癌転移阻害剤
本発明の課題は、癌の転移阻害剤、特に骨転移および肝転移を治療するための有用な薬剤を提供することにある。
本発明により、ＩＧＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質を有効成分とする癌転移阻害剤が提供される。該阻害剤により癌の転移を有意に抑制することができる。
本発明により、ＩＧＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質を有効成分とする癌転移阻害剤が提供される。該阻害剤により癌の転移を有意に抑制することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；以下、ＩＧＦと表記する）−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質を有効成分として含有する癌転移阻害剤に関する。
【背景技術】
癌の転移とは、癌細胞が体中に広がって再増殖することである。患者を死に至らしめる最大の原因は癌転移である。原発部位にとどまる癌は、外科的手術によって比較的簡単に取り除くことができる。しかし、さまざまな部位に転移した癌を外科的手術によって取り除くことは難しい（日経サイエンス１９９６年１２月号ｐ３０）。
癌の転移は特定の臓器に発生しやすい。骨は、肺、肝臓と並んで癌の遠隔転移の主な標的臓器である。特に、前立腺癌、乳癌、肺癌、多発性骨髄腫の患者では、骨に高率に転移する。骨に転移した癌に対して、従来の癌治療法ではほとんど効果が得られず、患者は強い肉体的苦痛および精神的不安に苛まれ、その結果、生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）は著しく損なわれる（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，２，５８４−５９３，２００２、実験医学１６、１４９−１５５、１９９８）。従って、骨転移を治療するための有用な治療方法が求められている。また、肝臓への転移は消化器癌、特に進行大腸癌で高率に発生するため、肝臓への転移は大腸癌の予後を不良にする大きな要因である。従って、肝転移を治療するために有用な治療法が求められている。
癌の骨転移のメカニズムについては、いまだ不明の点が多い。重要なメカニズムの一つとして、骨に豊富に含まれているさまざまな増殖因子が癌細胞の骨転移を促進する可能性が指摘されている。骨に貯蔵されている増殖因子とその貯蔵量（ｎｇ／ｇ乾燥骨重量）は、次の通りである［ＩＧＦ−ＩＩ：１３００−１７００ｎｇ／ｇ、トランスフォーミングβ増殖因子（ＴＧＦβ）：４００−４６０ｎｇ／ｇ、ＩＧＦ−Ｉ：８５−１７０ｎｇ／ｇ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）：５０−７０ｎｇ／ｇ、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）：４０−８０ｎｇ／ｇ、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）：０．５−１２ｎｇ／ｇ、骨形態原性蛋白質（ＢＭＰ）：１−２ｎｇ／ｇ、アクチビン：１ｎｇ／ｇ（実験医学１６、１４９−１５５、１９９８）］。癌細胞自身は骨を破壊することができない。しかしながら、破骨細胞で骨が破壊された後、骨に貯蔵されている上記増殖因子が遊離されて、癌細胞の増殖が促進される可能性が指摘されている。
また、癌の肝転移のメカニズムについても、いまだ不明の点が多い。消化器癌の血行性転移の場合には、原発巣から血流中に遊離した癌細胞は、まず肝臓に到達し、毛細血管床に捕らえられることが多いとの解剖学的な理由から、消化器癌は肝転移しやすいとの可能性が指摘されている。
ＩＧＦと癌の転移の関連性についても、報告がある。ＩＧＦ−Ｉの受容体（以下、ＩＧＦ−ＩＲと表記する）のドミナントネガティブ体をヒト大腸癌細胞株に発現すると、マウスでの肝転移が抑制されることが報告されている（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、８２、１３７７−１３８９、２００２）。また、ＩＧＦ−ＩＲドミナントネガティブ体をヒト乳癌細胞株に発現すると、マウスでの肺、肝、リンパ節への転移が抑制されることが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８、３３５３−３３６１、１９９８）。ルイス肺癌の亜株であるＨ−５９は肝臓に高転移性を示す腫瘍細胞株であるが、肝臓細胞の培養上清に含まれるＨ−５９の増殖を促進する因子を解析した結果、ＩＧＦ−ＩがＨ−５９の増殖促進活性を示すことが報告されている。ルイス肺癌の別の亜株で肺のみに転移するＭ−２７はＩＧＦ−Ｉによる増殖促進活性を持たないことから、癌細胞の肝臓への転移にはＩＧＦ−Ｉが関与していることが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５４、３７３２−３７３７、１９９４）。
実際、ＩＧＦ−ＩＲに対するアンチセンスＲＮＡを発現させることで、高転移性のヒト乳癌細胞のマウスでの造腫瘍性および肺への転移性が低下し、生存期間の延長が認められること（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７，３８４−３９５，２０００）、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体により、マウスに移植されたヒト横紋筋肉腫細胞やヒト乳癌細胞の増殖が抑制されること（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，５５３１−５５３４，１９９４；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，８４，１４１８−１４２３，１９８９；Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２２，１０１−１０６，１９９２）、などＩＧＦ作用の抑制による抗腫瘍効果が報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３２，Ｆ１０５−Ｆ１２６，１９９７）。その一方で、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、マウスに移植されたエストロゲン非依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着を抑制するものの、エストロゲン依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着や生着したヒト乳癌細胞の増殖を抑制できないことが示されており、ＩＧＦ−ＩＲの作用阻害のみでは、充分な抗腫瘍効果が得られないことも示唆されている（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２２，１０１−１０６，１９９２）。
ＩＧＦに対する抗体、すなわち抗ＩＧＦ抗体としては、既にいくつかの抗体が知られている。代表的なヒトＩＧＦ−Ｉに対する抗体（抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体）としては、ｓｍ１．２が報告されている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８１，２３８９−２３９２，１９８４）。ｓｍ１．２は、ｈＩＧＦ−ＩＩと４０％程度の交差反応性を有していること、１〜２μｇ／ｍＬの濃度でウェスタンブロッティング法により、１００ｎｇのｈＩＧＦ−Ｉを検出可能であること、１０〜３０μｇ／ｍＬの濃度で２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉによるマウス繊維芽細胞株ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３の増殖を阻害すること、が明らかとなっている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８１，２３８９−２３９２，１９８４；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９９，２９６１−２９７０，１９９７）。
その他、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体としては、Ｖａｌ５９−ＳｍＣ１２１があり、該抗体は、ヒトインスリンおよびｈＩＧＦ−ＩＩとは反応しないこと、ｈＩＧＦ−Ｉの１０〜１２番目のＬｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐを含むペプチドを認識すること、１２５Ｉ−ｈＩＧＦ−Ｉを用いたラジオイムノアッセイでは、１ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉの検出感度を示したことが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２５，３２７−３３５，１９９０）。４１／８１は、ｈＩＧＦ−ＩＩとは３％の反応性を有しており、また、１２５Ｉ−ｈＩＧＦ−Ｉを用いたラジオイムノアッセイでは、１ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉの検出感度を示す（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４９，１０９−１１２，１９８２）。３５Ｉ１７は、ｈＩＧＦ−ＩＩと０．５％程度の交差反応性を有していること、１μｇ／ｍＬの濃度でのウェスタンブロッティング法により、１μｇのｈＩＧＦ−Ｉを検出可能であること、１２μｇ／ｍＬ以上の濃度でｈＩＧＦ−Ｉによるマウス繊維芽細胞株ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３の増殖を完全に阻害すること、３０μｇ／ｍＬの濃度で１μｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩによるｈＩＧＦ−ＩＲの自己リン酸化を阻害すること、また、１２５Ｉ−ｈＩＧＦ−Ｉを用いたラジオイムノアッセイでは、０．１ｎＭのｈＩＧＦ−Ｉの検出感度を示すことが報告されている（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１６，５１３−５１８，１９９７）。 ＢＰＬ−Ｍ２３は、ｈＩＧＦ−Ｉに対して１０．５ ｌｉｔｒｅｓ／ｎｍｏｌの結合活性を示し、一方、ｈＩＧＦ−ＩＩおよびヒトインスリンには、それぞれ０．８％および０．０００１％の交差反応性を示すこと、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウサギのＩＧＦとは反応性を示すが、ラットおよびマウスのＩＧＦとは反応しないこと、ラット脂肪細胞に対するｈＩＧＦ−Ｉによる脂肪形成を抑制することが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２，２０１−２０６，１９８９）。７Ａ１、１Ｂ３、４Ｃ１、５Ａ７は、ｈＩＧＦ−ＩのＣおよびＤドメインの異なるエピトープを認識すること、ｈＩＧＦ−ＩＩとはそれぞれ６．６％、０．８３％、１２％、１．２％の交差反応性を示すことが報告されている（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１２，７３７−７４４，１９９３）。３Ｄ１／２／１は、ヒトおよびモルモットのＩＧＦ−Ｉとは反応を示すが、ウサギ、ラット、マウスのＩＧＦ−Ｉとは反応しないこと、ｈＩＧＦ−ＩＩとは、７％の交差反応性を示すことが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，５４，４７４−４７６，１９８２）。
代表的なヒトＩＧＦ−ＩＩに対する抗体（抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体）としては、Ｓ１Ｆ２が報告されている。Ｓ１Ｆ２は、ｈＩＧＦ−Ｉと１０％程度の交差反応性を有していること、１μｇ／ｍＬの濃度でのウェスタンブロッティング法により、１０〜１００ｎｇのｈＩＧＦ−ＩＩを検出可能であること、１００μｇ／ｍＬの濃度で１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩによるヒト繊維芽細胞のＤＮＡ合成促進作用を阻害することが明らかとなっている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，７，Ｓ２１−Ｓ２７，１９８９；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２４，８７０−８７７，１９８９）。２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５、ＩＤ９は、ｈＩＧＦ−ＩＩと反応し、ｈＩＧＦ−Ｉとは反応しないこと、競合酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡと表記する）により、１ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩを定量可能であることが報告されている（特開平５−２５２９８７号）。しかしながら、これらの抗体が癌転移の阻害に有用であることは知られていない。
従って、本発明の課題は、癌の転移阻害剤、特に癌の骨転移および肝転移を抑制するために有用な薬剤を提供することにある。
【発明の開示】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（４）の発明を包含する。
（１） インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の活性を阻害する物質を有効成分として含有する癌転移阻害剤。
（２） 物質が、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選ばれる、（１）に記載の阻害剤。
（ａ） ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片
（ｂ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を含む組成物
（ｃ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を組み合わせてなる組成物
（ｄ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片の複合体
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかと他分子を結合させた複合体
（３） 抗体がモノクローナル抗体である、（２）に記載の阻害剤。
（４） 抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、（２）または（３）に記載の阻害剤。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒト前立腺癌細胞ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂの増殖に対する抗体ＫＭ１４６８による増殖阻害活性を示す。横軸は添加サンプルの種類と濃度を、縦軸は細胞増殖を示す。
第２図Ａは、初期転移モデルにおける抗体ＫＭ１４６８の前立腺癌の骨転移阻害活性、第２図Ｃは、進行転移モデルにおける抗体ＫＭ１４６８の前立腺癌の骨転移阻害活性をそれぞれ示す。第２図Ｂは、初期転移モデルにおける抗体ＫＭ１４６８の添加および非添加時の血清中ＰＳＡ濃度、第２図Ｄは、進行転移モデルにおける抗体ＫＭ１４６８の添加および非添加時の血清中ＰＳＡ濃度をそれぞれ示す。
第３図は、ヒト多発性骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６に対するｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるＩＧＦ−ＩＲ、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化、ならびに抗体ＫＭ１４６８、抗体ＫＭ１７６２によるリン酸化抑制をウェスタンブロッティングにより検出した結果を示す。
第４図は、ｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるヒト多発性骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６増殖に対する抗体ＫＭ１４６８（１μｇ／ｍＬ）による増殖阻害活性を示す。
第５図は、ｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるヒト多発性骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６増殖に対する種々の濃度の抗体ＫＭ１４６８による増殖阻害活性を示す。
第６図は、初期転移モデルにおける、抗体ＫＭ１４６８の多発性骨髄腫の骨への転移阻害活性を示す。
第７図は、初期転移モデルにおける、抗体ＫＭ１４６８の乳腺癌の骨への転移阻害活性を示す。
第８図は、大腸癌の肝臓への転移モデルにおいて、抗ＩＧＦ抗体を投与したときの大腸癌細胞株の肝臓への転移の阻害活性を示す。各カラム内の横線は４分位置を示し、それぞれ上から９０、７５、５０、２５、１０％分値位置を表す。各カラムの○は各群における最大値および最小値を示す。
第９図は、大腸癌の肝臓への転移モデルにおいて、抗ＩＧＦ抗体を投与したときの腫瘍切片におけるＡＩ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｅｘ）値を示す。各カラム内の横線は４分位置を示し、それぞれ上から９０、７５、５０、２５、１０％分値位置を表す。各カラムの○は各群における最大値および最小値を示す。
第１０図Ａは、大腸癌の肝臓への転移モデルにおいて、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体を投与したときの大腸癌細胞株の肝臓での転移病巣に対する治療効果を示す。各カラム内の横線は４分位置を示し、それぞれ上から９０、７５、５０、２５、１０％分値位置を表す。第１０図Ｂは、大腸癌の肝臓への転移モデルにおいて、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体を投与したときの延命効果を示す。横軸は投与開始後の経過日数を示し、縦軸は累積生存率を示す。実線は処置群を、破線は無処置群を示す。
第１１図は、モノクローナル抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する特異的な反応性を示す（結合ＥＬＩＳＡ）。横軸は、抗体と抗原の組み合わせを、縦軸は結合活性（ＯＤ４１５）を示す。
第１２図は、モノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を有するｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を示す（競合ＥＬＩＳＡ）。横軸は添加したｈＩＧＦ−Ｉ濃度を、縦軸は結合活性（ＯＤ４１５）を示す。
第１３図は、抗体ＫＭ１４６８およびｓｍ１．２のｈＩＧＦ−Ｉに対する反応を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は結合活性（ＯＤ４１５）を示す。○はＫＭ１４６８、□はｓｍ１．２の反応性をそれぞれ示す。
第１４図は、抗体ＫＭ１４６８およびｓｍ１．２のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合における各種因子による阻害活性を示す。横軸は各種因子濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は結合活性（％）を示す。ＡはｈＩＧＦ−Ｉ、ＢはｈＩＧＦ−ＩＩ、Ｃはヒトインスリン、ＤはｍＩＧＦ−Ｉによるそれぞれの活性を示す。○はＫＭ１４６８、□はｓｍ１．２の反応性をそれぞれ示す。
第１５図は、抗体ＫＭ１４６８、ｓｍ１．２およびＳ１Ｆ２のｈＩＧＦおよびヒトインスリンによるヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７の増殖に対する影響を示す。Ａは各因子による細胞増殖活性を示す。横軸は各種因子濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。○はｈＩＧＦ−Ｉ、●はｈＩＧＦ−ＩＩ、□はヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。ＢはｈＩＧＦ−Ｉ、ＣはｈＩＧＦ−ＩＩ、Ｄはヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖を示す。○はＫＭ１４６８、□はｓｍ１．２、■はＳ１Ｆ２の活性をそれぞれ示す。
第１６図は、抗体ＫＭ１４６８、ｓｍ１．２およびＳ１Ｆ２のｈＩＧＦおよびヒトインスリンによるヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９の増殖に対する影響を示す。Ａは各因子による細胞増殖活性を示す。横軸は各種因子濃度（ｎｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。○はｈＩＧＦ−Ｉ、●はｈＩＧＦ−ＩＩ、□はヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。ＢはｈＩＧＦ−Ｉ、ＣはｈＩＧＦ−ＩＩ、Ｄはヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖を示す。○はＫＭ１４６８、□はｓｍ１．２、■はＳ１Ｆ２の活性をそれぞれ示す。
第１７図は、抗体ＫＭ１４６８、ｓｍ１．２およびＳ１Ｆ２のｈＩＧＦおよびヒトインスリンによるヒト骨肉腫細胞株ＭＧ６３の増殖に対する影響を示す。Ａは各因子による細胞増殖活性を示す。横軸は各種因子濃度（ｎｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。○はｈＩＧＦ−Ｉ、●はｈＩＧＦ−ＩＩ、□はヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。ＢはｈＩＧＦ−Ｉ、ＣはｈＩＧＦ−ＩＩ、Ｄはヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖を示す。○はＫＭ１４６８、□はｓｍ１．２、■はＳ１Ｆ２の活性をそれぞれ示す。
第１８図は、抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合における各種ペプチドによる阻害活性を示す。横軸は各種ペプチド濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は結合活性（％）を示す。用いた各種ペプチドについては、図中に示した。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年８月２１日に出願された日本国特許出願２００３−２９７８７１号、および２００４年５月１０日に出願された日本国特許出願２００４−１３９７０７号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
Ａ．本発明の癌転移阻害剤の有効成分
本発明の癌転移阻害剤の有効成分は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質であればいかなるものでもよい。
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質は、単一の物質であってもよく、複数の物質からなる組成物であってもよく、複数の物質からなる組成物の場合にはそれぞれの物質を同時にまた別々に使用してもよい。
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質としては、
（ａ） ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片
（ｂ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を含む組成物
（ｃ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を組み合わせてなる組成物
（ｄ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片の複合体
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかと他分子を結合させた複合体
などがあげられる。
上記の「ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する」とは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩが有するいずれかの活性を阻害することをいうが、具体的には、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩが有する細胞増殖促進活性を阻害することがあげられる。
本発明で使用される「ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片」とは、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの両方に特異的に結合し、かつＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの両方の活性を阻害する抗体または抗体断片をいう。具体的には、天然型ＩＧＦ−Ｉおよび天然型ＩＧＦ−ＩＩに存在するエピトープを認識する抗体または抗体断片、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの立体構造を認識する抗体または抗体断片などがあげられる。
本発明で使用される上記の抗体または抗体断片は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
また、上記の抗体または抗体断片には、「ヒト以外の動物の抗体」、「遺伝子組換え抗体」、それらの抗体断片なども含まれる。
ここで、「遺伝子組換え抗体」としては、ヒト化抗体、ヒト抗体などがあげられ、また、「ヒト化抗体」としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
「ヒト型キメラ抗体」とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体をいう。ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
また、ヒト以外の動物とは、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどをいう。
「ヒト型ＣＤＲ移植抗体」とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）と連結したＶ領域をコードするｃＤＮＡを設計、構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするｃＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
「ヒト抗体」とは、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を単独で培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を生成蓄積させることができる。
本発明において好ましく使用できる抗体または抗体断片としては、ハイブリドーマＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）が生産するモノクローナル抗体ＫＭ１４６８、または、ｈＩＧＦ−Ｉに反応し、約４０％ｈＩＧＦ−ＩＩにも交差反応する抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体ｓｍ１．２（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ社）などがあげられる。
「ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を含む組成物」としては、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれかと、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれかを含む組成物であればいかなるものでもよい。
ここで用いる「ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片」とは、ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合するが、ＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合しない（交差反応性がない）抗体をいい、例えば、マウスＩＧＦ−１（以下ｍＩＧＦ−Ｉと表記する）に対する抗体であるＡＦ７９１（Ｒ＆Ｄ社製）、ヒトＩＧＦ−Ｉ（以下ｈＩＧＦ−Ｉと表記する）に対するモノクローナル抗体である５６４０８（Ｒ＆Ｄ社製）、Ｍ２３／ＩＬＧ１−００１（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）などがあげられる。
また、「ＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片」とは、ＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合するが、ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合しない（交差反応性がない）抗体をいい、例えば、ｍＩＧＦ−ＩＩに対する抗体であるＡＦ７９２（Ｒ＆Ｄ社製）、ｈＩＧＦ−ＩＩに対するモノクローナル抗体であるＳ１Ｆ２（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ社製）などがあげられる。
また、「ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を組み合わせてなる組成物」とは、「ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片」を含む剤と、「ＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片」を含む剤を別々に調製し、これらの剤を組み合わせて同時にまたは逐次的に用いるための組成物をいう。
「ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片の複合体」としては、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれかと、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれかとを結合させることにより得られる複合体であればいかなるものでもよい。
具体的には、上記の二種類の抗体または抗体断片を下記の手段で結合させた抗体複合体があげられる。
抗体の結合方法としては、化学的に結合させる方法、または蛋白質工学的手法を用いる方法があげられる。
