癌診断用抗体
【課題】転移性疾患の検出及び診断のための方法及びキットを提供する。
【解決手段】細胞集団内の転移性又は潜在的転移性細胞の存在のin vitro検出方法であって、以下の(a)細胞を、(i)細胞膜チロシンキナーゼ、エフリン（Eph）A2に特異的に結合可能な試薬；又は(ii)EphA2タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸と特異的に結合可能な試薬とインキュベートして、該試薬とEphA2又は該核酸とを結合させ、(b)EphA2又は該核酸と結合する試薬を検出する、ただし試薬の結合は細胞集団内の転移性又は潜在的転移性細胞の存在を示すものとする、ステップを含む上記検出方法。および、EphA2の細胞内エピトープに特異的に結合する抗体。
【解決手段】細胞集団内の転移性又は潜在的転移性細胞の存在のin vitro検出方法であって、以下の(a)細胞を、(i)細胞膜チロシンキナーゼ、エフリン（Eph）A2に特異的に結合可能な試薬；又は(ii)EphA2タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸と特異的に結合可能な試薬とインキュベートして、該試薬とEphA2又は該核酸とを結合させ、(b)EphA2又は該核酸と結合する試薬を検出する、ただし試薬の結合は細胞集団内の転移性又は潜在的転移性細胞の存在を示すものとする、ステップを含む上記検出方法。および、EphA2の細胞内エピトープに特異的に結合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転移性疾患の診断に関する。より特に、本願発明は、転移性癌細胞内に過剰発現される特定の上皮細胞チロシン・キナーゼを検出しうる試薬に関する。最も特に、本願発明は、上皮細胞チロシン・キナーゼの細胞内エピトープに結合する試薬、及び癌診断へのそれら試薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞の転移は、１）原発腫瘍から分離し、２）局所組織中を遊走及び浸潤し、３）（リンパ液又は血液を介して）体内の遠位に場所を移し、４）異質な部位にコロニー形成し、そして５）この異質な環境の中で増幅及び生き残る、細胞の能力を必要とする。これらの性質の全てが細胞接着に関係している。細胞接着は、細胞とその微小環境との物理的相互作用を制御する。細胞接着は、腫瘍細胞の増殖、死、及び分化を命令するシグナルをも惹起する。
【０００３】
乳癌細胞を含む、さまざまな癌細胞は、変更された細胞接着を示すことが知られている。正常乳房上皮と比較して、形質転換ヒト乳房上皮細胞は、細胞−細胞接触が減少し、そして周囲の細胞外マトリックスとの相互作用が増加している。これらの変化は、細胞コロニーを離れた癌細胞の分離及び遊走の増加を促進し、そして細胞膜タンパク質のチロシン・リン酸化における変化に直接関係している。チロシン・リン酸化は、細胞シグナル伝達の有効な形態であり、そしてチロシン・リン酸化のレベルの変化は腫瘍細胞の侵襲力にとって重要であると考えられている。したがって、チロシン・リン酸化の制御は、転移性癌に対する治療処置に関する前途有望な標的を提示する。チロシン・リン酸化は、細胞膜チロシン・キナーゼにより制御され、そしてチロシン・キナーゼの発現増加は転移性癌細胞において発生することが知られている。
【０００４】
細胞膜チロシン・キナーゼ発現増加の同定は、転移性疾患の診断及び治療の助けとなるであろう。こうしたチロシン・キナーゼの１つがＥｐｈＡ２である。エフリン（Ｅｐｈｒｉｎｓ）として知られるチロシン・キナーゼのＥｐｈファミリーの仲間であるＥｐｈＡ２は、細胞結合リガンドをもつ膜貫通受容体チロシン・キナーゼである。１０年前にクローニングされたが（非特許文献１を参照のこと）、ＥｐｈＡ２の機能についてごくわずかしか知られていない、なぜなら主としてＥｐｈＡ２特異的抗体が以前は製造することが困難であったからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lindberg, R.A. and Hunter, T.,“cDNA Cloning and Characterization of Eck, an Epithelial Cell Receptor Protein-tyrosine Kinase in the Eph/elk Family of Protein Kinases”, Mol.Cell.Biol. 10 (12), 6316-6324 (1990)
【発明の開示】
【０００６】
ＥｐｈＡ２研究を容易にするために、チロシン・リン酸化したタンパク質に特異的なモノクローナル抗体の一団を製造する改良された方法を開発した。この方法の使用により、ＥｐｈＡ２の多様性を認識するモノクローナル抗体を作製した。これらの抗体を用いて、ＥｐｈＡ２が転移性乳房、肺、大腸、及び前立腺細胞において過剰発現していることが示された。ＥｐｈＡ２が正常細胞と転移性細胞では異って発現されるため、ＥｐｈＡ２特異的抗体は、転移性疾患の診断に有効である。１の特定のハイブリドーマより製造された抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープを認識し、ＥｐｈＡ２に対する結合において高い特異性を示した。
【０００７】
したがって、本願発明の１の側面は、ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに特異的に結合する化合物である。好ましい態様において、前記化合物は、ＥｐｈＡ２タンパク質のドメインに特異的な抗体である。他方において、ＥｐｈＡ２を特異的に標的化しうる天然又は人工的なリガンド、ペプチド、アンチセンス、ＡＴＰ類似物、若しくは他の低分子が利用されうる。本願発明の２の側面は、ＥｐｈＡ２細胞内エピトープを認識する抗体の製法である。本願発明の他の側面は、転移性疾患の診断におけるＥｐｈＡ２特異的抗体の使用である。本願発明の付加的な側面は、ＥｐｈＡ２、その断片のいずれか又はＥｐｈＡ２タンパク質をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡを検出するための特異的な診断用試薬である。本願発明のさらなる側面は、ＥｐｈＡ２のエピトープに特異的に結合しうる抗体及び抗体−ＥｐｈＡ２結合を検出するための手段を含むキットである。
【０００８】
本発明のさらなる特徴は、目下わかっているところの本発明実施のベスト・モードを具体化する以下の好ましい態様の詳細な記載を考慮して、当業者に対して明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、ヒト前立腺細胞から得られた細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示す一連のウエスタン・ブロットを示す。図１Ａは、さまざまなヒト前立腺癌細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示すウエスタン・ブロットである；図１Ｂは、ヒト前立腺上皮細胞株ＭＬＣにおけるＥｐｈＡ２発現及び癌遺伝子Ｋ−Ｒａｓ又はＸ線照射による形質転換後の上記細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示すウエスタン・ブロットである；図１Ｃは、ヒト前立腺上皮細胞株２６７Ｂ１における発現及び癌遺伝子Ｋ−Ｒａｓ又はＸ線照射による形質転換後の上記細胞株における発現を示すことを除いて、図１Ｂと類似している。
【図２】図２は、さまざまなヒト乳房上皮細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示すウエスタン・ブロットである。
