発光測定装置
【課題】対物レンズで集光して光電子増倍管へ入射する光量を増やして検出感度の向上ができる発光測定装置を提供する。
【解決手段】生体サンプルを測定するために中央部に凹部又は凸部が形成された作用極を持つ生体物質測定チップを測定する発光測定装置において、前記凹部又は凸部の中心と光軸が一致するように配置したレンズユニットと、前記レンズユニットと前記作用極との間に配置された前記光軸が通過する孔と焦点とを有する反射鏡と、前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサと、を備えた発光測定装置。
【解決手段】生体サンプルを測定するために中央部に凹部又は凸部が形成された作用極を持つ生体物質測定チップを測定する発光測定装置において、前記凹部又は凸部の中心と光軸が一致するように配置したレンズユニットと、前記レンズユニットと前記作用極との間に配置された前記光軸が通過する孔と焦点とを有する反射鏡と、前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサと、を備えた発光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光標識剤の発光量を測定する発光測定装置に関する。より詳細には、発光測定装置の検出感度を向上する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の発光測定装置は、ＤＮＡやたんぱく質の量を発光標識剤の発光量により測定する。発光標識剤を標識したＤＮＡやたんぱく質を電極へ特異的に吸着させ、電極近傍にある発光標識剤を電気化学反応によって発光させる。この電気化学発光を光センサで受光し、光量を電気信号に変換して発光量データとして出力する。
【０００３】
図１６に従来の発光測定装置を示す。チップ基板２００に光学的に透明なカバー２０４によって蓋をし、サンプル液や試薬を流すための流路２０３を形成している。流路２０３のチップ基板表面には電気化学反応を行う２種類の電極、作用極２０１と対極２０２を形成している。たんぱく質をサンドイッチ法により抗原抗体反応させる場合は次のような手順で行う。作用極２０１には目的タンパク質に特異的に結合する一次抗体をあらかじめ固定しておく。
【０００４】
流路２０３にサンプル液を流すと、一次抗体と特異的なたんぱく質のみ作用極２０１上で結合する。次に、目的タンパク質に特異的に結合し、発光標識剤を標識した二次抗体を流路２０３に流すと、作用極２０１上に目的たんぱく質がある場合にのみ二次抗体が結合する。流路２０３中の不要な二次抗体を緩衝液で洗い流し、作用極２０１と対極２０２との間に電圧を印加すると、作用極２０１上に二次抗体が結合している場合には作用極２０１上で発光し、二次抗体が結合していない場合には発光しない。作用極２０１上の発光２０５を対物レンズ２０６と集光レンズ２０７によって光電子増倍管２０８の受光面２０９に導き、フォトンカウント方式によって発光量を測定する。この発光量を元に目的タンパク質の量や有無を判定する（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開平６−３４５４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記従来の構成では、生体物質検出チップ上の発光標識剤からの発光は放射状に照射されるので、対物レンズに入射する光はそのうちの一部のみで、それ以外の光は、利用される事なく捨てられている。そのため、対物レンズで集光して光電子増倍管へ入射する光量が少ないため、検出感度を向上することができないという課題を有していた。
【０００６】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、対物レンズで集光して光電子増倍管へ入射する光量を増やして検出感度の向上ができる発光測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記従来の課題を解決するために、本発明の発光測定装置は、生体サンプルを測定するために中央部に凹部又は凸部が形成された作用極を持つ生体物質測定チップを測定する発光測定装置において、前記凹部又は凸部の中心と光軸が一致するように配置したレンズユニットと、前記レンズユニットと前記作用極との間に配置された前記光軸が通過する孔と焦点とを有する反射鏡と、前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサとを備えることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の発光測定装置によれば、発光標識剤の発光のうち、従来は対物レンズに入射させることができなかった発光も入射させることができ、光電子増倍管へ入射させられる光量を増加させることができるので、高い検出感度を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明の発光測定装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１０】
（実施の形態１）
図１に、本発明の実施の形態１における発光測定装置の全体構成図を示す。図１において、生体物質検出チップ７の中央部には発光標識を標識した生体物質を滴下している。その生体物質検出チップ７を生体物質検出チップ固定台４１上へ固定し、生体物質検出チップ７の中央部からの発光を受光ユニット４０にて検出する。生体物質検出チップ７はチップ位置合わせ用突起４８で位置規制し、受光ユニット４０の光軸である受光ユニット光軸１５と生体物質検出チップ７の発光中心とが位置するように固定している。受光ユニット４０は対物レンズ１１と集光レンズ１２とからなるレンズユニットと、反射鏡２０と、受光センサとして光電子増倍管ユニット１３とで構成している。
【００１１】
受光ユニット４０では生体物質検出チップ７からの発光を反射鏡２０で反射するとともに対物レンズ１１と集光レンズ１２とで構成するレンズユニットで光電子増倍管ユニット１３の受光面１４へと集光する。受光ユニット光軸１５は、対物レンズ１１と集光レンズ１２とで構成するレンズユニットの光軸と同一とし生体物質検出チップ７に対して垂直にしている。反射鏡２０は受光ユニット光軸１５の周りに対称な球面ミラーであり、その中央部をくりぬいた形状である。くりぬいているのは、生体物質検出チップ７で発光した光線のうち対物レンズ１１へ入射する光線を遮らないようにするためである。
【００１２】
反射鏡２０の球面の中心は生体物質検出チップ７の発光の中心とほぼ一致させている。反射鏡２０をこのような形状と配置とすることで、対物レンズ１１へ直接入射しない光線を反射して生体物質検出チップ７へと戻すことができる。生体物質検出チップ７の中心には金属反射膜製の電極があり、反射鏡２０から戻ってきた光を反射する。金属反射膜製の電極は凹形状としているので、反射の方向は対物レンズ１１の方向となる。
【００１３】
このように受光ユニット４０と生体物質検出チップ７とを構成することで、生体物質検出チップ７の発光はレンズユニットへ入射すると共に、反射鏡２０で反射された光が生体物質検出チップ７上へと戻り、さらに生体物質検出チップ７で反射されてレンズユニットへ入射する。従って、レンズユニットへは、直接光と反射鏡２０での反射光とが合計されて入射するので検出光量が２倍になり、その結果、検出感度が２倍になる。このメカニズムの詳細は後述する。
【００１４】
生体物質検出チップ７で発光させるための電圧の印加は次のように行う。図示していないホストＰＣよりホストＰＣインターフェース４７を介してコントローラ４６へ電圧印加のプロファイルを設定する。この電圧印加プロファイルは、例えば、０ボルトよりスタートし、１秒後に１．３Ｖまで上昇し、その後２秒間だけ１．３Ｖを保持した後０ボルトになるというステップになる。電圧印加部４２でこの電圧印加プロファイルに基づいた電圧を生成し、生体物質検出チップ固定台４１に配置した電極を介して生体物質検出チップ７へと接続される。この接続方法はどのような方法でも構わないが、生体物質検出チップ７を脱着可能とするため、生体物質検出チップ７への電気的接続は、ばね電極で生体物質検出チップ７を押さえる構成とするのが良い。
【００１５】
受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理は次のように行う。光電子増倍管ユニット１３はフォトンカウント方式であり、受光した光量に応じてパルス信号を出力する。このパルス信号を一定時間単位でカウンタ４３にてカウントし、カウント値メモリ４４へと順次格納する。タイミング生成部４５で一定時間単位でのカウントとカウント値の格納を制御するためのタイミング信号を生成する。タイミング生成部４５のタイミング信号生成のスタート／ストップはコントローラ４６よりコントロールする。コントローラ４６はカウント値メモリ４４よりカウント値データをホストＰＣインターフェース４７を介して図示していないホストＰＣへ転送する。ここでは、一定時間単位を１０ｍｓとし、１０ｍｓ単位でカウントして１０ｍｓ間に発生したパルス数をカウント値データとした。光電子増倍管ユニット１３の出力パルスの最小の周期であるパルス幅分解能は７０ｎｓのものを用いており、このとき１０ｍｓ間の最大パルス数は１４２，８５７個のため、カウンタ４３には１８ビットのものを採用した。発光量の測定時間を３秒間としたのでカウント値メモリ４４のメモリの個数は３０１個としている。
