癒着形成防止、抑制又は治療剤
本発明の課題は、例えば、心臓、胸部、婦人科的、眼病、腹部等の整形外科的あるいは形成外科的な手術を含む様々な外科的工程の前若しくは後に、又は外傷若しくは炎症等の起因による内臓癒着が危惧される場合に、効果的に癒着形成を防止、抑制又は治療を可能とする薬剤を提供することである。静脈内投与、経口投与又は経皮適用することによる少なくとも１の効果的な量のプロテアーゼ阻害剤を含む薬剤による。該プロテアーゼ阻害剤は、好ましくはセリンプロテアーゼ阻害剤であり、該セリンプロテアーゼ阻害剤はキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤である。具体的には、キマーゼ阻害剤であり、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２であるα−アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体であり、好ましくは鏡像異性体Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２である。
【発明の詳細な説明】
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号特願２００３−０２８７４３からの優先権を請求する。
【技術分野】
本発明はプロテアーゼ阻害剤を使用した癒着形成予防方法に関する。さらに詳しくは、本発明はセリンプロテアーゼ阻害剤、特にキマーゼ阻害剤を使用した癒着形成予防方法に関する。
【背景技術】
術後癒着形成は、例えば心臓、胸部、婦人科、眼科および腹部等の一般的な整形外科的あるいは形成外科的な手術後におこる主要な合併症である。囲心癒着は顕著な問題を引きおこし、再手術の心臓外科手術の罹病率や死亡率を増加させる（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．１４：９３−９７，２００１：非特許文献１）。術後の腹膜癒着は、腹部や婦人科手術後において、重症な場合には腸閉鎖症、不育症、痛みなどの合併症を伴う罹病の主な原因となっている（Ｄｉｇ．Ｓｕｒｇ．１８：２６０−７３，２００１：非特許文献２）。トラウマ、乾燥、局部貧血、伝染性由来の腹膜炎、子宮内膜症を含む多くの原因が癒着形成に関係あるとされる一方、癒着形成の病態生理学的本質は完全には理解されてはいない。
術後癒着は、一般的に傷害後５〜７日内の通常創傷治癒反応の結果としておこる。癒着形成と非癒着再上皮形成は代替経路であり、いずれも共に凝固の作用から開始し、それはカスケード反応でフィブリンゲルマトリックスの構築へ結びつくものと考えられる。フィブリン沈着が過剰又は除去されないと、フィブリンが架橋を形成することにより、フィブリンゲルマトリックスが形成され癒着の予備軍となりうる。架橋は線維芽細胞を含む細胞要素により癒着組織の基礎となる。これに対してプラスミンシステムのような腹膜の線維素溶解酵素保護システムはフィブリンゲルマトリックスを除去することができるが、外科手術は劇的にフィブリノゲン分解活動を衰退させるので、癒着形成又は再上皮形成のいずれの経路を選択するかは損傷した組織表面及びフィブリン溶解の程度により決定される。
癒着形成に対する予防と治療に対する様々な試みが行われてきたが、限られた成果と好ましくない副作用を残すだけであった（Ｔｈｅ Ｐｅｒｔｉｏｎｅｕｍ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ ３０７−３６９，１９９２：非特許文献３）。例えば、フィブリン沈着を予防する試みとして、腹膜洗浄で線維素性滲出液を洗い流すもの、局部貧血を最小限に抑える手術技術、治療漿膜表面の付着を制限する障壁の使用などが試されてきた。かわって、コルチコステロイドや非ステロイド系などの抗炎症剤が広く使用されるようになった（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２８：１２６−１２７，２００１：非特許文献４）。骨格形成後に従来のタンパク質分解酵素でフィブリンを分解してフィブリン沈着を除去する方法は研究中である（Ｉｎｔ．ｓｕｒｇ．８３：１１−１４，１９９８：非特許文献５）。術後癒着の形成防止又は治療方法として普遍的に効果的な方法は、まだ立証されているとはいえない。
マスト細胞はアレルギー性の炎症反応の誘導において重要な役割をはたしている。マスト細胞はその表面にＩｇＥのＦｃ部及びあるクラスのＩｇＧを結合させる受容体を発現し、それらの表面に抗体が結合するのを可能にさせる。結合した抗体と抗原の相互作用により、結果として、マスト細胞からヒスタミン、セロトニン、シトキン、その他アレルギー性、過敏性の反応の発生に対抗する様々な酵素等の伝達物質が放出される。加えて、マスト細胞は腹膜癒着形成に関わっているとの指摘もある（Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１６５；１２７−１３０，１９９３：非特許文献６）。ラットモデルで、マスト細胞の活性化、滞留を抑制するマスト細胞安定剤が癒着形成の減衰に効果があるとの報告がある（Ｓｕｒｇ．Ｔｏｄａｙ ２９：５１−５４，１９９９：非特許文献７）。また、マスト細胞欠乏マウスにおける癒着形成が、正常マウスに比べ顕著に軽症である事をも立証されている（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．９２：４０−４４，２０００：非特許文献８）。これらの報告はマスト細胞が癒着形成に密接に関わっていることを示すものである。しかしながら、マスト細胞の正確な役割や、マスト細胞から放出されたいずれの物質が癒着に関係するのかはまだ明らかにされていない。
キマーゼは、マスト細胞の分泌顆粒に含まれるキモトリプシン様セリンプロテアーゼである。キマーゼは、幹細胞因子を活性化させるサイトカインであり、マスト細胞蓄積誘導能を有する。例えば、盲腸擦過後のマウスの治療サイトにおいて、キマーゼ活性が顕著に増加したことが報告されている（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．９２：４０−４４，２０００：非特許文献８）。つまり、キマーゼ陽性マスト細胞は癒着形成の発生に関し、役割を担っているようである。しかしながら、癒着形成の発生におけるキマーゼの病態生理学的な役割はいまだ不明確である。キマーゼと癒着形成の関係を解明するために、現在、我々はキマーゼに対し効果のあるプロテアーゼ阻害剤の癒着形成の防止、抑制手段としての使用効果について研究している。
心臓、胸部、婦人科的、眼病、腹部の外科手術を含む様々な外科的工程の後に効果的に癒着形成を防止、抑制する方法に対する顕著な要望がある。癒着の予防に関し、中皮細胞によるプラスミノゲン活性剤の合成及び／又は分泌を促進させること等による方法が開示されている（特表２００２−５０６８１７号公表公報：特許文献１）。
また、プロテアーゼ阻害剤を使用した癒着の形成、再形成を防止・阻害するための方法について、我々は米国に出願中である。ここではキマーゼ阻害剤（例：α−ａｍｉｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）やその他セリンプロテアーゼ阻害剤を使用して、哺乳類における外科手術又は事故等による創傷後の腹膜又は胸膜腔の器官、その他の身体部位に対する癒着形成・再形成を防止、抑止するために、被検体の組織表面のある部位に、組織修復に十分の一定期間投与することにより脊椎動物被検体内の組織表面間の癒着形成を防止、抑制する方法を提供した。
しかしながら、これらの方法は、組織表面に薬剤を投与するものであり、該投与方法であれば、投与時期は外科手術後の一定期間に限定されるため、癒着の防止及び抑止に十分とはいえない。さらに、炎症等により生体内で癒着が起こる場合もありうるが、この場合にも従来の方法では処理することができない。
（非特許文献１）Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．１４：９３−９７，２００１
（非特許文献２）Ｌｉａｋａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｇ．Ｓｕｒｇ．１８：２６０−７３，２００１
（非特許文献３）ｄｉＺｅｒｅｇａ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ，Ｔｈｅ Ｐｅｒｔｉｏｎｅｕｍ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ ３０７−３６９，１９９２
（非特許文献４）Ｂａｙｓａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２８：１２６−１２７，２００１
（非特許文献５）Ｈｉｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．ｓｕｒｇ．８３：１１−１４，１９９８
（非特許文献６）Ｌｉｅｂｍａｎ ｅｔ ａｌ．，．Ｍ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１６５；１２７−１３０，１９９３
（非特許文献７）Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｔｏｄａｙ ２９：５１−５４，１９９９
（非特許文献８）Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．９２：４０−４４，２０００
（特許文献１）特表２００２−５０６８１７号公表公報
【発明の開示】
本発明は、例えば、心臓、胸部、婦人科的、眼病、腹部の整形外科的あるいは形成外科的な手術を含む様々な外科的処理の前、若しくは後に、又は外傷若しくは炎症等の起因による内臓癒着が危惧される場合に、効果的に癒着形成を防止、抑制を可能とする薬剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、少なくとも１の効果的な量のプロテアーゼ阻害剤を、癒着が危惧される組織の組織修復に十分量一定期間投与することで、癒着形成を防止可能としたことに着目し、鋭意研究を重ねた結果、該プロテアーゼ阻害剤を含む薬剤を静脈内投与、経口投与又は経皮適用することで上記目的を解決しうることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
１．少なくとも１のプロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤であって、静脈内投与、経口投与又は経皮適用されることを特徴とする脊椎動物被検体内の組織表面の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
２．該プロテアーゼ阻害剤が、セリンプロテアーゼ阻害剤である、前項１に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
３．該セリンプロテアーゼの阻害剤が、キモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤である前項２に記載の癒着形成防止、抑制又は治療剤、
４．該キモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が、キマーゼ阻害剤である前項３に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
５．該キマーゼ阻害剤が、α−アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体である前項４に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
６．該キマーゼ阻害剤が、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２である、前項４のに記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
７．該キマーゼ阻害剤が、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の鏡像異性体Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の濃縮製剤である前項４に記載の癒着形成防止、抑制又は治療剤、
８．該鏡像異性体濃縮製剤において、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２がＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の総重量の９５％以上を含有する前項７に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
９．該プロテアーゼ阻害剤が、当該部位において当該プロテアーゼ阻害剤の効果的な局所濃度を維持する伝達体と結合して投与され、そして、当該伝達体は、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、シクロデキストラン、そしてその化合物からなる集合体より選択された高分子量担体をなす、前項１〜８のいずれか１に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
１０．前項１〜９のいずれか１に記載のプロテアーゼ阻害剤と、薬学的に許容できる希釈液又は賦形剤からなる、癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
１１．外科手術前、外科手術中若しくは外科手術後、又は炎症性の内臓癒着が危惧される場合に脊椎動物被検体に対し、前項１〜８のいずれか１に記載の治癒形成の防止、抑制又は治療剤を投与する治癒形成の防止、抑制又は治療方法、よりなる。
【図面の簡単な説明】
図１は、偽薬またはＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２を内服したときの平均癒着スコアーを示した図である。（実験例）
