発現微量タンパク質／ペプチドの検出・分離・同定法
本発明は、発現微量タンパク質／ペプチドの検出・分離・同定法及びそのシステムを提供するものであり、本発明は、微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法であって、蛍光試薬で標識した被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドの蛍光誘導体を、ＨＰＬＣに付し、その蛍光分画を捕集した後、酵素水解に付し、その蛍光標識フラグメント及び非蛍光標識フラグメントを質量分析して得られた各フラグメントのイオン分子量情報をタンパク質及び／又はペプチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析することを特徴とする上記タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法、及びその同定システム、に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法に関するものであり、更に詳しくは、生体において遺伝子の発現により産生される微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを簡便な方法で、高感度に検出し、同定することを可能とする新規な発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法、及びその同定システムに関するものである。
本発明は、ポストゲノム時代において重要な役割を果たすことが期待される、発現タンパク質及び／又はペプチドを網羅的に解析するプロテオーム技術における新しい検出・分離・同定手法を提供するものとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代において重要な課題は、遺伝子を介して発現する発現タンパク質／ペプチドの微量検出とその分離・同定である。従来、この課題達成のために、２次元電氣泳動後のペプチドフィンガープリント法が汎用されてきた（非特許文献１参照）。しかし、この方法は、煩雑な操作のために該方法の再現性に難点があった。この難点を克服する手法として、最近、多次元高速液体クロマトグラフィー（多次元ＨＰＬＣ）による分離・同定法、或いはＩＣＡＴによる手法が提案されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
これらのうち、タンパク質／ペプチドを、直接、多次元ＨＰＬＣで分離・同定する方法は、全てのタンパク質／ペプチドを同時に処理するために、多大な労力と時間を要するという欠点がある。また、ＩＣＡＴによる手法は、チオール含有タンパク質／ペプチドのチオール基をｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ （ＩＣＡＴ） ｒｅａｇｅｎｔで標識した後、それをビオチン結合カラムにて捕集し、これら全てを酵素水解し、得られたペプチドフラグメント混合物をＨＰＬＣで分離、質量分析計（ＭＳ）にて質量分析し、タンパク質／ペプチドを網羅的に解析しようとするものである。しかし、この方法は、チオール含有タンパク質／ペプチドの全てを酵素水解するため、大量に存在する目的以外のタンパク質／ペプチドのフラグメントが、目的とする微量タンパク質／ペプチドのフラグメントの検出及びその同定を妨害する、と言う欠点があり、当技術分野においては、更なる方法のブレークスルーが必要とされていた。
【０００４】
【非特許文献１】Ｄｕｎｎ ＭＪ．Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ １９８７；４１８：１４５−１８５
【非特許文献２】Ｇｙｇｉ Ｓ．Ｐ， Ｒｉｓｔ Ｂ， Ｇｅｒｂｅｒ Ｓ．Ａ， Ｔｕｒｅｃｅｋ Ｆ， Ｇｅｌｂ Ｍ．Ｈ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ、 Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙｔａｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９９；１７：９９４−９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、上記従来技術における諸問題を抜本的に解決することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、従来法と異なり、被験試料中の蛍光標識可能なタンパク質及び／又はペプチドのみを蛍光選択的に分離した後、これを酵素水解に付し、分画した蛍光画分を質量分析、データベース照合、構造解析に供することにより、従来法では検出不可能であった微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを高感度に検出し、同定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は、遺伝子を介して発現する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを、簡便な測定手法で、高感度に検出・分離・同定することを可能とする上記発現タンパク質及び／又はペプチドの微量検出・分離・同定方法を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、上記微量検出・分離・同定方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを、高感度で検出・分離・同定するための発現タンパク質及び／又はペプチド同定システムを提供することを目的とするものである。
更に、本発明は、従来法では検出することができなかった、遺伝子を介して発現する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを超高感度で検出・分離・同定することを可能とする新しい分析方法及び手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）被験試料中の発現微量タンパク質及び／又はペプチドを高感度に検出・分離・同定する方法であって、被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、これを蛍光検出により分離し、その蛍光画分を質量分析に付するか、又はその蛍光画分を酵素水解に付し、そのペプチド断片を分離し、その画分を質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供して発現タンパク質及び／又はペプチドの同定を行うことを特徴とする上記発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
（２）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、ＨＰＬＣに付し、その蛍光分画を捕集した後、酵素水解に付し、その蛍光標識フラグメント及び非蛍光標識フラグメントを質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析して得られた各フラグメントのイオン分子量情報をタンパク質及び／又はペプチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析する、前記（１）に記載の方法。
（３）（ａ）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識する、（ｂ）それを１次元又は２次元のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光分画を捕集する、（ｃ）上記蛍光分画を酵素水解に付する、（ｄ）それを第二段階のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光クロマトグラムを得ると共に、その全ピークを質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供する、前記（１）に記載の方法。
（４）タンパク質及び／又はペプチド試料の水溶液に、官能基特異的蛍光試薬を加え、場合により、界面活性剤及び／又はタンパク変性剤を加え、タンパク質及び／又はペプチドを蛍光標識する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）蛍光標識したタンパク質及び／又はペプチド試料を蛍光検出器付きイオン交換カラムＨＰＬＣ、逆相分配ＨＰＬＣ、ゲル濾過ＨＰＬＣ、又は電気泳動に代表される分離手段に付し、蛍光をモニターしながらそのピーク分画を捕集する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（６）蛍光分画を、各種ペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシンに代表されるタンパク質分解酵素を用いて酵素水解する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（７）酵素水解物を蛍光検出器付き逆相ＨＰＬＣに付し、蛍光ピークを検出すると共に、蛍光標識フラグメント及び蛍光非標識フラグメントの質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析を行う、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（８）質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析に付して得られた各フラグメントのイオン分子量情報を、コンピューターによるタンパク質及び／又はペブチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析して、酵素水解以前のタンパク質及び／又はペプチドの同定を行う、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
（９）被験試料が、生体試料から採取したタンパク質及び／又はペプチド試料である、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（１０）タンパク質及び／又はペプチドフラグメント情報、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを用いてデータベース照合する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記（１）から（１０）のいずれかに記載の方法に使用する発現微量タンパク質及び／又はペプチド検出・分離・同定システムであって、被験試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識するための第一反応器、蛍光試薬で標識した蛍光誘導体を蛍光分画するための１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、蛍光分画を酵素水解するための第二反応器、酵素水解物の蛍光標識フラグメントを蛍光検出するための第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを搭載した構造解析装置の１種又は２種以上を構成要素として含むことを特徴とする上記検出・分離・同定システム。
（１２）上記第一反応器、１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、第二反応器、第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣを直列に配置してなる、前記（１１）に記載のシステム。
（１３）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを、蛍光誘導体化試薬として、下記の化５の一般式（１）
【０００８】
【化５】
【０００９】
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、−ＮＨＲ′（但、Ｒ′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキル）、又は−ＮＲ′′Ｒ′′′（但し、Ｒ′′はアルキル、Ｒ′′′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキルを示す。〕で表わされる化合物、又はその同位体化合物又は下記の化２の一般式（２）
【００１０】
【化６】
【００１１】
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物又はその同位体化合物、を用いて、蛍誘導体とする、請求項１に記載の方法。
（１４）前記（１）に記載の方法でタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体化するために使用する蛍光誘導体化試薬であって、下記の化７の一般式（１）
【００１２】
【化７】
【００１３】
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、−ＮＨＲ′（但、Ｒ′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキル）、又は−ＮＲ′′Ｒ′′′（但し、Ｒ′′はアルキル、Ｒ′′′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキルを示す。〕で表わされる化合物、又はその同位体化合物又は下記の化２の一般式（２）
【００１４】
【化８】
【００１５】
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物又はその同位体化合物、を用いて、蛍誘導体とする、請求項１に記載の方法。
（１５）被検試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体化後、ＨＰＬＣで分離・検出し、分画後、酵素水解し、この水解物を直接質量分析で配列分析とタンパク質の同定を行なうことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
（１６）被検試料として、異なる試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドを、それぞれ蛍光波長の異なる少なくとも２つの蛍光誘導体化試薬でそれぞれ誘導体化後、蛍光検出器付きＨＰＬＣで分離・検出し、分画後、各蛍光ピークをそのまま又は合体して定量に供する、及び／又は各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物を定量に供する、又はこの水解物をＨＰＬＣ−質量分析に供し、同定を行なう、ことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
（１７）各蛍光ピークをそのまま又は合体してＨＰＬＣによる定量に供し、試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの各誘導体の比率を算出する前記（１６）に記載の方法。
（１８）水解物をＨＰＬＣによる定量に供し、試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの各誘導体の比率を算出する前記（１６）に記載の方法。
（１９）試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの第１の蛍光誘導体化試薬との反応物及び第２の蛍光誘導体化試薬との反応物を合体し、２つの励起・蛍光検出の可能なＨＰＬＣに供し、分画後、各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物をＨＰＬＣ−質量分析に供し、同定を行う前記（１６）に記載の方法。
（２０）試料Ａ、Ｂが、２種類の細胞又は組織又は体液試料である前記（１６）に記載の方法。
（２１）蛍光誘導体化試薬として、ＤＡＡＢＤ−Ｘ、ＤＡＡＳｅＢＤ−Ｘ、及びＤＡＡＴｈＢＤ−Ｘ（但し、ＸはCｌ又はＦ）のうちの励起・蛍光波長の異なる少なくとも２つの蛍光誘導体化試薬でタンパク質及び／又はペプチドを誘導体化する前記（１６）に記載の方法。
（２２）蛍光波長の異なる蛍光誘導体化試薬として、ＤＡＡＢＤ−Ｘ、ＤＡＡＳｅＢＤ−Ｘ、又はＤＡＡＴｈＢＤ−Ｘ（但し、ＸはCｌ又はＦ）と、それらの各同位体を組み合わせて使用する前記（２１）に記載の方法。
（２３）酵素水解した試料を直接質量分析に付しペプチドマップを得ると同時に、蛍光試薬の有する骨格並びに電荷を活用して、蛍光標識化ペプチド断片を質量分析測定部で抽出してシステイン含有ペプチド部分の構造を取得し、これらを基にタンパク質及び／又はペプチドの同定を行なう前記（１６）に記載の方法。
（２４）蛍光誘導体化試薬で誘導体化したタンパク質及び／又はペプチドを分解することなく分画することが可能な、少なくともミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、及びミクロ自動注入装置を具備したことを特徴とする自動分画装置。
（２５）少なくとも、ミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、酵素反応装置、及びミクロ自動注入装置を備え、任意に、質量分析（ＭＳ）システムを具備したことを特徴とする微量タンパク質の高性能・簡易定量・同定解析装置。
【００１６】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、上記従来法の難点を克服するためになされたものであり、１）微量の発現タンパク質／ペプチドを蛍光試薬で標識し、２）それをＨＰＬＣ／蛍光検出にて第一段の分離・蛍光検出を行い、３）その蛍光分画（コントロール試料と比べて、被験試料に特異的に増減する蛍光画分）のみを捕集後、酵素水解し、それを第二段のＨＰＬＣ／蛍光検出にて分離し、蛍光ピークの確認を行った後、ＨＰＬＣ／ＭＳに付し、蛍光標識タンパク質／ペプチドフラグメントの同定を行い、当該微量タンパク質／ペプチドの特定を行う方法に関するものである。尚、タンパク質／ペプチド試料が純度の高い場合には、第一段のＨＰＬＣ／蛍光検出による分離を省くことができる。本発明の方法は、従来法と異なり、蛍光標識可能なタンパク質／ペプチドのみを特異的に抽出し、検出・同定することができるという特徴を有し、微量の発現タンパク質／ペプチドを特定するために尤も相応しい方法である。
【００１７】
本発明では、被験試料として、生体から採取したあらゆる種類のタンパク質及び／又はペプチドを含む試料が対象とされる。本発明の方法では、被験試料中の微量の発現タンパク質／ペプチドを蛍光試薬で標識し、蛍光誘導体化するが、この場合、タンパク質／ペプチド水溶液に、官能基特異的蛍光試薬を加え、場合により、界面活性剤及び／又はタンパク変性剤を加え、発現タンパク質／ペプチドを定量的に誘導体化することが重要である。即ち、本発明では、タンパク質／ペプチド試料の水溶液に、界面活性剤と場合によっては還元剤を添加し、これに官能基特異的蛍光試薬を加え、必要により、加温することにより、タンパク質及び／又はペプチドを蛍光標識する。本発明では、上記界面活性剤として、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両イオン性界面活性剤が用いられる。また、本発明では、上記還元剤として、好適には、Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、ｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅが用いられるが、これらに制限されるものではなく、同効のものであれば同様に使用することができる。
【００１８】
本発明において、上記官能基特異的蛍光試薬として、（例えば、４−Ｆｌｕｏｒｏ−７−ｎｉｔｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＮＢＤ−Ｆ）、５−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ （ＤＮＳ−ＣＬ）、Ｏｒｔｈｏｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ（ＯＰＡ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ、９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ （ＦＭＯＣ）等のアミノ基特異的蛍光試薬、Ａｍｍｏｎｉｕｍ ７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢＤ−Ｆ）、４−（Ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＡＢＤ−Ｆ）、４−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＡｃＡＢＤ−Ｆ）、４−Ｆｌｕｏｒｏ−７−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＴｃＡｃＡＢＤ−Ｆ）、ｍｏｎｏｂｒｏｍｏｂｉｍａｎｅ等のチオール基特異的蛍光試薬、４−Ｎｉｔｒｏ−７−Ｎ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＮＢＤ−ＰＺ）、４−Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−Ｎ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＢＤ−ＰＺ）と縮合剤との組み合わせによるカルボキシル基特異的蛍光試薬、又は、４−（Ｎ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｙｌｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ−７−ｎｉｔｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＮＢＤ−ＣＯＣＬ）等の水酸基用蛍光試薬）が例示されるが、これらに制限されない。
【００１９】
本発明においては、必要により、加温する（例えば、３０−１００℃、望ましくは４０−７０℃で１０−３００分間、望ましくは６０−１８０分間）ことにより、タンパク質／ペプチドを蛍光標識する。その後、反応液のほぼ全量を蛍光検出器付きイオン交換カラムＨＰＬＣ、又は逆相分配ＨＰＬＣ、又はゲル濾過ＨＰＬＣに付し、蛍光をモニターしながらピーク分画を分取する。この場合、蛍光検出は、標識蛍光体の励起・蛍光波長に相当する波長に設定して行う。例えば、ＮＢＤ−Ｆ、又はＳＢＤ−Ｆで標識した場合には、励起波長４８０ｎｍ或いは３８０ｎｍ、励起波長５２０ｎｍ又は５０５ｎｍに設定する。イオン交換ＨＰＬＣの場合には、塩、例えば、食塩、硫酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、酢酸アンモニウムなど、望ましくは酢酸アンモニウムのような揮発性の塩を段階的に増量し、それぞれの画分を得る。この画分そのもの又はこの画分を濃縮・乾固した試料を、酵素水解に付す。酵素としては、各種ペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシンなど、適宜のタンパク質分解酵素が用いられる。この際、酵素カラムを接続してオンラインで酵素水解を行うこともできる。
【００２０】
この溶液の一部を蛍光検出器付き逆相分配ＨＰＬＣに付し、蛍光標識体の溶出位置を確認する。次いで、この逆相ＨＰＬＣカラムの出口を質量分析計（どの様な質量分析計でも対応可能であるが、望ましくはエレクトロスプレー型質量分析計を用いる）に接続し、酵素水解物の蛍光標識フラグメント及び蛍光非標識フラグメントの質量分析（蛍光標識フラグメントは一回の質量分析、蛍光非標識フラグメントは親イオンを更に質量分析する）又は質量分析／質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を行う。この際、蛍光検出器と質量分析計を直列に接続することも可能である。このようにして得られた各フラグメントのイオン分子量情報を、コンピューターに接続したタンパク質／ペプチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析することにより、酵素水解以前のタンパク質／ペプチドの同定を行う。この場合、本発明では、タンパク質及び／又はペプチドフラグメント情報、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを用いてデータベース照合を行う。
【００２１】
本発明では、発現タンパク質及び／又はペプチドを含む被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体化し、この蛍光誘導体をＨＰＬＣ／蛍光検出で分離し、蛍光ピークの強さを比較して標的発現タンパク質及び／又はペプチドの蛍光誘導体を分離し、得られた標的発現タンパク質及び／又はペプチドのピーク画分を酵素分解し、次いで、質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析、データベース照合、構造解析により、上記タンパク質及び／又はペプチドを同定する。タンパク質及び／又はペプチドのアミノ基、チオール基、水酸基及びカルボキシル基などの機能性部分を誘導化するための多くの蛍光試薬が存在するので、本発明では、その目的に応じて、適当な試薬を任意に選択して使用することができる。後記する実施例に示されるように、例えば、Ｃｙｓ−含有タンパク質を誘導化するためには、チオール基に特異的な試薬である、Ａｍｍｏｎｉｕｍ ７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢＤ−Ｆ）を使用することができる。図１に、本発明の方法のプロセスの一例を模式的に示す。後記する実施例に示されるように、実際、このようにして、ラットに１０ｍｇのデキサメタゾンを投与して２日後のランゲルハンス島におけるＰａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、プロインシュリン ２、７８ＫＤ Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、プロテイン結合フォスファチジルアミン及びチオレドキシンが強く誘導されたことが示された。
【００２２】
本発明の方法で重要な点は、各組織におけるタンパク質の量は、ＨＰＬＣ／蛍光検出で分離する前に、例えば、正常組織と非正常組織との組織間で定量、比較されるべきであることから、標的発現タンパク質を定量的に誘導体化することである。そのために、本発明では、適宜の界面活性剤が用いられるが、例えば、いくつかの界面活性剤についてＢＳＡにより検討したところ、ＣＨＡＰＳがｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅと比べて高い強度を示した（図２参照）。本発明では、ｐＨ、温度、反応時間及び誘導体化反応の添加剤等について、標的発現タンパク質及び／又はペプチドに応じて、最適条件を設定することで定量的な蛍光誘導体化が可能である。本発明では、これらの条件は、発現タンパク質／ペプチドの種類、分析目的等に応じて、適宜設定することができる。本発明の方法により、試験タンパク質／ペプチドのクロマトグラムは単一の蛍光ピークを示した（図３参照）。本発明の方法において、タンパク質及び／又はペプチドの検出限界は、０．２−６．０ｆｍｏｌであり、最適条件下での１０−１０００ｆｍｏｌの範囲で良好な直線（γ＞０．９９９４）の測定曲線が得られ（表１参照）、検出性能は、従来法に比べて、顕著であることが分かる。表１に、蛍光検出／ＨＰＬＣによる各種タンパク質及び／又はペプチドの検出限界を示した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
更に、本発明では、上記方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチド検出・分離・同定システムとして、被験試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識するための第一反応器、蛍光試薬で標識した蛍光誘導体を蛍光分画するための１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、蛍光分画を酵素水解するための第二反応器、酵素水解物の蛍光標識フラグメントを蛍光検出するための第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを搭載した構造解析装置の１種又は２種以上を構成要素として含む上記検出・分離・同定システムが用いられる。この場合、上記第一反応器、２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、第二反応器、第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣを直列に配置することができる。これらの装置は、その使用目的に応じて、適宜の容量、形態に任意に設計することができる。
