発がん物質を解毒する組成物および方法
【課題】ヒトを含むほ乳類のがんの予防および治療に有用な医薬品、食品または化粧品の組成物を提供する。
【解決手段】本発明の組成物は、担体と、有効量の活性ベンゾ［ａ］ピレン結合タンパクとを含む、医薬品、食品または化粧品の組成物であって、前記タンパクは、ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼか、該メチルトランスフェラーゼの機能を保存した変異体か、前記メチルトランスフェラーゼまたは変異体の断片かであり、前記タンパクはベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有する、医薬品、食品または化粧品の組成物である。
【解決手段】本発明の組成物は、担体と、有効量の活性ベンゾ［ａ］ピレン結合タンパクとを含む、医薬品、食品または化粧品の組成物であって、前記タンパクは、ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼか、該メチルトランスフェラーゼの機能を保存した変異体か、前記メチルトランスフェラーゼまたは変異体の断片かであり、前記タンパクはベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有する、医薬品、食品または化粧品の組成物である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の発がん物質を生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で結合可能なタンパク質を含む、医薬品、食品または化粧品の組成物に関する。より具体的には、本発明は、生体内でベンゾ［ａ］ピレンと結合可能なタンパク質を含む、医薬品組成物、食品組成物または化粧品組成物に関する。さらに本発明は、がんの予防または治療用タンパク質の使用に関する。本発明は、本発明のタンパク質を含む、医療用組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明のベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）は以下の化学式の発がん物質である。
【０００３】
【化１】
【０００４】
ＢａＰは有機物の燃焼によって発生する。火力発電所および製鉄所の労働者と、アルミ精錬およびルーフィング関係者とは、ＢａＰを含むさまざまな多環芳香族炭化水素（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ、ＰＡＨｓ）の長期間曝露に関連する発がんリスクが高い（１、数字は、明細書の末尾に列挙する文献リストの番号である。また、本段落および次の段落では、段落末尾の非特許文献の番号でもある。）。細胞内に拡散した後は、ＢａＰはアリル炭化水素レセプター（ＡｈＲ）に結合し、当該細胞の核内に移行して、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子を転写活性化する（２−４）。ＢａＰ７，８−ジヒドロジオール−９，１０−エポキシド（ＢＰＤＥ）として知られるＢａＰの代謝産物は、ＤＮＡ付加体の形成および突然変異誘発を行うことができる（５）。
【非特許文献１】Ｆｉｓｃｈｍａｎ．Ｍ．Ｌ．、Ｃａｄｍａｎ、Ｅ．Ｃ．およびＤｅｓｍｏｎｄ、Ｓ．Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎ ＬａＤｏｕ Ｊ．編、Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｐ．ｐ．１８２−２０８．Ｐｒｅｔｉｎｃｅ−Ｈａ
【非特許文献２】Ｗｈｉｔｌｏｃｋ、Ｊ．Ｐ．Ｊｒ．、Ｏｋｉｎｏ、Ｓ．Ｔ．、Ｄｏｎｇ、Ｌ．、Ｋｏ、Ｈ．Ｐ．、Ｃｌａｒｋｅ−Ｋａｔｚｅｎｂｅｒｇ、Ｒ．、Ｍａ、Ｑ．およびＬｉ、Ｈ．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０ ５： Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０１Ａ１： ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１０： ８０９，８１８、１９９６．
【非特許文献３】Ｆｏｌｄｅｓ、Ｒ．Ｌ．、Ｈｉｎｅｓ、Ｒ．Ｎ．、Ｈｏ、Ｋ．Ｌ．、Ｓｈｅｎ、Ｍ．Ｌ．、Ｎａｇｅｌ、Ｋ．Ｂ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．３−Ｍｅｔｈｙｌｃｈｌａｎｔｈｒｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０ｃ ｇｅｎｅ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２３９： １３７−１４６、１９８５．
【非特許文献４】Ｒａｖａｌ、Ｐ．、Ｉｖｅｒｓｅｎ、Ｐ．Ｌ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０１Ａ１ ａｎｄ Ｐ４５０１Ａ２ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４１： １７１９−１７２３、１９９１．
【非特許文献５】Ｗｉｊｎｈｏｖｅｎ．Ｓ．Ｗ．、Ｋｏｏｌ、Ｈ．Ｊ．、ｖａｎ Ｏｏｓｔｒｏｍ，Ｃ．Ｔ．、Ｂｅｅｍｓ、Ｒ．Ｂ．、Ｍｕｌｌｅｎｄｅｒｓ、Ｌ．Ｈ．、ｖａｎ Ｚｅｅｌａｎｄ、Ａ．Ａ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ、Ｇ．Ｔ．、Ｖｒｉｅｌｉｎｇ、Ｈ．およびｖａｎ Ｓｔｅｅｇ、Ｈ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｒｅｐａｉｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｏｃｋａｙｎｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６０： ５６８１−５６８７、２０００．
【０００５】
多機能タンパク質である、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ、ＥＣ２．１．１．２０）は、（ａ）ＳＡＭのＳ−アデノシルホモシスチン（ＳＡＨ）に対する比の調節と、（ｂ）葉酸との結合とによって遺伝的安定性に影響を与える（６、７）。本発明の発明者らは、ヒト肝細胞性癌（ＨＣＣ）細胞株および腫瘍組織の両方においてＧＮＭＴ発現レベルの低下を以前報告した（８、９）。以前の研究プロジェクトでは、ヒトＧＮＭＴ遺伝子は６ｐ１２染色体領域に局在し、その多型性が特徴づけられた（１０、１１）。複数のヒトＧＮＭＴ遺伝子多型の遺伝子型解析は、ＨＣＣ組織での上述の遺伝子マーカーの３６−４７％においてヘテロ接合性が欠失していることを証明した（１１）。
【非特許文献６】Ｋｅｒｒ、Ｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２４７： ４２４８−４２５２、１９７２．
【非特許文献７】Ｙｅｏ、Ｅ．Ｊ．およびＷａｇｎｅｒ、Ｃ．Ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａ ｍａｊｏｒ ｆｏｌａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１： ２１０−２１４、１９９４．
【非特許文献８】Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．、Ｓｈｉｕ、Ｊ．Ｙ．、Ｔｚｅｎｇ、Ｓ．Ｊ．、Ｓｈｉｈ、Ｌ．Ｓ．、Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｊ．、Ｌｕｉ、Ｗ．Ｙ．およびＣｈｅｎ、Ｐ．Ｈ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７５： ７８７−７９３、１９９８．
【非特許文献９】Ｌｉｕ、Ｈ．Ｈ．、Ｃｈｅｎ、Ｋ．Ｈ．、Ｌｕｉ、Ｗ．Ｙ．、Ｗｏｎｇ、Ｆ．Ｗ．およびＣｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｎｅｗｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．、１０： ８７−９７、２００３．
【非特許文献１０】Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．、Ｃｈｅｎ、Ｌ．Ｙ．、Ｗｏｎｇ、Ｆ．Ｈ．、Ｌｅｅ、Ｃ．Ｍ．、Ｃｈａｎｇ、Ｔ．Ｊ．およびＹａｎｇ−Ｆｅｎｇ、Ｔ．Ｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６６：４３−４７、２０００．
【非特許文献１１】Ｔｓｅｎｇ、Ｔ．Ｌ．、Ｓｈｉｈ、Ｙ．Ｐ．、Ｈｕａｎｇ、Ｙ．Ｃ．、Ｗａｎｇ、Ｃ．Ｋ．、Ｃｈｅｎ、Ｐ．Ｈ．、Ｃｈａｎｇ、Ｊ．Ｇ．、Ｙｅｈ、Ｋ．Ｔ．、Ｓｔｒｕｅｗｉｎｇ、Ｊ．Ｐ．、Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．およびＢｕｅｔｏｗ、Ｋ．Ｈ．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ、ＧＮＭＴ、ｉｎ ｌｉｖｃｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３： ６４７−６５４、２００３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
ヒトを含むほ乳類のがん、主に、肝がん、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、脳腫瘍、乳がんおよび腎がんの予防および治療に有用な、医薬品、食品または化粧品の組成物を提供することが本発明の課題である。
【０００７】
ヒトまたは動物の身体の医学的治療薬としてのＧＮＭＴの新規な使用方法を提供することが本発明の別の課題である。
【０００８】
ＢａＰが介在する発がん、特に、ヒトを含むほ乳類のがん、主に、肝がん、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、脳腫瘍、乳がんおよび腎がんの予防または治療の方法を提供することは本発明のさらに別の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これらの課題は、本発明にしたがって、担体と、有効量の活性のあるベンゾ［ａ］ピレン結合タンパクとを含む、医薬品、食品または化粧品の組成物により解決されるが、前記タンパクは、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有するＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かである。本発明の組成物のメチルトランスフェラーゼは、ＧＮＭＴ、ＨｈａＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅ）、ＨａｅＩＩＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼまたはＰｖｕＩＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼであることが好ましい。前記メチルトランスフェラーゼが以下のアミノ酸配列を有するＧＮＭＴであることが最も好ましい（Ｃｈｅｎ ＹＭ、Ｃｈｅｎ ＬＹ、Ｗｏｎｇ ＦＨ、Ｌｅｅ ＣＭ、Ｃｈａｎｇ ＴＪ、Ｙａｎｇ−Ｆｅｎｇ ＴＬ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２０００年５月１５日号；６６（１）：４３−７． ＰＭＩＤ： １０８４３８０３ ［ＭＥＤＬＩＮＥ用にＰｕｂＭｅｄで索引される］）。
【００１０】
1-MVDSVYRTRSLGVAAEGLPDQYADGEAARVWQLYIGDTRSRTAEYKAWLL-50
51-GLLRQHGCQRVLDVACGTGVDSIMLVEEGFSVTSVDASDKMLKYALKERW-100
101-NRRHEPAFDKWVIEEANWMTLDKDVPQSAEGGFDAVICLGNSFAHLPDCK-150
151-GDQSEHRLALKNIASMVRAGGLLVIDHRNYDHILSTGCAPPGKNIYYKSD-200
201-LTKDVTTSVLIVNNKAHMVTLDYTVQVPGAGQDGSPGLSKFRLSYYPHCL-250
251-ASFTELLQAAFGGKCQHSVLGDFKPYKPGQTYIPCYFIHVLKRTD-295
配列番号１
ＧＮＭＴの配列データは、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータライブラリにアクセッション番号ＡＦ１０１４７５で登録されている。
【００１１】
本発明は、メチルトランスフェラーゼの特定のサブクラスの要素としてのＧＮＭＴが発がん物質ＢａＰの新規な解毒経路に関与するという認識に基づく。具体的には、本発明は、シトシンを標的原子団として用いるＤＮＡメチルトランスフェラーゼとＢａＰとは容易に相互作用することを示す、ＢａＰがＧＮＭＴその他のＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅｓ）のＳＡＭ結合ドメインと生体内で優先的に結合することの認識に基づく。ＧＮＭＴを過剰発現するトランスジェニックマウスがベンゾ［ａ］ピレンで処理されるとき、当該マウスのうち３０％だけが肺がんを発生したが、ＧＮＭＴを過剰発現しない正常マウスは同じ条件で６７％の発症率で肺がんを発生する。したがってＧＮＭＴが生体内でベンゾ［ａ］ピレンと結合することは発がんを予防できる。
【００１２】
本発明は、ベンゾ［ａ］ピレンを特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有する、ＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片を、ヒトを含むほ乳類のがん、特に、肝がん、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、脳腫瘍、乳がんおよび腎がんの予防および治療用の医薬の製造のための使用を提供する。前記組成物は、経口、局部または非経口で投与される場合がある。前記メチルトランスフェラーゼは、ＧＮＭＴ、ＨｈａＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＨａｅＩＩＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼまたはＰｖｕＩＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼであることが好ましい。前記メチルトランスフェラーゼがＧＮＭＴであることが最も好ましい。
【００１３】
本発明は、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合する、ＳＡＭ結合ドメインを有するＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かの医薬品として有効な量を個人に投与することを含む、がんの予防または治療の方法を提供する。前記ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有するＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かは、直接投与されてもよく、前記タンパク質をエンコードし、該タンパク質を発現可能なベクターによって投与されてもかまわない。
【００１４】
発明の詳細な説明
図１ ベンゾ［ａ］ピレン処理後の細胞でのＧＮＭＴの核内移行
写真ＡおよびＢ：２重ＩＦＡがｐＧＮＭＴをトランスフェクションしたＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨ細胞で実施された。抗血清：Ａ、ウサギ抗ＧＮＭＴ抗体；Ｂ、マウス抗Ｆｌａｇ抗血清。写真Ｃ−Ｆ：ｐＧＮＭＴをトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞を固定する前にＤＭＳＯ溶媒（ＣおよびＤ）またはＢａＰ（ＥおよびＦ）のいずれかで処理し、マウス抗Ｆｌａｇ抗血清と反応された。免疫蛍光染色は、ローダミン結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ａ）またはＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウス抗体（Ｂ−Ｆ）で実施された。核はヘキストＨ３３２５８で染色された。
【００１５】
図２ （Ａ）３２Ｐポストラベリングと、５次元薄層クロマトグラフィとの組み合わせを用いるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体の量（ＲＡＬ）。レーン１、ＤＭＳＯ溶媒の対照；レーン２、モック（ｍｏｃｋ）；レーン３、４０μｇの対照（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５）ベクターをトランスフェクションした細胞；レーン４、４０μｇのｐＧＮＭＴをトランスフェクションした細胞；レーン５、４０μｇのｐＧＮＭＴアンチセンスをトランスフェクションした細胞；レーン６、２０μｇのｐＧＮＭＴと、２０μｇのｐＧＮＭＴアンチセンスとをコ・トランスフェクションした細胞。１０８ヌクレオチドあたりのＤＮＡ付加体量（付加体相対レベル、ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｄｄｕｃｔｓ ｌｅｖｅｌ、ＲＡＬ）：レーン１、０；レーン２、１０３１．７；レーン３、１０９２．４；レーン４、７１９．８；レーン５、１４１１．３；レーン６、１０７９．７。（Ｂ）対照（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５）ベクター（レーン１）、ｐＧＮＭＴ（レーン２）、ｐＧＮＭＴアンチセンス（レーン３）またはｐＧＮＭＴ／ｐＧＮＭＴアンチセンス（レーン４）でトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット解析。泳動度の速いバンドはこれら４つの実験でのβ−アクチン発現レベルを示す。（Ｃ）１または１０μＭのＢａＰ処理されたＨｅｐＧ２、ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−１−１１細胞におけるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体の量。レーン１および４：それぞれ１および１０μＭのＢａＰ処理されたＨｅｐＧ２細胞；レーン２０５：それぞれ１および１０μＭのＢａＰ処理されたＳＣＧ２−１−１細胞；レーン３および６：それぞれ１および１０μＭのＢａＰ処理されたＳＣＧ２−１−１１細胞。１０８ヌクレオチドあたりのＤＮＡ付加体量（ＲＡＬ）：レーン１、１６１．９；レーン２、２６．４；レーン３、５５．２；レーン４、６８２．１；レーン５、３５４．９；レーン６、５０６．５。（Ｄ）ＨｅｐＧ２細胞（レーン１）、ＳＣＧ２−１−１細胞（レーン２）およびＳＣＧ２−１−１１細胞（レーン３）におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット解析。各細胞株から２０μｇの細胞溶解液がポリアクリルアミドゲル電気泳動に用いられた。泳動度の速いバンドはこれら４つの実験でのβ−アクチンの発現レベルを示す。
【００１６】
図３ Ａｄ−ＧＦＰまたはさまざまなＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させたＨｅｐＧ２細胞におけるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成に対するＧＮＭＴの過剰発現発現の影響
（Ａ）レーン１、Ａｄ−ＧＦＰを感染させ、ＤＭＳＯ溶媒で処理された細胞；レーン２、Ａｄ−ＧＦＰを感染させ、ＢａＰで処理された細胞；レーン３、１００ＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させ、ＢａＰで処理された細胞；レーン４、２５０ＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させ、ＢａＰで処理された細胞；レーン５、１０００ＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させ、ＢａＰで処理された細胞。１０８ヌクレオチドあたりのＤＮＡ付加体量（ＲＡＬ）：レーン１、０；レーン２、６３８．９；レーン３、５１４．２；レーン４、４０５．３；レーン５、２２４．３。（Ｂ）同じ実験におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット解析。レーン１、Ａｄ−ＧＦＰの対照；レーン２、Ａｄ−ＧＮＭＴ（１００ ＭＯＩｓ）；レーン３、Ａｄ−ＧＮＭＴ（２５０ ＭＯＩｓ）；レーン４、Ａｄ−ＧＮＭＴ（１，０００ ＭＯＩｓ）
【００１７】
図４。アリル炭化水素ヒドロキシラーゼ（ＡＨＨ）アッセイで測定される、ＳＣＧ２−ｎｅｇおよびＳＣＧ２−１−１細胞におけるＢａＰにより誘導されるシトクロムｐ４５０ １Ａ１（ＣＹＰ１Ａ１）酵素活性。レーン１−４、ＳＣＦＧ２−ｎｅｇにおけるＣＹＰ１Ａ１活性；レーン５−８ＳＣＧ２−１−１細胞におけるＣＹＰ１Ａ１活性。処理：レーン１および５、ＤＭＳＯ溶媒、レーン２および６、３μＭのＢａＰ；レーン３および７、６μＭのＢａＰ；レーン４および８、９μＭのＢａＰ。前記ＣＹＰ１Ａ１酵素活性の平均（ピコモル／ｍｇ／分）および標準偏差（かっこ内）：レーン１、１４．５（０．２７）；レーン２、２４．４７（０．１４）；レーン３、４１．５（１．４２）；レーン４、７１．３（１．７５）；レーン５、１６．２（３．６）；レーン６、２０．１（１．５）；レーン７、２７．７（１．２）；レーン８、３６．２（１．７）。
【００１８】
図５ ラマルク型遺伝アルゴリズム（Ｌａｍａｒｃｋｉａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いる２量体および４量体型のＧＮＭＴと結合するＢａＰのモデル
（Ａ）ラットＧＮＭＴ（シアン色、１Ｄ２Ｈ）の４量体型と結合したＳＡＨ（白色）とドッキングしたＢａＰ（赤色）。（Ｂ）ラットＧＮＭＴ（黄色、１Ｄ２Ｃ）の２量体型とドッキングしたＢａＰ（赤色）。（Ｃ）ＧＮＭＴの４量体型（シアン色）とスーパーインポーズされたＧＮＭＴの２量体型。（黄色）。複数のＢａＰの炭素原子の近傍のＧＮＭＴのアミノ酸残基（２量体の一方のサブユニットのＩｌｅ３４、Ｔｈｒ３７、Ｇｌｙ１３７、Ｈｉｓ１４２およびＬｅｕ２４０と、他方のサブユニットのＧｌｕ１５）が、１Ｄ２ＣおよびＢａＰのドッキングモデルにもとづいて表示される。
【００１９】
図６ ＢａＰによるＧＮＭＴ酵素活性の阻害
ＧＮＭＴ酵素活性の測定結果は、ＤＭＳＯ溶媒処理について２８１０．８ ± ７３．７ ナノモル／時／μｇ；１０μＭ ＢａＰ処理について１５６３．３ ± １２７．４ナノモル／時／μｇ；５０μＭ ＢａＰ処理について１０６９．５ ± １２４．２ナノモル／時／μｇ；１００μＭ ＢａＰ処理について１０８３．３ ± １７５．９ナノモル／時／μｇであった。各反応セットと、個々の実験とは、３重に繰り返して実施された。
【００２０】
図７ ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドの構築
ｐＰＥＰＣＫｅＸ(ベクター)とｐＳＫ−ｆｌＧＮＭＴ（インサート）とはＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化され、ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴを生成するために連結された。
【００２１】
図８ トランスジェニックマウスおよび正常マウスのノザンブロット。
【００２２】
図９ トランスジェニックマウスおよび正常マウスのウェスタンブロット。
【００２３】
図１０ ＢａＰ処理され、７８週間後に屠殺されたＧＮＭＴトランスジェニックマウス（Ａ）および正常マウス（Ｂ）の肺の臓器病理写真。
【００２４】
本発明はＢａＰによる発がんに関連するヒトの病状を予防および治療するための組成物および方法を提供する。本発明の治療薬および予防薬組成物は、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有する、少なくとも１種類のＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かを含む。本発明の組成物に含まれるメチルトランスフェラーゼタンパクは、他の全てのタンパク質または夾雑物をほぼ含まない、単離生成されたタンパク質の場合がある。前記メチルトランスフェラーゼタンパクは、例えば、抽出物のような、天然の原料から得られる混合物の形態で本発明の組成物中に含まれる場合がある。前記組成物が天然原料から得られる混合物を含む場合には、本発明の組成物は前記天然原料中のメチルトランスフェラーゼ濃度より高濃度のメチルトランスフェラーゼタンパクを含む。前記メチルトランスフェラーゼ濃度は前記天然原料中のメチルトランスフェラーゼ濃度より少なくとも２倍であることが好ましく、３ないし１０００倍であることがより好ましい。
【００２５】
本発明の組成物は治療薬の処方計画（ｒｅｇｉｍｅｎ）の下で患者に投与されるとき、発がんを治療または予防できる。本発明の組成物および方法は、発がん物質ベンゾ［ａ］ピレンとその誘導体に関連する病状を治療するための用いられる場合がある。実施例に記載の生体内試験は、発がんの予防および治療におけるメチルトランスフェラーゼの特定のサブクラスの要素としてＧＮＭＴを使用することに成功したことを実証する。前記サブクラスはベンゾ［ａ］ピレンと選択的に結合するＳＡＭ結合ドメインによって特徴づけられる。
【００２６】
本発明によれば、「タンパク質」とは、約１０００個のアミノ酸残基以下を含み、少なくとも約５０個のアミノ酸残基を含むのが好ましく、少なくとも約１００個のアミノ酸残基を含むのが好ましく、少なくとも約１５０個のアミノ酸残基を含むのがより好ましい、特定のアミノ酸残基の配列をいい、メチルトランスフェラーゼに由来する場合には、メチルトランスフェラーゼ全体のアミノ酸配列と同じかより少ない数のアミノ酸残基を含み、特定の実施態様では、前記タンパク質の全体のアミノ酸残基の約９５％以下であって、有効なＳＡＭ結合ドメインを含む。本発明にしたがって用いられるタンパク質は、少なくとも１個のＳＡＭ結合ドメインを含む。ＳＡＭ結合ドメインは、ＢａＰの認識および生体内でのＢａＰとの結合に必要な基本要素または最小単位である。前記ＳＡＭ結合ドメインは、生体内でのＢａＰと結合して、ＢａＰの細胞内への拡散、アリル炭化水素レセプター（ＡｈＲ）との結合、前記細胞の核内への移行またはＣＹＰ１Ａ１遺伝子の転写活性化を回避することに関与すると信じられている。したがって、ＢａＰと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有するＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かは、発がんの予防または治療に有用である。本発明の最も好ましいタンパク質はＧＮＭＴである。ドッキングモデルに基づくＧＮＭＴ（ｐｄｂ：１Ｄ２Ｃ）とＢａＰとの間の接触距離は、ＧＮＭＴの結合ポケットを例示するために以下の表１に示される。
【００２７】
【表１】
【００２８】
（ＢａＰに起因する疾患徴候の予防または遅延をもたらす）本発明の治療薬／予防薬の処方計画は、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有するＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かのうち少なくとも１つを含む本発明の組成物の投与を含む。本発明の組成物の使用は、（ａ）固体または液体食品または煙または蒸気のような流体に存在するＢａＰまたはその誘導体に曝露された個体内にＢａＰが吸収される前に、前記ＢａＰまたはその誘導体と結合するか、（ｂ）前記個体内のＢａＰまたはその誘導体と結合する場合がある。
【００２９】
本発明の組成物および方法は、ヒトを含むほ乳類における、肝がん、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、脳腫瘍、乳がんおよび腎がんのようながんを治療するうえで有用である。
【００３０】
ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合する、ＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体かの少なくとも１個のＳＡＭ結合ドメインを含む特定のアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＧＮＭＴのような既知のメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む場合がある。
【００３１】
さらに、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合する、ＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した断片または変異体かの少なくとも１個のＳＡＭ結合ドメインを含む特定のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ＧＮＭＴを含むいずれかの既知のメチルトランスフェラーゼとして同定される場合がある。機能を保存した断片に係る１つの方法は、前記タンパク質を、所望の長さの重複しないペプチドまたは重複するペプチドに分割して、前記ペプチドが、ベンゾ［ａ］ピレンを特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを少なくとも１個含むペプチドと、その誘導体とを含むかどうかを決定するために、前記ペプチドを合成、精製および試験することを含む。別の方法では、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを含む可能性があるペプチドを予測するためのアルゴリズムが用いられ、前記アルゴリズムによって予測されるペプチドが特異的にＢａＰと結合するかどうか決定するために、前記ペプチドを合成および精製して、例えば本実施例に記載のような細胞アッセイ中で試験する。タンパク質はＧＮＭＴと比較して同等またはそれ以上の高いＢａＰとの結合能を有することが好ましい。本発明で有用な好ましいタンパク質の断片は、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合する少なくとも１個のＳＡＭ結合ドメインを含む。
【００３２】
（前記組成物が注射される場合に特に望ましい）可溶性を増大し、治療薬または予防薬としての薬効または安定性（例えば、生体外での貯蔵寿命および生体内でのタンパク質分解酵素による分解への抵抗性）を増強するような目的のため、本発明の機能を保存した変異体用に前記タンパク質のいずれかの構造を改変することも可能である。機能を保存した変異体は、ＢａＰ結合能の改変を目的として、前記変異体が由来する天然のタンパク質の配列か、アミノ酸置換、欠失または追加のような改変を施されるべきタンパク質断片かと比較して、アミノ酸配列が変更されるように、あるいは、ある構成部分が同じ目的のために追加されるように、製造することは可能である。
