発酵茶葉、発酵茶葉抽出物および飲食品
【課題】健康の維持または改善に有効な薬効を有する新規な発酵茶葉、発酵茶葉抽出物およびこれを用いた飲食品を提供する。
【解決手段】茶の葉とビワ葉が混合、揉捻され、発酵した発酵茶葉、該発酵茶葉を抽出して得られる発酵茶葉抽出物、および該発酵茶葉および／または該発酵茶葉抽出液を含有する飲食品。
【解決手段】茶の葉とビワ葉が混合、揉捻され、発酵した発酵茶葉、該発酵茶葉を抽出して得られる発酵茶葉抽出物、および該発酵茶葉および／または該発酵茶葉抽出液を含有する飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は茶の葉とビワ葉を混合して用い、これを発酵してなる発酵茶葉、発酵茶葉抽出物およびこれらを用いた飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
茶には、抗酸化作用、抗ガン作用、癌予防、血中コレステロール低下作用、血圧上昇抑制効果等があることが知られている（例えば、下記非特許文献１）。
また下記特許文献１には、グアバ葉の抽出液に含まれるα−アミラーゼ阻害物質を用いたダイエット食品が提案されている。
【特許文献１】特開平７−５９５３９号公報
【非特許文献１】「茶の化学」村松敬一郎 編（朝倉書店）ｐ１２４−１９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
茶の原料や製法は多岐にわたっており、薬効成分についても未知の部分が多い。
茶は安全性の高い食品であり習慣的に摂取することが可能であるので、健康の維持または改善に有効な薬効を奏する新規な茶の開発が期待されている。
【０００４】
本発明は前記事情に鑑みてなされたもので、健康の維持または改善に有効な薬効を有する新規な発酵茶葉、発酵茶葉抽出物およびこれを用いた飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、茶の葉とビワ葉が混合、揉捻され、発酵してなることを特徴とする発酵茶葉を提供する。
本発明は、茶の葉とビワ葉が混合され、かつ組織が破壊され、発酵したことを特徴とする発酵茶葉を提供する。
本発明は、茶の葉とビワ葉が混合され、かつすりつぶされ、発酵したことを特徴とする発酵茶葉を提供する。
本発明は、茶の葉とビワ葉に水を加えて粉砕撹拌混合され、発酵したことを特徴とする発酵茶葉を提供する。
本発明は、本発明の発酵茶葉を抽出して得られる発酵茶葉抽出物を提供する。
本発明は、本発明の発酵茶葉を含有する飲食品を提供する。
本発明は、本発明の発酵茶葉抽出液を含有する飲食品を提供する。
本発明の飲食品は、血糖値上昇抑制用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、糖尿病予防または改善用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、中性脂肪低減用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、コレステロール低減用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、血清過酸化脂質低減用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、体脂肪蓄積抑制用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、血圧上昇抑制用飲食品として好適である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、血糖値上昇抑制効果、糖尿病予防または改善効果、中性脂肪低減効果、コレステロール低減効果、血清過酸化脂質低減効果、体脂肪蓄積抑制効果、または血圧上昇抑制効果といった健康の維持・改善に有効な薬効を有する新規な発酵茶葉、発酵茶葉抽出物およびこれを用いた飲食品が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
＜発酵茶葉＞
本発明において、原料として用いられる茶の葉は、いわゆるツバキ科の常緑低木Ｔｈｅａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｌ．の葉である。この葉としては、一番茶以外に二番茶、三番茶、秋冬番茶、刈番茶なども使用でき、比較的多くのポリフェノール類を含む二番茶以降の安価な茶の葉のほうが好ましい。なお、これらの遅手の番茶は、現在価格が低迷し、かなりのものが廃棄されているが、このものを有効に利用できる。
特に、後述の実験例および分析試験例で用いた長崎東彼杵産の中国種の茶葉、好ましくはヤブキタ種の茶葉には、天然での存在が少ししか確認されていないエピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンが含まれるので好ましい。また該エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンを含む可能性がある茶葉としては、インド産ダージリン紅茶や中国産キーモン紅茶の製造に用いられる茶葉が挙げられる。
該エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンは、後述するように、高いＡＧＨ阻害性（マルターゼ阻害性およびスクラーゼ阻害性）を有する。
【０００８】
本発明において、原料として用いられるビワ葉は、バラ科、植物名「ビワ」の葉であり、特に制限なく用いることができる。
【０００９】
本発明の発酵茶葉（以下、混合発酵茶葉ということもある。）は、次のようにして製造される。
まず、前処理として、ビワ葉および茶の葉を、必要に応じて乾燥し、含水率を５０〜６０質量％程度としておくことが好ましい。また適宜の寸法、例えば１〜１０ｍｍ角程度の大きさに切断しておくことが好ましい。
そして、茶の葉を乾燥し、水分量を減少させ、萎凋させる。この工程では、例えば粗揉機や、直火または電気で加熱した鍋または板状の器具を用い、茶の葉を撹拌しつつ、温度４０〜１５０℃の加熱空気を茶の葉に当てる方法、密閉撹拌容器内に茶の葉を投入し、容器内の空気を吸引して内部を減圧状態として撹拌して乾燥する方法、萎凋槽を用いてネット上に散布した茶の葉の下方から通気する方法などが用いられる。
この萎凋により原料の茶の葉の含水率を４５〜６５質量％、好ましくは５０〜６０質量％程度に減少させておくと、次の揉捻工程で茶の葉から水分が揉み出れ難くなるため、有効成分の流亡を防止できるとともに品質の低下を抑えることができる。また後の乾燥工程が短縮できる点でも好ましい。
【００１０】
次いで、萎凋工程を経た原料の茶の葉を加圧しながら揉む（揉捻）とともに、この揉捻時にビワ葉を添加して、両者を一緒に揉捻する。ビワ葉は茶の葉の揉捻開始と同時に添加してもよく、あるいは一定時間茶の葉のみの揉捻を行った後、びわ葉を添加してさらに揉捻してもよい。全揉捻時間のうち、揉捻開始から０〜４０％の時間が経過したのち、ビワ葉を添加することが好ましい。ビワ葉を揉捻工程の最初から添加しておくことがより好ましい。
ビワ葉の添加量は、ビワ葉／茶の葉の絶乾質量比が、５／９５〜３５／６５の範囲が好ましく、８／９２〜３０／７０の範囲がより好ましい。ビワ葉の添加量が上記範囲内であれば、茶の葉とビワ葉を混合したことによる血糖値上昇抑制作用の向上効果が良好に得られる。
【００１１】
揉捻は、茶の葉の揉捻に用いられている通常の揉捻機を用いる方法など、公知の方法を適宜採用できる。
揉捻時間は、１５〜２５分とされる。この範囲とすることにより血糖値上昇抑制作用が良好となる。
また、揉捻時の原料の温度は、２０〜４０℃とされる。２０℃未満では発酵不足となり、４０℃を越えると品質低下が著しくなる。
【００１２】
この揉捻により、茶の葉およびビワ葉の組織が破壊され、茶の葉に含まれるポリフェノールオキシダーゼなどの酸化酵素が茶の葉およびビワ葉に含まれるポリフェノールを酸化、重合し、酸化重合物が生成する。
【００１３】
次いで、この状態の混合原料を発酵工程に移す。すなわち、揉捻後の混合原料を数ｃｍの厚さに堆積させた状態で、温度２０〜２７℃、湿度３０〜６０％ＲＨの発酵室内などの環境下に静置する。なお、茶類の製造工程における「発酵」とは葉中の酸化酵素による酸化反応を意味する。
発酵時間は０〜４時間とされる。ここで、発酵時間が０時間と言うことは、先の揉捻工程において、揉捻の開始と同時に発酵が開始するためであり、揉捻工程の時間を発酵工程に含めない場合には、発酵時間が０時間と言うこともあり得るのであり、実体は０時間でも発酵が行われているものである。発酵時間が４時間を超えると、得られる混合発酵茶葉またはその抽出物の味、香りが低下する傾向がある。特に優れたＡＧＨ阻害性を得るには、発酵時間は１時間以下が好ましく、０時間が最も好ましい。
【００１４】
次いで、所定の発酵時間が経過したならば、原料を加熱して発酵を止め、乾燥する。例えば、連続式乾燥機に原料を投入し、これに温度８０〜１２０℃の熱風を吹き込み、排気温度が５０〜６０℃となるように操作する。加熱時間は１０〜３０分程度で十分であり、これにより原料中の含水率を５質量％程度とする。
上記製造工程において、揉捻時間、発酵時間が長くなるほどＡＧＨ阻害性が低くなる。また、抗酸化作用（１，１−ジピクリル−２−フェニルヒドラジル（ＤＰＰＨ）消去活性）も低くなる。機能性に注目して製造を行うなら揉捻時間を１５〜２５分とし、発酵時間をなるべく短くすることが理想である。
また、発酵時間が長くなるほど味に関しては苦渋みが強くなり、香りも悪くなり発酵時間が短いほど味、香りとも優れる。
【００１５】
こうして混合発酵茶葉が得られる。加熱工程後のものは、いわゆる荒茶であり、これに必要に応じて仕上げ加工を施して仕上げ茶としてもよい。仕上げ加工は、再乾燥、火入れ、篩い分け、整形、選別など、従来の茶葉製造における仕上げ加工と同様の工程を適宜採用することができる。上記火入れは、再加熱して香味の発揚を図る工程である。仕上げ加工を行うことにより、貯蔵性、香りなどの品質を高めて商品性を向上させることができる。また荒茶または仕上げ茶を適宜の大きさの粉末状にしてもよい。
【００１６】
また上記揉捻工程は、上述したように茶の葉およびビワ葉の組織が破壊されればよく、揉捻機を用いる方法のほかに、例えば手で揉む方法、すりつぶす方法、水を加えて粉砕する方法等を用いて行うことができる。
手で揉む方法を用いる場合は、通常、茶の葉の揉み込みに用いられている手法を適宜用いることができる。例えば、「ねこぶき」と呼ばれる荒縄で編んだ凹凸のある敷物上で、手で揉み込む方法などが採用でき、これ以外の方法を用いてもよい。具体的には、萎凋工程を経た原料の茶の葉を手で揉む方法で揉捻するとともに、この揉捻時にビワ葉を添加して、両者を一緒に揉捻する。この場合の揉捻時間は２０〜３０分が好ましく、２０分未満または３０分を超えると、得られる発酵茶の血糖値上昇抑制作用が低くなる。その他の条件等は上記と同じである。発酵工程は上記と同様に行うことができる。
本方法において、揉捻時間、発酵時間が長くなるほどＡＧＨ阻害性が低くなる。また、抗酸化作用（ＤＰＰＨ消去活性）も低くなる。機能性に注目して製造を行うなら揉捻時間を２０〜３０分とし、発酵時間をなるべく短くすることが理想である。
【００１７】
すりつぶす方法を用いる場合は、茶の葉のすりつぶしに用いられている通常の乳鉢を用いる方法などが採用でき、これ以外のすりつぶし方法を用いてもよい。具体的には、萎凋工程を経た原料の茶の葉をすりつぶすとともに、このすり込み時にビワ葉を添加し、両方の原料をすり込む。この場合のすりつぶし時間は、１５〜２５分が好ましく、１５分未満または２５分を超えると、得られる発酵茶の血糖値上昇抑制が低くなる。すりつぶし時間の原料の温度は、２０〜４０℃とされる。２０℃未満では発酵不足となり、４０℃を超えると品質低下となる。さらに、ビワ葉の添加のタイミングは、茶の葉のすりつぶし開始と同時に添加してもよく、あるいは一定時間茶の葉のみのすりつぶしを行った後、ビワ葉を添加してさらにすりつぶしてもよい。全すりつぶし時間のうち、すりつぶし開始から０〜４０％の時間が経過したのち、ビワ葉を添加することができる。その他の条件等は上記と同じである。
こうしてすりつぶすことによって、茶の葉およびビワ葉の原料の組織が破壊され、茶の葉に含まれるポリフェノールオキシダーゼなどの酸化酵素が茶の葉およびビワ葉に含まれるポリフェノールを酸化、重合し、酸化重合物が生成する。発酵工程は上記と同様に行うことができる。
本方法において、すりつぶし時間、発酵時間が長くなるほどＡＧＨ阻害性が低くなる。また、抗酸化作用（ＤＰＰＨ消去活性）も低くなる。機能性に注目して製造を行うならすりつぶし時間を１５〜２５分とし、発酵時間をなるべく短くすることが理想である。
また、発酵時間が長くなるほど味に関しては苦渋みが強くなり、香りも悪くなり発酵時間が短いほど味、香りとも優れる。
【００１８】
水を加えて粉砕する方法を用いる場合は、茶の葉とビワ葉に水を加え粉砕撹拌することによって、これらを混合するとともに茶の葉およびビワ葉の原料の組織を破壊することができる。粉砕撹拌は、茶の葉の粉砕撹拌に用いられている通常のミキサー等を用いる方法などが採用でき、これ以外の粉砕撹拌方法を用いてもよい。具体的には、萎凋工程を経た原料の茶の葉およびビワ葉に水を加えて粉砕撹拌する。茶の葉とビワ葉の混合割合は上記と同様である。加える水の量は茶の葉とビワ葉の合計１００質量部に対して、２０〜２００質量部が好ましく、５０〜１５０質量部がより好ましい。
粉砕撹拌時間は、５〜１５分とされ、５分未満または１５分を超えると、得られる発酵茶の血糖値上昇抑制が低くなる。粉砕撹拌時の原料の温度は上記と同様であり、２０〜４０℃とされる。
ビワ葉の添加のタイミングは、粉砕撹拌開始と同時に添加してもよく、あるいは一定時間茶の葉のみの粉砕撹拌を行った後、ビワ葉を添加してさらに粉砕撹拌してもよい。全粉砕撹拌時間のうち、粉砕撹拌開始から０〜５０％の時間が経過したのち、ビワ葉を添加することが好ましい。
こうして粉砕撹拌することによって、茶の葉およびビワ葉が混合されるとともに、これら原料の組織が破壊され、茶の葉に含まれるポリフェノールオキシダーゼなどの酸化酵素が茶の葉およびビワ葉に含まれるポリフェノールを酸化、重合し、酸化重合物が生成する。
ついで、粉砕撹拌により得られた混合原料を発酵する工程においては、粉砕撹拌後の混合原料を数ｃｍの厚さに堆積し、温度２０〜２７℃、湿度３０〜６０％ＲＨの発酵室内などの環境下において静置する。発酵時間は４〜１２時間が好ましい。発酵時間が４時間未満では、発酵が進んでいないので血糖値上昇抑制作用が低く、香りも青臭い。発酵時間が１２時間を超えると、得られる発酵茶の味、香りが低下する傾向がある。薬効を重視した場合では、４〜１２時間が好ましい。すなわち発酵時間４〜１２時間が、特にＡＧＨ阻害性が高くなる。また抗酸化作用（ＤＰＰＨ消去活性）も高くなる。機能性に注目して製造を行うなら粉砕撹拌時間１０〜１５分、発酵時間を４〜１２時間に保つことが理想である。また、この時間外では味に関しては苦渋みが強くなり、香りも悪くなる。
ついで、所定の発酵時間が経過したならば、原料を加熱して発酵を止め、乾燥する。例えば、容器に原料を流し込んだものを、乾燥機に入れ温度８０〜１２０℃の熱風を吹き込み、排気温度が５０〜６０℃となるように操作する。加熱時間は６０〜１２０分程度が好ましく、これにより原料中の水分量を５％程度とする。こうして、本発明の発酵茶が得られるが、加熱工程後のものは、粉状に粉砕してもよく、粉砕せずに固形物として用いることもできる。
【００１９】
こうして得られる混合発酵茶葉に含まれる成分としては、後述の分析試験例で分離された成分が挙げられる。
本発明の混合発酵茶葉によって奏される薬効に寄与する有効成分についての全体像は未だ明らかではないが、下記（１）〜（４）の各成分は、後述の実験例および分析試験例により、高いＡＧＨ阻害性（マルターゼ阻害性およびスクラーゼ阻害性）を示すことが判明している。
（１）テアシネンシンＡ（以下、ＴＳ−Ａと略記することもある。）、
（２）ガロイル基を有するテアフラビン誘導体、
（３）エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジン、
（４）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルでカテキンＡ環のフロログルシノール由来のシグナルとガロイル基由来のシグナルを示し、アセチル化体の分子量が２０００を極大とする１０００〜１５０００であるカテキンガレート類の酸化縮合したポリフェノール（以下、ポリフェノールＰと略記することもある。）。
【００２０】
（１）テアシネンシンＡは、図３に示される構造を有する化合物である。
（２）ガロイル基を有するテアフラビン誘導体は、具体的には、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート（３−ＴＦＧ）、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート（３’−ＴＦＧ）、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（３，３’−ＴＦＧＧ）から選ばれる１種以上である。これらの構造は図３に示される。これらの中でも、特に、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレートはＡＧＨ阻害性がより強い。
（３）エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンは、後述の分析試験例３におけるFｒ．７に含まれており、メルカプトエタノールによるチオール分解により、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）、およびエピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣｇ（以下、ＥＣＧと記載することもある））からなる群から選ばれる１種以上と、ＥＧＣ−ＭＥ（以下、「−ＭＥ」は「４−（２’−ハイドロキシエチルチオ）エーテル」を示す。例えばＥＧＣ−ＭＥは、ＥＧＣの４−（２’−ハイドロキシエチルチオ）エーテルであることを示す。以下同様）、ＥＣ−ＭＥ、ＥＧＣｇ−ＭＥ、およびＥＣｇ−ＭＥからなる群から選ばれる１種以上と、エピアフゼレチン−３−O−ガレート−ＭＥとを生じるものである。かかるプロアントシアニジンのチオール分解前の構造は例えば図４に示されるものと推定される。なお、（３）成分におけるエピアフゼレチンガレートは、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレートを指す。
この成分（３）は原料の茶の葉由来であり、原料の茶の葉として、（３）エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンを含有する茶の葉を用いて製造した混合発酵茶葉に含まれる。
【００２１】
上記（４）ポリフェノールＰは、例えば後述の分析試験例５に示されるように、これを含有する発酵茶葉を、６０％エタノール（濃度６０体積％のエタノール水溶液、以下、同様）で室温抽出した抽出液をエチルエーテル、酢酸エチル、ｎ−ブタノールで順次溶媒分配し、ｎ−ブタノール可溶部を６０％メタノールに溶かしたものを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにて、６０％メタノール、８０％メタノール、１００％メタノール、次いでメタノール−水―アセトン（８：１：１）混合溶液、メタノール−水―アセトン（６：２：２）混合溶液、水―アセトン（１：１）混合溶液で順次溶出した溶出液を、薄層クロマトグラフィー（トルエン−ギ酸エチル−ギ酸、１：７：１）分析して、原点から移動しない物質を含むフラクションだけを集めて濃縮して得られるものである。
【００２２】
また本発明の混合発酵茶葉には、ビワプロアントシアニジンが含まれることが特徴的である。後述の分析試験例３に示されるように、ビワプロアントシアニジンは、ＡＧＨ阻害性が高い混合発酵茶葉の抽出物から得られる複数のフラクションの中で、最もＡＧＨ阻害性が高いフラクション（Ｆｒ．７）に含まれていることからＡＧＨ阻害性に寄与していると考えられる。
【００２３】
また本発明の混合発酵茶葉は、ビワ葉を添加したことで、テアフラビン類（テアフラビン（ＴＦ）、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート（３−ＴＦＧ）、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート（３’−ＴＦＧ）、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（３，３’−ＴＦＧＧ））の生成が促進された点も特徴的である。
すなわち、混合発酵茶葉に含まれるテアフラビン類の合計の含有量は、ビワ葉を加えない他は同条件で製造した茶の葉の単独発酵茶葉に含まれるテアフラビン類の合計の含有量よりも多く、例えば１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは２．５倍以上である。上限は制限されないが、４倍より多くはならないと推測される。
例えば、後述の分析試験例４および図７（発酵茶葉エキスの酢酸エチル可溶性画分の高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記することもある。）分析結果）において、混合発酵茶葉エキスは、単独発酵茶葉エキスに比較して、テアフラビン類のピーク面積の合計が約２．７倍にも増加しており、ビワ茶の添加によってテアフラビン類の生成が大幅に促進されたことがわかる。
【００２４】
また本発明の混合発酵茶葉は、ビワ葉を添加したことで、前記（４）成分（ポリフェノールＰ）の生成が促進された点も特徴的である。
すなわち、混合発酵茶葉に含まれるポリフェノールＰの含有量は、ビワ葉を加えない他は同条件で製造した茶の葉の単独発酵茶葉に含まれるポリフェノールＰの含有量よりも多い。例えば１．２倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上である。上限は制限されないが、４倍より多くはならないと推測される。
例えば、後述の分析試験例４および図６（発酵茶葉エキスの水溶性画分のＨＰＬＣ分析結果）において、混合発酵茶葉エキスは、単独発酵茶葉エキスに比較して、ベースラインの盛り上がりとして検出される物質のピーク面積が約１．５９倍（１５９％）にも増加しており、この増加分はビワ茶の添加によって生成が促進されたカテキン酸化生成物によると考えられる。このカテキン酸化生成物は、分析試験例５において前記ポリフェノールＰとして特定された成分に相当する。
【００２５】
また本発明の混合発酵茶葉は、１−ヘキサノール、トランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−オール、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、およびネロリドールの香気成分を含み、固相マイクロ抽出法においてトランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−オール、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、ネロリドールの香気成分の各ピーク面積が、いずれも１−ヘキサノールのピーク面積より大きいという、特徴的な香気成分組成を有する。
上記に挙げた香気成分のうち、後述の分析試験例１０にも示されるように、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、およびネロリドールは、紅茶等の発酵茶にも比較的多く含まれ、緑茶等の不発酵茶および発酵したビワ葉には少ない香気成分である。また、トランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、および３−ヘキセン−１−オールは、発酵したビワ葉にも比較的多く含まれる香気成分である。本発明の混合発酵茶葉は、これらの香気成分を比較的多い含有量で有しており、これにより発酵茶として特有な香りを味わうことができる。
【００２６】
本発明の混合発酵茶葉は、後述の実験例にも示されるように、高いＡＧＨ阻害性を示し、これを摂取することにより、血糖値上昇抑制作用が得られ、糖尿病予防または改善効果、中性脂肪低減効果、コレステロール低減効果、血清過酸化脂質低減効果、体脂肪蓄積抑制効果、または血圧上昇抑制効果が得られる。好ましくは、これらの効果の２以上が同時に得られ、全部の効果を同時に得ることもできる。
【００２７】
＜発酵茶葉抽出物＞
本発明の発酵茶葉抽出物（以下、混合発酵茶葉抽出物ということもある）は、発酵茶葉の可溶性成分を抽出溶媒で抽出して得られる抽出物である。抽出溶媒は水（温水または熱水を含む）でもよく、有機溶媒でもよい。有機溶媒の具定例としてはメタノール、エタノール、アセトン等が挙げられる。本発明の血糖値上昇抑制用組成物としての発酵茶葉抽出物の形態は特に限定されず、溶液状でもよく、その濃縮物でもよく、さらに凍結乾燥等により乾燥させた固体でもよい。固体の場合は、塊状であってもよく、さらにそれを適宜の大きさに粉砕した粉末状であってもよい。発酵茶葉抽出物を有機溶媒を含む形態で飲食品に用いる場合は、有機溶媒としてエタノールが用いられる。
【００２８】
抽出条件は特に制限されないが、水で抽出する場合は、温度４０〜１００℃の温水または熱水に発酵茶葉を３分間〜６０分間程度浸して抽出することが好ましい。水と発酵茶葉との割合は、水１００質量部に対して、発酵茶葉（含水率５質量％）０．５〜２０質量部程度が好ましく、０．５〜５質量部程度がより好ましい。
有機溶媒で抽出する場合は、有機溶媒１００質量部に対して発酵茶葉（含水率５質量％）０．１〜２０質量部程度を用い、常圧または加圧下で、温度−２０〜６０℃、時間１〜６０分の条件で行うことが好ましいが、この範囲に限定されず、適宜変更することができる。
抽出処理後、ろ過、遠心分離などで、固形分を除去して抽出液が得られる。
【００２９】
混合発酵茶葉抽出物には、混合発酵茶葉の可溶性成分が含まれており、後述の実験例および分析試験例に示されるように高いＡＧＨ阻害性を示す。また後述の実験例および分析試験例に示されるように、該混合発酵茶葉抽出物を摂取することにより、血糖値上昇抑制効果、糖尿病予防または改善効果、中性脂肪低減効果、コレステロール低減効果、血清過酸化脂質低減効果、体脂肪蓄積抑制効果、または血圧上昇抑制効果が得られる。好ましくは、これらの効果の２以上が同時に得られ、全部の効果を同時に得ることもできる。
【００３０】
本発明の飲食品は、混合発酵茶葉を含有するもの、または混合発酵茶葉抽出物を含有するものであって、かつ経口摂取できる形態のものであれば特に限定されない。混合発酵茶葉と混合発酵茶葉抽出物の両方を含有してもよい。
本発明の飲食品は、例えば、混合発酵茶葉抽出物を含有する各種飲料である。また混合発酵茶葉抽出物が混合発酵茶葉を水で抽出したものであって、そのまま飲用可能な風味を有するものであれば、該抽出物を茶飲料とすることもできる。
または、混合発酵茶葉および／または混合発酵茶葉抽出物を種々の食品素材に添加した食品である。食品素材としては特に限定されることはなく、納豆、豆乳、味噌、醤油などの大豆食品、はんぺん、かまぼこ、ちくわなどの練り製品、ハム、ソーセージなどの食肉加工品、飴、キャラメル、最中、羊羹などの菓子類など多岐にわたる。
【００３１】
本発明の飲食品における、混合発酵茶葉および／または混合発酵茶葉抽出物の含有量は任意であり、得ようとする薬効の程度、および期待される風味および摂取量に応じて適宜設定することができる。
例えば血糖値上昇抑制用飲食品の場合は、添加する混合発酵茶葉および混合発酵茶葉抽出物それぞれのＡＧＨ阻害性（例えばＩＣ５０）を目安として、得ようとする血糖値上昇抑制効果、および期待される風味および摂取量に応じて適宜設定することができる。
【００３２】
発酵茶葉を水で抽出した抽出物をそのまま茶飲料とする場合、水と発酵茶葉との割合は、水１００質量部に対して、発酵茶葉（含水率５質量％）０．５〜２０質量部程度が好ましい。また抽出方法は、温度４０〜１００℃の温水または熱水に３分間〜６０分間浸す方法が好ましい。
発酵茶葉を食品素材に添加する場合、例えば、食品素材１００質量部に対して、発酵茶（含水率５質量％）０．１〜２００質量部の範囲で適宜に決めることができる。
このような本発明の飲食品は、混合発酵茶葉および／または混合発酵茶葉抽出物を含んでおり、これを摂取することにより血糖値上昇抑制効果、糖尿病予防または改善効果、中性脂肪低減効果、コレステロール低減効果、血清過酸化脂質低減効果、体脂肪蓄積抑制効果、または血圧上昇抑制効果が得られる。好ましくは、これらの効果の２以上が同時に得られ、全部の効果を同時に得ることもできる。
【実施例】
【００３３】
以下の実験例および分析試験例において「％」は特に断りのない限り「質量％」である。
以下の実験例および分析試験例で用いた原料の「茶の葉」はいずれも長崎県総合農林試験場東彼杵茶葉支場で栽培したヤブキタ種の三番茶の葉である。また、特に断りのない限り揉捻は揉捻機を用いて行った。
なお実施例１、分析試験例１〜５におけるＡＧＨ阻害性の評価は、松井らによる遊離ＡＧＨを用いた方法（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ４７，５５０−５５３，（１９９９））に拠って行い、測定結果をα−グルコシダーゼ（ＡＧＨ）酵素活性の阻害率（単位：％）で表している。
【００３４】
［実験例１］
（混合発酵茶葉の製造）
茶の葉にビワ葉を投入し、揉捻機で揉み込んだ。茶の葉とビワ葉の配合割合は茶の葉：ビワ茶の質量比が９０：１０（ビワ投入割合１０％）と７５：２５（ビワ投入割合２５％）の２通りとした。揉み込みの時間は２０分と４０分の２通りとした。
この後、０時間、１時間、２時間、４時間、６時間、２４時間の６通りの発酵工程を経て２４種類の混合発酵茶葉を得た。なお、発酵工程０時間のものは揉み込み終了直後に得られる混合発酵茶葉である。
【００３５】
（官能審査）