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、プロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤を、静脈内投与、経口投与又は経皮適用することを特徴とする脊椎動物披検体内の組織表面の癒着形成防止、抑制又は治療剤に関するものである。当該プロテアーゼ阻害剤は、例えば外科的処理の前・中・後に当該被検体に投与することができる。また、外科的手術を施さない場合でも、例えば外傷や炎症性の内臓癒着が危惧される場合等においても投与することができる。
本発明の薬剤は、温血の哺乳類の腹膜内の癒着形成を防止、抑制又は治療する為の薬剤であり、当該哺乳類に少なくとも１の効果的な量のセリンプロテアーゼ阻害剤を、静脈内投与、経口投与又は経皮適用により組織修復に十分量一定期間投与することからなる。好ましい実施例は、少なくとも１のキモトリプシン様セリンプロテアーゼであるセリンプロテアーゼ阻害剤を使用し、術後癒着形成を防止、抑制する方法に関する。本発明の薬剤は当該温血哺乳類としてヒトに適用することができる。
（プロテアーゼ阻害剤）
本発明の薬剤に含有されるプロテアーゼ阻害剤は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを使用することができる。
本発明の癒着形成防止、抑制又は治療剤の対象となるプロテアーゼ群は、好ましくはセリンプロテアーゼである。該セリンプロテアーゼは、ペプチド中のセリンを開裂結合させるエンドペプチダーゼのサブクラスである（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．，Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｅｄ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐ．３−２２，１９８６）。セリンプロテアーゼ自体は公知である。例えばキモトリプシン・スーパーファミリー及び放線菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ズブチリシン・スーパーファミリー等の２種のセリンプロテアーゼのスーパーファミリーが報告されている。
セリンプロテアーゼ阻害剤は公知であり、以下の系統群に分類することができる。（１）ウシのすい臓来トリプシン阻害剤（クニッツ）ファミリーであり、塩基性プロテアーゼ阻害剤（Ｋｅｔｃｈａｍ，Ｌ．Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎ：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｅｄ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｐ．１３１−１４３，１９７８）（以下「ＢＰＴＩ」という）としても知られている、（２）Ｋａｚａｌ群、（３）放線菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ズブリシン阻害剤群（以下「ＳＳＩ」という）、（４）セルピンファミリー、（５）大豆トリプシン阻害剤（クニッツ）ファミリー、（６）ポテト阻害剤ファミリー、（７）ボウマンバークファミリー（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：ｐ．５９３−６２６，１９８０）を含む。ＢＰＴＩ群、Ｋａｚａｌ群、ＳＳＩ群、大豆トリプシン群、ポテトトリプシン群のメンバを含む多くの完全な阻害剤と、Ｓｅｐｒｉｎ−α−１−抗トリプシンの開裂型のための結晶学的データが利用できる（Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）。多くのセリンプロテアーゼ阻害剤は広い特異性をもち、血液凝固セリンプロテアーゼを含むプロテアーゼのキモトリプシン・スーパーファミリーとセリンプロテアーゼの放線菌属スーパーファミリー両者を抑制することができる（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：ｐ．５９３−６２６，１９８０）。各阻害剤の特異性は、セリンプロテアーゼの直接の開裂部位に対するアミノ末端のアミノ酸の同一性によって決定すると考えられている。Ｐ部位残基として知られるこのアミノ酸は、セリンプロテアーゼの活性部位において、セリンとアシル結合を形成すると考えられている（ＬａｓｋｏｗｓｋｉＬａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：ｐ．５９３−６２６，１９８０）。
本発明の薬剤に含有される好ましいセリンプロテアーゼ阻害剤は、セルピン（ｓｅｒｐｉｎ）ファミリーとボウマンバーク（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ）ファミリーに属する。セルピンファミリーに対するセリンプロテアーゼ阻害剤として、プラスミノゲン活性化因子阻害剤であるＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、ＰＡＩ−３があり、Ｃｌエステラーゼ阻害剤、α−２−抗プラスミン、コントラプシン（ｃｏｎｔｒａｐｓｉｎ）、α−１−抗トリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、プロテアーゼネクシンＩ、α−１−抗キモトリプシン、プロテインＣ阻害剤、ヘパリンコファクターＩＩ及び成長ホルモン調節タンパク質が挙げられる（Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５２：５２７−５３５，１９８７）。
キモトリプシン・スーパーファミリーのセリンプロテアーゼの例としては、組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ｔ−ＰＡ）、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、ウロキナーゼ（又は非尿型プラスミノゲン活性化因子：ｕ−ＰＡ）、アクロシンン、活性化プロテインＣ、Ｃｌエステラーゼ、カプテシンＧ、キマーゼ、そしてカリクレイン、トロンビン、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、Ｘａ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩａ因子を含む血液凝固カスケードのプロテアーゼなどが含まれる（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．，Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｅｄ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｅｌｓｅｖｉｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐ．３−２２，１９８６，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇｅｒ，Ｗ．ｅｔ．ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１５７：ｐ．２１９−２２３，１９８３）。
キモトリプシン・スーパーファミリーのすべてのセリンプロテアーゼの触媒ドメインは、配列相同性と構造相同性をもつ。配列相同性は、（１）特異活性部位残基、例えば、トリプシンの場合に、１９５位のセリン、５７位のヒスチジン及び１０２位のアスパラギン酸が共通する；（２）オキシアニオン孔（ｏｘｙａｎｉｏｎ ｈｏｌｅ）（例えば、トリプシンの場合に、１９３位のグリシン及び１９４位のアスパラギン酸）、（３）構造においてジスルフィド架橋を形成するシステイン残基、の全保存を含む（Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．，Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｂｏｐｌ．，２４：１５２−１８２（１９７４））。
構造相同性は（１）２つのグリーク・キー構造からなる一般ホールド（ｃｏｍｍｏｎ ｆｏｌｄ）（Ｒｉｃｈｒｄｏｓｏｎ）、（２）触媒残基の一般要因、（３）分子核内での構造の精密な保存（Ｓｔｒｏｕｄ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｃｉ．ＡＭ．，２３１：２４−８８）を含む。
本発明の薬剤は、α−アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体を含むことができる。ウシトロンビン、ヒト因子ＸＩＩａ、ヒト因子Ｘａ、ヒト結晶カリクレイン、ウシトリプシン、ラット皮膚トリプターゼ、ヒト白血球エラスターゼ、ブタすい臓エラスターゼ、ウシキモトリプシン、ヒト白血球カテプシンＧ、ラットマスト細胞プロテアーゼＩＩを含む幾多のセリンプロテアーゼの阻害剤に関し、これらα−アミノアルキルホスホン酸塩誘導体が発見されている（米国特許５５４３３９６，５６８６４１９，５９５２３０７、他）。これらの誘導体は、ヒト血漿に含まれ、種々の環境下で非常に安定している。例えば、本発明の薬剤に含有される好適な阻害剤Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２、特に好ましくはＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２は、ヒト血漿内で約２０時間の半減期をもつ。この安定性は重要である。なぜなら、腹膜の浸出物は、大部分のプロテアーゼ阻害剤を中和し、活性を失わせると予測されるからである。アミノアルキルホスホン酸はａ−アミノ酸に相似しており、そして、一般的に受容したアミノ酸のための上付き文字のＰへと続く３文字の略称が命名された。例えば、アラニンに関するジフェニルα−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ（Ｎ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）エチルホスホネイト（ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）はＣｂｚ−ＡｌａＰ（ＯＰｈ）２と略称される。
Ｃ−端末のリン酸塩残基を有するペプチドＶａｌＰ（ＯＰｈ）２、それはバリンの類似体であるが、これは比較的有効で比較的特異的なエラスターゼ及びエラスターゼ様酵素に特異的な不可逆性阻害剤である。フェニルアラニン、他の芳香族アミノ酸又は長脂肪酸族側鎖と関連性があるＣ−端末リン酸塩残基は比較的有効であり、比較的特効のあるキモトリプシンとキモトリプシン様酵素の阻害剤である。オルニチン、溶解素、アルギニン又は、α−アミノ−α−（４−アミジノフェニル）メタンホスホン酸塩［（４−ＡｍＰｈＧｌｙ）Ｐ（ＯＰｈ）２］又はα−アミノ−α−（４−アミジノフェニルメチル）メタンホスホン酸塩［（４−ＡｍＰｈｅ）Ｐ（ＯＰｈ）２］のＣ−端末ジフェニルエステルに関連性があるペプチドは、比較的有効で比較的安定性のあるトリプシンとトリプシン様酵素の阻害剤である。
酵素との反応に対する付加的な特異性及び／又は増加した活性は、ペプチド構造の部位におけるアミノ酸配列の変異により、阻害分子へ導くことができる。ペプチドのＰ−ニトロアニリドといった酵素基質の配列と効果的なペプチドのリン酸塩阻害剤の配列間には一般的に一致した配列がある。比較的高活性の阻害剤は、一般的に、特定の酵素のための好都合なペプチドのＰ−ニトロアニリド基質の配列をもつ。例えば、キモトリプシンそしてキモトリプシン様酵素に対して比較的有効な阻害剤であるＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２は、これらの酵素に適当な基質であるＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＡと類似のアミノ酸配列を有する。ヒト白血球エラスターゼに比較的有効な阻害剤［Ｍｅｏ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌＰ（ＯＰｈ）２及びＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＶａｌＰ（ＯＰｈ）２］は、この酵素に対する２つの適当な基質ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡ及びＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡと類似のアミノ酸配列をもつ。論文中に報告された、それらの同じセリンプロテアーゼのための比較的有効な可逆的・不可逆的な阻害剤中に発見されたペプチド配列に基づくセリンプロテアーゼのためのホスホン酸塩阻害剤の設計も可能である（Ｐｏｗｅｒｓ ａｎｄ Ｈａｒｐｅｒ，ｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｂａｒｒｅｔｔ ａｎｄ Ｓａｌｖｅｓｅｎ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐ５５−１５２，１９８６；Ｔｒａｉｎｏｒｅ，Ｄ．Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８：３０３−３０７，１９８７）。
α−アミノアルキルホスホン酸のジフェニルエステルは前記方法により合成することができる（米国特許５５４３３９６）。α−アミノアルキルホスホン酸の２（置換フェニル）エステルは、トリフェニル亜リン酸の代わりに３（置換フェニル）リン酸を使用する方法にて調製することができる。パーフルオロアルキルジエステルは、エステル転移反応に含まれる方法によって合成することができる（Ｓｚｅｗｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐ．４０９−４１４，１９８２）。代わりに、前記のようにアミノアルキルホスホン酸のジエステルの合成とそれらのペプチドは、ホスホン酸部分のエステル化により行うことができる（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１４：３５６−３７７，１９８６）。本発明の薬剤に含有される多くの付加的セリンプロテアーゼ阻害剤は、米国特許により開示される（米国特許６２６２０６９，５９１６８８８，５９００４００，５１５７０１９，４８２９０５２，５７２３３１６，５８０７８２９）。
