発酵槽での真核微生物の超高密度培養によるポリエン脂肪酸を含有する脂質の生産促進
【課題】脂質、特に、ポリエン脂肪酸を含む脂質を生産し得る真核微生物を増殖させる方法を提供する。さらに、真核微生物の脂質を生産する方法も提供する。
【解決手段】真核微生物バイオマスの少なくとも約２０％を脂質として生産し得る真核微生物を増殖させる方法およびそれらの脂質を生産する方法を提供する。脂質は１種以上のポリエン脂肪酸を含むのが好ましく、真核微生物を含む発酵培地に、炭素源、好ましくは非アルコール炭素源と、制限栄養源とを添加することを含む。炭素源と制限栄養源は、発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌまで増大させるのに十分な速度で添加するのが好ましい。
【解決手段】真核微生物バイオマスの少なくとも約２０％を脂質として生産し得る真核微生物を増殖させる方法およびそれらの脂質を生産する方法を提供する。脂質は１種以上のポリエン脂肪酸を含むのが好ましく、真核微生物を含む発酵培地に、炭素源、好ましくは非アルコール炭素源と、制限栄養源とを添加することを含む。炭素源と制限栄養源は、発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌまで増大させるのに十分な速度で添加するのが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、微生物を増殖させ、微生物脂質を回収する新規方法に関する。特に、本発明は、微生物多価不飽和脂質の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
一般に、真核微生物におけるポリエン脂肪酸（２つ以上の不飽和炭素−炭素結合を含む脂肪酸）の生産には、分子状酸素の存在（すなわち、好気的条件）が必要であると考えられてきた。これは、すべての非寄生性真核微生物の脂肪酸に形成されるシス形二重結合に、直接酸素依存性不飽和化反応（酸化微生物デサチュラーゼ系）が関与すると考えられるからである。分子状酸素を必要とすることが知られている他の真核微生物脂質には、菌類および植物ステロール、オキシカロテノイド（すなわち、キサントフィル）、ユビキノン、ならびにこれらの脂質のいずれかから製造された化合物（すなわち、二次代謝産物）が含まれる。
【０００３】
（藻類；酵母を含む菌類；および原生生物などの）ある種の真核微生物は、発酵槽中でポリエン脂肪酸を良好に生産することが証明されている。しかし、（約１００ｇ／Ｌ微生物バイオマスを超える、特に商業的スケールでの）超高密度培養は、ポリエン脂肪酸含量を低下させ、したがって、ポリエン脂肪酸の生産性を低下させ得る。これは、一部には、発酵ブロス中の高濃度の微生物によって発生する高酸素所要量のために高溶存酸素レベルを維持することが困難であることを含めたいくつかの要素により得る。高溶存酸素レベルを維持する方法には、発酵槽中で、通気速度を増大させる方法および／または通気のために空気の代わりに純粋酸素を使用する方法および／または撹拌速度を増大させる方法などがある。これらの解決法は、一般に、脂質生産コストおよび発酵槽の資本コストを増大させたり、さらなる問題を生起させたりする可能性がある。例えば、通気速度を増大させると、高細胞密度の発酵槽中ではひどい発泡の問題が容易に発生し得るし、混合速度を増大させると、発酵ブロス中のせん断力が増大するために微生物細胞の破壊が生じ得る（これによって発酵ブロス中で脂質が遊離し、遊離した脂質は、酵素によって酸化かつ／または分解状態になり得る）。微生物細胞の破壊は、脂質形成を誘発させるために窒素を制限または喪失させ、その結果として細胞壁が弱体化された細胞で増大する問題である。
【０００４】
結果として、脂質生産真核微生物を超高細胞濃度で増殖させた場合、それらの脂質は、通常、極く少量のポリエン脂肪酸しか含まない。例えば、炭素源としてアルコールを用いて酵母リポミセス スタルケイイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）を１５３ｇ／Ｌの密度に増殖させ、１４０時間で８３ｇ／Ｌの脂質濃度を得た。しかるに、１００ｇ／Ｌを超える濃度におけるこの酵母のポリエン脂肪酸含量は、平均して、（２０〜３０ｇ／Ｌの細胞密度での総脂肪酸の１１．５％という高含量から低下して）総脂肪酸の４．２％に過ぎなかった。Ｙａｍａｕｃｈｉら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８４，６１，２７５−２８０（非特許文献１）。これでは、約３．５ｇ／Ｌのポリエン脂肪酸濃度および約０．０２５ｇ／Ｌ／時の平均ポリエン脂肪酸生産性しか得られない。さらに、この酵母脂質で報告されたポリエン脂肪酸はＣ１８：２だけであった。
【０００５】
別の酵母、ロドトルラ グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｕｓ）は、約０．４９ｇ／Ｌ／時の平均脂質生産性を有するが、これもやはりその脂質中の総ポリエン脂肪酸含量は低く（総脂肪酸の１５．８％、１４．７％のＣ１８：２および１．２％のＣ１８：３）、フェッドバッチ培養でのポリエン脂肪酸生産性は約０．０４７ｇ／Ｌ／時、連続培養では０．０７７ｇ／Ｌ／時に過ぎないことが示された。
【０００６】
本発明者らの一人は、スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目のある種の海洋微細藻類が、発酵槽中で、特に、低塩分レベル、特に超低塩化物レベルで増殖させると、優れたポリエン脂肪酸生産体となり得ることを既に証明している。１２０時間で、５９ｇ／Ｌの細胞密度に増殖させると、約０．１５８ｇ／Ｌ／時の平均ポリエン脂肪酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ−３；およびＤＰＡ、Ｃ２２：５ｎ−６）生産性を示すスラウストキトリズ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）を説明している者もいる。しかし、この生産性は、慣用のステンレス鋼発酵槽では重大な腐蝕を生起し得る濃度である約５０％海水の塩分でのみ達成された。
【０００７】
ポリエン脂肪酸、特に、Ｃ１８：４ｎ−３、Ｃ２０：４ｎ−６、Ｃ２０：５ｎ−３、Ｃ２２：５ｎ−３、Ｃ２２：５ｎ−６およびＣ２２：６ｎ−３などの高不飽和脂肪酸を含有する微生物脂質の生産コストは、一部には、高ポリエン脂肪酸含有真核微生物を増殖させる密度が限られており、かつ高生産性の達成に必要なこれらの高細胞濃度および高温では酸素の利用可能性が限られているために、依然として高いままである。
したがって、微生物を高濃度で増殖させ、さらにポリエン脂肪酸含有脂質の生産増大を促進する方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｙａｍａｕｃｈｉら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８４，６１，２７５−２８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、真核微生物バイオマスの少なくとも約２０％を脂質として生産し得る真核微生物を増殖させる方法およびそれらの脂質を生産する方法を提供する。脂質は１種以上のポリエン脂肪酸を含むのが好ましい。この方法は、真核微生物を含む発酵培地に、炭素源、好ましくは非アルコール炭素源と、制限栄養源とを添加することを含む。炭素源と制限栄養源は、発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌまで増大させるのに十分な速度で添加するのが好ましい。
【００１０】
本発明の１つの態様において、発酵条件は、バイオマス増大段階と脂質生産段階を含み、バイオマス密度増大段階は、炭素源および制限栄養源を添加することを含み、脂質生産段階は、脂質生産を誘発させる条件を創出するために、制限栄養源を加えずに炭素源を添加することを含む。
【００１１】
本発明の別の態様において、脂質生産段階において発酵培地中に存在する溶存酸素量は、バイオマス密度増大段階において発酵培地中に存在する溶存酸素量より低い。
【００１２】
本発明のさらに別の態様において、微生物は、藻類、（酵母を含めた）菌類、原生生物、細菌、およびそれらの混合物からなる群から選択され、微生物は、一般に合成に分子状酸素を要求すると考えられているポリエン脂肪酸または他の脂質を生産し得る。本発明の特に有用な微生物は、約３％未満の飽和度の発酵培地酸素レベルで脂質を生産し得る真核微生物である。
【００１３】
本発明のさらに別の態様において、微生物はフェッドバッチ法で増殖される。
本発明のさらに別の態様は、発酵プロセスの後半に発酵培地中約３％未満の飽和度の酸素レベルに維持することを提供する。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、
（ａ） 発酵培地中で真核微生物を増殖させて、発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌまで増大させるステップと、（ｂ） 微生物に脂質を生産させるのに十分な発酵条件を提供するステップと、（ｃ） 約１５％を超える部分が多価不飽和脂質である脂質を回収するステップと、から成る真核微生物脂質の生産方法を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、
（ｄ） 発酵培地から水分を除去して乾燥微生物を得るステップ、
（ｅ） 乾燥微生物から脂質を分離するステップ、
から成る脂質回収方法を提供する。
【００１６】
水除去ステップは、発酵培地を前もって遠心せずに直接ドラム乾燥機上に接触させることを含むのが好ましい。
本発明の別の態様は、
（ｄ） 微生物細胞を透過化、溶解または破裂するように発酵培地を処理するステップと、（ｅ）脂質／水エマルションの破壊を支援する水溶性溶媒の支援があるかまたは支援がない状態で、比重選別法、好ましくは遠心により、発酵ブロスから脂質を回収するステップと、から成る脂質回収方法を提供する。
【００１７】
ステップ（ｃ）において、発酵槽または類似の槽中で微生物細胞を処理するのが好ましい。
【００１８】
本発明の他の態様では、微生物のポリエン脂肪酸含量を豊富にする方法が提供される。この方法は、１０％未満の溶存酸素レベルを有する成長培地中で微生物を発酵させることを含む。
【００１９】
本発明の他の態様は、産物および微生物を生産するための従属栄養方法である。この方法は、成長培地中でポリケチドシンターゼ遺伝子を有する微生物を培養するステップと、培地中の溶存酸素レベルを約１０％未満に維持するステップとから成る。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、例えば、藻類、（酵母を含めた）菌類、原生生物および細菌などの微生物を増殖させる方法を提供する。微生物は、藻類、原生生物およびそれらの混合物からなる群から選択するのが好ましい。微生物が藻類であればなお好ましい。さらに、本発明の方法は、多様な脂質化合物、特に、不飽和脂質、好ましくは多価不飽和脂質（すなわち、少なくとも２つの不飽和炭素−炭素結合、例えば、二重結合を含む脂質）、より好ましくは、ドコサヘキサン酸（すなわち、ＤＨＡ）を含めた、ω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸などの高度不飽和脂質（すなわち、４つ以上の不飽和炭素−炭素結合を含む脂質）；ならびに他の天然の不飽和、多価不飽和および高度不飽和化合物の生産に用い得る。本明細書に用いられている限りにおいて、用語「脂質」には、リン脂質；遊離脂肪酸；脂肪酸エステル；トリアシルグリセロール；ステロールおよびステロールエステル；カロテノイド；キサントフィル（例えば、オキシカロテノイド）；炭化水素；イソプレノイド誘導化合物ならびに当業者には公知の他の脂質が含まれる。
【００２１】
より特定的に言えば、本発明の方法は、真核微生物のポリエン脂肪酸、カロテノイド、菌類ステロール、フィトステロール、キサントフィル、ユビキノン、および一般に不飽和炭素−炭素結合の生成に酸素を要求すると考えられている他のイソプレノイド誘導化合物、ならびにそれらの二次代謝産物の生産に有用である。特に、本発明の方法は、ポリエン脂肪酸を生産する微生物の増殖、および微生物ポリエン脂肪酸の生産に有用である。
【００２２】
本発明の方法は、多様な微生物を増殖させるため、およびそれらの微生物が生産する多価不飽和脂質含有化合物を得るために用い得るが、簡潔さ、便宜上および例示のために、本発明のこの詳細な説明は、ω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸を含む脂質を生産し得る微生物、特にＤＨＡ（またはＤＰＡ、ＥＰＡまたはＡＲＡなどの同類化合物）を生産し得る微生物を増殖させる方法について述べる。好ましい微生物には、微細藻類、（酵母を含めた）菌類、原生生物および細菌が含まれる。１つの好ましい微生物群は、微細藻類および藻様微生物を含むいわゆるストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）と称される微生物群のメンバーである。ストラメノパイルには以下の微生物群が含まれる：ハマトレス（Ｈａｍａｔｏｒｅｓ）、プロテロモナズ（Ｐｒｏｔｅｒｏｍｏｎａｄｓ）、オパリネス（Ｏｐａｌｉｎｅｓ）、ディベロペイエルラ（Ｄｅｖｅｌｏｐａｙｅｌｌａ）、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）、ラビリンツリド（Ｌａｂｒｉｎｔｈｕｌｉｄｓ）、スラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）、ビオセシド（Ｂｉｏｓｅｃｉｄｓ）、オオミセテス（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ヒポチトリジオミセテス（Ｈｙｐｏｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、コマチオン（Ｃｏｍｍａｔｉｏｎ）、レチキュロスファエラ（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｈａｅｒａ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、ペラゴコッカス（Ｐｅｌａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、オリコラ（Ｏｌｌｉｃｏｌａ）、アウレオコッカス（Ａｕｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パルマレス（Ｐａｒｍａｌｅｓ）、ジアトムス（Ｄｉａｔｏｍｓ）、キサントフィテス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔｅｓ）、ファエオフィテス（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔｅｓ）（褐藻）、ユースチグマトフィテス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ）、ラフィドフィテス（Ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔｅｓ）、シヌリドス（Ｓｙｎｕｒｉｄｓ）、〔リゾクロムリナアレス（Ｒｈｉｚｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａａｌｅｓ）、ペディネルラレス（Ｐｅｄｉｎｅｌｌａｌｅｓ）、ディクチオカレス（Ｄｉｃｔｙｏｃｈａｌｅｓ）を含めた〕アキソディネス（Ａｘｏｄｉｎｅｓ）、クリソメリダレス（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｒｉｄａｌｅｓ）、サルキノクリシダレス（Ｓａｒｃｉｎｏｃｈｒｙｓｉｄａｌｅｓ）、ヒドルラレス（Ｈｙｄｒｕｒａｌｅｓ）、ヒバーディアレス（Ｈｉｂｂｅｒｄｉａｌｅｓ）、およびクロムリナレス（Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａｌｅｓ）。他の好ましい微細藻類群には、クリプテコディウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｕｍ）属のメンバーを含めた、緑藻類および渦鞭毛虫類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）がある。より特定的に言えば、本発明の好ましい実施形態は、海洋微生物、特に、スラウストキトリアレス目のスラウストキトリウム、より特定的には、共にＢａｒｃｌａｙに付与され、それらの全文が本明細書に援用される共に譲渡された米国特許第５，３４０，５９４号および同第５，３４０，７４２号に開示されているスラウストキトリアレスを含めた、スラウストキトリウム属およびシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のスラウストキトリアレスなどの藻類を増殖させる方法に関連して述べられるであろう。多くの専門家はウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）が別の属ではなく、実際にはシゾキトリウム属の一部であると了解していることに留意すべきである。本明細書に用いられている限りにおいて、シゾキトリウム属にはウルケニアが含まれる。
【００２３】
好ましい微生物は、ポリケチドシンターゼ系を介して目的化合物を生産するものである。そのような微生物には、内在性ポリケチドシンターゼ系を有する微生物およびポリケチドシンターゼ系が遺伝子設計されている微生物が含まれる。ポリケチドは、抗生物質特性および薬理学的特性を含めた、広範囲な生物活性を有する構造的に多様な天然産物である。ポリケチドの炭素鎖構造の生合成は、ポリケチドシンターゼによって触媒される。構造的および機構的に関連する脂肪酸シンターゼと同様に、ポリケチドシンターゼは、一度に炭素鎖の２つの炭素を延長するアシルチオエステル間で繰り返される脱炭酸縮合を触媒する。しかし、脂肪酸シンターゼとは異なり、ポリケチドシンターゼは、最終産物中で大きな構造変動性を生成し得る。個々のポリケチドシンターゼ系は、アセテート以外の出発単位を用い、延長単位としてマロン酸メチルまたはマロン酸エチルを利用し、各縮合後に形成されたβ−ケト基上のケト還元、脱水およびエノイル還元の還元サイクルを変えることにより、これを行い得る。ここで、特に興味深いことは、脱水ステップにより導入される炭素−炭素二重結合が最終産物中に保持され得ることである。さらに、これらの二重結合は初期にはトランス配置であるが、酵素的異性化によりＤＨＡ（および他の目的ポリエン脂肪酸）中に見出されるシス配置に変換され得る。デヒドラーゼ反応も異性化反応も分子状酸素の不在下で起こり得る。
【００２４】
好ましくは、本発明に従って、産物および微生物を生産するために従属栄養方法が提供される。この方法は、成長培地中で、ポリケチドシンターゼ系を含有する微生物を培養するステップを含むのが好ましい。溶存酸素レベルは、好ましくは約８％未満、より好ましくは約４％未満、さらに好ましくは約３％未満、より好ましくは約１％未満に維持する。
【００２５】
しかし、本発明は全体としてそのように制限することを意図しておらず、当業者には、本発明の概念を、本明細書に述べられている技法に従って、他の脂質組成物を含めた様々な他の化合物を生産する他の微生物にも適用可能であることが認識されるであろうことは当然である。
【００２６】
藻類により比較的一定した速度で脂質が生産されるとすると、バイオマス密度が高いほど容量当たりの総脂質生産量も高くなることは容易に分る。藻類を増殖させるための現行の発酵法は約５０〜約８０ｇ／Ｌ以下のバイオマス密度をもたらす。本発明者らは、本発明の方法を用いることにより、現在知られているバイオマス密度より有意に高いバイオマス密度を達成し得ることを見出した。本発明の方法は、好ましくは少なくとも約１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約１３０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約１７０ｇ／Ｌ、最も好ましくは２００ｇ／Ｌより高いバイオマス密度を生成する。したがって、そのような高いバイオマス密度では、たとえ藻類の脂質生産速度がわずかに減少しても、容量当たりの全脂質生産速度は現在知られている方法より有意に高くなる。