【００１６】
発光量測定の動作は、生体物質検出チップ７への電圧印加と受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理とを同期して行う。まず、図示していないホストＰＣよりホストＰＣインターフェース４７を介してコントローラ４６へ測定スタートのコマンドを発行する。測定スタートのコマンドにより、コントローラ４６より電圧印加部４２へ電圧プロファイルを出力し、生体物質検出チップ７へ電圧プロファイルに基づいた電圧を印加する。同時にタイミング生成部４５をスタートさせ、受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理を開始する。所定の測定時間が経過すると、電圧印加部４２への電圧プロファイルが出力を停止して生体物質検出チップ７への電圧印加を停止する。同時にタイミング生成部４５をストップして検出光量の信号処理を停止する。その後、検出光量データとしてカウント値メモリ４４のカウント値データをホストＰＣインターフェース４７を介して図示していないホストＰＣへと転送して測定完了する。
【００１７】
図２に、本発明の実施の形態１における電圧印加部のブロック図を示す。電圧印加プロファイル記憶部３０よりＤ／Ａコンバータ３１へ電圧データを順次送って電圧印加プロファイルに基づいた電圧を発生する。オペアンプ３２により参照極接点３４の電圧がＤ／Ａコンバータ３１の出力電圧と等しくなるように対極接点３３に電圧を印加する。作用極接点３５はＧＮＤへ接地している。作用極接点３５は作用極へ、参照極接点３４は参照極へ、対極接点３３は対極へと接続している。先に述べた電圧印加プロファイルの１．３Ｖとは参照極に対する作用極の電位で定義される。ここでは、作用極はＧＮＤに接地され電位がゼロなので、参照極の電位が−１．３Ｖになるように対極の電位がマイナス方向で設定されることになる。つまり、Ｄ／Ａコンバータの出力電圧は電圧印加プロファイルと符号が逆であり、ここでは−１．３Ｖとなっている。
【００１８】
図３に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップを上面から見た図を示す。本実施例では、チップ基板４はガラス製で厚みは１ｍｍ、大きさは２０ｍｍ角とし、チップ基板４上には作用極１、対極２、参照極３の３つの電極を形成した。これら３つの電極は３電極法にて電気化学発光を行うための電極である。チップ基板４の中央部に発光標識の発光部位となる作用極１を円形に形成し、作用極１を囲むように対極２を配置し、作用極１と対極２との隙間に参照極３を配置している。本実施例では、作用極１の円形部の直径は３ｍｍ、対極２までの隙間は１ｍｍ、対極２の円形部の外周の直径は７ｍｍ、隙間にある参照極３の線幅は０．２ｍｍとした。３つの電極はチップ基板４の端に向けて伸ばしてあり、これは電圧印加部と接続するための接点部である。
【００１９】
作用極１、対極２及び参照極３には、発光標識の発光を反射する材料として、金をスパッタして形成した。先に述べた反射鏡からの光を受光ユニットへとチップ上で反射させるために、電極材料は反射率が高い必要がある。電極の材料としては、例えば、金、白金、パラジウム、ロジウムのような貴金属が挙げられる。発光標識の発光はあらゆる方向に放射されるが、電極の反射によってチップ下方への光が上方へ放射するようにでき、集光量を上げられるメリットもある。３つの電極が集まる中央部を囲むように液だめ用ゴム５を配置している。３つの電極のチップ基板４の端にある接点部が露出するように、液だめ用ゴム５の外形はチップ基板４よりも小さいほうが良い。本実施例では、液だめ用ゴム５の液滴部の直径は７．５ｍｍとした。
【００２０】
図４に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの図３中のＡ−Ａ’での断面図を示す。チップ基板４上の中央部に作用極１があり、作用極の中央部は凹の円錐形状となっている。円錐の頂点は、図３で示したチップ中央にある作用極１の円形部分の中心と一致している。チップ基板４の垂線に対する円錐の側面とのなす角、より正確には円錐の母線とのなす角を本実施例では６２．５度とした。従って、この円錐の頂角は１２５度となっている。この頂角の角度設定は先に述べた発光測定装置の反射鏡２０の反射光が対物レンズ１１へ入射するように光線追跡によって求めた。
【００２１】
作用極１の周りを取り囲むように対極２があり、その外側に液だめ用ゴム５を配置することで、電解液を液滴６のように全ての電極上に貯留することが出来る。液だめ用ゴム５は液滴６の液漏れを防ぐ必要があるため、チップ基板４への吸着性が高く、撥水性の高い素材としてシリコンゴムが良い。本実施例では、液滴６の電解液の液量は８０μｌとしたので、８０μｌの液滴が溢れないようにシリコンゴムの厚みは１ｍｍとした。
【００２２】
図５に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの発光を光電子増倍管へ集光する構成を示す。生体物質検出チップ７はチップ基板４上の中央部に作用極１があり、その周辺に対極２がある。さらに外側に液だめ用ゴム５を配置し、電解液を液滴６のように溜めている。作用極１上に発光標識を標識した生体物質を滴下しており、作用極１と対極間に電圧を印加すると発光標識が作用極１上で発光する。
【００２３】
生体物質検出チップ７からの発光を対物レンズ１１で集光し、さらに集光レンズ１２で光電子増倍管ユニット１３の受光面１４へと集光する。対物レンズ１１、集光レンズ１２、光電子増倍管ユニット１３の光軸である受光ユニット光軸１５は作用極１の中心にくるように配置する。本実施例では、対物レンズ１１の焦点距離は４０ｍｍ、有効径は３０ｍｍ、集散角Ｕは２２度とした。対物レンズ１１の集散角Ｕは発光中心より広がって対物レンズへ入射する光線のうち最も外側の光線と光軸とがなす角度のことである。
【００２４】
また本実施例では、集光レンズ１２には対物レンズ１１と同じものを用い、受光ユニット４０の全長を短くするため対物レンズ１１と集光レンズ１２との間隔は１ｍｍとした。対物レンズ１１の前側焦点位置が作用極１の中心となるように対物レンズ１１を配置し、集光レンズ１２の後側焦点位置が受光面１４となるように光電子増倍管ユニット１３を配置した。これにより、作用極１の像が受光面１４に結像するようにしている。
【００２５】
本実施例では、反射鏡２０は曲率半径４０ｍｍ、有効径は７９ｍｍ、中心のくりぬき穴径は４０ｍｍで、集散角Ｖが３０度〜８０度の光線を反射するようになっている。反射鏡２０の光軸は受光ユニット光軸１５に一致させて、くりぬき穴の中心に対物レンズ１１があり、それを取り囲むような配置としている。生体物質検出チップ７との位置関係は作用極１の中心に反射鏡２０の焦点位置が来るように反射鏡２０を配置する。この反射鏡２０はガラス製の凹面にアルミを蒸着した表面反射鏡とした。表面反射鏡ならば素材はガラスである必要はなく金属や樹脂でも構わないし、逆にガラス製の凸面にアルミを蒸着した反射鏡を電極から遠ざかる方向へ凸の向きに取り付けたのでも構わない。
【００２６】
対物レンズ１１の焦点距離や反射鏡２０の曲率半径は作用極１の半径に対して１０倍以上とするのが良い。この焦点距離や曲率半径が小さいと収差の影響が大きくなり、作用極１の外周寄りの発光成分が受光面１４へ到達しなくなるためである。大きくしすぎるのは光学的には問題ないが、装置サイズが大きくなる等、実用的ではない。
【００２７】
次に反射鏡２０で反射される光の光路について説明する。図５に示すように、作用極１の右側面から出て反射鏡２０へ向かう光線１６は、反射鏡２０の右側の面で反射されて光線１７となる。その後、作用極１の左側面で反射して光線１８となり対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する。反射鏡２０は受光ユニット光軸１５のまわりに対称に配置されているので、作用極の反対側の側面から出た光も対称的な光路をたどる。
【００２８】
作用極１の左側面から出て反射鏡２０の左側面へ向かった光は反射鏡２０で反射されて作用極１の右側面へと戻る。この戻ってきた光はちょうど対物レンズ１１の方向へ作用極で反射し、最終的に受光面１４へ到達する。反射鏡２０が３０度〜８０度の光線を反射するようにできているので、反射反射鏡２０へ向かう光束の中心が受光ユニット光軸１５とのなす角は５５度である。その光束が対物レンズ１１の中心に向かうように作用極１で反射すると最も効率良く反射光を導くことができる。そのためには、作用極の法線と受光ユニット光軸１５とのなす角を５５度の半分の２７．５度にするのが良い。従って、作用極１の円錐の頂角は１２５度としている。このようにして、作用極１上の発光は反射鏡２０で反射され作用極１でさらに反射されて対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する。