化学的に結合させる方法としては、二種類の抗体分子をＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅやＳ−ａｃｅｔｙｌｍｅｒｃａｐｔｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｈｙｄｒｉｄｅなどの架橋剤を用いて結合する方法などがあげられる。
蛋白質工学的な手法を用いる結合方法としては、蛋白質工学的手法を用いて複数個の抗体あるいは抗体断片を結合した形で発現させられる方法があれば、いかなる方法でも用いることができる。蛋白質工学的な手法と用いる結合方法で作製される抗体複合体としては、二種類のｓｃＦｖを適当なリンカーを介して結合させた分子、二種類の抗体Ｆａｂ’断片を適当なリンカーを介して結合させた分子、二種類のｓｃＦｖをＮ末端とＣ末端に連結したＦｃ融合蛋白質、二種類のｓｃＦｖを連結したＦｃ融合蛋白質のヘテロ分子、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉａｂｏｄｙがＮ末端あるいはＣ末端に連結したＦｃ融合蛋白質などがあげられる。
上述した抗体のいずれかと他分子を結合させた複合体としては、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片；ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を含む組成物；ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を組み合わせてなる組成物；ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片との複合体；のいずれかと少なくとも１種類の他分子を結合させることにより得られる複合体であればいかなるものでもよい。
他分子としては、例えば放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の化合物、蛋白質などがあげられる。放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などの他分子と上述の抗体との結合方法としては、いかなる方法でもよいが、好ましくは化学的に結合させる方法（抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４）、蛋白質工学的手法を用いる結合方法などがあげられる。
化学的な結合方法としては、抗体または抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖のＮ末端側あるいはＣ末端側、抗体または抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖などに上記の他分子を結合させる方法である。
蛋白質工学的手法を用いる結合方法としては、抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい他分子、例えば蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより抗体または抗体断片と他分子を結合させた融合体を製造する方法をあげることができる。
放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉなどがあげられ、例えば、クロラミンＴ法などにより抗体に結合させることができる。
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社、１９９６）、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社、１９８２）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
高分子の化合物としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基の修飾剤（特開昭６１−１７８９２６）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特公昭５６−２３５８７）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特開平２−１１７９２０）などがあげられる。
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２などがあげられる。また、癌細胞を直接障害する活性を有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質と抗体を結合させた複合体ついては、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、複合体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、複合体を製造することができる。
本発明で使用される抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧ型抗体分子を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるＦａｂは、抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧ型抗体分子を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるＦ（ａｂ’）２は、抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるＦａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一とすることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。本発明で使用されるｄｉａｂｏｄｙは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるｄｓＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明で使用されるＣＤＲを含むペプチドは、抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明で使用される抗体または抗体断片は、ＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖に対する阻害活性（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８，４０８３−４０９２，１９８８）などを測定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する活性を評価することができる。
Ｂ．本発明の癌転移阻害剤の有効成分の作製
以下に、本発明で使用される抗体の一つである、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、かつＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片の作製方法ならびに活性評価について記す。
１．ＩＧＦに対するヒト以外の動物のモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
ＩＧＦをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに導入、発現させ、組換え型ＩＧＦ蛋白質を得、これを抗原に用いることができる。あるいは、ＩＧＦ部分配列を有する合成ペプチドを抗原に用いることもできる。
抗原用部分ペプチドとしては、５〜３０残基程度の蛋白質部分配列が選択される。変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得するためには、立体構造上蛋白質の表面に存在している部分配列を抗原ペプチドとして選択する必要がある。立体構造上蛋白質表面に存在する部分は、ジェネティック・マック（Ｇｅｎｅｔｙｘ Ｍａｃ）など市販の蛋白質配列解析ソフトを用い、親水性の高い部分配列を予測することで推測することができる。すなわち、一般的に親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多いためである。また、蛋白質のＮ末端、Ｃ末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。しかしながら、このように選択した部分ペプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
部分ペプチドには蛋白質と架橋するために、システインを末端に付加する。蛋白質の内部配列を部分ペプチドとして選択した場合には、必要に応じペプチドのＮ末端はアセチル化、Ｃ末端はアミド化する。部分ペプチドは一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，１９７９；Ｖｏｌ．２，１９８０；Ｖｏｌ．３，１９８１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ペプチド合成の基礎と実験、丸善、１９８５；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、廣川書店、１９９１；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，１６１−２１４，１９９０）。また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社（以下、ＡＢＩ社と表記する）製ペプチド合成機、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｉｎｃ．社（以下、ＡＣＴ社と表記する）製ペプチド合成機などの市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸あるいはＮα−Ｂｏｃ−アミノ酸などを用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。
原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ＡＢＩ社、島津製作所、国産化学（株）、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社、渡辺化学（株）、ＡＣＴ社またはペプチド研究所（株）などから入手することができる。また、原料となる保護アミノ酸、保護有機酸、保護有機アミンは報告されている合成法に従って、あるいはそれに準じて合成することができる（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，１９７９；Ｖｏｌ．２，１９８０；Ｖｏｌ．３，１９８１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ペプチド合成の基礎と実験、丸善、１９８５；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、廣川書店、１９９１；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，１６１−２１４，１９９０）。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものでもよい。下記に、マウスおよびラットを用いる例について説明する。
３〜２０週令のマウスまたはラットに、上記１（１）で調製した抗原を免疫し、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に適当なアジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。アジュバントとしては、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどがあげられる。また、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する）やＫｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（以下、ＫＬＨと表記する）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いることができる。各抗原の投与後３〜７日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、抗原として用いたｈＩＧＦに対する反応性をＥＬＩＳＡなどで確認し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源とする。抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウスまたはラットより公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に準じて脾臓などを摘出し、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である８−アザグアニン耐性骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０，１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）など、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に従い、細胞融合時までに２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングリコール−１０００（以下、ＰＥＧ−１０００と表記する）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁する。細胞の洗浄にはＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＭＥＭと表記する）またはＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと表記する）などを用いる。また、融合細胞を懸濁する培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、ＨＡＴ培地｛通常培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地に１．５ｍＭグルタミン、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび１０％牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）を加えた培地］に０．１ｍＭヒポキサンチン、１５μＭチミジンおよび０．４μＭアミノプテリンを加えた培地｝を用いる。
培養後、培養上清の一部を取り、ＥＬＩＳＡにより抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。次いで、限界希釈法により単一細胞化を行い、ＥＬＩＳＡにより安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
（５）ハイブリドーマの選択
抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に従い、以下に述べるＥＬＩＳＡにより行う。これらの方法により、後述する抗ｈＩＧＦキメラ抗体、抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体またはそれらの抗体断片を産生する形質転換株の培養上清中に含まれる抗体あるいはすべての精製抗体の結合活性を測定することができる。
ＥＬＩＳＡ
抗原を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ハイブリドーマなどの培養上清あるいは精製抗体を第一抗体として反応させる。第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。第二抗体としては、第一抗体を認識することができる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗体を用いる。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としてはマウス抗体を認識できる抗体を用いる。反応後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして選択する。
当該ハイブリドーマの具体例としては、ハイブリドーマＫＭ１４６８などがあげられる。ハイブリドーマＫＭ１４６８は、２００２年３月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６ 郵便番号 ３０５−８５６６）にプタベスト条約の規定下でＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８として寄託されている。
（６）モノクローナル抗体の精製
０．５ｍＬのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、１（４）で得られた抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５×１０６〜２×１０７細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはセルロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）のカラムなどを用いて、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質濃度は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４があげられる。
（７）モノクローナル抗体の活性評価
（７−１）ｈＩＧＦへの結合活性評価
培養上清中あるいは精製した抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体のｈＩＧＦに対する結合活性は、上記１（５）のＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，２２９−２４０，１９９１）などにより測定することができる。また、ｈＩＧＦおよびｈＩＧＦの部分ペプチドを用いた競合ＥＬＩＳＡにより、ｈＩＧＦとの反応性および抗原エピトープを解析することができる。抗体がｈＩＧＦの立体構造を認識しているか否かは、通常行われる立体構造的解析法、あるいは種々の免疫学的測定法を組み合わせることにより、推測することができる。立体構造解析法としては、例えば、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴法などがあげられる。種々の免疫学的測定法を組み合わせる方法としては、例えば、非変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法と変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法を組み合わせる方法があげられる。このとき、非変性状態の抗原にのみ反応性を示す抗体は、抗原の立体構造を認識している可能性が高いものと推測できる。非変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法とは、液層中で非変性抗原と抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法などがあげられる。変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法としては、抗原がもとの立体構造を保持していない状態で抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法であればいずれでもよく、例えば、疎水性の反応プレート上に直接固定化した抗原や、適当な長さに消化した部分ペプチドなどに対するＥＬＩＳＡ法があげられる。
本発明の抗体は、該結合活性測定法または競合ＥＬＩＳＡにより、ｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性とｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性とを有する抗体を選択することにより取得することができる。
また、ｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株に対する影響を検討することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈＩＧＦの活性を阻害する活性を測定することができる。ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ依存的な増殖を示す細胞株としては、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）、ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２４２２）などがあげられる。
さらに、マウスなどの動物を用いてｈＩＧＦ依存的な細胞増殖測定系を確立し、該測定系に対する影響を検討することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｈＩＧＦの活性を阻害する活性を測定することができる。
（７−２）癌転移阻害活性評価
癌転移阻害活性の評価方法としては、Ｙｏｎｏｕら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，２１７７−２１８２，２００１）のヒト前立腺癌のヒト骨への転移評価系等を用いる方法があげられる。
２．ＩＧＦに対するヒト以外の動物のポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体は、上記１．（２）に示された方法で免疫を施した動物のうち、その血清が十分な抗体価を示した動物の血清から調製することができる。
即ち、該動物から回収した血液から遠心分離法により分画した血清、あるいは該血清から常法に従って免疫グロブリン画分を精製し、ポリクローナル抗体を調製することができる。該ポリクローナル抗体の活性は、上記１．（７）に記載の方法により、抗原に対する結合活性を評価することができる。
３．ヒト化抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとしては、ヒト抗体のＣＨおよび／またはＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであればいかなるものでもよい。ヒト化抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）などがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７，２２３−２３２，１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７８，１５２７−１５３１，１９８１）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３−１８０，１９９０）などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１４９，９６０−９６８，１９８７）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，４１，４７９−４８７，１９８５）とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，３３，７１７−７２８，１９８３）などがあげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１−２７８，１９９４）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９−５６７，１９９８）などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得する。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分あるいはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマから全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３−２８，１９８７）、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）などがあげられる。また、ハイブリドーマからｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）、あるいは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８−６１，１９９２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４，１９８９）、λＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９，１９８５）、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２８０−２８９，１９８３）およびｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９，１９８５）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，２７１−２８９，１９９２）、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５９，１７７−１９０，１９６８）、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８−７８２，１９８３）、ＮＭ５２２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，１−１９，１９８３）、Ｋ８０２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１１８−１３３，１９６６）およびＪＭ１０５（Ｇｅｎｅ，３８，２７５−２７６，１９８５）などが用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と表記する；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、ジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７４，５４６３−５４６７，１９７７）などの反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（ＡＢＩ社製）などを用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌のためのシグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することによって見出すことができる。
さらに、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどに対してＢＬＡＳＴ法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０，１９９０）などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、５’末端に適当な制限酵素の認識配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを増幅し、それぞれを上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮して塩基配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記３（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、上記３（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６−２７１，１９９１）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６−２７１，１９９１）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１２，５３５−５４２，１９７７）あるいはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１−１５０７，１９９４）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて上記３（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について上記３（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、上記３（４）および（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、上記３（４）および（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることができる。
（７）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記３（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などにより測定できる。
（８）ヒト化抗体の安定発現
上記３（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）などがあげられる。ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と表記する）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換体は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡにより測定できる。また、形質転換細胞は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系などを利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）やウェスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などで測定することができる。
（９）ヒト化抗体の活性評価
ヒト化抗体の活性評価は、上記１（７）と同様にして行うことができる。
４．抗体断片の作製
抗体断片は、上記１および２に記載の抗ｈＩＧＦ抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うなどの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、ペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素を用いた部位特異的切断、精製などの方法があげられる。
