皮膚外用剤
【課題】ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を用いた皮膚外用剤であって、薬剤の経皮吸収効果の改善された皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【解決手段】Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体０．０１〜２０重量％と、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩０．０００１〜１０重量％とを含有し、かつポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比が１００／１〜１／５０００であることを特徴とする皮膚外用剤。
【解決手段】Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体０．０１〜２０重量％と、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩０．０００１〜１０重量％とを含有し、かつポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比が１００／１〜１／５０００であることを特徴とする皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚外用剤、更に詳しくは特に薬剤の経皮吸収効果の改善された皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
人の皮膚は、角質層によって覆われており、乾燥した大気中においても水分を失うことなく生命活動を維持できるのは、外界と接しているこの角質層が存在しているからであることはよく知られている。角質層は薄く柔軟で且つ体内の水分を保ち、健常な皮膚状態を維持するように調節している。
【０００３】
しかしながら、我々は環境要因等（例えば、温度変化、湿度変化、光、水との接触、洗剤の使用等）により、しばしば表皮に何らかの損傷をきたすことがある。ダメージを受けた皮膚は、硬く、弾力性も失われ、カサカサとした肌荒れ状態となる。こうした肌荒れ皮膚は、近年、急増傾向にあるアトピー性皮膚炎との関連性も指摘されており、深刻なスキントラブルを招く恐れもある。
【０００４】
荒れ肌には、角質細胞の剥離によるものと、乾燥により皮膚の健康状態が悪化して表皮の硬化や損傷に至るものがある。前者の荒れ肌はコレステロール、セラミド、脂肪酸等の角質細胞間脂質の溶出、および紫外線、洗剤等に起因する角質細胞の変性や表皮細胞の増殖・角化バランスの崩壊による角層透過バリアの形成不全等によって発生する。この荒れ肌を予防または治癒する目的で、角質細胞間脂質成分又はそれに類似する合成の角質細胞間脂質を供給するなどの検討が行われている。この角層細胞間脂質は、有棘層と顆粒層の細胞で生合成された層板顆粒が、角層直下で細胞間に放出され、伸展し、層板（ラメラ）構造をとり、細胞間に広がったものである。層板顆粒はグルコシルセラミド、コレステロール、セラミド、リン脂質等から構成されるが、角層細胞間脂質にはグルコシルセラミドは殆ど含まれていない。すなわち、層板顆粒中のグルコシルセラミドは、β−グルコセレブロシダーゼによって加水分解を受け、セラミドに変換され、このセラミドがラメラ構造をとる結果、角層細胞間脂質として角層透過バリアの形成を改善し、荒れ肌防御のバリアの働きを持つと考えられる。洗浄剤による肌荒れはセラミドの補充が有効であり、肌荒れの改善に高い効果を示すことが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
一方、後者の荒れ肌には、皮膚外用剤には皮膚の恒常性維持の他、皮膚からの水分揮散を防止し、皮膚を構成する表皮、角質層に水分を保持させ皮膚に保湿性、柔軟性を保たせみずみずしい肌を保持する等の目的で保湿剤が配合されている。従来より用いられてきた保湿剤としては、オリーブ油、等の植物油やラノリンのような動物由来の脂質に代表される親油性の保湿剤の他に親水性の保湿剤としては、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール等の水溶性多価アルコール、ヒアルロン酸及びキサンタンガムのような多糖類、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、ピロリドンカルボン酸塩及びアミノ酸に代表される低分子量の天然保湿因子、植物抽出エキス等が知られている。
【０００６】
このように様々な種類の親水性、親油性の保湿剤が存在するが、安全性を重要視する風潮などから、昨今では動物由来のものや化学合成品は避けられる傾向にあり、好ましくは天然物や微生物による発酵生産物で、さらには生体のみならず環境にも負荷の少ない生分解性の素材が期待され注目を浴びている。
【０００７】
一方で、微生物が生産するバイオポリマーが有望視されている。バイオポリマーの中でも、アミノ酸が縮重合して構成されるポリアミノ酸と呼ばれる一群のバイオポリマーには、様々な機能が見出されており、その潜在能力に注目が集まっている。従来、ポリアミノ酸として、ポリ−γ−グルタミン酸（以下、「ＰＧＡ」と表記することがある）、ポリ−ε−リジンおよびシアノファイシンの３種類が同定されている。
【０００８】
ＰＧＡは、グルタミン酸のα−アミノ基とγ−カルボキシル基とがアミド結合したポリアミノ酸である。ＰＧＡは、古くから日本人に親しまれている納豆の糸引きの主体物質として知られる、吸水性のポリアミノ酸であるが、このように親しまれてきた背景として、その魅力的な機能性によるところが大きい。ＰＧＡの魅力的な機能としては、生分解性及び高吸水性を兼ね備えている点が知られている。これらの機能を利用して、上述した皮膚外用剤をはじめ、医療品、食品等、種々の分野、用途で用いられることが期待されている。
【０００９】
最近、ポリアミノ酸の構造的特徴（構成アミノ酸の光学活性や種類、分子サイズ、結合様式など）がその機能性に強く反映されていることが分かってきた。よく知られているところでは、生分解性と高吸水性を兼ね備えている点が挙げられる。それらの機能を利用し、食品、化粧品、医療品などの多くの分野で、種々の用途があるものと期待されている。しかし、現在、製品化されているＰＧＡは、化学的にヘテロなＤＬ−ＰＧＡである。具体的には、ＰＧＡは、納豆菌やその類縁菌から生産され、Ｄ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸が不規則に結合しており、その含有比率や、配列は生産菌の培養毎に変動する。一般に、ポリアミノ酸の構造的特徴（構成するアミノ酸の光学活性や種類、分子サイズ、結合様式など）は、その機能に強く影響を与える。上記ＤＬ−ＰＧＡは、分子毎に構造が異なるため、その性質も分子毎に異なる。これでは、所望の品質を有するＤＬ−ＰＧＡを安定して製造することが困難である。
【００１０】
ホモポリ−γ−グルタミン酸を生産する菌も報告されている。例えば、炭疸菌Bacillus anthracisはＤ−グルタミン酸のみからなるポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸（以下、Ｄ−ＰＧＡと記載することもある）を生産する事が報告されている（非特許文献２）。しかし、本菌は強い病原性を有する細菌であるため、工業的なＰＧＡ生産菌としては不適切であり、生産されるＤ−ＰＧＡの分子量も小さい。また、好アルカリ性細菌Bacillus haloduransは、Ｌ−グルタミン酸のみからなるポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩（以下Ｌ−ＰＧＡと記載することもある）を生産する事も報告されている（非特許文献３）。しかし、本菌の生産するＬ−ＰＧＡは分子量が極めて小さく、実用的な性能を得るには不十分である。
【００１１】
一方、高分子量のホモポリ−γ−グルタミン酸の生産菌として、好塩性古細菌Natrialba aegyptiacaが分子量１０万〜１００万程度のＬ−ＰＧＡを生産することが報告されている。しかし、本菌は液体培養条件下では分子量が１０万程度と小さい、かつ殆どポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩を生産しないため、工業的な生産菌として問題があった（非特許文献４、特許文献１）。
【００１２】
上記以外に、Ｌ−ＰＧＡを生産する生物としては、ヒドラ等が挙げられるが、ヒドラの場合も同様に分子量が極めて小さいという問題がある（非特許文献３）。
【００１３】
一方本発明者らは、均一な光学純度でかつ高分子量のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩を液体培養などで大量に調製することを可能とした。より具体的には、数平均分子量が１３０万以上で、かつ均一な光学純度のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩を、培養液１Ｌあたり４．９９ｇ以上の高い生産性で取得している（特許文献２）。
【００１４】
また、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の架橋方法と架橋体（特許文献３）、並びにポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸及びポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体のうち少なくとも一方を含むことを特徴とする皮膚外用剤（特許文献４）の報告がある。
【００１５】
従来から薬物の投与方法として、経皮投与による外用剤が開発されている。しかしそのような外用剤においては、薬物の経皮吸収性が十分に得られない場合が多く、その目的が達成されることは少ない。すなわち皮膚の最表層は皮膚角質層と呼ばれ、本来体外からの異物の侵入を防ぐ障壁としての生理的機能を有するものであるため、単に従来外用剤に常用されてきた基剤中に薬物を配合しただけでは、十分な経皮吸収性が得られない場合が多い。
【００１６】
これを改良するために近年、各種の経皮吸収促進剤を外用剤の基剤に配合することが一般に行われている。そのような経皮吸収促進剤としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、ミリスチン酸イソプロピル等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特表２００２−５１７２０４号公報
【特許文献２】特開２００７−３１４４３４号公報
【特許文献３】特開２００８−１２０９１０号公報