緑茶の官能審査経験がある３名のパネラーにて、上記で得た２４種類の混合発酵茶葉について、緑茶の審査法に従って香気および味の審査を行った。審査に当たっては、審査茶碗に混合発酵茶葉３ｇを入れ熱水１８０ｍｌを注ぎ、香りについては熱水を注いだ直後に、味については５分後に審査を行った。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１の結果に示されるように、味、香りに関しては、揉捻時間が２０分、発酵時間が０〜４時間で香気が高く、後味がさっぱりして優れる。揉捻時間が４０分になると味が低下し、発酵時間が６時間以上になると香りの劣化が顕著になる。
【００３８】
（ＡＧＨ活性の測定）
上記で得た２４種類の混合発酵茶葉のうち、発酵時間が６時間と２４時間のものを除く１６種類について、１００℃の熱水で１０分間抽出した抽出液（混合発酵茶葉の使用量；２．０ｍｇ／ｍｌ）のＡＧＨ阻害性を測定した。結果を表２に示す。
また、市販の緑茶、ビワ茶、グアバ茶、紅茶をそれぞれ同様に熱水で抽出した抽出液について、同様にしてＡＧＨ阻害性を測定した。結果を表３に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
表２に示されるように、ＡＧＨ阻害性は、茶の葉に対してビワ葉の配合割合を多くすると阻害率が低くなり、揉捻時間が長くても低くなる。また、発酵時間が長くなるにつれて阻害率が低くなる傾向がある。
また表２，３の結果より、特にビワ葉の配合割合１０質量％、揉捻時間２０分、発酵時間０〜１時間、およびビワ葉の配合割合２５質量％、揉捻時間２０分、発酵時間０時間の条件で、緑茶よりも優れたＡＧＨ阻害性が得られた。
【００４２】
［分析試験例１］
表２において、優れたＡＧＨ阻害性を示した混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）を７０％アセトン（濃度７０体積％のアセトン水溶液、以下同様。）で室温抽出し、抽出液を濃縮して水溶液とした後、エーテルを加え溶媒分配してクロロフィルなどの脂溶性成分を除いた。得られた水層を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した結果を図１に示す。
図１に示されるように、緑茶成分であるカフェイン、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣｇ）に加えて、これらのカテキンの酸化により生成する二量体であるところのテアシネンシンＣ、テアシネンシンＥ、テアシネンシンＡ、テアシネンシンＤ（ＥＧＣｇと重なっている）、テアフラビン類（テアフラビン（ＴＦ）、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート（３−ＴＦＧ）、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート（３’−ＴＦＧ）、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（３，３’−ＴＦＧＧ）を含む。）のピークが検出された。また、ベースラインの盛り上がりとして検出されるカテキン酸化生成物の存在も認められた。
【００４３】
［分析試験例２］
表２において、優れたＡＧＨ阻害性を示した混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）を乾燥させた乾燥発酵茶葉を図２に示す手順で分画した。
＜操作（１）＞ 乾燥発酵茶葉（含水率５質量％）１２５ｇを、７０％アセトン２Ｌと共に破砕機（製品名；ワーリングブレンダー ７０１１Ｓ型、エフ・エム・アイ社製）中で破砕し、ろ過した。残渣を７０％アセトン３Ｌで抽出してアセトン抽出液を得た後、該残渣をメタノール３Ｌで抽出してメタノール抽出液を得た。前記ろ過で得られたろ液と、前記アセトン抽出液と、前記メタノール抽出液を合わせてロータリーエバポレーターで濃縮後乾燥してエキス（乾燥物）５９．９ｇを得た。
＜操作（２）＞ 得られたエキスを水に懸濁し、エーテルを加え溶媒分配してクロロフィルなどの脂溶性成分を除いた。
＜操作（３）＞ 操作（２）で得られた水層を水で調製したＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（ファルマシア ファイン ケミカル社製、４ｃｍ×２８ｃｍ）に流し込み、水（５００ｍＬ）、４０％メタノール（２００ｍＬ）、６０％メタノール（３００ｍＬ）、８０％メタノール（３００ｍＬ）、メタノール（３００ｍＬ）、６０％アセトン（５００ｍＬ）で順次溶出した。
溶出液を濃縮してフラクションＦｒ．１（１８．６６ｇ）、Ｆｒ．２（５．７９ｇ）、Ｆｒ．３（３．１２ｇ）、Ｆｒ．４（４．８７ｇ）、Ｆｒ．５（６．０１ｇ）、Ｆｒ．６（３．５５ｇ）、Ｆｒ．７（２．０７ｇ）に分画した。
各フラクションについてＡＧＨ阻害活性を測定したところ、下記表４に示すように、Ｆｒ．６及び７が非常に高い阻害率を示した。
【００４４】
【表４】
【００４５】
そこで、Ｆｒ．６及び７について、さらに図２に示す操作で分離精製を行った。
＜操作（４）＞ Ｆｒ．６およびＦｒ．７それぞれについて、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ（三菱化学社製、３ｃｍ×２８ｃｍ）に付して、２０％メタノール（1００ｍＬ）、３０％メタノール（1００ｍＬ）、４０％メタノール（1００ｍＬ）、５０％メタノール（1００ｍＬ）、６０％メタノール（1００ｍＬ）、７０％メタノール（1００ｍＬ）、８０％メタノール（1００ｍＬ）、９０％メタノール（１００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．６からＦｒ．６−１（８９９ｍｇ）、Ｆｒ．６−２（２．１６ｇ）、Ｆｒ．６−３（２８２ｍｇ）の画分を得た。また、Ｆｒ．７からＦｒ．７−１（６７ｍｇ）、Ｆｒ．７−２（１．１７ｇ）、Ｆｒ．７−３（６００ｍｇ）の画分を得た。
このうちＦｒ．６−１とＦｒ．７−１は水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルを測定し、標品のスペクトルと比較することにより、それぞれテアシネンシンＡおよびテアシネンシンＤと同定した。Ｆｒ．６−３とＦｒ．７−３はいずれもＨＰＬＣと薄層クロマトグラフィーの結果からテアフラビン類であると同定した。
【００４６】
＜操作（５）＞ Ｆｒ．６−２とＦｒ．７−２を合わせたものをＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ（富士シリシア社製、３ｃｍ×３０ｃｍ）に付して、１０％メタノール（1００ｍＬ）、２０％メタノール（1００ｍＬ）、３０％メタノール（1００ｍＬ）、４０％メタノール（1００ｍＬ）、５０％メタノール（1００ｍＬ）、６０％メタノール（1００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．７２１（１７９ｍｇ）、Ｆｒ．７２２（１．１０ｇ）、Ｆｒ．７２３（５３０ｍｇ）、Ｆｒ．７２４（１．２７ｇ）に分画した。
このうちＦｒ．７２１は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、ＥＧＣｇとテアシネンシンＡの混合物であると同定した。
【００４７】
＜操作（６）＞ Ｆｒ．７２２と７２３を合わせたものをＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（３ｃｍ×２０ｃｍ）に流し込み、エタノール（５００ｍＬ）、９０％エタノール（２００ｍＬ）、２０％メタノール（３００ｍＬ）、６０％アセトン（４００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．７２２１（３．７ｍｇ）、Ｆｒ．７２２２（４１．３ｍｇ）、Ｆｒ．７２２３（４７．０ｍｇ）、Ｆｒ．７２２４（１６６．２ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５（４５８ｍｇ）、Ｆｒ．７２２６（６５７．５ｍｇ）に分画した。
このうちＦｒ．７２２１、Ｆｒ．７２２２、Ｆｒ．７２２３とＦｒ．７２２４は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、標品のスペクトルと比較することにより、それぞれ没食子酸、ＥＣｇ、ＥＧＣｇ、エピガロカテキン−３，３’（４’）−Ｏ−ガレートと同定した。
【００４８】
＜操作（７）＞ Ｆｒ．７２２５をＤｉａｉｏｎＨＰ２０ＳＳ（三菱化学社製、２ｃｍ×２０ｃｍ）に付して、２０％メタノール（1００ｍＬ）、２５％メタノール（1００ｍＬ）、３０％メタノール（1００ｍＬ）、３５％メタノール（1００ｍＬ）、４０％メタノール（1００ｍＬ）、４５％メタノール（1００ｍＬ）、５０％メタノール（1００ｍＬ）、６０％メタノール（１００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．７２２５１（３９．６ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５２（３２０ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５３（４７．７ｍｇ）に分画した。
このうちＦｒ．７２２５１は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、標品のスペクトルと比較することにより、ウーロンテアニンと同定した。
【００４９】
＜操作（８）＞Ｆｒ．７２２５２をＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ（富士シリシア社製、２ｃｍ×２０ｃｍ）に比して、１０％メタノール（1００ｍＬ）、２０％メタノール（1００ｍＬ）、３０％メタノール（1００ｍＬ）、４０％メタノール（1００ｍＬ）、５０％メタノール（1００ｍＬ）、６０％メタノール（1００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．７２２５２１（１０．５ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５２２（３８．３ｇ）、Ｆｒ．７２２５２３（６０ｍｇ）に分画した。
このうちＦｒ．７２２５２１は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、エピガロカテキン−３，３’（４’）−Ｏ−ガレートと同定した。
【００５０】
＜操作（９）＞ Ｆｒ．７２２５２３をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（１．５ｃｍ×２０ｃｍ）に流し込み、８０％メタノール（２００ｍＬ）、９０％メタノール（２００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）、６０％アセトン（２００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．７２２５２３１（１４．４ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５２３２（１６．１ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５２３３（１５．５ｍｇ）に分画した。
このうちＦｒ．７２２５２３２は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、標品のスペクトルと比較することにより、ガロイル ウーロンテアニンと同定した。
【００５１】
これらの結果より、ＡＧＨ阻害活性が高いＦｒ．６及び７の下記の画分にはそれぞれ下記化合物が含まれていることが判明した。下記化合物の構造を図３に示す。
Ｆｒ．６−１：テアシネンシンＡ（ＴＳ−Ａ）、
Ｆｒ．６−３、７−３：テアフラビン（ＴＦ）混合物（テアフラビン、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレートを含む）、
Ｆｒ．７−１：テアシネンシンＤ （ＴＳ−Ｄ）、
Ｆｒ．７２２１：没食子酸、
Ｆｒ．７２２２：エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣｇ）、
Ｆｒ．７２２３：エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）、
Ｆｒ．７２２４およびＦｒ．７２２５２１：エピガロカテキン（ＥＧＣ）−３，３’（４’）−ジ−Ｏ−ガレート、
Ｆｒ．７２２５１：ウーロンテアニン、
Ｆｒ．７２２５２３２：ガロイルウーロンテアニン。
【００５２】
また上記各化合物の含有量を定量した結果を図２中に示している。この結果より、ＡＧＨ阻害活性が高いＦｒ．６の主成分はテアシネンシンＡであることが判明した。またＡＧＨ阻害活性が高いＦｒ．７の主成分はテアフラビン（ＴＦ）混合物であることが判明した。該テアフラビン混合物に含まれる上記テアフラビン類について、それぞれＡＧＨ阻害活性を測定したところ、特にテアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレートが強い酵素阻害活性を示した。このことは後述の分析試験例５、６の結果からもわかる。
【００５３】
［分析試験例３］
上記分析試験例２において非常に高いＡＧＨ阻害活性を示したＦｒ．７について、ＨＰＬＣ分析を行った結果を図４Ａに示す。分析条件は、
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８ ＡＲＩＩ（ナカライテスク社製、４．６×２５０ｍｍ）、
カラム温度：３５℃、
移動相：Ａ；５０ｍＭリン酸、Ｂ；ＣＨ３ＣＮ、Ｂ ４％から３０％（３９分間）、３０％から７５％（１５分間）、
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、
検出：フォトダイオードアレイ検出（Ｍａｘ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）とした。
（なお、以下の分析試験例におけるＨＰＬＣ分析条件は、特に断りがない限り、本試験例と同様である。）
この図の結果より、Ｆｒ．７には上記分析試験例２で存在が判明したテアフラビン混合物および上記化合物のほかに、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析では原点として検出され、ＨＰＬＣ分析ではベースラインの盛り上がりとして検出される物質がかなり多く含まれていることが明らかになった。かかる物質は主に図２中のＦｒ．７２４に分画されていた。
かかる物質は、各種カラムクロマトでの挙動および紫外可視吸収スペクトルがＥＧＣｇのものと類似していること、塩化第二鉄試薬及びバニリン塩酸試薬に対して陽性であることから、上記分析試験例２で存在が判明したカテキン類よりも分子量の大きいカテキン酸化生成物と推測される。
通常、茶に含まれる高分子ポリフェノールの典型的なものにプロアントシアニジンがあり、ビワ葉にはエピカテキンを構成ユニットとするプロアントシアニジン（ビワプロアントシアニジン）が含まれることが知られていることから、前記Ｆｒ．７における「分子量の大きいカテキン酸化生成物」にはプロアントシアニジンが含まれていると推測される。
【００５４】
プロアントシアニジンは、カテキンまたはカテキン誘導体を構成ユニットとする二量体または重合体であり、これを構成するカテキンまたはカテキン誘導体は、４位の炭素（Ｃ−４）と８位の炭素（Ｃ−８）、あるいは４位の炭素（Ｃ−４）と６位の炭素（Ｃ−６）とが炭素−炭素結合されている。
そこで、前記Ｆｒ．７に含まれているプロアントシアニジンの構成ユニットを明らかにする目的で、Ｆｒ．７に対して、下記の方法でメルカプトエタノールによるチオール分解を行った。
すなわち、Ｆｒ．７の６０％エタノール溶液（Ｆｒ．７の濃度；１０ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬに、メルカプトエタノール試液（メルカプトエタノール２．５ｍＬ、０．１％塩酸４ｍＬ，エタノール２７．５ｍＬ、水１６ｍＬを混合したもの）１．８ｍＬを加えて６０℃で６時間加熱し、反応液２０μＬをＨＰＬＣで分析した。分析条件は図４Ａを得たときと同じとした。こうして得られたチオール分解後のクロマトグラムを図４Ｂに示す。
【００５５】
この図４Ｂに示されるように、Ｆｒ．７をチオール分解すると分解前（図４Ａ）には認められないピークが多数出現している。分解前には認められなかったピークおよび分解前よりも増大したピークについて、標品（Ｔａｎａｋａ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．ＣＨｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １，１９９４，３０１３）の保持時間及び紫外吸収スペクトルとの比較を行った結果、ＥＧＣ、ＥＣ、ＥＧＣｇ、ＥＣｇ、ＥＧＣ−ＭＥ、ＥＣ−ＭＥ、ＥＧＣｇ−ＭＥ、ＥＣｇ−ＭＥが同定された。
【００５６】
また、図４Ｂにおいて、３９分に検出されるピークは、Fｒ．７（５００ｍｇ）をメルカプトエタノール試液１０ｍＬに溶解し、６時間加熱後、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ（富士シリシア社製）（水−メタノール溶離液）カラムクロマト、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＥｔＯＨ溶離液）カラムクロマトで分離して精製したところ、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥであることが１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの解析結果より明らかになった。エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥの構造式を図５に示す。
すなわち、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、Ａ環、Ｃ環、ガロイル基及びヒドロキシエチルチオ基のシグナルはＥＧＣｇ−ＭＥのものとほとんど同じであるが、Ｂ環のシグナルがｄ７．４０及び６．８１にいずれも２Ｈ分の二重線（Ｊ＝８Ｈｚ）として観察され、これはＢ環がｐ−ヒドロキシフェノールであることを示していた。また、ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析ではｍ／ｚ ５０３に［Ｍ＋Ｈ］＋ピークを示したこともこのことを支持していた。
【００５７】
これら同定された構成ユニットのうち、ＥＧＣ、ＥＧＣｇ、ＥＣｇは高分子化合物の末端ユニットに由来し、チオエーテル化合物は延長ユニットに由来する。したがって、チオール分解される前の高分子化合物の構造、すなわち前記Ｆｒ．７に含まれるプロアントシアニジンの構造は、例えば図５に示すような構造を有すると推測される。
【００５８】
これまで、エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとするプロアントシアニジンは烏龍茶から得られる二量体が１種知られているのみである（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９８９，３７，３２５５−３２６３）。通常、二量体はＨＰＬＣで明確なピークとして検出されるが、Ｆｒ．７のＨＰＬＣでは、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥの生成量を説明できるほどの二量体に相当するピークは認められないことから、Ｆｒ．７のチオール分解により生成したエピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥは、三量体以上のプロアントシアニジンオリゴマーまたはポリマー由来であるといえる。かかる「エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとするプロアントシアニジン（三量体以上のオリゴマーまたはポリマー）」は、これまで知られていない新規な化合物である。
【００５９】
なお、ビワ葉を加えず、茶の葉のみを用いたほかは同様にして製造した発酵茶葉について、同様の分析試験を行い、チオール分解後に得られたチオエーテル化合物を比較したところ、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥのピークは、ビワ葉を混合した場合も、混合しない場合もほぼ同じ大きさで検出された。また、ビワ葉から抽出したプロアントシアニジンをチオール分解しても、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥは検出されなかった。このことから、Ｆｒ．７に含まれる「エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとするプロアントシアニジン」は茶の葉由来であることがわかる。
また、ＥＣ−ＭＥのピークは、ビワ葉を混合しない場合よりも、混合した場合の方が明らかに大きかった。このことから、ビワ葉に含まれる「エピカテキンを構成ユニットとするプロアントシアニジン（ビワプロアントシアニジン）」は、ＡＧＨ阻害性が高いＦｒ．７に含まれていることがわかる。
【００６０】
［分析試験例４］
図４Ｂに示されるように、ＡＧＨ阻害性が高いＦｒ．７をチオール分解した後も、ベースラインの盛り上がりは残っている。
このことは、Ｆｒ．７には、上記分析試験例３で述べた「エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとするプロアントシアニジン」および「ビワプロアントシアニジン」のほかに、ＨＰＬＣ分析においてベースラインの盛り上がりとして検出される物質が存在することを示している。
そこで、ＨＰＬＣ分析においてベースラインの盛り上がりとして検出される物質が、茶の葉とビワ葉を混合した場合の混合発酵茶葉と、ビワ葉を混合しないほかは同様にした場合の発酵茶葉（以下、単独発酵茶葉ということがある）とで生成量が異なるかどうか比較した。なお混合発酵茶葉の製造条件は分析試験例１，２と同様であり、茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間である。
【００６１】
混合発酵茶葉及び単独発酵茶葉それぞれについて、茶葉（含水率５質量％）３ｇを７０％アセトン１００ｍＬで室温抽出（抽出時間１８時間）した後ろ過した。ろ液を濃縮して水溶液（２０ｍＬ）とした後、エーテル、酢酸エチルで２回ずつ溶媒分配した。
残った水層を一旦濃縮した後、７０％エタノールで３０ｍＬとし、その１０μＬをＨＰＬＣで分析した。該水層のＨＰＬＣ分析結果を図６に示す。
この図に示されるように、混合発酵茶葉の方が、単独発酵茶葉よりも、明らかにベースラインの盛り上がりとして検出される物質の量が多い。ピークの面積を比較すると、混合発酵茶葉においてベースラインの盛り上がりとして検出される物質の量は、単独発酵茶葉の１５９％と見積もられる。この増加分にはビワ葉由来のプロアントシアニジンも含まれるが、混合発酵茶葉におけるビワ葉の添加量は茶の葉の１０分の１量にすぎないため、元々ビワ葉に含まれていた成分だけで５９％の増加は説明できない。したがって、この増加分は、ビワ葉を添加したことにより生成が促進され、ビワ葉を添加しないと生成されないカテキン酸化生成物の存在を示している。
【００６２】
一方、上記で得られた酢酸エチル層を濃縮後、８０％メタノールで３０ｍＬとした後、その１ｍＬをＯＤＳショートカラム（ＴＯＹＯＰＡＫ ＯＤＳ Ｍ、ＴＯＳＯ、東ソー社製）に８０％メタノールで通導し、溶出液を５．０ｍＬとして、その５μＬをＨＰＬＣで分析した。該酢酸エチル層のＨＰＬＣ分析結果を図７に示す。
この図に示されるように、混合発酵茶葉では単独発酵茶葉に比べてテアフラビン類のピーク面積が合わせて２．７倍に増加している。一方、カテキン類のピーク面積は減少しており、具体的にはＥＧＣは０．２４倍、ＥＣは０．４４倍、ＥＧＣｇは０．５７倍、ＥＣｇは０．６４倍にそれぞれ減少している。
このことは、混合発酵茶葉においては、茶葉にビワ葉を添加し揉み込むことで高分子のカテキン酸化生成物が多量に生成されることを示している。
【００６３】
［分析試験例５］
分析試験例４の結果より、混合発酵茶葉においては、茶葉にビワ葉を添加し揉み込むことで高分子のカテキン酸化生成物が多量に生成され、それはＨＰＬＣ分析ではベースラインの盛り上がりとして検出されること、すなわち薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析では原点として検出されることがわかった。
そこで、かかる混合発酵茶葉において特異的に増加する成分を特定することを目的として、以下の方法により、混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）に含まれる成分のうち、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析において原点として検出される酸化型高分子ポリフェノールを分離した。
すなわち、混合発酵茶葉（含水率５質量％）２２８ｇを６０％エタノール３Ｌで３回室温抽出し、３回の抽出液を合わせて減圧濃縮した。得られた水溶液（１．５Ｌ）をエチルエーテル、酢酸エチル、ｎ−ブタノールで順次溶媒分配して、エチルエーテル可溶部（４．０３ｇ）、酢酸エチル可溶部（９．８ｇ）、ｎ−ブタノール可溶部（２２．１ｇ）を得た。
ｎ−ブタノール可溶部１５ｇを６０％メタノールに溶かし、６０％メタノールでコンディショニングしたＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにかけ、６０％メタノール、８０％メタノール、１００％メタノール、次いでメタノール−水―アセトン（８：１：１）混合溶液、メタノール−水―アセトン（６：２：２）混合溶液、水―アセトン（１：１）混合溶液で順次溶出した。溶出液をＴＬＣ（トルエン−ギ酸エチル−ギ酸、１：７：１）分析して、原点から移動しない物質を含むフラクションだけを集め濃縮して、ポリマー様物質（酸化型高分子ポリフェノール画分）１．４ｇを得た。そのＨＰＬＣ分析結果を図８Ａに示す。
【００６４】
図８Ａにおいて、４５分付近の小さいピークはそのＵＶ吸収からテアフラビン類の混在を示しているが、そのピーク面積はベースライン盛り上がり全体の２％以下であった。
こうして得られたポリマー様物質（酸化型高分子ポリフェノール画分）についてＡＧＨ阻害性を測定した。その結果を表５に示す。
またテアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレートについてのＡＧＨ阻害性の測定結果も合わせて表５に示す。
【００６５】
【表５】
【００６６】
表５に示されるように、混合発酵茶葉から上記の方法で分離した酸化型高分子ポリフェノール画分、すなわち混合発酵茶葉において特異的に増加する高分子ポリフェノールは、テアフラビン−３，３’−Ｏ−ジガレートと同等の強いマルターゼ及びスクラーゼ阻害活性を示した。この活性は、含有量から考えて、混入しているテアフラビン類（４５分付近のピーク）によるものではなく、高分子ポリフェノールに由来するものである。
【００６７】
さらに、上記で得られた酸化型高分子ポリフェノール画分に対して、下記の方法でメルカプトエタノールによるチオール分解を行った。
すなわち、上記で得た酸化型高分子ポリフェノールを６０％エタノールに溶解させた溶液（酸化型高分子ポリフェノールの濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬと、メルカプトエタノール試液０．８ｍＬとを混合し、６０℃で５時間反応させ、その５μＬをＨＰＬＣで分析した。その結果を図８Ｂに示す。
前記分析試験例３においてＦｒ．７をチオール分解したものをＨＰＬＣ分析したときと同様に、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥを初めとするチオエーテル化合物及びカテキン類のピークが検出された。また図８Ｂにはチオール分解後にもベースラインの盛り上がりが観察された。
このことから、上記で得られた酸化型高分子ポリフェノール画分には、前述したエピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンが含まれるが、その含有割合は少なく、チオール分解されない物質がかなり含まれていることが示唆される。
【００６８】
そこで、この酸化型高分子ポリフェノール画分の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定し、それをビワ葉に含まれる「エピカテキンを構成ユニットとするプロアントシアニジン（ビワプロアントシアニジン）」の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルと比較した。その結果を図９に示す。図９Ａはビワプロアントシアニジンのスペクトルであり、図９Ｂは前記酸化型高分子ポリフェノール画分のスペクトルである。
図９の結果より、ビワプロアントシアニジンにはカテコール環型Ｂ環（Ｂｃ）由来のシグナルが観察されるのに対して、混合発酵茶葉から分離された酸化型高分子ポリフェノールにはＢ環由来のシグナルがほとんど観察されず、カテキンのＡ環に対応するフロログルシノール（１，３，５−トリヒドロキシベンゼン）に由来するシグナル、及びガロイル基のピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）に由来するシグナルが観察され、小さいながらＣ環由来のシグナルも一部認められた。
このことから、混合発酵茶葉から上記の方法で分離された酸化型高分子ポリフェノールの主成分はビワプロアントシアニジンではなく、Ｂ環部に様々な構造を持つカテキン誘導体が酸化的に縮合して高分子化した物質であることがわかる。
かかる高分子ポリフェノールの構造は、明確ではないが、図３に示した化合物からの類推により、主にカテキンガレート類のＢ環同士が酸化的に縮合して高分子化したものと考えられる。Ｂ環の結合様式としては図３に示すテアシネンシン、テアフラビン、ウーロンテアニンなど様々なタイプが推測されるが、現在のところ詳細は不明である。
【００６９】
また、この酸化型高分子ポリフェノール画分を元素分析した結果、炭素５７．０６％、水素４．５１％、窒素０．３５％であった。