【００２５】
本発明は、被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを、蛍光誘導体化試薬として、前記一般式（１）〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、又は−ＮＨＲ′（但し、Ｒ′はＮ置換アルキル）を示す。〕で表わされる化合物、又は前記一般式（２）（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物、を用いて、蛍光誘導体とすることができる。更に、本発明は、これらの化合物のいずれか１種を有効成分とする新規蛍光誘導体化試薬を提供することができる。
【００２６】
これらの化合物の具体例としては、好適には、例えば、以下の例があげられるが、これらに制限されるものではなく、これらと同等ないし類似の化合物であれば同様に使用することができる。本発明の化合物は、後記する実施例に具体的に記載した方法と同様にして容易に合成することができる。
（１）ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ］
（２）ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（３）ＤＡＡＢＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ］
（４）ＴＡＡＢＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（５）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｃｌ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ］
（６）ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（７）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ］
（８）ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（９）ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｃｌ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ］
（１０）ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（１１）ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ］
（１２）ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００２７】
本発明では、蛍光誘導体化試薬として、例えば、ＳＢＤ−Ｘ、ＳＢＳｅＤ−Ｘ、ＳＢＴｈＤ−Ｘ、ＤＡＡＢＤ−Ｘ、ＴＡＡＢＤ−Ｘ、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｘ、ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｘ、ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｘ、ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｘ（但し、ＸはＣｌ、又はＦ）、及びそれらの各同位体が提供される。これらの化合物は、いずれも、後記する実施例に示した化合物の場合と同様にして合成することができる。また、本発明では、前記一般式（１）で表わされる化合物の側鎖のアルキル基の鎖長を任意に変更することが可能である。本発明では、これらの化合物の、蛍光波長とＨＰＬＣ分離における保持時間の相違を利用して、これらの化合物を２つ以上組み合わせて使用することができる。ＨＰＬＣからの溶出は、例えば、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ＜ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ（側鎖のアルキル：プロピル）＜ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌの順に遅くなる。また、上記化合物の各同位体を使用することにより、更なる微量検出が可能となる。
【００２８】
本発明では、蛍光波長の異なる少なくとも２つの蛍光誘導体化試薬を利用することにより、例えば、同一起源の異なる歴史を有する二つのタンパク質試料の比較を簡便、かつ同時に行なうことができる。例えば、一方が病態患者試料で一方が健常者からの試料、あるいは一つの細胞又は組織試料で、一方がある薬剤で処理された試料で、他方が未処理の試料の比較を同一のクロマトグラムに基づいて同時に行なうこと、それにより、各蛍光誘導体化試薬で誘導体化されたタンパク質及び／又はペプチドの各誘導体を簡便、かつ正確に定量すること、が可能であり、２つの試料中のタンパク質及び／又はペプチドのプロファイルを同時的に測定し、比較することが実現できる。
【００２９】
本発明では、蛍光誘導体化試薬で誘導体化したタンパク質及び／又はペプチドを分解することなく分画することが可能な、少なくともミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、及びミクロ自動注入装置を具備した自動分画装置が提供される。また、本発明では、少なくとも、ミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、酵素反応装置、及びミクロ自動注入装置を備え、任意に、質量分析（ＭＳ）システムを具備した微量タンパク質及び／又はペプチドの高性能・簡易定量・同定装置が提供される。
【００３０】
本発明は、例えば、微量リン酸化タンパク質や糖タンパク質を蛍光誘導体化試薬で蛍光標識後、ミクロカラム−ＨＰＬＣ−蛍光検出器により修飾リン酸化部分並びに糖結合部分を保持したままのタンパク質として高性能分離・検出し、ミクロフラクションコレクターにて分取する。これに酵素を添加し、標識化タンパク質を酵素水解し、次いで、この水解試料を直接質量分析に付す。得られたペプチドマップと蛍光標識化ペプチドマップ情報を基に、データベース検索ソフトを利用して、例えば、翻訳後修飾微量タンパク質の修飾部分を含む同定を行なう。本発明の手法は、蛍光検出法とミクロＨＰＬＣとを組み合わせた方法であるため、例えば、超微量タンパク質を同定できること、翻訳後修飾タンパク質をそのまま分解することなく抽出して解析できること、そのため、リン酸化部位や糖結合部位の情報を確実に得られるばかりでなく、当該タンパク質を確実に同定できること、という従来の解析手法にはない利点を有している。本発明の解析手法は、生命科学、病態化学分野で広く使われることが期待され、疾患診断、治療、人類の健康維持へ貢献することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、１）遺伝子を介して発現する発現タンパク質及び／又はペプチドを簡便な方法及び手段で、高感度に検出・分離・同定することができる、２）本発明の方法により、従来法では検出できなかった微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを短時間で、感度良く検出・分離・同定することができる、３）また、上記検出・分離・同定方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの微量検出・分離・同定システムを提供することができる、４）本発明は、プロテオームのプラットフォーム技術を提供するものとして有用である、という効果が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
ラット膵ランゲルハンス島（ラ島）中チオール含有タンパク質／ペプチドの分離・同定（１）ラ島中チオール含有タンパク質／ペプチドの蛍光誘導体化
ラ島に０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した６Ｍ塩酸グアニジン溶液５０μｌを加えて可溶化した。これに６Ｍ塩酸グアニジン溶液に溶解した１７．５ｍＭＴＣＥＰ、１７．５ｍＭＳＢＤ−Ｆ、１０ｍＭＥＤＴＡ及び５０ｍＭＣＨＡＰＳをそれぞれ５０μｌずつ加え、混合した。この溶液を４０℃にて３時間反応させることにより蛍光誘導体化を行った。
（２）イオン交換ＨＰＬＣによる１次分離
上記の反応溶液をイオン交換カラムに付し、ＮａＣｌのグラジエント（０、０．０４、０．０８、０．１２及び０．３Ｍ）により蛍光タンパク質／ペプチドを溶出させ、５つのフラクションに分離した。なお、蛍光タンパク質／ペプチドの検出はＳＢＤ骨格の蛍光により行った。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
【００３４】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ ７．５×７５ｍｍ（東ソー（株））
ガードカラム：Ｃ８−３００−Ｓ ５４．０×１０ｍｍ（ＹＭＣ（株））
移動相：段階溶離〔０−５分：Ｃ１００％、５−１５分：Ａ１００％、１５−２５分：Ａ８７％Ｂ１３％、２５−３５分Ａ７３％Ｂ２７％、３５−４５分：Ａ６０％Ｂ４０％、４５−５５分：Ｂ１００％〕
Ａ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／アセトニトリル（５０：５０）
Ｂ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／アセトニトリル（５０：５０）
（０．３ＭＮａＣｌ含有）
Ｃ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
カラム温度：室温（約２５℃））
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：Ｅｘ３８０ｎｍ、Ｅｍ５０５ｎｍ
注入量：２００μｌ
【００３５】
（３）逆相ＨＰＬＣによる２次分離
上記の各画分を濃縮し、アセトニトリルを蒸発させた後、逆相カラムに付し、アセトニトリルの勾配溶離によりタンパク質／ペプチドをカラムから溶出させた。なお、タンパク質／ペプチドの検出はＳＢＤ骨格の蛍光によりモニターした。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
【００３６】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：カプセルパックＣ８ ＳＧ３００ ２．０×１００ｍｍ（（株）資生堂）
移動相：勾配溶離（０→６０分：Ｂ４０％→１００％）
Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸
Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル（４０：６０）
カラム温度：室温（約２５℃）
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：Ｅｘ３８０ｎｍ、Ｅｍ５０５ｎｍ
注入量：５０μｌ
【００３７】
（４）酵素処理
採取したＨＰＬＣの各ピーク画分をそれぞれのチューブに０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液５μｌを加えてトリフルオロ酢酸を中和後、濃縮してアセトニトリルを蒸発させた。残渣（約８０μｌ）に２０μｇ／ｍｌトリプシン（プロメガ）及び１０ｍＭ塩化カルシウムをそれぞれ１０μｌずつ添加した。これを３７℃で２時間インキュベートし、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用の試料とした。
【００３８】
（５）ＭＳ／ＭＳ測定によるタンパク質／ペプチドの同定
上記の試料を逆相カラムＨＰＬＣに付し、エレクトロスプレー法によるＭＳ／ＭＳ測定を行った。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。なお、タンパク質／ペプチドの同定はデータベースにＮＣＢＩ、サーチエンジンにＭＡＳＣＯＴを使用した。
【００３９】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ ＴＣ−Ｃ１８ ２．０ ×１００ｍｍ（Ｉｍｔａｃｔ（株））
移動相：勾配溶離（０→３０分：Ｂ２０％→１００％）
Ａ：０．１％ギ酸
Ｂ：０．１％ギ酸／アセトニトリル（５０：５０）
カラム温度：室温（約２５℃）
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
測定モード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：５００−３０００ｍ／ｚ
注入量：５０μｌ
【００４０】
上記の方法により、約１３０のタンパク質／ペプチドのピークが分離できた。
そのうち、約５０のタンパク質／ペプチドが同定できた（表２、図６参照）。
【００４１】
【表２】
【実施例２】
【００４２】
ＳＢＤ−Ｆで誘導体化したＢＳＡを、図１に示されるプロセスにより、トリプシンで酵素水解し、得られたペプチド混合物を逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）で分離し、蛍光検出器で検出した。次いで、各ペプチドをイオンスプレーイオントラップ質量分析計によるＭＳ／ＭＳ分析に供した。原理的には、トリプシン分解により、ＢＳＡは、４個のアミノ酸残基以上の２５のシステイン含有ペプチド及び３５のシステイン非含有ペプチドが生成されるが、本実施例では、２７以上の蛍光ペプチドが蛍光検出され、定量的に誘導体化が行われた（図４、Ａ）。
【００４３】
また、１１のシステイン含有ペプチド及び１７の非システイン含有ペプチドがマスクロマトグラフィーで検出された（図４、Ｂ）。 図５に、（Ｍ＋２Ｈ）２＋プレカーサー、ｍ／ｚ＝８７３．４（図４で矢印で示した）から得たＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
全てのペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルにより、確率的プロテイン同定法に基づくＭＡＳＣＯＴによるデータベース照合を行い、予測通り、完全にＢＳＡとしてタンパク質を同定した（スコア：３９）。
【実施例３】
【００４４】
デキサメタゾン（Ｄｅｘ）投与及び非投与のラット膵臓について試験した。
Ｄｅｘは、肝臓のグルコース産生の増加とインシュリン耐性の誘導により主なヒト糖尿病であるタイプ２の糖尿病を誘発する。実際に、Ｄｅｘ処理の２４時間後に、血中グルコースレベルは２０９．８ｍｇ／ｄＬに達し、処理前の値の１１８．３ｍｇ／ｄＬより著しく高い（ｐ＜０．０５）。本実施例では、２日間Ｄｅｘで処理又は未処理のラット膵臓からランゲルハンス島（６０島）を採取し、ＳＢＤ−Ｆで誘導体化した。本発明の方法を生物試料に適用するための重要な態様は、タンパク質混合物からＨＰＬＣで発現タンパク質を分離することである。本実施例では、蛍光タンパク質は、まず、ＳＢＤ−Ｆにより生成した多くのマイナス電荷と酸性アミノ酸部分に基づいてイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）で分離された。
【００４５】
ＩＥＣは、塩化ナトリウムの段階溶離（０、０．０４、０．０８、０．１２、及び０．３Ｍ ＮａＣｌ）により行い、蛍光タンパク質混合物を５つの画分として得た。次いで、各画分は、更に、それらの疎水性に基づいて、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）により分離された。この実験でのピークの容量（ｎ＝Ｌ／（４σ）、但し、Ｌは分析のトータル時間及び４σはピーク幅、としてのＨＰＬＣの性能の理論値）は、各ＲＰＬＣフラクションにつき４０と計算され、ＩＥＣ−ＲＰＬＣ法の５つのステップのピーク容量は、約２００であった。本実施例では、各ＲＰＬＣサイクルで約３−５０ピーク、合計で１２９ピークであった（図６）。
【００４６】
微量タンパク質を検出するために、ＩＥＣの段階溶離ステップを増やしてピーク容量を増加させた。未処理及びＤｅｘ処理ラットから得られたＲＰＬＣクロマトグラムの全ての蛍光ピークを比較した。その結果、５本の蛍光ピークが１．８以上増加し、３本の蛍光ピークがＤｅｘ処理で約１．５倍減少したことが見出された（表２）。表２に、Ｄｅｘ投与２日後の発現タンパク質の変化を示した。これらのタンパク質（即ち、標的発現タンパク質）は、広い小孔を有するＲＰＬＣ（３０ｎｍ小孔径）で分離され、トリプシンで分解し、各ペプチド混合物とした。各ペプチド混合物は、通常の小孔を有するＲＰＬＣ（１０ｎｍ小孔径）に供し、ＭＳ／ＭＳ分析した。データベース照合により、Ｄｅｘ処理後２日で増加したピークは、各々、膵臓ポリペプチド、プロインシュリン２、７８ＫＤグルコース−調節タンパク質、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質、及びチオレドキシンであり、減少したピークは、各々、プロテイン３１、ｄｎａｋ−タイプ分子シャペロンｈｓｐ７２−ｐｓｌ、及びインシュリンであった。
【実施例４】
【００４７】
本実施例では、以下の化９の（１）及び（２）の反応式により、新規蛍光誘導体化試薬の合成を行った。
【００４８】
【化９】
【００４９】
（１）ＤＡＡＢ−Ｃｌの合成
４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＤ−Ｃｌ）（１２６．５３ ｍｇ）をＣＨ３ＣＮに溶解し、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅを滴下し、ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅを加えた。室温で約１０分間攪拌後、反応液を減圧乾固した後、シリカゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙ ｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）（２０．２ｍｇ，８７．４％）を得た。
得られた化合物の確認データを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：７．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５），７．６５（１Ｈ，ｄ， Ｊ＝７．５），３．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７），２．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７）， ２．０２（６Ｈ，ｓ）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３０５（Ｍ＋Ｈ）＋
【００５０】
（２）ＴＡＡＢＤ−Ｃｌの合成
４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＤ−Ｃｌ）（１２６．５３ ｍｇ）をＣＨ３ＣＮに溶解し、Ｈ２Ｏに溶かしたａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅを滴下し、ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅを加えた。室温で約２０分間攪拌後、反応液を減圧乾固した後、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶かし、ＯＤＳカラムを用いて分取し、画分には、ＳＢＤ−Ｃｌ（化１０）が不純物として入っていたため、陰イオン交換カラムを用いて分取し、減圧乾固して、７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｅａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ）（１２７．２ｍｇ，５８．８ ％）を得た。
得られた化合物の確認データを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：８．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３），７．６９（１Ｈ，ｄ， Ｊ＝７．３），３．４６−３．４８（４Ｈ，ｍ），３．１２（９Ｈ，ｓ）。ＥＳＩ−ＭＳ ：ｍ／ｚ３１９（Ｍ）＋
【００５１】
【化１０】
【実施例５】
【００５２】
本実施例では、新規蛍光誘導体化試薬の反応性について検討した。
ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、ＴＡＡＢＤＤ−ＣｌのＳＢＤ−Ｆとの比較
１０μＭ還元型グルタチオン、システイン、ホモシステイン混合液１００μＬとＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＴＡＡＢＤ−Ｃｌ １００μＬを混合し、ｐＨ９、４０℃、１０〜１２０分間反応させた。尚、各試薬は５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１０Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ ９）に溶解した。０．１％ぎ酸で反応停止後、生成物をＨＰＬＣを用いて測定した。
【００５３】
図７に、蛍光誘導体化反応時間と蛍光強度との関係（左図：ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、右図：ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ）を示す。
ＳＢＤ−Ｆ（化１１）の場合、４０℃で誘導体化を行うと１２０分間の反応時間が必要であったが、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌは１０〜２０分、ＴＡＡＢＤ−Ｃｌは２０〜３０分で反応が終了することがわかった。
したがって、反応時間はＤＡＡＢＤ−Ｃｌの場合は２０分、ＴＡＡＢＤ−Ｃｌの場合は３０分が好適である。
【００５４】
【化１１】
【００５５】
（２）新規蛍光誘導体化試薬のＭＳでの感度
上記（１）で作成したサンプルをＬＣ−ＭＳにより検出し、蛍光誘導体化試薬でラベル化していないもの及びＳＢＤ−Ｆで誘導体化したものと、相対強度を比較した。
【００５６】
蛍光誘導体化試薬でラベル化していないｃｙｓｔｅｉｎｅ、ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＧＳＨの高さをそれぞれ１としたときの相対強度は表３の通りであった。これより、ＤＡＡＢＤ−ＣｌがＭＳでの感度が最も高いことがわかった。また、移動相が酸性であるので、ＤＡＡＢＤ化誘導体はプラスに荷電され水溶性であると考えられる。
【００５７】
【表３】
【実施例６】
【００５８】
（１）ＴＡＡＢＤ−Ｃｌのペプチドへの応用
１０μＭの以下に示した４種類のペプチド標品、１７．５ｍＭ ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＣＨＡＰＳ（界面活性剤）、２．５ｍＭ ＴＣＥＰ（還元剤）それぞれ５０μＬを混合し、ｐＨ９．０、４０℃で、３０，６０，９０，１２０分間反応させた。尚、各試薬は６．０Ｍ 塩酸グアニジン（タンパク変性剤）を含む０．１０ Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。生成したＴＡＡＢＤ化ペプチドをＨＰＬＣを用いて測定した。
１． ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ
２． ｏｘｙｔｏｃｉｎ
３． ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ
４． ａｍｙｌｉｎ（ｒａｔ）
図８に ＴＡＡＢＤ−Ｃｌとの反応時間と蛍光強度との関係を示す。
図８より、反応時間が６０分までは生成量が増加した。反応停止後は氷冷下で保存し、−２０℃にて保存すると、４８時間はほとんど分解しなかった。
【００５９】
（２）ＤＡＡＢＤ化ペプチド・タンパクの検出限界
表４に示した１０種類のペプチド・タンパク質標品１０μＭ混合液、２．５ｍＭ ＴＣＥＰ、１７．５ｍＭ ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＣＨＡＰＳそれぞれ５０μＬを混合し、ｐＨ９．０、４０℃で、３０分間反応させた。尚、各試薬は６．０ Ｍ 塩酸グアニジンを含む０．１０Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。生成したＤＡＡＢＤ化ペプチド・タンパク質はＨＰＬＣを用いて測定し、蛍光検出の検出限界をＳＢＤ−Ｆと比較した。
【００６０】
【表４】
【００６１】
（３）ＤＡＡＢＤ化ペプチド・タンパク質の同定
上記（２）で誘導体化した物質のうち、ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ、ｏｘｙｔｏｃｉｎ、ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ、ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、ａｍｙｌｉｎはＬＣ−ＭＳにより同定できた。それらの分子量を以下に示す。
ｍ／ｚ ５４１．８（Ｍ＋３Ｈ）３＋［ＤＡＡＢＤ−ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ］
５１６．０（Ｍ＋３Ｈ）３＋［ＤＡＡＢＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎ］
７２６．６（Ｍ＋３Ｈ）３＋［ＤＡＡＢＤ−ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ］
９８９．９（Ｍ＋４Ｈ）４＋［ＤＡＡＢＤ−ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ］
８９２．８（Ｍ＋５Ｈ）５＋［ＤＡＡＢＤ−ａｍｙｌｉｎ］
【００６２】
これら全ての分子量は、それぞれのペプチドの２つのシステイン残基にＤＡＡＢＤが付加したとしたときの分子量であり、多価イオンピークの検出結果よりＤＡＡＢＤ−Ｃｌによる誘導体化において、これらのペプチドのシステイン残基間のＳ−Ｓ結合が還元され、二つのチオール基両方に試薬が反応したことがわかった。
また、タンパク質の場合は酵素によってペプチドに分解する必要があるため、酵素トリプシンで消化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出及びＭＡＳＣＯＴによるデータベース検索を行って同定を試みた結果、システインを含まないペプチドのアミノ酸配列も併せて決定し、タンパク質を同定することができた。
【実施例７】
【００６３】
（ＳＢＳｅＤ−Ｆの合成）
２−ｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｎｉｌｉｄｅを硝酸で処理して、１−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−２−ｎｉｔｒｏ−６−ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅとし、これを脱アセチル化して、２−ｆｌｕｏｒｏ−６−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｌｉｎｅとし、次いで、パラジウム担持炭素触媒を用いて水素化して、３−ｆｌｕｏｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅを得た。
Ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｄｉｏｘｉｄｅエタノール加熱溶液を、３−ｆｌｕｏｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（６０ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）のエタノール加熱溶液に加え、混合物を３０分加熱した。これを、シリカゲルカラムによるクロマトグラフィーに供し、溶離液のジクロロメタンで溶出し、４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅを白色粉末（８８ｍｇ）として得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
ｍｐ．１２９℃、ＮＭＲ（ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）：δＨ７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２）、７．４１（１Ｈ，ｍ）、７．０６（１Ｈ，ｍ）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２０２．８［（Ｍ＋Ｈ）］。
【００６４】
このようにして得た４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅをｆｕｍｉｎｇ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ（６０％）に溶かし、１３０℃で３時間還流した。この溶液を冷却し、冷水（３０ｍｌ）に注ぎ、２８％ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅで中和した。この中性溶液にエタノール１００ｍｌを加え、濾過物を減圧乾固させた。残渣を水（１．０ｍｌ）に溶解し、更に、以下のＨＰＬＣで精製した。即ち、残渣の１００μｌをＨＰＬＣ分離に供した。ＨＰＬＣカラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ、１５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．、東ソー、溶離液：蒸留水、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２８０ｎｍ。ＳＢＳｅＤ−Ｆに相当するフラクションを集め、減圧して白色粉末（５０ｍｇ）を得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
ｍ．Ｐ．＞３００℃、ＮＭＲ（ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）：δＨ７．９７（１Ｈ，ｄ ｄ，Ｊ＝７．６，Ｊ＝５．４）、７．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．６，Ｊ＝１０．１）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２８０．８［（Ｍ−Ｈ）］。
【実施例８】
【００６５】
（ＳＢＴｈＤ−Ｆの合成）
Ｎ−ｔｈｉｏｎｙｌａｎｉｌｉｎｅ（０．４９ｇ，３．５ｍｍｏｌ）を３−ｆｌｕｏｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（２００ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）トルエン（２ｍｌ）溶液に加えた。反応混合物を１００−１２０℃で４時間加熱し、溶媒を濾別した後、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を１０％ＨＣｌ溶液及び水で各々洗浄した。有機相を乾燥し、減圧乾固させた。これをシリカゲルによるクロマトグラフィーに供し、溶離液のクロロホルムで溶出し、４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅを淡黄色油として得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
ＮＭＲ（ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）：δＨ７．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９）、７．５０（１Ｈ，ｍ）、７．２０（１Ｈ，ｍ）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ１５４．９［（Ｍ＋Ｈ）］。
【００６６】
このようにして得た４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ（３０ｍｌ）をｆｕｍｉｎｇ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ（６０％）に溶かし、１３０℃で３時間還流した。次いで、この溶液を冷却し、ゆっくり冷水（３０ｍｌ）に注ぎ、２８％ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅで中和した。中性溶液にエタノール１００ｍｌを加え、得られた濾過物を減圧乾固した。残渣を水（１．０ｍｌ）に溶かし、更に、以下の条件でＨＰＬＣで精製した。ＳＢＴｈＤ−Ｆに相当するフラクションを集め、減圧し、白色粉末（２５ｍｇ）を得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
ｄｅｃｏｍｐ．２６５℃、ＮＭＲ（ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）：δＨ８．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．９，Ｊ＝４．９）、７．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．９，Ｊ＝９．８）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２３２．８［（Ｍ−Ｈ）］。
上記方法により合成したＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆを下記の化１２に示す。
【００６７】
【化１２】
【実施例９】
【００６８】
（１）システイン誘導体の蛍光スペクトル
１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）による上記ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＳＢＴｈＤ−Ｆ又はＳＢＤ−Ｆの各蛍光試薬溶液（４ｍＭ）の５００μｌ部分を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）によるシステイン（０．４ｍＭ）溶液の同量と混合した。この混合物を６０℃で８時間放置した。反応の後、反応混合物をＨＰＬＣ分離し、各システイン誘導体に相当するフラクションを集め、それらの蛍光スペクトルを測定した。
【００６９】
ＳＢＳｅＤ−ＦとＳＢＴｈＤ−Ｆのシステインに対する反応性
４ｍＭの各試薬、ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＳＢＴｈＤ−Ｆ又はＳＢＤ−Ｆ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０又はｐＨ１０）の５００μｌ部分を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０又はｐＨ１０）によるシステイン溶液（０．４ｍＭ）の同量と混合した。反応混合物をＨＰＬＣ分離し、６０℃での反応をモニターした。
【００７０】
（２）結果
ＳＢＤ−Ｆのような水溶性試薬は、そのｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ残渣により水溶体中での誘導体の可溶性を増加させ、結果として、誘導体の吸収又は沈殿が減少する。したがって、インシュリンのような比較的疎水性ペプチドのＳＢＤ−Ｆによる誘導体は、逆相カラムで溶出され、高感度に検出されたが、本実施例では、更に、ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ又はｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ骨格をもつ蛍光試薬としてＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆを合成し、それらのシステインに対する反応性及びその誘導体の蛍光特性を調べた。
【００７１】
最大励起（λｅｘ）及び発光波長（λｅｘ）、及び誘導体の保持時間を表５に示す。各システイン誘導体の質量数（［Ｍ＋Ｈ］）は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（ｍ／ｚ３８１．９）、ＳＢＴｈＤ−Ｆ（ｍ／ｚ３３４．０）及びＳＢＤ−Ｆ（ｍ／ｚ３１８．０）について、理論値（各々３８２．０、３３４．０及び３１８．０）と一致した。誘導体の最大励起波長は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（３４０ｎｍ）及びＳＢＴｈＤ−Ｆ（３１５ｎｍ）はＳＢＤ−Ｆ（３６５ｎｍ）より短く、誘導体の最大発光波長は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（５４２ｎｍ）は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（５１７ｎｍ）及びＳＢＤ−Ｆ（５１４ｎｍ）よりも長かった。ＳＢＳｅＤ−Ｆ自体は蛍光が少ないが、ＳＢＴｈＤ−Ｆは多少の蛍光を与えた（λｅｘ；３５０ｎｍ，λｅｍ：４２４ｎｍ）。ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＳＢＴｈＤ−Ｆ及びＳＢＤ−Ｆのシステイン誘導体の逆相カラム（Ｃ１８）に対するｐＨ２．０の移動相による保持時間（ｔＲ）は、各々４．５、５．３及び４．８分であった。これから、ＳＢＳｅＤ−Ｆは、これらの中で最も高い親水性の蛍光試薬であった。
【００７２】
ＳＢＤ−Ｆの場合、至適反応条件は６０℃でｐＨ９．５で１時間であるが、ＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆの反応性は、ＳＢＤ−Ｆと比べて低く、蛍光強度は８−２４時間で徐々に増加し（図９、１０）、２４時間後でも、反応は最大に達しなかった（図９）。ｐＨ１０．０及び６０℃では、ＳＢＳｅＤ−Ｆ又はＳＢＴｈＤ−Ｆとシステインの量的反応時間は、８時間以上であり、ＳＢＤ−Ｆでは、１時間以内で完全に反応した（図１０）。
このように、水溶性の蛍光試薬ＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆは、ＳＢＤ−Ｆと比べて蛍光特性及び疎水性の点で異なっており、プロテオーム解析のための新規蛍光誘導体化試薬として有用である。
【実施例１０】
【００７３】
ＤＡＡＢＤ−Ｃｌによる線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）タンパク質の誘導体化及び同定
（１）方法
線虫（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｎ２株）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯＰ５０株を栄養源として２０℃で、ＮＧＭ寒天上に培養し、Ｍ９バッファーにより浮遊させてバクテリアから分離した。上記線虫をＭ９バッファーで２回洗った後、−８０℃で保管して用いた。この線虫を等量の１０ｍＭ ＣＨＡＰＳに懸濁し、超音波で溶解した。可溶性のフラクションを４℃で１０，０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集めた。上澄を可溶性フラクションとして−２０℃で保管した。このフラクションのタンパク質濃度をＢＳＡを標準に用いるＢｒａｄｆｏｒｄ ｍｅｔｈｏｄで決定した。上澄の約２０μＬ（１００μｇタンパク質）を同容量の２．５ｍＭ ＴＣＥＰ，１７．５ｍＭ ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ ＥＤＴＡ及び５０ｍＭ ＣＨＡＰＳを６．０Ｍグアニジンを含む１００ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中で混合した。反応混合物を４０℃で３０分インキュベートした後、反応を２００μＬの０．１％ギ酸で停止し、次いで、反応混合物（１０μｇタンパク質）の３０μＬをＨＰＬＣシステムに注入した。
【００７４】
ＲＰカラムがＰＲＯＴＥＩＮ（３０ｎｍ孔径、２５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）（Ｉｍｔａｋｔ）、移動相が溶離液（Ａ）０．１％トリフルオロ酢酸及び溶離液（Ｂ）水／ＣＨ３ＣＮ／トリフルオロ酢酸（７０／３０／０．１）、グラジエントシステムが流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで１００分かけて３０から７０％Ｂの条件でＨＰＬＣを行った。蛍光検出は５０８ｎｍ、励起波長は３８７ｎｍで行った。同定のために、蛍光タンパク質誘導体のいくつかのピークフラクションを分離し、減圧下に１０μＬに濃縮した。各フラクションは、２μｇ／ｍＬトリプシン及び１．０ｍＭ塩化カルシウムを含む９０μＬの５．０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ７．８）で希釈し、３７℃で２時間インキュベートした。各タンパク質加水分解ペプチド混合物を直接エレクトロスプレーイオントラップ質量分析装置を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。クロマトグラフィーは、ＨＰ１０９０シリーズＩＩシステム及びＣａｄｅｎｚａ ＴＣ−１８ ｃｏｌｕｍｎ（１２ｎｍポーラスシリカ、１００×２．０ｍｍ ｉ．ｄ．）のカラムを用いて実施した。移動相は溶離液（Ａ）１．０ｍＭギ酸アンモニウム及び溶離液（Ｂ）１．０ｍＭギ酸アンモニウム／ＣＨ３ＣＮ（５０／５０）とした。グラジエント溶出は、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで６０分かけて０から１００％で行った。タンパク質の同定は、システインのチオール残基に結合したＤＡＡＢＤを記憶するＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，Ｕ．Ｋ．）データベースサーチアルゴリズムを用いてＮＣＢＩｎｒデータベースより行った。
【００７５】
（２）結果
図１１は、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌで誘導体化した、線虫の可溶性フラクションから得られたタンパク質（約１０μｇ）のクロマトグラムを示す。本実施例では、タンパク質の分離、トリプシンによる加水分解及び任意に選択されたピークフラクションのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ同定により、１０種類のタンパク質が同定された。
図中、１はリボゾームタンパク質Ｓ３ａ（ＭＷ＝２８９４２）、２はカルレティキュリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）前駆体（ＭＷ＝４５５８８）、３はリボゾームタンパク質Ｌ１（ＭＷ＝３８６３５）、４は伸長因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）１−アルファ（ＭＷ＝５０６３６）、５はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＷ＝３５０９８）、６は４０Ｓリボゾームタンパク質（ＭＷ＝２２０４４）、７はビテロゲニン（ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）（ＭＷ＝１９３０９８）、８はアルギニンキナーゼ（ＭＷ＝４１９６９）、９はＨＳＰ−１熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）７０ｋｄタンパク質Ａ（ＭＷ＝６９６８０）及び１０はリボゾームタンパク質Ｌ７Ａｅ（ＭＷ＝１３９９２）を示す。本実施例では、任意に選択された１０種類のタンパク質が同定されたが、本発明では、同様にして、他のタンパク質の同定をすることが可能である。
【実施例１１】
【００７６】
７−クロロ−Ｎ−（２−ジメチルアミノプロピル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルフォンアミド
４−クロロ−７−クロロスルフォニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（０．２５ｇ、０．９９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌した。次いで、これにＮ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン（０．２１ｍｌ、１．４９ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２１ｍｌ、１．４９ｍｌ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、次いで、減圧で濃縮した。残渣をクロロホルムに溶解し、飽和アンモニウムクロライド水溶液及び塩水で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（１０％メタノール／クロロホルム）で精製し、生成物を得た。得られた固体をメチレンクロライド及びジイソプロピルエステルから再結晶し、明るい黄色の小板状の生成物（０．２２ｇ、０．６６ｍｍｏｌ、６７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ７．９７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），３．０５（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．４８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．３３（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）δ１４８．７７，１４５．００，１３３．４０，１２９．１５，１２７．８８，１２７．４７，５１．１４，４６．０９，４０．４５，１１．３６；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４４６，３２０９，３１０１，２９７６，２８１７，１５２５，１３４７，１１６４．
【実施例１２】
【００７７】
４−クロロ−７−クロロスルフォニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（０．２１ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８ｍｌ）に溶解し、０℃で撹拌した。次いで、これにＮ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミン（０．２０ｍｌ、１．２５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．１７ｍｌ、１．２５ｍｌ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、次いで、減圧で濃縮した。残渣をクロロホルムに溶解し、飽和アンモニウムクロライド水溶液及び塩水で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧で濃縮した。残渣をシルカゲルクロマトグラフィー（１０％メタノール／クロロホルム）で精製し、明るい黄色固体の生成物（０．１０ｇ、０．２９ｍｍｏｌ、３５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）δ８．０６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｍ，８Ｈ），１．９３（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１２５ＭＨｚ）δ１５０．３９，１４６．６６，１３５．５８，１３１．３３，１２９．３３，１２８．１０，５０．４１，４１．２１，２５．６９，９．２６；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３５０１，３４２８，３２０９，２９７３，２７３３，２６７５，１５２４，１３３８，１１６０．
【実施例１３】
【００７８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６の合成
ジメチルアンモニウムクロライド−ｄ６（２．４６ｇ）及びブロモアセトニトリル（３．３７ｇ）をジエチルエーテル（２０ｍｌ）に溶解した。１０℃でこれに５０％ＮａＯＨ（４．５ｇ）を添加した後、混合物を同じ温度で２時間撹拌した。エーテル層を分離し、水層をエーテル（１０ｍｌ×３）で抽出した。合体したエーテル層をＭｇＳＯ４で乾燥し、次いで、減圧で濃縮してＮ，Ｎ−ジメチルアミノアセトニトリル−ｄ６溶液（１０ｇ）を得て、次いで、それを１０℃でテトラハイドロフラン（４０ｍｌ）中のＬｉＡｌＨ４（１．２８ｇ）及びスルフォン酸（１．６９ｇ）の混合物に加えた。反応混合物を室温で１３時間よく撹拌、混合した。これにエーテル（３０ｍｌ）を加えた後、混合物をＮａＯＨ（水６ｍｌに４ｇ溶解）で処理した。エーテル層を分離し、水層をエーテル（１０ｍｌ×２）で抽出した。合体したエーテル層をＭｇＳＯ４で乾燥し、次いで、（５ｇになるまで）減圧濃縮した。残渣を希釈し、フラクション（７０−８０℃）を合わせて、１．７９ｇ（収率５２．５％）のＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６（７７．４％ ＴＨＦ溶液）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１．８２−１．８８（１．５４Ｈ，ｍ ｆｏｒ ＴＨＦ，４Ｈ），２．３３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），２．７７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．７２−３．７６（１．４８Ｈ，ｍ ｆｏｒ ＴＨＦ，４Ｈ）
【実施例１４】
【００７９】
７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルフォニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）の合成
４−クロロ−７−クロロスルフォニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（３．２８ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６０ｍｌ）に溶解した。この溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６（１．０ｇ）及びトリエチルアミン（１．９２ｍｌ）を各々加えて、氷で冷却して、同じ温度に１時間保持し、室温で１．５時間撹拌、混合した。次いで、反応混合を減圧濃縮し、残渣をＡｃＯＥｔに溶解した。エチルアセテート溶液を飽和ＮａＨＣＯ３、蒸留水、飽和ＮａＣｌ溶液で各々洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。ろ過した溶液を減圧濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（５０：１）を溶出液としてシリカゲルカラムで精製した。溶出した溶液を減圧乾燥し、残渣をＥｔＯＨ−ＡｃＯＥｔで再結晶して１．３６ｇ（収率４１．３％）のＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６：ｍｐ、１１０℃を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．１３（２Ｈ，ｍ），２．３３（２Ｈ，ｍ），ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３１１（Ｍ＋Ｈ）＋，ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１；１３４２ａｎｄ１１６６．
【実施例１５】
【００８０】
７−フルオロ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルフォンアミド（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）の合成
７−フルオロ−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルフォニルクロライド（７５ｍｇ）を３ｍｌのアセトニトリルに溶解した。これに、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−（２２ｍｇ）及びトリエチルアミン（３５μｌ）を加えた後、混合物を氷の上で３０分間撹拌した。反応混合を減圧で関そうし、残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し，ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ（９３：７）を用いてシリカゲルクロマトグラフィーに供し、７−フルオロ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルフォンアミド（４９ｍｇ、５６％）を赤い粉末として生成した。ｍｐ：１１７−１２０℃。１Ｈ−ＮＭＲδＨ８．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．９３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），２．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），１．９８（６Ｈ，ｓ）ｉｎ ＣＤ３ＯＤ；ＥＳＩ−ＭＳｍ／ｚ３５３［（Ｍ＋Ｈ）＋］
【実施例１６】
【００８１】
（１）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆによる低分子量チオールの誘導体化反応及び誘導体の蛍光特性
１ｍＭ（システイン、ホモシステイン、アラニン、セリン、又はグルタチオン）溶液の２０μＬを、同容量の２．５ｍＭＴＣＥＰ、１７．５ｍＭＤＡＡＮＳｅＤ−Ｆ、１０ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ及び５０ｍＭＣＨＡＰＳと混合した。各試薬は、６．０Ｍグアニジンを含む１００ｍＭホウ酸バッファーに溶解した。反応混合物を４０℃で１０−１２０分間加熱し、反応を０．１％トリフルオロ酢酸の２００μＬで停止した。混合溶液を３００μＬのメタノールで希釈し、蛍光スペクトルを蛍光スペクトロメーターで測定した。その結果、最大励起波長は約４２０ｎｍ、最大蛍光波長は約５４０ｎｍであった。
【００８２】
（２）低分子量チオールのＤＡＡＢＳｅＤ−誘導体の分離及び同定
０．１％トリフルオロ酢酸で反応を停止した上記反応混合物の１０μＬをＨＰＬＣシステムに供した。ＨＰＬＣシステムは、ポンプ（Ｌ−７１００、日立社製）、分離カラムＴＳＫｇｅｌ１２０−ＴＱＡ（内径２５０×４．６ｍｍ）（東ソー社製）及び蛍光検出器（ＦＬ−２０２５、ジャスコ社製）で構成した。蛍光検出は５４０ｎｍで、励起波長は４２０ｎｍで行った。移動相は、１５０ｍＭリン酸バッファー／ＣＨ３ＣＮ（９４／６）であり、流速は０．７５ｍｌ／分とした。
同定のために、反応混合物をＨＰ１０９０シリーズＩＩシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（ＧｍｂＨ）のカラムに直接注入して、エレクトロスプレー法によるＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。クロマトグラフィーは、Ｃａｄｅｎｚａ ＴＣ−１８カラム（シリカの１２ｎｍ孔、内径１００×２．０ｍｍ）（Ｉｍｔａｃｔ（株））で行った。移動相は、０．１％ギ酸の溶出液（Ａ）及び水／ＣＨ３ＣＮ／ギ酸（５０／５０／０．１）の溶出液（Ｂ）で構成した。０から１００％Ｂで流速０．２ｍｌ／分で１５分間グラジエント溶出を行った。このとき得られたクロマトグラムは、システイン、ホモシステイン、グルタチオンの３つのピークを与えた。