【特許文献４】特開２００８−１２０７２５号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】ジャーナル オブ バイオサイエンス アンド バイオエンジニアリング、９４，１８７（２００２）
【非特許文献２】Handy, W. E., and H.N. Rydon,Biochem J., 40, 297-309 (1946)
【非特許文献３】生物と化学 Vol.40, No.4, p212-214 (2002)
【非特許文献４】Hezayen, F. F., B. H. A. Rehm, B. J. Tindall and A. Steinbuchel, Int. J. Syst. E., 51, 1133-1142(2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を用いた皮膚外用剤であって、薬剤の経皮吸収効果の改善された皮膚外用剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
斯かる実情において、本発明者らは鋭意研究を行ったところ、Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体に対する経皮吸収促進効果に優れ、かつ安全性に優れた経皮吸収促進剤を開発すべく鋭意研究を行った結果、アセチル化ヒアルロン酸を経皮吸収進剤として用いることにより、優れたＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の経皮吸収性が得られ、かつ皮膚刺激性が低く安全性に優れていることを見出し、本発明を完成した。
【００２１】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体０．０１〜２０重量％と、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩０．０００１〜１０重量％とを含有し、かつポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比が１００／１〜１／５０００であることを特徴とする皮膚外用剤。
（２）ポリ−γ−L−グルタミン酸が、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸分子同士の架橋構造を有することを特徴とするポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体であることを特徴とする（１）の皮膚外用剤。
（３）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が１００万以上であることを特徴とする（１）または（２）の皮膚外用剤。
（４）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が２００万以上であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの皮膚外用剤。
（５）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が３５０万以上であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかの皮膚外用剤。
（６）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の吸水倍率が１０倍以上５０００倍以下であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかの皮膚外用剤。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体の経皮吸収促進効果に優れ、かつ安全性にも優れた皮膚外用剤を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の「ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸」とは、Ｌ−グルタミン酸のみからなるホモポリマ−である。その構造は式（Ｉ）にて示される構造である。α−ＣＯＯＨの水素は水素であっても良いし他の金属対イオンでも良い。例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛及び鉄等一般的なものあれば限定する必要はない。そのなかでも好ましくはナトリウムである。
【００２４】
【化１】
【００２５】
本発明の「分子量」とはプルラン標準物質の分子量換算にて算出した数平均分子量（Ｍｎ）のことを指す。
【００２６】
本発明のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸は、既存の方法で得ることができる。たとえば、特許文献２（特開２００７−３１４４３４号公報）に記載された方法で、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を得ることができる。以下に、一例として、特許文献２を参考にしたポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の製造方法を述べるがこれに限定されるものではない。
【００２７】
たとえば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−に、ナトリアルバ エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３０−８２株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−、受託日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８７２）、ナトリアルバ エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３０−２４３株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−、受託日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８７３）、またはナトリアルバ エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３１−２６４株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−、受託日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８７４）として寄託されている菌株をもちいてポリ−γ−L−グルタミン酸を得る場合、液体培養によりポリ−γ−L−グルタミン酸を得ることができる。または、特許文献２（特開２００７−３１４４３４号公報）に記載された方法で微生物を変異処理し、液体培養によりポリ−γ−L−グルタミン酸を生産できる微生物を作製し、ポリ−γ−L−グルタミン酸を生産することもできる。また、ナトリアルバ エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）を常法により固相培養し、ポリ−γ−L−グルタミン酸を生産することもできる。
【００２８】
液体培養する場合には、振とう培養、通気攪拌培養など好気条件などで行うことが望ましい。その際の培養温度は、３０〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃が適当である。また、培地のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、塩酸、硫酸またそれらの水溶液などによって調整できるが、ｐＨ調整できれば限定されない。培養ｐＨ５．０−９．０、好ましくはｐＨ６．０−８．５で培養するのが望ましい。また、培養期間は、通常２〜７日間程度でよい。また、培養時のＮａＣｌ濃度は１０〜３０％、好ましくは１５〜２５％で培養するのが望ましい。また、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ濃度は０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５．０％濃度で培養するのが望ましい。また、固体培養の場合においても前期液体培養の場合と応用に、培養温度は３０〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃、培養時のｐＨは５．０−９．０、好ましくはｐＨ６．０−８．５、培養時のＮａＣｌ濃度は１０−３０％、好ましくは１５〜２５％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ濃度は０．１−１０％、好ましくは０．５−５％濃度が採用される。このようにして培養すると、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸は、主として菌体外に蓄積されて前記した培養物中に含まれる。特に限定はされないが、ＰＧＡ生産液体培地−１（２２．５％ ＮａＣｌ、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ ＫＣｌ、３％ Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）を使用してもよく、各添加量は菌株にあわせて適宜調整すればよい。
【００２９】
培養液中のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の定量方法としては、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を含む試料から、硫酸銅やエタノ−ルを用いて沈澱させ、その沈殿物の重量測定およびＫｉｊｅｒｄｅｒ法による総窒素の測定を行なうもの（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１４５巻、４１５ペ−ジ、１９４２年）、塩酸加水分解後のグルタミン酸量を測定する方法（Ｒ．Ｄ．Ｈｏｕｓｅｗｒｉｇｔ，Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，６０巻、８９ペ−ジ、１９５０年）及び、塩基性色素との定量的な結合を利用した比色法（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０７巻、５９３ペ−ジ、１９５４年）が知られているが好ましくは、塩基性色素との定量的な結合を利用した比色法である。
【００３０】