【００２９】
図６に、本発明の実施の形態１における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極の下側面から対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。
【００３０】
図７に、本発明の実施の形態１における反射鏡を経由する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極１の下側面から反射鏡２０へ向かい、反射鏡２０で反射されて作用極の上側面で再び反射、対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。このように、反射鏡２０がない図６の光線に加えて、図７に示すような反射鏡２０からの反射光を受光面１４に入射させることにより、検出光量を２倍に増加させることができる。
【００３１】
それでは、本発明の実施の形態１の発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例について説明する。まず、生化学的試料からＤＮＡサンプルを抽出する。痰、血液、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、その他ＤＮＡを有する生化学的試料から超音波、振とうなどの物理手段、ＤＮＡ抽出溶液を用いる化学的手段を用いて必要試料を抽出する。抽出された長鎖の２本鎖ＤＮＡは制限酵素、あるいは超音波などの物理的手段によって任意の長さに切断する。切断された２本鎖ＤＮＡは熱処理、あるいはアルカリ変性により１本鎖ＤＮＡに分離される。これらの工程によりＤＮＡサンプルを得る。
【００３２】
次に、検出すべきＤＮＡと特異的に結合可能な部位を持つＤＮＡプローブを磁性微粒子の表面に固定する。磁性微粒子は、電気絶縁材料であるポリスチレンやデキストランのようなポリマーに酸化鉄のような可磁化物質を分散させたものである。前記磁性微粒子の粒径は、１０ｎｍ〜１０μｍと幅広く選択可能であり、特に限定されるものではないが、溶液中での分散性および分離、回収性から、３００ｎｍ〜５μｍが好ましい。
【００３３】
さらに、標識剤を準備する。本発明で使用される標識剤は、検出すべきＤＮＡと特異的に結合可能な部位であるＤＮＡプローブと、発光標識に結合しているものである。ＤＮＡと特異的に結合可能な部位としては、前述の磁性微粒子に固定化したＤＮＡプローブと同様、検出すべきＤＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のＤＮＡである。
【００３４】
発光標識としては、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が挙げられる。そして特に、中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体などがある。
【００３５】
前述のようにして得られたＤＮＡサンプル、ＤＮＡプローブが固定された磁性微粒子および標識剤を、反応容器で混合し、ハイブリダイズさせる。ＤＮＡサンプル中に検出すべきＤＮＡ配列が存在していると、標識剤がＤＮＡサンプルを介して磁性微粒子に結合した複合体を形成する。
【００３６】
ハイブリダイズさせた後、結合しなかった非目的サンプルや未反応物質はＢ／Ｆ分離により除去する。Ｂ／Ｆ分離は、反応容器の一部に磁石を配置し、磁力により磁性微粒子を固定後、溶液を除去することで行う。このＢ／Ｆ分離によって、磁性微粒子に結合した検出すべきＤＮＡ配列および標識剤を選択的に得ることができる。
【００３７】
Ｂ／Ｆ分離後、複合体から発光標識を分離する。この発光標識の分離は、少なくとも電気化学発光物質を磁性微粒子から分離できればよく、ＤＮＡプローブは切断、分解された状態であってもよい。また、標識剤のＤＮＡプローブやＤＮＡサンプル、磁性微粒子に固定化されたＤＮＡプローブとともに磁性微粒子から分離されてもよい。このような発光標識を分離する方法としては、アルカリ変性、熱変性、物理破壊、酵素分解などが挙げられる。
【００３８】
このようにして発光標識の分離を行った後、複合体から分離した発光標識を含む溶液を、生体物質検出チップ７の作用極１に滴下した後、乾燥により作用極上に固定する。
【００３９】
次に、電解液を生体物質検出チップ７上に滴下する。ここで、電解液は、支持電解質および還元剤を含む溶液であり、公知のものが使用可能である。支持電解質としては、溶液にイオン導電性を与える物質、例えば、リン酸ナトリウムや塩化ナトリウムのような塩を挙げられる。また、還元剤としては、電気化学的に酸化した電気化学発光物質を還元し、励起状態にする物質、例えば、トリエチルアミンやトリプロピルアミン、シュウ酸などが挙げられる。
【００４０】
生体物質検出チップ７に対して電位を印加し、電気化学発光させる。そして、光電子増倍管１３により電位印加中の電気化学発光の発光量を検出し、測定値はコントローラ４６により図示しないホストＰＣへ転送する。
【００４１】
図８に本発明の実施の形態１における電圧波形と発光波形の具体的な一例を示す。上側のグラフは印加する電圧波形で横軸が時間、縦軸が電圧値である。下側のグラフは発光波形で、横軸が時間、縦軸が発光量を示す光電子増倍管の単位時間当たりのカウント値である。本実施の形態において印加電圧は、電圧波形１００に示すように、ｔ１を１秒とし、１秒で１．３Ｖまで掃印し、２秒間１．３Ｖを保持した。また、発光量の検出の単位時間は１０ｍｓとし、１０ｍｓ毎の光電子増倍管からのパルスをカウント値としてプロットした。発光波形１０１は従来技術による発光波形であり、発光波形１０２は本実施の形態による発光波形である。この従来技術による発光検出は、反射鏡を装備していない受光ユニットを用いた。図８において、本実施の形態による発光波形１０２の場合は、従来技術による発光波形１０１と比較し、約２倍高い値を得られている。この差は、図７で説明した反射鏡と作用極による反射による効果であり、本発明が高感度な検出に有効である結果を示すものである。
【００４２】
これまで、凹部の形状を円錐で説明したが、三角錐、四角錐、六角錐のように多角錐でも構わない。いずれの場合も頂角は１２５度とするのが良く、円錐の場合と同様にして対向する電極面で反射させて、検出光量を増加させることができる。
【００４３】
（実施の形態２）
実施の形態１では、作用極の凹部が一つのみの場合であったが、複数の凹部でも同様に実現可能である。また、凹部の形状は円錐でもかまわないし、多角錐でも構わない。実施の形態1の構成と異なるところは作用極の凹部が複数の凹部で構成されている点であり、その他の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の構成は実施の形態１と同じである。複数の凹部を持つ作用極の構成例を図９から図１２で説明する。それぞれの図において図の左半分は作用極１の正面図で、右半分はＡ−Ａ’での断面図である。図９に、作用極１が複数の円錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が円錐形状の凹部である。図１０に、作用極１が複数の三角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が三角錐形状の凹部である。
【００４４】
図１１に、作用極１が複数の四角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が四角錐形状の凹部である。図１２に、作用極１が複数の六角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が六角錐形状の凹部である。いずれの場合も対向する作用極で反射させて検出光量を増大させることができる。これら検出光量を増大させる仕組みは実施の形態１と同じである。また、本発明の実施の形態２の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例についても実施の形態１と同様に行うことができ、その効果も同様に図８に示すように発光波形は約２倍高い値を得られている。
【００４５】
（実施の形態３）
実施の形態１では、作用極は凹形状としたが、凸形状でも同様に実現可能である。実施の形態1の構成と異なるところは作用極の凹部が凸部で構成されている点であり、その他の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の構成は実施の形態１と同じである。対物レンズ１１の方へ突き出た円錐形状を持つ作用極の場合の構成例を図１３から図１５で説明する。
【００４６】
