癌転移抑制剤及び医薬組成物
【課題】癌の転移を予防又は防止する手段、より具体的には、各種の癌に対して有効であり、安全性の高い、癌の転移抑制剤及びそれを含む医薬組成物を提供する。
【解決手段】以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする、癌転移抑制剤：
（Ａ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列を有する核酸を発現可能な形態で含む発現ベクター；
（Ｂ）前記（Ａ）の発現ベクターを含む、細胞、組織又は細胞株；
（Ｃ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物。
【解決手段】以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする、癌転移抑制剤：
（Ａ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列を有する核酸を発現可能な形態で含む発現ベクター；
（Ｂ）前記（Ａ）の発現ベクターを含む、細胞、組織又は細胞株；
（Ｃ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍の転移を抑制又は防止するための薬剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌が大きくなると悪性化して転移をすると考えられてきたが、最近の癌の研究により、原発癌の悪性度と癌の転移とは関係がないことが明らかになってきた。ごく最近、癌の幹細胞が見いだされ、癌の初期に転移性の高い細胞が血中に流出しており、そのうちのいくつかが、原発癌を除いた後に転移巣を形成し、転移癌として増殖することが明らかにされてきた（Steeg et al., Nat Clin Pract Oncol. 2008 April ; 5(4): 206-219. doi:10.1038/ncponc1066：非特許文献１）。
【０００３】
また、原発癌と転移癌とでは治療剤に対する感受性も異なっている。近年多く取り入れられている腫瘍血管新生の阻害薬による癌の兵糧攻めの手法は、原発癌の縮小には効果があることがわかっている。しかし、この治療法で使用されている血管内皮細胞増殖因子シグナルの阻害剤は、むしろ癌の浸潤や、転移を促進することが明らかになってきた(Steeg et al., Clin Cancer Res 2009;15(14) July 15, 2009, 4529-4530:非特許文献２； Loges et al., Cancer Cell 15, March 3, 2009 . 2009, 167-170：非特許文献３）。
【０００４】
したがって、患者の延命のためには癌の増殖を抑えるだけでなく、転移が癌の治療標的として重要であり、癌の転移を抑制する薬剤等の手段又は方法の開発が重要である。
【０００５】
ＢＲＡＫ（breast and kidney；「ＣＸＣＬ１４」等とも呼ばれる）は、多くの正常組織で発現しており、生体内のホメオスタシス維持に重要と考えられているケモカイン（白血球の走化性を促進する因子）である。ＢＲＡＫ遺伝子は、５ｑ３１遺伝子座に位置し、９９残基又は１１１残基の前駆体タンパク質として翻訳され、最終的に７７残基の成熟タンパク質となる。ＢＲＡＫは、哺乳動物間で高度に保存されており、たとえばＢＲＡＫのマウスのホモログは、７７アミノ酸残基のうちの２つの相同アミノ酸置換以外はすべてヒトのものと一致している。
【０００６】
本発明者らは、ＢＲＡＫが頭頚部癌、特に口腔領域の扁平上皮癌の増殖を抑制する作用を有しており、腫瘍増殖抑制剤として有用であることを見いだした（特開２００６−３２１７８２：特許文献１；Ozawa et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 348 (2006) 406-412:非特許文献４；Ozawa et al., Biomedical Research 30 (5) 315-318, 2009:非特許文献５；Ozawa et al., Cancer Science 100, 2202-2209 2009 Aug 9, 2009：非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−３２１７８２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Steeg, P. S. and Theodorescu D., Metastasis: a therapeutic target for cancer. Nat Clin Pract Oncol. 2008 April ; 5(4): 206-219. doi:10.1038/ncponc1066
【非特許文献２】Steeg, P. S., et al., Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis. Clin Cancer Res 2009;15(14) July 15, 2009,4529-4530
【非特許文献３】Loges, S. et al., Silencing or Fueling Metastasis with VEGF Inhibitors:Antiangiogenesis Revisited. Cancer Cell 15, March 3, 2009, 167-170
【非特許文献４】Ozawa, S. et al., BRAK/CXCL14 expression suppresses tumor growth in vivo in human oral carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 348 (2006) 406-412
【非特許文献５】Ozawa, S. et al., BRAK/CXCL14 expression in oral carcinoma cells completely suppresses tumor cell xenografts in SCID mouse. Biomedical Research 30 (5) 315-318, 2009
【非特許文献６】Ozawa, S. et al., Restoration of BRAK / CXCL14 gene expression by gefitinib is associated with antitumor efficacy of the drug in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Science 100, 2202-2209 2009 Aug 9, 2009 [Epub ahead of print]
【非特許文献７】Schllenberger, TD., et al., Cancer Res. (2004) 64(22):8262-70
【非特許文献８】Schwarze, SR. et al., Prostate (2005) Jan 13 (Online)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、癌の転移を予防又は防止する手段、より具体的には、各種の癌に対して有効であり、安全性の高い、癌の転移抑制剤及びそれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＢＲＡＫ／ＣＸＣＬ１４タンパク質を過剰に発現するトランスジェニック(Ｔｇ)マウスを作製したところ、このマウスは２年間飼育しても異常を示さず、メラノーマ（黒色腫）及びルイス肺癌の増殖を抑制することを見出した。
【００１１】
さらに、本発明者らは、このＢＲＡＫ／ＣＸＣＬ１４タンパク質を過剰に発現するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを用いて鋭意研究した結果、このマウスにおいては黒色腫及びルイス肺癌の増殖が抑制されるばかりでなく、これらの癌の転移もまた顕著に抑制されること、この抑制がＢＲＡＫに起因することを見いだし、本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、
〔１〕以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする、癌転移抑制剤；
（Ａ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列を有する核酸を発現可能な形態で含む発現ベクター；
（Ｂ）前記（Ａ）の発現ベクターを含む、細胞、組織又は細胞株；
（Ｃ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物；
〔２〕前記ＢＲＡＫポリペプチドが、配列表の配列番号４〜６のいずれかによって表される配列を有する、前記〔１〕記載の癌転移抑制剤；
〔３〕前記核酸が、配列表の配列番号１〜３のいずれかによって表される配列を有する、前記〔１〕記載の癌転移抑制剤；
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の癌転移抑制剤及び医薬的に許容されうる担体を含有する、医薬組成物、
を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、安全に癌の転移の抑制を可能にする薬剤が提供される。本発明の癌転移抑制剤は、種々の癌に有効である。
ＢＲＡＫは正常細胞で合成されているタンパク質であり、また、これを高レベルで発現するＴｇマウスは２年間飼育しても異常を示さなかったことから、本発明の癌転移抑制剤は、副作用がなく非常に安全性が高いものである。癌転移抑制剤の場合、癌増殖抑制剤（いわゆる抗癌剤）と違って、投与される時点では担癌状態ではない又は見かけ上健康である対象に対して長期にわたって投与される必要があるので、副作用がないことは極めて重要な利点である。