塩基性色素としてはクリスタルバイオレット、アニリンブル−、サフラニンオ−、メチレンブル−、メチルバイオレット、トルイジネブル−、コンゴレッド、アゾカルマイン、チオニン、ヘマトキシリンなどがあげられるが、サフラニンオ−が好ましい。
【００３１】
この培養物からポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を分離、採取するには、硫酸銅やエタノ−ルを用いて沈澱させるなどの前記の公知の方法を用いればよい。一例を挙げると、例えば、培養液を遠心分離し、菌体を取り除く。続いて、得られた上清液に３倍量の水を加え希釈した後、ｐＨを３．０に調整する。ｐＨ調整後、５時間 室温で攪拌した。その後、３倍量のエタノ−ルを加え、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を沈殿物として回収した。沈殿物を０．１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、低分子物質を透析により除去する。透析後、得られた液を核酸除去のため、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ処理を行っても良いし、次いでタンパク質除去のために、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理を行っても良い。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理後、透析により低分子物質を除去しても良い。透析後、凍結乾燥等により、乾燥ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を得ればよい。また、必要により陰イオン交換樹脂を用いた精製を行うことができるが、一般的な条件で精製可能である。
【００３２】
本発明に使用するポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の分子量は、特に限定されないが、好ましくは５０万以上、より好ましくは８０万以上、さらに好ましくは１００万以上、特に好ましくは１３０万以上である。
【００３３】
Ｌ−ＰＧＡの分子量の上限値は特に限定されるものではないが、前述のＬ−ＰＧＡの製造方法によれば、例えば、６００万、最大で１５００万のＬ−ＰＧＡを得ることができる。
【００３４】
このポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩は、古細菌によって生産されるために、納豆菌によって生産されるポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩と比べて特有の臭気が軽減することで、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品または医薬品の用途に利用しても品質を損なうことがない。
【００３５】
Ｌ−アスコルビン酸誘導体としては、Ｌ−アスコルビン酸アルキルエステル、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステル等が挙げられ、具体例としては、パルミチン酸Ｌ−アスコルビル、イソパルミチン酸Ｌ−アスコルビル、ジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル、ジイソパルミチン酸Ｌ−アスコルビル、ステアリン酸Ｌ−アスコルビル、イソステアリン酸Ｌ−アスコルビル、ジステアリン酸Ｌ−アスコルビル、ジイソステアリン酸Ｌ−アスコルビル、ミリスチン酸Ｌ−アスコルビル、イソミリスチン酸Ｌ−アスコルビル、ジミリスチン酸Ｌ−アスコルビル、ジイソミリスチン酸Ｌ−アスコルビル、２−エチルヘキサン酸Ｌ−アスコルビル、ジ２−エチルヘキサン酸Ｌ−アスコルビル、オレイン酸Ｌ−アスコルビル、ジオレイン酸Ｌ−アスコルビル等のＬ−アスコルビン酸アルキルエーテル、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−３−リン酸エステル、ＤＬ−α−トコフェノール−２−Ｌ−アスコルビン酸リン酸ジエステル等のＬ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−３−硫酸エステル等のＬ−アスコルビン酸硫酸エステル等が挙げられる。また、本発明においては、これらの塩も使用可能であり、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が好適に用いられる。上記Ｌ−アスコルビン酸またはその誘導体は、主として公知の合成的手法により得られるものであるが、もちろん、その他の方法により得られたものでも使用可能であり、市販されているビタミンＣの誘導体が使用可能である。
【００３６】
上記のＬ−アスコルビン酸およびその誘導体と、アセチル化ヒアルロン酸は、適当な皮膚外用剤中に配合して用いられる。皮膚外用剤の剤型としては、クリーム製剤、軟膏製剤、ゲル製剤、ローション製剤、乳剤、テープ製剤、パップ製剤、エアゾール製剤などが用いられる。
【００３７】
その場合の各々の成分の配合量は、Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体の種類、剤型の種類、投与の方法、投与の目的などによって異なるものであり一概には決められないが、概ね以下の範囲が好ましい配合量である。すなわち、Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合量は外用剤中０．０１〜２０重量％、より好ましくは ０．０１〜１０重量％である。０．０１重量％より少ないとＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の効果がえられないことがあり、また、１０重量％を超えて配合しても薬剤の効果の向上は期待できず、さらに使用性が劣ることがある。
【００３８】
本発明においてポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩を配合する場合の配合量は、皮膚外用剤全量中、０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜５重量％である。０．０００１重量％未満ではその効果は発揮されないことがあり、１０重量％を越えて配合しても薬剤の効果の向上は期待できず、さらには使用性面でべたつきを生じることがあり好ましくない。
【００３９】
本発明に係る皮膚外用剤中のポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比は、１００／１〜１／５０００が好適である。この比をはずれると薬剤の十分な効果が得られなかったり、必要以上にＬ−アスコルビン酸誘導体またはポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩が配合されていることになり費用面で不利益を生じることがある。すなわち、１００／１より多くポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩が配合されても薬剤の効果としてはそれ程の顕著な向上は期待できないことがあり、費用面でも不利益を生じることになる。また、１／５０００より多くＬ−アスコルビン酸およびその誘導体が多く配合されても美白効果の顕著な向上は期待できないため、費用面で不利益を生じることになる。また、この最適比をはずれると場合によっては、使用性が著しく悪くなることがあるため好ましくない。
【００４０】
本発明に係る皮膚外用剤中には、上記の必須構成成分の他に一般的に医薬品、医薬部外品、化粧料等に配合される成分を配合することができる。それらの成分としては、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブタンジオールなどの多価アルコール、流動パラフィン、スクワラン、高級アルコール、高級脂肪酸などの油分、クエン酸、乳酸などの有機酸類、苛性カリ、トリエタノールアミンなどのアルカリ類、高級アルキル硫酸エステル塩、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩などのアニオン性界面活性剤、高級アルキル四級アンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩などのカチオン性界面活性剤、高級アルキルジメチルアミンオキサイドなどの両性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステルなどの非イオン性界面活性剤、アスコルビン酸誘導体、トコフェロール誘導体などの薬剤、紫外線吸収剤、キレート剤、酸化防止剤、防腐剤、増粘剤、保湿剤、香料、アルコールなどが挙げられる。
【００４１】
以下、本発明を実施例に基づき、より詳細に説明する。なお、本発明は、特に実施例に限定されるものではない。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、以下の実施例に示す「％」は全て「重量％」である。
【００４２】
〔製造例１；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の製造〕
Natrialba aegyptica（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４９）のＬ乾燥アンプルに、０．４ｍｌのＰＧＡ生産用液体培地（２２．５％ ＮａＣｌ、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ ＫＣｌ、３％ Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）を加えて懸濁液を得た。０．２ｍｌの当該懸濁液を、ＰＧＡ寒天培地（１０％ ＮａＣｌ、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ ＫＣｌ、３％ Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、２％ Ａｇａｒ）に接種し、３７℃で３日間培養して、シングルコロニーを得た。
【００４３】
次に、５本の１８ｍｌ容試験管に、それぞれ、３ｍｌのＰＧＡ生産液体培地（２２．５％ ＮａＣｌ、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ ＫＣｌ、３％ Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、ｐＨ７．２）を入れ、さらに、上記シングルコロニーを白金耳で１白金耳掻き取り植菌した。植菌後の試験管を、３７℃、３００ｒｐｍで３日間培養して、さらに、得られた培養液０．５ｍｌを、５０ｍｌ ＰＧＡ生産液体培地を入れた５００ｍｌ容坂口フラスコ１０本にそれぞれ植菌し、３７℃で５日間培養した。培養後、得られた培養液を遠心し、菌体を取り除いて上清を回収した。