抗体断片として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドの製造法について以下に具体的に説明する。
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。また、Ｆａｂは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１−１０４３，１９８８）などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。
（２）Ｆ（ａｂ’）２の作製
Ｆ（ａｂ’）２は、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。また、下記４（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢ［５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）］で処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、上記４（２）に記載のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１０，１６３−１６７，１９９２）などがあげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラムなどを用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、ｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＆ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８−５６，１９９４）などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（５）ｄｉａｂｏｄｙの作製
ｄｉａｂｏｄｙは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶＨとＶＬをリンカーがコードするアミノ酸残基が８残基以下となるように連結したＤＮＡを作製し、ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターにクローニングし、ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを作製することができる。ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターとしては、ｄｉａｂｏｄｙのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８，１９９４）などがあげられる。ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにｄｉａｂｏｄｙを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｉａｂｏｄｙとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。まず、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにｄｓＦｖを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからＶＨおよびＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）。
（７）ＣＤＲペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからＣＤＲペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）。
（８）抗体断片の活性評価
精製した抗体断片の活性評価は、上記１（７）と同様にして行うことができる。
Ｃ．本発明の癌転移阻害剤
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質、具体的には、上記のようにして調製されるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片は、癌転移阻害作用を有するため癌転移阻害剤として有用である。また、該抗体または抗体断片は癌の転移先の転移巣において、転移後増殖を開始し、病態が進行してしまった転移巣に対して、病態の進行を抑制する活性を有するため、転移巣の治療剤としても有用である。
本発明の癌転移阻害剤の対象疾患としては原発巣から転移することが統計的に頻度が高いものであれば特に限定はされないが、各種悪性及び良性腫瘍、例えば、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌などがあげられる。
本発明の癌転移阻害剤は、特に、「ｈＩＧＦ依存性増殖癌」の転移に有効である。「ｈＩＧＦ依存性増殖癌」とは、ｈＩＧＦ存在下で増殖し、ｈＩＧＦ濃度に依存して増殖度が増加する癌のことをいい、たとえば前立腺癌、大腸癌、乳癌、骨肉腫などがあげられる。
上記の各種悪性及び良性腫瘍が転移する先の転移巣としては、ヒトの器官において癌の転移が認められる器官であればいかなる器官も包含される。これらの器官のうち、転移がよく認められる器官としては、例えば、肝臓、腎臓、胃、大腸、膵臓、乳腺、前立腺、膀胱、肺、気管支、脳、神経、リンパ節、副腎、骨などがあげられる。
本発明の癌転移阻害剤は、「ｈＩＧＦ依存性増殖癌」の転移に有効であるため、上記の各器官のうち、ｈＩＧＦが器官内に存在している器官への癌転移に特に有効であり、このようなｈＩＧＦが器官内に存在している器官としては、例えば、肝臓、骨などがあげられる。
癌転移としては、血管やリンパ管を介した他所性転移以外に、血管やリンパ管を介さない同所性転移なども本発明の癌転移に包含される。
本発明の具体的な癌転移としては、例えば、前立腺癌の骨転移、大腸癌の肝転移、乳癌の骨転移、または多発性骨髄腫などの骨髄腫の骨転移などがあげられる。
本発明の癌転移阻害剤は、有効成分であるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質（以下、阻害物質と記す）である抗体または抗体断片を単独で含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
本発明の癌転移阻害剤の投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができるが、静脈内投与が好ましい。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該阻害物質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該阻害物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該阻害物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
本発明の癌転移阻害剤の投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
本発明の癌転移阻害剤の投与対象は、原発巣または転移巣が同時、またはそれぞれ単独で臨床的に確認される癌患者であり、外科療法、化学療法、放射線療法、その他全ての癌の治療法の施療の有無を問わない。
原発巣のみが臨床的に認められている癌患者であっても、原発巣以外の部位に臨床的に発見が困難な転移がある場合がある。このような臨床的に発見が困難な転移は、原発巣の治療後に、癌の再発の原因となる。本発明の癌転移阻害剤は、癌の転移巣に有効であるため、転移後の再発の予防剤としても使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を何ら限定するものでない。
（実施例１） 抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８による前立腺癌細胞株の骨転移阻害効果の検討
（１）ｈＩＧＦ−Ｉによるヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞の増殖に対する影響
癌転移阻害試験に先立ち、ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２４２２）細胞の増殖が、ｈＩＧＦ−Ｉにより影響を受けるかを調べた。
１ウェルあたり５×１０５個のＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞を６ウェルプレートに播種し、２０％ウシ胎児血清（ＳＩＧＭＡ社製）を含んだＦ１２Ｋ（＋）培地｛Ｆ１２Ｋ（ＳＩＧＭＡ社製）に、２５ｎｇ／ｍＬコレラトキシン（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒト上皮成長因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１００ｐｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（ＳＩＧＭＡ社製）、０．１ｎＭジヒドロテストステロン（ＳＩＧＭＡ社製）、１／１００容量ＩＴＳ−Ｘサプリメント（×１００）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を添加したもの｝を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で静置培養した。４８時間の培養後、各ウェルの培地に、無添加、または１、１０あるいは１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）をそれぞれ添加した無血清Ｆ１２Ｋ培地（ＳＩＧＭＡ社製）に交換した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で、無血清培地に交換してから４８時間静置培養した後、細胞を回収してトリパンブルー染色により各ウェルの生細胞数を測定した。結果を第１図に示した。
第１図に示したように、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞はｈＩＧＦ−Ｉ濃度依存的に増殖が促進されることが明らかとなった。
（２）ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な細胞増殖に対する抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の影響
前項（１）で記載したｈＩＧＦ−Ｉ依存的に増殖するＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞を用いて、ｈＩＧＦ−Ｉの依存的な細胞増殖が、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８（以下、抗体ＫＭ１４６８と記す）により影響を受けるかを調べた。抗体ＫＭ１４６８は、後記参考例１に従って調製した。
実施例１（１）と同様にＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で４８時間培養した後、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）および最終濃度０、０．１、１、１０μｇ／ｍＬ抗体ＫＭ１４６８をそれぞれ添加した無血清Ｆ１２Ｋ培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で、静置培養した。無血清培地に交換してから４８時間後、細胞を回収してトリパンブルー染色により各ウェルの生細胞数を測定した。結果を第１図に示した。
第１図に示したように、抗体ＫＭ１４６８はｈＩＧＦ−Ｉ依存的なＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞の増殖を阻害した。また、その増殖阻害活性は、抗体ＫＭ１４６８濃度依存的であった。また、ネガティブコントロールである抗体ＫＭ１７６２（抗アベルメクチン抗体）は増殖を全く阻害しなかった。
（３）抗体ＫＭ１４６８による前立腺癌細胞株の骨転移阻害効果および転移巣に対する治療効果の検討
ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞のヒト骨への転移モデルを用いて、抗ｈＩＧＦ抗体の骨転移阻害効果および転移巣に対する治療効果を検討した。
Ｙｏｎｏｕらの手法（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，２１７７−２１８２，２００１）に従って調製した約１ｃｍ３のヒト骨組織片を、６−８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア）に皮下移植した。ヒト骨組織片の移植から４週間経過後、ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞を４×１０７個／ｍＬになるように無血清培地に懸濁し、細胞懸濁液１００μＬを移植したヒト骨組織片に注入した。初期転移モデルでは、ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞の移植と同時に抗体の投与を開始した。一方、進行転移モデルでは、ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞の移植から４週間経過した時点で抗体の投与を開始した。
各モデルにおけるマウスを、抗体ＫＭ１４６８を投与したマウス群（以下、処置群と表記する）、陰性対象として抗体ＫＭ１７６２（抗アベルメクチン抗体）を投与したマウス群（以下、無処置群と表記する）とに分けて、各群のマウスに抗体の投与を１回／週、４週間の腹腔内投与で行った。処置群での一回当たりの抗体ＫＭ１４６８投与量は、初期転移モデルでは０．０１、０．１または２ｍｇ／ｋｇとし、進行転移モデルでは０．１、２または１０ｍｇ／ｋｇとした。無処置群での一回当たりの抗体ＫＭ１７６２投与量は、初期転移モデルでは２ｍｇ／ｋｇとし、進行転移モデルでは１０ｍｇ／ｋｇとした。同時試験数は、処置群、無処置群共にそれぞれ９〜１０匹のマウスを用いて行った。両モデルとも、投与を開始してから４週間後に移植した骨組織の摘出し、同時に全採血を行った。
摘出したヒト骨組織を切片化し、骨組織中の腫瘍細胞が占める面積を、ＫＳ ３００ｓｙｓｔｅｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．００画像解析装置（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製）を用いて解析した。また採取した血液から血清画分を分取し、前立腺癌の血清腫瘍マーカーである前立腺特異的抗原（以下、ＰＳＡと表記する）濃度を、ラジオイムノアッセイキット（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ社製）を用いて測定した。
初期転移モデルのマウスから摘出したヒト骨組織に占める転移腫瘍細胞の面積の割合を第２図Ａに示し、進行転移モデルのマウスから摘出したヒト骨組織に占める転移腫瘍細胞の面積の割合を第２図Ｃに示した。初期転移モデル（第２図Ａ）の無処置群では、ヒト骨組織に占める腫瘍面積の割合は６％だったが、同モデルの処置群では、無処置群と比較して投与した抗体量依存的に腫瘍面積の割合が減少していた。２ｍｇ／ｋｇの最大投与量では、腫瘍面積の割合は無処置群と比較して約１／２０に減少していた。同様に、進行転移モデル（第２図Ｃ）においても、無処置群では骨組織内の腫瘍面積の割合が３８％であったが、同モデルの処置群では、無処置群と比較して投与した抗体量依存的に腫瘍面積の割合が減少していた。１０ｍｇ／ｋｇの最大投与量では、腫瘍面積の割合は無処置群と比較して約１／４に減少していた。
初期転移モデルのマウスの血清ＰＳＡ濃度を第２図Ｂに、進行転移モデルのマウスの血清ＰＳＡ濃度を第２図Ｄに示した。初期転移モデル（第２図Ｂ）の無処置群では、血清ＰＳＡ濃度が約５ｎｇ／ｍＬであったが、同モデルの処置群では無処置群と比較して投与した抗体量依存的に血清ＰＳＡが減少していた。２ｍｇ／ｋｇの最大投与量では、血清ＰＳＡは無処置群と比較して約１／１０に減少していた。同様に、進行転移モデル（第２図Ｄ）においても、無処置群では血清ＰＳＡ濃度が約４５ｎｇ／ｍＬであったが、同モデルの処置群では無処置群と比較して投与した抗体量依存的に血清ＰＳＡが減少しており、１０ｍｇ／ｋｇの最大投与量では、血清ＰＳＡは無処置群と比較して約１／２に減少していた。
以上のことから、抗体ＫＭ１４６８は、マウス体内に移植されたヒト骨組織へのヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞の生着を阻害するだけでなく、生着後、時間が経過し、増殖してしまった癌細胞の増殖を阻害する活性を有していることが示された。従って、抗体ＫＭ１４６８は前立腺癌の骨転移を阻害するのみならず、転移巣に対しても有効な治療効果を有することが明らかとなった。
（実施例２） 抗体ＫＭ１４６８による多発性骨髄腫細胞株の骨転移阻害効果の検討
（１）ｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞への影響
骨転移阻害効果試験に先立ち、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１５５）に対するｈＩＧＦ−Ｉ刺激による影響をウェスタンブロッティング（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｏｒ１２，１９８８）により調べた。このとき、それぞれリン酸化されたＩＧＦ−ＩＲ、Ａｋｔ（別称：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｂ）およびＭｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＭＡＰＫと記す）に特異的に反応する抗体を用いて、ＩＧＦ−ＩＲ、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化を検出した。
各６×１０６個のＲＰＭＩ８２２６細胞を無血清条件下で２４時間培養した後、ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）をそれぞれ０、１または１０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加して、３０分間の刺激を与えた。刺激後の細胞は冷却したリン酸緩衝液にて洗浄後回収し、２００μＬのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ［１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ＮＰ４０、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、８μＬのｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍｉｘｔｕｒｅ（１ ｔａｂｌｅｔ／ｍｌ Ｈ２Ｏ）、１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅおよび１０ｍＭ ＮａＦを添加した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）］に溶解して氷上で３０分間静置した後、遠心分離により上清を回収し、蛋白抽出を行った。
抽出したタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した後、定法に従ってメンブレンに転写し、各種抗体との反応性をウェスタンブロッティング（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｏｒ１２，１９８８）により検討した。
リン酸化されたＩＧＦ−ＩＲ、ＡｋｔまたはＭＡＰＫを認識する抗体として、それぞれ、抗リン酸化ＩＧＦ−ＩＲポリクローナル抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）または抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を、リン酸化および非リン酸化の区別無くＩＧＦ−ＩＲ、ＡｋｔまたはＭＡＰＫを認識する抗体として、それぞれ、抗ＩＧＦ−ＩＲβ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）または抗ＭＡＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。結果を第３図に示した。
第３図に示したように、ｈＩＧＦ−Ｉによる刺激により、ｈＩＧＦ−ＩＲおよびＡｋｔのリン酸化が亢進した（第３図のレーン１、６および７）。一方、ｈＩＧＦ−ＩＲ、Ａｋｔ、リン酸化ＭＡＰＫおよびＭＡＰＫの発現変動は認められなかった。
このことは、ｈＩＧＦ−Ｉによる刺激が、ＭＡＰＫを介する細胞増殖シグナルではなく、リン酸化されたＩＧＦ−ＩＲからＡｋｔのリン酸化を介した細胞生存シグナルを伝達することを示している。
（２）ｈＩＧＦ−Ｉの刺激に対する抗体ＫＭ１４６８の阻害効果の検討
前項（１）に記述したウェスタンブロッティングにより、ｈＩＧＦ−Ｉの刺激に対する抗体ＫＭ１４６８の阻害効果を検討した。抗体ＫＭ１４６８またはネガティブコントロール抗体であるＫＭ１７６２（抗アベルメクチン抗体）は、無血清条件下でｈＩＧＦ−Ｉ添加前に添加した。抗体ＫＭ１７６２は１μｇ／ｍＬの濃度で、抗体ＫＭ１４６８は０．１、１または１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。結果を第３図に示した。
第３図に示したように、抗体ＫＭ１７６２ではリン酸化は抑制されない（第３図のレーン８）が、抗体ＫＭ１４６８は濃度依存的にｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるｈＩＧＦ−ＩＲおよびＡｋｔのリン酸化を抑制できることが確認された（第３図のレーン９〜１１）。
同様にＲＰＭＩ８２２６細胞を用いて、ｈＩＧＦ−Ｉ刺激による細胞増殖に対する抗体ＫＭ１４６８の増殖阻害効果をトリパンブルー染色による生細胞数測定により、検討した。
無血清培地ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社製）で培養したＲＰＭＩ８２２６細胞を１ウェルあたり２×１０５個で６ウェルプレートに播種し、各ウェルに、ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）を無添加、もしくは１ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、さらに、ネガティブコントロール抗体である抗体ＫＭ１７６２または抗体ＫＭ１４６８を１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で静置培養し、２４時間毎に生細胞数の測定を行い、９６時間後まで計測した。結果を第４図に示した。
第４図に示されるように、７２時間と９６時間では、ｈＩＧＦ−Ｉで刺激された細胞の増殖は、抗体ＫＭ１４６８によって抑制されることが有意差を持って示された（ｐ＜０．０００１）。
さらに、同様の実験において、抗体ＫＭ１４６８の濃度を段階的に変更し、９６時間静置培養した後の生細胞数を測定した結果を第５図に示した。
第５図に示されるように、抗体ＫＭ１４６８の濃度依存的にＲＰＭＩ８２２６細胞の増殖は抑制されることが確認された。
以上のことから、抗体ＫＭ１４６８はｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるｈＩＧＦ−ＩＲからＡｋｔのリン酸化を介した細胞生存シグナルを阻害することにより、ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な増殖を示す多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞の増殖を阻害できることが示された。
（３）抗体ＫＭ１４６８による多発性骨髄腫細胞株の骨転移阻害効果の検討
ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞を用いてヒト骨での腫瘍形成モデルを作製し、抗体ＫＭ１４６８の骨内での腫瘍形成に対する抑制効果の検討を行った。
Ｙｏｎｏｕらの手法（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，２１７７−２１８２，２００１）に従って作製した約１ｃｍ３のヒト骨組織片を、６−８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア）に皮下移植した。ヒト骨組織片の移植から４週間経過後、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞を１×１０７個／ｍＬになるようにリン酸緩衝液に懸濁し、細胞懸濁液５０μＬを移植したヒト骨組織片に注入した。さらにヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞の移植と同時に抗体ＫＭ１４６８の投与を開始した。
抗体の効果を判定するために抗体ＫＭ１４６８を投与したマウス群（以下、処置群と表記する）、陰性対象として抗体ＫＭ１７６２を投与したマウス群（以下、対照処置群と表記する）とに分けて、各群のマウスに週１回の割合で４週間に渡って抗体の腹腔内投与を行った。処置群での１回当たりの抗体ＫＭ１４６８の投与量は、０．１または１ｍｇ／ｋｇとした。対照処置群での１回当たりの抗体ＫＭ１７６２の投与量は０．１ｍｇ／ｋｇとした。試験数は、処置群ではそれぞれ１０匹、対照処置群では５匹のマウスを用いて行った。投与を開始してから４週間後に移植した骨組織を摘出し、以下の方法で抗体ＫＭ１４６８の投与効果の判定を行った。
摘出したヒト骨組織を切片化し、骨組織中の腫瘍細胞が占める面積を、ＫＳ ３００ｓｙｓｔｅｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．００画像解析装置（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて解析した。結果は第６図に示した。
第６図に示したように、対照処置群では、ヒト骨組織に占める腫瘍面積の平均値は１８．５２±９．１７３ｍｍ２／ｃｍ２であったのに対して、処置群では０．１ｍｇ／ｋｇの濃度で抗体ＫＭ１４６８を投与した場合では、２．５３０±０．９０６４ｍｍ２／ｃｍ２（ｐ＝０．０２６０）であり、また１ｍｇ／ｋｇの濃度で抗体ＫＭ１４６８を投与した場合では、１．８９０±１．０９８ｍｍ２／ｃｍ２（ｐ＝ａｎｄ ０．０２２６）といずれも対照処置群と比較して腫瘍面積の減少が認められた。
以上のことから、抗体ＫＭ１４６８は、マウス体内に移植されたヒト骨組織でのヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞の生着、増殖を阻害することができ、ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な多発性骨髄腫の骨転移を阻害できることが示された。
（実施例３） 抗体ＫＭ１４６８による乳腺癌細胞株の骨転移巣に対する治療効果の検討
抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の乳癌骨転移巣に対する治療効果を、ヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）細胞のヒト骨への転移モデルを用いて検討した。ヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７は、参考例２の（３）で示されるように、ｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株である。
Ｙｏｎｏｕらの手法（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，２１７７−２１８２，２００１）に従って調製した約４００ｍｍ３のヒト骨組織片を、６−８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア）に皮下移植した。ヒト骨組織片の移植から４週間経過後、ヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７細胞を１×１０８個／ｍＬになるように無血清培地に懸濁し、細胞懸濁液５０μＬを移植したヒト骨組織片に注入した。さらに、ヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７細胞の移植と同時に抗体の投与を開始した。
抗体ＫＭ１４６８を投与したマウス群（以下、処置群と表記する）、陰性対象として抗体ＫＭ１７６２を投与したマウス群（以下、対照処置群と表記する）とに分けて、各群のマウスに週１回の割合で、４週間に渡って抗体の腹腔内投与を行った。処置群および対照処置群での一回当たりの抗体の投与量は２ｍｇ／ｋｇとした。同時試験数は、処置群、対照処置群共にそれぞれ１２匹のマウスを用いて行った。いずれの群においても、抗体の投与を開始してから４週間後に移植した骨組織を摘出した。
摘出したヒト骨組織を切片化し、骨組織中の腫瘍細胞が占める面積を、ＫＳ ３００ｓｙｓｔｅｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．００画像解析装置（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製）を用いて解析した。結果は第７図に示した。
第７図に示したように、対照処置群では、ヒト骨組織に占める腫瘍面積は平均２．７０ｍｍ２だったが、処置群では、対照処置群と比較して腫瘍面積は平均０．８５ｍｍ２と約３０％に減少した。以上のことから、抗体ＫＭ１４６８は、マウス体内に移植されたヒト骨組織におけるヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７細胞の生着増殖を阻害することができ、ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な乳癌の骨転移を阻害できることが示された。
（実施例４） 抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体および抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体による、大腸癌肝臓転移阻害効果
抗ｍＩＧＦ抗体のヒト大腸癌細胞株ＨＴ２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）細胞の肝臓への転移抑制効果を確認するため、マウスを用いて以下の実験を行った。
ＨＴ２９細胞を２×１０７個／ｍＬになるようにＰＢＳに懸濁し、該懸濁液２００μＬを９−１０週齢のオスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア）の脾臓の被膜下に注入して移植した。ＨＴ２９細胞の移植と同時に、各マウスを各種処置群および無処置群からなる以下の５群に分け、抗体およびＰＢＳの投与を行った。併せて、各群の同時再現数を示した。
１．無処置群（ＰＢＳ投与）；１０匹
２．抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９１）単独投与群；８匹
３．抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９２）単独投与群；６匹