【００２７】
本発明のヤブレツボカビ目微生物増殖法は、微生物を含む発酵培地のバイオマス密度を上述の密度まで増大させるに十分な速度で発酵培地に炭素源および制限栄養源を添加するステップを含む。本明細書に用いられている限りにおいて、用語「制限栄養源」とは、成長培地から制限栄養素が失われると、その不在が微生物のさらなる増殖または複製を有意に制限するという点で、微生物の増殖に不可欠な（栄養素自体を含めた）栄養源を表す。しかし、それでも、他の栄養素が豊富に存在するので、微生物は細胞内および／または細胞外産物を生産かつ蓄積し続けることができる。特定の制限栄養素を選択することにより、蓄積される産物のタイプを制御し得る。したがって、一定の速度で制限栄養源を供給することにより、微生物の増殖速度と、所望産物（例えば、脂質）の生産または蓄積とを制御し得る。１種以上の基質（例えば、炭素源および制限栄養源）を段階的に増量添加するこの発酵法は、一般に、フェッドバッチ発酵法と称されている。バッチ発酵法に基質を加える場合、存在する大量の炭素源（例えば、６０ｇ／Ｌのバイオマス密度当たり約２００ｇ／Ｌ以上）が微生物に対して有害作用を与えることが見出された。いずれの定理にも拘束されることなく、そのような高量の炭素源は、微生物に対して、浸透圧を含めた有害作用を及ぼし、微生物の初期生産性を阻害すると考えられる。本発明の方法はこの望ましくない有害作用を回避しながら、上記微生物バイオマス密度を達成するに十分な量の基質を提供する。
【００２８】
本発明の微生物増殖法は、バイオマス密度増大段階を含み得る。バイオマス密度増大段階において、発酵プロセスの第１目的は、上述のバイオマス密度を得るように発酵培地中のバイオマス密度を増大させることである。炭素源の添加速度は、通常、微生物の生産性、または液体ブロスから熱を除去し、かつ液体ブロスとの間で気体を移動させるのに不十分な発酵装置能力に基因する微生物の生存率に有意な有害作用を及ぼさない特定のレベルまたは範囲に維持される。発酵プロセスにおいて特定の微生物に必要とされる炭素源量の適切な範囲は当業者には周知である。本発明の炭素源は、非アルコール炭素源、すなわち、アルコールを含まない炭素源であるのが好ましい。本明細書に用いられている限りにおいて、「アルコール」とは、４つ以下の炭素原子を有し、ヒドロキシ基１つを含む化合物、例えば、メタノール、エタノールおよびイソプロパノールを表すが、本発明用には、乳酸および類似化合物などのヒドロキシ有機酸は含まれない。より好ましくは、本発明の炭素源は、フルクトース、グルコース、スクロース、糖ミツおよびスターチを含むがそれらには限定されない炭水化物である。他の適当な単純炭素源および複合炭素源ならびに窒素源は、上記に引用した特許に開示されている。しかし、通常は、主炭素源として、炭水化物、好ましくはコーンシロップが用いられる。ヒドロキシ脂肪酸、トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドの形態の脂肪酸も炭素源としての働きをし得る。
【００２９】
特に好ましい窒素源は、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、大豆タンパク質、アミノ酸、タンパク質、コーンスティープリカー、酵母エキス、動物副産物、無機アンモニウム塩、より好ましくは硫酸アンモニウム塩、水酸化アンモニウム塩、最も好ましくは水酸化アンモニウムである。他の制限栄養源には、（上記定義の）炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（ビタミンＢ１２源、パントテン酸塩源、チアミン源など）、ならびに微量金属源（亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源など）、および主要金属源（マグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源、およびシリカ源など）が含まれる。微量金属源および主要金属源は、これらの金属の硫酸塩および塩化物塩（例えば、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４、但しそれらには限定されない）を包含し得る。
【００３０】
窒素源としてアンモニウムを用いると、発酵培地は、塩基添加または緩衝液により調節しなければ、酸性になる。主要窒素源として水酸化アンモニウムを用いる場合、水酸化アンモニウムはｐＨの調節にも用い得る。スラウストキトリアレス目、特に、スラウストキトリウム属およびシゾキトリウム属のスラウストキトリアレス微生物は、広範なｐＨ範囲、例えば、約ｐＨ５〜約ｐＨ１１にわたって増殖するであろう。特定の微生物の発酵に適したｐＨ範囲は当業者の知識の範囲内である。
【００３１】
本発明の微生物増殖方法は、さらに生産段階を含み得る。この段階において、微生物による基質の主要用途は、バイオマス密度を増大させることではなく、脂質を生産させるために基質を用いることである。脂質はバイオマス密度増大段階でも微生物によって生産されるが、上述のように、バイオマス密度増大段階の主目的はバイオマス密度を増大させることであると理解すべきである。通常、生産段階での制限栄養基質の添加は、少なくするか、好ましくは停止する。
【００３２】
かつては、発酵培地中の溶存酸素の存在は、真核微生物によるω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸を含めた多価不飽和化合物の生産に極めて重要であると一般に考えられていた。したがって、一般に、発酵培地中に比較的大量の溶存酸素が存在することが好ましいと考えられた。しかし、驚くべきことに、思いがけなく、本発明者らは、生産段階の溶存酸素レベルを低下させると、脂質の生産速度が劇的に増大することを見出した。したがって、バイオマス密度増大段階における発酵培地中の溶存酸素レベルは、好ましくは少なくとも約８％の飽和度、より好ましくは少なくとも約４％の飽和度であるが、生産段階における発酵培地中の溶存酸素は、約３％以下の飽和度、好ましくは約１％以下の飽和度、より好ましくは約０％の飽和度に低下させる。発酵開始時には、ＤＯは飽和状態または飽和に近い状態であってよく、微生物が増殖するにつれ、これらの低ＤＯ整定値まで穏やかに低下させ得る。本発明の１つの特定の実施形態において、発酵培地中の溶存酸素レベル量は発酵プロセス中に変更される。例えば、総発酵時間が約９０〜約１００時間の発酵プロセスの場合、発酵培地中の溶存酸素レベルは、最初の２４時間には約８％、約２４時間目から約４０時間目までは約４％、約４０時間目から発酵プロセスの終りまでは約０．５％以下に維持される。
【００３３】
発酵培地中に存在する溶存酸素の量は、発酵槽のヘッドスペースの酸素量を調節するか、または好ましくは発酵培地のかきまぜ（もしくは攪拌）速度を調節することにより制御し得る。例えば、高かきまぜ（もしくは攪拌）速度では、低かきまぜ速度の場合より発酵培地中の溶存酸素量が比較的高くなる。例えば、約５３キロリットル（約１４，０００ガロン）容量の発酵槽では、約９０〜約１００時間の総発酵プロセス時間で上記溶存酸素レベルを達成するために、かきまぜ速度は、最初の１２時間は、約５０〜約７０ｒｐｍ、約１２時間目から約１８時間目までは約５５〜約８０ｒｐｍ、約１８時間目から発酵プロセスの終りまでは約７０〜約９０ｒｐｍに設定される。発酵培地中で特定の溶存酸素量を達成するために必要な特定のかきまぜ速度範囲は当業者が容易に決定し得る。
【００３４】
本発明の方法に好ましい温度は、少なくとも約２０℃、より好ましくは少なくとも約２５℃、最も好ましくは少なくとも約３０℃である。冷水は温水より高い量の溶存酸素を保持できると理解すべきである。したがって、高発酵培地温度は、上述のような特に望ましい、溶存酸素量を減少させるという追加利点を有する。
【００３５】
ある種の微生物は、発酵培地中に一定量の塩類溶液ミネラルを要求し得る。これらの塩類溶液ミネラル、特に塩化物イオンは、発酵槽や他の下流加工装置を腐蝕させ得る。発酵倍中に存在する比較的大量の塩化物イオンによるこれらの望ましくない作用を防止または減少させるために、本発明の方法はさらに、発酵培地中にナトリウム源として非塩化物含有ナトリウム塩、好ましくは硫酸ナトリウムを用いることを含み得る。より特定的に言えば、発酵のナトリウム所要量の有意な部分を非塩化物含有ナトリウム塩として供給する。例えば、発酵培地中のナトリウムの約７５％未満、より好ましくは約５０％未満、さらに好ましくは約２５％未満を塩化ナトリウムとして供給する。本発明の微生物は、約３ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約５００ｍｇ／Ｌ未満、さらに好ましくは約２５０ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは約６０〜約１２０ｍｇ／Ｌの塩化物濃度で増殖させ得る。
【００３６】
非塩化物含有ナトリウム塩には、ソーダ灰（炭酸ナトリウムと酸化ナトリウムの混合物）、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物が含まれ得るが、硫酸ナトリウムが好ましい。ソーダ灰、炭酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムは、発酵培地のｐＨを上昇させる傾向があり、したがって、培地の適切なｐＨを維持する調節ステップが必要である。微生物の塩分所要量を満たす硫酸ナトリウム濃度が有効であり、ナトリウム濃度は、（ｇ／ＬのＮａで表して）好ましくは少なくとも約１ｇ／Ｌ、より好ましくは約１〜約５０ｇ／Ｌの範囲、さらに好ましくは約２〜約２５ｇ／Ｌの範囲である。
【００３７】
微生物の接種、増殖および回収に関する種々の発酵パラメータは、米国特許第５，１３０，２４２号に詳細に述べられており、この特許はその全文が本明細書に援用される。発酵培地から微生物を分離するには、遠心、濾過、限外濾過、デカントおよび溶媒蒸発を含めた現在知られているいずれの分離法を用いてもよい。本発明者らは、本発明の方法によって得られる上記のような高いバイオマス密度のために、微生物の回収に遠心を用いる場合、水を添加することにより発酵培地を希釈してバイオマス密度を低下させ、それによって発酵培地から微生物をより効果的に分離し得ることを見出した。
【００３８】
本発明において達成される超高バイオマス密度により、微生物脂質の「無溶媒」回収法が容易になる。発酵槽中で細胞を溶解する好ましい方法は、２０００年１月１９日出願の「ＳＯＬＶＥＮＴＬＥＳＳ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ」と題する米国仮特許出願第６０／１７７，１２５号、２００１年１月１９日出願の「ＳＯＬＶＥＮＴＬＥＳＳ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ」と題する米国特許出願、および２００１年１月１９日出願の「ＳＯＬＶＥＮＴＬＥＳＳ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ」と題するＰＣＴ特許出願に記載されており、これらの特許出願はそれらの全文が本明細書に援用される。（脂質エマルションを分離し、脂質に富む分画を回収し得る）発酵槽中で細胞を透過化、破壊または溶解した後で脂質を回収する好ましい方法には、その全文が本明細書に援用されるＷＯ９６／０５２７８に略記されている脱油法が含まれる。この方法では、油／水エマルションに、水溶性化合物、例えば、アルコールまたはアセトンを添加してエマルションを破壊し、得られた混合物を、比重選別法、例えば、遠心により分離する。この方法は、エマルションの破壊に他の物質（水および／または溶解可能な脂質）を用いるように改変することもできる。
【００３９】
あるいは、発酵培地から水分を蒸発させること、例えば、発酵培地を直接（すなわち、例えば遠心により予備濃縮せずに）ドラム乾燥機装置などの乾燥機と接触させること、すなわち、直接ドラム乾燥機回収法により、発酵培地から微生物を乾燥形態で回収する。微生物の分離に直接ドラム乾燥機回収法を用いる場合、通常、蒸気加熱ドラム乾燥機を用いる。さらに、直接ドラム乾燥機回収法を用いる場合、発酵培地のバイオマス密度は、好ましくは少なくとも約１３０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも約１８０ｇ／Ｌである。一般に、直接ドラム乾燥機回収法にこの高バイオマス密度が望ましいのは、低バイオマス密度では、発酵培地がドラムを有意に冷却するに十分な水分量を含み、それによって微生物の乾燥が不完全になるからである。スプレー乾燥を含めた他の細胞乾燥法は当業者には周知である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】微生物の種々の脂質生産パラメータ対発酵培地中の溶存酸素量の表およびプロット。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の方法は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／時、好ましくは少なくとも約０．７ｇ／Ｌ／時、より好ましくは少なくとも約０．９ｇ／Ｌ／時、最も好ましくは少なくとも約１．０ｇ／Ｌ／時の平均脂質生産速度を提供する。さらに、本発明の方法により生産される脂質は、約１５％、好ましくは約２０％、より好ましくは約２５％、さらに好ましくは約３０％、最も好ましくは約３５％を超える量の多価不飽和脂質を含む。脂質は、乾燥微生物または発酵培地中の微生物から回収し得る。一般に、本発明の方法で微生物が生産する脂質の少なくとも約２０％、好ましくは脂質の少なくとも約３０％、より好ましくは脂質の少なくとも約４０％、最も好ましくは脂質の少なくとも約５０％は、ω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸である。あるいは、本発明の方法は、少なくとも約０．２ｇのω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）／Ｌ／時、好ましくは少なくとも約０．３ｇのω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）／Ｌ／時、より好ましくは少なくとも約０．４ｇのω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）／Ｌ／時、最も好ましくは少なくとも約０．５ｇのω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）／Ｌ／時の平均ω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）生産速度を提供する。あるいは、本発明の方法は、少なくとも約０．０７ｇのω−６脂肪酸（例えば、ＤＰＡｎ−６）／Ｌ／時、好ましくは少なくとも約０．１ｇのω−６脂肪酸（例えば、ＤＰＡｎ−６）／Ｌ／時、より好ましくは少なくとも約０．１３ｇのω−６脂肪酸（例えば、ＤＰＡｎ−６）／Ｌ／時、最も好ましくは少なくとも約０．１７ｇのω−６脂肪酸（例えば、ＤＰＡｎ−６）の平均ω−６脂肪酸（例えば、ＤＰＡｎ−６）生産速度を提供する。あるいは、（総脂肪酸メチルエステルに基づく）脂質の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約３５％、最も好ましくは少なくとも約４０％がＤＨＡである。
【００４２】
微生物、微生物から抽出された脂質、脂質抽出後に残留するバイオマスまたはそれらの組み合わせは、飲料、ソース、（ミルク、ヨーグルト、チーズおよびアイスクリームなどの）乳製品、ならびに焼き菓子類中の成分などの食物成分；（カプセルまたは錠剤形態の）栄養サプリメント；肉や産物をヒトが消費する任意の動物用の飼料または飼料サプリメント；ベビーフードおよび乳児用調合乳を含めた食物サプリメント；ならびに（直接または付加療法用の）医薬品として直接用い得る。用語「動物」とは、動物界に属する任意の生体を意味し、トリ肉、シーフード、ビーフ、ポークまたはラムが由来する任意の動物を包含するがそれらには限定されない。シーフードは、魚、小形エビおよび貝由来であるが、それらには限定されない。用語「産物」には、卵、乳または他の産物を含むがそれらには限定されない上記動物由来の肉以外の任意の産物が含まれる。上記動物に与えると、多価不飽和脂質は、動物の肉、乳、卵または他の産物中に組み込まれて、動物の多価不飽和脂質含量を増大させ得る。
本発明のさらなる目的、利点および新規特徴は、本発明を制限するものではない以下の実施例を吟味すれば当業者には明らかになるであろう。
【実施例】
【００４３】
これらの実施例に用いたシゾキトリウム株は、広くさまざまな発酵条件下に、概して約３：１比の２種の主要ポリエン酸、ＤＨＡｎ−３およびＤＰＡｎ−６と、ＥＰＡおよびＣ２０：３などの少量の他のポリエン酸を生産する。したがって、以下の実施例にはＤＨＡの量しか列挙されていないが、上記に開示されている比率を用いることにより、生産されるＤＰＡ（ｎ−６）の量は容易に計算し得る。
【００４４】
実施例１
この実施例は、脂質の生産性に及ぼす発酵培地中の酸素含量の影響を示している。
種々の溶存酸素レベルにおけるシゾキトリウム ＡＴＣＣ２０８８８番の発酵結果を測定した。結果を図１に示すが、図中、ＲＣＳは糖の残留濃度、ＤＣＷは乾燥細胞重量である。
【００４５】
実施例２
この実施例も最終バイオマス産物のＤＨＡ含量（％乾燥重量）に及ぼす発酵培地中の低酸素含量の影響を示している。
大型発酵槽で培養したシゾキトリウム種細胞中のＤＨＡ含量に及ぼす低酸素含量の影響を模擬するために、２５０ｍｌ三角フラスコで「縮小（スケールダウン）」実験を実施した。シゾキトリウム種（ＡＴＣＣ２０８８８番）をＯ４−４培地中で培養した。この培地は、脱イオン水に溶かした１リットル当たりの以下の成分からなっていた：Ｎａ２ＳＯ４ １２．６１ｇ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ；ＫＣｌ ０．２５ｇ；ＣａＣｌ２ ０．０５ｇ；グルタミン酸一ナトリウム ７．０ｇ；グルコース １０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ；ＮａＨＣＯ３ ０．１ｇ；酵母エキス ０．１ｇ；ビタミンミックス １．０ｍＬ；ＰＩＩ金属 １．００ｍＬ。ＰＩＩ金属ミックスは（１リットル当たり）：６．０ｇのＮａ２ＥＤＴＡ、０．２９ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、６．８４ｇのＨ３ＢＯ３、０．８６ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０６ｇのＺｎＣｌ２、０．０２６ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０５２ｇのＮｉＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．００２ｇのＣｕＳＯ４・Ｈ２Ｏおよび０．００５ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏを含む。ビタミンミックスは（１リットル当たり）：１００ｍｇのチアミン、０．５ｍｇのビオチンおよび０．５ｍｇのシアノコバラミンを含む。培地のｐＨを７．０に調整し、次いでフィルター滅菌した。
【００４６】
この縮小実験を行った理由は、それぞれ異なる量の培地を有する振とうフラスコ中で細胞を培養するためであった。ほとんど満杯のフラスコ（例えば、２５０ｍＬ振とうフラスコ中２００ｍＬ）は振とうテーブル上では良く混ざらず、したがって、細胞が増殖するにつれ、低溶存酸素状態が発生するであろう。したがって、この実験では、４種の処置を設定し、それぞれを２回実施した：（１）２５０ｍＬフラスコに５０ｍＬの培地を充填；（２）２５０ｍＬフラスコに１００ｍＬの培地を充填；（３）２５０ｍＬフラスコに１５０ｍＬの培地を充填；（４）２５０ｍＬ振とうフラスコに２００ｍＬの培地を充填。８つのフラスコそれぞれに、処理１の条件下、２８℃、振とうテーブル上２２０ｒｐｍで、Ｏ４−４培地中で４８時間培養したシゾキトリウム培養株からの細胞を接種した。
【００４７】
この実験用の８つのフラスコすべてを、インキュベータ（２８℃）の振とうテーブル（２２０ｒｐｍ）上に乗せ、暗所で４８時間培養した。実験後、各フラスコ中の溶存酸素（ＤＯ）レベルをＹＳＩ溶存酸素メーターで測定し、培地のｐＨ、細胞乾燥重量および細胞の脂肪酸含量も測定した。実験結果を表１に概説する。