直接対物レンズ１１に向かう発光は実施の形態１と全く同じである。反射鏡２０で反射される光の光路は異なり、実施の形態１とは正反対の反射面を使う。図１３に示すように、作用極１の右側面から出て反射鏡２０へ向かう光線６６は、反射鏡２０の左側の面で反射されて光線６７となる。その後、作用極１の左側面で反射して光線６８となり対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する。受光ユニット光軸１５のまわりに対称なので、作用極の反対側の側面から出た光も対称的な光路をたどる。
【００４７】
作用極１の左側面から出て反射鏡２０の右側面へ向かった光は反射鏡２０で反射されて作用極１の右側面へと戻る。この戻ってきた光はちょうど対物レンズ１１の方向へ作用極で反射し、最終的に受光面１４へ到達する。反射鏡２０が３０度〜８０度の光線を反射するようにできているので、反射反射鏡２０へ向かう光束の中心が受光ユニット光軸１５とのなす角は５５度である。その光束が対物レンズ１１の中心に向かうように作用極１で反射すると最も効率良く反射光を導くことができる。そのためには、作用極の法線と受光ユニット光軸１５とのなす角を５５度の半分の２７．５度にするのが良い。従って、作用極１の円錐の頂角は１２５度としている。このようにして、作用極１上の発光は反射鏡２０で反射され作用極１でさらに反射されて対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する。
【００４８】
図１４に、本発明の実施の形態３における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極の下側面から対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。図１５に、本発明の実施の形態１における反射鏡を経由する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極１の下側面から反射鏡２０へ向かい、反射鏡２０で反射されて作用極の上側面で再び反射、対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。このように、反射鏡２０がない図１４の光線に加えて、図１５に示すような反射鏡２０からの反射光を受光面１４に入射させることにより、検出光量を２倍に増加させることができる。
【００４９】
また、本発明の実施の形態３の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例についても実施の形態１と同様に行うことができ、その効果も同様に図８に示すように発光波形は約２倍高い値を得られている。
【００５０】
ここでは、凸部の形状を円錐で説明したが、三角錐、四角錐、六角錐のように多角錐でも構わない。いずれの場合も頂角は１２５度とするのが良く、円錐の場合と同様にして反対側の電極面で反射させて、検出光量を増加させることができる。
【００５１】
（実施の形態４）
実施の形態３では、作用極の凸部が一つのみの場合であったが、複数の凸部でも同様に実現可能である。また、凸部の形状は円錐でもかまわないし、多角錐でも構わない。実施の形態1の構成と異なるところは作用極の凸部が複数の凸部で構成されている点であり、その他の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の構成は実施の形態１と同じである。複数の凸部を持つ作用極の構成例についても実施の形態２で示した図９から図１２の凹部が凸部へ変わるだけである。左半分の正面図の白抜きの１個１個が凸部であり、右半分のＡ−Ａ’断面図は凸と凹との関係が逆になる。いずれの場合も対向する作用極で反射させて検出光量を増大させることができる。これら検出光量を増大させる仕組みは実施の形態３と同じである。また、本発明の実施の形態４の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例についても実施の形態１と同様に行うことができ、その効果も同様に図８に示すように発光波形は約２倍高い値を得られている。
【００５２】
以上のように、本発明で示したように生体物質検出チップ７の作用極１に凹部もしくは凸部を設け、対物レンズ１１への光束を遮らないようにくりぬいた反射鏡２０をその球面中心が作用極の中心に略一致するように配置することにより、対物レンズ１１に直接入射しない発光成分を反射鏡２０で反射させ、さらに作用極１で再度反射させて対物レンズ１１に入射させ、検出感度を向上することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明にかかる発光測定装置は、発光標識剤の発光のうち、従来は対物レンズに入射させることができなかった発光も入射させることができ、光電子増倍管へ入射させられる光量を増加させることができるので、高い検出感度を実現することができる効果を有し、光を集光し、光量を増加させる用途として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の実施の形態１における発光測定装置の全体構成図
【図２】本発明の実施の形態１における電圧印加部のブロック図
【図３】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの上面図
【図４】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの断面図
【図５】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの発光を光電子増倍管へ集光する構成を示す図
【図６】本発明の実施の形態１における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図
【図７】本発明の実施の形態１における反射鏡を経由する光線の追跡図
【図８】本発明の実施の形態１における電圧波形と発光波形を示す図
【図９】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の円錐で構成した図
【図１０】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の三角錐で構成した図
【図１１】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の四角錐で構成した図
【図１２】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の六角錐で構成した図
【図１３】本発明の実施の形態３における生体物質検出チップの発光を光電子増倍管へ集光する構成を示す図
【図１４】本発明の実施の形態３における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図
【図１５】本発明の実施の形態３における反射鏡を経由する光線の追跡図
【図１６】従来の発光測定装置の集光の構成を示す図
【符号の説明】
【００５５】
１ 作用極
２ 対極
３ 参照極
４ チップ基板
５ 液だめ用ゴム
６ 液滴
７ 生体物質検出チップ
１１ 対物レンズ
１２ 集光レンズ
１３ 光電子増倍管ユニット
１４ 受光面
１５ 受光ユニット光軸
２０ 反射鏡
４０ 受光ユニット
４１ 生体物質検出チップ固定台
４２ 電圧印加部
４３ カウンタ
４４ カウント値メモリ
４５ タイミング生成部
４６ コントローラ
４８ チップ位置合わせ用突起
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光標識剤の発光量を測定する発光測定装置に関する。より詳細には、発光測定装置の検出感度を向上する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の発光測定装置は、ＤＮＡやたんぱく質の量を発光標識剤の発光量により測定する。発光標識剤を標識したＤＮＡやたんぱく質を電極へ特異的に吸着させ、電極近傍にある発光標識剤を電気化学反応によって発光させる。この電気化学発光を光センサで受光し、光量を電気信号に変換して発光量データとして出力する。
【０００３】
図１６に従来の発光測定装置を示す。チップ基板２００に光学的に透明なカバー２０４によって蓋をし、サンプル液や試薬を流すための流路２０３を形成している。流路２０３のチップ基板表面には電気化学反応を行う２種類の電極、作用極２０１と対極２０２を形成している。たんぱく質をサンドイッチ法により抗原抗体反応させる場合は次のような手順で行う。作用極２０１には目的タンパク質に特異的に結合する一次抗体をあらかじめ固定しておく。
【０００４】
