発酵法による目的物質の製造法
【課題】 Ｌ−アミノ酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的物質を微生物を利用して製造する方法において、従来の方法と異なる原理によって目的物質の生産性を改善する方法を提供する。
【解決手段】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取する、微生物を利用した目的物質の製造法において、前記微生物として、目的物質の生産能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強された微生物を用いることにより、目的物質の生産性を改善する。
【解決手段】 微生物を培地中に培養し、該培地中に目的物質を生成蓄積させ、該目的物質を採取する、微生物を利用した目的物質の製造法において、前記微生物として、目的物質の生産能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強された微生物を用いることにより、目的物質の生産性を改善する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を利用した目的物質の製造法に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的物質を微生物を利用して製造する方法において、目的物質の生産性を改善するための手段を開示するものである。
【０００２】
【従来の技術】微生物を利用した物質の製造法の代表的なものとして発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法が知られている。Ｌ−アミノ酸は、調味料や、食品として用いられるだけでなく、医療を目的とする様々な栄養混合物のコンポーネントとして利用される。さらに、動物用飼料添加物として、製薬業および化学工業における試薬として、微生物によるＬ−リジンやＬ−ホモセリンなどのＬ−アミノ酸産生のための成長因子として利用される。発酵法によってＬ−アミノ酸を製造できる微生物としては、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌等が知られている。
【０００３】発酵法によってＬ−アミノ酸を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
【０００４】さらに近年はＬ−アミノ酸の発酵生産に、組換えＤＮＡ技術を用いることが行われてきた。この技術ではＬ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子を増強することにより宿主微生物のＬ−アミノ酸生合成系を強化することを、その原理としている。これらの事情については例えば「アミノ酸発酵 学会出版センター１９８６年」に解説されている。
【０００５】また、Ｌ−アミノ酸以外にも微生物を用いた発酵法で生産されている物質は多い。例えば抗生物質や、ビタミン等もその例である。これらの物質の発酵生産においても、組換えＤＮＡ技術の利用は、目的物質又はその前駆体の生合成系酵素をコードする遺伝子の増強が主なものである。
【０００６】上記のような微生物の育種技術により、目的物質の生産性は著しく改善されてきている。一方、微生物が産生する物質は、その物質の生合成系以外にも種々の生化学的反応の影響を受け、微生物の生育によっても左右される。したがって、目的物質の生産効率を向上させるために、培地や培養方法等の培養条件に関する検討が種々行われている。しかし、ＲＮＡポリメラーゼ活性と微生物の生育や目的物質の生産性との関係については、検討がなされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｌ−アミノ酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的物質を微生物を利用して製造する方法において、従来の方法と異なる原理によって目的物質の生産性を改善する方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、微生物のＲＮＡポリメラーゼ活性を増強すると、同微生物の生育が向上し、目的物質の生産量が増大することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００９】（１）目的物質の生産能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強された微生物。
（２）前記目的物質がＬ−アミノ酸である（１）の微生物。
（３）ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強が、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ及びｒｐｏＤの各遺伝子のコピー数を高めることによるものである（１）の微生物。
（４）微生物がエシェリヒア属細菌又はコリネ型細菌である（１）の微生物。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかの微生物を培地に培養し、該培養物中に目的物質を生成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取することを特徴とする目的物質の製造法。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。本発明により製造される目的物質は、微生物によって生産され得る物質であれば特に制限されず、例えばＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラニン等の種々のＬ−アミノ酸が挙げられる。その他にも、グアニル酸、イノシン酸等の核酸類、ビタミン類、抗生物質、成長因子、生理活性物質など、微生物により生合成される物質が挙げられる。また、現在微生物を利用して生産されていない物質であっても、微生物によって生産され得るものであれば本願発明が利用できることはいうまでもない。
【００１１】本発明に用いる微生物は特に制限されず、従来発酵法による有用物質の生産に用いられている微生物であれば使用することができる。また、従来、産業上利用されていない微生物であっても、目的物質を生産する能力を有する限り、本発明を適用することができる。本発明の微生物は、本来目的物質を生産する能力を有するものであってもよいし、変異法や組換えＤＮＡ技術などを利用した育種により目的物質を生産する能力を付与されたものであってもよい。
【００１２】具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、セラチア・マルセッセンス等のセラチア属細菌等が挙げられるが、これらに制限されない。
【００１３】より具体的には以下の菌株が挙げられる。例えば目的物質がＬ−スレオニンの場合はエシェリヒア・コリVKPM B-3996(RIA 1867)(米国特許第5,175,107号参照）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照）等であり、Ｌ−リジンの場合はエシェリヒア・コリ AJ11442（NRRL B-12185, FERM BP-1543)(米国特許第4,346,170号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3990（ATCC31269)(米国特許第4,066,501号参照）等であり、Ｌ−グルタミン酸の場合はエシェリヒア・コリ AJ12624 (FERM BP-3853)(フランス特許出願公開第2,680,178号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12475（FERM BP-2922)(米国特許第5,272,067号参照）等であり、Ｌ−ロイシンの場合はエシェリヒア・コリ AJ11478（FERM P-5274)(特公昭62-34397号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3718（FERMP-2516)(米国特許第3,970,519号参照）等であり、Ｌ−イソロイシンの場合はエシェリヒア・コリKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・フラバム AJ12149（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参照）等であり、Ｌ−バリンの場合はエシェリヒア・コリ VL1970（VKPM B-4411)）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12341（FERM BP-1763)(米国特許第5,188,948号参照）等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場合は、エシェリヒア・コリ AJ12604（FERM BP-3579)(欧州特許出願公開第 488,424号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12637（FERM BP-4160)(フランス特許出願公開第 2,686,898号参照）等である。
