白血病の検出方法及びそのための試薬
【課題】くすぶり型のＡＴＬをも容易に検出することができる、ＡＴＬの検出方法及びそのための試薬を提供すること並びにＡＴＬ以外の白血病をも容易に検出することができる、白血病の検出方法及びそのための試薬を提供すること。
【解決手段】生体から分離した白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原を測定することを含む白血病の検出方法を提供した。
【効果】白血球細胞上のＳＦ−２５抗原を癌マーカーとして用いることにより、発症後のＡＴＬのみならず、くすぶり型のＡＴＬをも検出することができる。また、白血球細胞上のＳＦ−２５抗原を癌マーカーとして用いることにより、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病のような、ＡＴＬ以外の白血病をも検出することができる。
【解決手段】生体から分離した白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原を測定することを含む白血病の検出方法を提供した。
【効果】白血球細胞上のＳＦ−２５抗原を癌マーカーとして用いることにより、発症後のＡＴＬのみならず、くすぶり型のＡＴＬをも検出することができる。また、白血球細胞上のＳＦ−２５抗原を癌マーカーとして用いることにより、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病のような、ＡＴＬ以外の白血病をも検出することができる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病等の白血病の検出方法及び臨床上発症していない白血病（例えば、くすぶり型成人Ｔ細胞白血病）の検出方法及びそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｕｅｋｅｍｉａ， 以下、「ＡＴＬ」ということがある）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−Ｉ（ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ−Ｉ， ＨＴＬＶ−Ｉ）により、Ｔ細胞が癌化する白血病であり、皮膚病変、肝脾腫大、リンパ節腫脹が高率で起きる。ＨＴＬＶ−Ｉに感染しても、発病する者は約２０００人に１人と少なく、ほとんど全ての感染者（キャリア）は、ＡＴＬを発病することなく生涯を終える。しかし、一旦発病すれば、治療法はなく、ほとんどの患者は発病から１年以内に死亡する。従来、ＡＴＬの診断は、臨床症状並びに白血球の検鏡及び抗体検査等の結果を総合的に考慮して行われている。
【０００３】
キャリアが発症する場合、「くすぶり型」（ｓｍｏｌｄｅｒｉｎｇ ｔｙｐｅ）を経由して完全な発症に至る。くすぶり型では、癌化したＴ細胞は極僅かであり、Ｔ細胞のほとんどは正常であるため、この段階で治療を行えば、発症を防ぐことが可能である。したがって、くすぶり型を検出することができれば、ＡＴＬの発症を防止することができ、医療上、極めて有利である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、くすぶり型では、未だ臨床的には発症していないので、臨床症状に基づく診断はもちろんできない。また、抗体検査では、キャリアか否かは区別できるが、キャリアとくすぶり型の区別はできない。さらに、くすぶり型では、ほとんどのＴ細胞は正常細胞であり、癌化しているのは極少数であるから、検鏡によって癌化した極少数のＴ細胞を見つけ出すことはなかなか困難である。このように、くすぶり型を容易に検出できる診断方法は現在までに知られていない。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、くすぶり型のＡＴＬをも容易に検出することができる、ＡＴＬの検出方法及びそのための試薬を提供することである。さらにまた、本発明の目的は、ＡＴＬ以外の白血病をも容易に検出することができる、白血病の検出方法及びそのための試薬を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、白血球細胞上のＳＦ−２５抗原を癌マーカーとして用いることにより、発症後のＡＴＬのみならず、くすぶり型のＡＴＬをも検出することができることを見出し、本発明を完成した。また、本願発明者らは、白血球細胞上のＳＦ−２５抗原を癌マーカーとして用いることにより、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病のような、ＡＴＬ以外の白血病をも検出することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、生体から分離した白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原を測定することを含む白血病の検出方法を提供する。また、本発明は、ＳＦ−２５抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む、白血病診断用試薬を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の白血病の検出方法は、生体から分離した白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原を測定することを含む。ＳＦ−２５抗原は、１９８７年に発見された分子量約１２５ ｋＤａの公知の糖タンパク抗原である（ＷＯ８９／０５３０７， 欧州特許第０ ３９７ ７００号、米国特許第５，２１２，０８５号、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｂ， Ｏｚｔｕｒｋ Ｍ， Ｍｏｔｔｅ Ｐ， Ｓｔｒａｕｓｓ Ｗ， Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ＫＪ ａｎｄ Ｗａｎｄｓ ＪＲ． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８８； ４８： ６５７３−６５７９． 、Ｗｉｌｓｏｎ Ｂ， Ｏｚｔｕｒｋ Ｍ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， Ｍｏｔｔｅ Ｐ， Ｋｅｗ Ｍ， Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ＫＪ ａｎｄ Ｗａｎｄｓ ＪＲ． Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９８８； ８５： ３１４０−３１４４．、ＴａｋａｈａｓｈｉＨ， Ｃａｒｌｓｏｎ Ｒ， Ｏｚｔｕｒｋ Ｍ， Ｓｕｎ Ｓ， Ｍｏｔｔｅ Ｐ， Ｓｔｒａｕｓｓ Ｗ， Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ＫＪ ａｎｄ Ｗａｎｄｓ ＪＲ， Ｓｈｏｕｖａｌ Ｄ． Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ａｎｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９８９； ９６： １３１７−１３２９．、Ｈｕｒｗｉｔｚ Ｅ， Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ Ｉ， Ｗｉｌｃｈｅｃｋ Ｍ， Ｓｈｏｕｖａｌ Ｄ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， ＷａｎｄｓＪＲ， Ｓｅｌａ Ｍ． Ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｏｆ ５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒｏｄｉｎｅ−ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ） ａｎｄ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９０； １： ２８５−２９０．