【００８３】
（３）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆによるペプチド及びタンパク質の誘導体化反応
１００μＭのペプチド及びタンパク質（インシュリン、トリプシン阻害剤、α−酸グリコプロテイン、カルボニックアンヒドラーゼ、α−ラクトアルブミン）溶液又は１０μＭ ＢＳＡ溶液の２０μＬを同容量の２．５ｍＭ ＴＣＥＰ、１７．５ｍＭ ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ（比較として）、１０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ及び５０ｍＭ ＣＨＡＰＳと混合した。各反応混合物を６．０Ｍグアニジンを含む１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶解した。各反応混合物を４０℃で６０分間（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）又は２０分間（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）加熱し、反応を０．１％トリフルオロ酢酸の２００μＬで停止した。混合物をメタノール３００μＬで希釈し、蛍光スペクトルを蛍光スペクトロメーターで測定した。その結果、最大励起波長は約４２５ｎｍ、最大蛍光波長は約５３５ｎｍであった。
【００８４】
（４）ペプチド及びタンパク質のＤＡＡＢＳｅＤ誘導体の分離
メタノールを除いた上記反応混合物の５５μＬをＨＰＬＣカラムに供した。ＨＰＬＣシステムは、ポンプ（Ｌ−７１００、日立社製）、タンパク質用のＲＰカラム（３０ｎｍ孔サイズ、内径２５０×４．６ｍｍ）（Ｉｍｔａｃｔ社製）及び蛍光検出器（ＦＬ−２０２５、ジャスコ社製）で構成した。蛍光検出は、５５０ｎｍ（励起波長４５０ｎｍ）（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）又は４９０ｎｍ（励起波長３７０ｎｍ）（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）で行った。溶出液（Ａ）は、水／ＣＨ３ＣＮ／トリフルオロ酢酸（９０／１０／０．１）からなり、溶出液（Ｂ）は、水／ＣＨ３ＣＮ／トリフルオロ酢酸（３０／７０／０．１）で構成した。０から１００％Ｂで流速０．５ｍＬ／分で２００分間のグラジエント溶出を行った。
【００８５】
（５）異なる波長でのタンパク質誘導体のＨＰＬＣ分離・定量及びタンパク質の同定
α−ラクトアルブミンを含み、１０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＣＨＡＰＳ、２．５ｍＭＴＣＥＰ、６．０Ｍグアニジンを含む混合溶液を２つの部分に分け、試料Ａには１μＭのα−ラクトアルブミン及び試料Ｂには２μＭのα−ラクトアルブミンを含むように調整した。試料ＡはＤＡＡＢＤ−Ｃｌと４０℃で２０分間反応させ、試料ＢはＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆと４０℃で３０分間反応させ、両者の反応溶液を再度混合した。混合物を２つの蛍光検出器に直列に連結したＨＰＬＣに供した。一つは、３７０ｎｍで励起して蛍光波長４９０ｎｍでＤＡＡＢＤ誘導体をモニターし、もう一つは、４５０ｎｍで励起して蛍光波長５５０ｎｍでＤＡＡＢＳｅＤ誘導体をモニターした。ＨＰＬＣシステムは上記（４）と同じである。
【００８６】
タンパク質の同定のために、試料Ａ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＤ誘導体及び試料Ｂ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＳｅＤ誘導体に相当するピークフラクションを合体し、ｐＨ７．８に調整し、トリプシンで加水分解した。次いで、得られたペプチド混合物を窒素ガスで濃縮し、タンパク質同定アルゴリズムを備えた、シスラインのチオール基に結合したＤＡＡＢＤ（ＭＷ、３９００）又はＤＡＡＢＳｅＤ（ＭＷ、４５３９）を記憶しているＭＡＳＣＯＴを有するＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。クロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）及び分離カラム、Ｃａｄｅｎｚａ ＴＣ−１８カラム（シリカの１２ｎｍ孔、内径１００×２．０ｍｍ）（Ｉｍｔａｃｔ社製）、０．１％ギ酸の溶出液（Ａ）及び水／ＣＨ３ＣＮ／キ酸（５０／５０／０．１）の溶出液（Ｂ）で構成した。０から１００％Ｂで流速０．２ｍＬ／分で６０分間のグラジエント溶出を行った。その結果、実施例１０と同様にα−ラクトアルブミン（ＭＷ１６２２８）が同定できた。
【実施例１７】
【００８７】
（１）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの合成
前述のように、ベンゾキサジアゾール試薬の、７−クロロ−Ｎ−[２−(ジメチルアミノ)エチル]−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルフォンアミド（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）は、感度のよい、選択的なチオール特異的試薬であり、プロテオミクス研究に有用である。ＤＡＡＢＤ−Ｃｌは、ペプチド及びタンパク質のチオールと反応して誘導体化し、３９０ｎｍの励起で５０２ｎｍで蛍光を発する。本実施例では、図１２の合成経路により、７−フルオロ−Ｎ−[２−（ジメチルアミノ）エチル]−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルフォンアミド（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）をＤＤＡＢＤ−Ｃｌのカウンターパートとして合成した。
【００８８】
本発明者は、７−フルオロ−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルフォネート（ＳＢＳｅＤ−Ｆ）及び７−フルオロ−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−スルフォネート（ＳＢＴｈＤ−Ｆ）をチオール特異的蛍光試薬として合成した。これらのシステインとの誘導体の蛍光波長は、各３４０ｎｍ及び３１５ｎｍの励起波長で、それぞれ５４２ｎｍ及び５１７ｎｍであった。対応するベンゾキサジアゾール試薬の、７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルフォネート（ＳＢＤ−Ｆ）は、３６５ｎｍの励起で５１４ｎｍで蛍光を発する誘導体を与える。ＳＢＳｅＤ−ＦとＳＢＤ−Ｆでの誘導体の最大波長の大きな相違にヒントを得て、本発明者は、ベンゾセレナジアゾール試薬、ＤＡＡＢＳｅＤ−ＦをＤＡＡＢＤ−Ｃｌのカウンターパートとして合成した（図１２）。
【００８９】
（２）チオールに対するＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの誘導体化反応の反応条件及び反応性
ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆによる低分子量チオール（システイン、ホモシステイン、グルタチオン、アラニン、セリン及びトリプシン）の誘導体化反応を４０℃（ｐＨ９．０）で行った。ペプチド及びタンパク質（インシュリン、α１−酸グリコタンパク質、トリプシン阻害剤、カルボニックアンヒドラーゼ、α−ラクトアルブミン、ＢＳＡ等）の場合、反応を促進するために、ＣＨＡＰＳ及びグアニジンの存在下で行った。予測したように、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆは、アラリン（アミノ及びカルボキシル基を含む）セリン（アミノ、カルボキシル及び水酸基を含む）及びチロシン（アミノ、カルボキシル、フェノール性水酸基を含む）のようなチオールを含まない化合物との反応では蛍光を示さなかった。これに対して、チオール化合物の場合には、蛍光を発し、その強度は３０分で最大に達したが、これは、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆはペプチド及びタンパク質と同様に低分子量のチオールと特異的に反応し、蛍光を生じ、反応速度は、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌと同様であることを示している。
【００９０】
（３）ＤＡＡＢＤ−Ｆと比較したＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ誘導体の蛍光特性
ＤＡＡＢＳｅＤ誘導体は、最大励起及び蛍光波長が、それぞれ４２３−４２９ｎｍ及び５２４−５４２ｎｍの範囲にあることを示した（表５）。
【００９１】
【表５】
【００９２】
（４）ＬＣ−ＭＳによるチオールのＤＡＡＢＳｅＤ誘導体の同定及び検出
ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆで誘導体化したチオール混合物をエレクトロスプレーイオントラップ質量分析計を備えたＨＰＬＣに供した。各チオールについて単一ピークが得られた。マススペクトルから、各低分子量チオールのＤＡＡＢＳｅＤ誘導体が、システイン（ＭＷ＝１２１）、ホモシステイン（ＭＷ＝１３５）及びグルタチオン誘導体（ＭＷ＝３０７）について、ベースイオンピークがｍ／ｚ＝４５４（Ｍ＋Ｈ）＋、４６８（Ｍ＋Ｈ）＋及び６４０（Ｍ＋Ｈ）＋として検出された。本実験では、用いたエレクトロスプレー法による分子イオン検出の限界（ＭＷが３０００以下）のため、タンパク質のＤＡＡＳｅＤ誘導体の同定は困難であった。
【００９３】
（５）ＤＡＡＢＳｅＤで誘導体化したペプチド及びタンパク質の検出限界
ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆで誘導体化したタンパク質から得られるクロマトグラムは、各誘導体の単一ピークを示し、重なるピークは観察されなかった。試薬自体は蛍光を発しないので、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆピークは現れなかった。上述の誘導体のピーク高さは、注入量に比例した。バソプレシン、α−ラクトアルブミン及びＢＳＡの検出限界は、それぞれ、７．５、７．２、及び７．２ｆｍｏｌであった。これらの検出限界はＤＡＡＢＤ誘導体のものと同様であった。ＤＡＡＢＤ誘導体に比較して、ＤＡＡＢＳｅＤ誘導体は早く溶出したので、ＤＡＡＢＳｅＤ誘導体は、ＤＡＡＢＤ誘導体よりも、ＨＰＬＣ固定相に対する低い親和性を有していた。同様の傾向は、ＳＢＤ誘導体と比べて、ＳＢＳｅＤ誘導体についても観察された。
【００９４】
（６）ＤＡＡＢＳｅＤ及びＤＡＡＢＤ誘導体の同時検出
ＤＡＡＢＤ及びＤＡＡＢＳｅＤ誘導体を併用した、二つの誘導体の同時蛍光検出は、同一起源の異なる歴史を有する二つのタンパク質試料の比較を簡便にする。例えば、一方が病態患者試料で一方が健常者からの試料、あるいは、二つの細胞又は組織試料で、一方がある薬剤で処理され、他方が未処理のものが例示される。本実験では、試料Ａ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＤ誘導体の反応溶液と、試料Ｂ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＳｅＢＤ誘導体の反応溶液を合体し、二つの蛍光検出器に連結したＨＰＬＣに供した。それぞれの検出波長は、ＤＡＡＢＤ誘導体では３７０ｎｍの励起で４９０ｎｍで行い、ＤＡＡＳｅＢＤ誘導体では、４５０ｎｍの励起で５５０ｎｍで行なった。二つの誘導体は、クロマトグラムで各単一ピークを与えた。α−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＤ誘導体及びα−ラクトアルブミンのＤＡＡＳｅＢＤ誘導体の保持時間は、５３．３分、及び５０．０分であった。
【００９５】
試料Ａ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＤ誘導体は、観察されたが、試料Ｂ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＳｅＤ誘導体は観察されなかった。試料Ｂ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＳｅＤ誘導体は観察され、試料Ａ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＤ誘導体は観察されなかった。したがって、この方法で、試料Ａ中に存在するα−ラクトアルブミンと試料Ｂ中に存在するα−ラクトアルブミンを区別することができ、同じ試料中のそれらの量を計測し、比較することができる。
【００９６】
分離された相当するピークフラクションを合体した混合物をトリプシンのような酵素で処理することで、タンパク質の定量及び同定が可能であった。例えば、試料Ａ中のＤＡＡＢＤ誘導体及び試料Ｂ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＳｅＤに相当する各ピークを合体し、トリプシンで分解し、得られたペプチド混合物を、２つの蛍光検出器に直結したＨＰＬＣにて分離・定量するとそのタンパク質（α−ラクトアルブミン）の定量が可能であり、更に得られたペプチド混合物をシステインのチオール残基に結合したＤＡＡＢＤ又はＤＡＡＢＳｅＤを記憶している、タンパク質の同定アルゴリズム、ＭＡＳＣＯＴを備えた、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。その結果、実施例１０と同様にα−ラクトアルブミン（ＭＷ１６２２８）が同定された。
【００９７】
本実験では、異なった試料Ａ及びＢ中のタンパク質α−ラクトアルブミンを取り上げ、比較した。これに対して、一つの試料中に多くの化合物が存在する実際のバイオ試料の、誘導化したタンパク質溶液を合体した混合物は、複雑なＨＰＬＣクロマトグラムのパターンを与えるので、クロマトグラムでタンパク質ピークを区別することは非常に困難になる。しかし、標的タンパク質の標準品があり、異なったクロマトフラフィー条件で二次元クロマトグラフィーを行なえば、二つのクロマトグラフィー上のタンパク質の二つの誘導体の保持時間を知ることができるので、クロマトグラム上でＤＡＡＢＤ−Ｃｌ及びＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの各誘導体のピーク分画を分離した後、これらを合体したピークフラクションを第２のクロマトグラフィーで再クロマトすることにより、精製されたタンパク質の各誘導体が定量できる。更に、ピーク分画を上記の酵素処理、蛍光検出ＨＰＬＣ又はＬＣ−質量分析計に付し、異なった試料中のタンパク質の定量又は同定ができる。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
以上詳述したように、本発明は、微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法及びそのシステムに係るものであり、本発明により、遺伝子を介して発現する発現タンパク質及び／又はペプチドを簡便な方法及び手段で、高感度に検出・分離・同定することができる。本発明の方法により、従来法では検出できなかった微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを短時間で、感度良く検出・分離・同定することができる。また、上記検出・分離・同定方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの微量検出・分離・同定システムを提供することができる。本発明は、プロテオームのプラットフォーム技術を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】本発明の方法の操作工程の一例を示す。
【図２】界面活性剤の種類と蛍光誘導体の生成の度合いとの関係を示す。
【図３】本発明の方法により試験した蛍光誘導体タンパク質／ペプチドのそれぞれの蛍光ピークを示す。
【図４】酵素水解物の蛍光クロマトグラム（Ａ）、及びマスクロマトグラム（Ｂ）を示す。
【図５】ＭＳ／ＭＳによるマススペクトルを示す。
【図６】実施例３における逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）によるクロマトグラムを示す。
【図７】蛍光誘導体化の反応時間と蛍光強度との関係を示す（左図：ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ，右図：ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ）。
【図８】ＴＡＡＢＤ−Ｃｌとの反応時間と蛍光強度との関係を示す。
【図９】新規蛍光試薬によるシステインの蛍光誘導体化（ｐＨ９．０）の反応時間とピーク領域との関係を示す。
【図１０】新規蛍光試薬によるシステインの蛍光誘導体化（ｐＨ１０．０）の反応時間とピーク領域との関係を示す。
【図１１】ＤＡＡＢＤ−Ｃｌで誘導体化した、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の可溶性フラクションが得られたタンパク質（約１０μｇ）のクロマトグラムを示す。
【図１２】ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｘの合成経路を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法に関するものであり、更に詳しくは、生体において遺伝子の発現により産生される微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを簡便な方法で、高感度に検出し、同定することを可能とする新規な発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法、及びその同定システムに関するものである。
本発明は、ポストゲノム時代において重要な役割を果たすことが期待される、発現タンパク質及び／又はペプチドを網羅的に解析するプロテオーム技術における新しい検出・分離・同定手法を提供するものとして有用である。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代において重要な課題は、遺伝子を介して発現する発現タンパク質／ペプチドの微量検出とその分離・同定である。従来、この課題達成のために、２次元電氣泳動後のペプチドフィンガープリント法が汎用されてきた（非特許文献１参照）。しかし、この方法は、煩雑な操作のために該方法の再現性に難点があった。この難点を克服する手法として、最近、多次元高速液体クロマトグラフィー（多次元ＨＰＬＣ）による分離・同定法、或いはＩＣＡＴによる手法が提案されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
これらのうち、タンパク質／ペプチドを、直接、多次元ＨＰＬＣで分離・同定する方法は、全てのタンパク質／ペプチドを同時に処理するために、多大な労力と時間を要するという欠点がある。また、ＩＣＡＴによる手法は、チオール含有タンパク質／ペプチドのチオール基をｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇｓ （ＩＣＡＴ） ｒｅａｇｅｎｔで標識した後、それをビオチン結合カラムにて捕集し、これら全てを酵素水解し、得られたペプチドフラグメント混合物をＨＰＬＣで分離、質量分析計（ＭＳ）にて質量分析し、タンパク質／ペプチドを網羅的に解析しようとするものである。しかし、この方法は、チオール含有タンパク質／ペプチドの全てを酵素水解するため、大量に存在する目的以外のタンパク質／ペプチドのフラグメントが、目的とする微量タンパク質／ペプチドのフラグメントの検出及びその同定を妨害する、と言う欠点があり、当技術分野においては、更なる方法のブレークスルーが必要とされていた。
【０００４】
【非特許文献１】Ｄｕｎｎ ＭＪ．Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ １９８７；４１８：１４５−１８５
【非特許文献２】Ｇｙｇｉ Ｓ．Ｐ， Ｒｉｓｔ Ｂ， Ｇｅｒｂｅｒ Ｓ．Ａ， Ｔｕｒｅｃｅｋ Ｆ， Ｇｅｌｂ Ｍ．Ｈ， Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ、 Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ ａｆｆｉｎｉｔｙｔａｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９９；１７：９９４−９９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、上記従来技術における諸問題を抜本的に解決することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、従来法と異なり、被験試料中の蛍光標識可能なタンパク質及び／又はペプチドのみを蛍光選択的に分離した後、これを酵素水解に付し、分画した蛍光画分を質量分析、データベース照合、構造解析に供することにより、従来法では検出不可能であった微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを高感度に検出し、同定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明は、遺伝子を介して発現する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを、簡便な測定手法で、高感度に検出・分離・同定することを可能とする上記発現タンパク質及び／又はペプチドの微量検出・分離・同定方法を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、上記微量検出・分離・同定方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを、高感度で検出・分離・同定するための発現タンパク質及び／又はペプチド同定システムを提供することを目的とするものである。
更に、本発明は、従来法では検出することができなかった、遺伝子を介して発現する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを超高感度で検出・分離・同定することを可能とする新しい分析方法及び手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）被験試料中の発現微量タンパク質及び／又はペプチドを高感度に検出・分離・同定する方法であって、被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、これを蛍光検出により分離し、その蛍光画分を質量分析に付するか、又はその蛍光画分を酵素水解に付し、そのペプチド断片を分離し、その画分を質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供して発現タンパク質及び／又はペプチドの同定を行うことを特徴とする上記発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
（２）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、ＨＰＬＣに付し、その蛍光分画を捕集した後、酵素水解に付し、その蛍光標識フラグメント及び非蛍光標識フラグメントを質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析して得られた各フラグメントのイオン分子量情報をタンパク質及び／又はペプチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析する、前記（１）に記載の方法。
（３）（ａ）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識する、（ｂ）それを１次元又は２次元のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光分画を捕集する、（ｃ）上記蛍光分画を酵素水解に付する、（ｄ）それを第二段階のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光クロマトグラムを得ると共に、その全ピークを質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供する、前記（１）に記載の方法。
（４）タンパク質及び／又はペプチド試料の水溶液に、官能基特異的蛍光試薬を加え、場合により、界面活性剤及び／又はタンパク変性剤を加え、タンパク質及び／又はペプチドを蛍光標識する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）蛍光標識したタンパク質及び／又はペプチド試料を蛍光検出器付きイオン交換カラムＨＰＬＣ、逆相分配ＨＰＬＣ、ゲル濾過ＨＰＬＣ、又は電気泳動に代表される分離手段に付し、蛍光をモニターしながらそのピーク分画を捕集する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（６）蛍光分画を、各種ペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシンに代表されるタンパク質分解酵素を用いて酵素水解する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（７）酵素水解物を蛍光検出器付き逆相ＨＰＬＣに付し、蛍光ピークを検出すると共に、蛍光標識フラグメント及び蛍光非標識フラグメントの質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析を行う、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（８）質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析に付して得られた各フラグメントのイオン分子量情報を、コンピューターによるタンパク質及び／又はペブチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析して、酵素水解以前のタンパク質及び／又はペプチドの同定を行う、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
（９）被験試料が、生体試料から採取したタンパク質及び／又はペプチド試料である、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（１０）タンパク質及び／又はペプチドフラグメント情報、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを用いてデータベース照合する、前記（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記（１）から（１０）のいずれかに記載の方法に使用する発現微量タンパク質及び／又はペプチド検出・分離・同定システムであって、被験試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識するための第一反応器、蛍光試薬で標識した蛍光誘導体を蛍光分画するための１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、蛍光分画を酵素水解するための第二反応器、酵素水解物の蛍光標識フラグメントを蛍光検出するための第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを搭載した構造解析装置の１種又は２種以上を構成要素として含むことを特徴とする上記検出・分離・同定システム。
（１２）上記第一反応器、１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、第二反応器、第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣを直列に配置してなる、前記（１１）に記載のシステム。
（１３）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを、蛍光誘導体化試薬として、下記の化５の一般式（１）
