皮膚バリア機能の鑑別法、これを用いた皮膚バリア機能強化素材のスクリーニング法、該皮膚バリア機能強化素材、及び該皮膚バリア機能強化素材を含有してなる化粧料
優れた皮膚バリア機能強化素材を開発するための技術を提供し、これに基づいて、皮膚バリア機能強化作用に優れる化粧料を開発し、提供する。１）正常ヒト表皮細胞を底部が半透膜であるウェル中で、被験物質の存在下及び非存在下培養し、２）細胞が半透膜に接着している側を下方、その逆側を上方とした場合、それぞれのウェルの細胞の上方に測定する金属イオンを含まない培地を、下方に金属イオンを含む培地を加え、培養し、３）それぞれの培地中の金属イオン濃度を計測し、４）これより金属イオンの表皮細胞層の透過性を計測し、被験物質の添加により添加しない場合に比べ透過性が減じた場合には、被験物質が皮膚バリア機能の強化素材として有効であると判別し、透過性の減じた量が大きいほど被験物質が皮膚バリア機能の強化素材としての適性が高いと鑑別する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚バリア機能の鑑別法、これを用いた皮膚バリア機能強化素材のスクリーニング法、該皮膚バリア機能強化素材、及び該皮膚バリア機能強化素材を含有してなる化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代に於いては、例えば、アトピー性皮膚炎の多発のように、皮膚バリア機能の不全によると思われる皮膚疾患が急増している。この原因としては、ストレスの過負荷が考えられるが（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４を参照）、現象としてこの様な皮膚バリア機能の不全が多発している以上、これを早い時期に重篤化しないように予防したり、実際に現れてしまった症状を改善する手段の開発が望まれている。
【０００３】
その一方で、この様な皮膚バリア機能の不全について、その発現が認識されるのは、肌荒れが起こったり、経皮的水分散逸量が急増したりするような、重篤化した後であることが多く、皮膚バリア機能の不全を初期段階で検出する手段の開発も望まれていたと言える。
【０００４】
皮膚バリア機能の不全の動物モデルについては、幾つかの提案が存するが（例えば、特許文献５、特許文献６を参照）、何れも動物を用いることが必須であり、時間と手間がかかり、且つ、再現性についても疑問の余地が存した。又、この様なスクリーニングでは評価出来る被験サンプル数にも限度が存した。
【０００５】
皮膚バリア機能の評価を、培養細胞を用いて鑑別する方法については全く知られていない。
【０００６】
一方、カルシウムイオンにおいては、表皮・角層細胞の分化・成熟に関与していることが知られており、適切な量のカルシウムイオンの存在は表皮・角層細胞の分化・成熟に秩序を与え、カルシウムイオンの適切な濃度勾配を表皮の下層から上層に向かって構築し、充分なバリア構造を構築する働きを示すが、過度に存在するカルシウムイオンは却って皮膚バリア機能を損なうことが知られている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３を参照）。又、皮膚におけるカルシウムイオン等の金属イオン濃度を調整する技術は全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２９１９０９号公報
【特許文献２】特開２０００−１５９６６６号公報
【特許文献３】特開２０００−３５４２５号公報
【特許文献４】特開平１０−２７９５０５号公報
【特許文献５】特開２００１−３２１０１６号公報
【特許文献６】ＷＯ２００３／０５３４６６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hwang J. et al, J Biol Chem.,(2007), in print
【非特許文献２】Ahn BK. et al , Arch Dermatol Res. ,2007 ;299(2):53-7.
【非特許文献３】Yuki T. et al, Experimental Dermatology ,2007;16 (4), 324-330
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、この様な条件下為されたものであり、優れた皮膚バリア機能強化素材を開発するための技術を提供し、これに基づいて、皮膚バリア機能強化作用に優れる化粧料を開発し、提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、真皮乃至は真皮相当組織から角層細胞への金属イオン、取り分け、角層細胞の分化に影響を及ぼすカルシウムイオンの移動を指標に素材をスクリーニングすることにより、化粧料素材として、優れた皮膚バリア機能の強化素材が得られることを見いだし発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）皮膚バリア機能の鑑別法であって、金属イオンの表皮細胞層の透過性を指標とし、金属イオンの透過性が高いほど、皮膚バリア機能が低いと鑑別することを特徴とする、鑑別法。
（２）前記金属イオンは、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンであることを特徴とする、（１）に記載の鑑別法。
（３）１）正常ヒト表皮細胞を底部が半透膜であるウェル中で、被験物質の存在下及び非存在下培養し、
２）細胞が半透膜に接着している側を下方、その逆側を上方とした場合、それぞれのウェルの細胞の上方に測定する金属イオンを含まない培地を、下方に金属イオンを含む培地を加え、培養し、
３）それぞれの培地中の金属イオン濃度を計測し、
４）これより金属イオンの表皮細胞層の透過性を計測し、被験物質の添加により添加しない場合に比べ透過性が減じた場合には、被験物質が皮膚バリア機能の強化素材として有効であると判別し、透過性の減じた量が大きいほど被験物質が皮膚バリア機能の強化素材としての適性が高いと鑑別することを特徴とする、
皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
（４）前記金属イオンはカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンであることを特徴とする、（３）に記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
（５）前記金属イオンはカルシウムイオンであることを特徴とする、（４）に記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
（６）（３）〜（５）何れかに記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法で有効とされた、皮膚バリア機能の強化素材。
（７）（６）に記載の皮膚バリア機能の強化素材を含む、表皮におけるカルシウムイオンの調整剤。
（８）（６）に記載の皮膚バリア機能の強化素材を含有してなる化粧料。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、優れた皮膚バリア機能強化素材を開発するための技術を提供し、これに基づいて、皮膚バリア機能強化作用に優れる化粧料を開発し、提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１の金属イオン添加濃度と透過係数の関係を示す図である。
【図２】実施例１のＴＥＲと透過係数の関係を示す図である。
【図３】実施例２の培地の比較結果を示す図である。
【図４】実施例３の結果を示す図である。
【図５】実施例４〜７の結果を示す図である。
【図６】実施例８、１０及び１１の結果を示す図である。
【図７】実施例９の結果を示す図である。
【図８】実施例１２、１３の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の皮膚バリア機能の鑑別法は、金属イオンの表皮細胞層の透過性を指標とすることを特徴とする。該鑑別法は、好ましくは、基底層細胞から角層細胞へ向かっての透過性を指標とする。なお、ここで「透過性」とは、物質が細胞内に取り込まれ、放出される性質及び物質が細胞間をすり抜ける性質の両者をあわせたもののことをいう。該鑑別法に於いて、前記金属イオンの透過性が高いほど、皮膚バリア機能は低いと鑑別される。
【００１４】
該鑑別法は、例えば、以下のように実施することが出来る。
１）正常ヒト表皮ケラチノサイトを底部が半透膜であるウェル中で培養し、２）ケラチノサイトが半透膜に接着している側を下方、その逆側を上方とした場合、それぞれのウェルのケラチノサイトの上方に測定する金属イオンを含まない培地を、下方に金属イオンを含む培地を加え、培養（金属イオン負荷条件）し、３）それぞれの培地中の金属イオン濃度を計測し、４）これより金属イオンの表皮細胞層の透過性を計測し、皮膚バリア機能を鑑別する。
【００１５】
表皮細胞としては、いずれの部位の表皮細胞を用いてもよく、例えば新生児の包皮、成人女性の乳房などの表皮細胞を用いることができる。表皮細胞としては市販の表皮細胞を用いることもできる。このような市販の表皮細胞の例としては、正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）などを挙げることができる。表皮は、基底層、有刺層、顆粒層、角層から構成され、本発明の鑑別法にはいずれの層の細胞を用いてもよいが、好ましくは基底層の細胞である。細胞の培養条件等は、通常の培養条件を適用することが出来る。金属イオン負荷条件下の培養時間としては、通常１〜３時間程度である。金属イオン負荷濃度としては、通常５〜１０ｍＭ程度である。
【００１６】
この様な鑑別は、上記のようにイン・ビトロに於いて、例えば、表皮細胞を三次元培養したものなどについて行うことが出来るし、生きた実験動物においても行うことが出来る。また、作製した培養物ごとにこの値を測定し、均質性を確かめるなど、そのバリア機能を一定化する目的で、本発明の鑑別法を用いることも出来る。
【００１７】
更に発展した応用としては、ヒト正常表皮細胞を培養する際に、被験物質を共存せしめ、非共存の場合と比較することにより、被験物質が表皮細胞の膜形成に於いて、皮膚バリア機能を高める働きをするのか、或いは、阻害する作用を示すのかを鑑別することが出来る。
【００１８】