ＥＧＣｇの計算値（Ｃ２２Ｈ１８Ｏ１１：炭素５７．６５％、水素３．９６％、Ｃ２２Ｈ１８Ｏ１１・２Ｈ２Ｏ：炭素５３．４４％、水素４．４９％）に比べて水素含有率が高く、通常の酸化では水素含有率は減少するはずであるので、カテキン酸化の過程で別の代謝産物が取り込まれている可能性が示唆される。
【００７０】
さらに、得られた酸化型高分子ポリフェノールをアセチル化した後、ゲル浸透クロマトグラフィーにより分子量を測定したところ、ピークトップ分子量は２０００（数平均分子量１４００、質量平均分子量３２００）であり、分子量分布は広く１０００〜１５０００程度であった。
ゲル浸透クロマトグラフィーの測定条件は以下の通りとした。
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ ４０００Ｈ６、直径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、東ソー社製、
ポンプ：ＴＯＳＯ ＤＰ８０２０、東ソー社製、
検出器：ＪＡＳＣＯ ＵＶ９７０日本分光社製、２５４ｎｍ、
移動層：テトラヒドロフラン、
温度：室温、
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、
標準ポリスチレンとの比較による分子量計算：ＪＡＳＣＯ ８０７ＩＴインテグレータ、日本分光社製。
なお、カテキン類からの類推でアセチル化による分子量増加分を１．５倍とすると、分子量は１３３０を極大とする６７０〜１０，０００となる。カテキンガレート類だけから生成したものと仮定すると、二量体に相当するもの（テアフラビン）から２０量体に相当するものまで含まれることになる。
【００７１】
［分析試験例６］
ＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＧＣｇ、テアフラビン（ＴＦ）、３−ＴＦＧ、３’−ＴＦＧ、３，３’−ＴＦＧＧ、およびテアシネンシンＡ（ＴＳ−Ａ）の純品（市販品）をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）：水＝１：９からなる混合溶媒に溶解させてサンプル溶液を調製し、各サンプル溶液に関してＡＧＨ阻害活性測定を行った。
本試験例および分析試験例７におけるＡＧＨ阻害性の評価は、ラット小腸ＡＧＨを固定化した担体を用いたｐｓｅｕｄｏ−ｉｎ ｖｉｖｏ法（Ｔ．Ｏｋｉ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２３，１０８４−１０８７（２０００））によって行い、酵素活性を５０％阻害する終濃度（ＩＣ５０値、単位：ｍＭ）で表している。その結果を表６に示す。
【００７２】
【表６】
【００７３】
表６の結果より、マルターゼ阻害性が強いのは、ＥＣＧ、ＥＧＣＧ、３−ＴＦＧ、３，３，−ＴＦＧＧであり、スクラーゼ阻害性が強いのは、ＥＣＧ、ＥＧＣＧ、３，３，−ＴＦＧＧであることが判明した。すなわち、カテキンではエステル型、テアフラビンではガロイル基の多置換ＯＨ基を有する分子構造をもつものがＡＧＨ阻害性がより強いことが明らかとなった。
【００７４】
［分析試験例７］
混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間、含水率５質量％）２０ｇを１００℃の熱水１０００ｍＬで１０分間抽出し、遠心分離して得られる上澄み液を凍結乾燥したものを試料としてＡＧＨ阻害性を調べた。
試料をＤＭＳＯ：水＝１：９の混合溶媒に溶解させてサンプル溶液を調製し、このサンプル溶液に関して上記ｐｓｅｕｄｏ−ｉｎ ｖｉｖｏ法によりＡＧＨ阻害性を測定した。またこのサンプル溶液に含まれるカテキン類（ＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＧＣｇ）およびテアフラビン類（ＴＦ、３−ＴＦＧ、３’−ＴＦＧ、３，３’−ＴＦＧＧ）の含有量を測定した。そして前記分析試験例６で測定したＩＣ５０値に基づいて、混合発酵茶葉によって奏されるＡＧＨ阻害性を１００％としたときの、各成分によって奏されるＡＧＨ阻害性の割合（活性寄与率、単位：％）を求めた。マルターゼ阻害性の結果を表７に示し、スクラーゼ阻害性の結果を表８に示す。
【００７５】
【表７】
【００７６】
【表８】
【００７７】
［分析試験例８］
分析試験例７と同じ混合発酵茶葉２０ｇを１００℃の熱水１Ｌで１０分間抽出した。抽出液をろ過して得られたろ液をエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥した。乾燥後の粉末１０ｍｇに水１ｍｌを添加し、撹拌後、遠心処理（３０００ｒｐｍ、１０分間）を行って上清、すなわち水溶性画分を得た。この水溶性画分のＡＧＨ阻害性を測定した。その結果を下記表９に示す。
なお本分析試験例におけるＡＧＨ阻害性の測定は前記遊離ＡＧＨを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ法（Ｏｋｉ．Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，４７，５５０−５５３（１９９９））により行った。
【００７８】
【表９】
【００７９】
表９の結果より、混合発酵茶葉の熱水抽出物の水溶性画分が、高いＡＧＨ阻害性を示すことがわかる。
そこで、この高いＡＧＨ阻害性を示す熱水抽出物の水溶性画分に対して、下記の方法でさらに成分分離操作を行った。
すなわち、該熱水抽出物の水溶性画分を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用いた吸着クロマトグラフィーに供した。溶出は水、５０％メタノール、１００％メタノール、７０％アセトンの順に行い、それぞれで得られた画分を凍結乾燥したものについて、上記と同様にしてＡＧＨ阻害性測定を行った。各画分の収率及びＡＧＨ阻害性を下記表１０に示す。なお表１０には表９の測定結果も合わせて示す。
【００８０】
【表１０】
【００８１】
表１０に示されるように、混合発酵茶葉熱水抽出物の水溶性画分のうち、特に７０％アセトン溶出画分及び１００％メタノール溶出画分のＡＧＨ阻害性が高かった。
そこで、この７０％アセトン溶出画分及び１００％メタノール溶出画分について、ゲル浸透クロマトグラフィーにより分子量を測定したところ、これらＡＧＨ阻害性が特に高い両画分に含まれる成分は分子量１００〜１５００の範囲にあることが判明した。
ここでのゲル浸透クロマトグラフィーの測定条件は以下の通りである。
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ２５００ ＰＷＸＬ、直径７．８ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、
ポンプ：島津製作所製、ＬＣ−１０Ａｖｐ、
検出器：ＳＰＤ−１０ＡＶ、２５４ｎｍ、
移動層：０．１Ｍ、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む）、
温度：室温、
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ、
標準ポリエチレングリコールとの比較による分子量計算。
【００８２】
［分析試験例９］
上記分析試験例８と同様に、分析試験例７と同じ混合発酵茶葉２０ｇを１００℃の熱水１Ｌで１０分間抽出し、得られた抽出液をろ過してろ液を得た。このろ液を、吸着剤Ｐｏｒａｐａｃｋ Ｑ（製品名、Ｗａｔｅｒｓ社製）を充填したカラムに供した。そして、水１００ｍｌ、続いて５０％メタノール１００ｍｌでカラム中の水溶性成分を溶出させた。こうして得られた水溶出画分、および５０％メタノール溶出画分をそれぞれ濃縮し乾燥させた後、ＡＧＨ阻害活性を測定した。その結果を下記表１１に示す。
本分析試験例におけるＡＧＨ阻害性の測定は上記松井らによる遊離ＡＧＨを用いた方法によって行い、阻害率（単位：％）の値で表す。
【００８３】
【表１１】
【００８４】
表１１に示されるように、混合発酵茶葉熱水抽出物の水溶出画分および５０％メタノール溶出画分のいずれも高いＡＧＨ阻害性を示した。
さらに、該水溶出画分および５０％メタノール溶出画分について、上記分析試験例８と同様の条件で、ゲル浸透クロマトグラフィーにより分子量を測定したところ、これらＡＧＨ阻害性が特に高い両画分に含まれる成分は分子量１００〜１９００の範囲にあることが判明した。
分析試験例８、９の結果より、混合発酵茶葉の熱水抽出物の水溶性画分が高いＡＧＨ阻害性を示すこと、およびこのＡＧＨ阻害性に大きく寄与する成分の分子量は、１００〜１９００程度の比較的低分子量であることがわかった。
【００８５】
［実験例２］
正常ラットに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を摂取させて、耐糖能に及ぼす影響を調べた。
混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）、番茶、ビワ葉を乾燥させ粉砕したビワ葉、およびビワ葉を混合せず茶の葉だけを２０分間揉捻して得た単独発酵茶葉を試料茶葉として用意した。なお上記番茶は、混合発酵茶葉の原料として使用したのと同じ茶の葉を用い、通常の緑茶の製造法に従って製造した番茶（茶の葉を発酵させずに製造した荒茶）である。
それぞれの試料茶葉（含水率５質量％）２０ｇを１００℃の熱水１，０００ｍｌで１０分間抽出した後、ろ過した。ろ液を凍結乾燥した粉末状の抽出物を得た。
コレステロールを含まないＡＩＮ−７６組成を基本とした食餌に、上記で調製した各熱水抽出物を含有率１質量％となるように添加した飼料（４種）を、それぞれ４週齢雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに自由摂食させた。
また、コントロールとして、食餌に熱水抽出物を添加しないコントロール食を、同様のラットに自由摂取させた。
ラットは、室温２２±１℃、湿度５５±５％、８：００〜２０：００点灯のライトサイクルの動物飼育室で飼育した。４週間後、６時間絶食した後、１ｇ／ｋｇ体重のマルトースを経口投与した。投与後、０、１０、２０、３０および６０分後にそれぞれ尾静脈より採血して、血糖試験測定メディセーフチップ（テルモ社製）を用いて血糖値を測定した。
その結果を図１０に示す。
【００８６】
図１０において、横軸はマルトース投与後の経過時間を示し、縦軸は血糖値の値を示している。なお血糖値の値は、マルトース投与時の血糖値を０ｍｇ／ｄｌとして表している。
この図に示されるように、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取したラットの血糖値は、いずれの試料茶葉よりも低いレベルで推移している。
このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物の摂取により優れた血糖値上昇抑制効果が得られることわかる。またその効果は、ビワ葉のみを乾燥させたビワ葉や、茶の葉のみを発酵させた茶葉で得られる効果よりも優れており、茶の葉とビワ葉を混合、揉捻、発酵させることにより相乗効果が得られることがわかる。
【００８７】
［実験例３］
２型糖尿病を発症するラットに混合発酵茶葉の粉末を摂取させて、血糖値に及ぼす影響を調べた。
混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間、含水率５質量％）、をフードプロセッサを用いて、６０〜１００メッシュの大きさの粉末状態になるまで、粉砕加工して粉末状混合発酵茶葉を得た。
ラットは、１ヶ月齢の２型糖尿病を自然発症する雄性のＯｔｓｕｋａ Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ Ｆａｔｔｙ ラット（以下ＯＬＥＴＦラットという）と、その対象モデル動物で糖尿病を発症しない雄性のＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ Ｏｔｓｕｋａ ラット（以下ＬＥＴＯラットという）とを用いた。ラットは、室温２２±１℃、湿度５５±５％、８：００〜２０：００点灯のライトサイクルの動物飼育室で飼育した。
最初の３ヶ月間はＬＥＴＯおよびＯＬＥＴＦラットにＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母工業（株）製）を与えて予備飼育を行った。ＯＬＥＴＦラットは通常５ヶ月齢から８ヶ月齢までに２型糖尿病を発症することから、発症の可能性のある１ヶ月前の４ヶ月齢からＬＥＴＯラットと共に試験食の摂食を開始した。
すなわち、４ヶ月齢の時に６時間絶食（９：００〜１５：００）後、尾静脈より採血して血糖値を測定し、体重と血糖値が等しくなるように１群６匹ずつ群分けし、以下の試験食を５ヶ月間自由摂食させた。
試験食は、ＡＩＮ−７６に基づいた純化食をコントロール食とし、ＬＥＴＯラット−コントロール群とＯＬＥＴＦラット−コントロール群に摂食させた。コントロール食の組成（ｇ／ｋｇ）は、カゼイン２００、サラダ油１００、ミネラル混合（ＡＩＮ−７６−ＭＸ）３５、ビタミン混合（ＡＩＮ−７６−ＶＸ）１０、セルロース５０、重酒石酸コリン２、ＤＬ−メチオニン３、コーンスターチ１５０およびショ糖４５０とした。
ＯＬＥＴＦラット−混合発酵茶葉添加群には、上記コントロール食に粉末状混合発酵茶葉を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
いずれの群も、飼育期間中、摂食量は毎日、体重および摂水量は１日おきに測定した。
【００８８】
試験食投与開始から１、２、３、４および５ヶ月後に、血糖試験測定メディセーフチップ（テルモ社製）を用い、６時間絶食後尾静脈より採血して血糖値を測定した。試験食を摂取した５ヶ月間のラット血糖値の変化を図１１に示す。
図１１において、横軸は試験食投与開始からの経過時間（単位：月）を示し、縦軸は血糖値の値を示している。
この図に示されるように、コントロール食を摂取した糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットの血糖値は、飼育期間を通じて低値であった。一方、コントロール食を摂取した糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットの血糖値は、経時的に上昇し、糖尿病を発症したとみなされた。
これに対して、２型糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットに混合発酵茶葉の粉末を添加した飼料を摂取させた群では、時間が長期間経過しても血糖値は上昇せず糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットと同程度の低レベルであった。このことから混合発酵茶葉の粉末は優れた血糖上昇抑制効果を有することが明らかとなった。
【００８９】
［実験例４］
２型糖尿病を発症するラットに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を摂取させて、血糖値に及ぼす影響を調べた。
混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間、含水率５質量％）２０ｇを１００℃の熱水１０００ｍＬで１０分間抽出し、ろ過して得られるろ液を凍結乾燥して粉末状の混合発酵茶葉抽出物を得た。
比較例として、通常の緑茶の製造法に従って製造した番茶（茶の葉を発酵させずに製造した荒茶）を同様の条件で抽出、ろ過、乾燥して粉末状の番茶抽出物を得た。また同じ含水率となるように乾燥させたビワ葉を同様の条件で抽出、ろ過、乾燥して粉末状のビワ葉抽出物を得た。
ラットは上記実験例３と同条件のものを用い、４ヶ月齢までの飼育条件も同じとした。
４ヶ月齢の時に６時間絶食（９：００〜１５：００）後、尾静脈より採血して血糖値を測定し、体重と血糖値が等しくなるように１群６匹ずつに群分けし、以下の試験食を５ヶ月間自由摂食させた。
ＬＥＴＯラットとＯＬＥＴＦラットのコントロール食群には、実験例３と同じコントロール食を摂食させた。
ＯＬＥＴＦラット−混合発酵茶葉添加群には、上記コントロール食に粉末状の混合発酵茶葉抽出物を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
ＯＬＥＴＦラット−番茶添加群には、上記コントロール食に粉末状の番茶抽出物を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
ＯＬＥＴＦラット−ビワ葉添加群には、上記コントロール食に粉末状のビワ葉抽出物を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
飼育期間中、摂食量は毎日、体重および摂水量は１日おきに測定した。
【００９０】
試験食投与開始から１、２、３、４および５ヶ月後に、実験例３と同様にして血糖値を測定した。試験食を摂取した５ヶ月間のラット血糖値の変化を図１２に示す。
図１２における縦軸と横軸は図１１と同様である。この図に示されるように、コントロール食を摂取した糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットの血糖値は、飼育期間を通じて低値であった。一方、コントロール食を摂取した糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットの血糖値は、経時的に上昇し、糖尿病を発症したとみなされた。
これに対して、２型糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を添加した飼料を摂取させた群では、時間が長期間経過しても血糖値は上昇せず糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットと同程度の低レベルであった。このことから混合発酵茶葉の熱水抽出物は優れた血糖上昇抑制効果を有することが明らかとなった。
【００９１】
［実験例５］
２型糖尿病を発症するラットに混合発酵茶葉の粉末を摂取させたときの他の効果を調べた。
上記実験例３と同様にして粉末状混合発酵茶葉を製造した。
比較例として、混合発酵茶葉の原料として使用したのと同じ茶の葉を用い製造した番茶（茶の葉を発酵させずに製造した荒茶）を製造し、同様に粉砕加工して粉末状番茶を得た。また同じ含水率となるように乾燥させたビワ葉を粉砕加工処理して粉末状ビワ葉を得た。
ラットは上記実験例３と同条件のものを用い、４ヶ月齢までの飼育条件も同じとした。
４ヶ月齢の時に６時間絶食（９：００〜１５：００）後、尾静脈より採血して血糖値を測定し、体重と血糖値が等しくなるように１群６匹ずつに群分けし、以下の試験食を５ヶ月間自由摂食させた。
ＬＥＴＯラットとＯＬＥＴＦラットのコントロール食群には、実験例３と同じコントロール食を摂食させた。
ＯＬＥＴＦラット−混合発酵茶葉添加群には、上記コントロール食に粉末状混合発酵茶葉を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
ＯＬＥＴＦラット−番茶添加群には、上記コントロール食に粉末状番茶を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
ＯＬＥＴＦラット−ビワ葉添加群には、上記コントロール食に粉末状ビワ葉を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
飼育期間中、摂食量は毎日、体重および摂水量は１日おきに測定した。
【００９２】
試験食投与開始５ヶ月後に、６時間絶食後、屠殺して血清、肝臓、および腎臓と睾丸周辺の脂肪組織を採取した。
下記表に血清インスリン濃度、血清過酸化脂質濃度、脂肪組織質量、血清コレステロール、血清トリグリセリド、肝臓コレステロール、肝臓トリグリセリドの測定結果をそれぞれ示す。
【００９３】
【表１２】
【００９４】
表１２の結果より、ＯＬＥＴＦラットにコントロール食またはビワ葉を摂取させた群はインスリンの低下が見られた。なおこれらの群は血糖値測定により糖尿病を発症した状態にあることがわかった。これに対して、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、粉末状混合発酵茶葉を摂取させた群は、インスリン濃度が糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットのレベルまで上昇していた。このことから混合発酵茶葉には糖尿病発症によるインスリン分泌低下を改善する効果があることが認められた。
【００９５】
【表１３】
【００９６】
表１３の結果より、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、粉末状混合発酵茶葉を摂取させた群は、血清過酸化脂質濃度が他のＯＬＥＴＦラット群に比べて低かった。このことから混合発酵茶葉には血清過酸化脂質濃度を低減させる効果があることが認められた。
【００９７】
【表１４】
【００９８】
表１４の結果より、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、粉末状混合発酵茶葉を摂取させた群は、コントロール食を摂取したＯＬＥＴＦラット群より、腎臓と睾丸周辺の脂肪組織質量が有意に低かった。このことから混合発酵茶葉には体脂肪蓄積抑制効果があることが認められた。
【００９９】
【表１５】
【０１００】
表１５の結果より、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、粉末状混合発酵茶葉を摂取させた群は、コントロール食を摂取したＯＬＥＴＦラット群より、血清および肝臓のコレステロール濃度および中性脂肪濃度が低下していた。このことから混合発酵茶葉にはコレステロール低減効果および中性脂肪低減効果があることが認められた。
【０１０１】
［実験例６］
２型糖尿病を発症するラットに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を摂取させたときの他の効果を調べた。
上記実験例４と同様にして、ＬＥＴＯラットおよびＯＬＥＴＦラットに試験食を５ヶ月間自由摂食させた。
試験食投与開始５ヶ月後に、６時間絶食後、屠殺して血清、肝臓、および腎臓と睾丸周辺の脂肪組織を採取した。
下記表に血清インスリン濃度、脂肪組織質量、血清トリグリセリド、肝臓トリグリセリドの測定結果をそれぞれ示す。
【０１０２】
【表１６】
【０１０３】
表１６の結果より、ＯＬＥＴＦラットにコントロール食、番茶抽出物、またはビワ葉抽出物を摂取させた群はインスリンの低下が見られた。なおこれらの群は血糖値測定により糖尿病を発症した状態にあることがわかった。これに対して、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、混合発酵茶葉抽出物を摂取させた群は、インスリン濃度が糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットのレベルまで上昇していた。このことから混合発酵茶葉の熱水抽出物には糖尿病発症によるインスリン分泌低下を改善する効果があることが認められた。
【０１０４】
【表１７】
【０１０５】
表１７の結果より、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、混合発酵茶葉抽出物を摂取させた群は、コントロール食を摂取したＯＬＥＴＦラット群より、腎臓と睾丸周辺の脂肪組織質量が低かった。このことから混合発酵茶葉の熱水抽出物には体脂肪蓄積抑制効果があることが認められた。
【０１０６】
【表１８】
【０１０７】
表１８の結果より、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、混合発酵茶葉抽出物を摂取させた群は、コントロール食を摂取したＯＬＥＴＦラット群より、血清および肝臓中性脂肪濃度が低下していた。このことから混合発酵茶葉の熱水抽出物には中性脂肪低減効果があることが認められた。
【０１０８】
［実験例７］
正常ラットに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を摂取させたときの他の効果を調べた。
すなわち、上記実験例２と同じ試料茶葉（番茶、単独発酵茶葉、ビワ茶、混合発酵茶葉）の熱水抽出物を凍結乾燥させたものをそれぞれ添加した４種の飼料、およびコントロール食を、実験例２と同じ条件で４週齢雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに自由摂食させて飼育した。
４週間後、６時間絶食した後屠殺して、血清、肝臓および脂肪組織を採取した。
下記表に血清過酸化脂質濃度、脂肪組織質量、血清中性脂肪（トリグリセリド）、肝臓中性脂肪（トリグリセリド）の測定結果をそれぞれ示す。
【０１０９】
【表１９】
【０１１０】
表１９の結果より、正常ラットにおいても、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取することにより、コントロール食を摂取した場合に比べて血清過酸化脂質濃度が低下した。このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物は、正常な健康状態においても、血清過酸化脂質低減効果を奏することが認められた。
【０１１１】
【表２０】
【０１１２】
表２０の結果より、正常ラットにおいても、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取することにより、コントロール食を摂取した場合に比べて脂肪組織質量が低かった。このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物は、正常な健康状態においても、体脂肪蓄積抑制効果を奏することが認められた。
【０１１３】
【表２１】
【０１１４】
表２１の結果より、正常ラットにおいても、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取することにより、コントロール食を摂取した場合に比べて血清および肝臓中性脂肪濃度が低かった。このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物は、正常な健康状態においても、中性脂肪低減効果を奏することが認められた。
【０１１５】
［実験例８］
混合発酵茶葉の熱水抽出物摂取による１型糖尿病に及ぼす影響を調べた。
すなわち、上記実験例２と同じ混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を、コレステロールを含まないＡＩＮ−７６組成を基本とした食餌に１質量％添加して４週齢雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに自由摂食させた。比較例として、同じ食餌に混合発酵茶葉抽出物を添加しないコントロール食をＳＤラットに与えた。飼育条件は実験例２と同じ条件とした。
摂食開始日および摂食開始１４日後に、６時間絶食した後、尾静脈より採血して、血糖試験測定メディセーフチップ（テルモ社製）を用いて血糖値を測定した。
また摂食開始１４日後の上記採血後、さらに絶食を続けて９時間後（絶食合計時間：１５時間）、３０ｍｇ／ｋｇ体重のストレプトゾシン（ＳＴＺ）を投与した。このＳＴＺは膵臓ランゲルハンス島β細胞を破壊して、インスリン分泌傷害を引き起こして１型糖尿病を発症させる作用を有する薬剤である。ＳＴＺ投与後、再び食餌を自由摂食させた。
再摂食開始から７日後と１４日後（最初の摂食開始から３週間後と４週間後）に、６時間絶食した後、尾静脈より採血して、血糖試験測定メディセーフチップ（テルモ社製）を用いて血糖値を測定した。
また再摂食開始から２週間後（最初の摂食開始から４週間後）、６時間絶食後（上記採血後）屠殺して、血清および膵臓ランゲルハンス島を採取した。取り出した膵臓ランゲルハンス島にグルコース刺激を与えて、インスリンの分泌を測定した。
摂食開始後の血糖値の変化を図１３に示す。また下記表にインスリン分泌の測定結果、および血清コレステロール濃度と血清中性脂肪濃度の測定結果を示す。
【０１１６】
図１３において、横軸は経過時間を示し、縦軸は血糖値の値を示している。なお血糖値の値は、摂食開始日の血糖値を１００ｍｇ／ｄＬとして表している。
この図に示されるように、コントロール食を摂取したラットの血糖値は、ＳＴＺを投与した１４日以降経時的に上昇し、１型糖尿病を発症したとみなされた。これに対して、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取したラットは、１４日以降の血糖値の上昇が小さく抑えられた。
【０１１７】
【表２２】
【０１１８】
表２２の結果より、摂食開始から４週間後（ＳＴＺ投与から２週間後）の膵臓ランゲルハンス島からのグルコース刺激によるインスリン分泌は、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取したラットでコントロール食を摂取したラットより高かった。このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物は、膵臓ランゲルハンス島を保護することでインスリン分泌機能を維持することが明らかとなり、混合発酵茶葉の熱水抽出物が１型糖尿病予防に有効であることが示唆された。
【０１１９】
【表２３】
【０１２０】
表２３の結果より、摂食開始から４週間後（ＳＴＺ投与から２週間後）の血清コレステロール濃度および血清中性脂肪濃度は、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取したラットでコントロール食を摂取したラットより低い値を示した。このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物は１型糖尿病において、血清脂質濃度低下作用を有することが明らかとなった。
【０１２１】
［実験例９］
発酵茶葉の安全性を確認するために動物実験を行った。
すなわち、混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）、を、フードプロセッサを用いて６０〜１００メッシュの大きさの粉末状態になるまで粉砕加工して得られた粉末状混合発酵茶葉を、４週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄ラットに１日当たり５０００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で経口投与した。温度２２±１℃、湿度５５±５％、飼料および水自由摂食の条件下で４週間飼育したところ、死亡は認められず、異常な体重変化はみられず、飼育終了後の剖検においても臓器の異常は観察されなかった。