【００１４】本発明に用いる微生物は、目的物質の産生能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強された微生物である。ＲＮＡポリメラーゼは、α、β、β’及びσの各サブユニットから構成され、α、β、β’は各々ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣの各遺伝子によりコードされている。エシェリヒア・コリでは、ｒｐｏＢ及びｒｐｏＣはオペロンを形成している。また、σサブユニットは、複数種存在し、エシェリヒア・コリではσ32、σ72等が知られており、それぞれｒｐｏＨ、ｒｐｏＤによりコードされている。これらのうち、ｒｐｏＤは増殖期に特異的に機能するものであり、本発明には好ましい。
【００１５】ＲＮＡポリメラーゼ活性を増強するには、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子断片を、目的の微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これを目的微生物に導入して形質転換すればよい。各遺伝子の細胞内のコピー数が上昇する結果、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強される。
【００１６】ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子としては、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、コリネ型細菌等、いずれの微生物の遺伝子も用いることができる。エシェリヒア・コリではｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｒｐｏＤの各遺伝子の塩基配列は明らかにされているので（ｒｐｏＡ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01685、ｒｐｏＢ，ｒｐｏＣ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01678、ｒｐｏＤ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01687）、これらの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
【００１７】ｒｐｏＡ遺伝子を増幅するためのプライマーとしては配列番号１及び２に示すプライマーが、ｒｐｏＢＣオペロンを増幅するためのプライマーとしては配列番号３及び４に示すプライマーが、ｒｐｏＤ遺伝子を増幅するためのプライマーとしては配列番号５及び６に示すプライマーが挙げられる。
【００１８】ＰＣＲ法により増幅された各遺伝子は、エシェリヒア・コリやコリネ型細菌等細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
【００１９】コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
【００２０】このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。
【００２１】これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００２２】ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子とベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、各遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断し、同ＤＮＡ断片とベクターを連結する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。各サブユニットをコードする遺伝子は、単一のベクターにすべてを挿入してもよく、異なる２種又は３種以上のベクターに別々に挿入してもよい。後記実施例では、ｒｐｏＡ遺伝子及びｒｐｏＢＣオペロンを同一のベクターに挿入して得た組換えベクターと、ｒｐｏＤ遺伝子を別のベクターに挿入して得た組換えベクターの２種の組換えベクターを用いて、コリネ型細菌にこれらの各遺伝子を導入した。
【００２３】上記のように調製した組換えＤＮＡを微生物に導入して形質転換するには、これまでに報告されている用いる微生物に応じた形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。コリネ型細菌には、電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）が有効である。
【００２４】ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強は、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子を微生物の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体ＤＮＡ上にＤＮＡ断片を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増殖される。
【００２５】ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子の発現が強化されることによってＲＮＡポリメラーゼ活性が増殖される。発現調節配列の増強は、各遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００２６】本発明の微生物は、本発明の効果が損なわれない限り、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強されていることに加えて、目的物質の生合成系酵素が増強されているなど、他の性質が付与されていてもよい。目的物質の生合成系酵素としては、例えば目的物質がＬ−グルタミン酸である場合には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等がある。
【００２７】また、本発明の微生物は、目的物質の生合成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損していてもよい。例えば、目的物質がＬ−グルタミン酸である場合には、前記酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００２８】さらに、本発明の微生物は、目的物質の生産にとって好ましい他の性質が付与されていてもよい。例えば目的物質がＬ−グルタミン酸であり、微生物がコリネ型細菌である場合には、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができる（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌としては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ13029株は、1994年９月２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERMP-14501として寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。
【００２９】また、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生産させることができる（WO96/06180号参照）。このような菌株としては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993株が挙げられる。同株は１９９４年６月３日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14348で寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5188が付与されている。
