百日咳毒素を精製する方法およびそれに有用なペプチド
【課題】百日咳毒素（ＰＴ）を精製するための試薬および方法を提供する。
【解決手段】アミノ酸配列ＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤを含むペプチド。
【解決手段】アミノ酸配列ＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤを含むペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、百日咳毒素（ＰＴ）を精製するための試薬および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
百日咳菌（Bordetella pertussis）によって産生される百日咳毒素（ＰＴ）は、百日咳に対する全てのワクチンの主成分である。ＰＴは典型的には破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドと併用される。ＰＴの工業生産は、典型的には百日咳菌を規定の培地で培養することによって達成される。ＰＴは次いで周知の技術（すなわち、特許文献１；特許文献２；および非特許文献１； 非特許文献２）を用いて上清から単離および精製される。公知の方法の多くはそれぞれ、マトリクス結合ウシフェチュイン（ＢＦ）またはアシアロフェチュインの使用を必要とし、その起源および純度が重要である。ウシ由来試薬の使用は、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）といったウシ関連疾患に関する幾分の懸念に結びついている。
【０００３】
従って、当業者は、ＢＦに依存しなでＰＴを精製する方法を求めている。１つのそのような方法は、Ｂｏｇｄａｎら（非特許文献２）によって記載されている。ＰＴを結合させることによってウシフェチュインのグリコシド部分を模倣する能力を有するペプチドが、ファージディスプレイシステムを用いて同定された。共通配列ＸＧＳＦＳＧＸ（Ｘは任意のアミノ酸である）を有する３つのペプチド（３Ｇ５：ＮＧＳＦＳＧＦ；３Ｇ８：ＮＧＳＦＳＧＣ；および、３Ｇ２：ＤＧＳＦＳＧＦ）が、ＰＴ−結合能を有するとして同定された。３Ｇ２は、部分精製されたＰＴ調製物からＰＴを精製するためのアフィニティカラムにおも利用された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第6,399,076号明細書
【特許文献２】米国特許第5,877,298号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sekura,et al.J.Biol.Chem.258: 14647-14651,1983
【非特許文献２】Bogdan,et al.Appl.Env.Micro.69 (10): 6272-6279,Oct.2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ウシ製品の不在下でＰＴを精製するためのペプチドを設計および使用するための他の方法が当業者に望まれている。いずれの形態でもフェチュインを使用しない、ＰＴのアフィニティ精製のための試薬および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は百日咳毒素（ＰＴ）を精製するための方法に関する。一実施形態では、ペプチド受容体に結合した核酸逆転写プライマーをＲＮＡに共有結合させ、そのＲＮＡを翻訳してタンパク質産物がプライマーに共有結合するようにペプチド産物を生じさせ、ＲＮＡを逆転写してＤＮＡ−タンパク質融合物を生じさせ、さらにその融合産物を試験してＰＴ結合ペプチドを含有する融合産物を同定することによって、ＤＮＡ−タンパク質融合物を作製する方法を提供する。その後、ペプチドの配列を配列決定によって同定する。他の実施形態では、ＰＴ−結合能を有し、かつ複雑な生物液からＰＴを精製するのに有用であるペプチドを提供する。また、複雑な生物液からＰＴを精製するのに使用するための固相担体および／またはクロマトグラフィー媒体に結合したペプチド、およびそのような精製を実施する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ａ）グルマリンライブラリの模式図。ライブラリのアミノ酸配列に翻訳される位置が強調表示されている。タンパク質部分の配列（アミノ酸５９個の長さ）は１文字アミノ酸コードで表され、Ｘは任意のアミノ酸を示す。ライブラリの翻訳されない部分は灰色の囲みで示す。（ａ）Ｔ７−ライブラリの最適なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのプロモーター、（ｂ） ＴＭＶ−ライブラリの完全なｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のためのタバコモザイクウイルス翻訳開始配列、（ｃ）ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ライブラリの効率的なアフィニティ精製のためのＨｉｓ６タグ、（ｄ）構造的な柔軟なリンカー、（ｅ）アミノ酸をそれぞれ５個および９個含む２つのランダム化ループを有するグルマリンコア、（ｆ）構造的な柔軟なリンカーおよび（ｇ）ピューロマイシン受容体分子との効率的なカップリングのための最適化されたリンカー。Ｂ）グルマリンＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリの構築は下記の反応を含む多段階工程である：ＰＣＲ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ＲＮＡのピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーとの化学的ライゲーション、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳、オリゴｄＴ精製、逆転写およびＨｉｓタグ精製。
【図２−１】ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）選択サイクルの略図。
【図２−２】グルマリンＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ライブラリを用いて実施した、固定化ＰＴに対する連続した６回の選択を示す（表１）。
【図３】ＰＴに対する結合活性を試験すべき選択されたグルマリン変異体。保存された配列モチーフが色付き囲みで強調表示されている。
【図４】ＰＴに対する第４回のグルマリン選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域およびグルマリン足場の定常領域が強調表示されている。ランダム化ループ１および２の位置が示されている。
【図５】ＰＴ（エポキシ）に対する第５ａ回のグルマリン選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域およびグルマリン足場の定常領域が強調表示されている。ランダム化ループ１および２の位置が示されている。
【図６】ＰＴ（ｓｔｒｅｐ）に対する第５ｂ回のグルマリン選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域およびグルマリン足場の定常領域が強調表示されている。ランダム化ループ１および２の位置が示されている。
【図７】ＰＴ（ｓｔｒｅｐ）に対する第６ａ回のグルマリン選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域およびグルマリン足場の定常領域が強調表示されている。ランダム化ループ１および２の位置が示されている。
【図８−１】ＰＴ（ｓｔｒｅｐ）に対する第６ｂ回のグルマリン選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域およびグルマリン足場の定常領域が強調表示されている。ランダム化ループ１および２の位置が示されている。
【図８−２】ＰＰ２６ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ライブラリについて実施した、固定化ＰＴに対する連続６回の選択を示す（表２）。
【図９】ＰＴに対する結合活性を試験すべき選択されたＰＰ２６変異体。保存された配列モチーフが強調表示されている。
【図１０】ＰＴに対する第４回のＰＰ２６選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域が強調表示されている。
【図１１】ＰＴ（エポキシ）に対する第５ａ回のＰＰ２６選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域を淡黄色囲みで示す。保存された配列モチーフが強調表示されている。
【図１２】ＰＴ（ｓｔｒｅｐ）に対する第５ｂ回のＰＰ２６選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域を淡黄色囲みで示す。保存された配列モチーフが強調表示されている。
【図１３】ＰＴに対する第６ａ回のＰＰ２６選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域を淡黄色囲みで示す。保存された配列モチーフが強調表示されている。
【図１４】ＰＴに対する第６ｂ回のＰＰ２６選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域が強調表示されている。
【図１５】合成ビオチン化コアペプチドのストレプトアビジンセファロースへの固定化および精製ＰＴとの結合の確認。ＰＴの非結合画分を、結合後の上清の１／４０容の１２％ＮｕＰａｇｅゲルでのＭＥＳ泳動緩衝液を用いた分離によって分析した（上側ゲル）。セファロースに結合したＰＴを分析するため、溶出液の５０％を１２％ＮｕＰａｇｅゲルでＭＥＳ泳動緩衝液を用いて分離した（下側ゲル）。検出は銀染色によって実施した。グルマリンペプチド１５および９を除いて、規定量の精製ＰＴを定量の標準として使用した。
【図１６】試料Ａ（左側ゲル）および試料Ｂ（右側ゲル）からのＰＴの精製。セファロースに結合したＰＴを分析するため、溶出液の５０％を１２％ＮｕＰａｇｅゲルでＭＥＳ泳動緩衝液を用いて分離した（下側ゲル）。検出は銀染色によって実施した。グルマリンペプチド９を除いて、規定量の精製ＰＴを定量の標準として使用した。
【図１７】試料ＡまたはＢから固定化ペプチドｐｐ２６クローン９および１５およびグルマリンクローン９および１５に結合したＰＴの洗浄条件の、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５または５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６の洗浄３回を用いた最適化。ＰＴを１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲルで分析しおよび銀染色によって可視化した。ＰＰＭ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｅｒｆｅｃｔマーカー。
【図１８】試料Ｂから固定化ペプチドｐｐ２６クローン９に結合したＰＴの洗浄条件の、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５または５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６の洗浄３〜２０回を用いた最適化。を１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲルで分析しおよび銀染色によって可視化した。
【図１９】ペプチドストレプトアビジンセファロースからの、０．２から２．０Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌを用いたＰＴの溶出。ペプチドに結合したＰＴをペプチド−ストレプトアビジンセファロースから、表示の溶出緩衝液（各２０μｌ）での３回連続洗浄によって置換した。残存物質を続いてゲル装填緩衝液で溶出した。全ての溶出液を１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（１×ＭＥＳ泳動緩衝液）で分析しおよび銀染色によって可視化した。
【図２０】酸性（５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５）または塩基性（１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５）条件下でのペプチドストレプトアビジンセファロースからのＰＴの溶出。ペプチドに結合したＰＴをペプチドストレプトアビジンセファロース（１種類のペプチド２００ｐｍｏｌまでを含む２０μｌ）から、表示の溶出緩衝液（各４０μｌ）での３回連続洗浄によって置換した。残存物質を続いてゲル装填緩衝液で溶出した。全ての溶出液を１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（１×ＭＥＳ泳動緩衝液）で分析しおよび銀染色によって可視化した。ペプチドストレプトアビジンセファロースの試料Ａとのインキュベート後の素通り画分の１／４０容を、各ペプチドについて同一ゲルで分析した。
【図２１】アフィニティリガンドとして固定化ｐｐ２６ペプチド９を有するストレプトアビジンセファロースでの、試料ＢからのＰＴの小スケールカラム精製（Ａ）、精製ＰＴの収量のゲル推定（Ｂ）。
【図２２】アフィニティリガンドとしてグルマリンペプチド１５を有するストレプトアビジンセファロースでの、試料ＢからのＰＴの小スケールカラム精製（Ａ）、精製ＰＴの収量のゲル推定（Ｂ）。
【図２３】ストレプトアビジンセファロース（１ｍｌ当たり）への固定化に用いられたさまざまな量のペプチド（表示の通り）に依存する、ペプチドストレプトアビジンセファロースへのＰＴ結合。結合したＰＴの量は、同一ゲル上の規定量の精製ＰＴとの直接比較によって定量した。例として、ｐｐ２６／９を、ｍｌ当たりのストレプトアビジンセファロースに固定化に用いたペプチドの量に対してプロットする。最高の結合はＰＴ約１００〜１５０ｐｍｏｌで生じると推定された。
【図２４】ペプチドストレプトアビジンセファロース１μｌ当たり、または６．８５ＲＩアシアロフェチュインセファロース６．８５μｌ当たりの、さまざまな量のインプット材料（試料Ｂ）の関数としてのＰＴ収量。溶出したＰＴの量は同一ゲル上の規定量の精製ＰＴとの直接比較を基礎として計算し、および表１２に列記する。
【図２５】繰り返しＰＴ結合および溶出のためのペプチドセファロース再使用。ストレプトアビジンセファロースに結合したＰＴを、１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５を用いて４回溶出し、およびカラムマトリクスを１０ｍＭＨＣｌで再生した。
【図２６】試料Ｂからのｐｐ２６／９ペプチドストレプトアビジンセファロース（０．５ｍｌ）でのＦＰＬＣカラム精製後のＰＴ溶出画分。溶出画分（溶出液各５００μｌのうち０．５μｌ）をＰＡＧＥ（１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル、ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色によって分析した。規定量の精製ＰＴを直接比較のために同一ゲル上で分離した。ＰＴの濃度は溶出画分の２８０ｎｍでの吸収（Ａ２８０）を測定することによって測定し、および精製ＰＴ標準と比較した（表参照）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、百日咳毒素（ＰＴ）を精製するための新規な方法のための試薬および方法論を提供する。上記の通り、１つのそのような方法はＢｏｇｄａｎ，ｅｔ ａｌ．によって示されている。その方法では、ファージディスプレイがＰＴ結合ペプチドを特定するために利用されている。本発明を実施する上で、ＰＴは、自然に発現されたＰＴ、無毒化ＰＴ（遺伝子組換えによりまたはその他）、天然またはその他のＰＴ変異体、組換えＰＴ、ＰＴ断片、または他の種類のＰＴを含む（例えば、米国特許第６，３９９，０７６号；第６，１６８，９２８号；第６，０１８，０２２号；第５，９７７，３０４号；第５，９６５，３８５号；第５，８５６，１２２号；第５，８７７，２９８号；第５，４３３，９４５号；第５，３５８，８６８号；第５，３３２，５８３号；第５，２４４，６５７号；第５，２２１，６１８号；第５，０８５，８６２号；第４，９９７，９１５号明細書を参照）。ほとんどの場合において、ＰＴの精製後に化学的無毒化が実施される。任意の形態のＰＴが、本明細書に記載の試薬がその特定の形態のＰＴを結合させる能力を有する限り、本発明の実施における使用に適している。本明細書中では、全ての引用文献、特許、および出願特許は参照により本開示に含まれる。
【００１０】
本発明はまた、ＰＴ−結合ペプチドを同定するための組換え技術の使用に関する。本発明は、当業界で既に公知である方法を越える効果をもたらす。加えて、ＰＴの精製に有用である新規なペプチドを提供する。一実施形態では、ペプチド受容体に結合した核酸逆転写プライマーをＲＮＡに結合させ、そのＲＮＡを翻訳してタンパク質産物がプライマーに共有結合しているようにペプチド産物を生じさせ、ＲＮＡを逆転写してＤＮＡ−タンパク質融合物を生じさせ、さらに融合産物を試験してＰＴ結合ペプチドを含む産物を同定することによって、ＤＮＡ−タンパク質融合物を作製する方法を提供する。その後、ペプチドの配列を配列決定によって同定する。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ ＨといったＲＮＡ分解化合物を用いた処理によって、ＲＮＡ部分を複合体から除去することができる。光架橋試薬およびペプチド受容体もまた本発明の実施に有用である。この系および関係する試薬は他では例えば、米国特許第６，４１６，９５０号（Ｌｏｈｓｅ，ｅｔ ａｌ）；第６，４２９，３００号（Ｋｕｒｚ，ｅｔ ａｌ．）；第６，４３６，６６５号（Ｋｕｉｍｅｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．）；第６，６０２，６８５号（Ｌｏｈｓｅ，ｅｔ ａｌ）；および，第６，６２３，９２６号明細書（Ｌｏｈｓｅ，ｅｔ ａｌ）に記載されている。
本発明の実施において、核酸、ペプチド、融合、リガンド、アフィニティ複合体などの試薬は、拡散しないように固相担体に結合または付着させてもよい。拡散しないように結合または接着させるために、試薬が液体の存在下で試薬の高濃度の領域から試薬の低濃度の領域へ移動しないように試薬を固相担体と化学的または物理的に結合させる。固相担体は任意のカラム（すなわち、非充填または充填クロマトグラフィー媒体、カラム材料）、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、固相粒子（すなわち、アガロースまたはセファロース）、マイクロチップ（すなわち、シリコン、シリコンガラス、または金チップ）、膜（すなわち、リポソームまたは小胞の膜）、あるいは、直接的または間接的に（例えば、抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、ビオチンといった他の結合パートナー媒介物を介して）試薬を結合または付着させることができる他の媒体である。
【００１１】
好ましい実施形態では、試薬はＰＴを結合させる能力を有する物質または化合物である。より好ましくは、試薬はＰＴを可逆的に結合させる能力を有する物質または化合物である。さらにより好ましくは、試薬は、ＰＴ以外の成分を含む液体中で、ＰＴを少なくとも結合させ、さらに好ましくは可逆的に結合させる能力を有するペプチドである。ＰＴを可逆的に結合させる試薬は、一定の条件下でＰＴを結合（吸着）させ、さらに別の条件下でＰＴを遊離（脱離）させるものである。例えば、その試薬は、中性ｐＨ条件に曝露されたときにＰＴを結合させ、かつ酸性または塩基性ｐＨの条件への曝露の後ＰＴを遊離させることができる。従って、試薬がＰＴを結合させる能力（すなわち、平衡解離定数またはＫｄ）は、試薬をＰＴと接触させる条件を変化させることによって操作することができる。本分野で公知な他の条件でも特に、温度、イオン強度（すなわち、例えば塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムといったイオン塩の濃度）、溶媒濃度、競合試薬／遊離リガンド／アナログの存在または不在、イオン化特性などの、他の条件を変化させてもよい。
【００１２】
一部の実施形態では、アフィニティマトリクス（すなわち、固相担体に結合したＰＴ結合ペプチド）を利用して目的成分（すなわち、ＰＴ）を生物学的液体またはその他の液体中に見出される複雑な混合物から分離する。一部の場合には、（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定して）ＰＴが液体中の主成分を構成しない細菌溶解物またはその他の組成物といった複雑な生物学的液体からＰＴを精製することが好ましい場合がある。別の場合には、ＰＴは、液体中の成分の大半がＰＴで表されるようにＰＴについて部分精製された組成物（ＰＴ約５０％以上から成る組成物）から単離してもよい。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定してＰＴが組成物中の総タンパク質の約５０％以上から成る組成物は、殆どの状況下で、部分精製されていると考えられる。
【００１３】
ＰＴを精製するために、ＰＴを含む組成物を、固相担体に結合しているＰＴ結合試薬、好ましくは可逆的に結合させるＰＴ結合試薬と、ＰＴとＰＴ結合試薬とが互いに結合して複合体を形成するように十分な時間接触させる。次に非ＰＴ成分を洗浄除去する。その後、ＰＴ−ＰＴ結合試薬の結合のＫｄが増大するように１つ以上の条件（すなわち、ｐＨ）を変化させ、ＰＴが複合体から遊離される。次に、遊離されたＰＴを回収し、さらなる使用のために調製する。そのような分離はアフィニティ精製と称され、そのように精製された産物はアフィニティ精製されていると称される。
【００１４】
アフィニティ精製法よりも選択性が低いと当業者に一般的に考えられているクロマトグラフィー法もまた、本発明の実施に用いることができる。本分野で公知であるように、そのような方法は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。これらの方法のうちの任意のもの（アフィニティ精製を含む）は、例えば低圧クロマトグラフィー（ＬＰＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはFast Protein liquid Chromatography（ＦＰＬＣ）に設置した適当な固相担体を用いて実施できる。そのような方法を実施するための適当な固相担体および装置は本分野で広く利用可能である。本発明の実施において、アフィニティクロマトグラフィーおよびより一般化された方法の両方を必要に応じて組み合わせて、開始材料（すなわち、細菌溶解物といった複雑な生物学的液体）を部分精製したり、材料を精製したり、あるいはアフィニティ精製または他の方法で精製された材料（すなわち、アフィニティ精製ＰＴ）をさらに精製することができる。
【００１５】
ＰＴを結合させるペプチドが同定されており、本明細書で開示されている。ある種のペプチドは高い親和性でＰＴを結合させることが分かっている。そのような好ましいＰＴ結合ペプチドとして、下記のペプチドが挙げられる：
ＲＳＳＨＣＲＨＲＮＣＨＴＩＴＲＧＮＭＲＩＥＴＰＮＮＩＲＫＤＡ （ｐｐ２６−５）；
ＳＴＭＮＴＮＲＭＤＩＱＲＬＭＴＮＨＶＫＲＤＳＳＰＧＳＩＤＡ （ｐｐ２６−６）；
ＲＳＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤＤＡ （ｐｐ２６−９）；
ＲＳＷＲＤＴＲＫＬＨＭＲＨＹＦＰＬＡＩＤＳＹＷＤＨＴＬＲＤＡ （ｐｐ２６−１５）；
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＡＲＷＤＬＶＣＣＥＰＬＥＣＩＹＴＳＥＬＹＡＴＣＧ （Ｇ−９）；
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＥＬＡＶＤＥＣＣＥＰＬＥＣＦＱＭＧＨＧＦＫＲＣＧ （Ｇ−１０）
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＳＱＳＶＰＭＣＣＥＰＬＥＣＫＷＦＮＥＮＹＧＩＣＧＳ （Ｇ−１５）； および、
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＥＬＡＩＤＥＣＣＥＰＬＥＣＴＫＧＤＬＧＦＲＫＣＧ （Ｇ−１９）。
これらのうち、特に好ましいペプチドは下記を含む：
ＲＳＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤＤＡ （ｐｐ２６−９）； および、
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＳＱＳＶＰＭＣＣＥＰＬＥＣＫＷＦＮＥＮＹＧＩＣＧＳ （Ｇ−１５）。
例えば、ペプチドの少なくとも１つの特徴または活性（すなわち、活性、抗原性）を有する、例えば、断片、変異体オルソログ、ホモログ、および誘導体といった関連ペプチドもさらに考慮される。断片は、ペプチドの配列（すなわち、核酸またはポリペプチド）の、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有しない）および／またはカルボキシ末端での切断を含む。断片はまた、変異体、オルソログ、ホモログ、および親配列と比較して１つ以上のアミノ酸付加または置換または内部欠失を有する他の変異体を含む。好ましい実施形態では、切断および／または欠失は、アミノ酸約１１個、アミノ酸２個、アミノ酸５個、アミノ酸１０個、アミノ酸２０個、アミノ酸３０個、アミノ酸４０個、アミノ酸５０個、またはそれ以上を含む。変異体とは、親配列と比較して１つ以上の配列の置換、欠失および／または付加を有する配列である。変異体は、天然に存在するかまたは人工的に構築できる。そのような変異体は、対応する核酸分子から調製できる。好ましい実施形態では、変異体は、１から３、または１から５、または１から１０、または１から１５、または１から２０、または１から２５、または１から３０、または１から４０、または１から５０、または５０を超えるアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を有する。
【００１６】
置換は、保存的、または非保存的、またはその任意の組み合わせであってよい。ポリペプチドの配列への保存的アミノ酸修飾（およびそれをコードするヌクレオチドへの対応する修飾）は、親ポリペプチドと同様の機能的および化学的特徴を有するポリペプチドを生じ得る。例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性、または親水性に対して影響がほとんどまたはまったく無い、および特に免疫原性の低下を結果として生じないような、天然アミノ酸残基の非天然残基での置換を含む。適当な保存的アミノ酸置換を表Ｉに示す：
ＰＴのような成分は、もともと共存しているタンパク質、脂質、糖質、または他の材料（すなわち、細菌溶解物）の少なくとも約５０％から分離されている場合に、精製されていると称される。成分は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して組成物の総タンパク質含量の少なくとも約９５〜１００％、９０〜９５％、８０〜９０％、７０〜８０％、６０〜７０％または５０〜６０％から分離されていることが好ましい。一部の実施形態では、精製成分とは、その成分が単独でまたは他の物質と組み合わせて投与された宿主において免疫反応を誘導するのに有用なものである。免疫反応は、例えば、ＰＴまたは百日咳菌の少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の産生および／またはＰＴを発現する細胞に対する細胞性免疫反応の誘導を含むであろう。免疫反応は、例えば、抗体産生の増加、抗原に対するより高い親和性を有する抗体の産生、または細胞性反応の増大（すなわち、Ｔ細胞の増加）を生じることによる、現在の免疫反応の増進である。免疫反応の他の指標は本分野で公知であり、免疫反応が生じているかどうかを判定するのに適している。
【００１７】
本明細書に記載の方法を用いて単離されたＰＴは、医薬組成物として調製することができる。好ましい医薬組成物は、例えば、懸濁剤、シロップ剤、またはエリキシル剤といった液体調製物中にＰＴを含む。好ましい注射用調製物は、例えば、滅菌懸濁剤または乳剤といった、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与に適したペプチドを含む。例えば、ＰＴは、滅菌水、生理食塩水、グルコースなどといった、適当なキャリヤー、希釈剤、または添加物と混合した組成物として調製することができる。組成物はまた、例えば、等張水性生理食塩水緩衝液中での再構成のための凍結乾燥形で提供してもよい。そのような組成物はまた、例えば、米国特許第５，８７７，２９８号および第６，３９９，０７６号明細書（Ｖｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．）および国際出願番号第ＰＣＴ／ＣＡ９６／００２７８号に記載のようなワクチンとして調製および利用することができる。本明細書に記載のように調製されたＰＴはまた、本分野で公知である他のものの中でも特に、コリネバクテリウム（すなわち、ジフテリア）、クロストリジウム（すなわち、破傷風）、ポリオウイルス（すなわち、ＩＰＶ、ＯＰＶ）、肝炎ウイルス、ナイセリア（すなわち、髄膜炎菌）、ストレプトコッカス、ヘモフィルス、または他の百日咳抗原（すなわち、繊維状赤血球凝集素、パータクチン、および凝集原）といった疾患の原因となる生物に由来する他の抗原と組み合わせてもよい。
【００１８】
本発明およびその多数の利点は、例示として示される下記の実施例からより詳細に理解できるであろう。
【実施例】
【００１９】
材料および方法
Ａ．百日咳毒素（ＰＴ）
ＰＴはＭＷ１０９ｋＤのヘテロオリゴマータンパク質複合体である（６個のサブユニットＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４×２、Ｓ５から成る）。硫酸アンモニウム沈澱物として調製された高純度（＞９９．９９％）調製物を使用した。天然の六量体複合体を認識するＰＴ特異的リガンド（アシアロフェチュイン）もまた使用した。アシアロフェチュインは可溶化型およびセファロース固定化型で入手可能である。
【００２０】
Ｂ．グマリンライブラリ選択
グルマリンは、ガガイモ科のつる性植物Ｇｙｍｎｅａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｅに由来する３５残基のポリペプチドである。グルマリンは、ラットにおいて甘味物質に対する神経反応を選択的に阻害する能力のため、甘味伝達の研究における薬理学的手段として利用されている。グルマリンはヒトにおいて明らかな作用を持たない。グルマリンの味覚抑制は、甘味受容体に直接結合するかまたは甘味伝達系の下流標的と相互作用することによって、そのペプチドが原因となり得ることが示唆されている（１）。
【００２１】
グルマリンは、通常４０残基未満の長さの構造的に関連するタンパク質の群である「ノッチン(knottins)」ファミリーに属する。ノッチンはタンパク質、糖質および脂質を含む幅広い分子標的に結合するが、しかし小さい三重鎖逆平行βシートおよびジスルフィド結合骨格を含む共通の足場(scaffold)を共有する（２，３）。
下記の通り、１５個のランダム化されたアミノ酸位置を有する特殊なグルマリンライブラリを設計した：
野生型グマリン：ｑｑＣＶＫＫＤＥＬＣＩＰＹＹＬＤＣＣＥＰＬＥＣＫＫＶＮＷＷＤＨＫＣｉｇ
グマリンコア：ＣＶＫＫＤＥＬＣＸＸＸＸＸＸＣＣＥＰＬＥＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ
グマリンコア配列中で、Ｘは任意のアミノ酸を表す。このライブラリは、タンパク質標的に対する高親和性結合物質(binder)をもたらすことが確認された。グルマリンライブラリは、少なくとも下記の理由のために、ＰＴ毒素に対する選択のための最良の選択肢となる一連の利点を併せ持つ：制限された自由度(flexibility)：標的トポロジーへの適合における高エントロピーコストを埋め合わせる；リニアライブラリよりも理論的に少数のアミノ酸で高い親和性；プロテアーゼに対する耐性；および下流用途における酸化還元溶出条件に対する感受性。グルマリンライブラリは図１に示す工程を用いて構築された。
【００２２】
１．開始オリゴヌクレオチドのＰＣＲ
３種類のゲル精製オリゴを用いて、２つのランダム化ループを有するグルマリンライブラリを構築した。１ｎｍｏｌのグルマリンテンプレート（≒約６×１０１４配列）５'−ＡＧＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＡＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＴＧＣ ＧＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＧＴ ＴＣＴ ＧＧＧ ＴＣＴ ＡＧＣ−３'を、１μＭの５'−Ｈｉｓタグプライマー５'−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＡ ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＴＡ ＴＴＴ ＡＣＡ ＡＴＴ ＡＣＡ ＡＴＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＡＧＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＡ−３'および１μＭの３'−プライマー５'−ＴＴＴ ＴＡＡ ＡＴＡ ＧＣＧ ＧＡＴ ＧＣＴ ＡＣＴ ＡＧＧ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＴ−３'を使用して、Ｔａｑ−ポリメラーゼを用いて、６回のＰＣＲ（９４℃で１分間；６５℃で１分間；７２℃で１分間）で増幅し、さらに２％アガロースゲルで分析し、ゲルは代表的ライブラリが構築されていたことを示した。