従って、ラットに対する発酵茶の致死量（ＬＤ５０）は５０００ｍｇ／ｋｇ体重より多いと推定され、安全性はかなり高いものと判断された。
【０１２２】
［実験例１０］
（混合発酵茶葉の製造−手で揉む方法）
茶の葉にビワ葉を投入し、手で揉む方法で揉捻した。茶の葉とビワ葉の配合割合は茶の葉：ビワ茶の質量比が９０：１０（ビワ投入割合１０％）と７５：２５（ビワ投入割合２５％）の２通りとした。揉み込みの時間（手揉み時間）は２５分と５０分の２通りとした。
この後、０時間、１時間、２時間、４時間の４通りの発酵工程を経て１６種類の混合発酵茶葉を得た。なお、発酵工程０時間のものは揉み込み終了直後に得られる混合発酵茶葉である。
得られた混合発酵茶葉について実験例１と同様にして１００℃の熱水で１０分間抽出した抽出液（混合発酵茶葉の使用量；２．０ｍｇ／ｍｌ）を得、該抽出液について実施例１と同様にしてＡＧＨ阻害性（マルターゼ阻害性およびスクラーゼ阻害性）を測定し、また下記の方法でＤＰＰＨ（１，１−ジピクリル−２−フェニルヒドラジル）消去活性を測定した。それぞれの結果を表２４、２５に示す。なお、ＤＰＰＨ消去活性の測定値が大きいほど抗酸化作用が高いことを示す。また実験例１と同様にして官能審査を行った。結果を表２６に示す。
【０１２３】
（ＤＰＰＨ消去活性の測定方法）
ＤＰＰＨ消去活性（単位：μｍｏｌ−Ｔｒｏｌｏｘ／ｍｇ）の測定は以下の方法で行った（以下、同様。）
混合発酵茶葉を粉砕したものを８０％エタノール溶液に溶かし、同じく８０％エタノール溶液を用いて０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。４００μＭ ＤＰＰＨ１２ｍｌと、２００ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）１２ｍｌと、２０％エタノール１２ｍｌとの混液を作り、エッペンドルフマルチピペットを用いて試験管（ａ）〜（ｆ）に該混液をそれぞれ０．９ｍｌずつ分注した後、試験管（ａ）〜（ｆ）のそれぞれに８０％エタノールを（３００−ｘ）μｌ加えた（ｘは分析試料の添加量であり、具体的に試験管（ａ）〜（ｆ）におけるｘは、順に０、３０、６０、１２０、１８０、２４０である）。さらに試験管（ａ）〜（ｆ）にそれぞれ分析試料（ｘ）μｌを加えて撹拌し、分析試料を添加してから２０分後に波長５２０ｎｍでの吸光度を測定した。
具体的には、時間の測定を開始してから３０秒後に試験管（ｂ）に分析試料を３０μｌ加え、６０秒後に試験管（ｃ）に分析試料を６０μｌ加え、１２０秒後に試験管（ｄ）に１２０μｌ加え、１８０秒後に試験管（ｅ）に１８０μｌを加え、２４０秒後に試験管（ｆ）に２４０μｌ加えた。そして時間の測定を開始してから２０分後に試験管（ａ）の吸光度を測定し、２０分３０秒後に試験管（ｂ）の吸光度を測定し、２１分後に試験管（ｃ）の吸光度を測定し、というように３０秒おきに吸光度の測定を行った。
一方、標準試料としてＴｒｏｌｏｘを用いて検量線を作成した。検量線の横軸は試料添加量（単位：μｍｏｌ）、縦軸は５２０ｎｍでの吸光度である。
分析試料についての測定値を、横軸を試料添加量（単位：μｌ）、縦軸を５２０ｎｍでの吸光度としてプロットし、直線的な吸光度減少が続く範囲内にて添加量（ｘ’μｌ）に対する吸光度（△Ａ５２０）の値を求める。次に検量線において同じ（△Ａ５２０）が得られるときのＴｒｏｌｏｘ添加量（単位：μｍｏｌ）を求める。こうして得られるＴｒｏｌｏｘ相当量（単位：μｍｏｌ）から、混合発酵茶葉１ｍｇ当たりの消去活性の値（単位：μｍｏｌ−Ｔｒｏｌｏｘ／ｍｇ）を求める。
【０１２４】
【表２４】
【０１２５】
【表２５】
【０１２６】
【表２６】
【０１２７】
［実験例１１］
（混合発酵茶葉の製造−すりつぶす方法）
乳鉢に茶の葉とビワ葉を入れてすりつぶした。茶の葉とビワ葉の配合割合は茶の葉：ビワ茶の質量比が９０：１０（ビワ投入割合１０％）と７５：２５（ビワ投入割合２５％）の２通りとした。すりつぶし時間は２０分と４０分の２通りとした。
この後、０時間、１時間、２時間、４時間の４通りの発酵工程を経て１６種類の混合発酵茶葉を得た。なお、発酵工程０時間のものはすりつぶし直後に得られる混合発酵茶葉である。
得られた混合発酵茶葉について実験例１と同様にしてＡＧＨ阻害性を測定し、またＤＰＰＨ消去活性を測定した。それぞれの結果を表２７、２８に示す。また実験例１と同様にして官能審査を行った。その結果を表２９に示す。
【０１２８】
【表２７】
【０１２９】
【表２８】
【０１３０】
【表２９】
【０１３１】
［実験例１２］
（混合発酵茶葉の製造−粉砕撹拌する方法）
ミキサー（製品名：ミルアンドミキサー、テスコム社製）に茶の葉とビワ葉と水を入れて粉砕撹拌した。茶の葉とビワ葉の配合割合は茶の葉：ビワ茶の質量比が９０：１０（ビワ投入割合１０％）と７５：２５（ビワ投入割合２５％）の２通りとした。水の添加量は、茶の葉とビワ葉の合計１００質量部に対して、１００質量部とした。粉砕撹拌時間は１０分と２０分の２通りとした。
この後、１時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間の５通りの発酵工程を経て２０種類の混合発酵茶葉を得た。
得られた混合発酵茶葉について実験例１と同様にしてＡＧＨ阻害性を測定し、またＤＰＰＨ消去活性を測定した。それぞれの結果を表３０、３１に示す。また実験例１と同様にして官能審査を行った。その結果を表３２に示す。
【０１３２】
【表３０】
【０１３３】
【表３１】
【０１３４】
【表３２】
【０１３５】
［分析試験例１０］
（香気成分の分析）
ビワ葉のみを乾燥させたもの、ビワ葉のみを発酵させたもの、市販されている紅茶（ダージリン紅茶およびアッサム紅茶）、長崎県総合農林試験場東彼杵茶業支場で栽培された茶の葉を用いて発酵させた紅茶、同じ茶の葉を用い発酵させずに製造した緑茶（荒茶）、および混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）のそれぞれをサンプルとして、香気成分の定量分析を行った。
一般に茶系の香気成分の前処理は、カラム濃縮法等で行われている。ここでは、簡易・迅速な試料の抽出、濃縮、クロマトグラフ導入法として固相マイクロ抽出法で行った。定量は、測定対象である試料に内標準としてシクロヘキサノールを添加しておき、各香気成分のピーク面積を内標準に対する相対ピーク面積比として求めた。
【０１３６】
具体的には、以下の方法で行った。試料の調整は２００ｍＬの三角フラスコに、サンプルを２０ｇ、３０％塩化ナトリウム水溶液を１ｍＬ、内標準として１％シクロヘキサノールを５０μＬ加えて密栓した後、８０℃で５分間加熱して三角フラスコ内を安定させた後、捕集管を２０分間挿入して、発生した香気成分をトラップした。香気成分をトラップした捕集管を２５０℃に加熱したガスクロマトグラフの注入口に挿入し、香気成分をガスクロマトグラフのカラムに３分間導入して分析を行った。捕集管はＳＵＰＥＬＣＯ社製のポリジメチルシクロヘキサン／ｃａｒｂｏｘｅｎ／ジビニルベンゼンを用いた。ガスクロマトグラフの分析条件については、カラムはＲｅａｐｅｃｔ社製のｓｔａｂｉｌ−ＷＡＸ（ポリエチレングリコール系）６０ｍ×０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μを使用し、カラム温度は７０℃に３分間保持後、２５０℃まで１０℃／分で昇温した。注入口温度は２５０℃、ヘリウム圧力は１２０ｋＰａとした。成分同定のためのガスクロマトグラフ質量分析は、Ｉ／Ｆ温度２５０℃、イオン化電圧７０ｅＶ、イオン化電流６０μＡで行った。１−ヘキサノール、トランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−オール、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、ネロリドールの９成分について、内標準に対する相対ピーク面積比を測定した。その結果を表３３に示す。
【０１３７】
【表３３】
【０１３８】
表の結果より、混合発酵茶葉には表に挙げた９成分が全て含まれている。これらのうち、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、およびネロリドールは、試験場の茶の葉を発酵させた紅茶にも比較的多く含まれており、市販の紅茶２種にも含まれているが、緑茶および発酵したビワ葉における含有量は比較的少ない。また、トランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、および３−ヘキセン−１−オールは、発酵したビワ葉に特徴的に多く含まれている。１−ヘキサノール以外の８成分のピーク面積（内標準に対する相対面積の値）を１−ヘキサノールのピーク面積（内標準に対する相対面積の値）と比較すると、８成分全部の各ピーク面積が、１−ヘキサノールのピーク面積よりも大きいのは混合発酵茶葉のみである。
なお１−ヘキサノールは、混合発酵茶葉において、茶の葉とビワ葉の配合割合、揉捻時間、発酵時間などの製造条件を変えても必ず検出され、かつ表に記載の他の８成分よりも常に少なく検出される香気成分である。
【０１３９】
［実験例１３］
２型糖尿病を自然発症するＫＫ−Ａｙマウスに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）、テアシネンシンを多く含むフラクション（以下、ＴＳフラクションという。）、およびテアフラビンを多く含むフラクション（以下、ＴＦフラクションという。）をそれぞれ摂取させて、血糖値に及ぼす影響を調べた。
混合発酵茶葉の熱水抽出物は、混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間、含水率５質量％）２０ｇを１００℃の熱水１，０００ｍｌで１０分間抽出した後、ろ過し、ろ液を凍結乾燥して粉末状にしたものを用いた。
ＴＳフラクションとしては、前記分析試験例２で得られるＦｒ．６を凍結乾燥して粉末状にしたものを用いた。
ＴＦフラクションとしては、前記分析試験例２で得られるＦｒ．７を凍結乾燥して粉末状にしたものを用いた。
マウスは、室温２２±１℃、湿度５５±５％、８：００〜２０：００点灯のライトサイクルの動物飼育室で飼育した。
５週齢のＫＫ−Ａｙマウスを用い、最初の２週間はＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母工業（株）製）を与えて予備飼育を行った。ＫＫ−Ａｙマウスは７〜８週齢頃に糖尿病を自然発症することから、発症する可能性のある７週齢から試験食の摂食を開始した。すなわち、７週齢のときに６時間絶食（９：００〜１５：００）後、尾静脈より採血して血糖値を測定し、体重と血糖値が等しくなるように１群７匹ずつに群分けし、以下の試験食を６週間自由摂食させた
【０１４０】
試験食は以下の７通りである。
・コントロール食：ＡＩＮ−７６組成に基づいた純化食をコントロール食とした。コントロール食の質量組成（ｇ／ｋｇ）は、カゼイン２００ｇ／ｋｇ、コーン油１００ｇ／ｋｇ、ミネラル混合物（ＡＩＮ−７６−ＭＸ）３５ｇ／ｋｇ、ビタミン混合物（ＡＩＮ−７６−ＶＸ）１０ｇ／ｋｇ、セルロース５０ｇ／ｋｇ、重酒石酸コリン２ｇ／ｋｇ、ＤＬ−メチオニン３ｇ／ｋｇ、コーンスターチ１５０ｇ／ｋｇおよびショ糖４５０ｇ／ｋｇとした。
・抽出物添加食：前記コントロール食１００質量部に、上記粉末状の熱水抽出物（凍結乾燥品）を１質量部を添加し、その添加量分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
・ＴＳ添加食：上記熱水抽出物（凍結乾燥品）にはテアシネンシンが５．４質量％含まれることから、前記抽出物添加試験食中とテアシネンシン含有量が等しくなるように、コントロール食に前記ＴＳフラクションを添加し、その添加量分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
・ＴＳ２倍添加食：テアシネンシン含有量が前記抽出物添加試験食の２倍となるように、コントロール食に前記ＴＳフラクションを添加し、その添加量分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
・ＴＦ添加食：上記熱水抽出物（凍結乾燥品）にはテアフラビンが４．８質量％含まれることから、前記抽出物添加試験食中とテアフラビン含有量が等しくなるように、コントロール食に前記ＴＦフラクションを添加し、その添加量分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
・ＴＦ２倍添加食：テアフラビン含有量が前記抽出物添加試験食の２倍となるように、コントロール食に前記ＴＦフラクションを添加し、その添加量分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
・ＴＳ＋ＴＦ添加食：テアシネンシン含有量およびテアフラビン含有量が前記抽出物添加試験食とそれぞれ等しくなるように、コントロール食に前記ＴＳフラクションおよびＴＦフラクションを添加し、それらの添加量の合計分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
【０１４１】
飼育期間中、摂食量は毎日測定し、体重および摂水量は１日おきに測定した。
試験食摂食開始２、４および６週間後に、血糖試験測定メディセーフチップ（テルモ社製）を用い、６時間絶食後、尾静脈より採血して血糖値を測定した。試験食を摂取した６週間のマウスの血糖値の変化を図１４から図１７に示す。
図１４に示すように、コントロール食を摂取したマウスの血糖値は、経時的に上昇して６週間後には３００ｍｇ／ｄｌを超えた。また摂水量も同様に増加したことから、コントロール食を摂取したマウスは糖尿病を発症したとみなされる。一方、抽出物添加食を摂取したマウスの血糖値は、経時的に減少する傾向にあり、６週間後の値はコントロール食を摂取したマウスの約半分に低下した。
図１５に示すように、ＴＳ添加食を摂取したマウスの血糖値は６週間後に低下し、ＴＳ２倍添加食を摂取した場合はさらに効果的に低下した。
図１６に示すように、ＴＦ添加食を摂取したマウスの血糖値は６週間後に低下し、ＴＦ２倍添加食を摂取した場合は４週間後から低下した。
図１７に示すように、ＴＳ＋ＴＦ添加食を摂取したマウスの血糖値は、４週間以降に抽出物添加食を摂取したマウスとほぼ同じレベルになった。
以上の結果から、混合発酵茶葉の熱水抽出物の血糖上昇抑制作用は、主にテアシネンシンとテアフラビンにより発揮されていることが明らかとなった。
【０１４２】
［臨床試験例１］
混合発酵茶葉の抽出物を含む飲料の摂取が、成人の血糖値、血清中性脂肪、血清コレステロール、体脂肪率および血圧に及ぼす影響を検討した。なお、本試験は県立長崎シーボルト大学研究倫理委員会の承認を受け、ヘルシンキ宣言の精神を遵守して実施した。
被験者は、長崎県庁内での募集に応募した長崎県庁職員で、健康な者と同様の日常生活を営んでおり、医師からの服薬指導を受けておらず、非妊娠者であり医師が適当と判断した者で、本試験の内容について十分な説明を受け、本人の自由意志により本人が同意書を提出した２８名である。
試験飲料は、９０℃の熱水１００質量部に対して、混合発酵茶葉を焙煎したもの（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間、含水率１質量％）を０．８３質量部添加して４分間抽出した後、ろ過したろ液を２００ｍｌずつ紙パックに充填し密封したものを用いた。
試験飲料を被験者に、朝食または昼食時と夕食時に各１本の１日合計２本を３ヶ月間飲用させた。試験飲料摂取前、摂取開始１ヶ月後、２ヶ月後および３ヶ月後の、早朝空腹時に採血、体重測定、体脂肪率測定および血圧（収縮期血圧および拡張期血圧）測定を行った。なお、採血前日の夜９時以降の飲食を禁止した。試験期間３ヶ月中の食事については特別な制限を設けず、日常と変わらない生活をするよう指導した。
血液成分についての測定項目として、総タンパク質、Ａ／Ｇ比、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸、尿酸、尿素窒素、クレアチニン、Ｎａ、Ｃｌ、Ｋ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、γ−ＧＴＰ、リン脂質、Ｃａ、無機リン、コリンエステラーゼ、ＬＤＨ、ＡＬＰ、アルブミン、直接ビリルビン、間接ビリルビン、インスリン、血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ、白血球数、赤血球数、血色素量、ヘマトクリット、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、血小板数を測定した。
【０１４３】
試験飲料を摂取した３ヶ月間、２８名の平均値は、すべての測定項目において正常範囲内であった。
図１８、１９は、血糖値の測定結果を示すグラフであり、図１８は２８名全員の平均値、図１９は、試験飲料摂取開始前の血糖値（初期値）が１１０ｍｇ／ｄＬ以上のヒト（１０名）の平均値を初期値に対する変動率で表している。該変動率は、（測定値の平均値−初期値）／初期値×１００（単位：％）で算出される値であり、図中の「＊」は初期値に対して有意差があることを示す（以下、同様）。
図２０、２１は、血清中性脂肪濃度の測定結果を示すグラフであり、図２０は２８名全員の平均値、図２１は、試験飲料摂取開始前の血清中性脂肪濃度（初期値）が１５０ｍｇ／ｄＬ以上のヒト（９名）の平均値を、初期値に対する変動率で表している。
図２２、２３は、血清コレステロール濃度の測定結果を示すグラフであり、図２２は２８名全員の平均値、図２３は、試験飲料摂取開始前の血清コレステロール濃度（初期値）が２２０ｍｇ／ｄＬ以上のヒト（１１名）の平均値を初期値に対する変動率で表している。
図２４、２５は、体脂肪率の測定結果を示すグラフであり、図２４は２８名全員の平均値、図２５は、試験飲料摂取開始前の体脂肪率（初期値）が２５％以上のヒト（１５名）の平均値を初期値に対する変動率で表している。
図２６、２７は、最高血圧の測定結果を示すグラフであり、図２６は２８名全員の平均値、図２７は、試験飲料摂取開始前の最高血圧（初期値）が１４０ｍｍＨｇ以上のヒト（１４名）の平均値を初期値に対する変動率で表している。
図２８、２９は、最低血圧の測定結果を示すグラフであり、図２８は２８名全員の平均値、図２９は、試験飲料摂取開始前の最低血圧（初期値）が９０ｍｍＨｇ以上のヒト（１０名）の平均値を初期値に対する変動率で表している。
これらの結果より、血糖値については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いヒトでは摂取開始２ヶ月後および３ヶ月後に摂取前に比べて有意に低下した。
血清中性脂肪濃度については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いヒトでは摂取開始２ヶ月後および３ヶ月後に摂取前に比べて４０％程度低下した。
血清コレステロール濃度については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いヒトでは摂取開始２ヶ月後および３ヶ月後に摂取前に比べて有意に低下した。
体脂肪率については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いやや肥満傾向のヒトでは摂取開始３ヶ月後に摂取前に比べて有意に低下した。
最高血圧については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いヒトでは摂取開始１ヶ月後、２ヶ月後および３ヶ月後に摂取前に比べて有意に低下した。
最低血圧については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いヒトでは摂取開始２ヶ月後および３ヶ月後に摂取前に比べて有意に低下した。
これらの結果から、混合発酵茶葉の抽出液を含有する飲料を摂取することにより、血糖値、血清中性脂肪、血清コレステロール、最高血圧および最低血圧の値がそれぞれ高い傾向を有するヒトにおいて、これらの値を改善させる効果が得られることが明らかとなった。またやや肥満傾向にあるヒトの体脂肪率を低下させる効果が得られることが明らかとなった。さらに、正常なヒトでは上記各測定値を低下させないことから、安全性が高い飲料であると評価される。
【０１４４】
［臨床試験例２］
混合発酵茶葉の抽出物を含む飲料の摂取が、若年女子の体脂肪率に及ぼす影響を検討した。なお、本試験は県立長崎シーボルト大学研究倫理委員会の承認を受け、ヘルシンキ宣言の精神を遵守して実施した。
被験者は、県立長崎シーボルト大学内での募集に応募した本学女子学生で、健康な者と同様の日常生活を営んでおり、医師からの服薬指導を受けておらず、非妊娠者であり医師が適当と判断した者で、本試験の内容について十分な説明を受け、本人の自由意志により本人が同意書を提出した成人女子学生５４名である。
試験飲料は上記臨床試験例１と同じものを用いた。また対照飲料として市販の２００ｍｌ紙パック入り緑茶飲料を用いた。
試験飲料を２７名の被験者に、対照飲料を２７名の被験者に、朝食または昼食時と夕食時に各１本の１日合計２本を３ヶ月間飲用させた。
摂取開始前に全員の血糖値および体脂肪率を測定し、試験飲料摂取群と対照飲料摂取群とで、それぞれの平均値がほぼ等しくなるように群分けをした。試験飲料と対照飲料の外見は同じで、外観から識別できないようにした。試験飲料摂取前、摂取開始１ヶ月後、２ヶ月後および３ヶ月後の、早朝空腹時に採血、体重測定、体脂肪測定および血圧測定を行った。なお、採血前日の夜９時以降の飲食を禁止した。試験３ヶ月間の食事については特別な制限を設けず、日常と変わらない生活をするよう指導した。
血液成分の測定項目は上記臨床試験例１と同じとした。
試験飲料を摂取した３ヶ月間、すべての測定項目において５４名の平均値は正常範囲内であった。またこの３ヶ月間、試験飲料を摂取した２７名の被験者と対照飲料を摂取した２７名の被験者の間に、すべての測定項目について差は観察されなかった。
図３０は、試験開始前の体脂肪率（初期値）が２５％以上のヒト（試験飲料摂取者で１１名、対照飲料摂取者で１３名）の体脂肪率を初期値に対する変動率で表している。
この図に示されるように体脂肪率の初期値が２５％以上であるやや肥満傾向の被験者において、試験飲料を摂取した群で対照飲料を摂取した群に比べて３ヶ月後の体脂肪率が有意に低下した。
これらの結果から、混合発酵茶葉の抽出液を含有する飲料を摂取することにより、やや肥満傾向にある若年女子の体脂肪率を低下させる効果が得られることが明らかとなった。また、正常な若年女子が摂取しても安全であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明によれば、上述したような糖尿病や高脂血症の予防または改善に有効な薬効を有する発酵茶葉、発酵茶葉抽出物および飲食品が得られる。
しかも本発明の発酵茶葉は、これまで有効に利用されていないビワ葉を有効利用することができるものであり、原料の茶の葉として、これまで刈り捨てられていた茶葉も使用できるという利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】本発明に係る混合発酵茶葉エキスの高速液体クロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図２】本発明に係る混合発酵茶葉の成分分離操作の例を示すフローチャートである。
【図３】本発明に係る混合発酵茶葉に含有されるポリフェノールの例を示す図である。
【図４】発明に係る混合発酵茶葉の成分分離操作で得られたフラクションの高速液ロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図５】発明に係る混合発酵茶葉の成分分離操作で得られたフラクションに含まれるプロアントシアジニンの推定構造およびそのチオール分解物の例を示す図である。
【図６】本発明に係る混合発酵茶葉エキスおよび比較例としての単独発酵茶葉エキスの水溶性画分の高速液体クロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図７】本発明に係る混合発酵茶葉エキスおよび比較例としての単独発酵茶葉エキスの酢酸エチル可溶画分の高速液体クロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図８】本発明に係る混合発酵茶葉から分離した酸化型高分子ポリフェノール画分およびそのチオール分解物の高速液体クロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図９】本発明に係る混合発酵茶葉から分離した酸化型高分子ポリフェノール画分およびビワプロアントシアニジンの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１０】実験例２の結果を示すグラフである。
【図１１】実験例３の結果を示すグラフである。
【図１２】実験例４の結果を示すグラフである。
【図１３】実験例８の結果を示すグラフである。
【図１４】実験例１３の結果を示すグラフである。
【図１５】実験例１３の結果を示すグラフである。
【図１６】実験例１３の結果を示すグラフである。
【図１７】実験例１３の結果を示すグラフである。
【図１８】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図１９】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２０】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２１】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２２】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２３】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２４】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２５】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２６】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２７】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２８】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２９】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図３０】臨床試験例２の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は茶の葉とビワ葉を混合して用い、これを発酵してなる発酵茶葉、発酵茶葉抽出物およびこれらを用いた飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
茶には、抗酸化作用、抗ガン作用、癌予防、血中コレステロール低下作用、血圧上昇抑制効果等があることが知られている（例えば、下記非特許文献１）。
また下記特許文献１には、グアバ葉の抽出液に含まれるα−アミラーゼ阻害物質を用いたダイエット食品が提案されている。
【特許文献１】特開平７−５９５３９号公報
【非特許文献１】「茶の化学」村松敬一郎 編（朝倉書店）ｐ１２４−１９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
茶の原料や製法は多岐にわたっており、薬効成分についても未知の部分が多い。
茶は安全性の高い食品であり習慣的に摂取することが可能であるので、健康の維持または改善に有効な薬効を奏する新規な茶の開発が期待されている。
【０００４】
本発明は前記事情に鑑みてなされたもので、健康の維持または改善に有効な薬効を有する新規な発酵茶葉、発酵茶葉抽出物およびこれを用いた飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、茶の葉とビワ葉が混合、揉捻され、発酵してなることを特徴とする発酵茶葉を提供する。
本発明は、茶の葉とビワ葉が混合され、かつ組織が破壊され、発酵したことを特徴とする発酵茶葉を提供する。
本発明は、茶の葉とビワ葉が混合され、かつすりつぶされ、発酵したことを特徴とする発酵茶葉を提供する。
本発明は、茶の葉とビワ葉に水を加えて粉砕撹拌混合され、発酵したことを特徴とする発酵茶葉を提供する。
本発明は、本発明の発酵茶葉を抽出して得られる発酵茶葉抽出物を提供する。
本発明は、本発明の発酵茶葉を含有する飲食品を提供する。
本発明は、本発明の発酵茶葉抽出液を含有する飲食品を提供する。
本発明の飲食品は、血糖値上昇抑制用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、糖尿病予防または改善用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、中性脂肪低減用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、コレステロール低減用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、血清過酸化脂質低減用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、体脂肪蓄積抑制用飲食品として好適である。
本発明の飲食品は、血圧上昇抑制用飲食品として好適である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、血糖値上昇抑制効果、糖尿病予防または改善効果、中性脂肪低減効果、コレステロール低減効果、血清過酸化脂質低減効果、体脂肪蓄積抑制効果、または血圧上昇抑制効果といった健康の維持・改善に有効な薬効を有する新規な発酵茶葉、発酵茶葉抽出物およびこれを用いた飲食品が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