、Ｗａｎｄｓ ＪＲ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｔｅｓ． Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌｕｍｅ ２． Ｅｄｓ ｂｙ Ｔｓｕｃｈｉｙａ Ｍ． １９９１ ｐｐ． ２９５−２９８． Ｈｕｒｗｉｔｚ Ｅ，Ａｄｌｅｒ Ｒ， Ｓｈｏｕｖａｌ Ｄ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， Ｗａｎｄｓ ＪＲ， Ｓｅｌａ Ｍ． Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ ｔｏ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ａｔｈｙｍｉｃ ｍｉｃｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １９９２； ３５： １８６−１９２．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， Ｎａｋａｄａ Ｔ， Ｐｕｉｓｉｅｕｘ Ｉ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ＬＡＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３； ２５９： １４６０−１４６３．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， Ｎａｋａｄａ Ｔ， Ｎａｋａｋｉ Ｍ， Ｗａｎｄｓ ＪＲ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｂｙ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＳＦ−２５ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９５； １０８： １７２−１８２．）。ＳＦ−２５抗原は、ヒト結腸腺腫細胞株（例えば、ＬＳ １８０ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＬ０１８７）， ＣＯＬＯ ３２０ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ−２２０．１）， ＷｉＤｒ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ−２１８）， Ｃａｃｏ−２ （ＨＴＢ−３７）や、ヒト肝臓癌細胞株（例えばＦＯＣＵＳ （Ｌｕｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ２０； ４９３−５０４（１９８４））の表面上に発現していることが知られている。また、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体も公知であり（ＷＯ８９／０５３０７， 欧州特許第０ ３９７ ７００号、米国特許第５，２１２，０８５号）、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマがＡＴＣＣに寄託されている（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９）。
【０００９】
上記の通り、ＳＦ−２５抗原は、ヒト結腸腺腫細胞及びヒト肝臓癌細胞上に発現される癌関連抗原であることは知られているが、ＡＴＬ患者の単核球上に発現することはこれまでに知られておらず、また、白血病との関連もはっきりしていなかった。下記実施例に具体的に記載するように、本願発明者らは、急性及び慢性ＡＴＬ患者並びにくすぶり型のＡＴＬ患者の単核球表面上にＳＦ−２５抗原が発現され、健常者及びＨＴＬＶ−１の健常キャリアの単球上にはＳＦ−２５抗原がほとんど全く発現されていないことを見出し、これを利用してＡＴＬ、とりわけ、くすぶり型のＡＴＬを検出できることを見出した。さらに、下記実施例に具体的に記載するように、インバースＰＣＲにより、ＨＴＬＶ−１がプロウイルス化（ヒトの染色体ＤＮＡ中に、ウイルスＤＮＡが組み込まれること）することによりＳＦ−２５抗原が単核球表面上に出現することを確認し、これにより、本発明の方法で、急性及び慢性ＡＴＬ並びにくすぶり型ＡＴＬが検出できることが確認された。
【００１０】
本発明の方法では、生体から分離された白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原を検出する。白血球細胞としては、特に限定されず、単核球や多核球を挙げることができる。血液から白血球細胞を分離する方法は周知であり、下記実施例にも単核球の分離方法が記載されている。
【００１１】
白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原の検出は、白血球細胞と抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用して、周知の免疫学的方法により行うことができる。抗ＳＦ−２５抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。上記の通り、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体は公知であり、寄託もされている。寄託されている、ハイブリドーマＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９により産生されるモノクローナル抗体は、上記したヒト肝臓癌細胞株ＦＯＣＵＳを免疫原としてマウスに免疫し、常法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、得られたモノクローナル抗体のうち、上記した各種ヒト結腸腺腫細胞株と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選択することにより得られた。本発明の方法には、この寄託された抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を用いることもできるし、同様な方法で作製される他のモノクローナル抗体を用いることもできる。なお、ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９を記載しているＷＯ８９／０５３０７， 欧州特許第０ ３９７ ７００号及び米国特許第５，２１２，０８５号の実施例に具体的に記載されているように、上記の方法により、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９以外にも１回の作製操作で多数得られているから、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体は、公知の方法により容易に作製可能なものであり、したがって、本発明の方法に用いられるモノクローナル抗体は、寄託されたハイブリドーマが産生するものに限定されるものでは全くない。また、上記したＳＦ−２５抗原を発現していることが知られているヒト結腸腺腫細胞株やヒト肝臓癌細胞株を免疫原として動物を免疫し、常法によりモノクローナル抗体を作製し、正常ヒト白血球細胞と抗原抗体反応しないモノクローナル抗体を選択することによっても容易に得ることができる。また、抗体自体のみならず、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗原との結合性を有する断片も用いることができる。
【００１２】