【００４４】
次に、回収した上清に３倍量の水を加え希釈した後、１Ｎ硫酸でｐＨを３．０に調整した。ｐＨを調整した後、室温で５時間攪拌した。その後、３倍量のエタノールを加えて遠心分離を行い、沈殿物を回収した。この沈殿物がＬ−ＰＧＡである。
【００４５】
回収したＬ−ＰＧＡを０．１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して、これを、低分子物質等の不純物を除去するために透析した。次に、透析後の液体に含まれる核酸を除去するために、当該液体に、ＭｇＣｌ２が１ｍＭ、ＤＮａｓｅＩ（ＴＡＫＡＲＡ社製）が１０Ｕ／ｍｌ、ＲＮａｓｅＩ（ニッポンジーン製）が２０μｇ／ｍｌとなるように加えて、３７℃で２時間インキュベートした。次いでタンパク質を除去するために、核酸を除去した後の液体にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（タカラバイオ製）を３Ｕ／ｍｌとなるように添加して、３７℃で５時間インキュベートしてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理を行なった。
【００４６】
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理の後、超純水で透析し、低分子物質を除去した。次に、Ｌ−ＰＧＡを陰イオン交換樹脂（Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社製）に吸着させ、０．５ＭのＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、１ＭのＮａＣｌ水溶液で溶出した。得られた溶液を、さらに超純水で透析し、透析後の溶液を凍結乾燥することにより、Ｌ−ＰＧＡのナトリウム塩（以下、「Ｌ−ＰＧＡ・Ｎａ塩」と表記する）を得た。なお、超純水は、ＭｉｌｌｉＱ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製の純水製造装置）で作製した。
【００４７】
〔製造例２；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の分子量分析−１〕
製造例１で得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の平均分子量を、ＧＰＣ分析にて測定した。その結果、Ｍｗ＝７，５２２，０００、Ｍｎ＝３，７０４，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．０３１であることが確認された（プルラン換算）。
【００４８】
なお、ＧＰＣ分析は、以下の条件で行なった。
装置：ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ（東ソー社製）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ α−Ｍ（東ソー社製）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
溶出液：０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液
カラム温度：４０℃
注入量：１０μｌ
検出器：示差屈折計
【００４９】
〔製造例３；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の分子量分析−２〕
製造例１において、１．０ＭのＮａＣｌ水溶液溶出した後、さらに、１Ｎ ＨＣｌを用いて、ｐＨを２．０に調製した以外は、製造例１と同様の操作を行なって得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の平均分子量をＧＰＣ分析により測定した。その結果、Ｍｗ＝２，８８８，０００、Ｍｎ＝１，３２７，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．１７６であることが確認された（プルラン換算）。なお、本製造例におけるＧＰＣ分析は、製造例２と同様の操作で行なった。
【００５０】
〔製造例４；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体の作製〕
製造例１で得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の５％水溶液を作製した。
【００５１】
次に、Ｌ−ＰＧＡ・Ｎａ塩水溶液を、窒素を用いて３分間バブリングした後、蓋付き１０ｍｌサンプル瓶に、２ｍｌ分取して蓋を閉めた。
【００５２】
次に、サンプル瓶に、線源をコバルト６０とするγ線照射装置を用いてγ線を照射した。照射線量は、５ｋＧｙとなるように照射した。γ線照射後に得られた生成物を、サンプル瓶から取り出し、余分な水分を８０メッシュの金網で水切りした後、凍結乾燥することで、Ｌ−ＰＧＡ架橋体粉末を得た。なお、上記余分な水分には、未架橋のＬ−ＰＧＡが含まれており、当該水切りは、未架橋のＬ−ＰＧＡを除去することが主たる目的である。
【００５３】
本発明と従来技術の比較
〔実施例１および比較例１〕
表１に示す組成の液剤を調製し、実施例１および比較例１とした。
【００５４】
【表１】
【００５５】
−製法−
（３）に（１）、（２）を溶解し、試料とした（実施例１）。（３）に（１）、（４）、（５）を乳化し、試料とした（比較例１）。
【００５６】
＜薬剤皮膚透過性試験＞
実施例１、比較例１を用いてＬ−アスコルビン酸誘導体の皮膚透過性試験を行った。
−試験方法−
Ｌ−アスコルビン酸誘導体に対する経皮吸収促進効果を評価するため、モデル皮膚を用いた生体外での皮膚透過試験を行った。モデル皮膚は、コラーゲン処理したナイロン膜上でヒト表皮細胞を培養し、増殖分化させることによって得られた分化表皮細胞膜を用いた。直径１０mmの膜表面に薬物試料を５０μl塗布し、ＣＯ2インキュベーター内で３７℃に保った。２４時間後に培養液をサンプリングし、高速液体クロマトグラフィーにより膜を透過したＬ−アスコルビン酸誘導体を定量した。結果は薬剤透過率（％）として表２に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
表２の結果から明らかなように、Ｌ−アスコルビン酸誘導体とアセチル化ヒアルロン酸を配合した液剤（実施例１）は、Ｌ−アスコルビン酸誘導体と従来経皮膚外用剤吸収促進剤として用いられてきたミリスチン酸イソプロピルを配合した液剤（比較例１）と比較して、Ｌ−アスコルビン酸誘導体の皮膚透過促進効果に優れ、アセチル化ヒアルロン酸を組み合わせることにより、はるかにその効果が増大していることがわかる。
【００５９】
ポリ−γ−L−グルタミン酸の配合
〔試験例１〜６〕
表３に示すポリ−γ−L−グルタミン酸の配合量を変えた種々の組成の液剤を実施例１に準じて調製し、試験例１〜６とした。また、Ｌ−アスコルビン酸誘導体の皮膚透過性試験を実施例１に準じて行い合わせて表３に示した。
【００６０】
【表３】
【００６１】
表３の結果から明らかなように、ポリ−γ−L−グルタミン酸の配合量が０．０００１重量％より少ない液剤（試験例１）は、ポリ−γ−L−グルタミン酸の配合量が０．０００１重量％以上の液剤（試験例２〜６）と比較して、顕著なＬ−アスコルビン酸誘導体の経皮吸収効果が得られないことがわかる。また、ポリ−γ−L−グルタミン酸の配合量が１０重量％以上の液剤（試験例６）は、配合量が１０重量％の液剤（試験例５）と比較して、薬剤透過率の向上がないことがわかる。
【００６２】
次に、本発明者らはＬ−アスコルビン酸およびその誘導体とポリ−γ−L−グルタミン酸を配合した皮膚外用剤を実際に使用したときの美白効果について調べた。
【００６３】
本発明の皮膚外用剤による美白効果
〔実施例２および比較例２、３〕
表４に示す組成の乳液を調製し、実施例２、比較例２、３とした。
【００６４】
【表４】
【００６５】
−製法−
Ｃの成分を７０℃に加熱溶解し、Ｂの成分を７０℃に加熱溶解したもの加え、ホモミキサーで乳化する。乳化後、かきまぜながら３０℃まで冷却し、Ａの成分を溶解したものを加え、均一に混合する。
【００６６】
＜美白効果試験＞
実施例２、比較例２および実施例２からＬ−アスコルビン酸誘導体を除いたコントロールとしての比較例３の乳液全３品について、しみ、そばかす等に悩む被験者に適用し、その美白効果を調べた。被験者は３０〜５０代の女性を一群２０名として、一つの乳液を３ヶ月１日２回、一回につき約０．５ｇを顔面に塗布し、期間終了時に被験者に対する問診により、その美白効果を判定した。判定は、以下の基準に従ってスコアをつけ、平均スコアとして表した。結果を表５に示す。
【００６７】
〔美白効果の判定スコア〕
４：しみ、そばかすがほとんど目立たなくなった
２：非常にうすくなった
１：ややうすくなった
０：変化なし
【００６８】
【表５】
【００６９】
表５の結果から明らかなように、Ｌ−アスコルビン酸誘導体のみを配合した乳液（比較例２）は、Ｌ−アスコルビン酸誘導体を配合しない乳液（比較例３）と比較すると若干美白効果を認めることができる。しかしながら、Ｌ−アスコルビン酸誘導体とポリ−γ−L−グルタミン酸を配合した乳液（実施例２）は、Ｌ−アスコルビン酸誘導体のみを配合した乳液（比較例２）と比較するとさらに顕著な美白効果が認められる。
【００７０】
Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合量
〔試験例７〜１２〕
表６に示すＬ−アスコルビン酸誘導体の配合量を変えた種々の組成の乳液を実施例２に準じて調製し、試験例７〜１２とした。また、美白効果の試験を実施例２に準じて行い、その評価を表６に合わせて示した。
【００７１】
【表６】
【００７２】
表６の結果から明らかなように、Ｌ−アスコルビン酸誘導体の配合量が０．０１〜２０重量％の乳液（試験例８〜１１）は、美白効果に優れていることがわかる。これに対して、Ｌ−アスコルビン酸誘導体の配合量が０．０１重量％より少ない乳液（試験例７）は美白効果が極端に劣り、２０重量％を超えて配合された乳液（試験例１２）は、２０重量％配合された乳液（試験例１１）と比較して、薬剤の顕著な向上がないことがわかる。
【００７３】
ポリ−γ−L−グルタミン酸とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比
〔試験例１３〜１８〕
表７に示すポリ−γ−L−グルタミン酸とＬ−アスコルビン酸誘導体の配合重量比を変えた種々の組成の乳液を実施例２に準じて調製し、試験例１３〜１８とした。また、美白効果の試験を実施例２に準じて行い、それらの評価を表９に合わせて示した。