【図３】図３Ａ及びＢは、免疫蛍光発光の顕微鏡検査により観察された、さまざまな乳房上皮細胞株の細胞膜におけるＥｐｈＡ２の局在を示す。図３Ａは、正常なＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞接着部位におけるＥｐｈＡ２の局在を示す；図３Ｂは、悪性細胞におけるＥｐｈＡ２の再分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ＥｐｈＡ２に特異的な抗体は、改良された方法により単離した。使用した方法は、応答性ハイブリドーマの感受性及び多様性を向上させるために設計されている。この方法により、Ｒａｓ形質転換ヒト上皮細胞からのチロシン・リン酸化タンパク質が既存のリン酸化チロシン特異的抗体を用いたアフィニティー・クロマトグラフィーにより単離される。そのチロシン・リン酸化タンパク質は、次にモノクローナル抗体製造のための免疫原として使用される。低用量のチロシン・リン酸化タンパク質を、１日おきに１０日間にわたりリンパ節近位に注射する（ＲＩＭＭＳ法）。はれた（engorged）リンパ節からのＢ細胞をその後単離し、そしてＢｃｌ−２過剰発現ミエローマと融合し、融合後のアポトーシスを最小限に抑える。この方法は、ハイブリドーマ製造の多様性、特異性、及び費用効率の増加をもたらす。ハイブリドーマは、通常の癌細胞と悪性の癌細胞を区別しうる抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにまずスクリーニングされる。現在まで、少なくとも４５０株のこうしたハイブリドーマを同定した。
【００１１】
ＥｐｈＡ２に特異的なハイブリドーマを選択した。ＲＩＭＭＳ法の使用によって、ＥｐｈＡ２に特異的に結合するさまざまなモノクローナル抗体の作製に到った。性状解析した最初の４つのハイブリドーマのうち、２つがＥｐｈＡ２上の独立したエピトープを認識する。１つ目のＤ７は、細胞内エピトープを認識する。２つ目のＢ２Ｄ６は、細胞外エピトープに結合する。Ｄ７はＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに高度に特異的であることが判明し、この特異性は、転移性腫瘍の診断に最新の基礎の多くを提供する。
【００１２】
特定のタンパク質の存在又は過剰発現を検出するために抗体を使用することは本技術分野で知られる。ＥｐｈＡ２は転移性細胞において過剰発現されるため、本発明のＥｐｈＡ２特異的抗体を、この過剰発現の検出に使用し、そして、それにより転移性疾患を検出しうる。こうした技術は、制限されるものではないが、さまざまな組織又は体液におけるウエスタン・ブロッティング、ドット・ブロッティング、沈殿、凝集、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫組織化学、インサイチュー・ハイブリダイゼーション、フロー・サイトメトリー、及びさまざまなサンドイッチ・アッセイを含む。これらの技術は、本技術分野で周知である。例えば米国特許第５，８７６，９４９号（本明細書に援用）を参照のこと。ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに特異的な抗体を使用する場合は、細胞を溶解し、そしてその抗体と一緒にインキュベートする必要がある。上述の技術は全細胞溶解物に対して行っても良く、又はＥｐｈＡ２の試験のために例えば免疫沈殿により分離しても良い。本願発明のＤ７抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに対して高度に特異的であり、そして転移性細胞におけるＥｐｈＡ２の特異な発現に感受性であることが判明した。他の技術、例えば免疫組織学的染色は、細胞全体を必要とし、そして特定の細胞密度の細胞層をさらに必要とし得る。こうした試験は、ＥｐｈＡ２の細胞外エピトープに特異的な抗体を必要とする。
【００１３】
本願発明の抗体は、広くさまざまな組織サンプルにおいて転移性疾患を検出するために使用されうる。例えば、ＥｐｈＡ２特異的抗体を用いた調査によって、乳房、腎臓、前立腺、肺、及び大腸において変更されたＥｐｈＡ２発現が生じることが明らかになっており、また変更されたＥｐｈＡ２発現は他の種類の細胞転移、特に上皮悪性腫瘍において生じると考えられている。ＥｐｈＡ２特異的抗体は、生検により採取された腫瘍組織における転移の検出に使用されうる。さまざまな体液のサンプル、例えば血液、血漿、髄液、唾液、及び尿も本発明の抗体により検査されうる。これらのサンプル中の変更されたＥｐｈＡ２発現は、転移性疾患の存在を示す。
【００１４】
さらに、他の抗体が、転移性疾患の状態についてさらなる情報を提供するために本発明の抗体と組み合わせて使用されうる。例えば転移性細胞のＥｐｈＡ２は、変更されたチロシン・リン酸化を示す。正常な乳房上皮細胞において、ＥｐｈＡ２は発現され、そしてチロシン・リン酸化されている。しかしながら、転移性乳房上皮細胞において、ＥｐｈＡ２は過剰発現され、そしてそのＥｐｈＡ２はチロシン・リン酸化されていない。ＥｐｈＡ２発現を定量化する検査は時にあいまいな結果を導くために、ＥｐｈＡ２発現の規模と同様にチロシン・リン酸化を測定することが望ましい。要するに、本願発明の抗体をリン酸化チロシン特異的抗体と組み合わせて用いる診断方法は、転移性疾患の状態を決定するためのデータを提供する。
【００１５】
その上、本願発明のＥｐｈＡ２特異的抗体は、転移と関連するＥｐｈＡ２局在性の変化を検出するために利用されうる。正常な乳房及び前立腺上皮細胞において、ＥｐｈＡ２は細胞接着部位に濃縮される。逆に、転移性前立腺細胞において、ＥｐｈＡ２は拡散性に分布し、そして転移性乳癌細胞において、ＥｐｈＡ２は膜のひだに再分布する。免疫組織学的染色又は免疫蛍光顕微鏡検査等の技術は、本技術分野で周知であり、ＥｐｈＡ２分布を視覚化するために使用されうる。例えば米国特許第５，５１４，５５４号（本明細書に援用）を参照のこと。ＥｐｈＡ２発現は、ＥｐｈＡ２全体又はＥｐｈＡ２タンパク質の断片を検出しうる抗体を使用することにより検出されうる。変更されたＥｐｈＡ２発現の他の検出方法は、ＥｐｈＡ２タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列の検出を含む。
【００１６】
ＥｐｈＡ２の過剰発現又は変更された分布を検出するために、ＥｐｈＡ２特異的抗体は、たくさんの知られた検出可能な標識、すなわち本願技術分野で知られるような蛍光、放射性又は酵素物質のいずれかにより、共有結合的又は非共有結合的に標識されうる。あるいは、本願発明の抗体に特異的な２次抗体を、公知の検出可能な標識により標識し、そして上記技術においてＥｐｈＡ２特異的抗体を検出するために使用する。
【００１７】
好ましい標識はクロモゲン色素を含む。最も一般的に使用されているものは、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）及び３，３′−ジアミノベンジジン・テトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）である。これらは光学顕微鏡検査を用いて検出されうる。さらに好ましくは蛍光標識である。最も一般的に使用されている蛍光標識化合物は、フルオレッセイン・イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、及びフルオレスカミンである。化学発光及び生物発光化合物、例えばルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム・エステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンも使用されうる。蛍光標識抗体が適切な波長の光に晒されると、その存在は蛍光により検出されうる。さらに好ましくは放射性標識である。本発明の抗体の標識に特に有用な放射性同位体は、 3Ｈ， 125Ｉ， 131Ｉ，35Ｓ，32Ｐ、及び14Ｃを含む。放射性同位体はガンマ・カウンター、シンチレーション・カウンター又はオートラジオグラフィーを用いるような方法により検出されうる。