抗ＳＦ−２５抗体を用いて、ＳＦ−２５抗原を発現している白血球細胞を検出すること、さらには、白血球細胞のうち、その表面上にＳＦ−２５抗原を発現する細胞の割合を測定することは、周知のフローサイトメトリーにより容易に行うことができる。フローサイトメトリーでは、蛍光標識した抗体を細胞と接触させ、抗原抗体反応により細胞に蛍光標識抗体が結合した細胞数を計数することができ、ひいては、抗体と結合した細胞の割合を算出することができる。フローサイトメトリーの装置及び必要な試薬類は市販されており、当業者が容易に実施することが可能である。
【００１３】
下記実施例に具体的に記載するように、ＳＦ−２５抗原を発現している単核球の割合は、平均して、急性ＡＴＬ患者で約４３％、慢性ＡＴＬ患者で約２８％、くすぶり型ＡＴＬ患者で約１５％であったが、健常人では約０．４％、健常キャリアで約０．６％であり、健常人＋健常キャリアの群と、急性＋慢性＋くすぶり型の群とは明瞭に区別することができる。すなわち、健常人の値と比較して、有意に高ければＡＴＬ（くすぶり型を含む）であると診断できる。また、下記実施例に具体的に記載するように、インバースＰＣＲにより、ＨＴＬＶ−１がプロウイルス化することによりＳＦ−２５抗原が単核球表面上に出現することを確認し、これにより、本発明の方法で、ＡＴＬ及びくすぶり型ＡＴＬが検出できることが確認された。
【００１４】
本発明の方法は、急性及び慢性ＡＴＬのみならず、くすぶり型ＡＴＬをも検出することができるという、医療上、非常に重要な特徴を有する。なお、くすぶり型ＡＴＬを検出できるということは、本発明の方法の重要な特徴であるが、本発明の方法によって、急性及び慢性ＡＴＬの診断も行えるので、本発明の方法は、急性及び慢性ＡＴＬの診断にも用いることができることは言うまでもない。
【００１５】
さらに、下記実施例に具体的に記載するように、ＳＦ−２５抗原は、ＡＴＬ以外の他の白血病であるＢ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病の患者の単核球上にも存在することが明らかになった。したがって、上記した白血球細胞上のＳＦ−２５抗原の検出は、ＡＴＬのみならず、他の白血病の検出にも適用することができることが明らかになった。
【００１６】
なお、白血球細胞上のＳＦ−２５抗原の検出のみでは、白血病がＡＴＬ、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病のいずれであるのかを識別することはできない。これらの識別は、公知の血液学的検査や、遺伝子検査（例えばＡＴＬの場合には、下記実施例に具体的に記載するインバースＰＣＲ等）により行うことができる。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１ ＡＴＬの検出
１． 試料の調製
急性ＡＴＬ患者７名、慢性ＡＴＬ患者５名、くすぶり型ＡＴＬ患者９名、健常ＡＴＬキャリア４２名及び健常人（ＨＴＬＶ−１非感染者）８名の末梢血から単核球を分離した。単核球の分離は、具体的に次のようにして行った。Ｌｙｍｐｈａｐｒｅｐ（商品名） （Ａｘｉｓ−Ｓｈｅｌｄ ＰｏＣ ＡＳ， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）５ｍｌを遠心管にとり、前記対象からえられたヘパリン加静脈血５ｍｌを静かに重層する。その後４００ｇ、３０分遠心し血漿と分離液の中間に帯上に浮遊する単核球を毛細管ピペットで回収した。回収した単核球をリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて３回遠心洗浄し、以下の実験に用いた。
【００１９】
２． フローサイトメトリー
マウス抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９により産生）を常法により、周知の蛍光標識であるフルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識し、得られた蛍光標識抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を用い、上記１で分離した単核球についてフローサイトメトリーを行った。フローサイトメトリーは、具体的に次のようにして行った。ＰＢＳ中に５ｘ１０６／ｍｌとなるよう調整した単核球浮遊液から、０．１ｍｌずつ２本の小試験管に分注し、１本には希釈した蛍光標識抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を１０μｌ加え、他の１本には同様にＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１を１０μｌ加えた。１０分ごとに静かに混和させながら、４℃３０分間反応させた。反応終了後ＰＢＳを加え、２回遠心洗浄後フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ（商品名）、Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ， Ｆｌｏｒｉｄａ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）にアプライし、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１をコントロールとして約１万個の細胞をカウントし陽性細胞の比率を求めた。
【００２０】
上記フローサイトメトリーにより、全単核球中の、ＳＦ−２５抗原を発現している単核球の割合を計測した。結果を下記表１及び図１に示す。
【００２１】
【表１】
表１
【００２２】
表１及び図１から明らかなように、本発明の方法により、健常人＋健常キャリアの群と、急性＋慢性＋くすぶり型の群とは明瞭に区別することが可能である。とりわけ、くすぶり型であっても、健常ＨＴＬＶ−Ｉキャリアとは明瞭に区別できることがわかる。
【００２３】
３． インバースＰＣＲ及びサザンブロット
次に、ＳＦ−２５抗原を発現している単核球の染色体ＤＮＡに、ＨＴＬＶ−Ｉ遺伝子がプロウイルス化して挿入されているか否かをインバースＰＣＲ及びサザンブロットにより調べた。これらは、具体的に次のようにして行った。
【００２４】
インバースＰＣＲの方法：
くすぶり型ＡＴＬ患者の末梢血から上記のようにして分離した単核球１０７をリン酸緩衝生食水（ｐＨ ７．２、０．５％牛血清アルブミンおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むー以下バッファー）６０μｌに浮遊させた。次に、ＦＩＴＣ標識したマウス抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９により産生）溶液（濃度０．１％）１０μｌを加え４ｏＣ５分間反応させ、２回洗浄し未吸着の抗体を除去した。この細胞に９０μｌのバッファ−を加え再浮遊させ、１０μｌの Ａｎｔｉ−ＦＩＴＣ マイクロ磁性ビ−ズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ， Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ 粒子直径５０ｎｍ）を加え、６ｏＣ１５分間標識し、ＳＦ−２５抗原を表面に有する単核球を磁性ビーズと結合させた。未吸着の磁性ビーズを除去するため細胞を２回洗浄後、５００μｌのバッファーに再浮遊させた。マックスミディセット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ， Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ） を用いて、この細胞をＭＡＣＳ分離ポジティブセレクションＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ， Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ） （一度バッファー５００μｌで洗浄したもの）にアプライし、磁力により磁性ビーズで標識された細胞（ＳＦ−２５抗原陽性細胞）と磁性ビーズで標識されなかった細胞（ＳＦ−２５抗原陰性細胞）を分画し、以下の実験で検体として用いた。