【００７４】
【表７】
【００７５】
表７の結果から明らかなように、ポリ−γ−L−グルタミン酸とＬ−アスコルビン酸誘導体の配合重量比が１００／１の乳液（試験例１４）は、１０／１の乳液（試験例１５）と比較して美白効果の向上が見られる。これに対して１００／１より多くポリ−γ−L−グルタミン酸の割合を増やした乳液（試験例１３）は、１００／１の乳液（試験例１４）と比較して、美白効果の向上はみられない。また、１／５０００の乳液（試験例１７）は、１／５００の乳液（試験例１６）と比較して美白効果の向上が見られる。これに対して１／５０００より多くＬ−アスコルビン酸誘導体の割合を増やした乳液（試験例１８）は、１／５０００の乳液（試験例１７）と比較して、美白効果の向上はみられない。したがって、ポリ−γ−L−グルタミン酸とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比は、１００／１〜１／５０００が好適であることがわかる。
【００７６】
次に、本発明の皮膚外用剤をより具体的にするため、さらに実施例を示す。なお、配合量は重量％を示す。これらの実施例の皮膚外用剤は実施例２と同様優れた美白効果を示した。
【００７７】
〔実施例３〕 クリーム
【００７８】
−製法−
Ｂの成分を７０℃に加熱溶解し、Ａの成分を７０℃に加熱溶解したもの加え、ホモミキサーで乳化する。乳化後、熱交換装置で冷却し、クリームを得る。
【００７９】
【表８】
【００８０】
〔実施例４〕 化粧水
【００８１】
−製法−
Ａのアルコール相をＢの水相に添加し、可溶化して化粧水を得た。
【００８２】
【表９】
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、ポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩ならびにＬ−アスコルビン酸およびその誘導体を含有することにより、薬剤の経皮吸収効果の改善された皮膚外用剤を提供することができる。さらに、従来のポリ−γ−L−グルタミン酸よりも、原料コストが安価であり、大量生産可能となり、長期にわたる使用に十分に耐え得ることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚外用剤、更に詳しくは特に薬剤の経皮吸収効果の改善された皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
人の皮膚は、角質層によって覆われており、乾燥した大気中においても水分を失うことなく生命活動を維持できるのは、外界と接しているこの角質層が存在しているからであることはよく知られている。角質層は薄く柔軟で且つ体内の水分を保ち、健常な皮膚状態を維持するように調節している。
【０００３】
しかしながら、我々は環境要因等（例えば、温度変化、湿度変化、光、水との接触、洗剤の使用等）により、しばしば表皮に何らかの損傷をきたすことがある。ダメージを受けた皮膚は、硬く、弾力性も失われ、カサカサとした肌荒れ状態となる。こうした肌荒れ皮膚は、近年、急増傾向にあるアトピー性皮膚炎との関連性も指摘されており、深刻なスキントラブルを招く恐れもある。
【０００４】
荒れ肌には、角質細胞の剥離によるものと、乾燥により皮膚の健康状態が悪化して表皮の硬化や損傷に至るものがある。前者の荒れ肌はコレステロール、セラミド、脂肪酸等の角質細胞間脂質の溶出、および紫外線、洗剤等に起因する角質細胞の変性や表皮細胞の増殖・角化バランスの崩壊による角層透過バリアの形成不全等によって発生する。この荒れ肌を予防または治癒する目的で、角質細胞間脂質成分又はそれに類似する合成の角質細胞間脂質を供給するなどの検討が行われている。この角層細胞間脂質は、有棘層と顆粒層の細胞で生合成された層板顆粒が、角層直下で細胞間に放出され、伸展し、層板（ラメラ）構造をとり、細胞間に広がったものである。層板顆粒はグルコシルセラミド、コレステロール、セラミド、リン脂質等から構成されるが、角層細胞間脂質にはグルコシルセラミドは殆ど含まれていない。すなわち、層板顆粒中のグルコシルセラミドは、β−グルコセレブロシダーゼによって加水分解を受け、セラミドに変換され、このセラミドがラメラ構造をとる結果、角層細胞間脂質として角層透過バリアの形成を改善し、荒れ肌防御のバリアの働きを持つと考えられる。洗浄剤による肌荒れはセラミドの補充が有効であり、肌荒れの改善に高い効果を示すことが報告されている（非特許文献１）。
【０００５】
一方、後者の荒れ肌には、皮膚外用剤には皮膚の恒常性維持の他、皮膚からの水分揮散を防止し、皮膚を構成する表皮、角質層に水分を保持させ皮膚に保湿性、柔軟性を保たせみずみずしい肌を保持する等の目的で保湿剤が配合されている。従来より用いられてきた保湿剤としては、オリーブ油、等の植物油やラノリンのような動物由来の脂質に代表される親油性の保湿剤の他に親水性の保湿剤としては、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール等の水溶性多価アルコール、ヒアルロン酸及びキサンタンガムのような多糖類、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子、ピロリドンカルボン酸塩及びアミノ酸に代表される低分子量の天然保湿因子、植物抽出エキス等が知られている。
【０００６】
このように様々な種類の親水性、親油性の保湿剤が存在するが、安全性を重要視する風潮などから、昨今では動物由来のものや化学合成品は避けられる傾向にあり、好ましくは天然物や微生物による発酵生産物で、さらには生体のみならず環境にも負荷の少ない生分解性の素材が期待され注目を浴びている。
【０００７】
一方で、微生物が生産するバイオポリマーが有望視されている。バイオポリマーの中でも、アミノ酸が縮重合して構成されるポリアミノ酸と呼ばれる一群のバイオポリマーには、様々な機能が見出されており、その潜在能力に注目が集まっている。従来、ポリアミノ酸として、ポリ−γ−グルタミン酸（以下、「ＰＧＡ」と表記することがある）、ポリ−ε−リジンおよびシアノファイシンの３種類が同定されている。
【０００８】
ＰＧＡは、グルタミン酸のα−アミノ基とγ−カルボキシル基とがアミド結合したポリアミノ酸である。ＰＧＡは、古くから日本人に親しまれている納豆の糸引きの主体物質として知られる、吸水性のポリアミノ酸であるが、このように親しまれてきた背景として、その魅力的な機能性によるところが大きい。ＰＧＡの魅力的な機能としては、生分解性及び高吸水性を兼ね備えている点が知られている。これらの機能を利用して、上述した皮膚外用剤をはじめ、医療品、食品等、種々の分野、用途で用いられることが期待されている。
【０００９】
最近、ポリアミノ酸の構造的特徴（構成アミノ酸の光学活性や種類、分子サイズ、結合様式など）がその機能性に強く反映されていることが分かってきた。よく知られているところでは、生分解性と高吸水性を兼ね備えている点が挙げられる。それらの機能を利用し、食品、化粧品、医療品などの多くの分野で、種々の用途があるものと期待されている。しかし、現在、製品化されているＰＧＡは、化学的にヘテロなＤＬ−ＰＧＡである。具体的には、ＰＧＡは、納豆菌やその類縁菌から生産され、Ｄ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸が不規則に結合しており、その含有比率や、配列は生産菌の培養毎に変動する。一般に、ポリアミノ酸の構造的特徴（構成するアミノ酸の光学活性や種類、分子サイズ、結合様式など）は、その機能に強く影響を与える。上記ＤＬ−ＰＧＡは、分子毎に構造が異なるため、その性質も分子毎に異なる。これでは、所望の品質を有するＤＬ−ＰＧＡを安定して製造することが困難である。
【００１０】
ホモポリ−γ−グルタミン酸を生産する菌も報告されている。例えば、炭疸菌Bacillus anthracisはＤ−グルタミン酸のみからなるポリ−γ−Ｄ−グルタミン酸（以下、Ｄ−ＰＧＡと記載することもある）を生産する事が報告されている（非特許文献２）。しかし、本菌は強い病原性を有する細菌であるため、工業的なＰＧＡ生産菌としては不適切であり、生産されるＤ−ＰＧＡの分子量も小さい。また、好アルカリ性細菌Bacillus haloduransは、Ｌ−グルタミン酸のみからなるポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩（以下Ｌ−ＰＧＡと記載することもある）を生産する事も報告されている（非特許文献３）。しかし、本菌の生産するＬ−ＰＧＡは分子量が極めて小さく、実用的な性能を得るには不十分である。
【００１１】
一方、高分子量のホモポリ−γ−グルタミン酸の生産菌として、好塩性古細菌Natrialba aegyptiacaが分子量１０万〜１００万程度のＬ−ＰＧＡを生産することが報告されている。しかし、本菌は液体培養条件下では分子量が１０万程度と小さい、かつ殆どポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩を生産しないため、工業的な生産菌として問題があった（非特許文献４、特許文献１）。
【００１２】
上記以外に、Ｌ−ＰＧＡを生産する生物としては、ヒドラ等が挙げられるが、ヒドラの場合も同様に分子量が極めて小さいという問題がある（非特許文献３）。
【００１３】
一方本発明者らは、均一な光学純度でかつ高分子量のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩を液体培養などで大量に調製することを可能とした。より具体的には、数平均分子量が１３０万以上で、かつ均一な光学純度のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩を、培養液１Ｌあたり４．９９ｇ以上の高い生産性で取得している（特許文献２）。
【００１４】
また、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の架橋方法と架橋体（特許文献３）、並びにポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸及びポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体のうち少なくとも一方を含むことを特徴とする皮膚外用剤（特許文献４）の報告がある。
【００１５】
従来から薬物の投与方法として、経皮投与による外用剤が開発されている。しかしそのような外用剤においては、薬物の経皮吸収性が十分に得られない場合が多く、その目的が達成されることは少ない。すなわち皮膚の最表層は皮膚角質層と呼ばれ、本来体外からの異物の侵入を防ぐ障壁としての生理的機能を有するものであるため、単に従来外用剤に常用されてきた基剤中に薬物を配合しただけでは、十分な経皮吸収性が得られない場合が多い。