本発明の鑑別法は皮膚バリア機能の向上（強化）に着目すれば、皮膚バリア機能向上成分のスクリーニングへの応用が出来る。例えば、（１−被験物質存在下の金属イオン透過率／被験物質非存在下の金属イオン透過率）×１００等のような値を設定し、この値が大きいものほど皮膚バリア機能の向上作用が高いものであると判別し、スクリーニングを行うことが出来る。カルシウムなどの透過性を阻害する作用が大きければ大きいほど皮膚バリア機能を向上させる作用が高いと判別出来る。この様な透過阻害により、表皮中のカルシウムなどのイオン濃度をコントロールし、適正な濃度勾配に補正することが出来る。これにより、適正な表皮・角層細胞の分化・成熟が促され、角層のバリア機能が向上する。この様なスクリーニングに於いては、ヒトに由来する正常表皮細胞を使用することも出来るし、ヒト以外の動物の正常表皮細胞を使用することも出来る。又、一部の遺伝子を相補的な遺伝子でマスクしたり、他の遺伝子をベクターなどを用いて導入したりして、形質転
換し、特異的な性質を有する表皮細胞を作り、これについてこの様な評価を行うことも出来る。
【００１９】
この様な鑑別に用いられる金属イオンとしては、生体に遍在する金属イオンであれば特段の限定はないが、特に好ましくはアルカリ土類金属イオンであり、中でもカルシウム及び／又はマグネシウムイオンである。最も好ましくは、カルシウムイオンである。これは、表皮細胞に於いては、カルシウムイオンは細胞分化の因子となっており、皮膚バリア機能が健全であれば当然コントロールされるべき金属イオンであり、かかる金属イオンが表皮細胞層を過剰に透過することは、皮膚バリア機能の不全の如実な証拠でもあるからである。又、この様なカルシウムイオンの通過による、表皮からのカルシウムイオンの流出は、角層細胞が成熟し強固な皮膚バリアを形成することを妨げる場合が存する。これを防止する素材は、表皮におけるバリア機能を向上せしめると同時に、角層においても、角層細胞の健全な成熟を促し、これによる皮膚バリア機能の向上も具現化する。
【００２０】
この様な金属イオンの定性的な標識手段は既に知られており、この様な標識手段によって、生体におけるカルシウムイオンなどの金属イオンの分布を知ることが出来る。本発明の鑑別法にもこのような手段を適用することが出来る。好ましい標識としては、カルシウムイオンであれば、アルゼナゾＩＩＩ（Arsenazo ＩＩＩ）或いはその塩等の様な色素が好ましく例示出来る。又、マグネシウムイオンであればキシリジルブルーＩ（Xylidyl blueＩ）等が好適に例示出来る。かかる標識の好ましい濃度は、０．００１ｍＭ〜１０００ｍＭである。かかる標識の局在しているところにカルシウムなどの金属イオンも局在していると見なせる。又、標識濃度が高いほどかかる部位におけるカルシウムなどの金属イオンの濃度も高いと鑑別出来る。
【００２１】
本発明の皮膚バリア機能の強化素材は、皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法で有効とされた、皮膚バリア機能の強化素材である。好ましくは、被験物質の存在下における、カルシウムイオンの真皮、真皮相当組織乃至は表皮深部から、角層乃至は角層相当組織への移動が、被験物質の非存在下に比して、有意に抑制された成分からなる。この様な作用には用量依存性が存し、この用量依存性が明確な濃度範囲になるように、化粧料に含有させて用いることが好ましい。このような作用用量は、個々の素材によっても変化するが、例えば０．０１ｍＭ〜５０ｍＭ、動植物エキスでは０．００１〜１０％（使用時最終濃度）である。この量範囲においては、前記素材は角層におけるカルシウムイオンの調整剤として機能し、角層のバリア機能も向上せしめる。
【００２２】
この様なカルシウムイオンの調整剤としての皮膚バリア機能の強化素材の具体的な例は、ミカン、タチバナ、ダイダイ等のミカン科ミカン属の植物、好ましくはダイダイ（Citrus aurantium）の果皮の極性溶剤、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、ミツバ、フェンネルなどのセリ科（Apiaceae）ミツバグサ属の植物の種子の極性溶剤、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、ヒナギク等のキク科ヒナギク属の植物の花、花蕾の極性溶剤抽出物、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、ローヤルゼリー乃至はその蛋白或いはその蛋白の加水分解物、ブナ、アメリカブナ、イヌブナ、ヨーロッパブナなどのブナ科ブナ属の植物、好ましくは、ヨーロッパブナ（Fagus sylvatica ）の樹皮の極性溶剤抽出物、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、ヤナギランなどのアカバナ科ヤナギラン属の植物の地上部の極性溶剤抽出物、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、フウチョウソウ科ケッパー（Capparis spinosa）の花、花蕾の極性溶剤抽出物、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、キクバオウレン、セリバオウレン、コセリバオウレン等のキンポウゲ科オウレン属の植物の植物体、好ましくは、根茎部を３０〜７０質量％の含水エタノールで抽出し、所望により抽出溶媒を除去或
いは更に分画精製した抽出物、パルマリア・パルメート（Palmaria palmate）等の紅藻類を水で抽出して、所望により限外濾過などで分子量を整え、溶媒除去した紅藻類の抽出物、棘皮動物ヒトデ綱（Asteroidea）アカヒトデ目（Asterina）の動物の極性溶剤抽出物、好ましくは３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、ドクダミなどのドクダミ科ドクダミ属（Houttuynia cordata）の植物の地上部の乾燥物の極性溶剤抽出物、好ましくは３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物等が好適に例示出来る。
【００２３】
かかる成分を化粧料に含有せしめる場合には、化粧料全量に対して、０．０１〜１０質量％含有させることが好ましく、０．０５〜１質量％を含有させることがより好ましい。これは少なすぎると前記効果を奏さない場合が存し、多すぎても表皮への送達量は頭打ちになり、徒に処方の自由度を損なう場合が存するからである。
【００２４】
本発明の化粧料は、前記皮膚バリア機能の強化素材を含有することを特徴とする。かかる成分以外に本発明の化粧料では、通常化粧料に含有される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類；流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール等；イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタエリトリット等の合成エステル油類；ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン；オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン；アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等；脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類；塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類；イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類；ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセロール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセロールモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、Ｐ
ＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類；ポリエチレングリコール、グリセロール、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキサンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等のポリオール類；ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類；表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類；表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類；レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル粉末、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類；パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤；アントラニル酸系紫外線吸収剤；サリチル酸系紫外線吸収剤；桂皮酸系紫外線吸収剤；ベンゾフェノン系紫外線吸収剤；糖系紫外線吸収剤；２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類；ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ6塩酸塩、ビタミンＢ6トリパルミテート、ビタミンＢ6ジオクタノエート、ビタミンＢ2又はその誘導体、ビタミンＢ12、ビタミンＢ15又はその誘導体等のビタミンＢ類；α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類等；フェノキシエタノール等の抗菌剤などが好ましく例示出来る。
【００２５】
本発明の化粧料は、前記任意成分とともに、必須成分である、角層におけるカルシウムイオンなどの調整剤としての、皮膚バリア機能の強化素材とを常法に従って処理することにより製造することが出来る。前記皮膚バリア機能の強化素材を的確に表皮に送達せしめることが特に好ましいことから、例えば、リポソームや二重膜ベシクル、脂肪小球などの送達コンパートメントに含有せしめ、かかる皮膚バリア機能の強化素材を担持した送達コンパートメントを化粧料に含有させても良く、この様な送達コンパートメントを含有させる形態が特に好ましい。又、化粧料としては、通常知られているものであれば特段の限定無く適用出来、例えば、ローション化粧料、乳液化粧料、クリーム化粧料、エッセンス化粧料、パック化粧料、アンダーメークアップ化粧料、ファンデーションなどが好ましく例示出来るが、ローション化粧料、乳液化粧料、クリーム化粧料、エッセンス化粧料、パック化粧料等が特に好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。