【００２５】
Ｔａｋｅｍｏｔｏ Ｓらによる報告（Ｂｌｏｏｄ Ｖｏｌ ８４ Ｎｏ９ ３０８０−３０８５， １９９４）に基づき以下のように行った。ＤＮＡｚｏｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｒｄ．， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， Ｏｈｉｏ．）を用いて各検体より染色体ＤＮＡを抽出し、このＤＮＡをＳａｕ３ＡＩを用いて切断し、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅをもちいてセルフライゲーションを行った。この方法により、ＨＴＬＶ−１ ５’ＬＴＲ及びｇａｇ ｓｅｑｕｎｃｅからなるものと、ＨＴＬＶ−１ ３’−ＬＴＲと染色体ＤＮＡからなるものとができる。ＨＴＬＶ−１の５’ ｐｒｏｖｉｒａｌ ＤＮＡからなるものを除く目的で、Ｓａｃ ＩＩで加熱処理した。このＤＮＡをテンプレートとしてｐｒｉｍｅｒ １ ； ｐｒｉｍｅｒ １： ５’−ａａｇｃｃｇｇｃａｇｔｃａｇｔｃｇｔｇａ−３’（ＨＴＬＶ−Ｉ 塩基配列の８９４６−８９２７）、 ｐｒｉｍｅｒ ２： ５’−ａａｇｔａｃｃｇｇｃａａｃｔｃｔｇｃｔｇ−３’ （ＨＴＬＶ−Ｉ 塩基配列の８９５８−８９７７）で第一段階のＰＣＲを行い、次いでｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒとして ３： ５’−ｇａａａｇｇｇａａａｇｇｇｇｔｇｇａａｃ−３’ （ＨＴＬＶ−Ｉ 塩基配列の８９２４−８９０５） ｐｒｉｍｅｒ ４： ５’−ｃｃａｇｃｇａｃａｇｃｃｃａｔｔｃｔａｔ−３’．（ＨＴＬＶ−Ｉ 塩基配列の８９８６−９００５） で第二段階のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。各ＰＣＲはＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ を用いて９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒のサイクルを第一段階は５０回、第二段階は３５回行った。このＰＣＲ産物 ５ｍｌをとり２％ アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色後、バンドを確認しＨＴＬＶ−Ｉのクローナルな組み込みの有無をみた。
【００２６】
サザンブロット：
上記の泳動産物を、ナイロンメンブランフィルタ−にトランスファーし、オリゴヌクレチド（５’−ｃｔｃｃａｇｇａｇａｇａａａｔｔｔａｇｔａｃａｃ−３’ ＨＴＬＶ−Ｉ塩基配列の９０１２−９０３５）をプローブとしてＨＴＬＶ−Ｉの組み込みを確認した。Ｔａｋｅｍｏｔｏらによる報告によると、この方法により染色体遺伝子を含むＨＴＬＶ−１の３’ＬＴＲのＵ５領域が増幅されると考えられる。ＡＴＬ患者におけるＨＴＬＶ−１遺伝子の組み込みは各症例間でランダムであるが、１人の患者ＡＴＬ細胞におけるＨＴＬＶ−１遺伝子の組み込みはモノクローナルであり、染色体ＤＮＡを含むＨＴＬＶ−１の３’ＬＴＲのＵ５領域を増幅することで、モノクローナルな増殖であるか否かを決定できる。事実彼らは染色体ＤＮＡを含むＨＴＬＶ−１の３’ＬＴＲのＵ５領域のＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ行うことによりそのことを確認している。
【００２７】
その結果、ＳＦ−２５抗原陽性単核球では、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス化ＤＮＡが、モノクローナルに組み込まれており、ＳＦ−２５抗原陰性細胞では、ＨＴＬＶ−Ｉのプロウイルス化は検出されなかった。このことから、本発明の方法により、急性、慢性及びくすぶり型ＡＴＬが検出できることが確認された。
【００２８】
実施例２ Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病の検出
実施例１と同様な方法により、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病患者１２名、急性リンパ性白血病患者１０名及び急性骨髄性白血病患者１２名の末梢血中の単核球について、ＳＦ−２５抗原を発現している単核球の割合を測定した。結果を下記表２に示す。
【００２９】
【表２】
表２
【００３０】
上記のとおり、健常人中のＳＦ−２５抗原発現単核球の割合（％）は０．４％であるから、ＳＦ−２５抗原をマーカーとしてＢ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病の検出も可能であることが明らかになった。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、くすぶり型ＡＴＬを包含するＡＴＬを、容易に高感度に検出することができる方法が初めて提供された。本発明によれば、末梢血中の単核球を用いて、容易にくすぶり型ＡＴＬを包含するＡＴＬを検出することができる。くすぶり型ＡＴＬは治療可能であるので、くすぶり型ＡＴＬを容易に高感度に検出できることは、医療上、非常に有利である。
【００３２】
【配列表】
【００３３】
【００３４】
【００３５】
【００３６】
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において、急性ＡＴＬ患者、慢性ＡＴＬ患者、くすぶり型ＡＴＬ患者、健常ＡＴＬキャリア及び健常人（ＨＴＬＶ−１非感染者）の末梢血中の単核球を被検試料とし、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより測定した、全単核球中のＳＦ−２５抗原陽性単核球の割合を示す図である。
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病等の白血病の検出方法及び臨床上発症していない白血病（例えば、くすぶり型成人Ｔ細胞白血病）の検出方法及びそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｕｅｋｅｍｉａ， 以下、「ＡＴＬ」ということがある）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス−Ｉ（ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ−Ｉ， ＨＴＬＶ−Ｉ）により、Ｔ細胞が癌化する白血病であり、皮膚病変、肝脾腫大、リンパ節腫脹が高率で起きる。ＨＴＬＶ−Ｉに感染しても、発病する者は約２０００人に１人と少なく、ほとんど全ての感染者（キャリア）は、ＡＴＬを発病することなく生涯を終える。しかし、一旦発病すれば、治療法はなく、ほとんどの患者は発病から１年以内に死亡する。従来、ＡＴＬの診断は、臨床症状並びに白血球の検鏡及び抗体検査等の結果を総合的に考慮して行われている。
【０００３】