【００１４】
さらに、本発明の癌転移抑制剤は、頭頚部癌をはじめとする癌に対して増殖抑制作用をも有することがわかっている。したがって、癌増殖抑制及び癌転移抑制を同時に行うことができるので、非常に有用性が高い。
【００１５】
また、ＢＲＡＫトランスジェニックマウスは、腫瘍抑制に関するＢＲＡＫの機能の分子メカニズム及びＢＲＡＫの生体内での機能を解明するための優れた実験ツールとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、トランスジェニックマウスの作製に用いた発現ベクターの構造を示す図である。
【図２】図２は、トランスジェニックマウス（「Ｔｇ」）及び野生型コントロールマウス（「Ｗｔ」）（各々５匹ずつ）の腎臓におけるトランスジーン（ヒトＢＲＡＫ）のｍＲＮＡの存在及び発現を表す図である。ゲノムＤＮＡ（パネルＡ）及びｃＤＮＡ（パネルＢ）をＰＣＲによって増幅し、３％アガロースゲルで分離した後、０．０１％エチジウムブロマイド染色によって可視化した。
【図３】図３は、マウス血漿中のＢＲＡＫタンパク濃度を示す図である。腫瘍を移植したマウス（「Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ」）及び移植していないマウス（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）の各々について、トランスジェニック（「Ｔｇ」）及び野生型（「Ｗｔ」）の両方からＥＤＴＡ含有溶液を含むチューブ内に血漿を採取した。５０μｌの血漿アリコートを用いてＥＬＩＳＡによりＢＲＡＫタンパクの血漿濃度を測定した。
【図４】図４は、トランスジェニックマウスにおけるルイス肺癌（「ＬＬＣ」）細胞及び黒色腫細胞（「Ｂ１６ ｍｅｌａｎｏｍａ」）の移植腫瘍の生育抑制を示す図である。２００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の種々の濃度の腫瘍細胞を、１０匹ずつのトランスジェニック（「Ｔｇ」）及び野生型（「Ｗｔ」）マウスの両側に注入し、腫瘍サイズを測定した。パネルＡ〜Ｅは、パネルＡ、Ｂ及びＣ：２０系統マウスにおけるＬＬＣ細胞；パネルＤ：５２系統マウスにおけるＬＬＣ細胞；パネルＥ：２０系統マウスにおける黒色腫細胞の結果である。「＊＊」はＰ＜０．０１、「＊＊＊」はＰ＜０．００１を表す。
【図５】図５は、トランスジェニック（「Ｔｇ」）及び野生型（「Ｗｔ」）マウスから採取したＬＬＣ腫瘍の免疫組織化学染色像の定量値の比較を示す図である。抗ＣＤ３１抗体（「ＣＤ」）又は抗α‐平滑筋アクチン抗体（αＳＭＡ）で陽性に染色された領域を、２００倍に拡大した５ヵ所のランダムに選択した視野上で測定した。「＊」はＰ＜０．０５を表す。
【図６】図６は、トランスジェニックマウスにおけるＢＲＡＫのルイス肺癌細胞に対する転移抑制効果を表す図（転移巣の数の比較を表すグラフ）である。
【図７】図７は、トランスジェニックマウスにおけるＢＲＡＫのＢ１６黒色腫細胞に対する転移抑制効果を表す図である。パネルＡは、典型的な肺の転移巣の写真を、スケール（上側の１目盛り＝１mm）とともに表す図であり、パネルＢは、転移巣の数の比較を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
上述のとおり、本発明の癌転移抑制剤は、（Ａ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列を有する核酸を発現可能な形態で含む発現ベクター；（Ｂ）前記（Ａ）の発現ベクターを含む、細胞、組織又は細胞株；（Ｃ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物、のいずれかを有効成分として含有する。
【００１８】
前記（Ａ）及び（Ｃ）における「ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物」は、ヒト、マウスその他の任意の生物に由来する天然型のアミノ酸配列を有するＢＲＡＫポリペプチドに加え、後述するような癌の転移を抑制する活性を維持している限りにおいて、天然型のアミノ酸配列と比較して１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、置換等によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このようなアミノ酸配列の改変は、それをコードする核酸配列に起因するものであってもよく、あるいはポリペプチドの修飾等によって生じるものであってもよく、また、改変が人為的であっても自然発生的であってもよい。
【００１９】
たとえば、配列表の配列番号４〜６に記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチド及びこれらに前記のような改変を加えたアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。配列番号４は、ヒトＢＲＡＫの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列、配列番号５は同様に前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列、配列番号６は成熟型ポリペプチドのアミノ酸配列である。好ましくは、ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物は、ＢＲＡＫのＮ末端側から約７０残基又はそれに相当する配列を含む。なお、本発明に関して、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、厳密に区別されず、互換的に使用される。
【００２０】
前記（Ａ）における「ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列」は、このようないずれかのポリペプチドをコードする任意の配列を意味する。たとえば、配列表の配列番号１〜３に記載されたヌクレオチド配列及びこれらに前記のような改変されたポリペプチドが生じるような改変を有するヌクレオチド配列が挙げられる。配列番号１は、ヒトＢＲＡＫのゲノム配列、配列番号２及び３は、ヒトＢＲＡＫのｍＲＮＡのｃＤＮＡ配列である（配列番号２のヌクレオチド番号１は、配列番号１の５０２番目のヌクレオチドに対応する）。このような配列を有する核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、また、ＤＮＡ又はこの配列に対応するＲＮＡのいずれであってもよい。
【００２１】
前記（Ａ）における発現ベクターの作製に使用されうるベクターとしては、前記ＢＲＡＫポリペプチドをコードする配列を細胞内において発現することができるものであれば、特に制限されない。例えば、選択マーカーを含むベクターなどの市販のものを有利に使用することができ、プラスミド、ウイルス（ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなど）などの任意の形態のベクターであることができる。当該技術分野で公知の任意の方法にしたがって、このようなベクターに前記のＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列を有する核酸を挿入することにより、発現ベクターを作製することができる。
【００２２】
前記（Ｂ）の細胞、組織又は細胞株は、前記の発現ベクターを、公知の方法にしたがって細胞、組織又は細胞株に導入することにより作製することができる。これらの細胞、組織又は細胞株は、動物、特に哺乳類動物に由来するものであることが好ましく、皮膚線維芽細胞、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞などの細胞、又はそれらに由来する組織又は細胞株などを使用することができる。
【００２３】
本発明の癌転移抑制剤は、このような（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１以上を有効成分として含有する。転移抑制対象の癌としては、特に限定されないが、肺癌、黒色腫などが挙げられる。
【００２４】
癌の転移を抑制する活性の有無は、公知の任意の試験方法によって、抑制剤の候補を適用した場合と適用しない場合（対照）とを腫瘍の転移巣の形成などについて比較することによって調べることができる。このような比較試験において、抑制剤の候補を適用した場合について統計的に有意な腫瘍の転移に関する不利な影響（たとえば形成された転移巣数の低減・形成の遅延、転移巣の縮小など）が認められた場合に、その候補物質は転移抑制活性を有すると判定される。
【００２５】
本発明の癌転移抑制剤の有効投与量は、転移抑制すべき癌の性質、大きさ、種類、部位など；投与対象個体の状態など；併用する治療の有無又は種類など、種々の要因によって変動するが、目安として、有効成分が（Ａ）の発現ベクターである場合、１回あたり１フェムト（１０−１５）グラム〜１マイクログラム／ｋｇ体重程度、有効成分が（Ｃ）のポリペプチドである場合、１ピコ（１０−１２）グラム〜１ミリグラム／ｋｇ体重程度である。また、有効成分が（Ｂ）の細胞等である場合、細胞数として、投与対象個体の体重１ｋｇあたり１０４〜１０１０個程度の範囲内が目安である。
【００２６】
いずれを用いた場合であっても、血漿中のＢＲＡＫ濃度を約２〜約３０ng/ml程度、好ましくは約３〜約１５ng/ml程度に上昇させることが望ましい。正常人の血漿中のＢＲＡＫ濃度は、平均約０．９〜１．１ng/ml程度であり、ほとんどが約０．７〜１．６ng/ml程度の範囲内であるが、非常に濃度が高く、この１０倍程度を示す個体も稀に観察される。したがって、ＢＲＡＫ濃度をこの程度に上昇させることは何ら悪影響を及ぼすことはないと考えられる。