【００２７】
［実施例１］
ヒト正常表皮細胞を用いて、本発明の皮膚バリア機能の鑑別法を応用した、イオン透過性試験を行った。
【００２８】
１）細胞播種とイオン透過実験
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。Millicell（登録商標） Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（登録商標）（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、下層１．５ｍｌ、上層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を１×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。ＴＥＲ（細胞層電気抵抗値）がピーク（３５０〜４５０Ω・ｃｍ2）になったところで下方方向（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ）、上方方向（ａｐｉｃａｌ ｓｉｄｅ）に表１に記載の調製液をそれぞれ１．５ｍｌ，０．５ｍｌ加えた。３７℃ ５％二酸化炭素雰囲気下で２時間静置培養し、ａｐｉｃａｌ，ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌの溶液を回収した。
【００２９】
【表１】
【００３０】
２）イオン透過係数 計算式
回収したサンプルを定量試薬｛Ｃａ−Ａｒｓｅｎａｚｏ−ＩＩＩ、Ｍｇ−Ｘｙｌｉｄｙｌ ｂｌｕｅＩ（ともにＦｌｕｋａ社製）｝で定量した。定量フローは以下のとおりである。定量結果からＮｅｔ Ｆｌｕｘ（単位時間、単位面積あたりの物質移動量）を計算し、Ｃａ、Ｍｇイオン透過係数を下記式より算出した。
【００３１】
【数１】
【００３２】
３）Ｃａ定量
ａ） ７．７６ｍｇのＡｒｓｅｎａｚｏＩＩＩに１Ｎ−ＮａＯＨを１００μｌ加えて溶解し、さらに表１で調製したＣａ用ａｐｉｃａｌ溶液を加えて５０ｍlに調整した。（Ca定量液）
ｂ）１Ｍ−ＣａＣｌ2水溶液をａｐｉｃａｌ溶液で希釈し、０．０１〜１ｍＭのＣａ標準液を調製し、９６ウェルプレートにＣａ標準液とＣａ定量液を５０μｌずつ加えＯＤ（６００）を測定し、検量線を引いた。
ｃ）サンプル中のＣａ定量は、Ｃａ定量液とサンプルを５０μｌずつ加えＯＤ（６００）を測定する。検量線に乗らない場合はサンプルをａｐｉｃａｌ溶液で希釈して測定した。
【００３３】
４）Ｍｇ定量
ａ）５．１３ｍｇのＸｙｌｉｄｙｌ ｂｌｕｅＩに１Ｎ−ＮａＯＨを２００μｌ加えて溶解し、硼酸緩衝液（０．２ｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨ ４０ｍｌと０．２ｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ，Ｈ3ＢＯ3混合液（ＫＣｌ １５ｇ，Ｈ3ＢＯ3 １２．５ｇを蒸留水で１ｌにする）５０ｍｌを混合して作る−ｐＨ１０）で５０mlに調整した。(Mg定量液)
ｂ） １Ｍ−ＭｇＣｌ2水溶液をａｐｉｃａｌ溶液で希釈し、０．０１〜１ｍＭのＭｇ標準液を調製し、９６ウェルプレートにＭｇ標準液１５μｌ、Ｍｇ定量液を１００μｌずつ加えＯＤ（５２０）を測定し、検量線を引いた。
ｃ） サンプル中のＭｇ定量は、Ｍｇ定量液１００μｌ、サンプル１５μｌずつ加えＯＤ（５２０）を測定する。検量線に乗らない場合はサンプルをａｐｉｃａｌ溶液で希釈して測定した。
【００３４】
５）ＴＥＲと透過係数との相関
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。Millicell（登録商標） Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（登録商標）（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、下層１．５ｍｌ、上層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を１×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。ＴＥＲを測定し、さらに下方方向（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１（ｅ）又は表１−２（ｅ）に記載の調製液を、上方方向（ａｐｉｃａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１又は表１−２に記載の調製液をそれぞれ１．５ｍｌ，０．５ｍｌ加えた。３７℃ ５％二酸化炭素雰囲気下で２時間静置培養し、ａｐｉｃａｌ，ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌの溶液を回収し、イオン透過係数を測定した。測定後、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、さらに１日後、２日後に、先と同様の操作でＴＥＲ及びイオン透過係数を測定した。
【００３５】
６）結果
金属イオン添加濃度と透過係数の関係は図１に示す。これより、透過係数は５ｍＭ以下で大きく立ち上がっていることから、この範囲に金属イオンの負荷濃度を設定すれば、その影響がより確実に鑑別出来ることがわかった。また、ＴＥＲと透過係数も負の相関にあり、透過係数が皮膚バリア機能と相関した値であることが裏付けられた。この結果は図２に示す。
【００３６】
［実施例２］
実施例１と同様に添加金属イオンとしてカルシウムを選択し、低カルシウム培地（図３ではＣａ−で表示）（０．１５ｍＭ）と高カルシウム培地（図３ではＣａ＋で表示）（１
．４５ｍＭ）でカルシウム透過係数及びマグネシウム透過係数の比較を行った。すなわち、凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。Millicell（登録商標） Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（登録商標）（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、下層１．５ｍｌ、上層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を１×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、低カルシウム培地条件ではＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地のまま、高カルシウム培地条件では１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換して、培養を継続した。１日後にＴＥＲを測定し、さらに下方方向（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１（ｅ）又は表１−２（ｅ）に記載の調製液を、上方方向（ａｐｉｃａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１又は表１−２に記載の調製液をそれぞれ１．５ｍｌ，０．５ｍｌ加えた。３７℃ ５％二酸化炭素雰囲気下で２時間静置培養し、ａｐｉｃａｌ，ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌの溶液を回収し、イオン透過係数を測定した。測定後、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地又は１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、さらに１日後〜５日後に、先と同様の操作でＴＥＲ及びイオン透過係数を測定した。結果を図３に示す。これによれば、高カルシウム培地で育てたケラチノサイトではタイトジャンクションが形成されていくに連れてＴＥＲが上がり、イオン透過係数は減少していることがわかる。これによりカルシウムは皮膚バリア機能の指標となるばかりでなく、細胞膜形成、すなわち、皮膚バリアそのものにも影響を与えており、その透過性のコントロールは皮膚バリア機能を考える上で重要であることが裏付けられた。
【００３７】
［実施例３］
表皮細胞同士の接着因子であるタイトジャンクション蛋白の１つであるクローディン１をｓｉＲＮＡを用いて抑制した場合のＴＥＲと金属イオン透過係数とを、実施例１の方法に従って測定した。すなわち、凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。その後、この培養した細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。Millicell（登録商標） Tissue Culture
Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（登録商標）（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、下層１．５ｍｌ、上層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記ｓｉＲＮＡトランスフェクションヒト表皮角化細胞を２．５×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに２４時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後４８時間培養した。ＴＥＲを測定し、さらに下方方向（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１（ｅ）又は表１−２（ｅ）に記載の調製液を、上方方向（ａｐｉｃａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１又は表１−２に記載の調製液をそれぞれ１．５ｍｌ，０．５ｍｌ加えた。３７℃ ５％二酸化炭素雰囲気下で２時間静置培養し、ａｐｉｃａｌ，ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌの溶液を回収し、イオン透過係数を測定した。結果を図４に示す。これより、クローディン１が抑制されているときには、ＴＥＲが減少し、カルシウムやマグネシウムなどの金属イオンの透過係数も上昇することがわかる。これよりクローディン１等のタイトジャンクション蛋白が金属イオンの透過に影響を与えており、これにより皮膚バリア機能にも影響を与えていることが推察される。