流路２０３にサンプル液を流すと、一次抗体と特異的なたんぱく質のみ作用極２０１上で結合する。次に、目的タンパク質に特異的に結合し、発光標識剤を標識した二次抗体を流路２０３に流すと、作用極２０１上に目的たんぱく質がある場合にのみ二次抗体が結合する。流路２０３中の不要な二次抗体を緩衝液で洗い流し、作用極２０１と対極２０２との間に電圧を印加すると、作用極２０１上に二次抗体が結合している場合には作用極２０１上で発光し、二次抗体が結合していない場合には発光しない。作用極２０１上の発光２０５を対物レンズ２０６と集光レンズ２０７によって光電子増倍管２０８の受光面２０９に導き、フォトンカウント方式によって発光量を測定する。この発光量を元に目的タンパク質の量や有無を判定する（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開平６−３４５４８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、前記従来の構成では、生体物質検出チップ上の発光標識剤からの発光は放射状に照射されるので、対物レンズに入射する光はそのうちの一部のみで、それ以外の光は、利用される事なく捨てられている。そのため、対物レンズで集光して光電子増倍管へ入射する光量が少ないため、検出感度を向上することができないという課題を有していた。
【０００６】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、対物レンズで集光して光電子増倍管へ入射する光量を増やして検出感度の向上ができる発光測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記従来の課題を解決するために、本発明の発光測定装置は、生体サンプルを測定するために中央部に凹部又は凸部が形成された作用極を持つ生体物質測定チップを測定する発光測定装置において、前記凹部又は凸部の中心と光軸が一致するように配置したレンズユニットと、前記レンズユニットと前記作用極との間に配置された前記光軸が通過する孔と焦点とを有する反射鏡と、前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサとを備えることを特徴としたものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の発光測定装置によれば、発光標識剤の発光のうち、従来は対物レンズに入射させることができなかった発光も入射させることができ、光電子増倍管へ入射させられる光量を増加させることができるので、高い検出感度を実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、本発明の発光測定装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００１０】
（実施の形態１）
図１に、本発明の実施の形態１における発光測定装置の全体構成図を示す。図１において、生体物質検出チップ７の中央部には発光標識を標識した生体物質を滴下している。その生体物質検出チップ７を生体物質検出チップ固定台４１上へ固定し、生体物質検出チップ７の中央部からの発光を受光ユニット４０にて検出する。生体物質検出チップ７はチップ位置合わせ用突起４８で位置規制し、受光ユニット４０の光軸である受光ユニット光軸１５と生体物質検出チップ７の発光中心とが位置するように固定している。受光ユニット４０は対物レンズ１１と集光レンズ１２とからなるレンズユニットと、反射鏡２０と、受光センサとして光電子増倍管ユニット１３とで構成している。
【００１１】
受光ユニット４０では生体物質検出チップ７からの発光を反射鏡２０で反射するとともに対物レンズ１１と集光レンズ１２とで構成するレンズユニットで光電子増倍管ユニット１３の受光面１４へと集光する。受光ユニット光軸１５は、対物レンズ１１と集光レンズ１２とで構成するレンズユニットの光軸と同一とし生体物質検出チップ７に対して垂直にしている。反射鏡２０は受光ユニット光軸１５の周りに対称な球面ミラーであり、その中央部をくりぬいた形状である。くりぬいているのは、生体物質検出チップ７で発光した光線のうち対物レンズ１１へ入射する光線を遮らないようにするためである。
【００１２】
反射鏡２０の球面の中心は生体物質検出チップ７の発光の中心とほぼ一致させている。反射鏡２０をこのような形状と配置とすることで、対物レンズ１１へ直接入射しない光線を反射して生体物質検出チップ７へと戻すことができる。生体物質検出チップ７の中心には金属反射膜製の電極があり、反射鏡２０から戻ってきた光を反射する。金属反射膜製の電極は凹形状としているので、反射の方向は対物レンズ１１の方向となる。
【００１３】
このように受光ユニット４０と生体物質検出チップ７とを構成することで、生体物質検出チップ７の発光はレンズユニットへ入射すると共に、反射鏡２０で反射された光が生体物質検出チップ７上へと戻り、さらに生体物質検出チップ７で反射されてレンズユニットへ入射する。従って、レンズユニットへは、直接光と反射鏡２０での反射光とが合計されて入射するので検出光量が２倍になり、その結果、検出感度が２倍になる。このメカニズムの詳細は後述する。
【００１４】
生体物質検出チップ７で発光させるための電圧の印加は次のように行う。図示していないホストＰＣよりホストＰＣインターフェース４７を介してコントローラ４６へ電圧印加のプロファイルを設定する。この電圧印加プロファイルは、例えば、０ボルトよりスタートし、１秒後に１．３Ｖまで上昇し、その後２秒間だけ１．３Ｖを保持した後０ボルトになるというステップになる。電圧印加部４２でこの電圧印加プロファイルに基づいた電圧を生成し、生体物質検出チップ固定台４１に配置した電極を介して生体物質検出チップ７へと接続される。この接続方法はどのような方法でも構わないが、生体物質検出チップ７を脱着可能とするため、生体物質検出チップ７への電気的接続は、ばね電極で生体物質検出チップ７を押さえる構成とするのが良い。
【００１５】
受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理は次のように行う。光電子増倍管ユニット１３はフォトンカウント方式であり、受光した光量に応じてパルス信号を出力する。このパルス信号を一定時間単位でカウンタ４３にてカウントし、カウント値メモリ４４へと順次格納する。タイミング生成部４５で一定時間単位でのカウントとカウント値の格納を制御するためのタイミング信号を生成する。タイミング生成部４５のタイミング信号生成のスタート／ストップはコントローラ４６よりコントロールする。コントローラ４６はカウント値メモリ４４よりカウント値データをホストＰＣインターフェース４７を介して図示していないホストＰＣへ転送する。ここでは、一定時間単位を１０ｍｓとし、１０ｍｓ単位でカウントして１０ｍｓ間に発生したパルス数をカウント値データとした。光電子増倍管ユニット１３の出力パルスの最小の周期であるパルス幅分解能は７０ｎｓのものを用いており、このとき１０ｍｓ間の最大パルス数は１４２，８５７個のため、カウンタ４３には１８ビットのものを採用した。発光量の測定時間を３秒間としたのでカウント値メモリ４４のメモリの個数は３０１個としている。
【００１６】
発光量測定の動作は、生体物質検出チップ７への電圧印加と受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理とを同期して行う。まず、図示していないホストＰＣよりホストＰＣインターフェース４７を介してコントローラ４６へ測定スタートのコマンドを発行する。測定スタートのコマンドにより、コントローラ４６より電圧印加部４２へ電圧プロファイルを出力し、生体物質検出チップ７へ電圧プロファイルに基づいた電圧を印加する。同時にタイミング生成部４５をスタートさせ、受光ユニット４０で受光した検出光量の信号処理を開始する。所定の測定時間が経過すると、電圧印加部４２への電圧プロファイルが出力を停止して生体物質検出チップ７への電圧印加を停止する。同時にタイミング生成部４５をストップして検出光量の信号処理を停止する。その後、検出光量データとしてカウント値メモリ４４のカウント値データをホストＰＣインターフェース４７を介して図示していないホストＰＣへと転送して測定完了する。
【００１７】
図２に、本発明の実施の形態１における電圧印加部のブロック図を示す。電圧印加プロファイル記憶部３０よりＤ／Ａコンバータ３１へ電圧データを順次送って電圧印加プロファイルに基づいた電圧を発生する。オペアンプ３２により参照極接点３４の電圧がＤ／Ａコンバータ３１の出力電圧と等しくなるように対極接点３３に電圧を印加する。作用極接点３５はＧＮＤへ接地している。作用極接点３５は作用極へ、参照極接点３４は参照極へ、対極接点３３は対極へと接続している。先に述べた電圧印加プロファイルの１．３Ｖとは参照極に対する作用極の電位で定義される。ここでは、作用極はＧＮＤに接地され電位がゼロなので、参照極の電位が−１．３Ｖになるように対極の電位がマイナス方向で設定されることになる。つまり、Ｄ／Ａコンバータの出力電圧は電圧印加プロファイルと符号が逆であり、ここでは−１．３Ｖとなっている。
【００１８】