４．抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９１）と抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９２）併用投与群；７匹
５．抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９１）と抗体ＫＭ１４６８併用投与群；７匹
投与は、ＨＴ２９細胞の移植同日より開始し、１回／週で４週間にわたり腹腔内に施した。処置群における一回当たりの投与量は、各抗体が一匹当たり２．５μｇとなるようにし、無処置群には同容量のＰＢＳを投与した。ＨＴ２９細胞は、腫瘍マーカーである癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと表記する）を分泌するため、マウス血清中のＣＥＡ値をアーキテクトＴＭ．ＣＥＡキット（ダイナボット社製）を用いて測定し、肝臓における腫瘍細胞の増殖の指標とした。
第８図には、腫瘍移植後２８日目のマウス血清中のＣＥＡ値を示した。無処置群と比べて、それぞれ抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体または抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体の単独投与群では、腫瘍増殖を部分的に抑制した。一方、抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体の併用投与群および抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗体ＫＭ１４６８併用投与群は、各抗体の単独投与群に比べて、顕著な腫瘍の増殖抑制活性を示した。抗体ＫＭ１４６８はヒトのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを中和する抗体であるが、マウスＩＧＦファミリーに対してはＩＧＦ−ＩＩを選択的に中和する活性を示すことから、抗体ＫＭ１４６８はｍＩＧＦ−ＩＩに対する中和抗体として機能していると考えられる。以上のことから、腫瘍細胞の転移には、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両者が関与しており、腫瘍の抑制に対してＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方の活性を同時に阻害することが効果的であることが明らかとなった。
さらに、抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗体ＫＭ１４６８併用投与群の腫瘍増殖抑制活性の機構を解析する目的で、上記の無処置群および抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗体ＫＭ１４６８併用投与群について腫瘍移植後２８日目のマウスの肝臓の転移病巣より腫瘍切片を作製し、免疫組織化学的検討を行なった。肝臓を切除後、３０％ホルマリンで固定後、パラフィン包埋し、厚さ５μｍの切片を作製した。切片をＨ＆Ｅ染色（病理標本の作り方、病理技術研究会編、１９９２）およびＥｎＶｉｓｏｎシステム（ＤＡＫＯ社製）を用いて抗ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、２００倍希釈で使用）で染色した。検出にあたっては、切片をクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でマイクロウェーブ処理（９５℃、２０分）を行い、抗原を賦活化して用いた。その結果、Ｈ＆Ｅ染色で抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗体ＫＭ１４６８併用投与群において、無処置群と比べて多数のアポトーシス小体が観察され、また、抗ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３抗体で染色されるアポトーシス細胞の増加が認められた。
アポトーシス誘導の指標（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｅｘ：ＡＩ）として、１０００個の腫瘍細胞あたりのｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３陽性細胞の割合（％）を求め、グラフ化した結果を第９図に示した。無処置群と比べて、処置群では有意なアポトーシス細胞の増加が認められた。以上の結果から、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方の活性を同時に阻害することにより、腫瘍細胞のアポトーシスが誘導され、腫瘍増殖が抑制されることが明らかとなった。
（実施例５） 抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体および抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体による、大腸癌の肝臓での転移病巣に対する治療効果
抗ｍＩＧＦ抗体のヒト大腸癌細胞株ＨＴ２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）細胞の肝臓での転移病巣に対する治療効果を確認するため、マウスを用いて以下の実験を行った。
ＨＴ２９細胞を２×１０７個／ｍＬになるようにＰＢＳに懸濁し、該懸濁液２００μＬを９−１０週齢のオスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア）の脾臓の被膜下に注入して移植した。ＨＴ２９細胞の移植２週間後、肝臓に転移が成立後に、マウスを以下の処置群、無処置群に分け、抗体およびＰＢＳの投与を行った。併せて、各群の同時再現数を示した。
１．無処置群（ＰＢＳ投与）；８匹
２．処置群（抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗体ＫＭ１４６８併用投与群）；９匹
抗体はＨＴ２９細胞の移植２週間後より投与を開始し、１回／週、４週間の腹腔内投与を行った。処置群における一回当たりの投与量は、マウス体重１ｇ当たり、抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９１）が０．１μｇ、抗体ＫＭ１４６８が１μｇとし、無処置群には同容量のＰＢＳを投与した。マウス血清中のＣＥＡ値をアーキテクトＴＭ．ＣＥＡキット（ダイナボット社製）を用いて測定し、肝臓における腫瘍細胞の増殖の指標とした。
第１０図Ａには、投与開始後２８日目のマウス血清中のＣＥＡ値を示した。無処置群と比べて、処置群は、優位な腫瘍の増殖抑制効果が認められた。第１０図Ｂには、マウスの累積生存率を示した。投与開始後４１日目に無処置群では全マウスが死亡したが、処置群では優位な延命効果が確認され、実験終了時の４２日目で４匹が生存していた。以上のことから、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方の活性を同時に阻害することが、肝臓における大腸癌の転移病巣に対して有効な治療効果を示し、また、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方の活性を同時に阻害する治療法は延命効果があることが明らかとなった。
（参考例１） 抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の作製
（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
組換え型ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）は、免疫原性を高める目的で以下の方法でメチル化ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、２回蒸留水に溶解したメチル化ＢＳＡを、メチル化ＢＳＡ：ｈＩＧＦ−Ｉ＝１：４（重量比）になるように４℃で混合し、１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌した。その後、連結針付きシリンジを用いて完全フロインドアジュバントあるいは不完全フロインドアジュバントと容量比１：１で混合し、免疫原（以下、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉと表記する）とした。
５週令雌ＳＤラットに、完全フロインドアジュバントを用いて上記のように調製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉ（ｈＩＧＦ−Ｉの１００μｇ相当量）を投与し、２週間後より不完全フロインドアジュバントを用いて同様に調製した免疫原を１週間に１回、計４回投与した。
眼底静脈叢より採血し、その血清中の抗体価を参考例１（４）に示す結合ＥＬＩＳＡで調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し、赤血球を除去し、ＭＥＭで３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（２）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を通常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（３）ハイブリドーマの作製
参考例１（１）で得られたラット脾細胞と（２）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞に３７℃で攪拌しながら、１０２個のラット脾細胞あたり０．２〜１．０ｍＬの融合培地（２ｇのＰＥＧ−１０００、２ｍＬのＭＥＭ、０．７ｍＬのジメチルスルホキシドの混液）を加え、１〜２分間毎に１〜２ｍＬのＭＥＭを数回加えた後、さらに、ＭＥＭを加えて全量が５０ｍＬになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、緩やかに細胞をほぐした後、１００ｍＬのＨＡＴ培地に懸濁した。
この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。この培養上清を参考例１（４）に示す結合ＥＬＩＳＡを用いて、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉに反応して、陰性対照であるメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡ［ＢＳＡを用いて上記参考例１（１）と同様の反応を行い作製したコンジュゲート］に反応しないウェルを選び、さらにＨＴ培地と通常培地に換え、２回の単一細胞化を行い、抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。
その結果、第１１図に示した反応性を有するＫＭ１４６８、ＫＭ１４６９、ＫＭ１４７０、ＫＭ１４７１、ＫＭ１４７２およびＫＭ１４７３の６クローンのハイブリドーマを取得した。各ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスを、サブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡにより検討した結果、いずれもＩｇＧ２ｂであった。
（４）モノクローナル抗体の選択（結合ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレートに固定化する抗原としては、参考例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉおよび陰性対照としてメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡを用いた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、上述の抗原をｈＩＧＦ−ＩあるいはＢＳＡの濃度として１０μｇ／ｍＬで５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、被免疫ラット抗血清、抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清あるいは精製した抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体を５０μＬ／ウェルで分注し、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を二次抗体として５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
（５）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令Ｂａｌｂ／ｃヌード雌マウスに参考例１（３）で得られたハイブリドーマクローンを５〜２０×１０６細胞／匹でそれぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマが腹水癌化したマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去した。その後、カプリル酸沈殿法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）によりＩｇＧ画分を精製し、精製モノクローナル抗体とした。
（参考例２） 抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の反応性の検討
（１）ｈＩＧＦ−Ｉの天然の立体構造に対する反応性
参考例１（３）で選択された抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を保つｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を、下記に示す競合ＥＬＩＳＡで調べた。
参考例１（４）に示した、参考例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉを固定化したプレートを準備し、２０μｇ／ｍＬより５倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注後、抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の精製抗体を希釈した溶液（ＫＭ１４６８：６．０μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７０：１．０μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７１：０．１６μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７２：７．０μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７３：１．２μｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で２時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
第１２図に示したように、本発明の６種の抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体はいずれもｈＩＧＦ−Ｉの天然の立体構造に反応性を示した。また、本系において、最も高い感度を示したＫＭ１４６８を用いた場合、液相系に含まれる１６ｎｇ／ｍＬまでの濃度の天然の立体構造を有するｈＩＧＦ−Ｉを検出可能であった。
（２）抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体のｈＩＧＦファミリーに対する反応性
精製した抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体ＫＭ１４６８（以下、抗体ＫＭ１４６８と記す）のｈＩＧＦに対する反応性を検討した。第１３図に、参考例１（４）に示した結合ＥＬＩＳＡにより、抗体ＫＭ１４６８および市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）のｈＩＧＦ−Ｉとの反応性を検討した結果を示した（抗体濃度は、３０μｇ／ｍＬから３倍希釈で段階的に希釈）。ただし、ｓｍ１．２の場合は、二次抗体として２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を用いた。第１３図に示したように、いずれの抗体も抗体濃度依存的なｈＩＧＦ−Ｉ結合活性を示したが、その活性の強さは、抗体ＫＭ１４６８の方が高かった。
次に、各抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合におけるｈＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ社製）、ｈＩＧＦ−ＩＩ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ社製）、ヒトインスリン（和光純薬社製）およびｍＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ社製）による阻害活性を以下に示した競合ＥＬＩＳＡで検討した。
参考例１（４）に示したように抗原を固定化したプレートを準備し、４．０μｇ／ｍＬに希釈した各種抗体を５０μＬ／ウェルで分注後、２０μｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩ、または、１０μｇ／ｍＬより５倍希釈で段階的に希釈したヒトインスリンあるいはｍＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＫＭ１４６８の場合は、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）、ｓｍ１．２の場合は、２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のＯＤ４１５を１００として相対値（％）で表示した。結果を第１４図に示した。第１４図に示したように、抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−Ｉ（第１４図Ａ）およびｈＩＧＦ−ＩＩ（第１４図Ｂ）で強く阻害され、ｈＩＧＦ−Ｉによる結合の５０％阻害の濃度（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５０；以下、ＩＣ５０と表記する）は約０．３μｇ／ｍＬ（約３９ｎＭ）、ｈＩＧＦ−ＩＩによるＩＣ５０は約０．４μｇ／ｍＬ（約５８ｎＭ）と同程度の値を示した。一方、ヒトインスリンおよびｍＩＧＦ−Ｉでは阻害は認められなかった。以上の結果から、抗体ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩとｈＩＧＦ−ＩＩの両方に特異的、かつ同程度の強さで反応することが明らかとなった。市販の抗ＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−Ｉ（第１４図Ａ）により強く阻害され、ｈＩＧＦ−ＩＩ（第１４図Ｂ）による阻害活性は弱かった。ｓｍ１．２のｈＩＧＦ−ＩによるＩＣ５０は約１．２μｇ／ｍＬ（約１５６ｎＭ）であったのに対し、ｈＩＧＦ−ＩＩによるＩＣ５０は＞１０μｇ／ｍＬ（＞１．４５μＭ）であった。一方、ヒトインスリンおよびｍＩＧＦ−Ｉでは阻害は認められなかった。
（３）抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体のｈＩＧＦ依存性細胞増殖に対する影響
精製した抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ依存性細胞増殖に対する影響を検討した。抗体としては、ＫＭ１４６８、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）あるいはヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４２７）をＴＦ／ＢＳＡ培地［Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）に１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）、２００μｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した培地］で０．５〜１×１０５細胞／ｍＬに調製し、９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルで分注した。さらに、ＴＦ／ＢＳＡ培地で各種濃度に希釈したｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩあるいはヒトインスリンの各因子を５０μＬ／ウェルで、ＴＦ／ＢＳＡ培地で各種濃度に希釈した各抗体を５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で５日間培養した。培養後、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ社製）を２０μＬ／ウェルで分注し、さらに、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２．５〜４時間培養した後に、ＯＤ４５０ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４５０と表記する）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
第１５図Ａには、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７の各因子による増殖曲線を示した。さらに、第１５図Ｂには、４０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、第１５図Ｃには、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩの存在下、第１５図Ｄには、１００ｎｇ／ｍＬのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖を示した。第１５図に示したように、ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖を同程度に強く阻害し、その活性は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、参考例２（２）の競合ＥＬＩＳＡで認められた各抗体の結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの活性が阻害されることを明確に示したものである。
第１６図Ａには、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９の各因子による増殖曲線を示した。さらに、第１６図Ｂには、１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、第１６図Ｃには、１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩの存在下、第１６図Ｄには、２０ｎｇ／ｍＬのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖を示した。
第１６図に示したように、ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖を同程度に強く阻害し、その活性は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、参考例２（２）の競合ＥＬＩＳＡで認められた結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの活性が阻害されることを明確に示したものである。さらに、第１６図ＢのＫＭ１４６８、第１６図ＣのＫＭ１４６８およびＳ１Ｆ２を反応させた場合には、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩを添加しない場合よりも細胞増殖が抑制された。このことから、ＨＴ−２９細胞は、自らｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩを産生して増殖しており、その増殖効果も抗体の添加によって阻害できることが明らかとなった。
第１７図Ａには、ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３の各因子による増殖曲線を示した。さらに、第１７図Ｂには、２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、第１７図Ｃには、２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩの存在下、第１７図Ｄには、２０ｎｇ／ｍＬのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖を示した。第１７図に示したように、ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖を同程度に強く阻害し、その活性は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、参考例２（２）の競合ＥＬＩＳＡで認められた結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、各因子の機能が阻害されることを明確に示したものである。
（参考例３）抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の抗原認識部位の解析
（１）ｈＩＧＦ−Ｉの部分ペプチドの合成
ＷＯ０１／６４７５４に記載の方法に従って、ｈＩＧＦ−Ｉの部分ペプチドを合成した。合成したペプチドは、ｈＩＧＦ−Ｉの１−１８番目（配列番号１；以下、ｐ１−１８と表記する）、１４−３０番目（配列番号２；以下、ｐ１４−３０と表記する）、２４−３５番目（配列番号３；以下、ｐ２４−３５と表記する）、２９−４１番目（配列番号４；以下、ｐ２９−４１と表記する）、３６−４７番目（配列番号５；以下、ｐ３６−４７と表記する）、４１−５６番目（配列番号６；以下、ｐ４１−５６と表記する）、５２−７０番目（配列番号７；以下、ｐ５２−７０と表記する）、５３−６１番目（配列番号８；以下、ｐ５３−６１と表記する）、６１−７０番目（配列番号９；以下、ｐ６１−７０と表記する）に相当するペプチドであり、ｈＩＧＦ−Ｉの全長を網羅するように設計した。上記ペプチドにおいては、内部に存在するＣｙｓについては、ＳｅｒあるいはＡｌａに置換した配列を合成した。また、４１−５６番目に相当する配列については、内部のＣｙｓを有する配列（配列番号１０；以下、ｐ４１−５６Ｃと表記する）も合成した。
（２）抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の抗原認識部位の解析
上記（１）で合成した各種ペプチドを用いて、抗ｈＩＧＦラット抗体ＫＭ１４６８の抗原認識部位の解析を以下に示す競合ＥＬＩＳＡで検討した。
参考例１（４）に示したように抗原を固定化したプレートを準備し、４．０μｇ／ｍＬに希釈した各種抗体を５０μＬ／ウェルで分注後、５０μｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に希釈した各種ペプチド溶液の単独あるいは種々の組合せ、あるいはｈＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のＯＤ４１５を１００とした相対値（％）で表示した。結果を第１８図に示した。第１８図に示したように、ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−Ｉにより濃度依存的に阻害されたが、各種ペプチドでは、単独あるいは組合せに拘わらず、阻害活性は認められなかった。以上の結果は、ＫＭ１４６８が、ｈＩＧＦ−Ｉの単なるアミノ酸一次配列ではなく、ｈＩＧＦ−Ｉの立体構造を認識していることを強く示唆する結果である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明の癌転移阻害剤は、前立腺癌の骨転移や大腸癌の肝転移などの癌転移を有意に阻害することができるので、癌治療のための医薬として臨床上極めて有用である。
また、本発明の癌転移阻害剤は、転移巣の腫瘍細胞の増殖抑制に特に有効であるので、癌転移の症状がはっきり現れていない患者へ予防的に投与することもできる。さらに、転移巣の腫瘍細胞の増殖抑制ができるため、病態が進行した転移巣に対する治療剤としても有効に用いることができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【技術分野】
本発明は、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；以下、ＩＧＦと表記する）−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質を有効成分として含有する癌転移阻害剤に関する。
【背景技術】
癌の転移とは、癌細胞が体中に広がって再増殖することである。患者を死に至らしめる最大の原因は癌転移である。原発部位にとどまる癌は、外科的手術によって比較的簡単に取り除くことができる。しかし、さまざまな部位に転移した癌を外科的手術によって取り除くことは難しい（日経サイエンス１９９６年１２月号ｐ３０）。
癌の転移は特定の臓器に発生しやすい。骨は、肺、肝臓と並んで癌の遠隔転移の主な標的臓器である。特に、前立腺癌、乳癌、肺癌、多発性骨髄腫の患者では、骨に高率に転移する。骨に転移した癌に対して、従来の癌治療法ではほとんど効果が得られず、患者は強い肉体的苦痛および精神的不安に苛まれ、その結果、生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）は著しく損なわれる（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，２，５８４−５９３，２００２、実験医学１６、１４９−１５５、１９９８）。従って、骨転移を治療するための有用な治療方法が求められている。また、肝臓への転移は消化器癌、特に進行大腸癌で高率に発生するため、肝臓への転移は大腸癌の予後を不良にする大きな要因である。従って、肝転移を治療するために有用な治療法が求められている。
癌の骨転移のメカニズムについては、いまだ不明の点が多い。重要なメカニズムの一つとして、骨に豊富に含まれているさまざまな増殖因子が癌細胞の骨転移を促進する可能性が指摘されている。骨に貯蔵されている増殖因子とその貯蔵量（ｎｇ／ｇ乾燥骨重量）は、次の通りである［ＩＧＦ−ＩＩ：１３００−１７００ｎｇ／ｇ、トランスフォーミングβ増殖因子（ＴＧＦβ）：４００−４６０ｎｇ／ｇ、ＩＧＦ−Ｉ：８５−１７０ｎｇ／ｇ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）：５０−７０ｎｇ／ｇ、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）：４０−８０ｎｇ／ｇ、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）：０．５−１２ｎｇ／ｇ、骨形態原性蛋白質（ＢＭＰ）：１−２ｎｇ／ｇ、アクチビン：１ｎｇ／ｇ（実験医学１６、１４９−１５５、１９９８）］。癌細胞自身は骨を破壊することができない。しかしながら、破骨細胞で骨が破壊された後、骨に貯蔵されている上記増殖因子が遊離されて、癌細胞の増殖が促進される可能性が指摘されている。