【００３８】
［実施例４］
セリ科ミツバグサ属の植物の種子の粉砕物５００ｇに、３ｌの５０％エタノール水溶液を加え、３時間攪拌下加熱し、還流を行った。室温まで冷却後、不溶物を濾過し、減圧濃縮し、残渣に１ｌの水と、１ｌの酢酸エチルを加え、液液抽出を行った。酢酸エチル層を取り、これを水５００ｍｌで２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮
し、溶媒を除去し、ミツバグサ抽出物１を得た。このものについて、実施例１の１）の手技で作成した三次元培養細胞を用い、これを１０-1％のミツバグサ抽出物１の存在下培養し、５ｍＭのカルシウム負荷濃度で培養した後、実施例１の３）の手技でカルシウムイオンを染色し、吸光度として測定した。被験物質の濃度が０のものを対照（コントロール）として、カルシウムイオンの透過比を求めた。結果を図５に示す。これよりミツバグサ抽出物１はカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００３９】
［実施例５］
実施例４のミツバグサ抽出物１をＬ−カルニチン（シグマ社製）に置換し、同様の手技でカルシウムの移動の抑制を調べた。結果を図５に示す。これよりＬ−カルニチンはカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００４０】
［実施例６］
棘皮動物ヒトデ綱（Asteroidea）アカヒトデ目（Asterina）の動物の乾燥物５００ｇに、３ｌの水を加え、３時間攪拌下加熱し、還流を行った。室温まで冷却後、不溶物を濾過し、減圧濃縮しヒトデ抽出物１を得た。実施例４のミツバグサ抽出物１をこのヒトデ抽出物１に置換し、同様の手技でカルシウムの移動の抑制を調べた。結果を図５に示す。これよりヒトデ抽出物１はカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００４１】
［実施例７］
実施例４のミツバグサ抽出物１をローヤルゼリー加水分解蛋白（「ロイヤルビサイトＰＸ」；片倉チッカリン株式会社製）に置換し、同様の手技でカルシウムの移動の抑制を調べた。結果を図５に示す。これよりローヤルゼリー加水分解蛋白はカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００４２】
［実施例８］
パルマリア・パルメートの植物体全体を乾燥させた後、該乾燥物の１００ｇを秤取り、これに２ｌの水を加え徐々に加熱し、６０℃まで昇温し、この温度を３時間保持した後、室温まで放冷した。冷却後濾過により不溶分を除去し、濾液を凍結乾燥してパルマリア抽出物１を得た。実施例４のミツバグサ抽出物１をパルマリア抽出物１に置換し、同様の手技でカルシウムの移動の抑制を調べた。結果を図６に示す。これよりパルマリア抽出物１はカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００４３】
［実施例９］
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。Millicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層１．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を１×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。その後α，ε−ビス（γ−Ｎ−ラウロイルグルタミル）リジン（ペリセア Ｌ−３０（登録商標）（以下、ペリセアと記載する）；旭化成株式会社製）を１０-4ｖ／ｖ％となるように培養液中に添加した培養液に交換してＴＥＲを測定し、さらに培養を継続し、１日後、２日後、３日後、４日後にＴＥＲを測定した。抽出物の添加時のＴＥＲ（Transepitherial Electrical Resistance）値（Ω・ｃｍ2）
に対する、一定時間後のＴＥＲ値の経時変化を示した。結果を図７に示す。また、実施例１の手技でカルシウムイオン透過係数を測定したところ、ＴＥＲの変化と逆相関性が見られた。これより、ペリセアの添加により、カルシウムイオンの移動が抑制され、コントロールに比べて、抵抗値が上昇していることが分かる。
【００４４】
［実施例１０］
実施例４のミツバグサ抽出物１をε，γ−グルタミルリジンに置換し、同様の手技でカルシウムの移動の抑制を調べた。結果を図６に示す。これよりε，γ−グルタミルリジンはカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００４５】
［実施例１１］
パルマリア抽出物１、α，ε−ビス（γ−Ｎ−ラウロイルグルタミル）リジン（ペリセア）及びε，γ−グルタミルリジンの併用効果を同様に求めた。結果を図６に示す。併用効果が認められた。
【００４６】
［実施例１２］
キンポウゲ科オウレン属キオウレンの根茎を細切したもの５００ｇに、３ｌの５０％エタノール水溶液を加え、３時間攪拌下加熱し、還流を行った。室温まで冷却後、不溶物を濾過し、減圧濃縮し、残渣に１ｌの水と、１ｌの酢酸エチルを加え、液液抽出を行った。酢酸エチル層を取り、これを水５００ｍｌで２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮し、溶媒を除去し、オウレン抽出物１を得た。
【００４７】
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。Millicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層１．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を１×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。その後、オウレン抽出物１を１０-5ｖ／ｖ％となるように培養液中に添加した培養液に交換してＴＥＲを測定し、さらに培養を継続し、１日後、２日後、３日後にＴＥＲを測定した。抽出物の添加時のＴＥＲ（Transepitherial Electrical Resistance）値（Ω・ｃｍ2）に対する、一定時間後のＴＥＲ値の経時変化を示した。結果を図８に示す。また、実施例１の手技でカルシウムイオン透過係数を測定したところ、ＴＥＲの変化と逆相関性が見られた。これより、オウレンの添加により、カルシウムイオンの移動が抑制され、コントロールに比べて、抵抗値が上昇していることが分かる。
【００４８】
［実施例１３］
実施例１２のキオウレンの根茎をミカン科ミカン属ダイダイの果皮の乾燥物に置換して同様に処理し、トウヒ（橙皮）抽出物１を得た。これを実施例１２と同様に操作して、カルシウムイオンの移動抑制による抵抗値の変化として測定評価した。結果を図８に示す。これより、トウヒ抽出物１は優れたカルシウム抑制作用が存することが分かった。
【００４９】
［実施例１４］
以下に示す処方に従って、本発明の化粧料を製造した。即ち、下記に示す処方に従って、本発明の化粧料である乳液を作製した。即ち、（Ａ）の各成分を混合し、８０℃に加熱した。一方、（Ｂ）の各成分を８０℃に加熱した。（Ａ）の混合物に（Ｂ）の混合物を加えて撹拌して乳化させ、更に（Ｃ）を加えて中和し、その後３５℃にまで撹拌、冷却し、
乳液を作製した。
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、化粧料の設計などに応用出来る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚バリア機能の鑑別法、これを用いた皮膚バリア機能強化素材のスクリーニング法、該皮膚バリア機能強化素材、及び該皮膚バリア機能強化素材を含有してなる化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代に於いては、例えば、アトピー性皮膚炎の多発のように、皮膚バリア機能の不全によると思われる皮膚疾患が急増している。この原因としては、ストレスの過負荷が考えられるが（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４を参照）、現象としてこの様な皮膚バリア機能の不全が多発している以上、これを早い時期に重篤化しないように予防したり、実際に現れてしまった症状を改善する手段の開発が望まれている。
【０００３】
その一方で、この様な皮膚バリア機能の不全について、その発現が認識されるのは、肌荒れが起こったり、経皮的水分散逸量が急増したりするような、重篤化した後であることが多く、皮膚バリア機能の不全を初期段階で検出する手段の開発も望まれていたと言える。
【０００４】
皮膚バリア機能の不全の動物モデルについては、幾つかの提案が存するが（例えば、特許文献５、特許文献６を参照）、何れも動物を用いることが必須であり、時間と手間がかかり、且つ、再現性についても疑問の余地が存した。又、この様なスクリーニングでは評価出来る被験サンプル数にも限度が存した。
【０００５】
皮膚バリア機能の評価を、培養細胞を用いて鑑別する方法については全く知られていない。
【０００６】
一方、カルシウムイオンにおいては、表皮・角層細胞の分化・成熟に関与していることが知られており、適切な量のカルシウムイオンの存在は表皮・角層細胞の分化・成熟に秩序を与え、カルシウムイオンの適切な濃度勾配を表皮の下層から上層に向かって構築し、充分なバリア構造を構築する働きを示すが、過度に存在するカルシウムイオンは却って皮膚バリア機能を損なうことが知られている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３を参照）。又、皮膚におけるカルシウムイオン等の金属イオン濃度を調整する技術は全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２９１９０９号公報
【特許文献２】特開２０００−１５９６６６号公報
【特許文献３】特開２０００−３５４２５号公報
【特許文献４】特開平１０−２７９５０５号公報
【特許文献５】特開２００１−３２１０１６号公報
【特許文献６】ＷＯ２００３／０５３４６６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Hwang J. et al, J Biol Chem.,(2007), in print
【非特許文献２】Ahn BK. et al , Arch Dermatol Res. ,2007 ;299(2):53-7.