多くの有機化合物は光学活性型が存在する。光学活性化合物を示す場合、識別コードＤそしてＬ又はＲそしてＳが、キラル中心の分子の絶対配置を示すために使用される。識別コード（＋）と（−）又はｄとｌは、水平偏光の回転のサインを示すため、化合物により使用される。（−）又はｌは化合物が左旋回していることを意味し、化合物識別コード（＋）又はｄは化合物が右旋回していることを示す。立体異性体とよばれるこれらの化合物は、互いに鏡像であることを除けば同一である。特定の立体異性体は鏡像異性体として表すことができ、そのような異性体の混合物は鏡像異性混合物又は鏡像異性ラセミックと呼ばれることもある。本発明の薬剤の製法として、立体異性純度又は光学純度をより有効性を増加及び／又は有害作用を減少させる手段を利用することができる。
本明細書において使用される用語「キラル」は、鏡像相手の重合不可の性質の分子をしめすものである。しかしながら、用語「アキラル」は鏡像相手に重合可能な分子を示す。用語「立体異性体」は同一化学構造をもつ化合物を意味する。しかし、空間の原子又は群の配置に関しては相違する。特に「鏡像異性体」は、重合不可能な鏡像ともう一つの２種の化合物の立体異性体を意味する。
一方、「ジアステレオマ」は非対称の２以上の中心を持つ立体異性体を示し、その分子は相互に鏡像ではない。キラル中心の命名法に関しては、用語ＳとＲ配置がＩＵＰＡＣ１９７４（Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｅ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，４５：１３−３０，１９７６）により定義される。
本発明の薬剤に含有される化合物に関し、互換的に使われている用語「鏡像異性的に濃縮された」と「非ラセミ体」は、光学的に濃縮された構成物を示し、その構成物内では鏡像異性体のラセミ混合物と比較して、一方の鏡像異性体が濃縮されている。別に明記されていない場合は、それらは、望ましい鏡像異性体の望ましくない鏡像異性体に対する相対的な割合が１対１以上である構成物を示す。例えば、鏡像異性的に濃縮された製剤は、望ましい鏡像異性体の望ましくない鏡像異性体に対する相対的な割合が、重さにして５０％以上であり、望ましくは少なくとも７５％、さらに望ましくは８０％である。もちろん濃縮物は、「十分に鏡像異性的に濃縮」された製剤、「十分に非ラセミ体の」製剤又は「十分に光学的に純粋」な製剤にすることにより８０％以上とすることが可能であり、それは少なくとも望ましい鏡像異性体が８５％以上、望ましくは９０％以上、さらに望ましくは９５％以上である薬剤を意味する。
鏡像体の分離は、既に公知の幾つかの方法によって達成することができる。例えば、２の鏡像異性体のラセミ混合物はクロマトグラフィーによって分離することができる（”Ｃｈｉｒａｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，Ｗ．Ｊ．Ｌｏｕｇｈ，Ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）。鏡像異性体は、伝統的な分離技術によっても分離することができる。例えば、ジアステレオマ塩の構成物と分画結晶化によって鏡像異性体を分離することができる。カルボン酸の鏡像異性体の分離については、ジアステレオマ塩が、ブルシン、キニーネ、エフェドリン、ストリキニーネ、その他のような鏡像異性的に純粋なキラル塩基を添加することにより形成される。代わりに、ジアステレオマエステルは、遊離物質を産出するためのジアステレオマエステルの分離、加水分離に続いて、鏡像異性的に濃縮されたカルボン酸であるメントールのような鏡像異性的に純粋なキラルアルコールを加えることにより形成される。アミノ化合物の光学異性体の分離に関しては、キラルカルボン又はカンファースルホン酸、酒石酸、マンデル酸又は乳酸といったスルホン酸の添加によりジアステレオマ塩の形成といった結果になる。上記のような分離技術のほかに、活性鏡像異性体は、既に公知の方法を使用し、望ましい光学異性体のみを産する立体特異的合成によっても合成することができる。キラル合成は高鏡像異性的純度の生成物を産出することができる。しかしながら、幾つかの事例では、生成物の鏡像異性的純度は特段高くない。熟練者たちは、キラル合成によって得られた鏡像異性的濃度をより高めるものとして、上記分離方法を高く評価している。鏡像異性体の光学的濃度は先行技術によって既知の方法によって決定される。例えば、鏡像異性体試料は、キラルクロマトグラフィーカラム上の高速液体クロマトグラフィーによって分析することができる。
本発明の薬剤に含有されるセリンプロテアーゼ阻害剤としてのキマーゼ阻害剤は、温血の哺乳類の腹膜内の癒着形成を防止、抑制又は治療方法に使用され、当該哺乳類に少なくとも１の効果的な量のキマーゼ阻害剤を組織修復に十分量一定期間存在するように、静脈内投与、経口投与又は経皮適用することができる。
好適には、例えばＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２といったα−アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体であるキマーゼ阻害剤を使用することができる。より好適には、鏡像異性的に濃縮したα−アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体、例えばＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の製剤を使用することができる。このＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２は、全Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２重量の５０％、８０％好ましくは９５％以上に濃縮したものが好適である。当該温血哺乳類はヒトであることが望ましい。濃縮する方法は、例えばアセトン−エーテルを用いて結晶化させ、再度同様に結晶化させることにより得ることができる。
（製剤）
本発明の薬剤は、前記プロテアーゼ阻害剤を単独で、あるいは適当な製剤用添加物と共に製剤形態の医薬組成物として調製し、投与することができる。このような医薬組成物の投与形態としては、経口的投与に使用されるもの、又は非経口的に投与されるものであれば特に限定されないが、例えば、錠剤、シロップ、注射用アンプル剤、注射用凍結乾燥粉末剤や軟膏剤、シップ剤等を用いることができる。各種製剤型への調製は、当業者が利用可能な周知の製剤添加物、例えば、希釈剤や添加剤などを用いて慣用の手法に従って行うことができる。
例えば、注射用凍結乾燥粉末剤は、精製された前記プロテアーゼ阻害剤の有効量を注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の希釈液に溶解し、必要に応じてカルボキシメチルセファロース、アルギン酸ナトリウム等の賦形剤、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、アミノ酸、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノール等の保存剤、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカイン等の無痛化剤、塩酸、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウム等のｐＨ調節剤等を加え、常法により製造することができる。また、注射用アンプル剤は、前記プロテアーゼ阻害剤の有効量を注射用蒸留水、生理食塩水、リンゲル液などの希釈剤に溶解し、必要に応じてサリチル酸ナトリウム、マニトール等の溶解補助剤、クエン酸ナトリウム、グリセリン等の緩衝剤、ブドウ糖、添加糖等の等張化剤、前述の安定化剤、保存剤、無痛化剤、ｐＨ調節剤等の添加剤を加えた後、通常の加熱滅菌、無菌ろ過等により無菌化して調製することができる。なお、有効成分の種類によっては加熱滅菌工程で失活する場合があるので、滅菌方法は適宜選択すべきである。
本発明の薬剤は、医薬上許容される担体等を用いて、錠剤、顆粒、カプセル剤、散剤等の固型状、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、レモナーデ剤等の液状の態様や軟膏剤、シップ剤の態様で、経口投与、非経口投与に適した剤型に製剤化し、医薬製剤として用いることもできる。必要ならば、上記製剤に補助剤、安定化剤、湿潤剤、その他の常用添加剤、例えば乳糖、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、白土、庶糖、トウモロコシ澱粉、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、カカオ油、エチレングリコール等を配合してもよい。
（投与量）
本発明の薬剤は、少なくとも１種のプロテアーゼ阻害剤を有効量含み、該プロテアーゼ阻害剤が癒着形成の部位において効果的な濃度で実質的に上皮化に足る十分な時間滞留するように投与することができる。
本発明において、投与可能なプロテアーゼ阻害剤の量と濃度は、効果を得るに十分な濃度すなわち「有効量」を最低濃度とし、「薬学的に許容できる」濃度を最高濃度とした範囲で決定することができる。所望の癒着形成を防止、抑制又は治療したい部位（腹部、胸部、眼、心臓、婦人科的組織等）で効果が得られるように、プロテアーゼ阻害剤混合物は適した剤型や媒体（生理食塩水）で、静脈内投与、経口投与又は経皮適用することができる。本発明において、経皮適用とは、軟膏剤や、シップ剤の製剤に調製したものを患部に塗る、若しくは貼ること等をいい、被検体の組織表面のある部位に塗布するのとは区別される。
本発明において「有効量」という用語は、上記の癒着形成の防止、抑制又は治療において、微毒又は無毒で、所望する反応を得る為の薬剤の十分な量を意味する。求められる正確な量は被検体によってまちまちであり、被検体の種、年齢、体重、一般的体調、投与の形態などによって変わってくる。適切な「有効量」は、ここに提供された事と慣例的な方法を使用した普遍的な先行技術により決定することもできる。
「薬学的に許容できる」とは、効果と危険性の比率的と比例して、過度の毒性、炎症、アレルギー反応又はその他の問題点又は合併症を伴わない、ヒト又は動物の組織との接触に適当な、信頼できる医療判断の範囲内での、物質、化合物、混合物又は投与形式を意味する。
該プロテアーゼ阻害化合物は一般的に作用する間隔で投与することができ、例えば手術前、手術中、手術完了後の期間にも投与することができる。術後少なくとも１〜７２時間、好ましくは１〜４８時間の間に投与を開始することができる。例えば静脈内投与の場合は、術後少なくとも１〜２４時間、好ましくは１〜１２時間の間に投与を開始することができ、経口投与の場合は、同様に１〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間、より好ましくは１２〜２４時間の間に投与を開始することができる。さらに、軟膏剤等を経皮適用する場合は、術後少なくとも１〜７２時間、好ましくは１〜４８時間の間に投与を開始することができる。一般的に術後癒着を形成しうる期間は、術後２４時間〜１４日であるから、静脈内投与、経口投与及び経皮適用の場合にはいずれもこの期間内に本発明の薬剤を継続的に投与することができる。
本発明の薬剤は、少なくとも１種のプロテアーゼ阻害剤が癒着形成の部位において効果的な濃度で実質的に上皮化に足る投与量で投与することができる。例えば、本発明の薬剤に含有されるプロテアーゼ阻害剤の具体例であるキマーゼ阻害剤（Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）を手術中に１０μＭ使用したとき、該生体内のキマーゼ活性は、血管組織において４週間にわたり顕著に抑制された。キマーゼ阻害剤（Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）の効果的な投与量は、成人体重１ｋｇ、１日あたり０．０００１〜１００ｍｇの間で選択することができる。例えば静脈内投与の場合には０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１ｍｇの間で、また経口投与の場合には０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇの間で投与量を選択することができる。さらに、経皮適用の場合には、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇの間で適用することができる。
他のプロテアーゼ阻害剤の効果的な量、経路は、公知の手段により決定することができる。
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
（アミノアルキルホスホン酸誘導体の調製）
アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体からなる薬剤は先行技術の１つによって証明され、実行される（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，ｐ．４８５−４９３，１９９１）。