【０００８】
【化５】
【０００９】
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、−ＮＨＲ′（但、Ｒ′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキル）、又は−ＮＲ′′Ｒ′′′（但し、Ｒ′′はアルキル、Ｒ′′′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキルを示す。〕で表わされる化合物、又はその同位体化合物又は下記の化２の一般式（２）
【００１０】
【化６】
【００１１】
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物又はその同位体化合物、を用いて、蛍誘導体とする、請求項１に記載の方法。
（１４）前記（１）に記載の方法でタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体化するために使用する蛍光誘導体化試薬であって、下記の化７の一般式（１）
【００１２】
【化７】
【００１３】
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、−ＮＨＲ′（但、Ｒ′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキル）、又は−ＮＲ′′Ｒ′′′（但し、Ｒ′′はアルキル、Ｒ′′′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキルを示す。〕で表わされる化合物、又はその同位体化合物又は下記の化２の一般式（２）
【００１４】
【化８】
【００１５】
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物又はその同位体化合物、を用いて、蛍誘導体とする、請求項１に記載の方法。
（１５）被検試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体化後、ＨＰＬＣで分離・検出し、分画後、酵素水解し、この水解物を直接質量分析で配列分析とタンパク質の同定を行なうことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
（１６）被検試料として、異なる試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドを、それぞれ蛍光波長の異なる少なくとも２つの蛍光誘導体化試薬でそれぞれ誘導体化後、蛍光検出器付きＨＰＬＣで分離・検出し、分画後、各蛍光ピークをそのまま又は合体して定量に供する、及び／又は各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物を定量に供する、又はこの水解物をＨＰＬＣ−質量分析に供し、同定を行なう、ことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
（１７）各蛍光ピークをそのまま又は合体してＨＰＬＣによる定量に供し、試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの各誘導体の比率を算出する前記（１６）に記載の方法。
（１８）水解物をＨＰＬＣによる定量に供し、試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの各誘導体の比率を算出する前記（１６）に記載の方法。
（１９）試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの第１の蛍光誘導体化試薬との反応物及び第２の蛍光誘導体化試薬との反応物を合体し、２つの励起・蛍光検出の可能なＨＰＬＣに供し、分画後、各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物をＨＰＬＣ−質量分析に供し、同定を行う前記（１６）に記載の方法。
（２０）試料Ａ、Ｂが、２種類の細胞又は組織又は体液試料である前記（１６）に記載の方法。
（２１）蛍光誘導体化試薬として、ＤＡＡＢＤ−Ｘ、ＤＡＡＳｅＢＤ−Ｘ、及びＤＡＡＴｈＢＤ−Ｘ（但し、ＸはCｌ又はＦ）のうちの励起・蛍光波長の異なる少なくとも２つの蛍光誘導体化試薬でタンパク質及び／又はペプチドを誘導体化する前記（１６）に記載の方法。
（２２）蛍光波長の異なる蛍光誘導体化試薬として、ＤＡＡＢＤ−Ｘ、ＤＡＡＳｅＢＤ−Ｘ、又はＤＡＡＴｈＢＤ−Ｘ（但し、ＸはCｌ又はＦ）と、それらの各同位体を組み合わせて使用する前記（２１）に記載の方法。
（２３）酵素水解した試料を直接質量分析に付しペプチドマップを得ると同時に、蛍光試薬の有する骨格並びに電荷を活用して、蛍光標識化ペプチド断片を質量分析測定部で抽出してシステイン含有ペプチド部分の構造を取得し、これらを基にタンパク質及び／又はペプチドの同定を行なう前記（１６）に記載の方法。
（２４）蛍光誘導体化試薬で誘導体化したタンパク質及び／又はペプチドを分解することなく分画することが可能な、少なくともミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、及びミクロ自動注入装置を具備したことを特徴とする自動分画装置。
（２５）少なくとも、ミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、酵素反応装置、及びミクロ自動注入装置を備え、任意に、質量分析（ＭＳ）システムを具備したことを特徴とする微量タンパク質の高性能・簡易定量・同定解析装置。
【００１６】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、上記従来法の難点を克服するためになされたものであり、１）微量の発現タンパク質／ペプチドを蛍光試薬で標識し、２）それをＨＰＬＣ／蛍光検出にて第一段の分離・蛍光検出を行い、３）その蛍光分画（コントロール試料と比べて、被験試料に特異的に増減する蛍光画分）のみを捕集後、酵素水解し、それを第二段のＨＰＬＣ／蛍光検出にて分離し、蛍光ピークの確認を行った後、ＨＰＬＣ／ＭＳに付し、蛍光標識タンパク質／ペプチドフラグメントの同定を行い、当該微量タンパク質／ペプチドの特定を行う方法に関するものである。尚、タンパク質／ペプチド試料が純度の高い場合には、第一段のＨＰＬＣ／蛍光検出による分離を省くことができる。本発明の方法は、従来法と異なり、蛍光標識可能なタンパク質／ペプチドのみを特異的に抽出し、検出・同定することができるという特徴を有し、微量の発現タンパク質／ペプチドを特定するために尤も相応しい方法である。
【００１７】
本発明では、被験試料として、生体から採取したあらゆる種類のタンパク質及び／又はペプチドを含む試料が対象とされる。本発明の方法では、被験試料中の微量の発現タンパク質／ペプチドを蛍光試薬で標識し、蛍光誘導体化するが、この場合、タンパク質／ペプチド水溶液に、官能基特異的蛍光試薬を加え、場合により、界面活性剤及び／又はタンパク変性剤を加え、発現タンパク質／ペプチドを定量的に誘導体化することが重要である。即ち、本発明では、タンパク質／ペプチド試料の水溶液に、界面活性剤と場合によっては還元剤を添加し、これに官能基特異的蛍光試薬を加え、必要により、加温することにより、タンパク質及び／又はペプチドを蛍光標識する。本発明では、上記界面活性剤として、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両イオン性界面活性剤が用いられる。また、本発明では、上記還元剤として、好適には、Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、ｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅが用いられるが、これらに制限されるものではなく、同効のものであれば同様に使用することができる。
【００１８】
本発明において、上記官能基特異的蛍光試薬として、（例えば、４−Ｆｌｕｏｒｏ−７−ｎｉｔｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＮＢＤ−Ｆ）、５−（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ （ＤＮＳ−ＣＬ）、Ｏｒｔｈｏｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ（ＯＰＡ）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ、９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ （ＦＭＯＣ）等のアミノ基特異的蛍光試薬、Ａｍｍｏｎｉｕｍ ７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢＤ−Ｆ）、４−（Ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＡＢＤ−Ｆ）、４−（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＡｃＡＢＤ−Ｆ）、４−Ｆｌｕｏｒｏ−７−ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＴｃＡｃＡＢＤ−Ｆ）、ｍｏｎｏｂｒｏｍｏｂｉｍａｎｅ等のチオール基特異的蛍光試薬、４−Ｎｉｔｒｏ−７−Ｎ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＮＢＤ−ＰＺ）、４−Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−Ｎ−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＢＤ−ＰＺ）と縮合剤との組み合わせによるカルボキシル基特異的蛍光試薬、又は、４−（Ｎ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｙｌｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ−７−ｎｉｔｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＮＢＤ−ＣＯＣＬ）等の水酸基用蛍光試薬）が例示されるが、これらに制限されない。
【００１９】
本発明においては、必要により、加温する（例えば、３０−１００℃、望ましくは４０−７０℃で１０−３００分間、望ましくは６０−１８０分間）ことにより、タンパク質／ペプチドを蛍光標識する。その後、反応液のほぼ全量を蛍光検出器付きイオン交換カラムＨＰＬＣ、又は逆相分配ＨＰＬＣ、又はゲル濾過ＨＰＬＣに付し、蛍光をモニターしながらピーク分画を分取する。この場合、蛍光検出は、標識蛍光体の励起・蛍光波長に相当する波長に設定して行う。例えば、ＮＢＤ−Ｆ、又はＳＢＤ−Ｆで標識した場合には、励起波長４８０ｎｍ或いは３８０ｎｍ、励起波長５２０ｎｍ又は５０５ｎｍに設定する。イオン交換ＨＰＬＣの場合には、塩、例えば、食塩、硫酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、酢酸アンモニウムなど、望ましくは酢酸アンモニウムのような揮発性の塩を段階的に増量し、それぞれの画分を得る。この画分そのもの又はこの画分を濃縮・乾固した試料を、酵素水解に付す。酵素としては、各種ペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシンなど、適宜のタンパク質分解酵素が用いられる。この際、酵素カラムを接続してオンラインで酵素水解を行うこともできる。
【００２０】
この溶液の一部を蛍光検出器付き逆相分配ＨＰＬＣに付し、蛍光標識体の溶出位置を確認する。次いで、この逆相ＨＰＬＣカラムの出口を質量分析計（どの様な質量分析計でも対応可能であるが、望ましくはエレクトロスプレー型質量分析計を用いる）に接続し、酵素水解物の蛍光標識フラグメント及び蛍光非標識フラグメントの質量分析（蛍光標識フラグメントは一回の質量分析、蛍光非標識フラグメントは親イオンを更に質量分析する）又は質量分析／質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を行う。この際、蛍光検出器と質量分析計を直列に接続することも可能である。このようにして得られた各フラグメントのイオン分子量情報を、コンピューターに接続したタンパク質／ペプチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析することにより、酵素水解以前のタンパク質／ペプチドの同定を行う。この場合、本発明では、タンパク質及び／又はペプチドフラグメント情報、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを用いてデータベース照合を行う。
【００２１】
本発明では、発現タンパク質及び／又はペプチドを含む被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体化し、この蛍光誘導体をＨＰＬＣ／蛍光検出で分離し、蛍光ピークの強さを比較して標的発現タンパク質及び／又はペプチドの蛍光誘導体を分離し、得られた標的発現タンパク質及び／又はペプチドのピーク画分を酵素分解し、次いで、質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析、データベース照合、構造解析により、上記タンパク質及び／又はペプチドを同定する。タンパク質及び／又はペプチドのアミノ基、チオール基、水酸基及びカルボキシル基などの機能性部分を誘導化するための多くの蛍光試薬が存在するので、本発明では、その目的に応じて、適当な試薬を任意に選択して使用することができる。後記する実施例に示されるように、例えば、Ｃｙｓ−含有タンパク質を誘導化するためには、チオール基に特異的な試薬である、Ａｍｍｏｎｉｕｍ ７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢＤ−Ｆ）を使用することができる。図１に、本発明の方法のプロセスの一例を模式的に示す。後記する実施例に示されるように、実際、このようにして、ラットに１０ｍｇのデキサメタゾンを投与して２日後のランゲルハンス島におけるＰａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、プロインシュリン ２、７８ＫＤ Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、プロテイン結合フォスファチジルアミン及びチオレドキシンが強く誘導されたことが示された。
【００２２】
本発明の方法で重要な点は、各組織におけるタンパク質の量は、ＨＰＬＣ／蛍光検出で分離する前に、例えば、正常組織と非正常組織との組織間で定量、比較されるべきであることから、標的発現タンパク質を定量的に誘導体化することである。そのために、本発明では、適宜の界面活性剤が用いられるが、例えば、いくつかの界面活性剤についてＢＳＡにより検討したところ、ＣＨＡＰＳがｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅと比べて高い強度を示した（図２参照）。本発明では、ｐＨ、温度、反応時間及び誘導体化反応の添加剤等について、標的発現タンパク質及び／又はペプチドに応じて、最適条件を設定することで定量的な蛍光誘導体化が可能である。本発明では、これらの条件は、発現タンパク質／ペプチドの種類、分析目的等に応じて、適宜設定することができる。本発明の方法により、試験タンパク質／ペプチドのクロマトグラムは単一の蛍光ピークを示した（図３参照）。本発明の方法において、タンパク質及び／又はペプチドの検出限界は、０．２−６．０ｆｍｏｌであり、最適条件下での１０−１０００ｆｍｏｌの範囲で良好な直線（γ＞０．９９９４）の測定曲線が得られ（表１参照）、検出性能は、従来法に比べて、顕著であることが分かる。表１に、蛍光検出／ＨＰＬＣによる各種タンパク質及び／又はペプチドの検出限界を示した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
更に、本発明では、上記方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチド検出・分離・同定システムとして、被験試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識するための第一反応器、蛍光試薬で標識した蛍光誘導体を蛍光分画するための１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、蛍光分画を酵素水解するための第二反応器、酵素水解物の蛍光標識フラグメントを蛍光検出するための第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを搭載した構造解析装置の１種又は２種以上を構成要素として含む上記検出・分離・同定システムが用いられる。この場合、上記第一反応器、２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、第二反応器、第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣを直列に配置することができる。これらの装置は、その使用目的に応じて、適宜の容量、形態に任意に設計することができる。
【００２５】
本発明は、被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを、蛍光誘導体化試薬として、前記一般式（１）〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、又は−ＮＨＲ′（但し、Ｒ′はＮ置換アルキル）を示す。〕で表わされる化合物、又は前記一般式（２）（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物、を用いて、蛍光誘導体とすることができる。更に、本発明は、これらの化合物のいずれか１種を有効成分とする新規蛍光誘導体化試薬を提供することができる。
【００２６】
これらの化合物の具体例としては、好適には、例えば、以下の例があげられるが、これらに制限されるものではなく、これらと同等ないし類似の化合物であれば同様に使用することができる。本発明の化合物は、後記する実施例に具体的に記載した方法と同様にして容易に合成することができる。
（１）ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ］
（２）ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（３）ＤＡＡＢＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ］
（４）ＴＡＡＢＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（５）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｃｌ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ］
（６）ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（７）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ］
（８）ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（９）ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｃｌ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ］
（１０）ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｃｌ（７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
（１１）ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｆ［４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ］
（１２）ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｆ（７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
【００２７】
本発明では、蛍光誘導体化試薬として、例えば、ＳＢＤ−Ｘ、ＳＢＳｅＤ−Ｘ、ＳＢＴｈＤ−Ｘ、ＤＡＡＢＤ−Ｘ、ＴＡＡＢＤ−Ｘ、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｘ、ＴＡＡＢＳｅＤ−Ｘ、ＤＡＡＢＴｈＤ−Ｘ、ＴＡＡＢＴｈＤ−Ｘ（但し、ＸはＣｌ、又はＦ）、及びそれらの各同位体が提供される。これらの化合物は、いずれも、後記する実施例に示した化合物の場合と同様にして合成することができる。また、本発明では、前記一般式（１）で表わされる化合物の側鎖のアルキル基の鎖長を任意に変更することが可能である。本発明では、これらの化合物の、蛍光波長とＨＰＬＣ分離における保持時間の相違を利用して、これらの化合物を２つ以上組み合わせて使用することができる。ＨＰＬＣからの溶出は、例えば、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ＜ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ（側鎖のアルキル：プロピル）＜ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌの順に遅くなる。また、上記化合物の各同位体を使用することにより、更なる微量検出が可能となる。
【００２８】
本発明では、蛍光波長の異なる少なくとも２つの蛍光誘導体化試薬を利用することにより、例えば、同一起源の異なる歴史を有する二つのタンパク質試料の比較を簡便、かつ同時に行なうことができる。例えば、一方が病態患者試料で一方が健常者からの試料、あるいは一つの細胞又は組織試料で、一方がある薬剤で処理された試料で、他方が未処理の試料の比較を同一のクロマトグラムに基づいて同時に行なうこと、それにより、各蛍光誘導体化試薬で誘導体化されたタンパク質及び／又はペプチドの各誘導体を簡便、かつ正確に定量すること、が可能であり、２つの試料中のタンパク質及び／又はペプチドのプロファイルを同時的に測定し、比較することが実現できる。
【００２９】
本発明では、蛍光誘導体化試薬で誘導体化したタンパク質及び／又はペプチドを分解することなく分画することが可能な、少なくともミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、及びミクロ自動注入装置を具備した自動分画装置が提供される。また、本発明では、少なくとも、ミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、酵素反応装置、及びミクロ自動注入装置を備え、任意に、質量分析（ＭＳ）システムを具備した微量タンパク質及び／又はペプチドの高性能・簡易定量・同定装置が提供される。
【００３０】
本発明は、例えば、微量リン酸化タンパク質や糖タンパク質を蛍光誘導体化試薬で蛍光標識後、ミクロカラム−ＨＰＬＣ−蛍光検出器により修飾リン酸化部分並びに糖結合部分を保持したままのタンパク質として高性能分離・検出し、ミクロフラクションコレクターにて分取する。これに酵素を添加し、標識化タンパク質を酵素水解し、次いで、この水解試料を直接質量分析に付す。得られたペプチドマップと蛍光標識化ペプチドマップ情報を基に、データベース検索ソフトを利用して、例えば、翻訳後修飾微量タンパク質の修飾部分を含む同定を行なう。本発明の手法は、蛍光検出法とミクロＨＰＬＣとを組み合わせた方法であるため、例えば、超微量タンパク質を同定できること、翻訳後修飾タンパク質をそのまま分解することなく抽出して解析できること、そのため、リン酸化部位や糖結合部位の情報を確実に得られるばかりでなく、当該タンパク質を確実に同定できること、という従来の解析手法にはない利点を有している。本発明の解析手法は、生命科学、病態化学分野で広く使われることが期待され、疾患診断、治療、人類の健康維持へ貢献することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、１）遺伝子を介して発現する発現タンパク質及び／又はペプチドを簡便な方法及び手段で、高感度に検出・分離・同定することができる、２）本発明の方法により、従来法では検出できなかった微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを短時間で、感度良く検出・分離・同定することができる、３）また、上記検出・分離・同定方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの微量検出・分離・同定システムを提供することができる、４）本発明は、プロテオームのプラットフォーム技術を提供するものとして有用である、という効果が奏される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
ラット膵ランゲルハンス島（ラ島）中チオール含有タンパク質／ペプチドの分離・同定（１）ラ島中チオール含有タンパク質／ペプチドの蛍光誘導体化
ラ島に０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した６Ｍ塩酸グアニジン溶液５０μｌを加えて可溶化した。これに６Ｍ塩酸グアニジン溶液に溶解した１７．５ｍＭＴＣＥＰ、１７．５ｍＭＳＢＤ−Ｆ、１０ｍＭＥＤＴＡ及び５０ｍＭＣＨＡＰＳをそれぞれ５０μｌずつ加え、混合した。この溶液を４０℃にて３時間反応させることにより蛍光誘導体化を行った。
（２）イオン交換ＨＰＬＣによる１次分離
上記の反応溶液をイオン交換カラムに付し、ＮａＣｌのグラジエント（０、０．０４、０．０８、０．１２及び０．３Ｍ）により蛍光タンパク質／ペプチドを溶出させ、５つのフラクションに分離した。なお、蛍光タンパク質／ペプチドの検出はＳＢＤ骨格の蛍光により行った。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
【００３４】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ ７．５×７５ｍｍ（東ソー（株））
ガードカラム：Ｃ８−３００−Ｓ ５４．０×１０ｍｍ（ＹＭＣ（株））
移動相：段階溶離〔０−５分：Ｃ１００％、５−１５分：Ａ１００％、１５−２５分：Ａ８７％Ｂ１３％、２５−３５分Ａ７３％Ｂ２７％、３５−４５分：Ａ６０％Ｂ４０％、４５−５５分：Ｂ１００％〕
Ａ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／アセトニトリル（５０：５０）
Ｂ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）／アセトニトリル（５０：５０）
（０．３ＭＮａＣｌ含有）
Ｃ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
カラム温度：室温（約２５℃））
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：Ｅｘ３８０ｎｍ、Ｅｍ５０５ｎｍ
注入量：２００μｌ
【００３５】
（３）逆相ＨＰＬＣによる２次分離
上記の各画分を濃縮し、アセトニトリルを蒸発させた後、逆相カラムに付し、アセトニトリルの勾配溶離によりタンパク質／ペプチドをカラムから溶出させた。なお、タンパク質／ペプチドの検出はＳＢＤ骨格の蛍光によりモニターした。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
【００３６】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：カプセルパックＣ８ ＳＧ３００ ２．０×１００ｍｍ（（株）資生堂）
移動相：勾配溶離（０→６０分：Ｂ４０％→１００％）
Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸
Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル（４０：６０）
カラム温度：室温（約２５℃）
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
検出：Ｅｘ３８０ｎｍ、Ｅｍ５０５ｎｍ
注入量：５０μｌ
【００３７】
（４）酵素処理
