発現の特定の変化（例えば、遺伝子発現パターンの変化）を示すという発見に基づいている。いかなる理論にも拘束されないが、本発明者らは、ＣＮＳ、例えば、脳の遺伝子発現の特定の変化は、癌発症の早期段階、例えば、疾患が臨床的に検出可能になる前および／または対象が症状を呈す前に、末梢癌の存在に応答して生じると考えている。したがって、本明細書に記載のＣＮＳの遺伝子発現の変化またはパターンを分析することによって、末梢癌を早期段階において診断し、早期治療的介入の標的とすることができる。
【００１０】
一態様において、本発明は、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するための方法を提供する。方法は、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、もしくは２１〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載する遺伝子またはその相同物、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂに記載する１つ以上の遺伝子より選択される、５つ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供するステップと、対象のＣＮＳ試料中の基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子の発現を検出するステップを含む、対象の遺伝子発現プロファイルを生成するステップと、対象の遺伝子発現プロファイルを基準遺伝子発現プロファイルと比較するステップとを含む。対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。一部の実施形態において、該方法はまた、１人以上の健康な被験体に対応する対照遺伝子発現プロファイルを提供するステップと、対象の遺伝子発現プロファイルを対照遺伝子発現プロファイルと比較するステップであって、対象の遺伝子発現プロファイルと対照遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が非ＣＮＳ癌を有さず、非ＣＮＳ癌を発症する可能性が低いことを示す、ステップと、を含む。
【００１１】
一部の実施形態においては、ＣＮＳ試料は、脳からの１つ以上の細胞、例えば、視床下部、中脳、および前前頭皮質からの細胞の試料である。一部の実施形態においては、脳細胞は、視床下部からのものである。
【００１２】
一部の実施形態においては、２つ以上の基準遺伝子発現プロファイルが使用され、それぞれは、異なる非ＣＮＳ癌に特異的である。
【００１３】
一部の実施形態においては、非ＣＮＳ癌は、肺癌、結腸癌、および乳癌からなる群より選択される。一部の実施形態においては、非ＣＮＳ癌は、直径０．５ｃｍ未満の固形腫瘍である。
【００１４】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載するいずれかの遺伝子、またはその相同物より選択される、１０個以上の遺伝子を含む。
【００１５】
遺伝子発現は、当技術分野で既知のいかなる方法をも使用して検出されることが可能であり、好適な実施形態においては、遺伝子発現は、マイクロアレイアッセイを使用して検出される。
【００１６】
一部の実施形態においては、対象は、ヒトであり、基準遺伝子発現プロファイルは、図５５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載する遺伝子の、１つ以上のヒト相同物を含む。対象は、癌の家族歴を有し得、画像分析で評価されたときに癌の臨床徴候を欠く可能性があり、および／またはＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、もしくはｈＭＳＨ６遺伝子等の非ＣＮＳ癌を発症するリスクが高いことに関連する遺伝子の保有者であり得る。
【００１７】
一部の実施形態において、該方法は、比較するステップの結果の記録を生成するステップと、任意で、対象、医療提供者または他の当事者に記録を伝達するステップと、をさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ肺癌を有しているか、発症する可能性が高いことを示す。
【００１９】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ乳癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００２０】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ結腸癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００２１】
別の態様において、本発明は、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌の存在に対応する基準遺伝子発現プロファイルを特徴とする。プロファイルは、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、または２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載するいずれかの遺伝子、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂのうちの１つまたは両方に記載するいずれかの遺伝子より選択される、５つ以上の遺伝子、例えば、１０、１２、２０、３０、４０、または５０個の遺伝子の発現データを含むことができる。
【００２２】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載するいずれかの遺伝子より選択される、５つ以上の遺伝子の発現データを含む。
【００２３】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌は、肺癌である。一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、５つ以上の遺伝子の発現データを含み、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌は、肺癌である。
【００２４】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌は、乳癌である。一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物の発現データを含み、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌は、乳癌である。
【００２５】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌は、結腸癌である。一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、５つ以上の遺伝子の発現データを含む。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載する基準遺伝子発現プロファイルに対応するデータセットを含む、コンピュータが読み取り可能な媒体を提供する。
【００２７】
付加的な態様において、本発明は、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するためのシステムを特徴とする。該システムは、
中枢神経系（ＣＮＳ）試料を得るためのサンプリング装置と、
ＣＮＳ試料中の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現データを生成する遺伝子発現検出装置、またはＣＮＳ中の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現の画像を得、１つ以上の遺伝子の遺伝子発現データを生成するためのイメージング装置と、
特定の非ＣＮＳ癌に対する、本明細書に記載される、基準遺伝子発現プロファイルと、
遺伝子発現データを受信し、基準遺伝子発現プロファイルと比較する比較器
とを含む。
【００２８】
さらに別の態様において、本発明は、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するための方法を提供する。該方法は、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載するいずれかの遺伝子、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂのうちの１つまたは両方に記載するいずれかの遺伝子より選択される５つ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供するステップと、対象のＣＮＳ試料（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料）中の基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子によりコードされる、タンパク質の発現を検出するステップを含む、対象の発現プロファイルを生成するステップと、対象の発現プロファイルを基準遺伝子発現プロファイルと比較するステップとを含む。対象の発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００２９】
一部の実施形態においては、２つ以上の基準遺伝子発現プロファイルが使用され、それぞれは異なる非ＣＮＳ癌に特異的である。
【００３０】
一部の実施形態においては、非ＣＮＳ癌は、肺癌、結腸癌、および乳癌からなる群より選択される。
【００３１】
一部の実施形態においては、非ＣＮＳ癌は、直径０．５ｃｍ未満の固形腫瘍である。
【００３２】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載するいずれかの遺伝子またはその相同物より選択される、５つ以上の遺伝子を含む。
【００３３】
一部の実施形態においては、該方法はまた、１体以上の健康な被験体に対応する対照遺伝子発現プロファイルを得るステップと、対象の発現プロファイルを対照遺伝子発現プロファイルと比較するステップであって、対象の発現プロファイルと対照遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が非ＣＮＳ癌を有さず、非ＣＮＳ癌を発症しないであろうということを示す、ステップと、を含む。
【００３４】
一部の実施形態においては、対象は、ヒトであり、基準遺伝子発現プロファイルは、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載する遺伝子の１つ以上のヒト相同物を含む。
【００３５】
対象は、癌の家族歴を有し得、画像分析で評価されたときに癌の臨床徴候を欠く可能性があり、および／またはＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、またはｈＭＳＨ６遺伝子等の非ＣＮＳ癌を発症するリスクが高いことに関連する遺伝子の保有者であり得る。
【００３６】
請求項３０に記載の方法は、比較するステップの結果の記録を生成するステップと、任意で、対象、医療提供者または他の当事者に記録を伝達するステップと、をさらに含む。
【００３７】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ肺癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００３８】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ乳癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００３９】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ結腸癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００４０】
別の態様において、本発明は、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するための方法を特徴とする。該方法は、Ａｔｘｎ２、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ａｔｐ５ｋ、Ｇｐｒ１０９ａ、およびＫｉｎからなる群より選択される５つ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供するステップと、対象の血液試料中の基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子の発現を検出するステップを含む、対象の遺伝子発現プロファイルを生成するステップと、対象の遺伝子発現プロファイルを基準遺伝子発現プロファイルと比較するステップとを含む。対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００４１】
なおさらなる態様において、本発明は、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するための方法を提供する。該方法は、表１に記載する遺伝子より選択される５つ以上のタンパク質を含む、基準タンパク質発現プロファイルを提供するステップと、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中の基準タンパク質発現プロファイルの全てのタンパク質の発現を検出するステップを含む、対象のタンパク質発現プロファイルを生成するステップと、対象のタンパク質発現プロファイルを基準タンパク質発現プロファイルと比較するステップとを含む。対象のタンパク質発現プロファイルと基準タンパク質発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００４２】
本明細書に記載する方法は、特に、種々の疾患のリスク評価のため、疾病の早期検出および診断のため、疾病の進行のモニタリングのため、疾病の治療効果のモニタリングのため、および／または臨床状態の評価のために有用である。
【００４３】
本明細書において使用する「疾患」または「疾病」は、生体または細胞、組織もしくは器官の一部の健康を脅かす状態の変化である。２つの用語は、疾患の極早期段階（例えば、対象または医療提供者によって検出できない可能性があるが、疾病過程を開始している生体の早期変化）を含む全ての疾患段階を含むことを意味する。例えば、「疾患」および「疾病」という用語は、新生物または腫瘍が形成される前の異常増殖期、および例えば、関節リウマチの発症において、炎症が現れる前の抗原に対する早期免疫応答を含む。
【００４４】
本明細書において使用する「異常増殖」または「癌」は、正常な細胞の増殖を通常は誘発しないと考えられる、または正常な細胞の増殖を停止すると考えられる条件下における細胞の未制御かつ進行性の増殖である。異常増殖は、組織の新たな異常な増殖である、「新生物」の形成を生じる可能性がある。異常に増殖する細胞が塊を形成すると、新生物は、一般に、「腫瘍」と称される。新生物または癌は、良性または悪性となり得る。
【００４５】
「対象」は、考えられる癌の存在について試験されるヒトまたは動物である。動物は、哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシもしくはヤギ等の家畜、実験用齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモットまたはハムスター）等の実験動物、ウサギ、または実験用霊長類、例えば、チンパンジーもしくはサルであることが可能である。
【００４６】
本明細書において使用する「一致する（ｍａｔｃｈｅｓ）、（ｍａｔｃｈｉｎｇ）」または「一致（ｍａｔｃｈ）」という用語は、発現プロファイルの比較に関する場合、対象の発現プロファイルの遺伝子の少なくとも７５％が、差次的に発現されることを意味する。差次的発現の方向に関するデータが、基準発現プロファイルに含まれる場合、「一致」は、対象の発現プロファイルの遺伝子の少なくとも７５％が、基準発現プロファイルの遺伝子と同じ方法で上方または下方制御されていることを意味する。例えば、基準発現プロファイルにおいて遺伝子１〜５が上方制御されており、遺伝子６〜１０が下方制御されている場合には、遺伝子１〜１０が下方制御されている対象のプロファイルは一致していないと考えられるが、遺伝子１、２、３、４および６が上方制御されており、遺伝子５、７、８、９および１０が下方制御されている対象のプロファイルは一致していると考えられる。
【００４７】
「高レベルの一致」は、遺伝子の少なくとも７５％が、基準発現プロファイルの遺伝子の発現レベルの少なくともプラスまたはマイナス５０％（または発現レベルの比のＬｏｇ２）内にあることを意味する。例えば、以下の基準発現プロファイルを仮定する。遺伝子Ａでは、疾患が存在しない場合の発現レベルに対する疾患が存在する場合の発現レベルのＬｏｇ２比は＋０．４であり、遺伝子Ｂでは、比は−０．４であり、遺伝子Ｃでは、比は＋０．２であり、および遺伝子Ｄでは、比は−０．２である。対象のプロファイルの遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ（基準プロファイルの遺伝子の７５％）が、それらの基準プロファイルの遺伝子に対する比の±５０％内であるため、以下の値（Ａ＝＋０．３、Ｂ＝−０．３、Ｃ＝＋０．１、Ｄ＝＋０．３）を有する対象のプロファイルは、高レベルの一致である。
【００４８】
本明細書に記載するものと同様または等価な方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載する全ての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は全体の内容が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示的にすぎず、限定をする意図はない。
【００４９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】異なる腫瘍細胞（肺、乳房、および結腸）の注射後の異なる経過時点における、マウスのＣＮＳにおいて差次的に発現される遺伝子の数をそれらのそれぞれの対照と比較して示す表である。この表のデータは、複数の分散分析（ＡＮＯＶＡ）テストにより得られ、１つのテストが各経過時点に対応する。表は、差次的に発現される遺伝子の数（遺伝子の列）、上方制御された差次的に発現される遺伝子の割合（上方の列）、平均倍率変化（倍率の列）、ならびに第５および第９５パーセンタイルを示す。データは、＞１．２の倍率変化を示す遺伝子に対応する。
【図２】生物学的反復の標準誤差により評価されたグラフの形態によるデータセットの品質の分析を示す、一連のグラフである。グラフは、種々の疾病モデル、すなわち、肺癌（図２Ａ）、乳癌（図２Ｂ）、結腸癌（図２Ｃ）、および関節炎（図２Ｄ）に対する、ｌｏｇ１０標準誤差（ＡＳＥ）の絶対値およびそれらの中央値の密度分布を示す。「Ｈｔ」は、視床下部を意味し、「Ｃｘ」は、前前頭皮質を意味し、「Ｍｂ」は、中脳を意味し、「Ｌｉ」は、肝臓を意味する。
【図３】腫瘍細胞を注射したマウスに差次的に発現される遺伝子の数をそれらのそれぞれの対照と比較して示す表である。差次的に発現される遺伝子は、本明細書に記載されているように選択された（初期分析）。表は、差次的に発現される遺伝子の数（遺伝子の行）、上方制御された遺伝子の割合（上方の行）、平均倍率変化（倍率の行）、ならびに第５および第９５パーセンタイルを示す。データは、＞１．２の倍率変化を示す遺伝子に対応する。
【図４】癌細胞を注射したマウスに差次的に発現される遺伝子の数をそれらのそれぞれの対照と比較して示す表である。選択された遺伝子は、一方向のみに変化した発現を示す遺伝子に対応する（第２のより限定的な分析）。表は、差次的に発現される遺伝子の数（遺伝子の行）、上方制御された遺伝子の割合（上方の行）、平均倍率変化（倍率の行）、ならびに第５および第９５パーセンタイルを示す。データは、＞１．２の倍率変化を示す遺伝子に対応する（遺伝子選択に関するさらなる詳細については、実験方法を参照）。
【図５】（図５Ａ−Ｉ）癌細胞を注射したマウスの脳に差次的に発現される遺伝子の表である。この表に含めるために選択される遺伝子は、より限定的な分析（実施例３に記載する）において、一方向のみ（すなわち、上または下）に変化した発現を示す遺伝子に対応する。各表は、以下のようなある脳領域に差次的に発現される遺伝子を含む。５Ａ〜Ｃ、皮質；５Ｄ〜Ｆ、視床下部；および５Ｇ〜Ｉ、中脳。マウスは、結腸癌細胞（５Ａ、５Ｄ、および５Ｇ）、乳癌細胞（５Ｂ、５Ｅ、および５Ｈ）、または肺（５Ｃ、５Ｆ、および５Ｉ）癌細胞を注射された。（図５Ｊ）癌細胞を注射したマウスに差次的に発現されるさらなる遺伝子の一連の表である。この表に含めるために選択される遺伝子は、対データのＡＮＯＶＡを使用して、より限定的な分析（実施例３に記載する）において、一方向のみに変化した発現を示す遺伝子に対応する。Ｈｔ、視床下部；ｃｔ、皮質；ｍｂ、中脳。
【図６】３つの癌モデルに対応する異なる脳領域および肝臓データセットの誤り発見率（Ｆａｌｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ：ＦＤＲ；ｑ値）を示す、一連のグラフである。発現レベルにおいて＞１．２の倍率変化を示す遺伝子は、それらの差次的発現のｐ値に応じてランクごとに分類された。図は、このランク付けされたリストから推定されるｑ値を示す。Ｃｘ：前前頭皮質、Ｈｔ：視床下部、Ｍｂ：中脳、Ｌｉ：肝臓。
【図７Ａ】リアルタイムＰＣＲによるマイクロアレイデータの確証を示す、棒グラフである。肺癌モデルの視床下部に対応する遺伝子は、基準１または２により選択され、それらの倍率変化に応じてグループ化された。棒は、確証された経過時点の割合を表し、棒上の数字は、アッセイした経過時点の数を示す。
【図７Ｂ】３つの脳領域に対する、肺、乳房、および結腸癌モデルの共通部分を示す、一連のベン図である。数字は、第２のより限定的な分析中に差次的に発現される遺伝子の数を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１ フィッシャーの直接確率検定。
【図８】（８Ａ−Ｃ）視床下部試料の一連の３つの二次元クラスター分析である。（８Ａ）これらの腫瘍モデル間で差次的に応答する遺伝子に基づいた、肺および結腸癌モデルから得られる視床下部試料の階層的クラスター分析である。対にしたモデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいた、（８Ｂ）乳房および肺癌モデル、ならびに（８Ｃ）結腸および乳癌モデルからの試料の階層的クラスター分析である。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要なクラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。（８Ｄ−Ｆ）図８Ａ〜図８Ｃに示す視床下部試料のクラスター分析で同定される遺伝子を記載する表である。８Ｄ、結腸対乳房；８Ｅ、結腸対肺；８Ｆ、乳房対肺。
【図９】（９Ａ−Ｃ）一連の３つの二次元クラスター分析である。皮質試料は、対にした癌モデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいて、（Ａ）乳房および肺癌モデル、（Ｂ）結腸および肺癌モデル、ならびに（Ｃ）乳房および結腸癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要クラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。（９Ｄ−Ｆ）図９Ａ〜図９Ｃに示す視床下部試料のクラスター分析において同定される遺伝子を記載する表である。９Ｄ、結腸対乳房；９Ｅ、結腸対肺；９Ｆ、乳房対肺。
【図１０】一連の３つの二次元クラスター分析である。中脳試料は、対にした癌モデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいて、（Ａ）乳房および肺癌モデル，（Ｂ）結腸および肺癌モデル、ならびに（Ｃ）乳房および結腸癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要クラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。
【図１１】リアルタイムＰＣＲにより確証された、肺、乳房、および結腸癌細胞を注射したマウスの視床下部、前前頭皮質、および中脳より選択される遺伝子の表である。これらの表中の遺伝子は、施設内でプリントされた１０Ｋオリゴヌクレオチドアレイ（ｐ＜０．０５）から得られた。１１Ａおよび１１Ｂの列の定義は、以下の通りである。領域：試料が得られた脳領域、モデル：癌モデル、遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、倍率：倍率変化（％）、ｐ値：ＡＮＯＶＡにより推定されるｐ値（＜０．０５であるべきである）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図１２】リアルタイムＰＣＲによりアッセイした遺伝子の表である。これらの表中の遺伝子は、施設内でプリントされた１０Ｋオリゴヌクレオチドアレイには存在しなかったが、疾病行動として既知の行動状態に関与することが知られている。データは、平均の平均±標準誤差として表現される。列の定義：領域：試料が得られた脳領域、モデル：癌モデル、遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、倍率：倍率変化（％）、ｐ値：ＡＮＯＶＡにより推定されるｐ値（＜０．０５であるべきである）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図１３】行動テストの結果を示す棒グラフである。（１３Ａ）腫瘍細胞の注射後の異なる経過時点において、マウスによりチューブから移された（掘られた）ペレットの平均重量。１群当たりｎ＝９匹の動物。（１３Ｂ）腫瘍細胞の注射後９日目に行われた強制水泳試験。Ｙ軸は、不動状態までの時間（秒）を示す。１群当たりｎ＝７匹の動物。
【図１４】（１４Ａ−Ｃ）一連の３つの二次元クラスター分析である。視床下部試料は、異なる対にしたモデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいて、（１４Ａ）関節炎および肺癌モデル、（１４Ｂ）関節炎、および乳癌モデル、ならびに（１４Ｃ）関節炎および結腸癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要クラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。（１４Ｄ−Ｇ）関節炎および癌モデル間で視床下部に差次的に発現される遺伝子の表である。１４Ｄ、関節炎対結腸；１４Ｅ、関節炎対肺；１４Ｆ、関節炎対乳房；１４Ｇ、関節炎対結腸、肺、および乳房。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図１５】（１５Ａ−Ｃ）一連の３つの二次元クラスター分析である。皮質試料は、異なる対にしたモデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいて、（１５Ａ）関節炎および肺癌モデル、（１５Ｂ）関節炎および乳癌モデル、ならびに（１５Ｃ）関節炎および結腸癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要クラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。（１５Ｄ−Ｇ）関節炎および癌モデル間で皮質に差次的に発現される遺伝子の表である。１５Ｄ、関節炎対結腸；１５Ｅ、関節炎対肺；１５Ｆ、関節炎対乳房；１５Ｇ、関節炎対結腸、肺、および乳房。列の定義は、図１４Ｄ〜Ｇと同様である。
【図１６】（１６Ａ−Ｃ）一連の３つの二次元クラスター分析である。中脳試料は、異なる対にしたモデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいて、（Ａ）関節炎および肺癌モデル、（Ｂ）関節炎および乳癌モデル、ならびに（Ｃ）関節炎および結腸癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要クラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。（１６Ｄ−Ｇ）関節炎および癌モデル間で中脳に差次的に発現される遺伝子の表である。１５６、関節炎対結腸；１６Ｅ、関節炎対肺；１６Ｆ、関節炎対乳房；１６Ｇ、関節炎対結腸、肺、および乳房。列の定義は、図１４Ｄ〜Ｇと同様である。
【図１７】（１７Ａ）視床下部試料の階層的クラスター分析は、各一対比較からの１０個の上位にランク付けされた遺伝子に基づいて、関節炎および癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。白線は、試料の優性クラスターへの細分を示す。試料標識は、疾病モデルおよび経過時点を示す。（１７Ｂ−Ｄ）ｐ値＜０．０５および倍率＞２０％を有するいずれかの関節炎モデルに対して変化する、各領域より選択される遺伝子の表であるが、それが両方のモデルにおいて変化する場合は、変化は同一方向でなければならず、例えば、少なくとも１つの経過時点において変化した遺伝子、２つ以上の経過時点において変化した遺伝子は、同一方向に変化していなければならない（すなわち、必ず上方または下方制御されている）。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、Ｃ５７およびＤＢＡ：各関節炎モデル（Ｃ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／１）に対する倍率変化（％）、最大：いずれかの関節炎モデルに対する最大倍率変化（＞２０であるべきである）、ｐ値：ＡＮＯＶＡにより推定されるｐ値（＜０．０５であるべきである）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図１８】関節炎モデルに対応する異なる脳領域データセットに対する誤り発見率（ＦＤＲ；ｑ値）を示すグラフである。発現レベルにおいて２０％を上回る倍率変化を示す遺伝子は、それらの差次的発現のｐ値に応じてランクごとに分類された。図は、このランク付けされたリストから推定されるｑ値を示す。Ｃｘ：前前頭皮質、Ｈｔ：視床下部、Ｍｂ：中脳。
【図１９】（１９Ａ，Ｄ，Ｇ）差次的に発現される遺伝子が豊富なＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉａデータベース（ＧＯ）遺伝子セットを示す、有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）である。黒丸は、ｐ＜０．０５における差次的遺伝子セットを表す。強度は、平均倍率変化を各遺伝子セットについての割合として示す（ｐ＜０．０５、ＧＳＥＡ）。白丸は、非差次的遺伝子セットを示す（ｐ＞０．０５）。密接に関係した遺伝子セットは、３つの経過時点にわたって同色でハイライトされるカテゴリ（上部標識）にグループ化された。最先端遺伝子（ＬＥＧ）は、選択された末端遺伝子セットから同定された。（１９Ｂ，Ｅ，Ｈ）成人の脳におけるそれらの生物学的機能に応じて、手動でグループ化されたＬＥＧを示す棒グラフである。（１９Ｃ，Ｆ，Ｉ）特定の信号伝達経路に属する「ニューロン結合」機能に対応する、遺伝子の数を図示する棒グラフである。水平棒は、信号伝達経路を示し、サイズは、遺伝子量に比例する。（１９Ｊ−Ｌ）乳癌（１９Ｊ）、結腸癌（１９Ｋ）、および肺癌（１９Ｌ）に対する差次的遺伝子オントロジーセットからの視床下部最先端遺伝子の表である。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、倍率：倍率変化（％）、ｐ．値：ＡＮＯＶＡにより推定されるｐ値（＜０．０５であるべきである）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図２０】癌に応答して脳に差次的に発現される個々の遺伝子のリストである。このリストは、異なる癌モデルを区別する遺伝子発現プロファイルに対するもの（図１１〜図１２）を除いて、前のリスト（図５、８〜１０、および１４〜１６）のうちの少なくとも１つに存在する遺伝子を含む。遺伝子の合計数：９９９。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図２１】各腫瘍の種類（結腸）に対する５０個の最有力候補遺伝子のリストである。これらのリストは、本明細書に記載するリストから作成されており、対としたデータに対するＡＮＯＶＡを使用して、リアルタイムＰＣＲおよび図５により確証された遺伝子を含む。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図２２】各腫瘍の種類（肺）に対する５０個の最有力候補遺伝子のリストである。これらのリストは、本明細書に記載するリストから作成されており、対としたデータに対するＡＮＯＶＡを使用して、リアルタイムＰＣＲおよび図５により確証された遺伝子を含む。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図２３】各腫瘍の種類（乳房）に対する５０個の最有力候補遺伝子のリストである。これらのリストは、本明細書に記載するリストから作成されており、対としたデータに対するＡＮＯＶＡを使用して、リアルタイムＰＣＲおよび図５により確証された遺伝子を含む。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
詳細な説明
本明細書に記載する方法は、一部には、癌の早期段階の（癌出現の数時間以内、数日以内、数週間以内または数ヶ月以内の場合もある）末梢（非ＣＮＳ）組織または器官を同定する（例えば、診断するまたはモニタする）ために、ＣＮＳにおける遺伝子発現の検出に依拠している。疾病の早期同定および／または診断は、早期治療的介入の機会を提供し、癌が過度に進行する、または攻撃的になる前に癌を標的とする。
【００５２】
一般的な方法
ＣＮＳは、強度または機能的関連性によって、内部恒常性を変更する可能性のある任意の内部または外部刺激に対する生体の応答に関与する。この機能の一部として、ＣＮＳおよび免疫系は、適宜、相互作用して適切な免疫応答を得る。
【００５３】
免疫応答は、神経および液性機序を介して脳に影響を与える。神経機序は、主に、迷走神経の活動に関係する。１８（３）：１３０−１３６６（１９９５）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４２１（６９２１）：３８４−３８８（２００３））。液性機構には、例えば、サトカイン介在による神経発火率の上昇など、脳構造上に直接働きかける、サトカイン介在の作用が挙げられる。（Ｒｏｔｈｗｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｐｋｉｎｓ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８）３：１３０−１３６６（１９９５）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４２１ ）６９２１：３８４−８３３（２００３））。一例において、末梢サイトカインは迷走神経に結合して、活性化し、脳の孤束および視床下部の核のニューロンを活性化することが示されている（Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ Ｍａｉｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６（１４）：７７１０−７７１３（１９９９））。
【００５４】
末梢からの液性信号は、脳への強力なメッセンジャーとして作用する。脳内のサイトカインは、末梢よりはるかに低用量で作用を発揮することができる。例えば、１００ｐｇ〜１０ｎｇの用量のインターロイキン−１（ＩＬ−１）の脳内投与は、体温、胃の機能、代謝の増加および挙動変化の最大限の変化を誘発するが、末梢に投与した際、同様の応答を誘発するためには数マイクログラムのこのサイトカインが必要である（Ｒｏｔｈｗｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｐｋｉｎｓ，（１９９５）、前記）。
【００５５】
内部免疫信号を感知すると、脳は種々の様態で反応する。免疫信号に対するＣＮＳ応答のパラダイムの一つは、視床下部−脳下垂体−副腎軸等の神経内分泌軸の活性化である。この軸が活性化されると、糖質コルチコイドが遊離され、進行中の免疫応答を１０分未満で調節することができる。迷走神経切離は、サイトカインの腹腔内投与後、視床下部下垂体副腎軸の活性化を弱めることが示されている（Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ Ｍａｉｅｒ，（１９９９）、前記）。このフィードバック機序は生理学的関連性が高い。すなわち、末梢におけるサイトカイン放出による糖質コルチコイド産生の阻害により、通常、生物は死亡する（Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ａｎｄ ｄｅｌ Ｒｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １７（１）：６４−１０２（１９９６））。
【００５６】
脳はまた、外部環境から免疫および他の系に影響する信号も感知することができる。例えば、ストレス反応の誘発により、糖質コルチコイドを放出し、進行中の免疫応答を弱くし得る。免疫系に対するストレスの影響は、動物モデルおよびヒトにおいて十分に証明されている（Ｄｅｉｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｓｙｃｈｏｐｈｙｓｉｏｌ． ３７（３）：２１９−３２（２０００）； Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ． Ｉｍｍｕｎ． １２（４）：２９７−３０７（１９９８）； Ｂｅｎｓｃｈｏｐ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０（４）：５１７−２４（１９９６）； Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４０：８０３−８（１９９８））。また、黙想またはヨガ等の精神／肉体介入が免疫系に影響を与える可能性があるという逸話的および予備的な証拠がある（Ｃａｓｓｉｌｅｔｈ， ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｃｌｉｎ． ４９（６）：３６２−７５（１９９９））。
【００５７】
本新規方法は、末梢癌および他の疾患を早期段階において検出する方法として、ＣＮＳのこの自然の反応を利用する。いかなる理論によっても限定するのではないが、本明細書に記載する該方法は、一部には、癌進行の発症の早期段階において末梢（非ＣＮＳ）疾患からの「アラーム信号」の存在をＣＮＳが感知するという発見に基づいている。したがって、本明細書に記載する該方法は、ＣＮＳ、例えば、ヒト等の対象からのＣＮＳ試料の遺伝子発現を検出することによって、末梢癌を診断するステップに関する。一態様において、非ＣＮＳ癌は、癌の進行が生体内で開始されてから、数時間、数週間、または数ヶ月以内に、脳の遺伝子発現の特定のプロファイル（例えば、脳の視床下部、皮質、および／または中脳領域に発現されるような、図５、１２、および１３における遺伝子より選択される遺伝子のプロファイル）に基づいて同定することができる。一部の実施形態においては、非ＣＮＳ癌は、癌の進行が生体内で開始されるが、癌が臨床的に検出可能になる、および／または増悪期になる前に、脳の遺伝子発現プロファイルに基づいて同定することができる。
【００５８】
癌発症
臨床的に検出可能な腫瘍塊は、異常であるが、免疫監視を逃れ、免疫系の攻撃を受けない細胞を含むことが一般に認められている。腫瘍の進行時には、細胞は、特に、組織適合性抗原の下方制御等の表現型変化に反映される高い突然変異率によって特徴付けられる。したがって、腫瘍は、クローン選択、および細胞を所定の治療に対して抵抗性にする突然変異を有する細胞クローンの腫瘍塊からの増殖によって特定の治療に抵抗性となることがある。腫瘍細胞クローンの「自然淘汰」は、所定の割合で生じ、免疫系からの成長および逸脱を促進する遺伝的および後成的特徴を有する悪性細胞が出現する。平均悪性度は１０，０００を超える突然変異を含むと推定される（Ｓｔｏｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９６（２６）：１５１２１−６（１９９９））。したがって、確立された癌の抗原プロファイルは、超早期段階の細胞の遺伝子型および表現型を反映しないと結論付けることができる。さらに、確立された癌に存在する腫瘍抗原および生物において誘導することができる応答は早期段階の腫瘍細胞によって誘導される抗原および応答と異なると考えることが妥当である。本明細書に記載する新規方法は、これらの障害にもかかわらず、このような早期段階の腫瘍細胞を検出することができる。
【００５９】
一部の新生物、例えば、一部の癌は、それらが従来の既知の技術を使用して臨床的に検出可能になる、および／またはそれらが悪性になる前に、長期間（例えば、１、２、５、１０、１５、２０、または２５年間）増殖する可能性がある。この期間は、悪性腫瘍が現在の方法によって検出可能になる前に、癌細胞を検出するための驚くほど長い機会を提供する。この期間中に、腫瘍細胞は、それらのゲノムの不安定性の結果として分子レベルのいくつかの改変を受ける。
【００６０】
それぞれの遺伝的変化は、おそらく増殖に選択的であるおよび／または先天性および適応免疫応答を回復し、活性化する新たな「アラーム信号」を誘発することができる。簡単には、腫瘍が臨床的に検出可能になる前に、１０〜１５年の腫瘍形成期間中に１０，０００のアラーム信号が作成される。
【００６１】
遺伝子発現を検出する方法
ＣＮＳにおける遺伝子発現は、生体外、例えば、単離したＣＮＳ試料において、または生体内において、例えば、生体内におけるイメージング技法を使用して検出することができる。
【００６２】
中枢神経系（ＣＮＳ）試料
ＣＮＳは、脳（脳神経を含む）および脊髄を指す。ＣＮＳ試料は、例えば、脳もしくは脊髄の細胞もしくは組織、または脳室および脊髄の中心管を満たす脳脊髄液（ＣＳＦ）試料であり得る。
【００６３】
遺伝子発現の検出が対象から単離されたＣＮＳ試料において実施される場合には、ＣＮＳ試料は、当業者が利用可能なあらゆる方法によって得ることができる。例えば、ＣＮＳ細胞または組織試料は、例えば、針生検または開放性外科的切開によって脳から得ることができる。脳のイメージングを実施して、脳に進入する針またはメスの正確な位置決めを決定することができる。
【００６４】
定位生検として知られる一例では、弱い沈静または全身麻酔下にある患者の頭蓋骨に小さい穴を開け、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャン等のコンピュータ支援式イメージング技法によってガイドして針を脳組織に挿入する。針を使用して細胞試料を取り出し、通常のアッセイ、例えば、本明細書に記載する遺伝子発現アッセイによってその遺伝子発現を検出することができる。別の例において、ＣＳＦ試料は、腰椎穿刺等の通常の方法によって得ることができる。この手技は、例えば、局所麻酔下で外来で実施することができる。
【００６５】
ＣＮＳ試料に特定の遺伝子発現アッセイを実施するのに必要な細胞数またはＣＳＦ量は異なるが、ＰＣＲに基づいた技法等のいくつかの技法では、極少数の細胞、例えば、１０〜１００細胞程度しか必要としない（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０（４）：３８７−９２（２００２））。ＣＮＳ試料は本明細書に記載する診断試験にすぐ使用しても、または例えば、冷蔵もしくは冷凍保存しても、および／または診断試験を実施する施設に輸送してもよい。
【００６６】
核酸を使用する方法
一実施形態において、本明細書に記載する方法は、（ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは遺伝子に対応する他の核酸等の）ポリヌクレオチドを検出する遺伝子発現を検出する技法を使用する。核酸を使用して遺伝子発現を検出する多数の方法が存在すること、および任意の好適な検出方法を使用することができることが当業者に理解されよう。典型的なアッセイ様式は核酸ハイブリダイゼーションを使用し、例えば、１）核ラン−オン（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎ−ｏｎ）アッセイ、２）スロットブロットアッセイ、３）ノーザンブロットアッセイ、４）磁気粒子分離、５）核酸もしくはＤＮＡアレイもしくはチップ（以下にもさらに詳細に考察されている）、６）逆ノーザンブロットアッセイ、７）ドットブロットアッセイ、８）インサイチューハイブリダイゼーション、９）ＲＮａｓｅ保護アッセイ、１０）リガーゼ連鎖反応、１１）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、１２）逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、および１３）ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）またはこれらの方法の任意の２つ以上の任意の組み合わせが挙げられる。このようなアッセイは、検出される特定の核酸の存在またはレベルを検出、同定またはモニタするために、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識または他の好適な標識等の検出可能な標識を使用することができる。このような技法および標識は当技術分野において既知であり、当業者が広範に利用することができる。
【００６７】