＜発酵茶葉＞
本発明において、原料として用いられる茶の葉は、いわゆるツバキ科の常緑低木Ｔｈｅａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｌ．の葉である。この葉としては、一番茶以外に二番茶、三番茶、秋冬番茶、刈番茶なども使用でき、比較的多くのポリフェノール類を含む二番茶以降の安価な茶の葉のほうが好ましい。なお、これらの遅手の番茶は、現在価格が低迷し、かなりのものが廃棄されているが、このものを有効に利用できる。
特に、後述の実験例および分析試験例で用いた長崎東彼杵産の中国種の茶葉、好ましくはヤブキタ種の茶葉には、天然での存在が少ししか確認されていないエピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンが含まれるので好ましい。また該エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンを含む可能性がある茶葉としては、インド産ダージリン紅茶や中国産キーモン紅茶の製造に用いられる茶葉が挙げられる。
該エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンは、後述するように、高いＡＧＨ阻害性（マルターゼ阻害性およびスクラーゼ阻害性）を有する。
【０００８】
本発明において、原料として用いられるビワ葉は、バラ科、植物名「ビワ」の葉であり、特に制限なく用いることができる。
【０００９】
本発明の発酵茶葉（以下、混合発酵茶葉ということもある。）は、次のようにして製造される。
まず、前処理として、ビワ葉および茶の葉を、必要に応じて乾燥し、含水率を５０〜６０質量％程度としておくことが好ましい。また適宜の寸法、例えば１〜１０ｍｍ角程度の大きさに切断しておくことが好ましい。
そして、茶の葉を乾燥し、水分量を減少させ、萎凋させる。この工程では、例えば粗揉機や、直火または電気で加熱した鍋または板状の器具を用い、茶の葉を撹拌しつつ、温度４０〜１５０℃の加熱空気を茶の葉に当てる方法、密閉撹拌容器内に茶の葉を投入し、容器内の空気を吸引して内部を減圧状態として撹拌して乾燥する方法、萎凋槽を用いてネット上に散布した茶の葉の下方から通気する方法などが用いられる。
この萎凋により原料の茶の葉の含水率を４５〜６５質量％、好ましくは５０〜６０質量％程度に減少させておくと、次の揉捻工程で茶の葉から水分が揉み出れ難くなるため、有効成分の流亡を防止できるとともに品質の低下を抑えることができる。また後の乾燥工程が短縮できる点でも好ましい。
【００１０】
次いで、萎凋工程を経た原料の茶の葉を加圧しながら揉む（揉捻）とともに、この揉捻時にビワ葉を添加して、両者を一緒に揉捻する。ビワ葉は茶の葉の揉捻開始と同時に添加してもよく、あるいは一定時間茶の葉のみの揉捻を行った後、びわ葉を添加してさらに揉捻してもよい。全揉捻時間のうち、揉捻開始から０〜４０％の時間が経過したのち、ビワ葉を添加することが好ましい。ビワ葉を揉捻工程の最初から添加しておくことがより好ましい。
ビワ葉の添加量は、ビワ葉／茶の葉の絶乾質量比が、５／９５〜３５／６５の範囲が好ましく、８／９２〜３０／７０の範囲がより好ましい。ビワ葉の添加量が上記範囲内であれば、茶の葉とビワ葉を混合したことによる血糖値上昇抑制作用の向上効果が良好に得られる。
【００１１】
揉捻は、茶の葉の揉捻に用いられている通常の揉捻機を用いる方法など、公知の方法を適宜採用できる。
揉捻時間は、１５〜２５分とされる。この範囲とすることにより血糖値上昇抑制作用が良好となる。
また、揉捻時の原料の温度は、２０〜４０℃とされる。２０℃未満では発酵不足となり、４０℃を越えると品質低下が著しくなる。
【００１２】
この揉捻により、茶の葉およびビワ葉の組織が破壊され、茶の葉に含まれるポリフェノールオキシダーゼなどの酸化酵素が茶の葉およびビワ葉に含まれるポリフェノールを酸化、重合し、酸化重合物が生成する。
【００１３】
次いで、この状態の混合原料を発酵工程に移す。すなわち、揉捻後の混合原料を数ｃｍの厚さに堆積させた状態で、温度２０〜２７℃、湿度３０〜６０％ＲＨの発酵室内などの環境下に静置する。なお、茶類の製造工程における「発酵」とは葉中の酸化酵素による酸化反応を意味する。
発酵時間は０〜４時間とされる。ここで、発酵時間が０時間と言うことは、先の揉捻工程において、揉捻の開始と同時に発酵が開始するためであり、揉捻工程の時間を発酵工程に含めない場合には、発酵時間が０時間と言うこともあり得るのであり、実体は０時間でも発酵が行われているものである。発酵時間が４時間を超えると、得られる混合発酵茶葉またはその抽出物の味、香りが低下する傾向がある。特に優れたＡＧＨ阻害性を得るには、発酵時間は１時間以下が好ましく、０時間が最も好ましい。
【００１４】
次いで、所定の発酵時間が経過したならば、原料を加熱して発酵を止め、乾燥する。例えば、連続式乾燥機に原料を投入し、これに温度８０〜１２０℃の熱風を吹き込み、排気温度が５０〜６０℃となるように操作する。加熱時間は１０〜３０分程度で十分であり、これにより原料中の含水率を５質量％程度とする。
上記製造工程において、揉捻時間、発酵時間が長くなるほどＡＧＨ阻害性が低くなる。また、抗酸化作用（１，１−ジピクリル−２−フェニルヒドラジル（ＤＰＰＨ）消去活性）も低くなる。機能性に注目して製造を行うなら揉捻時間を１５〜２５分とし、発酵時間をなるべく短くすることが理想である。
また、発酵時間が長くなるほど味に関しては苦渋みが強くなり、香りも悪くなり発酵時間が短いほど味、香りとも優れる。
【００１５】
こうして混合発酵茶葉が得られる。加熱工程後のものは、いわゆる荒茶であり、これに必要に応じて仕上げ加工を施して仕上げ茶としてもよい。仕上げ加工は、再乾燥、火入れ、篩い分け、整形、選別など、従来の茶葉製造における仕上げ加工と同様の工程を適宜採用することができる。上記火入れは、再加熱して香味の発揚を図る工程である。仕上げ加工を行うことにより、貯蔵性、香りなどの品質を高めて商品性を向上させることができる。また荒茶または仕上げ茶を適宜の大きさの粉末状にしてもよい。
【００１６】
また上記揉捻工程は、上述したように茶の葉およびビワ葉の組織が破壊されればよく、揉捻機を用いる方法のほかに、例えば手で揉む方法、すりつぶす方法、水を加えて粉砕する方法等を用いて行うことができる。
手で揉む方法を用いる場合は、通常、茶の葉の揉み込みに用いられている手法を適宜用いることができる。例えば、「ねこぶき」と呼ばれる荒縄で編んだ凹凸のある敷物上で、手で揉み込む方法などが採用でき、これ以外の方法を用いてもよい。具体的には、萎凋工程を経た原料の茶の葉を手で揉む方法で揉捻するとともに、この揉捻時にビワ葉を添加して、両者を一緒に揉捻する。この場合の揉捻時間は２０〜３０分が好ましく、２０分未満または３０分を超えると、得られる発酵茶の血糖値上昇抑制作用が低くなる。その他の条件等は上記と同じである。発酵工程は上記と同様に行うことができる。
本方法において、揉捻時間、発酵時間が長くなるほどＡＧＨ阻害性が低くなる。また、抗酸化作用（ＤＰＰＨ消去活性）も低くなる。機能性に注目して製造を行うなら揉捻時間を２０〜３０分とし、発酵時間をなるべく短くすることが理想である。
【００１７】
すりつぶす方法を用いる場合は、茶の葉のすりつぶしに用いられている通常の乳鉢を用いる方法などが採用でき、これ以外のすりつぶし方法を用いてもよい。具体的には、萎凋工程を経た原料の茶の葉をすりつぶすとともに、このすり込み時にビワ葉を添加し、両方の原料をすり込む。この場合のすりつぶし時間は、１５〜２５分が好ましく、１５分未満または２５分を超えると、得られる発酵茶の血糖値上昇抑制が低くなる。すりつぶし時間の原料の温度は、２０〜４０℃とされる。２０℃未満では発酵不足となり、４０℃を超えると品質低下となる。さらに、ビワ葉の添加のタイミングは、茶の葉のすりつぶし開始と同時に添加してもよく、あるいは一定時間茶の葉のみのすりつぶしを行った後、ビワ葉を添加してさらにすりつぶしてもよい。全すりつぶし時間のうち、すりつぶし開始から０〜４０％の時間が経過したのち、ビワ葉を添加することができる。その他の条件等は上記と同じである。
こうしてすりつぶすことによって、茶の葉およびビワ葉の原料の組織が破壊され、茶の葉に含まれるポリフェノールオキシダーゼなどの酸化酵素が茶の葉およびビワ葉に含まれるポリフェノールを酸化、重合し、酸化重合物が生成する。発酵工程は上記と同様に行うことができる。
本方法において、すりつぶし時間、発酵時間が長くなるほどＡＧＨ阻害性が低くなる。また、抗酸化作用（ＤＰＰＨ消去活性）も低くなる。機能性に注目して製造を行うならすりつぶし時間を１５〜２５分とし、発酵時間をなるべく短くすることが理想である。
また、発酵時間が長くなるほど味に関しては苦渋みが強くなり、香りも悪くなり発酵時間が短いほど味、香りとも優れる。
【００１８】
水を加えて粉砕する方法を用いる場合は、茶の葉とビワ葉に水を加え粉砕撹拌することによって、これらを混合するとともに茶の葉およびビワ葉の原料の組織を破壊することができる。粉砕撹拌は、茶の葉の粉砕撹拌に用いられている通常のミキサー等を用いる方法などが採用でき、これ以外の粉砕撹拌方法を用いてもよい。具体的には、萎凋工程を経た原料の茶の葉およびビワ葉に水を加えて粉砕撹拌する。茶の葉とビワ葉の混合割合は上記と同様である。加える水の量は茶の葉とビワ葉の合計１００質量部に対して、２０〜２００質量部が好ましく、５０〜１５０質量部がより好ましい。
粉砕撹拌時間は、５〜１５分とされ、５分未満または１５分を超えると、得られる発酵茶の血糖値上昇抑制が低くなる。粉砕撹拌時の原料の温度は上記と同様であり、２０〜４０℃とされる。
ビワ葉の添加のタイミングは、粉砕撹拌開始と同時に添加してもよく、あるいは一定時間茶の葉のみの粉砕撹拌を行った後、ビワ葉を添加してさらに粉砕撹拌してもよい。全粉砕撹拌時間のうち、粉砕撹拌開始から０〜５０％の時間が経過したのち、ビワ葉を添加することが好ましい。
こうして粉砕撹拌することによって、茶の葉およびビワ葉が混合されるとともに、これら原料の組織が破壊され、茶の葉に含まれるポリフェノールオキシダーゼなどの酸化酵素が茶の葉およびビワ葉に含まれるポリフェノールを酸化、重合し、酸化重合物が生成する。
ついで、粉砕撹拌により得られた混合原料を発酵する工程においては、粉砕撹拌後の混合原料を数ｃｍの厚さに堆積し、温度２０〜２７℃、湿度３０〜６０％ＲＨの発酵室内などの環境下において静置する。発酵時間は４〜１２時間が好ましい。発酵時間が４時間未満では、発酵が進んでいないので血糖値上昇抑制作用が低く、香りも青臭い。発酵時間が１２時間を超えると、得られる発酵茶の味、香りが低下する傾向がある。薬効を重視した場合では、４〜１２時間が好ましい。すなわち発酵時間４〜１２時間が、特にＡＧＨ阻害性が高くなる。また抗酸化作用（ＤＰＰＨ消去活性）も高くなる。機能性に注目して製造を行うなら粉砕撹拌時間１０〜１５分、発酵時間を４〜１２時間に保つことが理想である。また、この時間外では味に関しては苦渋みが強くなり、香りも悪くなる。
ついで、所定の発酵時間が経過したならば、原料を加熱して発酵を止め、乾燥する。例えば、容器に原料を流し込んだものを、乾燥機に入れ温度８０〜１２０℃の熱風を吹き込み、排気温度が５０〜６０℃となるように操作する。加熱時間は６０〜１２０分程度が好ましく、これにより原料中の水分量を５％程度とする。こうして、本発明の発酵茶が得られるが、加熱工程後のものは、粉状に粉砕してもよく、粉砕せずに固形物として用いることもできる。
【００１９】
こうして得られる混合発酵茶葉に含まれる成分としては、後述の分析試験例で分離された成分が挙げられる。
本発明の混合発酵茶葉によって奏される薬効に寄与する有効成分についての全体像は未だ明らかではないが、下記（１）〜（４）の各成分は、後述の実験例および分析試験例により、高いＡＧＨ阻害性（マルターゼ阻害性およびスクラーゼ阻害性）を示すことが判明している。
（１）テアシネンシンＡ（以下、ＴＳ−Ａと略記することもある。）、
（２）ガロイル基を有するテアフラビン誘導体、
（３）エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジン、
（４）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルでカテキンＡ環のフロログルシノール由来のシグナルとガロイル基由来のシグナルを示し、アセチル化体の分子量が２０００を極大とする１０００〜１５０００であるカテキンガレート類の酸化縮合したポリフェノール（以下、ポリフェノールＰと略記することもある。）。
【００２０】
（１）テアシネンシンＡは、図３に示される構造を有する化合物である。
（２）ガロイル基を有するテアフラビン誘導体は、具体的には、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート（３−ＴＦＧ）、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート（３’−ＴＦＧ）、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（３，３’−ＴＦＧＧ）から選ばれる１種以上である。これらの構造は図３に示される。これらの中でも、特に、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレートはＡＧＨ阻害性がより強い。
（３）エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンは、後述の分析試験例３におけるFｒ．７に含まれており、メルカプトエタノールによるチオール分解により、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）、およびエピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣｇ（以下、ＥＣＧと記載することもある））からなる群から選ばれる１種以上と、ＥＧＣ−ＭＥ（以下、「−ＭＥ」は「４−（２’−ハイドロキシエチルチオ）エーテル」を示す。例えばＥＧＣ−ＭＥは、ＥＧＣの４−（２’−ハイドロキシエチルチオ）エーテルであることを示す。以下同様）、ＥＣ−ＭＥ、ＥＧＣｇ−ＭＥ、およびＥＣｇ−ＭＥからなる群から選ばれる１種以上と、エピアフゼレチン−３−O−ガレート−ＭＥとを生じるものである。かかるプロアントシアニジンのチオール分解前の構造は例えば図４に示されるものと推定される。なお、（３）成分におけるエピアフゼレチンガレートは、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレートを指す。
この成分（３）は原料の茶の葉由来であり、原料の茶の葉として、（３）エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンを含有する茶の葉を用いて製造した混合発酵茶葉に含まれる。
【００２１】
上記（４）ポリフェノールＰは、例えば後述の分析試験例５に示されるように、これを含有する発酵茶葉を、６０％エタノール（濃度６０体積％のエタノール水溶液、以下、同様）で室温抽出した抽出液をエチルエーテル、酢酸エチル、ｎ−ブタノールで順次溶媒分配し、ｎ−ブタノール可溶部を６０％メタノールに溶かしたものを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにて、６０％メタノール、８０％メタノール、１００％メタノール、次いでメタノール−水―アセトン（８：１：１）混合溶液、メタノール−水―アセトン（６：２：２）混合溶液、水―アセトン（１：１）混合溶液で順次溶出した溶出液を、薄層クロマトグラフィー（トルエン−ギ酸エチル−ギ酸、１：７：１）分析して、原点から移動しない物質を含むフラクションだけを集めて濃縮して得られるものである。
【００２２】
また本発明の混合発酵茶葉には、ビワプロアントシアニジンが含まれることが特徴的である。後述の分析試験例３に示されるように、ビワプロアントシアニジンは、ＡＧＨ阻害性が高い混合発酵茶葉の抽出物から得られる複数のフラクションの中で、最もＡＧＨ阻害性が高いフラクション（Ｆｒ．７）に含まれていることからＡＧＨ阻害性に寄与していると考えられる。
【００２３】
また本発明の混合発酵茶葉は、ビワ葉を添加したことで、テアフラビン類（テアフラビン（ＴＦ）、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート（３−ＴＦＧ）、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート（３’−ＴＦＧ）、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（３，３’−ＴＦＧＧ））の生成が促進された点も特徴的である。
すなわち、混合発酵茶葉に含まれるテアフラビン類の合計の含有量は、ビワ葉を加えない他は同条件で製造した茶の葉の単独発酵茶葉に含まれるテアフラビン類の合計の含有量よりも多く、例えば１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは２．５倍以上である。上限は制限されないが、４倍より多くはならないと推測される。
例えば、後述の分析試験例４および図７（発酵茶葉エキスの酢酸エチル可溶性画分の高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略記することもある。）分析結果）において、混合発酵茶葉エキスは、単独発酵茶葉エキスに比較して、テアフラビン類のピーク面積の合計が約２．７倍にも増加しており、ビワ茶の添加によってテアフラビン類の生成が大幅に促進されたことがわかる。
【００２４】
また本発明の混合発酵茶葉は、ビワ葉を添加したことで、前記（４）成分（ポリフェノールＰ）の生成が促進された点も特徴的である。
すなわち、混合発酵茶葉に含まれるポリフェノールＰの含有量は、ビワ葉を加えない他は同条件で製造した茶の葉の単独発酵茶葉に含まれるポリフェノールＰの含有量よりも多い。例えば１．２倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上である。上限は制限されないが、４倍より多くはならないと推測される。
例えば、後述の分析試験例４および図６（発酵茶葉エキスの水溶性画分のＨＰＬＣ分析結果）において、混合発酵茶葉エキスは、単独発酵茶葉エキスに比較して、ベースラインの盛り上がりとして検出される物質のピーク面積が約１．５９倍（１５９％）にも増加しており、この増加分はビワ茶の添加によって生成が促進されたカテキン酸化生成物によると考えられる。このカテキン酸化生成物は、分析試験例５において前記ポリフェノールＰとして特定された成分に相当する。
【００２５】
また本発明の混合発酵茶葉は、１−ヘキサノール、トランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−オール、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、およびネロリドールの香気成分を含み、固相マイクロ抽出法においてトランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−オール、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、ネロリドールの香気成分の各ピーク面積が、いずれも１−ヘキサノールのピーク面積より大きいという、特徴的な香気成分組成を有する。
上記に挙げた香気成分のうち、後述の分析試験例１０にも示されるように、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、およびネロリドールは、紅茶等の発酵茶にも比較的多く含まれ、緑茶等の不発酵茶および発酵したビワ葉には少ない香気成分である。また、トランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、および３−ヘキセン−１−オールは、発酵したビワ葉にも比較的多く含まれる香気成分である。本発明の混合発酵茶葉は、これらの香気成分を比較的多い含有量で有しており、これにより発酵茶として特有な香りを味わうことができる。
【００２６】
本発明の混合発酵茶葉は、後述の実験例にも示されるように、高いＡＧＨ阻害性を示し、これを摂取することにより、血糖値上昇抑制作用が得られ、糖尿病予防または改善効果、中性脂肪低減効果、コレステロール低減効果、血清過酸化脂質低減効果、体脂肪蓄積抑制効果、または血圧上昇抑制効果が得られる。好ましくは、これらの効果の２以上が同時に得られ、全部の効果を同時に得ることもできる。
【００２７】
＜発酵茶葉抽出物＞
本発明の発酵茶葉抽出物（以下、混合発酵茶葉抽出物ということもある）は、発酵茶葉の可溶性成分を抽出溶媒で抽出して得られる抽出物である。抽出溶媒は水（温水または熱水を含む）でもよく、有機溶媒でもよい。有機溶媒の具定例としてはメタノール、エタノール、アセトン等が挙げられる。本発明の血糖値上昇抑制用組成物としての発酵茶葉抽出物の形態は特に限定されず、溶液状でもよく、その濃縮物でもよく、さらに凍結乾燥等により乾燥させた固体でもよい。固体の場合は、塊状であってもよく、さらにそれを適宜の大きさに粉砕した粉末状であってもよい。発酵茶葉抽出物を有機溶媒を含む形態で飲食品に用いる場合は、有機溶媒としてエタノールが用いられる。
【００２８】
抽出条件は特に制限されないが、水で抽出する場合は、温度４０〜１００℃の温水または熱水に発酵茶葉を３分間〜６０分間程度浸して抽出することが好ましい。水と発酵茶葉との割合は、水１００質量部に対して、発酵茶葉（含水率５質量％）０．５〜２０質量部程度が好ましく、０．５〜５質量部程度がより好ましい。
有機溶媒で抽出する場合は、有機溶媒１００質量部に対して発酵茶葉（含水率５質量％）０．１〜２０質量部程度を用い、常圧または加圧下で、温度−２０〜６０℃、時間１〜６０分の条件で行うことが好ましいが、この範囲に限定されず、適宜変更することができる。
抽出処理後、ろ過、遠心分離などで、固形分を除去して抽出液が得られる。
【００２９】
混合発酵茶葉抽出物には、混合発酵茶葉の可溶性成分が含まれており、後述の実験例および分析試験例に示されるように高いＡＧＨ阻害性を示す。また後述の実験例および分析試験例に示されるように、該混合発酵茶葉抽出物を摂取することにより、血糖値上昇抑制効果、糖尿病予防または改善効果、中性脂肪低減効果、コレステロール低減効果、血清過酸化脂質低減効果、体脂肪蓄積抑制効果、または血圧上昇抑制効果が得られる。好ましくは、これらの効果の２以上が同時に得られ、全部の効果を同時に得ることもできる。
【００３０】
本発明の飲食品は、混合発酵茶葉を含有するもの、または混合発酵茶葉抽出物を含有するものであって、かつ経口摂取できる形態のものであれば特に限定されない。混合発酵茶葉と混合発酵茶葉抽出物の両方を含有してもよい。
本発明の飲食品は、例えば、混合発酵茶葉抽出物を含有する各種飲料である。また混合発酵茶葉抽出物が混合発酵茶葉を水で抽出したものであって、そのまま飲用可能な風味を有するものであれば、該抽出物を茶飲料とすることもできる。
または、混合発酵茶葉および／または混合発酵茶葉抽出物を種々の食品素材に添加した食品である。食品素材としては特に限定されることはなく、納豆、豆乳、味噌、醤油などの大豆食品、はんぺん、かまぼこ、ちくわなどの練り製品、ハム、ソーセージなどの食肉加工品、飴、キャラメル、最中、羊羹などの菓子類など多岐にわたる。
【００３１】
本発明の飲食品における、混合発酵茶葉および／または混合発酵茶葉抽出物の含有量は任意であり、得ようとする薬効の程度、および期待される風味および摂取量に応じて適宜設定することができる。
例えば血糖値上昇抑制用飲食品の場合は、添加する混合発酵茶葉および混合発酵茶葉抽出物それぞれのＡＧＨ阻害性（例えばＩＣ５０）を目安として、得ようとする血糖値上昇抑制効果、および期待される風味および摂取量に応じて適宜設定することができる。
【００３２】
発酵茶葉を水で抽出した抽出物をそのまま茶飲料とする場合、水と発酵茶葉との割合は、水１００質量部に対して、発酵茶葉（含水率５質量％）０．５〜２０質量部程度が好ましい。また抽出方法は、温度４０〜１００℃の温水または熱水に３分間〜６０分間浸す方法が好ましい。
発酵茶葉を食品素材に添加する場合、例えば、食品素材１００質量部に対して、発酵茶（含水率５質量％）０．１〜２００質量部の範囲で適宜に決めることができる。
このような本発明の飲食品は、混合発酵茶葉および／または混合発酵茶葉抽出物を含んでおり、これを摂取することにより血糖値上昇抑制効果、糖尿病予防または改善効果、中性脂肪低減効果、コレステロール低減効果、血清過酸化脂質低減効果、体脂肪蓄積抑制効果、または血圧上昇抑制効果が得られる。好ましくは、これらの効果の２以上が同時に得られ、全部の効果を同時に得ることもできる。
【実施例】
【００３３】
以下の実験例および分析試験例において「％」は特に断りのない限り「質量％」である。
以下の実験例および分析試験例で用いた原料の「茶の葉」はいずれも長崎県総合農林試験場東彼杵茶葉支場で栽培したヤブキタ種の三番茶の葉である。また、特に断りのない限り揉捻は揉捻機を用いて行った。
なお実施例１、分析試験例１〜５におけるＡＧＨ阻害性の評価は、松井らによる遊離ＡＧＨを用いた方法（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ４７，５５０−５５３，（１９９９））に拠って行い、測定結果をα−グルコシダーゼ（ＡＧＨ）酵素活性の阻害率（単位：％）で表している。
【００３４】
［実験例１］
（混合発酵茶葉の製造）
茶の葉にビワ葉を投入し、揉捻機で揉み込んだ。茶の葉とビワ葉の配合割合は茶の葉：ビワ茶の質量比が９０：１０（ビワ投入割合１０％）と７５：２５（ビワ投入割合２５％）の２通りとした。揉み込みの時間は２０分と４０分の２通りとした。
この後、０時間、１時間、２時間、４時間、６時間、２４時間の６通りの発酵工程を経て２４種類の混合発酵茶葉を得た。なお、発酵工程０時間のものは揉み込み終了直後に得られる混合発酵茶葉である。
【００３５】
（官能審査）
緑茶の官能審査経験がある３名のパネラーにて、上記で得た２４種類の混合発酵茶葉について、緑茶の審査法に従って香気および味の審査を行った。審査に当たっては、審査茶碗に混合発酵茶葉３ｇを入れ熱水１８０ｍｌを注ぎ、香りについては熱水を注いだ直後に、味については５分後に審査を行った。結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１の結果に示されるように、味、香りに関しては、揉捻時間が２０分、発酵時間が０〜４時間で香気が高く、後味がさっぱりして優れる。揉捻時間が４０分になると味が低下し、発酵時間が６時間以上になると香りの劣化が顕著になる。
【００３８】
（ＡＧＨ活性の測定）
上記で得た２４種類の混合発酵茶葉のうち、発酵時間が６時間と２４時間のものを除く１６種類について、１００℃の熱水で１０分間抽出した抽出液（混合発酵茶葉の使用量；２．０ｍｇ／ｍｌ）のＡＧＨ阻害性を測定した。結果を表２に示す。
また、市販の緑茶、ビワ茶、グアバ茶、紅茶をそれぞれ同様に熱水で抽出した抽出液について、同様にしてＡＧＨ阻害性を測定した。結果を表３に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】
【表３】
【００４１】
表２に示されるように、ＡＧＨ阻害性は、茶の葉に対してビワ葉の配合割合を多くすると阻害率が低くなり、揉捻時間が長くても低くなる。また、発酵時間が長くなるにつれて阻害率が低くなる傾向がある。
また表２，３の結果より、特にビワ葉の配合割合１０質量％、揉捻時間２０分、発酵時間０〜１時間、およびビワ葉の配合割合２５質量％、揉捻時間２０分、発酵時間０時間の条件で、緑茶よりも優れたＡＧＨ阻害性が得られた。
【００４２】
［分析試験例１］
表２において、優れたＡＧＨ阻害性を示した混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）を７０％アセトン（濃度７０体積％のアセトン水溶液、以下同様。）で室温抽出し、抽出液を濃縮して水溶液とした後、エーテルを加え溶媒分配してクロロフィルなどの脂溶性成分を除いた。得られた水層を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した結果を図１に示す。
図１に示されるように、緑茶成分であるカフェイン、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣｇ）に加えて、これらのカテキンの酸化により生成する二量体であるところのテアシネンシンＣ、テアシネンシンＥ、テアシネンシンＡ、テアシネンシンＤ（ＥＧＣｇと重なっている）、テアフラビン類（テアフラビン（ＴＦ）、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート（３−ＴＦＧ）、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート（３’−ＴＦＧ）、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレート（３，３’−ＴＦＧＧ）を含む。）のピークが検出された。また、ベースラインの盛り上がりとして検出されるカテキン酸化生成物の存在も認められた。
【００４３】
［分析試験例２］
表２において、優れたＡＧＨ阻害性を示した混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）を乾燥させた乾燥発酵茶葉を図２に示す手順で分画した。
＜操作（１）＞ 乾燥発酵茶葉（含水率５質量％）１２５ｇを、７０％アセトン２Ｌと共に破砕機（製品名；ワーリングブレンダー ７０１１Ｓ型、エフ・エム・アイ社製）中で破砕し、ろ過した。残渣を７０％アセトン３Ｌで抽出してアセトン抽出液を得た後、該残渣をメタノール３Ｌで抽出してメタノール抽出液を得た。前記ろ過で得られたろ液と、前記アセトン抽出液と、前記メタノール抽出液を合わせてロータリーエバポレーターで濃縮後乾燥してエキス（乾燥物）５９．９ｇを得た。
＜操作（２）＞ 得られたエキスを水に懸濁し、エーテルを加え溶媒分配してクロロフィルなどの脂溶性成分を除いた。