【００１８】
抗体を検出できるように標識しうる他の方法は、抗体を酵素に連結し、引き続いてその抗体を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）又は酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に使用することによる。その酵素は、次にその基質に触れたとき、その基質と反応し、そして、例えば分光光度的、蛍光光度的又は視覚的方法により検出されうる化学成分を生じる。抗体を検出可能な状態に標識するために使用されうる酵素は、制限されるものではないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド・イソメラーゼ、酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオース・リン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼを含む。抗体を標識及び検出する他の方法は、本技術分野で知られ、そして本願発明の範囲の中にある。
【実施例】
【００１９】
実施例１
Ｄ７ハイブリドーマにより産生された抗体を、正常な前立腺上皮細胞と転移性細胞の間のＥｐｈＡ２発現の差異を検出するために使用した。図１は、さまざまなヒト前立腺細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示す。まず図１Ａに触れると、３つの転移性細胞株、ＬＮＣＡＰ，ＤＵ１４５、及びＰＣ３をＥｐｈＡ２発現のレベルについて試験する。これら３つの細胞株について、ＬＮＣＡＰは侵襲性が最も少なく、ＤＵ１４５はいくらかより侵襲性であり、そしてＰＣ３は最も侵襲性であることが知られている。ＥｐｈＡ２発現を、Ｄ７抗体によるウエスタン・ブロッティングによって測定する。図１Ａで理解されうるように、ＥｐｈＡ２発現は、侵襲性と正に相関する。
【００２０】
図１Ｂにおいて、Ｄ７抗体を、形質転換細胞における発現と比較した、正常ＭＬＣ細胞におけるＥｐｈＡ２発現の試験に使用する。正常ＭＬＣ細胞、Ｋ−Ｒａｓにより形質転換されたＭＬＣ細胞、及びＸ線照射により形質転換されたＭＬＣ細胞を試験した。図１Ｂで理解されうるように、ＥｐｈＡ２は、両形質転換細胞株において過剰発現されている。図１Ｃは、正常細胞株が２６７Ｂ１であることを除いて、図１Ｂに類似した結果を示す。図１Ｂと同様に、図１Ｃは、ＥｐｈＡ２が形質転換細胞において過剰発現されていることを示す。つまり図１は、ＥｐｈＡ２特異的抗体が転移性細胞における変化を検出し、そしてそれらの抗体を用いた試験が転移の侵襲性のレベルを示すことを証明する。
【００２１】
実施例２
ＥｐｈＡ２抗体を、転移性乳房細胞における変更されたＥｐｈＡ２発現を検出するために使用する。ＥｐｈＡ２は正常乳房上皮細胞において発現される。図２は、乳癌細胞株における変更されたＥｐｈＡ２発現を説明する。図２で理解されるように、Ｄ７抗体を用いた全細胞溶解物からのウエスタン・ブロットによって、非転移性乳房腫瘍から得られた細胞（ＺＲ７５−１，ＢＴ４７４，ＳＫＢＲ３）においてＥｐｈＡ２発現が全く存在しないことが明らかである。それに反して、ＥｐｈＡ２は、転移性乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において過剰発現されている。したがってＥｐｈＡ２抗体は、乳癌細胞における変更されたＥｐｈＡ２発現を検出し、これは転移の診断に使用しうる。さらに、非転移性乳房上皮細胞において、ＥｐｈＡ２の欠損が疾患の早期に発生し、そのため、他の知られたマーカーが正常である場合でも、ＥｐｈＡ２特異的抗体による検査によって、侵襲性に関する情報が提供される。したがって、Ｄ７抗体は、疾患の早期段階であっても、診断薬として有効である。
【００２２】
実施例３
ＥｐｈＡ２抗体は、他の抗体と組合わせて、ＥｐｈＡ２発現におけるさらなる変化の検出に使用される。実施例２において先に述べたとおり、Ｄ７を用いたウエスタン・ブロットは、非転移性腫瘍がＥｐｈＡ２の発現を欠き、そして転移性細胞がＥｐｈＡ２を過剰発現していることにより、非転移性と転移性腫瘍を識別しうる。しかしながら、チロシン・リン酸化を調べると、異なる結果が見出された。リン酸化チロシン特異的抗体を用いることで、ＥｐｈＡ２は正常細胞においてリン酸化されているが、しかし転移性細胞ではリン酸化されていないことが発見された。したがって、ＥｐｈＡ２特異的抗体が転移性と非転移性乳房腫瘍細胞の差異を質的に検出できるのに対して、ＥｐｈＡ２特異的抗体及びリン酸化チロシン特異的抗体の両方を組込んだ診断薬は、正常、非転移性、及び転移性乳房細胞を識別するための高感度の検査を提供する。
【００２３】
実施例４
免疫蛍光標識されたＥｐｈＡ２特異的抗体は、形質転換細胞におけるＥｐｈＡ２発現の再分布を検出する。この実施例で使用したＥｐｈＡ２特異的抗体は、Ｂ２Ｄ６として知られる細胞株により産生され、そしてこれらの抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞外エピトープに特異的である。図３Ａで見られるように、Ｂ２Ｄ６による免疫蛍光発光は、ＥｐｈＡ２が正常細胞において細胞−細胞接触部位に見出されることを証明する。しかしながら、図３Ｂに示される形質転換細胞においては、ＥｐｈＡ２は、再分布されている。さらに、転移性細胞において、ＥｐｈＡ２は、膜のひだに見出される。同様に、正常な前立腺上皮細胞において、ＥｐｈＡ２は細胞−細胞接着部位に見出されるが、しかし転移性前立腺上皮細胞において、ＥｐｈＡ２は過剰発現され、その発現は拡散性に分布している。したがって、ＥｐｈＡ２特異的抗体を用いた免疫蛍光発光は、形質転換及び腫瘍細胞の転移の状態を診断するためのさらなる方法を提供する。
【００２４】
実施例１〜４に示すとおり、転移性細胞におけるＥｐｈＡ２の過剰発現、再分布、及びリン酸化は、ＥｐｈＡ２特異的抗体を用いた、転移性腫瘍の診断のためのさまざまな基礎を提供する。免疫組織化学又はウエスタン・ブロッティングは、患者の乳房組織、前立腺組織又は他の腫瘍からの組織の生検サンプルにおけるＥｐｈＡ２発現の変化を観察するために使用されうる。さらに、Ｄ７及び他のＥｐｈＡ２特異的抗体は、転移性の徴候であろうところの、ＥｐｈＡ２の変更された発現を検出するために、血漿、尿、及び他の体液の測定に使用されうる。ＥｐｈＡ２の変更されたチロシン・リン酸化の検出は、ＥｐｈＡ２発現の変化に関する情報と組合わせて、転移性疾患の診断をさらに助ける。
【００２５】
本発明は、好ましい態様に対する言及によって詳細に記載されているが、そのバリエーション及び変更は特許請求の範囲に記載され、そして定められた本発明の範囲及び精神の中に存在する。
【受託番号】
【００２６】
ＰＴＡ ２７５４
ＰＴＡ ２７５５
【表１】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転移性疾患の診断に関する。より特に、本願発明は、転移性癌細胞内に過剰発現される特定の上皮細胞チロシン・キナーゼを検出しうる試薬に関する。最も特に、本願発明は、上皮細胞チロシン・キナーゼの細胞内エピトープに結合する試薬、及び癌診断へのそれら試薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞の転移は、１）原発腫瘍から分離し、２）局所組織中を遊走及び浸潤し、３）（リンパ液又は血液を介して）体内の遠位に場所を移し、４）異質な部位にコロニー形成し、そして５）この異質な環境の中で増幅及び生き残る、細胞の能力を必要とする。これらの性質の全てが細胞接着に関係している。細胞接着は、細胞とその微小環境との物理的相互作用を制御する。細胞接着は、腫瘍細胞の増殖、死、及び分化を命令するシグナルをも惹起する。