採取したＨＰＬＣの各ピーク画分をそれぞれのチューブに０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム溶液５μｌを加えてトリフルオロ酢酸を中和後、濃縮してアセトニトリルを蒸発させた。残渣（約８０μｌ）に２０μｇ／ｍｌトリプシン（プロメガ）及び１０ｍＭ塩化カルシウムをそれぞれ１０μｌずつ添加した。これを３７℃で２時間インキュベートし、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定用の試料とした。
【００３８】
（５）ＭＳ／ＭＳ測定によるタンパク質／ペプチドの同定
上記の試料を逆相カラムＨＰＬＣに付し、エレクトロスプレー法によるＭＳ／ＭＳ測定を行った。ＨＰＬＣ条件を以下に示す。なお、タンパク質／ペプチドの同定はデータベースにＮＣＢＩ、サーチエンジンにＭＡＳＣＯＴを使用した。
【００３９】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：Ｃａｄｅｎｚａ ＴＣ−Ｃ１８ ２．０ ×１００ｍｍ（Ｉｍｔａｃｔ（株））
移動相：勾配溶離（０→３０分：Ｂ２０％→１００％）
Ａ：０．１％ギ酸
Ｂ：０．１％ギ酸／アセトニトリル（５０：５０）
カラム温度：室温（約２５℃）
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
測定モード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：５００−３０００ｍ／ｚ
注入量：５０μｌ
【００４０】
上記の方法により、約１３０のタンパク質／ペプチドのピークが分離できた。
そのうち、約５０のタンパク質／ペプチドが同定できた（表２、図６参照）。
【００４１】
【表２】
【実施例２】
【００４２】
ＳＢＤ−Ｆで誘導体化したＢＳＡを、図１に示されるプロセスにより、トリプシンで酵素水解し、得られたペプチド混合物を逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）で分離し、蛍光検出器で検出した。次いで、各ペプチドをイオンスプレーイオントラップ質量分析計によるＭＳ／ＭＳ分析に供した。原理的には、トリプシン分解により、ＢＳＡは、４個のアミノ酸残基以上の２５のシステイン含有ペプチド及び３５のシステイン非含有ペプチドが生成されるが、本実施例では、２７以上の蛍光ペプチドが蛍光検出され、定量的に誘導体化が行われた（図４、Ａ）。
【００４３】
また、１１のシステイン含有ペプチド及び１７の非システイン含有ペプチドがマスクロマトグラフィーで検出された（図４、Ｂ）。 図５に、（Ｍ＋２Ｈ）２＋プレカーサー、ｍ／ｚ＝８７３．４（図４で矢印で示した）から得たＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
全てのペプチドフラグメントのＣＩＤスペクトルにより、確率的プロテイン同定法に基づくＭＡＳＣＯＴによるデータベース照合を行い、予測通り、完全にＢＳＡとしてタンパク質を同定した（スコア：３９）。
【実施例３】
【００４４】
デキサメタゾン（Ｄｅｘ）投与及び非投与のラット膵臓について試験した。
Ｄｅｘは、肝臓のグルコース産生の増加とインシュリン耐性の誘導により主なヒト糖尿病であるタイプ２の糖尿病を誘発する。実際に、Ｄｅｘ処理の２４時間後に、血中グルコースレベルは２０９．８ｍｇ／ｄＬに達し、処理前の値の１１８．３ｍｇ／ｄＬより著しく高い（ｐ＜０．０５）。本実施例では、２日間Ｄｅｘで処理又は未処理のラット膵臓からランゲルハンス島（６０島）を採取し、ＳＢＤ−Ｆで誘導体化した。本発明の方法を生物試料に適用するための重要な態様は、タンパク質混合物からＨＰＬＣで発現タンパク質を分離することである。本実施例では、蛍光タンパク質は、まず、ＳＢＤ−Ｆにより生成した多くのマイナス電荷と酸性アミノ酸部分に基づいてイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）で分離された。
【００４５】
ＩＥＣは、塩化ナトリウムの段階溶離（０、０．０４、０．０８、０．１２、及び０．３Ｍ ＮａＣｌ）により行い、蛍光タンパク質混合物を５つの画分として得た。次いで、各画分は、更に、それらの疎水性に基づいて、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）により分離された。この実験でのピークの容量（ｎ＝Ｌ／（４σ）、但し、Ｌは分析のトータル時間及び４σはピーク幅、としてのＨＰＬＣの性能の理論値）は、各ＲＰＬＣフラクションにつき４０と計算され、ＩＥＣ−ＲＰＬＣ法の５つのステップのピーク容量は、約２００であった。本実施例では、各ＲＰＬＣサイクルで約３−５０ピーク、合計で１２９ピークであった（図６）。
【００４６】
微量タンパク質を検出するために、ＩＥＣの段階溶離ステップを増やしてピーク容量を増加させた。未処理及びＤｅｘ処理ラットから得られたＲＰＬＣクロマトグラムの全ての蛍光ピークを比較した。その結果、５本の蛍光ピークが１．８以上増加し、３本の蛍光ピークがＤｅｘ処理で約１．５倍減少したことが見出された（表２）。表２に、Ｄｅｘ投与２日後の発現タンパク質の変化を示した。これらのタンパク質（即ち、標的発現タンパク質）は、広い小孔を有するＲＰＬＣ（３０ｎｍ小孔径）で分離され、トリプシンで分解し、各ペプチド混合物とした。各ペプチド混合物は、通常の小孔を有するＲＰＬＣ（１０ｎｍ小孔径）に供し、ＭＳ／ＭＳ分析した。データベース照合により、Ｄｅｘ処理後２日で増加したピークは、各々、膵臓ポリペプチド、プロインシュリン２、７８ＫＤグルコース−調節タンパク質、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質、及びチオレドキシンであり、減少したピークは、各々、プロテイン３１、ｄｎａｋ−タイプ分子シャペロンｈｓｐ７２−ｐｓｌ、及びインシュリンであった。
【実施例４】
【００４７】
本実施例では、以下の化９の（１）及び（２）の反応式により、新規蛍光誘導体化試薬の合成を行った。
【００４８】
【化９】
【００４９】
（１）ＤＡＡＢ−Ｃｌの合成
４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＤ−Ｃｌ）（１２６．５３ ｍｇ）をＣＨ３ＣＮに溶解し、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅを滴下し、ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅを加えた。室温で約１０分間攪拌後、反応液を減圧乾固した後、シリカゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２）で精製し、４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙ ｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）（２０．２ｍｇ，８７．４％）を得た。
得られた化合物の確認データを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：７．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５），７．６５（１Ｈ，ｄ， Ｊ＝７．５），３．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７），２．３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７）， ２．０２（６Ｈ，ｓ）。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３０５（Ｍ＋Ｈ）＋
【００５０】
（２）ＴＡＡＢＤ−Ｃｌの合成
４−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＤ−Ｃｌ）（１２６．５３ ｍｇ）をＣＨ３ＣＮに溶解し、Ｈ２Ｏに溶かしたａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅを滴下し、ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅを加えた。室温で約２０分間攪拌後、反応液を減圧乾固した後、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶かし、ＯＤＳカラムを用いて分取し、画分には、ＳＢＤ−Ｃｌ（化１０）が不純物として入っていたため、陰イオン交換カラムを用いて分取し、減圧乾固して、７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎｅａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ）（１２７．２ｍｇ，５８．８ ％）を得た。
得られた化合物の確認データを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：８．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３），７．６９（１Ｈ，ｄ， Ｊ＝７．３），３．４６−３．４８（４Ｈ，ｍ），３．１２（９Ｈ，ｓ）。ＥＳＩ−ＭＳ ：ｍ／ｚ３１９（Ｍ）＋
【００５１】
【化１０】
【実施例５】
【００５２】
本実施例では、新規蛍光誘導体化試薬の反応性について検討した。
ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、ＴＡＡＢＤＤ−ＣｌのＳＢＤ−Ｆとの比較
１０μＭ還元型グルタチオン、システイン、ホモシステイン混合液１００μＬとＤＡＡＢＤ−Ｃｌ又はＴＡＡＢＤ−Ｃｌ １００μＬを混合し、ｐＨ９、４０℃、１０〜１２０分間反応させた。尚、各試薬は５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１０Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ ９）に溶解した。０．１％ぎ酸で反応停止後、生成物をＨＰＬＣを用いて測定した。
【００５３】
図７に、蛍光誘導体化反応時間と蛍光強度との関係（左図：ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、右図：ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ）を示す。
ＳＢＤ−Ｆ（化１１）の場合、４０℃で誘導体化を行うと１２０分間の反応時間が必要であったが、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌは１０〜２０分、ＴＡＡＢＤ−Ｃｌは２０〜３０分で反応が終了することがわかった。
したがって、反応時間はＤＡＡＢＤ−Ｃｌの場合は２０分、ＴＡＡＢＤ−Ｃｌの場合は３０分が好適である。
【００５４】
【化１１】
【００５５】
（２）新規蛍光誘導体化試薬のＭＳでの感度
上記（１）で作成したサンプルをＬＣ−ＭＳにより検出し、蛍光誘導体化試薬でラベル化していないもの及びＳＢＤ−Ｆで誘導体化したものと、相対強度を比較した。
【００５６】
蛍光誘導体化試薬でラベル化していないｃｙｓｔｅｉｎｅ、ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ、ＧＳＨの高さをそれぞれ１としたときの相対強度は表３の通りであった。これより、ＤＡＡＢＤ−ＣｌがＭＳでの感度が最も高いことがわかった。また、移動相が酸性であるので、ＤＡＡＢＤ化誘導体はプラスに荷電され水溶性であると考えられる。
【００５７】
【表３】
【実施例６】
【００５８】
（１）ＴＡＡＢＤ−Ｃｌのペプチドへの応用
１０μＭの以下に示した４種類のペプチド標品、１７．５ｍＭ ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ、１０ ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＣＨＡＰＳ（界面活性剤）、２．５ｍＭ ＴＣＥＰ（還元剤）それぞれ５０μＬを混合し、ｐＨ９．０、４０℃で、３０，６０，９０，１２０分間反応させた。尚、各試薬は６．０Ｍ 塩酸グアニジン（タンパク変性剤）を含む０．１０ Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。生成したＴＡＡＢＤ化ペプチドをＨＰＬＣを用いて測定した。
１． ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ
２． ｏｘｙｔｏｃｉｎ
３． ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ
４． ａｍｙｌｉｎ（ｒａｔ）
図８に ＴＡＡＢＤ−Ｃｌとの反応時間と蛍光強度との関係を示す。
図８より、反応時間が６０分までは生成量が増加した。反応停止後は氷冷下で保存し、−２０℃にて保存すると、４８時間はほとんど分解しなかった。
【００５９】
（２）ＤＡＡＢＤ化ペプチド・タンパクの検出限界
表４に示した１０種類のペプチド・タンパク質標品１０μＭ混合液、２．５ｍＭ ＴＣＥＰ、１７．５ｍＭ ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＣＨＡＰＳそれぞれ５０μＬを混合し、ｐＨ９．０、４０℃で、３０分間反応させた。尚、各試薬は６．０ Ｍ 塩酸グアニジンを含む０．１０Ｍ ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。生成したＤＡＡＢＤ化ペプチド・タンパク質はＨＰＬＣを用いて測定し、蛍光検出の検出限界をＳＢＤ−Ｆと比較した。
【００６０】
【表４】
【００６１】
（３）ＤＡＡＢＤ化ペプチド・タンパク質の同定
上記（２）で誘導体化した物質のうち、ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ、ｏｘｙｔｏｃｉｎ、ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ、ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、ａｍｙｌｉｎはＬＣ−ＭＳにより同定できた。それらの分子量を以下に示す。
ｍ／ｚ ５４１．８（Ｍ＋３Ｈ）３＋［ＤＡＡＢＤ−ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ］
５１６．０（Ｍ＋３Ｈ）３＋［ＤＡＡＢＤ−ｏｘｙｔｏｃｉｎ］
７２６．６（Ｍ＋３Ｈ）３＋［ＤＡＡＢＤ−ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ］
９８９．９（Ｍ＋４Ｈ）４＋［ＤＡＡＢＤ−ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ］
８９２．８（Ｍ＋５Ｈ）５＋［ＤＡＡＢＤ−ａｍｙｌｉｎ］
【００６２】
これら全ての分子量は、それぞれのペプチドの２つのシステイン残基にＤＡＡＢＤが付加したとしたときの分子量であり、多価イオンピークの検出結果よりＤＡＡＢＤ−Ｃｌによる誘導体化において、これらのペプチドのシステイン残基間のＳ−Ｓ結合が還元され、二つのチオール基両方に試薬が反応したことがわかった。
また、タンパク質の場合は酵素によってペプチドに分解する必要があるため、酵素トリプシンで消化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ検出及びＭＡＳＣＯＴによるデータベース検索を行って同定を試みた結果、システインを含まないペプチドのアミノ酸配列も併せて決定し、タンパク質を同定することができた。
【実施例７】
【００６３】
（ＳＢＳｅＤ−Ｆの合成）
２−ｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｎｉｌｉｄｅを硝酸で処理して、１−ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ−２−ｎｉｔｒｏ−６−ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅとし、これを脱アセチル化して、２−ｆｌｕｏｒｏ−６−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｌｉｎｅとし、次いで、パラジウム担持炭素触媒を用いて水素化して、３−ｆｌｕｏｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅを得た。
Ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｄｉｏｘｉｄｅエタノール加熱溶液を、３−ｆｌｕｏｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（６０ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）のエタノール加熱溶液に加え、混合物を３０分加熱した。これを、シリカゲルカラムによるクロマトグラフィーに供し、溶離液のジクロロメタンで溶出し、４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅを白色粉末（８８ｍｇ）として得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
ｍｐ．１２９℃、ＮＭＲ（ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）：δＨ７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２）、７．４１（１Ｈ，ｍ）、７．０６（１Ｈ，ｍ）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２０２．８［（Ｍ＋Ｈ）］。
【００６４】
このようにして得た４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅをｆｕｍｉｎｇ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ（６０％）に溶かし、１３０℃で３時間還流した。この溶液を冷却し、冷水（３０ｍｌ）に注ぎ、２８％ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅで中和した。この中性溶液にエタノール１００ｍｌを加え、濾過物を減圧乾固させた。残渣を水（１．０ｍｌ）に溶解し、更に、以下のＨＰＬＣで精製した。即ち、残渣の１００μｌをＨＰＬＣ分離に供した。ＨＰＬＣカラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ、１５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．、東ソー、溶離液：蒸留水、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２８０ｎｍ。ＳＢＳｅＤ−Ｆに相当するフラクションを集め、減圧して白色粉末（５０ｍｇ）を得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
ｍ．Ｐ．＞３００℃、ＮＭＲ（ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）：δＨ７．９７（１Ｈ，ｄ ｄ，Ｊ＝７．６，Ｊ＝５．４）、７．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．６，Ｊ＝１０．１）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２８０．８［（Ｍ−Ｈ）］。
【実施例８】
【００６５】
（ＳＢＴｈＤ−Ｆの合成）
Ｎ−ｔｈｉｏｎｙｌａｎｉｌｉｎｅ（０．４９ｇ，３．５ｍｍｏｌ）を３−ｆｌｕｏｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（２００ｍｇ，１．６ｍｍｏｌ）トルエン（２ｍｌ）溶液に加えた。反応混合物を１００−１２０℃で４時間加熱し、溶媒を濾別した後、残渣をジクロロメタンに溶かし、溶液を１０％ＨＣｌ溶液及び水で各々洗浄した。有機相を乾燥し、減圧乾固させた。これをシリカゲルによるクロマトグラフィーに供し、溶離液のクロロホルムで溶出し、４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅを淡黄色油として得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
ＮＭＲ（ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）：δＨ７．６９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９）、７．５０（１Ｈ，ｍ）、７．２０（１Ｈ，ｍ）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ１５４．９［（Ｍ＋Ｈ）］。
【００６６】
このようにして得た４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ（３０ｍｌ）をｆｕｍｉｎｇ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ（６０％）に溶かし、１３０℃で３時間還流した。次いで、この溶液を冷却し、ゆっくり冷水（３０ｍｌ）に注ぎ、２８％ａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅで中和した。中性溶液にエタノール１００ｍｌを加え、得られた濾過物を減圧乾固した。残渣を水（１．０ｍｌ）に溶かし、更に、以下の条件でＨＰＬＣで精製した。ＳＢＴｈＤ−Ｆに相当するフラクションを集め、減圧し、白色粉末（２５ｍｇ）を得た。得られた化合物の確認データを以下に示す。
ｄｅｃｏｍｐ．２６５℃、ＮＭＲ（ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）：δＨ８．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．９，Ｊ＝４．９）、７．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．９，Ｊ＝９．８）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ２３２．８［（Ｍ−Ｈ）］。
上記方法により合成したＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆを下記の化１２に示す。
【００６７】
【化１２】
【実施例９】
【００６８】
（１）システイン誘導体の蛍光スペクトル
１ｍＭＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）による上記ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＳＢＴｈＤ−Ｆ又はＳＢＤ−Ｆの各蛍光試薬溶液（４ｍＭ）の５００μｌ部分を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）によるシステイン（０．４ｍＭ）溶液の同量と混合した。この混合物を６０℃で８時間放置した。反応の後、反応混合物をＨＰＬＣ分離し、各システイン誘導体に相当するフラクションを集め、それらの蛍光スペクトルを測定した。
【００６９】
ＳＢＳｅＤ−ＦとＳＢＴｈＤ−Ｆのシステインに対する反応性
４ｍＭの各試薬、ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＳＢＴｈＤ−Ｆ又はＳＢＤ−Ｆ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０又はｐＨ１０）の５００μｌ部分を、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０又はｐＨ１０）によるシステイン溶液（０．４ｍＭ）の同量と混合した。反応混合物をＨＰＬＣ分離し、６０℃での反応をモニターした。
【００７０】
（２）結果
ＳＢＤ−Ｆのような水溶性試薬は、そのｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ残渣により水溶体中での誘導体の可溶性を増加させ、結果として、誘導体の吸収又は沈殿が減少する。したがって、インシュリンのような比較的疎水性ペプチドのＳＢＤ−Ｆによる誘導体は、逆相カラムで溶出され、高感度に検出されたが、本実施例では、更に、ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ又はｂｅｎｚｏｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ骨格をもつ蛍光試薬としてＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆを合成し、それらのシステインに対する反応性及びその誘導体の蛍光特性を調べた。
【００７１】
最大励起（λｅｘ）及び発光波長（λｅｘ）、及び誘導体の保持時間を表５に示す。各システイン誘導体の質量数（［Ｍ＋Ｈ］）は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（ｍ／ｚ３８１．９）、ＳＢＴｈＤ−Ｆ（ｍ／ｚ３３４．０）及びＳＢＤ−Ｆ（ｍ／ｚ３１８．０）について、理論値（各々３８２．０、３３４．０及び３１８．０）と一致した。誘導体の最大励起波長は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（３４０ｎｍ）及びＳＢＴｈＤ−Ｆ（３１５ｎｍ）はＳＢＤ−Ｆ（３６５ｎｍ）より短く、誘導体の最大発光波長は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（５４２ｎｍ）は、ＳＢＳｅＤ−Ｆ（５１７ｎｍ）及びＳＢＤ−Ｆ（５１４ｎｍ）よりも長かった。ＳＢＳｅＤ−Ｆ自体は蛍光が少ないが、ＳＢＴｈＤ−Ｆは多少の蛍光を与えた（λｅｘ；３５０ｎｍ，λｅｍ：４２４ｎｍ）。ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＳＢＴｈＤ−Ｆ及びＳＢＤ−Ｆのシステイン誘導体の逆相カラム（Ｃ１８）に対するｐＨ２．０の移動相による保持時間（ｔＲ）は、各々４．５、５．３及び４．８分であった。これから、ＳＢＳｅＤ−Ｆは、これらの中で最も高い親水性の蛍光試薬であった。
【００７２】
ＳＢＤ−Ｆの場合、至適反応条件は６０℃でｐＨ９．５で１時間であるが、ＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆの反応性は、ＳＢＤ−Ｆと比べて低く、蛍光強度は８−２４時間で徐々に増加し（図９、１０）、２４時間後でも、反応は最大に達しなかった（図９）。ｐＨ１０．０及び６０℃では、ＳＢＳｅＤ−Ｆ又はＳＢＴｈＤ−Ｆとシステインの量的反応時間は、８時間以上であり、ＳＢＤ−Ｆでは、１時間以内で完全に反応した（図１０）。
このように、水溶性の蛍光試薬ＳＢＳｅＤ−Ｆ及びＳＢＴｈＤ−Ｆは、ＳＢＤ−Ｆと比べて蛍光特性及び疎水性の点で異なっており、プロテオーム解析のための新規蛍光誘導体化試薬として有用である。
【実施例１０】
【００７３】
ＤＡＡＢＤ−Ｃｌによる線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）タンパク質の誘導体化及び同定
（１）方法
線虫（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｎ２株）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯＰ５０株を栄養源として２０℃で、ＮＧＭ寒天上に培養し、Ｍ９バッファーにより浮遊させてバクテリアから分離した。上記線虫をＭ９バッファーで２回洗った後、−８０℃で保管して用いた。この線虫を等量の１０ｍＭ ＣＨＡＰＳに懸濁し、超音波で溶解した。可溶性のフラクションを４℃で１０，０００ｒｐｍ、５分の遠心分離により集めた。上澄を可溶性フラクションとして−２０℃で保管した。このフラクションのタンパク質濃度をＢＳＡを標準に用いるＢｒａｄｆｏｒｄ ｍｅｔｈｏｄで決定した。上澄の約２０μＬ（１００μｇタンパク質）を同容量の２．５ｍＭ ＴＣＥＰ，１７．５ｍＭ ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ ＥＤＴＡ及び５０ｍＭ ＣＨＡＰＳを６．０Ｍグアニジンを含む１００ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）中で混合した。反応混合物を４０℃で３０分インキュベートした後、反応を２００μＬの０．１％ギ酸で停止し、次いで、反応混合物（１０μｇタンパク質）の３０μＬをＨＰＬＣシステムに注入した。