＜操作（３）＞ 操作（２）で得られた水層を水で調製したＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（ファルマシア ファイン ケミカル社製、４ｃｍ×２８ｃｍ）に流し込み、水（５００ｍＬ）、４０％メタノール（２００ｍＬ）、６０％メタノール（３００ｍＬ）、８０％メタノール（３００ｍＬ）、メタノール（３００ｍＬ）、６０％アセトン（５００ｍＬ）で順次溶出した。
溶出液を濃縮してフラクションＦｒ．１（１８．６６ｇ）、Ｆｒ．２（５．７９ｇ）、Ｆｒ．３（３．１２ｇ）、Ｆｒ．４（４．８７ｇ）、Ｆｒ．５（６．０１ｇ）、Ｆｒ．６（３．５５ｇ）、Ｆｒ．７（２．０７ｇ）に分画した。
各フラクションについてＡＧＨ阻害活性を測定したところ、下記表４に示すように、Ｆｒ．６及び７が非常に高い阻害率を示した。
【００４４】
【表４】
【００４５】
そこで、Ｆｒ．６及び７について、さらに図２に示す操作で分離精製を行った。
＜操作（４）＞ Ｆｒ．６およびＦｒ．７それぞれについて、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ（三菱化学社製、３ｃｍ×２８ｃｍ）に付して、２０％メタノール（1００ｍＬ）、３０％メタノール（1００ｍＬ）、４０％メタノール（1００ｍＬ）、５０％メタノール（1００ｍＬ）、６０％メタノール（1００ｍＬ）、７０％メタノール（1００ｍＬ）、８０％メタノール（1００ｍＬ）、９０％メタノール（１００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．６からＦｒ．６−１（８９９ｍｇ）、Ｆｒ．６−２（２．１６ｇ）、Ｆｒ．６−３（２８２ｍｇ）の画分を得た。また、Ｆｒ．７からＦｒ．７−１（６７ｍｇ）、Ｆｒ．７−２（１．１７ｇ）、Ｆｒ．７−３（６００ｍｇ）の画分を得た。
このうちＦｒ．６−１とＦｒ．７−１は水素核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルを測定し、標品のスペクトルと比較することにより、それぞれテアシネンシンＡおよびテアシネンシンＤと同定した。Ｆｒ．６−３とＦｒ．７−３はいずれもＨＰＬＣと薄層クロマトグラフィーの結果からテアフラビン類であると同定した。
【００４６】
＜操作（５）＞ Ｆｒ．６−２とＦｒ．７−２を合わせたものをＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ（富士シリシア社製、３ｃｍ×３０ｃｍ）に付して、１０％メタノール（1００ｍＬ）、２０％メタノール（1００ｍＬ）、３０％メタノール（1００ｍＬ）、４０％メタノール（1００ｍＬ）、５０％メタノール（1００ｍＬ）、６０％メタノール（1００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．７２１（１７９ｍｇ）、Ｆｒ．７２２（１．１０ｇ）、Ｆｒ．７２３（５３０ｍｇ）、Ｆｒ．７２４（１．２７ｇ）に分画した。
このうちＦｒ．７２１は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、ＥＧＣｇとテアシネンシンＡの混合物であると同定した。
【００４７】
＜操作（６）＞ Ｆｒ．７２２と７２３を合わせたものをＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（３ｃｍ×２０ｃｍ）に流し込み、エタノール（５００ｍＬ）、９０％エタノール（２００ｍＬ）、２０％メタノール（３００ｍＬ）、６０％アセトン（４００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．７２２１（３．７ｍｇ）、Ｆｒ．７２２２（４１．３ｍｇ）、Ｆｒ．７２２３（４７．０ｍｇ）、Ｆｒ．７２２４（１６６．２ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５（４５８ｍｇ）、Ｆｒ．７２２６（６５７．５ｍｇ）に分画した。
このうちＦｒ．７２２１、Ｆｒ．７２２２、Ｆｒ．７２２３とＦｒ．７２２４は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、標品のスペクトルと比較することにより、それぞれ没食子酸、ＥＣｇ、ＥＧＣｇ、エピガロカテキン−３，３’（４’）−Ｏ−ガレートと同定した。
【００４８】
＜操作（７）＞ Ｆｒ．７２２５をＤｉａｉｏｎＨＰ２０ＳＳ（三菱化学社製、２ｃｍ×２０ｃｍ）に付して、２０％メタノール（1００ｍＬ）、２５％メタノール（1００ｍＬ）、３０％メタノール（1００ｍＬ）、３５％メタノール（1００ｍＬ）、４０％メタノール（1００ｍＬ）、４５％メタノール（1００ｍＬ）、５０％メタノール（1００ｍＬ）、６０％メタノール（１００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．７２２５１（３９．６ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５２（３２０ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５３（４７．７ｍｇ）に分画した。
このうちＦｒ．７２２５１は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、標品のスペクトルと比較することにより、ウーロンテアニンと同定した。
【００４９】
＜操作（８）＞Ｆｒ．７２２５２をＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ（富士シリシア社製、２ｃｍ×２０ｃｍ）に比して、１０％メタノール（1００ｍＬ）、２０％メタノール（1００ｍＬ）、３０％メタノール（1００ｍＬ）、４０％メタノール（1００ｍＬ）、５０％メタノール（1００ｍＬ）、６０％メタノール（1００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．７２２５２１（１０．５ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５２２（３８．３ｇ）、Ｆｒ．７２２５２３（６０ｍｇ）に分画した。
このうちＦｒ．７２２５２１は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、エピガロカテキン−３，３’（４’）−Ｏ−ガレートと同定した。
【００５０】
＜操作（９）＞ Ｆｒ．７２２５２３をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラム（１．５ｃｍ×２０ｃｍ）に流し込み、８０％メタノール（２００ｍＬ）、９０％メタノール（２００ｍＬ）、メタノール（２００ｍＬ）、６０％アセトン（２００ｍＬ）で順次溶出した。
得られた溶出液を濃縮してＦｒ．７２２５２３１（１４．４ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５２３２（１６．１ｍｇ）、Ｆｒ．７２２５２３３（１５．５ｍｇ）に分画した。
このうちＦｒ．７２２５２３２は１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、標品のスペクトルと比較することにより、ガロイル ウーロンテアニンと同定した。
【００５１】
これらの結果より、ＡＧＨ阻害活性が高いＦｒ．６及び７の下記の画分にはそれぞれ下記化合物が含まれていることが判明した。下記化合物の構造を図３に示す。
Ｆｒ．６−１：テアシネンシンＡ（ＴＳ−Ａ）、
Ｆｒ．６−３、７−３：テアフラビン（ＴＦ）混合物（テアフラビン、テアフラビン−３−Ｏ−ガレート、テアフラビン−３’−Ｏ−ガレート、テアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレートを含む）、
Ｆｒ．７−１：テアシネンシンＤ （ＴＳ−Ｄ）、
Ｆｒ．７２２１：没食子酸、
Ｆｒ．７２２２：エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＣｇ）、
Ｆｒ．７２２３：エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣｇ）、
Ｆｒ．７２２４およびＦｒ．７２２５２１：エピガロカテキン（ＥＧＣ）−３，３’（４’）−ジ−Ｏ−ガレート、
Ｆｒ．７２２５１：ウーロンテアニン、
Ｆｒ．７２２５２３２：ガロイルウーロンテアニン。
【００５２】
また上記各化合物の含有量を定量した結果を図２中に示している。この結果より、ＡＧＨ阻害活性が高いＦｒ．６の主成分はテアシネンシンＡであることが判明した。またＡＧＨ阻害活性が高いＦｒ．７の主成分はテアフラビン（ＴＦ）混合物であることが判明した。該テアフラビン混合物に含まれる上記テアフラビン類について、それぞれＡＧＨ阻害活性を測定したところ、特にテアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレートが強い酵素阻害活性を示した。このことは後述の分析試験例５、６の結果からもわかる。
【００５３】
［分析試験例３］
上記分析試験例２において非常に高いＡＧＨ阻害活性を示したＦｒ．７について、ＨＰＬＣ分析を行った結果を図４Ａに示す。分析条件は、
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８ ＡＲＩＩ（ナカライテスク社製、４．６×２５０ｍｍ）、
カラム温度：３５℃、
移動相：Ａ；５０ｍＭリン酸、Ｂ；ＣＨ３ＣＮ、Ｂ ４％から３０％（３９分間）、３０％から７５％（１５分間）、
流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、
検出：フォトダイオードアレイ検出（Ｍａｘ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）とした。
（なお、以下の分析試験例におけるＨＰＬＣ分析条件は、特に断りがない限り、本試験例と同様である。）
この図の結果より、Ｆｒ．７には上記分析試験例２で存在が判明したテアフラビン混合物および上記化合物のほかに、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析では原点として検出され、ＨＰＬＣ分析ではベースラインの盛り上がりとして検出される物質がかなり多く含まれていることが明らかになった。かかる物質は主に図２中のＦｒ．７２４に分画されていた。
かかる物質は、各種カラムクロマトでの挙動および紫外可視吸収スペクトルがＥＧＣｇのものと類似していること、塩化第二鉄試薬及びバニリン塩酸試薬に対して陽性であることから、上記分析試験例２で存在が判明したカテキン類よりも分子量の大きいカテキン酸化生成物と推測される。
通常、茶に含まれる高分子ポリフェノールの典型的なものにプロアントシアニジンがあり、ビワ葉にはエピカテキンを構成ユニットとするプロアントシアニジン（ビワプロアントシアニジン）が含まれることが知られていることから、前記Ｆｒ．７における「分子量の大きいカテキン酸化生成物」にはプロアントシアニジンが含まれていると推測される。
【００５４】
プロアントシアニジンは、カテキンまたはカテキン誘導体を構成ユニットとする二量体または重合体であり、これを構成するカテキンまたはカテキン誘導体は、４位の炭素（Ｃ−４）と８位の炭素（Ｃ−８）、あるいは４位の炭素（Ｃ−４）と６位の炭素（Ｃ−６）とが炭素−炭素結合されている。
そこで、前記Ｆｒ．７に含まれているプロアントシアニジンの構成ユニットを明らかにする目的で、Ｆｒ．７に対して、下記の方法でメルカプトエタノールによるチオール分解を行った。
すなわち、Ｆｒ．７の６０％エタノール溶液（Ｆｒ．７の濃度；１０ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬに、メルカプトエタノール試液（メルカプトエタノール２．５ｍＬ、０．１％塩酸４ｍＬ，エタノール２７．５ｍＬ、水１６ｍＬを混合したもの）１．８ｍＬを加えて６０℃で６時間加熱し、反応液２０μＬをＨＰＬＣで分析した。分析条件は図４Ａを得たときと同じとした。こうして得られたチオール分解後のクロマトグラムを図４Ｂに示す。
【００５５】
この図４Ｂに示されるように、Ｆｒ．７をチオール分解すると分解前（図４Ａ）には認められないピークが多数出現している。分解前には認められなかったピークおよび分解前よりも増大したピークについて、標品（Ｔａｎａｋａ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．ＣＨｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １，１９９４，３０１３）の保持時間及び紫外吸収スペクトルとの比較を行った結果、ＥＧＣ、ＥＣ、ＥＧＣｇ、ＥＣｇ、ＥＧＣ−ＭＥ、ＥＣ−ＭＥ、ＥＧＣｇ−ＭＥ、ＥＣｇ−ＭＥが同定された。
【００５６】
また、図４Ｂにおいて、３９分に検出されるピークは、Fｒ．７（５００ｍｇ）をメルカプトエタノール試液１０ｍＬに溶解し、６時間加熱後、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ（富士シリシア社製）（水−メタノール溶離液）カラムクロマト、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＥｔＯＨ溶離液）カラムクロマトで分離して精製したところ、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥであることが１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの解析結果より明らかになった。エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥの構造式を図５に示す。
すなわち、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、Ａ環、Ｃ環、ガロイル基及びヒドロキシエチルチオ基のシグナルはＥＧＣｇ−ＭＥのものとほとんど同じであるが、Ｂ環のシグナルがｄ７．４０及び６．８１にいずれも２Ｈ分の二重線（Ｊ＝８Ｈｚ）として観察され、これはＢ環がｐ−ヒドロキシフェノールであることを示していた。また、ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析ではｍ／ｚ ５０３に［Ｍ＋Ｈ］＋ピークを示したこともこのことを支持していた。
【００５７】
これら同定された構成ユニットのうち、ＥＧＣ、ＥＧＣｇ、ＥＣｇは高分子化合物の末端ユニットに由来し、チオエーテル化合物は延長ユニットに由来する。したがって、チオール分解される前の高分子化合物の構造、すなわち前記Ｆｒ．７に含まれるプロアントシアニジンの構造は、例えば図５に示すような構造を有すると推測される。
【００５８】
これまで、エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとするプロアントシアニジンは烏龍茶から得られる二量体が１種知られているのみである（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，１９８９，３７，３２５５−３２６３）。通常、二量体はＨＰＬＣで明確なピークとして検出されるが、Ｆｒ．７のＨＰＬＣでは、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥの生成量を説明できるほどの二量体に相当するピークは認められないことから、Ｆｒ．７のチオール分解により生成したエピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥは、三量体以上のプロアントシアニジンオリゴマーまたはポリマー由来であるといえる。かかる「エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとするプロアントシアニジン（三量体以上のオリゴマーまたはポリマー）」は、これまで知られていない新規な化合物である。
【００５９】
なお、ビワ葉を加えず、茶の葉のみを用いたほかは同様にして製造した発酵茶葉について、同様の分析試験を行い、チオール分解後に得られたチオエーテル化合物を比較したところ、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥのピークは、ビワ葉を混合した場合も、混合しない場合もほぼ同じ大きさで検出された。また、ビワ葉から抽出したプロアントシアニジンをチオール分解しても、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥは検出されなかった。このことから、Ｆｒ．７に含まれる「エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとするプロアントシアニジン」は茶の葉由来であることがわかる。
また、ＥＣ−ＭＥのピークは、ビワ葉を混合しない場合よりも、混合した場合の方が明らかに大きかった。このことから、ビワ葉に含まれる「エピカテキンを構成ユニットとするプロアントシアニジン（ビワプロアントシアニジン）」は、ＡＧＨ阻害性が高いＦｒ．７に含まれていることがわかる。
【００６０】
［分析試験例４］
図４Ｂに示されるように、ＡＧＨ阻害性が高いＦｒ．７をチオール分解した後も、ベースラインの盛り上がりは残っている。
このことは、Ｆｒ．７には、上記分析試験例３で述べた「エピアフゼレチンガレートを構成ユニットとするプロアントシアニジン」および「ビワプロアントシアニジン」のほかに、ＨＰＬＣ分析においてベースラインの盛り上がりとして検出される物質が存在することを示している。
そこで、ＨＰＬＣ分析においてベースラインの盛り上がりとして検出される物質が、茶の葉とビワ葉を混合した場合の混合発酵茶葉と、ビワ葉を混合しないほかは同様にした場合の発酵茶葉（以下、単独発酵茶葉ということがある）とで生成量が異なるかどうか比較した。なお混合発酵茶葉の製造条件は分析試験例１，２と同様であり、茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間である。
【００６１】
混合発酵茶葉及び単独発酵茶葉それぞれについて、茶葉（含水率５質量％）３ｇを７０％アセトン１００ｍＬで室温抽出（抽出時間１８時間）した後ろ過した。ろ液を濃縮して水溶液（２０ｍＬ）とした後、エーテル、酢酸エチルで２回ずつ溶媒分配した。
残った水層を一旦濃縮した後、７０％エタノールで３０ｍＬとし、その１０μＬをＨＰＬＣで分析した。該水層のＨＰＬＣ分析結果を図６に示す。
この図に示されるように、混合発酵茶葉の方が、単独発酵茶葉よりも、明らかにベースラインの盛り上がりとして検出される物質の量が多い。ピークの面積を比較すると、混合発酵茶葉においてベースラインの盛り上がりとして検出される物質の量は、単独発酵茶葉の１５９％と見積もられる。この増加分にはビワ葉由来のプロアントシアニジンも含まれるが、混合発酵茶葉におけるビワ葉の添加量は茶の葉の１０分の１量にすぎないため、元々ビワ葉に含まれていた成分だけで５９％の増加は説明できない。したがって、この増加分は、ビワ葉を添加したことにより生成が促進され、ビワ葉を添加しないと生成されないカテキン酸化生成物の存在を示している。
【００６２】
一方、上記で得られた酢酸エチル層を濃縮後、８０％メタノールで３０ｍＬとした後、その１ｍＬをＯＤＳショートカラム（ＴＯＹＯＰＡＫ ＯＤＳ Ｍ、ＴＯＳＯ、東ソー社製）に８０％メタノールで通導し、溶出液を５．０ｍＬとして、その５μＬをＨＰＬＣで分析した。該酢酸エチル層のＨＰＬＣ分析結果を図７に示す。
この図に示されるように、混合発酵茶葉では単独発酵茶葉に比べてテアフラビン類のピーク面積が合わせて２．７倍に増加している。一方、カテキン類のピーク面積は減少しており、具体的にはＥＧＣは０．２４倍、ＥＣは０．４４倍、ＥＧＣｇは０．５７倍、ＥＣｇは０．６４倍にそれぞれ減少している。
このことは、混合発酵茶葉においては、茶葉にビワ葉を添加し揉み込むことで高分子のカテキン酸化生成物が多量に生成されることを示している。
【００６３】
［分析試験例５］
分析試験例４の結果より、混合発酵茶葉においては、茶葉にビワ葉を添加し揉み込むことで高分子のカテキン酸化生成物が多量に生成され、それはＨＰＬＣ分析ではベースラインの盛り上がりとして検出されること、すなわち薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析では原点として検出されることがわかった。
そこで、かかる混合発酵茶葉において特異的に増加する成分を特定することを目的として、以下の方法により、混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）に含まれる成分のうち、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析において原点として検出される酸化型高分子ポリフェノールを分離した。
すなわち、混合発酵茶葉（含水率５質量％）２２８ｇを６０％エタノール３Ｌで３回室温抽出し、３回の抽出液を合わせて減圧濃縮した。得られた水溶液（１．５Ｌ）をエチルエーテル、酢酸エチル、ｎ−ブタノールで順次溶媒分配して、エチルエーテル可溶部（４．０３ｇ）、酢酸エチル可溶部（９．８ｇ）、ｎ−ブタノール可溶部（２２．１ｇ）を得た。
ｎ−ブタノール可溶部１５ｇを６０％メタノールに溶かし、６０％メタノールでコンディショニングしたＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムにかけ、６０％メタノール、８０％メタノール、１００％メタノール、次いでメタノール−水―アセトン（８：１：１）混合溶液、メタノール−水―アセトン（６：２：２）混合溶液、水―アセトン（１：１）混合溶液で順次溶出した。溶出液をＴＬＣ（トルエン−ギ酸エチル−ギ酸、１：７：１）分析して、原点から移動しない物質を含むフラクションだけを集め濃縮して、ポリマー様物質（酸化型高分子ポリフェノール画分）１．４ｇを得た。そのＨＰＬＣ分析結果を図８Ａに示す。
【００６４】
図８Ａにおいて、４５分付近の小さいピークはそのＵＶ吸収からテアフラビン類の混在を示しているが、そのピーク面積はベースライン盛り上がり全体の２％以下であった。
こうして得られたポリマー様物質（酸化型高分子ポリフェノール画分）についてＡＧＨ阻害性を測定した。その結果を表５に示す。
またテアフラビン−３，３’−ジ−Ｏ−ガレートについてのＡＧＨ阻害性の測定結果も合わせて表５に示す。
【００６５】
【表５】
【００６６】
表５に示されるように、混合発酵茶葉から上記の方法で分離した酸化型高分子ポリフェノール画分、すなわち混合発酵茶葉において特異的に増加する高分子ポリフェノールは、テアフラビン−３，３’−Ｏ−ジガレートと同等の強いマルターゼ及びスクラーゼ阻害活性を示した。この活性は、含有量から考えて、混入しているテアフラビン類（４５分付近のピーク）によるものではなく、高分子ポリフェノールに由来するものである。
【００６７】
さらに、上記で得られた酸化型高分子ポリフェノール画分に対して、下記の方法でメルカプトエタノールによるチオール分解を行った。
すなわち、上記で得た酸化型高分子ポリフェノールを６０％エタノールに溶解させた溶液（酸化型高分子ポリフェノールの濃度：１０ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬと、メルカプトエタノール試液０．８ｍＬとを混合し、６０℃で５時間反応させ、その５μＬをＨＰＬＣで分析した。その結果を図８Ｂに示す。
前記分析試験例３においてＦｒ．７をチオール分解したものをＨＰＬＣ分析したときと同様に、エピアフゼレチン−３−Ｏ−ガレート−ＭＥを初めとするチオエーテル化合物及びカテキン類のピークが検出された。また図８Ｂにはチオール分解後にもベースラインの盛り上がりが観察された。
このことから、上記で得られた酸化型高分子ポリフェノール画分には、前述したエピアフゼレチンガレートを構成ユニットとして有するプロアントシアニジンが含まれるが、その含有割合は少なく、チオール分解されない物質がかなり含まれていることが示唆される。
【００６８】
そこで、この酸化型高分子ポリフェノール画分の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定し、それをビワ葉に含まれる「エピカテキンを構成ユニットとするプロアントシアニジン（ビワプロアントシアニジン）」の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルと比較した。その結果を図９に示す。図９Ａはビワプロアントシアニジンのスペクトルであり、図９Ｂは前記酸化型高分子ポリフェノール画分のスペクトルである。
図９の結果より、ビワプロアントシアニジンにはカテコール環型Ｂ環（Ｂｃ）由来のシグナルが観察されるのに対して、混合発酵茶葉から分離された酸化型高分子ポリフェノールにはＢ環由来のシグナルがほとんど観察されず、カテキンのＡ環に対応するフロログルシノール（１，３，５−トリヒドロキシベンゼン）に由来するシグナル、及びガロイル基のピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）に由来するシグナルが観察され、小さいながらＣ環由来のシグナルも一部認められた。
このことから、混合発酵茶葉から上記の方法で分離された酸化型高分子ポリフェノールの主成分はビワプロアントシアニジンではなく、Ｂ環部に様々な構造を持つカテキン誘導体が酸化的に縮合して高分子化した物質であることがわかる。
かかる高分子ポリフェノールの構造は、明確ではないが、図３に示した化合物からの類推により、主にカテキンガレート類のＢ環同士が酸化的に縮合して高分子化したものと考えられる。Ｂ環の結合様式としては図３に示すテアシネンシン、テアフラビン、ウーロンテアニンなど様々なタイプが推測されるが、現在のところ詳細は不明である。
【００６９】
また、この酸化型高分子ポリフェノール画分を元素分析した結果、炭素５７．０６％、水素４．５１％、窒素０．３５％であった。
ＥＧＣｇの計算値（Ｃ２２Ｈ１８Ｏ１１：炭素５７．６５％、水素３．９６％、Ｃ２２Ｈ１８Ｏ１１・２Ｈ２Ｏ：炭素５３．４４％、水素４．４９％）に比べて水素含有率が高く、通常の酸化では水素含有率は減少するはずであるので、カテキン酸化の過程で別の代謝産物が取り込まれている可能性が示唆される。
【００７０】
さらに、得られた酸化型高分子ポリフェノールをアセチル化した後、ゲル浸透クロマトグラフィーにより分子量を測定したところ、ピークトップ分子量は２０００（数平均分子量１４００、質量平均分子量３２００）であり、分子量分布は広く１０００〜１５０００程度であった。
ゲル浸透クロマトグラフィーの測定条件は以下の通りとした。
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ ４０００Ｈ６、直径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、東ソー社製、
ポンプ：ＴＯＳＯ ＤＰ８０２０、東ソー社製、
検出器：ＪＡＳＣＯ ＵＶ９７０日本分光社製、２５４ｎｍ、
移動層：テトラヒドロフラン、
温度：室温、
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ、
標準ポリスチレンとの比較による分子量計算：ＪＡＳＣＯ ８０７ＩＴインテグレータ、日本分光社製。
なお、カテキン類からの類推でアセチル化による分子量増加分を１．５倍とすると、分子量は１３３０を極大とする６７０〜１０，０００となる。カテキンガレート類だけから生成したものと仮定すると、二量体に相当するもの（テアフラビン）から２０量体に相当するものまで含まれることになる。
【００７１】
［分析試験例６］
ＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＧＣｇ、テアフラビン（ＴＦ）、３−ＴＦＧ、３’−ＴＦＧ、３，３’−ＴＦＧＧ、およびテアシネンシンＡ（ＴＳ−Ａ）の純品（市販品）をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）：水＝１：９からなる混合溶媒に溶解させてサンプル溶液を調製し、各サンプル溶液に関してＡＧＨ阻害活性測定を行った。
本試験例および分析試験例７におけるＡＧＨ阻害性の評価は、ラット小腸ＡＧＨを固定化した担体を用いたｐｓｅｕｄｏ−ｉｎ ｖｉｖｏ法（Ｔ．Ｏｋｉ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２３，１０８４−１０８７（２０００））によって行い、酵素活性を５０％阻害する終濃度（ＩＣ５０値、単位：ｍＭ）で表している。その結果を表６に示す。
【００７２】
【表６】
【００７３】
表６の結果より、マルターゼ阻害性が強いのは、ＥＣＧ、ＥＧＣＧ、３−ＴＦＧ、３，３，−ＴＦＧＧであり、スクラーゼ阻害性が強いのは、ＥＣＧ、ＥＧＣＧ、３，３，−ＴＦＧＧであることが判明した。すなわち、カテキンではエステル型、テアフラビンではガロイル基の多置換ＯＨ基を有する分子構造をもつものがＡＧＨ阻害性がより強いことが明らかとなった。
【００７４】
［分析試験例７］
混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間、含水率５質量％）２０ｇを１００℃の熱水１０００ｍＬで１０分間抽出し、遠心分離して得られる上澄み液を凍結乾燥したものを試料としてＡＧＨ阻害性を調べた。
試料をＤＭＳＯ：水＝１：９の混合溶媒に溶解させてサンプル溶液を調製し、このサンプル溶液に関して上記ｐｓｅｕｄｏ−ｉｎ ｖｉｖｏ法によりＡＧＨ阻害性を測定した。またこのサンプル溶液に含まれるカテキン類（ＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＧＣｇ）およびテアフラビン類（ＴＦ、３−ＴＦＧ、３’−ＴＦＧ、３，３’−ＴＦＧＧ）の含有量を測定した。そして前記分析試験例６で測定したＩＣ５０値に基づいて、混合発酵茶葉によって奏されるＡＧＨ阻害性を１００％としたときの、各成分によって奏されるＡＧＨ阻害性の割合（活性寄与率、単位：％）を求めた。マルターゼ阻害性の結果を表７に示し、スクラーゼ阻害性の結果を表８に示す。
【００７５】
【表７】
【００７６】
【表８】
【００７７】
［分析試験例８］