【００３０】本発明の微生物の構築に必要な染色体ＤＮＡの調製、遺伝子断片とプラスミドとの連結、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook,J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００３１】上記のようにして目的物質の生産能が向上した微生物を培地中に培養し、該培地中に目的物質を生成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取することにより、目的物質を製造することができる。
【００３２】培地は、使用する微生物に応じて従来より用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。本発明を実施するための特別な培地は特に必要とされない。
【００３３】炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類等を用いることができる。
【００３４】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００３５】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００３６】培養は、利用される微生物に応じて従来より用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例えば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００３７】培養終了後の培地液からの目的物質の採取は、本願発明において特別な方法が必要とされることはない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００３８】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３９】＜１＞エシェリヒア・コリのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の単離とＲＮＡポリメラーゼ遺伝子導入用プラスミドの作製E. coli W3110株の全ゲノムＤＮＡを、斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1963)）により調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子を増幅した。
【００４０】プライマーは、公知のＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子の塩基配列（ｒｐｏＡ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01685、ｒｐｏＢ，ｒｐｏＣ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01678、ｒｐｏＤ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01687）に基づいて合成した。
【００４１】ｒｐｏＡ遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号１及び２に示すプライマーを、ｒｐｏＢＣオペロンを増幅するためのプライマーとして配列番号３及び４に示すプライマーを、ｒｐｏＤ遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号５及び６に示すプライマーを、それぞれ使用した。
【００４２】ｒｐｏＤ遺伝子を取得するために、前記染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６に示すプライマーを用いたＰＣＲにより得られた断片をEcoRIで消化した後、プラスミドpVC7（後述）のEcoRI部位に挿入し、プラスミドpVCDを作製した。次に、ｒｐｏＢＣ遺伝子を取得するために、前記染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び４に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた断片をＤＮＡブランティングキット（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、前記pVCDのsmaI部位に挿入し、pVCBCDを構築した。続いて、rpoA遺伝子を取得するために、前記染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１及び２に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた断片を上記と同様に平滑末端化した。pVCBCDをSacIで消化した後に、上記と同様に平滑末端化し、それを平滑末端化したrpoA遺伝子断片と結合させて、プラスミドpVCBCADを構築した。
【００４３】前記pVC7は、以下のようにして、エシェリヒア・コリ用ベクターであるpHSG399（Cmr；Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63-74, (1987)参照）にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのクリプティックプラスミドであるpAM330を結合することによって構築した。pAM330は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株より調製した。pHSG399を一箇所切断酵素であるAvaII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したのち、HindIII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したpAM330と接続した。pVC7は、E. coli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299由来のマルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持している。
【００４４】＜２＞ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で形質転換されたコリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産菌の作製及びＬ−アミノ酸の製造（１）コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産株へのpVCBCADの導入とＬ−グルタミン酸生産ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラスミドpVCBCADで形質転換した。pVCBCADを保持する株は5μg/mlのクロラムフェニコールを、それぞれ含む培地で選択した。
【００４５】得られた形質転換株AJ13029/pVCBCADを用いてＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの菌体を、同じ濃度の薬剤を含む表１に示す組成の種培養培地に接種し、３１．５℃で２４時間振とう培養して種培養を得た。表１に示す組成の本培養培地を５００ml容ガラス製ジャーファーメンターに３００mlずつ分注し加熱殺菌した後、上記種培養を４０ml接種した。撹拌速度を８００〜１３００rpm、通気量を１／２〜１／１vvmとし、培養温度３１．５℃にて培養を開始した。培養液のｐＨはアンモニアガスで７．５に維持した。培養を開始してから８時間後に培養温度を３７℃にシフトした。コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ13029株をpVC7で形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００４６】
【表１】