キャリアが発症する場合、「くすぶり型」（ｓｍｏｌｄｅｒｉｎｇ ｔｙｐｅ）を経由して完全な発症に至る。くすぶり型では、癌化したＴ細胞は極僅かであり、Ｔ細胞のほとんどは正常であるため、この段階で治療を行えば、発症を防ぐことが可能である。したがって、くすぶり型を検出することができれば、ＡＴＬの発症を防止することができ、医療上、極めて有利である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、くすぶり型では、未だ臨床的には発症していないので、臨床症状に基づく診断はもちろんできない。また、抗体検査では、キャリアか否かは区別できるが、キャリアとくすぶり型の区別はできない。さらに、くすぶり型では、ほとんどのＴ細胞は正常細胞であり、癌化しているのは極少数であるから、検鏡によって癌化した極少数のＴ細胞を見つけ出すことはなかなか困難である。このように、くすぶり型を容易に検出できる診断方法は現在までに知られていない。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、くすぶり型のＡＴＬをも容易に検出することができる、ＡＴＬの検出方法及びそのための試薬を提供することである。さらにまた、本発明の目的は、ＡＴＬ以外の白血病をも容易に検出することができる、白血病の検出方法及びそのための試薬を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明者は、鋭意研究の結果、白血球細胞上のＳＦ−２５抗原を癌マーカーとして用いることにより、発症後のＡＴＬのみならず、くすぶり型のＡＴＬをも検出することができることを見出し、本発明を完成した。また、本願発明者らは、白血球細胞上のＳＦ−２５抗原を癌マーカーとして用いることにより、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病のような、ＡＴＬ以外の白血病をも検出することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、生体から分離した白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原を測定することを含む白血病の検出方法を提供する。また、本発明は、ＳＦ−２５抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む、白血病診断用試薬を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
上記の通り、本発明の白血病の検出方法は、生体から分離した白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原を測定することを含む。ＳＦ−２５抗原は、１９８７年に発見された分子量約１２５ ｋＤａの公知の糖タンパク抗原である（ＷＯ８９／０５３０７， 欧州特許第０ ３９７ ７００号、米国特許第５，２１２，０８５号、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｂ， Ｏｚｔｕｒｋ Ｍ， Ｍｏｔｔｅ Ｐ， Ｓｔｒａｕｓｓ Ｗ， Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ＫＪ ａｎｄ Ｗａｎｄｓ ＪＲ． Ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８８； ４８： ６５７３−６５７９． 、Ｗｉｌｓｏｎ Ｂ， Ｏｚｔｕｒｋ Ｍ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， Ｍｏｔｔｅ Ｐ， Ｋｅｗ Ｍ， Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ＫＪ ａｎｄ Ｗａｎｄｓ ＪＲ． Ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９８８； ８５： ３１４０−３１４４．、ＴａｋａｈａｓｈｉＨ， Ｃａｒｌｓｏｎ Ｒ， Ｏｚｔｕｒｋ Ｍ， Ｓｕｎ Ｓ， Ｍｏｔｔｅ Ｐ， Ｓｔｒａｕｓｓ Ｗ， Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ＫＪ ａｎｄ Ｗａｎｄｓ ＪＲ， Ｓｈｏｕｖａｌ Ｄ． Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ａｎｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９８９； ９６： １３１７−１３２９．、Ｈｕｒｗｉｔｚ Ｅ， Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ Ｉ， Ｗｉｌｃｈｅｃｋ Ｍ， Ｓｈｏｕｖａｌ Ｄ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， ＷａｎｄｓＪＲ， Ｓｅｌａ Ｍ． Ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｏｆ ５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒｏｄｉｎｅ−ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ） ａｎｄ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９０； １： ２８５−２９０．、Ｗａｎｄｓ ＪＲ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ． Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈａｎｇｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｔｅｓ． Ｉｎ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌｕｍｅ ２． Ｅｄｓ ｂｙ Ｔｓｕｃｈｉｙａ Ｍ． １９９１ ｐｐ． ２９５−２９８． Ｈｕｒｗｉｔｚ Ｅ，Ａｄｌｅｒ Ｒ， Ｓｈｏｕｖａｌ Ｄ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， Ｗａｎｄｓ ＪＲ， Ｓｅｌａ Ｍ． Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ ｔｏ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ａｔｈｙｍｉｃ ｍｉｃｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ １９９２； ３５： １８６−１９２．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， Ｎａｋａｄａ Ｔ， Ｐｕｉｓｉｅｕｘ Ｉ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ＬＡＫ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３； ２５９： １４６０−１４６３．、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ， Ｎａｋａｄａ Ｔ， Ｎａｋａｋｉ Ｍ， Ｗａｎｄｓ ＪＲ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ ｂｙ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＳＦ−２５ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９５； １０８： １７２−１８２．）。ＳＦ−２５抗原は、ヒト結腸腺腫細胞株（例えば、ＬＳ １８０ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＬ０１８７）， ＣＯＬＯ ３２０ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ−２２０．１）， ＷｉＤｒ （ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＣＣＬ−２１８）， Ｃａｃｏ−２ （ＨＴＢ−３７）や、ヒト肝臓癌細胞株（例えばＦＯＣＵＳ （Ｌｕｎ Ｈ． ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ２０； ４９３−５０４（１９８４））の表面上に発現していることが知られている。また、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体も公知であり（ＷＯ８９／０５３０７， 欧州特許第０ ３９７ ７００号、米国特許第５，２１２，０８５号）、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマがＡＴＣＣに寄託されている（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９）。