【００４８】
【表１】
これらの結果は、（％ＦＡＭＥとしての）脂質含量およびＤＨＡ含量（％乾燥重量）は、低溶存酸素レベルで培養した細胞では高く、溶存酸素レベルが低くなるほど、脂質およびＤＨＡ含量が高くなったことを示している。これは、一般に脱飽和（二重）結合の形成には酸素が必要であると考えられていたので、予想外である。ＤＨＡは最も不飽和な脂肪酸の１つであるから、そのように多くのＤＨＡが低溶存酸素レベルで形成されたのは驚くべきことである。溶存酸素レベルが低下するにつれバイオマスの生産は低下するが、ＤＨＡ含量は増大する。したがって、高溶存酸素レベルでバイオマスの形成を最大にし、次いで、低溶存酸素レベルで長鎖脂肪酸の生産を最大にする増殖期を有するのが有利である。
【００４９】
実施例３
この実施例は、本発明の方法の再現性を示している。
１，２００ガロンの呼称作業容量を有する発酵槽を用いて微生物を生産した。得られた発酵ブロスを濃縮し、ドラム乾燥機を用いて微生物を乾燥した。得られた微生物のアリコートから脂質を抽出し、精製して、精製、脱色、脱臭した油を得た。脂質を分析する前に、栄養を補うために約３，０００ｐｐｍのｄ−ｌ−α−酢酸トコフェリルを加えた。
【００５０】
シゾキトリウムＡＴＣＣ２０８８８番の９回の発酵を実行し、その結果を表２に示す。最初の２４時間の溶存酸素レベルは約８％であり、その後は約４％であった。
【００５１】
【表２】
発酵槽中の容量が約４．５ｋｌ（約１，２００ガロン）に達するまでコーンシロップを充填し、約４．５ｋｌ（約１，２００ガロン）に達した時点でコーンシロップの添加を停止した。残留糖濃度が５ｇ／Ｌを下回った時点で発酵プロセスを停止した。接種から最後までの典型的な発酵時間は約１００時間であった。
【００５２】
発酵ブロス、すなわち、発酵培地を約２：１比を用いて水で希釈して、最終産物の灰含量を低減させ、遠心ステップにおける相分離の増進を支援した。濃縮細胞ペーストを７１℃（１６０°Ｆ）に加熱し、Ｂｌａｗ Ｋｎｏｘダブルドラム乾燥機〔１０６．６８ｃｍ×９１．４４ｃｍ（４２”×３６”）〕で乾燥した。しかし、微生物は前もって遠心せずに直接ドラム乾燥機上で乾燥するのが好ましい。
【００５３】
表２の各記入項目のアリコートから抽出した脂質の分析結果を表３に概説する。
【表３】
特に断りの無い限り、実施例項全体に用いた発酵培地は以下の成分を含み、最初の数時は呼称目標濃度を示し、（ ）内の数字は許容可能範囲を示す：硫酸ナトリウム １２ｇ／Ｌ（１１−１３）；ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ（０．４５−０．５５）；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２ｇ／Ｌ（１．８−２．２）；Ｈｏｄａｇ Ｋ−６０消泡剤 ０．３５ｇ／Ｌ（０．３−０．４）；Ｋ２ＳＯ４ ０．６５ｇ／Ｌ（０．６０−０．７０）；ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ（０．９−１．１）；（ＮＨ４）２ＳＯ４ １ｇ／Ｌ（０．９５−１．１）；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１７ｇ／Ｌ（０．１５−０．１９）；９５ＤＥコーンシロップ（固体ベース）４．５ｇ／Ｌ（２−１０）；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ（２．７−３．３）；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ（２．７−３．３）；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０４ｍｇ／Ｌ（０．０３５−０．０４５）；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０４ｍｇ／Ｌ（０−０．０４５）；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ２ｍｇ／Ｌ（１．８−２．２）；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ２ｍｇ／Ｌ（１．８−２．２）；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ（９−１１）；チアミン ９．５ｍｇ／Ｌ（４−１５）；ビタミンＢ１２ ０．１５ｍｇ／Ｌ（０．０５−０．２５）およびパントテン酸カルシウム ３．２ｍｇ／Ｌ（１．３−５．１）。さらに、窒素源として２８％ ＮＨ４ＯＨ溶液を用いる。
【００５４】
乾燥微生物の灰含量は約６重量％である。
【００５５】
実施例４
この実施例は、約５３キロリットル（１４，０００ガロン）スケールの微生物生産性に及ぼす発酵培地中の低減溶存酸素レベルの影響を示している。
実施例３に記載の手順を用い、上述の米国特許第５，３４０，５９４号および同第５，３４０，７４２号に開示されている分離法を用いて得られる野生型シゾキトリウム株を用いて、１４，０００ガロン呼称容量発酵を実施した。発酵培地中の溶存酸素レベルは、最初の２４時間には約８％であり、２４時間目から４０時間目までは約４％、４０時間目から発酵プロセスの終りまでは約０．５％であった。この発酵培地中低溶存酸素レベルプロセスの結果を表４に示す。
【００５６】
【表４】
実施例５
この実施例は、約１５５キロリットル（４１，０００ガロン）スケールの微生物生産性に及ぼす発酵培地中の低溶存酸素レベルの影響を示している。
【００５７】
約１５５キロリットル（４１，０００ガロン）発酵槽で発酵を実施したこと以外は、実施例４と同じ手順を用いた。このスケールで目的化合物濃度を維持するために、培地量を増やした。結果を表５に示す。
【００５８】
【表５】
実施例６
この実施例は、本発明の発酵プロセスに及ぼす追加窒素の影響を示している。
実施例４と類似の手順を用い、２５０−Ｌスケールのフェッドバッチ実験を４セット実施した。２種の対照実験と、追加のアンモニア（標準量の１．１５倍と１．２５倍）を含む２種の実験を行った。結果を表６に示す。
【００５９】
【表６】
一般に、追加窒素は、追加アンモニアを加えた２つのバッチのＤＨＡ生産性に有意な低下が観察されたので、発酵性能に負の影響を与える。表６に示されているように、対照バッチでは、最終ＤＨＡレベルが１８．４％および総細胞乾燥重量が２２．１％であったのに対し、追加窒素補充バッチでは、それぞれ、９．２％（１．１５倍のアンモニア）および１２．６％（１．２５倍のアンモニア）であった。
【００６０】
実施例７
この実施例は本発明の発酵プロセスの動力学的プロフィールを示している。
実施例４と類似の手順を用いて約３．８キロリットル（１，０００）ガロンスケールのフェッドバッチ実験を行った。本発明の発酵法の動的プロフィールを表７に示す。
【００６１】
表７． シゾキトリウムの約３．８キロリットル（１，０００）スケールフェッドバッチ発酵の動的プロフィール
【００６２】
【表７】
実施例８
この実施例は生産性に及ぼす炭素源量の影響を示している。
実施例４の方法を用い、種々の量の炭素源を用いて、３種の異なる発酵法を実施した。結果を表８に示す。
【００６３】
【表８】
実施例９
この実施例は、バイオマス、脂質（最も特定的にはＤＨＡ）に対する炭素転化効率に及ぼす栄養制限の影響を示している。
【００６４】
以下の化合物（呼称濃度）からなる基本増殖（ＩＣＭ−２）培地中の２リットル容量Ａｐｐｌｉｋｏｎ発酵槽中でシゾキトリウム ＡＴＣＣ２０８８８番を培養して、栄養制限の影響を調べる連続培養実験を実施した：グループＩ成分：Ｎａ２ＳＯ４（１８．５４ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２．０ｇ／Ｌ）およびＫＣＬ（０．５７２ｇ／Ｌ）；グループＩＩ成分（それぞれ別個に調製）：グルコース（４３．８１ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１．２８ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０２５ｇ／Ｌ）および（ＮＨ４）２ＳＯ４（６．５３８ｇ／Ｌ）；グループＩＩＩ成分：Ｎａ２ＥＤＴＡ（６．０ｍｇ／Ｌ）、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（０．２９ｍｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（６．８４ｍｇ／Ｌ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（０．８６ｍｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．２３４７ｍｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０２６ｍｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．００５ｍｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．００２ｍｇ／Ｌ）およびＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ（０．０５２ｍｇ／Ｌ）；ならびにグループＩＶ成分：チアミンＨＣｌ（０．２ｍｇ／Ｌ）、ビタミンＢ１２（０．００５ｍｇ／Ｌ）、パントテン酸カルシウム（０．２ｍｇ／Ｌ）。発酵槽に加える前に、グループＩおよびＩＩはオートクレーブ滅菌し、グループＩＩＩおよびＩＶはフィルター滅菌した。次いで、成長培地にシゾキトリウム属を接種し、最大細胞密度が得られるまで、３０℃、ｐＨ５．５および２０％の溶存酸素飽和度の制御条件下に増殖させた。
【００６５】
次いで、同時に滅菌ＩＣＭ−２供給培地を発酵槽にポンプで汲み上げ、定常状態に達するまで、シゾキトリウム細胞を含むブロスを０．０６ｈｒ−１の希釈速度を維持するに十分な流速で除去して、連続作業モードを確立した。栄養制限の影響を調べるために、出口細胞含有ブロス中に特定の要求栄養素が無くなるように、ＩＣＭ−２供給培地中のこの栄養素を含有する化合物を少なくすると、特定要求栄養素の不在によって細胞の増殖が制限される。各条件に適した定常状態が確立されたら、最終ブロス乾燥バイオマス、残留グルコース、ならびに細胞の制限栄養素濃度、細胞の脂質含量および細胞のＤＨＡ含量を測定した。消費された総グルコースを形成された総乾燥バイオマスで割って、グルコースのバイオマスへの転化効率を計算し、百分率ベースで表した。
【００６６】
以下の表にリストされている個々の栄養素に関してこの実験を繰り返し、個々の栄養素による制限増殖の影響を研究した。最終結果を以下の表に要約する：
表９．シゾキトリウム種のバイオマス収率、転化効率（グルコース→バイオマス）、脂質含量およびＤＨＡ含量に及ぼす栄養制限の影響
【００６７】
【表９】
上記表から、窒素を制限すると、細胞中でＤＨＡの蓄積が最高になり、次いで、リン酸塩、ナトリウム、ニッケル、マンガン、グルコース（炭素）、亜鉛および鉄の順であったことは明らかである。これらの栄養素の１種以上を細胞増殖を制限するのに十分な速度でバッチ発酵に供給することにより、この情報を商業用に利用することができる。最も好ましいケースでは、細胞のＤＨＡ含量を最大にするために、窒素を制限的にバッチ発酵に供給する。バイオマスまたは他の有益な産物の生産を最大にするために、他の栄養素（またはそれらの混合物）を制限的に供給し得る。この発酵制御法における制限栄養素として、硫黄などの評価されなかった他の生物学的に要求される成分または栄養素を用いることも可能である。
【００６８】
本発明は、種々の実施形態において、種々の実施形態、それらの副組み合わせおよび部分セットを含めた、本明細書に実質的に提示かつ記載されている構成成分、方法、プロセス、システムおよび／または装置を含む。当業者が本発明の開示を理解すれば、本発明の形成法および使用法が分るであろう。本発明は、種々の実施形態において、例えば、性能を改善したり、実施しやすくしたりかつ／または実施コストを低減させたりするために、これまでの装置または方法に用いられていたであろう品目の不在下を含めた、本発明またはその種々の実施形態において提示かつ／または記載されていない品目の不在下に装置および方法を提供することを含む。
【００６９】
本発明の上記説明は、例示および説明の目的で提示されている。上記説明は、本発明を本明細書に開示されている１つまたは複数の形態に限定しようとするものではない。本発明の説明には、１つ以上の実施形態や、いくつかの変形や改良の説明が含まれているが、例えば、本発明の開示を理解した後では当業者の技術および知識の範囲内に含まれ得る他の変形および改良も本発明の範囲内にある。本明細書に開示されているか否かに拘わらず、また、特許を受けることができる主題を公開するつもりなしに、権利請求されているものの代替となるか、交換可能であるか、かつ／または同等な構造、機能、範囲またはステップを含めた、許容される程度の代替実施形態を含む権利を得ることを意図する。
【技術分野】
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、微生物を増殖させ、微生物脂質を回収する新規方法に関する。特に、本発明は、微生物多価不飽和脂質の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
一般に、真核微生物におけるポリエン脂肪酸（２つ以上の不飽和炭素−炭素結合を含む脂肪酸）の生産には、分子状酸素の存在（すなわち、好気的条件）が必要であると考えられてきた。これは、すべての非寄生性真核微生物の脂肪酸に形成されるシス形二重結合に、直接酸素依存性不飽和化反応（酸化微生物デサチュラーゼ系）が関与すると考えられるからである。分子状酸素を必要とすることが知られている他の真核微生物脂質には、菌類および植物ステロール、オキシカロテノイド（すなわち、キサントフィル）、ユビキノン、ならびにこれらの脂質のいずれかから製造された化合物（すなわち、二次代謝産物）が含まれる。
【０００３】
（藻類；酵母を含む菌類；および原生生物などの）ある種の真核微生物は、発酵槽中でポリエン脂肪酸を良好に生産することが証明されている。しかし、（約１００ｇ／Ｌ微生物バイオマスを超える、特に商業的スケールでの）超高密度培養は、ポリエン脂肪酸含量を低下させ、したがって、ポリエン脂肪酸の生産性を低下させ得る。これは、一部には、発酵ブロス中の高濃度の微生物によって発生する高酸素所要量のために高溶存酸素レベルを維持することが困難であることを含めたいくつかの要素により得る。高溶存酸素レベルを維持する方法には、発酵槽中で、通気速度を増大させる方法および／または通気のために空気の代わりに純粋酸素を使用する方法および／または撹拌速度を増大させる方法などがある。これらの解決法は、一般に、脂質生産コストおよび発酵槽の資本コストを増大させたり、さらなる問題を生起させたりする可能性がある。例えば、通気速度を増大させると、高細胞密度の発酵槽中ではひどい発泡の問題が容易に発生し得るし、混合速度を増大させると、発酵ブロス中のせん断力が増大するために微生物細胞の破壊が生じ得る（これによって発酵ブロス中で脂質が遊離し、遊離した脂質は、酵素によって酸化かつ／または分解状態になり得る）。微生物細胞の破壊は、脂質形成を誘発させるために窒素を制限または喪失させ、その結果として細胞壁が弱体化された細胞で増大する問題である。
【０００４】
結果として、脂質生産真核微生物を超高細胞濃度で増殖させた場合、それらの脂質は、通常、極く少量のポリエン脂肪酸しか含まない。例えば、炭素源としてアルコールを用いて酵母リポミセス スタルケイイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙｉ）を１５３ｇ／Ｌの密度に増殖させ、１４０時間で８３ｇ／Ｌの脂質濃度を得た。しかるに、１００ｇ／Ｌを超える濃度におけるこの酵母のポリエン脂肪酸含量は、平均して、（２０〜３０ｇ／Ｌの細胞密度での総脂肪酸の１１．５％という高含量から低下して）総脂肪酸の４．２％に過ぎなかった。Ｙａｍａｕｃｈｉら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８４，６１，２７５−２８０（非特許文献１）。これでは、約３．５ｇ／Ｌのポリエン脂肪酸濃度および約０．０２５ｇ／Ｌ／時の平均ポリエン脂肪酸生産性しか得られない。さらに、この酵母脂質で報告されたポリエン脂肪酸はＣ１８：２だけであった。
【０００５】
別の酵母、ロドトルラ グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｕｓ）は、約０．４９ｇ／Ｌ／時の平均脂質生産性を有するが、これもやはりその脂質中の総ポリエン脂肪酸含量は低く（総脂肪酸の１５．８％、１４．７％のＣ１８：２および１．２％のＣ１８：３）、フェッドバッチ培養でのポリエン脂肪酸生産性は約０．０４７ｇ／Ｌ／時、連続培養では０．０７７ｇ／Ｌ／時に過ぎないことが示された。
【０００６】
本発明者らの一人は、スラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目のある種の海洋微細藻類が、発酵槽中で、特に、低塩分レベル、特に超低塩化物レベルで増殖させると、優れたポリエン脂肪酸生産体となり得ることを既に証明している。１２０時間で、５９ｇ／Ｌの細胞密度に増殖させると、約０．１５８ｇ／Ｌ／時の平均ポリエン脂肪酸（ＤＨＡ、Ｃ２２：６ｎ−３；およびＤＰＡ、Ｃ２２：５ｎ−６）生産性を示すスラウストキトリズ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）を説明している者もいる。しかし、この生産性は、慣用のステンレス鋼発酵槽では重大な腐蝕を生起し得る濃度である約５０％海水の塩分でのみ達成された。
【０００７】
ポリエン脂肪酸、特に、Ｃ１８：４ｎ−３、Ｃ２０：４ｎ−６、Ｃ２０：５ｎ−３、Ｃ２２：５ｎ−３、Ｃ２２：５ｎ−６およびＣ２２：６ｎ−３などの高不飽和脂肪酸を含有する微生物脂質の生産コストは、一部には、高ポリエン脂肪酸含有真核微生物を増殖させる密度が限られており、かつ高生産性の達成に必要なこれらの高細胞濃度および高温では酸素の利用可能性が限られているために、依然として高いままである。
したがって、微生物を高濃度で増殖させ、さらにポリエン脂肪酸含有脂質の生産増大を促進する方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｙａｍａｕｃｈｉら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８４，６１，２７５−２８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、真核微生物バイオマスの少なくとも約２０％を脂質として生産し得る真核微生物を増殖させる方法およびそれらの脂質を生産する方法を提供する。脂質は１種以上のポリエン脂肪酸を含むのが好ましい。この方法は、真核微生物を含む発酵培地に、炭素源、好ましくは非アルコール炭素源と、制限栄養源とを添加することを含む。炭素源と制限栄養源は、発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌまで増大させるのに十分な速度で添加するのが好ましい。
【００１０】
本発明の１つの態様において、発酵条件は、バイオマス増大段階と脂質生産段階を含み、バイオマス密度増大段階は、炭素源および制限栄養源を添加することを含み、脂質生産段階は、脂質生産を誘発させる条件を創出するために、制限栄養源を加えずに炭素源を添加することを含む。
【００１１】
本発明の別の態様において、脂質生産段階において発酵培地中に存在する溶存酸素量は、バイオマス密度増大段階において発酵培地中に存在する溶存酸素量より低い。
【００１２】
本発明のさらに別の態様において、微生物は、藻類、（酵母を含めた）菌類、原生生物、細菌、およびそれらの混合物からなる群から選択され、微生物は、一般に合成に分子状酸素を要求すると考えられているポリエン脂肪酸または他の脂質を生産し得る。本発明の特に有用な微生物は、約３％未満の飽和度の発酵培地酸素レベルで脂質を生産し得る真核微生物である。
【００１３】
本発明のさらに別の態様において、微生物はフェッドバッチ法で増殖される。