一実施形態において、被験対象のＣＮＳ試料から単離したｍＲＮＡに、配列パネルの１つ以上のメンバーに対応する多数のＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションすることによって、ＲＮａｓｅ保護アッセイを本明細書に記載する方法に使用することができる。ＣＮＳ試料の１つ以上の遺伝子の発現プロファイルを基準遺伝子発現プロファイル、例えば、基底状態の発現パターンまたは他の陰性もしくは陽性対照（例えば、末梢疾病がないことが既知の患者のプロファイル、または被験対象の特定の疾患がないことが既知の対象由来の標準的もしくは平均プロファイル）と比較することができる。一例において、試験ＣＮＳ試料の遺伝子発現プロファイルを、非ＣＮＳ異常増殖の存在に関連する基準遺伝子発現プロファイルと比較する。試験遺伝子発現プロファイルが基準遺伝子発現プロファイルに一致する場合には、対象は非ＣＮＳ異常増殖疾患を有するまたはそれを発症するリスクにあることを示す。
【００６８】
本明細書に記載する方法はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する方法にも好適である。ＰＣＲを使用する方法は、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：１８９−１９３，１９９１）、自己持続配列複製（３ＳＲ）（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：１８７４−１８７８， １９９０）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８６：１１７３−１１７７）、Ｑベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１９７，１９８８）、ローリングサイクル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号）または任意の他の核酸増幅方法を含み、当技術分野において既知の技法を使用する増幅分子の検出が続く。ＣＮＳ試料において発現されたｍＲＮＡのＰＣＲ増幅は、試料から単離したｍＲＮＡから直接、あるいは、そのようなｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡから行なうことができる。次いで、増幅した核酸を関心対象の特定のプローブ、例えば、本明細書に記載するＣＮＳ遺伝子のプローブにハイブリダイゼーションしてその発現を判定することができる。プローブをアレイ、例えば、本明細書に記載するアレイのアドレスに配置することができる。このような方法は日常的であり、特にコンピュータ制御式試薬分注および信号検出を使用する自動システムへ日常的に適応することができる。例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０（４）：３８７−９２（２００２）を参照されたい。
【００６９】
別の実施形態においては、特定の遺伝子に対応するｍＲＮＡの存在またはレベルを検出するために、インサイチュー方法が使用される。このような方法では、ＣＮＳ細胞または組織試料を調製／処理して、支持体、典型的にはガラススライドに固定し、次いでプローブ（例えば、本明細書に記載するＣＮＳ遺伝子のプローブ）と接触させることができる。
【００７０】
さらに別の実施形態において、米国特許第５，６９５，９３７号に記載する遺伝子発現の連続分析を使用して、本明細書に記載するＣＮＳ遺伝子の転写物レベルを検出する。
【００７１】
ポリペプチドを使用する方法
他の実施形態において、本明細書に記載する方法は、遺伝子がコードする遺伝子産物（ポリペプチド）遺伝子を検出するまたはポリペプチドの活性、例えば、酵素活性を検出する遺伝子発現を検出する技法を使用する。このような方法は、ＣＮＳ細胞から、例えば、ＣＳＦに分泌されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現を検出するのに特に有利である。
【００７２】
種々の方法を使用してＣＮＳ遺伝子がコードするタンパク質のレベルを求めることができる。一般に、これらの方法は、（脳細胞試料またはＣＳＦ試料等の）ＣＮＳ試料と関心対象のタンパク質に選択的に結合する抗体等の試薬を接触させるステップを含む。一実施形態において、抗体は検出可能な標識を有する。抗体はポリクローナル抗体、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。無傷の抗体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を使用することができる。プローブまたは抗体に関して「標識した」という用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質を結合する（すなわち、物理的に結合する）ことによるプローブまたは抗体の直接的な標識化、および検出可能な物質との反応によるプローブまたは抗体の間接的な標識化を含むことが意図される。生体外および生体内においてＣＮＳ試料のＣＮＳ遺伝子産物を検出するために、そのような検出方法を使用することができる。
【００７３】
生体外技法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、免疫蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析およびＬｕｍｉｎｅｘ（商標）ｘＭＡＰ（商標）検出アッセイ等の免疫測定法が挙げられる。 標的分析物を標識抗体と固相支持体に固定した抗体の間に「サンドイッチ」する「サンドイッチ」タイプのアッセイである免疫測定法もある。アッセイは、固定した抗体に結合した抗原標識抗体複合体の存在および量を観察することによって読み取られる。
【００７４】
本明細書に記載する方法に有用な別の免疫測定法は、「競合」タイプの免疫測定法であり、そこでは、固相表面に結合した抗体と、未知量の抗原分析物および同一種類の標識抗原を含有する試料（例えば、ＣＳＦ試料）を接触させる。次いで、固相表面に結合した標識抗原の量を求め、試料中の抗原分析物の量の相対的な測定値を提供する。このような免疫測定法は、使用が便利であるように「ディップスティック」様式（例えば、フロースルーまたは移動式のディップスティック設計）で容易に実施される。ディップスティックを使用するアッセイは、任意で、陰性または陽性の内部対照を含む。数多くの種類のディップスティック免疫測定法が当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，６５６，４４８号、第４，３６６，２４１号、および第４，７７０，８５３号に記載されている。他の実施形態において、抗体を使用するアッセイはアレイ様式で実施される。例えば、ＣＮＳ試料を標識、例えば、ビオチン化し、次いで抗体、例えば、抗体アレイ上に位置付けられている抗体に接触させる。例えば、蛍光標識に結合したアビジンで試料を検出することができる。
【００７５】
生体内技法は、例えば、検出対象の遺伝子産物に結合する標識抗体を対象（例えば、ＣＳＦ）に導入するステップを含む。抗体は、例えば、対象における存在および位置を標準的なイメージング技法によって検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
【００７６】
特定のＣＮＳ遺伝子産物を検出するために使用されるポリクローナルおよびモノクローナル抗体は入手可能な場合もある。例えば、本明細書に記載するＣＮＳマーカー遺伝子の多くの市販の抗体が存在する。または、当業者は、通常の技法を使用して診断アッセイに使用するのに好適な抗体を作製することができる。特定の標的を検出するためにポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製し、使用する方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｉ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １， １９９８）において記述されている。改変された抗体および抗原結合性抗体断片（例えば、キメラ抗体、再構成抗体、ヒト化抗体またはそれらの断片、例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２断片）；または生合成抗体（例えば、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等を作製する方法は当技術分野において既知であり、例えば、Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｖｅｒｌａｇ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １５， ２０００；第１版）に見出すことができる。
【００７７】
ＣＮＳ遺伝子発現のイメージング
一実施形態において、本明細書に記載する方法は、ＣＮＳにおける遺伝子発現を画像化する、例えば、遺伝子発現を非侵襲的に画像化する技法を使用する。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて栄養物を輸送するために存在する担体輸送システム等の内因性ＢＢＢ輸送システムを介して、標識プローブを脳に標的化することにより、標的遺伝子の発現を検出することができる標識プローブを、血液脳関門（ＢＢＢ）を通じて脳内に送達することができる。同様に、受容体媒介性の経細胞輸送システムを作動して、インスリン、トランスフェリンまたはインスリン様成長因子等の循環ペプチドを、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送する。これらの内因性ペプチドは、「輸送ペプチド」または「分子的なトロイの木馬」として作用して本明細書に記載する標識診断プローブを、ＢＢＢを越えて通過させることができる。次いで、既知の脳イメージング技法によって標識を検出することができる。このような方法は、例えば、米国特許第６，３７２，２５０号に記載される。他の実施形態において、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７（２６）：１４７０９−１４（２０００）、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ． ４３（７）：９４８−５６（２００２）は、ＢＢＢを通過するためにアンチセンス放射性医薬品と薬物標的化技術を合わせて使用して生体内において脳における遺伝子発現を画像化することを記載している。
【００７８】
標的遺伝子の発現を検出することができる標識プローブを脳内に送達する他の方法は、例えば、米国特許第５，７２０，７２０号に記載されている。この特許は、高流動微量注入により脳内に（遺伝子産物を画像化するための標識抗体等の）薬剤を送達する方法を記載している。
【００７９】
生体液中のＣＮＳ遺伝子発現の変化の検出
ＣＮＳにおける遺伝子の活性化により、離れた部位、例えば、血液、尿または精液（すなわち、ＣＳＦ以外の体液）等の体液における遺伝子産物の測定可能な変化を生ずることがある。例えば、大脳皮質、海馬、嗅内（ｅｎｔｏｒｒｈｉｎａｌ）皮質、視床の一部、基底核、小脳、および網様体は自律神経系の出力に影響することが既知である（Ｋａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ）。このような影響により、自律神経節または神経支配されている器官における遺伝子発現のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの測定可能な変化を生じ得る。この種の相互作用の一例は、末梢におけるサイトカイン放出による迷走神経活性化の免疫調節作用である（Ｔｒａｃｙ，Ｎａｔｕｒｅ，４２０：８５３−９，２００２）。
【００８０】
加えて、一部の実施形態においては、ＣＮＳにおける遺伝子の活性化は、血中のＣＮＳタンパク質レベル、すなわち、ＣＮＳ組織に発現し、血流中に行き着くタンパク質を測定することにより検出することができる。例えば、ＣＮＳのニューロンは、視床下部、下垂体、副腎、性腺、または甲状腺軸等のいくつかの神経内分泌軸を介して血中へのホルモンの放出を誘発することができる（Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ａｎｄ ｄｅｌ Ｒｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １７：１−３９，（１９９６））。脳の細胞外液は、くも膜絨毛を通過して脳から血液に、ならびにある種の脳神経（主に嗅神経）および脊髄神経根神経節を通ってリンパ液に排出される。脳または脳脊髄液の異なる領域に注射したタンパク質の最低１４〜４７％はリンパ液を通過する。したがって、ＣＳＦマーカーはリンパ液、血液または血清中に排出され、リンパ液、血液または血清中で検出することができる。血中に見られるこのようなマーカーは濃縮されてもよく、それによって血液成分の腎臓による選択的なろ過により尿中で検出可能になり得る。
【００８１】
ＣＮＳは、自律神経系および内分泌系を介して精巣に関連している。脳内の遺伝子の活性の変化によって視床下部−下垂体−性腺軸の活動または精巣の神経支配が変更されると、このような変化は、精子等の精巣に関連する体液中で検出できると考えられる。例えば、脊髄損傷患者は、精子の組成が変化することが示されている（Ｎａｄｅｒｉ ａｎｄ Ｓａｆａｒｉｎｅｊａｄ， Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ５８（２）：１７７−８４（２００３）参照）。
【００８２】
日常的な方法を使用して、ＣＮＳにおける遺伝子発現の変化の結果である、末梢体液等の末梢組織における遺伝子産物を同定することができる。例えば、候補マーカー遺伝子を実験動物の脳において崩壊することができる。野生型動物（すなわち、候補マーカー遺伝子が崩壊されていない動物）と比較した、実験動物の末梢組織における候補遺伝子の発現の変化は、末梢組織における候補分子の発現がＣＮＳにおける遺伝子発現の変化に関連していることを示す。
【００８３】
一部の実施形態においては、血中に検出されるＣＮＳ遺伝子産物は、以下表１のに記載するものを含む。
【００８４】
アレイ
本明細書に記載する方法は、当技術分野において既知の方法により、核酸またはタンパク質アレイ、例えば、核酸および／またはタンパク質「チップ」用に容易に適応させられる。典型的な実施形態において、アレイチップは、多数のＣＮＳ遺伝子の発現を検出するための多数のプローブ（例えば、ＤＮＡプローブおよび／または抗体プローブ）を含む。一実施形態において、特定のチップ上のプローブは、ＣＮＳ試料を採取した対象に非ＣＮＳ異常増殖が存在する場合には、各クラスターが特定の遺伝子発現プロファイルに関連する遺伝子の１つ以上の特定のパネルまたは「クラスター」のメンバーを検出するように選択される。チップは、固相平面支持体、例えば、ガラス、金属またはナイロン上の離れた所定の位置（アドレスまたは「スポット」）に固定（係留）された数十、数百または数千の個々のプローブを含むことができる。アレイはマクロアレイ、またはマイクロアレイであり得、その差はスポットのサイズである。マクロアレイは、直径約３００ミクロン以上のスポットを有し、ゲルまたはブロットスキャナーを使用して画像化することができる。マイクロアレイは、直径３００ミクロン未満、典型的には２００ミクロン未満のスポットを有する。
【００８５】
本明細書に記載する方法において遺伝子発現プロファイルを分析および比較するためには、核酸アレイは、本明細書内の表または図面に記載される少なくとも４つ、例えば、少なくとも１０、２０、４０、６０、８０または１００のＣＮＳ遺伝子の核酸プローブを使用して構築することができる。このようなアレイは対照プローブ（すなわち、陰性試料、例えば、非ＣＮＳ疾患が認められない対象の試料において発現が影響を受けないことが予想される遺伝子のプローブ）を含み得る。典型的には、このような対照または「正常な」非疾病試料は健康なボランティアから得られる。健康なボランティアの長期経時研究を実施して、対照試料が、疾病を生じない個体由来のものであることを確認することができる。このような研究は、対照遺伝子発現プロファイルのデータベースの生データを提供する。 そのようなデータベースは、本方法に使用することができる正常または対照「基準」プロファイル源を提供する。対照試料はまた、診断対象の疾患に関連のない死因で死亡した個体（例えば、不慮の外傷で死亡した個体）の死後に得ることもできる。このような場合には、死後試料は死後できるだけ早く、例えば、死後３時間以内に採取するべきである。
【００８６】
関心対象の組織、例えば、脳、脊髄またはＣＳＦ試料の総ｍＲＮＡに相当する標識ｃＤＮＡ集団を、好適なハイブリダイゼーション条件下でＤＮＡアレイと接触させる。例えば、固相支持体上の特定のアドレスにおける蛍光によって、ｃＤＮＡとアレイの配列とのハイブリダイゼーションを検出する。このように、特定の対象または対象群のＣＮＳ試料における遺伝子発現パターンを表す蛍光パターンが得られる。これらの遺伝子発現パターンはデジタル化して、コンピュータ分析および比較のために電子的に保存することができる。例えば、アレイを使用して、試験対象の個体におけるＣＮＳ遺伝子の発現と、例えば、デジタルデータベースに電子的に保存されている１つ以上の基準遺伝子発現プロファイルを比較することができ、この場合、基準遺伝子発現プロファイルは末梢異常増殖または他の疾患の有（陽性対照）またはなし（陰性対照）に関連する。
【００８７】
一部の実施形態において、ｃＤＮＡが、アレイを作製するためのプローブとして使用される。好適なｃＤＮＡは、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法によって得ることができる。ｃＤＮＡの長さは２０〜２，０００ヌクレオチド、例えば、１００〜１，０００ヌクレオチドであり得る。ｃＤＮＡを作製するための当技術分野において既知の他の方法を使用することができる。例えば、クローニングした配列の逆転写を使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に記載されている）。ｃＤＮＡプローブを好適な固相支持体（基板）、例えば、コーティングしたガラス顕微鏡スライドの特定の所定の位置（アドレス）に二次元格子状に配置または設置する（「プリントする」または「スポットする」）。少容量、例えば、５ナノリッターの濃縮ＤＮＡ溶液を各スポットに使用する。スポッティングは、業者の取扱説明書に従い、市販のマイクロスポッティング装置（配列マシーンまたは格子形成ロボットと呼ばれる場合もある）により行なうことができる。ＤＮＡアレイを作製するための固相支持体および装置の市販業者には、ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ Ｌｔｄ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ａｃｔｏｎ， ＭＡ；ＧＥＮＰＡＫ Ｉｎｃ．， Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ， ＮＹ；ＳｃｉＭａｔｒｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ；およびＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡが挙げられる。
【００８８】
ｃＤＮＡは任意の好適な方法によって固相支持体に結合することができる。一般に、結合は共有結合である。ＤＮＡ分子を固相支持体に共有結合するのに好適な方法には、アミノ架橋およびＵＶ架橋が挙げられる。ｃＤＮＡアレイの構築に関する手引きは、例えば、ＤｅＲｉｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：４５７−４６０（１９９６）、Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０：２２３−２２９（１９９９）；Ｌｏｃｋｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：１６７５−１６８０（１９９６）を参照されたい。
【００８９】
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、アレイの固定ＤＮＡプローブは合成オリゴヌクレオチドである。ｃＤＮＡに関して本明細書に記載する技法を使用して、事前に作製したオリゴヌクレオチドをスポットして、ＤＮＡアレイを作製することができる。しかし、一般に、オリゴヌクレオチドは固相支持体上に直接合成される。オリゴヌクレオチドアレイを合成するための方法は、当技術分野において既知である。例えば、Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，７４４，３０５号を参照されたい。オリゴヌクレオチドの配列は、検出対象の特定の遺伝子の配列の一部を表す。一般に、オリゴヌクレオチドの長さは１０〜５０ヌクレオチド、例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５ヌクレオチドである。
【００９０】
アプタマーアレイも本発明の方法に有用である。アプタマーは、ハイブリダイゼーションではなく、三次元配座に基づいて特定の標的分子に結合する核酸分子である。アプタマーは、例えば、オリゴヌクレオチドの最初の異種集団を合成し、次いで特定の標的分子にしっかりと結合するオリゴヌクレオチドを集団から選択することによって選択される。特定の標的分子に結合するアプタマーが同定されたら、生物学分野および他の分野において既知の種々の技法を使用して、例えば、クローニングおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、次いで転写によって複製することができる。標的分子は核酸、タンパク質、ペプチド、小有機または無機化合物および場合によっては、微生物全体であり得る。
【００９１】
オリゴヌクレオチドの異種集団の合成およびその集団からのアプタマーの選択は、試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）またはＳＥＬＥＸとして既知の手法を使用して実施することができる。ＳＥＬＥＸ方法は、例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２７０，１６３号および第５，５６７，５８８号、Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６７：２７５−３０１（１９９６）、ならびにＥｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８−２２（１９９０）に記載されている。簡単に説明すると、異種ＤＮＡオリゴマー集団を合成して、アプタマーの生体外選択のための候補オリゴマーを提供する。この最初のＤＮＡオリゴ集団は、長さ１５〜１００ヌクレオチドのランダム配列に長さ１０〜５０ヌクレオチドの一定の５’および３’配列が隣接しているセットである。一定領域はＰＣＲプライマーハイブリダイゼーションの部位を提供し、一実施においてＲＮＡポリメラーゼによる転写開始部位を提供し、ＲＮＡオリゴマーの集団を作製する。一定部位はまた、選択したアプタマーをクローニングするための制限部位も有する。一定領域の多数の例をアプタマー進化に使用することができる。例えば、Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６７：３３６−８３（１９９６）、Ｃｉｅｓｉｏｌｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６７：３１５−３５（１９９６）、およびＦｉｔｚｗａｔｅｒ，（１９９６）、前記参照。
【００９２】
アプタマーは、一般に、５〜１００サイクルの手法で選択される。各サイクルにおいて、オリゴマーは標的分子に結合され、それらが結合している標的を単離することによって精製し、標的から放出し、次いで２０〜３０世代のＰＣＲ増幅によって複製する。
【００９３】
アプタマー選択は、生物学における機能の進化的選択に類似している。異種オリゴヌクレオチド集団に上記のアプタマー選択手法を実施することは、連続的に複製中の生物学的な集団に、機能についての１０〜２０の厳しい選択事象を実施することと類似しており、各選択は２０〜３０世代の複製分だけ離れている。
【００９４】
異種性は、例えば、アプタマー選択手法の開始時にだけ導入し、複製過程全体には導入しない。または、異種性をアプタマー選択手法の後期段階に導入することができる。
【００９５】
例えば、２’−フルオロ−リボヌクレオチドオリゴマー、ＮＨ２−置換およびＯＣＨ３−置換リボースアプタマーならびにデオキシリボーズアプタマーを含む種々のオリゴマーをアプタマー選択に使用することができる。ＲＮＡおよびＤＮＡ集団は、同様に、任意の種類の標的分子に結合するように構成されたアプタマーを提供することができる。Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３２４５−６０（１９９４）を参照されたい。
【００９６】
２’−フルオロ−リボヌクレオチドオリゴマーの使用は、未置換のリボ−またはデオキシリボ−オリゴヌクレオチドで得られるものより１０〜１００倍結合親和性を増加すると考えられる。例えば、Ｐａｇｒａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５（１）：６８−７３（１９９７）を参照されたい。このような修飾塩基は追加の結合相互作用を提供し、アプタマーの二次構造の安定性を増す。これらの修飾はまたアプタマーをヌクレアーゼ耐性にし、これはシステムの実世界への適用に対する大きな利点である。例えば、上記のＬｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：５２２９−３４（１９９４）、Ｐａｇｒａｔｉｓ，（１９９７）を参照されたい。
【００９７】
本発明において、アプタマーは、ＣＮＳマーカー遺伝子に対応するｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質を検出するために使用することができる。
【００９８】
本発明の一部の実施形態において、動物モデルＣＮＳ遺伝子のヒト相同物のプローブ（例えば、核酸プローブ、抗体またはアプタマー）を本発明の検出方法に使用する。他の実施形態において、検出に使用するプローブは遺伝子の高度に保存されている領域、例えば、相同マウスとヒト配列の間で高度に保存されている配列からなる。
【００９９】
試料調製および分析
一般に、ＣＮＳ細胞または組織のｍＲＮＡは、特定の遺伝子を表して作製されるｃＤＮＡの相対量が試料中のｍＲＮＡの相対量を反映するような条件下においてｃＤＮＡに逆転写される。比較ハイブリダイゼーション法は、関心対象の遺伝子の配列にハイブリダイゼーションする対応するｃＤＮＡの量によって示される、２つの組織試料中の種々の特定のｍＲＮＡの量を比較することを含む。
【０１００】
ｃＤＮＡを作製するために使用するｍＲＮＡは、一般に、他の細胞内容物および成分から単離される。ｍＲＮＡを単離する有用な方法は２段階法である。第１の段階では、総ＲＮＡを単離する。第２の段階は、固相支持体、例えば、クロマトグラフィーカラムまたは磁気ビーズに結合したオリゴ（ｄＴ）分子にｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルをハイブリダイゼーションすることに基づく。総ＲＮＡ単離およびｍＲＮＡ単離は当技術分野において既知であり、例えば、業者の取扱説明書により市販のキットを使用して実施することができる。同様に、単離したｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は当技術分野において既知であり、業者の取扱説明書により市販のキットを使用して実施することができる。ｃＤＮＡの蛍光標識化は、蛍光標識したデオキシヌクレオチド、例えば、Ｃｙ５−ｄＵＴＰまたはＣｙ３−ｄＵＴＰをｃＤＮＡ合成反応に加えることによって実施することができる。ＤＮＡアレイで分析するためのｍＲＮＡの単離および蛍光標識したｃＤＮＡの合成に関する手引きは、例えば、Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：２２７−２３５（２０００）を参照されたい。
【０１０１】
ＤＮＡアレイのハイブリダイゼーションおよび洗浄、ハイブリダイゼーションの検出ならびにデータ分析の従来の技法は、必要以上の実験を行わないで新規方法に使用することができる。ＤＮＡアレイをスキャンし、データを分析するためのハードウェアおよびソフトウェアの市販業者には、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）、ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、およびＳｃａｎａｌｙｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（Ｆａｉｒｆａｘ，ＶＡ）が挙げられる。
【０１０２】
他の実施形態において、１つ以上のＣＮＳ遺伝子の発現レベルは、アッセイ対象のＣＮＳ試料の細胞に存在するタンパク質の存在および／またはレベルに反映される。ＣＮＳ試料中のタンパク質の存在またはレベルは通常の方法によって検出することができる。例えば、ＣＮＳ試料（例えば、ＣＳＦ試料）は、２次元（２Ｄ）ＰＡＧＥ等のゲル電気泳動技法によって分析することができる。タンパク質スポットが２Ｄ−ＰＡＧＥゲルで分離されたら、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によって差次的に発現されるスポットを同定することができる。この方法をペプチド分析に使用して、試料中の特定のタンパク質のフィンガープリントを提供することもできる。
【０１０３】
第２のプロテオミクス方法は、質量分析法によってＣＳＦ試料等のＣＮＳ試料を直接分析することによってプロテオミクススペクトルを得ることに関係し得る。例えば、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）分析を実施して、ＣＮＳ試料のプロテオミクスパターンを作製することができる。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、正常者と疾病患者を識別するクラスターパターンを同定することができることが示されている。Ｐａｗｅｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｓ． Ｍａｒｋｅｒｓ， １７（４）：３０１−７（２００１）を参照されたい。
【０１０４】
発現プロファイルの生成
本明細書に記載する方法に使用する遺伝子発現プロファイルは２つ以上のＣＮＳ遺伝子またはタンパク質の発現パターンである。場合によっては、発現プロファイルは、５、１０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれ以上の遺伝子またはタンパク質の発現パターンであることができる。本明細書において使用する「基準遺伝子発現プロファイル」は２つ以上のＣＮＳ遺伝子の発現の特徴的なパターン（データセット）（例えば、上方制御または下方制御および／または発現のレベル）であり、この場合、発現のパターンは特定の疾患のリスクまたは存在に関連する（例えば、疾患が認められない人の発現レベルに対する特定の疾患に関連する発現レベルの比）。特徴的なプロファイルと特定の疾患の関連は、ＣＮＳ遺伝子またはタンパク質の発現データを生成して分析し、ＣＮＳ遺伝子またはタンパク質の発現の特定のパターン（例えば、陰性対照と比較したときの特定の遺伝子の遺伝子発現の相対的な増加および／または低下）と特定の臨床状態の関連を同定することによって求められる。例えば、基準遺伝子発現プロファイルは遺伝子のセット（本明細書において遺伝子の「パネル」または「クラスター」とも称される）のデータであり得、そこでは、セットの各遺伝子は、特定の末梢疾患または任意の末梢疾患に関連する場合には下方制御または上方制御される。
【０１０５】
基準プロファイルはパネルの２つ以上の遺伝子の遺伝子発現の値、例えば、相対値を含み得、そこでは、パネルの少なくとも１つの遺伝子は下方制御され、少なくとも１つの遺伝子は上方制御される。
【０１０６】
非ＣＮＳ癌（または乳癌、肺癌または結腸癌等の特定の種類の非ＣＮＳ癌）に関連する例示的な遺伝子発現プロファイルを図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに示す。基準遺伝子発現プロファイルは、これらの図に示す遺伝子または遺伝子産物の少なくとも一部のデータを含み得る。例えば、肺癌に関連する基準遺伝子発現プロファイルは、図５Ａ５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに癌のＣＮＳマーカーとして記載する１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の差次的な発現の値を含むことができる。一部の実施形態においては、プロファイルは、図５Ｊおよび／または１１Ｂに記載する遺伝子に対する値を含む。図５Ａ〜Ｊは、マウスが肺、結腸、または乳癌細胞のいずれかを接種された後、１８、７２、または１９２時間経過時に、脳に差次的に発現される遺伝子の表である。図１１Ａ〜Ｂは、リアルタイムＰＣＲにより差次的に発現されると確証された、肺癌細胞を注射したマウスの視床下部試料からのある遺伝子の表である。図１２は、疾病行動として既知の行動状態に関与することが知られ、実施例２および３で使用される１０Ｋオリゴヌクレオチドアレイに表されないが、癌細胞の接種後に脳に差次的に発現されることがわかっている、遺伝子の表である。図２１Ａ〜２３Ｃは、各種類の癌に対する最有力候補遺伝子のリストである。
【０１０７】
基準プロファイルは、本明細書に記載する実施例１に例示するように、実験動物における非ＣＮＳ疾病の存在に応答するＣＮＳの遺伝子発現パターンの変化を検出し、実験試料においてあるパターンで差次的に発現される遺伝子および遺伝子クラスターのヒト相同物を同定することによって生成することができる。
【０１０８】
基準遺伝子発現プロファイルは、ヒトＣＮＳ遺伝子発現データを評価することによっても得ることができる。例えば、数十、数百または数千人のＣＮＳ遺伝子発現データを入手し、例えば、電子的、例えば、デジタル処理して保存されているデータベースを作成し、維持する。個体を追跡調査し、例えば、癌の臨床状態に関して比較的長期間にわたって（例えば、少なくとも５年、１０年、１５年、２０年、３０年、５０年以上または生涯にわたって）評価することができる。例えば、ＣＮＳ遺伝子発現データを入手してから５年、１０年、１５年、２０年、３０年または５０年後に特定の疾病を発症した個体の発現プロファイルを、疾病が認められていない個体の発現プロファイルと比較する。１つの臨床タイプの疾患を発症した個体と別の臨床タイプの疾患を発症した個体間、または早い年齢において疾病を発症した個体と遅い年齢で疾病を発症した個体間の同様の比較を実施する。これらの分析は、異なる病期の疾病、例えば、異なる病期の異常増殖または異なる種類の腫瘍に関連する特定の基準ＣＮＳ遺伝子発現プロファイルを提供する。「対照遺伝子発現プロファイル」は、健康（正常）個体または動物モデルにおける所定のセットの遺伝子のプロファイルである。
【０１０９】
基準および対照遺伝子発現プロファイルは、典型的には、電子デジタル形式、例えば、ＣＤ、ディスク、ＤＶＤ、ハードドライブ、コンピュータメモリまたはメモリカード等のコンピュータが読み取り可能な媒体に保存され、また対象の性別、疾患の種類および病期、年齢群ならびに人種等の識別情報を伴う。
【０１１０】
「対象遺伝子発現プロファイル」は、癌の存在について被験対象のＣＮＳ試料から得られる。まず、本明細書に記載するように、脳針生検（脳細胞試料）または腰椎穿刺（ＣＳＦ）等の通常の手段によってＣＮＳ試料、例えば、脳細胞試料またはＣＳＦ試料を対象から得る。次いで、遺伝子またはタンパク質発現を検出する方法、例えば、本明細書に記載する遺伝子またはタンパク質発現を検出する任意の方法に使用するために試料を調製する。一実施形態において、総ＲＮＡを試料から調製し、本明細書に記載する核酸アレイアッセイに使用するためのｃＤＮＡに逆転写することができる。別の実施形態において、本明細書に記載する抗体アッセイに使用するために総タンパク質を試料から調製する。次いで、調製した試料を、試験試料を比較する１つ以上の特定基準遺伝子発現プロファイルのＣＮＳ遺伝子または遺伝子産物のクラスターまたはパネルに対応するＣＮＳ遺伝子または遺伝子産物の少なくとも１つのクラスターまたはパネルの発現レベル（または抗体アレイの場合にはタンパク質レベル）を検出することができるアレイ（例えば、抗体または核酸アレイ）と接触させることができる。例えば、対象から調製したＣＮＳ試料を、本明細書、例えば、図面５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに示す遺伝子の２つ以上、例えば、２〜１５０、１０〜５０または２０〜３０の抗体プローブを含有する核酸プローブまたは抗体アレイを含有する核酸アレイと接触させることができる。一部の実施形態において、アレイは５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのいずれかに開示する特定のクラスターのマーカー遺伝子の各々のプローブを含有することができる。一部の実施形態においては、アレイは、図５Ｊおよび／または１１Ｂにおける１つ以上のマーカー遺伝子のプローブも含む。
【０１１１】
アレイアッセイの結果は、アレイ上の各位置（各プローブ）についての蛍光検出および結合した抗体またはハイブリダイゼーションした核酸の測定等の通常の技法によって得られる。次いで、アレイ上の各抗体またはプローブによってＣＮＳ試料中で検出される各ポリペプチドまたは遺伝子のレベルの値のデータセットを生成することができる。データセットは、患者の識別子および検出される発現またはタンパク質の実際のレベルおよび／または相対的なレベル等の情報を含むことができる。このようなデータセットを対象発現プロファイルとして直接使用してもまたは基準プロファイルの様式に匹敵する様式にデータセットを変換することができる。
【０１１２】
対象遺伝子発現プロファイルが生成されたら、本明細書に記載するように対象プロファイルを基準発現プロファイルと比較することができる。
【０１１３】
発現プロファイルの分析
新規方法およびシステムにより、試験対象の発現プロファイルを、特定の疾患の存在に関連する基準遺伝子発現プロファイルおよび／または特定の非ＣＮＳ疾患が認められないことに関連する対照（「正常」）遺伝子発現プロファイルと比較することによって試験対象を評価することができる。多数のボランティアにおけるＣＮＳ遺伝子発現の長期経時研究を実施して、疾病を発症しない個体に関連する対照発現プロファイルまたは疾病を発症する個体の基準プロファイルを同定し、確認する。このような研究は、本発明の方法に使用することができる陰性および陽性対照発現プロファイルのデータベースの生データを提供する。
【０１１４】
「対象」および「基準」プロファイルは、本明細書に記載する方法により得ることができる。一実施形態において、該方法は、対象から（医療提供者または他者から直接または間接的に）ＣＮＳ試料を得るステップと、試料から発現プロファイルを生成するステップと、対象の発現プロファイルを１つ以上の対照および／または基準プロファイルと比較するステップ、および／または対象のプロファイルと最も類似した基準プロファイルを選択するステップと、を含む。
【０１１５】
他の検出方法の場合と同様に、プロファイルに基づいたアッセイは症状の発症前（この場合には診断である）、治療前（この場合には予後である）または治療経過中（この場合にはモニタとして作用する）に実施することができる。
【０１１６】
種々の通常の統計学的手段を使用して、２つの発現プロファイルを比較することができる。考えられる１つの測定基準は、２つのプロファイル間の差である距離ベクトルである。対象および基準プロファイルの各々は多次元ベクトルとして表され、各次元はプロファイルの値、例えばパネルの特定の遺伝子の発現の値である。対象プロファイルおよび基準または対照プロファイルは、２つのプロファイルが上記の「一致」の条件を満たす場合、「一致」するとされる。対象および基準プロファイルが一致する場合には、対象は、基準プロファイルが関連する末梢疾患を有すると同定することができる。対象および正常対照プロファイルが一致する場合には、対象に末梢疾患は認められないと考えられる。
【０１１７】
一実施形態において、パターン認識ソフトウェアを使用して、マッチングプロファイルを同定する。信号対ノイズ比、相関分析、およびＡＮＯＶＡのような、一変量の伝統的な統計手法（Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５３１−７（１９９９）， ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−６（２００２）， Ｐａｖｌｉｄｉｓ， Ｐ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１：２８２−９（２００３））、またはＧｅｎｅｓ＠Ｗｏｒｋソフトウェアパッケージ（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．）に実装されるＳＰＬＡＳＨ（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ）アルゴリズムのような、特定の多変量技法（Ｌｅｐｒｅ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：１０３３−４４（２００４））を使用して、これらのプロファイルを得ることができる。
【０１１８】
別の一実施形態において、遺伝子発現プロファイルは、最近傍分類子を適用することによる定量パターン比較によって解析される。最近傍分類子に基づいて、順列由来の分布と共に、基準遺伝子発現パターンによって規定されるクラスに属する各対象プロファイルの確立を推定するために使用することができるスコアを規定する（Ｊｅｌｉｎｅｋ（２００３）、前記参照）。
【０１１９】
対象、医療提供者または関心を有する他の当事者に紙または電子形態で伝達することができる診断試験の結果は、対象の発現プロファイル自体、対象の発現プロファイルを別のプロファイルと比較した結果またはこれらのいずれかの記述子であることが可能である。伝達は、コンピュータネットワークで（例えば、搬送波に組み込まれたコンピュータデータ信号等のコンピュータ伝送の形態で）実施することができる。 新規システムはまた、以下のステップを実行するための実行可能なコードを有する（ＣＤ、ディスク、またはハードドライブ等の）コンピュータが読み取り可能な媒体を含む。対象の発現プロファイルを受信するステップ、基準発現プロファイルのデータベースにアクセスするステップ、およびｉ）対象の発現プロファイルに最も類似した一致基準プロファイルを選択するステップ、またはｉｉ）対象の発現プロファイルと少なくとも１つの基準プロファイルの類似性に対する、少なくとも１つの比較スコアを決定するステップのいずれか。対象の発現プロファイルおよび基準発現プロファイルは各々、同定された遺伝子もしくは遺伝子産物の１つ以上の発現レベルまたはそれらがコードするタンパク質のレベルを示す値を含む。
【０１２０】
予測医療
本明細書に記載する方法は、一般に予測医療分野において有用であり、さらに具体的には、診断および予後アッセイ、異常増殖の進行のモニタリング、または例えば、臨床試験における治療に対する応答のモニタリングに有用である。例えば、異常増殖の他の、例えば臨床徴候がない状態で、対象が超早期異常増殖を有するかどうかを判定することができる。本発明の方法は、例えば、癌を除去するための手術または治療を受けたことがある患者に特に有用であり、この場合には、本発明の方法は再発もしくは転移をモニタするために使用することができると思われ、本発明の方法は、例えば、環境的要因により癌の発生頻度が高い地域に生活している人または疾病（例えば、糖尿病、喘息または癌）の家族歴を有する個体または疾病感受性遺伝子、例えば、癌感受性遺伝子（例えば、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６）の保有者である個体に特に有用である。 他の癌感受性遺伝子は、Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ， Ｅｄｓ．）， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（２００２）に記載される。このような個体は、本明細書に記載する方法を使用して評価することができる。
【０１２１】
例えば、場合によっては、疾病を発症するリスクが高い場合（例えば、個体が癌の強い家族歴を有する場合、または個体が癌感受性遺伝子を保有するもしくは癌のリスクが高い地域で生活している場合）には、個体は生涯にわたって定期的（例えば、１０年ごと、５年ごとまたは毎年）評価され得る。
【０１２２】
非ＣＮＳ疾患を診断するシステム
対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）疾患を診断するためのシステムは、以下の要素を含むことができる。ＣＮＳ試料を得るためのサンプリング装置、遺伝子発現検出装置、基準遺伝子発現プロファイル、およびＣＮＳ試料中の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現を基準遺伝子発現プロファイルと比較するための手段（例えば、比較器）。
【０１２３】
サンプリング装置は、低侵襲的技法、例えば、脳外科的手術によってＣＮＳ試料を獲得する。低侵襲性脳外科的技法には、他の技法の中でも、コンピュータ支援式定位固定、術中超音波、脳マッピングおよび神経内視鏡が挙げられる。定位固定は、外部基準目印および神経構造を表示するイメージング技法を用いて脳内の任意の領域にナビゲートする（ｎａｖｉｇａｔｉｎｇ）システムを指す。
【０１２４】
または、「試料」は、実際の試料を採取するのではなく、例えば、脳における遺伝子発現を画像化することによって取得することができる。脳のイメージングは、他の方法の中でも、コンピュータ断層スキャン（ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）またはポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）によって実施することができる。これらの方法由来の信号は、脳内の任意の標的地点までの軌道および深さをコンピュータが算出して提供することができる基準点を提供する。Ｃｏｓｍａｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＣＲＷ）システムを含む最新の定位固定システムをＭＲＩおよび脳の血管造営位置に使用することができる。術中超音波は単独で使用、または定位固定と併用使用することができる。術中小音波を使用して、硬膜切開前に脳室等の組織を同定することができる。超音波プローブを使用して、深部病変の針生検を先導し、ＣＮＳ試料を獲得することもできる。剛性および可撓性の光ファイバー内視鏡を使用して、低侵襲的技法を使用して脳試料を得ることができる。レーザーおよび（生検器具を含む）種々の他の器具を取り付けて使用することができる。腰椎穿刺によって脳脊髄液を得るサンプリング装置も上記に記載するイメージング方法のいずれかによって先導することができる。