【０００３】
乳癌細胞を含む、さまざまな癌細胞は、変更された細胞接着を示すことが知られている。正常乳房上皮と比較して、形質転換ヒト乳房上皮細胞は、細胞−細胞接触が減少し、そして周囲の細胞外マトリックスとの相互作用が増加している。これらの変化は、細胞コロニーを離れた癌細胞の分離及び遊走の増加を促進し、そして細胞膜タンパク質のチロシン・リン酸化における変化に直接関係している。チロシン・リン酸化は、細胞シグナル伝達の有効な形態であり、そしてチロシン・リン酸化のレベルの変化は腫瘍細胞の侵襲力にとって重要であると考えられている。したがって、チロシン・リン酸化の制御は、転移性癌に対する治療処置に関する前途有望な標的を提示する。チロシン・リン酸化は、細胞膜チロシン・キナーゼにより制御され、そしてチロシン・キナーゼの発現増加は転移性癌細胞において発生することが知られている。
【０００４】
細胞膜チロシン・キナーゼ発現増加の同定は、転移性疾患の診断及び治療の助けとなるであろう。こうしたチロシン・キナーゼの１つがＥｐｈＡ２である。エフリン（Ｅｐｈｒｉｎｓ）として知られるチロシン・キナーゼのＥｐｈファミリーの仲間であるＥｐｈＡ２は、細胞結合リガンドをもつ膜貫通受容体チロシン・キナーゼである。１０年前にクローニングされたが（非特許文献１を参照のこと）、ＥｐｈＡ２の機能についてごくわずかしか知られていない、なぜなら主としてＥｐｈＡ２特異的抗体が以前は製造することが困難であったからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lindberg, R.A. and Hunter, T.,“cDNA Cloning and Characterization of Eck, an Epithelial Cell Receptor Protein-tyrosine Kinase in the Eph/elk Family of Protein Kinases”, Mol.Cell.Biol. 10 (12), 6316-6324 (1990)
【発明の開示】
【０００６】
ＥｐｈＡ２研究を容易にするために、チロシン・リン酸化したタンパク質に特異的なモノクローナル抗体の一団を製造する改良された方法を開発した。この方法の使用により、ＥｐｈＡ２の多様性を認識するモノクローナル抗体を作製した。これらの抗体を用いて、ＥｐｈＡ２が転移性乳房、肺、大腸、及び前立腺細胞において過剰発現していることが示された。ＥｐｈＡ２が正常細胞と転移性細胞では異って発現されるため、ＥｐｈＡ２特異的抗体は、転移性疾患の診断に有効である。１の特定のハイブリドーマより製造された抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープを認識し、ＥｐｈＡ２に対する結合において高い特異性を示した。
【０００７】
したがって、本願発明の１の側面は、ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに特異的に結合する化合物である。好ましい態様において、前記化合物は、ＥｐｈＡ２タンパク質のドメインに特異的な抗体である。他方において、ＥｐｈＡ２を特異的に標的化しうる天然又は人工的なリガンド、ペプチド、アンチセンス、ＡＴＰ類似物、若しくは他の低分子が利用されうる。本願発明の２の側面は、ＥｐｈＡ２細胞内エピトープを認識する抗体の製法である。本願発明の他の側面は、転移性疾患の診断におけるＥｐｈＡ２特異的抗体の使用である。本願発明の付加的な側面は、ＥｐｈＡ２、その断片のいずれか又はＥｐｈＡ２タンパク質をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡを検出するための特異的な診断用試薬である。本願発明のさらなる側面は、ＥｐｈＡ２のエピトープに特異的に結合しうる抗体及び抗体−ＥｐｈＡ２結合を検出するための手段を含むキットである。
【０００８】
本発明のさらなる特徴は、目下わかっているところの本発明実施のベスト・モードを具体化する以下の好ましい態様の詳細な記載を考慮して、当業者に対して明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、ヒト前立腺細胞から得られた細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示す一連のウエスタン・ブロットを示す。図１Ａは、さまざまなヒト前立腺癌細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示すウエスタン・ブロットである；図１Ｂは、ヒト前立腺上皮細胞株ＭＬＣにおけるＥｐｈＡ２発現及び癌遺伝子Ｋ−Ｒａｓ又はＸ線照射による形質転換後の上記細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示すウエスタン・ブロットである；図１Ｃは、ヒト前立腺上皮細胞株２６７Ｂ１における発現及び癌遺伝子Ｋ−Ｒａｓ又はＸ線照射による形質転換後の上記細胞株における発現を示すことを除いて、図１Ｂと類似している。
【図２】図２は、さまざまなヒト乳房上皮細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示すウエスタン・ブロットである。
【図３】図３Ａ及びＢは、免疫蛍光発光の顕微鏡検査により観察された、さまざまな乳房上皮細胞株の細胞膜におけるＥｐｈＡ２の局在を示す。図３Ａは、正常なＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞接着部位におけるＥｐｈＡ２の局在を示す；図３Ｂは、悪性細胞におけるＥｐｈＡ２の再分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ＥｐｈＡ２に特異的な抗体は、改良された方法により単離した。使用した方法は、応答性ハイブリドーマの感受性及び多様性を向上させるために設計されている。この方法により、Ｒａｓ形質転換ヒト上皮細胞からのチロシン・リン酸化タンパク質が既存のリン酸化チロシン特異的抗体を用いたアフィニティー・クロマトグラフィーにより単離される。そのチロシン・リン酸化タンパク質は、次にモノクローナル抗体製造のための免疫原として使用される。低用量のチロシン・リン酸化タンパク質を、１日おきに１０日間にわたりリンパ節近位に注射する（ＲＩＭＭＳ法）。はれた（engorged）リンパ節からのＢ細胞をその後単離し、そしてＢｃｌ−２過剰発現ミエローマと融合し、融合後のアポトーシスを最小限に抑える。この方法は、ハイブリドーマ製造の多様性、特異性、及び費用効率の増加をもたらす。ハイブリドーマは、通常の癌細胞と悪性の癌細胞を区別しうる抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにまずスクリーニングされる。現在まで、少なくとも４５０株のこうしたハイブリドーマを同定した。
【００１１】
ＥｐｈＡ２に特異的なハイブリドーマを選択した。ＲＩＭＭＳ法の使用によって、ＥｐｈＡ２に特異的に結合するさまざまなモノクローナル抗体の作製に到った。性状解析した最初の４つのハイブリドーマのうち、２つがＥｐｈＡ２上の独立したエピトープを認識する。１つ目のＤ７は、細胞内エピトープを認識する。２つ目のＢ２Ｄ６は、細胞外エピトープに結合する。Ｄ７はＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに高度に特異的であることが判明し、この特異性は、転移性腫瘍の診断に最新の基礎の多くを提供する。