【００３３】
本発明の組成物は、メチルトランスフェラーゼタンパク質を含む天然原料からの混合物に基づいて調製される場合がある。前記メチルトランスフェラーゼタンパク質を含む天然原料からの混合物は、適当な出発材料の抽出のようないずれかの適当な方法によって得られる場合がある。適当な天然原料は、微生物または動物に基づく場合がある。本発明の目的のためには、前記混合物中に含まれるメチルトランスフェラーゼがＢａＰ結合活性を有することを条件として、前記メチルトランスフェラーゼが純粋な形態で単離されることは必須ではない。したがって、必要な活性を提供するのに十分な濃度で前記メチルトランスフェラーゼが存在するかぎり、前記混合物を使用することは可能である。
【００３４】
ＧＮＭＴを含む本発明の混合物は、微生物、特に酵母か、微生物から抽出された混合物かに基づく場合がある。
【００３５】
本発明のＧＮＭＴを含む混合物は、動物の臓器に基づく場合がある。適当な動物は、ブタ、ウシまたはウサギから選択される場合がある。動物の適当な臓器は、肝臓、膵臓または前立腺から選択される場合がある。
【００３６】
本発明のタンパク質は、チンキ剤を調製するために材料を適当な溶媒と接触させるような標準的な手段または方法か、二酸化炭素抽出、凍結乾燥または噴霧乾燥のようないずれかの他の従来の手段または方法かを用いることによって、原料から抽出物として得られる場合がある。（Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．１９９５と、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ２２ｎｄ ｒｅｖと、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ （ＮＦ） １７ ｅｄ， ＵＳＰ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｍｄ．， １９９０とを参照せよ。）
【００３７】
前記抽出物は、本発明のタンパク質と、溶媒とを含む、微生物またはそのホモジネートか、動物臓器またはそのホモジネートを用いて調製されるが、前記溶媒は、蒸留水のような水か、ＰＢＳ、生理食塩水またはその他の溶媒と混合された水のような水溶液溶媒か、ＤＭＳＯ、ＤＭＦまたはエタノールまたはイソプロパノールのようなアルコールのような有機溶媒か、これらのいずれかの組み合わせかの場合がある。得られた抽出物は、液体の構成成分と、固体の構成成分とでできているのが典型的である。
【００３８】
ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合する少なくとも１個のＳＡＭ結合ドメインを含む特定のアミノ酸配列を有し、他の全てのポリペプチドおよび夾雑物を含まない、高度に精製されたペプチドは、標準的な技術を用いて化学合成によって合成される場合がある。タンパク質がポリマー支持体に固定される、固相合成方や、従来の均一な化学反応（液相合成）のような、さまざまなペプチドの化学合成方法が当業者に知られている。合成ペプチドは、均一状態（すなわち、少なくとも９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の純度）になるように、任意的には、文献で知られるタンパク質精製技術を用いて、全ての他のポリペプチドおよび夾雑物を含まないように、精製される場合がある。
【００３９】
高純度の均一なペプチド組成物を製造するための１つの実施態様によれば、合成化学的な手段によって製造されたタンパク質は、調製用逆相クロマトグラフィによって精製される場合がある。この方法では、粗製合成ペプチドは、適当な溶媒（典型的には水溶性バッファー）に溶解され、分離カラム（典型的には逆相シリカ系媒体、さらに、ポリマーまたは炭素系媒体が使用される場合がある）に適用される。ペプチドは、水溶性バッファー（典型的にはＴＦＡ、リン酸トリエチルアミン、酢酸等のバッファー）中の有機成分（典型的にはアセトニトリルまたはメタノール）の濃度を上昇することによって、前記カラムから溶出される。前記溶出液の分画が回収され、適当な分析方法（典型的には、逆相ＨＰＬＣまたはＣＺＥクロマトグラフィ）によって分析される。要求される純度を有する分画がプールされる。存在する対イオンは、選択する塩での追加の逆相クロマトグラフィか、イオン交換樹脂かによって交換される場合がある。前記ペプチドは、酢酸塩その他の適当な塩として単離される場合がある。前記ペプチドは、ろ過され、（典型的には凍結乾燥法により）水分が除去され、必要なペプチド成分の少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７％を含む、均一なペプチド組成物が得られる。任意的に、あるいは、前記逆相ＨＰＬＣとともに、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換、排除体積、向流または順相分離システムか、これらの方法のいずれかの組み合わせかにより精製が達成される場合がある。ペプチドは、限外濾過、回転乾燥、沈殿その他の類似技術を用いてさらに濃縮される場合がある。高純度の均一なペプチド組成物は、以下の技術か、これらの組み合わせのいずれかによって特徴づけられる場合がある。すなわち、（ａ）ペプチドの同一性をチェックするために分子量を決定する質量分析法と、（ｂ）アミノ酸組成により前記ペプチドの同一性をチェックするためのアミノ酸分析法と、（ｃ）特定のアミノ酸配列を確認するための（自動タンパク質シーケンサーまたは手作業による）アミノ酸配列決定法と、（ｄ）ペプチドの同一性および純度をチェックする（すなわち、ペプチドの不純物を同定する）ために用いられるＨＰＬＣ（所望の場合には多重システム）と、（ｅ）前記ペプチド組成物の水分濃度を決定するための含水量と、（ｆ）前記ペプチド組成物中の塩の有無を決定するためのイオン含有量と、残留有機試薬、出発材料および／または有機夾雑物の有無をチェックするための残留有機物とである。
【００４０】
約５０個以下の長さのアミノ酸残基を含み、最も好ましくは約３０個以下の長さのアミノ酸残基を含む本発明の合成ペプチドが、長さが長くなるとペプチド合成に困難をきたす場合があるため、特に好ましい。もっと長いペプチドは以下に説明する組換えＤＮＡ法で製造される場合がある。
【００４１】
本発明の方法で有用なタンパク質は、かかるペプチドをコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞中で組換えＤＮＡ法を用いて製造される場合もある。組換え法で製造されるときには、所望のペプチドをエンコードする核酸で形質転換された宿主細胞は、該細胞に適した培地中で培養され、単離ペプチドは、イオン交換クロマトグラフィか、限外ろ過か、電気泳動か、前記所望のペプチドに特異的な抗体を用いる免疫精製法かを含む、当業者に知られたペプチドおよびタンパク質の精製技術を用いて、細胞の培地か、宿主細胞か、その両方かから精製される場合がある。組換え法で製造されたタンパク質は、合成ペプチドについてすでに説明した方法によって、細胞由来の物質その他のポリペプチドまたは利用する培養液を含まずに、均一にまで単離精製される場合がある。
【００４２】
タンパク質は、化学的消化または酵素的切断の部位が予め定められており、消化結果が再現可能であるような、高純度な完全長または天然タンパク質の化学的または酵素的な切断によって製造される場合もある。切断は、いずれかの生物由来の少なくとも１種類のプロテアーゼその他の適当な酵素を用いる酵素的消化によって実行される場合がある。前記プロテアーゼは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｗ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｍｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ＥＣ３４の国際生化学分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）の命名委員会によるリストと、ＭＥＲＯＰＳのデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｒｏｐｓ．ｃｏ．ｕｋ、Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ ＤおよびＢａｒｒｅｌ Ａ Ｊ、ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄａｔａｂａｓｅ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８ ３２３−３２５ （１９９８）、およびＢａｒｒｅｔ Ａ Ｊ， Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ Ｄ Ｗｏｅｓｓｎｅｒ Ｊ Ｆ（ｅｄｓ）１９９８ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｏｎｄｏｎのリストとから選択される場合がある。特定のアミノ酸配列を有するタンパク質は、合成または組換え法によって製造された高純度の単離ペプチドのためにすでに説明された手順のいずれかによって、前記酵素的または化学的な消化の際に存在するいずれかの他のポリペプチドまたは夾雑物を含まないように高度に精製単離できる。
【００４３】
本発明のタンパク質を含む単離精製タンパク質または混合物は、ヒトを含むほ乳類における予防または治療用に適する、医薬品、食品または化粧品組成物に処方される場合がある。
【００４４】
本発明の治療または予防用組成物は、経口または非経口投与用か、局所適用用かの組成物である。前記組成物は、経口的に投与されるか、局所的に適用されるのが好ましい。
【００４５】
本発明の医薬品組成物は、錠剤、顆粒、粉末、カプセル、ゲル、ペースト、シロップ、水薬（ｐｏｔｉｏｎ）、エアロゾル、点眼薬または噴霧薬のような、従来の医薬品の経口投与剤形の場合がある。医薬品組成物が、吸気に先立ってタバコの煙のＢａＰと結合するように、タバコのフィルターの中に取り込まれる場合もある。食品組成物は、キャンディその他の菓子の材料や飲料のような従来の機能食品製品または食品添加物の形態であるのが普通である。化粧品の組成物は、クリーム、軟膏、シャンプー、リンスまたは香油の形態であるのが普通である。
【００４６】
ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを含む、ＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼ、その機能を保存した変異体またはこれらの断片に加えて、本発明の組成物は担体も含む。この担体は、粉末、ゲル、ペースト、錠剤、カプセル、ガム、薬用ドロップ、エアロゾルおよび液体のようなさまざまな剤形のうちのいずれかの場合がある。例えば、前記担体は、キャンディ、チューインガムまたはタバコのフィルターの場合がある。前記担体は、食感向上剤、噛み心地向上剤、濃厚化剤および増粘剤のような、口腔内での使用を容易にする添加剤を含む場合がある。前記担体は、甘味剤（砂糖、ソルビトール、サッカリンまたはアルパルテーム等）、果実、香辛料または香草または香油（シナモン、ミントまたはチョウジ等）等のような天然または人工の香料または香油、葉緑素および／またはいずれかの適当な従来の色素のような色素を含む場合がある。
【００４７】
経口投与の場合、本発明のタンパク質の不活性化を防止し、あるいは、吸収性および生体利用可能性を向上するための物質で本発明のタンパク質を含む組成物をコーティングするか、該組成物と同時投与する必要があるかもしれない。例えば、タンパク質の処方は、酵素阻害剤とともに、あるいは、リポソーム中で同時投与される場合がある。酵素阻害剤は、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＰ）、膵臓トリプシンインヒビターおよびトラシロールを含む。リポソームは、Ｗ／Ｏ／Ｗ型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）ＣＧＦエマルジョンと、従来のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎら、（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、７：２７参照）とを含む。あるタンパク質が適切に保護されるとき、該タンパク質は、例えば、不活性化希釈液または同化可能な可食性担体とともに経口投与される場合がある。前記タンパク質と他の含有成分とは、硬質または軟質のゼラチン製の殻でできたカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、被検者（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）の食事に直接取り込まれるかの場合がある。
【００４８】
本発明の治療用組成物が注射（すなわち皮内注射）によって投与されるべき場合には、該組成物が流動性を有し、注射が容易なように、前記高純度のタンパク質は医薬品として受容可能なｐＨ（すなわち、約４−９のｐＨ範囲）の水溶液中で溶けることが好ましい。前記組成物は医薬品として受容可能な担体も含むことが好ましい。ここで用いられるところの「医薬品として受容可能な担体」とは、賦形剤、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、有毒物質（ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇｅｎｔｓ）、緩衝剤、吸収遅延または促進剤、界面活性剤およびミセル形成剤、脂質、リポソームおよび液体複合体形成剤（ｌｉｑｕｉｄ ｃｏｍｌｅｘ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）安定化剤等のうちいずれかおよびすべてを含む。医薬品として活性がある物質についてのかかる媒体および試薬の使用は、当業者に知られている。いずれかの従来の媒体または試薬が前記活性化合物と不適合である場合を除いて、医薬品組成物中でのこれらの使用が意図される。補助的な活性化合物も前記組成物に取り込まれる場合がある。
【００４９】
本発明の治療用組成物は、必要に応じてろ過滅菌後に、上記の成分の１つまたは組み合わせとともに、適当な送達手段（ｖｅｈｉｃｌｅ）中に必要量の活性化合物（すなわち、すでに説明した１種類または２種類以上の高度に精製単離されたタンパク質）を取り込むことによって調製される滅菌水溶液の形態で処方される場合がある。好ましい医薬品として受容できる担体は、滅菌水、リン酸ナトリウム、マニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムまたはこれらのいずれかの組み合わせのような少なくとも１種類の賦形剤を含む。医薬品として受容可能な他の適当な担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）と、これらの適当な混合物と、植物油とを含む、溶媒または分散媒体を含む。適当な流動性は、例えば、レシチンのコーティングの使用と、分散の場合に必要な粒径の維持と、界面活性剤の使用とによって、維持される場合がある。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等のようなさまざまな抗細菌および抗真菌剤によって達成できる。注射可能な組成物の吸収の遅延は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延する試薬を前記組成物中に含むことによって実現できる。
【００５０】
本発明の治療用組成物は、無菌で、かつ、製造、貯蔵、配達および使用の条件下で安定であるべきであって、細菌および真菌のような望ましくない微生物の汚染する作用から保護されるべきである。本発明の治療用組成物の保全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を維持する（すなわち、汚染を防止する、貯蔵寿命を延ばす等）ように前記組成物を製造する好ましい手段は、滅菌水のような医薬品として受容可能な担体中で前記組成物が使用直前に再構成される凍結乾燥粉末の形状で、タンパク質と、医薬品として受容可能な担体との処方を調製することである。滅菌注射用液の調製のための無菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、前記活性成分と、以前にろ過滅菌された溶液由来のいずれかの追加の所望の成分との粉末が得られる、真空乾燥、凍結乾燥または遠心乾燥法である。本発明の治療用組成物の具体的な処方は、以下および実施例に説明される。
【００５１】
多くの場合では、本発明の治療用組成物は１種類または２種類以上の単離タンパク質を含む。ヒトへの医薬品としての投与に適する多タンパク質処方を含む治療用組成物は、複数の活性タンパク質を投与するうえで望ましい。前記多タンパク質処方は、特定のアミノ酸配列を有する少なくとも２種類または３種類以上の単離タンパク質を含む。多タンパク質処方を調製するときの特別な考慮事項は、前記処方中の全てのタンパク質の生理学的に受容可能なｐＨの水溶液中での溶解度および安定性を維持することを含む。これは、前記多タンパク質処方中の全てのタンパク質と適合可能な１種類または２種類以上の生理学的に受容可能な溶媒および賦形剤を選択することを要する。例えば、適当な賦形剤は、滅菌水か、マニトールか、リン酸ナトリウムか、リン酸ナトリウムおよびマニトールの両方かを含む。多タンパク質処方における追加の考慮事項は、必要な場合には、前記タンパク質の２量体化を阻止することである。ＥＤＴＡその他の当業者に知られた２量体化を阻止することが知られた物質または手順のような２量体化を阻止する試薬が前記多タンパク質処方に含まれる場合がある。
【００５２】
以下に本発明による好ましい医薬品組成物が提供される。
【００５３】
ＧＮＭＴ： ０．７５ｍｇタンパク質
バッファー： 生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）
膨潤剤： グリセリン
安定化剤： リン脂質（０．１％）
【００５４】
１００ｍＭリン酸が代替的なバッファーとして使用されてもよい。代替的な膨潤剤はマニトールおよびデキストロースである。
【００５５】
被検者（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）への上記の治療用組成物の投与は、該被検者の発がんの予防または治療に有効な投与量または期間で既知の手順を用いて実施される場合がある。
【００５６】
本発明の治療用組成物の有効量は、被検者の年齢、性別および体重のような因子によって変動する。本発明の治療用組成物は、経口投与、注射（皮下、静脈内等）、舌下、吸気、経皮適用、直腸投与または治療剤の投与のいずれかの他の一般的な経路によって投与される場合がある。１種類または２種類以上の本発明の治療用組成物の治療上の有効量を被検者に同時に、あるいは、逐次的に投与することが望ましい場合がある。同時または逐次的な投与のためのかかる組成物のそれぞれは、たった１種類のタンパク質しか含まない場合もあれば、上記の多タンパク質処方を含む場合もある。
【００５７】
本発明の１種類または２種類以上の組成物の非経口投与には、投与ユニットあたり好ましくは０．０１μｇ−５００ｍｇ、より好ましくは０．３μｇ−５０ｍｇの各活性成分（タンパク質）が投与される場合がある。本発明の１種類または２種類以上の組成物の経口投与の場合には、投与ユニットあたり、好ましくは０．０１μｇ−５００ｍｇ、より好ましくは０．３μｇ−５０ｍｇの各活性成分（タンパク質）が投与される場合がある。投与が容易で投与量が均一になるため、投与剤形のユニットごとに非経口組成物または経口組成物を処方することは特に有利である。ここで用いられるところの投与剤形のユニットとは、治療されるべきヒトの被検者のために単一投与量として適する物理的に分離されたユニットをいい、各ユニットは、所望の医薬品担体と協働して所望の治療効果を奏するように計算された活性タンパク質の予め定められた量を含む。本発明の新規な投与剤形のユニットの明細は、（ａ）活性化合物の独特な特徴と、達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）ヒトの被検者の治療のためにかかる活性化合物を調合する技術に固有の限界とに左右され、直接依存する。
【００５８】
投与の処方計画は、最適な治療反応を提供するために調整される場合がある。例えば、複数の分割された投与量が数日間、数週間、数ヶ月間または数年間にわたって投与される場合があり、あるいは、前記投与量が治療状況の緊急性に比例して、それぞれの次回の注射で増減される場合がある。１つの好ましい治療処方計画では、治療用組成物の皮内注射が毎週１回、１ないし３週間行われる。投与量は、投与するたびに一定である場合もあれば、それぞれの次の投与で増減される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
本発明は以下の限定ではない実施例によって例示される。
【実施例１】
【００６０】
実施例１（試験管内試験）
１．材料および方法
１．１ 細胞株および細胞培養
２種類のＨＣＣ株細胞Ｈｕｈ７（１３）およびＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨ（１４）と、１種類のヒト肝芽細胞腫株細胞ＨｅｐＧ２（１５）とが本研究に用いられた。細胞は、１０％熱不動化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、ユタ州、Ｌｏｇａｎ）と、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、不必須アミノ酸（０．１ｍＭ）、ファンギゾン(２．５ｍｇ／ｍＬ)およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、ニューヨーク州、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）で、５％ＣＯ２存在下加湿インキュベータ内で培養された。
【００６１】
１．２ ｐＧＮＭＴ、ｐＧＮＭＴ−アンチセンスおよびｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ ｓｈｏｒｔプラスミドの構築
ＣＭＶプロモーターとＧＮＭＴのｃＤＮＡ断片とを含むプラスミドｐＧＮＭＴを構築するために、我々は、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５（Ｋｏｄａｋ、ニューヨーク州、ロチェスター）をベクターとして、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＧＮＭＴ−９−１−２プラスミド（８）をインサート作成用のＰＣＲの鋳型として用いた。前記ＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列と、両端の制限エンドヌクレアーゼ部位とを含む０．９ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。２ｍＭ ＭｇＣｌ２および１５０ｎｍ プライマーという２つの点を除いて、全てのＰＣＲ条件は製造者（パーキン・エルマー、コネチカット州、Ｎｏｒｗａｌｋ）によって推薦されたものであった。２０回の増幅サイクルが、パーキン・エルマーのＡｍｐｌｉｔａｑゴールドＴａｑＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡサーマルサイクラーとを用いて実行された。各ＰＣＲサイクルは、６０°Ｃ３０秒間のプライマーアニーリングのステップと、７２°Ｃ３０秒間のＤＮＡ伸長のステップとを含んでいた。上流プライマー（５’−ｇｃｇｇａａｔｔｃＡＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣ−３’）は、３ｂｐ「クランプ」（ｇｃｇ）を５’末端に有し、１つの制限エンドヌクレアーゼ部位（ＥｃｏＲＩ）およびＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列とがこれに続いた。下流プライマー（５’−ｇｃｇｇａａｔｔｃＧＴＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＣ−３’）は、前記上流のプライマーと類似の構造的モチーフを含むが、前記ＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列の終結領域のネガティブ鎖配列を含んでいた。増幅直後に、ＰＣＲ反応液にＳＤＳ（０．１％）とＥＤＴＡ（５ｍＭ）とが添加された。ＤＮＡは２．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび７０％エタノールで沈殿された。ＥｃｏＲＩでの消化後、ＤＮＡ断片はアガロースゲルからの溶出によって単離ｓれ、ＥｃｏＲＩ消化されたｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５と連結された。
【００６２】
ファージミドのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＧＮＭＴ−９−１−２（８）から１３６ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するための２本のプライマー（Ｆ１、５’−ｇｃｇｇａａｔｔｃＡＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣ−３およびＲ１、５’−ｇｃｇｇａａｔｔｃＴＧＴＡＣＴＣＧＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣ−３’）がアンチセンス−ＧＮＭＴプラスミド（ｐＧＮＭＴ−アンチセンス）を構築するために用いられた。前記断片は、前記ＧＮＭＴの翻訳開始部位と、両端の２つの制限酵素部位（ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ）にわたるアンチセンス配列を含んでいた。クローニングの手順はｐＧＮＭＴについて説明したものと類似していた。ＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列組換えタンパク質（ＲＰ）を大腸菌で発現させるために、我々は、プラスミドｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ−ｓｈｏｒｔを構築した。ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩ制限酵素（ストラタジーン、カリフォルニア州、ラホヤ）を用いて大きなＳ−タグＤＮＡ断片がｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ（９）から切り出され、得られたプラスミドＤＮＡはＫｌｅｎｏｗ反応の後、再連結された。プラスミドＤＮＡ配列は、ダイターミネータサイクルシーケンシングコアキットを備えたＤＮＡシーケンサー（アプライド・バイオシステムズモデル３７３Ａ、バージョン１．０．２、カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）で確認された。
【００６３】
１．３ ＧＮＭＴ組換えタンパク質の発現および精製
ｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ−ｓｈｏｒｔが大腸菌ＢＬ２１菌株を形質転換するのに用いられ、ＩＰＴＧ誘導（誘導時間３時間、細菌の培養最適密度［ＯＤ］０．６−０．７）に用いられた。ＧＮＭＴの組換えタンパク質の精製は、製造者（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州、マジソン）のガイドラインに従って、Ｎｉ２＋が荷電したヒスチジン結合樹脂カラムを用いて実施された。組換えタンパク質の濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアース、イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）で測定され、純度はサンプルを１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド ミニゲル（バイオラッドラボラトリーズ、カリフォルニア州、リッチモンド）上で泳動することによってテストされた。
【００６４】
１．４ トランスフェクション
全てのプラスミドＤＮＡサンプルは、Ｑｉａｇｅｎメガキット（ドイツ、Ｈｉｌｄｅｎ）を用いて調製された。標準的なリン酸カルシウム共沈殿法（１６）がさまざまな肝がん細胞株由来の培養細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクションするのに用いられた。トランスフェクション後４８時間の細胞は、ＤＭＳＯ（ナカライテスク、大阪）に溶解したＢａＰ（シグマーアルドリッチ、ドイツ、シュタインハイム）の異なる濃度（１ないし１０μＭ）で１６時間処理された。処理細胞は、ＩＦＡか３２Ｐポストラベリングかのいずれかに供された。陰性対照を作るために、０．１％ ＤＭＳＯが前記細胞培養に添加された。
【００６５】
１．５ ＧＮＭＴを発現する安定なクローンの確立
リン酸カルシウム法を用いて、ＨｅｐＧ２細胞が、プラスミドＤＮＡのｐＧＮＭＴとｐＴＨ−Ｈｙｇ（クロンテク、カリフォルニア州、パロアルト）とでコ・トランスフェクションされた。細胞は、ハイグロマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含む選択培地に置かれた（１７）。１３個以上のクローンが選択され、ＧＮＭＴ発現が、各クローンから回収された細胞溶解液を用いてウェスタンブロットアッセイ法で解析された。これらのうちＳＣＧ２ １−１および１−１１は、そのＧＮＭＴ発現レベルに基づいて、さらに研究するために選択された。プラスミドｐＦＬＡＦ−ＣＭＶ−５およびｐＴＫ−ＨｙｇでトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞から選択された安定なクローンである、ＳＣＧ２−ｎｅｇも本研究における対照として用いられた。
【００６６】
１．６ 間接免疫蛍光抗体法（ＩＦＡ）
培養ＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨまたはＨｕｈ７細胞は、カバースライド上に配置され、１０μＭＢａＰまたは０．１％ＤＭＳＯで処理され、固定液Ｉ（ＰＢＳ中に、４％ パラホルムアルデヒド、４００ｍＭ ショ糖）で３７°Ｃ３０分間固定され、固定液ＩＩ（固定液Ｉに０．５％ トリトンＸ−１００を添加）で室温１５分間固定され、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中に０．５％ ＢＳＡ）で室温１時間処理された。ＰＢＳで洗浄後、前記スライドはさまざまな１次抗体と４°Ｃ終夜反応させられた。２種類の抗体は、１：５００希釈の抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｋｏｄａｋ、ニューヨーク州、ロチェスター）と、１：２００希釈のウサギ抗ＧＮＭＴ抗血清Ｒ４（１２）とであった。ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧと、ＴＲＩＴＣコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（シグマ−アルドリッチ）とが２次抗体として用いられた。ＰＢＳで４回洗浄後、スライドはマウントされ、共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ−ＮＴ、ドイツ、Ｈｉｌｄｅｎ）を用いて観察された。細胞各を局在化させるために、ＤＮＡがヘキストＨ３３２５８（シグマ−アルドリッチ）で染色された。