本発明のさらに別の態様は、発酵プロセスの後半に発酵培地中約３％未満の飽和度の酸素レベルに維持することを提供する。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、
（ａ） 発酵培地中で真核微生物を増殖させて、発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌまで増大させるステップと、（ｂ） 微生物に脂質を生産させるのに十分な発酵条件を提供するステップと、（ｃ） 約１５％を超える部分が多価不飽和脂質である脂質を回収するステップと、から成る真核微生物脂質の生産方法を提供する。
【００１５】
本発明の別の態様は、
（ｄ） 発酵培地から水分を除去して乾燥微生物を得るステップ、
（ｅ） 乾燥微生物から脂質を分離するステップ、
から成る脂質回収方法を提供する。
【００１６】
水除去ステップは、発酵培地を前もって遠心せずに直接ドラム乾燥機上に接触させることを含むのが好ましい。
本発明の別の態様は、
（ｄ） 微生物細胞を透過化、溶解または破裂するように発酵培地を処理するステップと、（ｅ）脂質／水エマルションの破壊を支援する水溶性溶媒の支援があるかまたは支援がない状態で、比重選別法、好ましくは遠心により、発酵ブロスから脂質を回収するステップと、から成る脂質回収方法を提供する。
【００１７】
ステップ（ｃ）において、発酵槽または類似の槽中で微生物細胞を処理するのが好ましい。
【００１８】
本発明の他の態様では、微生物のポリエン脂肪酸含量を豊富にする方法が提供される。この方法は、１０％未満の溶存酸素レベルを有する成長培地中で微生物を発酵させることを含む。
【００１９】
本発明の他の態様は、産物および微生物を生産するための従属栄養方法である。この方法は、成長培地中でポリケチドシンターゼ遺伝子を有する微生物を培養するステップと、培地中の溶存酸素レベルを約１０％未満に維持するステップとから成る。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、例えば、藻類、（酵母を含めた）菌類、原生生物および細菌などの微生物を増殖させる方法を提供する。微生物は、藻類、原生生物およびそれらの混合物からなる群から選択するのが好ましい。微生物が藻類であればなお好ましい。さらに、本発明の方法は、多様な脂質化合物、特に、不飽和脂質、好ましくは多価不飽和脂質（すなわち、少なくとも２つの不飽和炭素−炭素結合、例えば、二重結合を含む脂質）、より好ましくは、ドコサヘキサン酸（すなわち、ＤＨＡ）を含めた、ω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸などの高度不飽和脂質（すなわち、４つ以上の不飽和炭素−炭素結合を含む脂質）；ならびに他の天然の不飽和、多価不飽和および高度不飽和化合物の生産に用い得る。本明細書に用いられている限りにおいて、用語「脂質」には、リン脂質；遊離脂肪酸；脂肪酸エステル；トリアシルグリセロール；ステロールおよびステロールエステル；カロテノイド；キサントフィル（例えば、オキシカロテノイド）；炭化水素；イソプレノイド誘導化合物ならびに当業者には公知の他の脂質が含まれる。
【００２１】
より特定的に言えば、本発明の方法は、真核微生物のポリエン脂肪酸、カロテノイド、菌類ステロール、フィトステロール、キサントフィル、ユビキノン、および一般に不飽和炭素−炭素結合の生成に酸素を要求すると考えられている他のイソプレノイド誘導化合物、ならびにそれらの二次代謝産物の生産に有用である。特に、本発明の方法は、ポリエン脂肪酸を生産する微生物の増殖、および微生物ポリエン脂肪酸の生産に有用である。
【００２２】
本発明の方法は、多様な微生物を増殖させるため、およびそれらの微生物が生産する多価不飽和脂質含有化合物を得るために用い得るが、簡潔さ、便宜上および例示のために、本発明のこの詳細な説明は、ω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸を含む脂質を生産し得る微生物、特にＤＨＡ（またはＤＰＡ、ＥＰＡまたはＡＲＡなどの同類化合物）を生産し得る微生物を増殖させる方法について述べる。好ましい微生物には、微細藻類、（酵母を含めた）菌類、原生生物および細菌が含まれる。１つの好ましい微生物群は、微細藻類および藻様微生物を含むいわゆるストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）と称される微生物群のメンバーである。ストラメノパイルには以下の微生物群が含まれる：ハマトレス（Ｈａｍａｔｏｒｅｓ）、プロテロモナズ（Ｐｒｏｔｅｒｏｍｏｎａｄｓ）、オパリネス（Ｏｐａｌｉｎｅｓ）、ディベロペイエルラ（Ｄｅｖｅｌｏｐａｙｅｌｌａ）、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）、ラビリンツリド（Ｌａｂｒｉｎｔｈｕｌｉｄｓ）、スラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ）、ビオセシド（Ｂｉｏｓｅｃｉｄｓ）、オオミセテス（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ヒポチトリジオミセテス（Ｈｙｐｏｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、コマチオン（Ｃｏｍｍａｔｉｏｎ）、レチキュロスファエラ（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｈａｅｒａ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、ペラゴコッカス（Ｐｅｌａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、オリコラ（Ｏｌｌｉｃｏｌａ）、アウレオコッカス（Ａｕｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、パルマレス（Ｐａｒｍａｌｅｓ）、ジアトムス（Ｄｉａｔｏｍｓ）、キサントフィテス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔｅｓ）、ファエオフィテス（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔｅｓ）（褐藻）、ユースチグマトフィテス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｔｅｓ）、ラフィドフィテス（Ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｔｅｓ）、シヌリドス（Ｓｙｎｕｒｉｄｓ）、〔リゾクロムリナアレス（Ｒｈｉｚｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａａｌｅｓ）、ペディネルラレス（Ｐｅｄｉｎｅｌｌａｌｅｓ）、ディクチオカレス（Ｄｉｃｔｙｏｃｈａｌｅｓ）を含めた〕アキソディネス（Ａｘｏｄｉｎｅｓ）、クリソメリダレス（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｒｉｄａｌｅｓ）、サルキノクリシダレス（Ｓａｒｃｉｎｏｃｈｒｙｓｉｄａｌｅｓ）、ヒドルラレス（Ｈｙｄｒｕｒａｌｅｓ）、ヒバーディアレス（Ｈｉｂｂｅｒｄｉａｌｅｓ）、およびクロムリナレス（Ｃｈｒｏｍｕｌｉｎａｌｅｓ）。他の好ましい微細藻類群には、クリプテコディウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｕｍ）属のメンバーを含めた、緑藻類および渦鞭毛虫類（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）がある。より特定的に言えば、本発明の好ましい実施形態は、海洋微生物、特に、スラウストキトリアレス目のスラウストキトリウム、より特定的には、共にＢａｒｃｌａｙに付与され、それらの全文が本明細書に援用される共に譲渡された米国特許第５，３４０，５９４号および同第５，３４０，７４２号に開示されているスラウストキトリアレスを含めた、スラウストキトリウム属およびシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属のスラウストキトリアレスなどの藻類を増殖させる方法に関連して述べられるであろう。多くの専門家はウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）が別の属ではなく、実際にはシゾキトリウム属の一部であると了解していることに留意すべきである。本明細書に用いられている限りにおいて、シゾキトリウム属にはウルケニアが含まれる。
【００２３】
好ましい微生物は、ポリケチドシンターゼ系を介して目的化合物を生産するものである。そのような微生物には、内在性ポリケチドシンターゼ系を有する微生物およびポリケチドシンターゼ系が遺伝子設計されている微生物が含まれる。ポリケチドは、抗生物質特性および薬理学的特性を含めた、広範囲な生物活性を有する構造的に多様な天然産物である。ポリケチドの炭素鎖構造の生合成は、ポリケチドシンターゼによって触媒される。構造的および機構的に関連する脂肪酸シンターゼと同様に、ポリケチドシンターゼは、一度に炭素鎖の２つの炭素を延長するアシルチオエステル間で繰り返される脱炭酸縮合を触媒する。しかし、脂肪酸シンターゼとは異なり、ポリケチドシンターゼは、最終産物中で大きな構造変動性を生成し得る。個々のポリケチドシンターゼ系は、アセテート以外の出発単位を用い、延長単位としてマロン酸メチルまたはマロン酸エチルを利用し、各縮合後に形成されたβ−ケト基上のケト還元、脱水およびエノイル還元の還元サイクルを変えることにより、これを行い得る。ここで、特に興味深いことは、脱水ステップにより導入される炭素−炭素二重結合が最終産物中に保持され得ることである。さらに、これらの二重結合は初期にはトランス配置であるが、酵素的異性化によりＤＨＡ（および他の目的ポリエン脂肪酸）中に見出されるシス配置に変換され得る。デヒドラーゼ反応も異性化反応も分子状酸素の不在下で起こり得る。
【００２４】
好ましくは、本発明に従って、産物および微生物を生産するために従属栄養方法が提供される。この方法は、成長培地中で、ポリケチドシンターゼ系を含有する微生物を培養するステップを含むのが好ましい。溶存酸素レベルは、好ましくは約８％未満、より好ましくは約４％未満、さらに好ましくは約３％未満、より好ましくは約１％未満に維持する。
【００２５】
しかし、本発明は全体としてそのように制限することを意図しておらず、当業者には、本発明の概念を、本明細書に述べられている技法に従って、他の脂質組成物を含めた様々な他の化合物を生産する他の微生物にも適用可能であることが認識されるであろうことは当然である。
【００２６】
藻類により比較的一定した速度で脂質が生産されるとすると、バイオマス密度が高いほど容量当たりの総脂質生産量も高くなることは容易に分る。藻類を増殖させるための現行の発酵法は約５０〜約８０ｇ／Ｌ以下のバイオマス密度をもたらす。本発明者らは、本発明の方法を用いることにより、現在知られているバイオマス密度より有意に高いバイオマス密度を達成し得ることを見出した。本発明の方法は、好ましくは少なくとも約１００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約１３０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは少なくとも１５０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約１７０ｇ／Ｌ、最も好ましくは２００ｇ／Ｌより高いバイオマス密度を生成する。したがって、そのような高いバイオマス密度では、たとえ藻類の脂質生産速度がわずかに減少しても、容量当たりの全脂質生産速度は現在知られている方法より有意に高くなる。
【００２７】
本発明のヤブレツボカビ目微生物増殖法は、微生物を含む発酵培地のバイオマス密度を上述の密度まで増大させるに十分な速度で発酵培地に炭素源および制限栄養源を添加するステップを含む。本明細書に用いられている限りにおいて、用語「制限栄養源」とは、成長培地から制限栄養素が失われると、その不在が微生物のさらなる増殖または複製を有意に制限するという点で、微生物の増殖に不可欠な（栄養素自体を含めた）栄養源を表す。しかし、それでも、他の栄養素が豊富に存在するので、微生物は細胞内および／または細胞外産物を生産かつ蓄積し続けることができる。特定の制限栄養素を選択することにより、蓄積される産物のタイプを制御し得る。したがって、一定の速度で制限栄養源を供給することにより、微生物の増殖速度と、所望産物（例えば、脂質）の生産または蓄積とを制御し得る。１種以上の基質（例えば、炭素源および制限栄養源）を段階的に増量添加するこの発酵法は、一般に、フェッドバッチ発酵法と称されている。バッチ発酵法に基質を加える場合、存在する大量の炭素源（例えば、６０ｇ／Ｌのバイオマス密度当たり約２００ｇ／Ｌ以上）が微生物に対して有害作用を与えることが見出された。いずれの定理にも拘束されることなく、そのような高量の炭素源は、微生物に対して、浸透圧を含めた有害作用を及ぼし、微生物の初期生産性を阻害すると考えられる。本発明の方法はこの望ましくない有害作用を回避しながら、上記微生物バイオマス密度を達成するに十分な量の基質を提供する。
【００２８】
本発明の微生物増殖法は、バイオマス密度増大段階を含み得る。バイオマス密度増大段階において、発酵プロセスの第１目的は、上述のバイオマス密度を得るように発酵培地中のバイオマス密度を増大させることである。炭素源の添加速度は、通常、微生物の生産性、または液体ブロスから熱を除去し、かつ液体ブロスとの間で気体を移動させるのに不十分な発酵装置能力に基因する微生物の生存率に有意な有害作用を及ぼさない特定のレベルまたは範囲に維持される。発酵プロセスにおいて特定の微生物に必要とされる炭素源量の適切な範囲は当業者には周知である。本発明の炭素源は、非アルコール炭素源、すなわち、アルコールを含まない炭素源であるのが好ましい。本明細書に用いられている限りにおいて、「アルコール」とは、４つ以下の炭素原子を有し、ヒドロキシ基１つを含む化合物、例えば、メタノール、エタノールおよびイソプロパノールを表すが、本発明用には、乳酸および類似化合物などのヒドロキシ有機酸は含まれない。より好ましくは、本発明の炭素源は、フルクトース、グルコース、スクロース、糖ミツおよびスターチを含むがそれらには限定されない炭水化物である。他の適当な単純炭素源および複合炭素源ならびに窒素源は、上記に引用した特許に開示されている。しかし、通常は、主炭素源として、炭水化物、好ましくはコーンシロップが用いられる。ヒドロキシ脂肪酸、トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドの形態の脂肪酸も炭素源としての働きをし得る。
【００２９】
特に好ましい窒素源は、尿素、硝酸塩、亜硝酸塩、大豆タンパク質、アミノ酸、タンパク質、コーンスティープリカー、酵母エキス、動物副産物、無機アンモニウム塩、より好ましくは硫酸アンモニウム塩、水酸化アンモニウム塩、最も好ましくは水酸化アンモニウムである。他の制限栄養源には、（上記定義の）炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（ビタミンＢ１２源、パントテン酸塩源、チアミン源など）、ならびに微量金属源（亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源など）、および主要金属源（マグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源、およびシリカ源など）が含まれる。微量金属源および主要金属源は、これらの金属の硫酸塩および塩化物塩（例えば、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４、但しそれらには限定されない）を包含し得る。
【００３０】
窒素源としてアンモニウムを用いると、発酵培地は、塩基添加または緩衝液により調節しなければ、酸性になる。主要窒素源として水酸化アンモニウムを用いる場合、水酸化アンモニウムはｐＨの調節にも用い得る。スラウストキトリアレス目、特に、スラウストキトリウム属およびシゾキトリウム属のスラウストキトリアレス微生物は、広範なｐＨ範囲、例えば、約ｐＨ５〜約ｐＨ１１にわたって増殖するであろう。特定の微生物の発酵に適したｐＨ範囲は当業者の知識の範囲内である。
【００３１】
本発明の微生物増殖方法は、さらに生産段階を含み得る。この段階において、微生物による基質の主要用途は、バイオマス密度を増大させることではなく、脂質を生産させるために基質を用いることである。脂質はバイオマス密度増大段階でも微生物によって生産されるが、上述のように、バイオマス密度増大段階の主目的はバイオマス密度を増大させることであると理解すべきである。通常、生産段階での制限栄養基質の添加は、少なくするか、好ましくは停止する。
【００３２】
かつては、発酵培地中の溶存酸素の存在は、真核微生物によるω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸を含めた多価不飽和化合物の生産に極めて重要であると一般に考えられていた。したがって、一般に、発酵培地中に比較的大量の溶存酸素が存在することが好ましいと考えられた。しかし、驚くべきことに、思いがけなく、本発明者らは、生産段階の溶存酸素レベルを低下させると、脂質の生産速度が劇的に増大することを見出した。したがって、バイオマス密度増大段階における発酵培地中の溶存酸素レベルは、好ましくは少なくとも約８％の飽和度、より好ましくは少なくとも約４％の飽和度であるが、生産段階における発酵培地中の溶存酸素は、約３％以下の飽和度、好ましくは約１％以下の飽和度、より好ましくは約０％の飽和度に低下させる。発酵開始時には、ＤＯは飽和状態または飽和に近い状態であってよく、微生物が増殖するにつれ、これらの低ＤＯ整定値まで穏やかに低下させ得る。本発明の１つの特定の実施形態において、発酵培地中の溶存酸素レベル量は発酵プロセス中に変更される。例えば、総発酵時間が約９０〜約１００時間の発酵プロセスの場合、発酵培地中の溶存酸素レベルは、最初の２４時間には約８％、約２４時間目から約４０時間目までは約４％、約４０時間目から発酵プロセスの終りまでは約０．５％以下に維持される。
【００３３】
発酵培地中に存在する溶存酸素の量は、発酵槽のヘッドスペースの酸素量を調節するか、または好ましくは発酵培地のかきまぜ（もしくは攪拌）速度を調節することにより制御し得る。例えば、高かきまぜ（もしくは攪拌）速度では、低かきまぜ速度の場合より発酵培地中の溶存酸素量が比較的高くなる。例えば、約５３キロリットル（約１４，０００ガロン）容量の発酵槽では、約９０〜約１００時間の総発酵プロセス時間で上記溶存酸素レベルを達成するために、かきまぜ速度は、最初の１２時間は、約５０〜約７０ｒｐｍ、約１２時間目から約１８時間目までは約５５〜約８０ｒｐｍ、約１８時間目から発酵プロセスの終りまでは約７０〜約９０ｒｐｍに設定される。発酵培地中で特定の溶存酸素量を達成するために必要な特定のかきまぜ速度範囲は当業者が容易に決定し得る。
【００３４】
本発明の方法に好ましい温度は、少なくとも約２０℃、より好ましくは少なくとも約２５℃、最も好ましくは少なくとも約３０℃である。冷水は温水より高い量の溶存酸素を保持できると理解すべきである。したがって、高発酵培地温度は、上述のような特に望ましい、溶存酸素量を減少させるという追加利点を有する。
【００３５】
ある種の微生物は、発酵培地中に一定量の塩類溶液ミネラルを要求し得る。これらの塩類溶液ミネラル、特に塩化物イオンは、発酵槽や他の下流加工装置を腐蝕させ得る。発酵倍中に存在する比較的大量の塩化物イオンによるこれらの望ましくない作用を防止または減少させるために、本発明の方法はさらに、発酵培地中にナトリウム源として非塩化物含有ナトリウム塩、好ましくは硫酸ナトリウムを用いることを含み得る。より特定的に言えば、発酵のナトリウム所要量の有意な部分を非塩化物含有ナトリウム塩として供給する。例えば、発酵培地中のナトリウムの約７５％未満、より好ましくは約５０％未満、さらに好ましくは約２５％未満を塩化ナトリウムとして供給する。本発明の微生物は、約３ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約５００ｍｇ／Ｌ未満、さらに好ましくは約２５０ｍｇ／Ｌ未満、より好ましくは約６０〜約１２０ｍｇ／Ｌの塩化物濃度で増殖させ得る。
【００３６】