【００２７】
本発明の癌転移抑制剤は、そのまま単独で投与することが可能であるが、医薬組成物として投与することもできる。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの本発明の癌転移抑制剤と、少なくとも１つの医薬的に許容されうる担体とを含有する。医薬的に許容されうる担体としては、特に制限はなく、たとえばリポソーム又はその脂質成分、緩衝剤、崩壊剤、結合剤、保存剤など、製剤分野において公知の任意のものの中から、所望の剤型及び／又は投与経路に応じて適宜選択し、単独で又は組み合わせて使用することができる。
【００２９】
具体的には、たとえばＢＲＡＫタンパク（等電点が塩基性である）をアニオニックゼラチン（たとえば「メドジェルＰ１５」（商品名）など）と結合させて徐放性製剤とすることや、ＢＲＡＫ発現ベクターをカチオニックゼラチン（たとえば「メドジェルＥ５０」（商品名）など）と結合させて細胞への導入効率を上昇させることなどが挙げられる。
【００３０】
剤型としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、ペースト、軟膏、貼付剤などが挙げられる。
【００３１】
投与経路としては、経口、経皮、皮下、皮内、経粘膜、筋内、経膣、頬内、舌下、経直腸、鞘内、硬膜外などが挙げられる。また、全身投与でも局所投与でもよい。好ましくは局所投与である。
【実施例】
【００３２】
１． ＢＲＡＫを発現するベクターの構築
ヒトＢＲＡＫ前駆体のメッセンジャーＲＮＡに相補的な配列（ＮＭ ００４８８７； 配列番号２）を有するＤＮＡを、市販の哺乳類細胞用の発現ベクター「pTargeT（商標）Mammalian Expression Vector（プロメガ社)」のクローニング部位に挿入し、発現ベクター（「ｐＣＬ−ＢＲＡＫ」と呼ぶ）を作製した(Ozawa et al., Biochem Biophys Res Commun 348:406-412 (2006))。
【００３３】
このｐＣＬ−ＢＲＡＫベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、全長ＢＲＡＫ ｃＤＮＡを含む断片を単離して、予め同じ酵素で処理した公知の真核生物発現ベクターである「ｐＣＡＧＧＳベクター」（Niwa et al., Gene 108:193-199 (1991)参照）のクローニング部位に連結し、ＢＲＡＫ発現ベクター（「ｐＣＡＧＧＳ−ＢＲＡＫ」）を作製した。ｐＣＡＧＧＳ−ＢＲＡＫベクターの配列及びＢＲＡＫ挿入断片のセンス配列は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。ｐＣＡＧＧＳベクターは、サイトメガロウイルスのエンハンサー（「Ｃ」）、ニワトリβ‐アクチンのプロモーター（「Ａ」）、β‐グロビンのスプライシング部位（「Ｇ」）、ウサギβ‐グロビンのポリＡシグナル（「Ｇ」）及びＳＶ４０ウイルスの複製開始点（「Ｓ」）を含む。
ｐＣＡＧＧＳ−ＢＲＡＫベクターの構造を図１に示す。
【００３４】
２． ＢＲＡＫを発現するトランスジェニックマウスの作製
上記のようにして作製したｐＣＡＧＧＳ−ＢＲＡＫベクターを、３２９個のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス(Charles River Japan,. Inc., Tokyo, Japan)の受精卵に、マイクロインジェクションにより導入した。これらの胚を、Gordonら（Proc Natl Acad Sci USA 77:7380-7384 (1980)）に記載された方法にしたがって、偽妊娠したＣｒ１ｊ：ＣＤ−１(ＩＣＲ)系統の雌マウス(同上)１１匹の輸卵管に移植した。
【００３５】
これらのマウスから生まれた５７匹の仔について、尾からゲノムＤＮＡを採取し、ｈＢＲＡＫ−Ｓ３（フォワード： ５’−ＡＴＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＣＣ−３’；配列番号７）及びｈＢＲＡＫ−Ａ８（リバース： ５’−ＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＣ−３’；配列番号８）プライマーを用いてＰＣＲ解析によりトランスジーンの発現を確認した。
【００３６】
ＰＣＲ条件は以下のとおりであった： まず、９４℃、２分間での変性後、３０サイクルの９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；及び７２℃、４０秒を行い、次いで、７２℃で１０分間インキュベーションした後、４℃で保存した。
【００３７】
その結果、５７匹のうち、１０系統がトランスジェニックマウスであることが確認された。ホモ接合のトランスジェニックマウスを、同じ系統の雄及び雌マウスを交配することによって作製した。ホモ接合性は、野生型マウスと交配した場合に１０匹以上の仔がトランスジェニックであったことにより認定した。
【００３８】
以下の実験においては、そのうち、産仔の多い２０系統及び５２系統等を７〜９週齢で使用した。マウスは、１２時間明条件、１２時間暗条件で、餌及び水を自由に摂取させて維持した。
【００３９】
３． ＢＲＡＫトランスジェニックマウスの腎臓におけるトランスジーン及びそのｍＲＮＡの検出
上記で作製したＢＲＡＫトランスジェニックマウス及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腎臓を動物から取り出し、液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。凍結組織を「ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬」(Invitrogen Japan, Tokyo)で処理し、試薬添付の指示書の記載にしたがってＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。
【００４０】
ゲノムＤＮＡは、上記の条件を用いて増幅した。ＲＮＡは、逆転写した後、上記のとおりにＰＣＲ増幅した。ただし、ヒトＢＲＡＫについては、ＨＲ ＢＲＡＫ Ｓ１（フォワード： ５’−ＡＣＧＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣ−３’；配列番号９）及びＨＲ ＢＲＡＫ Ａ２（リバース： ５’−ＴＧＡＴＧＡＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣ-３’；配列番号１０）プライマーを用いて３０サイクルで行い、マウスβ−アクチンについては、ＭＲ ｂａｃｔｉｎ Ｓ１（フォワード： ５’−ＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧ−３’；配列番号１１）及びＭＲ ｂａｃｔｉｎ Ａ２（リバース： ５’−ＧＣＴＣＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧ−３’；配列番号１２）プライマーを用いて２０サイクルで行った。増幅したｃＤＮＡを、３％アガロースゲルを用いて分離した。
【００４１】
その結果、図２に示すように、肝臓、皮膚、腎臓、肺及び脳のような調べた全ての組織及び器官において、トランスジーン（ヒトＢＲＡＫ）のｍＲＮＡの発現が確認された。
【００４２】
４． マウス血漿中のＢＲＡＫタンパク量の測定
ＢＲＡＫトランスジェニック（Ｔｇ）及び野生型マウス（Ｗｔ）から、２５μlの２００mM ＥＤＴＡ(Wako Pure Chemical Co. Osaka)溶液を入れた試験管中に採血した。５０μlの血漿を、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに入れ（１試料あたり４ウェル）、固相サンドウィッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA; Catalog Number: DY866「DuoSet（登録商標） ELISA Development System, human CXCL14/BRAK」, R&D Systems, Inc. USA）を用いて、キット添付の指示書に基本的にしたがって、ＢＲＡＫタンパクの血漿濃度を決定した。
【００４３】
この方法で測定した場合、マウスＢＲＡＫ及びヒトＢＲＡＫが同じ感度で検出される。野生型マウスの血漿ＢＲＡＫレベルは約０．９ng/ml血漿であり、ヒトにおける血漿ＢＲＡＫレベルと同等であった。一方、トランスジェニックマウスでは約１０倍程度高く、血漿ＢＲＡＫレベルは１１〜１４ng/mlであった（図３）。
【００４４】
５． 腫瘍移植及びインビボでの腫瘍の生育と血漿ＢＲＡＫ濃度との関係
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のルイス肺癌細胞（ＬＬＣ， ＲＣＢ０５５８）及びＢ１６黒色腫細胞（ＲＣＢ１２８３）は、Riken Cell Bank から入手し、硫酸ゲンタマイシン(５０ mg/l, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)及びファンギゾン（２５０ μg/l, Invitrogen Japan, Tokyo）を含有し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ, Thermo Electron Melbourne, Australia）を添加したダルベッコ改変イーグル培地(Sigma, Tokyo)中で培養した。細胞は、９５％大気及び５％ＣＯ２中で３７℃で培養し、０．１％トリプシン（Trypsin 250, Wako /1 mM EDTA in Dulbecco's Mg2+-Ca2+-free phosphate-buffered saline (「ＤＰＢＳ（−）」, TAKARA BIO, Otsu, Japan)を用いて定期的に継代した。