【００６７】
１．７ ＧＮＭＴｃＤＮＡを含むアデノウイルス（Ａｄ−ＧＮＭＴ）の作成
ＣＭＶプロモーターで制御されるＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列の組換えアデノウイルスを構築するために、ＰＧＥＸ−ＧＮＭＴ（９）がＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化され、ＸｈｏＩ部位は平滑化された後、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化され、ＸｂａＩ部位が平滑化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ （−）（ストラタジーン）に挿入された。ＧＮＭＴｃＤＮＡも、ｐＸＣＭＶ−ＧＮＭＴを作成するために、ｐＡｄＥ１ＣＭＶ／ｐＡ（１８）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ部位にクローン化された。組換えアデノウイルスは、ｐＸＣＭＶ−ＧＮＭＴおよびｐＪＭ１７（１８）の２９３細胞へのコ・トランスフェクション後７ないし１２日以内に出現した。個別のウイルスクローンが単離され、アデノウイルス配列に特異的なプライマーセット（１８）、挿入フランキング領域（１８）およびＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列（８）によるＰＣＲを用いて同定された。ウイルスのタイターは上記のプラークアッセイ法（１８）によって決定された。
【００６８】
１．８ ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体を定量するための３２Ｐポストラベリングおよび５次元薄層クロマトグラフィ（５Ｄ−ＴＬＣ）
ｐＧＮＭＴプラスミドＤＮＡで４８時間一時的にトランスフェクションされたＳＣＧ２細胞およびＨＣＣ細胞株が用いられた。ＤＮＡは、１０μＭＢａＰまたは０．１％ＤＭＳＯ（対照）で１６時間処理された細胞から抽出され、コハク酸バッファー（２０ｍＭ コハク酸ナトリウムおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２）中のミクロコッカスエンドヌクレアーゼおよび膵臓ホスホジエステラーゼで３時間３７°Ｃで消化された。得られた３’ヌクレオチドはブタノール溶液でさらに２回抽出され、ラベリングバッファー中でＴ４キナーゼを用いて３８°Ｃ３０分間γ−３２Ｐ−ＡＴＰで標識された。５Ｄ−ＴＬＣが標識ＤＮＡ付加体を解明するために用いられた（２０）。付加体相対レベル（ＲＡＬ）は、付加体ヌクレオチド中のｃｐｍ／全ヌクレオチド中のｃｐｍ ｘ 希釈倍率として計算された。
【００６９】
１．９ アリル炭化水素ヒドロキシラーゼ（ＡＨＨ）アッセイ
シトクロムｐ４５０Ａ１酵素活性を測定するために、約１００μｇの細胞ホモジネートが反応液（1００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．４ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および２０μＭ ＢａＰ）と３７°Ｃ１０分間インキュベーションされた。上清のタンパク質濃度はバイオラッドのタンパク質アッセイキット（カリフォルニア州、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を用いて決定された。反応はアセトンの添加によって停止され、抽出がヘキサンおよび１Ｎ ＮａＯＨで実施された。ＮａＯＨ分画が、励起波長３９６ｎｍ、発光波長５２２ｎｍの蛍光分光光度計（日立、Ｆ４５００）で測定された。反応産物（３ヒドロキシ−ＢａＰ）の濃度は、標準試料との比較により計算され、手順の詳細は文献（２１）に説明されている。
【００７０】
１．１０ ウェスタンブロット（ＷＢ）アッセイ
ＷＢはトランスフェクションされた細胞またはＳＣＧ２クローン中のＧＮＭＴを検出するために用いられた。抗ＧＮＭＴモノクローナル抗体１４−１がＧＮＭＴを検出するのに用いられた（９）。ＷＢの手順の詳細は文献（２２）に説明されている。
【００７１】
１．１１ ラマルク型遺伝アルゴリズム（ＬＧＡ）によるドッキング
ＬＧＡが、ＢａＰと、さまざまな型のＧＮＭＴとの間の相互作用を解明するために用いられた。Ａｕｔｏｄｏｃｋ３．０ソフトウェアが最も有利なリガンド結合相互作用を同定するために用いられた。ファンデルワールス力結合と、疎水結合（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎｓ）と、静電気およびねじり自由エネルギーとが、リガンド−タンパク質結合の自由エネルギーを再現するために経験的に決定された（２３）。ヒトＧＮＭＴとのアミノ酸配列の相同性が９１％であることから、ラットＧＮＭＴのＸ線結晶学的なデータがドッキングに用いられた（２４、２５）。ＢａＰと、メチルトランスフェラーゼ−１ＶＩＤ（２６）、１ＨＭＹ（２７）、２ＡＤＭ（２８）、１ ＤＣＴ（２９）、１ ＢＯＯ（３０）、２ＤＰＭ（３１）１ＥＧ２（３２）および１Ｇ５５（３３）との間の相互作用が解析された。パラメータは以下のとおり。試行回数 １０回、ポピュレーションサイズ ５０、試行−終止基準 最大２７，０００世代または２．５ ｘ １０５回のエネルギー評価のいずれかが先に達成されること。ｒｍｓｄコンフォメーションクラスタリング許容値の０．５オングストロームが前記リガンドの結晶学的座標値から計算された。手順の詳細は文献（３４）に利用可能である。
【００７２】
１．１２ ＧＮＭＴ酵素活性アッセイ
Ｎｉ２＋−荷電ヒスチジン結合樹脂カラムから精製されたＧＮＭＴ組換えタンパク質が酵素活性アッセイに用いられた。ＧＮＭＴ組換えタンパク質（１０ｍｇ）が、１０、５０または１００μＭのＢａＰまたはＤＭＳＯ溶媒（対照）と室温で６０分間混合された後、５０ｍＭ グリシン、０．２３ｍＭ ＳＡＭおよび２．１６μＭ Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］−メチオニン（７６．４Ｃｉ／ミリモル）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）の１００μＬで処理された。３０分間３７°Ｃでのインキュベーション後、個々の反応は１０％ トリクロロ酢酸および５％ 活性炭（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈａｒｃｏａｌ）の５０μＬ混合物を添加することにより停止された。各反応は３重に繰り返して実施された。この手順はＣｏｏｋおよびＷａｇｎｅｒ（３５）に詳細に説明されている。
【００７３】
２．結果
２．１ ＧＮＭＴの核内移行がＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨおよびＨｕｈ７細胞の両方でＢａＰにより誘導された。
ＧＮＭＴは、ｐＧＮＭＴのＤＮＡでトランスフェクション後４８時間のＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨ細胞の細胞質中で発現された（ウサギ抗ＧＮＭＴ抗血清およびマウス抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体とのＩＦＡ２重染色、図１Ａおよび１Ｂ）。同様の結果はＤＭＳＯ溶媒で処理された対照のＨｕｈ７細胞でも認められた（図１ＣおよびＤ）。これに対して、ＧＮＭＴタンパクは１０μＭ ＢａＰで１６時間処理されたＨｕｈ７細胞の核内移行は部分的にしか起こらなかった（図１ＥおよびＦ）。細胞核を局在化させるために、ＤＮＡはヘキストＨ３３２５８で染色された（図１ＤおよびＦ）。
【００７４】
２．２ ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成に対するＧＮＭＴの阻害効果
３２Ｐ−ポストラベリング法および５Ｄ−ＴＬＣ法がＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成を定量するのに用いられた。１０Ｍ ＢａＰとの１６時間の処理後、ｐＧＮＭＴでトランスフェクションされたＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７およびＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨ細胞でのＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成は、ベクタープラスミドでトランスフェクションされた細胞と比較して、それぞれ５２．８％、１３．５％および２０．７％減少した（表１）。ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成に対するＧＮＭＴの阻害効果はＨｅｐＧ２細胞で最も強力であったので、我々はこの株細胞を以下の実験での標的として用いた。ＨｅｐＧ２細胞のＤＮＡトランスフェクション効率は約３０％であった。ｐＧＮＭＴに加えて、アンチセンスＧＮＭＴ配列を含むプラスミドが、ＧＮＭＴの効果の特異性を確認する目的で構築された。ＢａＰ処理後、ベクターの対照プラスミドでトランスフェクションされた細胞と比較して、ｐＧＮＭＴでトランスフェクションされた細胞で形成されたＢＰＤＥ付加体は、３４．１％の減少が認められた（図８Ａ、レーン３および４）。これに対し、ＢＰＤＥ付加体の２９．２％の増加がｐＧＮＭＴアンチセンスでトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞で認められた（レーン５）。等量（２０μｇ）のｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ−およびｐＧＮＭＴアンチセンスでトランスフェクションされた細胞で形成されたＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体の量は、前記ベクターの対照細胞で形成された量とほぼ等しかった（レーン６）。異なるトランスフェクション実験でのＧＮＭＴ発現と、アンチセンスＧＮＭＴｃＤＮＡプラスミドコンストラクト（ｐＧＮＭＴアンチセンス）の効果とは、マウス抗ＧＮＭＴモノクローナル抗体をもＷＢアッセイによって確認された。図２Ｂのレーン４に示されるとおり、ＧＮＭＴは、ｐＧＮＭＴとｐＧＮＭＴアンチセンスとを等量トランスフェクションされた細胞の溶解液では検出されなかった。
【００７５】
【表２】
【００７６】
＊：ヌクレオチド１０８個あたりの付加体相対レベル（ＲＡＬ）、γ−３２Ｐ−ＡＴＰポストラベリング法によって測定。
＊＊：トランスフェクション効率は、ＨｅｐＧ２が３０％、Ｈｕｈ７が４５％、ＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨが６０％であった。
【００７７】
ｐＧＮＭＴをトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞由来の２個の安定クローン（ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−１−１１）が、上記と同じ実験に用いられた。ノザンブロットアッセイの結果は、ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−１−１１細胞に存在するＧＮＭＴのｃＤＮＡの（細胞あたりの）コピー数がそれぞれ３および１であることを示した（データ示さず）。ウェスタンブロットアッセイの結果は、ＳＣＧ２−１−１細胞中のＧＮＭＴ発現レベルがＳＣＧ２−１−１１細胞での発現レベルのほぼ３倍であることを示した（図２Ｄ、レーン２および３）。ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−１−１１細胞を１または１０μＭのＢａＰで処理した後、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の阻害は、両方の処理条件下でのＧＮＭＴ発現レベルに比例した（図２Ｃ）。
【００７８】
同じ実験がアデノウイルスで伝達されるＧＮＭＴのｃＤＮＡ（Ａｄ−ＧＮＭＴ）を用いて実施された。正の直線的相関が、Ａｄ−ＧＮＭＴのＭＯＩｓと、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の阻害との間に認められた（図３）。Ａｄ−ＧＦＰを感染した対照細胞と比較すると、Ａｄ−ＧＮＭＴのＭＯＩｓが１００から、２５０に、そして１，０００に増加すると、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成は１９．５％、３６．６％および６１．８％にそれぞれ減少した（図３Ａ）。１００ＭＯＩｓのＡｄ−ＧＦＰの対照と、１００、２５０および１，０００ＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴとで感染されたＨｅｐＧ２細胞のＧＮＭＴの発現レベルがウェスタンブロット法で解析され、結果が図３Ｂ、レーン１−４に示される。
【００７９】
２．３ Ｂａｐによって誘導されるＣＹＰ１Ａ１酵素活性に対するＧＮＭＴの効果
ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−ｎｅｇ細胞は、さまざまな濃度のＢａＰで１６時間処理された後、ＡＨＨアッセイを用いて細胞のＣＹＰ１Ａ１酵素活性が測定された。３、６および９μＭのＢａＰで処理された細胞でのＣＹＰ１Ａ１活性は、ＳＣＧ２−ｎｅｇ細胞についてはそれぞれ２４．５ピコモル／ｍｇ／分、４１．５ピコモル／ｍｇ／分および７１．３ピコモル／ｍｇ／分で、ＳＣＧ２−１−１細胞についてはそれぞれ２０．１ピコモル／ｍｇ／分、２７．７ピコモル／ｍｇ／分および３６．２ピコモル／ｍｇ／分であった（図４）。９μＭのＢａＰで処理された細胞については、これは、ＧＮＭＴ発現細胞（すなわちＳＣＧ２−１−１）でのＣＹＰ１Ａ１酵素活性が、ＳＣＧ２−ｎｅｇ細胞と比較して４５％減少したことを表す。
【００８０】
２．４ ＧＮＭＴ−ＢａＰ相互作用のモデル作成
ＬＧＡが物理的なＧＮＭＴ−ＢａＰ相互作用を予測するために用いられた。ここでも、ヒトＧＮＭＴタンパク質との相同性が９１％であるため、ラットのＧＮＭＴ−ＢａＰ相互作用のＸ線結晶解析データがＢａＰとのドッキング実験に用いられた。図５Ａおよび５Ｂに示すとおり、ＢａＰはＧＮＭＴの２量体型（黄色）と４量体型（シアン色）との両方に結合するが、２量体型（タンパク質データベースＰＤＢコード；１Ｄ２Ｃ）と優先的に結合することを我々はみつけた。このクラスターは、ＳＡＭおよびＳＡＨ結合部位が交差する場所にあたる（表３および図５Ｂ）。ＧＮＭＴの２量体型とＢａＰとの間の結合エネルギーが低い（−９．１０Ｋｃａｌ／モル）ことは、ＢａＰがＳＡＭの位置を変位させることを示唆し、ＢａＰと、ＳＡＭと既に結合しているＧＮＭＴ（ＰＤＢコード：１ＸＶＡ）との結合エネルギーが高い（２５４．９Ｋｃａｌ／モル）ことは、ＢａＰおよびＳＡＭがＧＮＭＴとの結合について競合していることを示唆する（表３）。したがって、（２量体の一方のサブユニットのＴｈｒ３７、Ｇｌｙ１３７およびＨｉｓ１４２と、他方のサブユニットのＧｌｕ１５とを含む）複数のＧＮＭＴアミノ酸残基が、ＢａＰと非常に近接している（図５Ｃ）。
【００８１】
表３ ＧＮＭＴタンパク質とＢａＰ分子とのラマルク型遺伝アルゴリズムによるドッキング
【００８２】
【表３】
【００８３】
ａ：ＰＤＢ、タンパク質データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）
ｂ：クラスターはＳＡＭおよびＳＡＨ結合領域の交差する場所にあたる。
ｃ：ＢａｄはＳＡＭから〜２オングストロームで、エネルギーレベルが高いことは、かかる複合体の形成は困難であることを示唆する。
ｄ：ＢａＰはＳＡＭの１を変位させる。
ｅ：ＲＭＳＤ＝２．７０オングストローム 第２のクラスター（ｎ＝５）は、ＲＭＳＤが０．６８オングストロームで、平均エネルギーが−８．８０Ｋｃａｌ／モルの既知の結晶構造に対応する。第２のクラスターを安定化させる役割を果たすかもしれない酢酸基が近傍に位置することに留意せよ。
【００８４】
２．４ ＢａＰで誘導されるＧＮＭＴ酵素活性の阻害
ＢａＰがＧＮＭＴと結合可能であるという推論に基づいて、ＧＮＭＴ酵素活性に対するＢａＰの効果の可能性が、Ｈｉｓタグ付きのＧＮＭＴ組換えタンパク質を大腸菌で発現するためのプラスミドｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ−ｓｈｏｒｔを構築することによって研究された。Ｎｉ２＋荷電したヒスチジン結合樹脂カラムから精製されたＧＮＭＴ組換えタンパク質が我々の解析に用いられた。図６に示されるとおり、１０および５０μＭのＢａＰを含む反応からのＧＮＭＴ酵素活性は、ＤＭＳＯの対照と比較して、それぞれ４４％および６２％減少した。
【００８５】
ＩＦＡが、ＧＮＭＴの核内移行を誘導するＢａＰの能力を実証する。我々の結果は、ＧＮＭＴがＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成を阻害するだけでなく、ＣＹＰ１Ａ１酵素活性を下向き調節することを示し、逆に、ＢａＰはＧＮＭＴ酵素活性も阻害する。最後に、我々は、ＢａＰ−ＧＮＭＴ相互作用の正確な場所を示すためにドッキング実験を用いた。これらの結果は、損傷の生じる可能性がある型の曝露に対する細胞の防御機構が新たに見つかったことを意味する。我々は、終始一貫した結果によって、一時的トランスフェクション、安定的なトランスフェクションおよびアデノウイルス感染の系で、ＧＮＭＴによるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の阻害を確認した。ＧＮＭＴのｃＤＮＡのアンチセンスコンストラクトが相互作用の特異性を示すために用いられ（図２Ａ）、ウェスタンブロットアッセイがさまざまな遺伝子導入実験のセットにおけるＧＮＭＴ発現レベルを監視するために用いられた。ＧＮＭＴのＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の用量依存的な阻害効果は、ＨｅｐＧ２の安定なクローンと、ＧＮＭＴｃＤＮＡを伝達する組換えアデノウイルスとでさらに調べられた（図２Ｃおよび３Ａ）。
【００８６】
多くのＰＡＨｓはアリル炭化水素レセプター（ＡｈＲ）依存経路を通じてシトクロムＰ−４５０発現を誘導する（３７）。細胞内に拡散した後、ＢａＰはＡｈＲと結合して核内に移行し、核内で、ＢａＰ−ＡｈＲヘテロ２量体がＡｈＲ核内移行タンパク質（Ａｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ（Ａｒｎｔ））との複合体を形成する（２）。ＢａＰ−ＡｈＲ−Ａｒｎｔ複合体は、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子を、プロモーター領域内の生体異物応答エレメント（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）との相互作用を通じて転写を活性化する（３８）。ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の阻害に加えて、我々の結果は、ＧＮＭＴがＢａＰによって誘導されたＣＹＰ１Ａ１酵素活性を低下させることができることを示す（図４）。Ｆｏｕｓｓａｔら（３９）は、ＧＮＭＴがＣＹＰ１Ａ１遺伝子の転写活性化因子ではないことを証明するためにＡｈＲ欠損トランスジェニックマウスを用いた。我々のリアルタイムＰＣＲ解析の予備的なデータは、ＢａＰ処理後、ＳＣＧ２−１−１細胞でのＣＹＰ１Ａ１遺伝子発現は、ＨｅｐＧ２細胞と比較して約２０％減少したことを示した（投稿準備中）。
【００８７】
従前の研究は、ラットＧＮＭＴの４量体型が酵素として作用し、ラットＧＮＭＴの２量体型はＰＡＨｓと結合できることを示した（４０）。本発明では、ＬＧＡおよびスコアリング機能が、結合に関連する自由エネルギーの変化を推定して、ＢａＰとさまざまな型のＧＮＭＴとの間の相互作用の可能性がある部位を特定するために用いられ、ラットＧＮＭＴについてのＸ線結晶学的なデータがこの目的のために利用された。結果は、（ａ）ＢａＰ結合ドメインはＧＮＭＴの基質（ＳＡＭ）結合部位に位置し、（ｂ）ＢａＰはＧＮＭＴの２量体型との結合を優先することを示す。ＧＮＭＴ４量体のＲ１７５Ｋ突然変異型（ＰＤＢコード；１Ｄ２Ｇ）が、Ｒ／Ｋ残基は前記結合部位に近い（前記ＳＡＭ部位から−５オングストローム）が、Ｒ／Ｋ残基はＧＮＭＴ−ＢａＰクラスター形成には実質的になんら効果がないことを示すために用いられた（表３）。これに対し、酢酸イオンが存在すると、１ＸＶＡ結晶構造内のＧＮＭＴ−ＳＡＭ結合部位に第２の好ましいクラスターの形成が促進される（表３、最終行）。さまざまな検索システムのうちでＬＧＡ法は、結晶構造を特定する可能性が最も高い（２３）。ポピュレーションの多いクラスターは、結晶構造から０．２−０．８オングストロームのＲＭＳの相違を示す結晶学的に決定された位置に対応する。たいていのリガンドについて、我々のドッキングシミュレーションは、１．０オングストロームのＲＭＳＤ以内で結晶学的な結合モードに適合する単一の結合モードを予測した（２３）。ＬＧＡは、リガンドが高分子の標的に結合したコンホメーションを予測するための信頼できる方法であることが示される。ＢａＰ−ＧＮＭＴの相互作用は、ＧＮＭＴ酵素活性がＢａＰの存在下で５０％近く減少したことを示す機能的なアッセイによっても確認された（図６）。
【００８８】
ＢａＰはＧＮＭＴのＳＡＭ結合ドメインとの結合を優先するため、ＬＧＡがＢａＰと、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、ＨｈａＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＴａｑＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＨａｅＩＩＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＰｖｕＩＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＤｐｎＩＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＲｓｒＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼおよびＤＮＭＴ２という、８種類の他のＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅｓ）との間の相互作用を研究するために用いられた。我々の結果は、ＢａＰがＨｈａＩ−、ＨａｅＩＩＩ−、ＰｖｕＩＩ−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼおよびＤＮＭＴ２とは結合可能だか、ＣＯＭＴ、ＴａｑＩ−メチルトランスフェラーゼ、ＤｐｎＩＩ−メチルトランスフェラーゼおよびＲｓｒＩ−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼとは結合しなかったことを示す（表４）。ＢａＰが優先的に結合する全てのＤＮＡメチルトランスフェラーゼの標的原子はシトシンであってアデニンでないことが知られている（４１）。これは、ＢａＰのような環境発がん物質が異なるＤＮＡメチルトランスフェラーゼと相互作用する可能性があることを示唆する最初の証拠である。ＧＮＭＴ酵素活性が全トランス−レチノイン酸によって誘導されると、ラット肝細胞でのＤＮＡメチル化が低下することを示す証拠（４２）に照らして、ＢａＰは、ＤＮＭＴおよびＧＮＭＴとの相互作用を通じて、ＤＮＡメチル化に影響を与えて、発がん経路に寄与するかもしれないことが示される。
【００８９】
表４ 複数のＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼとＢａＰ分子とのラマルク型遺伝アルゴリズムによるドッキングａ
【００９０】
【表４】
【００９１】
ａ：ＳＡＭ分子は１ＶＩＤ、１ＨＭＹ、２ＡＤＭおよび２ＤＰMメチルトランスフェラーゼの高分子からドッキング前に除去された。ＢａＰ分子が以前のＳＡＭの位置に移動することが試みられた。ＳＡＨ分子はドッキング前に１ＢＯＯおよび１Ｇ５５メチルトランスフェラーゼ高分子から除去された。
ｂ：ＰＤＢ：タンパク質データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）
ｃ：第２クラスターのエネルギー（ポピュレーション６／１０）は−０．３２Ｋｃａｌ／モルで、ＣＯＭＴはＢａＰと特定の好ましい位置で結合するのではない。
ｄ：第２のクラスター（ポピュレーション１／１０）のエネルギーは−６．４５Ｋｃａｌ／モルで、ＨｈａＩ−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼは特定にエネルギーの低い好ましい位置でＢａＰと結合した。
ｅ：結合エネルギーが高い（＋４７．１９Ｋｃａｌ／モル）は、ＴａｑＩ ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼがＢａＰとは結合しないことを示唆する。
ｆ：第２のクラスターのエネルギー（ポピュレーション１／１０）は−９．５０Ｋｃａｌ／モルで、エネルギーが最低のクラスター（ポピュレーション８／１０、エネルギー−９．６９Ｋｃａｌ／モル）に非常に近い。そこで、ＨａｅＩＩＩＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼはＢａＰと特定の好ましい位置で強く結合した。
ｇ：結合エネルギーが高いこと（−８．６９Ｋｃａｌ／モル）は、ＰｖｕＩＩがＢａＰと結合することを示唆する。他の２つの観察されたクラスター（−８．６３Ｋｃａｌ／モルおよび−８．５８Ｋｃａｌ／モル）の結合エネルギーは最低エネルギーのクラスターと非常に近かった。
ｈ：＋１３．４６Ｋｃａｌ／モルの結合エネルギーは、ＤｐｎＩＩ ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼはＢａＰとは結合しないことを示唆する。
ｉ：＋８５．６４Ｋｃａｌ／モルの結合エネルギーは、ＲｓｒＩ ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼはＢａＰとは結合しないことを示唆する。
ｊ：−８．７０Ｋｃａｌ／モルの結合エネルギーはＤＮＭＴ２がＢａＰと特定の好ましい位置で強く結合することを示唆する。
【００９２】
３．要約
グリシンＮメチルトランスフェラーゼは（ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）のＳ−アデノシルホモシスチンに対する比の調節と、（ｂ）葉酸との結合とによって遺伝的安定性に影響を与える。ＧＮＭＴの４Ｓ多環芳香族炭化水素結合タンパクとしての同定に基づいて、ｃＤＮＡトランスフェクションにおいてＧＮＭＴを一時的か安定的かのいずれかで発現する肝がん株細胞が、ベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）解毒経路におけるＧＮＭＴの役割を解析するために用いられた。間接免疫蛍光抗体アッセイからの結果は、ＧＮＭＴが、ＢａＰ処理の前は細胞質に発現し、ＢａＰ処理後に細胞核内に移行したことを示す。ベクタープラスミドでトランスフェクションした細胞と比較すると、ＧＮＭＴ発現細胞で形成されるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体の数は有意に減少した。さらに、ＧＮＭＴによるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の用量依存性阻害が、ＧＮＭＴのｃＤＮＡを伝達する異なるＭＯＩｓの組換えアデノウイルスを感染させたＨｅｐＧ２細胞において観察された。ＡＨＨ酵素活性アッセイによると、ＧＮＭＴはＢａＰで誘導されたＣＹＰ１Ａ１酵素活性を阻害した。ＧＮＭＴのＸ線結晶学的データとともにラマルク型遺伝アルゴリズムを用いるＢａＰの自動化ドッキングは、ＢａＰがＧＮＭＴの２量体型のＳＡＭ結合ドメインに優先的に結合することを解明したが、これは、損傷を与える可能性のある曝露に対する細胞防御の新規知見である。ＧＮＭＴに加えて、ドッキング実験の結果は、ＢａＰがＨｈａＩメチルトランスフェラーゼ、ＨａｅＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、ＰｖｕＩメチルトランスフェラーゼおよびヒトＤＮＭＴ２とを含む他のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅｓ）と容易に結合することを示した。したがって、ＢａＰ−ＤＮＭＴおよびＢａＰ−ＧＮＭＴの相互作用は発がんに寄与することが示された。
【実施例２】
【００９３】
実施例２ ＢａＰ結合と生体内での発がん予防
１．試験用ＧＮＭＴトランスジェニックマウスモデル
１．１ ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドの構築
ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドは、（肝臓および腎臓で特異的に発現するホスホエノルピルビン酸カルボキシキナーゼのプロモーター（ＰＥＰＣＫ、Ｖａｌｅｒａら、１９９４）を含む）ｐＰＥＰＣＫｅｘベクターと、（完全長ヒトＧＮＭＴのｃＤＮＡを含む）ｐＳＫ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドとを用いて調製された。両方のプラスミドはＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化された。インサートは前記ベクターに連結され、コンピテント細胞（ＪＭ１０９）に形質転換された。クローンはアンピシリンで選択され、ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドであることをチェックするためにＰＣＲでスクリーニングされた（図１）。
【００９４】
１．２ トランスジェニックマウスの作出
ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドが増幅され、ＡｓｃＩで消化されて線状（４．３ｋｂ）にされた。線状ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴ遺伝子は、ＦＶＢ系統のマウスの０．５日胚に、前核顕微注入法によって導入された。前記胚は仮親（ＩＣＲ系統）に移植された。１８〜２１日後、マウスは出産し、トランスジェニックマウスを調べるためにＰＣＲでスクリーニングされた。
【００９５】
１．３ トランスジェニックマウスの肝臓および腎臓におけるヒトＧＮＭＴの発現