また、癌の肝転移のメカニズムについても、いまだ不明の点が多い。消化器癌の血行性転移の場合には、原発巣から血流中に遊離した癌細胞は、まず肝臓に到達し、毛細血管床に捕らえられることが多いとの解剖学的な理由から、消化器癌は肝転移しやすいとの可能性が指摘されている。
ＩＧＦと癌の転移の関連性についても、報告がある。ＩＧＦ−Ｉの受容体（以下、ＩＧＦ−ＩＲと表記する）のドミナントネガティブ体をヒト大腸癌細胞株に発現すると、マウスでの肝転移が抑制されることが報告されている（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、８２、１３７７−１３８９、２００２）。また、ＩＧＦ−ＩＲドミナントネガティブ体をヒト乳癌細胞株に発現すると、マウスでの肺、肝、リンパ節への転移が抑制されることが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８、３３５３−３３６１、１９９８）。ルイス肺癌の亜株であるＨ−５９は肝臓に高転移性を示す腫瘍細胞株であるが、肝臓細胞の培養上清に含まれるＨ−５９の増殖を促進する因子を解析した結果、ＩＧＦ−ＩがＨ−５９の増殖促進活性を示すことが報告されている。ルイス肺癌の別の亜株で肺のみに転移するＭ−２７はＩＧＦ−Ｉによる増殖促進活性を持たないことから、癌細胞の肝臓への転移にはＩＧＦ−Ｉが関与していることが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５４、３７３２−３７３７、１９９４）。
実際、ＩＧＦ−ＩＲに対するアンチセンスＲＮＡを発現させることで、高転移性のヒト乳癌細胞のマウスでの造腫瘍性および肺への転移性が低下し、生存期間の延長が認められること（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７，３８４−３９５，２０００）、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体により、マウスに移植されたヒト横紋筋肉腫細胞やヒト乳癌細胞の増殖が抑制されること（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４，５５３１−５５３４，１９９４；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，８４，１４１８−１４２３，１９８９；Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２２，１０１−１０６，１９９２）、などＩＧＦ作用の抑制による抗腫瘍効果が報告されている（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１３３２，Ｆ１０５−Ｆ１２６，１９９７）。その一方で、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、マウスに移植されたエストロゲン非依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着を抑制するものの、エストロゲン依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着や生着したヒト乳癌細胞の増殖を抑制できないことが示されており、ＩＧＦ−ＩＲの作用阻害のみでは、充分な抗腫瘍効果が得られないことも示唆されている（Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２２，１０１−１０６，１９９２）。
ＩＧＦに対する抗体、すなわち抗ＩＧＦ抗体としては、既にいくつかの抗体が知られている。代表的なヒトＩＧＦ−Ｉに対する抗体（抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体）としては、ｓｍ１．２が報告されている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８１，２３８９−２３９２，１９８４）。ｓｍ１．２は、ｈＩＧＦ−ＩＩと４０％程度の交差反応性を有していること、１〜２μｇ／ｍＬの濃度でウェスタンブロッティング法により、１００ｎｇのｈＩＧＦ−Ｉを検出可能であること、１０〜３０μｇ／ｍＬの濃度で２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉによるマウス繊維芽細胞株ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３の増殖を阻害すること、が明らかとなっている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８１，２３８９−２３９２，１９８４；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９９，２９６１−２９７０，１９９７）。
その他、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体としては、Ｖａｌ５９−ＳｍＣ１２１があり、該抗体は、ヒトインスリンおよびｈＩＧＦ−ＩＩとは反応しないこと、ｈＩＧＦ−Ｉの１０〜１２番目のＬｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐを含むペプチドを認識すること、１２５Ｉ−ｈＩＧＦ−Ｉを用いたラジオイムノアッセイでは、１ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉの検出感度を示したことが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２５，３２７−３３５，１９９０）。４１／８１は、ｈＩＧＦ−ＩＩとは３％の反応性を有しており、また、１２５Ｉ−ｈＩＧＦ−Ｉを用いたラジオイムノアッセイでは、１ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉの検出感度を示す（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１４９，１０９−１１２，１９８２）。３５Ｉ１７は、ｈＩＧＦ−ＩＩと０．５％程度の交差反応性を有していること、１μｇ／ｍＬの濃度でのウェスタンブロッティング法により、１μｇのｈＩＧＦ−Ｉを検出可能であること、１２μｇ／ｍＬ以上の濃度でｈＩＧＦ−Ｉによるマウス繊維芽細胞株ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３の増殖を完全に阻害すること、３０μｇ／ｍＬの濃度で１μｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩによるｈＩＧＦ−ＩＲの自己リン酸化を阻害すること、また、１２５Ｉ−ｈＩＧＦ−Ｉを用いたラジオイムノアッセイでは、０．１ｎＭのｈＩＧＦ−Ｉの検出感度を示すことが報告されている（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１６，５１３−５１８，１９９７）。 ＢＰＬ−Ｍ２３は、ｈＩＧＦ−Ｉに対して１０．５ ｌｉｔｒｅｓ／ｎｍｏｌの結合活性を示し、一方、ｈＩＧＦ−ＩＩおよびヒトインスリンには、それぞれ０．８％および０．０００１％の交差反応性を示すこと、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウサギのＩＧＦとは反応性を示すが、ラットおよびマウスのＩＧＦとは反応しないこと、ラット脂肪細胞に対するｈＩＧＦ−Ｉによる脂肪形成を抑制することが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２，２０１−２０６，１９８９）。７Ａ１、１Ｂ３、４Ｃ１、５Ａ７は、ｈＩＧＦ−ＩのＣおよびＤドメインの異なるエピトープを認識すること、ｈＩＧＦ−ＩＩとはそれぞれ６．６％、０．８３％、１２％、１．２％の交差反応性を示すことが報告されている（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１２，７３７−７４４，１９９３）。３Ｄ１／２／１は、ヒトおよびモルモットのＩＧＦ−Ｉとは反応を示すが、ウサギ、ラット、マウスのＩＧＦ−Ｉとは反応しないこと、ｈＩＧＦ−ＩＩとは、７％の交差反応性を示すことが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，５４，４７４−４７６，１９８２）。
代表的なヒトＩＧＦ−ＩＩに対する抗体（抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体）としては、Ｓ１Ｆ２が報告されている。Ｓ１Ｆ２は、ｈＩＧＦ−Ｉと１０％程度の交差反応性を有していること、１μｇ／ｍＬの濃度でのウェスタンブロッティング法により、１０〜１００ｎｇのｈＩＧＦ−ＩＩを検出可能であること、１００μｇ／ｍＬの濃度で１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩによるヒト繊維芽細胞のＤＮＡ合成促進作用を阻害することが明らかとなっている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，７，Ｓ２１−Ｓ２７，１９８９；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２４，８７０−８７７，１９８９）。２Ｈ１１、２Ｂ１１、ＩＤ５、ＩＤ９は、ｈＩＧＦ−ＩＩと反応し、ｈＩＧＦ−Ｉとは反応しないこと、競合酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡと表記する）により、１ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩを定量可能であることが報告されている（特開平５−２５２９８７号）。しかしながら、これらの抗体が癌転移の阻害に有用であることは知られていない。
従って、本発明の課題は、癌の転移阻害剤、特に癌の骨転移および肝転移を抑制するために有用な薬剤を提供することにある。
【発明の開示】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（４）の発明を包含する。
（１） インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の活性を阻害する物質を有効成分として含有する癌転移阻害剤。
（２） 物質が、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選ばれる、（１）に記載の阻害剤。
（ａ） ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片
（ｂ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を含む組成物
（ｃ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を組み合わせてなる組成物
（ｄ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片の複合体
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかと他分子を結合させた複合体
（３） 抗体がモノクローナル抗体である、（２）に記載の阻害剤。
（４） 抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、（２）または（３）に記載の阻害剤。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒト前立腺癌細胞ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂの増殖に対する抗体ＫＭ１４６８による増殖阻害活性を示す。横軸は添加サンプルの種類と濃度を、縦軸は細胞増殖を示す。
第２図Ａは、初期転移モデルにおける抗体ＫＭ１４６８の前立腺癌の骨転移阻害活性、第２図Ｃは、進行転移モデルにおける抗体ＫＭ１４６８の前立腺癌の骨転移阻害活性をそれぞれ示す。第２図Ｂは、初期転移モデルにおける抗体ＫＭ１４６８の添加および非添加時の血清中ＰＳＡ濃度、第２図Ｄは、進行転移モデルにおける抗体ＫＭ１４６８の添加および非添加時の血清中ＰＳＡ濃度をそれぞれ示す。
第３図は、ヒト多発性骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６に対するｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるＩＧＦ−ＩＲ、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化、ならびに抗体ＫＭ１４６８、抗体ＫＭ１７６２によるリン酸化抑制をウェスタンブロッティングにより検出した結果を示す。
第４図は、ｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるヒト多発性骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６増殖に対する抗体ＫＭ１４６８（１μｇ／ｍＬ）による増殖阻害活性を示す。
第５図は、ｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるヒト多発性骨髄腫細胞ＲＰＭＩ８２２６増殖に対する種々の濃度の抗体ＫＭ１４６８による増殖阻害活性を示す。
第６図は、初期転移モデルにおける、抗体ＫＭ１４６８の多発性骨髄腫の骨への転移阻害活性を示す。
第７図は、初期転移モデルにおける、抗体ＫＭ１４６８の乳腺癌の骨への転移阻害活性を示す。
第８図は、大腸癌の肝臓への転移モデルにおいて、抗ＩＧＦ抗体を投与したときの大腸癌細胞株の肝臓への転移の阻害活性を示す。各カラム内の横線は４分位置を示し、それぞれ上から９０、７５、５０、２５、１０％分値位置を表す。各カラムの○は各群における最大値および最小値を示す。
第９図は、大腸癌の肝臓への転移モデルにおいて、抗ＩＧＦ抗体を投与したときの腫瘍切片におけるＡＩ（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｅｘ）値を示す。各カラム内の横線は４分位置を示し、それぞれ上から９０、７５、５０、２５、１０％分値位置を表す。各カラムの○は各群における最大値および最小値を示す。
第１０図Ａは、大腸癌の肝臓への転移モデルにおいて、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体を投与したときの大腸癌細胞株の肝臓での転移病巣に対する治療効果を示す。各カラム内の横線は４分位置を示し、それぞれ上から９０、７５、５０、２５、１０％分値位置を表す。第１０図Ｂは、大腸癌の肝臓への転移モデルにおいて、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体を投与したときの延命効果を示す。横軸は投与開始後の経過日数を示し、縦軸は累積生存率を示す。実線は処置群を、破線は無処置群を示す。
第１１図は、モノクローナル抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する特異的な反応性を示す（結合ＥＬＩＳＡ）。横軸は、抗体と抗原の組み合わせを、縦軸は結合活性（ＯＤ４１５）を示す。
第１２図は、モノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を有するｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を示す（競合ＥＬＩＳＡ）。横軸は添加したｈＩＧＦ−Ｉ濃度を、縦軸は結合活性（ＯＤ４１５）を示す。
第１３図は、抗体ＫＭ１４６８およびｓｍ１．２のｈＩＧＦ−Ｉに対する反応を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は結合活性（ＯＤ４１５）を示す。○はＫＭ１４６８、□はｓｍ１．２の反応性をそれぞれ示す。
第１４図は、抗体ＫＭ１４６８およびｓｍ１．２のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合における各種因子による阻害活性を示す。横軸は各種因子濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は結合活性（％）を示す。ＡはｈＩＧＦ−Ｉ、ＢはｈＩＧＦ−ＩＩ、Ｃはヒトインスリン、ＤはｍＩＧＦ−Ｉによるそれぞれの活性を示す。○はＫＭ１４６８、□はｓｍ１．２の反応性をそれぞれ示す。
第１５図は、抗体ＫＭ１４６８、ｓｍ１．２およびＳ１Ｆ２のｈＩＧＦおよびヒトインスリンによるヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７の増殖に対する影響を示す。Ａは各因子による細胞増殖活性を示す。横軸は各種因子濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。○はｈＩＧＦ−Ｉ、●はｈＩＧＦ−ＩＩ、□はヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。ＢはｈＩＧＦ−Ｉ、ＣはｈＩＧＦ−ＩＩ、Ｄはヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖を示す。○はＫＭ１４６８、□はｓｍ１．２、■はＳ１Ｆ２の活性をそれぞれ示す。
第１６図は、抗体ＫＭ１４６８、ｓｍ１．２およびＳ１Ｆ２のｈＩＧＦおよびヒトインスリンによるヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９の増殖に対する影響を示す。Ａは各因子による細胞増殖活性を示す。横軸は各種因子濃度（ｎｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。○はｈＩＧＦ−Ｉ、●はｈＩＧＦ−ＩＩ、□はヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。ＢはｈＩＧＦ−Ｉ、ＣはｈＩＧＦ−ＩＩ、Ｄはヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖を示す。○はＫＭ１４６８、□はｓｍ１．２、■はＳ１Ｆ２の活性をそれぞれ示す。
第１７図は、抗体ＫＭ１４６８、ｓｍ１．２およびＳ１Ｆ２のｈＩＧＦおよびヒトインスリンによるヒト骨肉腫細胞株ＭＧ６３の増殖に対する影響を示す。Ａは各因子による細胞増殖活性を示す。横軸は各種因子濃度（ｎｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。○はｈＩＧＦ−Ｉ、●はｈＩＧＦ−ＩＩ、□はヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。ＢはｈＩＧＦ−Ｉ、ＣはｈＩＧＦ−ＩＩ、Ｄはヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は増殖（ＯＤ４５０）を示す。細点線は抗体非添加時の増殖を、点線は各因子非添加時の増殖を示す。○はＫＭ１４６８、□はｓｍ１．２、■はＳ１Ｆ２の活性をそれぞれ示す。
第１８図は、抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合における各種ペプチドによる阻害活性を示す。横軸は各種ペプチド濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は結合活性（％）を示す。用いた各種ペプチドについては、図中に示した。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年８月２１日に出願された日本国特許出願２００３−２９７８７１号、および２００４年５月１０日に出願された日本国特許出願２００４−１３９７０７号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
Ａ．本発明の癌転移阻害剤の有効成分
本発明の癌転移阻害剤の有効成分は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質であればいかなるものでもよい。
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質は、単一の物質であってもよく、複数の物質からなる組成物であってもよく、複数の物質からなる組成物の場合にはそれぞれの物質を同時にまた別々に使用してもよい。
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質としては、
（ａ） ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片
（ｂ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を含む組成物
（ｃ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を組み合わせてなる組成物
（ｄ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片の複合体
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかと他分子を結合させた複合体
などがあげられる。
上記の「ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する」とは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩが有するいずれかの活性を阻害することをいうが、具体的には、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩが有する細胞増殖促進活性を阻害することがあげられる。
本発明で使用される「ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片」とは、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの両方に特異的に結合し、かつＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの両方の活性を阻害する抗体または抗体断片をいう。具体的には、天然型ＩＧＦ−Ｉおよび天然型ＩＧＦ−ＩＩに存在するエピトープを認識する抗体または抗体断片、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの立体構造を認識する抗体または抗体断片などがあげられる。
本発明で使用される上記の抗体または抗体断片は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
また、上記の抗体または抗体断片には、「ヒト以外の動物の抗体」、「遺伝子組換え抗体」、それらの抗体断片なども含まれる。
ここで、「遺伝子組換え抗体」としては、ヒト化抗体、ヒト抗体などがあげられ、また、「ヒト化抗体」としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
「ヒト型キメラ抗体」とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＣＨおよびＣＬとからなる抗体をいう。ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
また、ヒト以外の動物とは、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどをいう。
「ヒト型ＣＤＲ移植抗体」とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）と連結したＶ領域をコードするｃＤＮＡを設計、構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするｃＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
「ヒト抗体」とは、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を単独で培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を生成蓄積させることができる。
本発明において好ましく使用できる抗体または抗体断片としては、ハイブリドーマＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８）が生産するモノクローナル抗体ＫＭ１４６８、または、ｈＩＧＦ−Ｉに反応し、約４０％ｈＩＧＦ−ＩＩにも交差反応する抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体ｓｍ１．２（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ社）などがあげられる。
「ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を含む組成物」としては、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれかと、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれかを含む組成物であればいかなるものでもよい。
ここで用いる「ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片」とは、ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合するが、ＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合しない（交差反応性がない）抗体をいい、例えば、マウスＩＧＦ−１（以下ｍＩＧＦ−Ｉと表記する）に対する抗体であるＡＦ７９１（Ｒ＆Ｄ社製）、ヒトＩＧＦ−Ｉ（以下ｈＩＧＦ−Ｉと表記する）に対するモノクローナル抗体である５６４０８（Ｒ＆Ｄ社製）、Ｍ２３／ＩＬＧ１−００１（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）などがあげられる。
また、「ＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片」とは、ＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合するが、ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合しない（交差反応性がない）抗体をいい、例えば、ｍＩＧＦ−ＩＩに対する抗体であるＡＦ７９２（Ｒ＆Ｄ社製）、ｈＩＧＦ−ＩＩに対するモノクローナル抗体であるＳ１Ｆ２（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ社製）などがあげられる。
また、「ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を組み合わせてなる組成物」とは、「ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片」を含む剤と、「ＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片」を含む剤を別々に調製し、これらの剤を組み合わせて同時にまたは逐次的に用いるための組成物をいう。
「ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片の複合体」としては、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれかと、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれかとを結合させることにより得られる複合体であればいかなるものでもよい。
具体的には、上記の二種類の抗体または抗体断片を下記の手段で結合させた抗体複合体があげられる。
抗体の結合方法としては、化学的に結合させる方法、または蛋白質工学的手法を用いる方法があげられる。
化学的に結合させる方法としては、二種類の抗体分子をＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅやＳ−ａｃｅｔｙｌｍｅｒｃａｐｔｏｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｈｙｄｒｉｄｅなどの架橋剤を用いて結合する方法などがあげられる。
蛋白質工学的な手法を用いる結合方法としては、蛋白質工学的手法を用いて複数個の抗体あるいは抗体断片を結合した形で発現させられる方法があれば、いかなる方法でも用いることができる。蛋白質工学的な手法と用いる結合方法で作製される抗体複合体としては、二種類のｓｃＦｖを適当なリンカーを介して結合させた分子、二種類の抗体Ｆａｂ’断片を適当なリンカーを介して結合させた分子、二種類のｓｃＦｖをＮ末端とＣ末端に連結したＦｃ融合蛋白質、二種類のｓｃＦｖを連結したＦｃ融合蛋白質のヘテロ分子、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｉａｂｏｄｙがＮ末端あるいはＣ末端に連結したＦｃ融合蛋白質などがあげられる。
上述した抗体のいずれかと他分子を結合させた複合体としては、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片；ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を含む組成物；ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を組み合わせてなる組成物；ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片との複合体；のいずれかと少なくとも１種類の他分子を結合させることにより得られる複合体であればいかなるものでもよい。
他分子としては、例えば放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の化合物、蛋白質などがあげられる。放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などの他分子と上述の抗体との結合方法としては、いかなる方法でもよいが、好ましくは化学的に結合させる方法（抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４）、蛋白質工学的手法を用いる結合方法などがあげられる。
化学的な結合方法としては、抗体または抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖のＮ末端側あるいはＣ末端側、抗体または抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖などに上記の他分子を結合させる方法である。
蛋白質工学的手法を用いる結合方法としては、抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい他分子、例えば蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより抗体または抗体断片と他分子を結合させた融合体を製造する方法をあげることができる。