【０１２５】
遺伝子発現検出装置は、核酸を使用する方法、アレイならびに試料調製および分析の副題で本明細書に記載するものを含む。比較器は、本明細書に記載するパターン認識ソフトウェアを搭載したコンピュータであり得る。
【０１２６】
コンピュータが読み取り可能な媒体
別の態様において、新規システムは、複数のデジタルコード化されたデータレコードまたはデータセットを有するコンピュータが読み取り可能な媒体を特徴とする。データレコードまたはデータセットは各々ＣＮＳ遺伝子発現レベルを示す値および試料の記述子を含む。記述子は、例えば、識別子（例えば、試料を入手する患者の識別子、例えば、復号表にアクセスする者によってのみ患者の情報に対応させることができる名前または参照コード）、発現レベルがあるレベルに到達しているまたはあるレベル以下に低下している事象において下される診断または実施される治療であり得る。データレコードは、関連する遺伝子の発現レベルを示す値も含み得る（例えば、データレコードは遺伝子「クラスター」の複数の遺伝子の各々の値を含んでもよく、この場合、クラスターの遺伝子の特定の基準遺伝子発現は非ＣＮＳ疾患に関連する）。データレコードはまた、対照遺伝子（例えば、発現が対照試料において変化されないまたは発現が診断上非ＣＮＳ疾患に関連がない遺伝子）の値を含む。データレコードは、例えば、表（（例えばオラクル（Ｏｒａｃｌｅ）またはサイベース（Ｓｙｂａｓｅ）データベース環境のＳＱＬデータベースなどの）関係型データベースのようなデータベースの一部である表）や、リストなど、多様な方法で構造化することができる。
【０１２７】
他の種からの相同配列の単離
本明細書に記載する方法に有用な遺伝子のヒト相同物は、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載され、ＧｅｎＢａｎｋおよびインターネットで利用可能な他の公共のデータベースに見られる。
【０１２８】
ＣＮＳマーカー遺伝子およびそれらの産物のヒト相同物（例えば、ヒト以外の実験動物における実験によって同定されるＣＮＳマーカー遺伝子のヒト相同物）は、本明細書に記載する方法の種々の実施形態に有用である。本明細書に提供されるＣＮＳマーカー遺伝子のほとんどのヒト相同物は既知である。ヒト相同物が同定されていない場合では、いくつかの標準的な方法を使用してこのような遺伝子を同定することができる。これらの方法には、マウスマーカー遺伝子核酸配列によるヒトライブラリーの低緊縮度ハイブリダイゼーションスクリーン、マウスマーカー遺伝子由来の縮重オリゴヌクレオチドでプライミングしたヒトＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、二重ハイブリッドスクリーン、および相同配列のデータベーススクリーンが挙げられる。
【０１２９】
化学療法剤
一実施形態において、本明細書に記載する方法は、例えば、新生物が生じる前、新生物が臨床的に検出可能になる前および／または腫瘍が悪性になる前に早期段階に対象における非ＣＮＳ異常増殖の存在を同定または診断することができる。したがって、本明細書に記載する方法によって検出される新生物は、一般に腫瘍細胞を標的とする、または特に特定の腫瘍細胞を標的とする薬剤による治療を受けることができる。一実施形態において、対象を化学療法剤で治療することができる。本明細書において使用する化学療法剤は、異常増殖の治療に使用される化学治療剤または化学治療薬を意味する。抗癌作用を発揮するという意味において、他の化合物を形式上化学療法剤として記述することができるが、簡単にするためにこの用語を使用する。数多くの例示的な化学療法剤を以下に記載する。
【０１３０】
好適な化学療法剤には、抗チューブリン／抗微小管薬、例えば、パクリタキセル、タキソール、タモキシフェン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、トポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アムサクリン、エピルビシン、マーバロン（ｍｅｒｂａｒｏｎｅ）、塩酸ピロキサントロン（ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；代謝拮抗剤、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキセート、ゲムシタビン、アシビシン（ａｃｉｖｉｃｉｎ）、アラノシン、ピラゾフリン、Ｎ−ホスホルアセチル−Ｌ−アスパレート＝ＰＡＬＡ、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ２’−デオキシシチジン、アラ−Ａ、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸；アルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ＢＣＮＵ＝カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、デカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタードおよびピポブロマン、４−イポメアノール；エストロゲン調節剤、例えば、ラロキシフェン；ピロキシカム；９−シスレチノイン酸が挙げられる。
【０１３１】
選択した化学療法剤の好適な用量は、当業者に既知である。例えば、薬剤がドキソルビシンである場合には、好適な用量は、患者の皮膚表面積あたり３０ｍｇ／ｍ２を含んでもよく、１週間間隔で２回静脈内投与される。しかし、当業者は、投与経路、投与回数、投与時期および用量を適宜容易に調節することができる。これらの点を考慮すると、一般的に、所定の化学療法剤の好適な用量は、１０ｍｇ／ｍ２から約５００ｍｇ／ｍ２であり、さらに好ましくは、患者の皮膚表面積あたり５０ｍｇ／ｍ２から約２５０ｍｇ／ｍ２である（平均的な体格の成人の皮膚表面は、約１．８ｍ２である）。このような用量は、選択した特定の薬物または薬剤に応じて調節することができるが、例えば、静脈内、皮内、直接部位注射、腹腔内、経鼻的等を含む任意の好適な経路によって投与することができる。投与は適宜反復することができる。
【０１３２】
一実施形態において、本明細書に記載する方法は、新生物が生じる前、新生物が臨床的に検出可能になる前および／または腫瘍が悪性になる前に早期段階に対象における非ＣＮＳ異常増殖の存在を同定または診断することができるので、化学療法剤の用量は、新生物、例えば、癌が、腫瘍塊の可視化または触診等の臨床方法によって検出または診断された後に典型的に使用される用量より少なくてもよい。
【０１３３】
治療標的のスクリーニング
非ＣＮＳ癌のＣＮＳマーカー遺伝子、例えば、本明細書に記載するＣＮＳマーカー遺伝子は、癌の存在を「感知する」だけでなく、応答、例えば、抗腫瘍応答を形成することによって癌の存在への応答に活発に関与することができる。または、ＣＮＳマーカー遺伝子は、癌の進行を促進することによって、例えば、新生物の増殖を誘発するまたは新生物の悪性転換を促進することによって非ＣＮＳ癌の存在に応答し得る。治療方法として、ＣＮＳにおいて前者の種類の遺伝子の発現または活性を促進するおよび／または後者の種類の遺伝子の活性の発現を阻害することが望まれると考えられる。したがって、ＣＮＳマーカー遺伝子が特定の癌を抑制または促進する応答を形成するかどうかにかかわらず、その同定は癌の進行を阻害する標的を提供し得る。
【０１３４】
治療標的であるとも考えられるこのようなＣＮＳマーカー遺伝子を同定する方法は、阻害応答を示さない動物と比較して、疾病に対する阻害応答を示す動物において差次的に発現されるＣＮＳ遺伝子を同定することである。例えば、実験動物には、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１２を発現する腫瘍誘発細胞（例えば、ＣＴ２６等の結腸癌細胞）を注射することができる。ＩＬ−１２を発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞の注射は、Ｔｈ１免疫介在性腫瘍拒絶を誘発することが知られている（Ａｄｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０（２３）：６６９６−７０３（２０００））。対照マウスには、ＩＬ−１２を発現しない腫瘍細胞を注射することができる。注射後の様々な経過時点において、ＣＮＳの遺伝子発現は、本明細書に記載されているように、例えば、マイクロアレイ分析により動物において分析される。このように、動物のＣＮＳ（例えば、脳）において具体的に「スイッチオン」および「スイッチオフ」する遺伝子を同定することができる。これらの遺伝子には、ＩＬの存在に応答するものがある。他は、抗腫瘍免疫応答の「刺激」に活発に関与する遺伝子に対応する。この方法は、抗腫瘍免疫応答の刺激に関与することができる任意のインターロイキン遺伝子に使用することができる。抗腫瘍応答を「刺激する」ことに活発に関与する脳遺伝子の同定は、例えば、遺伝子もしくは遺伝産物を直接使用することによって、またはそれらの活性を遮断もしくは刺激する薬剤をスクリーニングすることによって治療的介入の標的を提供する。
【０１３５】
治療標的であると考えられるＣＮＳ遺伝子を同定する第２の方法は、特定の遺伝子に脳特異的欠損（例えば、ノックアウト）を有する遺伝子組換え動物（例えば、ノックアウトマウス）を使用することによる。多大な数のＣＮＳ特異的ノックアウトマウスが現在当業者に利用可能であり（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙウェブサイト、神経生物学に使用する数多くのＪＡＸ（登録商標）マウスモデルを記載している）、さらに多くのものが日常的に利用可能になることが予想され得る。非ＣＮＳ疾病に対するＣＮＳ応答の役割は、（例えば、癌、ＲＡ、喘息または肥満について本明細書に記載するように）ノックアウトマウスに疾患を誘発し、疾病の結果を評価することによって、脳ノックアウト動物を入手または作製することができる任意の特定の遺伝子について確立することができる。
【０１３６】
治療標的でもあると考えられるＣＮＳマーカー遺伝子および遺伝子産物は、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載される。これらの遺伝子は細胞信号伝達に関与する分子（例えば、成長因子、ホルモン、サイトカインおよびそれらの受容体）であるか、またはそれらをコードし、検討した腫瘍の各々において差次的に発現されるマーカーでもある。
【０１３７】
ワクチン
本明細書に記載する方法はまた、予防的なワクチンの標的を提供する。疾病を「感知する」脳遺伝子セットは、既知または未知リガンドの受容体を含み得る。疾病細胞は、脳由来の抗疾病応答の誘発を阻害するこのようなリガンドを産生する可能性がある。このような例では、抗疾病応答に関与するＣＮＳ遺伝子を同定することにより、脳において疾病応答を阻害するように影響する可能性のある疾病細胞によって分泌される遺伝子産物を同定することができる。これらの産物を標的とする遺伝子ワクチンは実行可能な治療法になると考えられる。
【０１３８】
非ＣＮＳ疾患を治療する際の予防的なワクチン接種のためのＣＮＳ標的を同定する一方法は以下の通りである。実験腫瘍モデルにおいて抗疾病応答、例えば、腫瘍の場合には、ＩＬ−１２媒介性抗腫瘍応答を示す動物から（本明細書に上記するもの等の技術を使用して）ＣＮＳ遺伝子発現プロファイルを得るステップ。腫瘍を「感知する」遺伝子のクラスターから、ＩＬ−１２の存在下において、それらの発現レベルを変化させるものがあることが予想される。この遺伝子のサブセットは、抗腫瘍応答の「生成」に関与するものである可能性がある。この遺伝子のサブセットは予測可能な調節因子を有する可能性がある。例えば、ＩＬ−１２の存在下において非ＣＮＳ遺伝子に応答して発現プロファイルを変化するＣＮＳ遺伝子が受容体である場合には、このような受容体の遺伝子発現の変化はそのリガンドによって引き起こされる可能性があることを予想することができると考えられる。したがって、予防的な遺伝子ワクチンは、このようなリガンドに対するメモリー応答を形成するように設計することができると考えられる。
【０１３９】
第２の実験方法は、腫瘍細胞の非腫瘍形成投与（例えば、異常増殖が生体内に存在するが、新生物はまだ形成されていない状態）に応答して活性を変化するＣＮＳ遺伝子を同定することに関係し得る。上記に説明するように、このサブセットのＣＮＳ遺伝子から活性の変化を生ずる調節遺伝子を予測することができる。腫瘍細胞由来となり得るこのような調節遺伝子は、末梢生体における最初の腫瘍由来のアラーム信号となる可能性がある。したがって、予防的な遺伝子ワクチンは、このような遺伝子にメモリー応答を形成するように設計することができると考えられる。
【０１４０】
ワクチンは、例えば、標的対象の遺伝子に対応するポリペプチドまたは核酸であり得る。本明細書に記載するワクチンは、水、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液等の生理学的に適応可能な溶液またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて個体に投与または接種することができる。それらはまた、取り込みを促進するまたは接種部位に免疫系細胞を招集する能力を有する物質（例えば、促進剤およびアジュバント）の存在下で投与することができる。ワクチンは多数の投与様式および投与経路を有する。それらは皮内（ＩＤ）、筋肉内（ＩＭ）で投与することができ、どちからの経路によって、それらは針注射、遺伝子銃または無針ジェット注射によって投与することができる（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔ Ｉｎｃ．， Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。他の投与様式には、経口、静脈内、腹腔内、肺内、硝子体内および皮下接種が挙げられる。局所接種も可能であり、粘膜ワクチンと称することができる。これらには、例えば、鼻腔内、眼球、口腔、膣または直腸局所経路が挙げられる。これらの局所経路による送達は点鼻剤、点眼剤、吸入剤、坐剤またはミクロスフェアによるものであることが可能である。
【０１４１】
以下の実施例は例示的にすぎず、限定する意図はない。
【０１４２】
実施例
実施例１：癌に関連するＣＮＳ発現プロファイル予備研究
脳が、末梢における初期の腫瘍増殖の感知することができるかどうかを確立するために、ルイス肺、ＣＴ−２６結腸、および４Ｔ１乳房の発癌性細胞が同種マウスに注射され、異なる脳領域におけるトランスクリプトームが評価された。内部環境の監視における機能的関連性により、視床下部が選択され、連合領域であるために前前頭皮質が、また恒常性の基本パラメータの調節の役割により中脳が、選択された。
【０１４３】
生体内研究−腫瘍モデル
ＣＴ−２６．ＷＴ結腸癌およびＬＬ／２（ＬＬＣ１）肺癌をＤＭＥＭ中で増殖し、４Ｔ１乳房癌細胞を、加湿チャンバおよび５％ＣＯ２中で、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＲＰＭＩ中で増殖させた。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から、全ての細胞を得た。食餌および水は随時摂取させて、ケージあたり５匹の動物を入れ、ＨＥＰＡフィルター付きエアーラック（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ，Ｉｔａｌｙ）で飼育した８週齢のマウスに、悪性細胞を皮下注射した。雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、３００μｌのＰＢＳ中の１×１０６のＣＴ−２６．ＷＴ細胞を注射し、雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、第１および第２の乳腺間に１００μｌのＰＢＳ中の１×１０５の４Ｔ−１細胞を受け、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに、３００μｌのＰＢＳ中の１×１０６のＬＬ／２（ＬＬＣ１）細胞を注射した。
【０１４４】
明白な対照細胞がない場合は、シャム対照マウスに対応する容量のＰＢＳを注射した。正常細胞の注射は、不適切な部位に注射されると死に、最終的にアノイキスによる死の信号を送るため、信頼できる対照とはみなされなかった。したがって、各異なる腫瘍の種類が、他の腫瘍の種類に対する対照となった。
【０１４５】
対応する経過時点（１８、７２、または１９２時間）において、マウスを頸部脱臼により犠牲にし、視床下部、前前頭皮質、および中脳領域を切開した。同時に、肝臓を取り出した。領域は全て速やかにドライアイスで凍結し、ＲＮＡ抽出時まで−８０℃で保存した。
【０１４６】
米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の実験動物の使用に関する規則の規定および基準に従い、全ての動物処置を実行した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｌｅｌｏｉｒの倫理委員会により、動物実験は承認された。
【０１４７】
マイクロアレイ研究
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、総ＲＮＡを抽出した。ＭｉｃｒｏＰｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｅキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）を使用して、総ＲＮＡからポリＡ＋ＲＮＡを得た。オリゴｄＴプライマーおよびランダムプライマーによって、両方ともａａ−ｄＵＴＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の存在下で、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡをエタノール沈殿し、４．５μｌの０．１ＭＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）に再懸濁し、４．５μｌの染料（Ｃｙ３またはＣｙ５）と混合し、ＤＭＳＯ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｓｗｅｄｅｎ）に再懸濁し、室温において暗所で１時間インキュベーションした。製造業者の使用説明書に従い、以下の変更を加えて、ＳＮＡＰ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、プローブを精製した。最初のステップ：５００μｌのローディング緩衝液（７０％イソプロパノール中の２．２５Ｍ グアニジンＨＣｌ）を試料に添加し、試料を、ＳＮＡＰカラムに置き、第１の遠心分離前に４分間インキュベーションした。Ｖｉｒｔｅｋ Ｃｈｉｐｒｅａｄｅｒ Ａｒｒａｙｅｒ（Ｖｉｒｔｅｋ Ｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ． Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）を使用して、５０−ｍｅｒのマウス１０Ｋ Ｏｌｉｇｏ Ｓｅｔ（ＭＷＧ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＵｌｔｒａＧＡＰＳスライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）上にプリントした。プリントされたスライドを２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ中において、４２℃でプレハイブリダイゼーションを行なった。標識プローブを、３０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、４２℃で終夜ハイブリダイゼーションを行なった。
【０１４８】
データ取得および画像処理
分解１０μｍ、ピクセルの深さ１６ビットで、Ｃｈｉｐ−Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でスライドをスキャンし、ＶｅｒｓＡｒｒａｙ（商標） Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア ｖ４．５（ＢｉｏＲａｄ）で画像を分析した。
【０１４９】
データフィルタリングおよび正規化
データ処理は全て、Ｒ Ｓｙｓｔｅｍ ｖ２．２．１（ワールドワイドウェブ上のｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇで入手可能な、Ｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）下で実行した。ダスト由来データポイント（７５ピクセル未満のサイズのスポットまたは８０％未満の平均から中央値の相関のスポット（Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０（１２）：ｅ５４（２００２））、飽和データポイント（２０％を上回る飽和ピクセルの割合のスポット）、および低信号データポイント（１．２未満の信号対バックグラウンド比のスポット）を排除するために、データをフィルタリングした。３Ｄ正規化方法により、強度および空間関連バイアスを同時に補正した。簡潔に述べると、スポットｉ（Ｍｉ＝ｌｏｇ２Ｒｉ／Ｇｉ）のスポット強度の比を、非線形回帰の残余に置き換え、Ｍｉ＝ｆ（ｘｉ，ｙｉ，Ａｉ）であり、（ｘｉ，ｙｉ）は、スライドにおけるスポットｉの位置であり、Ａｉは、平均スポット強度、すなわち、Ａｉ＝１／２・ｌｏｇ２Ｒｉ／Ｇｉである。Ｒシステムのｌｏｅｓｓ関数を用いて、局所的に重み付けした３Ｄ多項式表面回帰を実行した。
【０１５０】
反復したスライド間のデータ統合および発現セット生成
染料交換（技術的）反復からのＭ値を、それらの品質スコア（ＱＣ）で重み付けし平均化した。ＱＣを、（０，１］の範囲になるようにスケーリングされたスポット周囲に対するスポット面積の比として画定した。各試料が同一の中央絶対偏差を有するように、得られる発現セットをスケール正規化した（Ｓｍｙｔｈ ａｎｄ Ｓｐｅｅｄ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１（４）：２６５−７３（２００３））。
【０１５１】
結果
癌細胞接種は、これらの研究の必要条件である、１００％のマウスに腫瘍増殖をもたらした。少量の転写物の損失を誘発する可能性があるＲＮＡ試料の増幅を防止するために、および技術上の変動に対して制御するために、１５匹のマウスプールから、それぞれの生物学的反復を得た。対照マウスには、ビヒクルのみを注射した。実験の開始後１８、７２、および１９２時間経過時に、マウスを犠牲にし、プリントされた１０Ｋオリゴヌクレオチドアレイ上の反復染料交換設計を使用して、脳の転写プロファイルを分析した（実験設計の理論的根拠に関しては、以下の実験方法を参照）。
【０１５２】
複数の分散分析（ＡＮＯＶＡ）テストを実行し、各経過時点に対して１つのテストであった。その早期段階における増殖する癌等の慢性刺激から予想される通り、それらのそれぞれの対照と比較される、悪性細胞を注射したマウス間の転写物レベルは、中程度の振幅の変化を呈した（最大で２００％）。図１は、３つの実験モデル（肺、乳房、および結腸）の結果を示す。各実験モデルに対して、３つの異なる経過時点（１８、７２、および１９２時間）において、視床下部、前前頭皮質、および中脳から試料を採取した。各経過時点における各試料を有する各癌モデルに対して、ＡＮＯＶＡテストを実行した。図１は、ＡＮＯＶＡテストを使用して差次的に発現されることがわかった遺伝子の数、上方制御された差次的に発現される遺伝子の割合、差次的に発現される遺伝子の平均倍率変化、および倍率変化データの第５および第９５パーセンタイル値を示す。図１からわかるように、１９２時間経過時において結腸癌モデルマウスの中脳に発現した遺伝子は、発現レベルにおいて最大で２００％の変化（第９５パーセンタイル値）を示した。
【０１５３】
興味深いことに、睡眠と覚醒との間の認識機能障害および皮質変化に続く海馬の変化等の、非急性状態に暴露されるマウスの脳に実行されたトランスクリプトーム分析において、転写物レベルの中程度の変化も見られた（Ｃｉｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ ４１（１）：３５−４３（２００４）； Ｂｌａｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２３（９）：３８０７−１９（２００３））。
【０１５４】
転写物の変化は、肺癌細胞を注射したマウスの視床下部において、最も多くの差次的に発現される遺伝子が見られたことを示す（図１）。加えて、結腸癌モデルにおいて、差次的に発現される遺伝子の数が、３つの経過時点において均等に分布したのに対して、肺および乳癌モデルにおいては、１８時間経過時において最も多くの差次的に発現される遺伝子を示した（図１）。
【０１５５】
生物学的反復試料の標準誤差により、各データセットの品質を評価し、異なる癌モデルに対するｌｏｇ１０標準誤差（ＡＳＥ）の絶対値の密度分布およびそれらの中央値をグラフにした。生物学的反復にわたって各遺伝子に対するＡＳＥを計算した。異なるデータセットの品質の差は見られず、脳領域と癌モデルとの間の認められた差は、システム生物学を反映することを示す（図２Ａ〜図２Ｄ）。結果は、異なるデータセットの品質の差がなかったことを示す。したがって、異なる脳領域において同定される、異なる量の差次的に発現される遺伝子は、人為的な結果であるのではなく、腫瘍の存在を感知する異なる脳領域の能力を反映する。
【０１５６】
総合すると、これらの結果は、末梢における悪性細胞の存在の脳による迅速な認識があることを示す。
【０１５７】
実施例２：癌に関連するＣＮＳ発現プロファイルの研究
３つの経過時点のいずれかにおいて差次的に発現される遺伝子を同定するために、混合モデルＡＮＯＶＡデザインを使用して、より完全な研究を行った。いずれかの経過時点において統計的に有意な変化を有する遺伝子を、さらなる分析のために選択した。図３は、３つの実験モデル（肺、乳房、および結腸）の結果を示す。各実験モデルに対して、３つの異なる経過時点（１８、７２、および１９２時間）において、視床下部、前前頭皮質、および中脳から試料を採取した。各癌モデルおよび脳領域に対して、ＡＮＯＶＡテストを実行した。図３は、ＡＮＯＶＡテストを使用して差次的に発現されることがわかった遺伝子の数、上方制御された差次的に発現される遺伝子の割合、差次的に発現される遺伝子の平均倍率変化、および倍率変化データの第５および第９５パーセンタイル値を示す。
【０１５８】
生物学的反復試料の分析
各経過時点において、少なくとも４つの生物学的反復を実行した。差次的に発現される遺伝子の同定に対して、反復なしで、治療と称する因子（レベル：腫瘍および対照）ならびに実験と称するランダム効果（レベル：１〜４）による、混合効果実験設計を用いた。治療因子に対する統計的有意性をＡＮＯＶＡにより推定した（Ｐ． Ｐａｖｌｉｄｉｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１， ２８２（２００３））。この設計は、多数の一方向ＡＮＯＶＡまたはｔ−検定と比較した場合、選択性の損失なしによりよい感度を有するため、いずれかの経過時点において因子治療により影響される遺伝子の同定に対して、多数のＡＮＯＶＡテストを実行する代わりに、前設計に因子時間（レベル：１８、７２、および１９２時間）を追加することを決定した（Ｐ． Ｐａｖｌｉｄｉｓ， Ｗ． Ｓ． Ｎｏｂｌｅ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２， ４２（２００１））。同一方向にそれらの発現レベルを変化させた遺伝子を同定するために、例えば、少なくとも１つの経過時点に変化した遺伝子、２つ以上の経過時点において変化した遺伝子は、同一方向に変化していなければならない（すなわち、必ず上方または下方制御されている）、治療間の平均差に対する統計的有意性をＡＮＯＶＡにより評価した。
【０１５９】
２つ以上の腫瘍モデルにより共有される差次的に発現される遺伝子の数が、偶然によってのみ、予想された量よりも有意に高かったかどうかを評価するために、フィッシャーの直接確率検定を使用した。
【０１６０】
実施例３：実施例２における研究のより限定的な分析
より限定的な分析において、１つの経過時点において上方制御を示すが、異なる経過時点において下方制御を示す遺伝子を排除した。２つの経過時点において上方制御を示したが、第３の経過時点において変化を示さなかった遺伝子は、より限定的な分析に加えられた遺伝子である。図４は、このより限定的な選択プロセスの結果を示す。図３および図４を比較することからわかるように、このより限定的な選択プロセスにより約半分の遺伝子が排除された。図５Ａ〜図５Ｊは、この第２のより限定的な選択プロセスにより同定された遺伝子の全ての表である。
【０１６１】
実施例４：肺癌モデルにおける視床下部のリアルタイムＰＣＲ確証研究
リアルタイムＰＣＲ確証研究は、以下の２つの主な理由により、肺癌群の視床下部領域に焦点を置いた。（ａ）遺伝子発現の最大の変化を有する領域のうちの１つであったこと（図１および図４を参照）、および（ｂ）統計的有意性に従いランクごとに分類される遺伝子に対する誤り発見率の分析（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｅｈａｖ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １２５（１−２）：２７９−８４（２００１））が、視床下部領域全体、特に、肺癌モデルが、最も多い差次的に発現される遺伝子を示したことを確認した。
【０１６２】
腫瘍細胞増殖により、他の器官が、遺伝子発現の変化を示す可能性があるかどうかを研究するために、マウスに癌細胞を注射し、肝臓における転写物レベルを評価した。図６Ａ〜図６Ｃは、肺癌細胞（６Ａ）、乳癌細胞（６Ｂ）、または結腸癌細胞（６Ｃ）の注射後に、差次的に発現されると同定される遺伝子の数（ｘ軸）の関数として、評価された誤り発見の割合（ｙ軸）を示す。０．２に設定された倍率発見の任意のカットオフによる誤り発見率分析は、肝臓において３つの差次的に発現される遺伝子のみを示し（図６Ａ〜図６Ｃ）、それは、肺癌モデルにおいて選択された約２００の視床下部遺伝子、または全ての脳領域および腫瘍モデルをプールした場合の６０を上回る平均遺伝子とは極めて対照的である（図６）。３０％を上回る肝臓マイクロアレイの振幅の変化を示す、全ての注釈付き遺伝子を確証するために、リアルタイムＰＣＲを使用した。マイクロアレイデータにおいて差次的に発現された１１個の遺伝子のうち、機能不明の亜鉛フィンガー遺伝子（Ｚｆａｎｄ２ａ）の配列のみが確証された。
【０１６３】
それらの変化の振幅とは無関係に、マイクロアレイにおけるそれらのｐ値の有意性に従い、リアルタイムＰＣＲ確証研究に対する試料を選択した。この選択方法は、リアルタイムＰＣＲによる５５％の確証をもたらした。確証の百分率は、＞１．３倍のみの振幅の変化が考慮された場合、８３％に上昇した。図７Ａは、５％を上回る倍率変化（１．０５）を含む百分率の倍率変化に従いグループ化された、リアルタイムＰＣＲ確証研究の結果を示す。実施例２の実験において５％を上回る倍率変化を示した遺伝子のうち、５５％の２９個の遺伝子が、リアルタイムＰＣＲにより確証された。実施例３において５％を上回る倍率変化を示した遺伝子のうち、５５％の２２個の遺伝子が、リアルタイムＰＣＲにより確証された。リアルタイムＰＣＲによる確証の程度は、脳における低レベルの差次的発現に関してすでに報告されたものと同様であった（Ｗｕｒｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１（４）：３０６−１６（２００３））。
【０１６４】
実施例２および３における実験間で、確証の程度は非常に類似していたため（図７Ａ）、それらが、癌増殖のモニタリングのためのより信頼できる候補であるだろうという考えに基づいて、一方向のみに変化した発現を示す遺伝子のリストにより、残りの実験を行った（第２のより限定的な分析）。
【０１６５】
リアルタイムＰＣＲ
製造業者の使用説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）１２−１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅＨ− Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、０．５μｇのｍＲＮＡを逆転写した。３７℃で１５分間、２μｌの２．５Ｍ ＮａＯＨでインキュベーションすることにより、ｍＲＮＡの分解を行った。１０μｌの２Ｍ ＨＥＰＥＳフリー酸で反応液を中和し、次いでｃＤＮＡ沈殿した。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ ｓｓＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｃＤＮＡの定量化を実行した。Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を使用してプライマーを設計し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ｉＣｙｃｌｅｒ ＩＱリアルタイム検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の９６ウェル光学プレートにおいてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、遺伝子を２つのハウスキーピング遺伝子（β２ミクログロブリンおよびβアクチン）と比較することによって、確証のために分析した各遺伝子を分析した。各２５μｌの反応物に対して、１μｌのｃＤＮＡ希釈液、２．５μｌの１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液、１．５μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、０．５μｌの各プライマー（１０μＭ）、０．７５μｌのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（１：１０００希釈）、０．２５μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．２５μｌのＲｏｘリファレンス色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５μｌのグリセロール、および０．２５μｌのプラチナムＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ＰＣＲ条件は以下のように設定した。９４℃において２．５分、ならびに９４℃において４５秒、５９℃において３０秒、および７２℃において１５秒を４０サイクル。全ての試料の融解曲線を必ず実行した。２〜４回、各回をトリプリケートで、各標的遺伝子を評価した。次いで、正常化対両方のハウスキーピング遺伝子の平均を実行した。統計的有意性をＡＮＯＶＡにより評価した。
【０１６６】
実施例５：実施例３において選択された遺伝子のベン図分析
実施例３において選択された遺伝子のベン図は、肺および乳癌モデルの視床下部および中脳データを比較した場合、統計的に有意な数の共有遺伝子を示した。図７Ｂは、肺癌モデルマウスの視床下部に差次的に発現された１２個の遺伝子が、乳癌モデルマウスの視床下部にも差次的に発現されたことを示す。図７Ｂはまた、肺癌モデルマウスの中脳に差次的に発現された８つの遺伝子が、乳癌モデルマウスの中脳にも差次的に発現されたことを示す。これらのデータは、脳が、末梢腫瘍細胞に応答して、特有の領域において遺伝子発現レベルを変化させることを示す。
【０１６７】
実施例６：２つの癌モデル間を区別する差次的に発現される遺伝子のサブセットの調査
対となる癌モデルを区別し得る、差次的に発現される遺伝子のサブセットの調査を行った。図８Ａは、３３個の差次的に発現される遺伝子（行）に基づいた、肺および結腸癌モデルから得られる２０個の視床下部試料のクラスタリング（列）を示す。同様に、図８は、乳房および肺癌モデル（図８Ｂ）から、および結腸および乳癌モデル（図８Ｃ）から得られる、視床下部試料のクラスタリングを示す。図９は、乳房および肺癌モデル（図９Ａ）から、結腸および肺モデル（図９Ｂ）から、および乳房および結腸モデル（図９Ｃ）から得られる、皮質試料のクラスタリングを示す。図１０は、乳房および肺癌モデル（図１０Ａ）から、結腸および肺モデル（図１０Ｂ）から、および乳房および結腸モデル（図１０Ｃ）から得られる、中脳試料のクラスタリングを示す。これらの図において、異なる領域における階層的クラスタリング分析の大部分の第１の枝分かれは、対となる癌モデルを正確に分離し、異なる癌を区別する脳の遺伝子発現特性の存在を示す。加えて、視床下部領域はまた、肺および結腸癌（ＲＯＣ−スコア：０．９８、ｐ＜０．０００１）、ならびに結腸および乳癌（ＲＯＣ−スコア：１、ｐ＜０．０００１）を区別するための、統計的に有意な予測能力を示した。
【０１６８】
階層的クラスター分析
実験全体にわたって同一方向にそれらの発現レベルを変化させた遺伝子のリストから（ｐ＜０．０５、上記の生物学的反復の分析の項を参照）、腫瘍モデル間で差次的に応答するものを選択した（ｐ＜０．０１、ｔ−検定）。４０％未満の欠測値を有する実験試料、および２０％未満の欠測値を有する遺伝子のみを分析に加えた。ユークリッド距離計算のために、Ｍｓｉ＝（Ｍｉ-エラー！オブジェクトは編集フィールドコードから作成できません。）／ＳＤ（Ｍ）として、データをスケーリングし、ＳＤは、標準偏差である。Ｗａｒｄの最小分散集積方法を使用して、クラスター分析を実行した（Ｊ． Ａ． Ｈａｒｔｉｇａｎ， Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７５， ｐｐ． ３６６）。
【０１６９】
予測能力推定
リーブ−ワン−アウト（ＬＯＯ）クロス確証を実行した。ｎ個の試料がある場合、順に全ての試料に対して、残りのｎ−１個の試料に関して分類子をトレーニングし、次いで、除外された試料に関して得られる仮説を試験した。重み付けした伝統的なｋ−最近傍（ｋｎｎ）法（以下の重み付けｋ−最近傍を参照）で分類を実現した。ＬＯＯプロセスは、ｎ仮説出力値を生成し、クラスを予測するために、所定の検出閾値τと比較した。τを変化させることにより、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線と呼ばれる、分類の感度対１−特異性の曲線を、描くことができる。ＲＯＣ曲線（ＲＯＣ−スコア）下の領域は、分類子の分離能力の測定値である。非常に好ましい分類子は、１に近いＲＯＣ−スコアを有し、好ましくない分類子は、約０．５のＲＯＣ−スコアを有する。クラス標識の無作為の１０，０００の順列により生成されるヌルモデルから、ＲＯＣ−スコアの統計的有意性を推定した。認められたスコアを上回る無作為化ＲＯＣスコアの割合として、認められたＲＯＣ−スコアのｐ値を算出した。
【０１７０】
重み付け最近傍（ｗＮＮ）
分類に有用な変数（遺伝子）をトレーニングセットより選択した（以下の変数選択の項を参照）。次いで、Ｙの標準偏差で変数を除することにより、トレーニングセット（Ｙ）およびテストセット（Ｘ）を正規化した。次いで、クラスｉに属するトレーニングセットの試料ｙおよびテスト試料ｘのそれぞれの間のユークリッド距離ｄ（ｙ，ｘ）を計算した。Ｇａｕｓｓ核関数ｓ−１（２π）−１／２ ｅｘｐ（−ｄ２／（２ｓ２））により、距離を重量（ｗ）に変換し、ｓは、距離ｄの標準偏差である。ｗＮＮ分類子をトレーニングするために全ての試料を使用して、決定関数ｆ（ｘ）を構築したため、ｋ＝Ｍである（以下に定義される通り）。クラス０に属するｘの推定投票スコアとして仮説出力値：
を生成し、ｌは、クラス標識のベクトルであり、ｍ０は、クラス０に属する試料の量である。したがって、クラスに対する投票スコアは、
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であり、ｍ０およびｍ１は、クラス０および１のそれぞれに属する試料の量であり、Ｍ＝ｍ０＋ｍ１である。
【０１７１】
このようにして、決定関数は、Ｄ（ｘ）＝ｆ１（ｘ）／ｆ０（ｘ）であり、Ｄ（ｘ）＞１である場合は、ｘは、クラス１に割り当てられ、Ｄ（ｘ）＜１である場合は、ｘは、クラス０に割り当てられる。
【０１７２】
変数選択
分類に好適な変数（遺伝子）を選択するために、ＬＯＯプロセスにおいてＲＯＣ−スコアを最大化する遺伝子セットを求めてトレーニングセットを検索した。簡潔に述べると、ｔ−検定を使用して、クラス間のそれらの差次的発現に従い、遺伝子をランク順序付けした。このランク付けリストの始めから、２個の遺伝子から始まり最大で１００個の遺伝子である、遺伝子を連続追加することにより、分類子における遺伝子数を最適化した。トレーニングセットで実行したＬＯＯで計算したＲＯＣ−スコアにより、遺伝子の各セットに対して、正しい分類の指数を推定した。ＲＯＣ−スコアを最大化する遺伝子の最少数を、分類に有用となるように選択した。
【０１７３】
実施例７：差次的に発現される遺伝子の機能カテゴリへのグループ化
マイクロアレイ情報の生物学的意義を理解するために、不偏Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉａデータベース（ＧＯ）（Ｍ． Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２５， ２５（２０００））の機能分類を使用して、差次的に発現される遺伝子を機能カテゴリにグループ化し、さらに、遺伝子集合濃縮解析（Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＧＳＥＡ）（Ａ． Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，（２００５））を使用して分析した。ＧＳＥＡは、任意のカットオフなしで全ての遺伝子を考察し、平均的な個々の変化が低い場合であっても、著しい活性の変化を集合的に示す遺伝子セットを同定する。分析は、視床下部領域に焦点を合わせた。各腫瘍の種類とそれらのそれぞれの対照の間で差次的に発現される遺伝子が豊富な機能遺伝子セットを同定した。機能カテゴリが、密接に関係した生物学的プロセスであった場合、それらをさらにグループ化した。ｐ＜０．０５における機能カテゴリの全体的な分析は、異なる癌モデル間で共有される統計的に有意な遺伝子セットを発見しなかった。この追加の種類の分析は、腫瘍保有マウスに差次的に発現される遺伝子ファミリーの同定を可能にする。この分析は、差次的に発現される遺伝子間の機能関係に基づいており、文献で認められており、他の手段により検出されない関連遺伝子に関する追加情報を提供し得る。しかしながら、有向非巡回ＧＯグラフを実行した後に遺伝子セットをカテゴリにグループ化することにより、３つのモデルにより共有される同様の生物学的プロセスの存在が明らかにされた（図１９Ａ〜図１９Ｉ）。これら共通のプロセスが、共通の生物学的機能を有する遺伝子に関与するかどうかを調査するために、最先端遺伝子サブセットを同定した（Ａ． Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，（２００５））。この分析（図１９Ｊ〜図１９Ｌ）は、「ニューロン結合」としてグループ化された軸索ガイダンスならびに細胞骨格およびシナプスリモデリング（図１９Ｂ、図１９Ｅ、図１９Ｈ、および図１９Ｊ〜図１９Ｌ）等の、同様の生物学的プロセスを反映した３つの癌モデルにより共有される遺伝子を同定し、これは、ＴＧＦβ／ＢＭＰ、ｗｎｔ、ヘッジホッグ、およびＮｏｔｃｈ信号伝達分子（図１９Ｃ，図１９Ｆおよび図１９Ｉ）等の、位置合図としての役割を果たす遺伝子ファミリーのメンバーを含んでいた（ｄｅ Ｗｉｔ， Ｊ． ＆ Ｖｅｒｈａａｇｅｎ， Ｊ．（２００３）Ｐｒｏｇ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ７１， ２４９−６７、Ｃｒｏｗｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １３， ９６７−７２．）。肺癌モデルの経時的分析は、１８時間経過時におけるＴＧＦβ／ＢＭＰ経路の上方制御、７２時間経過時におけるＷｎｔ経路、および１９２時間経過時におけるＮｏｔｃｈ経路の活性化に関連する「ニューロン結合」の増加を示す（図１９Ｃおよび図１９Ｊ〜図１９Ｌ）。乳房および結腸癌モデルにおいて、３つの経路およびヘッジホッグ信号伝達経路も活性化された（図１９Ｆおよび図１９Ｉ）。肺癌モデルとは対照的に、「ニューロン結合」は下方制御されたか、または結腸および乳癌のそれぞれにおいて変化を示さず、これらの信号伝達経路が、追加の生物学的プロセスにも関与する可能性があることを示唆する（図１９Ｊ〜図１９Ｌ）。注目すべきは、アレイが、少なくとも３０個の追加の信号伝達経路に対応する遺伝子配列を含んでいたという事実にもかかわらず、ＧＳＥＡ分析が、追加の信号伝達経路の有意な変化を得なかったことである。追加の最先端遺伝子は、肺および乳癌モデルにおける「免疫応答」、ならびに３つのモデルにおける「疾病応答」に関連する転写物を含む（図１９Ｂ、図１９Ｅ、図１９Ｈ、および図１９Ｊ〜図１９Ｌ）。肺および結腸癌モデルにおける「アポトーシス」の下方制御、ならびに乳房および結腸癌モデルにおける「シナプス活性」における下方制御も認められた（図１９Ｂ、図１９Ｅ、図１９Ｈ、および図１９Ｊ〜図１９Ｌ）。最後に、最先端遺伝子の３５％から４０％は、非関連の、または未知の生物学的機能を示した（図１９Ａ〜図１９Ｌの混合型を参照）。
【０１７４】