【００２３】
２．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ｄｓＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＲｉｂｏＭａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットを用いてＲＮＡに転写した。３７℃で４５分間インキュベート後、ＤＮａｓｅＩを添加し、さらに３７℃でインキュベートをさらに１５分間続けた。この混合物にフェノール／クロロホルム抽出を施した。過剰のＮＴＰは、ＮＡＰ−５ゲルろ過（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって除去した。ＲＮＡを６％−ＴＢＵ−ゲルで分析し、ｄｓＤＮＡが効率的に転写されたことが示唆された。
【００２４】
３．ＲＮＡとピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーとの化学カップリング
精製ＲＮＡを、１．５倍過剰のピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーＰＥＧ２Ａ１８：５'−ソラレン−ＵＡＧ ＣＧＧ ＡＵＧ Ｃ Ａ１８ （ＰＥＧ−９）２ ＣＣ ピューロマイシン （斜体で示されるヌクレオチドは２'−Ｏ−メチル−誘導体を表す）にアニーリングさせる（８５℃で１分間、０．３℃／秒のペースで２５℃まで冷却）。共有結合カップリングは、室温で（ＲＴ）１５分間、ＵＶ光（３６５ｎｍ）照射によって実施した。反応産物を６％−ＴＢＵゲルで分析し、結合反応が効率的に進んだことが示唆された。
【００２５】
４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳
ライゲーションしたＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のウサギ網状赤血球溶解物を用いて１５μＣｉ３５Ｓ−メチオニン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で翻訳した。３０℃で３０分間インキュベートした後、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２をそれぞれ終濃度５３０ｍＭおよび１５０ｍＭになるように添加し、さらに試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ゲルは翻訳反応が成功したことを示唆した。
【００２６】
５．オリゴｄＴ精製
分子（ｍＲＮＡ−タンパク質融合物）を、オリゴｄＴ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含むインキュベート緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と共に４℃で５分間インキュベートすることによって単離した。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）分子は、ＭｉｎｉＭＡＣＳ−カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を介したろ過、インキュベート緩衝液での洗浄および水での溶出によって単離した。試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、反応が成功したことが示唆された。
【００２７】
６．逆転写
対応するｃＤＮＡ鎖は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いた逆転写によって取扱説明書の条件下で、５倍過剰の３'−プライマーを用いて作製した。試料を４〜２０％ Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、反応が成功したことが示唆された。
【００２８】
７．Ｈｉｓタグ精製
逆転写されたＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）分子を、Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロース（５０μｌ／１０ｐｍｏｌ ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ）（ＱＩＡＧＥＮ）を含むＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００μｇ／ｍｌ断片化サケ精子ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）と混合し、さらに室温で６０分間緩やかに振とうさせながらインキュベートした。次に、Ｎｉ−ＮＴＡをろ過し、ＨＢＳ／５ｍＭイミダゾールで洗浄し、さらにＰＲＯｆｕｓｉｏｎをＨＢＳ／１５０ｍＭイミダゾールで溶出した。試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、精製が成功したことが示唆された。２０ｐｍｏｌ（≒約１×１０１３種の配列）の分子を、各選択についてインプット（投入）として用いる。
【００２９】
Ｂ．選択用リニアペプチドライブラリＰＰ２６
下記の構造を用いて、２６個のランダム化されたアミノ酸位置を有する特殊なリニアペプチドライブラリＰＰ２６を設計した：
Ｔ７−ＴＭＶ−ＭＧＲＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−ＡＲＳ−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−ＤＡＮＡＰＫ−ＡＳＡＩ
タンパク質部分の配列（長さ５０アミノ酸）は１文字アミノ酸コードで示され、ここでＸは任意のアミノ酸を表す。ライブラリの翻訳されない部分は下記を含む：（ａ）Ｔ７：ライブラリの最適なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７プロモーター；および（ｂ）ＴＭＶ：ライブラリの完全なｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のためのタバコモザイクウイルス翻訳開始配列。ＭＧＲＧＳは構造的な柔軟なリンカーを表す。ＨＨＨＨＨＨはＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリの効率的なアフィニティ精製のためのＨｉｓタグを表す。ＡＲＳは第二の構造的な柔軟なリンカー(structural, flexible linker)を表す。ＤＡＮＡＰＫは第三の構造的な柔軟なリンカーを表す。ＡＳＡＩはピューロマイシン受容体分子との効率的なカップリングのために最適化されたリンカーを表す。
【００３０】
このライブラリは、タンパク質標的に対する高親和性結合物質をもたらすことが確認された。ＰＰ２６ライブラリは、クロマトグラフィーアフィニティ試薬の選択に関して優れた選択肢となる２つの主な長所を併せ持つ：高い自由度：標的のトポロジーに適合できる；および保存構造の不在による頑健性、結果として生じる結合物質は厳しい生物物理学的条件に耐性である。
【００３１】
１．開始オリゴヌクレオチドのＰＣＲ
３種類のゲル精製オリゴを用いて、２つのランダム化ループを有するグルマリンライブラリを構築した。１ｎｍｏｌのＰＰ２６ テンプレート（≒約６×１０１４種の配列）５'−ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＣ ＣＴＴ ＣＧＧ ＡＧＣ ＧＴＴ ＡＧＣ ＧＴＣ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ Ａ−３'を、１μＭの５'−Ｈｉｓタグプライマー５'−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＴＡＧ ＧＧＡ ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＴＡ ＴＴＴ ＡＣＡ ＡＴＴ ＡＣＡ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＧＣＴ ＡＧＡ ＴＣＴ −３'および１μＭの３'−プライマー５'−ＡＡ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＣ ＣＴＴ ＣＧＧ ＡＧＣ ＧＴＴ ＡＧＣ −３'を使用して、６回のＰＣＲ（９４℃１分間；６５℃１分間；７２℃１分間）でＴａｑ−ポリメラーゼを用いて増幅し、さらに２％アガロースゲルで分析した。
【００３２】
２．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ｄｓＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＲｉｂｏＭａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットを用いてＲＮＡに転写した。３７℃で４５分間インキュベートした後、ＤＮａｓｅＩを添加し、さらに３７℃でインキュベートをさらに１５分間続けた。この混合物にフェノール／クロロホルム抽出を施した。過剰のＮＴＰを、ＮＡＰ−５ゲルろ過（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって除去した。ＲＮＡの転写を、６％−ＴＢＵ−ゲルでの分析によって確認した。
【００３３】
３．ＲＮＡおよびピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーの化学カップリング
精製ＲＮＡを、１．５倍過剰のピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーＰＥＧ２Ａ１８：５'−ソラレン−ＵＡＧ ＣＧＧ ＡＵＧ Ｃ Ａ１８ （ＰＥＧ−９）２ ＣＣ ピューロマイシン（斜体で示されるヌクレオチドは２'−Ｏ−メチル−誘導体を表す）とアニーリングさせた（８５℃で１分間、０．３℃／秒のペースで２５℃まで冷却）。共有カップリングは、室温（ＲＴ）で１５分間ＵＶ光（３６５ｎｍ）照射によって実施した。反応を６％−ＴＢＵ−ゲルでの反応産物の分析によって確認した。
【００３４】
４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳
ライゲーションしたＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のウサギ網状赤血球溶解物を用いて、１５μＣｉ３５Ｓ−メチオニン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で翻訳した。３０℃で３０分間インキュベートした後、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２をそれぞれ終濃度５３０ｍＭおよび１５０ｍＭになるように添加し、さらに翻訳を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析によって確認した。
【００３５】
５．オリゴｄＴ精製
分子（ｍＲＮＡ−タンパク質融合物）を、オリゴｄＴ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含むインキュベート緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と共に４℃で５分間インキュベートすることによって単離した。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）分子は、ＭｉｎｉＭＡＣＳ−カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を介したろ過、インキュベート緩衝液での洗浄および水での溶出によって単離した。反応を確認するために、試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００３６】
６．逆転写
対応するｃＤＮＡ鎖は、取扱説明書の条件下で、５倍過剰の３'−プライマーを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いた逆転写によって作製した。転写を確認するために、試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００３７】
７．Ｈｉｓタグ精製
逆転写されたＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）分子を、Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロース（５０μｌ／１０ｐｍｏｌ ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ）（ＱＩＡＧＥＮ）を含むＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００μｇ／ｍｌ断片化サケ精子ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）と混合し、さらに室温で６０分間緩やかに振とうさせながらインキュベートした。次に、Ｎｉ−ＮＴＡをろ過し、ＨＢＳ／５ｍＭイミダゾールで洗浄し、さらにＰＲＯｆｕｓｉｏｎをＨＢＳ／１５０ｍＭイミダゾールで溶出した。反応を確認するために、試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。２０ｐｍｏｌ（≒約１×１０１３種の配列）の分子を、各選択についてインプット（投入）として用いる。
【００３８】
Ｃ．標的調製
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）技術では、最大１０１３種の異なるＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子（ｍＲＮＡ−タンパク質融合物）から成る高度に多様な物質ライブラリが、高アフィニティ結合に関して所望の標的（タンパク質、糖質または脂質）に対して選択される。この工程で、標的は通常、固相に固定化される。これらの固相は好ましくは、選択処理中の迅速および効率的な取り扱いを可能にしさらに低バックグラウンドをもたらす磁気ビーズである。
【００３９】
１．ヌクレアーゼ活性に関して標的を試験
標的（５μｇのＰＲＰおよび０．５μｇのＰＴ）を、０．１２ｐｍｏｌの放射性標識化ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリ分子とそれぞれ４℃および室温（ＲＴ）で接触させ、次いで１時間および１６時間インキュベートした。インキュベート後の分子の完全性は、４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くオートラジオグラフィーによって確認した。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子の分解は検出されず、従って標的はヌクレアーゼを含まないことが実証された。
【００４０】
２．プロテアーゼ活性に関して標的を試験
標的（５μｇのＰＲＰおよび０．５μｇのＰＴ）を、１μｇの精製ＧＳＴ−タンパク質とそれぞれ４℃および室温で接触させ、次いで１時間および１６時間インキュベートした。インキュベート後のＧＳＴ−タンパク質の完全性は、４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くクマシーブリリアントブルー染色によって分析した。ＧＳＴ−タンパク質分子の分解は検出されず、従って標的はプロテアーゼを含まないことが実証された。
【００４１】
Ｄ．ＰＴの固定化
１．ＰＴの再構成
Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ社から入手した沈澱物５００μｌ（２．２６ｍｇ／ｍｌ）を２１．４００ｘｇで室温にて４５分間遠心分離した。上清を廃棄し；沈澱を１１００μｌのＣＴＷ緩衝液（０．２８６ｇ ＮａＨＣＯ３、０．１７０ ｇ Ｎａ２ＣＯ３、５０μｌ Ｔｗｅｅｎ−８０、５０ ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏに加える）に溶解させた。このＰＴ調製物の品質を検査するため、一連の希釈物（２５０ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、２．５μｇ、５μｇおよび１５μｇ）を、ＭＥＳ緩衝液で泳動する４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。少なくとも４本のバンドが明瞭に分離でき、サブユニットＳ１（２８ｋＤ）、Ｓ２（２３ｋＤ）、Ｓ３（２２ｋＤ）およびＳ４（１１．７ｋＤ）に対応した。ＰＴ−複合体中の最小のタンパク質５（９．３ｋＤ）は見られなかった。おそらく、このバンドはこのゲルシステム中で、わずかだけ大きいＳ４サブユニットと共に移動する。
【００４２】
２．カップリング戦略
磁気粒子へのタンパク質の固定化のためのいくつかの方法が確立された。原理的に二つの主な戦略が用いられる：標的タンパク質の一級アミン基およびスルフヒドリル基をエポキシ活性化磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）に共有結合でつなぎ、安定なアミド結合またはチオエーテル結合を形成する。この反応は、反応を促進するため硫酸アンモニウムの存在下で実施され、さらに通常、標的タンパク質の非常に効率的なカップリングを結果として生じる。いずれにしろ、ある種のタンパク質はこれらの条件下で構造変化を受けるように思われ、結合しているが天然でないおよび／または不活性な立体構造を結果として生じる；さらに、標的タンパク質の一級アミノ基およびスルフヒドリル基を、ＮＨＳエステル活性化ビオチン誘導体（Ｐｉｅｒｃｅ）に共有結合によってつなぎ、その後、ビオチン化されたタンパク質をストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）に固定化させる。
【００４３】
通常、所定の標的に反応条件が適している場合は、エポキシビーズへの標的タンパク質のカップリングが好ましく、それはビーズ上に標的だけが提示されることをこの方法が確実にするからである。ビオチン／ストレプトアビジンカップリングの場合は、ビーズはストレプトアビジンも提示し、選択中に抗ストレプトアビジン結合物質の濃縮をもたらし得る。従って、Ｐｈｙｌｏｓは、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリからストレプトアビジン結合物質を予め除いて、所定の標的について高品質の結果を得るための特化した方法を確立している。しかし全体として、共有結合カップリングは通常、標的特異的結合物質のより迅速な濃縮を結果として生じる。具体的にＰＴの場合には、硫酸アンモニウムインキュベートはＰＴ−タンパク質の機能に影響しないことが知られているため、共有結合カップリング戦略で開始するのが非常に合理的である。
【００４４】
３．エポキシビーズ（Ｄｙｎａｌ）へのカップリング条件の最適化
ＰＴのためのカップリング条件をいくつかの独立した実験で最適化した（様々な硫酸アンモニウム濃度（０．５〜２．０Ｍ）および様々なビーズ／標的比、ならびに時間および温度依存性（２分間〜１６時間；８℃〜ＲＴ）を用いて）。下記の反応条件で最良の結果が観察された：ＰＴ１００μｇ、ビーズ３．３×１０８個および硫酸アンモニウム終濃度１Ｍから成る終容量３００μｌを室温で２分間から６０分間２ｍｌエッペンドルフチューブ中でインキュベートした。インキュベート後、チューブを磁石中に４分間置いてビーズを落とし、さらに上清を続くゲル分析のために保存した。ビーズを１ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）で１回洗浄し、さらにビーズの一部（ビーズの５％）を４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、結合したタンパク質の量を測定した。ＰＴのエポキシビーズへのカップリングは、ほんの２分間の反応後でさえ非常に効率的に生じることが認められた。
【００４５】
４．エポキシビーズへのＰＴの半予備カップリング
２．６ｍｇの乾燥エポキシ活性化ビーズ（Ｍ−２７０、Ｄｙｎａｌ）（〜ビーズ１．７×１０８個）を１ｍｌリン酸緩衝液（１９ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、８１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）に再懸濁させ、さらに１０分間平衡化させた。新しいリン酸緩衝液を用いて平衡化を２回繰り返した。続いてビーズを、４８０ｐｍｏｌの再構成ＰＴ（１μｇ／μｌを含むＣＴＷ緩衝液）を含む１Ｍ硫酸アンモニウム（終容量１５７μｌ）とのカップリング反応に直接用いた。室温で１５分間連続攪拌しながらインキュベートした後、ビーズを３００μｌのＨＢＳ緩衝液で洗浄し、次いでＨＥＰＥＳ緩衝液での３回の洗浄工程を実施し、さらに最後に２４０μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁させ、小分けして４℃で保存した。カップリング反応の効率は、全ての洗浄画分、カップリング反応の上清、および洗浄したビーズからＳＤＳ装填緩衝液(loading buffer)によって除去可能なＰＴの画分の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析によって確認した。
【００４６】
５．エポキシ−ビーズ固定化ＰＴのアシアロフェチュインへの結合についての分析
４０μｌのＰＴ誘導体化ビーズを、３２０ｐｍｏｌのアシアロフェチュインを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）と室温で１時間インキュベートし（反応終容量２００μｌ）、２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液で２〜７回洗浄し、さらに最後に３０μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁させた。ビーズの５０％をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して反応を確認した。
【００４７】
４℃で１週間保存後のこれらのＰＴ誘導体化ビーズの試験は、アシアロフェチュイン結合能の低下を示し、材料が長期保存によってその性能を失うことを示した。従って、 ＰＴ誘導体化ビーズは、選択の各回について新しく調製および品質管理しなければならない。この 手順は非常に時間がかかるため、ＰＴのビオチン化を含む代替的な固定化戦略を調べた。
【００４８】
６．ＰＴの半予備ビオチン化
ビオチン化反応は、０．４ｍｇ（〜３．６５ｎｍｏｌ）の再構成ＰＴ（１μｇ／μｌを含むＣＴＷ緩衝液）を、２５μｇのＥＺ−リンカー−スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ）と、終容量７４０μｌ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中でインキュベートすることによって実施した。２時間氷上で連続攪拌しながらインキュベート後、ビオチン化反応を７４μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．０の添加によって停止した。続いて、タンパク質をＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）に対して４℃でＳｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセット（ＰＩＥＲＣＥ、３５００ ＭＷＣＯ０．５〜３ｍｌ）を用いて透析し、過剰のビオチン化試薬を除去した。ビオチン化ＰＴを透析カセットから取り出し、さらに小分けにして−２０℃で保存した。
【００４９】
７．ＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いたビオチン化ＰＴの品質管理
ビオチン化反応の品質は、ビオチン化ＰＴとＢＩＡｃｏｒｅストレプトアビジンチップとの相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＢＩＡｃｏｒｅ２０００）を用いて分析することによって管理した。チップに固定化されたビオチン化ＰＴへのアシアロフェチュインの結合を検出することもまた可能であった（固定化ＰＴへの結合シグナル〜４００ＲＵ；対照細胞への非特異的結合〜１００ＲＵ）。
【００５０】
Ｆ．ストレプトアビジン磁気ビーズおよびアシアロフェチュインへの結合についてのビオチン化ＰＴの分析
１．ストレプトアビジン磁気ビーズへのビオチン化ＰＴの結合
２０μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を、２０ｐｍｏｌのビオチン化ＰＴを含む１ｘＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、１００、μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）と室温で１時間インキュベートし、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）で３回洗浄し、さらに１６μｌのＳＤＳ−ゲル装填緩衝液に再懸濁させた。８μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して結合を確認した。同等の条件下での陰性対照実験で、遊離ＰＴ（非ビオチン化）はストレプトアビジン磁気ビーズと相互作用しなかった。
【００５１】
２．ビーズ固定化されたビオチン化ＰＴへのアシアロフェチュインの結合
２０μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を、２０ｐｍｏｌのビオチン化ＰＴを含む１ｘＨＢＳ緩衝液と室温で１時間インキュベートし、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）で４回洗浄した。続いて、ビオチン化ＰＴを担持するビーズを、４０ｐｍｏｌのアシアロフェチュインを含むＨＥＰＥＳ緩衝液と室温で１時間インキュベートした。ＨＥＰＥＳ緩衝液で４回洗浄後、ビーズを１６μｌのＳＤＳ−ゲル装填緩衝液に再懸濁させた。８μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、結合を確認した。ビオチン化ＰＴおよびアシアロフェチュインの、ストレプトアビジン磁気ビーズに対する連続インキュベートでなく同時インキュベートは、同じくアシアロフェチュインのビオチン化ＰＴへの結合を結果として生じた。同等の対照実験で、アシアロフェチュインはストレプトアビジン磁気ビーズと非特異的に相互作用しないと判定された。１週間−２０℃にて保存されていたビオチン化ＰＴを用いた同様の品質対照は、ストレプトアビジンおよび／またはアシアロフェチュイン結合能に有意な低下を示さなかった。従って、その後の選択ではビオチン化ＰＴが標準の標的として用いられた。
【００５２】
実施例２
ＰＴに対して選択的なペプチドの単離
グルマリンＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリおよび磁気ビーズに固定化されたＰＴを、精密に調節された厳しい条件下で接触させた。これらの条件は、ＰＴに対する親和性の上昇を示すＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリの変異体が標的に結合するのを可能にする。望ましくない非特異的結合変異体を希釈する多数の洗浄後、結合したＰＲＯｆｕｓｉｏｎ−分子をビーズから溶出し、さらに図２に示すように、新しいＰＲＯｆｕｓｉｏｎ形成サイクルを施す。厳しい条件を細かく適合させると共に、選択および再増幅を連続して実施することによって、所定の標的への高度に特異的な結合分子の集団が濃縮される（１０）。続いて、この集団のＤＮＡ部分をＥ．ｃｏｌｉプラスミドベクターにクローニングし、配列決定によって詳細に分析できる個々の変異体を単離する。
【００５３】
固定化ＰＴに対する連続した６回の選択を、グルマリンＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ライブラリを用いて実施した。上記の概念に従って、ストレプトアビジンビーズに固定化されたビオチン化ＰＴを、これらの選択に用いた（表１）。４回目の選択で、グルマリンプールのストレプトアビジンビーズへの低バックグラウンド結合が観察され、ビーズおよび／またはストレプトアビジン結合グルマリン変異体の濃縮開始が示唆された。従って、続く５回目の選択では、ビオチン／ストレプトアビジン固定化ＰＴをそれぞれ標的およびエポキシビーズカップリングＰＴとして用いて、２つの個別の選択を実施した。両方の選択で、標的結合の明らかなバックグラウンド修正された濃縮が観察された（表１）。この傾向は、ビオチン／ストレプトアビジン固定化ＰＴを用いた６回目の選択で確認され、ＰＴ結合変異体の蓄積を明らかに示した（表１）。
【表１】
【００５４】
Ａ．選択されたグルマリン結合物質プールのクローニング
選択回数Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の結果として得られたグルマリンＤＮＡ−プールを、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングした。グルマリンＤＮＡを、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯベクターに異なる濃度でライゲーションした。６μｌの反応に、０．５μｌ、２μｌおよび４μｌのグルマリンプールＤＮＡをそれぞれ用いた。ライゲーションは取扱説明書に従って実施した。
【００５５】
これらのライゲーション溶液２μｌで、２０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ'コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、さらに、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むＬＢ平板へ播種した。これらの形質転換させた試料のそれぞれから、１５０個の単一コロニーを、Ｔ７依存性タンパク質発現を抑制する５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むマスタープレート、およびブルーホワイトスクリーニングのためのＸ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを含む第２のプレートに採取した。形質転換のそれぞれについて、ブルーホワイト試験からのホワイトコロニーに対応する抑制マスタープレート由来のコロニー９６個を用いて９６ウェルＬＢ寒天平板および５００μｌ液体培養（５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むＬＢ）に播種した。９６ウェル寒天平板は委託配列決定に送付した。液体培養は５００μｌの４０％グリセロールと混合し、液体窒素中において凍結させさらに−８０℃で保存した。
【００５６】
個々の各クローンから、プラスミドＤＮＡを調製し、さらにＭ１３−プライマー５'−ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＧＴ−３'を用いた自動化ＤＮＡ配列決定手順に供した。図３〜８に示す通り、単一のグルマリン配列変異体が４回目の選択で顕著に濃縮され始め、さらに６回目の選択後には全配列の９０％超に相当する。これは、この変異体がおそらく最高の親和性でＰＴを結合させることを明らかに示す。この最も重要な配列変異体に加えて、共通配列モチーフを部分的に共有するさまざまな他のグルマリン配列が濃縮されている。この知見は、これらの他の配列がＰＴへの親和性を同様に示すことを示唆する。
【００５７】
Ｂ．固定化ＰＴに対するＰＰ２６アフィニティ選択
グルマリン選択と平行して、固定化ＰＴに対する連続６回の選択を、ＰＰ２６ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ライブラリについて実施した。ストレプトアビジンビーズに固定化されたビオチン化ＰＴを、これらの選択に用いた（表２）。４回目の選択で、グルマリンプールのストレプトアビジンビーズへの低バックグラウンド結合が観察され、ビーズおよび／またはストレプトアビジン結合ＰＰ２６変異体の濃縮開始が示唆された。従って、続く５回目の選択では、２つの個別の選択を、一方でビオチン／ストレプトアビジン固定化ＰＴを標的としておよび他方でエポキシビーズカップリングＰＴとしてそれぞれ用いて実施した。両方の選択で、標的結合の明らかなバックグラウンド修正された濃縮が観察された（表２）。この傾向は、ビオチン／ストレプトアビジン固定化ＰＴを用いた６回目の選択で確認され、従って、ＰＴ結合変異体の蓄積を明らかに示した。
【表２】
【００５８】
