発光検知ワークステーション
【課題】隣接するサンプルからのクロストーク、特に分析されるべきサンプルよりも高い光レベルの出力を有する隣接のサンプルからのクロストークを最少にしつつ、低い光レベルの発光サンプルを分析することができる発光検知装置を提供する。
【解決手段】コリメータ１１０、フレネルレンズ１２０、フィルタ１３０及びカメラレンズ１４０を含むチャンバを備えた発光検知装置であって、焦点合わせされた像が、電荷結合素子カメラ７０上の光学系によって形成される、発光検知装置。
【解決手段】コリメータ１１０、フレネルレンズ１２０、フィルタ１３０及びカメラレンズ１４０を含むチャンバを備えた発光検知装置であって、焦点合わせされた像が、電荷結合素子カメラ７０上の光学系によって形成される、発光検知装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光を検知し且つ定量する装置及び方法の分野に関し、更に特定すると、発光性のアッセイから発光される光を検知し且つ定量する装置及び方法の分野に関する。更に特定すると、本発明は、目標化合物の存在又は量の指示としての発光性アッセイからの生物発光及び／又は化学発光のような発光を検知し且つ定量するための装置及び方法に関する。本発明の好ましい実施形態は、撮像素子として電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び同撮像素子によって収集されたデータを分析するためのコンピュータを含んでいる。更に好ましい実施形態は、高処理量のスクリーニング（ＨＴＳ）用途において使用するための機能を有し且つアッセイプレートのロボットによる操作を提供する。
【背景技術】
【０００２】
物質の発光の分析及び特に生物発光（ＢＬ）又は化学発光（ＣＬ）のどちらかの分析は、種々の発光性分析物の定量的な測定をする極めて有用な方法になりつつある。
最近は、イムノアッセイプロトコルにおける分析物を定量的に分析するために発光検知を利用する方法が導入されて来ている。このような発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）は、免疫特異的抗体又は混成核酸配列とこれに似た特定のリガンドの反応特異性を、光の検知によって得られる高い感度と組み合わせることの可能性を提案している。伝統的には、放射性の試薬がこのような目的のために使用されて来ており、ＬＩＡ試薬の特異性及び感度は、概して、伝統的な放射性標識を採用しているものに似ている。しかしながら、ＬＩＡは、放射性試薬に対してＬＩＡ試薬の無毒性及びより長い保存性を有するため、多くの用途にとっての好ましい分析方法である。
【０００３】
他の発光試薬の中では、Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．によって開発された１，２−ジオキセタンのような化学発光化合物及びキサンタンエステルのような他の安定した化学発光分子等が商業的使用可能状態にある。これらの化合物は、試薬、頻繁には、目標化合物の存在又は特異的な不存在においてのみ存在するアルカリフォスファターゼのような酵素によって引き起こされる分解によって光を放出するように誘発される。発光の検知は定性的指示であり、射出された光の量は、存在する誘発試薬すなわち目標化合物の量の指示に適している。その他の良く知られた発光化合物も同様に使用することができる。
【０００４】
発光の放出は、放出された光の量を増幅するか又は増す促進薬の存在によって、ときどき促進することができる。これは、発光の抑制を減じる微環境において発光試薬を引きこもらせる試薬を使用することによって達成することができる。多くの生物学的作業は、水性媒体内で必然的になされる。水は、典型的には光の放出を抑制する。水に可溶性の重合性オニウム塩（アンモニウム、ホスホニウム、スルホニウム等）のような化合物を提供することにより、発光性化合物を引きこもらせるかも知れない水が排除されている小さい領域が設けられても良い。
【０００５】
発光反応を監視するために使用される装置（照度計）の大半は、射出された光子を検知するために一つ以上の光電子増倍管（ＰＭＴｓ）を使用している。ＰＭＴを基礎とするマイクロプレート照度計がプレートの全てのウエル（溜め）からの信号を測定することができる速度は、使用されるＰＭＴの数によって制限される。殆どのマイクロプレート照度計は、たった一つのＰＭＴを有し、従って、３８４ウエルプレートは、９６ウエルプレートを読み取るのに必要とされる時間の四倍の時間を必要とする。
【０００６】
生物学的研究の性質は、多くのサンプルが同時に、例えば化学発光物質が酵素と反応するようにアッセイされることを指示する。これは、特に、濃度、組成、媒体等によって変わる何千ものサンプルが試験されなければならない遺伝子スクリーニング及び薬物の発見に特に当てはまる。これは、多数のサンプルが同時に反応せしめられ、発光によって排除されることを必要とする。しかしながら、化学発光又は生物発光は時間と共に減少するので、高速処理の必要がある。たくさんのサンプルを同時にスクリーニングすることによって、改良されたより速いデータ収集時間がもたらされ、これは、それに続くより速いデータ分析及び分析データの改善された信頼性を可能にする。
【０００７】
各特定のサンプル分析物の発光が所望の精度で分析されるようにするために、各サンプルからの発光は、同時に分析されつつあるサンプルから隔離されなければならない。このような環境においては、外部光源又は隣接するサンプルからの迷光は、これらの光のレベルが低いときでさえ問題を生じ得る。一般的なアッセイ、特に高処理量のスクリーニング（ＨＴＳ）を採用しているアッセイは、試験されるべき多くのサンプルを収容するための反応チャンバとして、たくさんのウエル（溜め）が設けられたマイクロプレートのプラスチックトレイを使用している。現在使用されているプレートとしては、９６−ウエルプレート及び３８６−ウエルプレートがある。ＨＴＳ速度及び小型化に対する増加しつつある要望に応答して、１，５３６個のウエルを有するプレートが導入されつつある。正確な発光分析に対する特に困難な障害は、高い信号強度を有するウエルに隣接したサンプルウエル内の光が不注意に検知されることである。この隣接するサンプルによる光測定干渉の現象は、“クロストーク”と称され、これらのウエル内の信号が実際には弱い場合には、隣接するウエル内のサンプルに誤った値を割り当てることにもなり得る。
【０００８】
既に提案された幾つかの照度計としては、米国特許第４，７７２，４５３号、米国特許第４，３６６，１１８号及びヨーロッパ特許第ＥＰ ００２５３５０号に記載されたものがある。米国特許第４，７７２，４５３号は、複数のサンプル細胞を担持しているプラットホーム上に配置された固定の光検知器を有している照度計を記載している。各細胞は、サンプルからの光が光検知器に導かれる開口の下方に配置される。米国特許第４，３６６，１１８号は、サンプルの直線状のアレイから発光された光がサンプルの上方ではなく横で検知される照度計を記載している。最後に、ヨーロッパ特許第ＥＰ ００２５３５０号は、サンプルウエルの底部を通して射出される光がウエルの下方に配置された可動の光検知器によって検知される照度計を記載している。
【０００９】
ヨーロッパ特許第ＥＰ ００２５３５０号に開示されているように、検知の直前に発光反応を開始させるための液体注入装置が採用されている照度計の更なる改善が提案されて来た。また、米国特許第４，０９９，９２０号においては、照度計において使用するために、温度制御機構が提案されて来た。発光サンプルの温度制御は、例えば、高温でサンプルを培養することが望ましい場合に重要であるかも知れない。
【００１０】
ＨＴＳ用途のための種々の光検知装置が市場において入手可能である。これらの装置としては、Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＰｈａｒｍａｃｉａによるＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒによって提供されているＶｉｅｗＬｕｘ（登録商標）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓからのＣＬＩＰＲ（登録商標）がある。これらの装置は全て、高価で寸法が大きく（床設置モデル）、プレートの準備及び装荷のためのロボット装置とのほんの限られた両立性を有し、限られた作動範囲を有し、及び／又はクロストークを低減させないか又は原因を明らかにしていない光学的方法を使用している。使用される光学装置は、典型的には、プレートの端縁に設けられたウエルの歪んだ視野を提供する複雑なテレコンセントリックな光学レンズ系であり、この光学装置は、しばしば高価でありその費用は２０万ドルを超える。おそらく、最も一般的な検知装置は、パッカード社から販売されているＰＭＴに基づく検知装置であるＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）である。ＴｏｐＣｏｕｎｔ装置は、所望の作動範囲を有しているけれども、１，５３６ウエルプレートを読み取ることができず且つプレート全体を同時に撮像することができない。
【００１１】
隣接するサンプルからのクロストークは、撮像に基づく装置における改良された発光分析の開発に対して重大な障害となったままである。このことは、発光サンプルが隣接するサンプルからの光と干渉し得る迷光を生成する簡単な光学系の現象として理解することができる。更に、サンプルを極めて低い光レベルのサンプルを検知し且つ分析することができる照度計の開発が、クロストーク干渉に対して特に必至である。
【発明の概要】
【００１２】
従来技術によっては満足されない上に特定した必要性に対処すべく、本発明の主要な目的は、発光サンプルの分析を許容する光検知装置を提供することである。本発明の更に別の目的は、多数の発光サンプルを同時に分析することができる光検知装置を提供することである。本発明の好ましい実施形態においては、ウエルプレートが１，５３６個ものウエルを含んでいる、ウエル内に保持された多数のサンプルを同時に分析する光検知装置が提供されている。本発明は更に、分析中に多数のウエルトレイのロボットによる操作を含んでいる。
【００１３】
本発明の更に別の目的は、隣接するサンプルからのクロストーク、特に分析されるべきサンプルよりも高い光レベルの出力を有する隣接のサンプルからのクロストークを最少にしつつ、低い光レベルの発光サンプルを分析することができる発光検知装置を提供することである。
【００１４】
本発明の装置は、ウエルプレート上に垂直コリメータを備え、ウエルの数に適合する大きさを有するフレネルレンズ構造を採用している。従って、１５３６−ウエルプレートは、プレートのウエルと整合した１，５３６個の細胞を備えたプレート上の暗視野コリメータ（ｄａｒｋ ｃｏｌｌｉｍａｔｏｒ）を採用するであろう。コリメータの上方にはフレネルレンズが固定されており、このフレネルレンズは、レンズの上方の視野が、プレート上の位置（端縁であってもよい）にかかわらず、各ウエル内を真っ直ぐに見下ろしているように見えるように光を屈折させる。
【００１５】
フレネルレンズの上方には、迅速にプレート全体の像を付与するために、３５ｍｍの広角レンズを通して見て、一度にプレート全体の像を撮るために、ＣＣＤカメラが配置されている。ＣＣＤとフレネル／コリメータとの間には、典型的にはフィルタホイール上に配列されたフィルタがレンズに対してある角度で配設されている。このフィルタは、射出される光の特定の波長を許容し且つその他の波長の全てを反射又は吸収するように選択される。種々の波長で光を放出する多数の試薬から射出された光の連続的な検知を許容するために、いくつかのフィルタがホイール上に設けられても良い。
【００１６】
サンプルは、ロボットにより且つ自動化された準備装置によって良好に動作するように設計された装荷装置を介して、光学的検知プラットホームに供給される。既に反応混合物が設けられたウエルプレートが、人間又は好ましくはロボットによってシャトル上に配置される。
【００１７】
シャトル上でのプレートの整合は、コリメータのグリッドアレイに適合するために緊密な公差条件にもかかわらず比較的粗雑であってもよい。シャトルが装荷位置を離れると、弾性手段が、プレートを厳格に一致した整合状態へと付勢する。シャトルは、プレートを、一度にコラム内に１６個までのウエルを収容することができるオーバーヘッド注入バーの下に位置決めする。予め加えられていない場合には、誘発試薬又は発光試薬がサンプルに添加され、プレートは、同プレートを横切って次のウエルのコラムを装荷するために前方へと割送りされ、コリメータは、コリメータ及びフレネルレンズと整合される。多くの反応は高温でのみより良く進行するので、サンプルチャンバは絶縁され且つチャンバ内の又はチャンバに提供される空気を加熱するための加熱手段が設けられている。チャンバ内の温度を室温近くに維持するための及び温度を正しく制御するために、チャンバには熱交換器が設けられても良い。
【００１８】
多数ウエルのプレート全体からの発光は、多数の波長が採用される場合に異なるフィルタを介する連続的な撮像によって一度に撮像される。得られた信号は、コリメータによって減じられたクロストークを更に減じるために処理され、発光の存在及び量は、自動化されたソフトウエアを使用しているパーソナルコンピュータによって迅速に検知され且つ計算される。次いで、データが、ウエル毎の強度として報告されるか又は特定のアッセイ基準に照らして更に分析される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
添付図面と組み合わせて考えたときに以下の詳細な説明を参照することによって更に良く理解されると、本発明及び本発明に伴う利点の多くの更に完全な理解が容易に得られるであろう。
【図１】本発明による発光検知装置の好ましい実施形態の断面図である。
【図２】本発明による発光検知装置の光学系の詳細な断面図である。
【図３】本発明のプレート移送装置の断面図である。
【図４】本発明の注入装置のアームアセンブリの斜視図である。
【図５】フィルタホイールアセンブリの分解図である。
【図６】図６は、光学ハウジングの断面図である。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明のロボット機構の平面図である。
【図７】本発明の処理方法のフローチャートである。
【図８】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図９】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１０】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１１】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１２】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１３】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１４】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１５】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
幾つかの図面を通して同様の符号が同一の又は対応する部品を示している図面特に図１を参照すると、本発明の発光検知装置の好ましい実施形態は、好ましい実施形態においては１，５３６以上もの数とし得る複数のサンプルウエル２０を含むマイクロプレート（プレート）１０を運ぶためにシャトル又はトレイを使用している。当業者は、サンプルウエル２０の数は、照度計の構成要素の物理的寸法及び光学的特性のみによって限定され、本発明の技術によって限定されるものではないことを認識するであろう。サンプルウエル２０は、本発明の装置に供給される前に、手動又はロボットによって分析物を充填されてもよい。化学発光に必要な試薬は、分析物が供給チューブの列４０を介してプレートをトレイ上に配置する前に供給される注入装置３０によって自動的に充填されてもよい。典型的には、サンプルウエルは、化学発光試薬を含んでいるであろう。これらの試薬は、サンプル内の分析物の濃度に比例した強度で光を発する。この光は、極めて低い強度であることもあり、所望の検知限界を達成するためには十分な感度を有する装置を必要とする。