リアルタイムＰＣＲにより確証された遺伝子の分析は、ニューロン発症および活性に関与する遺伝子を示した（ＧＳＥＡ分析における明らかに表された生物学的カテゴリ）。図１１は、リアルタイムＰＣＲにより確証された遺伝子の表である。これらの遺伝子には、ニューロン発症および活性に関与するものもある。これらの遺伝子は、ミエリン恒常性に関与するトロンボキサンＡ２受容体（Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３（１）：４７５−８３（１９９８））、ドーパミン作動性伝達に関与するアタキシン−２（Ｂｏｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｖ． Ｄｉｓｏｒｄ． １９（１１）：１３２０−１３２５（２００４）、Ｗｕｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ． ６２（８）：１２８０−５（２００５））、およびシナプス活性に関与するコンタクチン２、オキシトシン、およびＧＡＢＡＡｒａｐｌ２（Ｆｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６１（１）：１５７−７０（１９９０）、Ｔｈｅｏｄｏｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． ４５（４）：４９１−５０１（２００４）、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８５（１−２）：１−１２（２０００））を含んでいた。興味深いことに、トロンボキサンＡ２受容体およびオキシトシンは、炎症／免疫関連プロセス、ＧＳＥＡ分析にも過剰に存在する生物学的カテゴリ、および疾病行動として既知の行動状態にも割り当てられ得る。この状態は、進行中の疾病の対処に集中するために、動物およびヒトの行動優先順位を変化させるが、重要なことに、異なる研究は、この行動状態と検討された癌の進行の間の強い関連性を提供した（Ｋｏｎｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２５（３）：１５４−９（２００２））。
【０１７５】
遺伝子注釈および遺伝子集合濃縮解析
Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚで入手可能）、およびＭｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ワールドワイドウェブ上のｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇで入手可能）から遺伝子情報を得た。Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）データベースのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ（ＢＰ）オントロジー（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２５（１）：２５−９（２０００））から機能遺伝子セットを生成した。ＧＯ Ｒ−パッケージに実装されるＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎデータベース（ＧＯＡ）（Ｃａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２６２−６（２００４））から、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ数からＧＯ−ＢＰカテゴリへのマッピングを得た。ｔ−検定により推定される差次的発現に対するそれらのｐ値に従い、遺伝子をランク順序付けした。遺伝子集合濃縮解析アルゴリズム（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２（４３）：１５５４５−５０（２００５））を使用して、遺伝子ランク付けリストの上部に過剰に存在する遺伝子セットを同定した。遺伝子を１０，０００回順列することにより、すなわち、遺伝子がそれらのサイズを維持しながらもセットに無作為に割り当てられることにより、統計的有意性（公称ｐ値）を推定した。差分ノードは、統計的に有意なＧＯ−ＢＰセット（ｐ＜０．０５）を意味する。
【０１７６】
実施例８：疾病行動として既知の行動状態に関連する遺伝子の研究
実施例１、２、および３に使用されるアレイにおいて存在しなかったが、疾病行動に関与することが知られる遺伝子発現を研究した。
【０１７７】
図１２は、疾病行動に関与することが知られているが、上記に実施例に使用されるマイクロアレイに存在しない遺伝子、ならびに少なくとも１つの経過時点、１つの脳領域、および１つの癌モデルに差次的に発現されることが、リアルタイムＰＣＲにより確証されている遺伝子の表である。例えば、３つの癌の種類を注射したマウスの視床下部および皮質におけるシクロ−オキシゲナーゼ−２（ｐｔｇｓ−２）のレベルは、上方制御されたことがわかった（乳癌モデルの皮質において１８時間経過時で＋１７．３％、結腸癌モデルの視床下部において１８時間経過時で＋９．８％、および肺癌モデルの視床下部において７２時間経過時で＋１４．３％、図１２を参照）。
【０１７８】
サイトカイン機能の干渉による疾病行動の減弱に関与する遺伝子の転写物レベルは、異なる腫瘍モデルを注射したマウスの視床下部において下方制御された。例えば、全てのモデルにおいてプロオピオメラノコルチン−アルファ（Ｐｏｍｃ１）、肺および乳癌細胞においてアルギニンバソプレシン、ならびに結腸癌細胞のみにおいておよびメラノコルチン受容体４および５−（Ｍｃ４ｒおよびＭｃ５ｒ）が減少した（図１２）。サイトカイン、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの疾病行動関連群に対しては、何の転写物レベルの変化も認められなかった。これらのデータは、疾病行動を発症しやすい分子環境の生成を示す。
【０１７９】
加えて、全ての腫瘍モデルの視床下部におけるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（Ｉｎｄｏ）の発現の減少（図１２）は、癌関連悪液質に関連する神経伝達物質であるセロトニンを生成するための、トリプトファンのより大きい接近性を示す可能性があり（Ｋｏｎｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２５（３）：１５４−１５９（２００２）； Ｌａｖｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １８（１）：１００−１０５（２００２））、悪液質をもたらす分子変化が、臨床症状が検出される前に早期に開始される可能性があることを示唆する。最後に、１８時間経過時における初期の増加後に、ニューロペプチドＹ（Ｎｐｙ）転写物レベルは、乳房および肺癌細胞を注射したマウスの皮質領域において正常に戻るか、もしくは減少したが、結腸癌においては、かなり後の１９２時間経過時において減少が認められた（図１２）。ＮｐｙおよびＭｃｒレベルの減少はまた、変化した摂食行動および癌発症においてのちに起こるストレスへの反応に先行する可能性がある（Ｈｅｉｌｉｇ ａｎｄ Ｔｈｏｒｓｅｌｌ， Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １３（１）：８５−９４（２００２））。
【０１８０】
実施例９：腫瘍保有動物の行動研究
疾病行動に関連する遺伝子発現は、穴掘りおよび水泳試験により分析されるように、腫瘍保有動物における行動変化は伴わなかった。
【０１８１】
穴掘り
記載される通りこの試験を実行した（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １４（２）：４０１−４０９（２００１））。簡潔に述べると、暗期の開始の少なくとも２時間前に、ペレットを充填したプラスチックチューブ（長さ２０ｃｍ、直径４ｃｍ）を含む個々のプラスチックケージにマウスを入れた。ケージの床に下部閉鎖端を置いた。ケージの床の３ｃｍ上にネジで開口端を支持し、内容物が非意図的に移動することを防止した。チューブを３００グラムのペレットで充填した。チューブに残ったペレットの重量を１６時間経過時に測定し、そこから移動した（穴が掘られた）重量を計算した。
【０１８２】
強制水泳試験
水（２４±１℃）を最大で１５ｃｍの深さまで充填したシリンダー（直径１９ｃｍおよび高さ２５ｃｍ）にマウスを別々に入れた。不動状態になるまでの時間を記録した（Ｐｅｔｉｔ−Ｄｅｍｏｕｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ）１７７（３）：２４５−５５（２００５））。マウスが、浮遊度を維持するために最小限の移動のみをする場合の不動状態を考察した。実験が終わった後に、タオルでマウスを乾かし、ケージに戻した。
【０１８３】
結果
図１３Ａ〜図１３Ｂは、腫瘍保有マウスおよび正常対照マウスの行動テストの結果を示す。結果は、腫瘍保有マウスおよび対照マウスに対して、実質的に同様である。
【０１８４】
これらの結果は、行動変化が見られるずっと前に、脳が、ある遺伝子の発現プロファイルを調節し得ることを示唆する。
【０１８５】
実施例１０：関節リウマチおよび癌モデル間の比較
癌に対する脳の分子応答の特異性をさらに評価するために、癌以外の慢性疾病の遺伝子発現を評価した。ＤＢＡ／１およびＣ５７ブラックマウスにおける２つの関節リウマチ（ＲＡ）のモデルを使用した。疾病の極早期段階、すなわち、両方のモデルにおける免疫化／追加免疫の１週間後に、脳試料を得た。マイクロアレイ分析は、対照マウスと比較して、視床下部、前前頭皮質、および中脳のそれぞれにおいて、＞１．２の倍率変化を有する、８９、７３、および１０４個の差次的に発現される遺伝子を同定した。モデル間のデータの比較は、癌細胞を注射したマウスおよびＲＡ−マウスが、非有意な数の差次的に発現される遺伝子を共有したことを示した。階層的クラスタリング分析は、第１の枝分かれが、各癌モデルに対応する対となる試料から、全ての関節炎試料を正確に分離したことを示した。（図１４Ａ〜図１４Ｃ、図１５Ａ〜１５Ｃ、および図１６Ａ〜図１６Ｃ）。
【０１８６】
同様の分析は、マウスのＲＡ群と３つの癌モデルの間の６つの考えられる対による比較のそれぞれにおける、１０個の上位にランク付けされた視床下部遺伝子を考察した。図１７Ａ〜図１７Ｂは、この分析において、関節炎のうちの１００％および癌モデル試料のうちの１００％が、第１のクラスタリングの枝分かれにおいて分かれたことを示す。第２の枝分かれは、乳癌試料のうちの１００％、７つの結腸癌試料のうちの１つ、および１２個の肺癌試料のうちの３つを含んでいた（図１７Ａ）。最後に、第３の枝分かれは、肺癌試料から結腸癌試料の残りを分離した（図１７Ａ）。皮質および中脳領域は、異なる試料の区別において視床下部ほど有効ではなかった。ＲＯＣ−スコアの計算は、前前頭皮質データが、ＲＡおよび乳癌モデル（ＲＯＣ−スコア：０．８３３３ｐ＜０．００１）、ならびにＲＡおよび肺癌モデル（ＲＯＣ−スコア：０．８０１３、ｐ＜０．００１）の区別に対して、統計的に有意な予測能力を示したことを示した。これは、ＲＡおよび結腸癌モデル（ＲＯＣ−スコア：０．９１０７ｐ＜０．００１）、ならびにＲＡおよび乳癌モデル（ＲＯＣ−スコア：１、ｐ＜０．００１）を区別することができた視床下部と同等の結果である。誤り発見率分析により、中脳は、最も多い差次的に発現される遺伝子を示したが、中脳は、２つの慢性疾病モデルを区別するための予測能力を示さなかった（図１８）。視床下部試料のＧＳＥＡ分析は、ＲＡおよび癌モデル間で統計的に有意な共有遺伝子セットを示さなかった。図１７Ｂ〜図１７Ｄは、＜０．０５のｐ値および＞２０％の倍率を有するいずれかの関節炎モデルに対して変化する各領域より選択される遺伝子のリストであり、両方のモデルにおいて変化する遺伝子に対して、変化は同一方向でなければならない。
【０１８７】
生体内研究−関節炎モデル
免疫化手法：１日目および２１日目に、同量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ， Ｓｉｇｍａ Ｃｏ）と混合した、２ｍｇ／ｍｌニワトリＩＩ型コラーゲン０．１ｍｌを、１０〜１２週齢のＤＢＡ／１およびＣ５７ＢＬ／６雄マウスの尾の付け根に皮内注射した。
【０１８８】
ＣＦＡのみをシャム治療した動物に注射した。２４日目に、ＬＰＳ（リポ多糖、０．１ｍｌのＰＢＳ中４０μｇ、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）をマウスに腹腔内注射し、１週間後（３１日目）に、早期疾病の徴候を示すマウスを頸部脱臼により犠牲にし、視床下部、前前頭皮質、および中脳を切開した。関節炎の発症は、免疫化の３週間後に足の腫脹として肉眼で見られた。この免疫化手法を使用すると、マウスの７３から９０％が、関節炎を発症した。関節炎の臨床的特徴は、２日に１回カリパスを使用して足の腫脹および腫脹した足の数を評価することによりモニタされ得る（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５（３）：７６３−９（１９９５））。
【０１８９】
介入がより成功裏に実行されることが多い時期の癌の早期検出は、大きな課題を残す。本明細書に記載する研究の目的は、末梢から発する信号の既知のインテグレーター（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｒ）としてのＣＮＳが、癌の進行を検出することができたかどうかを立証することであった。本研究は、癌細胞の注射の１８時間後という早期に見られる、変化する遺伝子発現レベルにより、脳が、実際に末梢腫瘍の存在に応答することを示す。単一遺伝子および遺伝子セット分析は、各癌モデルに対する分子特徴が特異的であることを示した。加えて、脳は、癌モデルにおいて認められたものとは異なる、特定の遺伝子プロファイルを有するＲＡ等の別の慢性疾病の早期発症を認識する。対照的に、肝臓等の末梢器官は、本質的には、腫瘍の存在を検出することができなかった。最後に、視床下部は、慢性末梢疾病から発する極早期信号をより効果的に検出および判別することができる領域のように思われた。
【０１９０】
実施例１１：ＣＳＦにおける差次的に発現されるタンパク質の同定
この実施例に記載する実験は、本明細書に記載されているような癌に関連する差次的ＣＮＳ遺伝子発現が、ＣＳＦにおける異なるタンパク質の存在とも関連があるかどうかを決定するために設計された。
【０１９１】
実施例１に記載されるように、生体内研究を行った。注射後２４時間および９日間後に、３０匹の動物の同一群（腫瘍注射された１５匹および１５匹の対照）からＣＳＦ試料を得た。各腫瘍の種類に対して、４つの独立した実験を行った。
【０１９２】
ＣＳＦ抽出のために、動物に麻酔をかけ、２７Ｇバタフライによる第４脳室の穿刺によりＣＳＦを得た。各実験群からのＣＳＦ試料をプールした。ＣＳＦ試料をＴＣＡ／アセトンで沈殿し、適切な量の溶解緩衝液（Ｕｒｅａ ７Ｍ、Ｔｉｏｕｒｅａ ２Ｍ、ＣＨＡＰＳ ４％、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ ２ｍＭ）に再懸濁させ、室温で１時間撹拌しながらインキュベーションし、−８０℃で保管した。
【０１９３】
２−Ｄ分析を実行するために、試料を適切な量の補水液に再懸濁し、およびカップローディング法により、終夜再水和された１１ｃｍのｐＨ３〜１０のＩＰＧストリップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）に添加した。製造業者の使用説明書に従い、Ｅｔｔａｎ ＩＰＧｐｈｏｒ等電点電気泳動システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）で、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を実行した。ＩＥＦ後に、１％ＤＴＴを含む平衡緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍの尿素、３０％ｖ／ｖグリセロール、２％ＳＤＳ、０．００５％ブロモフェノールブルー）で１５分間ストリップをインキュベーションし、続いて、平衡緩衝液中４％ヨードアセトアミドで、さらに１５分間インキュベーションした。Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ ＩＩＩ システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）で二次元（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実行した。
【０１９４】
データ分析、統計、およびタンパク質同定：
ＣｙｐｒｏＲｕｂｉ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）染色ゲルを画像スキャナでスキャンし、Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ２Ｄ Ｅｌｉｔｅ ３．１０ソフトウェアで分析した（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪから）。スポットを自動的に検出し、手動で編集し、ゲル間で一致させた。Ｒ−Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２．１．１下で正規化および推定統計を行った。質量分析に適合する硝酸銀染色を使用して、タンパク質を検出した。
【０１９５】
結果
増加あるいは減少すると同定されるタンパク質を表１に記載する。
【０１９６】
（表１）ＣＳＦにおいて差次的に存在するタンパク質
遺伝子座 定義
Ｐ２８６６５ ムリノグロブリン−１前駆体（ＭｕＧ１）
ＢＡＡ２３９５８ ＴＣＲベータ鎖
ＢＡＥ２８７０３ 名前の付けられていないタンパク質産物
ＡＡＡ４０９４２ アルファ−１ ＩＩＩ型コラーゲン
ＸＰ＿９９５００７ 亜鉛フィンガータンパク質２３５（亜鉛フィンガ ータンパク質９３）（Ｚｆｐ−９３）と同様
ＸＰ＿５７６３９４ グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素と同様
Ｐ１６６１７ ホスホグリセリン酸キナーゼ１
ＢＡＥ２６３２５ 名前の付けられていないタンパク質産物
ＡＡＨ８５０９８ エノラーゼ１、アルファ非ニューロン
ＮＰ＿０３３９３１ 炭酸脱水酵素２
ＢＡＢ２７３６２ 名前の付けられていないタンパク質産物
ＡＡＨ６２９５７ Ｃｐタンパク質
ＡＡＨ４３３３８ 補体成分 ３
ＸＰ＿２２３３６２ ｍＫＩＡＡ１４５８タンパク質と同様
【０１９７】
これらの結果は、恐らく本明細書に記載されているようなＣＮＳにおいて、おそらく差次的遺伝子発現の結果として、健康な動物にではなく、癌を有する動物のＣＳＦ中に存在するタンパク質の差次的パターンがあることを示す。
【０１９８】
実施例１２：血中の差次的に発現されるＣＮＳタンパク質の同定
この実施例に記載する実験は、本明細書に記載されているような癌に関連する差次的ＣＮＳ遺伝子発現が、移植したマウスの血中の異なるタンパク質の存在とも関連があるかどうかを決定するために設計された。
【０１９９】
実施例１に記載されるように、生体内研究を行った。ＥＤＴＡ１０％を有する５０ｍｌ円錐ファルコンチューブに血液を採取した。溶解緩衝液（ＫＨＣＯ３ １０ｍＭ、ＮＨ４Ｃｌ １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ ｐＨ＝８）を１ｍｌの血液あたり１５０ｍｌの溶解緩衝液の割合で添加した。時々撹拌しながら１５分間室温（ＲＴ）で試料をインキュベーションし、次いで、３００×ｇでＲＴで１５分間遠心分離した。製造業者の使用説明書に従い、上清を捨て、ペレットを５００μｌのＴｒｉｚｏｌ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でホモジナイズし、総ＲＮＡを分離した。製造業者の使用説明書に従い、ＲＮＡをＤＮａｓｅで処理し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。リアルタイムＰＣＲ実験を実施例４にあるように行った。
【０２００】
表２に示される結果は、健康な動物とは対照的に、癌を有する動物の血中に存在する遺伝子発現の差次的パターンを示す。
【０２０１】
（表２）血液試料中の確証された遺伝子
遺伝子 ＧｅｎＢａｎｋ 倍率変化（％） ｐ値 経過時点
Ａｃｃ．＃ （時間）
Atxn2 NM_009125 -106.38 0.020 18
Gabarapl2 NM_026693 -237.23 6.37E-06 18
Gabarapl2 NM_026693 +59.42 0.028 192
Atp5k NM_007507 -1004.77 0.003 18
Atp5k NM_007507 -54.99 0.041 72
Gpr109a NM_030701 -279.9 0.039 18
Kin X58472 -1796.78 0.031 18
【０２０２】
他の実施形態
本発明の数多くの実施形態が記載されている。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更を加えることができることが理解されると考えられる。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌のリスク評価、同定、診断、予後診断、および／またはモニタリング、ならびに早期治療的介入のための、方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
早期診断および同時に行われる早期治療的介入がほとんどのヒト疾患の治療および／または管理の成功の鍵となることは自明である。しかし、多くの疾患は、現在、病的過程がすでに進行してしまってからしか診断することができないか、または診断されない。例えば、多くの固形腫瘍は触診または組織イメージング技法によって可視化できるようになるまでは（すなわち、固形腫瘍のサイズが少なくとも０．５ｃｍとなるまで）、通常臨床的に検出不可能であり、それまでに何年も異常増殖が存在しているという可能性がある。同様に、糖尿病（空腹時血漿血糖値上昇または高血糖）の診断基準は、耐糖能障害（高血糖の根本原因）がすでに存在する場合に、疾患を同定する。別の例では、関節リウマチ（ＲＡ）は、関節硬直および関節痛の存在ならびに陽性のリウマチ因子の存在によって診断され、ＲＡを示す因子は全てすでに存在し、進行している可能性がある。
【０００３】
神経系の１つの主な機能は、ある閾値に到達する信号を感知し反応することにより、恒常性を維持することである。中枢神経系（ＣＮＳ）は、免疫系等の以前は無関係とみなされていた他の系から出る信号を感知し反応することができる（Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ａｎｄ ｄｅｌ Ｒｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １７（１）：６４−１０２（１９９６）（非特許文献１）、Ｔｒａｃｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ４２０（６９１７）：８５３−８５９（２００２）（非特許文献２）、Ｂｌａｌｏｃｋ， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． ２５７（２）：１２６−１３８（２００５）（非特許文献３）、Ａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３４５（８９４２）：９９−１０３（１９９５）（非特許文献４）、Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５（６）５７５−５８１（２００４）（非特許文献５））。例えば、脳は、免疫性末梢信号を感知し、視床下部−下垂体−副腎軸の活性化により反応することができ、その結果、進行中の免疫応答の調整をもたらす（Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１， ５６４（１９８３）（非特許文献６）； Ａ． Ｖ． Ｔｕｒｎｂｕｌｌ， Ｃ． Ｌ． Ｒｉｖｉｅｒ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７９，１（１９９９）（非特許文献７））。末梢信号は、液性、または迷走神経活性化等の、近年発見された神経経路により脳に影響を与えることができ、ＣＮＳと末梢との間の伝達の新しい経路が、いまだに発見されていないという考えを支持する（Ｔｒａｃｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ４２０（６９１７）：８５３−８５９（２００２）（非特許文献８）； Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｎ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８５（１−３）：４９−５９（２０００）（非特許文献９））。
【０００４】
癌は、先進工業国において、いまだに主な死亡原因である。患者生存の大幅な改善は、主に、まだ除去が可能である早期疾病検出により達成されており、可能な限り早期の段階に癌の存在を検出する必要性を強調する（Ｅｔｚｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ３（４）：２４３−２５２（２００３）（非特許文献１０））。
【０００５】
癌の進行は、高いゲノムの不安定性および高い突然変異率により特徴付けられ、各突然変異は、新しい遺伝子クローンを生成する（Ｋｈｏｎｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３（１１）：９９９−１００５（２００２）（非特許文献１１））。
【０００６】
機能的ゲノミクスおよびプロテオミクス等の高スループットスクリーニング方法の開発は、種々の疾患に関連する分子を探索する新たな生物学的基盤を提供している。マイクロアレイ分析に基づいた遺伝子−発現プロファイルは、肺癌患者の生存率を予測するのに幾分か有用となっている（Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８（８）：８１６−２４（２００２）（非特許文献１２））。同様の方法は、併用化学療法後のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の臨床成績を予測するのに有用であると言われた遺伝子群を同定した（Ｓｈｉｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８（１）：６８−７４（２００２）（非特許文献１３））。また、卵巣癌患者または前立腺癌患者と非癌ボランティアのプロテオミクスプロファイルの比較は、早期癌検出に有用である可能性のある一連の血清タンパク質を提供すると言われた（Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５９（９３０６）：５７２−７（２００２）（非特許文献１４）； Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９４（２０）：１５７６−８（２００２）（非特許文献１５））。
【０００７】
現在では、癌のほとんどの機能的ゲノミクス研究は、患者から得られる癌試料を使用して、（ゲノミクスまたはプロテオミクス方法によって）癌関連遺伝子発現プロファイルを生成している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ａｎｄ ｄｅｌ Ｒｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １７（１）：６４−１０２（１９９６）
【非特許文献２】Ｔｒａｃｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ４２０（６９１７）：８５３−８５９（２００２）
【非特許文献３】Ｂｌａｌｏｃｋ， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． ２５７（２）：１２６−１３８（２００５）
【非特許文献４】Ａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３４５（８９４２）：９９−１０３（１９９５）
【非特許文献５】Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ５（６）５７５−５８１（２００４）
【非特許文献６】Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１， ５６４（１９８３）
【非特許文献７】Ａ． Ｖ． Ｔｕｒｎｂｕｌｌ， Ｃ． Ｌ． Ｒｉｖｉｅｒ， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７９，１（１９９９）
【非特許文献８】Ｔｒａｃｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ４２０（６９１７）：８５３−８５９（２００２）
【非特許文献９】Ｇｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｎ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８５（１−３）：４９−５９（２０００）
【非特許文献１０】Ｅｔｚｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ３（４）：２４３−２５２（２００３）
【非特許文献１１】Ｋｈｏｎｇ ａｎｄ Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３（１１）：９９９−１００５（２００２）
【非特許文献１２】Ｂｅｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８（８）：８１６−２４（２００２）
【非特許文献１３】Ｓｈｉｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ８（１）：６８−７４（２００２）
【非特許文献１４】Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５９（９３０６）：５７２−７（２００２）
【非特許文献１５】Ｐｅｔｒｉｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９４（２０）：１５７６−８（２００２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載する方法およびシステムは、少なくとも一部で、中枢神経系（ＣＮＳ）が、末梢（非ＣＮＳ）癌の存在に応答した遺伝子発現の特定の変化（例えば、遺伝子発現パターンの変化）を示すという発見に基づいている。いかなる理論にも拘束されないが、本発明者らは、ＣＮＳ、例えば、脳の遺伝子発現の特定の変化は、癌発症の早期段階、例えば、疾患が臨床的に検出可能になる前および／または対象が症状を呈す前に、末梢癌の存在に応答して生じると考えている。したがって、本明細書に記載のＣＮＳの遺伝子発現の変化またはパターンを分析することによって、末梢癌を早期段階において診断し、早期治療的介入の標的とすることができる。
【００１０】
一態様において、本発明は、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するための方法を提供する。方法は、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、もしくは２１〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載する遺伝子またはその相同物、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂに記載する１つ以上の遺伝子より選択される、５つ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供するステップと、対象のＣＮＳ試料中の基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子の発現を検出するステップを含む、対象の遺伝子発現プロファイルを生成するステップと、対象の遺伝子発現プロファイルを基準遺伝子発現プロファイルと比較するステップとを含む。対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。一部の実施形態において、該方法はまた、１人以上の健康な被験体に対応する対照遺伝子発現プロファイルを提供するステップと、対象の遺伝子発現プロファイルを対照遺伝子発現プロファイルと比較するステップであって、対象の遺伝子発現プロファイルと対照遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が非ＣＮＳ癌を有さず、非ＣＮＳ癌を発症する可能性が低いことを示す、ステップと、を含む。
【００１１】
一部の実施形態においては、ＣＮＳ試料は、脳からの１つ以上の細胞、例えば、視床下部、中脳、および前前頭皮質からの細胞の試料である。一部の実施形態においては、脳細胞は、視床下部からのものである。
【００１２】
一部の実施形態においては、２つ以上の基準遺伝子発現プロファイルが使用され、それぞれは、異なる非ＣＮＳ癌に特異的である。
【００１３】
一部の実施形態においては、非ＣＮＳ癌は、肺癌、結腸癌、および乳癌からなる群より選択される。一部の実施形態においては、非ＣＮＳ癌は、直径０．５ｃｍ未満の固形腫瘍である。
【００１４】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載するいずれかの遺伝子、またはその相同物より選択される、１０個以上の遺伝子を含む。
【００１５】
遺伝子発現は、当技術分野で既知のいかなる方法をも使用して検出されることが可能であり、好適な実施形態においては、遺伝子発現は、マイクロアレイアッセイを使用して検出される。
【００１６】
一部の実施形態においては、対象は、ヒトであり、基準遺伝子発現プロファイルは、図５５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載する遺伝子の、１つ以上のヒト相同物を含む。対象は、癌の家族歴を有し得、画像分析で評価されたときに癌の臨床徴候を欠く可能性があり、および／またはＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、もしくはｈＭＳＨ６遺伝子等の非ＣＮＳ癌を発症するリスクが高いことに関連する遺伝子の保有者であり得る。
【００１７】
一部の実施形態において、該方法は、比較するステップの結果の記録を生成するステップと、任意で、対象、医療提供者または他の当事者に記録を伝達するステップと、をさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ肺癌を有しているか、発症する可能性が高いことを示す。
【００１９】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ乳癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００２０】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ結腸癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００２１】
別の態様において、本発明は、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌の存在に対応する基準遺伝子発現プロファイルを特徴とする。プロファイルは、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、または２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載するいずれかの遺伝子、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂのうちの１つまたは両方に記載するいずれかの遺伝子より選択される、５つ以上の遺伝子、例えば、１０、１２、２０、３０、４０、または５０個の遺伝子の発現データを含むことができる。
【００２２】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載するいずれかの遺伝子より選択される、５つ以上の遺伝子の発現データを含む。
【００２３】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌は、肺癌である。一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、５つ以上の遺伝子の発現データを含み、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌は、肺癌である。
【００２４】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌は、乳癌である。一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物の発現データを含み、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌は、乳癌である。
【００２５】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌は、結腸癌である。一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、５つ以上の遺伝子の発現データを含む。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載する基準遺伝子発現プロファイルに対応するデータセットを含む、コンピュータが読み取り可能な媒体を提供する。
【００２７】
付加的な態様において、本発明は、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するためのシステムを特徴とする。該システムは、
中枢神経系（ＣＮＳ）試料を得るためのサンプリング装置と、
ＣＮＳ試料中の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現データを生成する遺伝子発現検出装置、またはＣＮＳ中の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現の画像を得、１つ以上の遺伝子の遺伝子発現データを生成するためのイメージング装置と、
特定の非ＣＮＳ癌に対する、本明細書に記載される、基準遺伝子発現プロファイルと、
遺伝子発現データを受信し、基準遺伝子発現プロファイルと比較する比較器
とを含む。
【００２８】
さらに別の態様において、本発明は、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するための方法を提供する。該方法は、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載するいずれかの遺伝子、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂのうちの１つまたは両方に記載するいずれかの遺伝子より選択される５つ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供するステップと、対象のＣＮＳ試料（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料）中の基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子によりコードされる、タンパク質の発現を検出するステップを含む、対象の発現プロファイルを生成するステップと、対象の発現プロファイルを基準遺伝子発現プロファイルと比較するステップとを含む。対象の発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００２９】
一部の実施形態においては、２つ以上の基準遺伝子発現プロファイルが使用され、それぞれは異なる非ＣＮＳ癌に特異的である。
【００３０】
一部の実施形態においては、非ＣＮＳ癌は、肺癌、結腸癌、および乳癌からなる群より選択される。
【００３１】
一部の実施形態においては、非ＣＮＳ癌は、直径０．５ｃｍ未満の固形腫瘍である。
【００３２】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つ以上に記載するいずれかの遺伝子またはその相同物より選択される、５つ以上の遺伝子を含む。
【００３３】
一部の実施形態においては、該方法はまた、１体以上の健康な被験体に対応する対照遺伝子発現プロファイルを得るステップと、対象の発現プロファイルを対照遺伝子発現プロファイルと比較するステップであって、対象の発現プロファイルと対照遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が非ＣＮＳ癌を有さず、非ＣＮＳ癌を発症しないであろうということを示す、ステップと、を含む。
【００３４】
一部の実施形態においては、対象は、ヒトであり、基準遺伝子発現プロファイルは、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載する遺伝子の１つ以上のヒト相同物を含む。
【００３５】
対象は、癌の家族歴を有し得、画像分析で評価されたときに癌の臨床徴候を欠く可能性があり、および／またはＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、またはｈＭＳＨ６遺伝子等の非ＣＮＳ癌を発症するリスクが高いことに関連する遺伝子の保有者であり得る。
【００３６】
請求項３０に記載の方法は、比較するステップの結果の記録を生成するステップと、任意で、対象、医療提供者または他の当事者に記録を伝達するステップと、をさらに含む。
【００３７】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ肺癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００３８】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ乳癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００３９】
一部の実施形態においては、基準遺伝子発現プロファイルは、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み、対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ結腸癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００４０】
別の態様において、本発明は、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するための方法を特徴とする。該方法は、Ａｔｘｎ２、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ａｔｐ５ｋ、Ｇｐｒ１０９ａ、およびＫｉｎからなる群より選択される５つ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供するステップと、対象の血液試料中の基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子の発現を検出するステップを含む、対象の遺伝子発現プロファイルを生成するステップと、対象の遺伝子発現プロファイルを基準遺伝子発現プロファイルと比較するステップとを含む。対象の遺伝子発現プロファイルと基準遺伝子発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００４１】
なおさらなる態様において、本発明は、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するための方法を提供する。該方法は、表１に記載する遺伝子より選択される５つ以上のタンパク質を含む、基準タンパク質発現プロファイルを提供するステップと、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中の基準タンパク質発現プロファイルの全てのタンパク質の発現を検出するステップを含む、対象のタンパク質発現プロファイルを生成するステップと、対象のタンパク質発現プロファイルを基準タンパク質発現プロファイルと比較するステップとを含む。対象のタンパク質発現プロファイルと基準タンパク質発現プロファイルの一致は、対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す。
【００４２】
本明細書に記載する方法は、特に、種々の疾患のリスク評価のため、疾病の早期検出および診断のため、疾病の進行のモニタリングのため、疾病の治療効果のモニタリングのため、および／または臨床状態の評価のために有用である。
【００４３】
本明細書において使用する「疾患」または「疾病」は、生体または細胞、組織もしくは器官の一部の健康を脅かす状態の変化である。２つの用語は、疾患の極早期段階（例えば、対象または医療提供者によって検出できない可能性があるが、疾病過程を開始している生体の早期変化）を含む全ての疾患段階を含むことを意味する。例えば、「疾患」および「疾病」という用語は、新生物または腫瘍が形成される前の異常増殖期、および例えば、関節リウマチの発症において、炎症が現れる前の抗原に対する早期免疫応答を含む。
【００４４】
本明細書において使用する「異常増殖」または「癌」は、正常な細胞の増殖を通常は誘発しないと考えられる、または正常な細胞の増殖を停止すると考えられる条件下における細胞の未制御かつ進行性の増殖である。異常増殖は、組織の新たな異常な増殖である、「新生物」の形成を生じる可能性がある。異常に増殖する細胞が塊を形成すると、新生物は、一般に、「腫瘍」と称される。新生物または癌は、良性または悪性となり得る。
【００４５】
「対象」は、考えられる癌の存在について試験されるヒトまたは動物である。動物は、哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシもしくはヤギ等の家畜、実験用齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモットまたはハムスター）等の実験動物、ウサギ、または実験用霊長類、例えば、チンパンジーもしくはサルであることが可能である。
【００４６】