対数増殖期の細胞（１．０×１０５〜３．０×１０６個）をトリプシン処理し、２００μｌのＤＰＢＳ（−)中に懸濁して、１群７〜１０匹の野生型及びトランスジェニックマウスの背部両側の皮下に注入した。
【００４５】
腫瘍の体積（mm３）は、Nishimura ら（Jpn J Cancer Res 91:1199-1203 (2000)）及びOzawaら（Cancer Sci 100:2202-2209 (2009)）に記載されたとおりに、以下の式にしたがって算出した：（ａ×ｂ２）／２
式中、ａは長寸、ｂは短寸（いずれもmm）である。
【００４６】
これらの野生型及びトランスジェニック両マウスについて、上記４．に記載のとおりにして血漿中のＢＲＡＫ濃度を調べたところ、いずれも、移植のない動物と同程度であり、腫瘍の有無によって有意な変化は観察されなかった（図３）。
【００４７】
移植後２０日（１．０×１０５個のＢ１６黒色腫）〜最長５０日（１．０×１０５個のルイス肺癌細胞）までの間の腫瘍の体積を比較した。ＬＬＣ細胞について、注入した腫瘍細胞数にかかわらず、移植したトランスジェニックマウスにおいて形成された腫瘍は、野生型マウスの場合よりも有意に少なかった。しかし、トランスジェニックマウスと野生型マウスとの間に腫瘍サイズの有意差が観察されるまでの期間は、注入された腫瘍細胞数が低い場合は長くなっていた（図４、パネルＡ，Ｂ，Ｃ）。別の系統のトランスジェニックマウスにＬＬＣ細胞を注入した場合も、腫瘍サイズに有意差が観察された（５２系統；図４、パネルＤ）。さらに、Ｂ１６黒色腫細胞を２０系統のトランスジェニックマウスに注入した場合にも、腫瘍サイズの有意な抑制が観察された（図４、パネルＥ）。
【００４８】
腫瘍細胞移植片の有意な増殖抑制が２つの独立のＢＲＡＫトランスジェニックマウス系統で観察されたことから、腫瘍の抑制は、野生型に存在するかもしれない推定腫瘍促進刺激因子の破壊によるものではなく、トランスジェニックマウスにおけるＢＲＡＫの高発現によるものであることが示唆された。また、別の実験（ＲＴ−ＰＣＲ）において、ＬＬＣ又は黒色腫細胞におけるマウスＢＲＡＫ遺伝子の発現を検出できなかったので、トランスジェニックマウスにおいて産生されたＢＲＡＫはパラクリン及び／又はエンドクリン形式で機能することが示唆された。
【００４９】
６． 腫瘍移植片の血管構造についての免疫組織化学実験
ＬＬＣ腫瘍を注入した６日後及び１０日後に腫瘍移植片をトランスジェニックマウス（２０系統（ホモ）及び５７系統（ヘテロ））及び野生型マウスから採取し、Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物（Tissue-Tek, Miles Inc., Elkhart, In）中に包埋し、−８０℃に維持した。凍結組織をクリオスタットで６μｍの切片とし、風乾した切片を、一次抗体としてラット抗ＣＤ３１抗体（ER-MP12; BMA Biomedicals, Switzerland, １：８００希釈）とともにインキュベートし、次いで、二次抗体としてビオチニル化ウサギ抗ラットＩｇＧ（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA １：２５０希釈）とともにインキュベートした。別の切片を、ウサギ抗α‐平滑筋アクチン抗体（E184; Epitomics, Inc., Burlingame, CA １：１００希釈）を一次抗体として用い、次いで二次抗体としてＨＲＰ結合全ロバ抗ウサギＩｇＧ（GE Healthcare, England １：５０希釈）を用いてインキュベートした。いくつかの切片については、一次抗体を省略し、ネガティブコントロールとして用いた。
【００５０】
組織化学染色は、「Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ ＤＡＢ」（3,3-diaminobenzidine）基質キット（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）を製造業者の指示書にしたがって、Ｓｕｚｕｋｉら（Immunity 13：691−702（2000））に記載されたとおりに行なった。抗ＣＤ３１又は抗α‐平滑筋アクチン抗体によって陽性に染色された領域を、「Ｂｉｏｚｅｒｏ」（KEYENCE, Tokyo, Japan）及びＶＨアナライザー（同）を用いて２００倍に拡大した５ヵ所のランダムに選択した視野について測定した。
【００５１】
野生型マウス由来の腫瘍は、トランスジェニックマウスにおけるものよりもはるかに大きく、その色は赤く、血液量の多いことを示唆していた。腫瘍に浸潤していた視認可能な血管の数及び直径は、トランスジェニックマウスにおけるよりも野生型マウスにおいてはるかに多く、また大きかった。
腫瘍血管内皮細胞を抗ＣＤ３１抗体で免疫組織化学的に染色したところ、ＣＤ３１陽性細胞の数は、トランスジェニックマウスにおけるよりも野生型マウスにおいてはるかに増大していた。染色された領域は、特に野生型の血管中に位置する陽性細胞において、有意に大きかった（図５）。切片を抗α‐平滑筋アクチン抗体で染色したところ、染色された領域はこの場合においてもトランスジェニックマウスにおけるよりも野生型マウスにおいて有意に大きかった（図５）。
【００５２】
トランスジェニックマウスにおいて腫瘍への血管の侵入の抑制が観察されたことから、ＢＲＡＫが血管新生を抑制したことが示唆された。これらのデータによって、トランスジェニックマウスの腫瘍へのα−平滑筋細胞アクチン陽性細胞の侵入の阻害が、腫瘍内への血管内皮細胞の阻害に加えて起こることが示唆された。したがって、ＢＲＡＫは、血管周囲（perivascular）平滑筋細胞のケモタキシス及び成熟した機能的な微小血管（microvasculature）の形成を阻害することによって、腫瘍への血管の侵入を阻害する可能性がある。
【００５３】
ＢＲＡＫトランスジェニックマウスは、腫瘍抑制に関するＢＲＡＫの機能の分子メカニズム及びＢＲＡＫの生体内での機能を解明するための優れた実験ツールを提供する。
【００５４】
７． トランスジェニックマウスにおけるルイス肺癌細胞の転移抑制実験
１群１７匹の８〜９週齢のマウス（野生型Ｃ５７ＢＬ／６系及びＢＲＡＫトランスジェニックマウス）の尾静脈から１×１０５個のルイス肺癌細胞（上記５．に記載のとおりに培養しトリプシン処理したもの）を注入し、上記の条件下で飼育した。１４日後、頚椎骨折によりマウスを屠殺し、直ちに開胸して肺を摘出し、１０％ホルマリン液で固定した。数時間後に、それぞれの肺の転移巣の数を肉眼で数えた。
【００５５】
結果を図６に示す。野生型マウスにおいては平均７５個の転移巣が確認されたのに対し、ＢＲＡＫを高発現するトランスジェニックマウスにおいては平均約３７個であり、有意に転移巣の形成が抑制されていた（Ｐ＜０．００１）。
２群間の差異が統計学的に有意であるか否かを決定するために、スチューデントｔ−テストを用い、Ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意であるとした。
【００５６】
８． トランスジェニックマウスにおけるＢ１６黒色腫細胞の転移抑制実験
１群６匹の７週齢のマウス（野生型Ｃ５７ＢＬ／６系及びＢＲＡＫトランスジェニックマウス）の尾静脈から２×１０５個のＢ１６黒色腫細胞（上記５．に記載のとおりに培養しトリプシン処理したもの）を注入し、上記の条件下で飼育した。１８日後、頚椎骨折によりマウスを屠殺し、直ちに開胸して肺を摘出し、１０％ホルマリン液で固定した。数時間後に、それぞれの肺の転移巣の数を肉眼で数えた。
【００５７】
結果を図７に示す。野生型マウスにおいては平均１０８個の転移巣が確認されたのに対し、ＢＲＡＫを高発現するトランスジェニックマウスにおいては平均約３６個であり、非常に顕著に転移巣の形成が抑制されていた（Ｐ＜０．００１）。
パネルＡは各群の典型的な肺の例を表す写真である。黒く見えるのが黒色腫細胞の転移巣である。
【００５８】
これらのデータは、ＢＲＡＫがトランスジェニックマウスにおいて腫瘍の転移を抑制したことを示している。
従来の血管新生阻害剤については、腫瘍浸潤及び転移を刺激するといった重篤な副作用を有することが報告されているが、上記のように、ＢＲＡＫによる腫瘍の転移及び増殖抑制のメカニズムは他の公知の血管新生阻害剤のそれと大きく異なっていることが示唆される。ＢＲＡＫトランスジェニックマウスは、２年までの観察期間にわたって何ら異常性を示さず、また、ヒト集団には、正常範囲の１０倍も高い血中レベルでＢＲＡＫタンパクを発現しているが、見かけ上何ら異常の見られない個体が見出されている。したがって、血中ＢＲＡＫタンパクを高レベルで維持しても、重篤な副作用は起こらないことが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍の転移を抑制又は防止するための薬剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌が大きくなると悪性化して転移をすると考えられてきたが、最近の癌の研究により、原発癌の悪性度と癌の転移とは関係がないことが明らかになってきた。ごく最近、癌の幹細胞が見いだされ、癌の初期に転移性の高い細胞が血中に流出しており、そのうちのいくつかが、原発癌を除いた後に転移巣を形成し、転移癌として増殖することが明らかにされてきた（Steeg et al., Nat Clin Pract Oncol. 2008 April ; 5(4): 206-219. doi:10.1038/ncponc1066：非特許文献１）。
【０００３】