【００１６】
これを改良するために近年、各種の経皮吸収促進剤を外用剤の基剤に配合することが一般に行われている。そのような経皮吸収促進剤としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、ミリスチン酸イソプロピル等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特表２００２−５１７２０４号公報
【特許文献２】特開２００７−３１４４３４号公報
【特許文献３】特開２００８−１２０９１０号公報
【特許文献４】特開２００８−１２０７２５号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】ジャーナル オブ バイオサイエンス アンド バイオエンジニアリング、９４，１８７（２００２）
【非特許文献２】Handy, W. E., and H.N. Rydon,Biochem J., 40, 297-309 (1946)
【非特許文献３】生物と化学 Vol.40, No.4, p212-214 (2002)
【非特許文献４】Hezayen, F. F., B. H. A. Rehm, B. J. Tindall and A. Steinbuchel, Int. J. Syst. E., 51, 1133-1142(2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を用いた皮膚外用剤であって、薬剤の経皮吸収効果の改善された皮膚外用剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
斯かる実情において、本発明者らは鋭意研究を行ったところ、Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体に対する経皮吸収促進効果に優れ、かつ安全性に優れた経皮吸収促進剤を開発すべく鋭意研究を行った結果、アセチル化ヒアルロン酸を経皮吸収進剤として用いることにより、優れたＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の経皮吸収性が得られ、かつ皮膚刺激性が低く安全性に優れていることを見出し、本発明を完成した。
【００２１】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体０．０１〜２０重量％と、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩０．０００１〜１０重量％とを含有し、かつポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比が１００／１〜１／５０００であることを特徴とする皮膚外用剤。
（２）ポリ−γ−L−グルタミン酸が、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸分子同士の架橋構造を有することを特徴とするポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体であることを特徴とする（１）の皮膚外用剤。
（３）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が１００万以上であることを特徴とする（１）または（２）の皮膚外用剤。
（４）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が２００万以上であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの皮膚外用剤。
（５）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が３５０万以上であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかの皮膚外用剤。
（６）ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の吸水倍率が１０倍以上５０００倍以下であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかの皮膚外用剤。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体の経皮吸収促進効果に優れ、かつ安全性にも優れた皮膚外用剤を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の「ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸」とは、Ｌ−グルタミン酸のみからなるホモポリマ−である。その構造は式（Ｉ）にて示される構造である。α−ＣＯＯＨの水素は水素であっても良いし他の金属対イオンでも良い。例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛及び鉄等一般的なものあれば限定する必要はない。そのなかでも好ましくはナトリウムである。
【００２４】
【化１】
【００２５】
本発明の「分子量」とはプルラン標準物質の分子量換算にて算出した数平均分子量（Ｍｎ）のことを指す。
【００２６】
本発明のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸は、既存の方法で得ることができる。たとえば、特許文献２（特開２００７−３１４４３４号公報）に記載された方法で、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を得ることができる。以下に、一例として、特許文献２を参考にしたポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の製造方法を述べるがこれに限定されるものではない。
【００２７】
たとえば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−に、ナトリアルバ エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３０−８２株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−、受託日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８７２）、ナトリアルバ エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３０−２４３株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−、受託日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８７３）、またはナトリアルバ エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）０８３１−２６４株（受託機関名：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ−、受託日：平成１８年４月４日、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２０８７４）として寄託されている菌株をもちいてポリ−γ−L−グルタミン酸を得る場合、液体培養によりポリ−γ−L−グルタミン酸を得ることができる。または、特許文献２（特開２００７−３１４４３４号公報）に記載された方法で微生物を変異処理し、液体培養によりポリ−γ−L−グルタミン酸を生産できる微生物を作製し、ポリ−γ−L−グルタミン酸を生産することもできる。また、ナトリアルバ エジプチアキア（Natrialba aegyptiaca）を常法により固相培養し、ポリ−γ−L−グルタミン酸を生産することもできる。
【００２８】
液体培養する場合には、振とう培養、通気攪拌培養など好気条件などで行うことが望ましい。その際の培養温度は、３０〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃が適当である。また、培地のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、塩酸、硫酸またそれらの水溶液などによって調整できるが、ｐＨ調整できれば限定されない。培養ｐＨ５．０−９．０、好ましくはｐＨ６．０−８．５で培養するのが望ましい。また、培養期間は、通常２〜７日間程度でよい。また、培養時のＮａＣｌ濃度は１０〜３０％、好ましくは１５〜２５％で培養するのが望ましい。また、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ濃度は０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５．０％濃度で培養するのが望ましい。また、固体培養の場合においても前期液体培養の場合と応用に、培養温度は３０〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃、培養時のｐＨは５．０−９．０、好ましくはｐＨ６．０−８．５、培養時のＮａＣｌ濃度は１０−３０％、好ましくは１５〜２５％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ濃度は０．１−１０％、好ましくは０．５−５％濃度が採用される。このようにして培養すると、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸は、主として菌体外に蓄積されて前記した培養物中に含まれる。特に限定はされないが、ＰＧＡ生産液体培地−１（２２．５％ ＮａＣｌ、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ ＫＣｌ、３％ Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）を使用してもよく、各添加量は菌株にあわせて適宜調整すればよい。
【００２９】