【非特許文献３】Yuki T. et al, Experimental Dermatology ,2007;16 (4), 324-330
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、この様な条件下為されたものであり、優れた皮膚バリア機能強化素材を開発するための技術を提供し、これに基づいて、皮膚バリア機能強化作用に優れる化粧料を開発し、提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、真皮乃至は真皮相当組織から角層細胞への金属イオン、取り分け、角層細胞の分化に影響を及ぼすカルシウムイオンの移動を指標に素材をスクリーニングすることにより、化粧料素材として、優れた皮膚バリア機能の強化素材が得られることを見いだし発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）皮膚バリア機能の鑑別法であって、金属イオンの表皮細胞層の透過性を指標とし、金属イオンの透過性が高いほど、皮膚バリア機能が低いと鑑別することを特徴とする、鑑別法。
（２）前記金属イオンは、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンであることを特徴とする、（１）に記載の鑑別法。
（３）１）正常ヒト表皮細胞を底部が半透膜であるウェル中で、被験物質の存在下及び非存在下培養し、
２）細胞が半透膜に接着している側を下方、その逆側を上方とした場合、それぞれのウェルの細胞の上方に測定する金属イオンを含まない培地を、下方に金属イオンを含む培地を加え、培養し、
３）それぞれの培地中の金属イオン濃度を計測し、
４）これより金属イオンの表皮細胞層の透過性を計測し、被験物質の添加により添加しない場合に比べ透過性が減じた場合には、被験物質が皮膚バリア機能の強化素材として有効であると判別し、透過性の減じた量が大きいほど被験物質が皮膚バリア機能の強化素材としての適性が高いと鑑別することを特徴とする、
皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
（４）前記金属イオンはカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンであることを特徴とする、（３）に記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
（５）前記金属イオンはカルシウムイオンであることを特徴とする、（４）に記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
（６）（３）〜（５）何れかに記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法で有効とされた、皮膚バリア機能の強化素材。
（７）（６）に記載の皮膚バリア機能の強化素材を含む、表皮におけるカルシウムイオンの調整剤。
（８）（６）に記載の皮膚バリア機能の強化素材を含有してなる化粧料。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、優れた皮膚バリア機能強化素材を開発するための技術を提供し、これに基づいて、皮膚バリア機能強化作用に優れる化粧料を開発し、提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１の金属イオン添加濃度と透過係数の関係を示す図である。
【図２】実施例１のＴＥＲと透過係数の関係を示す図である。
【図３】実施例２の培地の比較結果を示す図である。
【図４】実施例３の結果を示す図である。
【図５】実施例４〜７の結果を示す図である。
【図６】実施例８、１０及び１１の結果を示す図である。
【図７】実施例９の結果を示す図である。
【図８】実施例１２、１３の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の皮膚バリア機能の鑑別法は、金属イオンの表皮細胞層の透過性を指標とすることを特徴とする。該鑑別法は、好ましくは、基底層細胞から角層細胞へ向かっての透過性を指標とする。なお、ここで「透過性」とは、物質が細胞内に取り込まれ、放出される性質及び物質が細胞間をすり抜ける性質の両者をあわせたもののことをいう。該鑑別法に於いて、前記金属イオンの透過性が高いほど、皮膚バリア機能は低いと鑑別される。
【００１４】
該鑑別法は、例えば、以下のように実施することが出来る。
１）正常ヒト表皮ケラチノサイトを底部が半透膜であるウェル中で培養し、２）ケラチノサイトが半透膜に接着している側を下方、その逆側を上方とした場合、それぞれのウェルのケラチノサイトの上方に測定する金属イオンを含まない培地を、下方に金属イオンを含む培地を加え、培養（金属イオン負荷条件）し、３）それぞれの培地中の金属イオン濃度を計測し、４）これより金属イオンの表皮細胞層の透過性を計測し、皮膚バリア機能を鑑別する。
【００１５】
表皮細胞としては、いずれの部位の表皮細胞を用いてもよく、例えば新生児の包皮、成人女性の乳房などの表皮細胞を用いることができる。表皮細胞としては市販の表皮細胞を用いることもできる。このような市販の表皮細胞の例としては、正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）などを挙げることができる。表皮は、基底層、有刺層、顆粒層、角層から構成され、本発明の鑑別法にはいずれの層の細胞を用いてもよいが、好ましくは基底層の細胞である。細胞の培養条件等は、通常の培養条件を適用することが出来る。金属イオン負荷条件下の培養時間としては、通常１〜３時間程度である。金属イオン負荷濃度としては、通常５〜１０ｍＭ程度である。
【００１６】
この様な鑑別は、上記のようにイン・ビトロに於いて、例えば、表皮細胞を三次元培養したものなどについて行うことが出来るし、生きた実験動物においても行うことが出来る。また、作製した培養物ごとにこの値を測定し、均質性を確かめるなど、そのバリア機能を一定化する目的で、本発明の鑑別法を用いることも出来る。
【００１７】
更に発展した応用としては、ヒト正常表皮細胞を培養する際に、被験物質を共存せしめ、非共存の場合と比較することにより、被験物質が表皮細胞の膜形成に於いて、皮膚バリア機能を高める働きをするのか、或いは、阻害する作用を示すのかを鑑別することが出来る。
【００１８】
本発明の鑑別法は皮膚バリア機能の向上（強化）に着目すれば、皮膚バリア機能向上成分のスクリーニングへの応用が出来る。例えば、（１−被験物質存在下の金属イオン透過率／被験物質非存在下の金属イオン透過率）×１００等のような値を設定し、この値が大きいものほど皮膚バリア機能の向上作用が高いものであると判別し、スクリーニングを行うことが出来る。カルシウムなどの透過性を阻害する作用が大きければ大きいほど皮膚バリア機能を向上させる作用が高いと判別出来る。この様な透過阻害により、表皮中のカルシウムなどのイオン濃度をコントロールし、適正な濃度勾配に補正することが出来る。これにより、適正な表皮・角層細胞の分化・成熟が促され、角層のバリア機能が向上する。この様なスクリーニングに於いては、ヒトに由来する正常表皮細胞を使用することも出来るし、ヒト以外の動物の正常表皮細胞を使用することも出来る。又、一部の遺伝子を相補的な遺伝子でマスクしたり、他の遺伝子をベクターなどを用いて導入したりして、形質転
換し、特異的な性質を有する表皮細胞を作り、これについてこの様な評価を行うことも出来る。
【００１９】
この様な鑑別に用いられる金属イオンとしては、生体に遍在する金属イオンであれば特段の限定はないが、特に好ましくはアルカリ土類金属イオンであり、中でもカルシウム及び／又はマグネシウムイオンである。最も好ましくは、カルシウムイオンである。これは、表皮細胞に於いては、カルシウムイオンは細胞分化の因子となっており、皮膚バリア機能が健全であれば当然コントロールされるべき金属イオンであり、かかる金属イオンが表皮細胞層を過剰に透過することは、皮膚バリア機能の不全の如実な証拠でもあるからである。又、この様なカルシウムイオンの通過による、表皮からのカルシウムイオンの流出は、角層細胞が成熟し強固な皮膚バリアを形成することを妨げる場合が存する。これを防止する素材は、表皮におけるバリア機能を向上せしめると同時に、角層においても、角層細胞の健全な成熟を促し、これによる皮膚バリア機能の向上も具現化する。
【００２０】
この様な金属イオンの定性的な標識手段は既に知られており、この様な標識手段によって、生体におけるカルシウムイオンなどの金属イオンの分布を知ることが出来る。本発明の鑑別法にもこのような手段を適用することが出来る。好ましい標識としては、カルシウムイオンであれば、アルゼナゾＩＩＩ（Arsenazo ＩＩＩ）或いはその塩等の様な色素が好ましく例示出来る。又、マグネシウムイオンであればキシリジルブルーＩ（Xylidyl blueＩ）等が好適に例示出来る。かかる標識の好ましい濃度は、０．００１ｍＭ〜１０００ｍＭである。かかる標識の局在しているところにカルシウムなどの金属イオンも局在していると見なせる。又、標識濃度が高いほどかかる部位におけるカルシウムなどの金属イオンの濃度も高いと鑑別出来る。
【００２１】
本発明の皮膚バリア機能の強化素材は、皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法で有効とされた、皮膚バリア機能の強化素材である。好ましくは、被験物質の存在下における、カルシウムイオンの真皮、真皮相当組織乃至は表皮深部から、角層乃至は角層相当組織への移動が、被験物質の非存在下に比して、有意に抑制された成分からなる。この様な作用には用量依存性が存し、この用量依存性が明確な濃度範囲になるように、化粧料に含有させて用いることが好ましい。このような作用用量は、個々の素材によっても変化するが、例えば０．０１ｍＭ〜５０ｍＭ、動植物エキスでは０．００１〜１０％（使用時最終濃度）である。この量範囲においては、前記素材は角層におけるカルシウムイオンの調整剤として機能し、角層のバリア機能も向上せしめる。
【００２２】