また、原発癌と転移癌とでは治療剤に対する感受性も異なっている。近年多く取り入れられている腫瘍血管新生の阻害薬による癌の兵糧攻めの手法は、原発癌の縮小には効果があることがわかっている。しかし、この治療法で使用されている血管内皮細胞増殖因子シグナルの阻害剤は、むしろ癌の浸潤や、転移を促進することが明らかになってきた(Steeg et al., Clin Cancer Res 2009;15(14) July 15, 2009, 4529-4530:非特許文献２； Loges et al., Cancer Cell 15, March 3, 2009 . 2009, 167-170：非特許文献３）。
【０００４】
したがって、患者の延命のためには癌の増殖を抑えるだけでなく、転移が癌の治療標的として重要であり、癌の転移を抑制する薬剤等の手段又は方法の開発が重要である。
【０００５】
ＢＲＡＫ（breast and kidney；「ＣＸＣＬ１４」等とも呼ばれる）は、多くの正常組織で発現しており、生体内のホメオスタシス維持に重要と考えられているケモカイン（白血球の走化性を促進する因子）である。ＢＲＡＫ遺伝子は、５ｑ３１遺伝子座に位置し、９９残基又は１１１残基の前駆体タンパク質として翻訳され、最終的に７７残基の成熟タンパク質となる。ＢＲＡＫは、哺乳動物間で高度に保存されており、たとえばＢＲＡＫのマウスのホモログは、７７アミノ酸残基のうちの２つの相同アミノ酸置換以外はすべてヒトのものと一致している。
【０００６】
本発明者らは、ＢＲＡＫが頭頚部癌、特に口腔領域の扁平上皮癌の増殖を抑制する作用を有しており、腫瘍増殖抑制剤として有用であることを見いだした（特開２００６−３２１７８２：特許文献１；Ozawa et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 348 (2006) 406-412:非特許文献４；Ozawa et al., Biomedical Research 30 (5) 315-318, 2009:非特許文献５；Ozawa et al., Cancer Science 100, 2202-2209 2009 Aug 9, 2009：非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６−３２１７８２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Steeg, P. S. and Theodorescu D., Metastasis: a therapeutic target for cancer. Nat Clin Pract Oncol. 2008 April ; 5(4): 206-219. doi:10.1038/ncponc1066
【非特許文献２】Steeg, P. S., et al., Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis. Clin Cancer Res 2009;15(14) July 15, 2009,4529-4530
【非特許文献３】Loges, S. et al., Silencing or Fueling Metastasis with VEGF Inhibitors:Antiangiogenesis Revisited. Cancer Cell 15, March 3, 2009, 167-170
【非特許文献４】Ozawa, S. et al., BRAK/CXCL14 expression suppresses tumor growth in vivo in human oral carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 348 (2006) 406-412
【非特許文献５】Ozawa, S. et al., BRAK/CXCL14 expression in oral carcinoma cells completely suppresses tumor cell xenografts in SCID mouse. Biomedical Research 30 (5) 315-318, 2009
【非特許文献６】Ozawa, S. et al., Restoration of BRAK / CXCL14 gene expression by gefitinib is associated with antitumor efficacy of the drug in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Science 100, 2202-2209 2009 Aug 9, 2009 [Epub ahead of print]
【非特許文献７】Schllenberger, TD., et al., Cancer Res. (2004) 64(22):8262-70
【非特許文献８】Schwarze, SR. et al., Prostate (2005) Jan 13 (Online)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、癌の転移を予防又は防止する手段、より具体的には、各種の癌に対して有効であり、安全性の高い、癌の転移抑制剤及びそれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＢＲＡＫ／ＣＸＣＬ１４タンパク質を過剰に発現するトランスジェニック(Ｔｇ)マウスを作製したところ、このマウスは２年間飼育しても異常を示さず、メラノーマ（黒色腫）及びルイス肺癌の増殖を抑制することを見出した。
【００１１】
さらに、本発明者らは、このＢＲＡＫ／ＣＸＣＬ１４タンパク質を過剰に発現するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを用いて鋭意研究した結果、このマウスにおいては黒色腫及びルイス肺癌の増殖が抑制されるばかりでなく、これらの癌の転移もまた顕著に抑制されること、この抑制がＢＲＡＫに起因することを見いだし、本発明を完成した。
【００１２】
本発明は、
〔１〕以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする、癌転移抑制剤；
（Ａ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列を有する核酸を発現可能な形態で含む発現ベクター；
（Ｂ）前記（Ａ）の発現ベクターを含む、細胞、組織又は細胞株；
（Ｃ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物；
〔２〕前記ＢＲＡＫポリペプチドが、配列表の配列番号４〜６のいずれかによって表される配列を有する、前記〔１〕記載の癌転移抑制剤；
〔３〕前記核酸が、配列表の配列番号１〜３のいずれかによって表される配列を有する、前記〔１〕記載の癌転移抑制剤；
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の癌転移抑制剤及び医薬的に許容されうる担体を含有する、医薬組成物、
を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、安全に癌の転移の抑制を可能にする薬剤が提供される。本発明の癌転移抑制剤は、種々の癌に有効である。
ＢＲＡＫは正常細胞で合成されているタンパク質であり、また、これを高レベルで発現するＴｇマウスは２年間飼育しても異常を示さなかったことから、本発明の癌転移抑制剤は、副作用がなく非常に安全性が高いものである。癌転移抑制剤の場合、癌増殖抑制剤（いわゆる抗癌剤）と違って、投与される時点では担癌状態ではない又は見かけ上健康である対象に対して長期にわたって投与される必要があるので、副作用がないことは極めて重要な利点である。
【００１４】
さらに、本発明の癌転移抑制剤は、頭頚部癌をはじめとする癌に対して増殖抑制作用をも有することがわかっている。したがって、癌増殖抑制及び癌転移抑制を同時に行うことができるので、非常に有用性が高い。
【００１５】
また、ＢＲＡＫトランスジェニックマウスは、腫瘍抑制に関するＢＲＡＫの機能の分子メカニズム及びＢＲＡＫの生体内での機能を解明するための優れた実験ツールとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、トランスジェニックマウスの作製に用いた発現ベクターの構造を示す図である。
【図２】図２は、トランスジェニックマウス（「Ｔｇ」）及び野生型コントロールマウス（「Ｗｔ」）（各々５匹ずつ）の腎臓におけるトランスジーン（ヒトＢＲＡＫ）のｍＲＮＡの存在及び発現を表す図である。ゲノムＤＮＡ（パネルＡ）及びｃＤＮＡ（パネルＢ）をＰＣＲによって増幅し、３％アガロースゲルで分離した後、０．０１％エチジウムブロマイド染色によって可視化した。
【図３】図３は、マウス血漿中のＢＲＡＫタンパク濃度を示す図である。腫瘍を移植したマウス（「Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｅｄ」）及び移植していないマウス（「Ｃｏｎｔｒｏｌ」）の各々について、トランスジェニック（「Ｔｇ」）及び野生型（「Ｗｔ」）の両方からＥＤＴＡ含有溶液を含むチューブ内に血漿を採取した。５０μｌの血漿アリコートを用いてＥＬＩＳＡによりＢＲＡＫタンパクの血漿濃度を測定した。
【図４】図４は、トランスジェニックマウスにおけるルイス肺癌（「ＬＬＣ」）細胞及び黒色腫細胞（「Ｂ１６ ｍｅｌａｎｏｍａ」）の移植腫瘍の生育抑制を示す図である。２００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の種々の濃度の腫瘍細胞を、１０匹ずつのトランスジェニック（「Ｔｇ」）及び野生型（「Ｗｔ」）マウスの両側に注入し、腫瘍サイズを測定した。パネルＡ〜Ｅは、パネルＡ、Ｂ及びＣ：２０系統マウスにおけるＬＬＣ細胞；パネルＤ：５２系統マウスにおけるＬＬＣ細胞；パネルＥ：２０系統マウスにおける黒色腫細胞の結果である。「＊＊」はＰ＜０．０１、「＊＊＊」はＰ＜０．００１を表す。