キマーゼ活性と癒着形成との関係を説明するのに、典型的なセリンプロテアーゼ阻害剤、キマーゼ阻害剤、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の効果を調べた。この化合物は公知の方法を使用し合成した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，ｐ．４８５−４９３，１９９１）。さらに詳しくは、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−ＯＨ（０．２５ｇ，１ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（０．２ｇ，１ｍｍｏｌ）と水素和物Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２（０．５８４ｇ，１ｍｍｏｌ）は、３０ｍｌの酢酸エチルに溶解し、オイルを加える。この溶液に対し、０．１ｇ（１ｍｍｏｌ）のコハク無水物と０．１ｇの５％Ｐｄ／Ｃが加えられ、混合物は、薄層クロマトグラフィーが新しい斑点を示すまで、水素気圧下で攪拌される。触媒はろ過により取り除かれ、有機層は数回水で洗浄され、乾燥後有機溶媒は提供の為に除去させる。有機物として例えば、ハイドロスコープ固体としての０．４５ｇ（６５％）の生成物が得られた（ｍｐ．５０−５３℃．；ｏｎｅ ａｐｏｔ ｏｎ ＴＬＣ，Ｒｆ＝０．４；３１Ｐ ＮＭＲ １９．７５，１９．２３ｐｐｍ，ｒａｔｉｏ １：１，Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３４Ｈ４０Ｏ３Ｎ３Ｐ．２Ｈ２Ｏ：５９．５６；Ｈ，６．４２．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５９．５９；Ｈ，６．４２）。
【実施例２】
（Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２キマーゼ阻害剤の濃縮鏡像異性体の調製）
以下に使用されているように、以下の略語が適用される。Ｚはベンジルオキシカルボニル、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ＷＳＣＤはカルボジイミド、ＨＯＢｔはＯｌｅｋｓｙｓｚｙｎとＰｏｗｅｒｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２４４：４２３−４４１，１９９４）及びベンジルオキシカルボニルは水素臭化物酸溶液により取り除かれた。生成物をＷＳＣＤ−ＨＯＢｔ反応によりＢｏｃ−Ｐｒｏとカップリングさせ、その後ラセミ混合物を得た。その後、再沈殿により分離した。まず、溶液中の非活性鏡像異性体を結晶化させて、溶液から除去した。ＨＣｌを加えたＢｏｃの溶液中の活性鏡像異性体からブロックを除いた後、試料をＷＳＣＤ−ＨＯＢｔ反応によりＢｏｃ−Ｖａｌとカップリングさせ、再度ブロックを除いて分離された。この生成物に対し、コハク無水物とトリエタノアミンを加え、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２を得た。そして、生成物を逆相ＨＰＬＣによって濃縮した。
（Ｚ−ＤＬ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）
フェニルアセトアルデヒド（２８．３ｍＬ，０．２４２ｍｏｌ）を４５ｍＬの酢酸で溶解した。カルバミル酸ベンジルエステル（２４．４ｇ，０．１６１ｍｏｌ）とトリフェニル亜リン酸塩（５０．０ｇ，０．１６１ｍｏｌ）をこの溶液に加え、１．５時間８５℃で攪拌した。有機溶剤を蒸発させた後、残りの溶液を室温まで冷まし、４００ｍＬのメタノールをこの溶液に加え、−２０℃で結晶化できるようにした。該生成物をろ過により集め、冷メタノールにより洗浄し、３２．９ｇ（４２％）のＺ−Ｄ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２とＺ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の化合物を産出するため真空内で乾燥した。
（ＤＬ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２・ＨＢｒ）
Ｚ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２とＺ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２（１４．３ｇ，２９．３ｍｍｏｌ）の混合物を３０ｍＬの２５％水素臭化物／酢酸溶液中に溶解し、室温で１時間攪拌した。両方を加えた後、分離された固体試料をろ過によって集めた。この試料をエーテルで洗浄し、１２ｇ（９４％）のＤとＬ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２・ＨＢｒの混合物を得る為に真空乾燥した。
（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＤＬ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）
ＤとＬ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２・ＨＢｒ（１１．５ｇ，２６ｍｍｏｌ），Ｂｏｃ−Ｐｒｏ（５．５３ｇ，２５．７ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ（３．５８ｇ，２６．５ｍｍｏｌ）の混合物を７０ｍＬのＤＭＦに溶解し、ＷＳＣＤ（４．７０ｍＬ，２６．５ｍｍｏｌ）を点滴によりで氷で冷却しながら加えた。室温で３．５時間攪拌した後、溶液を真空で濃縮し、エチルアセテートを加えた。結果により得られた溶液を逐次、酢酸とアルカリ性溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空乾燥濃縮した。アセトン−エテールにより結晶化させ、同様に再結晶化させて不活性鏡像異性体（Ｄ体）を除去し、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２を得た。残存溶液を真空で濃縮し、５．１０ｇの鏡像異性体を産出するための溶解剤としてトルエン−エチル−アセテート（５：１）を加え、中圧シリカゲルで精製した。
（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）
Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２（４．９８ｇ，９．０５ｍｍｏｌ）を３７ｍＬの冷ＨＣｌ／ジオキサン（４．９Ｎ）に溶解し、室温で１時間攪拌した。概溶液は真空で蒸発、乾燥させた。残物を４０ｍＬのＤＭＦで溶解し、Ｂｏｃ−Ｖａｌ（２．０６ｇ，９．５０ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１．３５ｇ，９．９６ｍｍｏｌ）をこの溶液に加えた。ＷＳＣＤ（１．７７ｍＬ，９．９６ｍｍｏｌ）を点滴又は氷で冷やしながらこの溶液に加え、室温で一晩攪拌した。酢酸エチルをこの反応溶液に加え、引き続いて、酸性とアルカリ性の溶液で洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過した後、無色オイルとして６．２６ｇ（９４％）の生成物を産出し、真空で濃縮した。
（Ｓｕｃ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）
Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２（５．８６ｇ，８．４７ｍｍｏｌ）を３５ｍＬの冷ＨＣｌ／ジオキサン（４．９Ｎ）に加え溶解し、室温で１時間攪拌した。概溶液を真空で蒸発、乾燥した。残物を３５ｍＬのＤＭＦを加え溶解し、コハク無水物（１．０２ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）を加えた。トリエチルアミン（２．３６ｍＬ，１６．９ｍｍｏｌ）を点滴によりこの溶液に加え、室温で２時間攪拌した。氷冷しながらＨＣｌ溶液により溶液のｐＨがｐＨ１．０となるように調整し、酢酸エチルを加えて試料を抽出した。抽出物を飽和塩水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、黄色オイルとして生成物を産出し、真空でろ過、濃縮した。オイルを逆相ＨＰＬＣ（分離管：ＹＭＣ ＯＤＳ ＳＨ−３６３−５，３０×２５０ｍｍ，移動相：０．１ＴＦＡ，勾配４０−７０％ ＭｅＣＮ）により濃縮し、ホワイトパウダーとして、２．３０ｇ（４２％）の生成物を産出し冷却乾燥した。
（実験例 Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の内服による癒着予防効果）
シリアンハムスター（ＳＬＣ社）、年齢６週間（体重８５〜９０グラム）を開胸し、心臓を擦過後、心筋癒着モデルを作製し、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２（１０ｍｇ／ｋｇ）（８例）又は偽薬（８例）をモデル作製前３日よりモデル作成後１４日まで１日１回、ゾンデで強制経口投与し、モデル作製後１４日の癒着程度を比較検討した。尚、癒着スコアーは下記のとおりである。なお、癒着スコアーにより、Ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ ｔｅｓｔを用いて有意差検定を行った。
癒着度０；心臓が容易に取り出せ、通常の心臓と同様に周囲から独立して存在している。
癒着度１；心臓の一部と周囲組織との薄膜性の癒着が認められるが、簡易癒着部位が剥離でき、心臓を露出できる。
癒着度２；心臓の数箇所と周囲組織との癒着が認められるが牽引することにより、癒着部が剥離でき、心臓を露出できる。
癒着度３；心臓が確認できるが、周囲の組織数箇所と強固に癒着し、強く牽引しなければ心臓の露出が行いにくい。
癒着度４；心臓を中心とした極度の細胞増殖、線維化が起こり周囲の組織との癒合が認められる。心臓が周辺組織と癒着しているため、牽引しても剥離不可能で、心臓の露出が非常に困難である。
偽薬群では、癒着度４が３例（３７．５％）、癒着度３が２例（２５％）、癒着度１が１例（１２．５％）、そして残りが癒着度０（２５％）であったのに対し、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２投与群では、癒着度４が１例（１２．５％）、癒着度２が１例（１２．５％）、そして残りが癒着度０（７５％）であり、有意に癒着度が軽減されていた。
【産業上の利用の可能性】
以上説明したように、本発明の癒着形成防止、抑制又は治療剤は、静脈内投与や経口投与又は経皮適用することにより癒着予防に有用であり、整形外科的あるいは形成外科的な手術後の癒着のみならず炎症性の内臓癒着にも有用である。
【図１】
本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号特願２００３−０２８７４３からの優先権を請求する。
【技術分野】
本発明はプロテアーゼ阻害剤を使用した癒着形成予防方法に関する。さらに詳しくは、本発明はセリンプロテアーゼ阻害剤、特にキマーゼ阻害剤を使用した癒着形成予防方法に関する。
【背景技術】
術後癒着形成は、例えば心臓、胸部、婦人科、眼科および腹部等の一般的な整形外科的あるいは形成外科的な手術後におこる主要な合併症である。囲心癒着は顕著な問題を引きおこし、再手術の心臓外科手術の罹病率や死亡率を増加させる（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．１４：９３−９７，２００１：非特許文献１）。術後の腹膜癒着は、腹部や婦人科手術後において、重症な場合には腸閉鎖症、不育症、痛みなどの合併症を伴う罹病の主な原因となっている（Ｄｉｇ．Ｓｕｒｇ．１８：２６０−７３，２００１：非特許文献２）。トラウマ、乾燥、局部貧血、伝染性由来の腹膜炎、子宮内膜症を含む多くの原因が癒着形成に関係あるとされる一方、癒着形成の病態生理学的本質は完全には理解されてはいない。
術後癒着は、一般的に傷害後５〜７日内の通常創傷治癒反応の結果としておこる。癒着形成と非癒着再上皮形成は代替経路であり、いずれも共に凝固の作用から開始し、それはカスケード反応でフィブリンゲルマトリックスの構築へ結びつくものと考えられる。フィブリン沈着が過剰又は除去されないと、フィブリンが架橋を形成することにより、フィブリンゲルマトリックスが形成され癒着の予備軍となりうる。架橋は線維芽細胞を含む細胞要素により癒着組織の基礎となる。これに対してプラスミンシステムのような腹膜の線維素溶解酵素保護システムはフィブリンゲルマトリックスを除去することができるが、外科手術は劇的にフィブリノゲン分解活動を衰退させるので、癒着形成又は再上皮形成のいずれの経路を選択するかは損傷した組織表面及びフィブリン溶解の程度により決定される。
癒着形成に対する予防と治療に対する様々な試みが行われてきたが、限られた成果と好ましくない副作用を残すだけであった（Ｔｈｅ Ｐｅｒｔｉｏｎｅｕｍ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ ３０７−３６９，１９９２：非特許文献３）。例えば、フィブリン沈着を予防する試みとして、腹膜洗浄で線維素性滲出液を洗い流すもの、局部貧血を最小限に抑える手術技術、治療漿膜表面の付着を制限する障壁の使用などが試されてきた。かわって、コルチコステロイドや非ステロイド系などの抗炎症剤が広く使用されるようになった（Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２８：１２６−１２７，２００１：非特許文献４）。骨格形成後に従来のタンパク質分解酵素でフィブリンを分解してフィブリン沈着を除去する方法は研究中である（Ｉｎｔ．ｓｕｒｇ．８３：１１−１４，１９９８：非特許文献５）。術後癒着の形成防止又は治療方法として普遍的に効果的な方法は、まだ立証されているとはいえない。