【００２１】
注入装置３０の動作は、好ましい実施形態においては本発明の照度計の全ての構成要素の作動を制御する中央演算処理装置５０によって制御される。データ収集、分析及び提示もまた処理装置５０によって制御されている。更に、本発明の好ましい実施形態においては、注入装置３０は、分析物に緩衝液を添加し且つ各々全て中央演算処理装置５０の制御下で維持されるか又はつかの間の強い発光である発光撮像の“輝き”及び／又は“閃光”を可能にする試薬を添加するために使用することもできる。
【００２２】
分析物がサンプルウエル２０内に配置された後に、プレート１０は、ＣＣＤカメラ７０が発光サンプルを正確に撮像できるようにするために、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ７０から固定焦点距離に配置されるか又はすぐ下方に設けられた光学チャンバ６０内に配置されているサンプルチャンバ５５内に配置される。多くの発光試薬及び特異な発光反応は温度に依存するので、サンプルチャンバ５５は、正確に温度制御されることができるのが好ましい。中央演算処理装置５０は各サンプルトレイ１０内のサンプルウエル２０の動き及び注入を制御するので、温度制御は、個々のサンプルプレート１０の温度を変えることができる中央演算処理装置５０によって提供される。本発明の照度計の好ましい実施形態においては、中央演算処理装置５０はまた、本発明の照度計内での分析物の操作を含む動作を行う工業ロボット（図示せず）をも制御する。
【００２３】
プレート１０がサンプルチャンバ５５内に配置されると、光学系８０が、完全なマイクロプレート１０の像を単一の像としてＣＣＤカメラ７０に供給する。
本発明の照度計の作動は合成された連続的な動作であり、照度計の全ての構成要素は協働して正確で正しく且つ信頼性のあるデータを提供するけれども、本発明は、三つの別個の一体化された系、すなわち、光学系、機械系及び処理系を参照することによってより容易に理解することができる。以下の全体としての動作の例を説明しながら、各々の動作を以下に説明する。
【００２４】
光学系
図２を参照すると、光学系８０が更に詳細に示されている。プレート１０内に配置されたプレートウエル２０内の分析物からの発光による光線１００は、最初に、暗視野コリメータ１１０内を通過する。コリメータ１１０は、ＣＣＤカメラ７０による最終的な撮像のために平行及びほぼ平行な光線のみがサンプルウエル２０を出て行くのを許容する。コリメーション作用は、サンプルウエル２０からの迷光の防止及び発光サンプル間のクロストークの排除の助けとなる。コリメータ１１０は、サンプルからの迷光の制限を高めるために、サンプルトレイ１０に対して密封係合されるか又はごく近接せしめられている。各ウエル１０は、コリメータ１１０内の対応するグリッド開口と厳密に整合されている。コリメータ１１０から出た発光光線は、フレネル視野レンズ１２０を通過し、このフレネル視野レンズは光をフィルタ１３０に向けて集光させる。本発明の好ましい実施形態においては、コリメータ１１０とフレネル視野レンズ１２０とは、ユーザーが交換することができるカセット内に包装されている。このような装置の交換は、種々の分析物の光学特性及びプレート内のウエルの分布を変えることに必然的に伴う。
【００２５】
フレネル視野レンズの使用は、幾つかの理由により光学系を入れ替えるためには好ましい。最初に、設計及び物質の改良は、実質的にはそれ本来の制約を排除しつつ、フレネルレンズの優れた光学的機能を利用して来た。今日においては、多くのフレネルレンズが、散乱光が極めて少ない殆ど傷の無い表面を形成している成形樹脂によって作られている。散乱光の除去は、本発明の照度計における隣接するサンプル間のクロストークを排除する重要な要素である。更に、フレネルレンズ及びその他の光学系の製造において一般的に採用される改良されたタイプの樹脂は、研磨されたガラスレンズに匹敵する光学的品質を有している。
【００２６】
コンピュータ制御のダイヤモンド研磨のような高度な技術による方法を使用すると、複雑な非球面を、フレネルレンズを注型するための長持ちする型内で加工することができる。この方法によりフレネルレンズを製造して、本発明におけるように、電荷結合素子カメラにとって最も有効である正確な光学結像作用を得ることができる。更に、フレネルレンズは、フラットで極めて薄く成形できるという点で従来のレンズに優る利点を提供する。フレネルレンズの形状により、フレネルレンズを照度計のハウジング内に直接一体化することが容易にでき、光量が低いサンプルの正しい撮像にとって必要な光遮蔽特性を高めることができる。更に、フレネルレンズは、匹敵する従来のガラスレンズよりも遙かに低廉である。
【００２７】
他の何らかのレンズと同じく、フレネルレンズからのビーム全体の広がりは、レンズの焦点距離に対する光源の大きさに依存する。発光アッセイサンプルのようなより小さい光源及びより長い焦点距離は、よりコンパクトなビームを形成する。本発明の照度計における光学系８０の幾何学的構造及び寸法を最小化することに対して実際的な制限があるので、フレネル視野レンズ１２０の使用は、細かく調整された光学系に対して最も大きな機会を提供する。プレート１０からの放射光はレンズ１２０を通過し、ＣＣＤ７０において得られる像が全てのウエル（例えば、横方向に外れている端縁のものであっても）内へ直接見下ろせるように屈折せしめられる。この特徴は、典型的には“テレセントリック”と呼ばれている。
【００２８】
更に、本発明の好ましい実施形態においては、フィルタ１３０がホイール上に形成され、この構造においては、種々のフィルタ要素が、分析されているサンプルの発光特性に依存してホイールの種々の部分を占めている。フィルタ１３０は、反射された迷光が視野の外側で反射されるように、ＣＣＤに対して２０°ないし３０°の角度で傾斜せしめられるのが好ましい。特に、フィルタホイール１３０は、高品質の結像を許容するばかりでなく、種々の波長で発光する種々の試薬の発光を分離するために使用することもできる種々の波長範囲の選択を可能にする。フィルタホイール１３０はまた、サンプルプレート１０内の個々のサンプルウエル２０の中央演算処理装置５０による制御と同様に中央演算処理装置５０によって制御される。多くのアッセイにおいては、本発明に参考として組み入れられている係属中の米国特許出願第０８／５７９，７８７号において取り組まれているような、種々の波長において発光する多数発光試薬が単一のウエル内で採用されている。多数のフィルタを使用することによって、各々が順に結像され、予め記憶された校正ファクタを使用して得られるデータから、正確な濃度を測定することができる。フィルタ１３０には、選択されたバンドパスと結合して又は独立した要素として作動する赤外（ＩＲ）フィルタが設けられているのが好ましい。出願人は、板状の燐光からＩＲ（赤外）線の迷光が生じて、異常に高いバックグラウンドを生じることを発見した。
【００２９】
フィルタホイール１３０からのサンプルによって射出された光は、好ましい実施形態においては大きい開口で歪みの少ないカメラレンズであるカメラレンズ１４０を通る。カメラレンズ１４０は、ＣＣＤチップ７０上に像を結ぶ。本発明の好ましい実施形態においては、ＣＣＤカメラ７０は、冷却された低ノイズで高い分解能の素子である。レンズは、低い光レベル（Ｆ１．４）で大きい開口数の３５ｍｍ広角レンズであるのが好ましい。倍率は３ないし６、好ましくは約５．５であるのが好ましい。好ましい実施形態においては、ＣＣＤカメラ７０には、作動範囲（請求の範囲の本発明においては約１０５である）を広げるために、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）照度計と称される焦点ぼけ防止ＣＣＤチップが設けられている。焦点ぼけは、単一の画素に光が当たり過ぎ光電子がＣＣＤ素子のウエル容量をオーバーフローして周りの画素を消失させてしまうときに起こる。更に、本発明の照度計の好ましい実施形態においては、選択されたＣＣＤカメラは、約−３５℃までのＣＣＤの冷却を提供する液体冷却熱電気（ペルチエ）素子を含んでおり、このＣＣＤは、各々が１６μｍ角であって２０．５ｍｍ×１６．４ｍｍの全作動領域を形成している１２８０×１０２４画素を有している。量子効率平均１５％は、４５０ｎｍないし８００ｎｍの範囲に亘っている。出力は、１６ビットの精度にデジタル化され、画素は、電子ノイズを低減させるために、“貯蔵（ｂｉｎ）”することができる。
【００３０】
ここに開示された特徴を使用することによって、本発明の照度計は、高い密度のサンプルトレイの高品質の結像を提供することができる空間解像度を有する。ノイズ性能及びＣＣＤ温度は、所望の検知限界を提供するように設計されている。
【００３１】
機構
本発明の照度計の機械系は、ＣＣＤカメラ７０によって読み取ることができるように、コリメータ１１０と整合されたマイクロプレートの自動化され且つ高い処理量の正確な供給を達成するように設計されている。この目的のために、図３に示されているように、本発明の照度計のシャトル２００は、プレート１０が、好ましくはロボットアームのようなロボット装置によってシャトルに装荷され、シャトル２００が次いでサンプルチャンバ５５に向かって運ばれる装荷位置２０２から、読み取り位置２０３まで並進する。シャトル２００は、一般的なステッピングモーター（図示せず）によって並進せしめられる。シャトル２００がサンプルチャンバ５５に向かって進むと、シャトル２００は注入装置３０の下で停止し得る。注入装置３０は、図４の下方により詳細に図示されている。依然として図３を参照すると、注入装置３０は、リザーバ２０４から抜き取った流体試薬を給送する。注射器ポンプ２０５が、リザーバ２０４から流体試薬を抜き取り、同流体試薬を注入チューブ４０へと圧送する。二方向弁２０６は、注射ポンプ２０５によってリザーバ２０４から抜き取られ且つ注射器ポンプ２０５によって圧送された流体の供給チューブ４０への流通を制御している。実際の動作においては、使用されている注入ポートと同じ数の注入チューブ４０が存在し、たくさんの注射器ポンプ２０５も使用される。図４の下方に図示されているように、注入装置３０は、１６個以下の注入ポート３０２を有している。注入装置が使用されているときに照度計と共に使用されるプレートには、典型的には、一つの列内に１６個以下のウエルが準備される。シャトル２００がプレート１０を注入装置３０の下まで進むと、シャトル２００は、ウエルの第１の列２０８が注入装置３０の下方に直接整合するように停止する。正確な量の分析物がウエルの第１の組に供給され、シャトル２００は、ウエルの第２の列内へ試薬を注入するために、一つの列を前方へ割り送りする。この過程は、全てのウエルが充填されるまで繰り返される。その後に、シャトル２００は、ヒンジ止めされたドア２１２を通ってサンプルチャンバ５５内へと前方に進む。別のやり方では、ドア２１２は、ギロチンドア又は同様のタイプの閉鎖機構であっても良い。プレート１０のウエルは、次いでサンプルチャンバ５５内で読み取られる。読み取りが完了すると、シャトル２００は装荷位置２０２へと戻る。
【００３２】
シャトル２００が注入バーのところへ進む前に、プレート内への正しい供給のために、チューブに流体を十分に入れる必要があるかもしれない。樋３０４は、矢印で示されたシャトル２００の移動方向に平行なその貯蔵位置から、同移動方向に直角な注入装置３０のすぐ下方に横たわる位置まで回転する。注入装置３０及びリザーバ２０４内の流体は、樋３０４内へ供給され且つ吸引によって取り出される。シャトルがサンプルチャンバ５５に向かって移動せしめられると、樋３０４は、次いで、シャトル２００の移動方向から離れて同移動方向に平行なその休止位置へと戻る。装荷位置２０２への戻り動作の際に、シャトル２００上のロケータ２１４はカム２１６と係合する。ロケータ２１４は、カム２１６と係合したときにロケータ２１４がプレート１０から凹むように、弾性手段上に取り付けられている。これによって、正しい位置決めの要件なしで、プレート１０の取り外し及び新しいプレート１０のロボットアーム又はその他の供給源からの供給が可能になる。シャトル２００が装荷位置２０２から移動して離れるときに、ロケータ２１４は、前方へ付勢されてプレート１０を定位置に確実に位置決めする。プレート１０は、ロケータ２１４の弾性的な付勢によって肩部２１７に当接せしめられて保持される。
【００３３】
得られた結果が正しい試験サンプルと関連付けられるように、各プレートは正しく特定されることが重要である。殆どのＨＴＳ研究所においては、殆どのマイクロプレートは、唯一の“バーコード”で標識される。標識は、プレート自体の面に直角な面上に配置されることが多い。各プレートの正しい特定を可能にするために、バーコードリーダー２１８が、概ね符号２９９によって示された照度計ハウジング内のドア２１２のすぐ上、例えば、アーム又はフランジ２２０上に取り付けられる。バーコードリーダー２１８はミラー２２２上に合焦され、これは、次いで、シャトル２００に到達したときにプレート１０の前方端縁又は先端から直接読み取ることが可能になる。このように、各プレートがサンプルチャンバ内に到達する前に、その濃度は、処理演算装置５０内に正しく記録され、得られた結果はその濃度と関連付けることができる。当業者は、種々の整合構造及びバーコードリーダー２１８及びミラー２２２の両方の位置決めが所望の識別結果をもたらすことを認識するであろう。
【００３４】
図４により明確に示されているように、注入装置３０は、アッセイされているプレート上のウエルの全体の数に対応する位置が設けられたアクチュエータホイール３０６の作動によって正しく配置される。同様に、プレートの異なる厚みを明確にするために、垂直方向の位置をホイール３０８によって制御しても良い。シャトル２００の単純な並進運動及び運ばれる各プレートの正しい位置決め及び特定を仮定すれば、サンプルチャンバ５５内への及びサンプルチャンバ５５からのマイクロプレート試験プレートの迅速なサイクリングをなすことができる。
【００３５】
本発明の光学系と関連させて上記したように、使用されている発光エミッタの選択された波長に含まれる光以外の光の通過を反らせるフィルタが設けられる。このフィルタアセンブリは、図５に分解図で示されている。フィルタフレーム５０２は、フィルタホイール５０６のハブに結合されたアーム５０４によって支持されている。たくさんの異なるフィルタが単一のホイール上に設けられても良い。フィルタ５０８自体は、グロメット、ねじ、又はその他の保持器具５１２によってフレーム５０２に固定されているカバー５１０によってフレームにしっかりと取り付けられ且つ保持されている。上記したように、フィルタホイールは、如何なる反射も視野の外側へ導くために、フィルタ５０８をコリメータ１１０に対して通常は約２２°で傾斜させてフレーム５０２内に保持するように位置決めされる。光は、カメラレンズ１４０及びＣＣＤカメラ７０と整合されたフィルタの開口５１４内を通過する。更に上記したように、フィルタ５０８は、フィルタ自体の構成要素として、又は測定される光用のフィルタに追加して設けられる構成要素として、赤外遮断装置を含むのが好ましい。赤外遮断装置は、外部からの光線によって生じる赤外放射がＣＣＤカメラによって受け取られた像を変えるのを防止するためのものである。
【００３６】
光学チャンバ６０が図６に示されている。図示されているように、光学チャンバ６０には、サンプルハウジング６０４が取り付けられている光学ハウジング６０２が結合されている。プレート１０が光学チャンバ６０内に装荷されると、プレートはサンプルハウジング６０４内に固定される。サンプルハウジング６０４は、コリメータ１１０と整合されて配置されており、サンプルハウジング６０４の上方にはフレネルレンズ１２０が設けられている。多くの発光アッセイは室温で設けることができるけれども、幾つかの発光アッセイは高い温度を必要とする。この装置の照度計には、サンプルチャンバが設けられており、同サンプルチャンバ内では、サンプルハウジング６０４は、好ましい実施形態においてはポリウレタンフォームである絶縁体６０６と、サンプルチャンバ５５内の温度を約４２℃の室温よりも高い温度まで上げるためのヒーター要素６０８と、を担持している。