本明細書において使用する「一致する（ｍａｔｃｈｅｓ）、（ｍａｔｃｈｉｎｇ）」または「一致（ｍａｔｃｈ）」という用語は、発現プロファイルの比較に関する場合、対象の発現プロファイルの遺伝子の少なくとも７５％が、差次的に発現されることを意味する。差次的発現の方向に関するデータが、基準発現プロファイルに含まれる場合、「一致」は、対象の発現プロファイルの遺伝子の少なくとも７５％が、基準発現プロファイルの遺伝子と同じ方法で上方または下方制御されていることを意味する。例えば、基準発現プロファイルにおいて遺伝子１〜５が上方制御されており、遺伝子６〜１０が下方制御されている場合には、遺伝子１〜１０が下方制御されている対象のプロファイルは一致していないと考えられるが、遺伝子１、２、３、４および６が上方制御されており、遺伝子５、７、８、９および１０が下方制御されている対象のプロファイルは一致していると考えられる。
【００４７】
「高レベルの一致」は、遺伝子の少なくとも７５％が、基準発現プロファイルの遺伝子の発現レベルの少なくともプラスまたはマイナス５０％（または発現レベルの比のＬｏｇ２）内にあることを意味する。例えば、以下の基準発現プロファイルを仮定する。遺伝子Ａでは、疾患が存在しない場合の発現レベルに対する疾患が存在する場合の発現レベルのＬｏｇ２比は＋０．４であり、遺伝子Ｂでは、比は−０．４であり、遺伝子Ｃでは、比は＋０．２であり、および遺伝子Ｄでは、比は−０．２である。対象のプロファイルの遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ（基準プロファイルの遺伝子の７５％）が、それらの基準プロファイルの遺伝子に対する比の±５０％内であるため、以下の値（Ａ＝＋０．３、Ｂ＝−０．３、Ｃ＝＋０．１、Ｄ＝＋０．３）を有する対象のプロファイルは、高レベルの一致である。
【００４８】
本明細書に記載するものと同様または等価な方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書に記載する全ての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は全体の内容が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示的にすぎず、限定をする意図はない。
【００４９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】異なる腫瘍細胞（肺、乳房、および結腸）の注射後の異なる経過時点における、マウスのＣＮＳにおいて差次的に発現される遺伝子の数をそれらのそれぞれの対照と比較して示す表である。この表のデータは、複数の分散分析（ＡＮＯＶＡ）テストにより得られ、１つのテストが各経過時点に対応する。表は、差次的に発現される遺伝子の数（遺伝子の列）、上方制御された差次的に発現される遺伝子の割合（上方の列）、平均倍率変化（倍率の列）、ならびに第５および第９５パーセンタイルを示す。データは、＞１．２の倍率変化を示す遺伝子に対応する。
【図２】生物学的反復の標準誤差により評価されたグラフの形態によるデータセットの品質の分析を示す、一連のグラフである。グラフは、種々の疾病モデル、すなわち、肺癌（図２Ａ）、乳癌（図２Ｂ）、結腸癌（図２Ｃ）、および関節炎（図２Ｄ）に対する、ｌｏｇ１０標準誤差（ＡＳＥ）の絶対値およびそれらの中央値の密度分布を示す。「Ｈｔ」は、視床下部を意味し、「Ｃｘ」は、前前頭皮質を意味し、「Ｍｂ」は、中脳を意味し、「Ｌｉ」は、肝臓を意味する。
【図３】腫瘍細胞を注射したマウスに差次的に発現される遺伝子の数をそれらのそれぞれの対照と比較して示す表である。差次的に発現される遺伝子は、本明細書に記載されているように選択された（初期分析）。表は、差次的に発現される遺伝子の数（遺伝子の行）、上方制御された遺伝子の割合（上方の行）、平均倍率変化（倍率の行）、ならびに第５および第９５パーセンタイルを示す。データは、＞１．２の倍率変化を示す遺伝子に対応する。
【図４】癌細胞を注射したマウスに差次的に発現される遺伝子の数をそれらのそれぞれの対照と比較して示す表である。選択された遺伝子は、一方向のみに変化した発現を示す遺伝子に対応する（第２のより限定的な分析）。表は、差次的に発現される遺伝子の数（遺伝子の行）、上方制御された遺伝子の割合（上方の行）、平均倍率変化（倍率の行）、ならびに第５および第９５パーセンタイルを示す。データは、＞１．２の倍率変化を示す遺伝子に対応する（遺伝子選択に関するさらなる詳細については、実験方法を参照）。
【図５】（図５Ａ−Ｉ）癌細胞を注射したマウスの脳に差次的に発現される遺伝子の表である。この表に含めるために選択される遺伝子は、より限定的な分析（実施例３に記載する）において、一方向のみ（すなわち、上または下）に変化した発現を示す遺伝子に対応する。各表は、以下のようなある脳領域に差次的に発現される遺伝子を含む。５Ａ〜Ｃ、皮質；５Ｄ〜Ｆ、視床下部；および５Ｇ〜Ｉ、中脳。マウスは、結腸癌細胞（５Ａ、５Ｄ、および５Ｇ）、乳癌細胞（５Ｂ、５Ｅ、および５Ｈ）、または肺（５Ｃ、５Ｆ、および５Ｉ）癌細胞を注射された。（図５Ｊ）癌細胞を注射したマウスに差次的に発現されるさらなる遺伝子の一連の表である。この表に含めるために選択される遺伝子は、対データのＡＮＯＶＡを使用して、より限定的な分析（実施例３に記載する）において、一方向のみに変化した発現を示す遺伝子に対応する。Ｈｔ、視床下部；ｃｔ、皮質；ｍｂ、中脳。
【図６】３つの癌モデルに対応する異なる脳領域および肝臓データセットの誤り発見率（Ｆａｌｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ：ＦＤＲ；ｑ値）を示す、一連のグラフである。発現レベルにおいて＞１．２の倍率変化を示す遺伝子は、それらの差次的発現のｐ値に応じてランクごとに分類された。図は、このランク付けされたリストから推定されるｑ値を示す。Ｃｘ：前前頭皮質、Ｈｔ：視床下部、Ｍｂ：中脳、Ｌｉ：肝臓。
【図７Ａ】リアルタイムＰＣＲによるマイクロアレイデータの確証を示す、棒グラフである。肺癌モデルの視床下部に対応する遺伝子は、基準１または２により選択され、それらの倍率変化に応じてグループ化された。棒は、確証された経過時点の割合を表し、棒上の数字は、アッセイした経過時点の数を示す。
【図７Ｂ】３つの脳領域に対する、肺、乳房、および結腸癌モデルの共通部分を示す、一連のベン図である。数字は、第２のより限定的な分析中に差次的に発現される遺伝子の数を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１ フィッシャーの直接確率検定。
【図８】（８Ａ−Ｃ）視床下部試料の一連の３つの二次元クラスター分析である。（８Ａ）これらの腫瘍モデル間で差次的に応答する遺伝子に基づいた、肺および結腸癌モデルから得られる視床下部試料の階層的クラスター分析である。対にしたモデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいた、（８Ｂ）乳房および肺癌モデル、ならびに（８Ｃ）結腸および乳癌モデルからの試料の階層的クラスター分析である。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要なクラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。（８Ｄ−Ｆ）図８Ａ〜図８Ｃに示す視床下部試料のクラスター分析で同定される遺伝子を記載する表である。８Ｄ、結腸対乳房；８Ｅ、結腸対肺；８Ｆ、乳房対肺。
【図９】（９Ａ−Ｃ）一連の３つの二次元クラスター分析である。皮質試料は、対にした癌モデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいて、（Ａ）乳房および肺癌モデル、（Ｂ）結腸および肺癌モデル、ならびに（Ｃ）乳房および結腸癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要クラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。（９Ｄ−Ｆ）図９Ａ〜図９Ｃに示す視床下部試料のクラスター分析において同定される遺伝子を記載する表である。９Ｄ、結腸対乳房；９Ｅ、結腸対肺；９Ｆ、乳房対肺。
【図１０】一連の３つの二次元クラスター分析である。中脳試料は、対にした癌モデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいて、（Ａ）乳房および肺癌モデル，（Ｂ）結腸および肺癌モデル、ならびに（Ｃ）乳房および結腸癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要クラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。
【図１１】リアルタイムＰＣＲにより確証された、肺、乳房、および結腸癌細胞を注射したマウスの視床下部、前前頭皮質、および中脳より選択される遺伝子の表である。これらの表中の遺伝子は、施設内でプリントされた１０Ｋオリゴヌクレオチドアレイ（ｐ＜０．０５）から得られた。１１Ａおよび１１Ｂの列の定義は、以下の通りである。領域：試料が得られた脳領域、モデル：癌モデル、遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、倍率：倍率変化（％）、ｐ値：ＡＮＯＶＡにより推定されるｐ値（＜０．０５であるべきである）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図１２】リアルタイムＰＣＲによりアッセイした遺伝子の表である。これらの表中の遺伝子は、施設内でプリントされた１０Ｋオリゴヌクレオチドアレイには存在しなかったが、疾病行動として既知の行動状態に関与することが知られている。データは、平均の平均±標準誤差として表現される。列の定義：領域：試料が得られた脳領域、モデル：癌モデル、遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、倍率：倍率変化（％）、ｐ値：ＡＮＯＶＡにより推定されるｐ値（＜０．０５であるべきである）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図１３】行動テストの結果を示す棒グラフである。（１３Ａ）腫瘍細胞の注射後の異なる経過時点において、マウスによりチューブから移された（掘られた）ペレットの平均重量。１群当たりｎ＝９匹の動物。（１３Ｂ）腫瘍細胞の注射後９日目に行われた強制水泳試験。Ｙ軸は、不動状態までの時間（秒）を示す。１群当たりｎ＝７匹の動物。
【図１４】（１４Ａ−Ｃ）一連の３つの二次元クラスター分析である。視床下部試料は、異なる対にしたモデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいて、（１４Ａ）関節炎および肺癌モデル、（１４Ｂ）関節炎、および乳癌モデル、ならびに（１４Ｃ）関節炎および結腸癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要クラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。（１４Ｄ−Ｇ）関節炎および癌モデル間で視床下部に差次的に発現される遺伝子の表である。１４Ｄ、関節炎対結腸；１４Ｅ、関節炎対肺；１４Ｆ、関節炎対乳房；１４Ｇ、関節炎対結腸、肺、および乳房。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図１５】（１５Ａ−Ｃ）一連の３つの二次元クラスター分析である。皮質試料は、異なる対にしたモデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいて、（１５Ａ）関節炎および肺癌モデル、（１５Ｂ）関節炎および乳癌モデル、ならびに（１５Ｃ）関節炎および結腸癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要クラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。（１５Ｄ−Ｇ）関節炎および癌モデル間で皮質に差次的に発現される遺伝子の表である。１５Ｄ、関節炎対結腸；１５Ｅ、関節炎対肺；１５Ｆ、関節炎対乳房；１５Ｇ、関節炎対結腸、肺、および乳房。列の定義は、図１４Ｄ〜Ｇと同様である。
【図１６】（１６Ａ−Ｃ）一連の３つの二次元クラスター分析である。中脳試料は、異なる対にしたモデル間で差次的に応答する遺伝子のサブセットに基づいて、（Ａ）関節炎および肺癌モデル、（Ｂ）関節炎および乳癌モデル、ならびに（Ｃ）関節炎および結腸癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。試料の２つの主要クラスターは、試料軸に属する階層ツリーの第１の枝分かれにより定義される。試料標識は、癌モデルおよび経過時点を示す。（１６Ｄ−Ｇ）関節炎および癌モデル間で中脳に差次的に発現される遺伝子の表である。１５６、関節炎対結腸；１６Ｅ、関節炎対肺；１６Ｆ、関節炎対乳房；１６Ｇ、関節炎対結腸、肺、および乳房。列の定義は、図１４Ｄ〜Ｇと同様である。
【図１７】（１７Ａ）視床下部試料の階層的クラスター分析は、各一対比較からの１０個の上位にランク付けされた遺伝子に基づいて、関節炎および癌モデルから得られた。各列は、試料を表し、各行は、単一遺伝子を表す。グレースケールは、倍率変化を割合（％）として表す。白線は、試料の優性クラスターへの細分を示す。試料標識は、疾病モデルおよび経過時点を示す。（１７Ｂ−Ｄ）ｐ値＜０．０５および倍率＞２０％を有するいずれかの関節炎モデルに対して変化する、各領域より選択される遺伝子の表であるが、それが両方のモデルにおいて変化する場合は、変化は同一方向でなければならず、例えば、少なくとも１つの経過時点において変化した遺伝子、２つ以上の経過時点において変化した遺伝子は、同一方向に変化していなければならない（すなわち、必ず上方または下方制御されている）。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、Ｃ５７およびＤＢＡ：各関節炎モデル（Ｃ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／１）に対する倍率変化（％）、最大：いずれかの関節炎モデルに対する最大倍率変化（＞２０であるべきである）、ｐ値：ＡＮＯＶＡにより推定されるｐ値（＜０．０５であるべきである）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図１８】関節炎モデルに対応する異なる脳領域データセットに対する誤り発見率（ＦＤＲ；ｑ値）を示すグラフである。発現レベルにおいて２０％を上回る倍率変化を示す遺伝子は、それらの差次的発現のｐ値に応じてランクごとに分類された。図は、このランク付けされたリストから推定されるｑ値を示す。Ｃｘ：前前頭皮質、Ｈｔ：視床下部、Ｍｂ：中脳。
【図１９】（１９Ａ，Ｄ，Ｇ）差次的に発現される遺伝子が豊富なＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉａデータベース（ＧＯ）遺伝子セットを示す、有向非巡回グラフ（ＤＡＧ）である。黒丸は、ｐ＜０．０５における差次的遺伝子セットを表す。強度は、平均倍率変化を各遺伝子セットについての割合として示す（ｐ＜０．０５、ＧＳＥＡ）。白丸は、非差次的遺伝子セットを示す（ｐ＞０．０５）。密接に関係した遺伝子セットは、３つの経過時点にわたって同色でハイライトされるカテゴリ（上部標識）にグループ化された。最先端遺伝子（ＬＥＧ）は、選択された末端遺伝子セットから同定された。（１９Ｂ，Ｅ，Ｈ）成人の脳におけるそれらの生物学的機能に応じて、手動でグループ化されたＬＥＧを示す棒グラフである。（１９Ｃ，Ｆ，Ｉ）特定の信号伝達経路に属する「ニューロン結合」機能に対応する、遺伝子の数を図示する棒グラフである。水平棒は、信号伝達経路を示し、サイズは、遺伝子量に比例する。（１９Ｊ−Ｌ）乳癌（１９Ｊ）、結腸癌（１９Ｋ）、および肺癌（１９Ｌ）に対する差次的遺伝子オントロジーセットからの視床下部最先端遺伝子の表である。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、倍率：倍率変化（％）、ｐ．値：ＡＮＯＶＡにより推定されるｐ値（＜０．０５であるべきである）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図２０】癌に応答して脳に差次的に発現される個々の遺伝子のリストである。このリストは、異なる癌モデルを区別する遺伝子発現プロファイルに対するもの（図１１〜図１２）を除いて、前のリスト（図５、８〜１０、および１４〜１６）のうちの少なくとも１つに存在する遺伝子を含む。遺伝子の合計数：９９９。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図２１】各腫瘍の種類（結腸）に対する５０個の最有力候補遺伝子のリストである。これらのリストは、本明細書に記載するリストから作成されており、対としたデータに対するＡＮＯＶＡを使用して、リアルタイムＰＣＲおよび図５により確証された遺伝子を含む。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図２２】各腫瘍の種類（肺）に対する５０個の最有力候補遺伝子のリストである。これらのリストは、本明細書に記載するリストから作成されており、対としたデータに対するＡＮＯＶＡを使用して、リアルタイムＰＣＲおよび図５により確証された遺伝子を含む。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【図２３】各腫瘍の種類（乳房）に対する５０個の最有力候補遺伝子のリストである。これらのリストは、本明細書に記載するリストから作成されており、対としたデータに対するＡＮＯＶＡを使用して、リアルタイムＰＣＲおよび図５により確証された遺伝子を含む。列の定義：遺伝子座：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）の番号（各遺伝子に対して同定される固有番号）、遺伝子：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子記号、説明：Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子データベースからの遺伝子の説明、遺伝子座（ホモ）：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅデータベースから得られるヒト相同物に対するＥｎｔｒｅｚ遺伝子数（＝ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ数）、遺伝子（ホモ）：ヒト相同物に対する遺伝子記号。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
詳細な説明
本明細書に記載する方法は、一部には、癌の早期段階の（癌出現の数時間以内、数日以内、数週間以内または数ヶ月以内の場合もある）末梢（非ＣＮＳ）組織または器官を同定する（例えば、診断するまたはモニタする）ために、ＣＮＳにおける遺伝子発現の検出に依拠している。疾病の早期同定および／または診断は、早期治療的介入の機会を提供し、癌が過度に進行する、または攻撃的になる前に癌を標的とする。
【００５２】
一般的な方法
ＣＮＳは、強度または機能的関連性によって、内部恒常性を変更する可能性のある任意の内部または外部刺激に対する生体の応答に関与する。この機能の一部として、ＣＮＳおよび免疫系は、適宜、相互作用して適切な免疫応答を得る。
【００５３】
免疫応答は、神経および液性機序を介して脳に影響を与える。神経機序は、主に、迷走神経の活動に関係する。１８（３）：１３０−１３６６（１９９５）； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４２１（６９２１）：３８４−３８８（２００３））。液性機構には、例えば、サトカイン介在による神経発火率の上昇など、脳構造上に直接働きかける、サトカイン介在の作用が挙げられる。（Ｒｏｔｈｗｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｐｋｉｎｓ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８）３：１３０−１３６６（１９９５）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４２１ ）６９２１：３８４−８３３（２００３））。一例において、末梢サイトカインは迷走神経に結合して、活性化し、脳の孤束および視床下部の核のニューロンを活性化することが示されている（Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ Ｍａｉｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６（１４）：７７１０−７７１３（１９９９））。
【００５４】
末梢からの液性信号は、脳への強力なメッセンジャーとして作用する。脳内のサイトカインは、末梢よりはるかに低用量で作用を発揮することができる。例えば、１００ｐｇ〜１０ｎｇの用量のインターロイキン−１（ＩＬ−１）の脳内投与は、体温、胃の機能、代謝の増加および挙動変化の最大限の変化を誘発するが、末梢に投与した際、同様の応答を誘発するためには数マイクログラムのこのサイトカインが必要である（Ｒｏｔｈｗｅｌｌ ａｎｄ Ｈｏｐｋｉｎｓ，（１９９５）、前記）。
【００５５】
内部免疫信号を感知すると、脳は種々の様態で反応する。免疫信号に対するＣＮＳ応答のパラダイムの一つは、視床下部−脳下垂体−副腎軸等の神経内分泌軸の活性化である。この軸が活性化されると、糖質コルチコイドが遊離され、進行中の免疫応答を１０分未満で調節することができる。迷走神経切離は、サイトカインの腹腔内投与後、視床下部下垂体副腎軸の活性化を弱めることが示されている（Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ Ｍａｉｅｒ，（１９９９）、前記）。このフィードバック機序は生理学的関連性が高い。すなわち、末梢におけるサイトカイン放出による糖質コルチコイド産生の阻害により、通常、生物は死亡する（Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ａｎｄ ｄｅｌ Ｒｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １７（１）：６４−１０２（１９９６））。
【００５６】
脳はまた、外部環境から免疫および他の系に影響する信号も感知することができる。例えば、ストレス反応の誘発により、糖質コルチコイドを放出し、進行中の免疫応答を弱くし得る。免疫系に対するストレスの影響は、動物モデルおよびヒトにおいて十分に証明されている（Ｄｅｉｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｓｙｃｈｏｐｈｙｓｉｏｌ． ３７（３）：２１９−３２（２０００）； Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ． Ｉｍｍｕｎ． １２（４）：２９７−３０７（１９９８）； Ｂｅｎｓｃｈｏｐ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０（４）：５１７−２４（１９９６）； Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８４０：８０３−８（１９９８））。また、黙想またはヨガ等の精神／肉体介入が免疫系に影響を与える可能性があるという逸話的および予備的な証拠がある（Ｃａｓｓｉｌｅｔｈ， ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． Ｃｌｉｎ． ４９（６）：３６２−７５（１９９９））。
【００５７】
本新規方法は、末梢癌および他の疾患を早期段階において検出する方法として、ＣＮＳのこの自然の反応を利用する。いかなる理論によっても限定するのではないが、本明細書に記載する該方法は、一部には、癌進行の発症の早期段階において末梢（非ＣＮＳ）疾患からの「アラーム信号」の存在をＣＮＳが感知するという発見に基づいている。したがって、本明細書に記載する該方法は、ＣＮＳ、例えば、ヒト等の対象からのＣＮＳ試料の遺伝子発現を検出することによって、末梢癌を診断するステップに関する。一態様において、非ＣＮＳ癌は、癌の進行が生体内で開始されてから、数時間、数週間、または数ヶ月以内に、脳の遺伝子発現の特定のプロファイル（例えば、脳の視床下部、皮質、および／または中脳領域に発現されるような、図５、１２、および１３における遺伝子より選択される遺伝子のプロファイル）に基づいて同定することができる。一部の実施形態においては、非ＣＮＳ癌は、癌の進行が生体内で開始されるが、癌が臨床的に検出可能になる、および／または増悪期になる前に、脳の遺伝子発現プロファイルに基づいて同定することができる。
【００５８】
癌発症
臨床的に検出可能な腫瘍塊は、異常であるが、免疫監視を逃れ、免疫系の攻撃を受けない細胞を含むことが一般に認められている。腫瘍の進行時には、細胞は、特に、組織適合性抗原の下方制御等の表現型変化に反映される高い突然変異率によって特徴付けられる。したがって、腫瘍は、クローン選択、および細胞を所定の治療に対して抵抗性にする突然変異を有する細胞クローンの腫瘍塊からの増殖によって特定の治療に抵抗性となることがある。腫瘍細胞クローンの「自然淘汰」は、所定の割合で生じ、免疫系からの成長および逸脱を促進する遺伝的および後成的特徴を有する悪性細胞が出現する。平均悪性度は１０，０００を超える突然変異を含むと推定される（Ｓｔｏｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９６（２６）：１５１２１−６（１９９９））。したがって、確立された癌の抗原プロファイルは、超早期段階の細胞の遺伝子型および表現型を反映しないと結論付けることができる。さらに、確立された癌に存在する腫瘍抗原および生物において誘導することができる応答は早期段階の腫瘍細胞によって誘導される抗原および応答と異なると考えることが妥当である。本明細書に記載する新規方法は、これらの障害にもかかわらず、このような早期段階の腫瘍細胞を検出することができる。
【００５９】
一部の新生物、例えば、一部の癌は、それらが従来の既知の技術を使用して臨床的に検出可能になる、および／またはそれらが悪性になる前に、長期間（例えば、１、２、５、１０、１５、２０、または２５年間）増殖する可能性がある。この期間は、悪性腫瘍が現在の方法によって検出可能になる前に、癌細胞を検出するための驚くほど長い機会を提供する。この期間中に、腫瘍細胞は、それらのゲノムの不安定性の結果として分子レベルのいくつかの改変を受ける。
【００６０】
それぞれの遺伝的変化は、おそらく増殖に選択的であるおよび／または先天性および適応免疫応答を回復し、活性化する新たな「アラーム信号」を誘発することができる。簡単には、腫瘍が臨床的に検出可能になる前に、１０〜１５年の腫瘍形成期間中に１０，０００のアラーム信号が作成される。
【００６１】
遺伝子発現を検出する方法
ＣＮＳにおける遺伝子発現は、生体外、例えば、単離したＣＮＳ試料において、または生体内において、例えば、生体内におけるイメージング技法を使用して検出することができる。
【００６２】
中枢神経系（ＣＮＳ）試料
ＣＮＳは、脳（脳神経を含む）および脊髄を指す。ＣＮＳ試料は、例えば、脳もしくは脊髄の細胞もしくは組織、または脳室および脊髄の中心管を満たす脳脊髄液（ＣＳＦ）試料であり得る。
【００６３】
遺伝子発現の検出が対象から単離されたＣＮＳ試料において実施される場合には、ＣＮＳ試料は、当業者が利用可能なあらゆる方法によって得ることができる。例えば、ＣＮＳ細胞または組織試料は、例えば、針生検または開放性外科的切開によって脳から得ることができる。脳のイメージングを実施して、脳に進入する針またはメスの正確な位置決めを決定することができる。
【００６４】
定位生検として知られる一例では、弱い沈静または全身麻酔下にある患者の頭蓋骨に小さい穴を開け、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャン等のコンピュータ支援式イメージング技法によってガイドして針を脳組織に挿入する。針を使用して細胞試料を取り出し、通常のアッセイ、例えば、本明細書に記載する遺伝子発現アッセイによってその遺伝子発現を検出することができる。別の例において、ＣＳＦ試料は、腰椎穿刺等の通常の方法によって得ることができる。この手技は、例えば、局所麻酔下で外来で実施することができる。
【００６５】
ＣＮＳ試料に特定の遺伝子発現アッセイを実施するのに必要な細胞数またはＣＳＦ量は異なるが、ＰＣＲに基づいた技法等のいくつかの技法では、極少数の細胞、例えば、１０〜１００細胞程度しか必要としない（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０（４）：３８７−９２（２００２））。ＣＮＳ試料は本明細書に記載する診断試験にすぐ使用しても、または例えば、冷蔵もしくは冷凍保存しても、および／または診断試験を実施する施設に輸送してもよい。
【００６６】
核酸を使用する方法
一実施形態において、本明細書に記載する方法は、（ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは遺伝子に対応する他の核酸等の）ポリヌクレオチドを検出する遺伝子発現を検出する技法を使用する。核酸を使用して遺伝子発現を検出する多数の方法が存在すること、および任意の好適な検出方法を使用することができることが当業者に理解されよう。典型的なアッセイ様式は核酸ハイブリダイゼーションを使用し、例えば、１）核ラン−オン（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎ−ｏｎ）アッセイ、２）スロットブロットアッセイ、３）ノーザンブロットアッセイ、４）磁気粒子分離、５）核酸もしくはＤＮＡアレイもしくはチップ（以下にもさらに詳細に考察されている）、６）逆ノーザンブロットアッセイ、７）ドットブロットアッセイ、８）インサイチューハイブリダイゼーション、９）ＲＮａｓｅ保護アッセイ、１０）リガーゼ連鎖反応、１１）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、１２）逆転写酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ、および１３）ディファレンシャルディスプレイＲＴ−ＰＣＲ（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）またはこれらの方法の任意の２つ以上の任意の組み合わせが挙げられる。このようなアッセイは、検出される特定の核酸の存在またはレベルを検出、同定またはモニタするために、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識または他の好適な標識等の検出可能な標識を使用することができる。このような技法および標識は当技術分野において既知であり、当業者が広範に利用することができる。
【００６７】
一実施形態において、被験対象のＣＮＳ試料から単離したｍＲＮＡに、配列パネルの１つ以上のメンバーに対応する多数のＤＮＡプローブをハイブリダイゼーションすることによって、ＲＮａｓｅ保護アッセイを本明細書に記載する方法に使用することができる。ＣＮＳ試料の１つ以上の遺伝子の発現プロファイルを基準遺伝子発現プロファイル、例えば、基底状態の発現パターンまたは他の陰性もしくは陽性対照（例えば、末梢疾病がないことが既知の患者のプロファイル、または被験対象の特定の疾患がないことが既知の対象由来の標準的もしくは平均プロファイル）と比較することができる。一例において、試験ＣＮＳ試料の遺伝子発現プロファイルを、非ＣＮＳ異常増殖の存在に関連する基準遺伝子発現プロファイルと比較する。試験遺伝子発現プロファイルが基準遺伝子発現プロファイルに一致する場合には、対象は非ＣＮＳ異常増殖疾患を有するまたはそれを発症するリスクにあることを示す。
【００６８】
本明細書に記載する方法はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する方法にも好適である。ＰＣＲを使用する方法は、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：１８９−１９３，１９９１）、自己持続配列複製（３ＳＲ）（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：１８７４−１８７８， １９９０）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８６：１１７３−１１７７）、Ｑベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１９７，１９８８）、ローリングサイクル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号）または任意の他の核酸増幅方法を含み、当技術分野において既知の技法を使用する増幅分子の検出が続く。ＣＮＳ試料において発現されたｍＲＮＡのＰＣＲ増幅は、試料から単離したｍＲＮＡから直接、あるいは、そのようなｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡから行なうことができる。次いで、増幅した核酸を関心対象の特定のプローブ、例えば、本明細書に記載するＣＮＳ遺伝子のプローブにハイブリダイゼーションしてその発現を判定することができる。プローブをアレイ、例えば、本明細書に記載するアレイのアドレスに配置することができる。このような方法は日常的であり、特にコンピュータ制御式試薬分注および信号検出を使用する自動システムへ日常的に適応することができる。例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０（４）：３８７−９２（２００２）を参照されたい。
【００６９】
別の実施形態においては、特定の遺伝子に対応するｍＲＮＡの存在またはレベルを検出するために、インサイチュー方法が使用される。このような方法では、ＣＮＳ細胞または組織試料を調製／処理して、支持体、典型的にはガラススライドに固定し、次いでプローブ（例えば、本明細書に記載するＣＮＳ遺伝子のプローブ）と接触させることができる。
【００７０】
さらに別の実施形態において、米国特許第５，６９５，９３７号に記載する遺伝子発現の連続分析を使用して、本明細書に記載するＣＮＳ遺伝子の転写物レベルを検出する。
【００７１】
ポリペプチドを使用する方法
他の実施形態において、本明細書に記載する方法は、遺伝子がコードする遺伝子産物（ポリペプチド）遺伝子を検出するまたはポリペプチドの活性、例えば、酵素活性を検出する遺伝子発現を検出する技法を使用する。このような方法は、ＣＮＳ細胞から、例えば、ＣＳＦに分泌されるポリペプチドをコードする遺伝子の発現を検出するのに特に有利である。
【００７２】
種々の方法を使用してＣＮＳ遺伝子がコードするタンパク質のレベルを求めることができる。一般に、これらの方法は、（脳細胞試料またはＣＳＦ試料等の）ＣＮＳ試料と関心対象のタンパク質に選択的に結合する抗体等の試薬を接触させるステップを含む。一実施形態において、抗体は検出可能な標識を有する。抗体はポリクローナル抗体、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。無傷の抗体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を使用することができる。プローブまたは抗体に関して「標識した」という用語は、プローブまたは抗体に検出可能な物質を結合する（すなわち、物理的に結合する）ことによるプローブまたは抗体の直接的な標識化、および検出可能な物質との反応によるプローブまたは抗体の間接的な標識化を含むことが意図される。生体外および生体内においてＣＮＳ試料のＣＮＳ遺伝子産物を検出するために、そのような検出方法を使用することができる。
【００７３】
生体外技法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、免疫蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析およびＬｕｍｉｎｅｘ（商標）ｘＭＡＰ（商標）検出アッセイ等の免疫測定法が挙げられる。 標的分析物を標識抗体と固相支持体に固定した抗体の間に「サンドイッチ」する「サンドイッチ」タイプのアッセイである免疫測定法もある。アッセイは、固定した抗体に結合した抗原標識抗体複合体の存在および量を観察することによって読み取られる。
【００７４】
本明細書に記載する方法に有用な別の免疫測定法は、「競合」タイプの免疫測定法であり、そこでは、固相表面に結合した抗体と、未知量の抗原分析物および同一種類の標識抗原を含有する試料（例えば、ＣＳＦ試料）を接触させる。次いで、固相表面に結合した標識抗原の量を求め、試料中の抗原分析物の量の相対的な測定値を提供する。このような免疫測定法は、使用が便利であるように「ディップスティック」様式（例えば、フロースルーまたは移動式のディップスティック設計）で容易に実施される。ディップスティックを使用するアッセイは、任意で、陰性または陽性の内部対照を含む。数多くの種類のディップスティック免疫測定法が当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，６５６，４４８号、第４，３６６，２４１号、および第４，７７０，８５３号に記載されている。他の実施形態において、抗体を使用するアッセイはアレイ様式で実施される。例えば、ＣＮＳ試料を標識、例えば、ビオチン化し、次いで抗体、例えば、抗体アレイ上に位置付けられている抗体に接触させる。例えば、蛍光標識に結合したアビジンで試料を検出することができる。
【００７５】
生体内技法は、例えば、検出対象の遺伝子産物に結合する標識抗体を対象（例えば、ＣＳＦ）に導入するステップを含む。抗体は、例えば、対象における存在および位置を標準的なイメージング技法によって検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
【００７６】
特定のＣＮＳ遺伝子産物を検出するために使用されるポリクローナルおよびモノクローナル抗体は入手可能な場合もある。例えば、本明細書に記載するＣＮＳマーカー遺伝子の多くの市販の抗体が存在する。または、当業者は、通常の技法を使用して診断アッセイに使用するのに好適な抗体を作製することができる。特定の標的を検出するためにポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製し、使用する方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｉ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １， １９９８）において記述されている。改変された抗体および抗原結合性抗体断片（例えば、キメラ抗体、再構成抗体、ヒト化抗体またはそれらの断片、例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２断片）；または生合成抗体（例えば、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等を作製する方法は当技術分野において既知であり、例えば、Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｖｅｒｌａｇ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １５， ２０００；第１版）に見出すことができる。
【００７７】
ＣＮＳ遺伝子発現のイメージング
一実施形態において、本明細書に記載する方法は、ＣＮＳにおける遺伝子発現を画像化する、例えば、遺伝子発現を非侵襲的に画像化する技法を使用する。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて栄養物を輸送するために存在する担体輸送システム等の内因性ＢＢＢ輸送システムを介して、標識プローブを脳に標的化することにより、標的遺伝子の発現を検出することができる標識プローブを、血液脳関門（ＢＢＢ）を通じて脳内に送達することができる。同様に、受容体媒介性の経細胞輸送システムを作動して、インスリン、トランスフェリンまたはインスリン様成長因子等の循環ペプチドを、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて輸送する。これらの内因性ペプチドは、「輸送ペプチド」または「分子的なトロイの木馬」として作用して本明細書に記載する標識診断プローブを、ＢＢＢを越えて通過させることができる。次いで、既知の脳イメージング技法によって標識を検出することができる。このような方法は、例えば、米国特許第６，３７２，２５０号に記載される。他の実施形態において、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９７（２６）：１４７０９−１４（２０００）、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ． ４３（７）：９４８−５６（２００２）は、ＢＢＢを通過するためにアンチセンス放射性医薬品と薬物標的化技術を合わせて使用して生体内において脳における遺伝子発現を画像化することを記載している。
【００７８】
標的遺伝子の発現を検出することができる標識プローブを脳内に送達する他の方法は、例えば、米国特許第５，７２０，７２０号に記載されている。この特許は、高流動微量注入により脳内に（遺伝子産物を画像化するための標識抗体等の）薬剤を送達する方法を記載している。
【００７９】
生体液中のＣＮＳ遺伝子発現の変化の検出
ＣＮＳにおける遺伝子の活性化により、離れた部位、例えば、血液、尿または精液（すなわち、ＣＳＦ以外の体液）等の体液における遺伝子産物の測定可能な変化を生ずることがある。例えば、大脳皮質、海馬、嗅内（ｅｎｔｏｒｒｈｉｎａｌ）皮質、視床の一部、基底核、小脳、および網様体は自律神経系の出力に影響することが既知である（Ｋａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ）。このような影響により、自律神経節または神経支配されている器官における遺伝子発現のｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの測定可能な変化を生じ得る。この種の相互作用の一例は、末梢におけるサイトカイン放出による迷走神経活性化の免疫調節作用である（Ｔｒａｃｙ，Ｎａｔｕｒｅ，４２０：８５３−９，２００２）。
【００８０】
加えて、一部の実施形態においては、ＣＮＳにおける遺伝子の活性化は、血中のＣＮＳタンパク質レベル、すなわち、ＣＮＳ組織に発現し、血流中に行き着くタンパク質を測定することにより検出することができる。例えば、ＣＮＳのニューロンは、視床下部、下垂体、副腎、性腺、または甲状腺軸等のいくつかの神経内分泌軸を介して血中へのホルモンの放出を誘発することができる（Ｂｅｓｅｄｏｖｓｋｙ ａｎｄ ｄｅｌ Ｒｅｙ， Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． １７：１−３９，（１９９６））。脳の細胞外液は、くも膜絨毛を通過して脳から血液に、ならびにある種の脳神経（主に嗅神経）および脊髄神経根神経節を通ってリンパ液に排出される。脳または脳脊髄液の異なる領域に注射したタンパク質の最低１４〜４７％はリンパ液を通過する。したがって、ＣＳＦマーカーはリンパ液、血液または血清中に排出され、リンパ液、血液または血清中で検出することができる。血中に見られるこのようなマーカーは濃縮されてもよく、それによって血液成分の腎臓による選択的なろ過により尿中で検出可能になり得る。
【００８１】
ＣＮＳは、自律神経系および内分泌系を介して精巣に関連している。脳内の遺伝子の活性の変化によって視床下部−下垂体−性腺軸の活動または精巣の神経支配が変更されると、このような変化は、精子等の精巣に関連する体液中で検出できると考えられる。例えば、脊髄損傷患者は、精子の組成が変化することが示されている（Ｎａｄｅｒｉ ａｎｄ Ｓａｆａｒｉｎｅｊａｄ， Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ５８（２）：１７７−８４（２００３）参照）。
【００８２】
日常的な方法を使用して、ＣＮＳにおける遺伝子発現の変化の結果である、末梢体液等の末梢組織における遺伝子産物を同定することができる。例えば、候補マーカー遺伝子を実験動物の脳において崩壊することができる。野生型動物（すなわち、候補マーカー遺伝子が崩壊されていない動物）と比較した、実験動物の末梢組織における候補遺伝子の発現の変化は、末梢組織における候補分子の発現がＣＮＳにおける遺伝子発現の変化に関連していることを示す。
【００８３】
一部の実施形態においては、血中に検出されるＣＮＳ遺伝子産物は、以下表１のに記載するものを含む。
【００８４】
アレイ
本明細書に記載する方法は、当技術分野において既知の方法により、核酸またはタンパク質アレイ、例えば、核酸および／またはタンパク質「チップ」用に容易に適応させられる。典型的な実施形態において、アレイチップは、多数のＣＮＳ遺伝子の発現を検出するための多数のプローブ（例えば、ＤＮＡプローブおよび／または抗体プローブ）を含む。一実施形態において、特定のチップ上のプローブは、ＣＮＳ試料を採取した対象に非ＣＮＳ異常増殖が存在する場合には、各クラスターが特定の遺伝子発現プロファイルに関連する遺伝子の１つ以上の特定のパネルまたは「クラスター」のメンバーを検出するように選択される。チップは、固相平面支持体、例えば、ガラス、金属またはナイロン上の離れた所定の位置（アドレスまたは「スポット」）に固定（係留）された数十、数百または数千の個々のプローブを含むことができる。アレイはマクロアレイ、またはマイクロアレイであり得、その差はスポットのサイズである。マクロアレイは、直径約３００ミクロン以上のスポットを有し、ゲルまたはブロットスキャナーを使用して画像化することができる。マイクロアレイは、直径３００ミクロン未満、典型的には２００ミクロン未満のスポットを有する。
【００８５】
本明細書に記載する方法において遺伝子発現プロファイルを分析および比較するためには、核酸アレイは、本明細書内の表または図面に記載される少なくとも４つ、例えば、少なくとも１０、２０、４０、６０、８０または１００のＣＮＳ遺伝子の核酸プローブを使用して構築することができる。このようなアレイは対照プローブ（すなわち、陰性試料、例えば、非ＣＮＳ疾患が認められない対象の試料において発現が影響を受けないことが予想される遺伝子のプローブ）を含み得る。典型的には、このような対照または「正常な」非疾病試料は健康なボランティアから得られる。健康なボランティアの長期経時研究を実施して、対照試料が、疾病を生じない個体由来のものであることを確認することができる。このような研究は、対照遺伝子発現プロファイルのデータベースの生データを提供する。 そのようなデータベースは、本方法に使用することができる正常または対照「基準」プロファイル源を提供する。対照試料はまた、診断対象の疾患に関連のない死因で死亡した個体（例えば、不慮の外傷で死亡した個体）の死後に得ることもできる。このような場合には、死後試料は死後できるだけ早く、例えば、死後３時間以内に採取するべきである。