【００１２】
特定のタンパク質の存在又は過剰発現を検出するために抗体を使用することは本技術分野で知られる。ＥｐｈＡ２は転移性細胞において過剰発現されるため、本発明のＥｐｈＡ２特異的抗体を、この過剰発現の検出に使用し、そして、それにより転移性疾患を検出しうる。こうした技術は、制限されるものではないが、さまざまな組織又は体液におけるウエスタン・ブロッティング、ドット・ブロッティング、沈殿、凝集、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫組織化学、インサイチュー・ハイブリダイゼーション、フロー・サイトメトリー、及びさまざまなサンドイッチ・アッセイを含む。これらの技術は、本技術分野で周知である。例えば米国特許第５，８７６，９４９号（本明細書に援用）を参照のこと。ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに特異的な抗体を使用する場合は、細胞を溶解し、そしてその抗体と一緒にインキュベートする必要がある。上述の技術は全細胞溶解物に対して行っても良く、又はＥｐｈＡ２の試験のために例えば免疫沈殿により分離しても良い。本願発明のＤ７抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞内エピトープに対して高度に特異的であり、そして転移性細胞におけるＥｐｈＡ２の特異な発現に感受性であることが判明した。他の技術、例えば免疫組織学的染色は、細胞全体を必要とし、そして特定の細胞密度の細胞層をさらに必要とし得る。こうした試験は、ＥｐｈＡ２の細胞外エピトープに特異的な抗体を必要とする。
【００１３】
本願発明の抗体は、広くさまざまな組織サンプルにおいて転移性疾患を検出するために使用されうる。例えば、ＥｐｈＡ２特異的抗体を用いた調査によって、乳房、腎臓、前立腺、肺、及び大腸において変更されたＥｐｈＡ２発現が生じることが明らかになっており、また変更されたＥｐｈＡ２発現は他の種類の細胞転移、特に上皮悪性腫瘍において生じると考えられている。ＥｐｈＡ２特異的抗体は、生検により採取された腫瘍組織における転移の検出に使用されうる。さまざまな体液のサンプル、例えば血液、血漿、髄液、唾液、及び尿も本発明の抗体により検査されうる。これらのサンプル中の変更されたＥｐｈＡ２発現は、転移性疾患の存在を示す。
【００１４】
さらに、他の抗体が、転移性疾患の状態についてさらなる情報を提供するために本発明の抗体と組み合わせて使用されうる。例えば転移性細胞のＥｐｈＡ２は、変更されたチロシン・リン酸化を示す。正常な乳房上皮細胞において、ＥｐｈＡ２は発現され、そしてチロシン・リン酸化されている。しかしながら、転移性乳房上皮細胞において、ＥｐｈＡ２は過剰発現され、そしてそのＥｐｈＡ２はチロシン・リン酸化されていない。ＥｐｈＡ２発現を定量化する検査は時にあいまいな結果を導くために、ＥｐｈＡ２発現の規模と同様にチロシン・リン酸化を測定することが望ましい。要するに、本願発明の抗体をリン酸化チロシン特異的抗体と組み合わせて用いる診断方法は、転移性疾患の状態を決定するためのデータを提供する。
【００１５】
その上、本願発明のＥｐｈＡ２特異的抗体は、転移と関連するＥｐｈＡ２局在性の変化を検出するために利用されうる。正常な乳房及び前立腺上皮細胞において、ＥｐｈＡ２は細胞接着部位に濃縮される。逆に、転移性前立腺細胞において、ＥｐｈＡ２は拡散性に分布し、そして転移性乳癌細胞において、ＥｐｈＡ２は膜のひだに再分布する。免疫組織学的染色又は免疫蛍光顕微鏡検査等の技術は、本技術分野で周知であり、ＥｐｈＡ２分布を視覚化するために使用されうる。例えば米国特許第５，５１４，５５４号（本明細書に援用）を参照のこと。ＥｐｈＡ２発現は、ＥｐｈＡ２全体又はＥｐｈＡ２タンパク質の断片を検出しうる抗体を使用することにより検出されうる。変更されたＥｐｈＡ２発現の他の検出方法は、ＥｐｈＡ２タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列の検出を含む。
【００１６】
ＥｐｈＡ２の過剰発現又は変更された分布を検出するために、ＥｐｈＡ２特異的抗体は、たくさんの知られた検出可能な標識、すなわち本願技術分野で知られるような蛍光、放射性又は酵素物質のいずれかにより、共有結合的又は非共有結合的に標識されうる。あるいは、本願発明の抗体に特異的な２次抗体を、公知の検出可能な標識により標識し、そして上記技術においてＥｐｈＡ２特異的抗体を検出するために使用する。
【００１７】
好ましい標識はクロモゲン色素を含む。最も一般的に使用されているものは、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）及び３，３′−ジアミノベンジジン・テトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）である。これらは光学顕微鏡検査を用いて検出されうる。さらに好ましくは蛍光標識である。最も一般的に使用されている蛍光標識化合物は、フルオレッセイン・イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、及びフルオレスカミンである。化学発光及び生物発光化合物、例えばルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム・エステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンも使用されうる。蛍光標識抗体が適切な波長の光に晒されると、その存在は蛍光により検出されうる。さらに好ましくは放射性標識である。本発明の抗体の標識に特に有用な放射性同位体は、 3Ｈ， 125Ｉ， 131Ｉ，35Ｓ，32Ｐ、及び14Ｃを含む。放射性同位体はガンマ・カウンター、シンチレーション・カウンター又はオートラジオグラフィーを用いるような方法により検出されうる。
【００１８】
抗体を検出できるように標識しうる他の方法は、抗体を酵素に連結し、引き続いてその抗体を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）又は酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）に使用することによる。その酵素は、次にその基質に触れたとき、その基質と反応し、そして、例えば分光光度的、蛍光光度的又は視覚的方法により検出されうる化学成分を生じる。抗体を検出可能な状態に標識するために使用されうる酵素は、制限されるものではないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド・イソメラーゼ、酵母アルコール・デヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオース・リン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼを含む。抗体を標識及び検出する他の方法は、本技術分野で知られ、そして本願発明の範囲の中にある。
【実施例】
【００１９】
実施例１
Ｄ７ハイブリドーマにより産生された抗体を、正常な前立腺上皮細胞と転移性細胞の間のＥｐｈＡ２発現の差異を検出するために使用した。図１は、さまざまなヒト前立腺細胞株におけるＥｐｈＡ２発現を示す。まず図１Ａに触れると、３つの転移性細胞株、ＬＮＣＡＰ，ＤＵ１４５、及びＰＣ３をＥｐｈＡ２発現のレベルについて試験する。これら３つの細胞株について、ＬＮＣＡＰは侵襲性が最も少なく、ＤＵ１４５はいくらかより侵襲性であり、そしてＰＣ３は最も侵襲性であることが知られている。ＥｐｈＡ２発現を、Ｄ７抗体によるウエスタン・ブロッティングによって測定する。図１Ａで理解されうるように、ＥｐｈＡ２発現は、侵襲性と正に相関する。