Ｃ．選択されたＰＰ２６結合物質プールのクローニング
選択の回Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の結果として得られたＰＰ２６ＤＮＡ−プールを、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングした。ＰＰ２６ＤＮＡをｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯベクターに異なる濃度でライゲーションした。６μｌの反応に、０．５μｌ、２μｌおよび４μｌのグルマリンプールＤＮＡをそれぞれ用いた。ライゲーションは取扱説明書に従って実施した。これらのライゲーション溶液の２μｌで、２０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ'コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、さらに、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むＬＢ平板へ播種した。これらの形質転換のそれぞれから、１５０個の単一コロニーを、Ｔ７依存性タンパク質発現を抑制する５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むマスタープレート、およびブルーホワイトスクリーニングのためのＸ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを含む第２のプレートに採取した。形質転換のそれぞれについて、ブルーホワイト試験からのホワイトコロニーに対応する抑制マスタープレート由来のコロニー９６個を用いて９６ウェルＬＢ寒天平板および５００μｌ液体培養（５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むＬＢ）に播種した。９６ウェル寒天平板は委託配列決定に送付した。液体培養は５００μｌの４０％グリセロールと混合し、液体窒素中で凍結し、さらに−８０℃で保存した。
【００５９】
Ｄ．各結合物質変異体の配列決定
個々の各クローンから、プラスミドＤＮＡを調製し、さらにＭ１３−プライマー５'−ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＧＴ−３'を用いる自動化ＤＮＡ配列決定手順に供した。図９〜１４に示す通り、２つの主な変異体が各回の選択中に濃縮された。両方の変異体は保存された配列モチーフを共有する。この知見は、保存されたアミノ酸の側鎖がＰＴ表面領域の一部と直接の相互作用を確立すると推定されることを示す。さらに、少なくとも４種類の別の変異体がより低い程度で濃縮されている。これらの変異体は上述の保存された配列モチーフを含まないため、これらの変異体はＰＴの異なる表面領域に結合する可能性があると結論できる。
【００６０】
Ｅ．選択されたＰＴ結合グルマリン−およびＰＰ２６−変異体の確認
選択はＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）分子−ｍＲＮＡ−ペプチド融合物を用いて実施したため、選択後分析の第一段階に、標的に結合する能力について遊離ペプチドを検査する必要がある。次の段階で、核酸部分でなくペプチドを介した標的結合を確認した変異体を、ＡＰ処理液の存在下で特異性試験に供する。この方法によって、ＡＰ処理に最も適した変異体が特定される。
【００６１】
１．ＰＴへの結合能に関する遊離ペプチドの試験
グルマリン−およびＰＰ２６−結合物質変異体の単一の濃縮された遊離ペプチドの定性的結合検定のために、ＴＮＴ Ｔ７カップリングＲｅｔｉｃｏｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、品番Ｌ５５４０）を下記の通り用いた。単一の結合物質候補のＤＮＡを、コロニーＰＣＲによって、結合物質クローンのグリセロールストックから増幅させた。ＰＣＲ中の突然変異を回避するために、プルーフリーディングポリメラーゼ（Ｐｗｏ）を使用した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分析した。ＰＣＲ産物５．０μｌを、ＴＮＴ系を用いたカップリングｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応のテンプレートとして、終容量５３μｌで取扱説明書に従って用いた。発現された結合物質候補を続いてＮｉ−ＮＴＡキレートクロマトグラフィー（ＱＩＡＧＥＮ）によって精製した。放射性標識化したＨｉｓタグ精製結合物質候補（各ペプチドの〜４０〜７０ｆｍｏｌ）を、ストレプトアビジン−磁気ビーズ上に固定化したビオチン化ＰＴと室温で１時間インキュベートした。ビーズをＨＢＳ緩衝液で３回洗浄し、次いで水に再懸濁させ、さらに液体シンチレーションカウンターで分析した。対照実験では各候補をストレプトアビジンビーズのみ（ＰＴ無し）とインキュベートした。ＰＰ２６およびグルマリンの最良の結合物質候補を特定し（表３および４、下記）および以降の特異性試験に供した。
【００６２】
２．処理液の存在下でのグルマリンおよびＰＰ２６変異体の特異性試験
Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ処理液の存在下での遊離グルマリンおよびＰＰ２６ペプチドの半定量的結合および特異性検定のために、ペプチドをまずＰＲＯｆｕｓｉｏｎとして作製し，精製して均一にし、さらに次いでＳ１−ヌクレアーゼ消化によって遊離ペプチドとした。選択された結合物質変異体（１０種類のグルマリンクローンおよび７種類のＰＰ２６クローン）のＤＮＡの十分量の増幅のため、ＴＮＴ発現に由来するＰＣＲ産物をテンプレートとして用いてＰＣＲを実施した。１０サイクルのＰＣＲ（９４℃３０秒間；６０℃３０秒間；７２℃３０秒間）の後、試料を２％アガロースゲルで分析した。ｄｓＤＮＡ（ＰＣＲ産物）を、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＲｉｂｏＭａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットを用いてＲＮＡへ転写した。４５分間３７℃にてインキュベート後、ＤＮａｓｅＩを添加し、さらに３７℃にてインキュベートをさらに１５分間続けた。この混合物をフェノール／クロロホルム抽出に供した。過剰のＮＴＰはＮＡＰ−５ゲルろ過（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって除去した。ＲＮＡを６％−ＴＢＵ−ゲルで分析した。
【００６３】
精製ＲＮＡを１．５倍過剰のピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーＰＥＧ２Ａ１８：５'−ソラレン−ＵＡＧ ＣＧＧ ＡＵＧ Ｃ Ａ１８ （ＰＥＧ−９）２ ＣＣ ピューロマイシン （斜体で示されるヌクレオチドは２'−Ｏ−メチル−誘導体を表す）とアニーリングさせた（８５℃１分間、２５℃へ０．３℃／秒の傾きで冷却）。共有結合カップリングは１５分間室温にて（ＲＴ）ＵＶ光（３６５ｎｍ）照射によって実施した。反応産物を６％−ＴＢＵゲルで分析した。ライゲーションしたＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のウサギ網状赤血球溶解物を用いて１５μＣｉ３５Ｓ−メチオニン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で翻訳した。３０分間３０℃にてインキュベート後、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２をそれぞれ終濃度５３０ｍＭおよび１５０ｍＭとなるよう加え、さらに試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ｍＲＮＡ−タンパク質融合物（ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標））を、オリゴｄＴ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含むインキュベート緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と４℃で５分間インキュベートすることによって単離した。分子は、ＭｉｎｉＭＡＣＳ−カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を介したろ過、インキュベート緩衝液での洗浄および水での溶出によって単離した。試料は４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００６４】
ＲＮＡ−タンパク質融合物のＲＮＡ部分を除去するため、オリゴｄＴ精製分子をＳ１−ヌクレアーゼ（Ｓ１−ヌクレアーゼはピューロマイシンリンカーのＤＮＡ部分を切断する）で取扱説明書に従って消化した。Ｓ１消化の前および後のＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子の試料を４〜１２％Ｂｉｓ／ＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ストレプトアビジンビーズ（Ｍ２８０Ｄｙｎａｌ）をＨＢＳで洗浄し、さらに４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化ＰＴ（９００ｐｍｏｌ）を９００μｌのＳｔｒｅｐｂｅａｄｓ（ＨＢＳ緩衝液で予備ブロックした）と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＴの固定化後、ビーズをビオチン（２ｍＭビオチンを含むＨＢＳ）で１分間ブロックし、さらに直ちにＨＢＳ緩衝液で４回洗浄してビオチンの痕跡を除去した。対照ビーズ（ＰＴ無し）をビオチンで同様にブロックした。
【００６５】
選択されたペプチドの結合分析のために、いくつかの平行反応を下記の通り設定した：ビオチンブロックしたストレプトアビジンビーズのみを用いる陰性対照；ストレプトアビジンビーズ上に固定化したＰＴを用いる陽性対照；ビオチンブロックしたビーズを１／４容のＡｖｅｎｔｉｓＰａｓｔｅｕｒ試料溶液Ｃ（素通り１．ＡＦカラム）と組み合わせて用いるバックグラウンド対照；１／４容の試料溶液Ｃと組み合わせたＰＴの混合物；ビオチンブロックビーズを１／４容のＡｖｅｎｔｉｓＰａｓｔｅｕｒ試料溶液Ｅ（培地）と組み合わせて用いるバックグラウンド対照；１／４容の試料溶液Ｅと組み合わせたＰＴの混合物；反応３〜６は、選択されたペプチドがＡｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒによって提供される試料の存在下でＰＴと特異的に結合する能力を評価するために実施した。結合は、室温で１時間、ペプチドの分解を回避するためプロテアーゼ阻害剤混合物（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ（登録商標）ＲＯＣＨＥ社）の存在下で実施した。ＨＢＳ溶液で洗浄後、ビーズをシンチレーションカウンターによって分析した。
【００６６】
表３に示す通り、試験した１０種類のグルマリン変異体のうち３つ（９、１０、１９番）が、ＡＰ処理液のどれにも影響されないＰＴへの標的結合を示す。これらの変異体は、ＡＰ処理中のアフィニティクロマトグラフィー用途のための最も有望な候補である。
【００６７】
表４に示す通り、試験した７種類のＰＰ２６変異体のうち３つ（５、６、９番）が、ＡＰ処理液によって低下しないＰＴへの標的結合を示す。これらの変異体は、ＡＰ処理中のさらなるアフィニティクロマトグラフィー用途のための最も有望な候補である。
【表３】
【表４】
【００６８】
Ｆ．化学合成によるペプチド作製
８種類の異なるペプチドが化学合成によってＮ末端ビオチン化ペプチドの形で作製された。ビオチン基は短い親水性リンカー（ＰＥＧ２＝８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）をスペーサーとした。これらの８つのペプチドのうち２つ（ＰＰ２６−５ｃおよびグマリン−９ｃ）をさらに、Ｃ末端タグ化ビオチン化ペプチド（追加のＣ末端リジンを介して）の形で合成した。ペプチドはＳｈｅｐｐａｒｄに従ってＦｍｏｃ／Ｂｕｔ戦略を用いて自動合成し、ＨＰＬＣによって精製し、さらに続いて凍結乾燥した。全ての精製ペプチドの品質は質量分析によって確認した。各ペプチド合成の標的量は精製ペプチド５ｍｇであった。精製後の合成ペプチドの収量および純度についての概要を表５に示す。
【表５】
【００６９】
全てのｐｐ２６ペプチドを、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌに終濃度１００μＭで溶解させた。全てのグルマリンペプチドを、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭＧＳＨ、１ｍＭＧＳＳＧに終濃度１００μＭで溶解させ、さらに続いて窒素下で少なくとも４８時間インキュベートして構造的折りたたみを可能にした。
【００７０】
Ｇ．細菌発現によるペプチド産生
百日咳毒素に対する結合物質として同定されたペプチドを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の読み枠内にサブクローニングし、さらに細菌で発現させた。ＧＳＴタグは溶解度を高め、さらにグルタチオンセファロースを用いる精製を可能にする。特異的ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼによって認識される遺伝子組換えによるプロテアーゼ切断部位は、ＧＳＴタグの除去を可能にし、ペプチドを遊離させる。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ自体がＧＳＴおよびヒトライノウイルス（ＨＲＶ）１４型３Ｃプロテアーゼの融合物タンパク質であり、さらに配列Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ＊Ｇｌｙ−Ｐｒｏを特異的に認識してＧｌｎおよびＧｌｙ残基の間を切断する。切断後、切断されない産物およびプロテアーゼは、グルタチオンセファロースを用いて切断反応物から除去できる。
【００７１】
Ｈ．発現ベクターの構築
１．ｐｐ２６変異体についてＧＳＴ融合物の構築
ＰＣＲ用のテンプレートとして、ＰＴに対する同定されたｐｐ２６結合物質の配列を含むｐＣＲ２．１ベクターを用いた。オリゴヌクレオチド４６７番（５'−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＣＡＴＣＡＴＣ−３'）および４６８番（５'−リン酸−ＧＧＧＴＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴＣ−３'）をＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と共に用いてＰＣＲで得られた産物を、ＮｃｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。修飾ベクター（追加のＮｃｏＩ部位を含むｐＧＥＸ６Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＮｃｏＩ／ＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、さらにＰＣＲ産物をこのベクターのＮｃｏＩ／ＳｍａＩ部位へ定方向クローニングした。ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での形質転換後、陽性クローンをコロニーＰＣＲによって特定し、さらに配列決定によって確認した。
【００７２】
２．グルマリン変異体についてＧＳＴ融合物の構築
ＰＣＲ用のテンプレートとして、ＰＴに対する同定されたグルマリン結合物質の配列を含むｐＣＲ２．１ベクターを用いた。オリゴヌクレオチド４６４番（５'−ＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＡＧＴＧＧＣ−３'）および４６５番（５'−リン酸−ＧＧＧＴＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＡＴＧＣＴＡＣＴＡＧＧＣ−３'）をＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と共に用いてＰＣＲで得られた産物を、ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。修飾ベクター（追加のＮｄｅＩ部位を含むｐＧＥＸ６Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ））をＮｄｅＩ／ＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、さらにＰＣＲ産物をこのベクターのＮｄｅＩ／ＳｍａＩ部位へ定方向ライゲーションした。ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での形質転換後、陽性クローンをコロニーＰＣＲによって特定し、さらに配列決定によって確認した（表６）。
【表６】
【００７３】
３．ＧＳＴｐｐ２６融合物の発現および精製
細菌株Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、プラスミドＤＮＡ（表参照）を用いて形質転換した。ｐｐ２６変異体の形質転換株を３７℃２５０ｒｐｍにてＯＤ６００〜０．５まで増殖させ、さらに１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって４時間誘導した。グルマリン−ＧＳＴ融合物の場合には、誘導は０．３３ｍＭ ＩＰＴＧ．を用いて２．５時間実施した。細菌を採集後、細胞を１ｍＭ２−メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤および１ｍＭリゾチームを含むＰＢＳ−ＫＭＴ（１０ｍＭＮａリン酸、ｐＨ７．５、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）に再懸濁し、３０分間室温にてインキュベートし、さらに超音波処理によって破壊した。遠心分離後に可溶性の上清をＧＳＨセファロースカラムへ精製のために移した。カラムをカラムの１０倍容の２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ＧＳＴ融合物タンパク質を２０ｍＭ ＧＳＨで溶出し、さらにＳＤＳゲルで分析して発現を確認した。
【００７４】
４．ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼを用いた切断によるＧＳＴタグの除去によるペプチド生成
あるペプチドのＧＳＴ−ペプチド融合物からのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断の一例を下記に示す。ＧＳＴタグはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とのインキュベートによって除去された：融合物タンパク質２．５ｍｇを１６０ＵのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎとインキュベートし、さらに５℃で１６時間、結合したＧＳＴ融合物タンパク質を含む密封ＧＳＴｒａｐＦＦカラムで消化した。一晩インキュベート後、第２のＧＳＴｒａｐＦＦカラムを接続してＧＳＴタグ化プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎを除去した。試料を流速０．２ｍｌ／分で加え、素通り画分を小部分試料として回収し、ＳＤＳゲル電気泳動によって分析し、さらにペプチドの量をＯＤ２８０測定によって計算した（約７００μｇ）。
【００７５】
実施例３
ＰＴのアフィニティ精製
Ａ．変性ゲルでの発酵上清の分析
処理液は、アフィニティクロマトグラフィー処理用の可能な開始材料と考えられた：
試料Ａ １０〜５０μｇ／ｍｌ（〜０．０９〜０．４５μＭ）の粗ＰＴを含む濃縮培養ろ液、発酵上清
試料Ｂ ９〜４５μｇ／ｍｌ（〜０．０８〜０．４μＭ）の粗ＰＴを含む吸収クロマトグラフィー上清
これらの処理液の複雑さを視覚化するため、両方の試料を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。試料Ａの主に高分子量成分が吸収クロマトグラフィーによって除去される（試料Ｂ）。
【００７６】
Ｂ．合成ビオチン化コアペプチドのストレプトアビジンセファロースへの固定化および精製ＰＴとの結合の確認
１．ストレプトアビジンセファロースへのペプチド固定化
ビオチン化ペプチドのストレプトアビジンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ７１−５００４−４０）への結合のため、予洗浄したストレプトアビジンセファロースの５０％スラリー２００μｌを、１ｎｍｏｌのペプチド（１００μＭペプチド溶液１０μｌ）と１ｍｌＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中４℃でインキュベートした。使用した条件下では、ストレプトアビジン セファロースの高結合能はビオチン化ペプチドの１００％の固定化を可能にすべきである（充填セファロース１μｌ当たりペプチド１０ｐｍｏｌ）。
【００７７】
２．固定化ペプチドへの精製ＰＴの結合
ペプチドを装填したセファロース２００μｌ（１０％ｉｇｅスラリー、固定化ペプチド２００ｐｍｏｌを含む）をＭｏｂｉｃｏｌカラム（ＭｏＢｉＴｅｃ、１０μｍフィルター）へ移し、さらに上清を１分間２０００ｒｐｍでの遠心分離によって除去した。ＨＥＰＥＳ緩衝液で４回洗浄後、セファロースを、精製百日咳毒素１００ｐｍｏｌを含む２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、さらに回転ホイール上で１時間室温にてインキュベートした。結合しない画分を遠心分離によって分離した（結合後の上清；ゲル分析に使用）。続いてペプチド−ストレプトアビジンセファロースを冷ＨＥＰＥＳ緩衝液（各２００μｌ）で３回洗浄し、さらに２０μｌの装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％Ｐ−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）に再懸濁して、結合したＰＴを溶出した。９５℃で５分間インキュベート後、装填緩衝液を遠心分離によって回収し、さらに続いてゲル分析に用いた（図１５）。対照として、ペプチドを伴わないストレプトアビジンセファロースを同一の条件下でＰＴと接触させた。使用した条件下では、百日咳毒素ペプチド結合物質クローンｐｐ２６５ｎ、５ｃ、９ｎ、１５ｎおよびグルマリンクローン１０ｎ、１９ｎ、１５ｎ、９ｎは精製ＰＴへの明らかな結合を示す。全ての陽性な結合物質候補は、未変性六量体ＰＴを結合させることができた。
【００７８】
Ｃ．合成ビオチン化コアペプチドのストレプトアビジンセファロースへの固定化および発酵上清からのＰＴとの結合の確認
ストレプトアビジンセファロースへのペプチド固定化および発酵上清からのＰＴとの結合分析を、ペプチドストレプトアビジンセファロースを２００μｌの試料Ａ（発酵上清）または２００μｌの試料Ｂ（吸収クロマトグラフィー上清カラム、０章参照）とインキュベートし、続いてＨＥＰＥＳ緩衝液で４回室温で洗浄した以外は０章に記載の通り実施した。結合分析の結果を図１６に示す。使用した条件下では、百日咳毒素ｐｐ２６結合物質クローン９ｎ、１５ｎおよびグルマリンクローン９ｎ、１５ｎは、発酵上清試料Ａおよび試料Ｂから未変性ＰＴ六量体を非常に効率的に結合できた。使用した条件下では、ｐｐ２６結合物質クローン５およびグルマリン結合物質クローン１０および１９はより低い親和性でＰＴに結合できることに注意する。試料Ａおよび試料ＢからこれらのペプチドへのＰＴ結合はその条件下では検出されなかったが、これらの結合物質はアフィニティクロマトグラフィーカラムにおけるリガンドとしての用途になお適するであろう（カラムは再結合作用によるＰＴの保持を可能にし、従ってｋｏｆｆの問題を最小化する）。
【００７９】
Ｄ．固定化ペプチドに関する熱力学データ
ペプチド結合能の推定のために、セファロース固定化ペプチド２０ｐｍｏｌを、過剰量のＰＴ１００ｐｍｏｌを含む容量２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＴ５００ｎＭに相当）とインキュベートした。洗浄後、ペプチド−ストレプトアビジンセファロース結合ＰＴの画分をゲル分析によって定量した。これは、使用した条件下での結合活性ペプチドの画分を直接計算するのを可能にする（ＰＴ／ペプチド結合比は１：１と仮定）。ＰＴ５００ｎＭの濃度は全てのペプチドについてＢｍａｘに達するのに十分高いという仮定に基づく。分析の結果を表７に示す。表に示す値は、ペプチドの期待可能な結合能の推定である。大部分の適当な結合物質の結合能（Ｂｍａｘ）および解離定数（ＫＤ）の正確な評価も実施できる。
【表７】
【００８０】
Ｅ．許容されるグレードの原材料に対して保健当局の基準を用いた、規定の緩衝液条件（ｐＨ、塩濃度、界面活性剤）下での精製百日咳毒素六量体の安定性の分析
百日咳毒素六量体安定性を幅広いｐＨおよび塩条件下でＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置で試験した。この目的で、２０００ＲＵまでのビオチン化ＰＴをストレプトアビジンチップに装填した。続いて異なる緩衝液をチップ固定化ＰＴに、２分間流速３０μｌ／分で加えた。各緩衝液注入の終了後に、チップをＨＢＳ／ＥＰ分析緩衝液で平衡化した（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ）、少なくとも２分間、流速３０μｌ／分）。緩衝液注入の前および後の測定されたＲＵシグナルの差は、チップ上のＰＴ六量体の減少と相関する。この減少は、使用した緩衝液条件下でのＰＴ六量体の安定性の損失と解釈された。
【００８１】
分析したｐＨ範囲はｐＨ２から１０．５で下記の緩衝液を用いた：１０ｍＭグリシン緩衝液（ＢＩＡｃｏｒｅ、ｐＨ２；２．５；３）、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ＢＩＡｃｏｒｅ、ｐＨ４；４．５；５；５．５）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）および１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６および１０．５）。ＰＴ六量体安定性に及ぼすｐＨの影響を示すＢＩＡｃｏｒｅ測定図が作製され、さらにＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を表８に要約する。使用した条件下で、百日咳毒素六量体はｐＨ２．５〜１０．５の幅広いｐＨ範囲で安定であることが示された。
【表８】
【００８２】
ＰＴ六量体安定性に及ぼす異なる塩条件の影響を、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２についてそれぞれｐＨ５．０（１０ｍＭ酢酸緩衝液）およびｐＨ８．５（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ）で、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置での類似の実験で調査した。使用した塩条件下でのＰＴ六量体安定性についての概要を表９に示す。六量体は最高２．５ＭのＮａＣｌまたは最高２ＭのＫＣｌを含む緩衝液（ｐＨ５および８．５にて）中で安定であった。ＭｇＣｌ２の場合には、ＰＴ六量体は最高２ＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液中でｐＨ８．５にて安定であった。
【表９】
【００８３】
Ｆ．発酵上清からのＰＴの特異的アフィニティ精製を可能にする規定の洗浄および溶出条件を設定（ｐＨ、塩濃度、界面活性剤）
百日咳毒素六量体が安定である条件の決定後、次の段階は、固定化ペプチドｐｐ２６クローン９および１５およびグルマリンクローン９および１５に結合した百日咳毒素についての洗浄および溶出条件を調べることであった。
【００８４】
１．ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置を用いたＰＴ／ペプチド安定性の評価
ＰＴ／ペプチド複合体の安定性を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置を用いて、ＰＴ六量体安定性に干渉しないことが示された異なるｐＨおよび塩条件下で調べた。５００〜１０００ＲＵの合成ペプチドをＢＩＡｃｏｒｅストレプトアビジンチップ上に固定化した。固定化ペプチドへのＰＴの結合を可能にするため、２０ｎＭの精製ＰＴを含むＨＥＰＥＳ緩衝液を１分間注入した。ＨＢＳ／ＥＰ分析緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ））で平衡化後、ＰＴ／ペプチド複合体を、以下の緩衝液の注入によって洗浄した：
（ａ）１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５および９．５
（ｂ）１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．５、５．０、４．５、および４．０
（ｃ）１０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ３．０および２．５
（ｄ）０．５、１．０、１．５、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液緩衝液、ｐＨ６．０、
（ｅ）０．５、１．０、１．５、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５、
（ｆ）０．５、１．０、１．５、２．０ＭＫＣｌを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０、
（ｇ）０．５、１．０、１．５、２．０ＭＫＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５、
（ｈ）０．５、１．０、１．５、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０、
（ｉ）０．５、１．０、１．５、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５。
【００８５】
各緩衝液注入の終了後にチップをＨＢＳ／ＥＰ分析緩衝液で平衡化した。使用した緩衝液条件下でのチップ上のＰＴ六量体の損失（緩衝液注入の前および後の測定されたＲＵシグナルの差）はＰＴ／ペプチド複合体安定性を反映する。全てのＰＴ／ペプチド複合体のｐＨ範囲安定性および塩安定性に関する概要を表１０に要約する。全てのＰＴ／ペプチド複合体は、１００ｍＭ炭酸、ｐＨ１０．５および１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５の存在下で完全に不安定化された。グルマリンペプチド９について、２．５Ｍ ＮａＣｌまたは少なくとも０．５Ｍ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液はＰＴ／ペプチド複合体安定性に干渉する。グルマリンペプチド１５とのＰＴ複合体はさらに少なくとも１．５Ｍ ＭｇＣｌ２の存在下で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で不安定化された）。
【表１０】
【００８６】
２．ペプチドストレプトアビジンセファロース上のＰＴの精製のための洗浄条件の評価
アシアロフェチュインでの百日咳毒素精製処理のための確立された条件に近い洗浄条件の適用を試みた（１Ｍ ＮａＣｌを含むかまたは含まない５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄）。百日咳毒素精製手順はペプチドｐｐ２６クローン９および１５およびグルマリンクローン９および１５について最適化した。セファロース２０μｌ上に固定化した各ペプチド２００ｐｍｏｌを１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１００μｌの試料Ａまたは試料Ｂとインキュベートし、ＰＴを結合させた。続いて結合したＰＴ画分を有するペプチドセファロースを下記に示す３つの異なる条件下で洗浄した：
（ａ）２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で３回；
（ｂ）２００μｌの５０ｍＭ酢酸ｐＨ６．０で３回；および、
（ｃ）２００μｌの５０ｍＭ酢酸ｐＨ６．０で６回。
【００８７】
洗浄後、残存物質をセファロースから、２０μｌの装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）で溶出した。全ての溶出液を続いてＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した（図１７）。
【００８８】