【００８６】
関心対象の組織、例えば、脳、脊髄またはＣＳＦ試料の総ｍＲＮＡに相当する標識ｃＤＮＡ集団を、好適なハイブリダイゼーション条件下でＤＮＡアレイと接触させる。例えば、固相支持体上の特定のアドレスにおける蛍光によって、ｃＤＮＡとアレイの配列とのハイブリダイゼーションを検出する。このように、特定の対象または対象群のＣＮＳ試料における遺伝子発現パターンを表す蛍光パターンが得られる。これらの遺伝子発現パターンはデジタル化して、コンピュータ分析および比較のために電子的に保存することができる。例えば、アレイを使用して、試験対象の個体におけるＣＮＳ遺伝子の発現と、例えば、デジタルデータベースに電子的に保存されている１つ以上の基準遺伝子発現プロファイルを比較することができ、この場合、基準遺伝子発現プロファイルは末梢異常増殖または他の疾患の有（陽性対照）またはなし（陰性対照）に関連する。
【００８７】
一部の実施形態において、ｃＤＮＡが、アレイを作製するためのプローブとして使用される。好適なｃＤＮＡは、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法によって得ることができる。ｃＤＮＡの長さは２０〜２，０００ヌクレオチド、例えば、１００〜１，０００ヌクレオチドであり得る。ｃＤＮＡを作製するための当技術分野において既知の他の方法を使用することができる。例えば、クローニングした配列の逆転写を使用することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に記載されている）。ｃＤＮＡプローブを好適な固相支持体（基板）、例えば、コーティングしたガラス顕微鏡スライドの特定の所定の位置（アドレス）に二次元格子状に配置または設置する（「プリントする」または「スポットする」）。少容量、例えば、５ナノリッターの濃縮ＤＮＡ溶液を各スポットに使用する。スポッティングは、業者の取扱説明書に従い、市販のマイクロスポッティング装置（配列マシーンまたは格子形成ロボットと呼ばれる場合もある）により行なうことができる。ＤＮＡアレイを作製するための固相支持体および装置の市販業者には、ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ Ｌｔｄ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ａｃｔｏｎ， ＭＡ；ＧＥＮＰＡＫ Ｉｎｃ．， Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ， ＮＹ；ＳｃｉＭａｔｒｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｄｕｒｈａｍ， ＮＣ；およびＴｅｌｅＣｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡが挙げられる。
【００８８】
ｃＤＮＡは任意の好適な方法によって固相支持体に結合することができる。一般に、結合は共有結合である。ＤＮＡ分子を固相支持体に共有結合するのに好適な方法には、アミノ架橋およびＵＶ架橋が挙げられる。ｃＤＮＡアレイの構築に関する手引きは、例えば、ＤｅＲｉｓｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：４５７−４６０（１９９６）、Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２０：２２３−２２９（１９９９）；Ｌｏｃｋｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４：１６７５−１６８０（１９９６）を参照されたい。
【００８９】
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、アレイの固定ＤＮＡプローブは合成オリゴヌクレオチドである。ｃＤＮＡに関して本明細書に記載する技法を使用して、事前に作製したオリゴヌクレオチドをスポットして、ＤＮＡアレイを作製することができる。しかし、一般に、オリゴヌクレオチドは固相支持体上に直接合成される。オリゴヌクレオチドアレイを合成するための方法は、当技術分野において既知である。例えば、Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，７４４，３０５号を参照されたい。オリゴヌクレオチドの配列は、検出対象の特定の遺伝子の配列の一部を表す。一般に、オリゴヌクレオチドの長さは１０〜５０ヌクレオチド、例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５ヌクレオチドである。
【００９０】
アプタマーアレイも本発明の方法に有用である。アプタマーは、ハイブリダイゼーションではなく、三次元配座に基づいて特定の標的分子に結合する核酸分子である。アプタマーは、例えば、オリゴヌクレオチドの最初の異種集団を合成し、次いで特定の標的分子にしっかりと結合するオリゴヌクレオチドを集団から選択することによって選択される。特定の標的分子に結合するアプタマーが同定されたら、生物学分野および他の分野において既知の種々の技法を使用して、例えば、クローニングおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、次いで転写によって複製することができる。標的分子は核酸、タンパク質、ペプチド、小有機または無機化合物および場合によっては、微生物全体であり得る。
【００９１】
オリゴヌクレオチドの異種集団の合成およびその集団からのアプタマーの選択は、試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）またはＳＥＬＥＸとして既知の手法を使用して実施することができる。ＳＥＬＥＸ方法は、例えば、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，２７０，１６３号および第５，５６７，５８８号、Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６７：２７５−３０１（１９９６）、ならびにＥｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８−２２（１９９０）に記載されている。簡単に説明すると、異種ＤＮＡオリゴマー集団を合成して、アプタマーの生体外選択のための候補オリゴマーを提供する。この最初のＤＮＡオリゴ集団は、長さ１５〜１００ヌクレオチドのランダム配列に長さ１０〜５０ヌクレオチドの一定の５’および３’配列が隣接しているセットである。一定領域はＰＣＲプライマーハイブリダイゼーションの部位を提供し、一実施においてＲＮＡポリメラーゼによる転写開始部位を提供し、ＲＮＡオリゴマーの集団を作製する。一定部位はまた、選択したアプタマーをクローニングするための制限部位も有する。一定領域の多数の例をアプタマー進化に使用することができる。例えば、Ｃｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６７：３３６−８３（１９９６）、Ｃｉｅｓｉｏｌｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６７：３１５−３５（１９９６）、およびＦｉｔｚｗａｔｅｒ，（１９９６）、前記参照。
【００９２】
アプタマーは、一般に、５〜１００サイクルの手法で選択される。各サイクルにおいて、オリゴマーは標的分子に結合され、それらが結合している標的を単離することによって精製し、標的から放出し、次いで２０〜３０世代のＰＣＲ増幅によって複製する。
【００９３】
アプタマー選択は、生物学における機能の進化的選択に類似している。異種オリゴヌクレオチド集団に上記のアプタマー選択手法を実施することは、連続的に複製中の生物学的な集団に、機能についての１０〜２０の厳しい選択事象を実施することと類似しており、各選択は２０〜３０世代の複製分だけ離れている。
【００９４】
異種性は、例えば、アプタマー選択手法の開始時にだけ導入し、複製過程全体には導入しない。または、異種性をアプタマー選択手法の後期段階に導入することができる。
【００９５】
例えば、２’−フルオロ−リボヌクレオチドオリゴマー、ＮＨ２−置換およびＯＣＨ３−置換リボースアプタマーならびにデオキシリボーズアプタマーを含む種々のオリゴマーをアプタマー選択に使用することができる。ＲＮＡおよびＤＮＡ集団は、同様に、任意の種類の標的分子に結合するように構成されたアプタマーを提供することができる。Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １３：３２４５−６０（１９９４）を参照されたい。
【００９６】
２’−フルオロ−リボヌクレオチドオリゴマーの使用は、未置換のリボ−またはデオキシリボ−オリゴヌクレオチドで得られるものより１０〜１００倍結合親和性を増加すると考えられる。例えば、Ｐａｇｒａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５（１）：６８−７３（１９９７）を参照されたい。このような修飾塩基は追加の結合相互作用を提供し、アプタマーの二次構造の安定性を増す。これらの修飾はまたアプタマーをヌクレアーゼ耐性にし、これはシステムの実世界への適用に対する大きな利点である。例えば、上記のＬｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：５２２９−３４（１９９４）、Ｐａｇｒａｔｉｓ，（１９９７）を参照されたい。
【００９７】
本発明において、アプタマーは、ＣＮＳマーカー遺伝子に対応するｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質を検出するために使用することができる。
【００９８】
本発明の一部の実施形態において、動物モデルＣＮＳ遺伝子のヒト相同物のプローブ（例えば、核酸プローブ、抗体またはアプタマー）を本発明の検出方法に使用する。他の実施形態において、検出に使用するプローブは遺伝子の高度に保存されている領域、例えば、相同マウスとヒト配列の間で高度に保存されている配列からなる。
【００９９】
試料調製および分析
一般に、ＣＮＳ細胞または組織のｍＲＮＡは、特定の遺伝子を表して作製されるｃＤＮＡの相対量が試料中のｍＲＮＡの相対量を反映するような条件下においてｃＤＮＡに逆転写される。比較ハイブリダイゼーション法は、関心対象の遺伝子の配列にハイブリダイゼーションする対応するｃＤＮＡの量によって示される、２つの組織試料中の種々の特定のｍＲＮＡの量を比較することを含む。
【０１００】
ｃＤＮＡを作製するために使用するｍＲＮＡは、一般に、他の細胞内容物および成分から単離される。ｍＲＮＡを単離する有用な方法は２段階法である。第１の段階では、総ＲＮＡを単離する。第２の段階は、固相支持体、例えば、クロマトグラフィーカラムまたは磁気ビーズに結合したオリゴ（ｄＴ）分子にｍＲＮＡのポリ（Ａ）テイルをハイブリダイゼーションすることに基づく。総ＲＮＡ単離およびｍＲＮＡ単離は当技術分野において既知であり、例えば、業者の取扱説明書により市販のキットを使用して実施することができる。同様に、単離したｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は当技術分野において既知であり、業者の取扱説明書により市販のキットを使用して実施することができる。ｃＤＮＡの蛍光標識化は、蛍光標識したデオキシヌクレオチド、例えば、Ｃｙ５−ｄＵＴＰまたはＣｙ３−ｄＵＴＰをｃＤＮＡ合成反応に加えることによって実施することができる。ＤＮＡアレイで分析するためのｍＲＮＡの単離および蛍光標識したｃＤＮＡの合成に関する手引きは、例えば、Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４：２２７−２３５（２０００）を参照されたい。
【０１０１】
ＤＮＡアレイのハイブリダイゼーションおよび洗浄、ハイブリダイゼーションの検出ならびにデータ分析の従来の技法は、必要以上の実験を行わないで新規方法に使用することができる。ＤＮＡアレイをスキャンし、データを分析するためのハードウェアおよびソフトウェアの市販業者には、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）、ＧＳＩ Ｌｕｍｏｎｉｃｓ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、およびＳｃａｎａｌｙｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（Ｆａｉｒｆａｘ，ＶＡ）が挙げられる。
【０１０２】
他の実施形態において、１つ以上のＣＮＳ遺伝子の発現レベルは、アッセイ対象のＣＮＳ試料の細胞に存在するタンパク質の存在および／またはレベルに反映される。ＣＮＳ試料中のタンパク質の存在またはレベルは通常の方法によって検出することができる。例えば、ＣＮＳ試料（例えば、ＣＳＦ試料）は、２次元（２Ｄ）ＰＡＧＥ等のゲル電気泳動技法によって分析することができる。タンパク質スポットが２Ｄ−ＰＡＧＥゲルで分離されたら、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によって差次的に発現されるスポットを同定することができる。この方法をペプチド分析に使用して、試料中の特定のタンパク質のフィンガープリントを提供することもできる。
【０１０３】
第２のプロテオミクス方法は、質量分析法によってＣＳＦ試料等のＣＮＳ試料を直接分析することによってプロテオミクススペクトルを得ることに関係し得る。例えば、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）分析を実施して、ＣＮＳ試料のプロテオミクスパターンを作製することができる。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、正常者と疾病患者を識別するクラスターパターンを同定することができることが示されている。Ｐａｗｅｌｅｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｓ． Ｍａｒｋｅｒｓ， １７（４）：３０１−７（２００１）を参照されたい。
【０１０４】
発現プロファイルの生成
本明細書に記載する方法に使用する遺伝子発現プロファイルは２つ以上のＣＮＳ遺伝子またはタンパク質の発現パターンである。場合によっては、発現プロファイルは、５、１０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれ以上の遺伝子またはタンパク質の発現パターンであることができる。本明細書において使用する「基準遺伝子発現プロファイル」は２つ以上のＣＮＳ遺伝子の発現の特徴的なパターン（データセット）（例えば、上方制御または下方制御および／または発現のレベル）であり、この場合、発現のパターンは特定の疾患のリスクまたは存在に関連する（例えば、疾患が認められない人の発現レベルに対する特定の疾患に関連する発現レベルの比）。特徴的なプロファイルと特定の疾患の関連は、ＣＮＳ遺伝子またはタンパク質の発現データを生成して分析し、ＣＮＳ遺伝子またはタンパク質の発現の特定のパターン（例えば、陰性対照と比較したときの特定の遺伝子の遺伝子発現の相対的な増加および／または低下）と特定の臨床状態の関連を同定することによって求められる。例えば、基準遺伝子発現プロファイルは遺伝子のセット（本明細書において遺伝子の「パネル」または「クラスター」とも称される）のデータであり得、そこでは、セットの各遺伝子は、特定の末梢疾患または任意の末梢疾患に関連する場合には下方制御または上方制御される。
【０１０５】
基準プロファイルはパネルの２つ以上の遺伝子の遺伝子発現の値、例えば、相対値を含み得、そこでは、パネルの少なくとも１つの遺伝子は下方制御され、少なくとも１つの遺伝子は上方制御される。
【０１０６】
非ＣＮＳ癌（または乳癌、肺癌または結腸癌等の特定の種類の非ＣＮＳ癌）に関連する例示的な遺伝子発現プロファイルを図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに示す。基準遺伝子発現プロファイルは、これらの図に示す遺伝子または遺伝子産物の少なくとも一部のデータを含み得る。例えば、肺癌に関連する基準遺伝子発現プロファイルは、図５Ａ５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに癌のＣＮＳマーカーとして記載する１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の差次的な発現の値を含むことができる。一部の実施形態においては、プロファイルは、図５Ｊおよび／または１１Ｂに記載する遺伝子に対する値を含む。図５Ａ〜Ｊは、マウスが肺、結腸、または乳癌細胞のいずれかを接種された後、１８、７２、または１９２時間経過時に、脳に差次的に発現される遺伝子の表である。図１１Ａ〜Ｂは、リアルタイムＰＣＲにより差次的に発現されると確証された、肺癌細胞を注射したマウスの視床下部試料からのある遺伝子の表である。図１２は、疾病行動として既知の行動状態に関与することが知られ、実施例２および３で使用される１０Ｋオリゴヌクレオチドアレイに表されないが、癌細胞の接種後に脳に差次的に発現されることがわかっている、遺伝子の表である。図２１Ａ〜２３Ｃは、各種類の癌に対する最有力候補遺伝子のリストである。
【０１０７】
基準プロファイルは、本明細書に記載する実施例１に例示するように、実験動物における非ＣＮＳ疾病の存在に応答するＣＮＳの遺伝子発現パターンの変化を検出し、実験試料においてあるパターンで差次的に発現される遺伝子および遺伝子クラスターのヒト相同物を同定することによって生成することができる。
【０１０８】
基準遺伝子発現プロファイルは、ヒトＣＮＳ遺伝子発現データを評価することによっても得ることができる。例えば、数十、数百または数千人のＣＮＳ遺伝子発現データを入手し、例えば、電子的、例えば、デジタル処理して保存されているデータベースを作成し、維持する。個体を追跡調査し、例えば、癌の臨床状態に関して比較的長期間にわたって（例えば、少なくとも５年、１０年、１５年、２０年、３０年、５０年以上または生涯にわたって）評価することができる。例えば、ＣＮＳ遺伝子発現データを入手してから５年、１０年、１５年、２０年、３０年または５０年後に特定の疾病を発症した個体の発現プロファイルを、疾病が認められていない個体の発現プロファイルと比較する。１つの臨床タイプの疾患を発症した個体と別の臨床タイプの疾患を発症した個体間、または早い年齢において疾病を発症した個体と遅い年齢で疾病を発症した個体間の同様の比較を実施する。これらの分析は、異なる病期の疾病、例えば、異なる病期の異常増殖または異なる種類の腫瘍に関連する特定の基準ＣＮＳ遺伝子発現プロファイルを提供する。「対照遺伝子発現プロファイル」は、健康（正常）個体または動物モデルにおける所定のセットの遺伝子のプロファイルである。
【０１０９】
基準および対照遺伝子発現プロファイルは、典型的には、電子デジタル形式、例えば、ＣＤ、ディスク、ＤＶＤ、ハードドライブ、コンピュータメモリまたはメモリカード等のコンピュータが読み取り可能な媒体に保存され、また対象の性別、疾患の種類および病期、年齢群ならびに人種等の識別情報を伴う。
【０１１０】
「対象遺伝子発現プロファイル」は、癌の存在について被験対象のＣＮＳ試料から得られる。まず、本明細書に記載するように、脳針生検（脳細胞試料）または腰椎穿刺（ＣＳＦ）等の通常の手段によってＣＮＳ試料、例えば、脳細胞試料またはＣＳＦ試料を対象から得る。次いで、遺伝子またはタンパク質発現を検出する方法、例えば、本明細書に記載する遺伝子またはタンパク質発現を検出する任意の方法に使用するために試料を調製する。一実施形態において、総ＲＮＡを試料から調製し、本明細書に記載する核酸アレイアッセイに使用するためのｃＤＮＡに逆転写することができる。別の実施形態において、本明細書に記載する抗体アッセイに使用するために総タンパク質を試料から調製する。次いで、調製した試料を、試験試料を比較する１つ以上の特定基準遺伝子発現プロファイルのＣＮＳ遺伝子または遺伝子産物のクラスターまたはパネルに対応するＣＮＳ遺伝子または遺伝子産物の少なくとも１つのクラスターまたはパネルの発現レベル（または抗体アレイの場合にはタンパク質レベル）を検出することができるアレイ（例えば、抗体または核酸アレイ）と接触させることができる。例えば、対象から調製したＣＮＳ試料を、本明細書、例えば、図面５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに示す遺伝子の２つ以上、例えば、２〜１５０、１０〜５０または２０〜３０の抗体プローブを含有する核酸プローブまたは抗体アレイを含有する核酸アレイと接触させることができる。一部の実施形態において、アレイは５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのいずれかに開示する特定のクラスターのマーカー遺伝子の各々のプローブを含有することができる。一部の実施形態においては、アレイは、図５Ｊおよび／または１１Ｂにおける１つ以上のマーカー遺伝子のプローブも含む。
【０１１１】
アレイアッセイの結果は、アレイ上の各位置（各プローブ）についての蛍光検出および結合した抗体またはハイブリダイゼーションした核酸の測定等の通常の技法によって得られる。次いで、アレイ上の各抗体またはプローブによってＣＮＳ試料中で検出される各ポリペプチドまたは遺伝子のレベルの値のデータセットを生成することができる。データセットは、患者の識別子および検出される発現またはタンパク質の実際のレベルおよび／または相対的なレベル等の情報を含むことができる。このようなデータセットを対象発現プロファイルとして直接使用してもまたは基準プロファイルの様式に匹敵する様式にデータセットを変換することができる。
【０１１２】
対象遺伝子発現プロファイルが生成されたら、本明細書に記載するように対象プロファイルを基準発現プロファイルと比較することができる。
【０１１３】
発現プロファイルの分析
新規方法およびシステムにより、試験対象の発現プロファイルを、特定の疾患の存在に関連する基準遺伝子発現プロファイルおよび／または特定の非ＣＮＳ疾患が認められないことに関連する対照（「正常」）遺伝子発現プロファイルと比較することによって試験対象を評価することができる。多数のボランティアにおけるＣＮＳ遺伝子発現の長期経時研究を実施して、疾病を発症しない個体に関連する対照発現プロファイルまたは疾病を発症する個体の基準プロファイルを同定し、確認する。このような研究は、本発明の方法に使用することができる陰性および陽性対照発現プロファイルのデータベースの生データを提供する。
【０１１４】
「対象」および「基準」プロファイルは、本明細書に記載する方法により得ることができる。一実施形態において、該方法は、対象から（医療提供者または他者から直接または間接的に）ＣＮＳ試料を得るステップと、試料から発現プロファイルを生成するステップと、対象の発現プロファイルを１つ以上の対照および／または基準プロファイルと比較するステップ、および／または対象のプロファイルと最も類似した基準プロファイルを選択するステップと、を含む。
【０１１５】
他の検出方法の場合と同様に、プロファイルに基づいたアッセイは症状の発症前（この場合には診断である）、治療前（この場合には予後である）または治療経過中（この場合にはモニタとして作用する）に実施することができる。
【０１１６】
種々の通常の統計学的手段を使用して、２つの発現プロファイルを比較することができる。考えられる１つの測定基準は、２つのプロファイル間の差である距離ベクトルである。対象および基準プロファイルの各々は多次元ベクトルとして表され、各次元はプロファイルの値、例えばパネルの特定の遺伝子の発現の値である。対象プロファイルおよび基準または対照プロファイルは、２つのプロファイルが上記の「一致」の条件を満たす場合、「一致」するとされる。対象および基準プロファイルが一致する場合には、対象は、基準プロファイルが関連する末梢疾患を有すると同定することができる。対象および正常対照プロファイルが一致する場合には、対象に末梢疾患は認められないと考えられる。
【０１１７】
一実施形態において、パターン認識ソフトウェアを使用して、マッチングプロファイルを同定する。信号対ノイズ比、相関分析、およびＡＮＯＶＡのような、一変量の伝統的な統計手法（Ｇｏｌｕｂ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：５３１−７（１９９９）， ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ４１５：５３０−６（２００２）， Ｐａｖｌｉｄｉｓ， Ｐ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１：２８２−９（２００３））、またはＧｅｎｅｓ＠Ｗｏｒｋソフトウェアパッケージ（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．）に実装されるＳＰＬＡＳＨ（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐａｔｔｅｒｎ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ）アルゴリズムのような、特定の多変量技法（Ｌｅｐｒｅ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０：１０３３−４４（２００４））を使用して、これらのプロファイルを得ることができる。
【０１１８】
別の一実施形態において、遺伝子発現プロファイルは、最近傍分類子を適用することによる定量パターン比較によって解析される。最近傍分類子に基づいて、順列由来の分布と共に、基準遺伝子発現パターンによって規定されるクラスに属する各対象プロファイルの確立を推定するために使用することができるスコアを規定する（Ｊｅｌｉｎｅｋ（２００３）、前記参照）。
【０１１９】
対象、医療提供者または関心を有する他の当事者に紙または電子形態で伝達することができる診断試験の結果は、対象の発現プロファイル自体、対象の発現プロファイルを別のプロファイルと比較した結果またはこれらのいずれかの記述子であることが可能である。伝達は、コンピュータネットワークで（例えば、搬送波に組み込まれたコンピュータデータ信号等のコンピュータ伝送の形態で）実施することができる。 新規システムはまた、以下のステップを実行するための実行可能なコードを有する（ＣＤ、ディスク、またはハードドライブ等の）コンピュータが読み取り可能な媒体を含む。対象の発現プロファイルを受信するステップ、基準発現プロファイルのデータベースにアクセスするステップ、およびｉ）対象の発現プロファイルに最も類似した一致基準プロファイルを選択するステップ、またはｉｉ）対象の発現プロファイルと少なくとも１つの基準プロファイルの類似性に対する、少なくとも１つの比較スコアを決定するステップのいずれか。対象の発現プロファイルおよび基準発現プロファイルは各々、同定された遺伝子もしくは遺伝子産物の１つ以上の発現レベルまたはそれらがコードするタンパク質のレベルを示す値を含む。
【０１２０】
予測医療
本明細書に記載する方法は、一般に予測医療分野において有用であり、さらに具体的には、診断および予後アッセイ、異常増殖の進行のモニタリング、または例えば、臨床試験における治療に対する応答のモニタリングに有用である。例えば、異常増殖の他の、例えば臨床徴候がない状態で、対象が超早期異常増殖を有するかどうかを判定することができる。本発明の方法は、例えば、癌を除去するための手術または治療を受けたことがある患者に特に有用であり、この場合には、本発明の方法は再発もしくは転移をモニタするために使用することができると思われ、本発明の方法は、例えば、環境的要因により癌の発生頻度が高い地域に生活している人または疾病（例えば、糖尿病、喘息または癌）の家族歴を有する個体または疾病感受性遺伝子、例えば、癌感受性遺伝子（例えば、ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６）の保有者である個体に特に有用である。 他の癌感受性遺伝子は、Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ， Ｅｄｓ．）， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（２００２）に記載される。このような個体は、本明細書に記載する方法を使用して評価することができる。
【０１２１】
例えば、場合によっては、疾病を発症するリスクが高い場合（例えば、個体が癌の強い家族歴を有する場合、または個体が癌感受性遺伝子を保有するもしくは癌のリスクが高い地域で生活している場合）には、個体は生涯にわたって定期的（例えば、１０年ごと、５年ごとまたは毎年）評価され得る。
【０１２２】
非ＣＮＳ疾患を診断するシステム
対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）疾患を診断するためのシステムは、以下の要素を含むことができる。ＣＮＳ試料を得るためのサンプリング装置、遺伝子発現検出装置、基準遺伝子発現プロファイル、およびＣＮＳ試料中の１つ以上の遺伝子の遺伝子発現を基準遺伝子発現プロファイルと比較するための手段（例えば、比較器）。
【０１２３】
サンプリング装置は、低侵襲的技法、例えば、脳外科的手術によってＣＮＳ試料を獲得する。低侵襲性脳外科的技法には、他の技法の中でも、コンピュータ支援式定位固定、術中超音波、脳マッピングおよび神経内視鏡が挙げられる。定位固定は、外部基準目印および神経構造を表示するイメージング技法を用いて脳内の任意の領域にナビゲートする（ｎａｖｉｇａｔｉｎｇ）システムを指す。
【０１２４】
または、「試料」は、実際の試料を採取するのではなく、例えば、脳における遺伝子発現を画像化することによって取得することができる。脳のイメージングは、他の方法の中でも、コンピュータ断層スキャン（ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）またはポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）によって実施することができる。これらの方法由来の信号は、脳内の任意の標的地点までの軌道および深さをコンピュータが算出して提供することができる基準点を提供する。Ｃｏｓｍａｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＣＲＷ）システムを含む最新の定位固定システムをＭＲＩおよび脳の血管造営位置に使用することができる。術中超音波は単独で使用、または定位固定と併用使用することができる。術中小音波を使用して、硬膜切開前に脳室等の組織を同定することができる。超音波プローブを使用して、深部病変の針生検を先導し、ＣＮＳ試料を獲得することもできる。剛性および可撓性の光ファイバー内視鏡を使用して、低侵襲的技法を使用して脳試料を得ることができる。レーザーおよび（生検器具を含む）種々の他の器具を取り付けて使用することができる。腰椎穿刺によって脳脊髄液を得るサンプリング装置も上記に記載するイメージング方法のいずれかによって先導することができる。
【０１２５】
遺伝子発現検出装置は、核酸を使用する方法、アレイならびに試料調製および分析の副題で本明細書に記載するものを含む。比較器は、本明細書に記載するパターン認識ソフトウェアを搭載したコンピュータであり得る。
【０１２６】
コンピュータが読み取り可能な媒体
別の態様において、新規システムは、複数のデジタルコード化されたデータレコードまたはデータセットを有するコンピュータが読み取り可能な媒体を特徴とする。データレコードまたはデータセットは各々ＣＮＳ遺伝子発現レベルを示す値および試料の記述子を含む。記述子は、例えば、識別子（例えば、試料を入手する患者の識別子、例えば、復号表にアクセスする者によってのみ患者の情報に対応させることができる名前または参照コード）、発現レベルがあるレベルに到達しているまたはあるレベル以下に低下している事象において下される診断または実施される治療であり得る。データレコードは、関連する遺伝子の発現レベルを示す値も含み得る（例えば、データレコードは遺伝子「クラスター」の複数の遺伝子の各々の値を含んでもよく、この場合、クラスターの遺伝子の特定の基準遺伝子発現は非ＣＮＳ疾患に関連する）。データレコードはまた、対照遺伝子（例えば、発現が対照試料において変化されないまたは発現が診断上非ＣＮＳ疾患に関連がない遺伝子）の値を含む。データレコードは、例えば、表（（例えばオラクル（Ｏｒａｃｌｅ）またはサイベース（Ｓｙｂａｓｅ）データベース環境のＳＱＬデータベースなどの）関係型データベースのようなデータベースの一部である表）や、リストなど、多様な方法で構造化することができる。
【０１２７】
他の種からの相同配列の単離
本明細書に記載する方法に有用な遺伝子のヒト相同物は、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載され、ＧｅｎＢａｎｋおよびインターネットで利用可能な他の公共のデータベースに見られる。
【０１２８】
ＣＮＳマーカー遺伝子およびそれらの産物のヒト相同物（例えば、ヒト以外の実験動物における実験によって同定されるＣＮＳマーカー遺伝子のヒト相同物）は、本明細書に記載する方法の種々の実施形態に有用である。本明細書に提供されるＣＮＳマーカー遺伝子のほとんどのヒト相同物は既知である。ヒト相同物が同定されていない場合では、いくつかの標準的な方法を使用してこのような遺伝子を同定することができる。これらの方法には、マウスマーカー遺伝子核酸配列によるヒトライブラリーの低緊縮度ハイブリダイゼーションスクリーン、マウスマーカー遺伝子由来の縮重オリゴヌクレオチドでプライミングしたヒトＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、二重ハイブリッドスクリーン、および相同配列のデータベーススクリーンが挙げられる。
【０１２９】
化学療法剤
一実施形態において、本明細書に記載する方法は、例えば、新生物が生じる前、新生物が臨床的に検出可能になる前および／または腫瘍が悪性になる前に早期段階に対象における非ＣＮＳ異常増殖の存在を同定または診断することができる。したがって、本明細書に記載する方法によって検出される新生物は、一般に腫瘍細胞を標的とする、または特に特定の腫瘍細胞を標的とする薬剤による治療を受けることができる。一実施形態において、対象を化学療法剤で治療することができる。本明細書において使用する化学療法剤は、異常増殖の治療に使用される化学治療剤または化学治療薬を意味する。抗癌作用を発揮するという意味において、他の化合物を形式上化学療法剤として記述することができるが、簡単にするためにこの用語を使用する。数多くの例示的な化学療法剤を以下に記載する。
【０１３０】
好適な化学療法剤には、抗チューブリン／抗微小管薬、例えば、パクリタキセル、タキソール、タモキシフェン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール；トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、トポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アムサクリン、エピルビシン、マーバロン（ｍｅｒｂａｒｏｎｅ）、塩酸ピロキサントロン（ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；代謝拮抗剤、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキセート、ゲムシタビン、アシビシン（ａｃｉｖｉｃｉｎ）、アラノシン、ピラゾフリン、Ｎ−ホスホルアセチル−Ｌ−アスパレート＝ＰＡＬＡ、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ２’−デオキシシチジン、アラ−Ａ、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸；アルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ＢＣＮＵ＝カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、デカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、ウラシルマスタードおよびピポブロマン、４−イポメアノール；エストロゲン調節剤、例えば、ラロキシフェン；ピロキシカム；９−シスレチノイン酸が挙げられる。
【０１３１】
選択した化学療法剤の好適な用量は、当業者に既知である。例えば、薬剤がドキソルビシンである場合には、好適な用量は、患者の皮膚表面積あたり３０ｍｇ／ｍ２を含んでもよく、１週間間隔で２回静脈内投与される。しかし、当業者は、投与経路、投与回数、投与時期および用量を適宜容易に調節することができる。これらの点を考慮すると、一般的に、所定の化学療法剤の好適な用量は、１０ｍｇ／ｍ２から約５００ｍｇ／ｍ２であり、さらに好ましくは、患者の皮膚表面積あたり５０ｍｇ／ｍ２から約２５０ｍｇ／ｍ２である（平均的な体格の成人の皮膚表面は、約１．８ｍ２である）。このような用量は、選択した特定の薬物または薬剤に応じて調節することができるが、例えば、静脈内、皮内、直接部位注射、腹腔内、経鼻的等を含む任意の好適な経路によって投与することができる。投与は適宜反復することができる。
【０１３２】
一実施形態において、本明細書に記載する方法は、新生物が生じる前、新生物が臨床的に検出可能になる前および／または腫瘍が悪性になる前に早期段階に対象における非ＣＮＳ異常増殖の存在を同定または診断することができるので、化学療法剤の用量は、新生物、例えば、癌が、腫瘍塊の可視化または触診等の臨床方法によって検出または診断された後に典型的に使用される用量より少なくてもよい。
【０１３３】
治療標的のスクリーニング
非ＣＮＳ癌のＣＮＳマーカー遺伝子、例えば、本明細書に記載するＣＮＳマーカー遺伝子は、癌の存在を「感知する」だけでなく、応答、例えば、抗腫瘍応答を形成することによって癌の存在への応答に活発に関与することができる。または、ＣＮＳマーカー遺伝子は、癌の進行を促進することによって、例えば、新生物の増殖を誘発するまたは新生物の悪性転換を促進することによって非ＣＮＳ癌の存在に応答し得る。治療方法として、ＣＮＳにおいて前者の種類の遺伝子の発現または活性を促進するおよび／または後者の種類の遺伝子の活性の発現を阻害することが望まれると考えられる。したがって、ＣＮＳマーカー遺伝子が特定の癌を抑制または促進する応答を形成するかどうかにかかわらず、その同定は癌の進行を阻害する標的を提供し得る。
【０１３４】
治療標的であるとも考えられるこのようなＣＮＳマーカー遺伝子を同定する方法は、阻害応答を示さない動物と比較して、疾病に対する阻害応答を示す動物において差次的に発現されるＣＮＳ遺伝子を同定することである。例えば、実験動物には、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１２を発現する腫瘍誘発細胞（例えば、ＣＴ２６等の結腸癌細胞）を注射することができる。ＩＬ−１２を発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞の注射は、Ｔｈ１免疫介在性腫瘍拒絶を誘発することが知られている（Ａｄｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０（２３）：６６９６−７０３（２０００））。対照マウスには、ＩＬ−１２を発現しない腫瘍細胞を注射することができる。注射後の様々な経過時点において、ＣＮＳの遺伝子発現は、本明細書に記載されているように、例えば、マイクロアレイ分析により動物において分析される。このように、動物のＣＮＳ（例えば、脳）において具体的に「スイッチオン」および「スイッチオフ」する遺伝子を同定することができる。これらの遺伝子には、ＩＬの存在に応答するものがある。他は、抗腫瘍免疫応答の「刺激」に活発に関与する遺伝子に対応する。この方法は、抗腫瘍免疫応答の刺激に関与することができる任意のインターロイキン遺伝子に使用することができる。抗腫瘍応答を「刺激する」ことに活発に関与する脳遺伝子の同定は、例えば、遺伝子もしくは遺伝産物を直接使用することによって、またはそれらの活性を遮断もしくは刺激する薬剤をスクリーニングすることによって治療的介入の標的を提供する。
【０１３５】
治療標的であると考えられるＣＮＳ遺伝子を同定する第２の方法は、特定の遺伝子に脳特異的欠損（例えば、ノックアウト）を有する遺伝子組換え動物（例えば、ノックアウトマウス）を使用することによる。多大な数のＣＮＳ特異的ノックアウトマウスが現在当業者に利用可能であり（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙウェブサイト、神経生物学に使用する数多くのＪＡＸ（登録商標）マウスモデルを記載している）、さらに多くのものが日常的に利用可能になることが予想され得る。非ＣＮＳ疾病に対するＣＮＳ応答の役割は、（例えば、癌、ＲＡ、喘息または肥満について本明細書に記載するように）ノックアウトマウスに疾患を誘発し、疾病の結果を評価することによって、脳ノックアウト動物を入手または作製することができる任意の特定の遺伝子について確立することができる。
【０１３６】
治療標的でもあると考えられるＣＮＳマーカー遺伝子および遺伝子産物は、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載される。これらの遺伝子は細胞信号伝達に関与する分子（例えば、成長因子、ホルモン、サイトカインおよびそれらの受容体）であるか、またはそれらをコードし、検討した腫瘍の各々において差次的に発現されるマーカーでもある。
【０１３７】
ワクチン
本明細書に記載する方法はまた、予防的なワクチンの標的を提供する。疾病を「感知する」脳遺伝子セットは、既知または未知リガンドの受容体を含み得る。疾病細胞は、脳由来の抗疾病応答の誘発を阻害するこのようなリガンドを産生する可能性がある。このような例では、抗疾病応答に関与するＣＮＳ遺伝子を同定することにより、脳において疾病応答を阻害するように影響する可能性のある疾病細胞によって分泌される遺伝子産物を同定することができる。これらの産物を標的とする遺伝子ワクチンは実行可能な治療法になると考えられる。
【０１３８】
非ＣＮＳ疾患を治療する際の予防的なワクチン接種のためのＣＮＳ標的を同定する一方法は以下の通りである。実験腫瘍モデルにおいて抗疾病応答、例えば、腫瘍の場合には、ＩＬ−１２媒介性抗腫瘍応答を示す動物から（本明細書に上記するもの等の技術を使用して）ＣＮＳ遺伝子発現プロファイルを得るステップ。腫瘍を「感知する」遺伝子のクラスターから、ＩＬ−１２の存在下において、それらの発現レベルを変化させるものがあることが予想される。この遺伝子のサブセットは、抗腫瘍応答の「生成」に関与するものである可能性がある。この遺伝子のサブセットは予測可能な調節因子を有する可能性がある。例えば、ＩＬ−１２の存在下において非ＣＮＳ遺伝子に応答して発現プロファイルを変化するＣＮＳ遺伝子が受容体である場合には、このような受容体の遺伝子発現の変化はそのリガンドによって引き起こされる可能性があることを予想することができると考えられる。したがって、予防的な遺伝子ワクチンは、このようなリガンドに対するメモリー応答を形成するように設計することができると考えられる。
【０１３９】
第２の実験方法は、腫瘍細胞の非腫瘍形成投与（例えば、異常増殖が生体内に存在するが、新生物はまだ形成されていない状態）に応答して活性を変化するＣＮＳ遺伝子を同定することに関係し得る。上記に説明するように、このサブセットのＣＮＳ遺伝子から活性の変化を生ずる調節遺伝子を予測することができる。腫瘍細胞由来となり得るこのような調節遺伝子は、末梢生体における最初の腫瘍由来のアラーム信号となる可能性がある。したがって、予防的な遺伝子ワクチンは、このような遺伝子にメモリー応答を形成するように設計することができると考えられる。
【０１４０】
ワクチンは、例えば、標的対象の遺伝子に対応するポリペプチドまたは核酸であり得る。本明細書に記載するワクチンは、水、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液等の生理学的に適応可能な溶液またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて個体に投与または接種することができる。それらはまた、取り込みを促進するまたは接種部位に免疫系細胞を招集する能力を有する物質（例えば、促進剤およびアジュバント）の存在下で投与することができる。ワクチンは多数の投与様式および投与経路を有する。それらは皮内（ＩＤ）、筋肉内（ＩＭ）で投与することができ、どちからの経路によって、それらは針注射、遺伝子銃または無針ジェット注射によって投与することができる（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔ Ｉｎｃ．， Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。他の投与様式には、経口、静脈内、腹腔内、肺内、硝子体内および皮下接種が挙げられる。局所接種も可能であり、粘膜ワクチンと称することができる。これらには、例えば、鼻腔内、眼球、口腔、膣または直腸局所経路が挙げられる。これらの局所経路による送達は点鼻剤、点眼剤、吸入剤、坐剤またはミクロスフェアによるものであることが可能である。
【０１４１】
以下の実施例は例示的にすぎず、限定する意図はない。
【０１４２】
実施例
実施例１：癌に関連するＣＮＳ発現プロファイル予備研究
脳が、末梢における初期の腫瘍増殖の感知することができるかどうかを確立するために、ルイス肺、ＣＴ−２６結腸、および４Ｔ１乳房の発癌性細胞が同種マウスに注射され、異なる脳領域におけるトランスクリプトームが評価された。内部環境の監視における機能的関連性により、視床下部が選択され、連合領域であるために前前頭皮質が、また恒常性の基本パラメータの調節の役割により中脳が、選択された。
【０１４３】
生体内研究−腫瘍モデル