この様なカルシウムイオンの調整剤としての皮膚バリア機能の強化素材の具体的な例は、ミカン、タチバナ、ダイダイ等のミカン科ミカン属の植物、好ましくはダイダイ（Citrus aurantium）の果皮の極性溶剤、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、ミツバ、フェンネルなどのセリ科（Apiaceae）ミツバグサ属の植物の種子の極性溶剤、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、ヒナギク等のキク科ヒナギク属の植物の花、花蕾の極性溶剤抽出物、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、ローヤルゼリー乃至はその蛋白或いはその蛋白の加水分解物、ブナ、アメリカブナ、イヌブナ、ヨーロッパブナなどのブナ科ブナ属の植物、好ましくは、ヨーロッパブナ（Fagus sylvatica ）の樹皮の極性溶剤抽出物、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、ヤナギランなどのアカバナ科ヤナギラン属の植物の地上部の極性溶剤抽出物、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、フウチョウソウ科ケッパー（Capparis spinosa）の花、花蕾の極性溶剤抽出物、好ましくは、３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、キクバオウレン、セリバオウレン、コセリバオウレン等のキンポウゲ科オウレン属の植物の植物体、好ましくは、根茎部を３０〜７０質量％の含水エタノールで抽出し、所望により抽出溶媒を除去或
いは更に分画精製した抽出物、パルマリア・パルメート（Palmaria palmate）等の紅藻類を水で抽出して、所望により限外濾過などで分子量を整え、溶媒除去した紅藻類の抽出物、棘皮動物ヒトデ綱（Asteroidea）アカヒトデ目（Asterina）の動物の極性溶剤抽出物、好ましくは３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物、ドクダミなどのドクダミ科ドクダミ属（Houttuynia cordata）の植物の地上部の乾燥物の極性溶剤抽出物、好ましくは３０〜７０％エタノール水溶液抽出物の溶剤除去物乃至は分画物等が好適に例示出来る。
【００２３】
かかる成分を化粧料に含有せしめる場合には、化粧料全量に対して、０．０１〜１０質量％含有させることが好ましく、０．０５〜１質量％を含有させることがより好ましい。これは少なすぎると前記効果を奏さない場合が存し、多すぎても表皮への送達量は頭打ちになり、徒に処方の自由度を損なう場合が存するからである。
【００２４】
本発明の化粧料は、前記皮膚バリア機能の強化素材を含有することを特徴とする。かかる成分以外に本発明の化粧料では、通常化粧料に含有される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類；流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール等；イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタエリトリット等の合成エステル油類；ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン；オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン；アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等；脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類；塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類；イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類；ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセロール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセロールモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、Ｐ
ＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類；ポリエチレングリコール、グリセロール、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキサンジオール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等のポリオール類；ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類；表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類；表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類；表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類；レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類；ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル粉末、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類；パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤；アントラニル酸系紫外線吸収剤；サリチル酸系紫外線吸収剤；桂皮酸系紫外線吸収剤；ベンゾフェノン系紫外線吸収剤；糖系紫外線吸収剤；２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類；エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類；ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ6塩酸塩、ビタミンＢ6トリパルミテート、ビタミンＢ6ジオクタノエート、ビタミンＢ2又はその誘導体、ビタミンＢ12、ビタミンＢ15又はその誘導体等のビタミンＢ類；α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類等；フェノキシエタノール等の抗菌剤などが好ましく例示出来る。
【００２５】
本発明の化粧料は、前記任意成分とともに、必須成分である、角層におけるカルシウムイオンなどの調整剤としての、皮膚バリア機能の強化素材とを常法に従って処理することにより製造することが出来る。前記皮膚バリア機能の強化素材を的確に表皮に送達せしめることが特に好ましいことから、例えば、リポソームや二重膜ベシクル、脂肪小球などの送達コンパートメントに含有せしめ、かかる皮膚バリア機能の強化素材を担持した送達コンパートメントを化粧料に含有させても良く、この様な送達コンパートメントを含有させる形態が特に好ましい。又、化粧料としては、通常知られているものであれば特段の限定無く適用出来、例えば、ローション化粧料、乳液化粧料、クリーム化粧料、エッセンス化粧料、パック化粧料、アンダーメークアップ化粧料、ファンデーションなどが好ましく例示出来るが、ローション化粧料、乳液化粧料、クリーム化粧料、エッセンス化粧料、パック化粧料等が特に好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。
【００２７】
［実施例１］
ヒト正常表皮細胞を用いて、本発明の皮膚バリア機能の鑑別法を応用した、イオン透過性試験を行った。
【００２８】
１）細胞播種とイオン透過実験
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。Millicell（登録商標） Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（登録商標）（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、下層１．５ｍｌ、上層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を１×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。ＴＥＲ（細胞層電気抵抗値）がピーク（３５０〜４５０Ω・ｃｍ2）になったところで下方方向（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ）、上方方向（ａｐｉｃａｌ ｓｉｄｅ）に表１に記載の調製液をそれぞれ１．５ｍｌ，０．５ｍｌ加えた。３７℃ ５％二酸化炭素雰囲気下で２時間静置培養し、ａｐｉｃａｌ，ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌの溶液を回収した。
【００２９】
【表１】
【００３０】
２）イオン透過係数 計算式
回収したサンプルを定量試薬｛Ｃａ−Ａｒｓｅｎａｚｏ−ＩＩＩ、Ｍｇ−Ｘｙｌｉｄｙｌ ｂｌｕｅＩ（ともにＦｌｕｋａ社製）｝で定量した。定量フローは以下のとおりである。定量結果からＮｅｔ Ｆｌｕｘ（単位時間、単位面積あたりの物質移動量）を計算し、Ｃａ、Ｍｇイオン透過係数を下記式より算出した。
【００３１】
【数１】
【００３２】
３）Ｃａ定量
ａ） ７．７６ｍｇのＡｒｓｅｎａｚｏＩＩＩに１Ｎ−ＮａＯＨを１００μｌ加えて溶解し、さらに表１で調製したＣａ用ａｐｉｃａｌ溶液を加えて５０ｍlに調整した。（Ca定量液）
ｂ）１Ｍ−ＣａＣｌ2水溶液をａｐｉｃａｌ溶液で希釈し、０．０１〜１ｍＭのＣａ標準液を調製し、９６ウェルプレートにＣａ標準液とＣａ定量液を５０μｌずつ加えＯＤ（６００）を測定し、検量線を引いた。
ｃ）サンプル中のＣａ定量は、Ｃａ定量液とサンプルを５０μｌずつ加えＯＤ（６００）を測定する。検量線に乗らない場合はサンプルをａｐｉｃａｌ溶液で希釈して測定した。
【００３３】
４）Ｍｇ定量
ａ）５．１３ｍｇのＸｙｌｉｄｙｌ ｂｌｕｅＩに１Ｎ−ＮａＯＨを２００μｌ加えて溶解し、硼酸緩衝液（０．２ｍｏｌ／ｌ ＮａＯＨ ４０ｍｌと０．２ｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ，Ｈ3ＢＯ3混合液（ＫＣｌ １５ｇ，Ｈ3ＢＯ3 １２．５ｇを蒸留水で１ｌにする）５０ｍｌを混合して作る−ｐＨ１０）で５０mlに調整した。(Mg定量液)