図３に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップを上面から見た図を示す。本実施例では、チップ基板４はガラス製で厚みは１ｍｍ、大きさは２０ｍｍ角とし、チップ基板４上には作用極１、対極２、参照極３の３つの電極を形成した。これら３つの電極は３電極法にて電気化学発光を行うための電極である。チップ基板４の中央部に発光標識の発光部位となる作用極１を円形に形成し、作用極１を囲むように対極２を配置し、作用極１と対極２との隙間に参照極３を配置している。本実施例では、作用極１の円形部の直径は３ｍｍ、対極２までの隙間は１ｍｍ、対極２の円形部の外周の直径は７ｍｍ、隙間にある参照極３の線幅は０．２ｍｍとした。３つの電極はチップ基板４の端に向けて伸ばしてあり、これは電圧印加部と接続するための接点部である。
【００１９】
作用極１、対極２及び参照極３には、発光標識の発光を反射する材料として、金をスパッタして形成した。先に述べた反射鏡からの光を受光ユニットへとチップ上で反射させるために、電極材料は反射率が高い必要がある。電極の材料としては、例えば、金、白金、パラジウム、ロジウムのような貴金属が挙げられる。発光標識の発光はあらゆる方向に放射されるが、電極の反射によってチップ下方への光が上方へ放射するようにでき、集光量を上げられるメリットもある。３つの電極が集まる中央部を囲むように液だめ用ゴム５を配置している。３つの電極のチップ基板４の端にある接点部が露出するように、液だめ用ゴム５の外形はチップ基板４よりも小さいほうが良い。本実施例では、液だめ用ゴム５の液滴部の直径は７．５ｍｍとした。
【００２０】
図４に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの図３中のＡ−Ａ’での断面図を示す。チップ基板４上の中央部に作用極１があり、作用極の中央部は凹の円錐形状となっている。円錐の頂点は、図３で示したチップ中央にある作用極１の円形部分の中心と一致している。チップ基板４の垂線に対する円錐の側面とのなす角、より正確には円錐の母線とのなす角を本実施例では６２．５度とした。従って、この円錐の頂角は１２５度となっている。この頂角の角度設定は先に述べた発光測定装置の反射鏡２０の反射光が対物レンズ１１へ入射するように光線追跡によって求めた。
【００２１】
作用極１の周りを取り囲むように対極２があり、その外側に液だめ用ゴム５を配置することで、電解液を液滴６のように全ての電極上に貯留することが出来る。液だめ用ゴム５は液滴６の液漏れを防ぐ必要があるため、チップ基板４への吸着性が高く、撥水性の高い素材としてシリコンゴムが良い。本実施例では、液滴６の電解液の液量は８０μｌとしたので、８０μｌの液滴が溢れないようにシリコンゴムの厚みは１ｍｍとした。
【００２２】
図５に、本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの発光を光電子増倍管へ集光する構成を示す。生体物質検出チップ７はチップ基板４上の中央部に作用極１があり、その周辺に対極２がある。さらに外側に液だめ用ゴム５を配置し、電解液を液滴６のように溜めている。作用極１上に発光標識を標識した生体物質を滴下しており、作用極１と対極間に電圧を印加すると発光標識が作用極１上で発光する。
【００２３】
生体物質検出チップ７からの発光を対物レンズ１１で集光し、さらに集光レンズ１２で光電子増倍管ユニット１３の受光面１４へと集光する。対物レンズ１１、集光レンズ１２、光電子増倍管ユニット１３の光軸である受光ユニット光軸１５は作用極１の中心にくるように配置する。本実施例では、対物レンズ１１の焦点距離は４０ｍｍ、有効径は３０ｍｍ、集散角Ｕは２２度とした。対物レンズ１１の集散角Ｕは発光中心より広がって対物レンズへ入射する光線のうち最も外側の光線と光軸とがなす角度のことである。
【００２４】
また本実施例では、集光レンズ１２には対物レンズ１１と同じものを用い、受光ユニット４０の全長を短くするため対物レンズ１１と集光レンズ１２との間隔は１ｍｍとした。対物レンズ１１の前側焦点位置が作用極１の中心となるように対物レンズ１１を配置し、集光レンズ１２の後側焦点位置が受光面１４となるように光電子増倍管ユニット１３を配置した。これにより、作用極１の像が受光面１４に結像するようにしている。
【００２５】
本実施例では、反射鏡２０は曲率半径４０ｍｍ、有効径は７９ｍｍ、中心のくりぬき穴径は４０ｍｍで、集散角Ｖが３０度〜８０度の光線を反射するようになっている。反射鏡２０の光軸は受光ユニット光軸１５に一致させて、くりぬき穴の中心に対物レンズ１１があり、それを取り囲むような配置としている。生体物質検出チップ７との位置関係は作用極１の中心に反射鏡２０の焦点位置が来るように反射鏡２０を配置する。この反射鏡２０はガラス製の凹面にアルミを蒸着した表面反射鏡とした。表面反射鏡ならば素材はガラスである必要はなく金属や樹脂でも構わないし、逆にガラス製の凸面にアルミを蒸着した反射鏡を電極から遠ざかる方向へ凸の向きに取り付けたのでも構わない。
【００２６】
対物レンズ１１の焦点距離や反射鏡２０の曲率半径は作用極１の半径に対して１０倍以上とするのが良い。この焦点距離や曲率半径が小さいと収差の影響が大きくなり、作用極１の外周寄りの発光成分が受光面１４へ到達しなくなるためである。大きくしすぎるのは光学的には問題ないが、装置サイズが大きくなる等、実用的ではない。
【００２７】
次に反射鏡２０で反射される光の光路について説明する。図５に示すように、作用極１の右側面から出て反射鏡２０へ向かう光線１６は、反射鏡２０の右側の面で反射されて光線１７となる。その後、作用極１の左側面で反射して光線１８となり対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する。反射鏡２０は受光ユニット光軸１５のまわりに対称に配置されているので、作用極の反対側の側面から出た光も対称的な光路をたどる。
【００２８】
作用極１の左側面から出て反射鏡２０の左側面へ向かった光は反射鏡２０で反射されて作用極１の右側面へと戻る。この戻ってきた光はちょうど対物レンズ１１の方向へ作用極で反射し、最終的に受光面１４へ到達する。反射鏡２０が３０度〜８０度の光線を反射するようにできているので、反射反射鏡２０へ向かう光束の中心が受光ユニット光軸１５とのなす角は５５度である。その光束が対物レンズ１１の中心に向かうように作用極１で反射すると最も効率良く反射光を導くことができる。そのためには、作用極の法線と受光ユニット光軸１５とのなす角を５５度の半分の２７．５度にするのが良い。従って、作用極１の円錐の頂角は１２５度としている。このようにして、作用極１上の発光は反射鏡２０で反射され作用極１でさらに反射されて対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する。
【００２９】
図６に、本発明の実施の形態１における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極の下側面から対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。
【００３０】
図７に、本発明の実施の形態１における反射鏡を経由する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極１の下側面から反射鏡２０へ向かい、反射鏡２０で反射されて作用極の上側面で再び反射、対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。このように、反射鏡２０がない図６の光線に加えて、図７に示すような反射鏡２０からの反射光を受光面１４に入射させることにより、検出光量を２倍に増加させることができる。
【００３１】
それでは、本発明の実施の形態１の発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例について説明する。まず、生化学的試料からＤＮＡサンプルを抽出する。痰、血液、糞便、精液、唾液、培養細胞、組織細胞、その他ＤＮＡを有する生化学的試料から超音波、振とうなどの物理手段、ＤＮＡ抽出溶液を用いる化学的手段を用いて必要試料を抽出する。抽出された長鎖の２本鎖ＤＮＡは制限酵素、あるいは超音波などの物理的手段によって任意の長さに切断する。切断された２本鎖ＤＮＡは熱処理、あるいはアルカリ変性により１本鎖ＤＮＡに分離される。これらの工程によりＤＮＡサンプルを得る。
【００３２】
次に、検出すべきＤＮＡと特異的に結合可能な部位を持つＤＮＡプローブを磁性微粒子の表面に固定する。磁性微粒子は、電気絶縁材料であるポリスチレンやデキストランのようなポリマーに酸化鉄のような可磁化物質を分散させたものである。前記磁性微粒子の粒径は、１０ｎｍ〜１０μｍと幅広く選択可能であり、特に限定されるものではないが、溶液中での分散性および分離、回収性から、３００ｎｍ〜５μｍが好ましい。
【００３３】
さらに、標識剤を準備する。本発明で使用される標識剤は、検出すべきＤＮＡと特異的に結合可能な部位であるＤＮＡプローブと、発光標識に結合しているものである。ＤＮＡと特異的に結合可能な部位としては、前述の磁性微粒子に固定化したＤＮＡプローブと同様、検出すべきＤＮＡ配列に対して相補的な塩基配列を有する１本鎖のＤＮＡである。