ＣＴ−２６．ＷＴ結腸癌およびＬＬ／２（ＬＬＣ１）肺癌をＤＭＥＭ中で増殖し、４Ｔ１乳房癌細胞を、加湿チャンバおよび５％ＣＯ２中で、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含むＲＰＭＩ中で増殖させた。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から、全ての細胞を得た。食餌および水は随時摂取させて、ケージあたり５匹の動物を入れ、ＨＥＰＡフィルター付きエアーラック（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ，Ｉｔａｌｙ）で飼育した８週齢のマウスに、悪性細胞を皮下注射した。雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、３００μｌのＰＢＳ中の１×１０６のＣＴ−２６．ＷＴ細胞を注射し、雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、第１および第２の乳腺間に１００μｌのＰＢＳ中の１×１０５の４Ｔ−１細胞を受け、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに、３００μｌのＰＢＳ中の１×１０６のＬＬ／２（ＬＬＣ１）細胞を注射した。
【０１４４】
明白な対照細胞がない場合は、シャム対照マウスに対応する容量のＰＢＳを注射した。正常細胞の注射は、不適切な部位に注射されると死に、最終的にアノイキスによる死の信号を送るため、信頼できる対照とはみなされなかった。したがって、各異なる腫瘍の種類が、他の腫瘍の種類に対する対照となった。
【０１４５】
対応する経過時点（１８、７２、または１９２時間）において、マウスを頸部脱臼により犠牲にし、視床下部、前前頭皮質、および中脳領域を切開した。同時に、肝臓を取り出した。領域は全て速やかにドライアイスで凍結し、ＲＮＡ抽出時まで−８０℃で保存した。
【０１４６】
米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の実験動物の使用に関する規則の規定および基準に従い、全ての動物処置を実行した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｌｅｌｏｉｒの倫理委員会により、動物実験は承認された。
【０１４７】
マイクロアレイ研究
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、総ＲＮＡを抽出した。ＭｉｃｒｏＰｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｅキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）を使用して、総ＲＮＡからポリＡ＋ＲＮＡを得た。オリゴｄＴプライマーおよびランダムプライマーによって、両方ともａａ−ｄＵＴＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の存在下で、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡを逆転写した。ｃＤＮＡをエタノール沈殿し、４．５μｌの０．１ＭＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）に再懸濁し、４．５μｌの染料（Ｃｙ３またはＣｙ５）と混合し、ＤＭＳＯ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｓｗｅｄｅｎ）に再懸濁し、室温において暗所で１時間インキュベーションした。製造業者の使用説明書に従い、以下の変更を加えて、ＳＮＡＰ Ｇｅｌ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、プローブを精製した。最初のステップ：５００μｌのローディング緩衝液（７０％イソプロパノール中の２．２５Ｍ グアニジンＨＣｌ）を試料に添加し、試料を、ＳＮＡＰカラムに置き、第１の遠心分離前に４分間インキュベーションした。Ｖｉｒｔｅｋ Ｃｈｉｐｒｅａｄｅｒ Ａｒｒａｙｅｒ（Ｖｉｒｔｅｋ Ｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ． Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ）を使用して、５０−ｍｅｒのマウス１０Ｋ Ｏｌｉｇｏ Ｓｅｔ（ＭＷＧ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＵｌｔｒａＧＡＰＳスライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）上にプリントした。プリントされたスライドを２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ中において、４２℃でプレハイブリダイゼーションを行なった。標識プローブを、３０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、４２℃で終夜ハイブリダイゼーションを行なった。
【０１４８】
データ取得および画像処理
分解１０μｍ、ピクセルの深さ１６ビットで、Ｃｈｉｐ−Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）でスライドをスキャンし、ＶｅｒｓＡｒｒａｙ（商標） Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア ｖ４．５（ＢｉｏＲａｄ）で画像を分析した。
【０１４９】
データフィルタリングおよび正規化
データ処理は全て、Ｒ Ｓｙｓｔｅｍ ｖ２．２．１（ワールドワイドウェブ上のｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇで入手可能な、Ｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）下で実行した。ダスト由来データポイント（７５ピクセル未満のサイズのスポットまたは８０％未満の平均から中央値の相関のスポット（Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０（１２）：ｅ５４（２００２））、飽和データポイント（２０％を上回る飽和ピクセルの割合のスポット）、および低信号データポイント（１．２未満の信号対バックグラウンド比のスポット）を排除するために、データをフィルタリングした。３Ｄ正規化方法により、強度および空間関連バイアスを同時に補正した。簡潔に述べると、スポットｉ（Ｍｉ＝ｌｏｇ２Ｒｉ／Ｇｉ）のスポット強度の比を、非線形回帰の残余に置き換え、Ｍｉ＝ｆ（ｘｉ，ｙｉ，Ａｉ）であり、（ｘｉ，ｙｉ）は、スライドにおけるスポットｉの位置であり、Ａｉは、平均スポット強度、すなわち、Ａｉ＝１／２・ｌｏｇ２Ｒｉ／Ｇｉである。Ｒシステムのｌｏｅｓｓ関数を用いて、局所的に重み付けした３Ｄ多項式表面回帰を実行した。
【０１５０】
反復したスライド間のデータ統合および発現セット生成
染料交換（技術的）反復からのＭ値を、それらの品質スコア（ＱＣ）で重み付けし平均化した。ＱＣを、（０，１］の範囲になるようにスケーリングされたスポット周囲に対するスポット面積の比として画定した。各試料が同一の中央絶対偏差を有するように、得られる発現セットをスケール正規化した（Ｓｍｙｔｈ ａｎｄ Ｓｐｅｅｄ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１（４）：２６５−７３（２００３））。
【０１５１】
結果
癌細胞接種は、これらの研究の必要条件である、１００％のマウスに腫瘍増殖をもたらした。少量の転写物の損失を誘発する可能性があるＲＮＡ試料の増幅を防止するために、および技術上の変動に対して制御するために、１５匹のマウスプールから、それぞれの生物学的反復を得た。対照マウスには、ビヒクルのみを注射した。実験の開始後１８、７２、および１９２時間経過時に、マウスを犠牲にし、プリントされた１０Ｋオリゴヌクレオチドアレイ上の反復染料交換設計を使用して、脳の転写プロファイルを分析した（実験設計の理論的根拠に関しては、以下の実験方法を参照）。
【０１５２】
複数の分散分析（ＡＮＯＶＡ）テストを実行し、各経過時点に対して１つのテストであった。その早期段階における増殖する癌等の慢性刺激から予想される通り、それらのそれぞれの対照と比較される、悪性細胞を注射したマウス間の転写物レベルは、中程度の振幅の変化を呈した（最大で２００％）。図１は、３つの実験モデル（肺、乳房、および結腸）の結果を示す。各実験モデルに対して、３つの異なる経過時点（１８、７２、および１９２時間）において、視床下部、前前頭皮質、および中脳から試料を採取した。各経過時点における各試料を有する各癌モデルに対して、ＡＮＯＶＡテストを実行した。図１は、ＡＮＯＶＡテストを使用して差次的に発現されることがわかった遺伝子の数、上方制御された差次的に発現される遺伝子の割合、差次的に発現される遺伝子の平均倍率変化、および倍率変化データの第５および第９５パーセンタイル値を示す。図１からわかるように、１９２時間経過時において結腸癌モデルマウスの中脳に発現した遺伝子は、発現レベルにおいて最大で２００％の変化（第９５パーセンタイル値）を示した。
【０１５３】
興味深いことに、睡眠と覚醒との間の認識機能障害および皮質変化に続く海馬の変化等の、非急性状態に暴露されるマウスの脳に実行されたトランスクリプトーム分析において、転写物レベルの中程度の変化も見られた（Ｃｉｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ ４１（１）：３５−４３（２００４）； Ｂｌａｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２３（９）：３８０７−１９（２００３））。
【０１５４】
転写物の変化は、肺癌細胞を注射したマウスの視床下部において、最も多くの差次的に発現される遺伝子が見られたことを示す（図１）。加えて、結腸癌モデルにおいて、差次的に発現される遺伝子の数が、３つの経過時点において均等に分布したのに対して、肺および乳癌モデルにおいては、１８時間経過時において最も多くの差次的に発現される遺伝子を示した（図１）。
【０１５５】
生物学的反復試料の標準誤差により、各データセットの品質を評価し、異なる癌モデルに対するｌｏｇ１０標準誤差（ＡＳＥ）の絶対値の密度分布およびそれらの中央値をグラフにした。生物学的反復にわたって各遺伝子に対するＡＳＥを計算した。異なるデータセットの品質の差は見られず、脳領域と癌モデルとの間の認められた差は、システム生物学を反映することを示す（図２Ａ〜図２Ｄ）。結果は、異なるデータセットの品質の差がなかったことを示す。したがって、異なる脳領域において同定される、異なる量の差次的に発現される遺伝子は、人為的な結果であるのではなく、腫瘍の存在を感知する異なる脳領域の能力を反映する。
【０１５６】
総合すると、これらの結果は、末梢における悪性細胞の存在の脳による迅速な認識があることを示す。
【０１５７】
実施例２：癌に関連するＣＮＳ発現プロファイルの研究
３つの経過時点のいずれかにおいて差次的に発現される遺伝子を同定するために、混合モデルＡＮＯＶＡデザインを使用して、より完全な研究を行った。いずれかの経過時点において統計的に有意な変化を有する遺伝子を、さらなる分析のために選択した。図３は、３つの実験モデル（肺、乳房、および結腸）の結果を示す。各実験モデルに対して、３つの異なる経過時点（１８、７２、および１９２時間）において、視床下部、前前頭皮質、および中脳から試料を採取した。各癌モデルおよび脳領域に対して、ＡＮＯＶＡテストを実行した。図３は、ＡＮＯＶＡテストを使用して差次的に発現されることがわかった遺伝子の数、上方制御された差次的に発現される遺伝子の割合、差次的に発現される遺伝子の平均倍率変化、および倍率変化データの第５および第９５パーセンタイル値を示す。
【０１５８】
生物学的反復試料の分析
各経過時点において、少なくとも４つの生物学的反復を実行した。差次的に発現される遺伝子の同定に対して、反復なしで、治療と称する因子（レベル：腫瘍および対照）ならびに実験と称するランダム効果（レベル：１〜４）による、混合効果実験設計を用いた。治療因子に対する統計的有意性をＡＮＯＶＡにより推定した（Ｐ． Ｐａｖｌｉｄｉｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１， ２８２（２００３））。この設計は、多数の一方向ＡＮＯＶＡまたはｔ−検定と比較した場合、選択性の損失なしによりよい感度を有するため、いずれかの経過時点において因子治療により影響される遺伝子の同定に対して、多数のＡＮＯＶＡテストを実行する代わりに、前設計に因子時間（レベル：１８、７２、および１９２時間）を追加することを決定した（Ｐ． Ｐａｖｌｉｄｉｓ， Ｗ． Ｓ． Ｎｏｂｌｅ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ． ２， ４２（２００１））。同一方向にそれらの発現レベルを変化させた遺伝子を同定するために、例えば、少なくとも１つの経過時点に変化した遺伝子、２つ以上の経過時点において変化した遺伝子は、同一方向に変化していなければならない（すなわち、必ず上方または下方制御されている）、治療間の平均差に対する統計的有意性をＡＮＯＶＡにより評価した。
【０１５９】
２つ以上の腫瘍モデルにより共有される差次的に発現される遺伝子の数が、偶然によってのみ、予想された量よりも有意に高かったかどうかを評価するために、フィッシャーの直接確率検定を使用した。
【０１６０】
実施例３：実施例２における研究のより限定的な分析
より限定的な分析において、１つの経過時点において上方制御を示すが、異なる経過時点において下方制御を示す遺伝子を排除した。２つの経過時点において上方制御を示したが、第３の経過時点において変化を示さなかった遺伝子は、より限定的な分析に加えられた遺伝子である。図４は、このより限定的な選択プロセスの結果を示す。図３および図４を比較することからわかるように、このより限定的な選択プロセスにより約半分の遺伝子が排除された。図５Ａ〜図５Ｊは、この第２のより限定的な選択プロセスにより同定された遺伝子の全ての表である。
【０１６１】
実施例４：肺癌モデルにおける視床下部のリアルタイムＰＣＲ確証研究
リアルタイムＰＣＲ確証研究は、以下の２つの主な理由により、肺癌群の視床下部領域に焦点を置いた。（ａ）遺伝子発現の最大の変化を有する領域のうちの１つであったこと（図１および図４を参照）、および（ｂ）統計的有意性に従いランクごとに分類される遺伝子に対する誤り発見率の分析（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｅｈａｖ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １２５（１−２）：２７９−８４（２００１））が、視床下部領域全体、特に、肺癌モデルが、最も多い差次的に発現される遺伝子を示したことを確認した。
【０１６２】
腫瘍細胞増殖により、他の器官が、遺伝子発現の変化を示す可能性があるかどうかを研究するために、マウスに癌細胞を注射し、肝臓における転写物レベルを評価した。図６Ａ〜図６Ｃは、肺癌細胞（６Ａ）、乳癌細胞（６Ｂ）、または結腸癌細胞（６Ｃ）の注射後に、差次的に発現されると同定される遺伝子の数（ｘ軸）の関数として、評価された誤り発見の割合（ｙ軸）を示す。０．２に設定された倍率発見の任意のカットオフによる誤り発見率分析は、肝臓において３つの差次的に発現される遺伝子のみを示し（図６Ａ〜図６Ｃ）、それは、肺癌モデルにおいて選択された約２００の視床下部遺伝子、または全ての脳領域および腫瘍モデルをプールした場合の６０を上回る平均遺伝子とは極めて対照的である（図６）。３０％を上回る肝臓マイクロアレイの振幅の変化を示す、全ての注釈付き遺伝子を確証するために、リアルタイムＰＣＲを使用した。マイクロアレイデータにおいて差次的に発現された１１個の遺伝子のうち、機能不明の亜鉛フィンガー遺伝子（Ｚｆａｎｄ２ａ）の配列のみが確証された。
【０１６３】
それらの変化の振幅とは無関係に、マイクロアレイにおけるそれらのｐ値の有意性に従い、リアルタイムＰＣＲ確証研究に対する試料を選択した。この選択方法は、リアルタイムＰＣＲによる５５％の確証をもたらした。確証の百分率は、＞１．３倍のみの振幅の変化が考慮された場合、８３％に上昇した。図７Ａは、５％を上回る倍率変化（１．０５）を含む百分率の倍率変化に従いグループ化された、リアルタイムＰＣＲ確証研究の結果を示す。実施例２の実験において５％を上回る倍率変化を示した遺伝子のうち、５５％の２９個の遺伝子が、リアルタイムＰＣＲにより確証された。実施例３において５％を上回る倍率変化を示した遺伝子のうち、５５％の２２個の遺伝子が、リアルタイムＰＣＲにより確証された。リアルタイムＰＣＲによる確証の程度は、脳における低レベルの差次的発現に関してすでに報告されたものと同様であった（Ｗｕｒｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１（４）：３０６−１６（２００３））。
【０１６４】
実施例２および３における実験間で、確証の程度は非常に類似していたため（図７Ａ）、それらが、癌増殖のモニタリングのためのより信頼できる候補であるだろうという考えに基づいて、一方向のみに変化した発現を示す遺伝子のリストにより、残りの実験を行った（第２のより限定的な分析）。
【０１６５】
リアルタイムＰＣＲ
製造業者の使用説明書に従い、オリゴ（ｄＴ）１２−１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅＨ− Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、０．５μｇのｍＲＮＡを逆転写した。３７℃で１５分間、２μｌの２．５Ｍ ＮａＯＨでインキュベーションすることにより、ｍＲＮＡの分解を行った。１０μｌの２Ｍ ＨＥＰＥＳフリー酸で反応液を中和し、次いでｃＤＮＡ沈殿した。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ ｓｓＤＮＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｃＤＮＡの定量化を実行した。Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を使用してプライマーを設計し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ｉＣｙｃｌｅｒ ＩＱリアルタイム検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の９６ウェル光学プレートにおいてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、遺伝子を２つのハウスキーピング遺伝子（β２ミクログロブリンおよびβアクチン）と比較することによって、確証のために分析した各遺伝子を分析した。各２５μｌの反応物に対して、１μｌのｃＤＮＡ希釈液、２．５μｌの１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液、１．５μｌの５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス、０．５μｌの各プライマー（１０μＭ）、０．７５μｌのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（１：１０００希釈）、０．２５μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．２５μｌのＲｏｘリファレンス色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２５μｌのグリセロール、および０．２５μｌのプラチナムＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ＰＣＲ条件は以下のように設定した。９４℃において２．５分、ならびに９４℃において４５秒、５９℃において３０秒、および７２℃において１５秒を４０サイクル。全ての試料の融解曲線を必ず実行した。２〜４回、各回をトリプリケートで、各標的遺伝子を評価した。次いで、正常化対両方のハウスキーピング遺伝子の平均を実行した。統計的有意性をＡＮＯＶＡにより評価した。
【０１６６】
実施例５：実施例３において選択された遺伝子のベン図分析
実施例３において選択された遺伝子のベン図は、肺および乳癌モデルの視床下部および中脳データを比較した場合、統計的に有意な数の共有遺伝子を示した。図７Ｂは、肺癌モデルマウスの視床下部に差次的に発現された１２個の遺伝子が、乳癌モデルマウスの視床下部にも差次的に発現されたことを示す。図７Ｂはまた、肺癌モデルマウスの中脳に差次的に発現された８つの遺伝子が、乳癌モデルマウスの中脳にも差次的に発現されたことを示す。これらのデータは、脳が、末梢腫瘍細胞に応答して、特有の領域において遺伝子発現レベルを変化させることを示す。
【０１６７】
実施例６：２つの癌モデル間を区別する差次的に発現される遺伝子のサブセットの調査
対となる癌モデルを区別し得る、差次的に発現される遺伝子のサブセットの調査を行った。図８Ａは、３３個の差次的に発現される遺伝子（行）に基づいた、肺および結腸癌モデルから得られる２０個の視床下部試料のクラスタリング（列）を示す。同様に、図８は、乳房および肺癌モデル（図８Ｂ）から、および結腸および乳癌モデル（図８Ｃ）から得られる、視床下部試料のクラスタリングを示す。図９は、乳房および肺癌モデル（図９Ａ）から、結腸および肺モデル（図９Ｂ）から、および乳房および結腸モデル（図９Ｃ）から得られる、皮質試料のクラスタリングを示す。図１０は、乳房および肺癌モデル（図１０Ａ）から、結腸および肺モデル（図１０Ｂ）から、および乳房および結腸モデル（図１０Ｃ）から得られる、中脳試料のクラスタリングを示す。これらの図において、異なる領域における階層的クラスタリング分析の大部分の第１の枝分かれは、対となる癌モデルを正確に分離し、異なる癌を区別する脳の遺伝子発現特性の存在を示す。加えて、視床下部領域はまた、肺および結腸癌（ＲＯＣ−スコア：０．９８、ｐ＜０．０００１）、ならびに結腸および乳癌（ＲＯＣ−スコア：１、ｐ＜０．０００１）を区別するための、統計的に有意な予測能力を示した。
【０１６８】
階層的クラスター分析
実験全体にわたって同一方向にそれらの発現レベルを変化させた遺伝子のリストから（ｐ＜０．０５、上記の生物学的反復の分析の項を参照）、腫瘍モデル間で差次的に応答するものを選択した（ｐ＜０．０１、ｔ−検定）。４０％未満の欠測値を有する実験試料、および２０％未満の欠測値を有する遺伝子のみを分析に加えた。ユークリッド距離計算のために、Ｍｓｉ＝（Ｍｉ-エラー！オブジェクトは編集フィールドコードから作成できません。）／ＳＤ（Ｍ）として、データをスケーリングし、ＳＤは、標準偏差である。Ｗａｒｄの最小分散集積方法を使用して、クラスター分析を実行した（Ｊ． Ａ． Ｈａｒｔｉｇａｎ， Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７５， ｐｐ． ３６６）。
【０１６９】
予測能力推定
リーブ−ワン−アウト（ＬＯＯ）クロス確証を実行した。ｎ個の試料がある場合、順に全ての試料に対して、残りのｎ−１個の試料に関して分類子をトレーニングし、次いで、除外された試料に関して得られる仮説を試験した。重み付けした伝統的なｋ−最近傍（ｋｎｎ）法（以下の重み付けｋ−最近傍を参照）で分類を実現した。ＬＯＯプロセスは、ｎ仮説出力値を生成し、クラスを予測するために、所定の検出閾値τと比較した。τを変化させることにより、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線と呼ばれる、分類の感度対１−特異性の曲線を、描くことができる。ＲＯＣ曲線（ＲＯＣ−スコア）下の領域は、分類子の分離能力の測定値である。非常に好ましい分類子は、１に近いＲＯＣ−スコアを有し、好ましくない分類子は、約０．５のＲＯＣ−スコアを有する。クラス標識の無作為の１０，０００の順列により生成されるヌルモデルから、ＲＯＣ−スコアの統計的有意性を推定した。認められたスコアを上回る無作為化ＲＯＣスコアの割合として、認められたＲＯＣ−スコアのｐ値を算出した。
【０１７０】
重み付け最近傍（ｗＮＮ）
分類に有用な変数（遺伝子）をトレーニングセットより選択した（以下の変数選択の項を参照）。次いで、Ｙの標準偏差で変数を除することにより、トレーニングセット（Ｙ）およびテストセット（Ｘ）を正規化した。次いで、クラスｉに属するトレーニングセットの試料ｙおよびテスト試料ｘのそれぞれの間のユークリッド距離ｄ（ｙ，ｘ）を計算した。Ｇａｕｓｓ核関数ｓ−１（２π）−１／２ ｅｘｐ（−ｄ２／（２ｓ２））により、距離を重量（ｗ）に変換し、ｓは、距離ｄの標準偏差である。ｗＮＮ分類子をトレーニングするために全ての試料を使用して、決定関数ｆ（ｘ）を構築したため、ｋ＝Ｍである（以下に定義される通り）。クラス０に属するｘの推定投票スコアとして仮説出力値：
を生成し、ｌは、クラス標識のベクトルであり、ｍ０は、クラス０に属する試料の量である。したがって、クラスに対する投票スコアは、
エラー！オブジェクトは編集フィールドコードから作成できません。
エラー！オブジェクトは編集フィールドコードから作成できません。
であり、ｍ０およびｍ１は、クラス０および１のそれぞれに属する試料の量であり、Ｍ＝ｍ０＋ｍ１である。
【０１７１】
このようにして、決定関数は、Ｄ（ｘ）＝ｆ１（ｘ）／ｆ０（ｘ）であり、Ｄ（ｘ）＞１である場合は、ｘは、クラス１に割り当てられ、Ｄ（ｘ）＜１である場合は、ｘは、クラス０に割り当てられる。
【０１７２】
変数選択
分類に好適な変数（遺伝子）を選択するために、ＬＯＯプロセスにおいてＲＯＣ−スコアを最大化する遺伝子セットを求めてトレーニングセットを検索した。簡潔に述べると、ｔ−検定を使用して、クラス間のそれらの差次的発現に従い、遺伝子をランク順序付けした。このランク付けリストの始めから、２個の遺伝子から始まり最大で１００個の遺伝子である、遺伝子を連続追加することにより、分類子における遺伝子数を最適化した。トレーニングセットで実行したＬＯＯで計算したＲＯＣ−スコアにより、遺伝子の各セットに対して、正しい分類の指数を推定した。ＲＯＣ−スコアを最大化する遺伝子の最少数を、分類に有用となるように選択した。
【０１７３】
実施例７：差次的に発現される遺伝子の機能カテゴリへのグループ化
マイクロアレイ情報の生物学的意義を理解するために、不偏Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｓｏｒｔｉａデータベース（ＧＯ）（Ｍ． Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２５， ２５（２０００））の機能分類を使用して、差次的に発現される遺伝子を機能カテゴリにグループ化し、さらに、遺伝子集合濃縮解析（Ｇｅｎｅ Ｓｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＧＳＥＡ）（Ａ． Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，（２００５））を使用して分析した。ＧＳＥＡは、任意のカットオフなしで全ての遺伝子を考察し、平均的な個々の変化が低い場合であっても、著しい活性の変化を集合的に示す遺伝子セットを同定する。分析は、視床下部領域に焦点を合わせた。各腫瘍の種類とそれらのそれぞれの対照の間で差次的に発現される遺伝子が豊富な機能遺伝子セットを同定した。機能カテゴリが、密接に関係した生物学的プロセスであった場合、それらをさらにグループ化した。ｐ＜０．０５における機能カテゴリの全体的な分析は、異なる癌モデル間で共有される統計的に有意な遺伝子セットを発見しなかった。この追加の種類の分析は、腫瘍保有マウスに差次的に発現される遺伝子ファミリーの同定を可能にする。この分析は、差次的に発現される遺伝子間の機能関係に基づいており、文献で認められており、他の手段により検出されない関連遺伝子に関する追加情報を提供し得る。しかしながら、有向非巡回ＧＯグラフを実行した後に遺伝子セットをカテゴリにグループ化することにより、３つのモデルにより共有される同様の生物学的プロセスの存在が明らかにされた（図１９Ａ〜図１９Ｉ）。これら共通のプロセスが、共通の生物学的機能を有する遺伝子に関与するかどうかを調査するために、最先端遺伝子サブセットを同定した（Ａ． Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，（２００５））。この分析（図１９Ｊ〜図１９Ｌ）は、「ニューロン結合」としてグループ化された軸索ガイダンスならびに細胞骨格およびシナプスリモデリング（図１９Ｂ、図１９Ｅ、図１９Ｈ、および図１９Ｊ〜図１９Ｌ）等の、同様の生物学的プロセスを反映した３つの癌モデルにより共有される遺伝子を同定し、これは、ＴＧＦβ／ＢＭＰ、ｗｎｔ、ヘッジホッグ、およびＮｏｔｃｈ信号伝達分子（図１９Ｃ，図１９Ｆおよび図１９Ｉ）等の、位置合図としての役割を果たす遺伝子ファミリーのメンバーを含んでいた（ｄｅ Ｗｉｔ， Ｊ． ＆ Ｖｅｒｈａａｇｅｎ， Ｊ．（２００３）Ｐｒｏｇ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ７１， ２４９−６７、Ｃｒｏｗｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １３， ９６７−７２．）。肺癌モデルの経時的分析は、１８時間経過時におけるＴＧＦβ／ＢＭＰ経路の上方制御、７２時間経過時におけるＷｎｔ経路、および１９２時間経過時におけるＮｏｔｃｈ経路の活性化に関連する「ニューロン結合」の増加を示す（図１９Ｃおよび図１９Ｊ〜図１９Ｌ）。乳房および結腸癌モデルにおいて、３つの経路およびヘッジホッグ信号伝達経路も活性化された（図１９Ｆおよび図１９Ｉ）。肺癌モデルとは対照的に、「ニューロン結合」は下方制御されたか、または結腸および乳癌のそれぞれにおいて変化を示さず、これらの信号伝達経路が、追加の生物学的プロセスにも関与する可能性があることを示唆する（図１９Ｊ〜図１９Ｌ）。注目すべきは、アレイが、少なくとも３０個の追加の信号伝達経路に対応する遺伝子配列を含んでいたという事実にもかかわらず、ＧＳＥＡ分析が、追加の信号伝達経路の有意な変化を得なかったことである。追加の最先端遺伝子は、肺および乳癌モデルにおける「免疫応答」、ならびに３つのモデルにおける「疾病応答」に関連する転写物を含む（図１９Ｂ、図１９Ｅ、図１９Ｈ、および図１９Ｊ〜図１９Ｌ）。肺および結腸癌モデルにおける「アポトーシス」の下方制御、ならびに乳房および結腸癌モデルにおける「シナプス活性」における下方制御も認められた（図１９Ｂ、図１９Ｅ、図１９Ｈ、および図１９Ｊ〜図１９Ｌ）。最後に、最先端遺伝子の３５％から４０％は、非関連の、または未知の生物学的機能を示した（図１９Ａ〜図１９Ｌの混合型を参照）。
【０１７４】
リアルタイムＰＣＲにより確証された遺伝子の分析は、ニューロン発症および活性に関与する遺伝子を示した（ＧＳＥＡ分析における明らかに表された生物学的カテゴリ）。図１１は、リアルタイムＰＣＲにより確証された遺伝子の表である。これらの遺伝子には、ニューロン発症および活性に関与するものもある。これらの遺伝子は、ミエリン恒常性に関与するトロンボキサンＡ２受容体（Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３（１）：４７５−８３（１９９８））、ドーパミン作動性伝達に関与するアタキシン−２（Ｂｏｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｖ． Ｄｉｓｏｒｄ． １９（１１）：１３２０−１３２５（２００４）、Ｗｕｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｎｅｕｒｏｌ． ６２（８）：１２８０−５（２００５））、およびシナプス活性に関与するコンタクチン２、オキシトシン、およびＧＡＢＡＡｒａｐｌ２（Ｆｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６１（１）：１５７−７０（１９９０）、Ｔｈｅｏｄｏｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． ４５（４）：４９１−５０１（２００４）、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８５（１−２）：１−１２（２０００））を含んでいた。興味深いことに、トロンボキサンＡ２受容体およびオキシトシンは、炎症／免疫関連プロセス、ＧＳＥＡ分析にも過剰に存在する生物学的カテゴリ、および疾病行動として既知の行動状態にも割り当てられ得る。この状態は、進行中の疾病の対処に集中するために、動物およびヒトの行動優先順位を変化させるが、重要なことに、異なる研究は、この行動状態と検討された癌の進行の間の強い関連性を提供した（Ｋｏｎｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２５（３）：１５４−９（２００２））。
【０１７５】
遺伝子注釈および遺伝子集合濃縮解析
Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ（ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚで入手可能）、およびＭｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ワールドワイドウェブ上のｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｊａｘ．ｏｒｇで入手可能）から遺伝子情報を得た。Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）データベースのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ（ＢＰ）オントロジー（Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ２５（１）：２５−９（２０００））から機能遺伝子セットを生成した。ＧＯ Ｒ−パッケージに実装されるＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎデータベース（ＧＯＡ）（Ｃａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２６２−６（２００４））から、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ数からＧＯ−ＢＰカテゴリへのマッピングを得た。ｔ−検定により推定される差次的発現に対するそれらのｐ値に従い、遺伝子をランク順序付けした。遺伝子集合濃縮解析アルゴリズム（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０２（４３）：１５５４５−５０（２００５））を使用して、遺伝子ランク付けリストの上部に過剰に存在する遺伝子セットを同定した。遺伝子を１０，０００回順列することにより、すなわち、遺伝子がそれらのサイズを維持しながらもセットに無作為に割り当てられることにより、統計的有意性（公称ｐ値）を推定した。差分ノードは、統計的に有意なＧＯ−ＢＰセット（ｐ＜０．０５）を意味する。
【０１７６】
実施例８：疾病行動として既知の行動状態に関連する遺伝子の研究
実施例１、２、および３に使用されるアレイにおいて存在しなかったが、疾病行動に関与することが知られる遺伝子発現を研究した。
【０１７７】
図１２は、疾病行動に関与することが知られているが、上記に実施例に使用されるマイクロアレイに存在しない遺伝子、ならびに少なくとも１つの経過時点、１つの脳領域、および１つの癌モデルに差次的に発現されることが、リアルタイムＰＣＲにより確証されている遺伝子の表である。例えば、３つの癌の種類を注射したマウスの視床下部および皮質におけるシクロ−オキシゲナーゼ−２（ｐｔｇｓ−２）のレベルは、上方制御されたことがわかった（乳癌モデルの皮質において１８時間経過時で＋１７．３％、結腸癌モデルの視床下部において１８時間経過時で＋９．８％、および肺癌モデルの視床下部において７２時間経過時で＋１４．３％、図１２を参照）。
【０１７８】
サイトカイン機能の干渉による疾病行動の減弱に関与する遺伝子の転写物レベルは、異なる腫瘍モデルを注射したマウスの視床下部において下方制御された。例えば、全てのモデルにおいてプロオピオメラノコルチン−アルファ（Ｐｏｍｃ１）、肺および乳癌細胞においてアルギニンバソプレシン、ならびに結腸癌細胞のみにおいておよびメラノコルチン受容体４および５−（Ｍｃ４ｒおよびＭｃ５ｒ）が減少した（図１２）。サイトカイン、ＩＧＦ−１、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの疾病行動関連群に対しては、何の転写物レベルの変化も認められなかった。これらのデータは、疾病行動を発症しやすい分子環境の生成を示す。
【０１７９】
加えて、全ての腫瘍モデルの視床下部におけるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（Ｉｎｄｏ）の発現の減少（図１２）は、癌関連悪液質に関連する神経伝達物質であるセロトニンを生成するための、トリプトファンのより大きい接近性を示す可能性があり（Ｋｏｎｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２５（３）：１５４−１５９（２００２）； Ｌａｖｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １８（１）：１００−１０５（２００２））、悪液質をもたらす分子変化が、臨床症状が検出される前に早期に開始される可能性があることを示唆する。最後に、１８時間経過時における初期の増加後に、ニューロペプチドＹ（Ｎｐｙ）転写物レベルは、乳房および肺癌細胞を注射したマウスの皮質領域において正常に戻るか、もしくは減少したが、結腸癌においては、かなり後の１９２時間経過時において減少が認められた（図１２）。ＮｐｙおよびＭｃｒレベルの減少はまた、変化した摂食行動および癌発症においてのちに起こるストレスへの反応に先行する可能性がある（Ｈｅｉｌｉｇ ａｎｄ Ｔｈｏｒｓｅｌｌ， Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １３（１）：８５−９４（２００２））。
【０１８０】
実施例９：腫瘍保有動物の行動研究
疾病行動に関連する遺伝子発現は、穴掘りおよび水泳試験により分析されるように、腫瘍保有動物における行動変化は伴わなかった。
【０１８１】
穴掘り
記載される通りこの試験を実行した（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １４（２）：４０１−４０９（２００１））。簡潔に述べると、暗期の開始の少なくとも２時間前に、ペレットを充填したプラスチックチューブ（長さ２０ｃｍ、直径４ｃｍ）を含む個々のプラスチックケージにマウスを入れた。ケージの床に下部閉鎖端を置いた。ケージの床の３ｃｍ上にネジで開口端を支持し、内容物が非意図的に移動することを防止した。チューブを３００グラムのペレットで充填した。チューブに残ったペレットの重量を１６時間経過時に測定し、そこから移動した（穴が掘られた）重量を計算した。
【０１８２】
強制水泳試験
水（２４±１℃）を最大で１５ｃｍの深さまで充填したシリンダー（直径１９ｃｍおよび高さ２５ｃｍ）にマウスを別々に入れた。不動状態になるまでの時間を記録した（Ｐｅｔｉｔ−Ｄｅｍｏｕｌｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ）１７７（３）：２４５−５５（２００５））。マウスが、浮遊度を維持するために最小限の移動のみをする場合の不動状態を考察した。実験が終わった後に、タオルでマウスを乾かし、ケージに戻した。
【０１８３】
結果
図１３Ａ〜図１３Ｂは、腫瘍保有マウスおよび正常対照マウスの行動テストの結果を示す。結果は、腫瘍保有マウスおよび対照マウスに対して、実質的に同様である。
【０１８４】
これらの結果は、行動変化が見られるずっと前に、脳が、ある遺伝子の発現プロファイルを調節し得ることを示唆する。
【０１８５】
実施例１０：関節リウマチおよび癌モデル間の比較
癌に対する脳の分子応答の特異性をさらに評価するために、癌以外の慢性疾病の遺伝子発現を評価した。ＤＢＡ／１およびＣ５７ブラックマウスにおける２つの関節リウマチ（ＲＡ）のモデルを使用した。疾病の極早期段階、すなわち、両方のモデルにおける免疫化／追加免疫の１週間後に、脳試料を得た。マイクロアレイ分析は、対照マウスと比較して、視床下部、前前頭皮質、および中脳のそれぞれにおいて、＞１．２の倍率変化を有する、８９、７３、および１０４個の差次的に発現される遺伝子を同定した。モデル間のデータの比較は、癌細胞を注射したマウスおよびＲＡ−マウスが、非有意な数の差次的に発現される遺伝子を共有したことを示した。階層的クラスタリング分析は、第１の枝分かれが、各癌モデルに対応する対となる試料から、全ての関節炎試料を正確に分離したことを示した。（図１４Ａ〜図１４Ｃ、図１５Ａ〜１５Ｃ、および図１６Ａ〜図１６Ｃ）。
【０１８６】
同様の分析は、マウスのＲＡ群と３つの癌モデルの間の６つの考えられる対による比較のそれぞれにおける、１０個の上位にランク付けされた視床下部遺伝子を考察した。図１７Ａ〜図１７Ｂは、この分析において、関節炎のうちの１００％および癌モデル試料のうちの１００％が、第１のクラスタリングの枝分かれにおいて分かれたことを示す。第２の枝分かれは、乳癌試料のうちの１００％、７つの結腸癌試料のうちの１つ、および１２個の肺癌試料のうちの３つを含んでいた（図１７Ａ）。最後に、第３の枝分かれは、肺癌試料から結腸癌試料の残りを分離した（図１７Ａ）。皮質および中脳領域は、異なる試料の区別において視床下部ほど有効ではなかった。ＲＯＣ−スコアの計算は、前前頭皮質データが、ＲＡおよび乳癌モデル（ＲＯＣ−スコア：０．８３３３ｐ＜０．００１）、ならびにＲＡおよび肺癌モデル（ＲＯＣ−スコア：０．８０１３、ｐ＜０．００１）の区別に対して、統計的に有意な予測能力を示したことを示した。これは、ＲＡおよび結腸癌モデル（ＲＯＣ−スコア：０．９１０７ｐ＜０．００１）、ならびにＲＡおよび乳癌モデル（ＲＯＣ−スコア：１、ｐ＜０．００１）を区別することができた視床下部と同等の結果である。誤り発見率分析により、中脳は、最も多い差次的に発現される遺伝子を示したが、中脳は、２つの慢性疾病モデルを区別するための予測能力を示さなかった（図１８）。視床下部試料のＧＳＥＡ分析は、ＲＡおよび癌モデル間で統計的に有意な共有遺伝子セットを示さなかった。図１７Ｂ〜図１７Ｄは、＜０．０５のｐ値および＞２０％の倍率を有するいずれかの関節炎モデルに対して変化する各領域より選択される遺伝子のリストであり、両方のモデルにおいて変化する遺伝子に対して、変化は同一方向でなければならない。
【０１８７】
生体内研究−関節炎モデル
免疫化手法：１日目および２１日目に、同量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ， Ｓｉｇｍａ Ｃｏ）と混合した、２ｍｇ／ｍｌニワトリＩＩ型コラーゲン０．１ｍｌを、１０〜１２週齢のＤＢＡ／１およびＣ５７ＢＬ／６雄マウスの尾の付け根に皮内注射した。
【０１８８】
ＣＦＡのみをシャム治療した動物に注射した。２４日目に、ＬＰＳ（リポ多糖、０．１ｍｌのＰＢＳ中４０μｇ、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）をマウスに腹腔内注射し、１週間後（３１日目）に、早期疾病の徴候を示すマウスを頸部脱臼により犠牲にし、視床下部、前前頭皮質、および中脳を切開した。関節炎の発症は、免疫化の３週間後に足の腫脹として肉眼で見られた。この免疫化手法を使用すると、マウスの７３から９０％が、関節炎を発症した。関節炎の臨床的特徴は、２日に１回カリパスを使用して足の腫脹および腫脹した足の数を評価することによりモニタされ得る（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５（３）：７６３−９（１９９５））。
【０１８９】
介入がより成功裏に実行されることが多い時期の癌の早期検出は、大きな課題を残す。本明細書に記載する研究の目的は、末梢から発する信号の既知のインテグレーター（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｒ）としてのＣＮＳが、癌の進行を検出することができたかどうかを立証することであった。本研究は、癌細胞の注射の１８時間後という早期に見られる、変化する遺伝子発現レベルにより、脳が、実際に末梢腫瘍の存在に応答することを示す。単一遺伝子および遺伝子セット分析は、各癌モデルに対する分子特徴が特異的であることを示した。加えて、脳は、癌モデルにおいて認められたものとは異なる、特定の遺伝子プロファイルを有するＲＡ等の別の慢性疾病の早期発症を認識する。対照的に、肝臓等の末梢器官は、本質的には、腫瘍の存在を検出することができなかった。最後に、視床下部は、慢性末梢疾病から発する極早期信号をより効果的に検出および判別することができる領域のように思われた。
【０１９０】
実施例１１：ＣＳＦにおける差次的に発現されるタンパク質の同定
この実施例に記載する実験は、本明細書に記載されているような癌に関連する差次的ＣＮＳ遺伝子発現が、ＣＳＦにおける異なるタンパク質の存在とも関連があるかどうかを決定するために設計された。
【０１９１】
実施例１に記載されるように、生体内研究を行った。注射後２４時間および９日間後に、３０匹の動物の同一群（腫瘍注射された１５匹および１５匹の対照）からＣＳＦ試料を得た。各腫瘍の種類に対して、４つの独立した実験を行った。
【０１９２】
ＣＳＦ抽出のために、動物に麻酔をかけ、２７Ｇバタフライによる第４脳室の穿刺によりＣＳＦを得た。各実験群からのＣＳＦ試料をプールした。ＣＳＦ試料をＴＣＡ／アセトンで沈殿し、適切な量の溶解緩衝液（Ｕｒｅａ ７Ｍ、Ｔｉｏｕｒｅａ ２Ｍ、ＣＨＡＰＳ ４％、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ ２ｍＭ）に再懸濁させ、室温で１時間撹拌しながらインキュベーションし、−８０℃で保管した。
【０１９３】
２−Ｄ分析を実行するために、試料を適切な量の補水液に再懸濁し、およびカップローディング法により、終夜再水和された１１ｃｍのｐＨ３〜１０のＩＰＧストリップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）に添加した。製造業者の使用説明書に従い、Ｅｔｔａｎ ＩＰＧｐｈｏｒ等電点電気泳動システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）で、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を実行した。ＩＥＦ後に、１％ＤＴＴを含む平衡緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍの尿素、３０％ｖ／ｖグリセロール、２％ＳＤＳ、０．００５％ブロモフェノールブルー）で１５分間ストリップをインキュベーションし、続いて、平衡緩衝液中４％ヨードアセトアミドで、さらに１５分間インキュベーションした。Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ ＩＩＩ システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）で二次元（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実行した。