表１────────────────────────────────── 濃 度 成 分 ──────────────────── 種培養 本培養────────────────────────────────── グルコース ５ g/dl １５ g/dl ＫＨ2ＰＯ4 ０．１ g/dl ０．２ g/dl ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０４g/dl ０．１５g/dl ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ mg/dl １．５ mg/dl ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ １ mg/dl １．５ mg/dl 大豆蛋白加水分解液 ２ ml/dl ５ ml/dl ビオチン ５０ μｇ/l ２００ μg/dl サイアミン塩酸塩 ２００ μｇ/l ３００ μg/dl──────────────────────────────────
【００４７】培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表２に示した。
【００４８】
【表２】
表２───────────────────────────── 菌 株 L-ク゛ルタミン酸生成量(g/L) 培養時間(ｈ)───────────────────────────── AJ13029/pVC7 ８３ ３０ AJ13029/pVCBCAD ８９ ２３─────────────────────────────
【００４９】（２）コリネ型細菌のＬ−リジン生産株へのpVCBCADの導入とＬ−リジン生産ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082に、前記と同様にしてpVCBCADを導入してAJ11082/pVCBCADを得た。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの菌体を、同じ濃度の薬剤を含む下記組成のＬ−リジン生産培地に接種し、31.5℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082株をpVC7で形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００５０】〔Ｌ−リジン生産培地〕炭酸カルシウム以外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カルシウムを50ｇ加える。
【００５１】
グルコース 100 g（ＮＨ4）2ＳＯ4 55 gＫＨ2ＰＯ4 1 gＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1 gビオチン 500 μgチアミン 2000 μgＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 gＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 gニコチンアミド 5 mg蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml炭酸カルシウム 50 g
【００５２】培養終了後、培養液中のＬ−リジン蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表３に示した。
【００５３】
【表３】
表３───────────────────────────── 菌 株 Ｌ−リジン生成量(g/dl) 培養時間(ｈ)───────────────────────────── AJ13029/pVC7 ２８．９ ７２ AJ13029/pVCBCAD ３０．１ ６０─────────────────────────────
【００５４】（３）コリネ型細菌のＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産株へのpVCBCADの導入とＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸同時生産ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993に、前記と同様にしてpVCBCADを導入してAJ12993/pVCBCADを得た。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの菌体を、同じ濃度の薬剤を含む前記Ｌ−リジン生産培地に接種して31.5℃にて培養した。培養を開始してから１２時間後に培養温度を３４℃にシフトし、培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ12993株をpVC7で形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００５５】培養終了後、培養液中のＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表４に示した。
【００５６】
【表４】
表４─────────────────────────────────── 菌 株 L-リシ゛ン生成量(g/dl) L-ク゛ルタミン酸生成量(g/dl) 培養時間─────────────────────────────────── AJ12993/pVC7 １０．５ １８．９ ６０ AJ12993/pVCBCAD １１．２ ２０．１ ４５───────────────────────────────────
【００５７】
【発明の効果】本発明により、目的物質を産生する微生物の生育及び目的物質の生産性を向上させることができる。
【００５８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.）
<120> 発酵法による目的物質の製造法<130> P-6307<141> 1999-07-19<160> 6<170> PatentIn Ver. 2.0
【００５９】
<210> 1<211> 17<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoA gene of Escherichia coli<400> 1gagaaagcga agcagtc 17
【００６０】
<210> 2<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoA gene of Escherichia coli<400> 2ctctgcagca gcttctgctt 20
【００６１】
<210> 3<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoBC operon of Escherichia coli<400> 3gccaaccctt ccggttgcag 20
【００６２】
<210> 4<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoBC operon of Escherichia coli<400> 4cgattactcg ttatcagaac 20
【００６３】
<210> 5<211> 30<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoD gene of Escherichia coli<400> 5gcgcgaattc atggagcaaa acccgcagtc 30
【００６４】
<210> 6<211> 30<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoD gene of Escherichia coli<400> 6gcgcgaattc ttaatcctcc aggaagctac 30
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物を利用した目的物質の製造法に関し、詳しくは、Ｌ−アミノ酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的物質を微生物を利用して製造する方法において、目的物質の生産性を改善するための手段を開示するものである。
【０００２】
【従来の技術】微生物を利用した物質の製造法の代表的なものとして発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法が知られている。Ｌ−アミノ酸は、調味料や、食品として用いられるだけでなく、医療を目的とする様々な栄養混合物のコンポーネントとして利用される。さらに、動物用飼料添加物として、製薬業および化学工業における試薬として、微生物によるＬ−リジンやＬ−ホモセリンなどのＬ−アミノ酸産生のための成長因子として利用される。発酵法によってＬ−アミノ酸を製造できる微生物としては、コリネ型細菌、エシェリヒア属細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌等が知られている。