【００３７】
雰囲気状態においてさえ、プレート１０の充填されたウエルから発生する水蒸気の結果として、凝結がフレネルレンズ１２０の表面上に集まる傾向がある。霜取り装置６１０は、チャンバが雰囲気状態にある場合に、雰囲気状態又はチャンバの温度よりもほんの数度、好ましくは２ないし３°加熱された空気の流れを、フレネルレンズ１２０の表面を横切るように導き、凝結を効率的に防止する。光学チャンバ６０の内側の頂部には、撮像前に所望の波長を濾波するために波長を変えるフィルタ６１４が取り付けられているフィルタホイール６１２を駆動するフィルタモーター６１０が取り付けられている。もちろん、光がフィルタ６１４を通過した後にＣＣＤカメラ上に導かれるように光学チャンバ６０の光学ハウジング６０２内に符号６１６で示された領域が設けられている。光学チャンバ６０の大きさは、図６においては、光学チャンバ６０とフィルタホイール６１２と霜取り装置６１０との間の関係を図示するために誇張されている。実際には、フィルタは、光学チャンバ６０の内側でサンプルハウジング６０４の外側に配置されているが、所望の機能を依然として達成しながら代替え的な配置が可能である。
【００３８】
図６Ａには、本発明の好ましい実施形態における新規なロボット機構６１６が平面図で示されており、このロボット機構６１６は、高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）において使用するための機能を提供する。図６Ａを参照すると、動作は以下の通りである。ロボットプレートスタック６２０、６２２、６２４、６２６及び６２８の各々は、垂直スタック内に配列された多数のサンプルプレート１０によって満たされている。図６Ａの好ましい実施形態においては、ロボットプレートスタック６２８は、廃棄スタックとして示されている。残りのロボットプレートスタック６２０、６２２、６２４及び６２６は、演算処理装置５０（図示せず）によって制御されるソフトウエアによって供給されるようにプログラムすることができる。これらのスタックのいずれかからプレートを装荷するか又は掴み取るために、ロボットアーム６３０は、演算処理装置５０内にプログラムされたソフトウエアの制御によって、所望のロボットプレートスタックへと垂直方向で且つ回転して移動する。
【００３９】
演算処理装置５０によって命令されたとき、この装置の移送装置２００は、サンプルプレート１０を、装荷位置２０２から読み取り位置２０３へと運び、撮像が完了すると装荷位置２０２へと戻す。図６Ａに示された本発明の実施形態においては、サンプルプレート１０を装荷位置２０２から読み取り位置２０３へと移動し且つ装荷位置２０２まで戻る経過時間は、典型的には、撮像時間を含む３０ないし１２０秒である。
【００４０】
ステージング（切り離し）位置６３２及び６３４が、ロボットアーム６３０の位置に対して４５度の位置に配置されている。一つの実施形態においては、撮像が進んでいる間に、ロボットアーム６３０は、サンプルプレート１０をステージング位置６３２に配置することができ、サンプルプレート１０を装荷位置２０２に配置する準備ができている。撮像が完了した時に、ロボットアームは、読み取られたプレートを、装荷位置２０２からステージング位置６３４まで移動させることができ、次いで、同プレートをステージング位置６３２から装荷位置２０２へ装荷し、サンプルプレート１０が撮像されている間に、ロボットは、プレートを、ステージング位置６３４から廃棄スタック６２８へと移動させ、新しいサンプルプレート１０をステージング位置６３２に配置する。実際には、ステージング位置は、装荷位置とほぼ同じ高さにあり、従って、動きが迅速である。好ましい実施形態においては、ロボットアーム６３０は、撮像が一続きであるよりもむしろ撮像が進んでいる間にロボットプレートスタック６２０、６２２、６２４及び６２６のいずれかへと時間がかかる動きを行う。
【００４１】
ステージング位置６３２及び６３４においては、単一のサンプルプレート１０のためのサイクル時間は、７２秒の全サイクル時間に対して、ステージング領域からの動き／ステージング領域までの動きとの二つの動き（各々３秒）プラス読み取り位置２０３への動き／読み取り位置からの二つの移送の動き（各々３秒）プラス積分時間（像露出）時間（典型的には６０秒）である。ステージング位置６３２及び６３４を使用しない場合の時間は、１２６秒の全体に対して、スタックへの二つの動き（各３０秒）プラス二つの移送（各３秒）プラス積分時間（典型的には６０秒）である。ロボット機構６１６の好ましい実施形態に記載されているように、ステージング位置６３２及び６３４の使用によってサイクル時間は４３％だけ短縮される。
【００４２】
処理
上記したように、本発明の照度計のワークステーションの機械系及び光学系は、フレネルレンズ／コリメータの使用を十分に利用してＣＣＤカメラによる単一の像視検及びそれに続く分析を可能にするＨＴＳ環境における正しく定量的な発光の値を提供するように設計されている。コリメータ、レンズ及びカメラは、互いに結合して、従来技術における試みにおいて経験されるクロストークを減少させる。得られた信号は、更に、図７に図示されているように、演算処理装置５０又はその他の方法に装荷されたソフトウエアによって更に処理して、得られた値を更に精緻なものにする。
【００４３】
ここに記載された本発明の一体化された機械系及び光学系によって収集された像のデータを処理する前に、本発明の一体化された処理構成要素は、信頼性のあるデータ収集とするために、最初に、これらの一体化された機械系及び光学系の機械的整合を制御しなければならない。この過程は、演算処理装置５０の制御下で行われる。整合試験を行うためには、本発明の発光検知は、所謂温かいウエルと呼ばれる試験プレートの４つの試験サンプルウエルから発光された光を測定する。好ましい実施形態においては、この温かいウエルは、整合試験のために使用されるサンプルトレイの各コーナーの近くに配置される。４つの温かいウエルの各々から隣接ウエルのクロストークが分析され、これらのクロストーク値が比較される。コリメータがサンプルトレイ上に正しく整合されたときには、クロストークの値が４つの温かいウエルに対して対称的であろう。本発明のソフトウエアは、試験サンプルウエルの不正確な数、不正確な強度又は不正確な配置のようなあらゆる検知されたエラーをフラグをたてて合図する。エラーがないことを検知した後か又は検知され且つフラグをたてて合図されたエラーを補正した後に、本発明のソフトウエアは、サンプルウエルのトレイ、コリメータ、フレネルレンズ及びＣＣＤカメラアセンブリの正しい整合を決定するために、対称性の計算を行う。本発明の公知の実施形態においては、以下のステップを行うことによって、対象性の計算を行うために公知のソフトウエア技術が採用されている。
１．温かいウエルと垂直及び水平隣接ウエルの強度を引き出す。
２．温かいウエルの各々に対して、水平及び垂直の隣接ウエルの強度の平均値を別個に計算する。
３．実際の隣接する強度と水平及び垂直方向の各々についての平均値との差を計算する。
４．パーセンテージの強度値に変換するために、この差を温かいウエルの強度によって正規化する。
５．最も悪い場合の差の絶対値を見つけ、それを全体的な不整合として表示する。
６．温かいウエルの右側（水平方向）に隣接する４つのウエルの平均をとることによって、Ｘ方向（水平方向）の平均の不整合を計算する。
７．温かいウエルの頂部（垂直方向）に隣接する４つのウエルの平均をとることによって、Ｙ方向（垂直方向）の平均の不整合を計算する。
８．温かいウエルの頂部における左側の温かいウエルの垂直方向に隣接のウエルの平均をとることによって回転方向の不整合を計算し、それを右側の温かいウエルの垂直方向に隣接のウエルの平均値から差し引き、それによって、隣接ウエルの値のあらゆる傾きを指示する。
【００４４】
ステップＡにおいては、各々のフィルタ／エミッタのための３つの実際の像が撮られる。Ａ１はカーソル前方 （ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）の像であり、Ａ２は全積分時間の像であり、Ａ３はカーソル後方（ｐｏｓｔ−ｃｕｒｓｏｒ）の像である。カーソル前方の像とカーソル後方の像とは、画素の飽和の問題を避け且つ検知作動範囲を広げるために撮られる。カーソル前方の像及びカーソル後方の像は、たくさんの飽和した画素を含むべきでない短い積分時間の像を指している。全積分時間の像の６個以上の画素が飽和すると、カーソル前方の像とカーソル後方の像とが一緒に平均化されて、ウエル領域の実際のデータが形成される。６個の画素の飽和がない場合には、全積分時間像が使用される。
【００４５】
ステップＢにおいては、各画素を明確に分離し且つ読み取るために、各像は、端縁検知及びマスキングを受け、処理ステップは、それによって各ウエルの端縁又は対応する光の像が特定されるか又は注釈を付けられて、本明細書に参考例として組み入れられている米国特許出願第０９／３５１，６６０号に開示されているように、各関係ウエル領域が区切られて明確に分離される。Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３の各々に対して、各々、カーソル前方像、全積分時間像、及びカーソル後方像、と称される端縁の検知及びマスキングがなされる。これらの像は、次いで、“異常値”補正、補正、又は異常値及び異常の“削り取り”を受ける。この方法においては、関連領域内の画素が“異常値”を特定するために試験される。この異常値は、検知された光の強度がそれらの近辺の光の強度と全体として一致しないものであり、所与の画素又は小さい画素領域の強度が近辺の画素又は画素領域と著しく異なる場合には、次いで、周囲の画素又は領域の平均値が使用されて、エラーデータと置き換えられる。これは、宇宙線によって生じるもののようなランダムな光線によるものであり得る。この方法においては、このタイプの強度は補正される。
【００４６】
続いて、ステップＣにおいて、各像Ｃ１、Ｃ２及びＣ３は、マスクで画成された関連領域の各々の中の平均の画素値を得るために、暗視野を差し引く暗視野減算法を受ける。この減算は、周期的に更新される記憶されているライブラリからウエル毎になされる。
【００４７】
特に、暗減算法は、光が無いときにおいてさえＣＣＤカメラが低レベルの画素又は貯蔵値を出力するという事実を補正するためになされる。この値は、位置及び積分時間の不変量である電子バイアス電圧と、位置によって変わり得る“暗電流”とを含んでおり且つ積分時間とＣＣＤの温度に比例している。ＣＣＤはまた、入力された光にかかわらず常に高いレベル又は飽和している欠陥画素をも有している。
【００４８】
本発明の処理ソフトウエアは、ステップＣにおいて、実際のサンプルウエルの像データから、このバックグラウンド像又はデータを差し引く。関連技術における当業者が知っているように、実際の画像のすぐ前又は後の“暗”画像を撮像し、両方の場合に同じ積分時間に亘って画像を撮像すること、及び実際の画像データからこの“暗”画像データを差し引くことは知られている。本発明の好ましい実施形態においては、“暗”画像データは、好ましくは、特別な時間間隔で迅速に補正される最初の“暗”画像バックグラウンドはスタート時に補正され、次いで、典型的には、画像処理動作中に４時間間隔でなされる。
【００４９】
バックグラウンド画像は、積分時間−不変要素と積分時間−変動要素とを有しているので、データは、最小積分時間と最大積分時間とにおいて各サンプルウエルに対して集められ、公知のデータ分析技術を使用して、“傾斜／遮断”ラインが２つのデータポイント間で計算される。この計算は、最小積分時間と最大積分時間との間の時間に対するデータ内挿を可能にし、最小積分時間未満又は最大積分時間を超える積分時間のためのデータ外挿をも可能にする。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態においては、ＣＣＤ出力増幅器によって生じる２つの別個の暗電流機能を有するＣＣＤカメラが採用されている。増幅器の作動によって熱が発生され、バックグラウンド“暗”画像データが必ず形成される。好ましい実施形態においては、増幅器は、１０秒未満の積分時間に亘って連続的に作動し、一方、１０秒を超える積分時間に対しては読み取り動作の直前までオフされたままである。１０秒以上の積分時間に対して計算された“傾斜／遮断”ラインは、次いで、必ず、１０秒未満の積分時間に対して計算された“傾斜／遮断”ラインよりも低い傾斜を有する。ステップＣにおいては、処理ソフトウエア要素は、演算処理装置５０内の０ないし１０秒の積分時間領域の両方に対して別個の画像データ収集及び最小二乗回帰を可能にし、個々のＡＯＩの各々に対して“暗”バックグラウンド画像データが別個に記憶される。
【００５１】
“暗”電流及びバイアスもまた常に変動し得る。処理ソフトウエア要素は、“暗”バックグラウンド画像が撮られたときに撮られる積分時間が（上記の回帰ライン技術を使用して）正規化された（上記した視野の外側の）“暗基準”画素値を、実際のサンプルウエル画像が撮られている間に撮られた“暗基準”画素値と比較することによって、この作用に対して補正する。これらの値の差は、次いで、“暗”バックグラウンドデータに対して全体的な数として適用できるように、差し引かれるか加算される。これは、バイアスドリフトを補正し且つ全体的なＣＣＤ温度ドリフトをも補正する。
【００５２】
上記したように、ステップＣの上記の“暗バックグラウンド”内挿／減算の全てはウエル毎になされる。
ステップＤにおいては、画素の飽和が起こってカーソル前方及びカーソル後方の画像の平均値が使用されなければならない場合に、画像データに、カーソル前方の像によって表されるパーセンテージ（例えば、３％）の逆数が掛けられる。
【００５３】
ステップＥにおいては、ウエルのデータが、完全に均一な入力照射に対する装置の応答の逆数である校正ファイルを使用している均一性変動値に対して補正される。
ステップＦにおいては、データ全体が処理され且つ二次元データアレイからの三次元像の再生がなされるのと同じやり方で最終的な画像を作成することによって、クロストーク補正がなされる。
【００５４】
特に、ステップＦの好ましい実施形態においては、インパルス応答関数（ＩＲＦ）が９６ウエルプレートタイプの９６個のウエル全てに対して収集される。これは、所与のプレート内の一つの特定のウエルに高強度の照射光源を満たし、プレートを撮像し、プレート内の全てのウエルの応答をこの一つの高強度のウエルに対して分析することによってなされる。ＩＲＦは、完全なデータの組に対して、所望される異なるウエル位置の各々についてこの方法を繰り返すことによって全てのウエルに対して別個に収集される。３８４ウエルタイプに対しては、９６個のサンプリング領域が選択され、選択された領域間でのウエルのデータは二次元で内挿される。好ましい実施形態においては、９６サンプリング領域は、外側から始まって中心に向かって１行おきに且つ１列おきに含まれている。３８４ウエルプレートにおいては行と列との数が偶数であるので、２つの中心の行と２つの中心の列とが内挿される。３８４ウエルプレート内の反射もまた利用され且つ欠けている入力データの反射を予測し且つ内挿するために使用される。更に、好ましい実施形態においては、全てのウエルが高強度のウエルに対して正規化される。
【００５５】
続いて、ステップＦにおいて、各ウエルのためのウエルＩＲＦ値の二次元アレイが“展開”されて一次元列アレイにされ、他のウエルに対するＩＲＦ値の二次元アレイが、以下の表１に示されているように連続する列として加算される。
【００５６】
【表１】
【００５７】
Ｎ×Ｎマトリックスの形態を有する展開されたマトリックス（式中、Ｎ＝補正されるウエルの数）は、反射ファクタを含む装置間のクロストークの完全な特性を含んでいる。この展開されたマトリックスは、次いで、公知のマトリックス反転法を使用して反転させ、且つ実際のアッセイデータから展開された一次マトリックスをマトリックスかけ算して補正として使用される。この計算方法は、［真の光源分布］を解くためのマトリックス代数学として示すこともできる：
［真の光源分布］×［系のＩＲＦ］＝［装置出力］
［真の光源分布］＝｛１／［装置のＩＲＦ］｝×［装置出力］