ＰＥＰＣＫプロモーター特異的な発現臓器をチェックするために、我々はノザンブロット法（図２）およびウェスタンブロット法（図３）を用いた。ヒトＧＮＭＴは肝臓および腎臓に特異的に発現していた。トランスジェニックマウスでのＧＮＭＴ発現レベルは正常マウスより高かった。
【００９６】
１．４ ＧＮＭＴトランスジェニックマウスおよびＨＢＶラージＳトランスジェニックマウスへのＢａＰ処理
以下の２群のマウス
１．ＧＮＭＴトランスジェニックマウス
２．正常マウス
が体重７ｇあたり３７５μｇのＢａＰを１５日間毎日腹腔内注射で処理された。
【００９７】
図４は、ＢａＰ処理され、処理の７８週間後に屠殺された前記２群の肺の病理観察写真である。
【００９８】
２．結果と結論
ＢａＰ処理されたトランスジェニックマウスでＧＮＭＴが過剰発現されるとき、該マウスの３０％しか肺の腫瘍が発生しなかった。（ＧＮＭＴが過剰発現されない）ＢａＰ処理された正常マウスは６６．６６％の発症率で肺の腫瘍が発生した。したがって、ＧＮＭＴは生体内でＢａＰと結合でき、これにより、発がんを予防できる。
【００９９】
略語一覧
ＧＮＭＴ グリシンＮメチルトランスフェラーゼ
ＨＣＣ 肝細胞性癌
ＰＡＨ 多環芳香族炭化水素
ＢａＰ ベンゾ［ａ］ピレン
ＢＰＤＥ ＢａＰ−７，８−ジオール９，１０−エポキシド
ＭＯＩ 多重感染度
ＩＰＴＧ イソプロピルチオ−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
ＣＹＰ１Ａ１ シトクロムＰ４５０Ａ１
ＡｈＲ アリル炭化水素レセプター
Ａｒｎｔ Ａｈレセプター核移行タンパク質
ＸＲＥ 生体異物応答エレメント（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＡＨＨ アリル炭化水素ヒドロキシラーゼ
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＩＦＡ 間接蛍光抗体法アッセイ
ＬＧＡ ラマルク型遺伝アルゴリズム
ＰＤＢ タンパク質データバンク
Ｍｔａｓｅ（ｓ） メチルトランスフェラーゼ
ＤＮＭＴ２ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ２
ＲＡＬ 付加体相対レベル
【０１００】
文献
１．Ｆｉｓｃｈｍａｎ．Ｍ．Ｌ．、Ｃａｄｍａｎ、Ｅ．Ｃ．およびＤｅｓｍｏｎｄ、Ｓ．Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎ ＬａＤｏｕ Ｊ．編、Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｐ．ｐ．１８２−２０８．Ｐｒｅｔｉｎｃｅ−Ｈａｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．Ｃｏｎｎ．、ＵＳＡ、１９９０．
【０１０１】
２．Ｗｈｉｔｌｏｃｋ、Ｊ．Ｐ．Ｊｒ．、Ｏｋｉｎｏ、Ｓ．Ｔ．、Ｄｏｎｇ、Ｌ．、Ｋｏ、Ｈ．Ｐ．、Ｃｌａｒｋｅ−Ｋａｔｚｅｎｂｅｒｇ、Ｒ．、Ｍａ、Ｑ．およびＬｉ、Ｈ．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０ ５： Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０１Ａ１： ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１０： ８０９，８１８、１９９６．
【０１０２】
３．Ｆｏｌｄｅｓ、Ｒ．Ｌ．、Ｈｉｎｅｓ、Ｒ．Ｎ．、Ｈｏ、Ｋ．Ｌ．、Ｓｈｅｎ、Ｍ．Ｌ．、Ｎａｇｅｌ、Ｋ．Ｂ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．３−Ｍｅｔｈｙｌｃｈｌａｎｔｈｒｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０ｃ ｇｅｎｅ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２３９： １３７−１４６、１９８５．
【０１０３】
４．Ｒａｖａｌ、Ｐ．、Ｉｖｅｒｓｅｎ、Ｐ．Ｌ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０１Ａ１ ａｎｄ Ｐ４５０１Ａ２ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４１： １７１９−１７２３、１９９１．
【０１０４】
５．Ｗｉｊｎｈｏｖｅｎ．Ｓ．Ｗ．、Ｋｏｏｌ、Ｈ．Ｊ．、ｖａｎ Ｏｏｓｔｒｏｍ，Ｃ．Ｔ．、Ｂｅｅｍｓ、Ｒ．Ｂ．、Ｍｕｌｌｅｎｄｅｒｓ、Ｌ．Ｈ．、ｖａｎ Ｚｅｅｌａｎｄ、Ａ．Ａ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ、Ｇ．Ｔ．、Ｖｒｉｅｌｉｎｇ、Ｈ．およびｖａｎ Ｓｔｅｅｇ、Ｈ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｒｅｐａｉｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｏｃｋａｙｎｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６０： ５６８１−５６８７、２０００．
【０１０５】
６．Ｋｅｒｒ、Ｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２４７： ４２４８−４２５２、１９７２．
【０１０６】
７．Ｙｅｏ、Ｅ．Ｊ．およびＷａｇｎｅｒ、Ｃ．Ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａ ｍａｊｏｒ ｆｏｌａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１： ２１０−２１４、１９９４．
【０１０７】
８．Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．、Ｓｈｉｕ、Ｊ．Ｙ．、Ｔｚｅｎｇ、Ｓ．Ｊ．、Ｓｈｉｈ、Ｌ．Ｓ．、Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｊ．、Ｌｕｉ、Ｗ．Ｙ．およびＣｈｅｎ、Ｐ．Ｈ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７５： ７８７−７９３、１９９８．
【０１０８】
９．Ｌｉｕ、Ｈ．Ｈ．、Ｃｈｅｎ、Ｋ．Ｈ．、Ｌｕｉ、Ｗ．Ｙ．、Ｗｏｎｇ、Ｆ．Ｗ．およびＣｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｎｅｗｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．、１０： ８７−９７、２００３．
【０１０９】
１０．Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．、Ｃｈｅｎ、Ｌ．Ｙ．、Ｗｏｎｇ、Ｆ．Ｈ．、Ｌｅｅ、Ｃ．Ｍ．、Ｃｈａｎｇ、Ｔ．Ｊ．およびＹａｎｇ−Ｆｅｎｇ、Ｔ．Ｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６６：４３−４７、２０００．
【０１１０】
１１．Ｔｓｅｎｇ、Ｔ．Ｌ．、Ｓｈｉｈ、Ｙ．Ｐ．、Ｈｕａｎｇ、Ｙ．Ｃ．、Ｗａｎｇ、Ｃ．Ｋ．、Ｃｈｅｎ、Ｐ．Ｈ．、Ｃｈａｎｇ、Ｊ．Ｇ．、Ｙｅｈ、Ｋ．Ｔ．、Ｓｔｒｕｅｗｉｎｇ、Ｊ．Ｐ．、Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．およびＢｕｅｔｏｗ、Ｋ．Ｈ．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ、ＧＮＭＴ、ｉｎ ｌｉｖｃｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３： ６４７−６５４、２００３．
【０１１１】
１２．Ｒａｈａ、Ａ．、Ｗａｇｎｅｒ、Ｃ．、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｒ．Ｇ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．Ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ４Ｓ ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９： ５７５０−５７５６、１９９４
【０１１２】
１３．Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ、Ｈ．、Ｔａｋｅｔａ、Ｋ．、Ｍｉｙａｎｏ、Ｋ．、Ｙａｍａｎｅ、Ｔ．およびＳａｔｏ、Ｊ．Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４２： ３８５８−３８６３、１９８２．
【０１１３】
１４．Ｆｏｇｈ、Ｊ．、Ｔｒｅｍｐｅ、Ｇ．およびＬｏｖｅｌｅｓｓ、Ｊ．Ｄ．Ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎ Ｆｏｇｈ Ｊ．（ｃｄ）、Ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｐ．ｐ．１１５−１１９、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７７．
【０１１４】
１５．Ａｄｅｎ、Ｄ．Ｐ．、Ｆｏｇｅｌ、Ａ．、Ｐｌｏｔｋｉｎ、Ｓ．、Ｄａｍｊａｎｏｖ、Ｉ．およびＫｎｏｗｌｅｓ、Ｂ．Ｂ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＨＢｓＡｇ ｉｎ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ．）、２８２： ６１５−６１６、１９７９．
【０１１５】
１６．Ｃｌａｒｋ、Ｓ．Ｊ．、Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．、Ｐａｕｌ、Ｃ．Ｌ．およびＦｒｏｍｍｅｒ、Ｍ．Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２： ２９９０−２９９７、１９９４．
【０１１６】
１７．Ｇｕｒｔｕ、Ｖ．、Ｙａｎ、Ｇ．およびＺｈａｎｇ、Ｇ．ＩＲＥＳ ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２９： ２９５−２９８、１９９６．
【０１１７】
１８．Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎ、Ｄ．、Ｚｈａｎｇ、Ｗ．Ｗ．、ｖｏｎ Ｅｓｃｈｅｎｂａｃｈ、Ａ．Ｃ．、Ｌｉｎ Ｓ．Ｈ．およびＨｓｉｅｈ、Ｊ．Ｔ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ、Ｃ−ＣＡＭ１、ｉｎａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ： ａ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５： ２８３１−２８３６、１９９５．
【０１１８】
１９．Ｖｅｓｓｅｌｉｎｏｖｉｔｃｈ、Ｓ．Ｄ．、Ｋｏｋａ、Ｍ．、Ｍｉｈａｉｌｏｖｉｃｈ、Ｎ．およびＲａｏ、Ｋ．Ｖ．Ｎ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｄｉｅｔｈｙｌ−ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ、ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１０８： ６０−６５、１９８４．
【０１１９】
２０．Ｒｏｇｇｅｂａｎｄ、Ｒ．、Ｗｏｌｔｅｒｂｅｅｋ、Ａ．Ｐ．、Ｒｕｔｔｅｎ、Ａ．Ａ．およびＢａａｎ、Ｒ．Ａ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ３２ｐ−ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−ＤＮＡ ａｄｄｕｃｔｓ ｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ ｂｙ ｈｕｍａｎ、ｒａｂｂｉｔ ａｎｄ ｒｏｄｅｎｔ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、１４：１９４５−１９５０、１９９３．
【０１２０】
２１．Ｃｈａｎｇ、Ｋ．Ｗ．、Ｌｅｅ、Ｈ．、Ｗａｎｇ、Ｈ．Ｊ．、Ｃｈｅｎ、Ｓ．Ｙ．およびＬｉｎ、Ｐ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｂｅｎｚｏ［Ａ］ｐｙｒｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ： ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、６５： １３３９−１３４９、１９９９．
【０１２１】
２２．Ｒｏｗｌｉｎｇ、Ｍ．Ｊ．、ＭｃＭｕｌｌｅｎ、Ｍ．Ｈ．およびＳｃｈａｌｉｎｓｋｅ、Ｋ．Ｌ．Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．、１３２： ３６５−３６９、２００２．
【０１２２】
２３．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｒ．Ｊ．、Ｇｏｏｄｓｅｌｌ、Ｄ．Ｓ．、Ｍｕｓａｈ、Ｒ．Ａ．、Ｍｏｒｒｉｓ、Ｇ．Ｍ．、Ｇｏｏｄｉｎ、Ｄ．Ｂ．およびＯｌｓｏｎ、Ａ．Ｊ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ： ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｎｎｏｄｅｌｉｎｇ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄ．Ｍｏｌ．Ｄｅ．、１７： ５２５−５３６、２００３．
【０１２３】
２４．Ｆｕ、Ｚ．、Ｈｕ、Ｙ．、Ｋｏｎｉｓｈｉ、Ｋ．、Ｔａｋａｔａ、Ｙ．、Ｏｇａｗａ、Ｈ．、Ｇｏｍｉ、Ｔ．、Ｆｕｊｉｏｋａ、Ｍ．およびＴａｋｕｓａｇａｗａ、Ｆ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５： １１９８５−１１９９３、１９９６．
【０１２４】
２５．Ｈｕａｎｇ、Ｙ．、Ｋｏｍｏｔｏ、Ｊ．、Ｋｏｎｉｓｈｉ、Ｋ．、Ｔａｋａｔａ、Ｙ．、Ｏｇａｗａ、Ｈ．、Ｇｏｍｉ、Ｔ．、Ｆｕｊｉｏｋａ、Ｍ．およびＴａｋｕｓａｇａｗａ、Ｆ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ａｕｔｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ： ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ、ｍｕｔａｎｔ Ｒ１７５Ｋ ａｎｄ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｂｏｕｎｄ Ｒ１７５Ｋ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９８： １４９−１６２、２０００．
【０１２５】
２６．Ｖｉｄｇｒｅｎ、Ｊ．、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ、Ｌ．Ａ．、ａｒｉｄ Ｌｉｌｊａｓ、Ａ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｔｅｃｈｏｌ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ．）、３６８： ３５４−３５８、１９９４．
【０１２６】
２７．Ｃｈｅｎｇ、Ｘ．、Ｋｕｍａｒ、Ｓ．、Ｐｏｓｆａｉ、Ｊ．、Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ、Ｊ．Ｗ．およびＲｏｂｅｒｔｓ、Ｒ．Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ Ｓ− ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ．Ｃｅｌｌ、７４： ２９９−３０７、１９９３．
【０１２７】
２８．Ｓｃｈｌｕｃｋｅｂｉｅｒ、Ｇ．、Ｋｏｚａｋ、Ｍ．、Ｂｌｅｉｍｌｉｎｇ、Ｎ．、Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、Ｅ．およびＳａｅｎｇｅｒ、Ｗ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ Ｓｉｎｅｆｕｎｇｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ａｄｅｎｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｍ．Ｔａｑｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６５：５６−６７、１９９７．
【０１２８】
２９．Ｒｅｉｎｉｓｃｈ、Ｋ．Ｍ．、Ｃｈｅｎ、Ｌ．、Ｖｅｒｄｉｎｅ、Ｇ．Ｌ．およびＬｉｐｓｃｏｍｂ、Ｗ．Ｎ．Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨａｅＩｌｌ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｏｎｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｔｏ ＤＮＡ： ａｎ ｅｘｔｒａｈｅｌｉｃａｌ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ、８２： １４３−１５３．１９９５．
【０１２９】
３０．Ｇｏｎｇ、Ｗ．、Ｏ’Ｇａｒａ、Ｍ．、Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ、Ｒ．Ｍ．およびＣｈｅｎｇ、Ｘ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｖｕｌＩ ＤＮＡ−（ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｎ４） ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｎ ｅｘａｍｐｌｅ ｏｆ ｄｏｍａｉｎ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５： ２７０２−２７１５、１９９７．
【０１３０】
３１．Ｔｒａｎ、Ｐ．Ｈ．、Ｋｏｒｓｚｕｎ、Ｚ．Ｒ．、Ｃｅｒｒｉｔｅｌｌｉ、Ｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｈｏｒｎ、Ｓ．Ｓ．およびＬａｃｋｓ、Ｓ．Ａ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｐｎｍ ＤＮＡ ａｄｅｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＤｐｎＩＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｂｏｕｎｄ ｔｏ Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、６： １５６３−１５７５、１９９８．
【０１３１】
３２．Ｓｃａｖｅｔｔａ、Ｒ．Ｄ．、Ｔｈｏｍａｓ、Ｃ．Ｂ．、Ｗａｌｓｈ、Ｍ．、Ｓｚｅｇｅｄｉ、Ｓ．、Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ、Ａ．、Ｇｕｍｐｏｒｔ、Ｒ．Ｉ．およびＣｈｕｒｃｈｉｌｌ、Ｍ．Ｅ．Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｒｓｒｌ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ６−ａｄｅｎｉｎｅ Ｂ ｃｌａｓｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８： ３９５０−３９６１、２０００．
【０１３２】
３３．Ｄｏｎｇ、Ａ．、Ｙｏｄｅｒ、Ｊ．Ａ．、Ｚｈａｎｇ、Ｘ．、Ｚｈｏｕ、Ｌ．、Ｂｅｓｔｏｒ、Ｔ．Ｈ．およびＣｈｅｎｇ、Ｘ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＤＮＭＴ ２、ａｎ ｅｎｉｇｍａｔｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ｔｈａｔ ｄｉｓｐｌａｙｓ ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２９： ４３９−４４８、２００１．
【０１３３】
３４．Ｍｏｒｒｉｓ、Ｇ．Ｍ．、Ｇｏｏｄｓｅｌｌ、Ｄ．Ｓ．、Ｈａｌｌｉｄａｙ、Ｒ．Ｓ．、Ｈｕｅｙ、Ｒ．、Ｈａｒｔ、Ｗ．Ｅ．、Ｂｅｌｅｗ、Ｒ．Ｋ．およびＯｌｓｏｎ、Ａ．Ｊ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｌａｍａｒｃｋｉａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ａｎｄ ａｎ ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒｅｅ ｅｎｅｒｇｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、１９： １６３９−１６６２、１９９８．
【０１３４】
３５．Ｃｏｏｋ、Ｒ．Ｊ．およびＷａｇｎｅｒ、Ｃ．Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｓ ａ ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｃｙｔｏｓｏｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１： ３６３１−３６３４、１９８４．
【０１３５】
３６．Ａｉｄａ、Ｋ．、Ｔａｗａｔａ、Ｍ．、Ｎｅｇｉｓｈｉ、Ｍ．およびＯｎａｙａ、Ｔ．Ｍｏｕｓｅ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｓ ｓｅｘｕａｌｌｙ ｄｉｍｏｒｐｈｉｃ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ．Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ、２９： ６４６−６４９、１９９７．
【０１３６】
３７．Ｏｋｅｙ、Ａ．Ｂ．、Ｂｅｎｄｙ、Ｇ．Ｐ．、Ｍａｓｏｎ、Ｍ．Ｅ．、Ｎｅｂｅｒｔ、Ｄ．Ｗ．、Ｆｏｒｓｔｅｒ−Ｇｉｂｓｏｎ、Ｃ．Ｊ．、Ｍｕｎｅａｎ、ｌおよびＤｕｆｒｅｓｎｅ、Ｍ．Ｊ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｓｏｌ−ｔｏ−ｎｕｃｌｅｕｓ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ２，３，７，８−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ ｉｎ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｌｉｎｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５： １１４１５−１１４２２、１９８０．
【０１３７】
３８．Ｈａｐｇｏｏｄ．Ｊ．、Ｃｕｔｈｉｌｌ、Ｓ．、Ｄｅｎｉｓ、Ｍ．、Ｐｏｅｌｌｉｎｇｅｒ、Ｌ．およびＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ、Ｊ．Ａ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｔ ａ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ： ｃｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６： ６０−６４、１９８９．
【０１３８】
３９．Ｆｏｕｓｓａｔ、Ｊ．、Ｃｏｓｔｅｔ、Ｐ．、Ｇａｌｔｉｅｒ、Ｐ．、Ｐｉｎｅａｕ、Ｔ．およびＬｅｓｃａ、Ｐ．Ｔｈｅ ４Ｓ ｂｅｎｚｏ（ａ）ｐｙｒｅｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｎｏｔ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＣＹＰ１Ａ１ ｇｅｎｅ ｉｎ Ａｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ （ＡＨＲ −／−） ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｅｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３４９： ３４９−３５５、１９９８．
【０１３９】
４０．Ｂｈａｔ、Ｒ．、Ｗａｇｎｅｒ、Ｃ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．Ｔｈｅ ｈｏｍｏｄｉｍｉｃ ｆｏｒｍ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３６： ９９０６−９９１０、１９９７．
【０１４０】
４１．Ｃｈａｎｇ、Ｘ．およびＲｏｂｅｒｔｓ、Ｒ．Ｊ．ＡｄｏＭｅｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ａｎｄ ｂａｓｅ ｆｌｉｐｐｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２９： ３７８４−３７９５、２００１．
【０１４１】
４２．Ｒｏｗｌｉｎｇ、Ｍ．Ｊ．、ＭｃＭｕｌｌｅｎ、Ｍ．Ｈ．およびＳｃｈａｌｉｎｓｋｅ、Ｋ．Ｌ．Ｖｉｔａｍｉｎｅ Ａ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｒａｔｓ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．、１３２： ３６５−３６９、２００２．
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】ベンゾ［ａ］ピレン処理後の細胞でのＧＮＭＴの核内移行を示す蛍光顕微鏡写真
【図２Ａ】さまざまな処理を施された細胞における１０８ヌクレオチドあたりのＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体相対レベルを示すグラフ
【図２Ｂ】トランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット
【図２Ｃ】１または１０μＭのＢａＰ処理されたＨｅｐＧ２、ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−１−１１細胞におけるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体の量を示すグラフ
【図２Ｄ】ＨｅｐＧ２細胞（レーン１）、ＳＣＧ２−１−１細胞（レーン２）およびＳＣＧ２−１−１１細胞（レーン３）におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット
【図３Ａ】Ａｄ−ＧＦＰまたはさまざまなＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させたＨｅｐＧ２細胞における１０８ヌクレオチドあたりのＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成を示すグラフ
【図３Ｂ】Ａｄ−ＧＦＰまたはさまざまなＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させたＨｅｐＧ２細胞におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット
【図４】ＳＣＧ２−ｎｅｇおよびＳＣＧ２−１−１細胞におけるＢａＰにより誘導されるシトクロムｐ４５０ １Ａ１（ＣＹＰ１Ａ１）酵素活性を示すグラフ
【図５Ａ】ラマルク型遺伝アルゴリズムを用いる２量体型のＧＮＭＴと結合するＢａＰのモデルを示すタンパク質ペプチド鎖骨格立体構造模式図
【図５Ｂ】ラマルク型遺伝アルゴリズムを用いる４量体型のＧＮＭＴと結合するＢａＰのモデルを示すタンパク質ペプチド鎖骨格立体構造模式図
【図５Ｃ】１Ｄ２ＣおよびＢａＰのドッキングモデルにおけるＢａＰの炭素原子とその近傍のＧＮＭＴのアミノ酸残基との位置関係を示す共有結合骨格立体構造模式図
【図６】ＢａＰによるＧＮＭＴ酵素活性の阻害を示すグラフ
【図７】ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドの構築の手順を示す模式図
【図８】トランスジェニックマウスおよび正常マウスのノザンブロット
【図９】トランスジェニックマウスおよび正常マウスのウェスタンブロット
【図１０】ＢａＰ処理され、７８週間後に屠殺されたＧＮＭＴトランスジェニックマウス（Ａ）および正常マウス（Ｂ）の肺の臓器病理写真
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の発がん物質を生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で結合可能なタンパク質を含む、医薬品、食品または化粧品の組成物に関する。より具体的には、本発明は、生体内でベンゾ［ａ］ピレンと結合可能なタンパク質を含む、医薬品組成物、食品組成物または化粧品組成物に関する。さらに本発明は、がんの予防または治療用タンパク質の使用に関する。本発明は、本発明のタンパク質を含む、医療用組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明のベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）は以下の化学式の発がん物質である。
【０００３】
【化１】
【０００４】
ＢａＰは有機物の燃焼によって発生する。火力発電所および製鉄所の労働者と、アルミ精錬およびルーフィング関係者とは、ＢａＰを含むさまざまな多環芳香族炭化水素（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ、ＰＡＨｓ）の長期間曝露に関連する発がんリスクが高い（１、数字は、明細書の末尾に列挙する文献リストの番号である。また、本段落および次の段落では、段落末尾の非特許文献の番号でもある。）。細胞内に拡散した後は、ＢａＰはアリル炭化水素レセプター（ＡｈＲ）に結合し、当該細胞の核内に移行して、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子を転写活性化する（２−４）。ＢａＰ７，８−ジヒドロジオール−９，１０−エポキシド（ＢＰＤＥ）として知られるＢａＰの代謝産物は、ＤＮＡ付加体の形成および突然変異誘発を行うことができる（５）。