【００２０】
図１Ｂにおいて、Ｄ７抗体を、形質転換細胞における発現と比較した、正常ＭＬＣ細胞におけるＥｐｈＡ２発現の試験に使用する。正常ＭＬＣ細胞、Ｋ−Ｒａｓにより形質転換されたＭＬＣ細胞、及びＸ線照射により形質転換されたＭＬＣ細胞を試験した。図１Ｂで理解されうるように、ＥｐｈＡ２は、両形質転換細胞株において過剰発現されている。図１Ｃは、正常細胞株が２６７Ｂ１であることを除いて、図１Ｂに類似した結果を示す。図１Ｂと同様に、図１Ｃは、ＥｐｈＡ２が形質転換細胞において過剰発現されていることを示す。つまり図１は、ＥｐｈＡ２特異的抗体が転移性細胞における変化を検出し、そしてそれらの抗体を用いた試験が転移の侵襲性のレベルを示すことを証明する。
【００２１】
実施例２
ＥｐｈＡ２抗体を、転移性乳房細胞における変更されたＥｐｈＡ２発現を検出するために使用する。ＥｐｈＡ２は正常乳房上皮細胞において発現される。図２は、乳癌細胞株における変更されたＥｐｈＡ２発現を説明する。図２で理解されるように、Ｄ７抗体を用いた全細胞溶解物からのウエスタン・ブロットによって、非転移性乳房腫瘍から得られた細胞（ＺＲ７５−１，ＢＴ４７４，ＳＫＢＲ３）においてＥｐｈＡ２発現が全く存在しないことが明らかである。それに反して、ＥｐｈＡ２は、転移性乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において過剰発現されている。したがってＥｐｈＡ２抗体は、乳癌細胞における変更されたＥｐｈＡ２発現を検出し、これは転移の診断に使用しうる。さらに、非転移性乳房上皮細胞において、ＥｐｈＡ２の欠損が疾患の早期に発生し、そのため、他の知られたマーカーが正常である場合でも、ＥｐｈＡ２特異的抗体による検査によって、侵襲性に関する情報が提供される。したがって、Ｄ７抗体は、疾患の早期段階であっても、診断薬として有効である。
【００２２】
実施例３
ＥｐｈＡ２抗体は、他の抗体と組合わせて、ＥｐｈＡ２発現におけるさらなる変化の検出に使用される。実施例２において先に述べたとおり、Ｄ７を用いたウエスタン・ブロットは、非転移性腫瘍がＥｐｈＡ２の発現を欠き、そして転移性細胞がＥｐｈＡ２を過剰発現していることにより、非転移性と転移性腫瘍を識別しうる。しかしながら、チロシン・リン酸化を調べると、異なる結果が見出された。リン酸化チロシン特異的抗体を用いることで、ＥｐｈＡ２は正常細胞においてリン酸化されているが、しかし転移性細胞ではリン酸化されていないことが発見された。したがって、ＥｐｈＡ２特異的抗体が転移性と非転移性乳房腫瘍細胞の差異を質的に検出できるのに対して、ＥｐｈＡ２特異的抗体及びリン酸化チロシン特異的抗体の両方を組込んだ診断薬は、正常、非転移性、及び転移性乳房細胞を識別するための高感度の検査を提供する。
【００２３】
実施例４
免疫蛍光標識されたＥｐｈＡ２特異的抗体は、形質転換細胞におけるＥｐｈＡ２発現の再分布を検出する。この実施例で使用したＥｐｈＡ２特異的抗体は、Ｂ２Ｄ６として知られる細胞株により産生され、そしてこれらの抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞外エピトープに特異的である。図３Ａで見られるように、Ｂ２Ｄ６による免疫蛍光発光は、ＥｐｈＡ２が正常細胞において細胞−細胞接触部位に見出されることを証明する。しかしながら、図３Ｂに示される形質転換細胞においては、ＥｐｈＡ２は、再分布されている。さらに、転移性細胞において、ＥｐｈＡ２は、膜のひだに見出される。同様に、正常な前立腺上皮細胞において、ＥｐｈＡ２は細胞−細胞接着部位に見出されるが、しかし転移性前立腺上皮細胞において、ＥｐｈＡ２は過剰発現され、その発現は拡散性に分布している。したがって、ＥｐｈＡ２特異的抗体を用いた免疫蛍光発光は、形質転換及び腫瘍細胞の転移の状態を診断するためのさらなる方法を提供する。
【００２４】
実施例１〜４に示すとおり、転移性細胞におけるＥｐｈＡ２の過剰発現、再分布、及びリン酸化は、ＥｐｈＡ２特異的抗体を用いた、転移性腫瘍の診断のためのさまざまな基礎を提供する。免疫組織化学又はウエスタン・ブロッティングは、患者の乳房組織、前立腺組織又は他の腫瘍からの組織の生検サンプルにおけるＥｐｈＡ２発現の変化を観察するために使用されうる。さらに、Ｄ７及び他のＥｐｈＡ２特異的抗体は、転移性の徴候であろうところの、ＥｐｈＡ２の変更された発現を検出するために、血漿、尿、及び他の体液の測定に使用されうる。ＥｐｈＡ２の変更されたチロシン・リン酸化の検出は、ＥｐｈＡ２発現の変化に関する情報と組合わせて、転移性疾患の診断をさらに助ける。
【００２５】
本発明は、好ましい態様に対する言及によって詳細に記載されているが、そのバリエーション及び変更は特許請求の範囲に記載され、そして定められた本発明の範囲及び精神の中に存在する。
【受託番号】
【００２６】
ＰＴＡ ２７５４
ＰＴＡ ２７５５
【表１】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団内の転移性又は潜在的転移性細胞の存在のin vitro検出方法であって、以下の
(a)細胞を、(i)EphA2に特異的に結合可能な試薬；又は(ii)EphA2タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸と特異的に結合可能な試薬とインキュベートして、該試薬とEphA2又は該核酸とを結合させ、
(b)EphA2又は該核酸と結合する試薬を検出する、ただし試薬の結合は細胞集団内の転移性又は潜在的転移性細胞の存在を示すものとする、
ステップを含む上記検出方法。
【請求項２】
前記試薬とのインキュベーション前に前記細胞集団の少なくとも一部を溶解することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬が抗体である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、EphA2の細胞内エピトープに特異的に結合可能である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株D7により産生される、請求項3又は4に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、EphA2の細胞外エピトープに特異的に結合可能である、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株B2D6により産生される、請求項3又は6に記載の方法。
【請求項８】
前記試薬を少なくとも1種の検出可能な標識により標識し、かつ、前記検出ステップがその標識の検出を含む、請求項3〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
検出可能な標識が、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識、クロモゲン標識、及び放射性標識からなる群から選ばれる、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出ステップがELISAアッセイ及びフロー・サイトメトリーから成る群から選ばれる診断法を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベート及び検出ステップがウエスタン・ブロッティング方法論を含む、請求項3〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
以下の
リン酸化チロシン特異性を有する2次抗体を準備し、そして
その2次抗体によりウエスタン・ブロッティングする、
ステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