【００７４】
ＲＰカラムがＰＲＯＴＥＩＮ（３０ｎｍ孔径、２５０×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．）（Ｉｍｔａｋｔ）、移動相が溶離液（Ａ）０．１％トリフルオロ酢酸及び溶離液（Ｂ）水／ＣＨ３ＣＮ／トリフルオロ酢酸（７０／３０／０．１）、グラジエントシステムが流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで１００分かけて３０から７０％Ｂの条件でＨＰＬＣを行った。蛍光検出は５０８ｎｍ、励起波長は３８７ｎｍで行った。同定のために、蛍光タンパク質誘導体のいくつかのピークフラクションを分離し、減圧下に１０μＬに濃縮した。各フラクションは、２μｇ／ｍＬトリプシン及び１．０ｍＭ塩化カルシウムを含む９０μＬの５．０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ７．８）で希釈し、３７℃で２時間インキュベートした。各タンパク質加水分解ペプチド混合物を直接エレクトロスプレーイオントラップ質量分析装置を用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。クロマトグラフィーは、ＨＰ１０９０シリーズＩＩシステム及びＣａｄｅｎｚａ ＴＣ−１８ ｃｏｌｕｍｎ（１２ｎｍポーラスシリカ、１００×２．０ｍｍ ｉ．ｄ．）のカラムを用いて実施した。移動相は溶離液（Ａ）１．０ｍＭギ酸アンモニウム及び溶離液（Ｂ）１．０ｍＭギ酸アンモニウム／ＣＨ３ＣＮ（５０／５０）とした。グラジエント溶出は、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで６０分かけて０から１００％で行った。タンパク質の同定は、システインのチオール残基に結合したＤＡＡＢＤを記憶するＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，Ｕ．Ｋ．）データベースサーチアルゴリズムを用いてＮＣＢＩｎｒデータベースより行った。
【００７５】
（２）結果
図１１は、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌで誘導体化した、線虫の可溶性フラクションから得られたタンパク質（約１０μｇ）のクロマトグラムを示す。本実施例では、タンパク質の分離、トリプシンによる加水分解及び任意に選択されたピークフラクションのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ同定により、１０種類のタンパク質が同定された。
図中、１はリボゾームタンパク質Ｓ３ａ（ＭＷ＝２８９４２）、２はカルレティキュリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ）前駆体（ＭＷ＝４５５８８）、３はリボゾームタンパク質Ｌ１（ＭＷ＝３８６３５）、４は伸長因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）１−アルファ（ＭＷ＝５０６３６）、５はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＷ＝３５０９８）、６は４０Ｓリボゾームタンパク質（ＭＷ＝２２０４４）、７はビテロゲニン（ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）（ＭＷ＝１９３０９８）、８はアルギニンキナーゼ（ＭＷ＝４１９６９）、９はＨＳＰ−１熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）７０ｋｄタンパク質Ａ（ＭＷ＝６９６８０）及び１０はリボゾームタンパク質Ｌ７Ａｅ（ＭＷ＝１３９９２）を示す。本実施例では、任意に選択された１０種類のタンパク質が同定されたが、本発明では、同様にして、他のタンパク質の同定をすることが可能である。
【実施例１１】
【００７６】
７−クロロ−Ｎ−（２−ジメチルアミノプロピル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルフォンアミド
４−クロロ−７−クロロスルフォニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（０．２５ｇ、０．９９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８ｍｌ）に溶解し、室温で撹拌した。次いで、これにＮ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン（０．２１ｍｌ、１．４９ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．２１ｍｌ、１．４９ｍｌ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、次いで、減圧で濃縮した。残渣をクロロホルムに溶解し、飽和アンモニウムクロライド水溶液及び塩水で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（１０％メタノール／クロロホルム）で精製し、生成物を得た。得られた固体をメチレンクロライド及びジイソプロピルエステルから再結晶し、明るい黄色の小板状の生成物（０．２２ｇ、０．６６ｍｍｏｌ、６７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）δ７．９７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），３．０５（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．４８（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，２Ｈ），２．３３（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，４Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）δ１４８．７７，１４５．００，１３３．４０，１２９．１５，１２７．８８，１２７．４７，５１．１４，４６．０９，４０．４５，１１．３６；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３４４６，３２０９，３１０１，２９７６，２８１７，１５２５，１３４７，１１６４．
【実施例１２】
【００７７】
４−クロロ−７−クロロスルフォニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（０．２１ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（８ｍｌ）に溶解し、０℃で撹拌した。次いで、これにＮ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミン（０．２０ｍｌ、１．２５ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．１７ｍｌ、１．２５ｍｌ）を加えた。反応混合物を３０分間撹拌し、次いで、減圧で濃縮した。残渣をクロロホルムに溶解し、飽和アンモニウムクロライド水溶液及び塩水で洗浄し、有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧で濃縮した。残渣をシルカゲルクロマトグラフィー（１０％メタノール／クロロホルム）で精製し、明るい黄色固体の生成物（０．１０ｇ、０．２９ｍｍｏｌ、３５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，５００ＭＨｚ）δ８．０６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），３．１９（ｍ，８Ｈ），１．９３（ｍ，２Ｈ），１．３２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１２５ＭＨｚ）δ１５０．３９，１４６．６６，１３５．５８，１３１．３３，１２９．３３，１２８．１０，５０．４１，４１．２１，２５．６９，９．２６；ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）３５０１，３４２８，３２０９，２９７３，２７３３，２６７５，１５２４，１３３８，１１６０．
【実施例１３】
【００７８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６の合成
ジメチルアンモニウムクロライド−ｄ６（２．４６ｇ）及びブロモアセトニトリル（３．３７ｇ）をジエチルエーテル（２０ｍｌ）に溶解した。１０℃でこれに５０％ＮａＯＨ（４．５ｇ）を添加した後、混合物を同じ温度で２時間撹拌した。エーテル層を分離し、水層をエーテル（１０ｍｌ×３）で抽出した。合体したエーテル層をＭｇＳＯ４で乾燥し、次いで、減圧で濃縮してＮ，Ｎ−ジメチルアミノアセトニトリル−ｄ６溶液（１０ｇ）を得て、次いで、それを１０℃でテトラハイドロフラン（４０ｍｌ）中のＬｉＡｌＨ４（１．２８ｇ）及びスルフォン酸（１．６９ｇ）の混合物に加えた。反応混合物を室温で１３時間よく撹拌、混合した。これにエーテル（３０ｍｌ）を加えた後、混合物をＮａＯＨ（水６ｍｌに４ｇ溶解）で処理した。エーテル層を分離し、水層をエーテル（１０ｍｌ×２）で抽出した。合体したエーテル層をＭｇＳＯ４で乾燥し、次いで、（５ｇになるまで）減圧濃縮した。残渣を希釈し、フラクション（７０−８０℃）を合わせて、１．７９ｇ（収率５２．５％）のＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６（７７．４％ ＴＨＦ溶液）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１．８２−１．８８（１．５４Ｈ，ｍ ｆｏｒ ＴＨＦ，４Ｈ），２．３３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），２．７７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．７２−３．７６（１．４８Ｈ，ｍ ｆｏｒ ＴＨＦ，４Ｈ）
【実施例１４】
【００７９】
７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルフォニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）の合成
４−クロロ−７−クロロスルフォニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（３．２８ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６０ｍｌ）に溶解した。この溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６（１．０ｇ）及びトリエチルアミン（１．９２ｍｌ）を各々加えて、氷で冷却して、同じ温度に１時間保持し、室温で１．５時間撹拌、混合した。次いで、反応混合を減圧濃縮し、残渣をＡｃＯＥｔに溶解した。エチルアセテート溶液を飽和ＮａＨＣＯ３、蒸留水、飽和ＮａＣｌ溶液で各々洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。ろ過した溶液を減圧濃縮し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（５０：１）を溶出液としてシリカゲルカラムで精製した。溶出した溶液を減圧乾燥し、残渣をＥｔＯＨ−ＡｃＯＥｔで再結晶して１．３６ｇ（収率４１．３％）のＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６：ｍｐ、１１０℃を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．１３（２Ｈ，ｍ），２．３３（２Ｈ，ｍ），ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ３１１（Ｍ＋Ｈ）＋，ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１；１３４２ａｎｄ１１６６．
【実施例１５】
【００８０】
７−フルオロ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルフォンアミド（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）の合成
７−フルオロ−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルフォニルクロライド（７５ｍｇ）を３ｍｌのアセトニトリルに溶解した。これに、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−（２２ｍｇ）及びトリエチルアミン（３５μｌ）を加えた後、混合物を氷の上で３０分間撹拌した。反応混合を減圧で関そうし、残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し，ＣＨ２Ｃｌ２−ＣＨ３ＯＨ（９３：７）を用いてシリカゲルクロマトグラフィーに供し、７−フルオロ−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルフォンアミド（４９ｍｇ、５６％）を赤い粉末として生成した。ｍｐ：１１７−１２０℃。１Ｈ−ＮＭＲδＨ８．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．９３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），２．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），１．９８（６Ｈ，ｓ）ｉｎ ＣＤ３ＯＤ；ＥＳＩ−ＭＳｍ／ｚ３５３［（Ｍ＋Ｈ）＋］
【実施例１６】
【００８１】
（１）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆによる低分子量チオールの誘導体化反応及び誘導体の蛍光特性
１ｍＭ（システイン、ホモシステイン、アラニン、セリン、又はグルタチオン）溶液の２０μＬを、同容量の２．５ｍＭＴＣＥＰ、１７．５ｍＭＤＡＡＮＳｅＤ−Ｆ、１０ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ及び５０ｍＭＣＨＡＰＳと混合した。各試薬は、６．０Ｍグアニジンを含む１００ｍＭホウ酸バッファーに溶解した。反応混合物を４０℃で１０−１２０分間加熱し、反応を０．１％トリフルオロ酢酸の２００μＬで停止した。混合溶液を３００μＬのメタノールで希釈し、蛍光スペクトルを蛍光スペクトロメーターで測定した。その結果、最大励起波長は約４２０ｎｍ、最大蛍光波長は約５４０ｎｍであった。
【００８２】
（２）低分子量チオールのＤＡＡＢＳｅＤ−誘導体の分離及び同定
０．１％トリフルオロ酢酸で反応を停止した上記反応混合物の１０μＬをＨＰＬＣシステムに供した。ＨＰＬＣシステムは、ポンプ（Ｌ−７１００、日立社製）、分離カラムＴＳＫｇｅｌ１２０−ＴＱＡ（内径２５０×４．６ｍｍ）（東ソー社製）及び蛍光検出器（ＦＬ−２０２５、ジャスコ社製）で構成した。蛍光検出は５４０ｎｍで、励起波長は４２０ｎｍで行った。移動相は、１５０ｍＭリン酸バッファー／ＣＨ３ＣＮ（９４／６）であり、流速は０．７５ｍｌ／分とした。
同定のために、反応混合物をＨＰ１０９０シリーズＩＩシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（ＧｍｂＨ）のカラムに直接注入して、エレクトロスプレー法によるＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。クロマトグラフィーは、Ｃａｄｅｎｚａ ＴＣ−１８カラム（シリカの１２ｎｍ孔、内径１００×２．０ｍｍ）（Ｉｍｔａｃｔ（株））で行った。移動相は、０．１％ギ酸の溶出液（Ａ）及び水／ＣＨ３ＣＮ／ギ酸（５０／５０／０．１）の溶出液（Ｂ）で構成した。０から１００％Ｂで流速０．２ｍｌ／分で１５分間グラジエント溶出を行った。このとき得られたクロマトグラムは、システイン、ホモシステイン、グルタチオンの３つのピークを与えた。
【００８３】
（３）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆによるペプチド及びタンパク質の誘導体化反応
１００μＭのペプチド及びタンパク質（インシュリン、トリプシン阻害剤、α−酸グリコプロテイン、カルボニックアンヒドラーゼ、α−ラクトアルブミン）溶液又は１０μＭ ＢＳＡ溶液の２０μＬを同容量の２．５ｍＭ ＴＣＥＰ、１７．５ｍＭ ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ（比較として）、１０ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ及び５０ｍＭ ＣＨＡＰＳと混合した。各反応混合物を６．０Ｍグアニジンを含む１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶解した。各反応混合物を４０℃で６０分間（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）又は２０分間（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）加熱し、反応を０．１％トリフルオロ酢酸の２００μＬで停止した。混合物をメタノール３００μＬで希釈し、蛍光スペクトルを蛍光スペクトロメーターで測定した。その結果、最大励起波長は約４２５ｎｍ、最大蛍光波長は約５３５ｎｍであった。
【００８４】
（４）ペプチド及びタンパク質のＤＡＡＢＳｅＤ誘導体の分離
メタノールを除いた上記反応混合物の５５μＬをＨＰＬＣカラムに供した。ＨＰＬＣシステムは、ポンプ（Ｌ−７１００、日立社製）、タンパク質用のＲＰカラム（３０ｎｍ孔サイズ、内径２５０×４．６ｍｍ）（Ｉｍｔａｃｔ社製）及び蛍光検出器（ＦＬ−２０２５、ジャスコ社製）で構成した。蛍光検出は、５５０ｎｍ（励起波長４５０ｎｍ）（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）又は４９０ｎｍ（励起波長３７０ｎｍ）（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）で行った。溶出液（Ａ）は、水／ＣＨ３ＣＮ／トリフルオロ酢酸（９０／１０／０．１）からなり、溶出液（Ｂ）は、水／ＣＨ３ＣＮ／トリフルオロ酢酸（３０／７０／０．１）で構成した。０から１００％Ｂで流速０．５ｍＬ／分で２００分間のグラジエント溶出を行った。
【００８５】
（５）異なる波長でのタンパク質誘導体のＨＰＬＣ分離・定量及びタンパク質の同定
α−ラクトアルブミンを含み、１０ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＣＨＡＰＳ、２．５ｍＭＴＣＥＰ、６．０Ｍグアニジンを含む混合溶液を２つの部分に分け、試料Ａには１μＭのα−ラクトアルブミン及び試料Ｂには２μＭのα−ラクトアルブミンを含むように調整した。試料ＡはＤＡＡＢＤ−Ｃｌと４０℃で２０分間反応させ、試料ＢはＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆと４０℃で３０分間反応させ、両者の反応溶液を再度混合した。混合物を２つの蛍光検出器に直列に連結したＨＰＬＣに供した。一つは、３７０ｎｍで励起して蛍光波長４９０ｎｍでＤＡＡＢＤ誘導体をモニターし、もう一つは、４５０ｎｍで励起して蛍光波長５５０ｎｍでＤＡＡＢＳｅＤ誘導体をモニターした。ＨＰＬＣシステムは上記（４）と同じである。
【００８６】
タンパク質の同定のために、試料Ａ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＤ誘導体及び試料Ｂ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＳｅＤ誘導体に相当するピークフラクションを合体し、ｐＨ７．８に調整し、トリプシンで加水分解した。次いで、得られたペプチド混合物を窒素ガスで濃縮し、タンパク質同定アルゴリズムを備えた、シスラインのチオール基に結合したＤＡＡＢＤ（ＭＷ、３９００）又はＤＡＡＢＳｅＤ（ＭＷ、４５３９）を記憶しているＭＡＳＣＯＴを有するＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。クロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）及び分離カラム、Ｃａｄｅｎｚａ ＴＣ−１８カラム（シリカの１２ｎｍ孔、内径１００×２．０ｍｍ）（Ｉｍｔａｃｔ社製）、０．１％ギ酸の溶出液（Ａ）及び水／ＣＨ３ＣＮ／キ酸（５０／５０／０．１）の溶出液（Ｂ）で構成した。０から１００％Ｂで流速０．２ｍＬ／分で６０分間のグラジエント溶出を行った。その結果、実施例１０と同様にα−ラクトアルブミン（ＭＷ１６２２８）が同定できた。
【実施例１７】
【００８７】
（１）ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの合成
前述のように、ベンゾキサジアゾール試薬の、７−クロロ−Ｎ−[２−(ジメチルアミノ)エチル]−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルフォンアミド（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）は、感度のよい、選択的なチオール特異的試薬であり、プロテオミクス研究に有用である。ＤＡＡＢＤ−Ｃｌは、ペプチド及びタンパク質のチオールと反応して誘導体化し、３９０ｎｍの励起で５０２ｎｍで蛍光を発する。本実施例では、図１２の合成経路により、７−フルオロ−Ｎ−[２−（ジメチルアミノ）エチル]−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルフォンアミド（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）をＤＤＡＢＤ−Ｃｌのカウンターパートとして合成した。
【００８８】
本発明者は、７−フルオロ−２，１，３−ベンゾセレナジアゾール−４−スルフォネート（ＳＢＳｅＤ−Ｆ）及び７−フルオロ−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−スルフォネート（ＳＢＴｈＤ−Ｆ）をチオール特異的蛍光試薬として合成した。これらのシステインとの誘導体の蛍光波長は、各３４０ｎｍ及び３１５ｎｍの励起波長で、それぞれ５４２ｎｍ及び５１７ｎｍであった。対応するベンゾキサジアゾール試薬の、７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−スルフォネート（ＳＢＤ−Ｆ）は、３６５ｎｍの励起で５１４ｎｍで蛍光を発する誘導体を与える。ＳＢＳｅＤ−ＦとＳＢＤ−Ｆでの誘導体の最大波長の大きな相違にヒントを得て、本発明者は、ベンゾセレナジアゾール試薬、ＤＡＡＢＳｅＤ−ＦをＤＡＡＢＤ−Ｃｌのカウンターパートとして合成した（図１２）。
【００８９】
（２）チオールに対するＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの誘導体化反応の反応条件及び反応性
ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆによる低分子量チオール（システイン、ホモシステイン、グルタチオン、アラニン、セリン及びトリプシン）の誘導体化反応を４０℃（ｐＨ９．０）で行った。ペプチド及びタンパク質（インシュリン、α１−酸グリコタンパク質、トリプシン阻害剤、カルボニックアンヒドラーゼ、α−ラクトアルブミン、ＢＳＡ等）の場合、反応を促進するために、ＣＨＡＰＳ及びグアニジンの存在下で行った。予測したように、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆは、アラリン（アミノ及びカルボキシル基を含む）セリン（アミノ、カルボキシル及び水酸基を含む）及びチロシン（アミノ、カルボキシル、フェノール性水酸基を含む）のようなチオールを含まない化合物との反応では蛍光を示さなかった。これに対して、チオール化合物の場合には、蛍光を発し、その強度は３０分で最大に達したが、これは、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆはペプチド及びタンパク質と同様に低分子量のチオールと特異的に反応し、蛍光を生じ、反応速度は、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌと同様であることを示している。
【００９０】
（３）ＤＡＡＢＤ−Ｆと比較したＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ誘導体の蛍光特性
ＤＡＡＢＳｅＤ誘導体は、最大励起及び蛍光波長が、それぞれ４２３−４２９ｎｍ及び５２４−５４２ｎｍの範囲にあることを示した（表５）。
【００９１】
【表５】
【００９２】
（４）ＬＣ−ＭＳによるチオールのＤＡＡＢＳｅＤ誘導体の同定及び検出
ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆで誘導体化したチオール混合物をエレクトロスプレーイオントラップ質量分析計を備えたＨＰＬＣに供した。各チオールについて単一ピークが得られた。マススペクトルから、各低分子量チオールのＤＡＡＢＳｅＤ誘導体が、システイン（ＭＷ＝１２１）、ホモシステイン（ＭＷ＝１３５）及びグルタチオン誘導体（ＭＷ＝３０７）について、ベースイオンピークがｍ／ｚ＝４５４（Ｍ＋Ｈ）＋、４６８（Ｍ＋Ｈ）＋及び６４０（Ｍ＋Ｈ）＋として検出された。本実験では、用いたエレクトロスプレー法による分子イオン検出の限界（ＭＷが３０００以下）のため、タンパク質のＤＡＡＳｅＤ誘導体の同定は困難であった。
【００９３】
（５）ＤＡＡＢＳｅＤで誘導体化したペプチド及びタンパク質の検出限界
ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆで誘導体化したタンパク質から得られるクロマトグラムは、各誘導体の単一ピークを示し、重なるピークは観察されなかった。試薬自体は蛍光を発しないので、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆピークは現れなかった。上述の誘導体のピーク高さは、注入量に比例した。バソプレシン、α−ラクトアルブミン及びＢＳＡの検出限界は、それぞれ、７．５、７．２、及び７．２ｆｍｏｌであった。これらの検出限界はＤＡＡＢＤ誘導体のものと同様であった。ＤＡＡＢＤ誘導体に比較して、ＤＡＡＢＳｅＤ誘導体は早く溶出したので、ＤＡＡＢＳｅＤ誘導体は、ＤＡＡＢＤ誘導体よりも、ＨＰＬＣ固定相に対する低い親和性を有していた。同様の傾向は、ＳＢＤ誘導体と比べて、ＳＢＳｅＤ誘導体についても観察された。
【００９４】
（６）ＤＡＡＢＳｅＤ及びＤＡＡＢＤ誘導体の同時検出
ＤＡＡＢＤ及びＤＡＡＢＳｅＤ誘導体を併用した、二つの誘導体の同時蛍光検出は、同一起源の異なる歴史を有する二つのタンパク質試料の比較を簡便にする。例えば、一方が病態患者試料で一方が健常者からの試料、あるいは、二つの細胞又は組織試料で、一方がある薬剤で処理され、他方が未処理のものが例示される。本実験では、試料Ａ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＤ誘導体の反応溶液と、試料Ｂ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＳｅＢＤ誘導体の反応溶液を合体し、二つの蛍光検出器に連結したＨＰＬＣに供した。それぞれの検出波長は、ＤＡＡＢＤ誘導体では３７０ｎｍの励起で４９０ｎｍで行い、ＤＡＡＳｅＢＤ誘導体では、４５０ｎｍの励起で５５０ｎｍで行なった。二つの誘導体は、クロマトグラムで各単一ピークを与えた。α−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＤ誘導体及びα−ラクトアルブミンのＤＡＡＳｅＢＤ誘導体の保持時間は、５３．３分、及び５０．０分であった。
【００９５】