【図５】図５は、トランスジェニック（「Ｔｇ」）及び野生型（「Ｗｔ」）マウスから採取したＬＬＣ腫瘍の免疫組織化学染色像の定量値の比較を示す図である。抗ＣＤ３１抗体（「ＣＤ」）又は抗α‐平滑筋アクチン抗体（αＳＭＡ）で陽性に染色された領域を、２００倍に拡大した５ヵ所のランダムに選択した視野上で測定した。「＊」はＰ＜０．０５を表す。
【図６】図６は、トランスジェニックマウスにおけるＢＲＡＫのルイス肺癌細胞に対する転移抑制効果を表す図（転移巣の数の比較を表すグラフ）である。
【図７】図７は、トランスジェニックマウスにおけるＢＲＡＫのＢ１６黒色腫細胞に対する転移抑制効果を表す図である。パネルＡは、典型的な肺の転移巣の写真を、スケール（上側の１目盛り＝１mm）とともに表す図であり、パネルＢは、転移巣の数の比較を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
上述のとおり、本発明の癌転移抑制剤は、（Ａ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列を有する核酸を発現可能な形態で含む発現ベクター；（Ｂ）前記（Ａ）の発現ベクターを含む、細胞、組織又は細胞株；（Ｃ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物、のいずれかを有効成分として含有する。
【００１８】
前記（Ａ）及び（Ｃ）における「ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物」は、ヒト、マウスその他の任意の生物に由来する天然型のアミノ酸配列を有するＢＲＡＫポリペプチドに加え、後述するような癌の転移を抑制する活性を維持している限りにおいて、天然型のアミノ酸配列と比較して１〜数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、置換等によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このようなアミノ酸配列の改変は、それをコードする核酸配列に起因するものであってもよく、あるいはポリペプチドの修飾等によって生じるものであってもよく、また、改変が人為的であっても自然発生的であってもよい。
【００１９】
たとえば、配列表の配列番号４〜６に記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチド及びこれらに前記のような改変を加えたアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。配列番号４は、ヒトＢＲＡＫの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列、配列番号５は同様に前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列、配列番号６は成熟型ポリペプチドのアミノ酸配列である。好ましくは、ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物は、ＢＲＡＫのＮ末端側から約７０残基又はそれに相当する配列を含む。なお、本発明に関して、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、厳密に区別されず、互換的に使用される。
【００２０】
前記（Ａ）における「ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列」は、このようないずれかのポリペプチドをコードする任意の配列を意味する。たとえば、配列表の配列番号１〜３に記載されたヌクレオチド配列及びこれらに前記のような改変されたポリペプチドが生じるような改変を有するヌクレオチド配列が挙げられる。配列番号１は、ヒトＢＲＡＫのゲノム配列、配列番号２及び３は、ヒトＢＲＡＫのｍＲＮＡのｃＤＮＡ配列である（配列番号２のヌクレオチド番号１は、配列番号１の５０２番目のヌクレオチドに対応する）。このような配列を有する核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、また、ＤＮＡ又はこの配列に対応するＲＮＡのいずれであってもよい。
【００２１】
前記（Ａ）における発現ベクターの作製に使用されうるベクターとしては、前記ＢＲＡＫポリペプチドをコードする配列を細胞内において発現することができるものであれば、特に制限されない。例えば、選択マーカーを含むベクターなどの市販のものを有利に使用することができ、プラスミド、ウイルス（ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなど）などの任意の形態のベクターであることができる。当該技術分野で公知の任意の方法にしたがって、このようなベクターに前記のＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列を有する核酸を挿入することにより、発現ベクターを作製することができる。
【００２２】
前記（Ｂ）の細胞、組織又は細胞株は、前記の発現ベクターを、公知の方法にしたがって細胞、組織又は細胞株に導入することにより作製することができる。これらの細胞、組織又は細胞株は、動物、特に哺乳類動物に由来するものであることが好ましく、皮膚線維芽細胞、骨髄幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞などの細胞、又はそれらに由来する組織又は細胞株などを使用することができる。
【００２３】
本発明の癌転移抑制剤は、このような（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１以上を有効成分として含有する。転移抑制対象の癌としては、特に限定されないが、肺癌、黒色腫などが挙げられる。
【００２４】
癌の転移を抑制する活性の有無は、公知の任意の試験方法によって、抑制剤の候補を適用した場合と適用しない場合（対照）とを腫瘍の転移巣の形成などについて比較することによって調べることができる。このような比較試験において、抑制剤の候補を適用した場合について統計的に有意な腫瘍の転移に関する不利な影響（たとえば形成された転移巣数の低減・形成の遅延、転移巣の縮小など）が認められた場合に、その候補物質は転移抑制活性を有すると判定される。
【００２５】
本発明の癌転移抑制剤の有効投与量は、転移抑制すべき癌の性質、大きさ、種類、部位など；投与対象個体の状態など；併用する治療の有無又は種類など、種々の要因によって変動するが、目安として、有効成分が（Ａ）の発現ベクターである場合、１回あたり１フェムト（１０−１５）グラム〜１マイクログラム／ｋｇ体重程度、有効成分が（Ｃ）のポリペプチドである場合、１ピコ（１０−１２）グラム〜１ミリグラム／ｋｇ体重程度である。また、有効成分が（Ｂ）の細胞等である場合、細胞数として、投与対象個体の体重１ｋｇあたり１０４〜１０１０個程度の範囲内が目安である。
【００２６】
いずれを用いた場合であっても、血漿中のＢＲＡＫ濃度を約２〜約３０ng/ml程度、好ましくは約３〜約１５ng/ml程度に上昇させることが望ましい。正常人の血漿中のＢＲＡＫ濃度は、平均約０．９〜１．１ng/ml程度であり、ほとんどが約０．７〜１．６ng/ml程度の範囲内であるが、非常に濃度が高く、この１０倍程度を示す個体も稀に観察される。したがって、ＢＲＡＫ濃度をこの程度に上昇させることは何ら悪影響を及ぼすことはないと考えられる。
【００２７】
本発明の癌転移抑制剤は、そのまま単独で投与することが可能であるが、医薬組成物として投与することもできる。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの本発明の癌転移抑制剤と、少なくとも１つの医薬的に許容されうる担体とを含有する。医薬的に許容されうる担体としては、特に制限はなく、たとえばリポソーム又はその脂質成分、緩衝剤、崩壊剤、結合剤、保存剤など、製剤分野において公知の任意のものの中から、所望の剤型及び／又は投与経路に応じて適宜選択し、単独で又は組み合わせて使用することができる。
【００２９】
具体的には、たとえばＢＲＡＫタンパク（等電点が塩基性である）をアニオニックゼラチン（たとえば「メドジェルＰ１５」（商品名）など）と結合させて徐放性製剤とすることや、ＢＲＡＫ発現ベクターをカチオニックゼラチン（たとえば「メドジェルＥ５０」（商品名）など）と結合させて細胞への導入効率を上昇させることなどが挙げられる。
【００３０】
剤型としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、ペースト、軟膏、貼付剤などが挙げられる。
【００３１】
投与経路としては、経口、経皮、皮下、皮内、経粘膜、筋内、経膣、頬内、舌下、経直腸、鞘内、硬膜外などが挙げられる。また、全身投与でも局所投与でもよい。好ましくは局所投与である。
【実施例】
【００３２】
１． ＢＲＡＫを発現するベクターの構築
ヒトＢＲＡＫ前駆体のメッセンジャーＲＮＡに相補的な配列（ＮＭ ００４８８７； 配列番号２）を有するＤＮＡを、市販の哺乳類細胞用の発現ベクター「pTargeT（商標）Mammalian Expression Vector（プロメガ社)」のクローニング部位に挿入し、発現ベクター（「ｐＣＬ−ＢＲＡＫ」と呼ぶ）を作製した(Ozawa et al., Biochem Biophys Res Commun 348:406-412 (2006))。
【００３３】