ｂ） １Ｍ−ＭｇＣｌ2水溶液をａｐｉｃａｌ溶液で希釈し、０．０１〜１ｍＭのＭｇ標準液を調製し、９６ウェルプレートにＭｇ標準液１５μｌ、Ｍｇ定量液を１００μｌずつ加えＯＤ（５２０）を測定し、検量線を引いた。
ｃ） サンプル中のＭｇ定量は、Ｍｇ定量液１００μｌ、サンプル１５μｌずつ加えＯＤ（５２０）を測定する。検量線に乗らない場合はサンプルをａｐｉｃａｌ溶液で希釈して測定した。
【００３４】
５）ＴＥＲと透過係数との相関
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。Millicell（登録商標） Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（登録商標）（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、下層１．５ｍｌ、上層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を１×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。ＴＥＲを測定し、さらに下方方向（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１（ｅ）又は表１−２（ｅ）に記載の調製液を、上方方向（ａｐｉｃａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１又は表１−２に記載の調製液をそれぞれ１．５ｍｌ，０．５ｍｌ加えた。３７℃ ５％二酸化炭素雰囲気下で２時間静置培養し、ａｐｉｃａｌ，ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌの溶液を回収し、イオン透過係数を測定した。測定後、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、さらに１日後、２日後に、先と同様の操作でＴＥＲ及びイオン透過係数を測定した。
【００３５】
６）結果
金属イオン添加濃度と透過係数の関係は図１に示す。これより、透過係数は５ｍＭ以下で大きく立ち上がっていることから、この範囲に金属イオンの負荷濃度を設定すれば、その影響がより確実に鑑別出来ることがわかった。また、ＴＥＲと透過係数も負の相関にあり、透過係数が皮膚バリア機能と相関した値であることが裏付けられた。この結果は図２に示す。
【００３６】
［実施例２］
実施例１と同様に添加金属イオンとしてカルシウムを選択し、低カルシウム培地（図３ではＣａ−で表示）（０．１５ｍＭ）と高カルシウム培地（図３ではＣａ＋で表示）（１
．４５ｍＭ）でカルシウム透過係数及びマグネシウム透過係数の比較を行った。すなわち、凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。Millicell（登録商標） Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（登録商標）（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、下層１．５ｍｌ、上層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を１×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、低カルシウム培地条件ではＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地のまま、高カルシウム培地条件では１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換して、培養を継続した。１日後にＴＥＲを測定し、さらに下方方向（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１（ｅ）又は表１−２（ｅ）に記載の調製液を、上方方向（ａｐｉｃａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１又は表１−２に記載の調製液をそれぞれ１．５ｍｌ，０．５ｍｌ加えた。３７℃ ５％二酸化炭素雰囲気下で２時間静置培養し、ａｐｉｃａｌ，ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌの溶液を回収し、イオン透過係数を測定した。測定後、Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地又は１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、さらに１日後〜５日後に、先と同様の操作でＴＥＲ及びイオン透過係数を測定した。結果を図３に示す。これによれば、高カルシウム培地で育てたケラチノサイトではタイトジャンクションが形成されていくに連れてＴＥＲが上がり、イオン透過係数は減少していることがわかる。これによりカルシウムは皮膚バリア機能の指標となるばかりでなく、細胞膜形成、すなわち、皮膚バリアそのものにも影響を与えており、その透過性のコントロールは皮膚バリア機能を考える上で重要であることが裏付けられた。
【００３７】
［実施例３］
表皮細胞同士の接着因子であるタイトジャンクション蛋白の１つであるクローディン１をｓｉＲＮＡを用いて抑制した場合のＴＥＲと金属イオン透過係数とを、実施例１の方法に従って測定した。すなわち、凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。その後、この培養した細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。Millicell（登録商標） Tissue Culture
Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（登録商標）（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、下層１．５ｍｌ、上層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記ｓｉＲＮＡトランスフェクションヒト表皮角化細胞を２．５×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに２４時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後４８時間培養した。ＴＥＲを測定し、さらに下方方向（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１（ｅ）又は表１−２（ｅ）に記載の調製液を、上方方向（ａｐｉｃａｌ ｓｉｄｅ）に表１−１又は表１−２に記載の調製液をそれぞれ１．５ｍｌ，０．５ｍｌ加えた。３７℃ ５％二酸化炭素雰囲気下で２時間静置培養し、ａｐｉｃａｌ，ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌの溶液を回収し、イオン透過係数を測定した。結果を図４に示す。これより、クローディン１が抑制されているときには、ＴＥＲが減少し、カルシウムやマグネシウムなどの金属イオンの透過係数も上昇することがわかる。これよりクローディン１等のタイトジャンクション蛋白が金属イオンの透過に影響を与えており、これにより皮膚バリア機能にも影響を与えていることが推察される。
【００３８】
［実施例４］
セリ科ミツバグサ属の植物の種子の粉砕物５００ｇに、３ｌの５０％エタノール水溶液を加え、３時間攪拌下加熱し、還流を行った。室温まで冷却後、不溶物を濾過し、減圧濃縮し、残渣に１ｌの水と、１ｌの酢酸エチルを加え、液液抽出を行った。酢酸エチル層を取り、これを水５００ｍｌで２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮
し、溶媒を除去し、ミツバグサ抽出物１を得た。このものについて、実施例１の１）の手技で作成した三次元培養細胞を用い、これを１０-1％のミツバグサ抽出物１の存在下培養し、５ｍＭのカルシウム負荷濃度で培養した後、実施例１の３）の手技でカルシウムイオンを染色し、吸光度として測定した。被験物質の濃度が０のものを対照（コントロール）として、カルシウムイオンの透過比を求めた。結果を図５に示す。これよりミツバグサ抽出物１はカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００３９】
［実施例５］
実施例４のミツバグサ抽出物１をＬ−カルニチン（シグマ社製）に置換し、同様の手技でカルシウムの移動の抑制を調べた。結果を図５に示す。これよりＬ−カルニチンはカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００４０】
［実施例６］
棘皮動物ヒトデ綱（Asteroidea）アカヒトデ目（Asterina）の動物の乾燥物５００ｇに、３ｌの水を加え、３時間攪拌下加熱し、還流を行った。室温まで冷却後、不溶物を濾過し、減圧濃縮しヒトデ抽出物１を得た。実施例４のミツバグサ抽出物１をこのヒトデ抽出物１に置換し、同様の手技でカルシウムの移動の抑制を調べた。結果を図５に示す。これよりヒトデ抽出物１はカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００４１】
［実施例７］
実施例４のミツバグサ抽出物１をローヤルゼリー加水分解蛋白（「ロイヤルビサイトＰＸ」；片倉チッカリン株式会社製）に置換し、同様の手技でカルシウムの移動の抑制を調べた。結果を図５に示す。これよりローヤルゼリー加水分解蛋白はカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００４２】
［実施例８］
パルマリア・パルメートの植物体全体を乾燥させた後、該乾燥物の１００ｇを秤取り、これに２ｌの水を加え徐々に加熱し、６０℃まで昇温し、この温度を３時間保持した後、室温まで放冷した。冷却後濾過により不溶分を除去し、濾液を凍結乾燥してパルマリア抽出物１を得た。実施例４のミツバグサ抽出物１をパルマリア抽出物１に置換し、同様の手技でカルシウムの移動の抑制を調べた。結果を図６に示す。これよりパルマリア抽出物１はカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００４３】
［実施例９］