放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉなどがあげられ、例えば、クロラミンＴ法などにより抗体に結合させることができる。
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社、１９９６）、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社、１９８２）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
高分子の化合物としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基の修飾剤（特開昭６１−１７８９２６）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特公昭５６−２３５８７）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特開平２−１１７９２０）などがあげられる。
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２などがあげられる。また、癌細胞を直接障害する活性を有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質と抗体を結合させた複合体ついては、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、複合体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、複合体を製造することができる。
本発明で使用される抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧ型抗体分子を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるＦａｂは、抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧ型抗体分子を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるＦ（ａｂ’）２は、抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるＦａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用されるｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一とすることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。本発明で使用されるｄｉａｂｏｄｙは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるｄｓＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明で使用されるＣＤＲを含むペプチドは、抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明で使用される抗体または抗体断片は、ＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖に対する阻害活性（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８，４０８３−４０９２，１９８８）などを測定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する活性を評価することができる。
Ｂ．本発明の癌転移阻害剤の有効成分の作製
以下に、本発明で使用される抗体の一つである、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、かつＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片の作製方法ならびに活性評価について記す。
１．ＩＧＦに対するヒト以外の動物のモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
ＩＧＦをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などに導入、発現させ、組換え型ＩＧＦ蛋白質を得、これを抗原に用いることができる。あるいは、ＩＧＦ部分配列を有する合成ペプチドを抗原に用いることもできる。
抗原用部分ペプチドとしては、５〜３０残基程度の蛋白質部分配列が選択される。変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得するためには、立体構造上蛋白質の表面に存在している部分配列を抗原ペプチドとして選択する必要がある。立体構造上蛋白質表面に存在する部分は、ジェネティック・マック（Ｇｅｎｅｔｙｘ Ｍａｃ）など市販の蛋白質配列解析ソフトを用い、親水性の高い部分配列を予測することで推測することができる。すなわち、一般的に親水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高い部分は蛋白質表面に存在する場合が多いためである。また、蛋白質のＮ末端、Ｃ末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。しかしながら、このように選択した部分ペプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
部分ペプチドには蛋白質と架橋するために、システインを末端に付加する。蛋白質の内部配列を部分ペプチドとして選択した場合には、必要に応じペプチドのＮ末端はアセチル化、Ｃ末端はアミド化する。部分ペプチドは一般的な液相、固相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法によって合成することができる（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，１９７９；Ｖｏｌ．２，１９８０；Ｖｏｌ．３，１９８１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ペプチド合成の基礎と実験、丸善、１９８５；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、廣川書店、１９９１；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，１６１−２１４，１９９０）。また、自動ペプチド合成機を用いることもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社（以下、ＡＢＩ社と表記する）製ペプチド合成機、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｉｎｃ．社（以下、ＡＣＴ社と表記する）製ペプチド合成機などの市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したＮα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸あるいはＮα−Ｂｏｃ−アミノ酸などを用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。
原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、ＡＢＩ社、島津製作所、国産化学（株）、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社、渡辺化学（株）、ＡＣＴ社またはペプチド研究所（株）などから入手することができる。また、原料となる保護アミノ酸、保護有機酸、保護有機アミンは報告されている合成法に従って、あるいはそれに準じて合成することができる（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，１９７９；Ｖｏｌ．２，１９８０；Ｖｏｌ．３，１９８１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；ペプチド合成の基礎と実験、丸善、１９８５；続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、廣川書店、１９９１；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，１６１−２１４，１９９０）。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものでもよい。下記に、マウスおよびラットを用いる例について説明する。
３〜２０週令のマウスまたはラットに、上記１（１）で調製した抗原を免疫し、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に適当なアジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。アジュバントとしては、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどがあげられる。また、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと表記する）やＫｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（以下、ＫＬＨと表記する）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いることができる。各抗原の投与後３〜７日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、抗原として用いたｈＩＧＦに対する反応性をＥＬＩＳＡなどで確認し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源とする。抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウスまたはラットより公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に準じて脾臓などを摘出し、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である８−アザグアニン耐性骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９，１９７６）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０，１９７８）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０，１９７９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９７５）など、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に従い、細胞融合時までに２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングリコール−１０００（以下、ＰＥＧ−１０００と表記する）などの細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させ、培地中に懸濁する。細胞の洗浄にはＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、ＭＥＭと表記する）またはＰｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと表記する）などを用いる。また、融合細胞を懸濁する培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、ＨＡＴ培地｛通常培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地に１．５ｍＭグルタミン、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび１０％牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）を加えた培地］に０．１ｍＭヒポキサンチン、１５μＭチミジンおよび０．４μＭアミノプテリンを加えた培地｝を用いる。
培養後、培養上清の一部を取り、ＥＬＩＳＡにより抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質に反応しないサンプルを選択する。次いで、限界希釈法により単一細胞化を行い、ＥＬＩＳＡにより安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
（５）ハイブリドーマの選択
抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、公知の方法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）に従い、以下に述べるＥＬＩＳＡにより行う。これらの方法により、後述する抗ｈＩＧＦキメラ抗体、抗ｈＩＧＦ ＣＤＲ移植抗体またはそれらの抗体断片を産生する形質転換株の培養上清中に含まれる抗体あるいはすべての精製抗体の結合活性を測定することができる。
ＥＬＩＳＡ
抗原を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ハイブリドーマなどの培養上清あるいは精製抗体を第一抗体として反応させる。第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。第二抗体としては、第一抗体を認識することができる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗体を用いる。具体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としてはマウス抗体を認識できる抗体を用いる。反応後、第二抗体の標識物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして選択する。
当該ハイブリドーマの具体例としては、ハイブリドーマＫＭ１４６８などがあげられる。ハイブリドーマＫＭ１４６８は、２００２年３月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６ 郵便番号 ３０５−８５６６）にプタベスト条約の規定下でＦＥＲＭ ＢＰ−７９７８として寄託されている。
（６）モノクローナル抗体の精製
０．５ｍＬのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を腹腔内投与し、２週間飼育した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、１（４）で得られた抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５×１０６〜２×１０７細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはセルロファインＧＳＬ２０００（生化学工業社製）のカラムなどを用いて、ＩｇＧあるいはＩｇＭ画分を回収し、精製モノクローナル抗体とする。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる。蛋白質濃度は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出することができる。
抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４があげられる。
（７）モノクローナル抗体の活性評価
（７−１）ｈＩＧＦへの結合活性評価
培養上清中あるいは精製した抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体のｈＩＧＦに対する結合活性は、上記１（５）のＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４５，２２９−２４０，１９９１）などにより測定することができる。また、ｈＩＧＦおよびｈＩＧＦの部分ペプチドを用いた競合ＥＬＩＳＡにより、ｈＩＧＦとの反応性および抗原エピトープを解析することができる。抗体がｈＩＧＦの立体構造を認識しているか否かは、通常行われる立体構造的解析法、あるいは種々の免疫学的測定法を組み合わせることにより、推測することができる。立体構造解析法としては、例えば、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴法などがあげられる。種々の免疫学的測定法を組み合わせる方法としては、例えば、非変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法と変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法を組み合わせる方法があげられる。このとき、非変性状態の抗原にのみ反応性を示す抗体は、抗原の立体構造を認識している可能性が高いものと推測できる。非変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法とは、液層中で非変性抗原と抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法などがあげられる。変性状態の抗原に対するＥＬＩＳＡ法としては、抗原がもとの立体構造を保持していない状態で抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法であればいずれでもよく、例えば、疎水性の反応プレート上に直接固定化した抗原や、適当な長さに消化した部分ペプチドなどに対するＥＬＩＳＡ法があげられる。
本発明の抗体は、該結合活性測定法または競合ＥＬＩＳＡにより、ｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性とｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性とを有する抗体を選択することにより取得することができる。
また、ｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株に対する影響を検討することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｈＩＧＦの活性を阻害する活性を測定することができる。ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ依存的な増殖を示す細胞株としては、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）、ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２４２２）などがあげられる。
さらに、マウスなどの動物を用いてｈＩＧＦ依存的な細胞増殖測定系を確立し、該測定系に対する影響を検討することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｈＩＧＦの活性を阻害する活性を測定することができる。
（７−２）癌転移阻害活性評価
癌転移阻害活性の評価方法としては、Ｙｏｎｏｕら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，２１７７−２１８２，２００１）のヒト前立腺癌のヒト骨への転移評価系等を用いる方法があげられる。
２．ＩＧＦに対するヒト以外の動物のポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体は、上記１．（２）に示された方法で免疫を施した動物のうち、その血清が十分な抗体価を示した動物の血清から調製することができる。
即ち、該動物から回収した血液から遠心分離法により分画した血清、あるいは該血清から常法に従って免疫グロブリン画分を精製し、ポリクローナル抗体を調製することができる。該ポリクローナル抗体の活性は、上記１．（７）に記載の方法により、抗原に対する結合活性を評価することができる。
３．ヒト化抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとしては、ヒト抗体のＣＨおよび／またはＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであればいかなるものでもよい。ヒト化抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）などがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７，２２３−２３２，１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７８，１５２７−１５３１，１９８１）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３−１８０，１９９０）などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７−１３１０，１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１４９，９６０−９６８，１９８７）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，４１，４７９−４８７，１９８５）とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，３３，７１７−７２８，１９８３）などがあげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１−２７８，１９９４）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９−５６７，１９９８）などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得する。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分あるいはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマから全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３−２８，１９８７）、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）などがあげられる。また、ハイブリドーマからｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）、あるいは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８−６１，１９９２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４，１９８９）、λＺＡＰ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９，１９８５）、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２８０−２８９，１９８３）およびｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３−１１９，１９８５）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，２７１−２８９，１９９２）、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５９，１７７−１９０，１９６８）、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８−７８２，１９８３）、ＮＭ５２２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，１−１９，１９８３）、Ｋ８０２（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１１８−１３３，１９６６）およびＪＭ１０５（Ｇｅｎｅ，３８，２７５−２７６，１９８５）などが用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と表記する；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、ジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７４，５４６３−５４６７，１９７７）などの反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７（ＡＢＩ社製）などを用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌のためのシグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することによって見出すことができる。
さらに、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどに対してＢＬＡＳＴ法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０，１９９０）などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、５’末端に適当な制限酵素の認識配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを増幅し、それぞれを上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮して塩基配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記３（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、上記３（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６−２７１，１９９１）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６−２７１，１９９１）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１２，５３５−５４２，１９７７）あるいはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１−１５０７，１９９４）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて上記３（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について上記３（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、上記３（４）および（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、上記３（４）および（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記３（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることができる。
（７）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記３（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，８４，７４１３−７４１７，１９８７）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などにより測定できる。
（８）ヒト化抗体の安定発現
上記３（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）などがあげられる。ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と表記する）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換体は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡにより測定できる。また、形質転換細胞は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系などを利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）やウェスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などで測定することができる。
（９）ヒト化抗体の活性評価
ヒト化抗体の活性評価は、上記１（７）と同様にして行うことができる。
４．抗体断片の作製
抗体断片は、上記１および２に記載の抗ｈＩＧＦ抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うなどの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、ペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素を用いた部位特異的切断、精製などの方法があげられる。
抗体断片として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドの製造法について以下に具体的に説明する。
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。また、Ｆａｂは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１−１０４３，１９８８）などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。
（２）Ｆ（ａｂ’）２の作製
Ｆ（ａｂ’）２は、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。また、下記４（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢ［５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）］で処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、上記４（２）に記載のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１０，１６３−１６７，１９９２）などがあげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラムなどを用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、ｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＆ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８−５６，１９９４）などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（５）ｄｉａｂｏｄｙの作製