【０００３】発酵法によってＬ−アミノ酸を製造するには、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。
【０００４】さらに近年はＬ−アミノ酸の発酵生産に、組換えＤＮＡ技術を用いることが行われてきた。この技術ではＬ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子を増強することにより宿主微生物のＬ−アミノ酸生合成系を強化することを、その原理としている。これらの事情については例えば「アミノ酸発酵 学会出版センター１９８６年」に解説されている。
【０００５】また、Ｌ−アミノ酸以外にも微生物を用いた発酵法で生産されている物質は多い。例えば抗生物質や、ビタミン等もその例である。これらの物質の発酵生産においても、組換えＤＮＡ技術の利用は、目的物質又はその前駆体の生合成系酵素をコードする遺伝子の増強が主なものである。
【０００６】上記のような微生物の育種技術により、目的物質の生産性は著しく改善されてきている。一方、微生物が産生する物質は、その物質の生合成系以外にも種々の生化学的反応の影響を受け、微生物の生育によっても左右される。したがって、目的物質の生産効率を向上させるために、培地や培養方法等の培養条件に関する検討が種々行われている。しかし、ＲＮＡポリメラーゼ活性と微生物の生育や目的物質の生産性との関係については、検討がなされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｌ−アミノ酸、抗生物質、ビタミン、成長因子、生理活性物質などの目的物質を微生物を利用して製造する方法において、従来の方法と異なる原理によって目的物質の生産性を改善する方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、微生物のＲＮＡポリメラーゼ活性を増強すると、同微生物の生育が向上し、目的物質の生産量が増大することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００９】（１）目的物質の生産能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強された微生物。
（２）前記目的物質がＬ−アミノ酸である（１）の微生物。
（３）ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強が、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ及びｒｐｏＤの各遺伝子のコピー数を高めることによるものである（１）の微生物。
（４）微生物がエシェリヒア属細菌又はコリネ型細菌である（１）の微生物。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかの微生物を培地に培養し、該培養物中に目的物質を生成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取することを特徴とする目的物質の製造法。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。本発明により製造される目的物質は、微生物によって生産され得る物質であれば特に制限されず、例えばＬ−スレオニン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラニン等の種々のＬ−アミノ酸が挙げられる。その他にも、グアニル酸、イノシン酸等の核酸類、ビタミン類、抗生物質、成長因子、生理活性物質など、微生物により生合成される物質が挙げられる。また、現在微生物を利用して生産されていない物質であっても、微生物によって生産され得るものであれば本願発明が利用できることはいうまでもない。
【００１１】本発明に用いる微生物は特に制限されず、従来発酵法による有用物質の生産に用いられている微生物であれば使用することができる。また、従来、産業上利用されていない微生物であっても、目的物質を生産する能力を有する限り、本発明を適用することができる。本発明の微生物は、本来目的物質を生産する能力を有するものであってもよいし、変異法や組換えＤＮＡ技術などを利用した育種により目的物質を生産する能力を付与されたものであってもよい。
【００１２】具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、セラチア・マルセッセンス等のセラチア属細菌等が挙げられるが、これらに制限されない。
【００１３】より具体的には以下の菌株が挙げられる。例えば目的物質がＬ−スレオニンの場合はエシェリヒア・コリVKPM B-3996(RIA 1867)(米国特許第5,175,107号参照）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,949号参照）等であり、Ｌ−リジンの場合はエシェリヒア・コリ AJ11442（NRRL B-12185, FERM BP-1543)(米国特許第4,346,170号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3990（ATCC31269)(米国特許第4,066,501号参照）等であり、Ｌ−グルタミン酸の場合はエシェリヒア・コリ AJ12624 (FERM BP-3853)(フランス特許出願公開第2,680,178号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12475（FERM BP-2922)(米国特許第5,272,067号参照）等であり、Ｌ−ロイシンの場合はエシェリヒア・コリ AJ11478（FERM P-5274)(特公昭62-34397号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ3718（FERMP-2516)(米国特許第3,970,519号参照）等であり、Ｌ−イソロイシンの場合はエシェリヒア・コリKX141（VKPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・フラバム AJ12149（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参照）等であり、Ｌ−バリンの場合はエシェリヒア・コリ VL1970（VKPM B-4411)）(欧州特許出願公開第519,113号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12341（FERM BP-1763)(米国特許第5,188,948号参照）等であり、Ｌ−フェニルアラニンの場合は、エシェリヒア・コリ AJ12604（FERM BP-3579)(欧州特許出願公開第 488,424号参照）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ12637（FERM BP-4160)(フランス特許出願公開第 2,686,898号参照）等である。
【００１４】本発明に用いる微生物は、目的物質の産生能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強された微生物である。ＲＮＡポリメラーゼは、α、β、β’及びσの各サブユニットから構成され、α、β、β’は各々ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣの各遺伝子によりコードされている。エシェリヒア・コリでは、ｒｐｏＢ及びｒｐｏＣはオペロンを形成している。また、σサブユニットは、複数種存在し、エシェリヒア・コリではσ32、σ72等が知られており、それぞれｒｐｏＨ、ｒｐｏＤによりコードされている。これらのうち、ｒｐｏＤは増殖期に特異的に機能するものであり、本発明には好ましい。
【００１５】ＲＮＡポリメラーゼ活性を増強するには、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子断片を、目的の微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これを目的微生物に導入して形質転換すればよい。各遺伝子の細胞内のコピー数が上昇する結果、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強される。