続いて、上記の処理によって得られた計算されたウエルの強度は、校正されて、公知のレポータ酵素の濃度のような重要な絶対パラメータにされる。この校正は、関連技術の当業者によく知られている種々の校正曲線のいずれかを作る正規化方法によって行われる。
【００５８】
任意的なステップＧにおいては、処理された画像情報が、試験された物質との適当な相関関係を得るために、調整前の必要な処理を受ける。特に、好ましい実施形態においては、本発明の処理ソフトウエアは、多要素分析を行うことができる。基本的な問題は、他の種々の試薬を含んでいる単一のサンプル内の単一の試薬の濃度を別個に計算することである。典型的には、本発明と共に使用される試薬は、種々のスペクトル（おそらく重なっている）に亘って射出するように系統立てられる。一体化された光学要素に関して既に述べたように、多数の試薬から光を分離する第１のステップは、他の目標でない試薬の発光に対する感度を最小にしつつ、目標試薬の発光に対する感度を最大にするように設計された光学バンドパスフィルタによって達成される。本発明の好ましい実施形態においては、目標試薬の発光スペクトルの各々に対して一つの光学フィルタがある。
【００５９】
光学フィルタは干渉素子であるので、それらのバンドパス特性は、濾波される発光の入射角に依存して変化する。各ウエルの特定の配置と光学フィルタに対して特異であるので、入射角は、各ウエルに対して特異である。従って、全ての計算及び濾波率は、サンプルウエル毎に特異でなければならない。多要素の校正は以下のようにしてなされる。
【００６０】
実際の複合（たくさんの試薬）サンプルに先立って、各ウエル内の単一の試薬のみを含む標準規格品の撮像が行われ且つ分析される。これらの標準規格品は、各ウエルに対して、各光学フィルタのための多要素係数として集合的に使用される一組の係数を形成するであろう。所与の光学フィルタに対して、そのフィルタのための目標試薬は最も高い出力を生成するべきである。その他の試薬もまた、フィルタのバンドパス内のスペクトルを有しているかも知れず且つこれらの目標でない試薬のスペクトルのフィルタ信号への重なりの測定値であるより小さい出力を生成するであろう。例えば、目標試薬に対するフィルタの出力は８５０であり、その他の２つの試薬に対するフィルタの出力は各々１００と５０である。３つの試薬が単一のウエル内に一緒に加えられた場合には、全体の出力は１００であり、比率は、８５０：１００：５０であった。これらの係数は、各々のウエル位置及びフィルタに対して別個に測定されて、連立方程式のための係数の完備した組を付与する。これによって、一つのサンプルウエル内の試薬の濃度のあらゆる組み合わせの解決を可能にするであろう。更に、好ましい実施形態においては、これらの係数はまた、“全体の発光”内の全体の強度の読み取りによって正規化され、その結果、この計算は、単一の試薬のみが“全発光”フィルタによって測定された場合に装置が測定する強度と同じ強度をもたらすであろう。この計算は、青と緑の試薬（計算においてはＲとして省略されている）及び青と緑と全発光のフィルタ（計算においてはＦとして省略されている）の簡単な場合に対して以下のように示すことができる：
ＬｅｔＡ＝（青Ｒないし青Ｆに対する装置の出力）／（青Ｒないし全発光Ｆに対する装置の出力）
ＬｅｔＢ＝（緑Ｒないし青Ｆに対する装置の出力）／（緑Ｒないし全発光Ｆに対する装置の出力）
ＬｅｔＣ＝（青Ｒないし緑Ｆに対する装置の出力）／（青Ｒないし全発光Ｆに対する装置の出力）
ＬｅｔＤ＝（緑Ｒないし緑Ｆに対する装置の出力）／（緑Ｒないし全発光Ｆに対する装置の出力）。
【００６１】
これらの係数は、多色での試験を行う前に、各ウエルに対して測定される。そして、多試薬／多色に対しては、
（青Ｆの装置の出力）＝Ａ×（青Ｒの真の強度）＋Ｂ×（緑Ｒの強度）及び
（緑Ｆの装置の出力）＝Ｃ×（青Ｒの真の強度）＋Ｄ×（緑Ｒの強度）
これらの２つの連立方程式は、次いで、演算処理装置５０の制御下で、処理ソフトウエアによって青及び緑の試薬の真の強度に対して解かれる。
【００６２】
更に、ステップＧにおいて、各フィルタに対する装置のなま出力は、方程式を解く前に積分時間に対して正規化される。結果として得られた強度は、上記した基準を使用して、濃度として計算することができる。
【００６３】
最後に、ステップＨにおいて、分析されたデータは、再び演算処理装置５０によって制御されたユーザーが受け入れ可能な形態で表される。
本発明は、作動範囲及びＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）照度計の自由度を例示しているＨＴＳ形式で実施されたアッセイの例を参照することによって、更に理解することができる。
【００６４】
例
例１−精製されたｃＡＭＰの測定
ｃＡＭＰ標準規格品が逐次希釈され且つアルカリ性フォスファターゼ結合ｃＡＭＰ及び抗−ｃＡＭＰを備えた９６ウエルアッセイに添加した。これらのプレートを、ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）プロトコルによって処理し、ＣＳＰＤ／Ｓａｐｐｈｉｒｅ−II（登録商標）を添加して３０分経過した後に、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）上で１分間撮像した。精製されたｃＡＭＰの０．０６ｐＭの感知は、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）のワークステーション上でｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）によってなされる。結果を図８に示す。
【００６５】
例２−Ｃ２細胞を発現するアドレナリン作用性β２レセプタ内でのｃＡＭＰ誘導
Ｃ２細胞を発現するアドレナリンβ２レセプタを、９６−ウエルプレート（１０，０００細胞／ウエル）内にプレートし、イソプロテレノールによって１０分間刺激した。ｃＡＭＰ製品を、ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎアッセイを使用している細胞溶解液内で定量した。アッセイプレートをＣＳＰＤ／Ｓａｐｐｈｉｒｅ−II（登録商標）を添加して３０分経過した後に、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）上で１分間撮像した。刺激されたアドレナリンレセプタからのＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）上で、次第に増えるｃＡＭＰのレベルを検知した。結果を図９に示す。
【００６６】
例３−３８４−及び１，５３６−ウエル形式のＬｕｃ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）レポータ遺伝子アッセイ
ｐＣＲＥ−Ｌｕｃをトランスフェクトされた細胞を、９６−、３８４−及び１，５３６−ウエルプレート内に接種し、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）によって２０時間培養し、Ｌｕｃ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）システムによってアッセイした。ＰＣＲＥ−Ｌｕｃは、ｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）の制御による発光酵素レポーター遺伝子を含んでいる。フォルスコリンは、アデニレートシクラーゼの不可逆性の活性化による細胞内のｃＡＭＰ製品を含んでいる。全てのプレートの形式が、比較可能なフォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルを示している。結果を図１０に示す。
【００６７】
例４−ｐＣＲＥ−ＬｕｃでトランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞のフォルスコリン誘導
ｐＣＲＥ−Ｌｕｃでトランスフェクトされた細胞を９６−ウエルプレート内で接種した。４つのランダムなウエルを、１ｍＭのフォルスコリンによって１７時間誘導し、Ｌｕｃ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）システムによってアッセイした。結果を図１１に示す。
【００６８】
例５−ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼレポーター酵素のＤｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）の定量
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ及びｐβｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌによって一緒にトランスフェクトし且つ９６−ウエルマイクロプレート（２×１０４細胞／ウエル）内に接種した。細胞は、１７時間フォルスコリンによって培養した。細胞にＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ Ａを添加し且つ１０分間培養した。Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ Ｂを注入し且つルシフェラーゼで触媒作用を施した発光を迅速に測定した。３０分後に、ＡｃｃｅｌｅｒａｔｏｒIIを添加し、次いで、β−ガラクシトダーゼで触媒作用を施した発光を、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）ＨＴＳワークステーション上で定量した。定量結果を図１２に示す。
【００６９】
例６−ルシフェラーゼレポータの正規化した折り畳み誘導
ルシフェラーゼ活性化の折り畳み誘導（ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を、β−ガラクトシダーゼ活性化に対する正規化に続いて計算した。Ｄｕａｌ−ｌｉｇｈｔ（登録商標）アッセイは、正規化のための制御レポータの使用を可能にし又は遺伝子発現によって特異性でない作用を監視することが可能になる。これを図１３に示す。
【００７０】
例７−アンタゴニスト活性化に対するＢＡＰＴＡ−ＡＭ作用
ＣＨＯ−Ａｅｑ−５ＨＴ２Ｂに、コエレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）ｈ＋／−０．５μＭ ＢＡＰＴＡ−ＡＭを４時間装荷した。アンタゴニスト メチセルギドを、３０分間、装荷された細胞に添加した。１μＭアゴニストａ−Ｍｅ−５ＨＴを注入し、発光された光を、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）システム上で２０秒間積分した。メチセルギド（０．６μＭ）に対してレポートされたＩＣ５０は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭの存在下で変化しない。得られたデータを図１４に示す。
【００７１】
例８−オレクシン２レセプタの刺激されたペプチド アゴニスト上でのＢＡＰＴＡ−ＡＭの作用
ＣＨＯ−Ａｅｑ−ＯＸ２−Ａ２細胞に、コエレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）ｈ＋／−０．６μＭ ＢＡＰＴＡ−ＡＭを４時間装荷した。ペプチド アンタゴニスト オレクシン Ｂをウエル内に注入し、発光された光を、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）システム上で２０秒間積分した。ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）システム上でこのアッセイを使用したとき、オレキシンＢ（０．７５ｎＭ）に対してレポートされたＥＣ５０は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭの存在下で変化しない。これは図１５に示す。
【００７２】
以上、本発明を特定の実施形態及び例を参考にして説明した。指示されていない場合でも、いかなる実施例又は例も限定することは意図していない。本発明の技術の経験なく及び請求の範囲内で、当業者は変形例を想到できるであろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光を検知し且つ定量する装置及び方法の分野に関し、更に特定すると、発光性のアッセイから発光される光を検知し且つ定量する装置及び方法の分野に関する。更に特定すると、本発明は、目標化合物の存在又は量の指示としての発光性アッセイからの生物発光及び／又は化学発光のような発光を検知し且つ定量するための装置及び方法に関する。本発明の好ましい実施形態は、撮像素子として電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び同撮像素子によって収集されたデータを分析するためのコンピュータを含んでいる。更に好ましい実施形態は、高処理量のスクリーニング（ＨＴＳ）用途において使用するための機能を有し且つアッセイプレートのロボットによる操作を提供する。
【背景技術】
【０００２】
物質の発光の分析及び特に生物発光（ＢＬ）又は化学発光（ＣＬ）のどちらかの分析は、種々の発光性分析物の定量的な測定をする極めて有用な方法になりつつある。
最近は、イムノアッセイプロトコルにおける分析物を定量的に分析するために発光検知を利用する方法が導入されて来ている。このような発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）は、免疫特異的抗体又は混成核酸配列とこれに似た特定のリガンドの反応特異性を、光の検知によって得られる高い感度と組み合わせることの可能性を提案している。伝統的には、放射性の試薬がこのような目的のために使用されて来ており、ＬＩＡ試薬の特異性及び感度は、概して、伝統的な放射性標識を採用しているものに似ている。しかしながら、ＬＩＡは、放射性試薬に対してＬＩＡ試薬の無毒性及びより長い保存性を有するため、多くの用途にとっての好ましい分析方法である。
【０００３】
他の発光試薬の中では、Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．によって開発された１，２−ジオキセタンのような化学発光化合物及びキサンタンエステルのような他の安定した化学発光分子等が商業的使用可能状態にある。これらの化合物は、試薬、頻繁には、目標化合物の存在又は特異的な不存在においてのみ存在するアルカリフォスファターゼのような酵素によって引き起こされる分解によって光を放出するように誘発される。発光の検知は定性的指示であり、射出された光の量は、存在する誘発試薬すなわち目標化合物の量の指示に適している。その他の良く知られた発光化合物も同様に使用することができる。
【０００４】
発光の放出は、放出された光の量を増幅するか又は増す促進薬の存在によって、ときどき促進することができる。これは、発光の抑制を減じる微環境において発光試薬を引きこもらせる試薬を使用することによって達成することができる。多くの生物学的作業は、水性媒体内で必然的になされる。水は、典型的には光の放出を抑制する。水に可溶性の重合性オニウム塩（アンモニウム、ホスホニウム、スルホニウム等）のような化合物を提供することにより、発光性化合物を引きこもらせるかも知れない水が排除されている小さい領域が設けられても良い。
【０００５】
発光反応を監視するために使用される装置（照度計）の大半は、射出された光子を検知するために一つ以上の光電子増倍管（ＰＭＴｓ）を使用している。ＰＭＴを基礎とするマイクロプレート照度計がプレートの全てのウエル（溜め）からの信号を測定することができる速度は、使用されるＰＭＴの数によって制限される。殆どのマイクロプレート照度計は、たった一つのＰＭＴを有し、従って、３８４ウエルプレートは、９６ウエルプレートを読み取るのに必要とされる時間の四倍の時間を必要とする。
【０００６】