非塩化物含有ナトリウム塩には、ソーダ灰（炭酸ナトリウムと酸化ナトリウムの混合物）、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物が含まれ得るが、硫酸ナトリウムが好ましい。ソーダ灰、炭酸ナトリウムおよび重炭酸ナトリウムは、発酵培地のｐＨを上昇させる傾向があり、したがって、培地の適切なｐＨを維持する調節ステップが必要である。微生物の塩分所要量を満たす硫酸ナトリウム濃度が有効であり、ナトリウム濃度は、（ｇ／ＬのＮａで表して）好ましくは少なくとも約１ｇ／Ｌ、より好ましくは約１〜約５０ｇ／Ｌの範囲、さらに好ましくは約２〜約２５ｇ／Ｌの範囲である。
【００３７】
微生物の接種、増殖および回収に関する種々の発酵パラメータは、米国特許第５，１３０，２４２号に詳細に述べられており、この特許はその全文が本明細書に援用される。発酵培地から微生物を分離するには、遠心、濾過、限外濾過、デカントおよび溶媒蒸発を含めた現在知られているいずれの分離法を用いてもよい。本発明者らは、本発明の方法によって得られる上記のような高いバイオマス密度のために、微生物の回収に遠心を用いる場合、水を添加することにより発酵培地を希釈してバイオマス密度を低下させ、それによって発酵培地から微生物をより効果的に分離し得ることを見出した。
【００３８】
本発明において達成される超高バイオマス密度により、微生物脂質の「無溶媒」回収法が容易になる。発酵槽中で細胞を溶解する好ましい方法は、２０００年１月１９日出願の「ＳＯＬＶＥＮＴＬＥＳＳ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ」と題する米国仮特許出願第６０／１７７，１２５号、２００１年１月１９日出願の「ＳＯＬＶＥＮＴＬＥＳＳ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ」と題する米国特許出願、および２００１年１月１９日出願の「ＳＯＬＶＥＮＴＬＥＳＳ ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ ＰＲＯＣＥＳＳ」と題するＰＣＴ特許出願に記載されており、これらの特許出願はそれらの全文が本明細書に援用される。（脂質エマルションを分離し、脂質に富む分画を回収し得る）発酵槽中で細胞を透過化、破壊または溶解した後で脂質を回収する好ましい方法には、その全文が本明細書に援用されるＷＯ９６／０５２７８に略記されている脱油法が含まれる。この方法では、油／水エマルションに、水溶性化合物、例えば、アルコールまたはアセトンを添加してエマルションを破壊し、得られた混合物を、比重選別法、例えば、遠心により分離する。この方法は、エマルションの破壊に他の物質（水および／または溶解可能な脂質）を用いるように改変することもできる。
【００３９】
あるいは、発酵培地から水分を蒸発させること、例えば、発酵培地を直接（すなわち、例えば遠心により予備濃縮せずに）ドラム乾燥機装置などの乾燥機と接触させること、すなわち、直接ドラム乾燥機回収法により、発酵培地から微生物を乾燥形態で回収する。微生物の分離に直接ドラム乾燥機回収法を用いる場合、通常、蒸気加熱ドラム乾燥機を用いる。さらに、直接ドラム乾燥機回収法を用いる場合、発酵培地のバイオマス密度は、好ましくは少なくとも約１３０ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも約１８０ｇ／Ｌである。一般に、直接ドラム乾燥機回収法にこの高バイオマス密度が望ましいのは、低バイオマス密度では、発酵培地がドラムを有意に冷却するに十分な水分量を含み、それによって微生物の乾燥が不完全になるからである。スプレー乾燥を含めた他の細胞乾燥法は当業者には周知である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】微生物の種々の脂質生産パラメータ対発酵培地中の溶存酸素量の表およびプロット。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の方法は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／時、好ましくは少なくとも約０．７ｇ／Ｌ／時、より好ましくは少なくとも約０．９ｇ／Ｌ／時、最も好ましくは少なくとも約１．０ｇ／Ｌ／時の平均脂質生産速度を提供する。さらに、本発明の方法により生産される脂質は、約１５％、好ましくは約２０％、より好ましくは約２５％、さらに好ましくは約３０％、最も好ましくは約３５％を超える量の多価不飽和脂質を含む。脂質は、乾燥微生物または発酵培地中の微生物から回収し得る。一般に、本発明の方法で微生物が生産する脂質の少なくとも約２０％、好ましくは脂質の少なくとも約３０％、より好ましくは脂質の少なくとも約４０％、最も好ましくは脂質の少なくとも約５０％は、ω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸である。あるいは、本発明の方法は、少なくとも約０．２ｇのω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）／Ｌ／時、好ましくは少なくとも約０．３ｇのω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）／Ｌ／時、より好ましくは少なくとも約０．４ｇのω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）／Ｌ／時、最も好ましくは少なくとも約０．５ｇのω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）／Ｌ／時の平均ω−３脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）生産速度を提供する。あるいは、本発明の方法は、少なくとも約０．０７ｇのω−６脂肪酸（例えば、ＤＰＡｎ−６）／Ｌ／時、好ましくは少なくとも約０．１ｇのω−６脂肪酸（例えば、ＤＰＡｎ−６）／Ｌ／時、より好ましくは少なくとも約０．１３ｇのω−６脂肪酸（例えば、ＤＰＡｎ−６）／Ｌ／時、最も好ましくは少なくとも約０．１７ｇのω−６脂肪酸（例えば、ＤＰＡｎ−６）の平均ω−６脂肪酸（例えば、ＤＰＡｎ−６）生産速度を提供する。あるいは、（総脂肪酸メチルエステルに基づく）脂質の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約３５％、最も好ましくは少なくとも約４０％がＤＨＡである。
【００４２】
微生物、微生物から抽出された脂質、脂質抽出後に残留するバイオマスまたはそれらの組み合わせは、飲料、ソース、（ミルク、ヨーグルト、チーズおよびアイスクリームなどの）乳製品、ならびに焼き菓子類中の成分などの食物成分；（カプセルまたは錠剤形態の）栄養サプリメント；肉や産物をヒトが消費する任意の動物用の飼料または飼料サプリメント；ベビーフードおよび乳児用調合乳を含めた食物サプリメント；ならびに（直接または付加療法用の）医薬品として直接用い得る。用語「動物」とは、動物界に属する任意の生体を意味し、トリ肉、シーフード、ビーフ、ポークまたはラムが由来する任意の動物を包含するがそれらには限定されない。シーフードは、魚、小形エビおよび貝由来であるが、それらには限定されない。用語「産物」には、卵、乳または他の産物を含むがそれらには限定されない上記動物由来の肉以外の任意の産物が含まれる。上記動物に与えると、多価不飽和脂質は、動物の肉、乳、卵または他の産物中に組み込まれて、動物の多価不飽和脂質含量を増大させ得る。
本発明のさらなる目的、利点および新規特徴は、本発明を制限するものではない以下の実施例を吟味すれば当業者には明らかになるであろう。
【実施例】
【００４３】
これらの実施例に用いたシゾキトリウム株は、広くさまざまな発酵条件下に、概して約３：１比の２種の主要ポリエン酸、ＤＨＡｎ−３およびＤＰＡｎ−６と、ＥＰＡおよびＣ２０：３などの少量の他のポリエン酸を生産する。したがって、以下の実施例にはＤＨＡの量しか列挙されていないが、上記に開示されている比率を用いることにより、生産されるＤＰＡ（ｎ−６）の量は容易に計算し得る。
【００４４】
実施例１
この実施例は、脂質の生産性に及ぼす発酵培地中の酸素含量の影響を示している。
種々の溶存酸素レベルにおけるシゾキトリウム ＡＴＣＣ２０８８８番の発酵結果を測定した。結果を図１に示すが、図中、ＲＣＳは糖の残留濃度、ＤＣＷは乾燥細胞重量である。
【００４５】
実施例２
この実施例も最終バイオマス産物のＤＨＡ含量（％乾燥重量）に及ぼす発酵培地中の低酸素含量の影響を示している。
大型発酵槽で培養したシゾキトリウム種細胞中のＤＨＡ含量に及ぼす低酸素含量の影響を模擬するために、２５０ｍｌ三角フラスコで「縮小（スケールダウン）」実験を実施した。シゾキトリウム種（ＡＴＣＣ２０８８８番）をＯ４−４培地中で培養した。この培地は、脱イオン水に溶かした１リットル当たりの以下の成分からなっていた：Ｎａ２ＳＯ４ １２．６１ｇ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ；ＫＣｌ ０．２５ｇ；ＣａＣｌ２ ０．０５ｇ；グルタミン酸一ナトリウム ７．０ｇ；グルコース １０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ；ＮａＨＣＯ３ ０．１ｇ；酵母エキス ０．１ｇ；ビタミンミックス １．０ｍＬ；ＰＩＩ金属 １．００ｍＬ。ＰＩＩ金属ミックスは（１リットル当たり）：６．０ｇのＮａ２ＥＤＴＡ、０．２９ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、６．８４ｇのＨ３ＢＯ３、０．８６ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．０６ｇのＺｎＣｌ２、０．０２６ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０５２ｇのＮｉＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．００２ｇのＣｕＳＯ４・Ｈ２Ｏおよび０．００５ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏを含む。ビタミンミックスは（１リットル当たり）：１００ｍｇのチアミン、０．５ｍｇのビオチンおよび０．５ｍｇのシアノコバラミンを含む。培地のｐＨを７．０に調整し、次いでフィルター滅菌した。
【００４６】
この縮小実験を行った理由は、それぞれ異なる量の培地を有する振とうフラスコ中で細胞を培養するためであった。ほとんど満杯のフラスコ（例えば、２５０ｍＬ振とうフラスコ中２００ｍＬ）は振とうテーブル上では良く混ざらず、したがって、細胞が増殖するにつれ、低溶存酸素状態が発生するであろう。したがって、この実験では、４種の処置を設定し、それぞれを２回実施した：（１）２５０ｍＬフラスコに５０ｍＬの培地を充填；（２）２５０ｍＬフラスコに１００ｍＬの培地を充填；（３）２５０ｍＬフラスコに１５０ｍＬの培地を充填；（４）２５０ｍＬ振とうフラスコに２００ｍＬの培地を充填。８つのフラスコそれぞれに、処理１の条件下、２８℃、振とうテーブル上２２０ｒｐｍで、Ｏ４−４培地中で４８時間培養したシゾキトリウム培養株からの細胞を接種した。
【００４７】
この実験用の８つのフラスコすべてを、インキュベータ（２８℃）の振とうテーブル（２２０ｒｐｍ）上に乗せ、暗所で４８時間培養した。実験後、各フラスコ中の溶存酸素（ＤＯ）レベルをＹＳＩ溶存酸素メーターで測定し、培地のｐＨ、細胞乾燥重量および細胞の脂肪酸含量も測定した。実験結果を表１に概説する。
【００４８】
【表１】
これらの結果は、（％ＦＡＭＥとしての）脂質含量およびＤＨＡ含量（％乾燥重量）は、低溶存酸素レベルで培養した細胞では高く、溶存酸素レベルが低くなるほど、脂質およびＤＨＡ含量が高くなったことを示している。これは、一般に脱飽和（二重）結合の形成には酸素が必要であると考えられていたので、予想外である。ＤＨＡは最も不飽和な脂肪酸の１つであるから、そのように多くのＤＨＡが低溶存酸素レベルで形成されたのは驚くべきことである。溶存酸素レベルが低下するにつれバイオマスの生産は低下するが、ＤＨＡ含量は増大する。したがって、高溶存酸素レベルでバイオマスの形成を最大にし、次いで、低溶存酸素レベルで長鎖脂肪酸の生産を最大にする増殖期を有するのが有利である。
【００４９】
実施例３
この実施例は、本発明の方法の再現性を示している。
１，２００ガロンの呼称作業容量を有する発酵槽を用いて微生物を生産した。得られた発酵ブロスを濃縮し、ドラム乾燥機を用いて微生物を乾燥した。得られた微生物のアリコートから脂質を抽出し、精製して、精製、脱色、脱臭した油を得た。脂質を分析する前に、栄養を補うために約３，０００ｐｐｍのｄ−ｌ−α−酢酸トコフェリルを加えた。
【００５０】
シゾキトリウムＡＴＣＣ２０８８８番の９回の発酵を実行し、その結果を表２に示す。最初の２４時間の溶存酸素レベルは約８％であり、その後は約４％であった。
【００５１】
【表２】
発酵槽中の容量が約４．５ｋｌ（約１，２００ガロン）に達するまでコーンシロップを充填し、約４．５ｋｌ（約１，２００ガロン）に達した時点でコーンシロップの添加を停止した。残留糖濃度が５ｇ／Ｌを下回った時点で発酵プロセスを停止した。接種から最後までの典型的な発酵時間は約１００時間であった。
【００５２】
発酵ブロス、すなわち、発酵培地を約２：１比を用いて水で希釈して、最終産物の灰含量を低減させ、遠心ステップにおける相分離の増進を支援した。濃縮細胞ペーストを７１℃（１６０°Ｆ）に加熱し、Ｂｌａｗ Ｋｎｏｘダブルドラム乾燥機〔１０６．６８ｃｍ×９１．４４ｃｍ（４２”×３６”）〕で乾燥した。しかし、微生物は前もって遠心せずに直接ドラム乾燥機上で乾燥するのが好ましい。
【００５３】
表２の各記入項目のアリコートから抽出した脂質の分析結果を表３に概説する。
【表３】
特に断りの無い限り、実施例項全体に用いた発酵培地は以下の成分を含み、最初の数時は呼称目標濃度を示し、（ ）内の数字は許容可能範囲を示す：硫酸ナトリウム １２ｇ／Ｌ（１１−１３）；ＫＣｌ ０．５ｇ／Ｌ（０．４５−０．５５）；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２ｇ／Ｌ（１．８−２．２）；Ｈｏｄａｇ Ｋ−６０消泡剤 ０．３５ｇ／Ｌ（０．３−０．４）；Ｋ２ＳＯ４ ０．６５ｇ／Ｌ（０．６０−０．７０）；ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ（０．９−１．１）；（ＮＨ４）２ＳＯ４ １ｇ／Ｌ（０．９５−１．１）；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．１７ｇ／Ｌ（０．１５−０．１９）；９５ＤＥコーンシロップ（固体ベース）４．５ｇ／Ｌ（２−１０）；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ（２．７−３．３）；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ３ｍｇ／Ｌ（２．７−３．３）；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０４ｍｇ／Ｌ（０．０３５−０．０４５）；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０４ｍｇ／Ｌ（０−０．０４５）；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ２ｍｇ／Ｌ（１．８−２．２）；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ２ｍｇ／Ｌ（１．８−２．２）；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ（９−１１）；チアミン ９．５ｍｇ／Ｌ（４−１５）；ビタミンＢ１２ ０．１５ｍｇ／Ｌ（０．０５−０．２５）およびパントテン酸カルシウム ３．２ｍｇ／Ｌ（１．３−５．１）。さらに、窒素源として２８％ ＮＨ４ＯＨ溶液を用いる。
【００５４】
乾燥微生物の灰含量は約６重量％である。
【００５５】
実施例４
この実施例は、約５３キロリットル（１４，０００ガロン）スケールの微生物生産性に及ぼす発酵培地中の低減溶存酸素レベルの影響を示している。
実施例３に記載の手順を用い、上述の米国特許第５，３４０，５９４号および同第５，３４０，７４２号に開示されている分離法を用いて得られる野生型シゾキトリウム株を用いて、１４，０００ガロン呼称容量発酵を実施した。発酵培地中の溶存酸素レベルは、最初の２４時間には約８％であり、２４時間目から４０時間目までは約４％、４０時間目から発酵プロセスの終りまでは約０．５％であった。この発酵培地中低溶存酸素レベルプロセスの結果を表４に示す。
【００５６】
【表４】
実施例５
この実施例は、約１５５キロリットル（４１，０００ガロン）スケールの微生物生産性に及ぼす発酵培地中の低溶存酸素レベルの影響を示している。
【００５７】
約１５５キロリットル（４１，０００ガロン）発酵槽で発酵を実施したこと以外は、実施例４と同じ手順を用いた。このスケールで目的化合物濃度を維持するために、培地量を増やした。結果を表５に示す。
【００５８】
【表５】
実施例６
この実施例は、本発明の発酵プロセスに及ぼす追加窒素の影響を示している。
実施例４と類似の手順を用い、２５０−Ｌスケールのフェッドバッチ実験を４セット実施した。２種の対照実験と、追加のアンモニア（標準量の１．１５倍と１．２５倍）を含む２種の実験を行った。結果を表６に示す。
【００５９】
【表６】
一般に、追加窒素は、追加アンモニアを加えた２つのバッチのＤＨＡ生産性に有意な低下が観察されたので、発酵性能に負の影響を与える。表６に示されているように、対照バッチでは、最終ＤＨＡレベルが１８．４％および総細胞乾燥重量が２２．１％であったのに対し、追加窒素補充バッチでは、それぞれ、９．２％（１．１５倍のアンモニア）および１２．６％（１．２５倍のアンモニア）であった。
【００６０】
実施例７
この実施例は本発明の発酵プロセスの動力学的プロフィールを示している。
実施例４と類似の手順を用いて約３．８キロリットル（１，０００）ガロンスケールのフェッドバッチ実験を行った。本発明の発酵法の動的プロフィールを表７に示す。
【００６１】
表７． シゾキトリウムの約３．８キロリットル（１，０００）スケールフェッドバッチ発酵の動的プロフィール
【００６２】
【表７】
実施例８
この実施例は生産性に及ぼす炭素源量の影響を示している。
実施例４の方法を用い、種々の量の炭素源を用いて、３種の異なる発酵法を実施した。結果を表８に示す。
【００６３】
【表８】
実施例９
この実施例は、バイオマス、脂質（最も特定的にはＤＨＡ）に対する炭素転化効率に及ぼす栄養制限の影響を示している。
【００６４】
以下の化合物（呼称濃度）からなる基本増殖（ＩＣＭ−２）培地中の２リットル容量Ａｐｐｌｉｋｏｎ発酵槽中でシゾキトリウム ＡＴＣＣ２０８８８番を培養して、栄養制限の影響を調べる連続培養実験を実施した：グループＩ成分：Ｎａ２ＳＯ４（１８．５４ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（２．０ｇ／Ｌ）およびＫＣＬ（０．５７２ｇ／Ｌ）；グループＩＩ成分（それぞれ別個に調製）：グルコース（４３．８１ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（１．２８ｇ／Ｌ）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０２５ｇ／Ｌ）および（ＮＨ４）２ＳＯ４（６．５３８ｇ／Ｌ）；グループＩＩＩ成分：Ｎａ２ＥＤＴＡ（６．０ｍｇ／Ｌ）、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（０．２９ｍｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（６．８４ｍｇ／Ｌ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（０．８６ｍｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．２３４７ｍｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０２６ｍｇ／Ｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（０．００５ｍｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（０．００２ｍｇ／Ｌ）およびＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ（０．０５２ｍｇ／Ｌ）；ならびにグループＩＶ成分：チアミンＨＣｌ（０．２ｍｇ／Ｌ）、ビタミンＢ１２（０．００５ｍｇ／Ｌ）、パントテン酸カルシウム（０．２ｍｇ／Ｌ）。発酵槽に加える前に、グループＩおよびＩＩはオートクレーブ滅菌し、グループＩＩＩおよびＩＶはフィルター滅菌した。次いで、成長培地にシゾキトリウム属を接種し、最大細胞密度が得られるまで、３０℃、ｐＨ５．５および２０％の溶存酸素飽和度の制御条件下に増殖させた。