分析試験例７と同じ混合発酵茶葉２０ｇを１００℃の熱水１Ｌで１０分間抽出した。抽出液をろ過して得られたろ液をエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥した。乾燥後の粉末１０ｍｇに水１ｍｌを添加し、撹拌後、遠心処理（３０００ｒｐｍ、１０分間）を行って上清、すなわち水溶性画分を得た。この水溶性画分のＡＧＨ阻害性を測定した。その結果を下記表９に示す。
なお本分析試験例におけるＡＧＨ阻害性の測定は前記遊離ＡＧＨを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ法（Ｏｋｉ．Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，４７，５５０−５５３（１９９９））により行った。
【００７８】
【表９】
【００７９】
表９の結果より、混合発酵茶葉の熱水抽出物の水溶性画分が、高いＡＧＨ阻害性を示すことがわかる。
そこで、この高いＡＧＨ阻害性を示す熱水抽出物の水溶性画分に対して、下記の方法でさらに成分分離操作を行った。
すなわち、該熱水抽出物の水溶性画分を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用いた吸着クロマトグラフィーに供した。溶出は水、５０％メタノール、１００％メタノール、７０％アセトンの順に行い、それぞれで得られた画分を凍結乾燥したものについて、上記と同様にしてＡＧＨ阻害性測定を行った。各画分の収率及びＡＧＨ阻害性を下記表１０に示す。なお表１０には表９の測定結果も合わせて示す。
【００８０】
【表１０】
【００８１】
表１０に示されるように、混合発酵茶葉熱水抽出物の水溶性画分のうち、特に７０％アセトン溶出画分及び１００％メタノール溶出画分のＡＧＨ阻害性が高かった。
そこで、この７０％アセトン溶出画分及び１００％メタノール溶出画分について、ゲル浸透クロマトグラフィーにより分子量を測定したところ、これらＡＧＨ阻害性が特に高い両画分に含まれる成分は分子量１００〜１５００の範囲にあることが判明した。
ここでのゲル浸透クロマトグラフィーの測定条件は以下の通りである。
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ２５００ ＰＷＸＬ、直径７．８ｍｍ×長さ２５０ｍｍ、
ポンプ：島津製作所製、ＬＣ−１０Ａｖｐ、
検出器：ＳＰＤ−１０ＡＶ、２５４ｎｍ、
移動層：０．１Ｍ、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む）、
温度：室温、
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ、
標準ポリエチレングリコールとの比較による分子量計算。
【００８２】
［分析試験例９］
上記分析試験例８と同様に、分析試験例７と同じ混合発酵茶葉２０ｇを１００℃の熱水１Ｌで１０分間抽出し、得られた抽出液をろ過してろ液を得た。このろ液を、吸着剤Ｐｏｒａｐａｃｋ Ｑ（製品名、Ｗａｔｅｒｓ社製）を充填したカラムに供した。そして、水１００ｍｌ、続いて５０％メタノール１００ｍｌでカラム中の水溶性成分を溶出させた。こうして得られた水溶出画分、および５０％メタノール溶出画分をそれぞれ濃縮し乾燥させた後、ＡＧＨ阻害活性を測定した。その結果を下記表１１に示す。
本分析試験例におけるＡＧＨ阻害性の測定は上記松井らによる遊離ＡＧＨを用いた方法によって行い、阻害率（単位：％）の値で表す。
【００８３】
【表１１】
【００８４】
表１１に示されるように、混合発酵茶葉熱水抽出物の水溶出画分および５０％メタノール溶出画分のいずれも高いＡＧＨ阻害性を示した。
さらに、該水溶出画分および５０％メタノール溶出画分について、上記分析試験例８と同様の条件で、ゲル浸透クロマトグラフィーにより分子量を測定したところ、これらＡＧＨ阻害性が特に高い両画分に含まれる成分は分子量１００〜１９００の範囲にあることが判明した。
分析試験例８、９の結果より、混合発酵茶葉の熱水抽出物の水溶性画分が高いＡＧＨ阻害性を示すこと、およびこのＡＧＨ阻害性に大きく寄与する成分の分子量は、１００〜１９００程度の比較的低分子量であることがわかった。
【００８５】
［実験例２］
正常ラットに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を摂取させて、耐糖能に及ぼす影響を調べた。
混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）、番茶、ビワ葉を乾燥させ粉砕したビワ葉、およびビワ葉を混合せず茶の葉だけを２０分間揉捻して得た単独発酵茶葉を試料茶葉として用意した。なお上記番茶は、混合発酵茶葉の原料として使用したのと同じ茶の葉を用い、通常の緑茶の製造法に従って製造した番茶（茶の葉を発酵させずに製造した荒茶）である。
それぞれの試料茶葉（含水率５質量％）２０ｇを１００℃の熱水１，０００ｍｌで１０分間抽出した後、ろ過した。ろ液を凍結乾燥した粉末状の抽出物を得た。
コレステロールを含まないＡＩＮ−７６組成を基本とした食餌に、上記で調製した各熱水抽出物を含有率１質量％となるように添加した飼料（４種）を、それぞれ４週齢雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに自由摂食させた。
また、コントロールとして、食餌に熱水抽出物を添加しないコントロール食を、同様のラットに自由摂取させた。
ラットは、室温２２±１℃、湿度５５±５％、８：００〜２０：００点灯のライトサイクルの動物飼育室で飼育した。４週間後、６時間絶食した後、１ｇ／ｋｇ体重のマルトースを経口投与した。投与後、０、１０、２０、３０および６０分後にそれぞれ尾静脈より採血して、血糖試験測定メディセーフチップ（テルモ社製）を用いて血糖値を測定した。
その結果を図１０に示す。
【００８６】
図１０において、横軸はマルトース投与後の経過時間を示し、縦軸は血糖値の値を示している。なお血糖値の値は、マルトース投与時の血糖値を０ｍｇ／ｄｌとして表している。
この図に示されるように、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取したラットの血糖値は、いずれの試料茶葉よりも低いレベルで推移している。
このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物の摂取により優れた血糖値上昇抑制効果が得られることわかる。またその効果は、ビワ葉のみを乾燥させたビワ葉や、茶の葉のみを発酵させた茶葉で得られる効果よりも優れており、茶の葉とビワ葉を混合、揉捻、発酵させることにより相乗効果が得られることがわかる。
【００８７】
［実験例３］
２型糖尿病を発症するラットに混合発酵茶葉の粉末を摂取させて、血糖値に及ぼす影響を調べた。
混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間、含水率５質量％）、をフードプロセッサを用いて、６０〜１００メッシュの大きさの粉末状態になるまで、粉砕加工して粉末状混合発酵茶葉を得た。
ラットは、１ヶ月齢の２型糖尿病を自然発症する雄性のＯｔｓｕｋａ Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ Ｆａｔｔｙ ラット（以下ＯＬＥＴＦラットという）と、その対象モデル動物で糖尿病を発症しない雄性のＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ Ｔｏｋｕｓｈｉｍａ Ｏｔｓｕｋａ ラット（以下ＬＥＴＯラットという）とを用いた。ラットは、室温２２±１℃、湿度５５±５％、８：００〜２０：００点灯のライトサイクルの動物飼育室で飼育した。
最初の３ヶ月間はＬＥＴＯおよびＯＬＥＴＦラットにＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母工業（株）製）を与えて予備飼育を行った。ＯＬＥＴＦラットは通常５ヶ月齢から８ヶ月齢までに２型糖尿病を発症することから、発症の可能性のある１ヶ月前の４ヶ月齢からＬＥＴＯラットと共に試験食の摂食を開始した。
すなわち、４ヶ月齢の時に６時間絶食（９：００〜１５：００）後、尾静脈より採血して血糖値を測定し、体重と血糖値が等しくなるように１群６匹ずつ群分けし、以下の試験食を５ヶ月間自由摂食させた。
試験食は、ＡＩＮ−７６に基づいた純化食をコントロール食とし、ＬＥＴＯラット−コントロール群とＯＬＥＴＦラット−コントロール群に摂食させた。コントロール食の組成（ｇ／ｋｇ）は、カゼイン２００、サラダ油１００、ミネラル混合（ＡＩＮ−７６−ＭＸ）３５、ビタミン混合（ＡＩＮ−７６−ＶＸ）１０、セルロース５０、重酒石酸コリン２、ＤＬ−メチオニン３、コーンスターチ１５０およびショ糖４５０とした。
ＯＬＥＴＦラット−混合発酵茶葉添加群には、上記コントロール食に粉末状混合発酵茶葉を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
いずれの群も、飼育期間中、摂食量は毎日、体重および摂水量は１日おきに測定した。
【００８８】
試験食投与開始から１、２、３、４および５ヶ月後に、血糖試験測定メディセーフチップ（テルモ社製）を用い、６時間絶食後尾静脈より採血して血糖値を測定した。試験食を摂取した５ヶ月間のラット血糖値の変化を図１１に示す。
図１１において、横軸は試験食投与開始からの経過時間（単位：月）を示し、縦軸は血糖値の値を示している。
この図に示されるように、コントロール食を摂取した糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットの血糖値は、飼育期間を通じて低値であった。一方、コントロール食を摂取した糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットの血糖値は、経時的に上昇し、糖尿病を発症したとみなされた。
これに対して、２型糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットに混合発酵茶葉の粉末を添加した飼料を摂取させた群では、時間が長期間経過しても血糖値は上昇せず糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットと同程度の低レベルであった。このことから混合発酵茶葉の粉末は優れた血糖上昇抑制効果を有することが明らかとなった。
【００８９】
［実験例４］
２型糖尿病を発症するラットに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を摂取させて、血糖値に及ぼす影響を調べた。
混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間、含水率５質量％）２０ｇを１００℃の熱水１０００ｍＬで１０分間抽出し、ろ過して得られるろ液を凍結乾燥して粉末状の混合発酵茶葉抽出物を得た。
比較例として、通常の緑茶の製造法に従って製造した番茶（茶の葉を発酵させずに製造した荒茶）を同様の条件で抽出、ろ過、乾燥して粉末状の番茶抽出物を得た。また同じ含水率となるように乾燥させたビワ葉を同様の条件で抽出、ろ過、乾燥して粉末状のビワ葉抽出物を得た。
ラットは上記実験例３と同条件のものを用い、４ヶ月齢までの飼育条件も同じとした。
４ヶ月齢の時に６時間絶食（９：００〜１５：００）後、尾静脈より採血して血糖値を測定し、体重と血糖値が等しくなるように１群６匹ずつに群分けし、以下の試験食を５ヶ月間自由摂食させた。
ＬＥＴＯラットとＯＬＥＴＦラットのコントロール食群には、実験例３と同じコントロール食を摂食させた。
ＯＬＥＴＦラット−混合発酵茶葉添加群には、上記コントロール食に粉末状の混合発酵茶葉抽出物を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
ＯＬＥＴＦラット−番茶添加群には、上記コントロール食に粉末状の番茶抽出物を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
ＯＬＥＴＦラット−ビワ葉添加群には、上記コントロール食に粉末状のビワ葉抽出物を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
飼育期間中、摂食量は毎日、体重および摂水量は１日おきに測定した。
【００９０】
試験食投与開始から１、２、３、４および５ヶ月後に、実験例３と同様にして血糖値を測定した。試験食を摂取した５ヶ月間のラット血糖値の変化を図１２に示す。
図１２における縦軸と横軸は図１１と同様である。この図に示されるように、コントロール食を摂取した糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットの血糖値は、飼育期間を通じて低値であった。一方、コントロール食を摂取した糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットの血糖値は、経時的に上昇し、糖尿病を発症したとみなされた。
これに対して、２型糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を添加した飼料を摂取させた群では、時間が長期間経過しても血糖値は上昇せず糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットと同程度の低レベルであった。このことから混合発酵茶葉の熱水抽出物は優れた血糖上昇抑制効果を有することが明らかとなった。
【００９１】
［実験例５］
２型糖尿病を発症するラットに混合発酵茶葉の粉末を摂取させたときの他の効果を調べた。
上記実験例３と同様にして粉末状混合発酵茶葉を製造した。
比較例として、混合発酵茶葉の原料として使用したのと同じ茶の葉を用い製造した番茶（茶の葉を発酵させずに製造した荒茶）を製造し、同様に粉砕加工して粉末状番茶を得た。また同じ含水率となるように乾燥させたビワ葉を粉砕加工処理して粉末状ビワ葉を得た。
ラットは上記実験例３と同条件のものを用い、４ヶ月齢までの飼育条件も同じとした。
４ヶ月齢の時に６時間絶食（９：００〜１５：００）後、尾静脈より採血して血糖値を測定し、体重と血糖値が等しくなるように１群６匹ずつに群分けし、以下の試験食を５ヶ月間自由摂食させた。
ＬＥＴＯラットとＯＬＥＴＦラットのコントロール食群には、実験例３と同じコントロール食を摂食させた。
ＯＬＥＴＦラット−混合発酵茶葉添加群には、上記コントロール食に粉末状混合発酵茶葉を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
ＯＬＥＴＦラット−番茶添加群には、上記コントロール食に粉末状番茶を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
ＯＬＥＴＦラット−ビワ葉添加群には、上記コントロール食に粉末状ビワ葉を飼料総質量の５％添加し、その添加量分のショ糖量を減じた。
飼育期間中、摂食量は毎日、体重および摂水量は１日おきに測定した。
【００９２】
試験食投与開始５ヶ月後に、６時間絶食後、屠殺して血清、肝臓、および腎臓と睾丸周辺の脂肪組織を採取した。
下記表に血清インスリン濃度、血清過酸化脂質濃度、脂肪組織質量、血清コレステロール、血清トリグリセリド、肝臓コレステロール、肝臓トリグリセリドの測定結果をそれぞれ示す。
【００９３】
【表１２】
【００９４】
表１２の結果より、ＯＬＥＴＦラットにコントロール食またはビワ葉を摂取させた群はインスリンの低下が見られた。なおこれらの群は血糖値測定により糖尿病を発症した状態にあることがわかった。これに対して、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、粉末状混合発酵茶葉を摂取させた群は、インスリン濃度が糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットのレベルまで上昇していた。このことから混合発酵茶葉には糖尿病発症によるインスリン分泌低下を改善する効果があることが認められた。
【００９５】
【表１３】
【００９６】
表１３の結果より、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、粉末状混合発酵茶葉を摂取させた群は、血清過酸化脂質濃度が他のＯＬＥＴＦラット群に比べて低かった。このことから混合発酵茶葉には血清過酸化脂質濃度を低減させる効果があることが認められた。
【００９７】
【表１４】
【００９８】
表１４の結果より、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、粉末状混合発酵茶葉を摂取させた群は、コントロール食を摂取したＯＬＥＴＦラット群より、腎臓と睾丸周辺の脂肪組織質量が有意に低かった。このことから混合発酵茶葉には体脂肪蓄積抑制効果があることが認められた。
【００９９】
【表１５】
【０１００】
表１５の結果より、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、粉末状混合発酵茶葉を摂取させた群は、コントロール食を摂取したＯＬＥＴＦラット群より、血清および肝臓のコレステロール濃度および中性脂肪濃度が低下していた。このことから混合発酵茶葉にはコレステロール低減効果および中性脂肪低減効果があることが認められた。
【０１０１】
［実験例６］
２型糖尿病を発症するラットに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を摂取させたときの他の効果を調べた。
上記実験例４と同様にして、ＬＥＴＯラットおよびＯＬＥＴＦラットに試験食を５ヶ月間自由摂食させた。
試験食投与開始５ヶ月後に、６時間絶食後、屠殺して血清、肝臓、および腎臓と睾丸周辺の脂肪組織を採取した。
下記表に血清インスリン濃度、脂肪組織質量、血清トリグリセリド、肝臓トリグリセリドの測定結果をそれぞれ示す。
【０１０２】
【表１６】
【０１０３】
表１６の結果より、ＯＬＥＴＦラットにコントロール食、番茶抽出物、またはビワ葉抽出物を摂取させた群はインスリンの低下が見られた。なおこれらの群は血糖値測定により糖尿病を発症した状態にあることがわかった。これに対して、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、混合発酵茶葉抽出物を摂取させた群は、インスリン濃度が糖尿病を発症しないＬＥＴＯラットのレベルまで上昇していた。このことから混合発酵茶葉の熱水抽出物には糖尿病発症によるインスリン分泌低下を改善する効果があることが認められた。
【０１０４】
【表１７】
【０１０５】
表１７の結果より、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、混合発酵茶葉抽出物を摂取させた群は、コントロール食を摂取したＯＬＥＴＦラット群より、腎臓と睾丸周辺の脂肪組織質量が低かった。このことから混合発酵茶葉の熱水抽出物には体脂肪蓄積抑制効果があることが認められた。
【０１０６】
【表１８】
【０１０７】
表１８の結果より、糖尿病を発症するＯＬＥＴＦラットであっても、混合発酵茶葉抽出物を摂取させた群は、コントロール食を摂取したＯＬＥＴＦラット群より、血清および肝臓中性脂肪濃度が低下していた。このことから混合発酵茶葉の熱水抽出物には中性脂肪低減効果があることが認められた。
【０１０８】
［実験例７］
正常ラットに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を摂取させたときの他の効果を調べた。
すなわち、上記実験例２と同じ試料茶葉（番茶、単独発酵茶葉、ビワ茶、混合発酵茶葉）の熱水抽出物を凍結乾燥させたものをそれぞれ添加した４種の飼料、およびコントロール食を、実験例２と同じ条件で４週齢雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに自由摂食させて飼育した。
４週間後、６時間絶食した後屠殺して、血清、肝臓および脂肪組織を採取した。
下記表に血清過酸化脂質濃度、脂肪組織質量、血清中性脂肪（トリグリセリド）、肝臓中性脂肪（トリグリセリド）の測定結果をそれぞれ示す。
【０１０９】
【表１９】
【０１１０】
表１９の結果より、正常ラットにおいても、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取することにより、コントロール食を摂取した場合に比べて血清過酸化脂質濃度が低下した。このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物は、正常な健康状態においても、血清過酸化脂質低減効果を奏することが認められた。
【０１１１】
【表２０】
【０１１２】
表２０の結果より、正常ラットにおいても、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取することにより、コントロール食を摂取した場合に比べて脂肪組織質量が低かった。このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物は、正常な健康状態においても、体脂肪蓄積抑制効果を奏することが認められた。
【０１１３】
【表２１】
【０１１４】
表２１の結果より、正常ラットにおいても、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取することにより、コントロール食を摂取した場合に比べて血清および肝臓中性脂肪濃度が低かった。このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物は、正常な健康状態においても、中性脂肪低減効果を奏することが認められた。
【０１１５】
［実験例８］
混合発酵茶葉の熱水抽出物摂取による１型糖尿病に及ぼす影響を調べた。
すなわち、上記実験例２と同じ混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）を、コレステロールを含まないＡＩＮ−７６組成を基本とした食餌に１質量％添加して４週齢雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットに自由摂食させた。比較例として、同じ食餌に混合発酵茶葉抽出物を添加しないコントロール食をＳＤラットに与えた。飼育条件は実験例２と同じ条件とした。
摂食開始日および摂食開始１４日後に、６時間絶食した後、尾静脈より採血して、血糖試験測定メディセーフチップ（テルモ社製）を用いて血糖値を測定した。
また摂食開始１４日後の上記採血後、さらに絶食を続けて９時間後（絶食合計時間：１５時間）、３０ｍｇ／ｋｇ体重のストレプトゾシン（ＳＴＺ）を投与した。このＳＴＺは膵臓ランゲルハンス島β細胞を破壊して、インスリン分泌傷害を引き起こして１型糖尿病を発症させる作用を有する薬剤である。ＳＴＺ投与後、再び食餌を自由摂食させた。
再摂食開始から７日後と１４日後（最初の摂食開始から３週間後と４週間後）に、６時間絶食した後、尾静脈より採血して、血糖試験測定メディセーフチップ（テルモ社製）を用いて血糖値を測定した。
また再摂食開始から２週間後（最初の摂食開始から４週間後）、６時間絶食後（上記採血後）屠殺して、血清および膵臓ランゲルハンス島を採取した。取り出した膵臓ランゲルハンス島にグルコース刺激を与えて、インスリンの分泌を測定した。
摂食開始後の血糖値の変化を図１３に示す。また下記表にインスリン分泌の測定結果、および血清コレステロール濃度と血清中性脂肪濃度の測定結果を示す。
【０１１６】
図１３において、横軸は経過時間を示し、縦軸は血糖値の値を示している。なお血糖値の値は、摂食開始日の血糖値を１００ｍｇ／ｄＬとして表している。
この図に示されるように、コントロール食を摂取したラットの血糖値は、ＳＴＺを投与した１４日以降経時的に上昇し、１型糖尿病を発症したとみなされた。これに対して、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取したラットは、１４日以降の血糖値の上昇が小さく抑えられた。
【０１１７】
【表２２】
【０１１８】
表２２の結果より、摂食開始から４週間後（ＳＴＺ投与から２週間後）の膵臓ランゲルハンス島からのグルコース刺激によるインスリン分泌は、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取したラットでコントロール食を摂取したラットより高かった。このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物は、膵臓ランゲルハンス島を保護することでインスリン分泌機能を維持することが明らかとなり、混合発酵茶葉の熱水抽出物が１型糖尿病予防に有効であることが示唆された。
【０１１９】
【表２３】
【０１２０】
表２３の結果より、摂食開始から４週間後（ＳＴＺ投与から２週間後）の血清コレステロール濃度および血清中性脂肪濃度は、混合発酵茶葉の熱水抽出物を摂取したラットでコントロール食を摂取したラットより低い値を示した。このことから、混合発酵茶葉の熱水抽出物は１型糖尿病において、血清脂質濃度低下作用を有することが明らかとなった。
【０１２１】
［実験例９］
発酵茶葉の安全性を確認するために動物実験を行った。
すなわち、混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）、を、フードプロセッサを用いて６０〜１００メッシュの大きさの粉末状態になるまで粉砕加工して得られた粉末状混合発酵茶葉を、４週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雄ラットに１日当たり５０００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で経口投与した。温度２２±１℃、湿度５５±５％、飼料および水自由摂食の条件下で４週間飼育したところ、死亡は認められず、異常な体重変化はみられず、飼育終了後の剖検においても臓器の異常は観察されなかった。
従って、ラットに対する発酵茶の致死量（ＬＤ５０）は５０００ｍｇ／ｋｇ体重より多いと推定され、安全性はかなり高いものと判断された。
【０１２２】
［実験例１０］
（混合発酵茶葉の製造−手で揉む方法）
茶の葉にビワ葉を投入し、手で揉む方法で揉捻した。茶の葉とビワ葉の配合割合は茶の葉：ビワ茶の質量比が９０：１０（ビワ投入割合１０％）と７５：２５（ビワ投入割合２５％）の２通りとした。揉み込みの時間（手揉み時間）は２５分と５０分の２通りとした。
この後、０時間、１時間、２時間、４時間の４通りの発酵工程を経て１６種類の混合発酵茶葉を得た。なお、発酵工程０時間のものは揉み込み終了直後に得られる混合発酵茶葉である。
得られた混合発酵茶葉について実験例１と同様にして１００℃の熱水で１０分間抽出した抽出液（混合発酵茶葉の使用量；２．０ｍｇ／ｍｌ）を得、該抽出液について実施例１と同様にしてＡＧＨ阻害性（マルターゼ阻害性およびスクラーゼ阻害性）を測定し、また下記の方法でＤＰＰＨ（１，１−ジピクリル−２−フェニルヒドラジル）消去活性を測定した。それぞれの結果を表２４、２５に示す。なお、ＤＰＰＨ消去活性の測定値が大きいほど抗酸化作用が高いことを示す。また実験例１と同様にして官能審査を行った。結果を表２６に示す。
【０１２３】
（ＤＰＰＨ消去活性の測定方法）
ＤＰＰＨ消去活性（単位：μｍｏｌ−Ｔｒｏｌｏｘ／ｍｇ）の測定は以下の方法で行った（以下、同様。）
混合発酵茶葉を粉砕したものを８０％エタノール溶液に溶かし、同じく８０％エタノール溶液を用いて０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。４００μＭ ＤＰＰＨ１２ｍｌと、２００ｍＭ ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）１２ｍｌと、２０％エタノール１２ｍｌとの混液を作り、エッペンドルフマルチピペットを用いて試験管（ａ）〜（ｆ）に該混液をそれぞれ０．９ｍｌずつ分注した後、試験管（ａ）〜（ｆ）のそれぞれに８０％エタノールを（３００−ｘ）μｌ加えた（ｘは分析試料の添加量であり、具体的に試験管（ａ）〜（ｆ）におけるｘは、順に０、３０、６０、１２０、１８０、２４０である）。さらに試験管（ａ）〜（ｆ）にそれぞれ分析試料（ｘ）μｌを加えて撹拌し、分析試料を添加してから２０分後に波長５２０ｎｍでの吸光度を測定した。
具体的には、時間の測定を開始してから３０秒後に試験管（ｂ）に分析試料を３０μｌ加え、６０秒後に試験管（ｃ）に分析試料を６０μｌ加え、１２０秒後に試験管（ｄ）に１２０μｌ加え、１８０秒後に試験管（ｅ）に１８０μｌを加え、２４０秒後に試験管（ｆ）に２４０μｌ加えた。そして時間の測定を開始してから２０分後に試験管（ａ）の吸光度を測定し、２０分３０秒後に試験管（ｂ）の吸光度を測定し、２１分後に試験管（ｃ）の吸光度を測定し、というように３０秒おきに吸光度の測定を行った。
一方、標準試料としてＴｒｏｌｏｘを用いて検量線を作成した。検量線の横軸は試料添加量（単位：μｍｏｌ）、縦軸は５２０ｎｍでの吸光度である。
分析試料についての測定値を、横軸を試料添加量（単位：μｌ）、縦軸を５２０ｎｍでの吸光度としてプロットし、直線的な吸光度減少が続く範囲内にて添加量（ｘ’μｌ）に対する吸光度（△Ａ５２０）の値を求める。次に検量線において同じ（△Ａ５２０）が得られるときのＴｒｏｌｏｘ添加量（単位：μｍｏｌ）を求める。こうして得られるＴｒｏｌｏｘ相当量（単位：μｍｏｌ）から、混合発酵茶葉１ｍｇ当たりの消去活性の値（単位：μｍｏｌ−Ｔｒｏｌｏｘ／ｍｇ）を求める。
【０１２４】
【表２４】
【０１２５】
【表２５】
【０１２６】
【表２６】
【０１２７】
［実験例１１］
（混合発酵茶葉の製造−すりつぶす方法）
乳鉢に茶の葉とビワ葉を入れてすりつぶした。茶の葉とビワ葉の配合割合は茶の葉：ビワ茶の質量比が９０：１０（ビワ投入割合１０％）と７５：２５（ビワ投入割合２５％）の２通りとした。すりつぶし時間は２０分と４０分の２通りとした。
この後、０時間、１時間、２時間、４時間の４通りの発酵工程を経て１６種類の混合発酵茶葉を得た。なお、発酵工程０時間のものはすりつぶし直後に得られる混合発酵茶葉である。
得られた混合発酵茶葉について実験例１と同様にしてＡＧＨ阻害性を測定し、またＤＰＰＨ消去活性を測定した。それぞれの結果を表２７、２８に示す。また実験例１と同様にして官能審査を行った。その結果を表２９に示す。
【０１２８】
【表２７】
【０１２９】