生物学的研究の性質は、多くのサンプルが同時に、例えば化学発光物質が酵素と反応するようにアッセイされることを指示する。これは、特に、濃度、組成、媒体等によって変わる何千ものサンプルが試験されなければならない遺伝子スクリーニング及び薬物の発見に特に当てはまる。これは、多数のサンプルが同時に反応せしめられ、発光によって排除されることを必要とする。しかしながら、化学発光又は生物発光は時間と共に減少するので、高速処理の必要がある。たくさんのサンプルを同時にスクリーニングすることによって、改良されたより速いデータ収集時間がもたらされ、これは、それに続くより速いデータ分析及び分析データの改善された信頼性を可能にする。
【０００７】
各特定のサンプル分析物の発光が所望の精度で分析されるようにするために、各サンプルからの発光は、同時に分析されつつあるサンプルから隔離されなければならない。このような環境においては、外部光源又は隣接するサンプルからの迷光は、これらの光のレベルが低いときでさえ問題を生じ得る。一般的なアッセイ、特に高処理量のスクリーニング（ＨＴＳ）を採用しているアッセイは、試験されるべき多くのサンプルを収容するための反応チャンバとして、たくさんのウエル（溜め）が設けられたマイクロプレートのプラスチックトレイを使用している。現在使用されているプレートとしては、９６−ウエルプレート及び３８６−ウエルプレートがある。ＨＴＳ速度及び小型化に対する増加しつつある要望に応答して、１，５３６個のウエルを有するプレートが導入されつつある。正確な発光分析に対する特に困難な障害は、高い信号強度を有するウエルに隣接したサンプルウエル内の光が不注意に検知されることである。この隣接するサンプルによる光測定干渉の現象は、“クロストーク”と称され、これらのウエル内の信号が実際には弱い場合には、隣接するウエル内のサンプルに誤った値を割り当てることにもなり得る。
【０００８】
既に提案された幾つかの照度計としては、米国特許第４，７７２，４５３号、米国特許第４，３６６，１１８号及びヨーロッパ特許第ＥＰ ００２５３５０号に記載されたものがある。米国特許第４，７７２，４５３号は、複数のサンプル細胞を担持しているプラットホーム上に配置された固定の光検知器を有している照度計を記載している。各細胞は、サンプルからの光が光検知器に導かれる開口の下方に配置される。米国特許第４，３６６，１１８号は、サンプルの直線状のアレイから発光された光がサンプルの上方ではなく横で検知される照度計を記載している。最後に、ヨーロッパ特許第ＥＰ ００２５３５０号は、サンプルウエルの底部を通して射出される光がウエルの下方に配置された可動の光検知器によって検知される照度計を記載している。
【０００９】
ヨーロッパ特許第ＥＰ ００２５３５０号に開示されているように、検知の直前に発光反応を開始させるための液体注入装置が採用されている照度計の更なる改善が提案されて来た。また、米国特許第４，０９９，９２０号においては、照度計において使用するために、温度制御機構が提案されて来た。発光サンプルの温度制御は、例えば、高温でサンプルを培養することが望ましい場合に重要であるかも知れない。
【００１０】
ＨＴＳ用途のための種々の光検知装置が市場において入手可能である。これらの装置としては、Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＰｈａｒｍａｃｉａによるＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒによって提供されているＶｉｅｗＬｕｘ（登録商標）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓからのＣＬＩＰＲ（登録商標）がある。これらの装置は全て、高価で寸法が大きく（床設置モデル）、プレートの準備及び装荷のためのロボット装置とのほんの限られた両立性を有し、限られた作動範囲を有し、及び／又はクロストークを低減させないか又は原因を明らかにしていない光学的方法を使用している。使用される光学装置は、典型的には、プレートの端縁に設けられたウエルの歪んだ視野を提供する複雑なテレコンセントリックな光学レンズ系であり、この光学装置は、しばしば高価でありその費用は２０万ドルを超える。おそらく、最も一般的な検知装置は、パッカード社から販売されているＰＭＴに基づく検知装置であるＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）である。ＴｏｐＣｏｕｎｔ装置は、所望の作動範囲を有しているけれども、１，５３６ウエルプレートを読み取ることができず且つプレート全体を同時に撮像することができない。
【００１１】
隣接するサンプルからのクロストークは、撮像に基づく装置における改良された発光分析の開発に対して重大な障害となったままである。このことは、発光サンプルが隣接するサンプルからの光と干渉し得る迷光を生成する簡単な光学系の現象として理解することができる。更に、サンプルを極めて低い光レベルのサンプルを検知し且つ分析することができる照度計の開発が、クロストーク干渉に対して特に必至である。
【発明の概要】
【００１２】
従来技術によっては満足されない上に特定した必要性に対処すべく、本発明の主要な目的は、発光サンプルの分析を許容する光検知装置を提供することである。本発明の更に別の目的は、多数の発光サンプルを同時に分析することができる光検知装置を提供することである。本発明の好ましい実施形態においては、ウエルプレートが１，５３６個ものウエルを含んでいる、ウエル内に保持された多数のサンプルを同時に分析する光検知装置が提供されている。本発明は更に、分析中に多数のウエルトレイのロボットによる操作を含んでいる。
【００１３】
本発明の更に別の目的は、隣接するサンプルからのクロストーク、特に分析されるべきサンプルよりも高い光レベルの出力を有する隣接のサンプルからのクロストークを最少にしつつ、低い光レベルの発光サンプルを分析することができる発光検知装置を提供することである。
【００１４】
本発明の装置は、ウエルプレート上に垂直コリメータを備え、ウエルの数に適合する大きさを有するフレネルレンズ構造を採用している。従って、１５３６−ウエルプレートは、プレートのウエルと整合した１，５３６個の細胞を備えたプレート上の暗視野コリメータ（ｄａｒｋ ｃｏｌｌｉｍａｔｏｒ）を採用するであろう。コリメータの上方にはフレネルレンズが固定されており、このフレネルレンズは、レンズの上方の視野が、プレート上の位置（端縁であってもよい）にかかわらず、各ウエル内を真っ直ぐに見下ろしているように見えるように光を屈折させる。
【００１５】
フレネルレンズの上方には、迅速にプレート全体の像を付与するために、３５ｍｍの広角レンズを通して見て、一度にプレート全体の像を撮るために、ＣＣＤカメラが配置されている。ＣＣＤとフレネル／コリメータとの間には、典型的にはフィルタホイール上に配列されたフィルタがレンズに対してある角度で配設されている。このフィルタは、射出される光の特定の波長を許容し且つその他の波長の全てを反射又は吸収するように選択される。種々の波長で光を放出する多数の試薬から射出された光の連続的な検知を許容するために、いくつかのフィルタがホイール上に設けられても良い。
【００１６】
サンプルは、ロボットにより且つ自動化された準備装置によって良好に動作するように設計された装荷装置を介して、光学的検知プラットホームに供給される。既に反応混合物が設けられたウエルプレートが、人間又は好ましくはロボットによってシャトル上に配置される。
【００１７】
シャトル上でのプレートの整合は、コリメータのグリッドアレイに適合するために緊密な公差条件にもかかわらず比較的粗雑であってもよい。シャトルが装荷位置を離れると、弾性手段が、プレートを厳格に一致した整合状態へと付勢する。シャトルは、プレートを、一度にコラム内に１６個までのウエルを収容することができるオーバーヘッド注入バーの下に位置決めする。予め加えられていない場合には、誘発試薬又は発光試薬がサンプルに添加され、プレートは、同プレートを横切って次のウエルのコラムを装荷するために前方へと割送りされ、コリメータは、コリメータ及びフレネルレンズと整合される。多くの反応は高温でのみより良く進行するので、サンプルチャンバは絶縁され且つチャンバ内の又はチャンバに提供される空気を加熱するための加熱手段が設けられている。チャンバ内の温度を室温近くに維持するための及び温度を正しく制御するために、チャンバには熱交換器が設けられても良い。
【００１８】
多数ウエルのプレート全体からの発光は、多数の波長が採用される場合に異なるフィルタを介する連続的な撮像によって一度に撮像される。得られた信号は、コリメータによって減じられたクロストークを更に減じるために処理され、発光の存在及び量は、自動化されたソフトウエアを使用しているパーソナルコンピュータによって迅速に検知され且つ計算される。次いで、データが、ウエル毎の強度として報告されるか又は特定のアッセイ基準に照らして更に分析される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
添付図面と組み合わせて考えたときに以下の詳細な説明を参照することによって更に良く理解されると、本発明及び本発明に伴う利点の多くの更に完全な理解が容易に得られるであろう。
【図１】本発明による発光検知装置の好ましい実施形態の断面図である。
【図２】本発明による発光検知装置の光学系の詳細な断面図である。
【図３】本発明のプレート移送装置の断面図である。
【図４】本発明の注入装置のアームアセンブリの斜視図である。
【図５】フィルタホイールアセンブリの分解図である。
【図６】図６は、光学ハウジングの断面図である。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明のロボット機構の平面図である。
【図７】本発明の処理方法のフローチャートである。
【図８】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図９】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１０】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１１】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１２】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１３】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１４】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【図１５】例１ないし１０における本発明を使用して得られた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
幾つかの図面を通して同様の符号が同一の又は対応する部品を示している図面特に図１を参照すると、本発明の発光検知装置の好ましい実施形態は、好ましい実施形態においては１，５３６以上もの数とし得る複数のサンプルウエル２０を含むマイクロプレート（プレート）１０を運ぶためにシャトル又はトレイを使用している。当業者は、サンプルウエル２０の数は、照度計の構成要素の物理的寸法及び光学的特性のみによって限定され、本発明の技術によって限定されるものではないことを認識するであろう。サンプルウエル２０は、本発明の装置に供給される前に、手動又はロボットによって分析物を充填されてもよい。化学発光に必要な試薬は、分析物が供給チューブの列４０を介してプレートをトレイ上に配置する前に供給される注入装置３０によって自動的に充填されてもよい。典型的には、サンプルウエルは、化学発光試薬を含んでいるであろう。これらの試薬は、サンプル内の分析物の濃度に比例した強度で光を発する。この光は、極めて低い強度であることもあり、所望の検知限界を達成するためには十分な感度を有する装置を必要とする。
【００２１】
注入装置３０の動作は、好ましい実施形態においては本発明の照度計の全ての構成要素の作動を制御する中央演算処理装置５０によって制御される。データ収集、分析及び提示もまた処理装置５０によって制御されている。更に、本発明の好ましい実施形態においては、注入装置３０は、分析物に緩衝液を添加し且つ各々全て中央演算処理装置５０の制御下で維持されるか又はつかの間の強い発光である発光撮像の“輝き”及び／又は“閃光”を可能にする試薬を添加するために使用することもできる。
【００２２】
分析物がサンプルウエル２０内に配置された後に、プレート１０は、ＣＣＤカメラ７０が発光サンプルを正確に撮像できるようにするために、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ７０から固定焦点距離に配置されるか又はすぐ下方に設けられた光学チャンバ６０内に配置されているサンプルチャンバ５５内に配置される。多くの発光試薬及び特異な発光反応は温度に依存するので、サンプルチャンバ５５は、正確に温度制御されることができるのが好ましい。中央演算処理装置５０は各サンプルトレイ１０内のサンプルウエル２０の動き及び注入を制御するので、温度制御は、個々のサンプルプレート１０の温度を変えることができる中央演算処理装置５０によって提供される。本発明の照度計の好ましい実施形態においては、中央演算処理装置５０はまた、本発明の照度計内での分析物の操作を含む動作を行う工業ロボット（図示せず）をも制御する。
【００２３】
プレート１０がサンプルチャンバ５５内に配置されると、光学系８０が、完全なマイクロプレート１０の像を単一の像としてＣＣＤカメラ７０に供給する。
本発明の照度計の作動は合成された連続的な動作であり、照度計の全ての構成要素は協働して正確で正しく且つ信頼性のあるデータを提供するけれども、本発明は、三つの別個の一体化された系、すなわち、光学系、機械系及び処理系を参照することによってより容易に理解することができる。以下の全体としての動作の例を説明しながら、各々の動作を以下に説明する。
【００２４】
光学系
図２を参照すると、光学系８０が更に詳細に示されている。プレート１０内に配置されたプレートウエル２０内の分析物からの発光による光線１００は、最初に、暗視野コリメータ１１０内を通過する。コリメータ１１０は、ＣＣＤカメラ７０による最終的な撮像のために平行及びほぼ平行な光線のみがサンプルウエル２０を出て行くのを許容する。コリメーション作用は、サンプルウエル２０からの迷光の防止及び発光サンプル間のクロストークの排除の助けとなる。コリメータ１１０は、サンプルからの迷光の制限を高めるために、サンプルトレイ１０に対して密封係合されるか又はごく近接せしめられている。各ウエル１０は、コリメータ１１０内の対応するグリッド開口と厳密に整合されている。コリメータ１１０から出た発光光線は、フレネル視野レンズ１２０を通過し、このフレネル視野レンズは光をフィルタ１３０に向けて集光させる。本発明の好ましい実施形態においては、コリメータ１１０とフレネル視野レンズ１２０とは、ユーザーが交換することができるカセット内に包装されている。このような装置の交換は、種々の分析物の光学特性及びプレート内のウエルの分布を変えることに必然的に伴う。
【００２５】
フレネル視野レンズの使用は、幾つかの理由により光学系を入れ替えるためには好ましい。最初に、設計及び物質の改良は、実質的にはそれ本来の制約を排除しつつ、フレネルレンズの優れた光学的機能を利用して来た。今日においては、多くのフレネルレンズが、散乱光が極めて少ない殆ど傷の無い表面を形成している成形樹脂によって作られている。散乱光の除去は、本発明の照度計における隣接するサンプル間のクロストークを排除する重要な要素である。更に、フレネルレンズ及びその他の光学系の製造において一般的に採用される改良されたタイプの樹脂は、研磨されたガラスレンズに匹敵する光学的品質を有している。
【００２６】
コンピュータ制御のダイヤモンド研磨のような高度な技術による方法を使用すると、複雑な非球面を、フレネルレンズを注型するための長持ちする型内で加工することができる。この方法によりフレネルレンズを製造して、本発明におけるように、電荷結合素子カメラにとって最も有効である正確な光学結像作用を得ることができる。更に、フレネルレンズは、フラットで極めて薄く成形できるという点で従来のレンズに優る利点を提供する。フレネルレンズの形状により、フレネルレンズを照度計のハウジング内に直接一体化することが容易にでき、光量が低いサンプルの正しい撮像にとって必要な光遮蔽特性を高めることができる。更に、フレネルレンズは、匹敵する従来のガラスレンズよりも遙かに低廉である。