ｄｉａｂｏｄｙは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶＨとＶＬをリンカーがコードするアミノ酸残基が８残基以下となるように連結したＤＮＡを作製し、ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターにクローニングし、ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを作製することができる。ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターとしては、ｄｉａｂｏｄｙのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８，１９９４）などがあげられる。ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにｄｉａｂｏｄｙを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｉａｂｏｄｙとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。まず、上記３（２）、３（４）および３（５）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにｄｓＦｖを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからＶＨおよびＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）。
（７）ＣＤＲペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからＣＤＲペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）。
（８）抗体断片の活性評価
精製した抗体断片の活性評価は、上記１（７）と同様にして行うことができる。
Ｃ．本発明の癌転移阻害剤
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質、具体的には、上記のようにして調製されるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片は、癌転移阻害作用を有するため癌転移阻害剤として有用である。また、該抗体または抗体断片は癌の転移先の転移巣において、転移後増殖を開始し、病態が進行してしまった転移巣に対して、病態の進行を抑制する活性を有するため、転移巣の治療剤としても有用である。
本発明の癌転移阻害剤の対象疾患としては原発巣から転移することが統計的に頻度が高いものであれば特に限定はされないが、各種悪性及び良性腫瘍、例えば、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、カポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄腫、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌などがあげられる。
本発明の癌転移阻害剤は、特に、「ｈＩＧＦ依存性増殖癌」の転移に有効である。「ｈＩＧＦ依存性増殖癌」とは、ｈＩＧＦ存在下で増殖し、ｈＩＧＦ濃度に依存して増殖度が増加する癌のことをいい、たとえば前立腺癌、大腸癌、乳癌、骨肉腫などがあげられる。
上記の各種悪性及び良性腫瘍が転移する先の転移巣としては、ヒトの器官において癌の転移が認められる器官であればいかなる器官も包含される。これらの器官のうち、転移がよく認められる器官としては、例えば、肝臓、腎臓、胃、大腸、膵臓、乳腺、前立腺、膀胱、肺、気管支、脳、神経、リンパ節、副腎、骨などがあげられる。
本発明の癌転移阻害剤は、「ｈＩＧＦ依存性増殖癌」の転移に有効であるため、上記の各器官のうち、ｈＩＧＦが器官内に存在している器官への癌転移に特に有効であり、このようなｈＩＧＦが器官内に存在している器官としては、例えば、肝臓、骨などがあげられる。
癌転移としては、血管やリンパ管を介した他所性転移以外に、血管やリンパ管を介さない同所性転移なども本発明の癌転移に包含される。
本発明の具体的な癌転移としては、例えば、前立腺癌の骨転移、大腸癌の肝転移、乳癌の骨転移、または多発性骨髄腫などの骨髄腫の骨転移などがあげられる。
本発明の癌転移阻害剤は、有効成分であるＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する物質（以下、阻害物質と記す）である抗体または抗体断片を単独で含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩、グリシン、グルコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
本発明の癌転移阻害剤の投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることができるが、静脈内投与が好ましい。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該阻害物質そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該阻害物質を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該阻害物質および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
本発明の癌転移阻害剤の投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
本発明の癌転移阻害剤の投与対象は、原発巣または転移巣が同時、またはそれぞれ単独で臨床的に確認される癌患者であり、外科療法、化学療法、放射線療法、その他全ての癌の治療法の施療の有無を問わない。
原発巣のみが臨床的に認められている癌患者であっても、原発巣以外の部位に臨床的に発見が困難な転移がある場合がある。このような臨床的に発見が困難な転移は、原発巣の治療後に、癌の再発の原因となる。本発明の癌転移阻害剤は、癌の転移巣に有効であるため、転移後の再発の予防剤としても使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を何ら限定するものでない。
（実施例１） 抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８による前立腺癌細胞株の骨転移阻害効果の検討
（１）ｈＩＧＦ−Ｉによるヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞の増殖に対する影響
癌転移阻害試験に先立ち、ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２４２２）細胞の増殖が、ｈＩＧＦ−Ｉにより影響を受けるかを調べた。
１ウェルあたり５×１０５個のＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞を６ウェルプレートに播種し、２０％ウシ胎児血清（ＳＩＧＭＡ社製）を含んだＦ１２Ｋ（＋）培地｛Ｆ１２Ｋ（ＳＩＧＭＡ社製）に、２５ｎｇ／ｍＬコレラトキシン（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、１０ｎｇ／ｍＬ組換えヒト上皮成長因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１００ｐｇ／ｍＬヒドロコルチゾン（ＳＩＧＭＡ社製）、０．１ｎＭジヒドロテストステロン（ＳＩＧＭＡ社製）、１／１００容量ＩＴＳ−Ｘサプリメント（×１００）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を添加したもの｝を用いて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で静置培養した。４８時間の培養後、各ウェルの培地に、無添加、または１、１０あるいは１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）をそれぞれ添加した無血清Ｆ１２Ｋ培地（ＳＩＧＭＡ社製）に交換した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で、無血清培地に交換してから４８時間静置培養した後、細胞を回収してトリパンブルー染色により各ウェルの生細胞数を測定した。結果を第１図に示した。
第１図に示したように、ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞はｈＩＧＦ−Ｉ濃度依存的に増殖が促進されることが明らかとなった。
（２）ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な細胞増殖に対する抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の影響
前項（１）で記載したｈＩＧＦ−Ｉ依存的に増殖するＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞を用いて、ｈＩＧＦ−Ｉの依存的な細胞増殖が、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８（以下、抗体ＫＭ１４６８と記す）により影響を受けるかを調べた。抗体ＫＭ１４６８は、後記参考例１に従って調製した。
実施例１（１）と同様にＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で４８時間培養した後、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）および最終濃度０、０．１、１、１０μｇ／ｍＬ抗体ＫＭ１４６８をそれぞれ添加した無血清Ｆ１２Ｋ培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で、静置培養した。無血清培地に交換してから４８時間後、細胞を回収してトリパンブルー染色により各ウェルの生細胞数を測定した。結果を第１図に示した。
第１図に示したように、抗体ＫＭ１４６８はｈＩＧＦ−Ｉ依存的なＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞の増殖を阻害した。また、その増殖阻害活性は、抗体ＫＭ１４６８濃度依存的であった。また、ネガティブコントロールである抗体ＫＭ１７６２（抗アベルメクチン抗体）は増殖を全く阻害しなかった。
（３）抗体ＫＭ１４６８による前立腺癌細胞株の骨転移阻害効果および転移巣に対する治療効果の検討
ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞のヒト骨への転移モデルを用いて、抗ｈＩＧＦ抗体の骨転移阻害効果および転移巣に対する治療効果を検討した。
Ｙｏｎｏｕらの手法（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，２１７７−２１８２，２００１）に従って調製した約１ｃｍ３のヒト骨組織片を、６−８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア）に皮下移植した。ヒト骨組織片の移植から４週間経過後、ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞を４×１０７個／ｍＬになるように無血清培地に懸濁し、細胞懸濁液１００μＬを移植したヒト骨組織片に注入した。初期転移モデルでは、ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞の移植と同時に抗体の投与を開始した。一方、進行転移モデルでは、ヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞の移植から４週間経過した時点で抗体の投与を開始した。
各モデルにおけるマウスを、抗体ＫＭ１４６８を投与したマウス群（以下、処置群と表記する）、陰性対象として抗体ＫＭ１７６２（抗アベルメクチン抗体）を投与したマウス群（以下、無処置群と表記する）とに分けて、各群のマウスに抗体の投与を１回／週、４週間の腹腔内投与で行った。処置群での一回当たりの抗体ＫＭ１４６８投与量は、初期転移モデルでは０．０１、０．１または２ｍｇ／ｋｇとし、進行転移モデルでは０．１、２または１０ｍｇ／ｋｇとした。無処置群での一回当たりの抗体ＫＭ１７６２投与量は、初期転移モデルでは２ｍｇ／ｋｇとし、進行転移モデルでは１０ｍｇ／ｋｇとした。同時試験数は、処置群、無処置群共にそれぞれ９〜１０匹のマウスを用いて行った。両モデルとも、投与を開始してから４週間後に移植した骨組織の摘出し、同時に全採血を行った。
摘出したヒト骨組織を切片化し、骨組織中の腫瘍細胞が占める面積を、ＫＳ ３００ｓｙｓｔｅｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．００画像解析装置（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製）を用いて解析した。また採取した血液から血清画分を分取し、前立腺癌の血清腫瘍マーカーである前立腺特異的抗原（以下、ＰＳＡと表記する）濃度を、ラジオイムノアッセイキット（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ社製）を用いて測定した。
初期転移モデルのマウスから摘出したヒト骨組織に占める転移腫瘍細胞の面積の割合を第２図Ａに示し、進行転移モデルのマウスから摘出したヒト骨組織に占める転移腫瘍細胞の面積の割合を第２図Ｃに示した。初期転移モデル（第２図Ａ）の無処置群では、ヒト骨組織に占める腫瘍面積の割合は６％だったが、同モデルの処置群では、無処置群と比較して投与した抗体量依存的に腫瘍面積の割合が減少していた。２ｍｇ／ｋｇの最大投与量では、腫瘍面積の割合は無処置群と比較して約１／２０に減少していた。同様に、進行転移モデル（第２図Ｃ）においても、無処置群では骨組織内の腫瘍面積の割合が３８％であったが、同モデルの処置群では、無処置群と比較して投与した抗体量依存的に腫瘍面積の割合が減少していた。１０ｍｇ／ｋｇの最大投与量では、腫瘍面積の割合は無処置群と比較して約１／４に減少していた。
初期転移モデルのマウスの血清ＰＳＡ濃度を第２図Ｂに、進行転移モデルのマウスの血清ＰＳＡ濃度を第２図Ｄに示した。初期転移モデル（第２図Ｂ）の無処置群では、血清ＰＳＡ濃度が約５ｎｇ／ｍＬであったが、同モデルの処置群では無処置群と比較して投与した抗体量依存的に血清ＰＳＡが減少していた。２ｍｇ／ｋｇの最大投与量では、血清ＰＳＡは無処置群と比較して約１／１０に減少していた。同様に、進行転移モデル（第２図Ｄ）においても、無処置群では血清ＰＳＡ濃度が約４５ｎｇ／ｍＬであったが、同モデルの処置群では無処置群と比較して投与した抗体量依存的に血清ＰＳＡが減少しており、１０ｍｇ／ｋｇの最大投与量では、血清ＰＳＡは無処置群と比較して約１／２に減少していた。
以上のことから、抗体ＫＭ１４６８は、マウス体内に移植されたヒト骨組織へのヒト前立腺癌細胞株ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ細胞の生着を阻害するだけでなく、生着後、時間が経過し、増殖してしまった癌細胞の増殖を阻害する活性を有していることが示された。従って、抗体ＫＭ１４６８は前立腺癌の骨転移を阻害するのみならず、転移巣に対しても有効な治療効果を有することが明らかとなった。
（実施例２） 抗体ＫＭ１４６８による多発性骨髄腫細胞株の骨転移阻害効果の検討
（１）ｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞への影響
骨転移阻害効果試験に先立ち、ヒト多発性骨髄腫細胞株であるＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１５５）に対するｈＩＧＦ−Ｉ刺激による影響をウェスタンブロッティング（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｏｒ１２，１９８８）により調べた。このとき、それぞれリン酸化されたＩＧＦ−ＩＲ、Ａｋｔ（別称：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｂ）およびＭｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ（以下、ＭＡＰＫと記す）に特異的に反応する抗体を用いて、ＩＧＦ−ＩＲ、ＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化を検出した。
各６×１０６個のＲＰＭＩ８２２６細胞を無血清条件下で２４時間培養した後、ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）をそれぞれ０、１または１０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加して、３０分間の刺激を与えた。刺激後の細胞は冷却したリン酸緩衝液にて洗浄後回収し、２００μＬのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ［１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ＮＰ４０、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、８μＬのｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍｉｘｔｕｒｅ（１ ｔａｂｌｅｔ／ｍｌ Ｈ２Ｏ）、１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅおよび１０ｍＭ ＮａＦを添加した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）］に溶解して氷上で３０分間静置した後、遠心分離により上清を回収し、蛋白抽出を行った。
抽出したタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した後、定法に従ってメンブレンに転写し、各種抗体との反応性をウェスタンブロッティング（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｏｒ１２，１９８８）により検討した。
リン酸化されたＩＧＦ−ＩＲ、ＡｋｔまたはＭＡＰＫを認識する抗体として、それぞれ、抗リン酸化ＩＧＦ−ＩＲポリクローナル抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、抗リン酸化Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）または抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を、リン酸化および非リン酸化の区別無くＩＧＦ−ＩＲ、ＡｋｔまたはＭＡＰＫを認識する抗体として、それぞれ、抗ＩＧＦ−ＩＲβ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗Ａｋｔ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）または抗ＭＡＰＫ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。結果を第３図に示した。
第３図に示したように、ｈＩＧＦ−Ｉによる刺激により、ｈＩＧＦ−ＩＲおよびＡｋｔのリン酸化が亢進した（第３図のレーン１、６および７）。一方、ｈＩＧＦ−ＩＲ、Ａｋｔ、リン酸化ＭＡＰＫおよびＭＡＰＫの発現変動は認められなかった。
このことは、ｈＩＧＦ−Ｉによる刺激が、ＭＡＰＫを介する細胞増殖シグナルではなく、リン酸化されたＩＧＦ−ＩＲからＡｋｔのリン酸化を介した細胞生存シグナルを伝達することを示している。
（２）ｈＩＧＦ−Ｉの刺激に対する抗体ＫＭ１４６８の阻害効果の検討
前項（１）に記述したウェスタンブロッティングにより、ｈＩＧＦ−Ｉの刺激に対する抗体ＫＭ１４６８の阻害効果を検討した。抗体ＫＭ１４６８またはネガティブコントロール抗体であるＫＭ１７６２（抗アベルメクチン抗体）は、無血清条件下でｈＩＧＦ−Ｉ添加前に添加した。抗体ＫＭ１７６２は１μｇ／ｍＬの濃度で、抗体ＫＭ１４６８は０．１、１または１０μｇ／ｍＬの濃度で添加した。結果を第３図に示した。
第３図に示したように、抗体ＫＭ１７６２ではリン酸化は抑制されない（第３図のレーン８）が、抗体ＫＭ１４６８は濃度依存的にｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるｈＩＧＦ−ＩＲおよびＡｋｔのリン酸化を抑制できることが確認された（第３図のレーン９〜１１）。
同様にＲＰＭＩ８２２６細胞を用いて、ｈＩＧＦ−Ｉ刺激による細胞増殖に対する抗体ＫＭ１４６８の増殖阻害効果をトリパンブルー染色による生細胞数測定により、検討した。
無血清培地ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社製）で培養したＲＰＭＩ８２２６細胞を１ウェルあたり２×１０５個で６ウェルプレートに播種し、各ウェルに、ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）を無添加、もしくは１ｎｇ／ｍＬの濃度で添加し、さらに、ネガティブコントロール抗体である抗体ＫＭ１７６２または抗体ＫＭ１４６８を１μｇ／ｍＬの濃度で添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で静置培養し、２４時間毎に生細胞数の測定を行い、９６時間後まで計測した。結果を第４図に示した。
第４図に示されるように、７２時間と９６時間では、ｈＩＧＦ−Ｉで刺激された細胞の増殖は、抗体ＫＭ１４６８によって抑制されることが有意差を持って示された（ｐ＜０．０００１）。
さらに、同様の実験において、抗体ＫＭ１４６８の濃度を段階的に変更し、９６時間静置培養した後の生細胞数を測定した結果を第５図に示した。
第５図に示されるように、抗体ＫＭ１４６８の濃度依存的にＲＰＭＩ８２２６細胞の増殖は抑制されることが確認された。
以上のことから、抗体ＫＭ１４６８はｈＩＧＦ−Ｉ刺激によるｈＩＧＦ−ＩＲからＡｋｔのリン酸化を介した細胞生存シグナルを阻害することにより、ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な増殖を示す多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞の増殖を阻害できることが示された。
（３）抗体ＫＭ１４６８による多発性骨髄腫細胞株の骨転移阻害効果の検討
ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞を用いてヒト骨での腫瘍形成モデルを作製し、抗体ＫＭ１４６８の骨内での腫瘍形成に対する抑制効果の検討を行った。
Ｙｏｎｏｕらの手法（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，２１７７−２１８２，２００１）に従って作製した約１ｃｍ３のヒト骨組織片を、６−８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア）に皮下移植した。ヒト骨組織片の移植から４週間経過後、ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞を１×１０７個／ｍＬになるようにリン酸緩衝液に懸濁し、細胞懸濁液５０μＬを移植したヒト骨組織片に注入した。さらにヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞の移植と同時に抗体ＫＭ１４６８の投与を開始した。
抗体の効果を判定するために抗体ＫＭ１４６８を投与したマウス群（以下、処置群と表記する）、陰性対象として抗体ＫＭ１７６２を投与したマウス群（以下、対照処置群と表記する）とに分けて、各群のマウスに週１回の割合で４週間に渡って抗体の腹腔内投与を行った。処置群での１回当たりの抗体ＫＭ１４６８の投与量は、０．１または１ｍｇ／ｋｇとした。対照処置群での１回当たりの抗体ＫＭ１７６２の投与量は０．１ｍｇ／ｋｇとした。試験数は、処置群ではそれぞれ１０匹、対照処置群では５匹のマウスを用いて行った。投与を開始してから４週間後に移植した骨組織を摘出し、以下の方法で抗体ＫＭ１４６８の投与効果の判定を行った。
摘出したヒト骨組織を切片化し、骨組織中の腫瘍細胞が占める面積を、ＫＳ ３００ｓｙｓｔｅｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．００画像解析装置（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて解析した。結果は第６図に示した。
第６図に示したように、対照処置群では、ヒト骨組織に占める腫瘍面積の平均値は１８．５２±９．１７３ｍｍ２／ｃｍ２であったのに対して、処置群では０．１ｍｇ／ｋｇの濃度で抗体ＫＭ１４６８を投与した場合では、２．５３０±０．９０６４ｍｍ２／ｃｍ２（ｐ＝０．０２６０）であり、また１ｍｇ／ｋｇの濃度で抗体ＫＭ１４６８を投与した場合では、１．８９０±１．０９８ｍｍ２／ｃｍ２（ｐ＝ａｎｄ ０．０２２６）といずれも対照処置群と比較して腫瘍面積の減少が認められた。
以上のことから、抗体ＫＭ１４６８は、マウス体内に移植されたヒト骨組織でのヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６細胞の生着、増殖を阻害することができ、ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な多発性骨髄腫の骨転移を阻害できることが示された。
（実施例３） 抗体ＫＭ１４６８による乳腺癌細胞株の骨転移巣に対する治療効果の検討
抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の乳癌骨転移巣に対する治療効果を、ヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）細胞のヒト骨への転移モデルを用いて検討した。ヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７は、参考例２の（３）で示されるように、ｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株である。
Ｙｏｎｏｕらの手法（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，２１７７−２１８２，２００１）に従って調製した約４００ｍｍ３のヒト骨組織片を、６−８週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア）に皮下移植した。ヒト骨組織片の移植から４週間経過後、ヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７細胞を１×１０８個／ｍＬになるように無血清培地に懸濁し、細胞懸濁液５０μＬを移植したヒト骨組織片に注入した。さらに、ヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７細胞の移植と同時に抗体の投与を開始した。
抗体ＫＭ１４６８を投与したマウス群（以下、処置群と表記する）、陰性対象として抗体ＫＭ１７６２を投与したマウス群（以下、対照処置群と表記する）とに分けて、各群のマウスに週１回の割合で、４週間に渡って抗体の腹腔内投与を行った。処置群および対照処置群での一回当たりの抗体の投与量は２ｍｇ／ｋｇとした。同時試験数は、処置群、対照処置群共にそれぞれ１２匹のマウスを用いて行った。いずれの群においても、抗体の投与を開始してから４週間後に移植した骨組織を摘出した。
摘出したヒト骨組織を切片化し、骨組織中の腫瘍細胞が占める面積を、ＫＳ ３００ｓｙｓｔｅｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．００画像解析装置（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ社製）を用いて解析した。結果は第７図に示した。
第７図に示したように、対照処置群では、ヒト骨組織に占める腫瘍面積は平均２．７０ｍｍ２だったが、処置群では、対照処置群と比較して腫瘍面積は平均０．８５ｍｍ２と約３０％に減少した。以上のことから、抗体ＫＭ１４６８は、マウス体内に移植されたヒト骨組織におけるヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７細胞の生着増殖を阻害することができ、ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な乳癌の骨転移を阻害できることが示された。
（実施例４） 抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体および抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体による、大腸癌肝臓転移阻害効果
抗ｍＩＧＦ抗体のヒト大腸癌細胞株ＨＴ２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）細胞の肝臓への転移抑制効果を確認するため、マウスを用いて以下の実験を行った。
ＨＴ２９細胞を２×１０７個／ｍＬになるようにＰＢＳに懸濁し、該懸濁液２００μＬを９−１０週齢のオスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア）の脾臓の被膜下に注入して移植した。ＨＴ２９細胞の移植と同時に、各マウスを各種処置群および無処置群からなる以下の５群に分け、抗体およびＰＢＳの投与を行った。併せて、各群の同時再現数を示した。
１．無処置群（ＰＢＳ投与）；１０匹
２．抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９１）単独投与群；８匹
３．抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９２）単独投与群；６匹
４．抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９１）と抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９２）併用投与群；７匹
５．抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９１）と抗体ＫＭ１４６８併用投与群；７匹
投与は、ＨＴ２９細胞の移植同日より開始し、１回／週で４週間にわたり腹腔内に施した。処置群における一回当たりの投与量は、各抗体が一匹当たり２．５μｇとなるようにし、無処置群には同容量のＰＢＳを投与した。ＨＴ２９細胞は、腫瘍マーカーである癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと表記する）を分泌するため、マウス血清中のＣＥＡ値をアーキテクトＴＭ．ＣＥＡキット（ダイナボット社製）を用いて測定し、肝臓における腫瘍細胞の増殖の指標とした。