【０００９】
上記の通り、ＳＦ−２５抗原は、ヒト結腸腺腫細胞及びヒト肝臓癌細胞上に発現される癌関連抗原であることは知られているが、ＡＴＬ患者の単核球上に発現することはこれまでに知られておらず、また、白血病との関連もはっきりしていなかった。下記実施例に具体的に記載するように、本願発明者らは、急性及び慢性ＡＴＬ患者並びにくすぶり型のＡＴＬ患者の単核球表面上にＳＦ−２５抗原が発現され、健常者及びＨＴＬＶ−１の健常キャリアの単球上にはＳＦ−２５抗原がほとんど全く発現されていないことを見出し、これを利用してＡＴＬ、とりわけ、くすぶり型のＡＴＬを検出できることを見出した。さらに、下記実施例に具体的に記載するように、インバースＰＣＲにより、ＨＴＬＶ−１がプロウイルス化（ヒトの染色体ＤＮＡ中に、ウイルスＤＮＡが組み込まれること）することによりＳＦ−２５抗原が単核球表面上に出現することを確認し、これにより、本発明の方法で、急性及び慢性ＡＴＬ並びにくすぶり型ＡＴＬが検出できることが確認された。
【００１０】
本発明の方法では、生体から分離された白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原を検出する。白血球細胞としては、特に限定されず、単核球や多核球を挙げることができる。血液から白血球細胞を分離する方法は周知であり、下記実施例にも単核球の分離方法が記載されている。
【００１１】
白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原の検出は、白血球細胞と抗ＳＦ−２５抗体又はその抗原結合性断片との抗原抗体反応を利用して、周知の免疫学的方法により行うことができる。抗ＳＦ−２５抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。上記の通り、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体は公知であり、寄託もされている。寄託されている、ハイブリドーマＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９により産生されるモノクローナル抗体は、上記したヒト肝臓癌細胞株ＦＯＣＵＳを免疫原としてマウスに免疫し、常法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製し、得られたモノクローナル抗体のうち、上記した各種ヒト結腸腺腫細胞株と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選択することにより得られた。本発明の方法には、この寄託された抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を用いることもできるし、同様な方法で作製される他のモノクローナル抗体を用いることもできる。なお、ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９を記載しているＷＯ８９／０５３０７， 欧州特許第０ ３９７ ７００号及び米国特許第５，２１２，０８５号の実施例に具体的に記載されているように、上記の方法により、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９以外にも１回の作製操作で多数得られているから、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体は、公知の方法により容易に作製可能なものであり、したがって、本発明の方法に用いられるモノクローナル抗体は、寄託されたハイブリドーマが産生するものに限定されるものでは全くない。また、上記したＳＦ−２５抗原を発現していることが知られているヒト結腸腺腫細胞株やヒト肝臓癌細胞株を免疫原として動物を免疫し、常法によりモノクローナル抗体を作製し、正常ヒト白血球細胞と抗原抗体反応しないモノクローナル抗体を選択することによっても容易に得ることができる。また、抗体自体のみならず、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗原との結合性を有する断片も用いることができる。
【００１２】
抗ＳＦ−２５抗体を用いて、ＳＦ−２５抗原を発現している白血球細胞を検出すること、さらには、白血球細胞のうち、その表面上にＳＦ−２５抗原を発現する細胞の割合を測定することは、周知のフローサイトメトリーにより容易に行うことができる。フローサイトメトリーでは、蛍光標識した抗体を細胞と接触させ、抗原抗体反応により細胞に蛍光標識抗体が結合した細胞数を計数することができ、ひいては、抗体と結合した細胞の割合を算出することができる。フローサイトメトリーの装置及び必要な試薬類は市販されており、当業者が容易に実施することが可能である。
【００１３】
下記実施例に具体的に記載するように、ＳＦ−２５抗原を発現している単核球の割合は、平均して、急性ＡＴＬ患者で約４３％、慢性ＡＴＬ患者で約２８％、くすぶり型ＡＴＬ患者で約１５％であったが、健常人では約０．４％、健常キャリアで約０．６％であり、健常人＋健常キャリアの群と、急性＋慢性＋くすぶり型の群とは明瞭に区別することができる。すなわち、健常人の値と比較して、有意に高ければＡＴＬ（くすぶり型を含む）であると診断できる。また、下記実施例に具体的に記載するように、インバースＰＣＲにより、ＨＴＬＶ−１がプロウイルス化することによりＳＦ−２５抗原が単核球表面上に出現することを確認し、これにより、本発明の方法で、ＡＴＬ及びくすぶり型ＡＴＬが検出できることが確認された。
【００１４】
本発明の方法は、急性及び慢性ＡＴＬのみならず、くすぶり型ＡＴＬをも検出することができるという、医療上、非常に重要な特徴を有する。なお、くすぶり型ＡＴＬを検出できるということは、本発明の方法の重要な特徴であるが、本発明の方法によって、急性及び慢性ＡＴＬの診断も行えるので、本発明の方法は、急性及び慢性ＡＴＬの診断にも用いることができることは言うまでもない。
【００１５】
さらに、下記実施例に具体的に記載するように、ＳＦ−２５抗原は、ＡＴＬ以外の他の白血病であるＢ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病の患者の単核球上にも存在することが明らかになった。したがって、上記した白血球細胞上のＳＦ−２５抗原の検出は、ＡＴＬのみならず、他の白血病の検出にも適用することができることが明らかになった。
【００１６】
なお、白血球細胞上のＳＦ−２５抗原の検出のみでは、白血病がＡＴＬ、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病のいずれであるのかを識別することはできない。これらの識別は、公知の血液学的検査や、遺伝子検査（例えばＡＴＬの場合には、下記実施例に具体的に記載するインバースＰＣＲ等）により行うことができる。
【００１７】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１ ＡＴＬの検出
１． 試料の調製