【００２７】
他の何らかのレンズと同じく、フレネルレンズからのビーム全体の広がりは、レンズの焦点距離に対する光源の大きさに依存する。発光アッセイサンプルのようなより小さい光源及びより長い焦点距離は、よりコンパクトなビームを形成する。本発明の照度計における光学系８０の幾何学的構造及び寸法を最小化することに対して実際的な制限があるので、フレネル視野レンズ１２０の使用は、細かく調整された光学系に対して最も大きな機会を提供する。プレート１０からの放射光はレンズ１２０を通過し、ＣＣＤ７０において得られる像が全てのウエル（例えば、横方向に外れている端縁のものであっても）内へ直接見下ろせるように屈折せしめられる。この特徴は、典型的には“テレセントリック”と呼ばれている。
【００２８】
更に、本発明の好ましい実施形態においては、フィルタ１３０がホイール上に形成され、この構造においては、種々のフィルタ要素が、分析されているサンプルの発光特性に依存してホイールの種々の部分を占めている。フィルタ１３０は、反射された迷光が視野の外側で反射されるように、ＣＣＤに対して２０°ないし３０°の角度で傾斜せしめられるのが好ましい。特に、フィルタホイール１３０は、高品質の結像を許容するばかりでなく、種々の波長で発光する種々の試薬の発光を分離するために使用することもできる種々の波長範囲の選択を可能にする。フィルタホイール１３０はまた、サンプルプレート１０内の個々のサンプルウエル２０の中央演算処理装置５０による制御と同様に中央演算処理装置５０によって制御される。多くのアッセイにおいては、本発明に参考として組み入れられている係属中の米国特許出願第０８／５７９，７８７号において取り組まれているような、種々の波長において発光する多数発光試薬が単一のウエル内で採用されている。多数のフィルタを使用することによって、各々が順に結像され、予め記憶された校正ファクタを使用して得られるデータから、正確な濃度を測定することができる。フィルタ１３０には、選択されたバンドパスと結合して又は独立した要素として作動する赤外（ＩＲ）フィルタが設けられているのが好ましい。出願人は、板状の燐光からＩＲ（赤外）線の迷光が生じて、異常に高いバックグラウンドを生じることを発見した。
【００２９】
フィルタホイール１３０からのサンプルによって射出された光は、好ましい実施形態においては大きい開口で歪みの少ないカメラレンズであるカメラレンズ１４０を通る。カメラレンズ１４０は、ＣＣＤチップ７０上に像を結ぶ。本発明の好ましい実施形態においては、ＣＣＤカメラ７０は、冷却された低ノイズで高い分解能の素子である。レンズは、低い光レベル（Ｆ１．４）で大きい開口数の３５ｍｍ広角レンズであるのが好ましい。倍率は３ないし６、好ましくは約５．５であるのが好ましい。好ましい実施形態においては、ＣＣＤカメラ７０には、作動範囲（請求の範囲の本発明においては約１０５である）を広げるために、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）照度計と称される焦点ぼけ防止ＣＣＤチップが設けられている。焦点ぼけは、単一の画素に光が当たり過ぎ光電子がＣＣＤ素子のウエル容量をオーバーフローして周りの画素を消失させてしまうときに起こる。更に、本発明の照度計の好ましい実施形態においては、選択されたＣＣＤカメラは、約−３５℃までのＣＣＤの冷却を提供する液体冷却熱電気（ペルチエ）素子を含んでおり、このＣＣＤは、各々が１６μｍ角であって２０．５ｍｍ×１６．４ｍｍの全作動領域を形成している１２８０×１０２４画素を有している。量子効率平均１５％は、４５０ｎｍないし８００ｎｍの範囲に亘っている。出力は、１６ビットの精度にデジタル化され、画素は、電子ノイズを低減させるために、“貯蔵（ｂｉｎ）”することができる。
【００３０】
ここに開示された特徴を使用することによって、本発明の照度計は、高い密度のサンプルトレイの高品質の結像を提供することができる空間解像度を有する。ノイズ性能及びＣＣＤ温度は、所望の検知限界を提供するように設計されている。
【００３１】
機構
本発明の照度計の機械系は、ＣＣＤカメラ７０によって読み取ることができるように、コリメータ１１０と整合されたマイクロプレートの自動化され且つ高い処理量の正確な供給を達成するように設計されている。この目的のために、図３に示されているように、本発明の照度計のシャトル２００は、プレート１０が、好ましくはロボットアームのようなロボット装置によってシャトルに装荷され、シャトル２００が次いでサンプルチャンバ５５に向かって運ばれる装荷位置２０２から、読み取り位置２０３まで並進する。シャトル２００は、一般的なステッピングモーター（図示せず）によって並進せしめられる。シャトル２００がサンプルチャンバ５５に向かって進むと、シャトル２００は注入装置３０の下で停止し得る。注入装置３０は、図４の下方により詳細に図示されている。依然として図３を参照すると、注入装置３０は、リザーバ２０４から抜き取った流体試薬を給送する。注射器ポンプ２０５が、リザーバ２０４から流体試薬を抜き取り、同流体試薬を注入チューブ４０へと圧送する。二方向弁２０６は、注射ポンプ２０５によってリザーバ２０４から抜き取られ且つ注射器ポンプ２０５によって圧送された流体の供給チューブ４０への流通を制御している。実際の動作においては、使用されている注入ポートと同じ数の注入チューブ４０が存在し、たくさんの注射器ポンプ２０５も使用される。図４の下方に図示されているように、注入装置３０は、１６個以下の注入ポート３０２を有している。注入装置が使用されているときに照度計と共に使用されるプレートには、典型的には、一つの列内に１６個以下のウエルが準備される。シャトル２００がプレート１０を注入装置３０の下まで進むと、シャトル２００は、ウエルの第１の列２０８が注入装置３０の下方に直接整合するように停止する。正確な量の分析物がウエルの第１の組に供給され、シャトル２００は、ウエルの第２の列内へ試薬を注入するために、一つの列を前方へ割り送りする。この過程は、全てのウエルが充填されるまで繰り返される。その後に、シャトル２００は、ヒンジ止めされたドア２１２を通ってサンプルチャンバ５５内へと前方に進む。別のやり方では、ドア２１２は、ギロチンドア又は同様のタイプの閉鎖機構であっても良い。プレート１０のウエルは、次いでサンプルチャンバ５５内で読み取られる。読み取りが完了すると、シャトル２００は装荷位置２０２へと戻る。
【００３２】
シャトル２００が注入バーのところへ進む前に、プレート内への正しい供給のために、チューブに流体を十分に入れる必要があるかもしれない。樋３０４は、矢印で示されたシャトル２００の移動方向に平行なその貯蔵位置から、同移動方向に直角な注入装置３０のすぐ下方に横たわる位置まで回転する。注入装置３０及びリザーバ２０４内の流体は、樋３０４内へ供給され且つ吸引によって取り出される。シャトルがサンプルチャンバ５５に向かって移動せしめられると、樋３０４は、次いで、シャトル２００の移動方向から離れて同移動方向に平行なその休止位置へと戻る。装荷位置２０２への戻り動作の際に、シャトル２００上のロケータ２１４はカム２１６と係合する。ロケータ２１４は、カム２１６と係合したときにロケータ２１４がプレート１０から凹むように、弾性手段上に取り付けられている。これによって、正しい位置決めの要件なしで、プレート１０の取り外し及び新しいプレート１０のロボットアーム又はその他の供給源からの供給が可能になる。シャトル２００が装荷位置２０２から移動して離れるときに、ロケータ２１４は、前方へ付勢されてプレート１０を定位置に確実に位置決めする。プレート１０は、ロケータ２１４の弾性的な付勢によって肩部２１７に当接せしめられて保持される。
【００３３】
得られた結果が正しい試験サンプルと関連付けられるように、各プレートは正しく特定されることが重要である。殆どのＨＴＳ研究所においては、殆どのマイクロプレートは、唯一の“バーコード”で標識される。標識は、プレート自体の面に直角な面上に配置されることが多い。各プレートの正しい特定を可能にするために、バーコードリーダー２１８が、概ね符号２９９によって示された照度計ハウジング内のドア２１２のすぐ上、例えば、アーム又はフランジ２２０上に取り付けられる。バーコードリーダー２１８はミラー２２２上に合焦され、これは、次いで、シャトル２００に到達したときにプレート１０の前方端縁又は先端から直接読み取ることが可能になる。このように、各プレートがサンプルチャンバ内に到達する前に、その濃度は、処理演算装置５０内に正しく記録され、得られた結果はその濃度と関連付けることができる。当業者は、種々の整合構造及びバーコードリーダー２１８及びミラー２２２の両方の位置決めが所望の識別結果をもたらすことを認識するであろう。
【００３４】
図４により明確に示されているように、注入装置３０は、アッセイされているプレート上のウエルの全体の数に対応する位置が設けられたアクチュエータホイール３０６の作動によって正しく配置される。同様に、プレートの異なる厚みを明確にするために、垂直方向の位置をホイール３０８によって制御しても良い。シャトル２００の単純な並進運動及び運ばれる各プレートの正しい位置決め及び特定を仮定すれば、サンプルチャンバ５５内への及びサンプルチャンバ５５からのマイクロプレート試験プレートの迅速なサイクリングをなすことができる。
【００３５】
本発明の光学系と関連させて上記したように、使用されている発光エミッタの選択された波長に含まれる光以外の光の通過を反らせるフィルタが設けられる。このフィルタアセンブリは、図５に分解図で示されている。フィルタフレーム５０２は、フィルタホイール５０６のハブに結合されたアーム５０４によって支持されている。たくさんの異なるフィルタが単一のホイール上に設けられても良い。フィルタ５０８自体は、グロメット、ねじ、又はその他の保持器具５１２によってフレーム５０２に固定されているカバー５１０によってフレームにしっかりと取り付けられ且つ保持されている。上記したように、フィルタホイールは、如何なる反射も視野の外側へ導くために、フィルタ５０８をコリメータ１１０に対して通常は約２２°で傾斜させてフレーム５０２内に保持するように位置決めされる。光は、カメラレンズ１４０及びＣＣＤカメラ７０と整合されたフィルタの開口５１４内を通過する。更に上記したように、フィルタ５０８は、フィルタ自体の構成要素として、又は測定される光用のフィルタに追加して設けられる構成要素として、赤外遮断装置を含むのが好ましい。赤外遮断装置は、外部からの光線によって生じる赤外放射がＣＣＤカメラによって受け取られた像を変えるのを防止するためのものである。
【００３６】
光学チャンバ６０が図６に示されている。図示されているように、光学チャンバ６０には、サンプルハウジング６０４が取り付けられている光学ハウジング６０２が結合されている。プレート１０が光学チャンバ６０内に装荷されると、プレートはサンプルハウジング６０４内に固定される。サンプルハウジング６０４は、コリメータ１１０と整合されて配置されており、サンプルハウジング６０４の上方にはフレネルレンズ１２０が設けられている。多くの発光アッセイは室温で設けることができるけれども、幾つかの発光アッセイは高い温度を必要とする。この装置の照度計には、サンプルチャンバが設けられており、同サンプルチャンバ内では、サンプルハウジング６０４は、好ましい実施形態においてはポリウレタンフォームである絶縁体６０６と、サンプルチャンバ５５内の温度を約４２℃の室温よりも高い温度まで上げるためのヒーター要素６０８と、を担持している。
【００３７】
雰囲気状態においてさえ、プレート１０の充填されたウエルから発生する水蒸気の結果として、凝結がフレネルレンズ１２０の表面上に集まる傾向がある。霜取り装置６１０は、チャンバが雰囲気状態にある場合に、雰囲気状態又はチャンバの温度よりもほんの数度、好ましくは２ないし３°加熱された空気の流れを、フレネルレンズ１２０の表面を横切るように導き、凝結を効率的に防止する。光学チャンバ６０の内側の頂部には、撮像前に所望の波長を濾波するために波長を変えるフィルタ６１４が取り付けられているフィルタホイール６１２を駆動するフィルタモーター６１０が取り付けられている。もちろん、光がフィルタ６１４を通過した後にＣＣＤカメラ上に導かれるように光学チャンバ６０の光学ハウジング６０２内に符号６１６で示された領域が設けられている。光学チャンバ６０の大きさは、図６においては、光学チャンバ６０とフィルタホイール６１２と霜取り装置６１０との間の関係を図示するために誇張されている。実際には、フィルタは、光学チャンバ６０の内側でサンプルハウジング６０４の外側に配置されているが、所望の機能を依然として達成しながら代替え的な配置が可能である。
【００３８】
図６Ａには、本発明の好ましい実施形態における新規なロボット機構６１６が平面図で示されており、このロボット機構６１６は、高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）において使用するための機能を提供する。図６Ａを参照すると、動作は以下の通りである。ロボットプレートスタック６２０、６２２、６２４、６２６及び６２８の各々は、垂直スタック内に配列された多数のサンプルプレート１０によって満たされている。図６Ａの好ましい実施形態においては、ロボットプレートスタック６２８は、廃棄スタックとして示されている。残りのロボットプレートスタック６２０、６２２、６２４及び６２６は、演算処理装置５０（図示せず）によって制御されるソフトウエアによって供給されるようにプログラムすることができる。これらのスタックのいずれかからプレートを装荷するか又は掴み取るために、ロボットアーム６３０は、演算処理装置５０内にプログラムされたソフトウエアの制御によって、所望のロボットプレートスタックへと垂直方向で且つ回転して移動する。
【００３９】
演算処理装置５０によって命令されたとき、この装置の移送装置２００は、サンプルプレート１０を、装荷位置２０２から読み取り位置２０３へと運び、撮像が完了すると装荷位置２０２へと戻す。図６Ａに示された本発明の実施形態においては、サンプルプレート１０を装荷位置２０２から読み取り位置２０３へと移動し且つ装荷位置２０２まで戻る経過時間は、典型的には、撮像時間を含む３０ないし１２０秒である。
【００４０】
ステージング（切り離し）位置６３２及び６３４が、ロボットアーム６３０の位置に対して４５度の位置に配置されている。一つの実施形態においては、撮像が進んでいる間に、ロボットアーム６３０は、サンプルプレート１０をステージング位置６３２に配置することができ、サンプルプレート１０を装荷位置２０２に配置する準備ができている。撮像が完了した時に、ロボットアームは、読み取られたプレートを、装荷位置２０２からステージング位置６３４まで移動させることができ、次いで、同プレートをステージング位置６３２から装荷位置２０２へ装荷し、サンプルプレート１０が撮像されている間に、ロボットは、プレートを、ステージング位置６３４から廃棄スタック６２８へと移動させ、新しいサンプルプレート１０をステージング位置６３２に配置する。実際には、ステージング位置は、装荷位置とほぼ同じ高さにあり、従って、動きが迅速である。好ましい実施形態においては、ロボットアーム６３０は、撮像が一続きであるよりもむしろ撮像が進んでいる間にロボットプレートスタック６２０、６２２、６２４及び６２６のいずれかへと時間がかかる動きを行う。
【００４１】
ステージング位置６３２及び６３４においては、単一のサンプルプレート１０のためのサイクル時間は、７２秒の全サイクル時間に対して、ステージング領域からの動き／ステージング領域までの動きとの二つの動き（各々３秒）プラス読み取り位置２０３への動き／読み取り位置からの二つの移送の動き（各々３秒）プラス積分時間（像露出）時間（典型的には６０秒）である。ステージング位置６３２及び６３４を使用しない場合の時間は、１２６秒の全体に対して、スタックへの二つの動き（各３０秒）プラス二つの移送（各３秒）プラス積分時間（典型的には６０秒）である。ロボット機構６１６の好ましい実施形態に記載されているように、ステージング位置６３２及び６３４の使用によってサイクル時間は４３％だけ短縮される。