試薬の結合が、全細胞を含む結合複合体を生じる、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
試薬の結合の検出が、前記結合複合体を免疫組織化学染色に供することを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
細胞をスライド上に固定するステップをさらに含み、かつ、検出ステップが免疫蛍光染色を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
細胞集団が、乳房細胞、腎臓細胞、前立腺細胞、肺細胞、及び大腸細胞から成る群から選ばれる細胞を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞集団が、上皮細胞を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞集団が、乳癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、及び大腸癌細胞から成る群から選ばれる細胞を含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞集団が、上皮癌細胞を含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記転移性又は潜在的転移性癌細胞が、乳癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、及び大腸癌細胞から成る群から選ばれる細胞を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記転移性又は潜在的転移性癌細胞が、上皮癌細胞を含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞集団が、組織生検からの細胞を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞集団が、乳房組織又は前立腺組織生検からの細胞を含む、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞集団が、体液からの細胞を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、血液、血漿、髄液、唾液、及び尿から成る群から選ばれる体液から採取される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
選ばれた細胞集団内の癌細胞の存在のin vitro検出方法であって、以下の：
相似の正常細胞集団におけるEphA2発現レベル、局在パターン、及びリン酸化量と比較される、
(i)EphA2発現レベルの変化；
(ii)EphA2局在パターンの変化；及び
(iii)EphA2リン酸化量の変化
の少なくとも1つについて選ばれた細胞集団の少なくとも一部をアッセイすること、ここで上記変化が、上記選ばれた細胞集団内の癌細胞の存在を示すものとする、
を含む上記検出方法。
【請求項２７】
EphA2の発現レベル、局在パターン又はリン酸化量の変化が、前記細胞集団内の転移性癌細胞の存在を示す、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
EphA2の発現レベルの変化が、前記細胞集団内の非転移性癌細胞の存在を示す、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
癌細胞を含む細胞集団内における疾患ステージのin vitro決定方法であって、
(a)(i)EphA2発現レベル；
(ii)EphA2局在性；及び
(iii)EphA2リン酸化量
の少なくとも1つについて細胞集団の少なくとも一部をアッセイし；そして
(b)上記癌細胞の疾患ステージを決定する、
ことを含む上記決定方法。
【請求項３０】
前記細胞集団のアッセイが、癌細胞集団の少なくとも一部をEphA2に結合可能な試薬と一緒にインキュベートして、該試薬とEphA2とを結合させ；そして試薬の結合を検出することを含む、請求項26〜29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
前記試薬が、抗体である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が、ハイブリドーマD7又はB2D6により産生される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
EphA2の細胞内エピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項３４】
モノクローナル抗体である、請求項33に記載の抗体。
【請求項３５】
検出可能な標識に結合した、請求項33又は34に記載の抗体。
【請求項３６】
ハイブリドーマ細胞株D7により産生された請求項35に記載の抗体。
【請求項３７】
EphA2の細胞内エピトープに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項３８】
モノクローナル抗体である、請求項37に記載の単離された抗体。
【請求項３９】
細胞集団内の転移性細胞の存在の検出キットであって、以下の、
(a)EphA2のエピトープに特異的に結合可能な抗体、及び
(b)抗体-エピトープ結合の検出手段
を含む、上記検出キット。
【請求項４０】
抗体-エピトープ結合の検出手段が抗体に結合させた標識である、請求項39に記載のキット。
【請求項４１】
リン酸化チロシン特異性を有する抗体をさらに含む、請求項39又は40に記載のキット。
【請求項１】
細胞集団内の転移性又は潜在的転移性細胞の存在のin vitro検出方法であって、以下の
(a)細胞を、(i)EphA2に特異的に結合可能な試薬；又は(ii)EphA2タンパク質の少なくとも一部をコードする核酸と特異的に結合可能な試薬とインキュベートして、該試薬とEphA2又は該核酸とを結合させ、
(b)EphA2又は該核酸と結合する試薬を検出する、ただし試薬の結合は細胞集団内の転移性又は潜在的転移性細胞の存在を示すものとする、
ステップを含む上記検出方法。
【請求項２】
前記試薬とのインキュベーション前に前記細胞集団の少なくとも一部を溶解することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬が抗体である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、EphA2の細胞内エピトープに特異的に結合可能である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株D7により産生される、請求項3又は4に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、EphA2の細胞外エピトープに特異的に結合可能である、請求項3に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞株B2D6により産生される、請求項3又は6に記載の方法。
【請求項８】
前記試薬を少なくとも1種の検出可能な標識により標識し、かつ、前記検出ステップがその標識の検出を含む、請求項3〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