【非特許文献１】Ｆｉｓｃｈｍａｎ．Ｍ．Ｌ．、Ｃａｄｍａｎ、Ｅ．Ｃ．およびＤｅｓｍｏｎｄ、Ｓ．Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎ ＬａＤｏｕ Ｊ．編、Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｐ．ｐ．１８２−２０８．Ｐｒｅｔｉｎｃｅ−Ｈａ
【非特許文献２】Ｗｈｉｔｌｏｃｋ、Ｊ．Ｐ．Ｊｒ．、Ｏｋｉｎｏ、Ｓ．Ｔ．、Ｄｏｎｇ、Ｌ．、Ｋｏ、Ｈ．Ｐ．、Ｃｌａｒｋｅ−Ｋａｔｚｅｎｂｅｒｇ、Ｒ．、Ｍａ、Ｑ．およびＬｉ、Ｈ．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０ ５： Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０１Ａ１： ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１０： ８０９，８１８、１９９６．
【非特許文献３】Ｆｏｌｄｅｓ、Ｒ．Ｌ．、Ｈｉｎｅｓ、Ｒ．Ｎ．、Ｈｏ、Ｋ．Ｌ．、Ｓｈｅｎ、Ｍ．Ｌ．、Ｎａｇｅｌ、Ｋ．Ｂ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．３−Ｍｅｔｈｙｌｃｈｌａｎｔｈｒｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０ｃ ｇｅｎｅ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２３９： １３７−１４６、１９８５．
【非特許文献４】Ｒａｖａｌ、Ｐ．、Ｉｖｅｒｓｅｎ、Ｐ．Ｌ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０１Ａ１ ａｎｄ Ｐ４５０１Ａ２ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４１： １７１９−１７２３、１９９１．
【非特許文献５】Ｗｉｊｎｈｏｖｅｎ．Ｓ．Ｗ．、Ｋｏｏｌ、Ｈ．Ｊ．、ｖａｎ Ｏｏｓｔｒｏｍ，Ｃ．Ｔ．、Ｂｅｅｍｓ、Ｒ．Ｂ．、Ｍｕｌｌｅｎｄｅｒｓ、Ｌ．Ｈ．、ｖａｎ Ｚｅｅｌａｎｄ、Ａ．Ａ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ、Ｇ．Ｔ．、Ｖｒｉｅｌｉｎｇ、Ｈ．およびｖａｎ Ｓｔｅｅｇ、Ｈ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｒｅｐａｉｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｏｃｋａｙｎｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６０： ５６８１−５６８７、２０００．
【０００５】
多機能タンパク質である、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ、ＥＣ２．１．１．２０）は、（ａ）ＳＡＭのＳ−アデノシルホモシスチン（ＳＡＨ）に対する比の調節と、（ｂ）葉酸との結合とによって遺伝的安定性に影響を与える（６、７）。本発明の発明者らは、ヒト肝細胞性癌（ＨＣＣ）細胞株および腫瘍組織の両方においてＧＮＭＴ発現レベルの低下を以前報告した（８、９）。以前の研究プロジェクトでは、ヒトＧＮＭＴ遺伝子は６ｐ１２染色体領域に局在し、その多型性が特徴づけられた（１０、１１）。複数のヒトＧＮＭＴ遺伝子多型の遺伝子型解析は、ＨＣＣ組織での上述の遺伝子マーカーの３６−４７％においてヘテロ接合性が欠失していることを証明した（１１）。
【非特許文献６】Ｋｅｒｒ、Ｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２４７： ４２４８−４２５２、１９７２．
【非特許文献７】Ｙｅｏ、Ｅ．Ｊ．およびＷａｇｎｅｒ、Ｃ．Ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａ ｍａｊｏｒ ｆｏｌａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１： ２１０−２１４、１９９４．
【非特許文献８】Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．、Ｓｈｉｕ、Ｊ．Ｙ．、Ｔｚｅｎｇ、Ｓ．Ｊ．、Ｓｈｉｈ、Ｌ．Ｓ．、Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｊ．、Ｌｕｉ、Ｗ．Ｙ．およびＣｈｅｎ、Ｐ．Ｈ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７５： ７８７−７９３、１９９８．
【非特許文献９】Ｌｉｕ、Ｈ．Ｈ．、Ｃｈｅｎ、Ｋ．Ｈ．、Ｌｕｉ、Ｗ．Ｙ．、Ｗｏｎｇ、Ｆ．Ｗ．およびＣｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｎｅｗｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．、１０： ８７−９７、２００３．
【非特許文献１０】Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．、Ｃｈｅｎ、Ｌ．Ｙ．、Ｗｏｎｇ、Ｆ．Ｈ．、Ｌｅｅ、Ｃ．Ｍ．、Ｃｈａｎｇ、Ｔ．Ｊ．およびＹａｎｇ−Ｆｅｎｇ、Ｔ．Ｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６６：４３−４７、２０００．
【非特許文献１１】Ｔｓｅｎｇ、Ｔ．Ｌ．、Ｓｈｉｈ、Ｙ．Ｐ．、Ｈｕａｎｇ、Ｙ．Ｃ．、Ｗａｎｇ、Ｃ．Ｋ．、Ｃｈｅｎ、Ｐ．Ｈ．、Ｃｈａｎｇ、Ｊ．Ｇ．、Ｙｅｈ、Ｋ．Ｔ．、Ｓｔｒｕｅｗｉｎｇ、Ｊ．Ｐ．、Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．およびＢｕｅｔｏｗ、Ｋ．Ｈ．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ、ＧＮＭＴ、ｉｎ ｌｉｖｃｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３： ６４７−６５４、２００３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
ヒトを含むほ乳類のがん、主に、肝がん、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、脳腫瘍、乳がんおよび腎がんの予防および治療に有用な、医薬品、食品または化粧品の組成物を提供することが本発明の課題である。
【０００７】
ヒトまたは動物の身体の医学的治療薬としてのＧＮＭＴの新規な使用方法を提供することが本発明の別の課題である。
【０００８】
ＢａＰが介在する発がん、特に、ヒトを含むほ乳類のがん、主に、肝がん、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、脳腫瘍、乳がんおよび腎がんの予防または治療の方法を提供することは本発明のさらに別の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これらの課題は、本発明にしたがって、担体と、有効量の活性のあるベンゾ［ａ］ピレン結合タンパクとを含む、医薬品、食品または化粧品の組成物により解決されるが、前記タンパクは、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有するＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かである。本発明の組成物のメチルトランスフェラーゼは、ＧＮＭＴ、ＨｈａＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅ）、ＨａｅＩＩＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼまたはＰｖｕＩＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼであることが好ましい。前記メチルトランスフェラーゼが以下のアミノ酸配列を有するＧＮＭＴであることが最も好ましい（Ｃｈｅｎ ＹＭ、Ｃｈｅｎ ＬＹ、Ｗｏｎｇ ＦＨ、Ｌｅｅ ＣＭ、Ｃｈａｎｇ ＴＪ、Ｙａｎｇ−Ｆｅｎｇ ＴＬ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２０００年５月１５日号；６６（１）：４３−７． ＰＭＩＤ： １０８４３８０３ ［ＭＥＤＬＩＮＥ用にＰｕｂＭｅｄで索引される］）。
【００１０】
1-MVDSVYRTRSLGVAAEGLPDQYADGEAARVWQLYIGDTRSRTAEYKAWLL-50
51-GLLRQHGCQRVLDVACGTGVDSIMLVEEGFSVTSVDASDKMLKYALKERW-100
101-NRRHEPAFDKWVIEEANWMTLDKDVPQSAEGGFDAVICLGNSFAHLPDCK-150
151-GDQSEHRLALKNIASMVRAGGLLVIDHRNYDHILSTGCAPPGKNIYYKSD-200
201-LTKDVTTSVLIVNNKAHMVTLDYTVQVPGAGQDGSPGLSKFRLSYYPHCL-250
251-ASFTELLQAAFGGKCQHSVLGDFKPYKPGQTYIPCYFIHVLKRTD-295
配列番号１
ＧＮＭＴの配列データは、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋデータライブラリにアクセッション番号ＡＦ１０１４７５で登録されている。
【００１１】
本発明は、メチルトランスフェラーゼの特定のサブクラスの要素としてのＧＮＭＴが発がん物質ＢａＰの新規な解毒経路に関与するという認識に基づく。具体的には、本発明は、シトシンを標的原子団として用いるＤＮＡメチルトランスフェラーゼとＢａＰとは容易に相互作用することを示す、ＢａＰがＧＮＭＴその他のＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅｓ）のＳＡＭ結合ドメインと生体内で優先的に結合することの認識に基づく。ＧＮＭＴを過剰発現するトランスジェニックマウスがベンゾ［ａ］ピレンで処理されるとき、当該マウスのうち３０％だけが肺がんを発生したが、ＧＮＭＴを過剰発現しない正常マウスは同じ条件で６７％の発症率で肺がんを発生する。したがってＧＮＭＴが生体内でベンゾ［ａ］ピレンと結合することは発がんを予防できる。
【００１２】
本発明は、ベンゾ［ａ］ピレンを特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有する、ＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片を、ヒトを含むほ乳類のがん、特に、肝がん、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、脳腫瘍、乳がんおよび腎がんの予防および治療用の医薬の製造のための使用を提供する。前記組成物は、経口、局部または非経口で投与される場合がある。前記メチルトランスフェラーゼは、ＧＮＭＴ、ＨｈａＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＨａｅＩＩＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼまたはＰｖｕＩＩ−ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼであることが好ましい。前記メチルトランスフェラーゼがＧＮＭＴであることが最も好ましい。
【００１３】
本発明は、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合する、ＳＡＭ結合ドメインを有するＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かの医薬品として有効な量を個人に投与することを含む、がんの予防または治療の方法を提供する。前記ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有するＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かは、直接投与されてもよく、前記タンパク質をエンコードし、該タンパク質を発現可能なベクターによって投与されてもかまわない。
【００１４】
発明の詳細な説明
図１ ベンゾ［ａ］ピレン処理後の細胞でのＧＮＭＴの核内移行
写真ＡおよびＢ：２重ＩＦＡがｐＧＮＭＴをトランスフェクションしたＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨ細胞で実施された。抗血清：Ａ、ウサギ抗ＧＮＭＴ抗体；Ｂ、マウス抗Ｆｌａｇ抗血清。写真Ｃ−Ｆ：ｐＧＮＭＴをトランスフェクションしたＨｕｈ７細胞を固定する前にＤＭＳＯ溶媒（ＣおよびＤ）またはＢａＰ（ＥおよびＦ）のいずれかで処理し、マウス抗Ｆｌａｇ抗血清と反応された。免疫蛍光染色は、ローダミン結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ａ）またはＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウス抗体（Ｂ−Ｆ）で実施された。核はヘキストＨ３３２５８で染色された。
【００１５】
図２ （Ａ）３２Ｐポストラベリングと、５次元薄層クロマトグラフィとの組み合わせを用いるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体の量（ＲＡＬ）。レーン１、ＤＭＳＯ溶媒の対照；レーン２、モック（ｍｏｃｋ）；レーン３、４０μｇの対照（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５）ベクターをトランスフェクションした細胞；レーン４、４０μｇのｐＧＮＭＴをトランスフェクションした細胞；レーン５、４０μｇのｐＧＮＭＴアンチセンスをトランスフェクションした細胞；レーン６、２０μｇのｐＧＮＭＴと、２０μｇのｐＧＮＭＴアンチセンスとをコ・トランスフェクションした細胞。１０８ヌクレオチドあたりのＤＮＡ付加体量（付加体相対レベル、ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｄｄｕｃｔｓ ｌｅｖｅｌ、ＲＡＬ）：レーン１、０；レーン２、１０３１．７；レーン３、１０９２．４；レーン４、７１９．８；レーン５、１４１１．３；レーン６、１０７９．７。（Ｂ）対照（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５）ベクター（レーン１）、ｐＧＮＭＴ（レーン２）、ｐＧＮＭＴアンチセンス（レーン３）またはｐＧＮＭＴ／ｐＧＮＭＴアンチセンス（レーン４）でトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット解析。泳動度の速いバンドはこれら４つの実験でのβ−アクチン発現レベルを示す。（Ｃ）１または１０μＭのＢａＰ処理されたＨｅｐＧ２、ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−１−１１細胞におけるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体の量。レーン１および４：それぞれ１および１０μＭのＢａＰ処理されたＨｅｐＧ２細胞；レーン２０５：それぞれ１および１０μＭのＢａＰ処理されたＳＣＧ２−１−１細胞；レーン３および６：それぞれ１および１０μＭのＢａＰ処理されたＳＣＧ２−１−１１細胞。１０８ヌクレオチドあたりのＤＮＡ付加体量（ＲＡＬ）：レーン１、１６１．９；レーン２、２６．４；レーン３、５５．２；レーン４、６８２．１；レーン５、３５４．９；レーン６、５０６．５。（Ｄ）ＨｅｐＧ２細胞（レーン１）、ＳＣＧ２−１−１細胞（レーン２）およびＳＣＧ２−１−１１細胞（レーン３）におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット解析。各細胞株から２０μｇの細胞溶解液がポリアクリルアミドゲル電気泳動に用いられた。泳動度の速いバンドはこれら４つの実験でのβ−アクチンの発現レベルを示す。
【００１６】
図３ Ａｄ−ＧＦＰまたはさまざまなＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させたＨｅｐＧ２細胞におけるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成に対するＧＮＭＴの過剰発現発現の影響
（Ａ）レーン１、Ａｄ−ＧＦＰを感染させ、ＤＭＳＯ溶媒で処理された細胞；レーン２、Ａｄ−ＧＦＰを感染させ、ＢａＰで処理された細胞；レーン３、１００ＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させ、ＢａＰで処理された細胞；レーン４、２５０ＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させ、ＢａＰで処理された細胞；レーン５、１０００ＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させ、ＢａＰで処理された細胞。１０８ヌクレオチドあたりのＤＮＡ付加体量（ＲＡＬ）：レーン１、０；レーン２、６３８．９；レーン３、５１４．２；レーン４、４０５．３；レーン５、２２４．３。（Ｂ）同じ実験におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット解析。レーン１、Ａｄ−ＧＦＰの対照；レーン２、Ａｄ−ＧＮＭＴ（１００ ＭＯＩｓ）；レーン３、Ａｄ−ＧＮＭＴ（２５０ ＭＯＩｓ）；レーン４、Ａｄ−ＧＮＭＴ（１，０００ ＭＯＩｓ）
【００１７】
図４。アリル炭化水素ヒドロキシラーゼ（ＡＨＨ）アッセイで測定される、ＳＣＧ２−ｎｅｇおよびＳＣＧ２−１−１細胞におけるＢａＰにより誘導されるシトクロムｐ４５０ １Ａ１（ＣＹＰ１Ａ１）酵素活性。レーン１−４、ＳＣＦＧ２−ｎｅｇにおけるＣＹＰ１Ａ１活性；レーン５−８ＳＣＧ２−１−１細胞におけるＣＹＰ１Ａ１活性。処理：レーン１および５、ＤＭＳＯ溶媒、レーン２および６、３μＭのＢａＰ；レーン３および７、６μＭのＢａＰ；レーン４および８、９μＭのＢａＰ。前記ＣＹＰ１Ａ１酵素活性の平均（ピコモル／ｍｇ／分）および標準偏差（かっこ内）：レーン１、１４．５（０．２７）；レーン２、２４．４７（０．１４）；レーン３、４１．５（１．４２）；レーン４、７１．３（１．７５）；レーン５、１６．２（３．６）；レーン６、２０．１（１．５）；レーン７、２７．７（１．２）；レーン８、３６．２（１．７）。
【００１８】
図５ ラマルク型遺伝アルゴリズム（Ｌａｍａｒｃｋｉａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いる２量体および４量体型のＧＮＭＴと結合するＢａＰのモデル
（Ａ）ラットＧＮＭＴ（シアン色、１Ｄ２Ｈ）の４量体型と結合したＳＡＨ（白色）とドッキングしたＢａＰ（赤色）。（Ｂ）ラットＧＮＭＴ（黄色、１Ｄ２Ｃ）の２量体型とドッキングしたＢａＰ（赤色）。（Ｃ）ＧＮＭＴの４量体型（シアン色）とスーパーインポーズされたＧＮＭＴの２量体型。（黄色）。複数のＢａＰの炭素原子の近傍のＧＮＭＴのアミノ酸残基（２量体の一方のサブユニットのＩｌｅ３４、Ｔｈｒ３７、Ｇｌｙ１３７、Ｈｉｓ１４２およびＬｅｕ２４０と、他方のサブユニットのＧｌｕ１５）が、１Ｄ２ＣおよびＢａＰのドッキングモデルにもとづいて表示される。
【００１９】
図６ ＢａＰによるＧＮＭＴ酵素活性の阻害
ＧＮＭＴ酵素活性の測定結果は、ＤＭＳＯ溶媒処理について２８１０．８ ± ７３．７ ナノモル／時／μｇ；１０μＭ ＢａＰ処理について１５６３．３ ± １２７．４ナノモル／時／μｇ；５０μＭ ＢａＰ処理について１０６９．５ ± １２４．２ナノモル／時／μｇ；１００μＭ ＢａＰ処理について１０８３．３ ± １７５．９ナノモル／時／μｇであった。各反応セットと、個々の実験とは、３重に繰り返して実施された。
【００２０】
図７ ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドの構築
ｐＰＥＰＣＫｅＸ(ベクター)とｐＳＫ−ｆｌＧＮＭＴ（インサート）とはＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化され、ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴを生成するために連結された。
【００２１】
図８ トランスジェニックマウスおよび正常マウスのノザンブロット。
【００２２】
図９ トランスジェニックマウスおよび正常マウスのウェスタンブロット。
【００２３】
図１０ ＢａＰ処理され、７８週間後に屠殺されたＧＮＭＴトランスジェニックマウス（Ａ）および正常マウス（Ｂ）の肺の臓器病理写真。
【００２４】
本発明はＢａＰによる発がんに関連するヒトの病状を予防および治療するための組成物および方法を提供する。本発明の治療薬および予防薬組成物は、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有する、少なくとも１種類のＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かを含む。本発明の組成物に含まれるメチルトランスフェラーゼタンパクは、他の全てのタンパク質または夾雑物をほぼ含まない、単離生成されたタンパク質の場合がある。前記メチルトランスフェラーゼタンパクは、例えば、抽出物のような、天然の原料から得られる混合物の形態で本発明の組成物中に含まれる場合がある。前記組成物が天然原料から得られる混合物を含む場合には、本発明の組成物は前記天然原料中のメチルトランスフェラーゼ濃度より高濃度のメチルトランスフェラーゼタンパクを含む。前記メチルトランスフェラーゼ濃度は前記天然原料中のメチルトランスフェラーゼ濃度より少なくとも２倍であることが好ましく、３ないし１０００倍であることがより好ましい。
【００２５】
本発明の組成物は治療薬の処方計画（ｒｅｇｉｍｅｎ）の下で患者に投与されるとき、発がんを治療または予防できる。本発明の組成物および方法は、発がん物質ベンゾ［ａ］ピレンとその誘導体に関連する病状を治療するための用いられる場合がある。実施例に記載の生体内試験は、発がんの予防および治療におけるメチルトランスフェラーゼの特定のサブクラスの要素としてＧＮＭＴを使用することに成功したことを実証する。前記サブクラスはベンゾ［ａ］ピレンと選択的に結合するＳＡＭ結合ドメインによって特徴づけられる。
【００２６】
本発明によれば、「タンパク質」とは、約１０００個のアミノ酸残基以下を含み、少なくとも約５０個のアミノ酸残基を含むのが好ましく、少なくとも約１００個のアミノ酸残基を含むのが好ましく、少なくとも約１５０個のアミノ酸残基を含むのがより好ましい、特定のアミノ酸残基の配列をいい、メチルトランスフェラーゼに由来する場合には、メチルトランスフェラーゼ全体のアミノ酸配列と同じかより少ない数のアミノ酸残基を含み、特定の実施態様では、前記タンパク質の全体のアミノ酸残基の約９５％以下であって、有効なＳＡＭ結合ドメインを含む。本発明にしたがって用いられるタンパク質は、少なくとも１個のＳＡＭ結合ドメインを含む。ＳＡＭ結合ドメインは、ＢａＰの認識および生体内でのＢａＰとの結合に必要な基本要素または最小単位である。前記ＳＡＭ結合ドメインは、生体内でのＢａＰと結合して、ＢａＰの細胞内への拡散、アリル炭化水素レセプター（ＡｈＲ）との結合、前記細胞の核内への移行またはＣＹＰ１Ａ１遺伝子の転写活性化を回避することに関与すると信じられている。したがって、ＢａＰと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有するＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かは、発がんの予防または治療に有用である。本発明の最も好ましいタンパク質はＧＮＭＴである。ドッキングモデルに基づくＧＮＭＴ（ｐｄｂ：１Ｄ２Ｃ）とＢａＰとの間の接触距離は、ＧＮＭＴの結合ポケットを例示するために以下の表１に示される。
【００２７】
【表１】
【００２８】
（ＢａＰに起因する疾患徴候の予防または遅延をもたらす）本発明の治療薬／予防薬の処方計画は、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有するＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体か、これらの断片かのうち少なくとも１つを含む本発明の組成物の投与を含む。本発明の組成物の使用は、（ａ）固体または液体食品または煙または蒸気のような流体に存在するＢａＰまたはその誘導体に曝露された個体内にＢａＰが吸収される前に、前記ＢａＰまたはその誘導体と結合するか、（ｂ）前記個体内のＢａＰまたはその誘導体と結合する場合がある。
【００２９】
本発明の組成物および方法は、ヒトを含むほ乳類における、肝がん、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、脳腫瘍、乳がんおよび腎がんのようながんを治療するうえで有用である。
【００３０】
ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合する、ＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した変異体かの少なくとも１個のＳＡＭ結合ドメインを含む特定のアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するＧＮＭＴのような既知のメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列を含む場合がある。
【００３１】
さらに、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合する、ＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼか、その機能を保存した断片または変異体かの少なくとも１個のＳＡＭ結合ドメインを含む特定のアミノ酸配列を有するタンパク質は、ＧＮＭＴを含むいずれかの既知のメチルトランスフェラーゼとして同定される場合がある。機能を保存した断片に係る１つの方法は、前記タンパク質を、所望の長さの重複しないペプチドまたは重複するペプチドに分割して、前記ペプチドが、ベンゾ［ａ］ピレンを特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを少なくとも１個含むペプチドと、その誘導体とを含むかどうかを決定するために、前記ペプチドを合成、精製および試験することを含む。別の方法では、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを含む可能性があるペプチドを予測するためのアルゴリズムが用いられ、前記アルゴリズムによって予測されるペプチドが特異的にＢａＰと結合するかどうか決定するために、前記ペプチドを合成および精製して、例えば本実施例に記載のような細胞アッセイ中で試験する。タンパク質はＧＮＭＴと比較して同等またはそれ以上の高いＢａＰとの結合能を有することが好ましい。本発明で有用な好ましいタンパク質の断片は、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合する少なくとも１個のＳＡＭ結合ドメインを含む。
【００３２】
（前記組成物が注射される場合に特に望ましい）可溶性を増大し、治療薬または予防薬としての薬効または安定性（例えば、生体外での貯蔵寿命および生体内でのタンパク質分解酵素による分解への抵抗性）を増強するような目的のため、本発明の機能を保存した変異体用に前記タンパク質のいずれかの構造を改変することも可能である。機能を保存した変異体は、ＢａＰ結合能の改変を目的として、前記変異体が由来する天然のタンパク質の配列か、アミノ酸置換、欠失または追加のような改変を施されるべきタンパク質断片かと比較して、アミノ酸配列が変更されるように、あるいは、ある構成部分が同じ目的のために追加されるように、製造することは可能である。
【００３３】
本発明の組成物は、メチルトランスフェラーゼタンパク質を含む天然原料からの混合物に基づいて調製される場合がある。前記メチルトランスフェラーゼタンパク質を含む天然原料からの混合物は、適当な出発材料の抽出のようないずれかの適当な方法によって得られる場合がある。適当な天然原料は、微生物または動物に基づく場合がある。本発明の目的のためには、前記混合物中に含まれるメチルトランスフェラーゼがＢａＰ結合活性を有することを条件として、前記メチルトランスフェラーゼが純粋な形態で単離されることは必須ではない。したがって、必要な活性を提供するのに十分な濃度で前記メチルトランスフェラーゼが存在するかぎり、前記混合物を使用することは可能である。
【００３４】
ＧＮＭＴを含む本発明の混合物は、微生物、特に酵母か、微生物から抽出された混合物かに基づく場合がある。
【００３５】
本発明のＧＮＭＴを含む混合物は、動物の臓器に基づく場合がある。適当な動物は、ブタ、ウシまたはウサギから選択される場合がある。動物の適当な臓器は、肝臓、膵臓または前立腺から選択される場合がある。
【００３６】
本発明のタンパク質は、チンキ剤を調製するために材料を適当な溶媒と接触させるような標準的な手段または方法か、二酸化炭素抽出、凍結乾燥または噴霧乾燥のようないずれかの他の従来の手段または方法かを用いることによって、原料から抽出物として得られる場合がある。（Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．１９９５と、Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ２２ｎｄ ｒｅｖと、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ （ＮＦ） １７ ｅｄ， ＵＳＰ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｍｄ．， １９９０とを参照せよ。）
【００３７】
前記抽出物は、本発明のタンパク質と、溶媒とを含む、微生物またはそのホモジネートか、動物臓器またはそのホモジネートを用いて調製されるが、前記溶媒は、蒸留水のような水か、ＰＢＳ、生理食塩水またはその他の溶媒と混合された水のような水溶液溶媒か、ＤＭＳＯ、ＤＭＦまたはエタノールまたはイソプロパノールのようなアルコールのような有機溶媒か、これらのいずれかの組み合わせかの場合がある。得られた抽出物は、液体の構成成分と、固体の構成成分とでできているのが典型的である。
【００３８】
ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合する少なくとも１個のＳＡＭ結合ドメインを含む特定のアミノ酸配列を有し、他の全てのポリペプチドおよび夾雑物を含まない、高度に精製されたペプチドは、標準的な技術を用いて化学合成によって合成される場合がある。タンパク質がポリマー支持体に固定される、固相合成方や、従来の均一な化学反応（液相合成）のような、さまざまなペプチドの化学合成方法が当業者に知られている。合成ペプチドは、均一状態（すなわち、少なくとも９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは少なくとも９７％の純度）になるように、任意的には、文献で知られるタンパク質精製技術を用いて、全ての他のポリペプチドおよび夾雑物を含まないように、精製される場合がある。