【００６５】
次いで、同時に滅菌ＩＣＭ−２供給培地を発酵槽にポンプで汲み上げ、定常状態に達するまで、シゾキトリウム細胞を含むブロスを０．０６ｈｒ−１の希釈速度を維持するに十分な流速で除去して、連続作業モードを確立した。栄養制限の影響を調べるために、出口細胞含有ブロス中に特定の要求栄養素が無くなるように、ＩＣＭ−２供給培地中のこの栄養素を含有する化合物を少なくすると、特定要求栄養素の不在によって細胞の増殖が制限される。各条件に適した定常状態が確立されたら、最終ブロス乾燥バイオマス、残留グルコース、ならびに細胞の制限栄養素濃度、細胞の脂質含量および細胞のＤＨＡ含量を測定した。消費された総グルコースを形成された総乾燥バイオマスで割って、グルコースのバイオマスへの転化効率を計算し、百分率ベースで表した。
【００６６】
以下の表にリストされている個々の栄養素に関してこの実験を繰り返し、個々の栄養素による制限増殖の影響を研究した。最終結果を以下の表に要約する：
表９．シゾキトリウム種のバイオマス収率、転化効率（グルコース→バイオマス）、脂質含量およびＤＨＡ含量に及ぼす栄養制限の影響
【００６７】
【表９】
上記表から、窒素を制限すると、細胞中でＤＨＡの蓄積が最高になり、次いで、リン酸塩、ナトリウム、ニッケル、マンガン、グルコース（炭素）、亜鉛および鉄の順であったことは明らかである。これらの栄養素の１種以上を細胞増殖を制限するのに十分な速度でバッチ発酵に供給することにより、この情報を商業用に利用することができる。最も好ましいケースでは、細胞のＤＨＡ含量を最大にするために、窒素を制限的にバッチ発酵に供給する。バイオマスまたは他の有益な産物の生産を最大にするために、他の栄養素（またはそれらの混合物）を制限的に供給し得る。この発酵制御法における制限栄養素として、硫黄などの評価されなかった他の生物学的に要求される成分または栄養素を用いることも可能である。
【００６８】
本発明は、種々の実施形態において、種々の実施形態、それらの副組み合わせおよび部分セットを含めた、本明細書に実質的に提示かつ記載されている構成成分、方法、プロセス、システムおよび／または装置を含む。当業者が本発明の開示を理解すれば、本発明の形成法および使用法が分るであろう。本発明は、種々の実施形態において、例えば、性能を改善したり、実施しやすくしたりかつ／または実施コストを低減させたりするために、これまでの装置または方法に用いられていたであろう品目の不在下を含めた、本発明またはその種々の実施形態において提示かつ／または記載されていない品目の不在下に装置および方法を提供することを含む。
【００６９】
本発明の上記説明は、例示および説明の目的で提示されている。上記説明は、本発明を本明細書に開示されている１つまたは複数の形態に限定しようとするものではない。本発明の説明には、１つ以上の実施形態や、いくつかの変形や改良の説明が含まれているが、例えば、本発明の開示を理解した後では当業者の技術および知識の範囲内に含まれ得る他の変形および改良も本発明の範囲内にある。本明細書に開示されているか否かに拘わらず、また、特許を受けることができる主題を公開するつもりなしに、権利請求されているものの代替となるか、交換可能であるか、かつ／または同等な構造、機能、範囲またはステップを含めた、許容される程度の代替実施形態を含む権利を得ることを意図する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのバイオマスの少なくとも約２０％を脂質として生産することができる真核微生物から、ポリエン脂肪酸を含む脂質を生産する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、非アルコール炭素源と制限栄養素源とを加えることから成る方法。
【請求項２】
前記方法は、バイオマス密度増大段階と生産段階とから成り、前記バイオマス密度増大段階は、前記炭素源と前記制限栄養素源とを加えること含み、前記生産段階は、脂質生産を引き起こす前記栄養素制限状態を誘導するために前記制限栄養素源を全く加えないかあるいはほどんど加えない状態で前記炭素源を加えることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生産段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量は、前記バイオマス密度増大段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量よりも低い、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマス密度増大段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量は、少なくとも約４％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生産段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量は、約１％未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非アルコール炭素源は炭水化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記制限栄養素源は、窒素源、炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（例えばビタミンＢ１２、パントテン酸塩源、チアミン源）、微量金属源（例えば亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源）および主要金属源（例えばマグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源）、珪酸源、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項１の方法。
【請求項８】
前記微量金属源および主要金属源が、それらの金属の硫酸塩および塩化物の塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４）ならびにそれらの混合物から成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記制限栄養素源は窒素源を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記窒素源は無機アンモニウム塩を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記窒素源は水酸化アンモニウムを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
発酵培地のｐＨは前記制限栄養素源によって調節される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵培地は少なくとも約２０℃の温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂質の少なくとも約１５％は多価不飽和脂質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ω−３およびω６脂肪酸の合計量は、前記脂質の少なくとも約２０％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物は飽和の約３％未満の発酵培地の酸素レベルで脂質を生産することができる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物は供給バッチ方法において生育する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記発酵方法の生産期の間、前記発酵培地で飽和の約３％未満の酸素レベルを維持することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記微生物は微小藻類および藻類様微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記微生物はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物はスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
そのバイオマスの少なくとも約２０％を脂質として生産することができる真核微生物を生育する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、炭素源と制限栄養素源とを加えることから成り、前記方法は約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産し、前記微生物によって生産された脂質の合計の少なくとも約１５％は多価不飽和脂質である、方法。
【請求項２７】
前記方法は、
（ａ）発酵培地中の溶存酸素レベルが少なくとも約４％である、バイオマス密度増大段階；
（ｂ）発酵培地中の溶存酸素レベルが約１％未満である、高い脂質生産段階；からさらに成る、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記炭素源は非アルコール炭素源である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記制限栄養素源は、窒素源、炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（例えばビタミンＢ１２、パントテン酸塩源、チアミン源）、微量金属源（例えば亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源）および主要金属源（例えばマグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源）、珪酸源、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記微量金属源および主要金属源が、それらの金属の硫酸塩および塩化物の塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４）ならびにそれらの混合物から成る群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記制限栄養素源は窒素源を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記窒素源は無機アンモニウム塩を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記微生物は微小藻類である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記微生物はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目である、請求項２６の方法。
【請求項３７】
前記微生物はスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
ω−３およびω−６脂肪酸の合計量は、前記脂質の少なくとも約２０％である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
真核微生物を生育する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、炭素源と制限栄養素源とを加えることから成り、前記微生物は、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物は、自身のバイオマスの少なくとも約２０％を、いくつかのポリエン脂肪酸を含む脂質として生産することができる、方法。
【請求項４１】
前記方法は少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で微生物脂質を生産する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記脂質の少なくとも約１５％は多価不飽和脂質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ω−３およびω−６多価不飽和脂肪酸の合計量は、前記脂質の少なくとも約２０％である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも平均で約０．２ｇ／Ｌ／ｈｒのドコサヘキサエン酸を生産する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記炭素源は非アルコールである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記炭素源は炭水化物である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記制限栄養素源は、窒素源、炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（例えばビタミンＢ１２、パントテン酸塩源、チアミン源）、微量金属源（例えば亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源）および主要金属源（例えばマグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源）、珪酸源、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記微量金属源および主要金属源が、それらの金属の硫酸塩および塩化物の塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４）ならびにそれらの混合物から成る群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記制限栄養素源は窒素源を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記窒素源は無機アンモニウム塩を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記窒素源は水酸化アンモニウムを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
前記微生物は微小藻類および藻類様微生物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５５】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５６】
真核微生物脂質を生産する方法であって、
（ａ）前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるために発酵培地で真核微生物を生育するステップと、
（ｂ）前記微生物が前記脂質を生産できるのに十分な発酵条件を提供するステップと、
（ｃ）約１５％よりも多くが多価不飽和脂質である前記脂質を回収するステップと、から成る方法。
【請求項５７】
前記微生物を生育するステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルは、前記脂質を生産するステップ中の発酵培地中の溶存酸素レベルよりも高い、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記微生物を生育するステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルは、少なくとも約４％である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記脂質を生産するステップ中の発酵培地中の溶存酸素レベルは、約１％未満である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記微生物は微小藻類および藻類様微生物である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記微生物はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記微生物はスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
ω−３およびω−６脂肪酸の合計量は、前記微生物脂質の少なくとも約２０％である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
前記微生物脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
少なくとも約０．２ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度でドコサヘキサエン酸を生産する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６８】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）前記発酵培地から水を除去し、乾燥微生物を提供するステップと、
（ｅ）前記乾燥微生物から前記脂質を単離するステップとから成る、請求項５６に記載の方法。
【請求項６９】
前記水を除去するステップは、前もって遠心せずにドラム乾燥機上で前記発酵培地を直接接触させることを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）発酵培地を処理して、微生物細胞を透過化、溶解、または破裂させるステップと、
（ｅ）脂質／水エマルションの破壊を援助する作用物質の支援があるかまたは支援がない状態で、比重選別法により発酵培地から脂質を回収するステップと、から成る、請求項５６に記載の方法。
【請求項７１】
前記微生物細胞はステップ（ｄ）において発酵槽または同様な容器中で処理される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記比重選別法は遠心を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記微生物を生育するステップは、炭素源および制限栄養素源を加えることを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項７４】
前記炭素源は非アルコールである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記炭素源は炭水化物を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記制限栄養素源は、窒素源、炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（例えばビタミンＢ１２、パントテン酸塩源、チアミン源）、微量金属源（例えば亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源）および主要金属源（例えばマグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源）、珪酸源、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記微量金属源および主要金属源が、それらの金属の硫酸塩および塩化物の塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４）ならびにそれらの混合物から成る群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記制限栄養素源は窒素源を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記窒素源は無機アンモニウム塩を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記窒素源は水酸化アンモニウムを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