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。Millicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層１．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を１×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。その後α，ε−ビス（γ−Ｎ−ラウロイルグルタミル）リジン（ペリセア Ｌ−３０（登録商標）（以下、ペリセアと記載する）；旭化成株式会社製）を１０-4ｖ／ｖ％となるように培養液中に添加した培養液に交換してＴＥＲを測定し、さらに培養を継続し、１日後、２日後、３日後、４日後にＴＥＲを測定した。抽出物の添加時のＴＥＲ（Transepitherial Electrical Resistance）値（Ω・ｃｍ2）
に対する、一定時間後のＴＥＲ値の経時変化を示した。結果を図７に示す。また、実施例１の手技でカルシウムイオン透過係数を測定したところ、ＴＥＲの変化と逆相関性が見られた。これより、ペリセアの添加により、カルシウムイオンの移動が抑制され、コントロールに比べて、抵抗値が上昇していることが分かる。
【００４４】
［実施例１０］
実施例４のミツバグサ抽出物１をε，γ−グルタミルリジンに置換し、同様の手技でカルシウムの移動の抑制を調べた。結果を図６に示す。これよりε，γ−グルタミルリジンはカルシウムイオンの真皮・表皮深層部から角層への移動を抑制する作用を有することが分かる。
【００４５】
［実施例１１］
パルマリア抽出物１、α，ε−ビス（γ−Ｎ−ラウロイルグルタミル）リジン（ペリセア）及びε，γ−グルタミルリジンの併用効果を同様に求めた。結果を図６に示す。併用効果が認められた。
【００４６】
［実施例１２］
キンポウゲ科オウレン属キオウレンの根茎を細切したもの５００ｇに、３ｌの５０％エタノール水溶液を加え、３時間攪拌下加熱し、還流を行った。室温まで冷却後、不溶物を濾過し、減圧濃縮し、残渣に１ｌの水と、１ｌの酢酸エチルを加え、液液抽出を行った。酢酸エチル層を取り、これを水５００ｍｌで２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮し、溶媒を除去し、オウレン抽出物１を得た。
【００４７】
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。Millicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層１．５ｍｌの前記培養液を入れ、上記正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を１×１０5／ｃｍ2で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。その後、オウレン抽出物１を１０-5ｖ／ｖ％となるように培養液中に添加した培養液に交換してＴＥＲを測定し、さらに培養を継続し、１日後、２日後、３日後にＴＥＲを測定した。抽出物の添加時のＴＥＲ（Transepitherial Electrical Resistance）値（Ω・ｃｍ2）に対する、一定時間後のＴＥＲ値の経時変化を示した。結果を図８に示す。また、実施例１の手技でカルシウムイオン透過係数を測定したところ、ＴＥＲの変化と逆相関性が見られた。これより、オウレンの添加により、カルシウムイオンの移動が抑制され、コントロールに比べて、抵抗値が上昇していることが分かる。
【００４８】
［実施例１３］
実施例１２のキオウレンの根茎をミカン科ミカン属ダイダイの果皮の乾燥物に置換して同様に処理し、トウヒ（橙皮）抽出物１を得た。これを実施例１２と同様に操作して、カルシウムイオンの移動抑制による抵抗値の変化として測定評価した。結果を図８に示す。これより、トウヒ抽出物１は優れたカルシウム抑制作用が存することが分かった。
【００４９】
［実施例１４］
以下に示す処方に従って、本発明の化粧料を製造した。即ち、下記に示す処方に従って、本発明の化粧料である乳液を作製した。即ち、（Ａ）の各成分を混合し、８０℃に加熱した。一方、（Ｂ）の各成分を８０℃に加熱した。（Ａ）の混合物に（Ｂ）の混合物を加えて撹拌して乳化させ、更に（Ｃ）を加えて中和し、その後３５℃にまで撹拌、冷却し、
乳液を作製した。
【００５０】
【表２】
【００５１】
【表３】
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、化粧料の設計などに応用出来る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚バリア機能の鑑別法であって、金属イオンの表皮細胞層の透過性を指標とし、金属イオンの透過性が高いほど、皮膚バリア機能が低いと鑑別することを特徴とする、鑑別法。
【請求項２】
前記金属イオンは、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンであることを特徴とする、請求項１に記載の鑑別法。
【請求項３】
１）正常ヒト表皮細胞を底部が半透膜であるウェル中で、被験物質の存在下及び非存在下培養し、
２）細胞が半透膜に接着している側を下方、その逆側を上方とした場合、それぞれのウェルの細胞の上方に測定する金属イオンを含まない培地を、下方に金属イオンを含む培地を加え、培養し、
３）それぞれの培地中の金属イオン濃度を計測し、
４）これより金属イオンの表皮細胞層の透過性を計測し、被験物質の添加により添加しない場合に比べ透過性が減じた場合には、被験物質が皮膚バリア機能の強化素材として有効であると判別し、透過性の減じた量が大きいほど被験物質が皮膚バリア機能の強化素材としての適性が高いと鑑別することを特徴とする、
皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
【請求項４】
前記金属イオンはカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンであることを特徴とする、請求項３に記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
【請求項５】
前記金属イオンはカルシウムイオンであることを特徴とする、請求項４に記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
【請求項６】
請求項３〜５何れか１項に記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法で有効とされた、皮膚バリア機能の強化素材。
【請求項７】
請求項６に記載の皮膚バリア機能の強化素材を含む、表皮におけるカルシウムイオンの調整剤。
【請求項８】
請求項６に記載の皮膚バリア機能の強化素材を含有してなる化粧料。
【請求項１】
皮膚バリア機能の鑑別法であって、金属イオンの表皮細胞層の透過性を指標とし、金属イオンの透過性が高いほど、皮膚バリア機能が低いと鑑別することを特徴とする、鑑別法。
【請求項２】
前記金属イオンは、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンであることを特徴とする、請求項１に記載の鑑別法。
【請求項３】
１）正常ヒト表皮細胞を底部が半透膜であるウェル中で、被験物質の存在下及び非存在下培養し、
２）細胞が半透膜に接着している側を下方、その逆側を上方とした場合、それぞれのウェルの細胞の上方に測定する金属イオンを含まない培地を、下方に金属イオンを含む培地を加え、培養し、
３）それぞれの培地中の金属イオン濃度を計測し、
４）これより金属イオンの表皮細胞層の透過性を計測し、被験物質の添加により添加しない場合に比べ透過性が減じた場合には、被験物質が皮膚バリア機能の強化素材として有効であると判別し、透過性の減じた量が大きいほど被験物質が皮膚バリア機能の強化素材としての適性が高いと鑑別することを特徴とする、
皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
【請求項４】
前記金属イオンはカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンであることを特徴とする、請求項３に記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
【請求項５】
前記金属イオンはカルシウムイオンであることを特徴とする、請求項４に記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法。
【請求項６】
請求項３〜５何れか１項に記載の皮膚バリア機能の強化素材のスクリーニング法で有効とされた、皮膚バリア機能の強化素材。
【請求項７】
請求項６に記載の皮膚バリア機能の強化素材を含む、表皮におけるカルシウムイオンの調整剤。
【請求項８】
請求項６に記載の皮膚バリア機能の強化素材を含有してなる化粧料。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１０−５１１３７６（Ｐ２０１０−５１１３７６Ａ）
【公表日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１９７３４（Ｐ２００９−５１９７３４）
【出願日】平成１９年１２月７日（２００７．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０７４０７０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７２７１７
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（０００１１３４７０）ポーラ化成工業株式会社 (717)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月７日（２００７．１２．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０７４０７０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７２７１７
【国際公開日】平成２０年６月１９日（２００８．６．１９）
【出願人】（０００１１３４７０）ポーラ化成工業株式会社 (717)
【Ｆターム（参考）】
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