このｐＣＬ−ＢＲＡＫベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、全長ＢＲＡＫ ｃＤＮＡを含む断片を単離して、予め同じ酵素で処理した公知の真核生物発現ベクターである「ｐＣＡＧＧＳベクター」（Niwa et al., Gene 108:193-199 (1991)参照）のクローニング部位に連結し、ＢＲＡＫ発現ベクター（「ｐＣＡＧＧＳ−ＢＲＡＫ」）を作製した。ｐＣＡＧＧＳ−ＢＲＡＫベクターの配列及びＢＲＡＫ挿入断片のセンス配列は、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。ｐＣＡＧＧＳベクターは、サイトメガロウイルスのエンハンサー（「Ｃ」）、ニワトリβ‐アクチンのプロモーター（「Ａ」）、β‐グロビンのスプライシング部位（「Ｇ」）、ウサギβ‐グロビンのポリＡシグナル（「Ｇ」）及びＳＶ４０ウイルスの複製開始点（「Ｓ」）を含む。
ｐＣＡＧＧＳ−ＢＲＡＫベクターの構造を図１に示す。
【００３４】
２． ＢＲＡＫを発現するトランスジェニックマウスの作製
上記のようにして作製したｐＣＡＧＧＳ−ＢＲＡＫベクターを、３２９個のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統のマウス(Charles River Japan,. Inc., Tokyo, Japan)の受精卵に、マイクロインジェクションにより導入した。これらの胚を、Gordonら（Proc Natl Acad Sci USA 77:7380-7384 (1980)）に記載された方法にしたがって、偽妊娠したＣｒ１ｊ：ＣＤ−１(ＩＣＲ)系統の雌マウス(同上)１１匹の輸卵管に移植した。
【００３５】
これらのマウスから生まれた５７匹の仔について、尾からゲノムＤＮＡを採取し、ｈＢＲＡＫ−Ｓ３（フォワード： ５’−ＡＴＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＣＣ−３’；配列番号７）及びｈＢＲＡＫ−Ａ８（リバース： ５’−ＣＣＴＴＣＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣＣ−３’；配列番号８）プライマーを用いてＰＣＲ解析によりトランスジーンの発現を確認した。
【００３６】
ＰＣＲ条件は以下のとおりであった： まず、９４℃、２分間での変性後、３０サイクルの９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；及び７２℃、４０秒を行い、次いで、７２℃で１０分間インキュベーションした後、４℃で保存した。
【００３７】
その結果、５７匹のうち、１０系統がトランスジェニックマウスであることが確認された。ホモ接合のトランスジェニックマウスを、同じ系統の雄及び雌マウスを交配することによって作製した。ホモ接合性は、野生型マウスと交配した場合に１０匹以上の仔がトランスジェニックであったことにより認定した。
【００３８】
以下の実験においては、そのうち、産仔の多い２０系統及び５２系統等を７〜９週齢で使用した。マウスは、１２時間明条件、１２時間暗条件で、餌及び水を自由に摂取させて維持した。
【００３９】
３． ＢＲＡＫトランスジェニックマウスの腎臓におけるトランスジーン及びそのｍＲＮＡの検出
上記で作製したＢＲＡＫトランスジェニックマウス及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腎臓を動物から取り出し、液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。凍結組織を「ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬」(Invitrogen Japan, Tokyo)で処理し、試薬添付の指示書の記載にしたがってＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。
【００４０】
ゲノムＤＮＡは、上記の条件を用いて増幅した。ＲＮＡは、逆転写した後、上記のとおりにＰＣＲ増幅した。ただし、ヒトＢＲＡＫについては、ＨＲ ＢＲＡＫ Ｓ１（フォワード： ５’−ＡＣＧＧＧＴＣＣＡＡＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣ−３’；配列番号９）及びＨＲ ＢＲＡＫ Ａ２（リバース： ５’−ＴＧＡＴＧＡＡＧＣＧＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣ-３’；配列番号１０）プライマーを用いて３０サイクルで行い、マウスβ−アクチンについては、ＭＲ ｂａｃｔｉｎ Ｓ１（フォワード： ５’−ＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧ−３’；配列番号１１）及びＭＲ ｂａｃｔｉｎ Ａ２（リバース： ５’−ＧＣＴＣＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧ−３’；配列番号１２）プライマーを用いて２０サイクルで行った。増幅したｃＤＮＡを、３％アガロースゲルを用いて分離した。
【００４１】
その結果、図２に示すように、肝臓、皮膚、腎臓、肺及び脳のような調べた全ての組織及び器官において、トランスジーン（ヒトＢＲＡＫ）のｍＲＮＡの発現が確認された。
【００４２】
４． マウス血漿中のＢＲＡＫタンパク量の測定
ＢＲＡＫトランスジェニック（Ｔｇ）及び野生型マウス（Ｗｔ）から、２５μlの２００mM ＥＤＴＡ(Wako Pure Chemical Co. Osaka)溶液を入れた試験管中に採血した。５０μlの血漿を、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに入れ（１試料あたり４ウェル）、固相サンドウィッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA; Catalog Number: DY866「DuoSet（登録商標） ELISA Development System, human CXCL14/BRAK」, R&D Systems, Inc. USA）を用いて、キット添付の指示書に基本的にしたがって、ＢＲＡＫタンパクの血漿濃度を決定した。
【００４３】
この方法で測定した場合、マウスＢＲＡＫ及びヒトＢＲＡＫが同じ感度で検出される。野生型マウスの血漿ＢＲＡＫレベルは約０．９ng/ml血漿であり、ヒトにおける血漿ＢＲＡＫレベルと同等であった。一方、トランスジェニックマウスでは約１０倍程度高く、血漿ＢＲＡＫレベルは１１〜１４ng/mlであった（図３）。
【００４４】
５． 腫瘍移植及びインビボでの腫瘍の生育と血漿ＢＲＡＫ濃度との関係
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のルイス肺癌細胞（ＬＬＣ， ＲＣＢ０５５８）及びＢ１６黒色腫細胞（ＲＣＢ１２８３）は、Riken Cell Bank から入手し、硫酸ゲンタマイシン(５０ mg/l, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)及びファンギゾン（２５０ μg/l, Invitrogen Japan, Tokyo）を含有し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ, Thermo Electron Melbourne, Australia）を添加したダルベッコ改変イーグル培地(Sigma, Tokyo)中で培養した。細胞は、９５％大気及び５％ＣＯ２中で３７℃で培養し、０．１％トリプシン（Trypsin 250, Wako /1 mM EDTA in Dulbecco's Mg2+-Ca2+-free phosphate-buffered saline (「ＤＰＢＳ（−）」, TAKARA BIO, Otsu, Japan)を用いて定期的に継代した。
対数増殖期の細胞（１．０×１０５〜３．０×１０６個）をトリプシン処理し、２００μｌのＤＰＢＳ（−)中に懸濁して、１群７〜１０匹の野生型及びトランスジェニックマウスの背部両側の皮下に注入した。
【００４５】
腫瘍の体積（mm３）は、Nishimura ら（Jpn J Cancer Res 91:1199-1203 (2000)）及びOzawaら（Cancer Sci 100:2202-2209 (2009)）に記載されたとおりに、以下の式にしたがって算出した：（ａ×ｂ２）／２
式中、ａは長寸、ｂは短寸（いずれもmm）である。
【００４６】
これらの野生型及びトランスジェニック両マウスについて、上記４．に記載のとおりにして血漿中のＢＲＡＫ濃度を調べたところ、いずれも、移植のない動物と同程度であり、腫瘍の有無によって有意な変化は観察されなかった（図３）。
【００４７】
移植後２０日（１．０×１０５個のＢ１６黒色腫）〜最長５０日（１．０×１０５個のルイス肺癌細胞）までの間の腫瘍の体積を比較した。ＬＬＣ細胞について、注入した腫瘍細胞数にかかわらず、移植したトランスジェニックマウスにおいて形成された腫瘍は、野生型マウスの場合よりも有意に少なかった。しかし、トランスジェニックマウスと野生型マウスとの間に腫瘍サイズの有意差が観察されるまでの期間は、注入された腫瘍細胞数が低い場合は長くなっていた（図４、パネルＡ，Ｂ，Ｃ）。別の系統のトランスジェニックマウスにＬＬＣ細胞を注入した場合も、腫瘍サイズに有意差が観察された（５２系統；図４、パネルＤ）。さらに、Ｂ１６黒色腫細胞を２０系統のトランスジェニックマウスに注入した場合にも、腫瘍サイズの有意な抑制が観察された（図４、パネルＥ）。
【００４８】
腫瘍細胞移植片の有意な増殖抑制が２つの独立のＢＲＡＫトランスジェニックマウス系統で観察されたことから、腫瘍の抑制は、野生型に存在するかもしれない推定腫瘍促進刺激因子の破壊によるものではなく、トランスジェニックマウスにおけるＢＲＡＫの高発現によるものであることが示唆された。また、別の実験（ＲＴ−ＰＣＲ）において、ＬＬＣ又は黒色腫細胞におけるマウスＢＲＡＫ遺伝子の発現を検出できなかったので、トランスジェニックマウスにおいて産生されたＢＲＡＫはパラクリン及び／又はエンドクリン形式で機能することが示唆された。