急性ＡＴＬ患者７名、慢性ＡＴＬ患者５名、くすぶり型ＡＴＬ患者９名、健常ＡＴＬキャリア４２名及び健常人（ＨＴＬＶ−１非感染者）８名の末梢血から単核球を分離した。単核球の分離は、具体的に次のようにして行った。Ｌｙｍｐｈａｐｒｅｐ（商品名） （Ａｘｉｓ−Ｓｈｅｌｄ ＰｏＣ ＡＳ， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）５ｍｌを遠心管にとり、前記対象からえられたヘパリン加静脈血５ｍｌを静かに重層する。その後４００ｇ、３０分遠心し血漿と分離液の中間に帯上に浮遊する単核球を毛細管ピペットで回収した。回収した単核球をリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて３回遠心洗浄し、以下の実験に用いた。
【００１９】
２． フローサイトメトリー
マウス抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９により産生）を常法により、周知の蛍光標識であるフルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識し、得られた蛍光標識抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を用い、上記１で分離した単核球についてフローサイトメトリーを行った。フローサイトメトリーは、具体的に次のようにして行った。ＰＢＳ中に５ｘ１０６／ｍｌとなるよう調整した単核球浮遊液から、０．１ｍｌずつ２本の小試験管に分注し、１本には希釈した蛍光標識抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を１０μｌ加え、他の１本には同様にＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１を１０μｌ加えた。１０分ごとに静かに混和させながら、４℃３０分間反応させた。反応終了後ＰＢＳを加え、２回遠心洗浄後フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ（商品名）、Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｍｉａｍｉ， Ｆｌｏｒｉｄａ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）にアプライし、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ１をコントロールとして約１万個の細胞をカウントし陽性細胞の比率を求めた。
【００２０】
上記フローサイトメトリーにより、全単核球中の、ＳＦ−２５抗原を発現している単核球の割合を計測した。結果を下記表１及び図１に示す。
【００２１】
【表１】
表１
【００２２】
表１及び図１から明らかなように、本発明の方法により、健常人＋健常キャリアの群と、急性＋慢性＋くすぶり型の群とは明瞭に区別することが可能である。とりわけ、くすぶり型であっても、健常ＨＴＬＶ−Ｉキャリアとは明瞭に区別できることがわかる。
【００２３】
３． インバースＰＣＲ及びサザンブロット
次に、ＳＦ−２５抗原を発現している単核球の染色体ＤＮＡに、ＨＴＬＶ−Ｉ遺伝子がプロウイルス化して挿入されているか否かをインバースＰＣＲ及びサザンブロットにより調べた。これらは、具体的に次のようにして行った。
【００２４】
インバースＰＣＲの方法：
くすぶり型ＡＴＬ患者の末梢血から上記のようにして分離した単核球１０７をリン酸緩衝生食水（ｐＨ ７．２、０．５％牛血清アルブミンおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むー以下バッファー）６０μｌに浮遊させた。次に、ＦＩＴＣ標識したマウス抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＨＢ９５９９により産生）溶液（濃度０．１％）１０μｌを加え４ｏＣ５分間反応させ、２回洗浄し未吸着の抗体を除去した。この細胞に９０μｌのバッファ−を加え再浮遊させ、１０μｌの Ａｎｔｉ−ＦＩＴＣ マイクロ磁性ビ−ズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ， Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ 粒子直径５０ｎｍ）を加え、６ｏＣ１５分間標識し、ＳＦ−２５抗原を表面に有する単核球を磁性ビーズと結合させた。未吸着の磁性ビーズを除去するため細胞を２回洗浄後、５００μｌのバッファーに再浮遊させた。マックスミディセット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ， Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ） を用いて、この細胞をＭＡＣＳ分離ポジティブセレクションＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ， Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ） （一度バッファー５００μｌで洗浄したもの）にアプライし、磁力により磁性ビーズで標識された細胞（ＳＦ−２５抗原陽性細胞）と磁性ビーズで標識されなかった細胞（ＳＦ−２５抗原陰性細胞）を分画し、以下の実験で検体として用いた。
【００２５】
Ｔａｋｅｍｏｔｏ Ｓらによる報告（Ｂｌｏｏｄ Ｖｏｌ ８４ Ｎｏ９ ３０８０−３０８５， １９９４）に基づき以下のように行った。ＤＮＡｚｏｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ Ｒｄ．， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， Ｏｈｉｏ．）を用いて各検体より染色体ＤＮＡを抽出し、このＤＮＡをＳａｕ３ＡＩを用いて切断し、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅをもちいてセルフライゲーションを行った。この方法により、ＨＴＬＶ−１ ５’ＬＴＲ及びｇａｇ ｓｅｑｕｎｃｅからなるものと、ＨＴＬＶ−１ ３’−ＬＴＲと染色体ＤＮＡからなるものとができる。ＨＴＬＶ−１の５’ ｐｒｏｖｉｒａｌ ＤＮＡからなるものを除く目的で、Ｓａｃ ＩＩで加熱処理した。このＤＮＡをテンプレートとしてｐｒｉｍｅｒ １ ； ｐｒｉｍｅｒ １： ５’−ａａｇｃｃｇｇｃａｇｔｃａｇｔｃｇｔｇａ−３’（ＨＴＬＶ−Ｉ 塩基配列の８９４６−８９２７）、 ｐｒｉｍｅｒ ２： ５’−ａａｇｔａｃｃｇｇｃａａｃｔｃｔｇｃｔｇ−３’ （ＨＴＬＶ−Ｉ 塩基配列の８９５８−８９７７）で第一段階のＰＣＲを行い、次いでｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒとして ３： ５’−ｇａａａｇｇｇａａａｇｇｇｇｔｇｇａａｃ−３’ （ＨＴＬＶ−Ｉ 塩基配列の８９２４−８９０５） ｐｒｉｍｅｒ ４： ５’−ｃｃａｇｃｇａｃａｇｃｃｃａｔｔｃｔａｔ−３’．（ＨＴＬＶ−Ｉ 塩基配列の８９８６−９００５） で第二段階のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った。各ＰＣＲはＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ を用いて９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃３０秒のサイクルを第一段階は５０回、第二段階は３５回行った。このＰＣＲ産物 ５ｍｌをとり２％ アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色後、バンドを確認しＨＴＬＶ−Ｉのクローナルな組み込みの有無をみた。
【００２６】
サザンブロット：