培養液中のポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の定量方法としては、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を含む試料から、硫酸銅やエタノ−ルを用いて沈澱させ、その沈殿物の重量測定およびＫｉｊｅｒｄｅｒ法による総窒素の測定を行なうもの（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１４５巻、４１５ペ−ジ、１９４２年）、塩酸加水分解後のグルタミン酸量を測定する方法（Ｒ．Ｄ．Ｈｏｕｓｅｗｒｉｇｔ，Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，６０巻、８９ペ−ジ、１９５０年）及び、塩基性色素との定量的な結合を利用した比色法（Ｍ．Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０７巻、５９３ペ−ジ、１９５４年）が知られているが好ましくは、塩基性色素との定量的な結合を利用した比色法である。
【００３０】
塩基性色素としてはクリスタルバイオレット、アニリンブル−、サフラニンオ−、メチレンブル−、メチルバイオレット、トルイジネブル−、コンゴレッド、アゾカルマイン、チオニン、ヘマトキシリンなどがあげられるが、サフラニンオ−が好ましい。
【００３１】
この培養物からポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を分離、採取するには、硫酸銅やエタノ−ルを用いて沈澱させるなどの前記の公知の方法を用いればよい。一例を挙げると、例えば、培養液を遠心分離し、菌体を取り除く。続いて、得られた上清液に３倍量の水を加え希釈した後、ｐＨを３．０に調整する。ｐＨ調整後、５時間 室温で攪拌した。その後、３倍量のエタノ−ルを加え、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を沈殿物として回収した。沈殿物を０．１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させ、低分子物質を透析により除去する。透析後、得られた液を核酸除去のため、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ処理を行っても良いし、次いでタンパク質除去のために、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理を行っても良い。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ処理後、透析により低分子物質を除去しても良い。透析後、凍結乾燥等により、乾燥ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸を得ればよい。また、必要により陰イオン交換樹脂を用いた精製を行うことができるが、一般的な条件で精製可能である。
【００３２】
本発明に使用するポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の分子量は、特に限定されないが、好ましくは５０万以上、より好ましくは８０万以上、さらに好ましくは１００万以上、特に好ましくは１３０万以上である。
【００３３】
Ｌ−ＰＧＡの分子量の上限値は特に限定されるものではないが、前述のＬ−ＰＧＡの製造方法によれば、例えば、６００万、最大で１５００万のＬ−ＰＧＡを得ることができる。
【００３４】
このポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩は、古細菌によって生産されるために、納豆菌によって生産されるポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩と比べて特有の臭気が軽減することで、化粧品、医薬部外品、医療用品、衛生用品または医薬品の用途に利用しても品質を損なうことがない。
【００３５】
Ｌ−アスコルビン酸誘導体としては、Ｌ−アスコルビン酸アルキルエステル、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステル等が挙げられ、具体例としては、パルミチン酸Ｌ−アスコルビル、イソパルミチン酸Ｌ−アスコルビル、ジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル、ジイソパルミチン酸Ｌ−アスコルビル、ステアリン酸Ｌ−アスコルビル、イソステアリン酸Ｌ−アスコルビル、ジステアリン酸Ｌ−アスコルビル、ジイソステアリン酸Ｌ−アスコルビル、ミリスチン酸Ｌ−アスコルビル、イソミリスチン酸Ｌ−アスコルビル、ジミリスチン酸Ｌ−アスコルビル、ジイソミリスチン酸Ｌ−アスコルビル、２−エチルヘキサン酸Ｌ−アスコルビル、ジ２−エチルヘキサン酸Ｌ−アスコルビル、オレイン酸Ｌ−アスコルビル、ジオレイン酸Ｌ−アスコルビル等のＬ−アスコルビン酸アルキルエーテル、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−３−リン酸エステル、ＤＬ−α−トコフェノール−２−Ｌ−アスコルビン酸リン酸ジエステル等のＬ−アスコルビン酸リン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−３−硫酸エステル等のＬ−アスコルビン酸硫酸エステル等が挙げられる。また、本発明においては、これらの塩も使用可能であり、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が好適に用いられる。上記Ｌ−アスコルビン酸またはその誘導体は、主として公知の合成的手法により得られるものであるが、もちろん、その他の方法により得られたものでも使用可能であり、市販されているビタミンＣの誘導体が使用可能である。
【００３６】
上記のＬ−アスコルビン酸およびその誘導体と、アセチル化ヒアルロン酸は、適当な皮膚外用剤中に配合して用いられる。皮膚外用剤の剤型としては、クリーム製剤、軟膏製剤、ゲル製剤、ローション製剤、乳剤、テープ製剤、パップ製剤、エアゾール製剤などが用いられる。
【００３７】
その場合の各々の成分の配合量は、Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体の種類、剤型の種類、投与の方法、投与の目的などによって異なるものであり一概には決められないが、概ね以下の範囲が好ましい配合量である。すなわち、Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合量は外用剤中０．０１〜２０重量％、より好ましくは ０．０１〜１０重量％である。０．０１重量％より少ないとＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の効果がえられないことがあり、また、１０重量％を超えて配合しても薬剤の効果の向上は期待できず、さらに使用性が劣ることがある。
【００３８】
本発明においてポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩を配合する場合の配合量は、皮膚外用剤全量中、０．０００１〜１０重量％、好ましくは０．００１〜５重量％である。０．０００１重量％未満ではその効果は発揮されないことがあり、１０重量％を越えて配合しても薬剤の効果の向上は期待できず、さらには使用性面でべたつきを生じることがあり好ましくない。
【００３９】
本発明に係る皮膚外用剤中のポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比は、１００／１〜１／５０００が好適である。この比をはずれると薬剤の十分な効果が得られなかったり、必要以上にＬ−アスコルビン酸誘導体またはポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩が配合されていることになり費用面で不利益を生じることがある。すなわち、１００／１より多くポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩が配合されても薬剤の効果としてはそれ程の顕著な向上は期待できないことがあり、費用面でも不利益を生じることになる。また、１／５０００より多くＬ−アスコルビン酸およびその誘導体が多く配合されても美白効果の顕著な向上は期待できないため、費用面で不利益を生じることになる。また、この最適比をはずれると場合によっては、使用性が著しく悪くなることがあるため好ましくない。
【００４０】
本発明に係る皮膚外用剤中には、上記の必須構成成分の他に一般的に医薬品、医薬部外品、化粧料等に配合される成分を配合することができる。それらの成分としては、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブタンジオールなどの多価アルコール、流動パラフィン、スクワラン、高級アルコール、高級脂肪酸などの油分、クエン酸、乳酸などの有機酸類、苛性カリ、トリエタノールアミンなどのアルカリ類、高級アルキル硫酸エステル塩、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩などのアニオン性界面活性剤、高級アルキル四級アンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩などのカチオン性界面活性剤、高級アルキルジメチルアミンオキサイドなどの両性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステルなどの非イオン性界面活性剤、アスコルビン酸誘導体、トコフェロール誘導体などの薬剤、紫外線吸収剤、キレート剤、酸化防止剤、防腐剤、増粘剤、保湿剤、香料、アルコールなどが挙げられる。
【００４１】
以下、本発明を実施例に基づき、より詳細に説明する。なお、本発明は、特に実施例に限定されるものではない。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、以下の実施例に示す「％」は全て「重量％」である。
【００４２】
〔製造例１；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の製造〕
Natrialba aegyptica（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７４９）のＬ乾燥アンプルに、０．４ｍｌのＰＧＡ生産用液体培地（２２．５％ ＮａＣｌ、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ ＫＣｌ、３％ Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）を加えて懸濁液を得た。０．２ｍｌの当該懸濁液を、ＰＧＡ寒天培地（１０％ ＮａＣｌ、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ ＫＣｌ、３％ Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、２％ Ａｇａｒ）に接種し、３７℃で３日間培養して、シングルコロニーを得た。