検出可能な標識が、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識、クロモゲン標識、及び放射性標識からなる群から選ばれる、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出ステップがELISAアッセイ及びフロー・サイトメトリーから成る群から選ばれる診断法を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インキュベート及び検出ステップがウエスタン・ブロッティング方法論を含む、請求項3〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
以下の
リン酸化チロシン特異性を有する2次抗体を準備し、そして
その2次抗体によりウエスタン・ブロッティングする、
ステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
試薬の結合が、全細胞を含む結合複合体を生じる、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
試薬の結合の検出が、前記結合複合体を免疫組織化学染色に供することを含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
細胞をスライド上に固定するステップをさらに含み、かつ、検出ステップが免疫蛍光染色を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
細胞集団が、乳房細胞、腎臓細胞、前立腺細胞、肺細胞、及び大腸細胞から成る群から選ばれる細胞を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞集団が、上皮細胞を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞集団が、乳癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、及び大腸癌細胞から成る群から選ばれる細胞を含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞集団が、上皮癌細胞を含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記転移性又は潜在的転移性癌細胞が、乳癌細胞、腎臓癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、及び大腸癌細胞から成る群から選ばれる細胞を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記転移性又は潜在的転移性癌細胞が、上皮癌細胞を含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞集団が、組織生検からの細胞を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞集団が、乳房組織又は前立腺組織生検からの細胞を含む、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞集団が、体液からの細胞を含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、血液、血漿、髄液、唾液、及び尿から成る群から選ばれる体液から採取される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
選ばれた細胞集団内の癌細胞の存在のin vitro検出方法であって、以下の：
相似の正常細胞集団におけるEphA2発現レベル、局在パターン、及びリン酸化量と比較される、
(i)EphA2発現レベルの変化；
(ii)EphA2局在パターンの変化；及び
(iii)EphA2リン酸化量の変化
の少なくとも1つについて選ばれた細胞集団の少なくとも一部をアッセイすること、ここで上記変化が、上記選ばれた細胞集団内の癌細胞の存在を示すものとする、
を含む上記検出方法。
【請求項２７】
EphA2の発現レベル、局在パターン又はリン酸化量の変化が、前記細胞集団内の転移性癌細胞の存在を示す、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
EphA2の発現レベルの変化が、前記細胞集団内の非転移性癌細胞の存在を示す、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
癌細胞を含む細胞集団内における疾患ステージのin vitro決定方法であって、
(a)(i)EphA2発現レベル；
(ii)EphA2局在性；及び
(iii)EphA2リン酸化量
の少なくとも1つについて細胞集団の少なくとも一部をアッセイし；そして
(b)上記癌細胞の疾患ステージを決定する、
ことを含む上記決定方法。
【請求項３０】
前記細胞集団のアッセイが、癌細胞集団の少なくとも一部をEphA2に結合可能な試薬と一緒にインキュベートして、該試薬とEphA2とを結合させ；そして試薬の結合を検出することを含む、請求項26〜29のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
前記試薬が、抗体である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が、ハイブリドーマD7又はB2D6により産生される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
EphA2の細胞内エピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項３４】
モノクローナル抗体である、請求項33に記載の抗体。
【請求項３５】
検出可能な標識に結合した、請求項33又は34に記載の抗体。
【請求項３６】
ハイブリドーマ細胞株D7により産生された請求項35に記載の抗体。
【請求項３７】
EphA2の細胞内エピトープに特異的に結合する単離された抗体。
【請求項３８】
モノクローナル抗体である、請求項37に記載の単離された抗体。
【請求項３９】
細胞集団内の転移性細胞の存在の検出キットであって、以下の、
(a)EphA2のエピトープに特異的に結合可能な抗体、及び
(b)抗体-エピトープ結合の検出手段
を含む、上記検出キット。
【請求項４０】
抗体-エピトープ結合の検出手段が抗体に結合させた標識である、請求項39に記載のキット。
【請求項４１】
リン酸化チロシン特異性を有する抗体をさらに含む、請求項39又は40に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１０３２６４（Ｐ２０１２−１０３２６４Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２８７１５８（Ｐ２０１１−２８７１５８）
【出願日】平成２３年１２月２８日（２０１１．１２．２８）
【分割の表示】特願２００１−５１６９２７（Ｐ２００１−５１６９２７）の分割
【原出願日】平成１２年８月１７日（２０００．８．１７）
【出願人】（５９８０６３２０３）パーデュー・リサーチ・ファウンデーション (59)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２８７１５８（Ｐ２０１１−２８７１５８）
【出願日】平成２３年１２月２８日（２０１１．１２．２８）
【分割の表示】特願２００１−５１６９２７（Ｐ２００１−５１６９２７）の分割
【原出願日】平成１２年８月１７日（２０００．８．１７）
【出願人】（５９８０６３２０３）パーデュー・リサーチ・ファウンデーション (59)
【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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