【００１６】ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子としては、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、コリネ型細菌等、いずれの微生物の遺伝子も用いることができる。エシェリヒア・コリではｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｒｐｏＤの各遺伝子の塩基配列は明らかにされているので（ｒｐｏＡ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01685、ｒｐｏＢ，ｒｐｏＣ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01678、ｒｐｏＤ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01687）、これらの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得することが可能である。
【００１７】ｒｐｏＡ遺伝子を増幅するためのプライマーとしては配列番号１及び２に示すプライマーが、ｒｐｏＢＣオペロンを増幅するためのプライマーとしては配列番号３及び４に示すプライマーが、ｒｐｏＤ遺伝子を増幅するためのプライマーとしては配列番号５及び６に示すプライマーが挙げられる。
【００１８】ＰＣＲ法により増幅された各遺伝子は、エシェリヒア・コリやコリネ型細菌等細胞内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
【００１９】コリネ型細菌の細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
【００２０】このようなシャトルベクターとしては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示した。
【００２１】これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００２２】ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子とベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、各遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断し、同ＤＮＡ断片とベクターを連結する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。各サブユニットをコードする遺伝子は、単一のベクターにすべてを挿入してもよく、異なる２種又は３種以上のベクターに別々に挿入してもよい。後記実施例では、ｒｐｏＡ遺伝子及びｒｐｏＢＣオペロンを同一のベクターに挿入して得た組換えベクターと、ｒｐｏＤ遺伝子を別のベクターに挿入して得た組換えベクターの２種の組換えベクターを用いて、コリネ型細菌にこれらの各遺伝子を導入した。
【００２３】上記のように調製した組換えＤＮＡを微生物に導入して形質転換するには、これまでに報告されている用いる微生物に応じた形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。コリネ型細菌には、電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）が有効である。
【００２４】ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強は、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子を微生物の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体ＤＮＡ上にＤＮＡ断片を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増殖される。
【００２５】ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強は、上記の遺伝子増幅による以外に、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、ＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子の発現が強化されることによってＲＮＡポリメラーゼ活性が増殖される。発現調節配列の増強は、各遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００２６】本発明の微生物は、本発明の効果が損なわれない限り、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強されていることに加えて、目的物質の生合成系酵素が増強されているなど、他の性質が付与されていてもよい。目的物質の生合成系酵素としては、例えば目的物質がＬ−グルタミン酸である場合には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等がある。
【００２７】また、本発明の微生物は、目的物質の生合成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損していてもよい。例えば、目的物質がＬ−グルタミン酸である場合には、前記酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００２８】さらに、本発明の微生物は、目的物質の生産にとって好ましい他の性質が付与されていてもよい。例えば目的物質がＬ−グルタミン酸であり、微生物がコリネ型細菌である場合には、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができる（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌としては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ13029株は、1994年９月２日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERMP-14501として寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。
【００２９】また、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生産させることができる（WO96/06180号参照）。このような菌株としては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993株が挙げられる。同株は１９９４年６月３日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14348で寄託され、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5188が付与されている。
【００３０】本発明の微生物の構築に必要な染色体ＤＮＡの調製、遺伝子断片とプラスミドとの連結、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook,J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００３１】上記のようにして目的物質の生産能が向上した微生物を培地中に培養し、該培地中に目的物質を生成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取することにより、目的物質を製造することができる。
【００３２】培地は、使用する微生物に応じて従来より用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。本発明を実施するための特別な培地は特に必要とされない。
【００３３】炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類等を用いることができる。