マスト細胞はアレルギー性の炎症反応の誘導において重要な役割をはたしている。マスト細胞はその表面にＩｇＥのＦｃ部及びあるクラスのＩｇＧを結合させる受容体を発現し、それらの表面に抗体が結合するのを可能にさせる。結合した抗体と抗原の相互作用により、結果として、マスト細胞からヒスタミン、セロトニン、シトキン、その他アレルギー性、過敏性の反応の発生に対抗する様々な酵素等の伝達物質が放出される。加えて、マスト細胞は腹膜癒着形成に関わっているとの指摘もある（Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１６５；１２７−１３０，１９９３：非特許文献６）。ラットモデルで、マスト細胞の活性化、滞留を抑制するマスト細胞安定剤が癒着形成の減衰に効果があるとの報告がある（Ｓｕｒｇ．Ｔｏｄａｙ ２９：５１−５４，１９９９：非特許文献７）。また、マスト細胞欠乏マウスにおける癒着形成が、正常マウスに比べ顕著に軽症である事をも立証されている（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．９２：４０−４４，２０００：非特許文献８）。これらの報告はマスト細胞が癒着形成に密接に関わっていることを示すものである。しかしながら、マスト細胞の正確な役割や、マスト細胞から放出されたいずれの物質が癒着に関係するのかはまだ明らかにされていない。
キマーゼは、マスト細胞の分泌顆粒に含まれるキモトリプシン様セリンプロテアーゼである。キマーゼは、幹細胞因子を活性化させるサイトカインであり、マスト細胞蓄積誘導能を有する。例えば、盲腸擦過後のマウスの治療サイトにおいて、キマーゼ活性が顕著に増加したことが報告されている（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．９２：４０−４４，２０００：非特許文献８）。つまり、キマーゼ陽性マスト細胞は癒着形成の発生に関し、役割を担っているようである。しかしながら、癒着形成の発生におけるキマーゼの病態生理学的な役割はいまだ不明確である。キマーゼと癒着形成の関係を解明するために、現在、我々はキマーゼに対し効果のあるプロテアーゼ阻害剤の癒着形成の防止、抑制手段としての使用効果について研究している。
心臓、胸部、婦人科的、眼病、腹部の外科手術を含む様々な外科的工程の後に効果的に癒着形成を防止、抑制する方法に対する顕著な要望がある。癒着の予防に関し、中皮細胞によるプラスミノゲン活性剤の合成及び／又は分泌を促進させること等による方法が開示されている（特表２００２−５０６８１７号公表公報：特許文献１）。
また、プロテアーゼ阻害剤を使用した癒着の形成、再形成を防止・阻害するための方法について、我々は米国に出願中である。ここではキマーゼ阻害剤（例：α−ａｍｉｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）やその他セリンプロテアーゼ阻害剤を使用して、哺乳類における外科手術又は事故等による創傷後の腹膜又は胸膜腔の器官、その他の身体部位に対する癒着形成・再形成を防止、抑止するために、被検体の組織表面のある部位に、組織修復に十分の一定期間投与することにより脊椎動物被検体内の組織表面間の癒着形成を防止、抑制する方法を提供した。
しかしながら、これらの方法は、組織表面に薬剤を投与するものであり、該投与方法であれば、投与時期は外科手術後の一定期間に限定されるため、癒着の防止及び抑止に十分とはいえない。さらに、炎症等により生体内で癒着が起こる場合もありうるが、この場合にも従来の方法では処理することができない。
（非特許文献１）Ｋｒａｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．１４：９３−９７，２００１
（非特許文献２）Ｌｉａｋａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｇ．Ｓｕｒｇ．１８：２６０−７３，２００１
（非特許文献３）ｄｉＺｅｒｅｇａ ａｎｄ Ｒｏｇｅｒｓ，Ｔｈｅ Ｐｅｒｔｉｏｎｅｕｍ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ ３０７−３６９，１９９２
（非特許文献４）Ｂａｙｓａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２８：１２６−１２７，２００１
（非特許文献５）Ｈｉｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．ｓｕｒｇ．８３：１１−１４，１９９８
（非特許文献６）Ｌｉｅｂｍａｎ ｅｔ ａｌ．，．Ｍ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１６５；１２７−１３０，１９９３
（非特許文献７）Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｔｏｄａｙ ２９：５１−５４，１９９９
（非特許文献８）Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．９２：４０−４４，２０００
（特許文献１）特表２００２−５０６８１７号公表公報
【発明の開示】
本発明は、例えば、心臓、胸部、婦人科的、眼病、腹部の整形外科的あるいは形成外科的な手術を含む様々な外科的処理の前、若しくは後に、又は外傷若しくは炎症等の起因による内臓癒着が危惧される場合に、効果的に癒着形成を防止、抑制を可能とする薬剤を提供することを目的とする。
本発明者らは、少なくとも１の効果的な量のプロテアーゼ阻害剤を、癒着が危惧される組織の組織修復に十分量一定期間投与することで、癒着形成を防止可能としたことに着目し、鋭意研究を重ねた結果、該プロテアーゼ阻害剤を含む薬剤を静脈内投与、経口投与又は経皮適用することで上記目的を解決しうることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
１．少なくとも１のプロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤であって、静脈内投与、経口投与又は経皮適用されることを特徴とする脊椎動物被検体内の組織表面の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
２．該プロテアーゼ阻害剤が、セリンプロテアーゼ阻害剤である、前項１に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
３．該セリンプロテアーゼの阻害剤が、キモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤である前項２に記載の癒着形成防止、抑制又は治療剤、
４．該キモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が、キマーゼ阻害剤である前項３に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
５．該キマーゼ阻害剤が、α−アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体である前項４に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
６．該キマーゼ阻害剤が、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２である、前項４のに記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
７．該キマーゼ阻害剤が、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の鏡像異性体Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の濃縮製剤である前項４に記載の癒着形成防止、抑制又は治療剤、
８．該鏡像異性体濃縮製剤において、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２がＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の総重量の９５％以上を含有する前項７に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
９．該プロテアーゼ阻害剤が、当該部位において当該プロテアーゼ阻害剤の効果的な局所濃度を維持する伝達体と結合して投与され、そして、当該伝達体は、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、シクロデキストラン、そしてその化合物からなる集合体より選択された高分子量担体をなす、前項１〜８のいずれか１に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
１０．前項１〜９のいずれか１に記載のプロテアーゼ阻害剤と、薬学的に許容できる希釈液又は賦形剤からなる、癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤、
１１．外科手術前、外科手術中若しくは外科手術後、又は炎症性の内臓癒着が危惧される場合に脊椎動物被検体に対し、前項１〜８のいずれか１に記載の治癒形成の防止、抑制又は治療剤を投与する治癒形成の防止、抑制又は治療方法、よりなる。
【図面の簡単な説明】
図１は、偽薬またはＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２を内服したときの平均癒着スコアーを示した図である。（実験例）
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、プロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤を、静脈内投与、経口投与又は経皮適用することを特徴とする脊椎動物披検体内の組織表面の癒着形成防止、抑制又は治療剤に関するものである。当該プロテアーゼ阻害剤は、例えば外科的処理の前・中・後に当該被検体に投与することができる。また、外科的手術を施さない場合でも、例えば外傷や炎症性の内臓癒着が危惧される場合等においても投与することができる。
本発明の薬剤は、温血の哺乳類の腹膜内の癒着形成を防止、抑制又は治療する為の薬剤であり、当該哺乳類に少なくとも１の効果的な量のセリンプロテアーゼ阻害剤を、静脈内投与、経口投与又は経皮適用により組織修復に十分量一定期間投与することからなる。好ましい実施例は、少なくとも１のキモトリプシン様セリンプロテアーゼであるセリンプロテアーゼ阻害剤を使用し、術後癒着形成を防止、抑制する方法に関する。本発明の薬剤は当該温血哺乳類としてヒトに適用することができる。
（プロテアーゼ阻害剤）
本発明の薬剤に含有されるプロテアーゼ阻害剤は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを使用することができる。
本発明の癒着形成防止、抑制又は治療剤の対象となるプロテアーゼ群は、好ましくはセリンプロテアーゼである。該セリンプロテアーゼは、ペプチド中のセリンを開裂結合させるエンドペプチダーゼのサブクラスである（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．，Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｅｄ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐ．３−２２，１９８６）。セリンプロテアーゼ自体は公知である。例えばキモトリプシン・スーパーファミリー及び放線菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ズブチリシン・スーパーファミリー等の２種のセリンプロテアーゼのスーパーファミリーが報告されている。
セリンプロテアーゼ阻害剤は公知であり、以下の系統群に分類することができる。（１）ウシのすい臓来トリプシン阻害剤（クニッツ）ファミリーであり、塩基性プロテアーゼ阻害剤（Ｋｅｔｃｈａｍ，Ｌ．Ｋ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎ：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｅｄ．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｐ．１３１−１４３，１９７８）（以下「ＢＰＴＩ」という）としても知られている、（２）Ｋａｚａｌ群、（３）放線菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ズブリシン阻害剤群（以下「ＳＳＩ」という）、（４）セルピンファミリー、（５）大豆トリプシン阻害剤（クニッツ）ファミリー、（６）ポテト阻害剤ファミリー、（７）ボウマンバークファミリー（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：ｐ．５９３−６２６，１９８０）を含む。ＢＰＴＩ群、Ｋａｚａｌ群、ＳＳＩ群、大豆トリプシン群、ポテトトリプシン群のメンバを含む多くの完全な阻害剤と、Ｓｅｐｒｉｎ−α−１−抗トリプシンの開裂型のための結晶学的データが利用できる（Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）。多くのセリンプロテアーゼ阻害剤は広い特異性をもち、血液凝固セリンプロテアーゼを含むプロテアーゼのキモトリプシン・スーパーファミリーとセリンプロテアーゼの放線菌属スーパーファミリー両者を抑制することができる（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：ｐ．５９３−６２６，１９８０）。各阻害剤の特異性は、セリンプロテアーゼの直接の開裂部位に対するアミノ末端のアミノ酸の同一性によって決定すると考えられている。Ｐ部位残基として知られるこのアミノ酸は、セリンプロテアーゼの活性部位において、セリンとアシル結合を形成すると考えられている（ＬａｓｋｏｗｓｋｉＬａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：ｐ．５９３−６２６，１９８０）。