【００３４】
発光標識としては、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が挙げられる。そして特に、中心金属がルテニウム、オスニウムである錯体は良好な電気化学発光特性を有し、このような良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスニウムビピリジン錯体、オスニウムフェナントロリン錯体などがある。
【００３５】
前述のようにして得られたＤＮＡサンプル、ＤＮＡプローブが固定された磁性微粒子および標識剤を、反応容器で混合し、ハイブリダイズさせる。ＤＮＡサンプル中に検出すべきＤＮＡ配列が存在していると、標識剤がＤＮＡサンプルを介して磁性微粒子に結合した複合体を形成する。
【００３６】
ハイブリダイズさせた後、結合しなかった非目的サンプルや未反応物質はＢ／Ｆ分離により除去する。Ｂ／Ｆ分離は、反応容器の一部に磁石を配置し、磁力により磁性微粒子を固定後、溶液を除去することで行う。このＢ／Ｆ分離によって、磁性微粒子に結合した検出すべきＤＮＡ配列および標識剤を選択的に得ることができる。
【００３７】
Ｂ／Ｆ分離後、複合体から発光標識を分離する。この発光標識の分離は、少なくとも電気化学発光物質を磁性微粒子から分離できればよく、ＤＮＡプローブは切断、分解された状態であってもよい。また、標識剤のＤＮＡプローブやＤＮＡサンプル、磁性微粒子に固定化されたＤＮＡプローブとともに磁性微粒子から分離されてもよい。このような発光標識を分離する方法としては、アルカリ変性、熱変性、物理破壊、酵素分解などが挙げられる。
【００３８】
このようにして発光標識の分離を行った後、複合体から分離した発光標識を含む溶液を、生体物質検出チップ７の作用極１に滴下した後、乾燥により作用極上に固定する。
【００３９】
次に、電解液を生体物質検出チップ７上に滴下する。ここで、電解液は、支持電解質および還元剤を含む溶液であり、公知のものが使用可能である。支持電解質としては、溶液にイオン導電性を与える物質、例えば、リン酸ナトリウムや塩化ナトリウムのような塩を挙げられる。また、還元剤としては、電気化学的に酸化した電気化学発光物質を還元し、励起状態にする物質、例えば、トリエチルアミンやトリプロピルアミン、シュウ酸などが挙げられる。
【００４０】
生体物質検出チップ７に対して電位を印加し、電気化学発光させる。そして、光電子増倍管１３により電位印加中の電気化学発光の発光量を検出し、測定値はコントローラ４６により図示しないホストＰＣへ転送する。
【００４１】
図８に本発明の実施の形態１における電圧波形と発光波形の具体的な一例を示す。上側のグラフは印加する電圧波形で横軸が時間、縦軸が電圧値である。下側のグラフは発光波形で、横軸が時間、縦軸が発光量を示す光電子増倍管の単位時間当たりのカウント値である。本実施の形態において印加電圧は、電圧波形１００に示すように、ｔ１を１秒とし、１秒で１．３Ｖまで掃印し、２秒間１．３Ｖを保持した。また、発光量の検出の単位時間は１０ｍｓとし、１０ｍｓ毎の光電子増倍管からのパルスをカウント値としてプロットした。発光波形１０１は従来技術による発光波形であり、発光波形１０２は本実施の形態による発光波形である。この従来技術による発光検出は、反射鏡を装備していない受光ユニットを用いた。図８において、本実施の形態による発光波形１０２の場合は、従来技術による発光波形１０１と比較し、約２倍高い値を得られている。この差は、図７で説明した反射鏡と作用極による反射による効果であり、本発明が高感度な検出に有効である結果を示すものである。
【００４２】
これまで、凹部の形状を円錐で説明したが、三角錐、四角錐、六角錐のように多角錐でも構わない。いずれの場合も頂角は１２５度とするのが良く、円錐の場合と同様にして対向する電極面で反射させて、検出光量を増加させることができる。
【００４３】
（実施の形態２）
実施の形態１では、作用極の凹部が一つのみの場合であったが、複数の凹部でも同様に実現可能である。また、凹部の形状は円錐でもかまわないし、多角錐でも構わない。実施の形態1の構成と異なるところは作用極の凹部が複数の凹部で構成されている点であり、その他の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の構成は実施の形態１と同じである。複数の凹部を持つ作用極の構成例を図９から図１２で説明する。それぞれの図において図の左半分は作用極１の正面図で、右半分はＡ−Ａ’での断面図である。図９に、作用極１が複数の円錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が円錐形状の凹部である。図１０に、作用極１が複数の三角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が三角錐形状の凹部である。
【００４４】
図１１に、作用極１が複数の四角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が四角錐形状の凹部である。図１２に、作用極１が複数の六角錐で構成されている場合を示す。正面図の白抜きの１個１個が六角錐形状の凹部である。いずれの場合も対向する作用極で反射させて検出光量を増大させることができる。これら検出光量を増大させる仕組みは実施の形態１と同じである。また、本発明の実施の形態２の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例についても実施の形態１と同様に行うことができ、その効果も同様に図８に示すように発光波形は約２倍高い値を得られている。
【００４５】
（実施の形態３）
実施の形態１では、作用極は凹形状としたが、凸形状でも同様に実現可能である。実施の形態1の構成と異なるところは作用極の凹部が凸部で構成されている点であり、その他の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の構成は実施の形態１と同じである。対物レンズ１１の方へ突き出た円錐形状を持つ作用極の場合の構成例を図１３から図１５で説明する。
【００４６】
直接対物レンズ１１に向かう発光は実施の形態１と全く同じである。反射鏡２０で反射される光の光路は異なり、実施の形態１とは正反対の反射面を使う。図１３に示すように、作用極１の右側面から出て反射鏡２０へ向かう光線６６は、反射鏡２０の左側の面で反射されて光線６７となる。その後、作用極１の左側面で反射して光線６８となり対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する。受光ユニット光軸１５のまわりに対称なので、作用極の反対側の側面から出た光も対称的な光路をたどる。
【００４７】
作用極１の左側面から出て反射鏡２０の右側面へ向かった光は反射鏡２０で反射されて作用極１の右側面へと戻る。この戻ってきた光はちょうど対物レンズ１１の方向へ作用極で反射し、最終的に受光面１４へ到達する。反射鏡２０が３０度〜８０度の光線を反射するようにできているので、反射反射鏡２０へ向かう光束の中心が受光ユニット光軸１５とのなす角は５５度である。その光束が対物レンズ１１の中心に向かうように作用極１で反射すると最も効率良く反射光を導くことができる。そのためには、作用極の法線と受光ユニット光軸１５とのなす角を５５度の半分の２７．５度にするのが良い。従って、作用極１の円錐の頂角は１２５度としている。このようにして、作用極１上の発光は反射鏡２０で反射され作用極１でさらに反射されて対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する。
【００４８】
図１４に、本発明の実施の形態３における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極の下側面から対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。図１５に、本発明の実施の形態１における反射鏡を経由する光線の追跡図を示す。液滴６の中央部にある作用極１の下側面から反射鏡２０へ向かい、反射鏡２０で反射されて作用極の上側面で再び反射、対物レンズ１１、集光レンズ１２を通って受光面１４へ到達する光線を示している。このように、反射鏡２０がない図１４の光線に加えて、図１５に示すような反射鏡２０からの反射光を受光面１４に入射させることにより、検出光量を２倍に増加させることができる。
【００４９】
また、本発明の実施の形態３の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例についても実施の形態１と同様に行うことができ、その効果も同様に図８に示すように発光波形は約２倍高い値を得られている。
【００５０】