【００３４】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００３５】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００３６】培養は、利用される微生物に応じて従来より用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例えば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００３７】培養終了後の培地液からの目的物質の採取は、本願発明において特別な方法が必要とされることはない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００３８】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３９】＜１＞エシェリヒア・コリのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の単離とＲＮＡポリメラーゼ遺伝子導入用プラスミドの作製E. coli W3110株の全ゲノムＤＮＡを、斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1963)）により調製した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＲＮＡポリメラーゼの各サブユニットをコードする遺伝子を増幅した。
【００４０】プライマーは、公知のＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子の塩基配列（ｒｐｏＡ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01685、ｒｐｏＢ，ｒｐｏＣ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01678、ｒｐｏＤ：GenBank/EMBL/DDBJ Accession J01687）に基づいて合成した。
【００４１】ｒｐｏＡ遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号１及び２に示すプライマーを、ｒｐｏＢＣオペロンを増幅するためのプライマーとして配列番号３及び４に示すプライマーを、ｒｐｏＤ遺伝子を増幅するためのプライマーとして配列番号５及び６に示すプライマーを、それぞれ使用した。
【００４２】ｒｐｏＤ遺伝子を取得するために、前記染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６に示すプライマーを用いたＰＣＲにより得られた断片をEcoRIで消化した後、プラスミドpVC7（後述）のEcoRI部位に挿入し、プラスミドpVCDを作製した。次に、ｒｐｏＢＣ遺伝子を取得するために、前記染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び４に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた断片をＤＮＡブランティングキット（宝酒造（株）製）を用いて平滑末端化し、前記pVCDのsmaI部位に挿入し、pVCBCDを構築した。続いて、rpoA遺伝子を取得するために、前記染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号１及び２に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた断片を上記と同様に平滑末端化した。pVCBCDをSacIで消化した後に、上記と同様に平滑末端化し、それを平滑末端化したrpoA遺伝子断片と結合させて、プラスミドpVCBCADを構築した。
【００４３】前記pVC7は、以下のようにして、エシェリヒア・コリ用ベクターであるpHSG399（Cmr；Takeshita, S. et al., Gene, 61, 63-74, (1987)参照）にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのクリプティックプラスミドであるpAM330を結合することによって構築した。pAM330は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株より調製した。pHSG399を一箇所切断酵素であるAvaII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したのち、HindIII（宝酒造（株）製）にて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにて平滑末端化したpAM330と接続した。pVC7は、E. coli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299由来のマルチプルクローニングサイトとlacZ’を保持している。
【００４４】＜２＞ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で形質転換されたコリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産菌の作製及びＬ−アミノ酸の製造（１）コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産株へのpVCBCADの導入とＬ−グルタミン酸生産ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラスミドpVCBCADで形質転換した。pVCBCADを保持する株は5μg/mlのクロラムフェニコールを、それぞれ含む培地で選択した。
【００４５】得られた形質転換株AJ13029/pVCBCADを用いてＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの菌体を、同じ濃度の薬剤を含む表１に示す組成の種培養培地に接種し、３１．５℃で２４時間振とう培養して種培養を得た。表１に示す組成の本培養培地を５００ml容ガラス製ジャーファーメンターに３００mlずつ分注し加熱殺菌した後、上記種培養を４０ml接種した。撹拌速度を８００〜１３００rpm、通気量を１／２〜１／１vvmとし、培養温度３１．５℃にて培養を開始した。培養液のｐＨはアンモニアガスで７．５に維持した。培養を開始してから８時間後に培養温度を３７℃にシフトした。コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ13029株をpVC7で形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００４６】
【表１】
表１────────────────────────────────── 濃 度 成 分 ──────────────────── 種培養 本培養────────────────────────────────── グルコース ５ g/dl １５ g/dl ＫＨ2ＰＯ4 ０．１ g/dl ０．２ g/dl ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０４g/dl ０．１５g/dl ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ mg/dl １．５ mg/dl ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ １ mg/dl １．５ mg/dl 大豆蛋白加水分解液 ２ ml/dl ５ ml/dl ビオチン ５０ μｇ/l ２００ μg/dl サイアミン塩酸塩 ２００ μｇ/l ３００ μg/dl──────────────────────────────────
【００４７】培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表２に示した。
【００４８】
【表２】
表２───────────────────────────── 菌 株 L-ク゛ルタミン酸生成量(g/L) 培養時間(ｈ)───────────────────────────── AJ13029/pVC7 ８３ ３０ AJ13029/pVCBCAD ８９ ２３─────────────────────────────
【００４９】（２）コリネ型細菌のＬ−リジン生産株へのpVCBCADの導入とＬ−リジン生産ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082に、前記と同様にしてpVCBCADを導入してAJ11082/pVCBCADを得た。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの菌体を、同じ濃度の薬剤を含む下記組成のＬ−リジン生産培地に接種し、31.5℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082株をpVC7で形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００５０】〔Ｌ−リジン生産培地〕炭酸カルシウム以外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カルシウムを50ｇ加える。