【０１９４】
データ分析、統計、およびタンパク質同定：
ＣｙｐｒｏＲｕｂｉ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）染色ゲルを画像スキャナでスキャンし、Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ２Ｄ Ｅｌｉｔｅ ３．１０ソフトウェアで分析した（両方ともＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪから）。スポットを自動的に検出し、手動で編集し、ゲル間で一致させた。Ｒ−Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２．１．１下で正規化および推定統計を行った。質量分析に適合する硝酸銀染色を使用して、タンパク質を検出した。
【０１９５】
結果
増加あるいは減少すると同定されるタンパク質を表１に記載する。
【０１９６】
（表１）ＣＳＦにおいて差次的に存在するタンパク質
遺伝子座 定義
Ｐ２８６６５ ムリノグロブリン−１前駆体（ＭｕＧ１）
ＢＡＡ２３９５８ ＴＣＲベータ鎖
ＢＡＥ２８７０３ 名前の付けられていないタンパク質産物
ＡＡＡ４０９４２ アルファ−１ ＩＩＩ型コラーゲン
ＸＰ＿９９５００７ 亜鉛フィンガータンパク質２３５（亜鉛フィンガ ータンパク質９３）（Ｚｆｐ−９３）と同様
ＸＰ＿５７６３９４ グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素と同様
Ｐ１６６１７ ホスホグリセリン酸キナーゼ１
ＢＡＥ２６３２５ 名前の付けられていないタンパク質産物
ＡＡＨ８５０９８ エノラーゼ１、アルファ非ニューロン
ＮＰ＿０３３９３１ 炭酸脱水酵素２
ＢＡＢ２７３６２ 名前の付けられていないタンパク質産物
ＡＡＨ６２９５７ Ｃｐタンパク質
ＡＡＨ４３３３８ 補体成分 ３
ＸＰ＿２２３３６２ ｍＫＩＡＡ１４５８タンパク質と同様
【０１９７】
これらの結果は、恐らく本明細書に記載されているようなＣＮＳにおいて、おそらく差次的遺伝子発現の結果として、健康な動物にではなく、癌を有する動物のＣＳＦ中に存在するタンパク質の差次的パターンがあることを示す。
【０１９８】
実施例１２：血中の差次的に発現されるＣＮＳタンパク質の同定
この実施例に記載する実験は、本明細書に記載されているような癌に関連する差次的ＣＮＳ遺伝子発現が、移植したマウスの血中の異なるタンパク質の存在とも関連があるかどうかを決定するために設計された。
【０１９９】
実施例１に記載されるように、生体内研究を行った。ＥＤＴＡ１０％を有する５０ｍｌ円錐ファルコンチューブに血液を採取した。溶解緩衝液（ＫＨＣＯ３ １０ｍＭ、ＮＨ４Ｃｌ １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ ｐＨ＝８）を１ｍｌの血液あたり１５０ｍｌの溶解緩衝液の割合で添加した。時々撹拌しながら１５分間室温（ＲＴ）で試料をインキュベーションし、次いで、３００×ｇでＲＴで１５分間遠心分離した。製造業者の使用説明書に従い、上清を捨て、ペレットを５００μｌのＴｒｉｚｏｌ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でホモジナイズし、総ＲＮＡを分離した。製造業者の使用説明書に従い、ＲＮＡをＤＮａｓｅで処理し、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。リアルタイムＰＣＲ実験を実施例４にあるように行った。
【０２００】
表２に示される結果は、健康な動物とは対照的に、癌を有する動物の血中に存在する遺伝子発現の差次的パターンを示す。
【０２０１】
（表２）血液試料中の確証された遺伝子
遺伝子 ＧｅｎＢａｎｋ 倍率変化（％） ｐ値 経過時点
Ａｃｃ．＃ （時間）
Atxn2 NM_009125 -106.38 0.020 18
Gabarapl2 NM_026693 -237.23 6.37E-06 18
Gabarapl2 NM_026693 +59.42 0.028 192
Atp5k NM_007507 -1004.77 0.003 18
Atp5k NM_007507 -54.99 0.041 72
Gpr109a NM_030701 -279.9 0.039 18
Kin X58472 -1796.78 0.031 18
【０２０２】
他の実施形態
本発明の数多くの実施形態が記載されている。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更を加えることができることが理解されると考えられる。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断する方法であって、
図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、もしくは２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つもしくは複数に記載される遺伝子またはその相同物、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂに記載される１つまたは複数の遺伝子より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供する段階、
前記対象のＣＮＳ試料中における、前記基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子の発現を検出することを含む、対象の遺伝子発現プロファイルを生成する段階、ならびに
前記対象の遺伝子発現プロファイルを前記基準遺伝子発現プロファイルと比較する段階
を含み、
前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項２】
前記ＣＮＳ試料は、脳からの１つまたは複数の細胞の試料である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
脳細胞が、視床下部、中脳、および前前頭皮質からの細胞からなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
脳細胞が、視床下部より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
２つまたはそれ以上の基準遺伝子発現プロファイルが使用され、それぞれが、異なる非ＣＮＳ癌に特異的である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
非ＣＮＳ癌が、肺癌、結腸癌、および乳癌からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
非ＣＮＳ癌が、直径０．５ｃｍ未満の固形腫瘍である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つもしくは複数に記載される任意の遺伝子またはその相同物より選択される、１０個またはそれ以上の遺伝子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
１体または複数の健康な被験体に対応する対照遺伝子発現プロファイルを提供する段階、および
前記対象の遺伝子発現プロファイルを前記対照遺伝子発現プロファイルと比較する段階
をさらに含み、
前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記対照遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有さず、かつ発症する可能性が低いことを示す、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子発現が、マイクロアレイアッセイを使用して検出される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記対象がヒトであり、かつ前記基準遺伝子発現プロファイルが、図５５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載される遺伝子の１つまたは複数のヒト相同物を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、癌の家族歴を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、画像分析で評価された際に癌の臨床徴候を欠く、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、疾患を発症するリスクが高いことに関連する遺伝子の保有者である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨｌまたはｈＭＳＨ６遺伝子の保有者である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
比較する段階の結果の記録を生成する段階、および
任意で、前記対象、医療提供者、または他の当事者に前記記録を伝達する段階
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ肺癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される１つ以上の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ乳癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ結腸癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、または２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つまたは複数に記載される任意の遺伝子、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂのうちの１つまたは両方に記載される任意の遺伝子より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子の発現データを含む、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌の存在に対応する、基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２１】
図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つまたは複数に記載される任意の遺伝子より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子の発現データを含む、請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２２】
以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌が、肺癌である、請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２３】
以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子の発現データを含み；かつ前記非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌が、肺癌である、請求項２２記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２４】
以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される、１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌が、乳癌である、請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２５】
Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物の発現データを含み；かつ前記非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌が、乳癌である、請求項２４記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２６】
以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌が、結腸癌である、請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２７】
以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子の発現データを含む、請求項２６記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２８】
請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイルに対応するデータセットを含む、コンピュータが読み取り可能な媒体。
【請求項２９】
中枢神経系（ＣＮＳ）試料を得るためのサンプリング装置と、
前記ＣＮＳ試料における１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現データを生成する遺伝子発現検出装置、またはＣＮＳにおける１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の画像を得、かつ前記１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現データを生成するためのイメージング装置と、
特定の非ＣＮＳ癌に対する、請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイルと、
前記遺伝子発現データを受信し、かつ前記基準遺伝子発現プロファイルと比較する比較器
とを含む、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するためのシステム。
【請求項３０】
対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断する方法であって、
図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つまたは複数に記載される任意の遺伝子、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂのうちの１つまたは両方に記載される任意の遺伝子より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供する段階、
前記対象のＣＮＳ試料中における、前記基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を検出することを含む、対象の発現プロファイルを生成する段階、ならびに
前記対象の発現プロファイルを前記基準遺伝子発現プロファイルと比較する段階、
を含み、
前記対象の発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項３１】
前記ＣＮＳ試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
２つまたはそれ以上の基準遺伝子発現プロファイルが使用され、それぞれが、異なる非ＣＮＳ癌に特異的である、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
非ＣＮＳ癌が、肺癌、結腸癌、および乳癌からなる群より選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
非ＣＮＳ癌が、直径０．５ｃｍ未満の固形腫瘍である、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つまたは複数に記載される任意の遺伝子またはその相同物より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子を含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
１体または複数の健康な被験体に対応する対照遺伝子発現プロファイルを得る段階、および
前記対象の発現プロファイルを前記対照遺伝子発現プロファイルを比較する段階
をさらに含み、
前記対象の発現プロファイルと前記対照遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有さず、かつ発症する可能性が低いことを示す、請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
前記対象がヒトであり、かつ前記基準遺伝子発現プロファイルが、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載される遺伝子の１つまたは複数のヒト相同物を含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３８】
前記対象が、癌の家族歴を有する、請求項３０記載の方法。
【請求項３９】
前記対象が、画像分析で評価された際に癌の臨床徴候を欠く、請求項３０記載の方法。
【請求項４０】
前記対象が、疾患を発症するリスクが高いことに関連する遺伝子の保有者である、請求項３０記載の方法。
【請求項４１】
前記対象が、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨｌまたはｈＭＳＨ６遺伝子の保有者である、請求項３０記載の方法。
【請求項４２】
比較する段階の結果の記録を生成する段階、および
任意で、前記対象、医療提供者または他の当事者に記録を伝達する段階
をさらに含む、請求項３０記載の方法。
【請求項４３】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ肺癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項３０記載の方法。
【請求項４４】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される、１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ乳癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項３０記載の方法。
【請求項４５】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ結腸癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項３０記載の方法。
【請求項４６】
対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断する方法であって、
Ａｔｘｎ２、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ａｔｐ５ｋ、Ｇｐｒ１０９ａ、およびＫｉｎからなる群より選択される５つまたはそれ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供する段階、
前記対象の血液試料中における、前記基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子の発現を検出することを含む、対象の遺伝子発現プロファイルを生成する段階、ならびに
前記対象の遺伝子発現プロファイルを前記基準遺伝子発現プロファイルと比較する段階
を含み、
前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項４７】
対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断する方法であって、
表１に記載される遺伝子より選択される５つまたはそれ以上のタンパク質を含む、基準タンパク質発現プロファイルを提供する段階、
前記対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中における、前記基準タンパク質発現プロファイルの全てのタンパク質の発現を検出することを含む、対象のタンパク質発現プロファイルを生成する段階、および
前記対象のタンパク質発現プロファイルを前記基準タンパク質発現プロファイルと比較する段階
を含み、
前記対象のタンパク質発現プロファイルと前記基準タンパク質発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項１】
対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断する方法であって、
図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、もしくは２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つもしくは複数に記載される遺伝子またはその相同物、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂに記載される１つまたは複数の遺伝子より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供する段階、
前記対象のＣＮＳ試料中における、前記基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子の発現を検出することを含む、対象の遺伝子発現プロファイルを生成する段階、ならびに
前記対象の遺伝子発現プロファイルを前記基準遺伝子発現プロファイルと比較する段階
を含み、
前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項２】
前記ＣＮＳ試料は、脳からの１つまたは複数の細胞の試料である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
脳細胞が、視床下部、中脳、および前前頭皮質からの細胞からなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
脳細胞が、視床下部より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
２つまたはそれ以上の基準遺伝子発現プロファイルが使用され、それぞれが、異なる非ＣＮＳ癌に特異的である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
非ＣＮＳ癌が、肺癌、結腸癌、および乳癌からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
非ＣＮＳ癌が、直径０．５ｃｍ未満の固形腫瘍である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つもしくは複数に記載される任意の遺伝子またはその相同物より選択される、１０個またはそれ以上の遺伝子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
１体または複数の健康な被験体に対応する対照遺伝子発現プロファイルを提供する段階、および
前記対象の遺伝子発現プロファイルを前記対照遺伝子発現プロファイルと比較する段階
をさらに含み、
前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記対照遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有さず、かつ発症する可能性が低いことを示す、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子発現が、マイクロアレイアッセイを使用して検出される、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記対象がヒトであり、かつ前記基準遺伝子発現プロファイルが、図５５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載される遺伝子の１つまたは複数のヒト相同物を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、癌の家族歴を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、画像分析で評価された際に癌の臨床徴候を欠く、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、疾患を発症するリスクが高いことに関連する遺伝子の保有者である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨｌまたはｈＭＳＨ６遺伝子の保有者である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
比較する段階の結果の記録を生成する段階、および
任意で、前記対象、医療提供者、または他の当事者に前記記録を伝達する段階
をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ肺癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される１つ以上の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ乳癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ結腸癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、または２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つまたは複数に記載される任意の遺伝子、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂのうちの１つまたは両方に記載される任意の遺伝子より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子の発現データを含む、非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌の存在に対応する、基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２１】
図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つまたは複数に記載される任意の遺伝子より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子の発現データを含む、請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２２】
以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌が、肺癌である、請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２３】
以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子の発現データを含み；かつ前記非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌が、肺癌である、請求項２２記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２４】
以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される、１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌が、乳癌である、請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２５】
Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物の発現データを含み；かつ前記非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌が、乳癌である、請求項２４記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２６】
以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌が、結腸癌である、請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２７】
以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子の発現データを含む、請求項２６記載の基準遺伝子発現プロファイル。
【請求項２８】
請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイルに対応するデータセットを含む、コンピュータが読み取り可能な媒体。
【請求項２９】
中枢神経系（ＣＮＳ）試料を得るためのサンプリング装置と、
前記ＣＮＳ試料における１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現データを生成する遺伝子発現検出装置、またはＣＮＳにおける１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現の画像を得、かつ前記１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現データを生成するためのイメージング装置と、
特定の非ＣＮＳ癌に対する、請求項２０記載の基準遺伝子発現プロファイルと、
前記遺伝子発現データを受信し、かつ前記基準遺伝子発現プロファイルと比較する比較器
とを含む、対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断するためのシステム。
【請求項３０】
対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断する方法であって、
図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つまたは複数に記載される任意の遺伝子、および任意で図５Ｊまたは１１Ｂのうちの１つまたは両方に記載される任意の遺伝子より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供する段階、
前記対象のＣＮＳ試料中における、前記基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を検出することを含む、対象の発現プロファイルを生成する段階、ならびに
前記対象の発現プロファイルを前記基準遺伝子発現プロファイルと比較する段階、
を含み、
前記対象の発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項３１】
前記ＣＮＳ試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
２つまたはそれ以上の基準遺伝子発現プロファイルが使用され、それぞれが、異なる非ＣＮＳ癌に特異的である、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
非ＣＮＳ癌が、肺癌、結腸癌、および乳癌からなる群より選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
非ＣＮＳ癌が、直径０．５ｃｍ未満の固形腫瘍である、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃのうちの１つまたは複数に記載される任意の遺伝子またはその相同物より選択される、５つまたはそれ以上の遺伝子を含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
１体または複数の健康な被験体に対応する対照遺伝子発現プロファイルを得る段階、および
前記対象の発現プロファイルを前記対照遺伝子発現プロファイルを比較する段階
をさらに含み、
前記対象の発現プロファイルと前記対照遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有さず、かつ発症する可能性が低いことを示す、請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
前記対象がヒトであり、かつ前記基準遺伝子発現プロファイルが、図５Ａ〜５Ｉ、１１Ａ、１２、および２１Ａ〜２３Ｃに記載される遺伝子の１つまたは複数のヒト相同物を含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３８】
前記対象が、癌の家族歴を有する、請求項３０記載の方法。
【請求項３９】
前記対象が、画像分析で評価された際に癌の臨床徴候を欠く、請求項３０記載の方法。
【請求項４０】
前記対象が、疾患を発症するリスクが高いことに関連する遺伝子の保有者である、請求項３０記載の方法。
【請求項４１】
前記対象が、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨｌまたはｈＭＳＨ６遺伝子の保有者である、請求項３０記載の方法。
【請求項４２】
比較する段階の結果の記録を生成する段階、および
任意で、前記対象、医療提供者または他の当事者に記録を伝達する段階
をさらに含む、請求項３０記載の方法。
【請求項４３】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ｔｂｘａ２ｒ、Ａｔｘｎ２、Ｃｎｔｎ２、Ｏｘｔ、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ｕｎｃ８４ａ、Ａｔｐ５ｋ、Ｂｍｐ１５、Ｋｉｎ、Ｎａｄｋ、Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ肺癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項３０記載の方法。
【請求項４４】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｐｏｍｃ、Ｎｐｙ、Ｐｔｇｓ２、およびその相同物より選択される、１つまたは複数の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ乳癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項３０記載の方法。
【請求項４５】
前記基準遺伝子発現プロファイルが、以下の遺伝子群：Ａｖｐ、Ｉｎｄｏ、Ｍｃ４ｒ、Ｍｃ５ｒ、Ｐｏｍｃ、Ｐｔｇｓ２、Ｎｐｙ、およびその相同物より選択される、１つ以上の遺伝子の発現データを含み；かつ前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ結腸癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、請求項３０記載の方法。
【請求項４６】
対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断する方法であって、
Ａｔｘｎ２、Ｇａｂａｒａｐｌ２、Ａｔｐ５ｋ、Ｇｐｒ１０９ａ、およびＫｉｎからなる群より選択される５つまたはそれ以上の遺伝子を含む、基準遺伝子発現プロファイルを提供する段階、
前記対象の血液試料中における、前記基準遺伝子発現プロファイルの全ての遺伝子の発現を検出することを含む、対象の遺伝子発現プロファイルを生成する段階、ならびに
前記対象の遺伝子発現プロファイルを前記基準遺伝子発現プロファイルと比較する段階
を含み、
前記対象の遺伝子発現プロファイルと前記基準遺伝子発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、方法。
【請求項４７】
対象における非中枢神経系（非ＣＮＳ）癌を診断する方法であって、
表１に記載される遺伝子より選択される５つまたはそれ以上のタンパク質を含む、基準タンパク質発現プロファイルを提供する段階、
前記対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）試料中における、前記基準タンパク質発現プロファイルの全てのタンパク質の発現を検出することを含む、対象のタンパク質発現プロファイルを生成する段階、および
前記対象のタンパク質発現プロファイルを前記基準タンパク質発現プロファイルと比較する段階
を含み、
前記対象のタンパク質発現プロファイルと前記基準タンパク質発現プロファイルの一致は、前記対象が、非ＣＮＳ癌を有しているか、または発症する可能性が高いことを示す、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ−１】
【図５Ｂ−２】
【図５Ｃ−１】
【図５Ｃ−２】
【図５Ｃ−３】
【図５Ｃ−４】
【図５Ｄ−１】
【図５Ｄ−２】
【図５Ｄ−３】
【図５Ｅ−１】
【図５Ｅ−２】
【図５Ｅ−３】
【図５Ｅ−４】
【図５Ｆ−１】
【図５Ｆ−２】
【図５Ｆ−３】
【図５Ｆ−４】
【図５Ｆ−５】
【図５Ｇ−１】
【図５Ｇ−２】
【図５Ｇ−３】
【図５Ｈ−１】
【図５Ｈ−２】
【図５Ｈ−３】
【図５Ｉ−１】
【図５Ｉ−２】
【図５Ｉ−３】
【図５Ｊ−１】
【図５Ｊ−２】
【図５Ｊ−３】
【図５Ｊ−４】
【図５Ｊ−５】
【図５Ｊ−６】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ−１】
【図８Ｅ−２】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ−１】
【図９Ｄ−２】
【図９Ｅ−１】
【図９Ｅ−２】
【図９Ｆ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ−１】
【図１０Ｄ−２】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ−１】
【図１４Ｄ−２】
【図１４Ｅ−１】
【図１４Ｅ−２】
【図１４Ｅ−３】
【図１４Ｆ−１】
【図１４Ｆ−２】
【図１４Ｇ−１】
【図１４Ｇ−２】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ−１】
【図１５Ｅ−２】
【図１５Ｆ−１】
【図１５Ｆ−２】
【図１５Ｇ−１】
【図１５Ｇ−２】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ−１】
【図１６Ｄ−２】
【図１６Ｅ−１】
【図１６Ｅ−２】
【図１６Ｆ−１】
【図１６Ｆ−２】
【図１６Ｇ−１】
【図１６Ｇ−２】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ−１】
【図１７Ｂ−２】
【図１７Ｂ−３】
【図１７Ｂ−４】
【図１７Ｃ−１】
【図１７Ｃ−２】
【図１７Ｃ−３】
【図１７Ｃ−４】
【図１７Ｃ−５】
【図１７Ｃ−６】
【図１７Ｄ−１】
【図１７Ｄ−２】
【図１７Ｄ−３】
【図１７Ｄ−４】
【図１７Ｄ−５】
【図１７Ｄ−６】
【図１８】
【図１９Ａ−Ｃ】
【図１９Ｄ−Ｆ】
【図１９Ｇ−Ｉ】
【図１９Ｊ−１】
【図１９Ｊ−２】
【図１９Ｊ−３】
【図１９Ｊ−４】
【図１９Ｊ−５】
【図１９Ｊ−６】
【図１９Ｊ−７】
【図１９Ｊ−８】
【図１９Ｊ−９】
【図１９Ｋ−１】
【図１９Ｋ−２】
【図１９Ｋ−３】
【図１９Ｋ−４】
【図１９Ｋ−５】
【図１９Ｋ−６】
【図１９Ｋ−７】
【図１９Ｋ−８】
【図１９Ｋ−９】
【図１９Ｋ−１０】
【図１９Ｋ−１１】
【図１９Ｌ−１】
【図１９Ｌ−２】
【図１９Ｌ−３】
【図１９Ｌ−４】
【図１９Ｌ−５】
【図１９Ｌ−６】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２０−３】
【図２０−４】
【図２０−５】
【図２０−６】
【図２０−７】
【図２０−８】
【図２０−９】
【図２０−１０】
【図２０−１１】
【図２０−１２】
【図２０−１３】
【図２０−１４】
【図２０−１５】
【図２０−１６】
【図２０−１７】
【図２０−１８】
【図２０−１９】
【図２０−２０】
【図２０−２１】
【図２０−２２】
【図２０−２３】
【図２０−２４】
【図２０−２５】
【図２０−２６】
【図２０−２７】
【図２０−２８】
【図２０−２９】
【図２０−３０】
【図２０−３１】
【図２０−３２】
【図２０−３３】
【図２０−３４】
【図２０−３５】
【図２０−３６】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ−１】
【図５Ｂ−２】
【図５Ｃ−１】
【図５Ｃ−２】
【図５Ｃ−３】
【図５Ｃ−４】
【図５Ｄ−１】
【図５Ｄ−２】
【図５Ｄ−３】
【図５Ｅ−１】
【図５Ｅ−２】
【図５Ｅ−３】
【図５Ｅ−４】
【図５Ｆ−１】
【図５Ｆ−２】
【図５Ｆ−３】
【図５Ｆ−４】
【図５Ｆ−５】
【図５Ｇ−１】
【図５Ｇ−２】
【図５Ｇ−３】
【図５Ｈ−１】
【図５Ｈ−２】
【図５Ｈ−３】
【図５Ｉ−１】
【図５Ｉ−２】
【図５Ｉ−３】
【図５Ｊ−１】
【図５Ｊ−２】
【図５Ｊ−３】
【図５Ｊ−４】
【図５Ｊ−５】
【図５Ｊ−６】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ−１】
【図８Ｅ−２】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ−１】
【図９Ｄ−２】
【図９Ｅ−１】
【図９Ｅ−２】
【図９Ｆ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ−１】
【図１０Ｄ−２】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ−１】
【図１４Ｄ−２】
【図１４Ｅ−１】
【図１４Ｅ−２】
【図１４Ｅ−３】
【図１４Ｆ−１】
【図１４Ｆ−２】
【図１４Ｇ−１】
【図１４Ｇ−２】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ−１】
【図１５Ｅ−２】
【図１５Ｆ−１】
【図１５Ｆ−２】
【図１５Ｇ−１】
【図１５Ｇ−２】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ−１】
【図１６Ｄ−２】
【図１６Ｅ−１】
【図１６Ｅ−２】
【図１６Ｆ−１】
【図１６Ｆ−２】
【図１６Ｇ−１】
【図１６Ｇ−２】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ−１】
【図１７Ｂ−２】
【図１７Ｂ−３】
【図１７Ｂ−４】
【図１７Ｃ−１】
【図１７Ｃ−２】
【図１７Ｃ−３】
【図１７Ｃ−４】
【図１７Ｃ−５】
【図１７Ｃ−６】
【図１７Ｄ−１】
【図１７Ｄ−２】
【図１７Ｄ−３】
【図１７Ｄ−４】
【図１７Ｄ−５】
【図１７Ｄ−６】
【図１８】
【図１９Ａ−Ｃ】
【図１９Ｄ−Ｆ】
【図１９Ｇ−Ｉ】
【図１９Ｊ−１】
【図１９Ｊ−２】
【図１９Ｊ−３】
【図１９Ｊ−４】
【図１９Ｊ−５】
【図１９Ｊ−６】
【図１９Ｊ−７】
【図１９Ｊ−８】
【図１９Ｊ−９】
【図１９Ｋ−１】
【図１９Ｋ−２】
【図１９Ｋ−３】
【図１９Ｋ−４】
【図１９Ｋ−５】
【図１９Ｋ−６】
【図１９Ｋ−７】
【図１９Ｋ−８】
【図１９Ｋ−９】
【図１９Ｋ−１０】
【図１９Ｋ−１１】
【図１９Ｌ−１】
【図１９Ｌ−２】
【図１９Ｌ−３】
【図１９Ｌ−４】
【図１９Ｌ−５】
【図１９Ｌ−６】
【図２０−１】
【図２０−２】
【図２０−３】
【図２０−４】
【図２０−５】
【図２０−６】
【図２０−７】
【図２０−８】
【図２０−９】
【図２０−１０】
【図２０−１１】
【図２０−１２】
【図２０−１３】
【図２０−１４】
【図２０−１５】
【図２０−１６】
【図２０−１７】
【図２０−１８】
【図２０−１９】
【図２０−２０】
【図２０−２１】
【図２０−２２】
【図２０−２３】
【図２０−２４】
【図２０−２５】
【図２０−２６】
【図２０−２７】
【図２０−２８】
【図２０−２９】
【図２０−３０】
【図２０−３１】
【図２０−３２】
【図２０−３３】
【図２０−３４】
【図２０−３５】
【図２０−３６】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２３Ｃ】
【公表番号】特表２０１０−５０９９０９（Ｐ２０１０−５０９９０９Ａ）
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３６８２５（Ｐ２００９−５３６８２５）
【出願日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００４６２９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３７５２７
【国際公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５０６００５１５６）ジェントロン リミテッド ライアビリティー カンパニー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００４６２９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３７５２７
【国際公開日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【出願人】（５０６００５１５６）ジェントロン リミテッド ライアビリティー カンパニー (2)
【Ｆターム（参考）】
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