真核微生物脂質を生産する方法であって、
（ａ）前記微生物を含む発酵培地に、非アルコール炭素源および制限栄養素源を加えるステップと、
（ｂ）前記微生物が前記微生物脂質を生産するのに十分な条件を提供するステップと、
（ｃ）少なくとも約１５％が多価不飽和脂質である前記微生物脂質を回収するステップと、から成る方法。
【請求項８２】
バイオマス密度増大ステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルは、脂質を生産するステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルよりも高い、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
バイオマス密度増大ステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルは、少なくとも約４％である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
脂質を生産するステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルは、約１％以下である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８８】
前記微生物は微小藻類および藻類様微生物である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８９】
前記微生物はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目である、請求項８１に記載の方法。
【請求項９０】
前記微生物はスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項９１】
前記方法は少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で微生物脂質を生産する、請求項８１に記載の方法。
【請求項９２】
ω−３およびω−６多価不飽和脂肪酸の合計量は、前記微生物脂質の少なくとも約２０％である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項８１に記載の方法。
【請求項９４】
少なくとも約０．２ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度でドコサヘキサエン酸を生産する、請求項８１に記載の方法。
【請求項９５】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）前記発酵培地から水を除去し、乾燥微生物を提供するステップと、
（ｅ）前記乾燥微生物から前記脂質を単離するステップとから成る、請求項５８に記載の方法。
【請求項９６】
前記水を除去するステップは、前もって遠心せずに前記発酵培地から直接水を蒸発させることを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）発酵培地を処理して、微生物細胞を透過化、溶解、または破裂させるステップと、
（ｅ）脂質／水エマルションの破壊を援助する作用物質の支援があるかまたは支援がない状態で、比重選別法により発酵培地から脂質を回収するステップと、から成る、請求項８１に記載の方法。
【請求項９８】
前記微生物細胞はステップ（ｄ）において発酵槽または同様な容器中で処理される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記比重選別法は遠心を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記非アルコール炭素源は炭水化物を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項１０１】
前記制限栄養素源は、窒素源、炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（例えばビタミンＢ１２、パントテン酸塩源、チアミン源）、微量金属源（例えば亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源）および主要金属源（例えばマグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源）、珪酸源、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項１０２】
前記微量金属源および主要金属源が、それらの金属の硫酸塩および塩化物の塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４）ならびにそれらの混合物から成る群より選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記制限栄養素源は窒素源を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記窒素源は無機アンモニウム塩を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記窒素源は水酸化アンモニウムを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
真核微生物脂質を生産する方法であって、
（ａ）真核微生物を含む発酵培地に、炭素源および制限栄養素源を加え、少なくとも約１００ｇ／Ｌのバイオマス密度を生産するよう前記発酵培地中の溶存酸素レベルを少なくとも約４％に維持するのに十分な条件を提供するステップと、
（ｂ）前記発酵培地中の溶存酸素レベルを約１％以下に維持するのに十分な条件を提供し、前記微生物が前記脂質を生産することができるのに十分な条件を提供するステップと、
（ｃ）少なくとも約１５％が多価不飽和脂質である前記微生物脂質を回収するステップと、から成る方法。
【請求項１０７】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記微生物は微小藻類および藻類様微生物である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
前記微生物はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１２】
前記微生物はスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１３】
ω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸の合計量は、前記微生物脂質の少なくとも約２０％である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１４】
前記微生物脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１５】
少なくとも約０．２ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度でドコサヘキサエン酸を生産する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１６】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）前記発酵培地から水を除去し、乾燥微生物を提供するステップと、
（ｅ）前記乾燥微生物から前記脂質を単離するステップとから成る、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１７】
前記水を除去するステップは、前もって遠心せずに前記発酵培地から直接水を蒸発させることを含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）発酵培地を処理して、微生物細胞を透過化、溶解、または破裂させるステップと、
（ｅ）脂質／水エマルションの破壊を援助する作用物質の支援があるかまたは支援がない状態で、比重選別法により発酵培地から脂質を回収するステップと、から成る、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記微生物細胞はステップ（ｄ）において発酵槽または同様な容器中で処理される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記比重選別法は遠心を含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
微生物のポリエン脂肪酸含量を豊富にする方法であって、１０％未満の溶存酸素レベルを有する成長培地で、前記微生物を発酵させることを含む方法。
【請求項１２２】
前記溶存酸素レベルは５パーセント未満である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記溶存酸素レベルは１パーセント未満である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
最初の成長期の間、溶存酸素レベルは約１０パーセントより大きく、後の生産期の間、溶存酸素レベルは１０パーセント未満である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２５】
前記微生物はポリケチドシンターゼ遺伝子を有する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２６】
産物と微生物を生産する従属栄養方法であって、
ａ．ポリケチドシンターゼ遺伝子を有する前記微生物を成長培地中で培養するステップと、
ｂ．溶存酸素レベルを約１０パーセント未満に維持するステップと、から成る方法。
【請求項１２７】
前記溶存酸素レベルは約５パーセント未満である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記溶存酸素レベルは約１パーセント未満である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ポリケチドシンターゼ遺伝子が前記微生物中で天然で生じる、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ポリケチドシンターゼ遺伝子は前記微生物へ遺伝学的に導入される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３１】
最初の成長期の間、溶存酸素レベルは約１０パーセントより大きく、後の生産期の間、溶存酸素レベルは１０パーセント未満である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１】
そのバイオマスの少なくとも約２０％を脂質として生産することができる真核微生物から、ポリエン脂肪酸を含む脂質を生産する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、非アルコール炭素源と制限栄養素源とを加えることから成る方法。
【請求項２】
前記方法は、バイオマス密度増大段階と生産段階とから成り、前記バイオマス密度増大段階は、前記炭素源と前記制限栄養素源とを加えること含み、前記生産段階は、脂質生産を引き起こす前記栄養素制限状態を誘導するために前記制限栄養素源を全く加えないかあるいはほどんど加えない状態で前記炭素源を加えることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生産段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量は、前記バイオマス密度増大段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量よりも低い、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマス密度増大段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量は、少なくとも約４％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生産段階中の前記発酵培地中の溶存酸素量は、約１％未満である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非アルコール炭素源は炭水化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記制限栄養素源は、窒素源、炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（例えばビタミンＢ１２、パントテン酸塩源、チアミン源）、微量金属源（例えば亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源）および主要金属源（例えばマグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源）、珪酸源、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項１の方法。
【請求項８】
前記微量金属源および主要金属源が、それらの金属の硫酸塩および塩化物の塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４）ならびにそれらの混合物から成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記制限栄養素源は窒素源を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記窒素源は無機アンモニウム塩を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記窒素源は水酸化アンモニウムを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
発酵培地のｐＨは前記制限栄養素源によって調節される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵培地は少なくとも約２０℃の温度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記脂質の少なくとも約１５％は多価不飽和脂質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ω−３およびω６脂肪酸の合計量は、前記脂質の少なくとも約２０％である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物は飽和の約３％未満の発酵培地の酸素レベルで脂質を生産することができる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記微生物は供給バッチ方法において生育する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記発酵方法の生産期の間、前記発酵培地で飽和の約３％未満の酸素レベルを維持することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記微生物は微小藻類および藻類様微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記微生物はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記微生物はスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
そのバイオマスの少なくとも約２０％を脂質として生産することができる真核微生物を生育する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、炭素源と制限栄養素源とを加えることから成り、前記方法は約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で脂質を生産し、前記微生物によって生産された脂質の合計の少なくとも約１５％は多価不飽和脂質である、方法。
【請求項２７】
前記方法は、
（ａ）発酵培地中の溶存酸素レベルが少なくとも約４％である、バイオマス密度増大段階；
（ｂ）発酵培地中の溶存酸素レベルが約１％未満である、高い脂質生産段階；からさらに成る、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記炭素源は非アルコール炭素源である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記制限栄養素源は、窒素源、炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（例えばビタミンＢ１２、パントテン酸塩源、チアミン源）、微量金属源（例えば亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源）および主要金属源（例えばマグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源）、珪酸源、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記微量金属源および主要金属源が、それらの金属の硫酸塩および塩化物の塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４）ならびにそれらの混合物から成る群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記制限栄養素源は窒素源を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記窒素源は無機アンモニウム塩を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記微生物は微小藻類である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記微生物はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目である、請求項２６の方法。
【請求項３７】
前記微生物はスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
ω−３およびω−６脂肪酸の合計量は、前記脂質の少なくとも約２０％である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
真核微生物を生育する方法であって、前記微生物を含む発酵培地に、前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるのに十分な速度で、炭素源と制限栄養素源とを加えることから成り、前記微生物は、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物は、自身のバイオマスの少なくとも約２０％を、いくつかのポリエン脂肪酸を含む脂質として生産することができる、方法。
【請求項４１】