本発明の薬剤に含有される好ましいセリンプロテアーゼ阻害剤は、セルピン（ｓｅｒｐｉｎ）ファミリーとボウマンバーク（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ）ファミリーに属する。セルピンファミリーに対するセリンプロテアーゼ阻害剤として、プラスミノゲン活性化因子阻害剤であるＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、ＰＡＩ−３があり、Ｃｌエステラーゼ阻害剤、α−２−抗プラスミン、コントラプシン（ｃｏｎｔｒａｐｓｉｎ）、α−１−抗トリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、プロテアーゼネクシンＩ、α−１−抗キモトリプシン、プロテインＣ阻害剤、ヘパリンコファクターＩＩ及び成長ホルモン調節タンパク質が挙げられる（Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５２：５２７−５３５，１９８７）。
キモトリプシン・スーパーファミリーのセリンプロテアーゼの例としては、組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ｔ−ＰＡ）、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリプシン、プラスミン、エラスターゼ、ウロキナーゼ（又は非尿型プラスミノゲン活性化因子：ｕ−ＰＡ）、アクロシンン、活性化プロテインＣ、Ｃｌエステラーゼ、カプテシンＧ、キマーゼ、そしてカリクレイン、トロンビン、ＶＩＩａ因子、ＩＸａ因子、Ｘａ因子、ＸＩａ因子、ＸＩＩａ因子を含む血液凝固カスケードのプロテアーゼなどが含まれる（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．，Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｅｄ．Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｅｌｓｅｖｉｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐ．３−２２，１９８６，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇｅｒ，Ｗ．ｅｔ．ａｌ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１５７：ｐ．２１９−２２３，１９８３）。
キモトリプシン・スーパーファミリーのすべてのセリンプロテアーゼの触媒ドメインは、配列相同性と構造相同性をもつ。配列相同性は、（１）特異活性部位残基、例えば、トリプシンの場合に、１９５位のセリン、５７位のヒスチジン及び１０２位のアスパラギン酸が共通する；（２）オキシアニオン孔（ｏｘｙａｎｉｏｎ ｈｏｌｅ）（例えば、トリプシンの場合に、１９３位のグリシン及び１９４位のアスパラギン酸）、（３）構造においてジスルフィド架橋を形成するシステイン残基、の全保存を含む（Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．，Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｂｏｐｌ．，２４：１５２−１８２（１９７４））。
構造相同性は（１）２つのグリーク・キー構造からなる一般ホールド（ｃｏｍｍｏｎ ｆｏｌｄ）（Ｒｉｃｈｒｄｏｓｏｎ）、（２）触媒残基の一般要因、（３）分子核内での構造の精密な保存（Ｓｔｒｏｕｄ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｃｉ．ＡＭ．，２３１：２４−８８）を含む。
本発明の薬剤は、α−アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体を含むことができる。ウシトロンビン、ヒト因子ＸＩＩａ、ヒト因子Ｘａ、ヒト結晶カリクレイン、ウシトリプシン、ラット皮膚トリプターゼ、ヒト白血球エラスターゼ、ブタすい臓エラスターゼ、ウシキモトリプシン、ヒト白血球カテプシンＧ、ラットマスト細胞プロテアーゼＩＩを含む幾多のセリンプロテアーゼの阻害剤に関し、これらα−アミノアルキルホスホン酸塩誘導体が発見されている（米国特許５５４３３９６，５６８６４１９，５９５２３０７、他）。これらの誘導体は、ヒト血漿に含まれ、種々の環境下で非常に安定している。例えば、本発明の薬剤に含有される好適な阻害剤Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２、特に好ましくはＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２は、ヒト血漿内で約２０時間の半減期をもつ。この安定性は重要である。なぜなら、腹膜の浸出物は、大部分のプロテアーゼ阻害剤を中和し、活性を失わせると予測されるからである。アミノアルキルホスホン酸はａ−アミノ酸に相似しており、そして、一般的に受容したアミノ酸のための上付き文字のＰへと続く３文字の略称が命名された。例えば、アラニンに関するジフェニルα−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ（Ｎ−ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）エチルホスホネイト（ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）はＣｂｚ−ＡｌａＰ（ＯＰｈ）２と略称される。
Ｃ−端末のリン酸塩残基を有するペプチドＶａｌＰ（ＯＰｈ）２、それはバリンの類似体であるが、これは比較的有効で比較的特異的なエラスターゼ及びエラスターゼ様酵素に特異的な不可逆性阻害剤である。フェニルアラニン、他の芳香族アミノ酸又は長脂肪酸族側鎖と関連性があるＣ−端末リン酸塩残基は比較的有効であり、比較的特効のあるキモトリプシンとキモトリプシン様酵素の阻害剤である。オルニチン、溶解素、アルギニン又は、α−アミノ−α−（４−アミジノフェニル）メタンホスホン酸塩［（４−ＡｍＰｈＧｌｙ）Ｐ（ＯＰｈ）２］又はα−アミノ−α−（４−アミジノフェニルメチル）メタンホスホン酸塩［（４−ＡｍＰｈｅ）Ｐ（ＯＰｈ）２］のＣ−端末ジフェニルエステルに関連性があるペプチドは、比較的有効で比較的安定性のあるトリプシンとトリプシン様酵素の阻害剤である。
酵素との反応に対する付加的な特異性及び／又は増加した活性は、ペプチド構造の部位におけるアミノ酸配列の変異により、阻害分子へ導くことができる。ペプチドのＰ−ニトロアニリドといった酵素基質の配列と効果的なペプチドのリン酸塩阻害剤の配列間には一般的に一致した配列がある。比較的高活性の阻害剤は、一般的に、特定の酵素のための好都合なペプチドのＰ−ニトロアニリド基質の配列をもつ。例えば、キモトリプシンそしてキモトリプシン様酵素に対して比較的有効な阻害剤であるＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２は、これらの酵素に適当な基質であるＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＡと類似のアミノ酸配列を有する。ヒト白血球エラスターゼに比較的有効な阻害剤［Ｍｅｏ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＶａｌＰ（ＯＰｈ）２及びＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＶａｌＰ（ＯＰｈ）２］は、この酵素に対する２つの適当な基質ＭｅＯ−Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡ及びＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＮＡと類似のアミノ酸配列をもつ。論文中に報告された、それらの同じセリンプロテアーゼのための比較的有効な可逆的・不可逆的な阻害剤中に発見されたペプチド配列に基づくセリンプロテアーゼのためのホスホン酸塩阻害剤の設計も可能である（Ｐｏｗｅｒｓ ａｎｄ Ｈａｒｐｅｒ，ｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｂａｒｒｅｔｔ ａｎｄ Ｓａｌｖｅｓｅｎ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐ５５−１５２，１９８６；Ｔｒａｉｎｏｒｅ，Ｄ．Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８：３０３−３０７，１９８７）。
α−アミノアルキルホスホン酸のジフェニルエステルは前記方法により合成することができる（米国特許５５４３３９６）。α−アミノアルキルホスホン酸の２（置換フェニル）エステルは、トリフェニル亜リン酸の代わりに３（置換フェニル）リン酸を使用する方法にて調製することができる。パーフルオロアルキルジエステルは、エステル転移反応に含まれる方法によって合成することができる（Ｓｚｅｗｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐ．４０９−４１４，１９８２）。代わりに、前記のようにアミノアルキルホスホン酸のジエステルの合成とそれらのペプチドは、ホスホン酸部分のエステル化により行うことができる（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１４：３５６−３７７，１９８６）。本発明の薬剤に含有される多くの付加的セリンプロテアーゼ阻害剤は、米国特許により開示される（米国特許６２６２０６９，５９１６８８８，５９００４００，５１５７０１９，４８２９０５２，５７２３３１６，５８０７８２９）。
多くの有機化合物は光学活性型が存在する。光学活性化合物を示す場合、識別コードＤそしてＬ又はＲそしてＳが、キラル中心の分子の絶対配置を示すために使用される。識別コード（＋）と（−）又はｄとｌは、水平偏光の回転のサインを示すため、化合物により使用される。（−）又はｌは化合物が左旋回していることを意味し、化合物識別コード（＋）又はｄは化合物が右旋回していることを示す。立体異性体とよばれるこれらの化合物は、互いに鏡像であることを除けば同一である。特定の立体異性体は鏡像異性体として表すことができ、そのような異性体の混合物は鏡像異性混合物又は鏡像異性ラセミックと呼ばれることもある。本発明の薬剤の製法として、立体異性純度又は光学純度をより有効性を増加及び／又は有害作用を減少させる手段を利用することができる。
本明細書において使用される用語「キラル」は、鏡像相手の重合不可の性質の分子をしめすものである。しかしながら、用語「アキラル」は鏡像相手に重合可能な分子を示す。用語「立体異性体」は同一化学構造をもつ化合物を意味する。しかし、空間の原子又は群の配置に関しては相違する。特に「鏡像異性体」は、重合不可能な鏡像ともう一つの２種の化合物の立体異性体を意味する。
一方、「ジアステレオマ」は非対称の２以上の中心を持つ立体異性体を示し、その分子は相互に鏡像ではない。キラル中心の命名法に関しては、用語ＳとＲ配置がＩＵＰＡＣ１９７４（Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｅ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，４５：１３−３０，１９７６）により定義される。
本発明の薬剤に含有される化合物に関し、互換的に使われている用語「鏡像異性的に濃縮された」と「非ラセミ体」は、光学的に濃縮された構成物を示し、その構成物内では鏡像異性体のラセミ混合物と比較して、一方の鏡像異性体が濃縮されている。別に明記されていない場合は、それらは、望ましい鏡像異性体の望ましくない鏡像異性体に対する相対的な割合が１対１以上である構成物を示す。例えば、鏡像異性的に濃縮された製剤は、望ましい鏡像異性体の望ましくない鏡像異性体に対する相対的な割合が、重さにして５０％以上であり、望ましくは少なくとも７５％、さらに望ましくは８０％である。もちろん濃縮物は、「十分に鏡像異性的に濃縮」された製剤、「十分に非ラセミ体の」製剤又は「十分に光学的に純粋」な製剤にすることにより８０％以上とすることが可能であり、それは少なくとも望ましい鏡像異性体が８５％以上、望ましくは９０％以上、さらに望ましくは９５％以上である薬剤を意味する。
鏡像体の分離は、既に公知の幾つかの方法によって達成することができる。例えば、２の鏡像異性体のラセミ混合物はクロマトグラフィーによって分離することができる（”Ｃｈｉｒａｌ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ”，Ｗ．Ｊ．Ｌｏｕｇｈ，Ｅｄ．Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）。鏡像異性体は、伝統的な分離技術によっても分離することができる。例えば、ジアステレオマ塩の構成物と分画結晶化によって鏡像異性体を分離することができる。カルボン酸の鏡像異性体の分離については、ジアステレオマ塩が、ブルシン、キニーネ、エフェドリン、ストリキニーネ、その他のような鏡像異性的に純粋なキラル塩基を添加することにより形成される。代わりに、ジアステレオマエステルは、遊離物質を産出するためのジアステレオマエステルの分離、加水分離に続いて、鏡像異性的に濃縮されたカルボン酸であるメントールのような鏡像異性的に純粋なキラルアルコールを加えることにより形成される。アミノ化合物の光学異性体の分離に関しては、キラルカルボン又はカンファースルホン酸、酒石酸、マンデル酸又は乳酸といったスルホン酸の添加によりジアステレオマ塩の形成といった結果になる。上記のような分離技術のほかに、活性鏡像異性体は、既に公知の方法を使用し、望ましい光学異性体のみを産する立体特異的合成によっても合成することができる。キラル合成は高鏡像異性的純度の生成物を産出することができる。しかしながら、幾つかの事例では、生成物の鏡像異性的純度は特段高くない。熟練者たちは、キラル合成によって得られた鏡像異性的濃度をより高めるものとして、上記分離方法を高く評価している。鏡像異性体の光学的濃度は先行技術によって既知の方法によって決定される。例えば、鏡像異性体試料は、キラルクロマトグラフィーカラム上の高速液体クロマトグラフィーによって分析することができる。
本発明の薬剤に含有されるセリンプロテアーゼ阻害剤としてのキマーゼ阻害剤は、温血の哺乳類の腹膜内の癒着形成を防止、抑制又は治療方法に使用され、当該哺乳類に少なくとも１の効果的な量のキマーゼ阻害剤を組織修復に十分量一定期間存在するように、静脈内投与、経口投与又は経皮適用することができる。