上記の泳動産物を、ナイロンメンブランフィルタ−にトランスファーし、オリゴヌクレチド（５’−ｃｔｃｃａｇｇａｇａｇａａａｔｔｔａｇｔａｃａｃ−３’ ＨＴＬＶ−Ｉ塩基配列の９０１２−９０３５）をプローブとしてＨＴＬＶ−Ｉの組み込みを確認した。Ｔａｋｅｍｏｔｏらによる報告によると、この方法により染色体遺伝子を含むＨＴＬＶ−１の３’ＬＴＲのＵ５領域が増幅されると考えられる。ＡＴＬ患者におけるＨＴＬＶ−１遺伝子の組み込みは各症例間でランダムであるが、１人の患者ＡＴＬ細胞におけるＨＴＬＶ−１遺伝子の組み込みはモノクローナルであり、染色体ＤＮＡを含むＨＴＬＶ−１の３’ＬＴＲのＵ５領域を増幅することで、モノクローナルな増殖であるか否かを決定できる。事実彼らは染色体ＤＮＡを含むＨＴＬＶ−１の３’ＬＴＲのＵ５領域のＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ行うことによりそのことを確認している。
【００２７】
その結果、ＳＦ−２５抗原陽性単核球では、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス化ＤＮＡが、モノクローナルに組み込まれており、ＳＦ−２５抗原陰性細胞では、ＨＴＬＶ−Ｉのプロウイルス化は検出されなかった。このことから、本発明の方法により、急性、慢性及びくすぶり型ＡＴＬが検出できることが確認された。
【００２８】
実施例２ Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病の検出
実施例１と同様な方法により、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病患者１２名、急性リンパ性白血病患者１０名及び急性骨髄性白血病患者１２名の末梢血中の単核球について、ＳＦ−２５抗原を発現している単核球の割合を測定した。結果を下記表２に示す。
【００２９】
【表２】
表２
【００３０】
上記のとおり、健常人中のＳＦ−２５抗原発現単核球の割合（％）は０．４％であるから、ＳＦ−２５抗原をマーカーとしてＢ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病の検出も可能であることが明らかになった。
【００３１】
【発明の効果】
本発明により、くすぶり型ＡＴＬを包含するＡＴＬを、容易に高感度に検出することができる方法が初めて提供された。本発明によれば、末梢血中の単核球を用いて、容易にくすぶり型ＡＴＬを包含するＡＴＬを検出することができる。くすぶり型ＡＴＬは治療可能であるので、くすぶり型ＡＴＬを容易に高感度に検出できることは、医療上、非常に有利である。
【００３２】
【配列表】
【００３３】
【００３４】
【００３５】
【００３６】
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において、急性ＡＴＬ患者、慢性ＡＴＬ患者、くすぶり型ＡＴＬ患者、健常ＡＴＬキャリア及び健常人（ＨＴＬＶ−１非感染者）の末梢血中の単核球を被検試料とし、抗ＳＦ−２５モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより測定した、全単核球中のＳＦ−２５抗原陽性単核球の割合を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離した白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原を測定することを含む白血病の検出方法。
【請求項２】
白血球細胞のうち、その表面上にＳＦ−２５抗原を発現する細胞の割合を測定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
白血球細胞が単核球である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ＳＦ−２５抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片と、白血球細胞上のＳＦ−２５抗原との抗原抗体反応を利用して行う請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体又はその抗原結合性断片が蛍光標識されており、フローサイトメトリーにより行う請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記白血病が成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記白血病が成人Ｔ細胞白血病である請求項７記載の方法。
【請求項９】
くすぶり型を検出する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＳＦ−２５抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む、白血病診断用試薬。
【請求項１１】
前記抗体が蛍光標識されている請求項１０記載の試薬。
【請求項１２】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１０又は１１記載の試薬。
【請求項１３】
成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病診断用試薬である請求項１０ないし１２記載の試薬。
【請求項１４】
成人Ｔ細胞白血病診断用試薬である請求項１３記載の試薬。
【請求項１】
生体から分離した白血球細胞表面上のＳＦ−２５抗原を測定することを含む白血病の検出方法。
【請求項２】
白血球細胞のうち、その表面上にＳＦ−２５抗原を発現する細胞の割合を測定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
白血球細胞が単核球である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ＳＦ−２５抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片と、白血球細胞上のＳＦ−２５抗原との抗原抗体反応を利用して行う請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体又はその抗原結合性断片が蛍光標識されており、フローサイトメトリーにより行う請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記白血病が成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記白血病が成人Ｔ細胞白血病である請求項７記載の方法。
【請求項９】
くすぶり型を検出する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＳＦ−２５抗原と抗原抗体反応する抗体又はその抗原結合性断片を含む、白血病診断用試薬。
【請求項１１】
前記抗体が蛍光標識されている請求項１０記載の試薬。
【請求項１２】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１０又は１１記載の試薬。
【請求項１３】
成人Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病又は急性骨髄性白血病診断用試薬である請求項１０ないし１２記載の試薬。
【請求項１４】
成人Ｔ細胞白血病診断用試薬である請求項１３記載の試薬。
【図１】
【公開番号】特開２００４−１６３１２１（Ｐ２００４−１６３１２１Ａ）
【公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００２−３２６０４５（Ｐ２００２−３２６０４５）
【出願日】平成１４年１１月８日（２００２．１１．８）
【出願人】（３９００３７００６）株式会社エスアールエル (29)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１４年１１月８日（２００２．１１．８）
【出願人】（３９００３７００６）株式会社エスアールエル (29)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]