試料Ａ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＤ誘導体は、観察されたが、試料Ｂ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＳｅＤ誘導体は観察されなかった。試料Ｂ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＳｅＤ誘導体は観察され、試料Ａ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＤ誘導体は観察されなかった。したがって、この方法で、試料Ａ中に存在するα−ラクトアルブミンと試料Ｂ中に存在するα−ラクトアルブミンを区別することができ、同じ試料中のそれらの量を計測し、比較することができる。
【００９６】
分離された相当するピークフラクションを合体した混合物をトリプシンのような酵素で処理することで、タンパク質の定量及び同定が可能であった。例えば、試料Ａ中のＤＡＡＢＤ誘導体及び試料Ｂ中のα−ラクトアルブミンのＤＡＡＢＳｅＤに相当する各ピークを合体し、トリプシンで分解し、得られたペプチド混合物を、２つの蛍光検出器に直結したＨＰＬＣにて分離・定量するとそのタンパク質（α−ラクトアルブミン）の定量が可能であり、更に得られたペプチド混合物をシステインのチオール残基に結合したＤＡＡＢＤ又はＤＡＡＢＳｅＤを記憶している、タンパク質の同定アルゴリズム、ＭＡＳＣＯＴを備えた、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。その結果、実施例１０と同様にα−ラクトアルブミン（ＭＷ１６２２８）が同定された。
【００９７】
本実験では、異なった試料Ａ及びＢ中のタンパク質α−ラクトアルブミンを取り上げ、比較した。これに対して、一つの試料中に多くの化合物が存在する実際のバイオ試料の、誘導化したタンパク質溶液を合体した混合物は、複雑なＨＰＬＣクロマトグラムのパターンを与えるので、クロマトグラムでタンパク質ピークを区別することは非常に困難になる。しかし、標的タンパク質の標準品があり、異なったクロマトフラフィー条件で二次元クロマトグラフィーを行なえば、二つのクロマトグラフィー上のタンパク質の二つの誘導体の保持時間を知ることができるので、クロマトグラム上でＤＡＡＢＤ−Ｃｌ及びＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆの各誘導体のピーク分画を分離した後、これらを合体したピークフラクションを第２のクロマトグラフィーで再クロマトすることにより、精製されたタンパク質の各誘導体が定量できる。更に、ピーク分画を上記の酵素処理、蛍光検出ＨＰＬＣ又はＬＣ−質量分析計に付し、異なった試料中のタンパク質の定量又は同定ができる。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
以上詳述したように、本発明は、微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法及びそのシステムに係るものであり、本発明により、遺伝子を介して発現する発現タンパク質及び／又はペプチドを簡便な方法及び手段で、高感度に検出・分離・同定することができる。本発明の方法により、従来法では検出できなかった微量の発現タンパク質及び／又はペプチドを短時間で、感度良く検出・分離・同定することができる。また、上記検出・分離・同定方法に使用する微量の発現タンパク質及び／又はペプチドの微量検出・分離・同定システムを提供することができる。本発明は、プロテオームのプラットフォーム技術を提供するものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】本発明の方法の操作工程の一例を示す。
【図２】界面活性剤の種類と蛍光誘導体の生成の度合いとの関係を示す。
【図３】本発明の方法により試験した蛍光誘導体タンパク質／ペプチドのそれぞれの蛍光ピークを示す。
【図４】酵素水解物の蛍光クロマトグラム（Ａ）、及びマスクロマトグラム（Ｂ）を示す。
【図５】ＭＳ／ＭＳによるマススペクトルを示す。
【図６】実施例３における逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）によるクロマトグラムを示す。
【図７】蛍光誘導体化の反応時間と蛍光強度との関係を示す（左図：ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ，右図：ＴＡＡＢＤ−Ｃｌ）。
【図８】ＴＡＡＢＤ−Ｃｌとの反応時間と蛍光強度との関係を示す。
【図９】新規蛍光試薬によるシステインの蛍光誘導体化（ｐＨ９．０）の反応時間とピーク領域との関係を示す。
【図１０】新規蛍光試薬によるシステインの蛍光誘導体化（ｐＨ１０．０）の反応時間とピーク領域との関係を示す。
【図１１】ＤＡＡＢＤ−Ｃｌで誘導体化した、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の可溶性フラクションが得られたタンパク質（約１０μｇ）のクロマトグラムを示す。
【図１２】ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｘの合成経路を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料中の発現微量タンパク質及び／又はペプチドを高感度に検出・分離・同定する方法であって、被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、これを蛍光検出により分離し、その蛍光画分を質量分析に付するか、又はその蛍光画分を酵素水解に付し、そのペプチド断片を分離し、その画分を質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供して発現タンパク質及び／又はペプチドの同定を行うことを特徴とする上記発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
【請求項２】
被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、ＨＰＬＣに付し、その蛍光分画を捕集した後、酵素水解に付し、その蛍光標識フラグメント及び非蛍光標識フラグメントを質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析して得られた各フラグメントのイオン分子量情報をタンパク質及び／又はペプチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識する、（２）それを１次元又は２次元のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光分画を捕集する、（３）上記蛍光分画を酵素水解に付する、（４）それを第二段階のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光クロマトグラムを得ると共に、その全ピークを質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質及び／又はペプチド試料の水溶液に、官能基特異的蛍光試薬を加え、場合により、界面活性剤及び／又はタンパク変性剤を加え、タンパク質及び／又はペプチドを蛍光標識する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
蛍光標識したタンパク質及び／又はペプチド試料を蛍光検出器付きイオン交換カラムＨＰＬＣ、逆相分配ＨＰＬＣ、ゲル濾過ＨＰＬＣ、又は電気泳動に代表される分離手段に付し、蛍光をモニターしながらそのピーク分画を捕集する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
蛍光分画を、各種ペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシンに代表されるタンパク質分解酵素を用いて酵素水解する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
酵素水解物を蛍光検出器付き逆相ＨＰＬＣに付し、蛍光ピークを検出すると共に、蛍光標識フラグメント及び蛍光非標識フラグメントの質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析を行う、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析に付して得られた各フラグメントのイオン分子量情報を、コンピューターによるタンパク質及び／又はペブチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析して、酵素水解以前のタンパク質及び／又はペプチドの同定を行う、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
被験試料が、生体試料から採取したタンパク質及び／又はペプチド試料である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質及び／又はペプチドフラグメント情報、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを用いてデータベース照合する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法に使用する発現微量タンパク質及び／又はペプチド検出・分離・同定システムであって、被験試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識するための第一反応器、蛍光試薬で標識した蛍光誘導体を蛍光分画するための１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、蛍光分画を酵素水解するための第二反応器、酵素水解物の蛍光標識フラグメントを蛍光検出するための第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを搭載した構造解析装置の１種又は２種以上を構成要素として含むことを特徴とする上記検出・分離・同定システム。
【請求項１２】
上記第一反応器、１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、第二反応器、第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣを直列に配置してなる、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを、蛍光誘導体化試薬として、下記の化１の一般式（１）
【化１】
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、−ＮＨＲ′（但、Ｒ′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキル）、又は−ＮＲ′′Ｒ′′′（但し、Ｒ′′はアルキル、Ｒ′′′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキルを示す。〕で表わされる化合物、又はその同位体化合物又は下記の化２の一般式（２）
【化２】
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物又はその同位体化合物、を用いて、蛍誘導体とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法でタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導化するために使用する蛍光誘導体化試薬であって、下記の化３の一般式（１）
【化３】
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、−ＮＨＲ′（但、Ｒ′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキル）、又は−ＮＲ′′Ｒ′′′（但し、Ｒ′′はアルキル、Ｒ′′′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキルを示す。〕で表わされる化合物、又はその同位体化合物又は下記の化２の一般式（２）
【化４】
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物又はその同位体化合物、を用いて、蛍誘導体とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
被検試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体化後、ＨＰＬＣで分離・検出し、分画後、酵素水解し、この水解物を直接質量分析で配列分析とタンパク質の同定を行なうことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
【請求項１６】
被検試料として、異なる試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドを、それぞれ蛍光波長の異なる少なくとも２つの蛍光誘導体化試薬でそれぞれ誘導体化後、蛍光検出器付きＨＰＬＣで分離・検出し、分画後、各蛍光ピークをそのまま又は合体して定量に供する、及び／又は各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物を定量に供する、又はこの水解物をＨＰＬＣ−質量分析に供し、同定を行なう、ことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
【請求項１７】
各蛍光ピークをそのまま又は合体してＨＰＬＣによる定量に供し、試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの各誘導体の比率を算出する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
水解物をＨＰＬＣによる定量に供し、試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの各誘導体の比率を算出する請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの第１の蛍光誘導体化試薬との反応物及び第２の蛍光誘導体化試薬との反応物を合体し、２つの励起・蛍光検出の可能なＨＰＬＣに供し、分画後、各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物をＨＰＬＣ−質量分析に供し、同定を行う請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
試料Ａ、Ｂが、２種類の細胞又は組織又は体液試料である請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
蛍光誘導体化試薬として、ＤＡＡＢＤ−Ｘ、ＤＡＡＳｅＢＤ−Ｘ、及びＤＡＡＴｈＢＤ−Ｘ（但し、ＸはCｌ又はＦ）のうちの励起・蛍光波長の異なる少なくとも２つの蛍光誘導体化試薬でタンパク質及び／又はペプチドを誘導体化する請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
蛍光波長の異なる蛍光誘導体化試薬として、ＤＡＡＢＤ−Ｘ、ＤＡＡＳｅＢＤ−Ｘ、又はＤＡＡＴｈＢＤ−Ｘ（但し、ＸはCｌ又はＦ）と、それらの各同位体を組み合わせて使用する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
酵素水解した試料を直接質量分析に付しペプチドマップを得ると同時に、蛍光試薬の有する骨格並びに電荷を活用して、蛍光標識化ペプチド断片を質量分析測定部で抽出してシステイン含有ペプチド部分の構造を取得し、これらを基にタンパク質及び／又はペプチドの同定を行なう請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
蛍光誘導体化試薬で誘導体化したタンパク質及び／又はペプチドを分解することなく分画することが可能な、少なくともミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、及びミクロ自動注入装置を具備したことを特徴とする自動分画装置。
【請求項２５】
少なくとも、ミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、酵素反応装置、及びミクロ自動注入装置を備え、任意に、質量分析（ＭＳ）システムを具備したことを特徴とする微量タンパク質の高性能・簡易定量・同定解析装置。
【請求項１】
被験試料中の発現微量タンパク質及び／又はペプチドを高感度に検出・分離・同定する方法であって、被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、これを蛍光検出により分離し、その蛍光画分を質量分析に付するか、又はその蛍光画分を酵素水解に付し、そのペプチド断片を分離し、その画分を質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供して発現タンパク質及び／又はペプチドの同定を行うことを特徴とする上記発現タンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
【請求項２】
被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体とした後、ＨＰＬＣに付し、その蛍光分画を捕集した後、酵素水解に付し、その蛍光標識フラグメント及び非蛍光標識フラグメントを質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析して得られた各フラグメントのイオン分子量情報をタンパク質及び／又はペプチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識する、（２）それを１次元又は２次元のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光分画を捕集する、（３）上記蛍光分画を酵素水解に付する、（４）それを第二段階のＨＰＬＣ／蛍光検出により、その蛍光クロマトグラムを得ると共に、その全ピークを質量分析に付し、データベース照合、構造解析に供する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質及び／又はペプチド試料の水溶液に、官能基特異的蛍光試薬を加え、場合により、界面活性剤及び／又はタンパク変性剤を加え、タンパク質及び／又はペプチドを蛍光標識する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
蛍光標識したタンパク質及び／又はペプチド試料を蛍光検出器付きイオン交換カラムＨＰＬＣ、逆相分配ＨＰＬＣ、ゲル濾過ＨＰＬＣ、又は電気泳動に代表される分離手段に付し、蛍光をモニターしながらそのピーク分画を捕集する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
蛍光分画を、各種ペプチダーゼ、トリプシン、キモトリプシンに代表されるタンパク質分解酵素を用いて酵素水解する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
酵素水解物を蛍光検出器付き逆相ＨＰＬＣに付し、蛍光ピークを検出すると共に、蛍光標識フラグメント及び蛍光非標識フラグメントの質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析を行う、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
質量分析又はＭＳ／ＭＳ分析に付して得られた各フラグメントのイオン分子量情報を、コンピューターによるタンパク質及び／又はペブチドフラグメントデータベースと照合し、構造解析して、酵素水解以前のタンパク質及び／又はペプチドの同定を行う、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
被験試料が、生体試料から採取したタンパク質及び／又はペプチド試料である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質及び／又はペプチドフラグメント情報、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを用いてデータベース照合する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法に使用する発現微量タンパク質及び／又はペプチド検出・分離・同定システムであって、被験試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光試薬で標識するための第一反応器、蛍光試薬で標識した蛍光誘導体を蛍光分画するための１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、蛍光分画を酵素水解するための第二反応器、酵素水解物の蛍光標識フラグメントを蛍光検出するための第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、及び蛍光試薬で標識したアミノ酸の情報を含んだデータベースを搭載した構造解析装置の１種又は２種以上を構成要素として含むことを特徴とする上記検出・分離・同定システム。
【請求項１２】
上記第一反応器、１次元又は２次元の蛍光検出器付きＨＰＬＣ、第二反応器、第二段階の蛍光検出器付きＨＰＬＣを直列に配置してなる、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
被験試料中のタンパク質及び／又はペプチドを、蛍光誘導体化試薬として、下記の化１の一般式（１）
【化１】
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、−ＮＨＲ′（但、Ｒ′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキル）、又は−ＮＲ′′Ｒ′′′（但し、Ｒ′′はアルキル、Ｒ′′′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキルを示す。〕で表わされる化合物、又はその同位体化合物又は下記の化２の一般式（２）
【化２】
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物又はその同位体化合物、を用いて、蛍誘導体とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法でタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導化するために使用する蛍光誘導体化試薬であって、下記の化３の一般式（１）
【化３】
〔式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｏ、Ｓｅ又はＳ、Ｒは、−ＮＨ２、−ＮＨＲ′（但、Ｒ′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキル）、又は−ＮＲ′′Ｒ′′′（但し、Ｒ′′はアルキル、Ｒ′′′はアルキル置換Ｎアルキル、ジアルキル置換Ｎアルキル又はトリアルキル置換Ｎアルキルを示す。〕で表わされる化合物、又はその同位体化合物又は下記の化２の一般式（２）
【化４】
（式中、Ｘは、ハロゲン、Ｙは、Ｓｅ又はＳを示す。）で表わされる化合物又はその同位体化合物、を用いて、蛍誘導体とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
被検試料のタンパク質及び／又はペプチドを蛍光誘導体化後、ＨＰＬＣで分離・検出し、分画後、酵素水解し、この水解物を直接質量分析で配列分析とタンパク質の同定を行なうことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
【請求項１６】
被検試料として、異なる試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドを、それぞれ蛍光波長の異なる少なくとも２つの蛍光誘導体化試薬でそれぞれ誘導体化後、蛍光検出器付きＨＰＬＣで分離・検出し、分画後、各蛍光ピークをそのまま又は合体して定量に供する、及び／又は各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物を定量に供する、又はこの水解物をＨＰＬＣ−質量分析に供し、同定を行なう、ことを特徴とするタンパク質及び／又はペプチドの検出・分離・同定方法。
【請求項１７】
各蛍光ピークをそのまま又は合体してＨＰＬＣによる定量に供し、試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの各誘導体の比率を算出する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
水解物をＨＰＬＣによる定量に供し、試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの各誘導体の比率を算出する請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
試料Ａ中及び試料Ｂ中のタンパク質及び／又はペプチドの第１の蛍光誘導体化試薬との反応物及び第２の蛍光誘導体化試薬との反応物を合体し、２つの励起・蛍光検出の可能なＨＰＬＣに供し、分画後、各蛍光ピークを合体して酵素水解に供し、この水解物をＨＰＬＣ−質量分析に供し、同定を行う請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
試料Ａ、Ｂが、２種類の細胞又は組織又は体液試料である請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
蛍光誘導体化試薬として、ＤＡＡＢＤ−Ｘ、ＤＡＡＳｅＢＤ−Ｘ、及びＤＡＡＴｈＢＤ−Ｘ（但し、ＸはCｌ又はＦ）のうちの励起・蛍光波長の異なる少なくとも２つの蛍光誘導体化試薬でタンパク質及び／又はペプチドを誘導体化する請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
蛍光波長の異なる蛍光誘導体化試薬として、ＤＡＡＢＤ−Ｘ、ＤＡＡＳｅＢＤ−Ｘ、又はＤＡＡＴｈＢＤ−Ｘ（但し、ＸはCｌ又はＦ）と、それらの各同位体を組み合わせて使用する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
酵素水解した試料を直接質量分析に付しペプチドマップを得ると同時に、蛍光試薬の有する骨格並びに電荷を活用して、蛍光標識化ペプチド断片を質量分析測定部で抽出してシステイン含有ペプチド部分の構造を取得し、これらを基にタンパク質及び／又はペプチドの同定を行なう請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
蛍光誘導体化試薬で誘導体化したタンパク質及び／又はペプチドを分解することなく分画することが可能な、少なくともミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、及びミクロ自動注入装置を具備したことを特徴とする自動分画装置。
【請求項２５】
少なくとも、ミクロカラム−ＨＰＬＣ、ミクロ蛍光検出器、ミクロフラクションコレクター、酵素反応装置、及びミクロ自動注入装置を備え、任意に、質量分析（ＭＳ）システムを具備したことを特徴とする微量タンパク質の高性能・簡易定量・同定解析装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５６１４６
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【発行日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１６２２３（Ｐ２００５−５１６２２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１８５９２
【国際出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【出願人】（５９２１９１７９３）
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月２３日（２００５．６．２３）
【発行日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１８５９２
【国際出願日】平成１６年１２月１３日（２００４．１２．１３）
【出願人】（５９２１９１７９３）
【Ｆターム（参考）】
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