第８図には、腫瘍移植後２８日目のマウス血清中のＣＥＡ値を示した。無処置群と比べて、それぞれ抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体または抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体の単独投与群では、腫瘍増殖を部分的に抑制した。一方、抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体の併用投与群および抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗体ＫＭ１４６８併用投与群は、各抗体の単独投与群に比べて、顕著な腫瘍の増殖抑制活性を示した。抗体ＫＭ１４６８はヒトのＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを中和する抗体であるが、マウスＩＧＦファミリーに対してはＩＧＦ−ＩＩを選択的に中和する活性を示すことから、抗体ＫＭ１４６８はｍＩＧＦ−ＩＩに対する中和抗体として機能していると考えられる。以上のことから、腫瘍細胞の転移には、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両者が関与しており、腫瘍の抑制に対してＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方の活性を同時に阻害することが効果的であることが明らかとなった。
さらに、抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗体ＫＭ１４６８併用投与群の腫瘍増殖抑制活性の機構を解析する目的で、上記の無処置群および抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗体ＫＭ１４６８併用投与群について腫瘍移植後２８日目のマウスの肝臓の転移病巣より腫瘍切片を作製し、免疫組織化学的検討を行なった。肝臓を切除後、３０％ホルマリンで固定後、パラフィン包埋し、厚さ５μｍの切片を作製した。切片をＨ＆Ｅ染色（病理標本の作り方、病理技術研究会編、１９９２）およびＥｎＶｉｓｏｎシステム（ＤＡＫＯ社製）を用いて抗ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、２００倍希釈で使用）で染色した。検出にあたっては、切片をクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中でマイクロウェーブ処理（９５℃、２０分）を行い、抗原を賦活化して用いた。その結果、Ｈ＆Ｅ染色で抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗体ＫＭ１４６８併用投与群において、無処置群と比べて多数のアポトーシス小体が観察され、また、抗ｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３抗体で染色されるアポトーシス細胞の増加が認められた。
アポトーシス誘導の指標（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｅｘ：ＡＩ）として、１０００個の腫瘍細胞あたりのｃｌｅａｖｅｄ ｃａｓｐａｓｅ−３陽性細胞の割合（％）を求め、グラフ化した結果を第９図に示した。無処置群と比べて、処置群では有意なアポトーシス細胞の増加が認められた。以上の結果から、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方の活性を同時に阻害することにより、腫瘍細胞のアポトーシスが誘導され、腫瘍増殖が抑制されることが明らかとなった。
（実施例５） 抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体および抗ｍＩＧＦ−ＩＩ抗体による、大腸癌の肝臓での転移病巣に対する治療効果
抗ｍＩＧＦ抗体のヒト大腸癌細胞株ＨＴ２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）細胞の肝臓での転移病巣に対する治療効果を確認するため、マウスを用いて以下の実験を行った。
ＨＴ２９細胞を２×１０７個／ｍＬになるようにＰＢＳに懸濁し、該懸濁液２００μＬを９−１０週齢のオスのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本クレア）の脾臓の被膜下に注入して移植した。ＨＴ２９細胞の移植２週間後、肝臓に転移が成立後に、マウスを以下の処置群、無処置群に分け、抗体およびＰＢＳの投与を行った。併せて、各群の同時再現数を示した。
１．無処置群（ＰＢＳ投与）；８匹
２．処置群（抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体と抗体ＫＭ１４６８併用投与群）；９匹
抗体はＨＴ２９細胞の移植２週間後より投与を開始し、１回／週、４週間の腹腔内投与を行った。処置群における一回当たりの投与量は、マウス体重１ｇ当たり、抗ｍＩＧＦ−Ｉ抗体（Ｒ＆Ｄ社製 ＡＦ７９１）が０．１μｇ、抗体ＫＭ１４６８が１μｇとし、無処置群には同容量のＰＢＳを投与した。マウス血清中のＣＥＡ値をアーキテクトＴＭ．ＣＥＡキット（ダイナボット社製）を用いて測定し、肝臓における腫瘍細胞の増殖の指標とした。
第１０図Ａには、投与開始後２８日目のマウス血清中のＣＥＡ値を示した。無処置群と比べて、処置群は、優位な腫瘍の増殖抑制効果が認められた。第１０図Ｂには、マウスの累積生存率を示した。投与開始後４１日目に無処置群では全マウスが死亡したが、処置群では優位な延命効果が確認され、実験終了時の４２日目で４匹が生存していた。以上のことから、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方の活性を同時に阻害することが、肝臓における大腸癌の転移病巣に対して有効な治療効果を示し、また、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方の活性を同時に阻害する治療法は延命効果があることが明らかとなった。
（参考例１） 抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の作製
（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
組換え型ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）は、免疫原性を高める目的で以下の方法でメチル化ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、２回蒸留水に溶解したメチル化ＢＳＡを、メチル化ＢＳＡ：ｈＩＧＦ−Ｉ＝１：４（重量比）になるように４℃で混合し、１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌した。その後、連結針付きシリンジを用いて完全フロインドアジュバントあるいは不完全フロインドアジュバントと容量比１：１で混合し、免疫原（以下、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉと表記する）とした。
５週令雌ＳＤラットに、完全フロインドアジュバントを用いて上記のように調製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉ（ｈＩＧＦ−Ｉの１００μｇ相当量）を投与し、２週間後より不完全フロインドアジュバントを用いて同様に調製した免疫原を１週間に１回、計４回投与した。
眼底静脈叢より採血し、その血清中の抗体価を参考例１（４）に示す結合ＥＬＩＳＡで調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し、赤血球を除去し、ＭＥＭで３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（２）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を通常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した。
（３）ハイブリドーマの作製
参考例１（１）で得られたラット脾細胞と（２）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞に３７℃で攪拌しながら、１０２個のラット脾細胞あたり０．２〜１．０ｍＬの融合培地（２ｇのＰＥＧ−１０００、２ｍＬのＭＥＭ、０．７ｍＬのジメチルスルホキシドの混液）を加え、１〜２分間毎に１〜２ｍＬのＭＥＭを数回加えた後、さらに、ＭＥＭを加えて全量が５０ｍＬになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、緩やかに細胞をほぐした後、１００ｍＬのＨＡＴ培地に懸濁した。
この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。この培養上清を参考例１（４）に示す結合ＥＬＩＳＡを用いて、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉに反応して、陰性対照であるメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡ［ＢＳＡを用いて上記参考例１（１）と同様の反応を行い作製したコンジュゲート］に反応しないウェルを選び、さらにＨＴ培地と通常培地に換え、２回の単一細胞化を行い、抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。
その結果、第１１図に示した反応性を有するＫＭ１４６８、ＫＭ１４６９、ＫＭ１４７０、ＫＭ１４７１、ＫＭ１４７２およびＫＭ１４７３の６クローンのハイブリドーマを取得した。各ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスを、サブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡにより検討した結果、いずれもＩｇＧ２ｂであった。
（４）モノクローナル抗体の選択（結合ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレートに固定化する抗原としては、参考例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉおよび陰性対照としてメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡを用いた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、上述の抗原をｈＩＧＦ−ＩあるいはＢＳＡの濃度として１０μｇ／ｍＬで５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、被免疫ラット抗血清、抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清あるいは精製した抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体を５０μＬ／ウェルで分注し、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を二次抗体として５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
（５）モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令Ｂａｌｂ／ｃヌード雌マウスに参考例１（３）で得られたハイブリドーマクローンを５〜２０×１０６細胞／匹でそれぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマが腹水癌化したマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去した。その後、カプリル酸沈殿法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）によりＩｇＧ画分を精製し、精製モノクローナル抗体とした。
（参考例２） 抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の反応性の検討
（１）ｈＩＧＦ−Ｉの天然の立体構造に対する反応性
参考例１（３）で選択された抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を保つｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を、下記に示す競合ＥＬＩＳＡで調べた。
参考例１（４）に示した、参考例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉを固定化したプレートを準備し、２０μｇ／ｍＬより５倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注後、抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の精製抗体を希釈した溶液（ＫＭ１４６８：６．０μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７０：１．０μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７１：０．１６μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７２：７．０μｇ／ｍＬ、ＫＭ１４７３：１．２μｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で２時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
第１２図に示したように、本発明の６種の抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体はいずれもｈＩＧＦ−Ｉの天然の立体構造に反応性を示した。また、本系において、最も高い感度を示したＫＭ１４６８を用いた場合、液相系に含まれる１６ｎｇ／ｍＬまでの濃度の天然の立体構造を有するｈＩＧＦ−Ｉを検出可能であった。
（２）抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体のｈＩＧＦファミリーに対する反応性
精製した抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体ＫＭ１４６８（以下、抗体ＫＭ１４６８と記す）のｈＩＧＦに対する反応性を検討した。第１３図に、参考例１（４）に示した結合ＥＬＩＳＡにより、抗体ＫＭ１４６８および市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）のｈＩＧＦ−Ｉとの反応性を検討した結果を示した（抗体濃度は、３０μｇ／ｍＬから３倍希釈で段階的に希釈）。ただし、ｓｍ１．２の場合は、二次抗体として２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を用いた。第１３図に示したように、いずれの抗体も抗体濃度依存的なｈＩＧＦ−Ｉ結合活性を示したが、その活性の強さは、抗体ＫＭ１４６８の方が高かった。
次に、各抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合におけるｈＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ社製）、ｈＩＧＦ−ＩＩ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ社製）、ヒトインスリン（和光純薬社製）およびｍＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ ＥＣ社製）による阻害活性を以下に示した競合ＥＬＩＳＡで検討した。
参考例１（４）に示したように抗原を固定化したプレートを準備し、４．０μｇ／ｍＬに希釈した各種抗体を５０μＬ／ウェルで分注後、２０μｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩ、または、１０μｇ／ｍＬより５倍希釈で段階的に希釈したヒトインスリンあるいはｍＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＫＭ１４６８の場合は、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）、ｓｍ１．２の場合は、２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のＯＤ４１５を１００として相対値（％）で表示した。結果を第１４図に示した。第１４図に示したように、抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−Ｉ（第１４図Ａ）およびｈＩＧＦ−ＩＩ（第１４図Ｂ）で強く阻害され、ｈＩＧＦ−Ｉによる結合の５０％阻害の濃度（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５０；以下、ＩＣ５０と表記する）は約０．３μｇ／ｍＬ（約３９ｎＭ）、ｈＩＧＦ−ＩＩによるＩＣ５０は約０．４μｇ／ｍＬ（約５８ｎＭ）と同程度の値を示した。一方、ヒトインスリンおよびｍＩＧＦ−Ｉでは阻害は認められなかった。以上の結果から、抗体ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩとｈＩＧＦ−ＩＩの両方に特異的、かつ同程度の強さで反応することが明らかとなった。市販の抗ＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−Ｉ（第１４図Ａ）により強く阻害され、ｈＩＧＦ−ＩＩ（第１４図Ｂ）による阻害活性は弱かった。ｓｍ１．２のｈＩＧＦ−ＩによるＩＣ５０は約１．２μｇ／ｍＬ（約１５６ｎＭ）であったのに対し、ｈＩＧＦ−ＩＩによるＩＣ５０は＞１０μｇ／ｍＬ（＞１．４５μＭ）であった。一方、ヒトインスリンおよびｍＩＧＦ−Ｉでは阻害は認められなかった。
（３）抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体のｈＩＧＦ依存性細胞増殖に対する影響
精製した抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ依存性細胞増殖に対する影響を検討した。抗体としては、ＫＭ１４６８、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）あるいはヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４２７）をＴＦ／ＢＳＡ培地［Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）に１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）、２００μｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した培地］で０．５〜１×１０５細胞／ｍＬに調製し、９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルで分注した。さらに、ＴＦ／ＢＳＡ培地で各種濃度に希釈したｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩあるいはヒトインスリンの各因子を５０μＬ／ウェルで、ＴＦ／ＢＳＡ培地で各種濃度に希釈した各抗体を５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で５日間培養した。培養後、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ社製）を２０μＬ／ウェルで分注し、さらに、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２．５〜４時間培養した後に、ＯＤ４５０ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４５０と表記する）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
第１５図Ａには、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７の各因子による増殖曲線を示した。さらに、第１５図Ｂには、４０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、第１５図Ｃには、１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩの存在下、第１５図Ｄには、１００ｎｇ／ｍＬのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖を示した。第１５図に示したように、ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖を同程度に強く阻害し、その活性は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、参考例２（２）の競合ＥＬＩＳＡで認められた各抗体の結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの活性が阻害されることを明確に示したものである。
第１６図Ａには、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９の各因子による増殖曲線を示した。さらに、第１６図Ｂには、１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、第１６図Ｃには、１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩの存在下、第１６図Ｄには、２０ｎｇ／ｍＬのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖を示した。
第１６図に示したように、ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖を同程度に強く阻害し、その活性は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、参考例２（２）の競合ＥＬＩＳＡで認められた結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの活性が阻害されることを明確に示したものである。さらに、第１６図ＢのＫＭ１４６８、第１６図ＣのＫＭ１４６８およびＳ１Ｆ２を反応させた場合には、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩを添加しない場合よりも細胞増殖が抑制された。このことから、ＨＴ−２９細胞は、自らｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩを産生して増殖しており、その増殖効果も抗体の添加によって阻害できることが明らかとなった。
第１７図Ａには、ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ−６３の各因子による増殖曲線を示した。さらに、第１７図Ｂには、２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、第１７図Ｃには、２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩの存在下、第１７図Ｄには、２０ｎｇ／ｍＬのヒトインスリン存在下での、各抗体添加時の増殖を示した。第１７図に示したように、ＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩによる細胞増殖を同程度に強く阻害し、その活性は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２よりも高かった。一方、ヒトインスリンによる増殖に対しては、いずれの抗体も影響を与えなかった。以上の結果は、参考例２（２）の競合ＥＬＩＳＡで認められた結合特異性と良く相関しており、また、各抗体の結合により、各因子の機能が阻害されることを明確に示したものである。
（参考例３）抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の抗原認識部位の解析
（１）ｈＩＧＦ−Ｉの部分ペプチドの合成
ＷＯ０１／６４７５４に記載の方法に従って、ｈＩＧＦ−Ｉの部分ペプチドを合成した。合成したペプチドは、ｈＩＧＦ−Ｉの１−１８番目（配列番号１；以下、ｐ１−１８と表記する）、１４−３０番目（配列番号２；以下、ｐ１４−３０と表記する）、２４−３５番目（配列番号３；以下、ｐ２４−３５と表記する）、２９−４１番目（配列番号４；以下、ｐ２９−４１と表記する）、３６−４７番目（配列番号５；以下、ｐ３６−４７と表記する）、４１−５６番目（配列番号６；以下、ｐ４１−５６と表記する）、５２−７０番目（配列番号７；以下、ｐ５２−７０と表記する）、５３−６１番目（配列番号８；以下、ｐ５３−６１と表記する）、６１−７０番目（配列番号９；以下、ｐ６１−７０と表記する）に相当するペプチドであり、ｈＩＧＦ−Ｉの全長を網羅するように設計した。上記ペプチドにおいては、内部に存在するＣｙｓについては、ＳｅｒあるいはＡｌａに置換した配列を合成した。また、４１−５６番目に相当する配列については、内部のＣｙｓを有する配列（配列番号１０；以下、ｐ４１−５６Ｃと表記する）も合成した。
（２）抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の抗原認識部位の解析
上記（１）で合成した各種ペプチドを用いて、抗ｈＩＧＦラット抗体ＫＭ１４６８の抗原認識部位の解析を以下に示す競合ＥＬＩＳＡで検討した。
参考例１（４）に示したように抗原を固定化したプレートを準備し、４．０μｇ／ｍＬに希釈した各種抗体を５０μＬ／ウェルで分注後、５０μｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に希釈した各種ペプチド溶液の単独あるいは種々の組合せ、あるいはｈＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のＯＤ４１５を１００とした相対値（％）で表示した。結果を第１８図に示した。第１８図に示したように、ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−Ｉにより濃度依存的に阻害されたが、各種ペプチドでは、単独あるいは組合せに拘わらず、阻害活性は認められなかった。以上の結果は、ＫＭ１４６８が、ｈＩＧＦ−Ｉの単なるアミノ酸一次配列ではなく、ｈＩＧＦ−Ｉの立体構造を認識していることを強く示唆する結果である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明の癌転移阻害剤は、前立腺癌の骨転移や大腸癌の肝転移などの癌転移を有意に阻害することができるので、癌治療のための医薬として臨床上極めて有用である。
また、本発明の癌転移阻害剤は、転移巣の腫瘍細胞の増殖抑制に特に有効であるので、癌転移の症状がはっきり現れていない患者へ予防的に投与することもできる。さらに、転移巣の腫瘍細胞の増殖抑制ができるため、病態が進行した転移巣に対する治療剤としても有効に用いることができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の活性を阻害する物質を有効成分として含有する癌転移阻害剤。
【請求項２】
物質が、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選ばれる、請求項１に記載の阻害剤。
（ａ） ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片
（ｂ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を含む組成物
（ｃ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を組み合わせてなる組成物
（ｄ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片の複合体
（ｅ） 上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかと他分子を結合させた複合体
【請求項３】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の阻害剤。
【請求項４】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項２又は３に記載の阻害剤。
【請求項１】
インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の活性を阻害する物質を有効成分として含有する癌転移阻害剤。
【請求項２】
物質が、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選ばれる、請求項１に記載の阻害剤。
（ａ） ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片
（ｂ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を含む組成物
（ｃ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片を組み合わせてなる組成物
（ｄ） ＩＧＦ−Ｉに特異的に結合し、ＩＧＦ−Ｉの活性を阻害する抗体または抗体断片、およびＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ＩＧＦ−ＩＩの活性を阻害する抗体または抗体断片の複合体
（ｅ） 上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかと他分子を結合させた複合体
【請求項３】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の阻害剤。
【請求項４】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項２又は３に記載の阻害剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１８６７１
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【発行日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１３３７５（Ｐ２００５−５１３３７５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２３３０
【国際出願日】平成１６年８月２０日（２００４．８．２０）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【発行日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１２３３０
【国際出願日】平成１６年８月２０日（２００４．８．２０）
【出願人】（０００００１０２９）協和醗酵工業株式会社 (276)
【出願人】（５９０００１４５２）国立がんセンター総長 (80)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]