５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６．０での洗浄がより厳しいものでありおよび５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄するよりも効率的に高分子量不純物のバックグランドを低減する。しかしこれらの洗浄条件下では、特にグルマリンペプチド９および５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６．０での反復洗浄（６回洗浄）の場合には、ＰＴ／ペプチド複合体はより不安定である。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５とは対照的に、ペプチド固定化ＰＴの損失は、５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６．０での洗浄を１０から２０回反復した際により劇的であった（例としてｐｐ２６ペプチド９について図１８で示す）。
【００８９】
３．ペプチドストレプトアビジンセファロース上のＰＴの精製のための溶出条件の評価
ペプチドセファロースからのＰＴの溶出を、六量体安定性と類似の条件下で試験した。
【００９０】
ａ．ＭｇＣｌ２による溶出
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００測定によって上に示す通り、全てのＰＴ／ペプチド複合体は、ＰＴ六量体安定性には決定的でないことが示された条件である２Ｍ ＭｇＣｌ２に感受性であった。規定のＭｇＣｌ２濃度の溶出効率を、ストレプトアビジンセファロースへ４種類の固定化合成ペプチドのうちの１つを介して結合したＰＴについて評価した。セファロース２０μｌ上に固定化した各ペプチド４００ｐｍｏｌを１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１００μｌの試料ＡとインキュベートしてＰＴを結合させた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（各２００μｌ）で４回洗浄後、ＰＴの結合した画分を、下記の緩衝液の２０μｌを３回連続で用いて溶出した。
【００９１】
（ａ）０．２Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、または
（ｂ）０．５Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、または
（ｃ）１．０Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、または
（ｄ）１．５Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、または
（ｅ）２．０Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５。
【００９２】
残存物質をその後、ペプチドストレプトアビジンセファロースから２０μｌの装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）で溶出した。全ての溶出液を続いてＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した（図１９）。本実験で示される通り、ＭｇＣｌ２での溶出はグルマリンペプチドについてのほうがｐｐ２６ペプチドについてよりも効率的であったが、相当な量のＰＴがなおペプチドストレプトアビジンセファロース上に残存した。
【００９３】
ｂ．ｐＨ変化による溶出
ＢＩＡｃｏｒｅ測定は、ＰＴは全てのペプチドから、ＰＴ六量体安定性には決定的に重要でない酸性（ｐＨ２．５）または塩基性（ｐＨ１０．５）緩衝液条件を用いて溶出可能であったことを明らかにした（１００ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ１０．５よりもＰＴ六量体安定性に穏和な５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５、ｘｘｘを参照）。セファロース２０μｌ上に固定化した各ペプチド２００ｐｍｏｌを１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１００μｌの試料Ａとインキュベートし、ＰＴを結合させた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（各２００μｌ）で４回洗浄後、ＰＴをペプチドストレプトアビジンセファロースから、５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５、または１００ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ１０．５での４０μｌの溶出の連続３回によって溶出した。残存物質を続いてペプチドストレプトアビジンセファロースから、２０μｌの装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）で溶出した。全ての溶出液をＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した（図２０）。ほぼ全てのＰＴがペプチドストレプトアビジンセファロースから、５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５を用いておよび１００ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ１０．５を用いて溶出可能であった。
【００９４】
４．最適化された条件を小スケール精製計画に適用し、結合能を確認
ａ．最適化された洗浄および溶出条件下での試料ＢからのＰＴの精製（４μｌカラム）
最適化された洗浄および溶出条件を組み合わせて、ペプチドストレプトアビジンセファロース上での試料ＢからのＰＴの精製を可能にした。ＰＴの非特異的結合を低減するために、ペプチド／ストレプトアビジンセファロースの最適比を先に各ペプチドについて滴定した。続いて試料Ｂ／ペプチドストレプトアビジンセファロース比を、ペプチドの予想される高（中）インプット当たりの高回収量に関して最適化した。これらの条件を下記の小スケールカラム精製に適用した。
【００９５】
ｐｐ２６ペプチド９およびグルマリンペプチド１５については、ストレプトアビジンセファロースへの固定化は、ストレプトアビジンセファロース１６μｌのペプチド１６００ｐｍｏｌとのインキュベートによって実施した。ｐｐ２６ペプチド１５の場合には、ストレプトアビジンセファロース１６μｌをペプチド６０００ｐｍｏｌとインキュベートした（ｐｐ２６／１５はストレプトアビジンセファロースとより低い効率で結合し、不完全なペプチドビオチン化によって説明されうる）。グルマリンペプチド９については、８０００ｐｍｏｌがストレプトアビジンセファロース８０μｌ上に固定化された。続いて洗浄したペプチドストレプトアビジンセファロースを等分し、さらに４つのＭｏｂｉｌｃｏｍカラム（１０μＭフィルター付き）へ移した。
【００９６】
各カラム（ｐｐ２６／９およびｇｕｒ／１５についてはセファロース４μｌとペプチド４００ｐｍｏｌ；４μｌと不確定量の結合ペプチドｐｐ２６／１５；ｇｕｒ／９については２０μｌとペプチド２０００ｐｍｏｌを含む）を４００μｌの試料Ｂ（ＨＣｌの添加によってｐＨ７．０〜７．５に調整）とインキュベートしてＰＴを結合させた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５（各１００μｌ）で５回洗浄後、ＰＴをペプチドストレプトアビジンセファロースから下記の通り連続溶出によって溶出した（ｐｐ２６／９およびｇｕｒ／１５について３回溶出；ｐｐ２６／１５およびｇｕｒ／９について４回溶出）：
（ａ）カラム１の場合、５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５（各２０μｌ）で、または
（ｂ）カラム２の場合、１００ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ１０．５（各２０μｌ）で、または
（ｃ）カラム３の場合、２Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５（各２０μｌ）で。
【００９７】
カラム１〜３およびカラム４上の残存物質を続いてペプチドストレプトアビジンセファロースから２０μｌ装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）での溶出によって溶出した。全ての溶出液をＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した（図２１、２２）。ペプチドストレプトアビジンセファロースでの精製後のＰＴの収量を計算するため、プールした溶出液１〜３をＰＡＧＥおよび銀染色によって分析し、さらに同じゲル上で分離した規定量の精製ＰＴと比較して推定を可能にした（図２１Ｂおよび２２Ｂ）。ゲル推定に基づき、精製ＰＴの収量は表１１に示す通り計算された。
【表１１】
【００９８】
ｂ．アフィニティ精製中にストレプトアビジンセファロース上のさまざまなペプチド密度を用いたＰＴ収量の測定
ペプチドストレプトアビジンセファロースに結合したＰＴを、ストレプトアビジンセファロース上にアフィニティリガンドとして固定化されたペプチドのさまざまな濃度への依存性について調べた。固定化のために１μｌ容のストレプトアビジンセファロースを漸増量のペプチドｐｐ２６／９またはグルマリン／１５（ペプチド１００、２００、３００、４００、５００、１０００ｐｍｏｌ）とインキュベートした。ペプチドの非結合画分をセファロースから、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（カラム上）での洗浄３回によって除去した。続いて各ペプチドストレプトアビジンマトリクスを６００μｌの試料ＡとインキュベートしてＰＴを結合させた。８０分後、各マトリクスを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（各２００μｌ）で４回洗浄し、さらに続いて２０μｌのゲル装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー；インキュベート１０分間９５℃にて）で溶出した。溶出液をＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した（図２３）。ペプチドストレプトアビジンセファロースに結合したＰＴの量をデンシトメトリー評価によって計算し、さらにストレプトアビジンセファロースへの固定化に最初に用いたペプチドの量の関数としてプロットした（ｐｐ２６／９について図２３に示す）。ペプチド３００〜４００ｐｍｏｌがストレプトアビジンセファロース１μｌへの固定化に用いられた場合に最高のＰＴ結合に達した。より多量のペプチドは、おそらくＰＴの立体障害の作用を反映して、より多いＰＴ結合を結果として生じなかった。
【００９９】
ペプチド４００ｐｍｏｌのインプットがストレプトアビジンセファロース１μｌへの固定化に用いられた場合のペプチド（ｐｐ２６／９またはグルマリン／１５）の有効に結合した画分を、ＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で、ゲル装填緩衝液を用いた溶出（９５℃にて１０分間加熱）後に評価した。溶出可能なペプチドの量は、同一ゲル上の規定量の精製ＰＴとの直接比較によって推定した（データ記載せず）：ｐｐ２６／９について１００〜１５０ｐｍｏｌ；グルマリン／１５について５０ｐｍｏｌ。
【０１００】
ｃ．アフィニティ精製中に一定濃度のペプチドセファロースにてさまざまな量の試料Ｂを用いたＰＴ収量の測定
ペプチド固定化のために４００ｐｍｏｌのｐｐ２６／９またはグルマリン／１５を１μｌのストレプトアビジンセファロースと１時間室温にてインキュベートした。ペプチドセファロースを２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５緩衝液で３回洗浄し、さらに続いてさまざまな量の試料Ｂ（５０、６６、１００、２００、４００、６００μｌ、ＨＣｌの添加によってｐＨ７．０〜７．５に予め調整）と１時間室温にてインキュベートした。アフィニティマトリクスを１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で４回洗浄し、さらに１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５（各２０μｌ）での４回連続溶出によって溶出した。プールした溶出液（計８０μｌ）のうち５μｌをＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した。溶出したＰＴの量は、質量標準としての同一ゲル上の規定量の精製ＰＴとの直接比較を基礎として計算した（図２４、表１２）。
【表１２】
【０１０１】
ペプチドストレプトアビジンセファロースの精製効率をアシアロフェチュインセファロースと比較するために、アシアロフェチュインセファロースを用いた滴定実験を類似の条件下で平行して実施した（セファロース上に固定化された、反応当たり等しい量のアフィニティリガンド、セファロースへ有効に結合したアフィニティリガンド１００ｐｍｏｌに相当）。これは６．８５μｌのアシアロフェチュインセファロース（バッチ番号ＦＡ０５３１９８：密度１．１ｍｇ／ｍｌ、１４．６ｐｍｏｌ／ｌ）の、さまざまな量の試料Ｂ（５０、６６、１００、１７１．３、２００、４００μｌ、ＨＣｌの添加によってｐＨ７．０〜７．５に予め調整）との１時間室温にてのインキュベートによって達成された。続いてアシアロフェチュインセファロースを洗浄し、さらに結合ＰＴを溶出し、さらに上記の通り分析した。使用した精製条件下でのストレプトアビジンセファロースのペプチド結合効率は、アシアロフェチュインセファロースの結合効率よりも有意に高かった。
【０１０２】
ｄ．繰り返しＰＴ結合および溶出のためのペプチドセファロースの再使用
ＰＴの繰り返し結合および溶出のためのペプチド装填セファロース（ｐｐ２６／９およびグルマリン／１５）の再使用性を調べるため、セファロースをＰＴ結合、溶出および再生の反復サイクルに用いた（計４回）。ペプチド固定化のために、６００ｐｍｏｌのｐｐ２６／９またはグルマリン／１５をストレプトアビジンセファロース２μｌと一晩室温にてインキュベートし、さらに続いてＨＥＰＥＳ緩衝液で３回洗浄した。ＰＴの結合のために、各ペプチドストレプトアビジンセファロースを４００μｌの試料Ｂ（ＨＣｌの添加によってｐＨ７．０〜７．５に調整）と１時間室温にてインキュベートし、さらに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（各２００μｌ）で４回洗浄した。ＰＴは１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５（各２０μｌ）での４回連続溶出によって溶出した。続いてカラムマトリクスを１０ｍＭＨＣｌ（１×２０μｌ、２×１００μｌ）での洗浄３回によって再生し、さらにその後、２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５での洗浄２回によって中性化した。この結合、溶出および再生手順をペプチドセファロースにさらに３回適用した。プールした溶出液（計８０μｌ）のうち４μｌ、各結合／溶出／再生サイクルからの１回目の再生緩衝液のうち７μｌをＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）で分析および銀染色し、ペプチドセファロースは再使用されうることを示した（図２５）。
【０１０３】
５．ＰＴの大スケールＦＰＬＣ精製
ＰＴ結合および溶出のための最適化された条件を、下記の通り大スケールＦＰＬＣ精製（０．５ｍｌカラム）に適用した：
Ａ）ビオチン化ペプチドのストレプトアビジン−セファロースへの固定化：２００ｎｍｏｌのペプチドｐｐ２６／９を１時間３０分間室温にて回転ホイール上で１ｍｌの５０％ストレプトアビジン−セファロースと１０ｍｌ容（ＨＥＰＥＳ緩衝液）中でインキュベートした。インキュベート後、セファロースを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５で３回洗浄した。
【０１０４】
Ｂ）ＰＴの結合（試料Ｂから）：セファロース５００μｌに有効に固定化されるペプチドの推定量は５０ｎｍｏｌであった。ペプチド−セファロースを試料Ｂ２５ｍｌと１時間３０分間室温にて倒立回転機中でインキュベートした（ＰＴ推定濃度〜０．５ｐｍｏｌ／μｌ、２５ｍｌ中に１２．５ｎｍｏｌに相当、固定化ペプチド対ＰＴ量の比４：１に相当）。
【０１０５】
Ｃ）ＦＰＬＣ−カラム：インキュベート後、セファロースをカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＨＲ５／５）に移した。カラムの充填中、セファロースを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５（２〜３ｍｌ）で洗浄した。続いてカラムを流路に接続し、さらにカラムの２０倍容（１０ｍｌ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５で洗浄した。固定化ＰＴを１１ｍｌの１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５で溶出した。溶出画分を５００μｌ画分として回収し（ＰｈａｒｍａｃｉａフラクションコレクターＦＲＡＣ−１００）および溶出プロファイルを２８０ｎｍでのＵＶ吸収の測定によって評価した。溶出後、カラムを１．５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５で洗浄し、さらに続いて２．５ｍｌの１０ｍＭＨＣｌで再生し、その後１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５での中性化を実施した。
【０１０６】
Ｄ）溶出画分の分析および収量の計算：溶出画分をＰＡＧＥ（１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル、ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色によって分析した
（図２６）。ＰＴの濃度は、溶出画分の２８０ｎｍでの吸収（Ａ２８０）を測定、さらにこれらの結果を精製ＰＴを用いて作製した較正曲線と比較することによって測定した（図２６中の表を参照）。
【０１０７】
ＰＴの量はさらに、同一ゲル上の質量標準としての規定量の精製ＰＴとの直接比較に基づいて計算した。ゲル推定はＰＴ８１００ｐｍｏｌの収量を導く。これはＡ２８０を用いた濃度測定と非常に良く相関する。２５ｍｌの試料Ｂは１１２５μｇのＰＴを含むと推定されるならば、ＰＴの６９％〜７２％以上がこれらの条件下で溶出される。この結果は、再生後の同一のペプチド−セファロースを用いて２５ｍｌの試料ＢからＰＴを結合させるＦＰＬＣ分析の反復によって確認された。この実験では、８０３μｇのＰＴが精製された（Ａ２８０）（表１３）。
【表１３】
【表１４】
【０１０８】
６．ｐｐ２６ペプチド９／百日咳毒素複合体形成の平衡定数および速度定数の評価
ｐｐ２６Ｋ９／ＰＴ複合体形成に関する平衡定数および速度定数を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置を用いてＨＢＳ／ＥＰ分析緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０）中で室温にて評価した。さまざまな濃度のｐｐ２６−Ｋ９（濃度２．５ｎＭから１００ｎＭ）の、ＣＭ５チップ上に固定化されたＰＴ（アミンカップリング法による６０００ＲＵの固定化）への結合は、流速３０μｌ／分にて分析した。ＰＴ結合ペプチドの定量的溶出は３ｍＭ ＨＣｌ、ｐＨ ２．５を用いて得られた。推論できる平衡定数および速度定数をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析し、その結果を下記に示す：
解離平衡定数ＫＤ→７．５ｘ１０−９Ｍ
結合平衡定数ＫＡ→１．３ｘ１０−８Ｍ−１
結合速度定数ｋｏｎ→１．３ｘ１０５Ｍ−１ｘｓ−１
解離速度定数ｋｏｆｆ→１０−３Ｓ−１
本発明は好ましい実施形態に関して記載されている一方、当業者は変化および修飾を考えうることが理解される。従って、付属の請求項は、請求される通りの本発明の範囲内にあるそのような同等の変化の全てを包含することが意図される。
【０１０９】
他の実施態様
１．下記のペプチドから選択され、百日咳毒素を結合させる能力を有することを特徴とするペプチド：
ＲＳＳＨＣＲＨＲＮＣＨＴＩＴＲＧＮＭＲＩＥＴＰＮＮＩＲＫＤＡ（ｐｐ２６−５）；
ＳＴＭＮＴＮＲＭＤＩＱＲＬＭＴＮＨＶＫＲＤＳＳＰＧＳＩＤＡ（ｐｐ２６−６）；
ＲＳＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤＤＡ（ｐｐ２６−９）；
ＲＳＷＲＤＴＲＫＬＨＭＲＨＹＦＰＬＡＩＤＳＹＷＤＨＴＬＲＤＡ（ｐｐ２６−１５）；
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＡＲＷＤＬＶＣＣＥＰＬＥＣＩＹＴＳＥＬＹＡＴＣＧ（Ｇ−９）；
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＥＬＡＶＤＥＣＣＥＰＬＥＣＦＱＭＧＨＧＦＫＲＣＧ（Ｇ−１０）
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＳＱＳＶＰＭＣＣＥＰＬＥＣＫＷＦＮＥＮＹＧＩＣＧＳ（Ｇ−１５）； および、
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＥＬＡＩＤＥＣＣＥＰＬＥＣＴＫＧＤＬＧＦＲＫＣＧ（Ｇ−１９）。
【０１１０】
２．ＲＳＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤＤＡ（ｐｐ２６−９）またはＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＳＱＳＶＰＭＣＣＥＰＬＥＣＫＷＦＮＥＮＹＧＩＣＧＳ（Ｇ−１５）であることを特徴とする実施態様１記載のペプチド。
【０１１１】
３．ＤＮＡ−ペプチド融合物を作製する方法であって：
（ａ）ペプチド受容体に結合した核酸逆転写プライマーを、ペプチドをコードするＲＮＡに共有結合させ；
（ｂ）前記ＲＮＡを翻訳して、逆転写プライマーに共有結合しているペプチドを生じさせ；さらに、
（ｃ）前記ＲＮＡを逆転写して、ＤＮＡ−ペプチド融合物を生じさせる；工程を含み、
前記ペプチドが百日咳毒素に対する結合親和性を有することを特徴とする方法。
【０１１２】
４．ＤＮＡ−ペプチド融合物を作製する方法であって：
（ａ）ＲＮＡ−ペプチド融合物を作製し；
（ｂ）核酸逆転写プライマーを前記融合物にハイブリダイズさせ；
（ｃ）前記プライマーを前記融合物に共有結合させ；さらに
（ｄ）前記ＲＮＡ−ペプチド融合物のＲＮＡを逆転写してＤＮＡ−ペプチド融合物を生じさせる；工程を含み、
前記ペプチドが百日咳毒素に対する結合親和性を有することを特徴とする方法。
【０１１３】
５．ＤＮＡ−ペプチド融合物を作製する方法であって：
（ａ）ペプチド受容体に共有結合したＲＮＡ分子を提供し；
（ｂ）核酸逆転写プライマーを前記ＲＮＡ分子に共有結合させ；
（ｃ）前記ＲＮＡ分子を翻訳してペプチドを生じさせ；さらに
（ｄ）前記ＲＮＡ分子を逆転写してＤＮＡ−ペプチド融合物を生じさせる；工程を組み合わせて含み、
前記ペプチドが百日咳毒素に対する結合親和性を有することを特徴とする方法。
【０１１４】
６．実施態様３から５いずれか１項記載の方法を用いて調製されたＤＮＡ−ペプチド融合物。
【０１１５】
７．実施態様３から５いずれか１項記載の方法を用いて同定された百日咳毒素に対する親和性を有するペプチド。
【０１１６】
８．ビオチン化されていることを特徴とする実施態様１、２または７記載のペプチド。
【０１１７】
９．百日咳毒素を含む生物溶液に、固相担体に結合した実施態様１、２または７記載の少なくとも１つのペプチドを接触させて百日咳毒素−ペプチド複合体を形成し、さらにその複合体を前記生物溶液中の他の成分から単離する工程を含むことを特徴とする百日咳毒素を精製する方法。
【０１１８】
１０．百日咳毒素を前記複合体から遊離させさらに単離することを特徴とする実施態様９記載の方法。
【０１１９】
１１．前記複合体の周囲環境のｐＨを変化させることによって、百日咳毒素を該複合体から遊離させることを特徴とする実施態様１０記載の方法。
【０１２０】
１２．酸性ｐＨを有する溶液に前記複合体をさらすことを特徴とする実施態様１１記載の方法。
【０１２１】
１３．塩基性ｐＨを有する溶液に前記複合体をさらすことを特徴とする実施態様１１記載の方法。
【０１２２】
１４．複合体の周囲環境のイオン強度を変化させることによって、百日咳毒素を該複合体から遊離させることを特徴とする実施態様１０記載の方法。
【０１２３】
１５．高濃度の１以上のイオン塩を有する溶液に前記複合体をさらすことによって、イオン強度を変化させることを特徴とする実施態様１４記載の方法。
【０１２４】
１６．前記イオン塩が、塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムの少なくとも１つであることを特徴とする実施態様１５記載の方法。
【０１２５】
１７．前記イオン塩が塩化マグネシウムであることを特徴とする実施態様１６記載の方法。
【０１２６】
１８．前記固相担体がビーズであることを特徴とする実施態様９〜１７いずれか１項記載の方法。
【０１２７】
１９．前記固相担体がセファロースを含むことを特徴とする実施態様９〜１７いずれか１項記載の方法。
【０１２８】
２０．前記固相担体がストレプトアビジンセファロースから成ることを特徴とする実施態様１９記載の方法。
【０１２９】
２１．前記ペプチドがビオチン化されており、該ペプチド上のビオチン部分とストレプトアビジンセファロース上のストレプトアビジン部分との相互作用を介してペプチドが固相担体に結合していることを特徴とする実施態様２０記載の方法。
【０１３０】
２２．百日咳毒素に対する結合親和性を有するペプチドのＤＮＡ−ペプチド融合物を単離する方法であって：
（ａ）ペプチド受容体に結合した核酸逆転写プライマーを、ペプチドをコードするＲＮＡに共有結合させ；
（ｂ）ＲＮＡを翻訳して、逆転写プライマーに共有結合したペプチドを生じさせ；さらに
（ｃ）ＲＮＡを逆転写して、ＤＮＡ−ペプチド融合物を生じさせ；
（ｄ）ＤＮＡ−ペプチド融合物に、固相担体に結合した百日咳毒素を接触させて、ＤＮＡ−ペプチド融合物−百日咳毒素複合体を形成し；
（ｅ）前記複合体を、百日咳毒素と複合体形成しなかったＤＮＡ−ペプチド融合物から単離し；さらに
（ｆ）ＤＮＡ−ペプチド融合物をＤＮＡ−ペプチド融合物−百日咳毒素複合体から単離する；工程を組み合わせて含むことを特徴とする方法。
【０１３１】
２３．百日咳毒素に対する結合親和性を有するペプチドを同定する方法であって、実施態様２２記載の方法を実し、さらに、ＤＮＡ−ペプチド融合物のペプチド部分のアミノ酸配列を特定する工程を含むことを特徴とする方法。
【０１３２】
２４．百日咳毒素に対する結合親和性を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列を同定する方法であって、実施態様２２記載の方法を実施し、さらに、ＤＮＡ−ペプチド融合物のＤＮＡ部分のヌクレオチド配列を特定する工程を含むことを特徴とする方法。
【０１３３】
２５．実施態様１０記載の方法によって単離された百日咳毒素を含む免疫組成物。
【０１３４】
２６．百日咳毒素を結合させる能力を有し、さらに図３〜１４のいずれかに示されるペプチドのアミノ酸配列を有することを特徴とするペプチド。
【０１３５】
２７．前記百日咳毒素に対する結合親和性を有するペプチドのアミノ酸配列が、グマリンまたはＰＰ２６に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする実施態様３〜５または９〜２４いずれか１項記載の方法。
【０１３６】
２８．前記百日咳毒素に対する結合親和性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列が、グマリンまたはＰＰ２６に由来するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする実施態様３〜５または９〜２４いずれか１項記載の方法。
【０１３７】
２９．百日咳毒素を結合させる能力を有し、さらにアミノ酸配列ＬＧＨＧＬＧＹＡＹを含むことを特徴とするペプチド。
【０１３８】
３０．アミノ酸配列ＥＬＡＶＤ、ＥＬＡＩＤ、またはＡＲＷＤＬＶをさらに含むことを特徴とする実施態様２９のペプチド。
【０１３９】
３１．百日咳毒素を結合させる能力を有し、さらにアミノ酸配列ＴＴＡＳＫＳまたはＫＷＴＮＥＨＦＧＴの少なくとも１つを含むことを特徴とするペプチド。
【０１４０】
３２．アミノ酸配列ＴＴＡＳＫＳおよびＫＷＴＮＥＨＦＧＴを含むことを特徴とする実施態様３１記載のペプチド。
【０１４１】
３３．百日咳毒素を結合させる能力を有し、さらに下記の群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするペプチド：
ＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤ；
ＶＧＴＴＩＲＩＡＱＤＴＥＨＹＲＮＶＹＨＫＬＳＱＹＳＲ；
ＷＴＳＭＱＧＥＴＬＷＲＴＤＲＬＡＴＴＫＴＳＭＳＨＰＰ；
ＬＳＡＬＲＲＴＥＲＴＷＮＴＩＨＱＧＨＨＬＥＷＹＰＰＡ；
ＬＳＲＬＡＲＴＥＲＴＷＤＲＩＨＱＧＨＨＬＥＷＨＰＰＡ；
ＴＭＮＴＮＲＭＤＩＱＲＬＭＴＮＨＶＫＲＤＳＳＰＧＳＩ；
ＬＳＡＬＭＲＴＥＲＴＷＮＴＩＨＱＧＨＨＬＥＷＹＰＰＡ；
ＣＬＡＴＲＮＧＦＶＭＮＴＤＲＧＴＹＶＫＲＰＴＶＬＱ；および
ＣＬＡＴＲＮＧＦＶＱＭＮＴＤＲＧＴＹＶＫＲＰＴＶＬＱ。
【０１４２】
３４．百日咳毒素を結合させる能力を有し、さらにアミノ酸配列ＸＸＡＸＲＸＸＸＸＸＸＮＴＸＸＸＸＸＸＸＸＸＴ、または
ＸＸＡＸＲＸＸＸＸＸＸＮＴＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹを含み、ここでＸは任意のアミノ酸であることを特徴とするペプチド。
【０１４３】
３５．百日咳毒素を結合する能力を有し、さらにアミノ酸配列ＶＸＸＸＸＸＸＸＸＤＴＸＸＸＸＲＸＸＸＸＸＬＳを有し、ここでＸは任意のアミノ酸であることを特徴とするペプチド。
【０１４４】
３６．少なくとも１つのアミノ酸が保存的に置換されていることを特徴とする実施態様２９〜３５いずれか１項記載のペプチド。
【０１４５】
３７．ビオチン化されていることを特徴とする実施態様２９〜３６いずれか１項記載のペプチド。
【０１４６】
３８．百日咳毒素を含む生物溶液に、固相担体に結合した実施態様２９〜３７に記載の少なくとも１つのペプチドを接触させて百日咳毒素−ペプチド複合体を形成し、さらにその複合体を前記生物溶液中の他の成分から単離する工程を含むことを特徴とする、百日咳毒素を精製する方法。
【０１４７】
３９．前記百日咳毒素を複合体から遊離させさらに単離することを特徴とする実施態様３８記載の方法。
【０１４８】
４０．前記複合体の周囲環境のｐＨを変化させることによって、百日咳毒素を該複合体から遊離させることを特徴とする実施態様３９記載の方法。
【０１４９】
４１．酸性ｐＨを有する溶液に前記複合体をさらすことを特徴とする実施態様４０記載の方法。
【０１５０】
４２．塩基性ｐＨを有する溶液に前記複合体をさらすことを特徴とする実施態様４０記載の方法。
【０１５１】
４３．複合体の周囲環境のイオン強度を変化させることによって、百日咳毒素を該複合体から遊離させることを特徴とする実施態様３９記載の方法。
【０１５２】
４４．高濃度の１以上のイオン塩を有する溶液に前記複合体をさらすことによって、イオン強度を変化させることを特徴とする実施態様４３記載の方法。
【０１５３】
４５．前記イオン塩が、塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムの少なくとも１つであることを特徴とする実施態様４４記載の方法。
【０１５４】
４６．前記イオン塩が塩化マグネシウムであることを特徴とする実施態様４５記載の方法。
【０１５５】
４７．前記固相担体がビーズであることを特徴とする実施態様３８〜４６いずれか１項記載の方法。
【０１５６】
４８．前記固相担体がセファロースを含むことを特徴とする実施態様３８〜４６いずれか１項記載の方法。
【０１５７】
４９．前記固相担体がストレプトアビジンセファロースから成ることを特徴とする実施態様４８記載の方法。
【０１５８】
５０．前記ペプチドがビオチン化されており、該ペプチド上のビオチン部分とストレプトアビジンセファロース上のストレプトアビジン部分との相互作用を介してペプチドが固相担体に結合していることを特徴とする実施態様４９記載の方法。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、百日咳毒素（ＰＴ）を精製するための試薬および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
百日咳菌（Bordetella pertussis）によって産生される百日咳毒素（ＰＴ）は、百日咳に対する全てのワクチンの主成分である。ＰＴは典型的には破傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドと併用される。ＰＴの工業生産は、典型的には百日咳菌を規定の培地で培養することによって達成される。ＰＴは次いで周知の技術（すなわち、特許文献１；特許文献２；および非特許文献１； 非特許文献２）を用いて上清から単離および精製される。公知の方法の多くはそれぞれ、マトリクス結合ウシフェチュイン（ＢＦ）またはアシアロフェチュインの使用を必要とし、その起源および純度が重要である。ウシ由来試薬の使用は、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）といったウシ関連疾患に関する幾分の懸念に結びついている。
【０００３】