好適には、例えばＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２といったα−アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体であるキマーゼ阻害剤を使用することができる。より好適には、鏡像異性的に濃縮したα−アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体、例えばＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の製剤を使用することができる。このＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２は、全Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２重量の５０％、８０％好ましくは９５％以上に濃縮したものが好適である。当該温血哺乳類はヒトであることが望ましい。濃縮する方法は、例えばアセトン−エーテルを用いて結晶化させ、再度同様に結晶化させることにより得ることができる。
（製剤）
本発明の薬剤は、前記プロテアーゼ阻害剤を単独で、あるいは適当な製剤用添加物と共に製剤形態の医薬組成物として調製し、投与することができる。このような医薬組成物の投与形態としては、経口的投与に使用されるもの、又は非経口的に投与されるものであれば特に限定されないが、例えば、錠剤、シロップ、注射用アンプル剤、注射用凍結乾燥粉末剤や軟膏剤、シップ剤等を用いることができる。各種製剤型への調製は、当業者が利用可能な周知の製剤添加物、例えば、希釈剤や添加剤などを用いて慣用の手法に従って行うことができる。
例えば、注射用凍結乾燥粉末剤は、精製された前記プロテアーゼ阻害剤の有効量を注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の希釈液に溶解し、必要に応じてカルボキシメチルセファロース、アルギン酸ナトリウム等の賦形剤、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、アミノ酸、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノール等の保存剤、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカイン等の無痛化剤、塩酸、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウム等のｐＨ調節剤等を加え、常法により製造することができる。また、注射用アンプル剤は、前記プロテアーゼ阻害剤の有効量を注射用蒸留水、生理食塩水、リンゲル液などの希釈剤に溶解し、必要に応じてサリチル酸ナトリウム、マニトール等の溶解補助剤、クエン酸ナトリウム、グリセリン等の緩衝剤、ブドウ糖、添加糖等の等張化剤、前述の安定化剤、保存剤、無痛化剤、ｐＨ調節剤等の添加剤を加えた後、通常の加熱滅菌、無菌ろ過等により無菌化して調製することができる。なお、有効成分の種類によっては加熱滅菌工程で失活する場合があるので、滅菌方法は適宜選択すべきである。
本発明の薬剤は、医薬上許容される担体等を用いて、錠剤、顆粒、カプセル剤、散剤等の固型状、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、レモナーデ剤等の液状の態様や軟膏剤、シップ剤の態様で、経口投与、非経口投与に適した剤型に製剤化し、医薬製剤として用いることもできる。必要ならば、上記製剤に補助剤、安定化剤、湿潤剤、その他の常用添加剤、例えば乳糖、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、白土、庶糖、トウモロコシ澱粉、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、カカオ油、エチレングリコール等を配合してもよい。
（投与量）
本発明の薬剤は、少なくとも１種のプロテアーゼ阻害剤を有効量含み、該プロテアーゼ阻害剤が癒着形成の部位において効果的な濃度で実質的に上皮化に足る十分な時間滞留するように投与することができる。
本発明において、投与可能なプロテアーゼ阻害剤の量と濃度は、効果を得るに十分な濃度すなわち「有効量」を最低濃度とし、「薬学的に許容できる」濃度を最高濃度とした範囲で決定することができる。所望の癒着形成を防止、抑制又は治療したい部位（腹部、胸部、眼、心臓、婦人科的組織等）で効果が得られるように、プロテアーゼ阻害剤混合物は適した剤型や媒体（生理食塩水）で、静脈内投与、経口投与又は経皮適用することができる。本発明において、経皮適用とは、軟膏剤や、シップ剤の製剤に調製したものを患部に塗る、若しくは貼ること等をいい、被検体の組織表面のある部位に塗布するのとは区別される。
本発明において「有効量」という用語は、上記の癒着形成の防止、抑制又は治療において、微毒又は無毒で、所望する反応を得る為の薬剤の十分な量を意味する。求められる正確な量は被検体によってまちまちであり、被検体の種、年齢、体重、一般的体調、投与の形態などによって変わってくる。適切な「有効量」は、ここに提供された事と慣例的な方法を使用した普遍的な先行技術により決定することもできる。
「薬学的に許容できる」とは、効果と危険性の比率的と比例して、過度の毒性、炎症、アレルギー反応又はその他の問題点又は合併症を伴わない、ヒト又は動物の組織との接触に適当な、信頼できる医療判断の範囲内での、物質、化合物、混合物又は投与形式を意味する。
該プロテアーゼ阻害化合物は一般的に作用する間隔で投与することができ、例えば手術前、手術中、手術完了後の期間にも投与することができる。術後少なくとも１〜７２時間、好ましくは１〜４８時間の間に投与を開始することができる。例えば静脈内投与の場合は、術後少なくとも１〜２４時間、好ましくは１〜１２時間の間に投与を開始することができ、経口投与の場合は、同様に１〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間、より好ましくは１２〜２４時間の間に投与を開始することができる。さらに、軟膏剤等を経皮適用する場合は、術後少なくとも１〜７２時間、好ましくは１〜４８時間の間に投与を開始することができる。一般的に術後癒着を形成しうる期間は、術後２４時間〜１４日であるから、静脈内投与、経口投与及び経皮適用の場合にはいずれもこの期間内に本発明の薬剤を継続的に投与することができる。
本発明の薬剤は、少なくとも１種のプロテアーゼ阻害剤が癒着形成の部位において効果的な濃度で実質的に上皮化に足る投与量で投与することができる。例えば、本発明の薬剤に含有されるプロテアーゼ阻害剤の具体例であるキマーゼ阻害剤（Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）を手術中に１０μＭ使用したとき、該生体内のキマーゼ活性は、血管組織において４週間にわたり顕著に抑制された。キマーゼ阻害剤（Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）の効果的な投与量は、成人体重１ｋｇ、１日あたり０．０００１〜１００ｍｇの間で選択することができる。例えば静脈内投与の場合には０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１ｍｇの間で、また経口投与の場合には０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇの間で投与量を選択することができる。さらに、経皮適用の場合には、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇの間で適用することができる。
他のプロテアーゼ阻害剤の効果的な量、経路は、公知の手段により決定することができる。
【実施例】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
（アミノアルキルホスホン酸誘導体の調製）
アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体からなる薬剤は先行技術の１つによって証明され、実行される（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，ｐ．４８５−４９３，１９９１）。
キマーゼ活性と癒着形成との関係を説明するのに、典型的なセリンプロテアーゼ阻害剤、キマーゼ阻害剤、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の効果を調べた。この化合物は公知の方法を使用し合成した（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，ｐ．４８５−４９３，１９９１）。さらに詳しくは、Ｃｂｚ−Ｖａｌ−ＯＨ（０．２５ｇ，１ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（０．２ｇ，１ｍｍｏｌ）と水素和物Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２（０．５８４ｇ，１ｍｍｏｌ）は、３０ｍｌの酢酸エチルに溶解し、オイルを加える。この溶液に対し、０．１ｇ（１ｍｍｏｌ）のコハク無水物と０．１ｇの５％Ｐｄ／Ｃが加えられ、混合物は、薄層クロマトグラフィーが新しい斑点を示すまで、水素気圧下で攪拌される。触媒はろ過により取り除かれ、有機層は数回水で洗浄され、乾燥後有機溶媒は提供の為に除去させる。有機物として例えば、ハイドロスコープ固体としての０．４５ｇ（６５％）の生成物が得られた（ｍｐ．５０−５３℃．；ｏｎｅ ａｐｏｔ ｏｎ ＴＬＣ，Ｒｆ＝０．４；３１Ｐ ＮＭＲ １９．７５，１９．２３ｐｐｍ，ｒａｔｉｏ １：１，Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３４Ｈ４０Ｏ３Ｎ３Ｐ．２Ｈ２Ｏ：５９．５６；Ｈ，６．４２．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，５９．５９；Ｈ，６．４２）。
【実施例２】
（Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２キマーゼ阻害剤の濃縮鏡像異性体の調製）
以下に使用されているように、以下の略語が適用される。Ｚはベンジルオキシカルボニル、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、ＷＳＣＤはカルボジイミド、ＨＯＢｔはＯｌｅｋｓｙｓｚｙｎとＰｏｗｅｒｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２４４：４２３−４４１，１９９４）及びベンジルオキシカルボニルは水素臭化物酸溶液により取り除かれた。生成物をＷＳＣＤ−ＨＯＢｔ反応によりＢｏｃ−Ｐｒｏとカップリングさせ、その後ラセミ混合物を得た。その後、再沈殿により分離した。まず、溶液中の非活性鏡像異性体を結晶化させて、溶液から除去した。ＨＣｌを加えたＢｏｃの溶液中の活性鏡像異性体からブロックを除いた後、試料をＷＳＣＤ−ＨＯＢｔ反応によりＢｏｃ−Ｖａｌとカップリングさせ、再度ブロックを除いて分離された。この生成物に対し、コハク無水物とトリエタノアミンを加え、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２を得た。そして、生成物を逆相ＨＰＬＣによって濃縮した。
（Ｚ−ＤＬ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）
フェニルアセトアルデヒド（２８．３ｍＬ，０．２４２ｍｏｌ）を４５ｍＬの酢酸で溶解した。カルバミル酸ベンジルエステル（２４．４ｇ，０．１６１ｍｏｌ）とトリフェニル亜リン酸塩（５０．０ｇ，０．１６１ｍｏｌ）をこの溶液に加え、１．５時間８５℃で攪拌した。有機溶剤を蒸発させた後、残りの溶液を室温まで冷まし、４００ｍＬのメタノールをこの溶液に加え、−２０℃で結晶化できるようにした。該生成物をろ過により集め、冷メタノールにより洗浄し、３２．９ｇ（４２％）のＺ−Ｄ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２とＺ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の化合物を産出するため真空内で乾燥した。
（ＤＬ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２・ＨＢｒ）
Ｚ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２とＺ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２（１４．３ｇ，２９．３ｍｍｏｌ）の混合物を３０ｍＬの２５％水素臭化物／酢酸溶液中に溶解し、室温で１時間攪拌した。両方を加えた後、分離された固体試料をろ過によって集めた。この試料をエーテルで洗浄し、１２ｇ（９４％）のＤとＬ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２・ＨＢｒの混合物を得る為に真空乾燥した。
（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＤＬ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）
ＤとＬ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２・ＨＢｒ（１１．５ｇ，２６ｍｍｏｌ），Ｂｏｃ−Ｐｒｏ（５．５３ｇ，２５．７ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ（３．５８ｇ，２６．５ｍｍｏｌ）の混合物を７０ｍＬのＤＭＦに溶解し、ＷＳＣＤ（４．７０ｍＬ，２６．５ｍｍｏｌ）を点滴によりで氷で冷却しながら加えた。室温で３．５時間攪拌した後、溶液を真空で濃縮し、エチルアセテートを加えた。結果により得られた溶液を逐次、酢酸とアルカリ性溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空乾燥濃縮した。アセトン−エテールにより結晶化させ、同様に再結晶化させて不活性鏡像異性体（Ｄ体）を除去し、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２を得た。残存溶液を真空で濃縮し、５．１０ｇの鏡像異性体を産出するための溶解剤としてトルエン−エチル−アセテート（５：１）を加え、中圧シリカゲルで精製した。