前記方法は少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で微生物脂質を生産する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記脂質の少なくとも約１５％は多価不飽和脂質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ω−３およびω−６多価不飽和脂肪酸の合計量は、前記脂質の少なくとも約２０％である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも平均で約０．２ｇ／Ｌ／ｈｒのドコサヘキサエン酸を生産する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記炭素源は非アルコールである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記炭素源は炭水化物である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記制限栄養素源は、窒素源、炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（例えばビタミンＢ１２、パントテン酸塩源、チアミン源）、微量金属源（例えば亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源）および主要金属源（例えばマグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源）、珪酸源、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記微量金属源および主要金属源が、それらの金属の硫酸塩および塩化物の塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４）ならびにそれらの混合物から成る群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記制限栄養素源は窒素源を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
前記窒素源は無機アンモニウム塩を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記窒素源は水酸化アンモニウムを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
前記微生物は微小藻類および藻類様微生物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５５】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項５６】
真核微生物脂質を生産する方法であって、
（ａ）前記発酵培地のバイオマス密度を少なくとも約１００ｇ／Ｌに増大させるために発酵培地で真核微生物を生育するステップと、
（ｂ）前記微生物が前記脂質を生産できるのに十分な発酵条件を提供するステップと、
（ｃ）約１５％よりも多くが多価不飽和脂質である前記脂質を回収するステップと、から成る方法。
【請求項５７】
前記微生物を生育するステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルは、前記脂質を生産するステップ中の発酵培地中の溶存酸素レベルよりも高い、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記微生物を生育するステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルは、少なくとも約４％である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記脂質を生産するステップ中の発酵培地中の溶存酸素レベルは、約１％未満である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記微生物は微小藻類および藻類様微生物である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６３】
前記微生物はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記微生物はスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
ω−３およびω−６脂肪酸の合計量は、前記微生物脂質の少なくとも約２０％である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
前記微生物脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
少なくとも約０．２ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度でドコサヘキサエン酸を生産する、請求項５６に記載の方法。
【請求項６８】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）前記発酵培地から水を除去し、乾燥微生物を提供するステップと、
（ｅ）前記乾燥微生物から前記脂質を単離するステップとから成る、請求項５６に記載の方法。
【請求項６９】
前記水を除去するステップは、前もって遠心せずにドラム乾燥機上で前記発酵培地を直接接触させることを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）発酵培地を処理して、微生物細胞を透過化、溶解、または破裂させるステップと、
（ｅ）脂質／水エマルションの破壊を援助する作用物質の支援があるかまたは支援がない状態で、比重選別法により発酵培地から脂質を回収するステップと、から成る、請求項５６に記載の方法。
【請求項７１】
前記微生物細胞はステップ（ｄ）において発酵槽または同様な容器中で処理される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記比重選別法は遠心を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記微生物を生育するステップは、炭素源および制限栄養素源を加えることを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項７４】
前記炭素源は非アルコールである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記炭素源は炭水化物を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記制限栄養素源は、窒素源、炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（例えばビタミンＢ１２、パントテン酸塩源、チアミン源）、微量金属源（例えば亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源）および主要金属源（例えばマグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源）、珪酸源、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記微量金属源および主要金属源が、それらの金属の硫酸塩および塩化物の塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４）ならびにそれらの混合物から成る群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記制限栄養素源は窒素源を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記窒素源は無機アンモニウム塩を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記窒素源は水酸化アンモニウムを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
真核微生物脂質を生産する方法であって、
（ａ）前記微生物を含む発酵培地に、非アルコール炭素源および制限栄養素源を加えるステップと、
（ｂ）前記微生物が前記微生物脂質を生産するのに十分な条件を提供するステップと、
（ｃ）少なくとも約１５％が多価不飽和脂質である前記微生物脂質を回収するステップと、から成る方法。
【請求項８２】
バイオマス密度増大ステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルは、脂質を生産するステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルよりも高い、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
バイオマス密度増大ステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルは、少なくとも約４％である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
脂質を生産するステップ中の前記発酵培地中の溶存酸素レベルは、約１％以下である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８８】
前記微生物は微小藻類および藻類様微生物である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８９】
前記微生物はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目である、請求項８１に記載の方法。
【請求項９０】
前記微生物はスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項９１】
前記方法は少なくとも約０．５ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度で微生物脂質を生産する、請求項８１に記載の方法。
【請求項９２】
ω−３およびω−６多価不飽和脂肪酸の合計量は、前記微生物脂質の少なくとも約２０％である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項８１に記載の方法。
【請求項９４】
少なくとも約０．２ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度でドコサヘキサエン酸を生産する、請求項８１に記載の方法。
【請求項９５】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）前記発酵培地から水を除去し、乾燥微生物を提供するステップと、
（ｅ）前記乾燥微生物から前記脂質を単離するステップとから成る、請求項５８に記載の方法。
【請求項９６】
前記水を除去するステップは、前もって遠心せずに前記発酵培地から直接水を蒸発させることを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）発酵培地を処理して、微生物細胞を透過化、溶解、または破裂させるステップと、
（ｅ）脂質／水エマルションの破壊を援助する作用物質の支援があるかまたは支援がない状態で、比重選別法により発酵培地から脂質を回収するステップと、から成る、請求項８１に記載の方法。
【請求項９８】
前記微生物細胞はステップ（ｄ）において発酵槽または同様な容器中で処理される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記比重選別法は遠心を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記非アルコール炭素源は炭水化物を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項１０１】
前記制限栄養素源は、窒素源、炭素源、リン酸塩源、ビタミン源（例えばビタミンＢ１２、パントテン酸塩源、チアミン源）、微量金属源（例えば亜鉛源、銅源、コバルト源、ニッケル源、鉄源、マンガン源、モリブデン源）および主要金属源（例えばマグネシウム源、カルシウム源、ナトリウム源、カリウム源）、珪酸源、およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項１０２】
前記微量金属源および主要金属源が、それらの金属の硫酸塩および塩化物の塩（例えばＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ；ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；ＣａＣｌ２；Ｋ２ＳＯ４；ＫＣｌ；およびＮａ２ＳＯ４）ならびにそれらの混合物から成る群より選択される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記制限栄養素源は窒素源を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記窒素源は無機アンモニウム塩を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記窒素源は水酸化アンモニウムを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
真核微生物脂質を生産する方法であって、
（ａ）真核微生物を含む発酵培地に、炭素源および制限栄養素源を加え、少なくとも約１００ｇ／Ｌのバイオマス密度を生産するよう前記発酵培地中の溶存酸素レベルを少なくとも約４％に維持するのに十分な条件を提供するステップと、
（ｂ）前記発酵培地中の溶存酸素レベルを約１％以下に維持するのに十分な条件を提供し、前記微生物が前記脂質を生産することができるのに十分な条件を提供するステップと、
（ｃ）少なくとも約１５％が多価不飽和脂質である前記微生物脂質を回収するステップと、から成る方法。
【請求項１０７】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記微生物が、藻類、真菌類（酵母を含む）、原生生物、細菌類およびそれらの混合物から成る群より選択され、前記微生物はポリエン脂肪酸またはそれらの合成に酸素を必要とすることが一般に知られている他の脂質を生産することができる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記微生物はストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
前記微生物は微小藻類および藻類様微生物である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１１】
前記微生物はスラウストキトリアレス（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）目である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１２】
前記微生物はスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびそれらの混合物から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１３】
ω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸の合計量は、前記微生物脂質の少なくとも約２０％である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１４】
前記微生物脂質の少なくとも約２５％はドコサヘキサエン酸である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１５】
少なくとも約０．２ｇ／Ｌ／ｈｒの平均速度でドコサヘキサエン酸を生産する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１６】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）前記発酵培地から水を除去し、乾燥微生物を提供するステップと、
（ｅ）前記乾燥微生物から前記脂質を単離するステップとから成る、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１７】
前記水を除去するステップは、前もって遠心せずに前記発酵培地から直接水を蒸発させることを含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記脂質を回収するステップは、
（ｄ）発酵培地を処理して、微生物細胞を透過化、溶解、または破裂させるステップと、
（ｅ）脂質／水エマルションの破壊を援助する作用物質の支援があるかまたは支援がない状態で、比重選別法により発酵培地から脂質を回収するステップと、から成る、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記微生物細胞はステップ（ｄ）において発酵槽または同様な容器中で処理される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記比重選別法は遠心を含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
微生物のポリエン脂肪酸含量を豊富にする方法であって、１０％未満の溶存酸素レベルを有する成長培地で、前記微生物を発酵させることを含む方法。
【請求項１２２】
前記溶存酸素レベルは５パーセント未満である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記溶存酸素レベルは１パーセント未満である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
最初の成長期の間、溶存酸素レベルは約１０パーセントより大きく、後の生産期の間、溶存酸素レベルは１０パーセント未満である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２５】
前記微生物はポリケチドシンターゼ遺伝子を有する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２６】
産物と微生物を生産する従属栄養方法であって、
ａ．ポリケチドシンターゼ遺伝子を有する前記微生物を成長培地中で培養するステップと、
ｂ．溶存酸素レベルを約１０パーセント未満に維持するステップと、から成る方法。
【請求項１２７】
前記溶存酸素レベルは約５パーセント未満である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記溶存酸素レベルは約１パーセント未満である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ポリケチドシンターゼ遺伝子が前記微生物中で天然で生じる、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ポリケチドシンターゼ遺伝子は前記微生物へ遺伝学的に導入される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３１】
最初の成長期の間、溶存酸素レベルは約１０パーセントより大きく、後の生産期の間、溶存酸素レベルは１０パーセント未満である、請求項１２６に記載の方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１３−９９３６６（Ｐ２０１３−９９３６６Ａ）
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−４１５１５（Ｐ２０１３−４１５１５）
【出願日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【分割の表示】特願２００９−２８２３９３（Ｐ２００９−２８２３９３）の分割
【原出願日】平成１３年１月２６日（２００１．１．２６）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【分割の表示】特願２００９−２８２３９３（Ｐ２００９−２８２３９３）の分割
【原出願日】平成１３年１月２６日（２００１．１．２６）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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