ここでは、凸部の形状を円錐で説明したが、三角錐、四角錐、六角錐のように多角錐でも構わない。いずれの場合も頂角は１２５度とするのが良く、円錐の場合と同様にして反対側の電極面で反射させて、検出光量を増加させることができる。
【００５１】
（実施の形態４）
実施の形態３では、作用極の凸部が一つのみの場合であったが、複数の凸部でも同様に実現可能である。また、凸部の形状は円錐でもかまわないし、多角錐でも構わない。実施の形態1の構成と異なるところは作用極の凸部が複数の凸部で構成されている点であり、その他の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置の構成は実施の形態１と同じである。複数の凸部を持つ作用極の構成例についても実施の形態２で示した図９から図１２の凹部が凸部へ変わるだけである。左半分の正面図の白抜きの１個１個が凸部であり、右半分のＡ−Ａ’断面図は凸と凹との関係が逆になる。いずれの場合も対向する作用極で反射させて検出光量を増大させることができる。これら検出光量を増大させる仕組みは実施の形態３と同じである。また、本発明の実施の形態４の生体物質測定チップ及びそれを用いた発光測定装置を用いたＤＮＡの検出例についても実施の形態１と同様に行うことができ、その効果も同様に図８に示すように発光波形は約２倍高い値を得られている。
【００５２】
以上のように、本発明で示したように生体物質検出チップ７の作用極１に凹部もしくは凸部を設け、対物レンズ１１への光束を遮らないようにくりぬいた反射鏡２０をその球面中心が作用極の中心に略一致するように配置することにより、対物レンズ１１に直接入射しない発光成分を反射鏡２０で反射させ、さらに作用極１で再度反射させて対物レンズ１１に入射させ、検出感度を向上することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明にかかる発光測定装置は、発光標識剤の発光のうち、従来は対物レンズに入射させることができなかった発光も入射させることができ、光電子増倍管へ入射させられる光量を増加させることができるので、高い検出感度を実現することができる効果を有し、光を集光し、光量を増加させる用途として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の実施の形態１における発光測定装置の全体構成図
【図２】本発明の実施の形態１における電圧印加部のブロック図
【図３】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの上面図
【図４】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの断面図
【図５】本発明の実施の形態１における生体物質検出チップの発光を光電子増倍管へ集光する構成を示す図
【図６】本発明の実施の形態１における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図
【図７】本発明の実施の形態１における反射鏡を経由する光線の追跡図
【図８】本発明の実施の形態１における電圧波形と発光波形を示す図
【図９】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の円錐で構成した図
【図１０】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の三角錐で構成した図
【図１１】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の四角錐で構成した図
【図１２】本発明の実施の形態２における作用極表面を多数の六角錐で構成した図
【図１３】本発明の実施の形態３における生体物質検出チップの発光を光電子増倍管へ集光する構成を示す図
【図１４】本発明の実施の形態３における光電子増倍管へ直接入射する光線の追跡図
【図１５】本発明の実施の形態３における反射鏡を経由する光線の追跡図
【図１６】従来の発光測定装置の集光の構成を示す図
【符号の説明】
【００５５】
１ 作用極
２ 対極
３ 参照極
４ チップ基板
５ 液だめ用ゴム
６ 液滴
７ 生体物質検出チップ
１１ 対物レンズ
１２ 集光レンズ
１３ 光電子増倍管ユニット
１４ 受光面
１５ 受光ユニット光軸
２０ 反射鏡
４０ 受光ユニット
４１ 生体物質検出チップ固定台
４２ 電圧印加部
４３ カウンタ
４４ カウント値メモリ
４５ タイミング生成部
４６ コントローラ
４８ チップ位置合わせ用突起
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルを測定するために中央部に凹部又は凸部が形成された作用極を持つ生体物質測定チップを測定する発光測定装置において、
前記凹部又は凸部の中心と光軸が一致するように配置したレンズユニットと、
前記レンズユニットと前記作用極との間に配置された前記光軸が通過する孔と焦点とを有する反射鏡と、
前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサと、
を備えた発光測定装置。
【請求項２】
前記反射鏡の焦点と前記作用極の凹部又は凸部の中心とが一致するように前記反射鏡を配置した請求項１に記載の発光測定装置。
【請求項３】
前記反射鏡の前記作用極側の面は金属反射膜が形成された凹面である請求項２に記載の発光測定装置。
【請求項４】
前記反射鏡は、光透過性部材で構成され前記作用極と反対の側の面は金属反射膜を形成した凸面である請求項２に記載の発光測定装置。
【請求項５】
前記作用極の凹部又は凸部を円錐形状とした請求項１に記載の発光測定装置。
【請求項６】
前記作用極の凹部又は凸部を多角錐形状とした請求項１に記載の発光測定装置。
【請求項７】
前記レンズユニットは、対物レンズと集光レンズとから成り、前記作用極の発光面と前記受光センサの受光面とが結像関係となるように前記対物レンズと前記集光レンズとを配置した請求項１に記載の発光測定装置。
【請求項８】
前記対物レンズの焦点距離と前記球面ミラーの曲率半径とを共に前記生体物質測定チップの作用極の中央部の最大幅に対して１０倍以上とした請求項７に記載の発光測定装置。
【請求項９】
前記作用極に複数の凹部もしくは凸部を有する請求項１から請求項８に記載の発光測定装置。
【請求項１０】
前記凹部もしくは前記凸部を全て同一の円錐形状とした請求項９に記載の発光測定装置。
【請求項１１】
前記凹部もしくは前記凸部を全て同一の多角錐形状とした請求項９に記載の発光測定装置。
【請求項１】
生体サンプルを測定するために中央部に凹部又は凸部が形成された作用極を持つ生体物質測定チップを測定する発光測定装置において、
前記凹部又は凸部の中心と光軸が一致するように配置したレンズユニットと、
前記レンズユニットと前記作用極との間に配置された前記光軸が通過する孔と焦点とを有する反射鏡と、
前記レンズユニットから出射された光を受光する位置に配置された受光センサと、
を備えた発光測定装置。
【請求項２】
前記反射鏡の焦点と前記作用極の凹部又は凸部の中心とが一致するように前記反射鏡を配置した請求項１に記載の発光測定装置。
【請求項３】
前記反射鏡の前記作用極側の面は金属反射膜が形成された凹面である請求項２に記載の発光測定装置。
【請求項４】
前記反射鏡は、光透過性部材で構成され前記作用極と反対の側の面は金属反射膜を形成した凸面である請求項２に記載の発光測定装置。
【請求項５】
前記作用極の凹部又は凸部を円錐形状とした請求項１に記載の発光測定装置。
【請求項６】
前記作用極の凹部又は凸部を多角錐形状とした請求項１に記載の発光測定装置。
【請求項７】
前記レンズユニットは、対物レンズと集光レンズとから成り、前記作用極の発光面と前記受光センサの受光面とが結像関係となるように前記対物レンズと前記集光レンズとを配置した請求項１に記載の発光測定装置。
【請求項８】
前記対物レンズの焦点距離と前記球面ミラーの曲率半径とを共に前記生体物質測定チップの作用極の中央部の最大幅に対して１０倍以上とした請求項７に記載の発光測定装置。
【請求項９】
前記作用極に複数の凹部もしくは凸部を有する請求項１から請求項８に記載の発光測定装置。
【請求項１０】
前記凹部もしくは前記凸部を全て同一の円錐形状とした請求項９に記載の発光測定装置。
【請求項１１】
前記凹部もしくは前記凸部を全て同一の多角錐形状とした請求項９に記載の発光測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２００９−２１０３１６（Ｐ２００９−２１０３１６Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１７９０（Ｐ２００８−５１７９０）
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３日（２００８．３．３）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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