従って、当業者は、ＢＦに依存しなでＰＴを精製する方法を求めている。１つのそのような方法は、Ｂｏｇｄａｎら（非特許文献２）によって記載されている。ＰＴを結合させることによってウシフェチュインのグリコシド部分を模倣する能力を有するペプチドが、ファージディスプレイシステムを用いて同定された。共通配列ＸＧＳＦＳＧＸ（Ｘは任意のアミノ酸である）を有する３つのペプチド（３Ｇ５：ＮＧＳＦＳＧＦ；３Ｇ８：ＮＧＳＦＳＧＣ；および、３Ｇ２：ＤＧＳＦＳＧＦ）が、ＰＴ−結合能を有するとして同定された。３Ｇ２は、部分精製されたＰＴ調製物からＰＴを精製するためのアフィニティカラムにおも利用された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第6,399,076号明細書
【特許文献２】米国特許第5,877,298号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sekura,et al.J.Biol.Chem.258: 14647-14651,1983
【非特許文献２】Bogdan,et al.Appl.Env.Micro.69 (10): 6272-6279,Oct.2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ウシ製品の不在下でＰＴを精製するためのペプチドを設計および使用するための他の方法が当業者に望まれている。いずれの形態でもフェチュインを使用しない、ＰＴのアフィニティ精製のための試薬および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は百日咳毒素（ＰＴ）を精製するための方法に関する。一実施形態では、ペプチド受容体に結合した核酸逆転写プライマーをＲＮＡに共有結合させ、そのＲＮＡを翻訳してタンパク質産物がプライマーに共有結合するようにペプチド産物を生じさせ、ＲＮＡを逆転写してＤＮＡ−タンパク質融合物を生じさせ、さらにその融合産物を試験してＰＴ結合ペプチドを含有する融合産物を同定することによって、ＤＮＡ−タンパク質融合物を作製する方法を提供する。その後、ペプチドの配列を配列決定によって同定する。他の実施形態では、ＰＴ−結合能を有し、かつ複雑な生物液からＰＴを精製するのに有用であるペプチドを提供する。また、複雑な生物液からＰＴを精製するのに使用するための固相担体および／またはクロマトグラフィー媒体に結合したペプチド、およびそのような精製を実施する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ａ）グルマリンライブラリの模式図。ライブラリのアミノ酸配列に翻訳される位置が強調表示されている。タンパク質部分の配列（アミノ酸５９個の長さ）は１文字アミノ酸コードで表され、Ｘは任意のアミノ酸を示す。ライブラリの翻訳されない部分は灰色の囲みで示す。（ａ）Ｔ７−ライブラリの最適なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのプロモーター、（ｂ） ＴＭＶ−ライブラリの完全なｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のためのタバコモザイクウイルス翻訳開始配列、（ｃ）ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ライブラリの効率的なアフィニティ精製のためのＨｉｓ６タグ、（ｄ）構造的な柔軟なリンカー、（ｅ）アミノ酸をそれぞれ５個および９個含む２つのランダム化ループを有するグルマリンコア、（ｆ）構造的な柔軟なリンカーおよび（ｇ）ピューロマイシン受容体分子との効率的なカップリングのための最適化されたリンカー。Ｂ）グルマリンＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリの構築は下記の反応を含む多段階工程である：ＰＣＲ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ＲＮＡのピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーとの化学的ライゲーション、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳、オリゴｄＴ精製、逆転写およびＨｉｓタグ精製。
【図２−１】ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）選択サイクルの略図。
【図２−２】グルマリンＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ライブラリを用いて実施した、固定化ＰＴに対する連続した６回の選択を示す（表１）。
【図３】ＰＴに対する結合活性を試験すべき選択されたグルマリン変異体。保存された配列モチーフが色付き囲みで強調表示されている。
【図４】ＰＴに対する第４回のグルマリン選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域およびグルマリン足場の定常領域が強調表示されている。ランダム化ループ１および２の位置が示されている。
【図５】ＰＴ（エポキシ）に対する第５ａ回のグルマリン選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域およびグルマリン足場の定常領域が強調表示されている。ランダム化ループ１および２の位置が示されている。
【図６】ＰＴ（ｓｔｒｅｐ）に対する第５ｂ回のグルマリン選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域およびグルマリン足場の定常領域が強調表示されている。ランダム化ループ１および２の位置が示されている。
【図７】ＰＴ（ｓｔｒｅｐ）に対する第６ａ回のグルマリン選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域およびグルマリン足場の定常領域が強調表示されている。ランダム化ループ１および２の位置が示されている。
【図８−１】ＰＴ（ｓｔｒｅｐ）に対する第６ｂ回のグルマリン選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域およびグルマリン足場の定常領域が強調表示されている。ランダム化ループ１および２の位置が示されている。
【図８−２】ＰＰ２６ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ライブラリについて実施した、固定化ＰＴに対する連続６回の選択を示す（表２）。
【図９】ＰＴに対する結合活性を試験すべき選択されたＰＰ２６変異体。保存された配列モチーフが強調表示されている。
【図１０】ＰＴに対する第４回のＰＰ２６選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域が強調表示されている。
【図１１】ＰＴ（エポキシ）に対する第５ａ回のＰＰ２６選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域を淡黄色囲みで示す。保存された配列モチーフが強調表示されている。
【図１２】ＰＴ（ｓｔｒｅｐ）に対する第５ｂ回のＰＰ２６選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域を淡黄色囲みで示す。保存された配列モチーフが強調表示されている。
【図１３】ＰＴに対する第６ａ回のＰＰ２６選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域を淡黄色囲みで示す。保存された配列モチーフが強調表示されている。
【図１４】ＰＴに対する第６ｂ回のＰＰ２６選択の配列分析。各変異体のアミノ酸配列を１文字アミノ酸コードで示す。ライブラリの定常隣接領域が強調表示されている。
【図１５】合成ビオチン化コアペプチドのストレプトアビジンセファロースへの固定化および精製ＰＴとの結合の確認。ＰＴの非結合画分を、結合後の上清の１／４０容の１２％ＮｕＰａｇｅゲルでのＭＥＳ泳動緩衝液を用いた分離によって分析した（上側ゲル）。セファロースに結合したＰＴを分析するため、溶出液の５０％を１２％ＮｕＰａｇｅゲルでＭＥＳ泳動緩衝液を用いて分離した（下側ゲル）。検出は銀染色によって実施した。グルマリンペプチド１５および９を除いて、規定量の精製ＰＴを定量の標準として使用した。
【図１６】試料Ａ（左側ゲル）および試料Ｂ（右側ゲル）からのＰＴの精製。セファロースに結合したＰＴを分析するため、溶出液の５０％を１２％ＮｕＰａｇｅゲルでＭＥＳ泳動緩衝液を用いて分離した（下側ゲル）。検出は銀染色によって実施した。グルマリンペプチド９を除いて、規定量の精製ＰＴを定量の標準として使用した。
【図１７】試料ＡまたはＢから固定化ペプチドｐｐ２６クローン９および１５およびグルマリンクローン９および１５に結合したＰＴの洗浄条件の、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５または５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６の洗浄３回を用いた最適化。ＰＴを１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲルで分析しおよび銀染色によって可視化した。ＰＰＭ：ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｅｒｆｅｃｔマーカー。
【図１８】試料Ｂから固定化ペプチドｐｐ２６クローン９に結合したＰＴの洗浄条件の、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５または５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６の洗浄３〜２０回を用いた最適化。を１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲルで分析しおよび銀染色によって可視化した。
【図１９】ペプチドストレプトアビジンセファロースからの、０．２から２．０Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌを用いたＰＴの溶出。ペプチドに結合したＰＴをペプチド−ストレプトアビジンセファロースから、表示の溶出緩衝液（各２０μｌ）での３回連続洗浄によって置換した。残存物質を続いてゲル装填緩衝液で溶出した。全ての溶出液を１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（１×ＭＥＳ泳動緩衝液）で分析しおよび銀染色によって可視化した。
【図２０】酸性（５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５）または塩基性（１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５）条件下でのペプチドストレプトアビジンセファロースからのＰＴの溶出。ペプチドに結合したＰＴをペプチドストレプトアビジンセファロース（１種類のペプチド２００ｐｍｏｌまでを含む２０μｌ）から、表示の溶出緩衝液（各４０μｌ）での３回連続洗浄によって置換した。残存物質を続いてゲル装填緩衝液で溶出した。全ての溶出液を１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（１×ＭＥＳ泳動緩衝液）で分析しおよび銀染色によって可視化した。ペプチドストレプトアビジンセファロースの試料Ａとのインキュベート後の素通り画分の１／４０容を、各ペプチドについて同一ゲルで分析した。
【図２１】アフィニティリガンドとして固定化ｐｐ２６ペプチド９を有するストレプトアビジンセファロースでの、試料ＢからのＰＴの小スケールカラム精製（Ａ）、精製ＰＴの収量のゲル推定（Ｂ）。
【図２２】アフィニティリガンドとしてグルマリンペプチド１５を有するストレプトアビジンセファロースでの、試料ＢからのＰＴの小スケールカラム精製（Ａ）、精製ＰＴの収量のゲル推定（Ｂ）。
【図２３】ストレプトアビジンセファロース（１ｍｌ当たり）への固定化に用いられたさまざまな量のペプチド（表示の通り）に依存する、ペプチドストレプトアビジンセファロースへのＰＴ結合。結合したＰＴの量は、同一ゲル上の規定量の精製ＰＴとの直接比較によって定量した。例として、ｐｐ２６／９を、ｍｌ当たりのストレプトアビジンセファロースに固定化に用いたペプチドの量に対してプロットする。最高の結合はＰＴ約１００〜１５０ｐｍｏｌで生じると推定された。
【図２４】ペプチドストレプトアビジンセファロース１μｌ当たり、または６．８５ＲＩアシアロフェチュインセファロース６．８５μｌ当たりの、さまざまな量のインプット材料（試料Ｂ）の関数としてのＰＴ収量。溶出したＰＴの量は同一ゲル上の規定量の精製ＰＴとの直接比較を基礎として計算し、および表１２に列記する。
【図２５】繰り返しＰＴ結合および溶出のためのペプチドセファロース再使用。ストレプトアビジンセファロースに結合したＰＴを、１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５を用いて４回溶出し、およびカラムマトリクスを１０ｍＭＨＣｌで再生した。
【図２６】試料Ｂからのｐｐ２６／９ペプチドストレプトアビジンセファロース（０．５ｍｌ）でのＦＰＬＣカラム精製後のＰＴ溶出画分。溶出画分（溶出液各５００μｌのうち０．５μｌ）をＰＡＧＥ（１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル、ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色によって分析した。規定量の精製ＰＴを直接比較のために同一ゲル上で分離した。ＰＴの濃度は溶出画分の２８０ｎｍでの吸収（Ａ２８０）を測定することによって測定し、および精製ＰＴ標準と比較した（表参照）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、百日咳毒素（ＰＴ）を精製するための新規な方法のための試薬および方法論を提供する。上記の通り、１つのそのような方法はＢｏｇｄａｎ，ｅｔ ａｌ．によって示されている。その方法では、ファージディスプレイがＰＴ結合ペプチドを特定するために利用されている。本発明を実施する上で、ＰＴは、自然に発現されたＰＴ、無毒化ＰＴ（遺伝子組換えによりまたはその他）、天然またはその他のＰＴ変異体、組換えＰＴ、ＰＴ断片、または他の種類のＰＴを含む（例えば、米国特許第６，３９９，０７６号；第６，１６８，９２８号；第６，０１８，０２２号；第５，９７７，３０４号；第５，９６５，３８５号；第５，８５６，１２２号；第５，８７７，２９８号；第５，４３３，９４５号；第５，３５８，８６８号；第５，３３２，５８３号；第５，２４４，６５７号；第５，２２１，６１８号；第５，０８５，８６２号；第４，９９７，９１５号明細書を参照）。ほとんどの場合において、ＰＴの精製後に化学的無毒化が実施される。任意の形態のＰＴが、本明細書に記載の試薬がその特定の形態のＰＴを結合させる能力を有する限り、本発明の実施における使用に適している。本明細書中では、全ての引用文献、特許、および出願特許は参照により本開示に含まれる。
【００１０】
本発明はまた、ＰＴ−結合ペプチドを同定するための組換え技術の使用に関する。本発明は、当業界で既に公知である方法を越える効果をもたらす。加えて、ＰＴの精製に有用である新規なペプチドを提供する。一実施形態では、ペプチド受容体に結合した核酸逆転写プライマーをＲＮＡに結合させ、そのＲＮＡを翻訳してタンパク質産物がプライマーに共有結合しているようにペプチド産物を生じさせ、ＲＮＡを逆転写してＤＮＡ−タンパク質融合物を生じさせ、さらに融合産物を試験してＰＴ結合ペプチドを含む産物を同定することによって、ＤＮＡ−タンパク質融合物を作製する方法を提供する。その後、ペプチドの配列を配列決定によって同定する。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ ＨといったＲＮＡ分解化合物を用いた処理によって、ＲＮＡ部分を複合体から除去することができる。光架橋試薬およびペプチド受容体もまた本発明の実施に有用である。この系および関係する試薬は他では例えば、米国特許第６，４１６，９５０号（Ｌｏｈｓｅ，ｅｔ ａｌ）；第６，４２９，３００号（Ｋｕｒｚ，ｅｔ ａｌ．）；第６，４３６，６６５号（Ｋｕｉｍｅｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．）；第６，６０２，６８５号（Ｌｏｈｓｅ，ｅｔ ａｌ）；および，第６，６２３，９２６号明細書（Ｌｏｈｓｅ，ｅｔ ａｌ）に記載されている。
本発明の実施において、核酸、ペプチド、融合、リガンド、アフィニティ複合体などの試薬は、拡散しないように固相担体に結合または付着させてもよい。拡散しないように結合または接着させるために、試薬が液体の存在下で試薬の高濃度の領域から試薬の低濃度の領域へ移動しないように試薬を固相担体と化学的または物理的に結合させる。固相担体は任意のカラム（すなわち、非充填または充填クロマトグラフィー媒体、カラム材料）、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、固相粒子（すなわち、アガロースまたはセファロース）、マイクロチップ（すなわち、シリコン、シリコンガラス、または金チップ）、膜（すなわち、リポソームまたは小胞の膜）、あるいは、直接的または間接的に（例えば、抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、ストレプトアビジン、ビオチンといった他の結合パートナー媒介物を介して）試薬を結合または付着させることができる他の媒体である。
【００１１】
好ましい実施形態では、試薬はＰＴを結合させる能力を有する物質または化合物である。より好ましくは、試薬はＰＴを可逆的に結合させる能力を有する物質または化合物である。さらにより好ましくは、試薬は、ＰＴ以外の成分を含む液体中で、ＰＴを少なくとも結合させ、さらに好ましくは可逆的に結合させる能力を有するペプチドである。ＰＴを可逆的に結合させる試薬は、一定の条件下でＰＴを結合（吸着）させ、さらに別の条件下でＰＴを遊離（脱離）させるものである。例えば、その試薬は、中性ｐＨ条件に曝露されたときにＰＴを結合させ、かつ酸性または塩基性ｐＨの条件への曝露の後ＰＴを遊離させることができる。従って、試薬がＰＴを結合させる能力（すなわち、平衡解離定数またはＫｄ）は、試薬をＰＴと接触させる条件を変化させることによって操作することができる。本分野で公知な他の条件でも特に、温度、イオン強度（すなわち、例えば塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムといったイオン塩の濃度）、溶媒濃度、競合試薬／遊離リガンド／アナログの存在または不在、イオン化特性などの、他の条件を変化させてもよい。
【００１２】
一部の実施形態では、アフィニティマトリクス（すなわち、固相担体に結合したＰＴ結合ペプチド）を利用して目的成分（すなわち、ＰＴ）を生物学的液体またはその他の液体中に見出される複雑な混合物から分離する。一部の場合には、（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定して）ＰＴが液体中の主成分を構成しない細菌溶解物またはその他の組成物といった複雑な生物学的液体からＰＴを精製することが好ましい場合がある。別の場合には、ＰＴは、液体中の成分の大半がＰＴで表されるようにＰＴについて部分精製された組成物（ＰＴ約５０％以上から成る組成物）から単離してもよい。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定してＰＴが組成物中の総タンパク質の約５０％以上から成る組成物は、殆どの状況下で、部分精製されていると考えられる。
【００１３】
ＰＴを精製するために、ＰＴを含む組成物を、固相担体に結合しているＰＴ結合試薬、好ましくは可逆的に結合させるＰＴ結合試薬と、ＰＴとＰＴ結合試薬とが互いに結合して複合体を形成するように十分な時間接触させる。次に非ＰＴ成分を洗浄除去する。その後、ＰＴ−ＰＴ結合試薬の結合のＫｄが増大するように１つ以上の条件（すなわち、ｐＨ）を変化させ、ＰＴが複合体から遊離される。次に、遊離されたＰＴを回収し、さらなる使用のために調製する。そのような分離はアフィニティ精製と称され、そのように精製された産物はアフィニティ精製されていると称される。
【００１４】
アフィニティ精製法よりも選択性が低いと当業者に一般的に考えられているクロマトグラフィー法もまた、本発明の実施に用いることができる。本分野で公知であるように、そのような方法は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。これらの方法のうちの任意のもの（アフィニティ精製を含む）は、例えば低圧クロマトグラフィー（ＬＰＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、またはFast Protein liquid Chromatography（ＦＰＬＣ）に設置した適当な固相担体を用いて実施できる。そのような方法を実施するための適当な固相担体および装置は本分野で広く利用可能である。本発明の実施において、アフィニティクロマトグラフィーおよびより一般化された方法の両方を必要に応じて組み合わせて、開始材料（すなわち、細菌溶解物といった複雑な生物学的液体）を部分精製したり、材料を精製したり、あるいはアフィニティ精製または他の方法で精製された材料（すなわち、アフィニティ精製ＰＴ）をさらに精製することができる。
【００１５】
ＰＴを結合させるペプチドが同定されており、本明細書で開示されている。ある種のペプチドは高い親和性でＰＴを結合させることが分かっている。そのような好ましいＰＴ結合ペプチドとして、下記のペプチドが挙げられる：
ＲＳＳＨＣＲＨＲＮＣＨＴＩＴＲＧＮＭＲＩＥＴＰＮＮＩＲＫＤＡ （ｐｐ２６−５）；
ＳＴＭＮＴＮＲＭＤＩＱＲＬＭＴＮＨＶＫＲＤＳＳＰＧＳＩＤＡ （ｐｐ２６−６）；
ＲＳＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤＤＡ （ｐｐ２６−９）；
ＲＳＷＲＤＴＲＫＬＨＭＲＨＹＦＰＬＡＩＤＳＹＷＤＨＴＬＲＤＡ （ｐｐ２６−１５）；
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＡＲＷＤＬＶＣＣＥＰＬＥＣＩＹＴＳＥＬＹＡＴＣＧ （Ｇ−９）；
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＥＬＡＶＤＥＣＣＥＰＬＥＣＦＱＭＧＨＧＦＫＲＣＧ （Ｇ−１０）
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＳＱＳＶＰＭＣＣＥＰＬＥＣＫＷＦＮＥＮＹＧＩＣＧＳ （Ｇ−１５）； および、
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＥＬＡＩＤＥＣＣＥＰＬＥＣＴＫＧＤＬＧＦＲＫＣＧ （Ｇ−１９）。
これらのうち、特に好ましいペプチドは下記を含む：
ＲＳＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤＤＡ （ｐｐ２６−９）； および、
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＳＱＳＶＰＭＣＣＥＰＬＥＣＫＷＦＮＥＮＹＧＩＣＧＳ （Ｇ−１５）。
例えば、ペプチドの少なくとも１つの特徴または活性（すなわち、活性、抗原性）を有する、例えば、断片、変異体オルソログ、ホモログ、および誘導体といった関連ペプチドもさらに考慮される。断片は、ペプチドの配列（すなわち、核酸またはポリペプチド）の、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有しない）および／またはカルボキシ末端での切断を含む。断片はまた、変異体、オルソログ、ホモログ、および親配列と比較して１つ以上のアミノ酸付加または置換または内部欠失を有する他の変異体を含む。好ましい実施形態では、切断および／または欠失は、アミノ酸約１１個、アミノ酸２個、アミノ酸５個、アミノ酸１０個、アミノ酸２０個、アミノ酸３０個、アミノ酸４０個、アミノ酸５０個、またはそれ以上を含む。変異体とは、親配列と比較して１つ以上の配列の置換、欠失および／または付加を有する配列である。変異体は、天然に存在するかまたは人工的に構築できる。そのような変異体は、対応する核酸分子から調製できる。好ましい実施形態では、変異体は、１から３、または１から５、または１から１０、または１から１５、または１から２０、または１から２５、または１から３０、または１から４０、または１から５０、または５０を超えるアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を有する。
【００１６】
置換は、保存的、または非保存的、またはその任意の組み合わせであってよい。ポリペプチドの配列への保存的アミノ酸修飾（およびそれをコードするヌクレオチドへの対応する修飾）は、親ポリペプチドと同様の機能的および化学的特徴を有するポリペプチドを生じ得る。例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性、または親水性に対して影響がほとんどまたはまったく無い、および特に免疫原性の低下を結果として生じないような、天然アミノ酸残基の非天然残基での置換を含む。適当な保存的アミノ酸置換を表Ｉに示す：
ＰＴのような成分は、もともと共存しているタンパク質、脂質、糖質、または他の材料（すなわち、細菌溶解物）の少なくとも約５０％から分離されている場合に、精製されていると称される。成分は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して組成物の総タンパク質含量の少なくとも約９５〜１００％、９０〜９５％、８０〜９０％、７０〜８０％、６０〜７０％または５０〜６０％から分離されていることが好ましい。一部の実施形態では、精製成分とは、その成分が単独でまたは他の物質と組み合わせて投与された宿主において免疫反応を誘導するのに有用なものである。免疫反応は、例えば、ＰＴまたは百日咳菌の少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の産生および／またはＰＴを発現する細胞に対する細胞性免疫反応の誘導を含むであろう。免疫反応は、例えば、抗体産生の増加、抗原に対するより高い親和性を有する抗体の産生、または細胞性反応の増大（すなわち、Ｔ細胞の増加）を生じることによる、現在の免疫反応の増進である。免疫反応の他の指標は本分野で公知であり、免疫反応が生じているかどうかを判定するのに適している。
【００１７】
本明細書に記載の方法を用いて単離されたＰＴは、医薬組成物として調製することができる。好ましい医薬組成物は、例えば、懸濁剤、シロップ剤、またはエリキシル剤といった液体調製物中にＰＴを含む。好ましい注射用調製物は、例えば、滅菌懸濁剤または乳剤といった、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与に適したペプチドを含む。例えば、ＰＴは、滅菌水、生理食塩水、グルコースなどといった、適当なキャリヤー、希釈剤、または添加物と混合した組成物として調製することができる。組成物はまた、例えば、等張水性生理食塩水緩衝液中での再構成のための凍結乾燥形で提供してもよい。そのような組成物はまた、例えば、米国特許第５，８７７，２９８号および第６，３９９，０７６号明細書（Ｖｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．）および国際出願番号第ＰＣＴ／ＣＡ９６／００２７８号に記載のようなワクチンとして調製および利用することができる。本明細書に記載のように調製されたＰＴはまた、本分野で公知である他のものの中でも特に、コリネバクテリウム（すなわち、ジフテリア）、クロストリジウム（すなわち、破傷風）、ポリオウイルス（すなわち、ＩＰＶ、ＯＰＶ）、肝炎ウイルス、ナイセリア（すなわち、髄膜炎菌）、ストレプトコッカス、ヘモフィルス、または他の百日咳抗原（すなわち、繊維状赤血球凝集素、パータクチン、および凝集原）といった疾患の原因となる生物に由来する他の抗原と組み合わせてもよい。
【００１８】
本発明およびその多数の利点は、例示として示される下記の実施例からより詳細に理解できるであろう。
【実施例】
【００１９】
材料および方法
Ａ．百日咳毒素（ＰＴ）
ＰＴはＭＷ１０９ｋＤのヘテロオリゴマータンパク質複合体である（６個のサブユニットＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４×２、Ｓ５から成る）。硫酸アンモニウム沈澱物として調製された高純度（＞９９．９９％）調製物を使用した。天然の六量体複合体を認識するＰＴ特異的リガンド（アシアロフェチュイン）もまた使用した。アシアロフェチュインは可溶化型およびセファロース固定化型で入手可能である。
【００２０】
Ｂ．グマリンライブラリ選択
グルマリンは、ガガイモ科のつる性植物Ｇｙｍｎｅａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｅに由来する３５残基のポリペプチドである。グルマリンは、ラットにおいて甘味物質に対する神経反応を選択的に阻害する能力のため、甘味伝達の研究における薬理学的手段として利用されている。グルマリンはヒトにおいて明らかな作用を持たない。グルマリンの味覚抑制は、甘味受容体に直接結合するかまたは甘味伝達系の下流標的と相互作用することによって、そのペプチドが原因となり得ることが示唆されている（１）。
【００２１】
グルマリンは、通常４０残基未満の長さの構造的に関連するタンパク質の群である「ノッチン(knottins)」ファミリーに属する。ノッチンはタンパク質、糖質および脂質を含む幅広い分子標的に結合するが、しかし小さい三重鎖逆平行βシートおよびジスルフィド結合骨格を含む共通の足場(scaffold)を共有する（２，３）。
下記の通り、１５個のランダム化されたアミノ酸位置を有する特殊なグルマリンライブラリを設計した：
野生型グマリン：ｑｑＣＶＫＫＤＥＬＣＩＰＹＹＬＤＣＣＥＰＬＥＣＫＫＶＮＷＷＤＨＫＣｉｇ
グマリンコア：ＣＶＫＫＤＥＬＣＸＸＸＸＸＸＣＣＥＰＬＥＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＣ
グマリンコア配列中で、Ｘは任意のアミノ酸を表す。このライブラリは、タンパク質標的に対する高親和性結合物質(binder)をもたらすことが確認された。グルマリンライブラリは、少なくとも下記の理由のために、ＰＴ毒素に対する選択のための最良の選択肢となる一連の利点を併せ持つ：制限された自由度(flexibility)：標的トポロジーへの適合における高エントロピーコストを埋め合わせる；リニアライブラリよりも理論的に少数のアミノ酸で高い親和性；プロテアーゼに対する耐性；および下流用途における酸化還元溶出条件に対する感受性。グルマリンライブラリは図１に示す工程を用いて構築された。
【００２２】
１．開始オリゴヌクレオチドのＰＣＲ
３種類のゲル精製オリゴを用いて、２つのランダム化ループを有するグルマリンライブラリを構築した。１ｎｍｏｌのグルマリンテンプレート（≒約６×１０１４配列）５'−ＡＧＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧＣ ＴＧＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＡＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＴＧＣ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＧＣ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＮＮＳ ＴＧＣ ＧＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＧＴ ＴＣＴ ＧＧＧ ＴＣＴ ＡＧＣ−３'を、１μＭの５'−Ｈｉｓタグプライマー５'−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＡ ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＴＡ ＴＴＴ ＡＣＡ ＡＴＴ ＡＣＡ ＡＴＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＡＧＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＣＡ−３'および１μＭの３'−プライマー５'−ＴＴＴ ＴＡＡ ＡＴＡ ＧＣＧ ＧＡＴ ＧＣＴ ＡＣＴ ＡＧＧ ＣＴＡ ＧＡＣ ＣＣＡ ＧＡＡ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＴ−３'を使用して、Ｔａｑ−ポリメラーゼを用いて、６回のＰＣＲ（９４℃で１分間；６５℃で１分間；７２℃で１分間）で増幅し、さらに２％アガロースゲルで分析し、ゲルは代表的ライブラリが構築されていたことを示した。
【００２３】
２．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ｄｓＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＲｉｂｏＭａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットを用いてＲＮＡに転写した。３７℃で４５分間インキュベート後、ＤＮａｓｅＩを添加し、さらに３７℃でインキュベートをさらに１５分間続けた。この混合物にフェノール／クロロホルム抽出を施した。過剰のＮＴＰは、ＮＡＰ−５ゲルろ過（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって除去した。ＲＮＡを６％−ＴＢＵ−ゲルで分析し、ｄｓＤＮＡが効率的に転写されたことが示唆された。