【００４２】
処理
上記したように、本発明の照度計のワークステーションの機械系及び光学系は、フレネルレンズ／コリメータの使用を十分に利用してＣＣＤカメラによる単一の像視検及びそれに続く分析を可能にするＨＴＳ環境における正しく定量的な発光の値を提供するように設計されている。コリメータ、レンズ及びカメラは、互いに結合して、従来技術における試みにおいて経験されるクロストークを減少させる。得られた信号は、更に、図７に図示されているように、演算処理装置５０又はその他の方法に装荷されたソフトウエアによって更に処理して、得られた値を更に精緻なものにする。
【００４３】
ここに記載された本発明の一体化された機械系及び光学系によって収集された像のデータを処理する前に、本発明の一体化された処理構成要素は、信頼性のあるデータ収集とするために、最初に、これらの一体化された機械系及び光学系の機械的整合を制御しなければならない。この過程は、演算処理装置５０の制御下で行われる。整合試験を行うためには、本発明の発光検知は、所謂温かいウエルと呼ばれる試験プレートの４つの試験サンプルウエルから発光された光を測定する。好ましい実施形態においては、この温かいウエルは、整合試験のために使用されるサンプルトレイの各コーナーの近くに配置される。４つの温かいウエルの各々から隣接ウエルのクロストークが分析され、これらのクロストーク値が比較される。コリメータがサンプルトレイ上に正しく整合されたときには、クロストークの値が４つの温かいウエルに対して対称的であろう。本発明のソフトウエアは、試験サンプルウエルの不正確な数、不正確な強度又は不正確な配置のようなあらゆる検知されたエラーをフラグをたてて合図する。エラーがないことを検知した後か又は検知され且つフラグをたてて合図されたエラーを補正した後に、本発明のソフトウエアは、サンプルウエルのトレイ、コリメータ、フレネルレンズ及びＣＣＤカメラアセンブリの正しい整合を決定するために、対称性の計算を行う。本発明の公知の実施形態においては、以下のステップを行うことによって、対象性の計算を行うために公知のソフトウエア技術が採用されている。
１．温かいウエルと垂直及び水平隣接ウエルの強度を引き出す。
２．温かいウエルの各々に対して、水平及び垂直の隣接ウエルの強度の平均値を別個に計算する。
３．実際の隣接する強度と水平及び垂直方向の各々についての平均値との差を計算する。
４．パーセンテージの強度値に変換するために、この差を温かいウエルの強度によって正規化する。
５．最も悪い場合の差の絶対値を見つけ、それを全体的な不整合として表示する。
６．温かいウエルの右側（水平方向）に隣接する４つのウエルの平均をとることによって、Ｘ方向（水平方向）の平均の不整合を計算する。
７．温かいウエルの頂部（垂直方向）に隣接する４つのウエルの平均をとることによって、Ｙ方向（垂直方向）の平均の不整合を計算する。
８．温かいウエルの頂部における左側の温かいウエルの垂直方向に隣接のウエルの平均をとることによって回転方向の不整合を計算し、それを右側の温かいウエルの垂直方向に隣接のウエルの平均値から差し引き、それによって、隣接ウエルの値のあらゆる傾きを指示する。
【００４４】
ステップＡにおいては、各々のフィルタ／エミッタのための３つの実際の像が撮られる。Ａ１はカーソル前方 （ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）の像であり、Ａ２は全積分時間の像であり、Ａ３はカーソル後方（ｐｏｓｔ−ｃｕｒｓｏｒ）の像である。カーソル前方の像とカーソル後方の像とは、画素の飽和の問題を避け且つ検知作動範囲を広げるために撮られる。カーソル前方の像及びカーソル後方の像は、たくさんの飽和した画素を含むべきでない短い積分時間の像を指している。全積分時間の像の６個以上の画素が飽和すると、カーソル前方の像とカーソル後方の像とが一緒に平均化されて、ウエル領域の実際のデータが形成される。６個の画素の飽和がない場合には、全積分時間像が使用される。
【００４５】
ステップＢにおいては、各画素を明確に分離し且つ読み取るために、各像は、端縁検知及びマスキングを受け、処理ステップは、それによって各ウエルの端縁又は対応する光の像が特定されるか又は注釈を付けられて、本明細書に参考例として組み入れられている米国特許出願第０９／３５１，６６０号に開示されているように、各関係ウエル領域が区切られて明確に分離される。Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３の各々に対して、各々、カーソル前方像、全積分時間像、及びカーソル後方像、と称される端縁の検知及びマスキングがなされる。これらの像は、次いで、“異常値”補正、補正、又は異常値及び異常の“削り取り”を受ける。この方法においては、関連領域内の画素が“異常値”を特定するために試験される。この異常値は、検知された光の強度がそれらの近辺の光の強度と全体として一致しないものであり、所与の画素又は小さい画素領域の強度が近辺の画素又は画素領域と著しく異なる場合には、次いで、周囲の画素又は領域の平均値が使用されて、エラーデータと置き換えられる。これは、宇宙線によって生じるもののようなランダムな光線によるものであり得る。この方法においては、このタイプの強度は補正される。
【００４６】
続いて、ステップＣにおいて、各像Ｃ１、Ｃ２及びＣ３は、マスクで画成された関連領域の各々の中の平均の画素値を得るために、暗視野を差し引く暗視野減算法を受ける。この減算は、周期的に更新される記憶されているライブラリからウエル毎になされる。
【００４７】
特に、暗減算法は、光が無いときにおいてさえＣＣＤカメラが低レベルの画素又は貯蔵値を出力するという事実を補正するためになされる。この値は、位置及び積分時間の不変量である電子バイアス電圧と、位置によって変わり得る“暗電流”とを含んでおり且つ積分時間とＣＣＤの温度に比例している。ＣＣＤはまた、入力された光にかかわらず常に高いレベル又は飽和している欠陥画素をも有している。
【００４８】
本発明の処理ソフトウエアは、ステップＣにおいて、実際のサンプルウエルの像データから、このバックグラウンド像又はデータを差し引く。関連技術における当業者が知っているように、実際の画像のすぐ前又は後の“暗”画像を撮像し、両方の場合に同じ積分時間に亘って画像を撮像すること、及び実際の画像データからこの“暗”画像データを差し引くことは知られている。本発明の好ましい実施形態においては、“暗”画像データは、好ましくは、特別な時間間隔で迅速に補正される最初の“暗”画像バックグラウンドはスタート時に補正され、次いで、典型的には、画像処理動作中に４時間間隔でなされる。
【００４９】
バックグラウンド画像は、積分時間−不変要素と積分時間−変動要素とを有しているので、データは、最小積分時間と最大積分時間とにおいて各サンプルウエルに対して集められ、公知のデータ分析技術を使用して、“傾斜／遮断”ラインが２つのデータポイント間で計算される。この計算は、最小積分時間と最大積分時間との間の時間に対するデータ内挿を可能にし、最小積分時間未満又は最大積分時間を超える積分時間のためのデータ外挿をも可能にする。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態においては、ＣＣＤ出力増幅器によって生じる２つの別個の暗電流機能を有するＣＣＤカメラが採用されている。増幅器の作動によって熱が発生され、バックグラウンド“暗”画像データが必ず形成される。好ましい実施形態においては、増幅器は、１０秒未満の積分時間に亘って連続的に作動し、一方、１０秒を超える積分時間に対しては読み取り動作の直前までオフされたままである。１０秒以上の積分時間に対して計算された“傾斜／遮断”ラインは、次いで、必ず、１０秒未満の積分時間に対して計算された“傾斜／遮断”ラインよりも低い傾斜を有する。ステップＣにおいては、処理ソフトウエア要素は、演算処理装置５０内の０ないし１０秒の積分時間領域の両方に対して別個の画像データ収集及び最小二乗回帰を可能にし、個々のＡＯＩの各々に対して“暗”バックグラウンド画像データが別個に記憶される。
【００５１】
“暗”電流及びバイアスもまた常に変動し得る。処理ソフトウエア要素は、“暗”バックグラウンド画像が撮られたときに撮られる積分時間が（上記の回帰ライン技術を使用して）正規化された（上記した視野の外側の）“暗基準”画素値を、実際のサンプルウエル画像が撮られている間に撮られた“暗基準”画素値と比較することによって、この作用に対して補正する。これらの値の差は、次いで、“暗”バックグラウンドデータに対して全体的な数として適用できるように、差し引かれるか加算される。これは、バイアスドリフトを補正し且つ全体的なＣＣＤ温度ドリフトをも補正する。
【００５２】
上記したように、ステップＣの上記の“暗バックグラウンド”内挿／減算の全てはウエル毎になされる。
ステップＤにおいては、画素の飽和が起こってカーソル前方及びカーソル後方の画像の平均値が使用されなければならない場合に、画像データに、カーソル前方の像によって表されるパーセンテージ（例えば、３％）の逆数が掛けられる。
【００５３】
ステップＥにおいては、ウエルのデータが、完全に均一な入力照射に対する装置の応答の逆数である校正ファイルを使用している均一性変動値に対して補正される。
ステップＦにおいては、データ全体が処理され且つ二次元データアレイからの三次元像の再生がなされるのと同じやり方で最終的な画像を作成することによって、クロストーク補正がなされる。
【００５４】
特に、ステップＦの好ましい実施形態においては、インパルス応答関数（ＩＲＦ）が９６ウエルプレートタイプの９６個のウエル全てに対して収集される。これは、所与のプレート内の一つの特定のウエルに高強度の照射光源を満たし、プレートを撮像し、プレート内の全てのウエルの応答をこの一つの高強度のウエルに対して分析することによってなされる。ＩＲＦは、完全なデータの組に対して、所望される異なるウエル位置の各々についてこの方法を繰り返すことによって全てのウエルに対して別個に収集される。３８４ウエルタイプに対しては、９６個のサンプリング領域が選択され、選択された領域間でのウエルのデータは二次元で内挿される。好ましい実施形態においては、９６サンプリング領域は、外側から始まって中心に向かって１行おきに且つ１列おきに含まれている。３８４ウエルプレートにおいては行と列との数が偶数であるので、２つの中心の行と２つの中心の列とが内挿される。３８４ウエルプレート内の反射もまた利用され且つ欠けている入力データの反射を予測し且つ内挿するために使用される。更に、好ましい実施形態においては、全てのウエルが高強度のウエルに対して正規化される。
【００５５】
続いて、ステップＦにおいて、各ウエルのためのウエルＩＲＦ値の二次元アレイが“展開”されて一次元列アレイにされ、他のウエルに対するＩＲＦ値の二次元アレイが、以下の表１に示されているように連続する列として加算される。
【００５６】
【表１】
【００５７】
Ｎ×Ｎマトリックスの形態を有する展開されたマトリックス（式中、Ｎ＝補正されるウエルの数）は、反射ファクタを含む装置間のクロストークの完全な特性を含んでいる。この展開されたマトリックスは、次いで、公知のマトリックス反転法を使用して反転させ、且つ実際のアッセイデータから展開された一次マトリックスをマトリックスかけ算して補正として使用される。この計算方法は、［真の光源分布］を解くためのマトリックス代数学として示すこともできる：
［真の光源分布］×［系のＩＲＦ］＝［装置出力］
［真の光源分布］＝｛１／［装置のＩＲＦ］｝×［装置出力］
続いて、上記の処理によって得られた計算されたウエルの強度は、校正されて、公知のレポータ酵素の濃度のような重要な絶対パラメータにされる。この校正は、関連技術の当業者によく知られている種々の校正曲線のいずれかを作る正規化方法によって行われる。
【００５８】
任意的なステップＧにおいては、処理された画像情報が、試験された物質との適当な相関関係を得るために、調整前の必要な処理を受ける。特に、好ましい実施形態においては、本発明の処理ソフトウエアは、多要素分析を行うことができる。基本的な問題は、他の種々の試薬を含んでいる単一のサンプル内の単一の試薬の濃度を別個に計算することである。典型的には、本発明と共に使用される試薬は、種々のスペクトル（おそらく重なっている）に亘って射出するように系統立てられる。一体化された光学要素に関して既に述べたように、多数の試薬から光を分離する第１のステップは、他の目標でない試薬の発光に対する感度を最小にしつつ、目標試薬の発光に対する感度を最大にするように設計された光学バンドパスフィルタによって達成される。本発明の好ましい実施形態においては、目標試薬の発光スペクトルの各々に対して一つの光学フィルタがある。
【００５９】
光学フィルタは干渉素子であるので、それらのバンドパス特性は、濾波される発光の入射角に依存して変化する。各ウエルの特定の配置と光学フィルタに対して特異であるので、入射角は、各ウエルに対して特異である。従って、全ての計算及び濾波率は、サンプルウエル毎に特異でなければならない。多要素の校正は以下のようにしてなされる。
【００６０】
実際の複合（たくさんの試薬）サンプルに先立って、各ウエル内の単一の試薬のみを含む標準規格品の撮像が行われ且つ分析される。これらの標準規格品は、各ウエルに対して、各光学フィルタのための多要素係数として集合的に使用される一組の係数を形成するであろう。所与の光学フィルタに対して、そのフィルタのための目標試薬は最も高い出力を生成するべきである。その他の試薬もまた、フィルタのバンドパス内のスペクトルを有しているかも知れず且つこれらの目標でない試薬のスペクトルのフィルタ信号への重なりの測定値であるより小さい出力を生成するであろう。例えば、目標試薬に対するフィルタの出力は８５０であり、その他の２つの試薬に対するフィルタの出力は各々１００と５０である。３つの試薬が単一のウエル内に一緒に加えられた場合には、全体の出力は１００であり、比率は、８５０：１００：５０であった。これらの係数は、各々のウエル位置及びフィルタに対して別個に測定されて、連立方程式のための係数の完備した組を付与する。これによって、一つのサンプルウエル内の試薬の濃度のあらゆる組み合わせの解決を可能にするであろう。更に、好ましい実施形態においては、これらの係数はまた、“全体の発光”内の全体の強度の読み取りによって正規化され、その結果、この計算は、単一の試薬のみが“全発光”フィルタによって測定された場合に装置が測定する強度と同じ強度をもたらすであろう。この計算は、青と緑の試薬（計算においてはＲとして省略されている）及び青と緑と全発光のフィルタ（計算においてはＦとして省略されている）の簡単な場合に対して以下のように示すことができる：
ＬｅｔＡ＝（青Ｒないし青Ｆに対する装置の出力）／（青Ｒないし全発光Ｆに対する装置の出力）
ＬｅｔＢ＝（緑Ｒないし青Ｆに対する装置の出力）／（緑Ｒないし全発光Ｆに対する装置の出力）
ＬｅｔＣ＝（青Ｒないし緑Ｆに対する装置の出力）／（青Ｒないし全発光Ｆに対する装置の出力）
ＬｅｔＤ＝（緑Ｒないし緑Ｆに対する装置の出力）／（緑Ｒないし全発光Ｆに対する装置の出力）。
【００６１】
これらの係数は、多色での試験を行う前に、各ウエルに対して測定される。そして、多試薬／多色に対しては、
（青Ｆの装置の出力）＝Ａ×（青Ｒの真の強度）＋Ｂ×（緑Ｒの強度）及び
（緑Ｆの装置の出力）＝Ｃ×（青Ｒの真の強度）＋Ｄ×（緑Ｒの強度）
これらの２つの連立方程式は、次いで、演算処理装置５０の制御下で、処理ソフトウエアによって青及び緑の試薬の真の強度に対して解かれる。
【００６２】
更に、ステップＧにおいて、各フィルタに対する装置のなま出力は、方程式を解く前に積分時間に対して正規化される。結果として得られた強度は、上記した基準を使用して、濃度として計算することができる。
【００６３】
最後に、ステップＨにおいて、分析されたデータは、再び演算処理装置５０によって制御されたユーザーが受け入れ可能な形態で表される。
本発明は、作動範囲及びＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）照度計の自由度を例示しているＨＴＳ形式で実施されたアッセイの例を参照することによって、更に理解することができる。
【００６４】
例
例１−精製されたｃＡＭＰの測定