【００３９】
高純度の均一なペプチド組成物を製造するための１つの実施態様によれば、合成化学的な手段によって製造されたタンパク質は、調製用逆相クロマトグラフィによって精製される場合がある。この方法では、粗製合成ペプチドは、適当な溶媒（典型的には水溶性バッファー）に溶解され、分離カラム（典型的には逆相シリカ系媒体、さらに、ポリマーまたは炭素系媒体が使用される場合がある）に適用される。ペプチドは、水溶性バッファー（典型的にはＴＦＡ、リン酸トリエチルアミン、酢酸等のバッファー）中の有機成分（典型的にはアセトニトリルまたはメタノール）の濃度を上昇することによって、前記カラムから溶出される。前記溶出液の分画が回収され、適当な分析方法（典型的には、逆相ＨＰＬＣまたはＣＺＥクロマトグラフィ）によって分析される。要求される純度を有する分画がプールされる。存在する対イオンは、選択する塩での追加の逆相クロマトグラフィか、イオン交換樹脂かによって交換される場合がある。前記ペプチドは、酢酸塩その他の適当な塩として単離される場合がある。前記ペプチドは、ろ過され、（典型的には凍結乾燥法により）水分が除去され、必要なペプチド成分の少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７％を含む、均一なペプチド組成物が得られる。任意的に、あるいは、前記逆相ＨＰＬＣとともに、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換、排除体積、向流または順相分離システムか、これらの方法のいずれかの組み合わせかにより精製が達成される場合がある。ペプチドは、限外濾過、回転乾燥、沈殿その他の類似技術を用いてさらに濃縮される場合がある。高純度の均一なペプチド組成物は、以下の技術か、これらの組み合わせのいずれかによって特徴づけられる場合がある。すなわち、（ａ）ペプチドの同一性をチェックするために分子量を決定する質量分析法と、（ｂ）アミノ酸組成により前記ペプチドの同一性をチェックするためのアミノ酸分析法と、（ｃ）特定のアミノ酸配列を確認するための（自動タンパク質シーケンサーまたは手作業による）アミノ酸配列決定法と、（ｄ）ペプチドの同一性および純度をチェックする（すなわち、ペプチドの不純物を同定する）ために用いられるＨＰＬＣ（所望の場合には多重システム）と、（ｅ）前記ペプチド組成物の水分濃度を決定するための含水量と、（ｆ）前記ペプチド組成物中の塩の有無を決定するためのイオン含有量と、残留有機試薬、出発材料および／または有機夾雑物の有無をチェックするための残留有機物とである。
【００４０】
約５０個以下の長さのアミノ酸残基を含み、最も好ましくは約３０個以下の長さのアミノ酸残基を含む本発明の合成ペプチドが、長さが長くなるとペプチド合成に困難をきたす場合があるため、特に好ましい。もっと長いペプチドは以下に説明する組換えＤＮＡ法で製造される場合がある。
【００４１】
本発明の方法で有用なタンパク質は、かかるペプチドをコードする核酸配列で形質転換された宿主細胞中で組換えＤＮＡ法を用いて製造される場合もある。組換え法で製造されるときには、所望のペプチドをエンコードする核酸で形質転換された宿主細胞は、該細胞に適した培地中で培養され、単離ペプチドは、イオン交換クロマトグラフィか、限外ろ過か、電気泳動か、前記所望のペプチドに特異的な抗体を用いる免疫精製法かを含む、当業者に知られたペプチドおよびタンパク質の精製技術を用いて、細胞の培地か、宿主細胞か、その両方かから精製される場合がある。組換え法で製造されたタンパク質は、合成ペプチドについてすでに説明した方法によって、細胞由来の物質その他のポリペプチドまたは利用する培養液を含まずに、均一にまで単離精製される場合がある。
【００４２】
タンパク質は、化学的消化または酵素的切断の部位が予め定められており、消化結果が再現可能であるような、高純度な完全長または天然タンパク質の化学的または酵素的な切断によって製造される場合もある。切断は、いずれかの生物由来の少なくとも１種類のプロテアーゼその他の適当な酵素を用いる酵素的消化によって実行される場合がある。前記プロテアーゼは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｗ．ａｃ．ｕｋ／ｉｕｍｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ＥＣ３４の国際生化学分子生物学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）の命名委員会によるリストと、ＭＥＲＯＰＳのデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｒｏｐｓ．ｃｏ．ｕｋ、Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ ＤおよびＢａｒｒｅｌ Ａ Ｊ、ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄａｔａｂａｓｅ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８ ３２３−３２５ （１９９８）、およびＢａｒｒｅｔ Ａ Ｊ， Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ｎ Ｄ Ｗｏｅｓｓｎｅｒ Ｊ Ｆ（ｅｄｓ）１９９８ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｏｎｄｏｎのリストとから選択される場合がある。特定のアミノ酸配列を有するタンパク質は、合成または組換え法によって製造された高純度の単離ペプチドのためにすでに説明された手順のいずれかによって、前記酵素的または化学的な消化の際に存在するいずれかの他のポリペプチドまたは夾雑物を含まないように高度に精製単離できる。
【００４３】
本発明のタンパク質を含む単離精製タンパク質または混合物は、ヒトを含むほ乳類における予防または治療用に適する、医薬品、食品または化粧品組成物に処方される場合がある。
【００４４】
本発明の治療または予防用組成物は、経口または非経口投与用か、局所適用用かの組成物である。前記組成物は、経口的に投与されるか、局所的に適用されるのが好ましい。
【００４５】
本発明の医薬品組成物は、錠剤、顆粒、粉末、カプセル、ゲル、ペースト、シロップ、水薬（ｐｏｔｉｏｎ）、エアロゾル、点眼薬または噴霧薬のような、従来の医薬品の経口投与剤形の場合がある。医薬品組成物が、吸気に先立ってタバコの煙のＢａＰと結合するように、タバコのフィルターの中に取り込まれる場合もある。食品組成物は、キャンディその他の菓子の材料や飲料のような従来の機能食品製品または食品添加物の形態であるのが普通である。化粧品の組成物は、クリーム、軟膏、シャンプー、リンスまたは香油の形態であるのが普通である。
【００４６】
ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを含む、ＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼ、その機能を保存した変異体またはこれらの断片に加えて、本発明の組成物は担体も含む。この担体は、粉末、ゲル、ペースト、錠剤、カプセル、ガム、薬用ドロップ、エアロゾルおよび液体のようなさまざまな剤形のうちのいずれかの場合がある。例えば、前記担体は、キャンディ、チューインガムまたはタバコのフィルターの場合がある。前記担体は、食感向上剤、噛み心地向上剤、濃厚化剤および増粘剤のような、口腔内での使用を容易にする添加剤を含む場合がある。前記担体は、甘味剤（砂糖、ソルビトール、サッカリンまたはアルパルテーム等）、果実、香辛料または香草または香油（シナモン、ミントまたはチョウジ等）等のような天然または人工の香料または香油、葉緑素および／またはいずれかの適当な従来の色素のような色素を含む場合がある。
【００４７】
経口投与の場合、本発明のタンパク質の不活性化を防止し、あるいは、吸収性および生体利用可能性を向上するための物質で本発明のタンパク質を含む組成物をコーティングするか、該組成物と同時投与する必要があるかもしれない。例えば、タンパク質の処方は、酵素阻害剤とともに、あるいは、リポソーム中で同時投与される場合がある。酵素阻害剤は、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＥＰ）、膵臓トリプシンインヒビターおよびトラシロールを含む。リポソームは、Ｗ／Ｏ／Ｗ型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）ＣＧＦエマルジョンと、従来のリポソーム（Ｓｔｒｅｊａｎら、（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、７：２７参照）とを含む。あるタンパク質が適切に保護されるとき、該タンパク質は、例えば、不活性化希釈液または同化可能な可食性担体とともに経口投与される場合がある。前記タンパク質と他の含有成分とは、硬質または軟質のゼラチン製の殻でできたカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されるか、被検者（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）の食事に直接取り込まれるかの場合がある。
【００４８】
本発明の治療用組成物が注射（すなわち皮内注射）によって投与されるべき場合には、該組成物が流動性を有し、注射が容易なように、前記高純度のタンパク質は医薬品として受容可能なｐＨ（すなわち、約４−９のｐＨ範囲）の水溶液中で溶けることが好ましい。前記組成物は医薬品として受容可能な担体も含むことが好ましい。ここで用いられるところの「医薬品として受容可能な担体」とは、賦形剤、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、有毒物質（ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇｅｎｔｓ）、緩衝剤、吸収遅延または促進剤、界面活性剤およびミセル形成剤、脂質、リポソームおよび液体複合体形成剤（ｌｉｑｕｉｄ ｃｏｍｌｅｘ ｆｏｒｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）安定化剤等のうちいずれかおよびすべてを含む。医薬品として活性がある物質についてのかかる媒体および試薬の使用は、当業者に知られている。いずれかの従来の媒体または試薬が前記活性化合物と不適合である場合を除いて、医薬品組成物中でのこれらの使用が意図される。補助的な活性化合物も前記組成物に取り込まれる場合がある。
【００４９】
本発明の治療用組成物は、必要に応じてろ過滅菌後に、上記の成分の１つまたは組み合わせとともに、適当な送達手段（ｖｅｈｉｃｌｅ）中に必要量の活性化合物（すなわち、すでに説明した１種類または２種類以上の高度に精製単離されたタンパク質）を取り込むことによって調製される滅菌水溶液の形態で処方される場合がある。好ましい医薬品として受容できる担体は、滅菌水、リン酸ナトリウム、マニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムまたはこれらのいずれかの組み合わせのような少なくとも１種類の賦形剤を含む。医薬品として受容可能な他の適当な担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）と、これらの適当な混合物と、植物油とを含む、溶媒または分散媒体を含む。適当な流動性は、例えば、レシチンのコーティングの使用と、分散の場合に必要な粒径の維持と、界面活性剤の使用とによって、維持される場合がある。微生物の作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等のようなさまざまな抗細菌および抗真菌剤によって達成できる。注射可能な組成物の吸収の遅延は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収を遅延する試薬を前記組成物中に含むことによって実現できる。
【００５０】
本発明の治療用組成物は、無菌で、かつ、製造、貯蔵、配達および使用の条件下で安定であるべきであって、細菌および真菌のような望ましくない微生物の汚染する作用から保護されるべきである。本発明の治療用組成物の保全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を維持する（すなわち、汚染を防止する、貯蔵寿命を延ばす等）ように前記組成物を製造する好ましい手段は、滅菌水のような医薬品として受容可能な担体中で前記組成物が使用直前に再構成される凍結乾燥粉末の形状で、タンパク質と、医薬品として受容可能な担体との処方を調製することである。滅菌注射用液の調製のための無菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、前記活性成分と、以前にろ過滅菌された溶液由来のいずれかの追加の所望の成分との粉末が得られる、真空乾燥、凍結乾燥または遠心乾燥法である。本発明の治療用組成物の具体的な処方は、以下および実施例に説明される。
【００５１】
多くの場合では、本発明の治療用組成物は１種類または２種類以上の単離タンパク質を含む。ヒトへの医薬品としての投与に適する多タンパク質処方を含む治療用組成物は、複数の活性タンパク質を投与するうえで望ましい。前記多タンパク質処方は、特定のアミノ酸配列を有する少なくとも２種類または３種類以上の単離タンパク質を含む。多タンパク質処方を調製するときの特別な考慮事項は、前記処方中の全てのタンパク質の生理学的に受容可能なｐＨの水溶液中での溶解度および安定性を維持することを含む。これは、前記多タンパク質処方中の全てのタンパク質と適合可能な１種類または２種類以上の生理学的に受容可能な溶媒および賦形剤を選択することを要する。例えば、適当な賦形剤は、滅菌水か、マニトールか、リン酸ナトリウムか、リン酸ナトリウムおよびマニトールの両方かを含む。多タンパク質処方における追加の考慮事項は、必要な場合には、前記タンパク質の２量体化を阻止することである。ＥＤＴＡその他の当業者に知られた２量体化を阻止することが知られた物質または手順のような２量体化を阻止する試薬が前記多タンパク質処方に含まれる場合がある。
【００５２】
以下に本発明による好ましい医薬品組成物が提供される。
【００５３】
ＧＮＭＴ： ０．７５ｍｇタンパク質
バッファー： 生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）
膨潤剤： グリセリン
安定化剤： リン脂質（０．１％）
【００５４】
１００ｍＭリン酸が代替的なバッファーとして使用されてもよい。代替的な膨潤剤はマニトールおよびデキストロースである。
【００５５】
被検者（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）への上記の治療用組成物の投与は、該被検者の発がんの予防または治療に有効な投与量または期間で既知の手順を用いて実施される場合がある。
【００５６】
本発明の治療用組成物の有効量は、被検者の年齢、性別および体重のような因子によって変動する。本発明の治療用組成物は、経口投与、注射（皮下、静脈内等）、舌下、吸気、経皮適用、直腸投与または治療剤の投与のいずれかの他の一般的な経路によって投与される場合がある。１種類または２種類以上の本発明の治療用組成物の治療上の有効量を被検者に同時に、あるいは、逐次的に投与することが望ましい場合がある。同時または逐次的な投与のためのかかる組成物のそれぞれは、たった１種類のタンパク質しか含まない場合もあれば、上記の多タンパク質処方を含む場合もある。
【００５７】
本発明の１種類または２種類以上の組成物の非経口投与には、投与ユニットあたり好ましくは０．０１μｇ−５００ｍｇ、より好ましくは０．３μｇ−５０ｍｇの各活性成分（タンパク質）が投与される場合がある。本発明の１種類または２種類以上の組成物の経口投与の場合には、投与ユニットあたり、好ましくは０．０１μｇ−５００ｍｇ、より好ましくは０．３μｇ−５０ｍｇの各活性成分（タンパク質）が投与される場合がある。投与が容易で投与量が均一になるため、投与剤形のユニットごとに非経口組成物または経口組成物を処方することは特に有利である。ここで用いられるところの投与剤形のユニットとは、治療されるべきヒトの被検者のために単一投与量として適する物理的に分離されたユニットをいい、各ユニットは、所望の医薬品担体と協働して所望の治療効果を奏するように計算された活性タンパク質の予め定められた量を含む。本発明の新規な投与剤形のユニットの明細は、（ａ）活性化合物の独特な特徴と、達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）ヒトの被検者の治療のためにかかる活性化合物を調合する技術に固有の限界とに左右され、直接依存する。
【００５８】
投与の処方計画は、最適な治療反応を提供するために調整される場合がある。例えば、複数の分割された投与量が数日間、数週間、数ヶ月間または数年間にわたって投与される場合があり、あるいは、前記投与量が治療状況の緊急性に比例して、それぞれの次回の注射で増減される場合がある。１つの好ましい治療処方計画では、治療用組成物の皮内注射が毎週１回、１ないし３週間行われる。投与量は、投与するたびに一定である場合もあれば、それぞれの次の投与で増減される場合がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
本発明は以下の限定ではない実施例によって例示される。
【実施例１】
【００６０】
実施例１（試験管内試験）
１．材料および方法
１．１ 細胞株および細胞培養
２種類のＨＣＣ株細胞Ｈｕｈ７（１３）およびＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨ（１４）と、１種類のヒト肝芽細胞腫株細胞ＨｅｐＧ２（１５）とが本研究に用いられた。細胞は、１０％熱不動化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、ユタ州、Ｌｏｇａｎ）と、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、不必須アミノ酸（０．１ｍＭ）、ファンギゾン(２．５ｍｇ／ｍＬ)およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、ニューヨーク州、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）で、５％ＣＯ２存在下加湿インキュベータ内で培養された。
【００６１】
１．２ ｐＧＮＭＴ、ｐＧＮＭＴ−アンチセンスおよびｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ ｓｈｏｒｔプラスミドの構築
ＣＭＶプロモーターとＧＮＭＴのｃＤＮＡ断片とを含むプラスミドｐＧＮＭＴを構築するために、我々は、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５（Ｋｏｄａｋ、ニューヨーク州、ロチェスター）をベクターとして、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＧＮＭＴ−９−１−２プラスミド（８）をインサート作成用のＰＣＲの鋳型として用いた。前記ＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列と、両端の制限エンドヌクレアーゼ部位とを含む０．９ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。２ｍＭ ＭｇＣｌ２および１５０ｎｍ プライマーという２つの点を除いて、全てのＰＣＲ条件は製造者（パーキン・エルマー、コネチカット州、Ｎｏｒｗａｌｋ）によって推薦されたものであった。２０回の増幅サイクルが、パーキン・エルマーのＡｍｐｌｉｔａｑゴールドＴａｑＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡサーマルサイクラーとを用いて実行された。各ＰＣＲサイクルは、６０°Ｃ３０秒間のプライマーアニーリングのステップと、７２°Ｃ３０秒間のＤＮＡ伸長のステップとを含んでいた。上流プライマー（５’−ｇｃｇｇａａｔｔｃＡＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣ−３’）は、３ｂｐ「クランプ」（ｇｃｇ）を５’末端に有し、１つの制限エンドヌクレアーゼ部位（ＥｃｏＲＩ）およびＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列とがこれに続いた。下流プライマー（５’−ｇｃｇｇａａｔｔｃＧＴＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＣ−３’）は、前記上流のプライマーと類似の構造的モチーフを含むが、前記ＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列の終結領域のネガティブ鎖配列を含んでいた。増幅直後に、ＰＣＲ反応液にＳＤＳ（０．１％）とＥＤＴＡ（５ｍＭ）とが添加された。ＤＮＡは２．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび７０％エタノールで沈殿された。ＥｃｏＲＩでの消化後、ＤＮＡ断片はアガロースゲルからの溶出によって単離ｓれ、ＥｃｏＲＩ消化されたｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５と連結された。
【００６２】
ファージミドのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＧＮＭＴ−９−１−２（８）から１３６ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するための２本のプライマー（Ｆ１、５’−ｇｃｇｇａａｔｔｃＡＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＧＴＧＴＡＣ−３およびＲ１、５’−ｇｃｇｇａａｔｔｃＴＧＴＡＣＴＣＧＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣ−３’）がアンチセンス−ＧＮＭＴプラスミド（ｐＧＮＭＴ−アンチセンス）を構築するために用いられた。前記断片は、前記ＧＮＭＴの翻訳開始部位と、両端の２つの制限酵素部位（ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ）にわたるアンチセンス配列を含んでいた。クローニングの手順はｐＧＮＭＴについて説明したものと類似していた。ＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列組換えタンパク質（ＲＰ）を大腸菌で発現させるために、我々は、プラスミドｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ−ｓｈｏｒｔを構築した。ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩ制限酵素（ストラタジーン、カリフォルニア州、ラホヤ）を用いて大きなＳ−タグＤＮＡ断片がｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ（９）から切り出され、得られたプラスミドＤＮＡはＫｌｅｎｏｗ反応の後、再連結された。プラスミドＤＮＡ配列は、ダイターミネータサイクルシーケンシングコアキットを備えたＤＮＡシーケンサー（アプライド・バイオシステムズモデル３７３Ａ、バージョン１．０．２、カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ）で確認された。
【００６３】
１．３ ＧＮＭＴ組換えタンパク質の発現および精製
ｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ−ｓｈｏｒｔが大腸菌ＢＬ２１菌株を形質転換するのに用いられ、ＩＰＴＧ誘導（誘導時間３時間、細菌の培養最適密度［ＯＤ］０．６−０．７）に用いられた。ＧＮＭＴの組換えタンパク質の精製は、製造者（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州、マジソン）のガイドラインに従って、Ｎｉ２＋が荷電したヒスチジン結合樹脂カラムを用いて実施された。組換えタンパク質の濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアース、イリノイ州、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）で測定され、純度はサンプルを１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド ミニゲル（バイオラッドラボラトリーズ、カリフォルニア州、リッチモンド）上で泳動することによってテストされた。
【００６４】
１．４ トランスフェクション
全てのプラスミドＤＮＡサンプルは、Ｑｉａｇｅｎメガキット（ドイツ、Ｈｉｌｄｅｎ）を用いて調製された。標準的なリン酸カルシウム共沈殿法（１６）がさまざまな肝がん細胞株由来の培養細胞にプラスミドＤＮＡをトランスフェクションするのに用いられた。トランスフェクション後４８時間の細胞は、ＤＭＳＯ（ナカライテスク、大阪）に溶解したＢａＰ（シグマーアルドリッチ、ドイツ、シュタインハイム）の異なる濃度（１ないし１０μＭ）で１６時間処理された。処理細胞は、ＩＦＡか３２Ｐポストラベリングかのいずれかに供された。陰性対照を作るために、０．１％ ＤＭＳＯが前記細胞培養に添加された。
【００６５】
１．５ ＧＮＭＴを発現する安定なクローンの確立
リン酸カルシウム法を用いて、ＨｅｐＧ２細胞が、プラスミドＤＮＡのｐＧＮＭＴとｐＴＨ−Ｈｙｇ（クロンテク、カリフォルニア州、パロアルト）とでコ・トランスフェクションされた。細胞は、ハイグロマイシン（３００μｇ／ｍＬ）を含む選択培地に置かれた（１７）。１３個以上のクローンが選択され、ＧＮＭＴ発現が、各クローンから回収された細胞溶解液を用いてウェスタンブロットアッセイ法で解析された。これらのうちＳＣＧ２ １−１および１−１１は、そのＧＮＭＴ発現レベルに基づいて、さらに研究するために選択された。プラスミドｐＦＬＡＦ−ＣＭＶ−５およびｐＴＫ−ＨｙｇでトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞から選択された安定なクローンである、ＳＣＧ２−ｎｅｇも本研究における対照として用いられた。
【００６６】
１．６ 間接免疫蛍光抗体法（ＩＦＡ）
培養ＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨまたはＨｕｈ７細胞は、カバースライド上に配置され、１０μＭＢａＰまたは０．１％ＤＭＳＯで処理され、固定液Ｉ（ＰＢＳ中に、４％ パラホルムアルデヒド、４００ｍＭ ショ糖）で３７°Ｃ３０分間固定され、固定液ＩＩ（固定液Ｉに０．５％ トリトンＸ−１００を添加）で室温１５分間固定され、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中に０．５％ ＢＳＡ）で室温１時間処理された。ＰＢＳで洗浄後、前記スライドはさまざまな１次抗体と４°Ｃ終夜反応させられた。２種類の抗体は、１：５００希釈の抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｋｏｄａｋ、ニューヨーク州、ロチェスター）と、１：２００希釈のウサギ抗ＧＮＭＴ抗血清Ｒ４（１２）とであった。ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧと、ＴＲＩＴＣコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（シグマ−アルドリッチ）とが２次抗体として用いられた。ＰＢＳで４回洗浄後、スライドはマウントされ、共焦点蛍光顕微鏡（ＴＣＳ−ＮＴ、ドイツ、Ｈｉｌｄｅｎ）を用いて観察された。細胞各を局在化させるために、ＤＮＡがヘキストＨ３３２５８（シグマ−アルドリッチ）で染色された。
【００６７】
１．７ ＧＮＭＴｃＤＮＡを含むアデノウイルス（Ａｄ−ＧＮＭＴ）の作成
ＣＭＶプロモーターで制御されるＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列の組換えアデノウイルスを構築するために、ＰＧＥＸ−ＧＮＭＴ（９）がＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化され、ＸｈｏＩ部位は平滑化された後、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化され、ＸｂａＩ部位が平滑化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ （−）（ストラタジーン）に挿入された。ＧＮＭＴｃＤＮＡも、ｐＸＣＭＶ−ＧＮＭＴを作成するために、ｐＡｄＥ１ＣＭＶ／ｐＡ（１８）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ部位にクローン化された。組換えアデノウイルスは、ｐＸＣＭＶ−ＧＮＭＴおよびｐＪＭ１７（１８）の２９３細胞へのコ・トランスフェクション後７ないし１２日以内に出現した。個別のウイルスクローンが単離され、アデノウイルス配列に特異的なプライマーセット（１８）、挿入フランキング領域（１８）およびＧＮＭＴのｃＤＮＡ配列（８）によるＰＣＲを用いて同定された。ウイルスのタイターは上記のプラークアッセイ法（１８）によって決定された。
【００６８】
１．８ ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体を定量するための３２Ｐポストラベリングおよび５次元薄層クロマトグラフィ（５Ｄ−ＴＬＣ）
ｐＧＮＭＴプラスミドＤＮＡで４８時間一時的にトランスフェクションされたＳＣＧ２細胞およびＨＣＣ細胞株が用いられた。ＤＮＡは、１０μＭＢａＰまたは０．１％ＤＭＳＯ（対照）で１６時間処理された細胞から抽出され、コハク酸バッファー（２０ｍＭ コハク酸ナトリウムおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２）中のミクロコッカスエンドヌクレアーゼおよび膵臓ホスホジエステラーゼで３時間３７°Ｃで消化された。得られた３’ヌクレオチドはブタノール溶液でさらに２回抽出され、ラベリングバッファー中でＴ４キナーゼを用いて３８°Ｃ３０分間γ−３２Ｐ−ＡＴＰで標識された。５Ｄ−ＴＬＣが標識ＤＮＡ付加体を解明するために用いられた（２０）。付加体相対レベル（ＲＡＬ）は、付加体ヌクレオチド中のｃｐｍ／全ヌクレオチド中のｃｐｍ ｘ 希釈倍率として計算された。
【００６９】
１．９ アリル炭化水素ヒドロキシラーゼ（ＡＨＨ）アッセイ
シトクロムｐ４５０Ａ１酵素活性を測定するために、約１００μｇの細胞ホモジネートが反応液（1００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．４ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および２０μＭ ＢａＰ）と３７°Ｃ１０分間インキュベーションされた。上清のタンパク質濃度はバイオラッドのタンパク質アッセイキット（カリフォルニア州、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）を用いて決定された。反応はアセトンの添加によって停止され、抽出がヘキサンおよび１Ｎ ＮａＯＨで実施された。ＮａＯＨ分画が、励起波長３９６ｎｍ、発光波長５２２ｎｍの蛍光分光光度計（日立、Ｆ４５００）で測定された。反応産物（３ヒドロキシ−ＢａＰ）の濃度は、標準試料との比較により計算され、手順の詳細は文献（２１）に説明されている。