【００２４】
３．ＲＮＡとピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーとの化学カップリング
精製ＲＮＡを、１．５倍過剰のピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーＰＥＧ２Ａ１８：５'−ソラレン−ＵＡＧ ＣＧＧ ＡＵＧ Ｃ Ａ１８ （ＰＥＧ−９）２ ＣＣ ピューロマイシン （斜体で示されるヌクレオチドは２'−Ｏ−メチル−誘導体を表す）にアニーリングさせる（８５℃で１分間、０．３℃／秒のペースで２５℃まで冷却）。共有結合カップリングは、室温で（ＲＴ）１５分間、ＵＶ光（３６５ｎｍ）照射によって実施した。反応産物を６％−ＴＢＵゲルで分析し、結合反応が効率的に進んだことが示唆された。
【００２５】
４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳
ライゲーションしたＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のウサギ網状赤血球溶解物を用いて１５μＣｉ３５Ｓ−メチオニン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で翻訳した。３０℃で３０分間インキュベートした後、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２をそれぞれ終濃度５３０ｍＭおよび１５０ｍＭになるように添加し、さらに試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ゲルは翻訳反応が成功したことを示唆した。
【００２６】
５．オリゴｄＴ精製
分子（ｍＲＮＡ−タンパク質融合物）を、オリゴｄＴ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含むインキュベート緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と共に４℃で５分間インキュベートすることによって単離した。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）分子は、ＭｉｎｉＭＡＣＳ−カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を介したろ過、インキュベート緩衝液での洗浄および水での溶出によって単離した。試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、反応が成功したことが示唆された。
【００２７】
６．逆転写
対応するｃＤＮＡ鎖は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いた逆転写によって取扱説明書の条件下で、５倍過剰の３'−プライマーを用いて作製した。試料を４〜２０％ Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、反応が成功したことが示唆された。
【００２８】
７．Ｈｉｓタグ精製
逆転写されたＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）分子を、Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロース（５０μｌ／１０ｐｍｏｌ ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ）（ＱＩＡＧＥＮ）を含むＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００μｇ／ｍｌ断片化サケ精子ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）と混合し、さらに室温で６０分間緩やかに振とうさせながらインキュベートした。次に、Ｎｉ−ＮＴＡをろ過し、ＨＢＳ／５ｍＭイミダゾールで洗浄し、さらにＰＲＯｆｕｓｉｏｎをＨＢＳ／１５０ｍＭイミダゾールで溶出した。試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、精製が成功したことが示唆された。２０ｐｍｏｌ（≒約１×１０１３種の配列）の分子を、各選択についてインプット（投入）として用いる。
【００２９】
Ｂ．選択用リニアペプチドライブラリＰＰ２６
下記の構造を用いて、２６個のランダム化されたアミノ酸位置を有する特殊なリニアペプチドライブラリＰＰ２６を設計した：
Ｔ７−ＴＭＶ−ＭＧＲＧＳ−ＨＨＨＨＨＨ−ＡＲＳ−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−ＤＡＮＡＰＫ−ＡＳＡＩ
タンパク質部分の配列（長さ５０アミノ酸）は１文字アミノ酸コードで示され、ここでＸは任意のアミノ酸を表す。ライブラリの翻訳されない部分は下記を含む：（ａ）Ｔ７：ライブラリの最適なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７プロモーター；および（ｂ）ＴＭＶ：ライブラリの完全なｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳のためのタバコモザイクウイルス翻訳開始配列。ＭＧＲＧＳは構造的な柔軟なリンカーを表す。ＨＨＨＨＨＨはＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリの効率的なアフィニティ精製のためのＨｉｓタグを表す。ＡＲＳは第二の構造的な柔軟なリンカー(structural, flexible linker)を表す。ＤＡＮＡＰＫは第三の構造的な柔軟なリンカーを表す。ＡＳＡＩはピューロマイシン受容体分子との効率的なカップリングのために最適化されたリンカーを表す。
【００３０】
このライブラリは、タンパク質標的に対する高親和性結合物質をもたらすことが確認された。ＰＰ２６ライブラリは、クロマトグラフィーアフィニティ試薬の選択に関して優れた選択肢となる２つの主な長所を併せ持つ：高い自由度：標的のトポロジーに適合できる；および保存構造の不在による頑健性、結果として生じる結合物質は厳しい生物物理学的条件に耐性である。
【００３１】
１．開始オリゴヌクレオチドのＰＣＲ
３種類のゲル精製オリゴを用いて、２つのランダム化ループを有するグルマリンライブラリを構築した。１ｎｍｏｌのＰＰ２６ テンプレート（≒約６×１０１４種の配列）５'−ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＣ ＣＴＴ ＣＧＧ ＡＧＣ ＧＴＴ ＡＧＣ ＧＴＣ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＳＮＮ ＡＧＡ ＴＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ Ａ−３'を、１μＭの５'−Ｈｉｓタグプライマー５'−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＴＡＧ ＧＧＡ ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＴＡ ＴＴＴ ＡＣＡ ＡＴＴ ＡＣＡ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＧＴ ＧＧＣ ＴＣＡ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＧＣＴ ＡＧＡ ＴＣＴ −３'および１μＭの３'−プライマー５'−ＡＡ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＣ ＣＴＴ ＣＧＧ ＡＧＣ ＧＴＴ ＡＧＣ −３'を使用して、６回のＰＣＲ（９４℃１分間；６５℃１分間；７２℃１分間）でＴａｑ−ポリメラーゼを用いて増幅し、さらに２％アガロースゲルで分析した。
【００３２】
２．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ｄｓＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＲｉｂｏＭａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットを用いてＲＮＡに転写した。３７℃で４５分間インキュベートした後、ＤＮａｓｅＩを添加し、さらに３７℃でインキュベートをさらに１５分間続けた。この混合物にフェノール／クロロホルム抽出を施した。過剰のＮＴＰを、ＮＡＰ−５ゲルろ過（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって除去した。ＲＮＡの転写を、６％−ＴＢＵ−ゲルでの分析によって確認した。
【００３３】
３．ＲＮＡおよびピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーの化学カップリング
精製ＲＮＡを、１．５倍過剰のピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーＰＥＧ２Ａ１８：５'−ソラレン−ＵＡＧ ＣＧＧ ＡＵＧ Ｃ Ａ１８ （ＰＥＧ−９）２ ＣＣ ピューロマイシン（斜体で示されるヌクレオチドは２'−Ｏ−メチル−誘導体を表す）とアニーリングさせた（８５℃で１分間、０．３℃／秒のペースで２５℃まで冷却）。共有カップリングは、室温（ＲＴ）で１５分間ＵＶ光（３６５ｎｍ）照射によって実施した。反応を６％−ＴＢＵ−ゲルでの反応産物の分析によって確認した。
【００３４】
４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳
ライゲーションしたＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のウサギ網状赤血球溶解物を用いて、１５μＣｉ３５Ｓ−メチオニン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で翻訳した。３０℃で３０分間インキュベートした後、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２をそれぞれ終濃度５３０ｍＭおよび１５０ｍＭになるように添加し、さらに翻訳を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析によって確認した。
【００３５】
５．オリゴｄＴ精製
分子（ｍＲＮＡ−タンパク質融合物）を、オリゴｄＴ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含むインキュベート緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と共に４℃で５分間インキュベートすることによって単離した。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）分子は、ＭｉｎｉＭＡＣＳ−カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を介したろ過、インキュベート緩衝液での洗浄および水での溶出によって単離した。反応を確認するために、試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００３６】
６．逆転写
対応するｃＤＮＡ鎖は、取扱説明書の条件下で、５倍過剰の３'−プライマーを用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いた逆転写によって作製した。転写を確認するために、試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００３７】
７．Ｈｉｓタグ精製
逆転写されたＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）分子を、Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロース（５０μｌ／１０ｐｍｏｌ ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ）（ＱＩＡＧＥＮ）を含むＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００μｇ／ｍｌ断片化サケ精子ＤＮＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）と混合し、さらに室温で６０分間緩やかに振とうさせながらインキュベートした。次に、Ｎｉ−ＮＴＡをろ過し、ＨＢＳ／５ｍＭイミダゾールで洗浄し、さらにＰＲＯｆｕｓｉｏｎをＨＢＳ／１５０ｍＭイミダゾールで溶出した。反応を確認するために、試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。２０ｐｍｏｌ（≒約１×１０１３種の配列）の分子を、各選択についてインプット（投入）として用いる。
【００３８】
Ｃ．標的調製
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）技術では、最大１０１３種の異なるＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子（ｍＲＮＡ−タンパク質融合物）から成る高度に多様な物質ライブラリが、高アフィニティ結合に関して所望の標的（タンパク質、糖質または脂質）に対して選択される。この工程で、標的は通常、固相に固定化される。これらの固相は好ましくは、選択処理中の迅速および効率的な取り扱いを可能にしさらに低バックグラウンドをもたらす磁気ビーズである。
【００３９】
１．ヌクレアーゼ活性に関して標的を試験
標的（５μｇのＰＲＰおよび０．５μｇのＰＴ）を、０．１２ｐｍｏｌの放射性標識化ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリ分子とそれぞれ４℃および室温（ＲＴ）で接触させ、次いで１時間および１６時間インキュベートした。インキュベート後の分子の完全性は、４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くオートラジオグラフィーによって確認した。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子の分解は検出されず、従って標的はヌクレアーゼを含まないことが実証された。
【００４０】
２．プロテアーゼ活性に関して標的を試験
標的（５μｇのＰＲＰおよび０．５μｇのＰＴ）を、１μｇの精製ＧＳＴ−タンパク質とそれぞれ４℃および室温で接触させ、次いで１時間および１６時間インキュベートした。インキュベート後のＧＳＴ−タンパク質の完全性は、４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび続くクマシーブリリアントブルー染色によって分析した。ＧＳＴ−タンパク質分子の分解は検出されず、従って標的はプロテアーゼを含まないことが実証された。
【００４１】
Ｄ．ＰＴの固定化
１．ＰＴの再構成
Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ社から入手した沈澱物５００μｌ（２．２６ｍｇ／ｍｌ）を２１．４００ｘｇで室温にて４５分間遠心分離した。上清を廃棄し；沈澱を１１００μｌのＣＴＷ緩衝液（０．２８６ｇ ＮａＨＣＯ３、０．１７０ ｇ Ｎａ２ＣＯ３、５０μｌ Ｔｗｅｅｎ−８０、５０ ｍｌのＭｉｌｌｉＱ Ｈ２Ｏに加える）に溶解させた。このＰＴ調製物の品質を検査するため、一連の希釈物（２５０ｎｇ、５００ｎｇ、１μｇ、２．５μｇ、５μｇおよび１５μｇ）を、ＭＥＳ緩衝液で泳動する４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。少なくとも４本のバンドが明瞭に分離でき、サブユニットＳ１（２８ｋＤ）、Ｓ２（２３ｋＤ）、Ｓ３（２２ｋＤ）およびＳ４（１１．７ｋＤ）に対応した。ＰＴ−複合体中の最小のタンパク質５（９．３ｋＤ）は見られなかった。おそらく、このバンドはこのゲルシステム中で、わずかだけ大きいＳ４サブユニットと共に移動する。
【００４２】
２．カップリング戦略
磁気粒子へのタンパク質の固定化のためのいくつかの方法が確立された。原理的に二つの主な戦略が用いられる：標的タンパク質の一級アミン基およびスルフヒドリル基をエポキシ活性化磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）に共有結合でつなぎ、安定なアミド結合またはチオエーテル結合を形成する。この反応は、反応を促進するため硫酸アンモニウムの存在下で実施され、さらに通常、標的タンパク質の非常に効率的なカップリングを結果として生じる。いずれにしろ、ある種のタンパク質はこれらの条件下で構造変化を受けるように思われ、結合しているが天然でないおよび／または不活性な立体構造を結果として生じる；さらに、標的タンパク質の一級アミノ基およびスルフヒドリル基を、ＮＨＳエステル活性化ビオチン誘導体（Ｐｉｅｒｃｅ）に共有結合によってつなぎ、その後、ビオチン化されたタンパク質をストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）に固定化させる。
【００４３】
通常、所定の標的に反応条件が適している場合は、エポキシビーズへの標的タンパク質のカップリングが好ましく、それはビーズ上に標的だけが提示されることをこの方法が確実にするからである。ビオチン／ストレプトアビジンカップリングの場合は、ビーズはストレプトアビジンも提示し、選択中に抗ストレプトアビジン結合物質の濃縮をもたらし得る。従って、Ｐｈｙｌｏｓは、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリからストレプトアビジン結合物質を予め除いて、所定の標的について高品質の結果を得るための特化した方法を確立している。しかし全体として、共有結合カップリングは通常、標的特異的結合物質のより迅速な濃縮を結果として生じる。具体的にＰＴの場合には、硫酸アンモニウムインキュベートはＰＴ−タンパク質の機能に影響しないことが知られているため、共有結合カップリング戦略で開始するのが非常に合理的である。
【００４４】
３．エポキシビーズ（Ｄｙｎａｌ）へのカップリング条件の最適化
ＰＴのためのカップリング条件をいくつかの独立した実験で最適化した（様々な硫酸アンモニウム濃度（０．５〜２．０Ｍ）および様々なビーズ／標的比、ならびに時間および温度依存性（２分間〜１６時間；８℃〜ＲＴ）を用いて）。下記の反応条件で最良の結果が観察された：ＰＴ１００μｇ、ビーズ３．３×１０８個および硫酸アンモニウム終濃度１Ｍから成る終容量３００μｌを室温で２分間から６０分間２ｍｌエッペンドルフチューブ中でインキュベートした。インキュベート後、チューブを磁石中に４分間置いてビーズを落とし、さらに上清を続くゲル分析のために保存した。ビーズを１ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）で１回洗浄し、さらにビーズの一部（ビーズの５％）を４〜１２％ＢｉｓＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、結合したタンパク質の量を測定した。ＰＴのエポキシビーズへのカップリングは、ほんの２分間の反応後でさえ非常に効率的に生じることが認められた。
【００４５】
４．エポキシビーズへのＰＴの半予備カップリング
２．６ｍｇの乾燥エポキシ活性化ビーズ（Ｍ−２７０、Ｄｙｎａｌ）（〜ビーズ１．７×１０８個）を１ｍｌリン酸緩衝液（１９ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、８１ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）に再懸濁させ、さらに１０分間平衡化させた。新しいリン酸緩衝液を用いて平衡化を２回繰り返した。続いてビーズを、４８０ｐｍｏｌの再構成ＰＴ（１μｇ／μｌを含むＣＴＷ緩衝液）を含む１Ｍ硫酸アンモニウム（終容量１５７μｌ）とのカップリング反応に直接用いた。室温で１５分間連続攪拌しながらインキュベートした後、ビーズを３００μｌのＨＢＳ緩衝液で洗浄し、次いでＨＥＰＥＳ緩衝液での３回の洗浄工程を実施し、さらに最後に２４０μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁させ、小分けして４℃で保存した。カップリング反応の効率は、全ての洗浄画分、カップリング反応の上清、および洗浄したビーズからＳＤＳ装填緩衝液(loading buffer)によって除去可能なＰＴの画分の、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析によって確認した。
【００４６】
５．エポキシ−ビーズ固定化ＰＴのアシアロフェチュインへの結合についての分析
４０μｌのＰＴ誘導体化ビーズを、３２０ｐｍｏｌのアシアロフェチュインを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）と室温で１時間インキュベートし（反応終容量２００μｌ）、２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液で２〜７回洗浄し、さらに最後に３０μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁させた。ビーズの５０％をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して反応を確認した。
【００４７】
４℃で１週間保存後のこれらのＰＴ誘導体化ビーズの試験は、アシアロフェチュイン結合能の低下を示し、材料が長期保存によってその性能を失うことを示した。従って、 ＰＴ誘導体化ビーズは、選択の各回について新しく調製および品質管理しなければならない。この 手順は非常に時間がかかるため、ＰＴのビオチン化を含む代替的な固定化戦略を調べた。
【００４８】
６．ＰＴの半予備ビオチン化
ビオチン化反応は、０．４ｍｇ（〜３．６５ｎｍｏｌ）の再構成ＰＴ（１μｇ／μｌを含むＣＴＷ緩衝液）を、２５μｇのＥＺ−リンカー−スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ）と、終容量７４０μｌ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）中でインキュベートすることによって実施した。２時間氷上で連続攪拌しながらインキュベート後、ビオチン化反応を７４μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．０の添加によって停止した。続いて、タンパク質をＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）に対して４℃でＳｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセット（ＰＩＥＲＣＥ、３５００ ＭＷＣＯ０．５〜３ｍｌ）を用いて透析し、過剰のビオチン化試薬を除去した。ビオチン化ＰＴを透析カセットから取り出し、さらに小分けにして−２０℃で保存した。
【００４９】
７．ＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いたビオチン化ＰＴの品質管理
ビオチン化反応の品質は、ビオチン化ＰＴとＢＩＡｃｏｒｅストレプトアビジンチップとの相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＢＩＡｃｏｒｅ２０００）を用いて分析することによって管理した。チップに固定化されたビオチン化ＰＴへのアシアロフェチュインの結合を検出することもまた可能であった（固定化ＰＴへの結合シグナル〜４００ＲＵ；対照細胞への非特異的結合〜１００ＲＵ）。
【００５０】
Ｆ．ストレプトアビジン磁気ビーズおよびアシアロフェチュインへの結合についてのビオチン化ＰＴの分析
１．ストレプトアビジン磁気ビーズへのビオチン化ＰＴの結合
２０μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を、２０ｐｍｏｌのビオチン化ＰＴを含む１ｘＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、１００、μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）と室温で１時間インキュベートし、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）で３回洗浄し、さらに１６μｌのＳＤＳ−ゲル装填緩衝液に再懸濁させた。８μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して結合を確認した。同等の条件下での陰性対照実験で、遊離ＰＴ（非ビオチン化）はストレプトアビジン磁気ビーズと相互作用しなかった。
【００５１】
２．ビーズ固定化されたビオチン化ＰＴへのアシアロフェチュインの結合
２０μｌのストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を、２０ｐｍｏｌのビオチン化ＰＴを含む１ｘＨＢＳ緩衝液と室温で１時間インキュベートし、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）で４回洗浄した。続いて、ビオチン化ＰＴを担持するビーズを、４０ｐｍｏｌのアシアロフェチュインを含むＨＥＰＥＳ緩衝液と室温で１時間インキュベートした。ＨＥＰＥＳ緩衝液で４回洗浄後、ビーズを１６μｌのＳＤＳ−ゲル装填緩衝液に再懸濁させた。８μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析して、結合を確認した。ビオチン化ＰＴおよびアシアロフェチュインの、ストレプトアビジン磁気ビーズに対する連続インキュベートでなく同時インキュベートは、同じくアシアロフェチュインのビオチン化ＰＴへの結合を結果として生じた。同等の対照実験で、アシアロフェチュインはストレプトアビジン磁気ビーズと非特異的に相互作用しないと判定された。１週間−２０℃にて保存されていたビオチン化ＰＴを用いた同様の品質対照は、ストレプトアビジンおよび／またはアシアロフェチュイン結合能に有意な低下を示さなかった。従って、その後の選択ではビオチン化ＰＴが標準の標的として用いられた。
【００５２】
実施例２
ＰＴに対して選択的なペプチドの単離
グルマリンＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリおよび磁気ビーズに固定化されたＰＴを、精密に調節された厳しい条件下で接触させた。これらの条件は、ＰＴに対する親和性の上昇を示すＰＲＯｆｕｓｉｏｎライブラリの変異体が標的に結合するのを可能にする。望ましくない非特異的結合変異体を希釈する多数の洗浄後、結合したＰＲＯｆｕｓｉｏｎ−分子をビーズから溶出し、さらに図２に示すように、新しいＰＲＯｆｕｓｉｏｎ形成サイクルを施す。厳しい条件を細かく適合させると共に、選択および再増幅を連続して実施することによって、所定の標的への高度に特異的な結合分子の集団が濃縮される（１０）。続いて、この集団のＤＮＡ部分をＥ．ｃｏｌｉプラスミドベクターにクローニングし、配列決定によって詳細に分析できる個々の変異体を単離する。
【００５３】
固定化ＰＴに対する連続した６回の選択を、グルマリンＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ライブラリを用いて実施した。上記の概念に従って、ストレプトアビジンビーズに固定化されたビオチン化ＰＴを、これらの選択に用いた（表１）。４回目の選択で、グルマリンプールのストレプトアビジンビーズへの低バックグラウンド結合が観察され、ビーズおよび／またはストレプトアビジン結合グルマリン変異体の濃縮開始が示唆された。従って、続く５回目の選択では、ビオチン／ストレプトアビジン固定化ＰＴをそれぞれ標的およびエポキシビーズカップリングＰＴとして用いて、２つの個別の選択を実施した。両方の選択で、標的結合の明らかなバックグラウンド修正された濃縮が観察された（表１）。この傾向は、ビオチン／ストレプトアビジン固定化ＰＴを用いた６回目の選択で確認され、ＰＴ結合変異体の蓄積を明らかに示した（表１）。
【表１】
【００５４】
Ａ．選択されたグルマリン結合物質プールのクローニング
選択回数Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の結果として得られたグルマリンＤＮＡ−プールを、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングした。グルマリンＤＮＡを、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯベクターに異なる濃度でライゲーションした。６μｌの反応に、０．５μｌ、２μｌおよび４μｌのグルマリンプールＤＮＡをそれぞれ用いた。ライゲーションは取扱説明書に従って実施した。
【００５５】
これらのライゲーション溶液２μｌで、２０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ'コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、さらに、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むＬＢ平板へ播種した。これらの形質転換させた試料のそれぞれから、１５０個の単一コロニーを、Ｔ７依存性タンパク質発現を抑制する５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むマスタープレート、およびブルーホワイトスクリーニングのためのＸ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを含む第２のプレートに採取した。形質転換のそれぞれについて、ブルーホワイト試験からのホワイトコロニーに対応する抑制マスタープレート由来のコロニー９６個を用いて９６ウェルＬＢ寒天平板および５００μｌ液体培養（５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むＬＢ）に播種した。９６ウェル寒天平板は委託配列決定に送付した。液体培養は５００μｌの４０％グリセロールと混合し、液体窒素中において凍結させさらに−８０℃で保存した。
【００５６】
個々の各クローンから、プラスミドＤＮＡを調製し、さらにＭ１３−プライマー５'−ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＧＴ−３'を用いた自動化ＤＮＡ配列決定手順に供した。図３〜８に示す通り、単一のグルマリン配列変異体が４回目の選択で顕著に濃縮され始め、さらに６回目の選択後には全配列の９０％超に相当する。これは、この変異体がおそらく最高の親和性でＰＴを結合させることを明らかに示す。この最も重要な配列変異体に加えて、共通配列モチーフを部分的に共有するさまざまな他のグルマリン配列が濃縮されている。この知見は、これらの他の配列がＰＴへの親和性を同様に示すことを示唆する。
【００５７】
Ｂ．固定化ＰＴに対するＰＰ２６アフィニティ選択
グルマリン選択と平行して、固定化ＰＴに対する連続６回の選択を、ＰＰ２６ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ライブラリについて実施した。ストレプトアビジンビーズに固定化されたビオチン化ＰＴを、これらの選択に用いた（表２）。４回目の選択で、グルマリンプールのストレプトアビジンビーズへの低バックグラウンド結合が観察され、ビーズおよび／またはストレプトアビジン結合ＰＰ２６変異体の濃縮開始が示唆された。従って、続く５回目の選択では、２つの個別の選択を、一方でビオチン／ストレプトアビジン固定化ＰＴを標的としておよび他方でエポキシビーズカップリングＰＴとしてそれぞれ用いて実施した。両方の選択で、標的結合の明らかなバックグラウンド修正された濃縮が観察された（表２）。この傾向は、ビオチン／ストレプトアビジン固定化ＰＴを用いた６回目の選択で確認され、従って、ＰＴ結合変異体の蓄積を明らかに示した。
【表２】
【００５８】
Ｃ．選択されたＰＰ２６結合物質プールのクローニング
選択の回Ｒ４、Ｒ５およびＲ６の結果として得られたＰＰ２６ＤＮＡ−プールを、ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターに、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングした。ＰＰ２６ＤＮＡをｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯベクターに異なる濃度でライゲーションした。６μｌの反応に、０．５μｌ、２μｌおよび４μｌのグルマリンプールＤＮＡをそれぞれ用いた。ライゲーションは取扱説明書に従って実施した。これらのライゲーション溶液の２μｌで、２０μｌのＥ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０Ｆ'コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、さらに、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むＬＢ平板へ播種した。これらの形質転換のそれぞれから、１５０個の単一コロニーを、Ｔ７依存性タンパク質発現を抑制する５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むマスタープレート、およびブルーホワイトスクリーニングのためのＸ−ＧａｌおよびＩＰＴＧを含む第２のプレートに採取した。形質転換のそれぞれについて、ブルーホワイト試験からのホワイトコロニーに対応する抑制マスタープレート由来のコロニー９６個を用いて９６ウェルＬＢ寒天平板および５００μｌ液体培養（５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび０．５％グルコースを含むＬＢ）に播種した。９６ウェル寒天平板は委託配列決定に送付した。液体培養は５００μｌの４０％グリセロールと混合し、液体窒素中で凍結し、さらに−８０℃で保存した。