ｃＡＭＰ標準規格品が逐次希釈され且つアルカリ性フォスファターゼ結合ｃＡＭＰ及び抗−ｃＡＭＰを備えた９６ウエルアッセイに添加した。これらのプレートを、ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）プロトコルによって処理し、ＣＳＰＤ／Ｓａｐｐｈｉｒｅ−II（登録商標）を添加して３０分経過した後に、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）上で１分間撮像した。精製されたｃＡＭＰの０．０６ｐＭの感知は、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）のワークステーション上でｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）によってなされる。結果を図８に示す。
【００６５】
例２−Ｃ２細胞を発現するアドレナリン作用性β２レセプタ内でのｃＡＭＰ誘導
Ｃ２細胞を発現するアドレナリンβ２レセプタを、９６−ウエルプレート（１０，０００細胞／ウエル）内にプレートし、イソプロテレノールによって１０分間刺激した。ｃＡＭＰ製品を、ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎアッセイを使用している細胞溶解液内で定量した。アッセイプレートをＣＳＰＤ／Ｓａｐｐｈｉｒｅ−II（登録商標）を添加して３０分経過した後に、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）上で１分間撮像した。刺激されたアドレナリンレセプタからのＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）上で、次第に増えるｃＡＭＰのレベルを検知した。結果を図９に示す。
【００６６】
例３−３８４−及び１，５３６−ウエル形式のＬｕｃ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）レポータ遺伝子アッセイ
ｐＣＲＥ−Ｌｕｃをトランスフェクトされた細胞を、９６−、３８４−及び１，５３６−ウエルプレート内に接種し、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）によって２０時間培養し、Ｌｕｃ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）システムによってアッセイした。ＰＣＲＥ−Ｌｕｃは、ｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）の制御による発光酵素レポーター遺伝子を含んでいる。フォルスコリンは、アデニレートシクラーゼの不可逆性の活性化による細胞内のｃＡＭＰ製品を含んでいる。全てのプレートの形式が、比較可能なフォルスコリン誘導ｃＡＭＰレベルを示している。結果を図１０に示す。
【００６７】
例４−ｐＣＲＥ−ＬｕｃでトランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞のフォルスコリン誘導
ｐＣＲＥ−Ｌｕｃでトランスフェクトされた細胞を９６−ウエルプレート内で接種した。４つのランダムなウエルを、１ｍＭのフォルスコリンによって１７時間誘導し、Ｌｕｃ−Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）システムによってアッセイした。結果を図１１に示す。
【００６８】
例５−ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼレポーター酵素のＤｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）の定量
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ及びｐβｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌによって一緒にトランスフェクトし且つ９６−ウエルマイクロプレート（２×１０４細胞／ウエル）内に接種した。細胞は、１７時間フォルスコリンによって培養した。細胞にＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ Ａを添加し且つ１０分間培養した。Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕａｌ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｂｕｆｆｅｒ Ｂを注入し且つルシフェラーゼで触媒作用を施した発光を迅速に測定した。３０分後に、ＡｃｃｅｌｅｒａｔｏｒIIを添加し、次いで、β−ガラクシトダーゼで触媒作用を施した発光を、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）ＨＴＳワークステーション上で定量した。定量結果を図１２に示す。
【００６９】
例６−ルシフェラーゼレポータの正規化した折り畳み誘導
ルシフェラーゼ活性化の折り畳み誘導（ｆｏｌｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を、β−ガラクトシダーゼ活性化に対する正規化に続いて計算した。Ｄｕａｌ−ｌｉｇｈｔ（登録商標）アッセイは、正規化のための制御レポータの使用を可能にし又は遺伝子発現によって特異性でない作用を監視することが可能になる。これを図１３に示す。
【００７０】
例７−アンタゴニスト活性化に対するＢＡＰＴＡ−ＡＭ作用
ＣＨＯ−Ａｅｑ−５ＨＴ２Ｂに、コエレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）ｈ＋／−０．５μＭ ＢＡＰＴＡ−ＡＭを４時間装荷した。アンタゴニスト メチセルギドを、３０分間、装荷された細胞に添加した。１μＭアゴニストａ−Ｍｅ−５ＨＴを注入し、発光された光を、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）システム上で２０秒間積分した。メチセルギド（０．６μＭ）に対してレポートされたＩＣ５０は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭの存在下で変化しない。得られたデータを図１４に示す。
【００７１】
例８−オレクシン２レセプタの刺激されたペプチド アゴニスト上でのＢＡＰＴＡ−ＡＭの作用
ＣＨＯ−Ａｅｑ−ＯＸ２−Ａ２細胞に、コエレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）ｈ＋／−０．６μＭ ＢＡＰＴＡ−ＡＭを４時間装荷した。ペプチド アンタゴニスト オレクシン Ｂをウエル内に注入し、発光された光を、ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）システム上で２０秒間積分した。ＮｏｒｔｈＳｔａｒ（登録商標）システム上でこのアッセイを使用したとき、オレキシンＢ（０．７５ｎＭ）に対してレポートされたＥＣ５０は、ＢＡＰＴＡ−ＡＭの存在下で変化しない。これは図１５に示す。
【００７２】
以上、本発明を特定の実施形態及び例を参考にして説明した。指示されていない場合でも、いかなる実施例又は例も限定することは意図していない。本発明の技術の経験なく及び請求の範囲内で、当業者は変形例を想到できるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の発光サンプルを分析するための照度計であって、
ＣＣＤ（電荷結合素子）と、
各々のウエルが前記複数の発光サンプルのうちの単一のサンプルを含むためのものである複数のウエルと、
前記発光サンプルを加熱するためのヒーターと、
前記複数のウエルの対応するウエルと整合された複数のグリッド開口を備えており、前記複数のウエルと前記ＣＣＤとの間に配置されており、前記ウエルからの平行な光線及びほぼ平行な光線のみが前記ＣＣＤによって撮像されるようにする、コリメータと、
該コリメータに隣接せしめられて配置されている視野レンズであって、前記コリメータが該視野レンズと前記複数のウエルとの間に配置されている、前記視野レンズと、を含む照度計。
【請求項２】
請求項１に記載の照度計であって、
前記複数の発光サンプルの各々が、生物発光物質又は化学発光物質のうちの一つである、照度計。
【請求項３】
請求項１に記載の照度計であって、
前記複数の発光サンプルの分析を制御するための中央演算処理ユニットを更に備えている、照度計。
【請求項４】
請求項１に記載の照度計であって、前記チャンバが温度制御されている、照度計。
【請求項５】
請求項１に記載の照度計であって、
前記視野レンズと前記ＣＣＤとの間に配置されたフィルタを更に備えている、照度計。
【請求項６】
請求項１に記載の照度計であって、
前記視野レンズ上の凝結を防止するための霜取り装置を更に備えている、照度計。
【請求項７】
照度計内の複数の発光サンプルを分析する方法であって、
前記複数の発光サンプルを、対応する複数のサンプルウエル内に配置するステップと、
ＣＣＤ（電荷結合素子）を準備するステップと、
発光サンプルを加熱する構造とされているヒーターを準備するステップと、
前記複数のサンプルウエルと前記ＣＣＤとの間に、対応する前記サンプルウエルに整合された複数のグリッド開口を備えているコリメータを位置決めするステップと、
前記コリメータのレンズに隣接させて第一のレンズを位置決めするステップと、
前記第一のレンズと前記ＣＣＤとの間に第二のレンズを位置決めするステップと、
前記ウエルからの平行な光線及びほぼ平行な光線のみが前記ＣＣＤによって撮像されるようにするステップと、を含む方法。
【請求項８】
請求項１１に記載の方法であって、
前記フレネル視野レンズと前記カメラレンズとの間にフィルタを配置するステップを更に含んでいる、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の照度計であって、前記コリメータが前記複数のウエル隣接して位置決めされている、照度計。
【請求項１０】
請求項１に記載の照度計であって、前記コリメータが、ほぼ平行な光線のみが前記ＣＣＤによって撮像されるようにする構造とされている、照度計。
【請求項１１】
請求項１に記載の照度計であって、前記視野レンズがフレネルレンズである、照度計。
【請求項１２】
請求項１に記載の照度計であって、前記視野レンズと前記ＣＣＤとの間に位置決めされているレンズを更に備えている、照度計。
【請求項１３】
請求項１に記載の照度計であって、
前記ＣＣＤからバックグラウンド画像を受け取り、前記ＣＣＤからサンプルウエルの実際の画像を受け取り、該実際の画像から前記バックグラウンド画像を差し引く、処理装置を更に備えている、照度計。
【請求項１４】
請求項７に記載の方法であって、
前記ＣＣＤによってバックグラウンド像を撮像するステップと、
前記ＣＣＤによってサンプルウエルの実際の像を撮像するステップと、
該実際の像から前記バックグラウンド像を差し引くステップと、を更に含んでいる方法。
【請求項１】
複数の発光サンプルを分析するための照度計であって、
ＣＣＤ（電荷結合素子）と、
各々のウエルが前記複数の発光サンプルのうちの単一のサンプルを含むためのものである複数のウエルと、
前記発光サンプルを加熱するためのヒーターと、
前記複数のウエルの対応するウエルと整合された複数のグリッド開口を備えており、前記複数のウエルと前記ＣＣＤとの間に配置されており、前記ウエルからの平行な光線及びほぼ平行な光線のみが前記ＣＣＤによって撮像されるようにする、コリメータと、
該コリメータに隣接せしめられて配置されている視野レンズであって、前記コリメータが該視野レンズと前記複数のウエルとの間に配置されている、前記視野レンズと、を含む照度計。
【請求項２】
請求項１に記載の照度計であって、
前記複数の発光サンプルの各々が、生物発光物質又は化学発光物質のうちの一つである、照度計。
【請求項３】
請求項１に記載の照度計であって、
前記複数の発光サンプルの分析を制御するための中央演算処理ユニットを更に備えている、照度計。
【請求項４】
請求項１に記載の照度計であって、前記チャンバが温度制御されている、照度計。
【請求項５】
請求項１に記載の照度計であって、
前記視野レンズと前記ＣＣＤとの間に配置されたフィルタを更に備えている、照度計。
【請求項６】
請求項１に記載の照度計であって、
前記視野レンズ上の凝結を防止するための霜取り装置を更に備えている、照度計。
【請求項７】
照度計内の複数の発光サンプルを分析する方法であって、
前記複数の発光サンプルを、対応する複数のサンプルウエル内に配置するステップと、
ＣＣＤ（電荷結合素子）を準備するステップと、
発光サンプルを加熱する構造とされているヒーターを準備するステップと、
前記複数のサンプルウエルと前記ＣＣＤとの間に、対応する前記サンプルウエルに整合された複数のグリッド開口を備えているコリメータを位置決めするステップと、
前記コリメータのレンズに隣接させて第一のレンズを位置決めするステップと、
前記第一のレンズと前記ＣＣＤとの間に第二のレンズを位置決めするステップと、
前記ウエルからの平行な光線及びほぼ平行な光線のみが前記ＣＣＤによって撮像されるようにするステップと、を含む方法。
【請求項８】
請求項１１に記載の方法であって、
前記フレネル視野レンズと前記カメラレンズとの間にフィルタを配置するステップを更に含んでいる、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の照度計であって、前記コリメータが前記複数のウエル隣接して位置決めされている、照度計。
【請求項１０】
請求項１に記載の照度計であって、前記コリメータが、ほぼ平行な光線のみが前記ＣＣＤによって撮像されるようにする構造とされている、照度計。
【請求項１１】
請求項１に記載の照度計であって、前記視野レンズがフレネルレンズである、照度計。
【請求項１２】
請求項１に記載の照度計であって、前記視野レンズと前記ＣＣＤとの間に位置決めされているレンズを更に備えている、照度計。
【請求項１３】
請求項１に記載の照度計であって、
前記ＣＣＤからバックグラウンド画像を受け取り、前記ＣＣＤからサンプルウエルの実際の画像を受け取り、該実際の画像から前記バックグラウンド画像を差し引く、処理装置を更に備えている、照度計。
【請求項１４】
請求項７に記載の方法であって、
前記ＣＣＤによってバックグラウンド像を撮像するステップと、
前記ＣＣＤによってサンプルウエルの実際の像を撮像するステップと、
該実際の像から前記バックグラウンド像を差し引くステップと、を更に含んでいる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図６Ａ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図６Ａ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１２−２３０１１０（Ｐ２０１２−２３０１１０Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１３７４７３（Ｐ２０１２−１３７４７３）
【出願日】平成２４年６月１９日（２０１２．６．１９）
【分割の表示】特願２００１−５１２２７６（Ｐ２００１−５１２２７６）の分割
【原出願日】平成１２年７月２１日（２０００．７．２１）
【出願人】（３１０００９７７５）アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１３７４７３（Ｐ２０１２−１３７４７３）
【出願日】平成２４年６月１９日（２０１２．６．１９）
【分割の表示】特願２００１−５１２２７６（Ｐ２００１−５１２２７６）の分割
【原出願日】平成１２年７月２１日（２０００．７．２１）
【出願人】（３１０００９７７５）アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー (19)
【Ｆターム（参考）】
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