【表２８】
【０１３０】
【表２９】
【０１３１】
［実験例１２］
（混合発酵茶葉の製造−粉砕撹拌する方法）
ミキサー（製品名：ミルアンドミキサー、テスコム社製）に茶の葉とビワ葉と水を入れて粉砕撹拌した。茶の葉とビワ葉の配合割合は茶の葉：ビワ茶の質量比が９０：１０（ビワ投入割合１０％）と７５：２５（ビワ投入割合２５％）の２通りとした。水の添加量は、茶の葉とビワ葉の合計１００質量部に対して、１００質量部とした。粉砕撹拌時間は１０分と２０分の２通りとした。
この後、１時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間の５通りの発酵工程を経て２０種類の混合発酵茶葉を得た。
得られた混合発酵茶葉について実験例１と同様にしてＡＧＨ阻害性を測定し、またＤＰＰＨ消去活性を測定した。それぞれの結果を表３０、３１に示す。また実験例１と同様にして官能審査を行った。その結果を表３２に示す。
【０１３２】
【表３０】
【０１３３】
【表３１】
【０１３４】
【表３２】
【０１３５】
［分析試験例１０］
（香気成分の分析）
ビワ葉のみを乾燥させたもの、ビワ葉のみを発酵させたもの、市販されている紅茶（ダージリン紅茶およびアッサム紅茶）、長崎県総合農林試験場東彼杵茶業支場で栽培された茶の葉を用いて発酵させた紅茶、同じ茶の葉を用い発酵させずに製造した緑茶（荒茶）、および混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間）のそれぞれをサンプルとして、香気成分の定量分析を行った。
一般に茶系の香気成分の前処理は、カラム濃縮法等で行われている。ここでは、簡易・迅速な試料の抽出、濃縮、クロマトグラフ導入法として固相マイクロ抽出法で行った。定量は、測定対象である試料に内標準としてシクロヘキサノールを添加しておき、各香気成分のピーク面積を内標準に対する相対ピーク面積比として求めた。
【０１３６】
具体的には、以下の方法で行った。試料の調整は２００ｍＬの三角フラスコに、サンプルを２０ｇ、３０％塩化ナトリウム水溶液を１ｍＬ、内標準として１％シクロヘキサノールを５０μＬ加えて密栓した後、８０℃で５分間加熱して三角フラスコ内を安定させた後、捕集管を２０分間挿入して、発生した香気成分をトラップした。香気成分をトラップした捕集管を２５０℃に加熱したガスクロマトグラフの注入口に挿入し、香気成分をガスクロマトグラフのカラムに３分間導入して分析を行った。捕集管はＳＵＰＥＬＣＯ社製のポリジメチルシクロヘキサン／ｃａｒｂｏｘｅｎ／ジビニルベンゼンを用いた。ガスクロマトグラフの分析条件については、カラムはＲｅａｐｅｃｔ社製のｓｔａｂｉｌ−ＷＡＸ（ポリエチレングリコール系）６０ｍ×０．２５ｍｍ、膜厚０．２５μを使用し、カラム温度は７０℃に３分間保持後、２５０℃まで１０℃／分で昇温した。注入口温度は２５０℃、ヘリウム圧力は１２０ｋＰａとした。成分同定のためのガスクロマトグラフ質量分析は、Ｉ／Ｆ温度２５０℃、イオン化電圧７０ｅＶ、イオン化電流６０μＡで行った。１−ヘキサノール、トランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−オール、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、ネロリドールの９成分について、内標準に対する相対ピーク面積比を測定した。その結果を表３３に示す。
【０１３７】
【表３３】
【０１３８】
表の結果より、混合発酵茶葉には表に挙げた９成分が全て含まれている。これらのうち、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、およびネロリドールは、試験場の茶の葉を発酵させた紅茶にも比較的多く含まれており、市販の紅茶２種にも含まれているが、緑茶および発酵したビワ葉における含有量は比較的少ない。また、トランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、および３−ヘキセン−１−オールは、発酵したビワ葉に特徴的に多く含まれている。１−ヘキサノール以外の８成分のピーク面積（内標準に対する相対面積の値）を１−ヘキサノールのピーク面積（内標準に対する相対面積の値）と比較すると、８成分全部の各ピーク面積が、１−ヘキサノールのピーク面積よりも大きいのは混合発酵茶葉のみである。
なお１−ヘキサノールは、混合発酵茶葉において、茶の葉とビワ葉の配合割合、揉捻時間、発酵時間などの製造条件を変えても必ず検出され、かつ表に記載の他の８成分よりも常に少なく検出される香気成分である。
【０１３９】
［実験例１３］
２型糖尿病を自然発症するＫＫ−Ａｙマウスに混合発酵茶葉の熱水抽出物（凍結乾燥品）、テアシネンシンを多く含むフラクション（以下、ＴＳフラクションという。）、およびテアフラビンを多く含むフラクション（以下、ＴＦフラクションという。）をそれぞれ摂取させて、血糖値に及ぼす影響を調べた。
混合発酵茶葉の熱水抽出物は、混合発酵茶葉（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間、含水率５質量％）２０ｇを１００℃の熱水１，０００ｍｌで１０分間抽出した後、ろ過し、ろ液を凍結乾燥して粉末状にしたものを用いた。
ＴＳフラクションとしては、前記分析試験例２で得られるＦｒ．６を凍結乾燥して粉末状にしたものを用いた。
ＴＦフラクションとしては、前記分析試験例２で得られるＦｒ．７を凍結乾燥して粉末状にしたものを用いた。
マウスは、室温２２±１℃、湿度５５±５％、８：００〜２０：００点灯のライトサイクルの動物飼育室で飼育した。
５週齢のＫＫ−Ａｙマウスを用い、最初の２週間はＭＦ固形飼料（オリエンタル酵母工業（株）製）を与えて予備飼育を行った。ＫＫ−Ａｙマウスは７〜８週齢頃に糖尿病を自然発症することから、発症する可能性のある７週齢から試験食の摂食を開始した。すなわち、７週齢のときに６時間絶食（９：００〜１５：００）後、尾静脈より採血して血糖値を測定し、体重と血糖値が等しくなるように１群７匹ずつに群分けし、以下の試験食を６週間自由摂食させた
【０１４０】
試験食は以下の７通りである。
・コントロール食：ＡＩＮ−７６組成に基づいた純化食をコントロール食とした。コントロール食の質量組成（ｇ／ｋｇ）は、カゼイン２００ｇ／ｋｇ、コーン油１００ｇ／ｋｇ、ミネラル混合物（ＡＩＮ−７６−ＭＸ）３５ｇ／ｋｇ、ビタミン混合物（ＡＩＮ−７６−ＶＸ）１０ｇ／ｋｇ、セルロース５０ｇ／ｋｇ、重酒石酸コリン２ｇ／ｋｇ、ＤＬ−メチオニン３ｇ／ｋｇ、コーンスターチ１５０ｇ／ｋｇおよびショ糖４５０ｇ／ｋｇとした。
・抽出物添加食：前記コントロール食１００質量部に、上記粉末状の熱水抽出物（凍結乾燥品）を１質量部を添加し、その添加量分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
・ＴＳ添加食：上記熱水抽出物（凍結乾燥品）にはテアシネンシンが５．４質量％含まれることから、前記抽出物添加試験食中とテアシネンシン含有量が等しくなるように、コントロール食に前記ＴＳフラクションを添加し、その添加量分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
・ＴＳ２倍添加食：テアシネンシン含有量が前記抽出物添加試験食の２倍となるように、コントロール食に前記ＴＳフラクションを添加し、その添加量分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
・ＴＦ添加食：上記熱水抽出物（凍結乾燥品）にはテアフラビンが４．８質量％含まれることから、前記抽出物添加試験食中とテアフラビン含有量が等しくなるように、コントロール食に前記ＴＦフラクションを添加し、その添加量分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
・ＴＦ２倍添加食：テアフラビン含有量が前記抽出物添加試験食の２倍となるように、コントロール食に前記ＴＦフラクションを添加し、その添加量分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
・ＴＳ＋ＴＦ添加食：テアシネンシン含有量およびテアフラビン含有量が前記抽出物添加試験食とそれぞれ等しくなるように、コントロール食に前記ＴＳフラクションおよびＴＦフラクションを添加し、それらの添加量の合計分のショ糖を前記コントロール食から減じた。
【０１４１】
飼育期間中、摂食量は毎日測定し、体重および摂水量は１日おきに測定した。
試験食摂食開始２、４および６週間後に、血糖試験測定メディセーフチップ（テルモ社製）を用い、６時間絶食後、尾静脈より採血して血糖値を測定した。試験食を摂取した６週間のマウスの血糖値の変化を図１４から図１７に示す。
図１４に示すように、コントロール食を摂取したマウスの血糖値は、経時的に上昇して６週間後には３００ｍｇ／ｄｌを超えた。また摂水量も同様に増加したことから、コントロール食を摂取したマウスは糖尿病を発症したとみなされる。一方、抽出物添加食を摂取したマウスの血糖値は、経時的に減少する傾向にあり、６週間後の値はコントロール食を摂取したマウスの約半分に低下した。
図１５に示すように、ＴＳ添加食を摂取したマウスの血糖値は６週間後に低下し、ＴＳ２倍添加食を摂取した場合はさらに効果的に低下した。
図１６に示すように、ＴＦ添加食を摂取したマウスの血糖値は６週間後に低下し、ＴＦ２倍添加食を摂取した場合は４週間後から低下した。
図１７に示すように、ＴＳ＋ＴＦ添加食を摂取したマウスの血糖値は、４週間以降に抽出物添加食を摂取したマウスとほぼ同じレベルになった。
以上の結果から、混合発酵茶葉の熱水抽出物の血糖上昇抑制作用は、主にテアシネンシンとテアフラビンにより発揮されていることが明らかとなった。
【０１４２】
［臨床試験例１］
混合発酵茶葉の抽出物を含む飲料の摂取が、成人の血糖値、血清中性脂肪、血清コレステロール、体脂肪率および血圧に及ぼす影響を検討した。なお、本試験は県立長崎シーボルト大学研究倫理委員会の承認を受け、ヘルシンキ宣言の精神を遵守して実施した。
被験者は、長崎県庁内での募集に応募した長崎県庁職員で、健康な者と同様の日常生活を営んでおり、医師からの服薬指導を受けておらず、非妊娠者であり医師が適当と判断した者で、本試験の内容について十分な説明を受け、本人の自由意志により本人が同意書を提出した２８名である。
試験飲料は、９０℃の熱水１００質量部に対して、混合発酵茶葉を焙煎したもの（茶の葉とビワ葉の配合割合９：１、揉捻時間２０分、発酵時間０時間、含水率１質量％）を０．８３質量部添加して４分間抽出した後、ろ過したろ液を２００ｍｌずつ紙パックに充填し密封したものを用いた。
試験飲料を被験者に、朝食または昼食時と夕食時に各１本の１日合計２本を３ヶ月間飲用させた。試験飲料摂取前、摂取開始１ヶ月後、２ヶ月後および３ヶ月後の、早朝空腹時に採血、体重測定、体脂肪率測定および血圧（収縮期血圧および拡張期血圧）測定を行った。なお、採血前日の夜９時以降の飲食を禁止した。試験期間３ヶ月中の食事については特別な制限を設けず、日常と変わらない生活をするよう指導した。
血液成分についての測定項目として、総タンパク質、Ａ／Ｇ比、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、中性脂肪、遊離脂肪酸、尿酸、尿素窒素、クレアチニン、Ｎａ、Ｃｌ、Ｋ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、γ−ＧＴＰ、リン脂質、Ｃａ、無機リン、コリンエステラーゼ、ＬＤＨ、ＡＬＰ、アルブミン、直接ビリルビン、間接ビリルビン、インスリン、血糖、ヘモグロビンＡ１ｃ、白血球数、赤血球数、血色素量、ヘマトクリット、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、血小板数を測定した。
【０１４３】
試験飲料を摂取した３ヶ月間、２８名の平均値は、すべての測定項目において正常範囲内であった。
図１８、１９は、血糖値の測定結果を示すグラフであり、図１８は２８名全員の平均値、図１９は、試験飲料摂取開始前の血糖値（初期値）が１１０ｍｇ／ｄＬ以上のヒト（１０名）の平均値を初期値に対する変動率で表している。該変動率は、（測定値の平均値−初期値）／初期値×１００（単位：％）で算出される値であり、図中の「＊」は初期値に対して有意差があることを示す（以下、同様）。
図２０、２１は、血清中性脂肪濃度の測定結果を示すグラフであり、図２０は２８名全員の平均値、図２１は、試験飲料摂取開始前の血清中性脂肪濃度（初期値）が１５０ｍｇ／ｄＬ以上のヒト（９名）の平均値を、初期値に対する変動率で表している。
図２２、２３は、血清コレステロール濃度の測定結果を示すグラフであり、図２２は２８名全員の平均値、図２３は、試験飲料摂取開始前の血清コレステロール濃度（初期値）が２２０ｍｇ／ｄＬ以上のヒト（１１名）の平均値を初期値に対する変動率で表している。
図２４、２５は、体脂肪率の測定結果を示すグラフであり、図２４は２８名全員の平均値、図２５は、試験飲料摂取開始前の体脂肪率（初期値）が２５％以上のヒト（１５名）の平均値を初期値に対する変動率で表している。
図２６、２７は、最高血圧の測定結果を示すグラフであり、図２６は２８名全員の平均値、図２７は、試験飲料摂取開始前の最高血圧（初期値）が１４０ｍｍＨｇ以上のヒト（１４名）の平均値を初期値に対する変動率で表している。
図２８、２９は、最低血圧の測定結果を示すグラフであり、図２８は２８名全員の平均値、図２９は、試験飲料摂取開始前の最低血圧（初期値）が９０ｍｍＨｇ以上のヒト（１０名）の平均値を初期値に対する変動率で表している。
これらの結果より、血糖値については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いヒトでは摂取開始２ヶ月後および３ヶ月後に摂取前に比べて有意に低下した。
血清中性脂肪濃度については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いヒトでは摂取開始２ヶ月後および３ヶ月後に摂取前に比べて４０％程度低下した。
血清コレステロール濃度については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いヒトでは摂取開始２ヶ月後および３ヶ月後に摂取前に比べて有意に低下した。
体脂肪率については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いやや肥満傾向のヒトでは摂取開始３ヶ月後に摂取前に比べて有意に低下した。
最高血圧については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いヒトでは摂取開始１ヶ月後、２ヶ月後および３ヶ月後に摂取前に比べて有意に低下した。
最低血圧については、全員の平均値は試験期間中変動しなかったが、初期値が高いヒトでは摂取開始２ヶ月後および３ヶ月後に摂取前に比べて有意に低下した。
これらの結果から、混合発酵茶葉の抽出液を含有する飲料を摂取することにより、血糖値、血清中性脂肪、血清コレステロール、最高血圧および最低血圧の値がそれぞれ高い傾向を有するヒトにおいて、これらの値を改善させる効果が得られることが明らかとなった。またやや肥満傾向にあるヒトの体脂肪率を低下させる効果が得られることが明らかとなった。さらに、正常なヒトでは上記各測定値を低下させないことから、安全性が高い飲料であると評価される。
【０１４４】
［臨床試験例２］
混合発酵茶葉の抽出物を含む飲料の摂取が、若年女子の体脂肪率に及ぼす影響を検討した。なお、本試験は県立長崎シーボルト大学研究倫理委員会の承認を受け、ヘルシンキ宣言の精神を遵守して実施した。
被験者は、県立長崎シーボルト大学内での募集に応募した本学女子学生で、健康な者と同様の日常生活を営んでおり、医師からの服薬指導を受けておらず、非妊娠者であり医師が適当と判断した者で、本試験の内容について十分な説明を受け、本人の自由意志により本人が同意書を提出した成人女子学生５４名である。
試験飲料は上記臨床試験例１と同じものを用いた。また対照飲料として市販の２００ｍｌ紙パック入り緑茶飲料を用いた。
試験飲料を２７名の被験者に、対照飲料を２７名の被験者に、朝食または昼食時と夕食時に各１本の１日合計２本を３ヶ月間飲用させた。
摂取開始前に全員の血糖値および体脂肪率を測定し、試験飲料摂取群と対照飲料摂取群とで、それぞれの平均値がほぼ等しくなるように群分けをした。試験飲料と対照飲料の外見は同じで、外観から識別できないようにした。試験飲料摂取前、摂取開始１ヶ月後、２ヶ月後および３ヶ月後の、早朝空腹時に採血、体重測定、体脂肪測定および血圧測定を行った。なお、採血前日の夜９時以降の飲食を禁止した。試験３ヶ月間の食事については特別な制限を設けず、日常と変わらない生活をするよう指導した。
血液成分の測定項目は上記臨床試験例１と同じとした。
試験飲料を摂取した３ヶ月間、すべての測定項目において５４名の平均値は正常範囲内であった。またこの３ヶ月間、試験飲料を摂取した２７名の被験者と対照飲料を摂取した２７名の被験者の間に、すべての測定項目について差は観察されなかった。
図３０は、試験開始前の体脂肪率（初期値）が２５％以上のヒト（試験飲料摂取者で１１名、対照飲料摂取者で１３名）の体脂肪率を初期値に対する変動率で表している。
この図に示されるように体脂肪率の初期値が２５％以上であるやや肥満傾向の被験者において、試験飲料を摂取した群で対照飲料を摂取した群に比べて３ヶ月後の体脂肪率が有意に低下した。
これらの結果から、混合発酵茶葉の抽出液を含有する飲料を摂取することにより、やや肥満傾向にある若年女子の体脂肪率を低下させる効果が得られることが明らかとなった。また、正常な若年女子が摂取しても安全であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明によれば、上述したような糖尿病や高脂血症の予防または改善に有効な薬効を有する発酵茶葉、発酵茶葉抽出物および飲食品が得られる。
しかも本発明の発酵茶葉は、これまで有効に利用されていないビワ葉を有効利用することができるものであり、原料の茶の葉として、これまで刈り捨てられていた茶葉も使用できるという利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】本発明に係る混合発酵茶葉エキスの高速液体クロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図２】本発明に係る混合発酵茶葉の成分分離操作の例を示すフローチャートである。
【図３】本発明に係る混合発酵茶葉に含有されるポリフェノールの例を示す図である。
【図４】発明に係る混合発酵茶葉の成分分離操作で得られたフラクションの高速液ロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図５】発明に係る混合発酵茶葉の成分分離操作で得られたフラクションに含まれるプロアントシアジニンの推定構造およびそのチオール分解物の例を示す図である。
【図６】本発明に係る混合発酵茶葉エキスおよび比較例としての単独発酵茶葉エキスの水溶性画分の高速液体クロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図７】本発明に係る混合発酵茶葉エキスおよび比較例としての単独発酵茶葉エキスの酢酸エチル可溶画分の高速液体クロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図８】本発明に係る混合発酵茶葉から分離した酸化型高分子ポリフェノール画分およびそのチオール分解物の高速液体クロマトグラフィー分析結果を示す図である。
【図９】本発明に係る混合発酵茶葉から分離した酸化型高分子ポリフェノール画分およびビワプロアントシアニジンの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１０】実験例２の結果を示すグラフである。
【図１１】実験例３の結果を示すグラフである。
【図１２】実験例４の結果を示すグラフである。
【図１３】実験例８の結果を示すグラフである。
【図１４】実験例１３の結果を示すグラフである。
【図１５】実験例１３の結果を示すグラフである。
【図１６】実験例１３の結果を示すグラフである。
【図１７】実験例１３の結果を示すグラフである。
【図１８】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図１９】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２０】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２１】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２２】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２３】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２４】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２５】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２６】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２７】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２８】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図２９】臨床試験例１の結果を示すグラフである。
【図３０】臨床試験例２の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
茶の葉とビワ葉が混合、揉捻され、発酵したことを特徴とする発酵茶葉。
【請求項２】
茶の葉とビワ葉が混合され、かつ組織が破壊され、発酵したことを特徴とする発酵茶葉。
【請求項３】
茶の葉とビワ葉が混合され、かつすりつぶされ、発酵したことを特徴とする発酵茶葉。
【請求項４】
茶の葉とビワ葉に水を加えて粉砕撹拌混合され、発酵したことを特徴とする発酵茶葉。
【請求項５】
前記発酵茶葉に含まれるテアフラビン類の含有量が、前記茶の葉を単独で発酵させた単独発酵茶葉に含まれるテアフラビン類の含有量よりも多いことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵茶葉。
【請求項６】
前記発酵茶葉が１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルでカテキンＡ環のフロログルシノール由来のシグナルとガロイル基由来のシグナルを示し、アセチル化体の分子量が２０００を極大とする１０００〜１５０００であるカテキンガレート類の酸化縮合したポリフェノールＰを含有しており、前記発酵茶葉における該ポリフェノールＰの含有量が、前記茶の葉を単独で発酵させた単独発酵茶葉に含まれる該ポリフェノールＰの含有量よりも多いことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵茶葉。
【請求項７】
前記発酵茶葉が１−ヘキサノール、トランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−オール、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、およびネロリドールの香気成分を含み、固相マイクロ抽出法においてトランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−オール、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、およびネロリドールの香気成分の各ピーク面積が、いずれも１−ヘキサノールのピーク面積より大きいことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵茶葉。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵茶葉を抽出して得られる発酵茶葉抽出物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵茶葉を含有する飲食品。
【請求項１０】
請求項８記載の発酵茶葉抽出物を含有する飲食品。
【請求項１１】
血糖値上昇抑制用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１２】
糖尿病予防または改善用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１３】
中性脂肪低減用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１４】
コレステロール低減用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１５】
血清過酸化脂質低減用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１６】
体脂肪蓄積抑制用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１７】
血圧上昇抑制用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１】
茶の葉とビワ葉が混合、揉捻され、発酵したことを特徴とする発酵茶葉。
【請求項２】
茶の葉とビワ葉が混合され、かつ組織が破壊され、発酵したことを特徴とする発酵茶葉。
【請求項３】
茶の葉とビワ葉が混合され、かつすりつぶされ、発酵したことを特徴とする発酵茶葉。
【請求項４】
茶の葉とビワ葉に水を加えて粉砕撹拌混合され、発酵したことを特徴とする発酵茶葉。
【請求項５】
前記発酵茶葉に含まれるテアフラビン類の含有量が、前記茶の葉を単独で発酵させた単独発酵茶葉に含まれるテアフラビン類の含有量よりも多いことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵茶葉。
【請求項６】
前記発酵茶葉が１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルでカテキンＡ環のフロログルシノール由来のシグナルとガロイル基由来のシグナルを示し、アセチル化体の分子量が２０００を極大とする１０００〜１５０００であるカテキンガレート類の酸化縮合したポリフェノールＰを含有しており、前記発酵茶葉における該ポリフェノールＰの含有量が、前記茶の葉を単独で発酵させた単独発酵茶葉に含まれる該ポリフェノールＰの含有量よりも多いことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵茶葉。
【請求項７】
前記発酵茶葉が１−ヘキサノール、トランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−オール、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、およびネロリドールの香気成分を含み、固相マイクロ抽出法においてトランス−２−ヘキセナール、酢酸３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−オール、リナロール、ベンツアルデヒド、サリチル酸メチル、ゲラニオール、およびネロリドールの香気成分の各ピーク面積が、いずれも１−ヘキサノールのピーク面積より大きいことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵茶葉。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵茶葉を抽出して得られる発酵茶葉抽出物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵茶葉を含有する飲食品。
【請求項１０】
請求項８記載の発酵茶葉抽出物を含有する飲食品。
【請求項１１】
血糖値上昇抑制用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１２】
糖尿病予防または改善用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１３】
中性脂肪低減用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１４】
コレステロール低減用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１５】
血清過酸化脂質低減用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１６】
体脂肪蓄積抑制用である請求項９または１０記載の飲食品。
【請求項１７】
血圧上昇抑制用である請求項９または１０記載の飲食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【公開番号】特開２００７−２２８９６４（Ｐ２００７−２２８９６４Ａ）
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２３４８２（Ｐ２００７−２３４８２）
【出願日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（０００２１４１９１）長崎県 (106)
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【出願人】（５０５２２５１９７）長崎県公立大学法人 (31)
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（０００２１４１９１）長崎県 (106)
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【出願人】（５０５２２５１９７）長崎県公立大学法人 (31)
【出願人】（５０４１４５３４２）国立大学法人九州大学 (960)
【Ｆターム（参考）】
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