【００５９】
Ｄ．各結合物質変異体の配列決定
個々の各クローンから、プラスミドＤＮＡを調製し、さらにＭ１３−プライマー５'−ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＧＴ−３'を用いる自動化ＤＮＡ配列決定手順に供した。図９〜１４に示す通り、２つの主な変異体が各回の選択中に濃縮された。両方の変異体は保存された配列モチーフを共有する。この知見は、保存されたアミノ酸の側鎖がＰＴ表面領域の一部と直接の相互作用を確立すると推定されることを示す。さらに、少なくとも４種類の別の変異体がより低い程度で濃縮されている。これらの変異体は上述の保存された配列モチーフを含まないため、これらの変異体はＰＴの異なる表面領域に結合する可能性があると結論できる。
【００６０】
Ｅ．選択されたＰＴ結合グルマリン−およびＰＰ２６−変異体の確認
選択はＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標）分子−ｍＲＮＡ−ペプチド融合物を用いて実施したため、選択後分析の第一段階に、標的に結合する能力について遊離ペプチドを検査する必要がある。次の段階で、核酸部分でなくペプチドを介した標的結合を確認した変異体を、ＡＰ処理液の存在下で特異性試験に供する。この方法によって、ＡＰ処理に最も適した変異体が特定される。
【００６１】
１．ＰＴへの結合能に関する遊離ペプチドの試験
グルマリン−およびＰＰ２６−結合物質変異体の単一の濃縮された遊離ペプチドの定性的結合検定のために、ＴＮＴ Ｔ７カップリングＲｅｔｉｃｏｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、品番Ｌ５５４０）を下記の通り用いた。単一の結合物質候補のＤＮＡを、コロニーＰＣＲによって、結合物質クローンのグリセロールストックから増幅させた。ＰＣＲ中の突然変異を回避するために、プルーフリーディングポリメラーゼ（Ｐｗｏ）を使用した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分析した。ＰＣＲ産物５．０μｌを、ＴＮＴ系を用いたカップリングｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応のテンプレートとして、終容量５３μｌで取扱説明書に従って用いた。発現された結合物質候補を続いてＮｉ−ＮＴＡキレートクロマトグラフィー（ＱＩＡＧＥＮ）によって精製した。放射性標識化したＨｉｓタグ精製結合物質候補（各ペプチドの〜４０〜７０ｆｍｏｌ）を、ストレプトアビジン−磁気ビーズ上に固定化したビオチン化ＰＴと室温で１時間インキュベートした。ビーズをＨＢＳ緩衝液で３回洗浄し、次いで水に再懸濁させ、さらに液体シンチレーションカウンターで分析した。対照実験では各候補をストレプトアビジンビーズのみ（ＰＴ無し）とインキュベートした。ＰＰ２６およびグルマリンの最良の結合物質候補を特定し（表３および４、下記）および以降の特異性試験に供した。
【００６２】
２．処理液の存在下でのグルマリンおよびＰＰ２６変異体の特異性試験
Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒ処理液の存在下での遊離グルマリンおよびＰＰ２６ペプチドの半定量的結合および特異性検定のために、ペプチドをまずＰＲＯｆｕｓｉｏｎとして作製し，精製して均一にし、さらに次いでＳ１−ヌクレアーゼ消化によって遊離ペプチドとした。選択された結合物質変異体（１０種類のグルマリンクローンおよび７種類のＰＰ２６クローン）のＤＮＡの十分量の増幅のため、ＴＮＴ発現に由来するＰＣＲ産物をテンプレートとして用いてＰＣＲを実施した。１０サイクルのＰＣＲ（９４℃３０秒間；６０℃３０秒間；７２℃３０秒間）の後、試料を２％アガロースゲルで分析した。ｄｓＤＮＡ（ＰＣＲ産物）を、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＲｉｂｏＭａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットを用いてＲＮＡへ転写した。４５分間３７℃にてインキュベート後、ＤＮａｓｅＩを添加し、さらに３７℃にてインキュベートをさらに１５分間続けた。この混合物をフェノール／クロロホルム抽出に供した。過剰のＮＴＰはＮＡＰ−５ゲルろ過（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって除去した。ＲＮＡを６％−ＴＢＵ−ゲルで分析した。
【００６３】
精製ＲＮＡを１．５倍過剰のピューロマイシン−オリゴヌクレオチドリンカーＰＥＧ２Ａ１８：５'−ソラレン−ＵＡＧ ＣＧＧ ＡＵＧ Ｃ Ａ１８ （ＰＥＧ−９）２ ＣＣ ピューロマイシン （斜体で示されるヌクレオチドは２'−Ｏ−メチル−誘導体を表す）とアニーリングさせた（８５℃１分間、２５℃へ０．３℃／秒の傾きで冷却）。共有結合カップリングは１５分間室温にて（ＲＴ）ＵＶ光（３６５ｎｍ）照射によって実施した。反応産物を６％−ＴＢＵゲルで分析した。ライゲーションしたＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のウサギ網状赤血球溶解物を用いて１５μＣｉ３５Ｓ−メチオニン（１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で翻訳した。３０分間３０℃にてインキュベート後、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２をそれぞれ終濃度５３０ｍＭおよび１５０ｍＭとなるよう加え、さらに試料を４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ｍＲＮＡ−タンパク質融合物（ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（登録商標））を、オリゴｄＴ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含むインキュベート緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と４℃で５分間インキュベートすることによって単離した。分子は、ＭｉｎｉＭＡＣＳ−カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を介したろ過、インキュベート緩衝液での洗浄および水での溶出によって単離した。試料は４〜２０％Ｔｒｉｓ／グリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００６４】
ＲＮＡ−タンパク質融合物のＲＮＡ部分を除去するため、オリゴｄＴ精製分子をＳ１−ヌクレアーゼ（Ｓ１−ヌクレアーゼはピューロマイシンリンカーのＤＮＡ部分を切断する）で取扱説明書に従って消化した。Ｓ１消化の前および後のＰＲＯｆｕｓｉｏｎ分子の試料を４〜１２％Ｂｉｓ／ＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ストレプトアビジンビーズ（Ｍ２８０Ｄｙｎａｌ）をＨＢＳで洗浄し、さらに４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化ＰＴ（９００ｐｍｏｌ）を９００μｌのＳｔｒｅｐｂｅａｄｓ（ＨＢＳ緩衝液で予備ブロックした）と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＴの固定化後、ビーズをビオチン（２ｍＭビオチンを含むＨＢＳ）で１分間ブロックし、さらに直ちにＨＢＳ緩衝液で４回洗浄してビオチンの痕跡を除去した。対照ビーズ（ＰＴ無し）をビオチンで同様にブロックした。
【００６５】
選択されたペプチドの結合分析のために、いくつかの平行反応を下記の通り設定した：ビオチンブロックしたストレプトアビジンビーズのみを用いる陰性対照；ストレプトアビジンビーズ上に固定化したＰＴを用いる陽性対照；ビオチンブロックしたビーズを１／４容のＡｖｅｎｔｉｓＰａｓｔｅｕｒ試料溶液Ｃ（素通り１．ＡＦカラム）と組み合わせて用いるバックグラウンド対照；１／４容の試料溶液Ｃと組み合わせたＰＴの混合物；ビオチンブロックビーズを１／４容のＡｖｅｎｔｉｓＰａｓｔｅｕｒ試料溶液Ｅ（培地）と組み合わせて用いるバックグラウンド対照；１／４容の試料溶液Ｅと組み合わせたＰＴの混合物；反応３〜６は、選択されたペプチドがＡｖｅｎｔｉｓ Ｐａｓｔｅｕｒによって提供される試料の存在下でＰＴと特異的に結合する能力を評価するために実施した。結合は、室温で１時間、ペプチドの分解を回避するためプロテアーゼ阻害剤混合物（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｉｎｉ（登録商標）ＲＯＣＨＥ社）の存在下で実施した。ＨＢＳ溶液で洗浄後、ビーズをシンチレーションカウンターによって分析した。
【００６６】
表３に示す通り、試験した１０種類のグルマリン変異体のうち３つ（９、１０、１９番）が、ＡＰ処理液のどれにも影響されないＰＴへの標的結合を示す。これらの変異体は、ＡＰ処理中のアフィニティクロマトグラフィー用途のための最も有望な候補である。
【００６７】
表４に示す通り、試験した７種類のＰＰ２６変異体のうち３つ（５、６、９番）が、ＡＰ処理液によって低下しないＰＴへの標的結合を示す。これらの変異体は、ＡＰ処理中のさらなるアフィニティクロマトグラフィー用途のための最も有望な候補である。
【表３】
【表４】
【００６８】
Ｆ．化学合成によるペプチド作製
８種類の異なるペプチドが化学合成によってＮ末端ビオチン化ペプチドの形で作製された。ビオチン基は短い親水性リンカー（ＰＥＧ２＝８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）をスペーサーとした。これらの８つのペプチドのうち２つ（ＰＰ２６−５ｃおよびグマリン−９ｃ）をさらに、Ｃ末端タグ化ビオチン化ペプチド（追加のＣ末端リジンを介して）の形で合成した。ペプチドはＳｈｅｐｐａｒｄに従ってＦｍｏｃ／Ｂｕｔ戦略を用いて自動合成し、ＨＰＬＣによって精製し、さらに続いて凍結乾燥した。全ての精製ペプチドの品質は質量分析によって確認した。各ペプチド合成の標的量は精製ペプチド５ｍｇであった。精製後の合成ペプチドの収量および純度についての概要を表５に示す。
【表５】
【００６９】
全てのｐｐ２６ペプチドを、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌに終濃度１００μＭで溶解させた。全てのグルマリンペプチドを、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭＧＳＨ、１ｍＭＧＳＳＧに終濃度１００μＭで溶解させ、さらに続いて窒素下で少なくとも４８時間インキュベートして構造的折りたたみを可能にした。
【００７０】
Ｇ．細菌発現によるペプチド産生
百日咳毒素に対する結合物質として同定されたペプチドを、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の読み枠内にサブクローニングし、さらに細菌で発現させた。ＧＳＴタグは溶解度を高め、さらにグルタチオンセファロースを用いる精製を可能にする。特異的ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼによって認識される遺伝子組換えによるプロテアーゼ切断部位は、ＧＳＴタグの除去を可能にし、ペプチドを遊離させる。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ自体がＧＳＴおよびヒトライノウイルス（ＨＲＶ）１４型３Ｃプロテアーゼの融合物タンパク質であり、さらに配列Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ＊Ｇｌｙ−Ｐｒｏを特異的に認識してＧｌｎおよびＧｌｙ残基の間を切断する。切断後、切断されない産物およびプロテアーゼは、グルタチオンセファロースを用いて切断反応物から除去できる。
【００７１】
Ｈ．発現ベクターの構築
１．ｐｐ２６変異体についてＧＳＴ融合物の構築
ＰＣＲ用のテンプレートとして、ＰＴに対する同定されたｐｐ２６結合物質の配列を含むｐＣＲ２．１ベクターを用いた。オリゴヌクレオチド４６７番（５'−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＣＡＴＣＡＴＣ−３'）および４６８番（５'−リン酸−ＧＧＧＴＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＴＴＣＧＧＡＧＣＧＴＴＡＧＣＧＴＣ−３'）をＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と共に用いてＰＣＲで得られた産物を、ＮｃｏＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。修飾ベクター（追加のＮｃｏＩ部位を含むｐＧＥＸ６Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をＮｃｏＩ／ＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、さらにＰＣＲ産物をこのベクターのＮｃｏＩ／ＳｍａＩ部位へ定方向クローニングした。ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での形質転換後、陽性クローンをコロニーＰＣＲによって特定し、さらに配列決定によって確認した。
【００７２】
２．グルマリン変異体についてＧＳＴ融合物の構築
ＰＣＲ用のテンプレートとして、ＰＴに対する同定されたグルマリン結合物質の配列を含むｐＣＲ２．１ベクターを用いた。オリゴヌクレオチド４６４番（５'−ＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＡＧＴＧＧＣ−３'）および４６５番（５'−リン酸−ＧＧＧＴＴＡＡＡＴＡＧＣＧＧＡＴＧＣＴＡＣＴＡＧＧＣ−３'）をＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と共に用いてＰＣＲで得られた産物を、ＮｄｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。修飾ベクター（追加のＮｄｅＩ部位を含むｐＧＥＸ６Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ））をＮｄｅＩ／ＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、さらにＰＣＲ産物をこのベクターのＮｄｅＩ／ＳｍａＩ部位へ定方向ライゲーションした。ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での形質転換後、陽性クローンをコロニーＰＣＲによって特定し、さらに配列決定によって確認した（表６）。
【表６】
【００７３】
３．ＧＳＴｐｐ２６融合物の発現および精製
細菌株Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、プラスミドＤＮＡ（表参照）を用いて形質転換した。ｐｐ２６変異体の形質転換株を３７℃２５０ｒｐｍにてＯＤ６００〜０．５まで増殖させ、さらに１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって４時間誘導した。グルマリン−ＧＳＴ融合物の場合には、誘導は０．３３ｍＭ ＩＰＴＧ．を用いて２．５時間実施した。細菌を採集後、細胞を１ｍＭ２−メルカプトエタノール、プロテアーゼ阻害剤および１ｍＭリゾチームを含むＰＢＳ−ＫＭＴ（１０ｍＭＮａリン酸、ｐＨ７．５、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）に再懸濁し、３０分間室温にてインキュベートし、さらに超音波処理によって破壊した。遠心分離後に可溶性の上清をＧＳＨセファロースカラムへ精製のために移した。カラムをカラムの１０倍容の２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄後、ＧＳＴ融合物タンパク質を２０ｍＭ ＧＳＨで溶出し、さらにＳＤＳゲルで分析して発現を確認した。
【００７４】
４．ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼを用いた切断によるＧＳＴタグの除去によるペプチド生成
あるペプチドのＧＳＴ−ペプチド融合物からのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ切断の一例を下記に示す。ＧＳＴタグはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とのインキュベートによって除去された：融合物タンパク質２．５ｍｇを１６０ＵのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎとインキュベートし、さらに５℃で１６時間、結合したＧＳＴ融合物タンパク質を含む密封ＧＳＴｒａｐＦＦカラムで消化した。一晩インキュベート後、第２のＧＳＴｒａｐＦＦカラムを接続してＧＳＴタグ化プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎを除去した。試料を流速０．２ｍｌ／分で加え、素通り画分を小部分試料として回収し、ＳＤＳゲル電気泳動によって分析し、さらにペプチドの量をＯＤ２８０測定によって計算した（約７００μｇ）。
【００７５】
実施例３
ＰＴのアフィニティ精製
Ａ．変性ゲルでの発酵上清の分析
処理液は、アフィニティクロマトグラフィー処理用の可能な開始材料と考えられた：
試料Ａ １０〜５０μｇ／ｍｌ（〜０．０９〜０．４５μＭ）の粗ＰＴを含む濃縮培養ろ液、発酵上清
試料Ｂ ９〜４５μｇ／ｍｌ（〜０．０８〜０．４μＭ）の粗ＰＴを含む吸収クロマトグラフィー上清
これらの処理液の複雑さを視覚化するため、両方の試料を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。試料Ａの主に高分子量成分が吸収クロマトグラフィーによって除去される（試料Ｂ）。
【００７６】
Ｂ．合成ビオチン化コアペプチドのストレプトアビジンセファロースへの固定化および精製ＰＴとの結合の確認
１．ストレプトアビジンセファロースへのペプチド固定化
ビオチン化ペプチドのストレプトアビジンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ７１−５００４−４０）への結合のため、予洗浄したストレプトアビジンセファロースの５０％スラリー２００μｌを、１ｎｍｏｌのペプチド（１００μＭペプチド溶液１０μｌ）と１ｍｌＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中４℃でインキュベートした。使用した条件下では、ストレプトアビジン セファロースの高結合能はビオチン化ペプチドの１００％の固定化を可能にすべきである（充填セファロース１μｌ当たりペプチド１０ｐｍｏｌ）。
【００７７】
２．固定化ペプチドへの精製ＰＴの結合
ペプチドを装填したセファロース２００μｌ（１０％ｉｇｅスラリー、固定化ペプチド２００ｐｍｏｌを含む）をＭｏｂｉｃｏｌカラム（ＭｏＢｉＴｅｃ、１０μｍフィルター）へ移し、さらに上清を１分間２０００ｒｐｍでの遠心分離によって除去した。ＨＥＰＥＳ緩衝液で４回洗浄後、セファロースを、精製百日咳毒素１００ｐｍｏｌを含む２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液に再懸濁し、さらに回転ホイール上で１時間室温にてインキュベートした。結合しない画分を遠心分離によって分離した（結合後の上清；ゲル分析に使用）。続いてペプチド−ストレプトアビジンセファロースを冷ＨＥＰＥＳ緩衝液（各２００μｌ）で３回洗浄し、さらに２０μｌの装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％Ｐ−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）に再懸濁して、結合したＰＴを溶出した。９５℃で５分間インキュベート後、装填緩衝液を遠心分離によって回収し、さらに続いてゲル分析に用いた（図１５）。対照として、ペプチドを伴わないストレプトアビジンセファロースを同一の条件下でＰＴと接触させた。使用した条件下では、百日咳毒素ペプチド結合物質クローンｐｐ２６５ｎ、５ｃ、９ｎ、１５ｎおよびグルマリンクローン１０ｎ、１９ｎ、１５ｎ、９ｎは精製ＰＴへの明らかな結合を示す。全ての陽性な結合物質候補は、未変性六量体ＰＴを結合させることができた。
【００７８】
Ｃ．合成ビオチン化コアペプチドのストレプトアビジンセファロースへの固定化および発酵上清からのＰＴとの結合の確認
ストレプトアビジンセファロースへのペプチド固定化および発酵上清からのＰＴとの結合分析を、ペプチドストレプトアビジンセファロースを２００μｌの試料Ａ（発酵上清）または２００μｌの試料Ｂ（吸収クロマトグラフィー上清カラム、０章参照）とインキュベートし、続いてＨＥＰＥＳ緩衝液で４回室温で洗浄した以外は０章に記載の通り実施した。結合分析の結果を図１６に示す。使用した条件下では、百日咳毒素ｐｐ２６結合物質クローン９ｎ、１５ｎおよびグルマリンクローン９ｎ、１５ｎは、発酵上清試料Ａおよび試料Ｂから未変性ＰＴ六量体を非常に効率的に結合できた。使用した条件下では、ｐｐ２６結合物質クローン５およびグルマリン結合物質クローン１０および１９はより低い親和性でＰＴに結合できることに注意する。試料Ａおよび試料ＢからこれらのペプチドへのＰＴ結合はその条件下では検出されなかったが、これらの結合物質はアフィニティクロマトグラフィーカラムにおけるリガンドとしての用途になお適するであろう（カラムは再結合作用によるＰＴの保持を可能にし、従ってｋｏｆｆの問題を最小化する）。
【００７９】
Ｄ．固定化ペプチドに関する熱力学データ
ペプチド結合能の推定のために、セファロース固定化ペプチド２０ｐｍｏｌを、過剰量のＰＴ１００ｐｍｏｌを含む容量２００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＴ５００ｎＭに相当）とインキュベートした。洗浄後、ペプチド−ストレプトアビジンセファロース結合ＰＴの画分をゲル分析によって定量した。これは、使用した条件下での結合活性ペプチドの画分を直接計算するのを可能にする（ＰＴ／ペプチド結合比は１：１と仮定）。ＰＴ５００ｎＭの濃度は全てのペプチドについてＢｍａｘに達するのに十分高いという仮定に基づく。分析の結果を表７に示す。表に示す値は、ペプチドの期待可能な結合能の推定である。大部分の適当な結合物質の結合能（Ｂｍａｘ）および解離定数（ＫＤ）の正確な評価も実施できる。
【表７】
【００８０】
Ｅ．許容されるグレードの原材料に対して保健当局の基準を用いた、規定の緩衝液条件（ｐＨ、塩濃度、界面活性剤）下での精製百日咳毒素六量体の安定性の分析
百日咳毒素六量体安定性を幅広いｐＨおよび塩条件下でＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置で試験した。この目的で、２０００ＲＵまでのビオチン化ＰＴをストレプトアビジンチップに装填した。続いて異なる緩衝液をチップ固定化ＰＴに、２分間流速３０μｌ／分で加えた。各緩衝液注入の終了後に、チップをＨＢＳ／ＥＰ分析緩衝液で平衡化した（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ）、少なくとも２分間、流速３０μｌ／分）。緩衝液注入の前および後の測定されたＲＵシグナルの差は、チップ上のＰＴ六量体の減少と相関する。この減少は、使用した緩衝液条件下でのＰＴ六量体の安定性の損失と解釈された。
【００８１】
分析したｐＨ範囲はｐＨ２から１０．５で下記の緩衝液を用いた：１０ｍＭグリシン緩衝液（ＢＩＡｃｏｒｅ、ｐＨ２；２．５；３）、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ＢＩＡｃｏｒｅ、ｐＨ４；４．５；５；５．５）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）および１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６および１０．５）。ＰＴ六量体安定性に及ぼすｐＨの影響を示すＢＩＡｃｏｒｅ測定図が作製され、さらにＢＩＡｃｏｒｅ分析の結果を表８に要約する。使用した条件下で、百日咳毒素六量体はｐＨ２．５〜１０．５の幅広いｐＨ範囲で安定であることが示された。
【表８】
【００８２】
ＰＴ六量体安定性に及ぼす異なる塩条件の影響を、ＮａＣｌ、ＫＣｌおよびＭｇＣｌ２についてそれぞれｐＨ５．０（１０ｍＭ酢酸緩衝液）およびｐＨ８．５（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ）で、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置での類似の実験で調査した。使用した塩条件下でのＰＴ六量体安定性についての概要を表９に示す。六量体は最高２．５ＭのＮａＣｌまたは最高２ＭのＫＣｌを含む緩衝液（ｐＨ５および８．５にて）中で安定であった。ＭｇＣｌ２の場合には、ＰＴ六量体は最高２ＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液中でｐＨ８．５にて安定であった。
【表９】
【００８３】
Ｆ．発酵上清からのＰＴの特異的アフィニティ精製を可能にする規定の洗浄および溶出条件を設定（ｐＨ、塩濃度、界面活性剤）
百日咳毒素六量体が安定である条件の決定後、次の段階は、固定化ペプチドｐｐ２６クローン９および１５およびグルマリンクローン９および１５に結合した百日咳毒素についての洗浄および溶出条件を調べることであった。
【００８４】
１．ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置を用いたＰＴ／ペプチド安定性の評価
ＰＴ／ペプチド複合体の安定性を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置を用いて、ＰＴ六量体安定性に干渉しないことが示された異なるｐＨおよび塩条件下で調べた。５００〜１０００ＲＵの合成ペプチドをＢＩＡｃｏｒｅストレプトアビジンチップ上に固定化した。固定化ペプチドへのＰＴの結合を可能にするため、２０ｎＭの精製ＰＴを含むＨＥＰＥＳ緩衝液を１分間注入した。ＨＢＳ／ＥＰ分析緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ポリソルベート２０（ｖ／ｖ））で平衡化後、ＰＴ／ペプチド複合体を、以下の緩衝液の注入によって洗浄した：
（ａ）１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５および９．５
（ｂ）１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．５、５．０、４．５、および４．０
（ｃ）１０ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ３．０および２．５
（ｄ）０．５、１．０、１．５、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液緩衝液、ｐＨ６．０、
（ｅ）０．５、１．０、１．５、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５、
（ｆ）０．５、１．０、１．５、２．０ＭＫＣｌを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０、
（ｇ）０．５、１．０、１．５、２．０ＭＫＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５、
（ｈ）０．５、１．０、１．５、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０、
（ｉ）０．５、１．０、１．５、２．０Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５。
【００８５】
各緩衝液注入の終了後にチップをＨＢＳ／ＥＰ分析緩衝液で平衡化した。使用した緩衝液条件下でのチップ上のＰＴ六量体の損失（緩衝液注入の前および後の測定されたＲＵシグナルの差）はＰＴ／ペプチド複合体安定性を反映する。全てのＰＴ／ペプチド複合体のｐＨ範囲安定性および塩安定性に関する概要を表１０に要約する。全てのＰＴ／ペプチド複合体は、１００ｍＭ炭酸、ｐＨ１０．５および１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５の存在下で完全に不安定化された。グルマリンペプチド９について、２．５Ｍ ＮａＣｌまたは少なくとも０．５Ｍ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液はＰＴ／ペプチド複合体安定性に干渉する。グルマリンペプチド１５とのＰＴ複合体はさらに少なくとも１．５Ｍ ＭｇＣｌ２の存在下で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５中で不安定化された）。
【表１０】
【００８６】
２．ペプチドストレプトアビジンセファロース上のＰＴの精製のための洗浄条件の評価
アシアロフェチュインでの百日咳毒素精製処理のための確立された条件に近い洗浄条件の適用を試みた（１Ｍ ＮａＣｌを含むかまたは含まない５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄）。百日咳毒素精製手順はペプチドｐｐ２６クローン９および１５およびグルマリンクローン９および１５について最適化した。セファロース２０μｌ上に固定化した各ペプチド２００ｐｍｏｌを１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１００μｌの試料Ａまたは試料Ｂとインキュベートし、ＰＴを結合させた。続いて結合したＰＴ画分を有するペプチドセファロースを下記に示す３つの異なる条件下で洗浄した：
（ａ）２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で３回；
（ｂ）２００μｌの５０ｍＭ酢酸ｐＨ６．０で３回；および、
（ｃ）２００μｌの５０ｍＭ酢酸ｐＨ６．０で６回。
【００８７】
洗浄後、残存物質をセファロースから、２０μｌの装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）で溶出した。全ての溶出液を続いてＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した（図１７）。
【００８８】
５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６．０での洗浄がより厳しいものでありおよび５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄するよりも効率的に高分子量不純物のバックグランドを低減する。しかしこれらの洗浄条件下では、特にグルマリンペプチド９および５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６．０での反復洗浄（６回洗浄）の場合には、ＰＴ／ペプチド複合体はより不安定である。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５とは対照的に、ペプチド固定化ＰＴの損失は、５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６．０での洗浄を１０から２０回反復した際により劇的であった（例としてｐｐ２６ペプチド９について図１８で示す）。
【００８９】
３．ペプチドストレプトアビジンセファロース上のＰＴの精製のための溶出条件の評価
ペプチドセファロースからのＰＴの溶出を、六量体安定性と類似の条件下で試験した。
【００９０】
ａ．ＭｇＣｌ２による溶出
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００測定によって上に示す通り、全てのＰＴ／ペプチド複合体は、ＰＴ六量体安定性には決定的でないことが示された条件である２Ｍ ＭｇＣｌ２に感受性であった。規定のＭｇＣｌ２濃度の溶出効率を、ストレプトアビジンセファロースへ４種類の固定化合成ペプチドのうちの１つを介して結合したＰＴについて評価した。セファロース２０μｌ上に固定化した各ペプチド４００ｐｍｏｌを１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１００μｌの試料ＡとインキュベートしてＰＴを結合させた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（各２００μｌ）で４回洗浄後、ＰＴの結合した画分を、下記の緩衝液の２０μｌを３回連続で用いて溶出した。
【００９１】
（ａ）０．２Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、または