【００７０】
１．１０ ウェスタンブロット（ＷＢ）アッセイ
ＷＢはトランスフェクションされた細胞またはＳＣＧ２クローン中のＧＮＭＴを検出するために用いられた。抗ＧＮＭＴモノクローナル抗体１４−１がＧＮＭＴを検出するのに用いられた（９）。ＷＢの手順の詳細は文献（２２）に説明されている。
【００７１】
１．１１ ラマルク型遺伝アルゴリズム（ＬＧＡ）によるドッキング
ＬＧＡが、ＢａＰと、さまざまな型のＧＮＭＴとの間の相互作用を解明するために用いられた。Ａｕｔｏｄｏｃｋ３．０ソフトウェアが最も有利なリガンド結合相互作用を同定するために用いられた。ファンデルワールス力結合と、疎水結合（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎｓ）と、静電気およびねじり自由エネルギーとが、リガンド−タンパク質結合の自由エネルギーを再現するために経験的に決定された（２３）。ヒトＧＮＭＴとのアミノ酸配列の相同性が９１％であることから、ラットＧＮＭＴのＸ線結晶学的なデータがドッキングに用いられた（２４、２５）。ＢａＰと、メチルトランスフェラーゼ−１ＶＩＤ（２６）、１ＨＭＹ（２７）、２ＡＤＭ（２８）、１ ＤＣＴ（２９）、１ ＢＯＯ（３０）、２ＤＰＭ（３１）１ＥＧ２（３２）および１Ｇ５５（３３）との間の相互作用が解析された。パラメータは以下のとおり。試行回数 １０回、ポピュレーションサイズ ５０、試行−終止基準 最大２７，０００世代または２．５ ｘ １０５回のエネルギー評価のいずれかが先に達成されること。ｒｍｓｄコンフォメーションクラスタリング許容値の０．５オングストロームが前記リガンドの結晶学的座標値から計算された。手順の詳細は文献（３４）に利用可能である。
【００７２】
１．１２ ＧＮＭＴ酵素活性アッセイ
Ｎｉ２＋−荷電ヒスチジン結合樹脂カラムから精製されたＧＮＭＴ組換えタンパク質が酵素活性アッセイに用いられた。ＧＮＭＴ組換えタンパク質（１０ｍｇ）が、１０、５０または１００μＭのＢａＰまたはＤＭＳＯ溶媒（対照）と室温で６０分間混合された後、５０ｍＭ グリシン、０．２３ｍＭ ＳＡＭおよび２．１６μＭ Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］−メチオニン（７６．４Ｃｉ／ミリモル）を含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）の１００μＬで処理された。３０分間３７°Ｃでのインキュベーション後、個々の反応は１０％ トリクロロ酢酸および５％ 活性炭（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｈａｒｃｏａｌ）の５０μＬ混合物を添加することにより停止された。各反応は３重に繰り返して実施された。この手順はＣｏｏｋおよびＷａｇｎｅｒ（３５）に詳細に説明されている。
【００７３】
２．結果
２．１ ＧＮＭＴの核内移行がＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨおよびＨｕｈ７細胞の両方でＢａＰにより誘導された。
ＧＮＭＴは、ｐＧＮＭＴのＤＮＡでトランスフェクション後４８時間のＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨ細胞の細胞質中で発現された（ウサギ抗ＧＮＭＴ抗血清およびマウス抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体とのＩＦＡ２重染色、図１Ａおよび１Ｂ）。同様の結果はＤＭＳＯ溶媒で処理された対照のＨｕｈ７細胞でも認められた（図１ＣおよびＤ）。これに対して、ＧＮＭＴタンパクは１０μＭ ＢａＰで１６時間処理されたＨｕｈ７細胞の核内移行は部分的にしか起こらなかった（図１ＥおよびＦ）。細胞核を局在化させるために、ＤＮＡはヘキストＨ３３２５８で染色された（図１ＤおよびＦ）。
【００７４】
２．２ ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成に対するＧＮＭＴの阻害効果
３２Ｐ−ポストラベリング法および５Ｄ−ＴＬＣ法がＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成を定量するのに用いられた。１０Ｍ ＢａＰとの１６時間の処理後、ｐＧＮＭＴでトランスフェクションされたＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７およびＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨ細胞でのＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成は、ベクタープラスミドでトランスフェクションされた細胞と比較して、それぞれ５２．８％、１３．５％および２０．７％減少した（表１）。ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成に対するＧＮＭＴの阻害効果はＨｅｐＧ２細胞で最も強力であったので、我々はこの株細胞を以下の実験での標的として用いた。ＨｅｐＧ２細胞のＤＮＡトランスフェクション効率は約３０％であった。ｐＧＮＭＴに加えて、アンチセンスＧＮＭＴ配列を含むプラスミドが、ＧＮＭＴの効果の特異性を確認する目的で構築された。ＢａＰ処理後、ベクターの対照プラスミドでトランスフェクションされた細胞と比較して、ｐＧＮＭＴでトランスフェクションされた細胞で形成されたＢＰＤＥ付加体は、３４．１％の減少が認められた（図８Ａ、レーン３および４）。これに対し、ＢＰＤＥ付加体の２９．２％の増加がｐＧＮＭＴアンチセンスでトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞で認められた（レーン５）。等量（２０μｇ）のｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ−およびｐＧＮＭＴアンチセンスでトランスフェクションされた細胞で形成されたＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体の量は、前記ベクターの対照細胞で形成された量とほぼ等しかった（レーン６）。異なるトランスフェクション実験でのＧＮＭＴ発現と、アンチセンスＧＮＭＴｃＤＮＡプラスミドコンストラクト（ｐＧＮＭＴアンチセンス）の効果とは、マウス抗ＧＮＭＴモノクローナル抗体をもＷＢアッセイによって確認された。図２Ｂのレーン４に示されるとおり、ＧＮＭＴは、ｐＧＮＭＴとｐＧＮＭＴアンチセンスとを等量トランスフェクションされた細胞の溶解液では検出されなかった。
【００７５】
【表２】
【００７６】
＊：ヌクレオチド１０８個あたりの付加体相対レベル（ＲＡＬ）、γ−３２Ｐ−ＡＴＰポストラベリング法によって測定。
＊＊：トランスフェクション効率は、ＨｅｐＧ２が３０％、Ｈｕｈ７が４５％、ＨＡ２２Ｔ／ＶＧＨが６０％であった。
【００７７】
ｐＧＮＭＴをトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞由来の２個の安定クローン（ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−１−１１）が、上記と同じ実験に用いられた。ノザンブロットアッセイの結果は、ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−１−１１細胞に存在するＧＮＭＴのｃＤＮＡの（細胞あたりの）コピー数がそれぞれ３および１であることを示した（データ示さず）。ウェスタンブロットアッセイの結果は、ＳＣＧ２−１−１細胞中のＧＮＭＴ発現レベルがＳＣＧ２−１−１１細胞での発現レベルのほぼ３倍であることを示した（図２Ｄ、レーン２および３）。ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−１−１１細胞を１または１０μＭのＢａＰで処理した後、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の阻害は、両方の処理条件下でのＧＮＭＴ発現レベルに比例した（図２Ｃ）。
【００７８】
同じ実験がアデノウイルスで伝達されるＧＮＭＴのｃＤＮＡ（Ａｄ−ＧＮＭＴ）を用いて実施された。正の直線的相関が、Ａｄ−ＧＮＭＴのＭＯＩｓと、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の阻害との間に認められた（図３）。Ａｄ−ＧＦＰを感染した対照細胞と比較すると、Ａｄ−ＧＮＭＴのＭＯＩｓが１００から、２５０に、そして１，０００に増加すると、ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成は１９．５％、３６．６％および６１．８％にそれぞれ減少した（図３Ａ）。１００ＭＯＩｓのＡｄ−ＧＦＰの対照と、１００、２５０および１，０００ＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴとで感染されたＨｅｐＧ２細胞のＧＮＭＴの発現レベルがウェスタンブロット法で解析され、結果が図３Ｂ、レーン１−４に示される。
【００７９】
２．３ Ｂａｐによって誘導されるＣＹＰ１Ａ１酵素活性に対するＧＮＭＴの効果
ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−ｎｅｇ細胞は、さまざまな濃度のＢａＰで１６時間処理された後、ＡＨＨアッセイを用いて細胞のＣＹＰ１Ａ１酵素活性が測定された。３、６および９μＭのＢａＰで処理された細胞でのＣＹＰ１Ａ１活性は、ＳＣＧ２−ｎｅｇ細胞についてはそれぞれ２４．５ピコモル／ｍｇ／分、４１．５ピコモル／ｍｇ／分および７１．３ピコモル／ｍｇ／分で、ＳＣＧ２−１−１細胞についてはそれぞれ２０．１ピコモル／ｍｇ／分、２７．７ピコモル／ｍｇ／分および３６．２ピコモル／ｍｇ／分であった（図４）。９μＭのＢａＰで処理された細胞については、これは、ＧＮＭＴ発現細胞（すなわちＳＣＧ２−１−１）でのＣＹＰ１Ａ１酵素活性が、ＳＣＧ２−ｎｅｇ細胞と比較して４５％減少したことを表す。
【００８０】
２．４ ＧＮＭＴ−ＢａＰ相互作用のモデル作成
ＬＧＡが物理的なＧＮＭＴ−ＢａＰ相互作用を予測するために用いられた。ここでも、ヒトＧＮＭＴタンパク質との相同性が９１％であるため、ラットのＧＮＭＴ−ＢａＰ相互作用のＸ線結晶解析データがＢａＰとのドッキング実験に用いられた。図５Ａおよび５Ｂに示すとおり、ＢａＰはＧＮＭＴの２量体型（黄色）と４量体型（シアン色）との両方に結合するが、２量体型（タンパク質データベースＰＤＢコード；１Ｄ２Ｃ）と優先的に結合することを我々はみつけた。このクラスターは、ＳＡＭおよびＳＡＨ結合部位が交差する場所にあたる（表３および図５Ｂ）。ＧＮＭＴの２量体型とＢａＰとの間の結合エネルギーが低い（−９．１０Ｋｃａｌ／モル）ことは、ＢａＰがＳＡＭの位置を変位させることを示唆し、ＢａＰと、ＳＡＭと既に結合しているＧＮＭＴ（ＰＤＢコード：１ＸＶＡ）との結合エネルギーが高い（２５４．９Ｋｃａｌ／モル）ことは、ＢａＰおよびＳＡＭがＧＮＭＴとの結合について競合していることを示唆する（表３）。したがって、（２量体の一方のサブユニットのＴｈｒ３７、Ｇｌｙ１３７およびＨｉｓ１４２と、他方のサブユニットのＧｌｕ１５とを含む）複数のＧＮＭＴアミノ酸残基が、ＢａＰと非常に近接している（図５Ｃ）。
【００８１】
表３ ＧＮＭＴタンパク質とＢａＰ分子とのラマルク型遺伝アルゴリズムによるドッキング
【００８２】
【表３】
【００８３】
ａ：ＰＤＢ、タンパク質データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）
ｂ：クラスターはＳＡＭおよびＳＡＨ結合領域の交差する場所にあたる。
ｃ：ＢａｄはＳＡＭから〜２オングストロームで、エネルギーレベルが高いことは、かかる複合体の形成は困難であることを示唆する。
ｄ：ＢａＰはＳＡＭの１を変位させる。
ｅ：ＲＭＳＤ＝２．７０オングストローム 第２のクラスター（ｎ＝５）は、ＲＭＳＤが０．６８オングストロームで、平均エネルギーが−８．８０Ｋｃａｌ／モルの既知の結晶構造に対応する。第２のクラスターを安定化させる役割を果たすかもしれない酢酸基が近傍に位置することに留意せよ。
【００８４】
２．４ ＢａＰで誘導されるＧＮＭＴ酵素活性の阻害
ＢａＰがＧＮＭＴと結合可能であるという推論に基づいて、ＧＮＭＴ酵素活性に対するＢａＰの効果の可能性が、Ｈｉｓタグ付きのＧＮＭＴ組換えタンパク質を大腸菌で発現するためのプラスミドｐＧＮＭＴ−Ｈｉｓ−ｓｈｏｒｔを構築することによって研究された。Ｎｉ２＋荷電したヒスチジン結合樹脂カラムから精製されたＧＮＭＴ組換えタンパク質が我々の解析に用いられた。図６に示されるとおり、１０および５０μＭのＢａＰを含む反応からのＧＮＭＴ酵素活性は、ＤＭＳＯの対照と比較して、それぞれ４４％および６２％減少した。
【００８５】
ＩＦＡが、ＧＮＭＴの核内移行を誘導するＢａＰの能力を実証する。我々の結果は、ＧＮＭＴがＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成を阻害するだけでなく、ＣＹＰ１Ａ１酵素活性を下向き調節することを示し、逆に、ＢａＰはＧＮＭＴ酵素活性も阻害する。最後に、我々は、ＢａＰ−ＧＮＭＴ相互作用の正確な場所を示すためにドッキング実験を用いた。これらの結果は、損傷の生じる可能性がある型の曝露に対する細胞の防御機構が新たに見つかったことを意味する。我々は、終始一貫した結果によって、一時的トランスフェクション、安定的なトランスフェクションおよびアデノウイルス感染の系で、ＧＮＭＴによるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の阻害を確認した。ＧＮＭＴのｃＤＮＡのアンチセンスコンストラクトが相互作用の特異性を示すために用いられ（図２Ａ）、ウェスタンブロットアッセイがさまざまな遺伝子導入実験のセットにおけるＧＮＭＴ発現レベルを監視するために用いられた。ＧＮＭＴのＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の用量依存的な阻害効果は、ＨｅｐＧ２の安定なクローンと、ＧＮＭＴｃＤＮＡを伝達する組換えアデノウイルスとでさらに調べられた（図２Ｃおよび３Ａ）。
【００８６】
多くのＰＡＨｓはアリル炭化水素レセプター（ＡｈＲ）依存経路を通じてシトクロムＰ−４５０発現を誘導する（３７）。細胞内に拡散した後、ＢａＰはＡｈＲと結合して核内に移行し、核内で、ＢａＰ−ＡｈＲヘテロ２量体がＡｈＲ核内移行タンパク質（Ａｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ（Ａｒｎｔ））との複合体を形成する（２）。ＢａＰ−ＡｈＲ−Ａｒｎｔ複合体は、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子を、プロモーター領域内の生体異物応答エレメント（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）との相互作用を通じて転写を活性化する（３８）。ＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の阻害に加えて、我々の結果は、ＧＮＭＴがＢａＰによって誘導されたＣＹＰ１Ａ１酵素活性を低下させることができることを示す（図４）。Ｆｏｕｓｓａｔら（３９）は、ＧＮＭＴがＣＹＰ１Ａ１遺伝子の転写活性化因子ではないことを証明するためにＡｈＲ欠損トランスジェニックマウスを用いた。我々のリアルタイムＰＣＲ解析の予備的なデータは、ＢａＰ処理後、ＳＣＧ２−１−１細胞でのＣＹＰ１Ａ１遺伝子発現は、ＨｅｐＧ２細胞と比較して約２０％減少したことを示した（投稿準備中）。
【００８７】
従前の研究は、ラットＧＮＭＴの４量体型が酵素として作用し、ラットＧＮＭＴの２量体型はＰＡＨｓと結合できることを示した（４０）。本発明では、ＬＧＡおよびスコアリング機能が、結合に関連する自由エネルギーの変化を推定して、ＢａＰとさまざまな型のＧＮＭＴとの間の相互作用の可能性がある部位を特定するために用いられ、ラットＧＮＭＴについてのＸ線結晶学的なデータがこの目的のために利用された。結果は、（ａ）ＢａＰ結合ドメインはＧＮＭＴの基質（ＳＡＭ）結合部位に位置し、（ｂ）ＢａＰはＧＮＭＴの２量体型との結合を優先することを示す。ＧＮＭＴ４量体のＲ１７５Ｋ突然変異型（ＰＤＢコード；１Ｄ２Ｇ）が、Ｒ／Ｋ残基は前記結合部位に近い（前記ＳＡＭ部位から−５オングストローム）が、Ｒ／Ｋ残基はＧＮＭＴ−ＢａＰクラスター形成には実質的になんら効果がないことを示すために用いられた（表３）。これに対し、酢酸イオンが存在すると、１ＸＶＡ結晶構造内のＧＮＭＴ−ＳＡＭ結合部位に第２の好ましいクラスターの形成が促進される（表３、最終行）。さまざまな検索システムのうちでＬＧＡ法は、結晶構造を特定する可能性が最も高い（２３）。ポピュレーションの多いクラスターは、結晶構造から０．２−０．８オングストロームのＲＭＳの相違を示す結晶学的に決定された位置に対応する。たいていのリガンドについて、我々のドッキングシミュレーションは、１．０オングストロームのＲＭＳＤ以内で結晶学的な結合モードに適合する単一の結合モードを予測した（２３）。ＬＧＡは、リガンドが高分子の標的に結合したコンホメーションを予測するための信頼できる方法であることが示される。ＢａＰ−ＧＮＭＴの相互作用は、ＧＮＭＴ酵素活性がＢａＰの存在下で５０％近く減少したことを示す機能的なアッセイによっても確認された（図６）。
【００８８】
ＢａＰはＧＮＭＴのＳＡＭ結合ドメインとの結合を優先するため、ＬＧＡがＢａＰと、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、ＨｈａＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＴａｑＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＨａｅＩＩＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＰｖｕＩＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＤｐｎＩＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼ、ＲｓｒＩ ＤＮＡ メチルトランスフェラーゼおよびＤＮＭＴ２という、８種類の他のＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅｓ）との間の相互作用を研究するために用いられた。我々の結果は、ＢａＰがＨｈａＩ−、ＨａｅＩＩＩ−、ＰｖｕＩＩ−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼおよびＤＮＭＴ２とは結合可能だか、ＣＯＭＴ、ＴａｑＩ−メチルトランスフェラーゼ、ＤｐｎＩＩ−メチルトランスフェラーゼおよびＲｓｒＩ−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼとは結合しなかったことを示す（表４）。ＢａＰが優先的に結合する全てのＤＮＡメチルトランスフェラーゼの標的原子はシトシンであってアデニンでないことが知られている（４１）。これは、ＢａＰのような環境発がん物質が異なるＤＮＡメチルトランスフェラーゼと相互作用する可能性があることを示唆する最初の証拠である。ＧＮＭＴ酵素活性が全トランス−レチノイン酸によって誘導されると、ラット肝細胞でのＤＮＡメチル化が低下することを示す証拠（４２）に照らして、ＢａＰは、ＤＮＭＴおよびＧＮＭＴとの相互作用を通じて、ＤＮＡメチル化に影響を与えて、発がん経路に寄与するかもしれないことが示される。
【００８９】
表４ 複数のＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼとＢａＰ分子とのラマルク型遺伝アルゴリズムによるドッキングａ
【００９０】
【表４】
【００９１】
ａ：ＳＡＭ分子は１ＶＩＤ、１ＨＭＹ、２ＡＤＭおよび２ＤＰMメチルトランスフェラーゼの高分子からドッキング前に除去された。ＢａＰ分子が以前のＳＡＭの位置に移動することが試みられた。ＳＡＨ分子はドッキング前に１ＢＯＯおよび１Ｇ５５メチルトランスフェラーゼ高分子から除去された。
ｂ：ＰＤＢ：タンパク質データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）
ｃ：第２クラスターのエネルギー（ポピュレーション６／１０）は−０．３２Ｋｃａｌ／モルで、ＣＯＭＴはＢａＰと特定の好ましい位置で結合するのではない。
ｄ：第２のクラスター（ポピュレーション１／１０）のエネルギーは−６．４５Ｋｃａｌ／モルで、ＨｈａＩ−ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼは特定にエネルギーの低い好ましい位置でＢａＰと結合した。
ｅ：結合エネルギーが高い（＋４７．１９Ｋｃａｌ／モル）は、ＴａｑＩ ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼがＢａＰとは結合しないことを示唆する。
ｆ：第２のクラスターのエネルギー（ポピュレーション１／１０）は−９．５０Ｋｃａｌ／モルで、エネルギーが最低のクラスター（ポピュレーション８／１０、エネルギー−９．６９Ｋｃａｌ／モル）に非常に近い。そこで、ＨａｅＩＩＩＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼはＢａＰと特定の好ましい位置で強く結合した。
ｇ：結合エネルギーが高いこと（−８．６９Ｋｃａｌ／モル）は、ＰｖｕＩＩがＢａＰと結合することを示唆する。他の２つの観察されたクラスター（−８．６３Ｋｃａｌ／モルおよび−８．５８Ｋｃａｌ／モル）の結合エネルギーは最低エネルギーのクラスターと非常に近かった。
ｈ：＋１３．４６Ｋｃａｌ／モルの結合エネルギーは、ＤｐｎＩＩ ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼはＢａＰとは結合しないことを示唆する。
ｉ：＋８５．６４Ｋｃａｌ／モルの結合エネルギーは、ＲｓｒＩ ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼはＢａＰとは結合しないことを示唆する。
ｊ：−８．７０Ｋｃａｌ／モルの結合エネルギーはＤＮＭＴ２がＢａＰと特定の好ましい位置で強く結合することを示唆する。
【００９２】
３．要約
グリシンＮメチルトランスフェラーゼは（ａ）Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）のＳ−アデノシルホモシスチンに対する比の調節と、（ｂ）葉酸との結合とによって遺伝的安定性に影響を与える。ＧＮＭＴの４Ｓ多環芳香族炭化水素結合タンパクとしての同定に基づいて、ｃＤＮＡトランスフェクションにおいてＧＮＭＴを一時的か安定的かのいずれかで発現する肝がん株細胞が、ベンゾ［ａ］ピレン（ＢａＰ）解毒経路におけるＧＮＭＴの役割を解析するために用いられた。間接免疫蛍光抗体アッセイからの結果は、ＧＮＭＴが、ＢａＰ処理の前は細胞質に発現し、ＢａＰ処理後に細胞核内に移行したことを示す。ベクタープラスミドでトランスフェクションした細胞と比較すると、ＧＮＭＴ発現細胞で形成されるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体の数は有意に減少した。さらに、ＧＮＭＴによるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成の用量依存性阻害が、ＧＮＭＴのｃＤＮＡを伝達する異なるＭＯＩｓの組換えアデノウイルスを感染させたＨｅｐＧ２細胞において観察された。ＡＨＨ酵素活性アッセイによると、ＧＮＭＴはＢａＰで誘導されたＣＹＰ１Ａ１酵素活性を阻害した。ＧＮＭＴのＸ線結晶学的データとともにラマルク型遺伝アルゴリズムを用いるＢａＰの自動化ドッキングは、ＢａＰがＧＮＭＴの２量体型のＳＡＭ結合ドメインに優先的に結合することを解明したが、これは、損傷を与える可能性のある曝露に対する細胞防御の新規知見である。ＧＮＭＴに加えて、ドッキング実験の結果は、ＢａＰがＨｈａＩメチルトランスフェラーゼ、ＨａｅＩＩＩメチルトランスフェラーゼ、ＰｖｕＩメチルトランスフェラーゼおよびヒトＤＮＭＴ２とを含む他のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅｓ）と容易に結合することを示した。したがって、ＢａＰ−ＤＮＭＴおよびＢａＰ−ＧＮＭＴの相互作用は発がんに寄与することが示された。
【実施例２】
【００９３】
実施例２ ＢａＰ結合と生体内での発がん予防
１．試験用ＧＮＭＴトランスジェニックマウスモデル
１．１ ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドの構築
ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドは、（肝臓および腎臓で特異的に発現するホスホエノルピルビン酸カルボキシキナーゼのプロモーター（ＰＥＰＣＫ、Ｖａｌｅｒａら、１９９４）を含む）ｐＰＥＰＣＫｅｘベクターと、（完全長ヒトＧＮＭＴのｃＤＮＡを含む）ｐＳＫ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドとを用いて調製された。両方のプラスミドはＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化された。インサートは前記ベクターに連結され、コンピテント細胞（ＪＭ１０９）に形質転換された。クローンはアンピシリンで選択され、ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドであることをチェックするためにＰＣＲでスクリーニングされた（図１）。
【００９４】
１．２ トランスジェニックマウスの作出
ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドが増幅され、ＡｓｃＩで消化されて線状（４．３ｋｂ）にされた。線状ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴ遺伝子は、ＦＶＢ系統のマウスの０．５日胚に、前核顕微注入法によって導入された。前記胚は仮親（ＩＣＲ系統）に移植された。１８〜２１日後、マウスは出産し、トランスジェニックマウスを調べるためにＰＣＲでスクリーニングされた。
【００９５】
１．３ トランスジェニックマウスの肝臓および腎臓におけるヒトＧＮＭＴの発現
ＰＥＰＣＫプロモーター特異的な発現臓器をチェックするために、我々はノザンブロット法（図２）およびウェスタンブロット法（図３）を用いた。ヒトＧＮＭＴは肝臓および腎臓に特異的に発現していた。トランスジェニックマウスでのＧＮＭＴ発現レベルは正常マウスより高かった。
【００９６】
１．４ ＧＮＭＴトランスジェニックマウスおよびＨＢＶラージＳトランスジェニックマウスへのＢａＰ処理
以下の２群のマウス
１．ＧＮＭＴトランスジェニックマウス
２．正常マウス
が体重７ｇあたり３７５μｇのＢａＰを１５日間毎日腹腔内注射で処理された。
【００９７】
図４は、ＢａＰ処理され、処理の７８週間後に屠殺された前記２群の肺の病理観察写真である。
【００９８】
２．結果と結論
ＢａＰ処理されたトランスジェニックマウスでＧＮＭＴが過剰発現されるとき、該マウスの３０％しか肺の腫瘍が発生しなかった。（ＧＮＭＴが過剰発現されない）ＢａＰ処理された正常マウスは６６．６６％の発症率で肺の腫瘍が発生した。したがって、ＧＮＭＴは生体内でＢａＰと結合でき、これにより、発がんを予防できる。
【００９９】
略語一覧
ＧＮＭＴ グリシンＮメチルトランスフェラーゼ
ＨＣＣ 肝細胞性癌
ＰＡＨ 多環芳香族炭化水素
ＢａＰ ベンゾ［ａ］ピレン
ＢＰＤＥ ＢａＰ−７，８−ジオール９，１０−エポキシド
ＭＯＩ 多重感染度
ＩＰＴＧ イソプロピルチオ−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
ＣＹＰ１Ａ１ シトクロムＰ４５０Ａ１
ＡｈＲ アリル炭化水素レセプター
Ａｒｎｔ Ａｈレセプター核移行タンパク質
ＸＲＥ 生体異物応答エレメント（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＡＨＨ アリル炭化水素ヒドロキシラーゼ
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＩＦＡ 間接蛍光抗体法アッセイ
ＬＧＡ ラマルク型遺伝アルゴリズム
ＰＤＢ タンパク質データバンク
Ｍｔａｓｅ（ｓ） メチルトランスフェラーゼ
ＤＮＭＴ２ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ２
ＲＡＬ 付加体相対レベル
【０１００】
文献
１．Ｆｉｓｃｈｍａｎ．Ｍ．Ｌ．、Ｃａｄｍａｎ、Ｅ．Ｃ．およびＤｅｓｍｏｎｄ、Ｓ．Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎ ＬａＤｏｕ Ｊ．編、Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｐ．ｐ．１８２−２０８．Ｐｒｅｔｉｎｃｅ−Ｈａｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．Ｃｏｎｎ．、ＵＳＡ、１９９０．
【０１０１】
２．Ｗｈｉｔｌｏｃｋ、Ｊ．Ｐ．Ｊｒ．、Ｏｋｉｎｏ、Ｓ．Ｔ．、Ｄｏｎｇ、Ｌ．、Ｋｏ、Ｈ．Ｐ．、Ｃｌａｒｋｅ−Ｋａｔｚｅｎｂｅｒｇ、Ｒ．、Ｍａ、Ｑ．およびＬｉ、Ｈ．Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０ ５： Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０１Ａ１： ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１０： ８０９，８１８、１９９６．
【０１０２】
３．Ｆｏｌｄｅｓ、Ｒ．Ｌ．、Ｈｉｎｅｓ、Ｒ．Ｎ．、Ｈｏ、Ｋ．Ｌ．、Ｓｈｅｎ、Ｍ．Ｌ．、Ｎａｇｅｌ、Ｋ．Ｂ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．３−Ｍｅｔｈｙｌｃｈｌａｎｔｈｒｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ−４５０ｃ ｇｅｎｅ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２３９： １３７−１４６、１９８５．
【０１０３】
４．Ｒａｖａｌ、Ｐ．、Ｉｖｅｒｓｅｎ、Ｐ．Ｌ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ Ｐ４５０１Ａ１ ａｎｄ Ｐ４５０１Ａ２ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４１： １７１９−１７２３、１９９１．
【０１０４】