【００５１】
グルコース 100 g（ＮＨ4）2ＳＯ4 55 gＫＨ2ＰＯ4 1 gＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1 gビオチン 500 μgチアミン 2000 μgＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 gＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 gニコチンアミド 5 mg蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml炭酸カルシウム 50 g
【００５２】培養終了後、培養液中のＬ−リジン蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表３に示した。
【００５３】
【表３】
表３───────────────────────────── 菌 株 Ｌ−リジン生成量(g/dl) 培養時間(ｈ)───────────────────────────── AJ13029/pVC7 ２８．９ ７２ AJ13029/pVCBCAD ３０．１ ６０─────────────────────────────
【００５４】（３）コリネ型細菌のＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産株へのpVCBCADの導入とＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸同時生産ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993に、前記と同様にしてpVCBCADを導入してAJ12993/pVCBCADを得た。5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ13029/pVCBCADの菌体を、同じ濃度の薬剤を含む前記Ｌ−リジン生産培地に接種して31.5℃にて培養した。培養を開始してから１２時間後に培養温度を３４℃にシフトし、培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ12993株をpVC7で形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００５５】培養終了後、培養液中のＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結果を表４に示した。
【００５６】
【表４】
表４─────────────────────────────────── 菌 株 L-リシ゛ン生成量(g/dl) L-ク゛ルタミン酸生成量(g/dl) 培養時間─────────────────────────────────── AJ12993/pVC7 １０．５ １８．９ ６０ AJ12993/pVCBCAD １１．２ ２０．１ ４５───────────────────────────────────
【００５７】
【発明の効果】本発明により、目的物質を産生する微生物の生育及び目的物質の生産性を向上させることができる。
【００５８】
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.）
<120> 発酵法による目的物質の製造法<130> P-6307<141> 1999-07-19<160> 6<170> PatentIn Ver. 2.0
【００５９】
<210> 1<211> 17<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoA gene of Escherichia coli<400> 1gagaaagcga agcagtc 17
【００６０】
<210> 2<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoA gene of Escherichia coli<400> 2ctctgcagca gcttctgctt 20
【００６１】
<210> 3<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoBC operon of Escherichia coli<400> 3gccaaccctt ccggttgcag 20
【００６２】
<210> 4<211> 20<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoBC operon of Escherichia coli<400> 4cgattactcg ttatcagaac 20
【００６３】
<210> 5<211> 30<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoD gene of Escherichia coli<400> 5gcgcgaattc atggagcaaa acccgcagtc 30
【００６４】
<210> 6<211> 30<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying rpoD gene of Escherichia coli<400> 6gcgcgaattc ttaatcctcc aggaagctac 30
【特許請求の範囲】
【請求項１】 目的物質の生産能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強された微生物。
【請求項２】 前記目的物質がＬ−アミノ酸である請求項１記載の微生物。
【請求項３】 ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強が、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ及びｒｐｏＤの各遺伝子のコピー数を高めることによるものである請求項１記載の微生物。
【請求項４】 微生物がエシェリヒア属細菌又はコリネ型細菌である請求項１記載の微生物。
【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物を培地に培養し、該培養物中に目的物質を生成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取することを特徴とする目的物質の製造法。
【請求項１】 目的物質の生産能を有し、かつ、ＲＮＡポリメラーゼ活性が増強された微生物。
【請求項２】 前記目的物質がＬ−アミノ酸である請求項１記載の微生物。
【請求項３】 ＲＮＡポリメラーゼ活性の増強が、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ及びｒｐｏＤの各遺伝子のコピー数を高めることによるものである請求項１記載の微生物。
【請求項４】 微生物がエシェリヒア属細菌又はコリネ型細菌である請求項１記載の微生物。
【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物を培地に培養し、該培養物中に目的物質を生成蓄積せしめ、該培養物から目的物質を採取することを特徴とする目的物質の製造法。
【公開番号】特開２００３−２０４７８３（Ｐ２００３−２０４７８３Ａ）
【公開日】平成１５年７月２２日（２００３．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平１１−２０５２６７
【出願日】平成１１年７月１９日（１９９９．７．１９）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１５年７月２２日（２００３．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１１年７月１９日（１９９９．７．１９）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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