（ｂ）０．５Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、または
（ｃ）１．０Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、または
（ｄ）１．５Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５、または
（ｅ）２．０Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．５。
【００９２】
残存物質をその後、ペプチドストレプトアビジンセファロースから２０μｌの装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）で溶出した。全ての溶出液を続いてＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した（図１９）。本実験で示される通り、ＭｇＣｌ２での溶出はグルマリンペプチドについてのほうがｐｐ２６ペプチドについてよりも効率的であったが、相当な量のＰＴがなおペプチドストレプトアビジンセファロース上に残存した。
【００９３】
ｂ．ｐＨ変化による溶出
ＢＩＡｃｏｒｅ測定は、ＰＴは全てのペプチドから、ＰＴ六量体安定性には決定的に重要でない酸性（ｐＨ２．５）または塩基性（ｐＨ１０．５）緩衝液条件を用いて溶出可能であったことを明らかにした（１００ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ１０．５よりもＰＴ六量体安定性に穏和な５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５、ｘｘｘを参照）。セファロース２０μｌ上に固定化した各ペプチド２００ｐｍｏｌを１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１００μｌの試料Ａとインキュベートし、ＰＴを結合させた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（各２００μｌ）で４回洗浄後、ＰＴをペプチドストレプトアビジンセファロースから、５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５、または１００ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ１０．５での４０μｌの溶出の連続３回によって溶出した。残存物質を続いてペプチドストレプトアビジンセファロースから、２０μｌの装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）で溶出した。全ての溶出液をＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した（図２０）。ほぼ全てのＰＴがペプチドストレプトアビジンセファロースから、５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５を用いておよび１００ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ１０．５を用いて溶出可能であった。
【００９４】
４．最適化された条件を小スケール精製計画に適用し、結合能を確認
ａ．最適化された洗浄および溶出条件下での試料ＢからのＰＴの精製（４μｌカラム）
最適化された洗浄および溶出条件を組み合わせて、ペプチドストレプトアビジンセファロース上での試料ＢからのＰＴの精製を可能にした。ＰＴの非特異的結合を低減するために、ペプチド／ストレプトアビジンセファロースの最適比を先に各ペプチドについて滴定した。続いて試料Ｂ／ペプチドストレプトアビジンセファロース比を、ペプチドの予想される高（中）インプット当たりの高回収量に関して最適化した。これらの条件を下記の小スケールカラム精製に適用した。
【００９５】
ｐｐ２６ペプチド９およびグルマリンペプチド１５については、ストレプトアビジンセファロースへの固定化は、ストレプトアビジンセファロース１６μｌのペプチド１６００ｐｍｏｌとのインキュベートによって実施した。ｐｐ２６ペプチド１５の場合には、ストレプトアビジンセファロース１６μｌをペプチド６０００ｐｍｏｌとインキュベートした（ｐｐ２６／１５はストレプトアビジンセファロースとより低い効率で結合し、不完全なペプチドビオチン化によって説明されうる）。グルマリンペプチド９については、８０００ｐｍｏｌがストレプトアビジンセファロース８０μｌ上に固定化された。続いて洗浄したペプチドストレプトアビジンセファロースを等分し、さらに４つのＭｏｂｉｌｃｏｍカラム（１０μＭフィルター付き）へ移した。
【００９６】
各カラム（ｐｐ２６／９およびｇｕｒ／１５についてはセファロース４μｌとペプチド４００ｐｍｏｌ；４μｌと不確定量の結合ペプチドｐｐ２６／１５；ｇｕｒ／９については２０μｌとペプチド２０００ｐｍｏｌを含む）を４００μｌの試料Ｂ（ＨＣｌの添加によってｐＨ７．０〜７．５に調整）とインキュベートしてＰＴを結合させた。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５（各１００μｌ）で５回洗浄後、ＰＴをペプチドストレプトアビジンセファロースから下記の通り連続溶出によって溶出した（ｐｐ２６／９およびｇｕｒ／１５について３回溶出；ｐｐ２６／１５およびｇｕｒ／９について４回溶出）：
（ａ）カラム１の場合、５０ｍＭグリシン、ｐＨ２．５（各２０μｌ）で、または
（ｂ）カラム２の場合、１００ｍＭ炭酸緩衝液、ｐＨ１０．５（各２０μｌ）で、または
（ｃ）カラム３の場合、２Ｍ ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５（各２０μｌ）で。
【００９７】
カラム１〜３およびカラム４上の残存物質を続いてペプチドストレプトアビジンセファロースから２０μｌ装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー）での溶出によって溶出した。全ての溶出液をＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した（図２１、２２）。ペプチドストレプトアビジンセファロースでの精製後のＰＴの収量を計算するため、プールした溶出液１〜３をＰＡＧＥおよび銀染色によって分析し、さらに同じゲル上で分離した規定量の精製ＰＴと比較して推定を可能にした（図２１Ｂおよび２２Ｂ）。ゲル推定に基づき、精製ＰＴの収量は表１１に示す通り計算された。
【表１１】
【００９８】
ｂ．アフィニティ精製中にストレプトアビジンセファロース上のさまざまなペプチド密度を用いたＰＴ収量の測定
ペプチドストレプトアビジンセファロースに結合したＰＴを、ストレプトアビジンセファロース上にアフィニティリガンドとして固定化されたペプチドのさまざまな濃度への依存性について調べた。固定化のために１μｌ容のストレプトアビジンセファロースを漸増量のペプチドｐｐ２６／９またはグルマリン／１５（ペプチド１００、２００、３００、４００、５００、１０００ｐｍｏｌ）とインキュベートした。ペプチドの非結合画分をセファロースから、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（カラム上）での洗浄３回によって除去した。続いて各ペプチドストレプトアビジンマトリクスを６００μｌの試料ＡとインキュベートしてＰＴを結合させた。８０分後、各マトリクスを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（各２００μｌ）で４回洗浄し、さらに続いて２０μｌのゲル装填緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、１％ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノール、１２．５％グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー；インキュベート１０分間９５℃にて）で溶出した。溶出液をＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した（図２３）。ペプチドストレプトアビジンセファロースに結合したＰＴの量をデンシトメトリー評価によって計算し、さらにストレプトアビジンセファロースへの固定化に最初に用いたペプチドの量の関数としてプロットした（ｐｐ２６／９について図２３に示す）。ペプチド３００〜４００ｐｍｏｌがストレプトアビジンセファロース１μｌへの固定化に用いられた場合に最高のＰＴ結合に達した。より多量のペプチドは、おそらくＰＴの立体障害の作用を反映して、より多いＰＴ結合を結果として生じなかった。
【００９９】
ペプチド４００ｐｍｏｌのインプットがストレプトアビジンセファロース１μｌへの固定化に用いられた場合のペプチド（ｐｐ２６／９またはグルマリン／１５）の有効に結合した画分を、ＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で、ゲル装填緩衝液を用いた溶出（９５℃にて１０分間加熱）後に評価した。溶出可能なペプチドの量は、同一ゲル上の規定量の精製ＰＴとの直接比較によって推定した（データ記載せず）：ｐｐ２６／９について１００〜１５０ｐｍｏｌ；グルマリン／１５について５０ｐｍｏｌ。
【０１００】
ｃ．アフィニティ精製中に一定濃度のペプチドセファロースにてさまざまな量の試料Ｂを用いたＰＴ収量の測定
ペプチド固定化のために４００ｐｍｏｌのｐｐ２６／９またはグルマリン／１５を１μｌのストレプトアビジンセファロースと１時間室温にてインキュベートした。ペプチドセファロースを２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５緩衝液で３回洗浄し、さらに続いてさまざまな量の試料Ｂ（５０、６６、１００、２００、４００、６００μｌ、ＨＣｌの添加によってｐＨ７．０〜７．５に予め調整）と１時間室温にてインキュベートした。アフィニティマトリクスを１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で４回洗浄し、さらに１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５（各２０μｌ）での４回連続溶出によって溶出した。プールした溶出液（計８０μｌ）のうち５μｌをＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色で分析した。溶出したＰＴの量は、質量標準としての同一ゲル上の規定量の精製ＰＴとの直接比較を基礎として計算した（図２４、表１２）。
【表１２】
【０１０１】
ペプチドストレプトアビジンセファロースの精製効率をアシアロフェチュインセファロースと比較するために、アシアロフェチュインセファロースを用いた滴定実験を類似の条件下で平行して実施した（セファロース上に固定化された、反応当たり等しい量のアフィニティリガンド、セファロースへ有効に結合したアフィニティリガンド１００ｐｍｏｌに相当）。これは６．８５μｌのアシアロフェチュインセファロース（バッチ番号ＦＡ０５３１９８：密度１．１ｍｇ／ｍｌ、１４．６ｐｍｏｌ／ｌ）の、さまざまな量の試料Ｂ（５０、６６、１００、１７１．３、２００、４００μｌ、ＨＣｌの添加によってｐＨ７．０〜７．５に予め調整）との１時間室温にてのインキュベートによって達成された。続いてアシアロフェチュインセファロースを洗浄し、さらに結合ＰＴを溶出し、さらに上記の通り分析した。使用した精製条件下でのストレプトアビジンセファロースのペプチド結合効率は、アシアロフェチュインセファロースの結合効率よりも有意に高かった。
【０１０２】
ｄ．繰り返しＰＴ結合および溶出のためのペプチドセファロースの再使用
ＰＴの繰り返し結合および溶出のためのペプチド装填セファロース（ｐｐ２６／９およびグルマリン／１５）の再使用性を調べるため、セファロースをＰＴ結合、溶出および再生の反復サイクルに用いた（計４回）。ペプチド固定化のために、６００ｐｍｏｌのｐｐ２６／９またはグルマリン／１５をストレプトアビジンセファロース２μｌと一晩室温にてインキュベートし、さらに続いてＨＥＰＥＳ緩衝液で３回洗浄した。ＰＴの結合のために、各ペプチドストレプトアビジンセファロースを４００μｌの試料Ｂ（ＨＣｌの添加によってｐＨ７．０〜７．５に調整）と１時間室温にてインキュベートし、さらに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（各２００μｌ）で４回洗浄した。ＰＴは１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５（各２０μｌ）での４回連続溶出によって溶出した。続いてカラムマトリクスを１０ｍＭＨＣｌ（１×２０μｌ、２×１００μｌ）での洗浄３回によって再生し、さらにその後、２００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５での洗浄２回によって中性化した。この結合、溶出および再生手順をペプチドセファロースにさらに３回適用した。プールした溶出液（計８０μｌ）のうち４μｌ、各結合／溶出／再生サイクルからの１回目の再生緩衝液のうち７μｌをＰＡＧＥによって１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル（ＭＥＳ泳動緩衝液）で分析および銀染色し、ペプチドセファロースは再使用されうることを示した（図２５）。
【０１０３】
５．ＰＴの大スケールＦＰＬＣ精製
ＰＴ結合および溶出のための最適化された条件を、下記の通り大スケールＦＰＬＣ精製（０．５ｍｌカラム）に適用した：
Ａ）ビオチン化ペプチドのストレプトアビジン−セファロースへの固定化：２００ｎｍｏｌのペプチドｐｐ２６／９を１時間３０分間室温にて回転ホイール上で１ｍｌの５０％ストレプトアビジン−セファロースと１０ｍｌ容（ＨＥＰＥＳ緩衝液）中でインキュベートした。インキュベート後、セファロースを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５で３回洗浄した。
【０１０４】
Ｂ）ＰＴの結合（試料Ｂから）：セファロース５００μｌに有効に固定化されるペプチドの推定量は５０ｎｍｏｌであった。ペプチド−セファロースを試料Ｂ２５ｍｌと１時間３０分間室温にて倒立回転機中でインキュベートした（ＰＴ推定濃度〜０．５ｐｍｏｌ／μｌ、２５ｍｌ中に１２．５ｎｍｏｌに相当、固定化ペプチド対ＰＴ量の比４：１に相当）。
【０１０５】
Ｃ）ＦＰＬＣ−カラム：インキュベート後、セファロースをカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＨＲ５／５）に移した。カラムの充填中、セファロースを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５（２〜３ｍｌ）で洗浄した。続いてカラムを流路に接続し、さらにカラムの２０倍容（１０ｍｌ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５で洗浄した。固定化ＰＴを１１ｍｌの１００ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ１０．５で溶出した。溶出画分を５００μｌ画分として回収し（ＰｈａｒｍａｃｉａフラクションコレクターＦＲＡＣ−１００）および溶出プロファイルを２８０ｎｍでのＵＶ吸収の測定によって評価した。溶出後、カラムを１．５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５で洗浄し、さらに続いて２．５ｍｌの１０ｍＭＨＣｌで再生し、その後１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５での中性化を実施した。
【０１０６】
Ｄ）溶出画分の分析および収量の計算：溶出画分をＰＡＧＥ（１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル、ＭＥＳ泳動緩衝液）および銀染色によって分析した
（図２６）。ＰＴの濃度は、溶出画分の２８０ｎｍでの吸収（Ａ２８０）を測定、さらにこれらの結果を精製ＰＴを用いて作製した較正曲線と比較することによって測定した（図２６中の表を参照）。
【０１０７】
ＰＴの量はさらに、同一ゲル上の質量標準としての規定量の精製ＰＴとの直接比較に基づいて計算した。ゲル推定はＰＴ８１００ｐｍｏｌの収量を導く。これはＡ２８０を用いた濃度測定と非常に良く相関する。２５ｍｌの試料Ｂは１１２５μｇのＰＴを含むと推定されるならば、ＰＴの６９％〜７２％以上がこれらの条件下で溶出される。この結果は、再生後の同一のペプチド−セファロースを用いて２５ｍｌの試料ＢからＰＴを結合させるＦＰＬＣ分析の反復によって確認された。この実験では、８０３μｇのＰＴが精製された（Ａ２８０）（表１３）。
【表１３】
【表１４】
【０１０８】
６．ｐｐ２６ペプチド９／百日咳毒素複合体形成の平衡定数および速度定数の評価
ｐｐ２６Ｋ９／ＰＴ複合体形成に関する平衡定数および速度定数を、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置を用いてＨＢＳ／ＥＰ分析緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０）中で室温にて評価した。さまざまな濃度のｐｐ２６−Ｋ９（濃度２．５ｎＭから１００ｎＭ）の、ＣＭ５チップ上に固定化されたＰＴ（アミンカップリング法による６０００ＲＵの固定化）への結合は、流速３０μｌ／分にて分析した。ＰＴ結合ペプチドの定量的溶出は３ｍＭ ＨＣｌ、ｐＨ ２．５を用いて得られた。推論できる平衡定数および速度定数をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析し、その結果を下記に示す：
解離平衡定数ＫＤ→７．５ｘ１０−９Ｍ
結合平衡定数ＫＡ→１．３ｘ１０−８Ｍ−１
結合速度定数ｋｏｎ→１．３ｘ１０５Ｍ−１ｘｓ−１
解離速度定数ｋｏｆｆ→１０−３Ｓ−１
本発明は好ましい実施形態に関して記載されている一方、当業者は変化および修飾を考えうることが理解される。従って、付属の請求項は、請求される通りの本発明の範囲内にあるそのような同等の変化の全てを包含することが意図される。
【０１０９】
他の実施態様
１．下記のペプチドから選択され、百日咳毒素を結合させる能力を有することを特徴とするペプチド：
ＲＳＳＨＣＲＨＲＮＣＨＴＩＴＲＧＮＭＲＩＥＴＰＮＮＩＲＫＤＡ（ｐｐ２６−５）；
ＳＴＭＮＴＮＲＭＤＩＱＲＬＭＴＮＨＶＫＲＤＳＳＰＧＳＩＤＡ（ｐｐ２６−６）；
ＲＳＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤＤＡ（ｐｐ２６−９）；
ＲＳＷＲＤＴＲＫＬＨＭＲＨＹＦＰＬＡＩＤＳＹＷＤＨＴＬＲＤＡ（ｐｐ２６−１５）；
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＡＲＷＤＬＶＣＣＥＰＬＥＣＩＹＴＳＥＬＹＡＴＣＧ（Ｇ−９）；
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＥＬＡＶＤＥＣＣＥＰＬＥＣＦＱＭＧＨＧＦＫＲＣＧ（Ｇ−１０）
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＳＱＳＶＰＭＣＣＥＰＬＥＣＫＷＦＮＥＮＹＧＩＣＧＳ（Ｇ−１５）； および、
ＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＥＬＡＩＤＥＣＣＥＰＬＥＣＴＫＧＤＬＧＦＲＫＣＧ（Ｇ−１９）。
【０１１０】
２．ＲＳＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤＤＡ（ｐｐ２６−９）またはＳＧＣＶＫＫＤＥＬＣＳＱＳＶＰＭＣＣＥＰＬＥＣＫＷＦＮＥＮＹＧＩＣＧＳ（Ｇ−１５）であることを特徴とする実施態様１記載のペプチド。
【０１１１】
３．ＤＮＡ−ペプチド融合物を作製する方法であって：
（ａ）ペプチド受容体に結合した核酸逆転写プライマーを、ペプチドをコードするＲＮＡに共有結合させ；
（ｂ）前記ＲＮＡを翻訳して、逆転写プライマーに共有結合しているペプチドを生じさせ；さらに、
（ｃ）前記ＲＮＡを逆転写して、ＤＮＡ−ペプチド融合物を生じさせる；工程を含み、
前記ペプチドが百日咳毒素に対する結合親和性を有することを特徴とする方法。
【０１１２】
４．ＤＮＡ−ペプチド融合物を作製する方法であって：
（ａ）ＲＮＡ−ペプチド融合物を作製し；
（ｂ）核酸逆転写プライマーを前記融合物にハイブリダイズさせ；
（ｃ）前記プライマーを前記融合物に共有結合させ；さらに
（ｄ）前記ＲＮＡ−ペプチド融合物のＲＮＡを逆転写してＤＮＡ−ペプチド融合物を生じさせる；工程を含み、
前記ペプチドが百日咳毒素に対する結合親和性を有することを特徴とする方法。
【０１１３】
５．ＤＮＡ−ペプチド融合物を作製する方法であって：
（ａ）ペプチド受容体に共有結合したＲＮＡ分子を提供し；
（ｂ）核酸逆転写プライマーを前記ＲＮＡ分子に共有結合させ；
（ｃ）前記ＲＮＡ分子を翻訳してペプチドを生じさせ；さらに
（ｄ）前記ＲＮＡ分子を逆転写してＤＮＡ−ペプチド融合物を生じさせる；工程を組み合わせて含み、
前記ペプチドが百日咳毒素に対する結合親和性を有することを特徴とする方法。
【０１１４】
６．実施態様３から５いずれか１項記載の方法を用いて調製されたＤＮＡ−ペプチド融合物。
【０１１５】
７．実施態様３から５いずれか１項記載の方法を用いて同定された百日咳毒素に対する親和性を有するペプチド。
【０１１６】
８．ビオチン化されていることを特徴とする実施態様１、２または７記載のペプチド。
【０１１７】
９．百日咳毒素を含む生物溶液に、固相担体に結合した実施態様１、２または７記載の少なくとも１つのペプチドを接触させて百日咳毒素−ペプチド複合体を形成し、さらにその複合体を前記生物溶液中の他の成分から単離する工程を含むことを特徴とする百日咳毒素を精製する方法。
【０１１８】
１０．百日咳毒素を前記複合体から遊離させさらに単離することを特徴とする実施態様９記載の方法。
【０１１９】
１１．前記複合体の周囲環境のｐＨを変化させることによって、百日咳毒素を該複合体から遊離させることを特徴とする実施態様１０記載の方法。
【０１２０】
１２．酸性ｐＨを有する溶液に前記複合体をさらすことを特徴とする実施態様１１記載の方法。
【０１２１】
１３．塩基性ｐＨを有する溶液に前記複合体をさらすことを特徴とする実施態様１１記載の方法。
【０１２２】
１４．複合体の周囲環境のイオン強度を変化させることによって、百日咳毒素を該複合体から遊離させることを特徴とする実施態様１０記載の方法。
【０１２３】
１５．高濃度の１以上のイオン塩を有する溶液に前記複合体をさらすことによって、イオン強度を変化させることを特徴とする実施態様１４記載の方法。
【０１２４】
１６．前記イオン塩が、塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムの少なくとも１つであることを特徴とする実施態様１５記載の方法。
【０１２５】
１７．前記イオン塩が塩化マグネシウムであることを特徴とする実施態様１６記載の方法。
【０１２６】
１８．前記固相担体がビーズであることを特徴とする実施態様９〜１７いずれか１項記載の方法。
【０１２７】
１９．前記固相担体がセファロースを含むことを特徴とする実施態様９〜１７いずれか１項記載の方法。
【０１２８】
２０．前記固相担体がストレプトアビジンセファロースから成ることを特徴とする実施態様１９記載の方法。
【０１２９】
２１．前記ペプチドがビオチン化されており、該ペプチド上のビオチン部分とストレプトアビジンセファロース上のストレプトアビジン部分との相互作用を介してペプチドが固相担体に結合していることを特徴とする実施態様２０記載の方法。
【０１３０】
２２．百日咳毒素に対する結合親和性を有するペプチドのＤＮＡ−ペプチド融合物を単離する方法であって：
（ａ）ペプチド受容体に結合した核酸逆転写プライマーを、ペプチドをコードするＲＮＡに共有結合させ；
（ｂ）ＲＮＡを翻訳して、逆転写プライマーに共有結合したペプチドを生じさせ；さらに
（ｃ）ＲＮＡを逆転写して、ＤＮＡ−ペプチド融合物を生じさせ；
（ｄ）ＤＮＡ−ペプチド融合物に、固相担体に結合した百日咳毒素を接触させて、ＤＮＡ−ペプチド融合物−百日咳毒素複合体を形成し；
（ｅ）前記複合体を、百日咳毒素と複合体形成しなかったＤＮＡ−ペプチド融合物から単離し；さらに
（ｆ）ＤＮＡ−ペプチド融合物をＤＮＡ−ペプチド融合物−百日咳毒素複合体から単離する；工程を組み合わせて含むことを特徴とする方法。
【０１３１】
２３．百日咳毒素に対する結合親和性を有するペプチドを同定する方法であって、実施態様２２記載の方法を実し、さらに、ＤＮＡ−ペプチド融合物のペプチド部分のアミノ酸配列を特定する工程を含むことを特徴とする方法。
【０１３２】
２４．百日咳毒素に対する結合親和性を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列を同定する方法であって、実施態様２２記載の方法を実施し、さらに、ＤＮＡ−ペプチド融合物のＤＮＡ部分のヌクレオチド配列を特定する工程を含むことを特徴とする方法。
【０１３３】
２５．実施態様１０記載の方法によって単離された百日咳毒素を含む免疫組成物。
【０１３４】
２６．百日咳毒素を結合させる能力を有し、さらに図３〜１４のいずれかに示されるペプチドのアミノ酸配列を有することを特徴とするペプチド。
【０１３５】
２７．前記百日咳毒素に対する結合親和性を有するペプチドのアミノ酸配列が、グマリンまたはＰＰ２６に由来するアミノ酸配列を含むことを特徴とする実施態様３〜５または９〜２４いずれか１項記載の方法。
【０１３６】
２８．前記百日咳毒素に対する結合親和性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列が、グマリンまたはＰＰ２６に由来するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする実施態様３〜５または９〜２４いずれか１項記載の方法。
【０１３７】
２９．百日咳毒素を結合させる能力を有し、さらにアミノ酸配列ＬＧＨＧＬＧＹＡＹを含むことを特徴とするペプチド。
【０１３８】
３０．アミノ酸配列ＥＬＡＶＤ、ＥＬＡＩＤ、またはＡＲＷＤＬＶをさらに含むことを特徴とする実施態様２９のペプチド。
【０１３９】
３１．百日咳毒素を結合させる能力を有し、さらにアミノ酸配列ＴＴＡＳＫＳまたはＫＷＴＮＥＨＦＧＴの少なくとも１つを含むことを特徴とするペプチド。
【０１４０】
３２．アミノ酸配列ＴＴＡＳＫＳおよびＫＷＴＮＥＨＦＧＴを含むことを特徴とする実施態様３１記載のペプチド。
【０１４１】
３３．百日咳毒素を結合させる能力を有し、さらに下記の群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするペプチド：
ＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤ；
ＶＧＴＴＩＲＩＡＱＤＴＥＨＹＲＮＶＹＨＫＬＳＱＹＳＲ；
ＷＴＳＭＱＧＥＴＬＷＲＴＤＲＬＡＴＴＫＴＳＭＳＨＰＰ；
ＬＳＡＬＲＲＴＥＲＴＷＮＴＩＨＱＧＨＨＬＥＷＹＰＰＡ；
ＬＳＲＬＡＲＴＥＲＴＷＤＲＩＨＱＧＨＨＬＥＷＨＰＰＡ；
ＴＭＮＴＮＲＭＤＩＱＲＬＭＴＮＨＶＫＲＤＳＳＰＧＳＩ；
ＬＳＡＬＭＲＴＥＲＴＷＮＴＩＨＱＧＨＨＬＥＷＹＰＰＡ；
ＣＬＡＴＲＮＧＦＶＭＮＴＤＲＧＴＹＶＫＲＰＴＶＬＱ；および
ＣＬＡＴＲＮＧＦＶＱＭＮＴＤＲＧＴＹＶＫＲＰＴＶＬＱ。
【０１４２】
３４．百日咳毒素を結合させる能力を有し、さらにアミノ酸配列ＸＸＡＸＲＸＸＸＸＸＸＮＴＸＸＸＸＸＸＸＸＸＴ、または
ＸＸＡＸＲＸＸＸＸＸＸＮＴＸＸＸＸＸＸＸＸＸＹを含み、ここでＸは任意のアミノ酸であることを特徴とするペプチド。
【０１４３】
３５．百日咳毒素を結合する能力を有し、さらにアミノ酸配列ＶＸＸＸＸＸＸＸＸＤＴＸＸＸＸＲＸＸＸＸＸＬＳを有し、ここでＸは任意のアミノ酸であることを特徴とするペプチド。
【０１４４】
３６．少なくとも１つのアミノ酸が保存的に置換されていることを特徴とする実施態様２９〜３５いずれか１項記載のペプチド。
【０１４５】
３７．ビオチン化されていることを特徴とする実施態様２９〜３６いずれか１項記載のペプチド。
【０１４６】
３８．百日咳毒素を含む生物溶液に、固相担体に結合した実施態様２９〜３７に記載の少なくとも１つのペプチドを接触させて百日咳毒素−ペプチド複合体を形成し、さらにその複合体を前記生物溶液中の他の成分から単離する工程を含むことを特徴とする、百日咳毒素を精製する方法。
【０１４７】
３９．前記百日咳毒素を複合体から遊離させさらに単離することを特徴とする実施態様３８記載の方法。
【０１４８】
４０．前記複合体の周囲環境のｐＨを変化させることによって、百日咳毒素を該複合体から遊離させることを特徴とする実施態様３９記載の方法。
【０１４９】
４１．酸性ｐＨを有する溶液に前記複合体をさらすことを特徴とする実施態様４０記載の方法。
【０１５０】
４２．塩基性ｐＨを有する溶液に前記複合体をさらすことを特徴とする実施態様４０記載の方法。
【０１５１】
４３．複合体の周囲環境のイオン強度を変化させることによって、百日咳毒素を該複合体から遊離させることを特徴とする実施態様３９記載の方法。
【０１５２】
４４．高濃度の１以上のイオン塩を有する溶液に前記複合体をさらすことによって、イオン強度を変化させることを特徴とする実施態様４３記載の方法。
【０１５３】
４５．前記イオン塩が、塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムの少なくとも１つであることを特徴とする実施態様４４記載の方法。
【０１５４】
４６．前記イオン塩が塩化マグネシウムであることを特徴とする実施態様４５記載の方法。
【０１５５】
４７．前記固相担体がビーズであることを特徴とする実施態様３８〜４６いずれか１項記載の方法。
【０１５６】
４８．前記固相担体がセファロースを含むことを特徴とする実施態様３８〜４６いずれか１項記載の方法。
【０１５７】
４９．前記固相担体がストレプトアビジンセファロースから成ることを特徴とする実施態様４８記載の方法。
【０１５８】
５０．前記ペプチドがビオチン化されており、該ペプチド上のビオチン部分とストレプトアビジンセファロース上のストレプトアビジン部分との相互作用を介してペプチドが固相担体に結合していることを特徴とする実施態様４９記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤを含むペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列ＲＳＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤＤＡ（配列番号７）を含むことを特徴とする請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
拡散しないように固体担体に直接または間接的に結合した請求項１または２記載のペプチドを含む試薬。
【請求項４】
前記固体担体が、非充填または充填クロマトグラフィー媒体、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、固相粒子、アガロース、セファロース、マイクロチップ、シリコン、シリコンガラス、金、膜、およびリポソームよりなる群から選択されることを特徴とする請求項３記載の試薬。
【請求項５】
百日咳毒素に可逆的に結合している請求項３または４記載の試薬。
【請求項１】
アミノ酸配列ＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤを含むペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列ＲＳＮＶＩＰＬＮＥＶＷＹＤＴＧＷＤＲＰＨＲＳＲＬＳＩＤＤＤＡ（配列番号７）を含むことを特徴とする請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
拡散しないように固体担体に直接または間接的に結合した請求項１または２記載のペプチドを含む試薬。
【請求項４】
前記固体担体が、非充填または充填クロマトグラフィー媒体、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、固相粒子、アガロース、セファロース、マイクロチップ、シリコン、シリコンガラス、金、膜、およびリポソームよりなる群から選択されることを特徴とする請求項３記載の試薬。
【請求項５】
百日咳毒素に可逆的に結合している請求項３または４記載の試薬。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公開番号】特開２０１１−１７３９１９（Ｐ２０１１−１７３９１９Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０９６２９（Ｐ２０１１−１０９６２９）
【出願日】平成２３年５月１６日（２０１１．５．１６）
【分割の表示】特願２００６−５４１３７２（Ｐ２００６−５４１３７２）の分割
【原出願日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０３２６３００１）サノフィ パストゥール インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月１６日（２０１１．５．１６）
【分割の表示】特願２００６−５４１３７２（Ｐ２００６−５４１３７２）の分割
【原出願日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０３２６３００１）サノフィ パストゥール インコーポレイテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]