５．Ｗｉｊｎｈｏｖｅｎ．Ｓ．Ｗ．、Ｋｏｏｌ、Ｈ．Ｊ．、ｖａｎ Ｏｏｓｔｒｏｍ，Ｃ．Ｔ．、Ｂｅｅｍｓ、Ｒ．Ｂ．、Ｍｕｌｌｅｎｄｅｒｓ、Ｌ．Ｈ．、ｖａｎ Ｚｅｅｌａｎｄ、Ａ．Ａ．、ｖａｎ ｄｅｒ Ｈｏｒｓｔ、Ｇ．Ｔ．、Ｖｒｉｅｌｉｎｇ、Ｈ．およびｖａｎ Ｓｔｅｅｇ、Ｈ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｒｅｐａｉｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃｏｃｋａｙｎｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｇｒｏｕｐ Ｂ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６０： ５６８１−５６８７、２０００．
【０１０５】
６．Ｋｅｒｒ、Ｓ．Ｊ．Ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２４７： ４２４８−４２５２、１９７２．
【０１０６】
７．Ｙｅｏ、Ｅ．Ｊ．およびＷａｇｎｅｒ、Ｃ．Ｔｉｓｓｕｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａ ｍａｊｏｒ ｆｏｌａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１： ２１０−２１４、１９９４．
【０１０７】
８．Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．、Ｓｈｉｕ、Ｊ．Ｙ．、Ｔｚｅｎｇ、Ｓ．Ｊ．、Ｓｈｉｈ、Ｌ．Ｓ．、Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｊ．、Ｌｕｉ、Ｗ．Ｙ．およびＣｈｅｎ、Ｐ．Ｈ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、７５： ７８７−７９３、１９９８．
【０１０８】
９．Ｌｉｕ、Ｈ．Ｈ．、Ｃｈｅｎ、Ｋ．Ｈ．、Ｌｕｉ、Ｗ．Ｙ．、Ｗｏｎｇ、Ｆ．Ｗ．およびＣｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｎｅｗｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．、１０： ８７−９７、２００３．
【０１０９】
１０．Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．、Ｃｈｅｎ、Ｌ．Ｙ．、Ｗｏｎｇ、Ｆ．Ｈ．、Ｌｅｅ、Ｃ．Ｍ．、Ｃｈａｎｇ、Ｔ．Ｊ．およびＹａｎｇ−Ｆｅｎｇ、Ｔ．Ｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、６６：４３−４７、２０００．
【０１１０】
１１．Ｔｓｅｎｇ、Ｔ．Ｌ．、Ｓｈｉｈ、Ｙ．Ｐ．、Ｈｕａｎｇ、Ｙ．Ｃ．、Ｗａｎｇ、Ｃ．Ｋ．、Ｃｈｅｎ、Ｐ．Ｈ．、Ｃｈａｎｇ、Ｊ．Ｇ．、Ｙｅｈ、Ｋ．Ｔ．、Ｓｔｒｕｅｗｉｎｇ、Ｊ．Ｐ．、Ｃｈｅｎ、Ｙ．Ｍ．Ａ．およびＢｕｅｔｏｗ、Ｋ．Ｈ．Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ、ＧＮＭＴ、ｉｎ ｌｉｖｃｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３： ６４７−６５４、２００３．
【０１１１】
１２．Ｒａｈａ、Ａ．、Ｗａｇｎｅｒ、Ｃ．、ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｒ．Ｇ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．Ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ４Ｓ ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９： ５７５０−５７５６、１９９４
【０１１２】
１３．Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ、Ｈ．、Ｔａｋｅｔａ、Ｋ．、Ｍｉｙａｎｏ、Ｋ．、Ｙａｍａｎｅ、Ｔ．およびＳａｔｏ、Ｊ．Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４２： ３８５８−３８６３、１９８２．
【０１１３】
１４．Ｆｏｇｈ、Ｊ．、Ｔｒｅｍｐｅ、Ｇ．およびＬｏｖｅｌｅｓｓ、Ｊ．Ｄ．Ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎ Ｆｏｇｈ Ｊ．（ｃｄ）、Ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｐ．ｐ．１１５−１１９、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７７．
【０１１４】
１５．Ａｄｅｎ、Ｄ．Ｐ．、Ｆｏｇｅｌ、Ａ．、Ｐｌｏｔｋｉｎ、Ｓ．、Ｄａｍｊａｎｏｖ、Ｉ．およびＫｎｏｗｌｅｓ、Ｂ．Ｂ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＨＢｓＡｇ ｉｎ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ．）、２８２： ６１５−６１６、１９７９．
【０１１５】
１６．Ｃｌａｒｋ、Ｓ．Ｊ．、Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．、Ｐａｕｌ、Ｃ．Ｌ．およびＦｒｏｍｍｅｒ、Ｍ．Ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２： ２９９０−２９９７、１９９４．
【０１１６】
１７．Ｇｕｒｔｕ、Ｖ．、Ｙａｎ、Ｇ．およびＺｈａｎｇ、Ｇ．ＩＲＥＳ ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２２９： ２９５−２９８、１９９６．
【０１１７】
１８．Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎ、Ｄ．、Ｚｈａｎｇ、Ｗ．Ｗ．、ｖｏｎ Ｅｓｃｈｅｎｂａｃｈ、Ａ．Ｃ．、Ｌｉｎ Ｓ．Ｈ．およびＨｓｉｅｈ、Ｊ．Ｔ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ、Ｃ−ＣＡＭ１、ｉｎａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ： ａ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５： ２８３１−２８３６、１９９５．
【０１１８】
１９．Ｖｅｓｓｅｌｉｎｏｖｉｔｃｈ、Ｓ．Ｄ．、Ｋｏｋａ、Ｍ．、Ｍｉｈａｉｌｏｖｉｃｈ、Ｎ．およびＲａｏ、Ｋ．Ｖ．Ｎ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｄｉｅｔｈｙｌ−ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ、ｉｎｆａｎｔ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１０８： ６０−６５、１９８４．
【０１１９】
２０．Ｒｏｇｇｅｂａｎｄ、Ｒ．、Ｗｏｌｔｅｒｂｅｅｋ、Ａ．Ｐ．、Ｒｕｔｔｅｎ、Ａ．Ａ．およびＢａａｎ、Ｒ．Ａ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ３２ｐ−ｐｏｓｔｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ−ＤＮＡ ａｄｄｕｃｔｓ ｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ ｂｙ ｈｕｍａｎ、ｒａｂｂｉｔ ａｎｄ ｒｏｄｅｎｔ ｌｉｖｅｒ ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、１４：１９４５−１９５０、１９９３．
【０１２０】
２１．Ｃｈａｎｇ、Ｋ．Ｗ．、Ｌｅｅ、Ｈ．、Ｗａｎｇ、Ｈ．Ｊ．、Ｃｈｅｎ、Ｓ．Ｙ．およびＬｉｎ、Ｐ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｂｅｎｚｏ［Ａ］ｐｙｒｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ： ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．、６５： １３３９−１３４９、１９９９．
【０１２１】
２２．Ｒｏｗｌｉｎｇ、Ｍ．Ｊ．、ＭｃＭｕｌｌｅｎ、Ｍ．Ｈ．およびＳｃｈａｌｉｎｓｋｅ、Ｋ．Ｌ．Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．、１３２： ３６５−３６９、２００２．
【０１２２】
２３．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｒ．Ｊ．、Ｇｏｏｄｓｅｌｌ、Ｄ．Ｓ．、Ｍｕｓａｈ、Ｒ．Ａ．、Ｍｏｒｒｉｓ、Ｇ．Ｍ．、Ｇｏｏｄｉｎ、Ｄ．Ｂ．およびＯｌｓｏｎ、Ａ．Ｊ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｔｏ ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ： ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｎｎｏｄｅｌｉｎｇ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄ．Ｍｏｌ．Ｄｅ．、１７： ５２５−５３６、２００３．
【０１２３】
２４．Ｆｕ、Ｚ．、Ｈｕ、Ｙ．、Ｋｏｎｉｓｈｉ、Ｋ．、Ｔａｋａｔａ、Ｙ．、Ｏｇａｗａ、Ｈ．、Ｇｏｍｉ、Ｔ．、Ｆｕｊｉｏｋａ、Ｍ．およびＴａｋｕｓａｇａｗａ、Ｆ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５： １１９８５−１１９９３、１９９６．
【０１２４】
２５．Ｈｕａｎｇ、Ｙ．、Ｋｏｍｏｔｏ、Ｊ．、Ｋｏｎｉｓｈｉ、Ｋ．、Ｔａｋａｔａ、Ｙ．、Ｏｇａｗａ、Ｈ．、Ｇｏｍｉ、Ｔ．、Ｆｕｊｉｏｋａ、Ｍ．およびＴａｋｕｓａｇａｗａ、Ｆ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ａｕｔｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｃｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ： ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ、ｍｕｔａｎｔ Ｒ１７５Ｋ ａｎｄ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｂｏｕｎｄ Ｒ１７５Ｋ ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９８： １４９−１６２、２０００．
【０１２５】
２６．Ｖｉｄｇｒｅｎ、Ｊ．、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ、Ｌ．Ａ．、ａｒｉｄ Ｌｉｌｊａｓ、Ａ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｔｅｃｈｏｌ Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄ．）、３６８： ３５４−３５８、１９９４．
【０１２６】
２７．Ｃｈｅｎｇ、Ｘ．、Ｋｕｍａｒ、Ｓ．、Ｐｏｓｆａｉ、Ｊ．、Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ、Ｊ．Ｗ．およびＲｏｂｅｒｔｓ、Ｒ．Ｊ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＨｈａＩ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ Ｓ− ａｄｅｎｏｓｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ．Ｃｅｌｌ、７４： ２９９−３０７、１９９３．
【０１２７】
２８．Ｓｃｈｌｕｃｋｅｂｉｅｒ、Ｇ．、Ｋｏｚａｋ、Ｍ．、Ｂｌｅｉｍｌｉｎｇ、Ｎ．、Ｗｅｉｎｈｏｌｄ、Ｅ．およびＳａｅｎｇｅｒ、Ｗ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ａｎｄ Ｓｉｎｅｆｕｎｇｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ａｄｅｎｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｍ．Ｔａｑｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６５：５６−６７、１９９７．
【０１２８】
２９．Ｒｅｉｎｉｓｃｈ、Ｋ．Ｍ．、Ｃｈｅｎ、Ｌ．、Ｖｅｒｄｉｎｅ、Ｇ．Ｌ．およびＬｉｐｓｃｏｍｂ、Ｗ．Ｎ．Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨａｅＩｌｌ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｃｏｎｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｔｏ ＤＮＡ： ａｎ ｅｘｔｒａｈｅｌｉｃａｌ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ、８２： １４３−１５３．１９９５．
【０１２９】
３０．Ｇｏｎｇ、Ｗ．、Ｏ’Ｇａｒａ、Ｍ．、Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ、Ｒ．Ｍ．およびＣｈｅｎｇ、Ｘ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｖｕｌＩ ＤＮＡ−（ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｎ４） ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａｎ ｅｘａｍｐｌｅ ｏｆ ｄｏｍａｉｎ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５： ２７０２−２７１５、１９９７．
【０１３０】
３１．Ｔｒａｎ、Ｐ．Ｈ．、Ｋｏｒｓｚｕｎ、Ｚ．Ｒ．、Ｃｅｒｒｉｔｅｌｌｉ、Ｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｈｏｒｎ、Ｓ．Ｓ．およびＬａｃｋｓ、Ｓ．Ａ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｐｎｍ ＤＮＡ ａｄｅｎｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＤｐｎＩＩ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｂｏｕｎｄ ｔｏ Ｓ−Ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、６： １５６３−１５７５、１９９８．
【０１３１】
３２．Ｓｃａｖｅｔｔａ、Ｒ．Ｄ．、Ｔｈｏｍａｓ、Ｃ．Ｂ．、Ｗａｌｓｈ、Ｍ．、Ｓｚｅｇｅｄｉ、Ｓ．、Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ、Ａ．、Ｇｕｍｐｏｒｔ、Ｒ．Ｉ．およびＣｈｕｒｃｈｉｌｌ、Ｍ．Ｅ．Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｒｓｒｌ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ６−ａｄｅｎｉｎｅ Ｂ ｃｌａｓｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２８： ３９５０−３９６１、２０００．
【０１３２】
３３．Ｄｏｎｇ、Ａ．、Ｙｏｄｅｒ、Ｊ．Ａ．、Ｚｈａｎｇ、Ｘ．、Ｚｈｏｕ、Ｌ．、Ｂｅｓｔｏｒ、Ｔ．Ｈ．およびＣｈｅｎｇ、Ｘ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＤＮＭＴ ２、ａｎ ｅｎｉｇｍａｔｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ｔｈａｔ ｄｉｓｐｌａｙｓ ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２９： ４３９−４４８、２００１．
【０１３３】
３４．Ｍｏｒｒｉｓ、Ｇ．Ｍ．、Ｇｏｏｄｓｅｌｌ、Ｄ．Ｓ．、Ｈａｌｌｉｄａｙ、Ｒ．Ｓ．、Ｈｕｅｙ、Ｒ．、Ｈａｒｔ、Ｗ．Ｅ．、Ｂｅｌｅｗ、Ｒ．Ｋ．およびＯｌｓｏｎ、Ａ．Ｊ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｏｃｋｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｌａｍａｒｃｋｉａｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ａｎｄ ａｎ ｅｍｐｉｒｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒｅｅ ｅｎｅｒｇｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．、１９： １６３９−１６６２、１９９８．
【０１３４】
３５．Ｃｏｏｋ、Ｒ．Ｊ．およびＷａｇｎｅｒ、Ｃ．Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｓ ａ ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｃｙｔｏｓｏｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１： ３６３１−３６３４、１９８４．
【０１３５】
３６．Ａｉｄａ、Ｋ．、Ｔａｗａｔａ、Ｍ．、Ｎｅｇｉｓｈｉ、Ｍ．およびＯｎａｙａ、Ｔ．Ｍｏｕｓｅ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｓ ｓｅｘｕａｌｌｙ ｄｉｍｏｒｐｈｉｃ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ．Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ、２９： ６４６−６４９、１９９７．
【０１３６】
３７．Ｏｋｅｙ、Ａ．Ｂ．、Ｂｅｎｄｙ、Ｇ．Ｐ．、Ｍａｓｏｎ、Ｍ．Ｅ．、Ｎｅｂｅｒｔ、Ｄ．Ｗ．、Ｆｏｒｓｔｅｒ−Ｇｉｂｓｏｎ、Ｃ．Ｊ．、Ｍｕｎｅａｎ、ｌおよびＤｕｆｒｅｓｎｅ、Ｍ．Ｊ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｓｏｌ−ｔｏ−ｎｕｃｌｅｕｓ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ２，３，７，８−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ ｉｎ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｌｉｎｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５： １１４１５−１１４２２、１９８０．
【０１３７】
３８．Ｈａｐｇｏｏｄ．Ｊ．、Ｃｕｔｈｉｌｌ、Ｓ．、Ｄｅｎｉｓ、Ｍ．、Ｐｏｅｌｌｉｎｇｅｒ、Ｌ．およびＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ、Ｊ．Ａ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｔ ａ ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ： ｃｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｏｘｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８６： ６０−６４、１９８９．
【０１３８】
３９．Ｆｏｕｓｓａｔ、Ｊ．、Ｃｏｓｔｅｔ、Ｐ．、Ｇａｌｔｉｅｒ、Ｐ．、Ｐｉｎｅａｕ、Ｔ．およびＬｅｓｃａ、Ｐ．Ｔｈｅ ４Ｓ ｂｅｎｚｏ（ａ）ｐｙｒｅｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｎｏｔ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＣＹＰ１Ａ１ ｇｅｎｅ ｉｎ Ａｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ （ＡＨＲ −／−） ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｅｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３４９： ３４９−３５５、１９９８．
【０１３９】
４０．Ｂｈａｔ、Ｒ．、Ｗａｇｎｅｒ、Ｃ．およびＢｒｅｓｎｉｃｋ、Ｅ．Ｔｈｅ ｈｏｍｏｄｉｍｉｃ ｆｏｒｍ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３６： ９９０６−９９１０、１９９７．
【０１４０】
４１．Ｃｈａｎｇ、Ｘ．およびＲｏｂｅｒｔｓ、Ｒ．Ｊ．ＡｄｏＭｅｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ａｎｄ ｂａｓｅ ｆｌｉｐｐｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２９： ３７８４−３７９５、２００１．
【０１４１】
４２．Ｒｏｗｌｉｎｇ、Ｍ．Ｊ．、ＭｃＭｕｌｌｅｎ、Ｍ．Ｈ．およびＳｃｈａｌｉｎｓｋｅ、Ｋ．Ｌ．Ｖｉｔａｍｉｎｅ Ａ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｒａｔｓ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．、１３２： ３６５−３６９、２００２．
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】ベンゾ［ａ］ピレン処理後の細胞でのＧＮＭＴの核内移行を示す蛍光顕微鏡写真
【図２Ａ】さまざまな処理を施された細胞における１０８ヌクレオチドあたりのＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体相対レベルを示すグラフ
【図２Ｂ】トランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット
【図２Ｃ】１または１０μＭのＢａＰ処理されたＨｅｐＧ２、ＳＣＧ２−１−１およびＳＣＧ２−１−１１細胞におけるＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体の量を示すグラフ
【図２Ｄ】ＨｅｐＧ２細胞（レーン１）、ＳＣＧ２−１−１細胞（レーン２）およびＳＣＧ２−１−１１細胞（レーン３）におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット
【図３Ａ】Ａｄ−ＧＦＰまたはさまざまなＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させたＨｅｐＧ２細胞における１０８ヌクレオチドあたりのＢＰＤＥ−ＤＮＡ付加体形成を示すグラフ
【図３Ｂ】Ａｄ−ＧＦＰまたはさまざまなＭＯＩｓのＡｄ−ＧＮＭＴを感染させたＨｅｐＧ２細胞におけるＧＮＭＴ発現のウェスタンブロット
【図４】ＳＣＧ２−ｎｅｇおよびＳＣＧ２−１−１細胞におけるＢａＰにより誘導されるシトクロムｐ４５０ １Ａ１（ＣＹＰ１Ａ１）酵素活性を示すグラフ
【図５Ａ】ラマルク型遺伝アルゴリズムを用いる２量体型のＧＮＭＴと結合するＢａＰのモデルを示すタンパク質ペプチド鎖骨格立体構造模式図
【図５Ｂ】ラマルク型遺伝アルゴリズムを用いる４量体型のＧＮＭＴと結合するＢａＰのモデルを示すタンパク質ペプチド鎖骨格立体構造模式図
【図５Ｃ】１Ｄ２ＣおよびＢａＰのドッキングモデルにおけるＢａＰの炭素原子とその近傍のＧＮＭＴのアミノ酸残基との位置関係を示す共有結合骨格立体構造模式図
【図６】ＢａＰによるＧＮＭＴ酵素活性の阻害を示すグラフ
【図７】ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴプラスミドの構築の手順を示す模式図
【図８】トランスジェニックマウスおよび正常マウスのノザンブロット
【図９】トランスジェニックマウスおよび正常マウスのウェスタンブロット
【図１０】ＢａＰ処理され、７８週間後に屠殺されたＧＮＭＴトランスジェニックマウス（Ａ）および正常マウス（Ｂ）の肺の臓器病理写真
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体と、有効量の活性ベンゾ［ａ］ピレン結合タンパクとを含む、医薬品、食品または化粧品の組成物であって、該タンパクは、ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼか、該メチルトランスフェラーゼの機能を保存した変異体か、前記メチルトランスフェラーゼまたは変異体の断片かであり、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有する、医薬品、食品または化粧品の組成物。
【請求項２】
前記医薬品または食品の組成物は、経口または非経口投与に適する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記メチルトランスフェラーゼは、ＧＮＭＴと、ＨｈａＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼと、ＨａｅＩＩＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼと、ＰｖｕＩＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼとのグループから選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記メチルトランスフェラーゼはＧＮＭＴである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼの機能を保存した変異体または前記メチルトランスフェラーゼの断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、微生物か、微生物または動物臓器から抽出された混合物かである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼか、該メチルトランスフェラーゼの機能を保存した変異体か、前記メチルトランスフェラーゼまたは変異体の断片かを用いる、がんの予防または治療用医薬の製造方法。
【請求項８】
前記がんは、ヒトを含むほ乳類の肝がん、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、脳腫瘍、乳がんおよび腎がんである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有する、ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼか、該メチルトランスフェラーゼの機能を保存した変異体か、前記メチルトランスフェラーゼまたは変異体の断片かの医薬品としての有効量を投与することを含む、がんの予防または治療方法。
【請求項１】
担体と、有効量の活性ベンゾ［ａ］ピレン結合タンパクとを含む、医薬品、食品または化粧品の組成物であって、該タンパクは、ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼか、該メチルトランスフェラーゼの機能を保存した変異体か、前記メチルトランスフェラーゼまたは変異体の断片かであり、ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有する、医薬品、食品または化粧品の組成物。
【請求項２】
前記医薬品または食品の組成物は、経口または非経口投与に適する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記メチルトランスフェラーゼは、ＧＮＭＴと、ＨｈａＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼと、ＨａｅＩＩＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼと、ＰｖｕＩＩ ＤＮＡメチルトランスフェラーゼとのグループから選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記メチルトランスフェラーゼはＧＮＭＴである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼの機能を保存した変異体または前記メチルトランスフェラーゼの断片は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物は、微生物か、微生物または動物臓器から抽出された混合物かである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼか、該メチルトランスフェラーゼの機能を保存した変異体か、前記メチルトランスフェラーゼまたは変異体の断片かを用いる、がんの予防または治療用医薬の製造方法。
【請求項８】
前記がんは、ヒトを含むほ乳類の肝がん、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、大腸がん、脳腫瘍、乳がんおよび腎がんである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ベンゾ［ａ］ピレンと特異的に結合するＳＡＭ結合ドメインを有する、ＳＡＭ依存性メチルトランスフェラーゼか、該メチルトランスフェラーゼの機能を保存した変異体か、前記メチルトランスフェラーゼまたは変異体の断片かの医薬品としての有効量を投与することを含む、がんの予防または治療方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−４５２２８（Ｐ２００６−４５２２８Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００５−２１８７６５（Ｐ２００５−２１８７６５）
【出願日】平成１７年７月２８日（２００５．７．２８）
【出願人】（５０３４４８４７９）晶研生化科技股▲ふん▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２１８７６５（Ｐ２００５−２１８７６５）
【出願日】平成１７年７月２８日（２００５．７．２８）
【出願人】（５０３４４８４７９）晶研生化科技股▲ふん▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]