【００４９】
６． 腫瘍移植片の血管構造についての免疫組織化学実験
ＬＬＣ腫瘍を注入した６日後及び１０日後に腫瘍移植片をトランスジェニックマウス（２０系統（ホモ）及び５７系統（ヘテロ））及び野生型マウスから採取し、Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物（Tissue-Tek, Miles Inc., Elkhart, In）中に包埋し、−８０℃に維持した。凍結組織をクリオスタットで６μｍの切片とし、風乾した切片を、一次抗体としてラット抗ＣＤ３１抗体（ER-MP12; BMA Biomedicals, Switzerland, １：８００希釈）とともにインキュベートし、次いで、二次抗体としてビオチニル化ウサギ抗ラットＩｇＧ（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA １：２５０希釈）とともにインキュベートした。別の切片を、ウサギ抗α‐平滑筋アクチン抗体（E184; Epitomics, Inc., Burlingame, CA １：１００希釈）を一次抗体として用い、次いで二次抗体としてＨＲＰ結合全ロバ抗ウサギＩｇＧ（GE Healthcare, England １：５０希釈）を用いてインキュベートした。いくつかの切片については、一次抗体を省略し、ネガティブコントロールとして用いた。
【００５０】
組織化学染色は、「Ｖｅｃｔａｓｔａｔｉｎ ＤＡＢ」（3,3-diaminobenzidine）基質キット（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）を製造業者の指示書にしたがって、Ｓｕｚｕｋｉら（Immunity 13：691−702（2000））に記載されたとおりに行なった。抗ＣＤ３１又は抗α‐平滑筋アクチン抗体によって陽性に染色された領域を、「Ｂｉｏｚｅｒｏ」（KEYENCE, Tokyo, Japan）及びＶＨアナライザー（同）を用いて２００倍に拡大した５ヵ所のランダムに選択した視野について測定した。
【００５１】
野生型マウス由来の腫瘍は、トランスジェニックマウスにおけるものよりもはるかに大きく、その色は赤く、血液量の多いことを示唆していた。腫瘍に浸潤していた視認可能な血管の数及び直径は、トランスジェニックマウスにおけるよりも野生型マウスにおいてはるかに多く、また大きかった。
腫瘍血管内皮細胞を抗ＣＤ３１抗体で免疫組織化学的に染色したところ、ＣＤ３１陽性細胞の数は、トランスジェニックマウスにおけるよりも野生型マウスにおいてはるかに増大していた。染色された領域は、特に野生型の血管中に位置する陽性細胞において、有意に大きかった（図５）。切片を抗α‐平滑筋アクチン抗体で染色したところ、染色された領域はこの場合においてもトランスジェニックマウスにおけるよりも野生型マウスにおいて有意に大きかった（図５）。
【００５２】
トランスジェニックマウスにおいて腫瘍への血管の侵入の抑制が観察されたことから、ＢＲＡＫが血管新生を抑制したことが示唆された。これらのデータによって、トランスジェニックマウスの腫瘍へのα−平滑筋細胞アクチン陽性細胞の侵入の阻害が、腫瘍内への血管内皮細胞の阻害に加えて起こることが示唆された。したがって、ＢＲＡＫは、血管周囲（perivascular）平滑筋細胞のケモタキシス及び成熟した機能的な微小血管（microvasculature）の形成を阻害することによって、腫瘍への血管の侵入を阻害する可能性がある。
【００５３】
ＢＲＡＫトランスジェニックマウスは、腫瘍抑制に関するＢＲＡＫの機能の分子メカニズム及びＢＲＡＫの生体内での機能を解明するための優れた実験ツールを提供する。
【００５４】
７． トランスジェニックマウスにおけるルイス肺癌細胞の転移抑制実験
１群１７匹の８〜９週齢のマウス（野生型Ｃ５７ＢＬ／６系及びＢＲＡＫトランスジェニックマウス）の尾静脈から１×１０５個のルイス肺癌細胞（上記５．に記載のとおりに培養しトリプシン処理したもの）を注入し、上記の条件下で飼育した。１４日後、頚椎骨折によりマウスを屠殺し、直ちに開胸して肺を摘出し、１０％ホルマリン液で固定した。数時間後に、それぞれの肺の転移巣の数を肉眼で数えた。
【００５５】
結果を図６に示す。野生型マウスにおいては平均７５個の転移巣が確認されたのに対し、ＢＲＡＫを高発現するトランスジェニックマウスにおいては平均約３７個であり、有意に転移巣の形成が抑制されていた（Ｐ＜０．００１）。
２群間の差異が統計学的に有意であるか否かを決定するために、スチューデントｔ−テストを用い、Ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意であるとした。
【００５６】
８． トランスジェニックマウスにおけるＢ１６黒色腫細胞の転移抑制実験
１群６匹の７週齢のマウス（野生型Ｃ５７ＢＬ／６系及びＢＲＡＫトランスジェニックマウス）の尾静脈から２×１０５個のＢ１６黒色腫細胞（上記５．に記載のとおりに培養しトリプシン処理したもの）を注入し、上記の条件下で飼育した。１８日後、頚椎骨折によりマウスを屠殺し、直ちに開胸して肺を摘出し、１０％ホルマリン液で固定した。数時間後に、それぞれの肺の転移巣の数を肉眼で数えた。
【００５７】
結果を図７に示す。野生型マウスにおいては平均１０８個の転移巣が確認されたのに対し、ＢＲＡＫを高発現するトランスジェニックマウスにおいては平均約３６個であり、非常に顕著に転移巣の形成が抑制されていた（Ｐ＜０．００１）。
パネルＡは各群の典型的な肺の例を表す写真である。黒く見えるのが黒色腫細胞の転移巣である。
【００５８】
これらのデータは、ＢＲＡＫがトランスジェニックマウスにおいて腫瘍の転移を抑制したことを示している。
従来の血管新生阻害剤については、腫瘍浸潤及び転移を刺激するといった重篤な副作用を有することが報告されているが、上記のように、ＢＲＡＫによる腫瘍の転移及び増殖抑制のメカニズムは他の公知の血管新生阻害剤のそれと大きく異なっていることが示唆される。ＢＲＡＫトランスジェニックマウスは、２年までの観察期間にわたって何ら異常性を示さず、また、ヒト集団には、正常範囲の１０倍も高い血中レベルでＢＲＡＫタンパクを発現しているが、見かけ上何ら異常の見られない個体が見出されている。したがって、血中ＢＲＡＫタンパクを高レベルで維持しても、重篤な副作用は起こらないことが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする、癌転移抑制剤：
（Ａ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列を有する核酸を発現可能な形態で含む発現ベクター；
（Ｂ）前記（Ａ）の発現ベクターを含む、細胞、組織又は細胞株；
（Ｃ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物。
【請求項２】
前記ＢＲＡＫポリペプチドが、配列表の配列番号４〜６のいずれかによって表される配列を有する、請求項１記載の癌転移抑制剤。
【請求項３】
前記核酸が、配列表の配列番号１〜３のいずれかによって表される配列を有する、請求項１記載の癌転移抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の癌転移抑制剤及び医薬的に許容されうる担体を含有する、医薬組成物。
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかを有効成分として含有することを特徴とする、癌転移抑制剤：
（Ａ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物をコードする配列を有する核酸を発現可能な形態で含む発現ベクター；
（Ｂ）前記（Ａ）の発現ベクターを含む、細胞、組織又は細胞株；
（Ｃ）ＢＲＡＫポリペプチド又はその機能的等価物。
【請求項２】
前記ＢＲＡＫポリペプチドが、配列表の配列番号４〜６のいずれかによって表される配列を有する、請求項１記載の癌転移抑制剤。
【請求項３】
前記核酸が、配列表の配列番号１〜３のいずれかによって表される配列を有する、請求項１記載の癌転移抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の癌転移抑制剤及び医薬的に許容されうる担体を含有する、医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−１２３３０（Ｐ２０１２−１２３３０Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５０１２５（Ｐ２０１０−１５０１２５）
【出願日】平成２２年６月３０日（２０１０．６．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｐｒｉｎｇｅｒｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｊ３４ｖ２０ｒ１１ｊｈ０２ｈ５３／平成２２年３月２４日
【出願人】（５０５０７９７８５）学校法人神奈川歯科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月３０日（２０１０．６．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｐｒｉｎｇｅｒｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｊ３４ｖ２０ｒ１１ｊｈ０２ｈ５３／平成２２年３月２４日
【出願人】（５０５０７９７８５）学校法人神奈川歯科大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
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