（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）
Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２（４．９８ｇ，９．０５ｍｍｏｌ）を３７ｍＬの冷ＨＣｌ／ジオキサン（４．９Ｎ）に溶解し、室温で１時間攪拌した。概溶液は真空で蒸発、乾燥させた。残物を４０ｍＬのＤＭＦで溶解し、Ｂｏｃ−Ｖａｌ（２．０６ｇ，９．５０ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１．３５ｇ，９．９６ｍｍｏｌ）をこの溶液に加えた。ＷＳＣＤ（１．７７ｍＬ，９．９６ｍｍｏｌ）を点滴又は氷で冷やしながらこの溶液に加え、室温で一晩攪拌した。酢酸エチルをこの反応溶液に加え、引き続いて、酸性とアルカリ性の溶液で洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過した後、無色オイルとして６．２６ｇ（９４％）の生成物を産出し、真空で濃縮した。
（Ｓｕｃ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２）
Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２（５．８６ｇ，８．４７ｍｍｏｌ）を３５ｍＬの冷ＨＣｌ／ジオキサン（４．９Ｎ）に加え溶解し、室温で１時間攪拌した。概溶液を真空で蒸発、乾燥した。残物を３５ｍＬのＤＭＦを加え溶解し、コハク無水物（１．０２ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）を加えた。トリエチルアミン（２．３６ｍＬ，１６．９ｍｍｏｌ）を点滴によりこの溶液に加え、室温で２時間攪拌した。氷冷しながらＨＣｌ溶液により溶液のｐＨがｐＨ１．０となるように調整し、酢酸エチルを加えて試料を抽出した。抽出物を飽和塩水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、黄色オイルとして生成物を産出し、真空でろ過、濃縮した。オイルを逆相ＨＰＬＣ（分離管：ＹＭＣ ＯＤＳ ＳＨ−３６３−５，３０×２５０ｍｍ，移動相：０．１ＴＦＡ，勾配４０−７０％ ＭｅＣＮ）により濃縮し、ホワイトパウダーとして、２．３０ｇ（４２％）の生成物を産出し冷却乾燥した。
（実験例 Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の内服による癒着予防効果）
シリアンハムスター（ＳＬＣ社）、年齢６週間（体重８５〜９０グラム）を開胸し、心臓を擦過後、心筋癒着モデルを作製し、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２（１０ｍｇ／ｋｇ）（８例）又は偽薬（８例）をモデル作製前３日よりモデル作成後１４日まで１日１回、ゾンデで強制経口投与し、モデル作製後１４日の癒着程度を比較検討した。尚、癒着スコアーは下記のとおりである。なお、癒着スコアーにより、Ｓｔｕｄｅｎｔ−ｔ ｔｅｓｔを用いて有意差検定を行った。
癒着度０；心臓が容易に取り出せ、通常の心臓と同様に周囲から独立して存在している。
癒着度１；心臓の一部と周囲組織との薄膜性の癒着が認められるが、簡易癒着部位が剥離でき、心臓を露出できる。
癒着度２；心臓の数箇所と周囲組織との癒着が認められるが牽引することにより、癒着部が剥離でき、心臓を露出できる。
癒着度３；心臓が確認できるが、周囲の組織数箇所と強固に癒着し、強く牽引しなければ心臓の露出が行いにくい。
癒着度４；心臓を中心とした極度の細胞増殖、線維化が起こり周囲の組織との癒合が認められる。心臓が周辺組織と癒着しているため、牽引しても剥離不可能で、心臓の露出が非常に困難である。
偽薬群では、癒着度４が３例（３７．５％）、癒着度３が２例（２５％）、癒着度１が１例（１２．５％）、そして残りが癒着度０（２５％）であったのに対し、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２投与群では、癒着度４が１例（１２．５％）、癒着度２が１例（１２．５％）、そして残りが癒着度０（７５％）であり、有意に癒着度が軽減されていた。
【産業上の利用の可能性】
以上説明したように、本発明の癒着形成防止、抑制又は治療剤は、静脈内投与や経口投与又は経皮適用することにより癒着予防に有用であり、整形外科的あるいは形成外科的な手術後の癒着のみならず炎症性の内臓癒着にも有用である。
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１のプロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤であって、静脈内投与、経口投与又は経皮適用されることを特徴とする脊椎動物被検体内の組織表面の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項２】
該プロテアーゼ阻害剤が、セリンプロテアーゼ阻害剤である、請求の範囲第１項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項３】
該セリンプロテアーゼの阻害剤が、キモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤である請求の範囲第２項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項４】
該キモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が、キマーゼ阻害剤である請求の範囲第３項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項５】
該キマーゼ阻害剤が、α−アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体である請求の範囲第４項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項６】
該キマーゼ阻害剤が、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２である、請求の範囲第４項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項７】
該キマーゼ阻害剤が、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の鏡像異性体Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の濃縮製剤である請求の範囲第４項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項８】
該鏡像異性体濃縮製剤において、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２がＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の総重量の９５％以上を含有する請求の範囲第７項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項９】
該プロテアーゼ阻害剤が、当該部位において当該プロテアーゼ阻害剤の効果的な局所濃度を維持する伝達体と結合して投与され、そして、当該伝達体は、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、シクロデキストラン、そしてその化合物からなる集合体より選択された高分子量担体をなす、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項１０】
請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１に記載のプロテアーゼ阻害剤と、薬学的に許容できる希釈液又は賦形剤からなる、癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項１１】
外科手術前、外科手術中若しくは外科手術後、又は炎症性の内臓癒着が危惧される場合に脊椎動物被検体に対し、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１に記載の癒着形成防止、癒着形成抑制又は癒着形成治療用薬剤を投与する治癒形成の防止、抑制又は治療方法。
【請求項１】
少なくとも１のプロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤であって、静脈内投与、経口投与又は経皮適用されることを特徴とする脊椎動物被検体内の組織表面の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項２】
該プロテアーゼ阻害剤が、セリンプロテアーゼ阻害剤である、請求の範囲第１項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項３】
該セリンプロテアーゼの阻害剤が、キモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤である請求の範囲第２項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項４】
該キモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤が、キマーゼ阻害剤である請求の範囲第３項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項５】
該キマーゼ阻害剤が、α−アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体である請求の範囲第４項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項６】
該キマーゼ阻害剤が、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２である、請求の範囲第４項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項７】
該キマーゼ阻害剤が、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の鏡像異性体Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の濃縮製剤である請求の範囲第４項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項８】
該鏡像異性体濃縮製剤において、Ｓｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２がＳｕｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｈｅＰ（ＯＰｈ）２の総重量の９５％以上を含有する請求の範囲第７項に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項９】
該プロテアーゼ阻害剤が、当該部位において当該プロテアーゼ阻害剤の効果的な局所濃度を維持する伝達体と結合して投与され、そして、当該伝達体は、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、シクロデキストラン、そしてその化合物からなる集合体より選択された高分子量担体をなす、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１に記載の癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項１０】
請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１に記載のプロテアーゼ阻害剤と、薬学的に許容できる希釈液又は賦形剤からなる、癒着形成の防止、抑制又は治療用薬剤。
【請求項１１】
外科手術前、外科手術中若しくは外科手術後、又は炎症性の内臓癒着が危惧される場合に脊椎動物被検体に対し、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１に記載の癒着形成防止、癒着形成抑制又は癒着形成治療用薬剤を投与する治癒形成の防止、抑制又は治療方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６９２７６
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【発行日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４８５０（Ｐ２００５−５０４８５０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１１１１
【国際出願日】平成１６年２月４日（２００４．２．４）
【出願人】（５０２３７１６７９）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【発行日】平成１８年５月２５日（２００６．５．２５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００１１１１
【国際出願日】平成１６年２月４日（２００４．２．４）
【出願人】（５０２３７１６７９）
【Ｆターム（参考）】
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