【００４３】
次に、５本の１８ｍｌ容試験管に、それぞれ、３ｍｌのＰＧＡ生産液体培地（２２．５％ ＮａＣｌ、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ ＫＣｌ、３％ Ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．７５％ Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ、ｐＨ７．２）を入れ、さらに、上記シングルコロニーを白金耳で１白金耳掻き取り植菌した。植菌後の試験管を、３７℃、３００ｒｐｍで３日間培養して、さらに、得られた培養液０．５ｍｌを、５０ｍｌ ＰＧＡ生産液体培地を入れた５００ｍｌ容坂口フラスコ１０本にそれぞれ植菌し、３７℃で５日間培養した。培養後、得られた培養液を遠心し、菌体を取り除いて上清を回収した。
【００４４】
次に、回収した上清に３倍量の水を加え希釈した後、１Ｎ硫酸でｐＨを３．０に調整した。ｐＨを調整した後、室温で５時間攪拌した。その後、３倍量のエタノールを加えて遠心分離を行い、沈殿物を回収した。この沈殿物がＬ−ＰＧＡである。
【００４５】
回収したＬ−ＰＧＡを０．１ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解して、これを、低分子物質等の不純物を除去するために透析した。次に、透析後の液体に含まれる核酸を除去するために、当該液体に、ＭｇＣｌ２が１ｍＭ、ＤＮａｓｅＩ（ＴＡＫＡＲＡ社製）が１０Ｕ／ｍｌ、ＲＮａｓｅＩ（ニッポンジーン製）が２０μｇ／ｍｌとなるように加えて、３７℃で２時間インキュベートした。次いでタンパク質を除去するために、核酸を除去した後の液体にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（タカラバイオ製）を３Ｕ／ｍｌとなるように添加して、３７℃で５時間インキュベートしてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理を行なった。
【００４６】
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ処理の後、超純水で透析し、低分子物質を除去した。次に、Ｌ−ＰＧＡを陰イオン交換樹脂（Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社製）に吸着させ、０．５ＭのＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、１ＭのＮａＣｌ水溶液で溶出した。得られた溶液を、さらに超純水で透析し、透析後の溶液を凍結乾燥することにより、Ｌ−ＰＧＡのナトリウム塩（以下、「Ｌ−ＰＧＡ・Ｎａ塩」と表記する）を得た。なお、超純水は、ＭｉｌｌｉＱ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製の純水製造装置）で作製した。
【００４７】
〔製造例２；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の分子量分析−１〕
製造例１で得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の平均分子量を、ＧＰＣ分析にて測定した。その結果、Ｍｗ＝７，５２２，０００、Ｍｎ＝３，７０４，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．０３１であることが確認された（プルラン換算）。
【００４８】
なお、ＧＰＣ分析は、以下の条件で行なった。
装置：ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ（東ソー社製）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ α−Ｍ（東ソー社製）
流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
溶出液：０．１５Ｍ ＮａＣｌ水溶液
カラム温度：４０℃
注入量：１０μｌ
検出器：示差屈折計
【００４９】
〔製造例３；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の分子量分析−２〕
製造例１において、１．０ＭのＮａＣｌ水溶液溶出した後、さらに、１Ｎ ＨＣｌを用いて、ｐＨを２．０に調製した以外は、製造例１と同様の操作を行なって得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の平均分子量をＧＰＣ分析により測定した。その結果、Ｍｗ＝２，８８８，０００、Ｍｎ＝１，３２７，０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．１７６であることが確認された（プルラン換算）。なお、本製造例におけるＧＰＣ分析は、製造例２と同様の操作で行なった。
【００５０】
〔製造例４；ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体の作製〕
製造例１で得たＬ−ＰＧＡ・Ｎａ塩の５％水溶液を作製した。
【００５１】
次に、Ｌ−ＰＧＡ・Ｎａ塩水溶液を、窒素を用いて３分間バブリングした後、蓋付き１０ｍｌサンプル瓶に、２ｍｌ分取して蓋を閉めた。
【００５２】
次に、サンプル瓶に、線源をコバルト６０とするγ線照射装置を用いてγ線を照射した。照射線量は、５ｋＧｙとなるように照射した。γ線照射後に得られた生成物を、サンプル瓶から取り出し、余分な水分を８０メッシュの金網で水切りした後、凍結乾燥することで、Ｌ−ＰＧＡ架橋体粉末を得た。なお、上記余分な水分には、未架橋のＬ−ＰＧＡが含まれており、当該水切りは、未架橋のＬ−ＰＧＡを除去することが主たる目的である。
【００５３】
本発明と従来技術の比較
〔実施例１および比較例１〕
表１に示す組成の液剤を調製し、実施例１および比較例１とした。
【００５４】
【表１】
【００５５】
−製法−
（３）に（１）、（２）を溶解し、試料とした（実施例１）。（３）に（１）、（４）、（５）を乳化し、試料とした（比較例１）。
【００５６】
＜薬剤皮膚透過性試験＞
実施例１、比較例１を用いてＬ−アスコルビン酸誘導体の皮膚透過性試験を行った。
−試験方法−
Ｌ−アスコルビン酸誘導体に対する経皮吸収促進効果を評価するため、モデル皮膚を用いた生体外での皮膚透過試験を行った。モデル皮膚は、コラーゲン処理したナイロン膜上でヒト表皮細胞を培養し、増殖分化させることによって得られた分化表皮細胞膜を用いた。直径１０mmの膜表面に薬物試料を５０μl塗布し、ＣＯ2インキュベーター内で３７℃に保った。２４時間後に培養液をサンプリングし、高速液体クロマトグラフィーにより膜を透過したＬ−アスコルビン酸誘導体を定量した。結果は薬剤透過率（％）として表２に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
表２の結果から明らかなように、Ｌ−アスコルビン酸誘導体とアセチル化ヒアルロン酸を配合した液剤（実施例１）は、Ｌ−アスコルビン酸誘導体と従来経皮膚外用剤吸収促進剤として用いられてきたミリスチン酸イソプロピルを配合した液剤（比較例１）と比較して、Ｌ−アスコルビン酸誘導体の皮膚透過促進効果に優れ、アセチル化ヒアルロン酸を組み合わせることにより、はるかにその効果が増大していることがわかる。
【００５９】
ポリ−γ−L−グルタミン酸の配合
〔試験例１〜６〕
表３に示すポリ−γ−L−グルタミン酸の配合量を変えた種々の組成の液剤を実施例１に準じて調製し、試験例１〜６とした。また、Ｌ−アスコルビン酸誘導体の皮膚透過性試験を実施例１に準じて行い合わせて表３に示した。
【００６０】
【表３】
【００６１】
表３の結果から明らかなように、ポリ−γ−L−グルタミン酸の配合量が０．０００１重量％より少ない液剤（試験例１）は、ポリ−γ−L−グルタミン酸の配合量が０．０００１重量％以上の液剤（試験例２〜６）と比較して、顕著なＬ−アスコルビン酸誘導体の経皮吸収効果が得られないことがわかる。また、ポリ−γ−L−グルタミン酸の配合量が１０重量％以上の液剤（試験例６）は、配合量が１０重量％の液剤（試験例５）と比較して、薬剤透過率の向上がないことがわかる。
【００６２】
次に、本発明者らはＬ−アスコルビン酸およびその誘導体とポリ−γ−L−グルタミン酸を配合した皮膚外用剤を実際に使用したときの美白効果について調べた。
【００６３】
本発明の皮膚外用剤による美白効果
〔実施例２および比較例２、３〕
表４に示す組成の乳液を調製し、実施例２、比較例２、３とした。
【００６４】
【表４】
【００６５】
−製法−
Ｃの成分を７０℃に加熱溶解し、Ｂの成分を７０℃に加熱溶解したもの加え、ホモミキサーで乳化する。乳化後、かきまぜながら３０℃まで冷却し、Ａの成分を溶解したものを加え、均一に混合する。
【００６６】
＜美白効果試験＞
実施例２、比較例２および実施例２からＬ−アスコルビン酸誘導体を除いたコントロールとしての比較例３の乳液全３品について、しみ、そばかす等に悩む被験者に適用し、その美白効果を調べた。被験者は３０〜５０代の女性を一群２０名として、一つの乳液を３ヶ月１日２回、一回につき約０．５ｇを顔面に塗布し、期間終了時に被験者に対する問診により、その美白効果を判定した。判定は、以下の基準に従ってスコアをつけ、平均スコアとして表した。結果を表５に示す。
【００６７】
〔美白効果の判定スコア〕
４：しみ、そばかすがほとんど目立たなくなった
２：非常にうすくなった
１：ややうすくなった
０：変化なし
【００６８】
【表５】
【００６９】
表５の結果から明らかなように、Ｌ−アスコルビン酸誘導体のみを配合した乳液（比較例２）は、Ｌ−アスコルビン酸誘導体を配合しない乳液（比較例３）と比較すると若干美白効果を認めることができる。しかしながら、Ｌ−アスコルビン酸誘導体とポリ−γ−L−グルタミン酸を配合した乳液（実施例２）は、Ｌ−アスコルビン酸誘導体のみを配合した乳液（比較例２）と比較するとさらに顕著な美白効果が認められる。
【００７０】
Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合量
〔試験例７〜１２〕
表６に示すＬ−アスコルビン酸誘導体の配合量を変えた種々の組成の乳液を実施例２に準じて調製し、試験例７〜１２とした。また、美白効果の試験を実施例２に準じて行い、その評価を表６に合わせて示した。
【００７１】
【表６】
【００７２】
表６の結果から明らかなように、Ｌ−アスコルビン酸誘導体の配合量が０．０１〜２０重量％の乳液（試験例８〜１１）は、美白効果に優れていることがわかる。これに対して、Ｌ−アスコルビン酸誘導体の配合量が０．０１重量％より少ない乳液（試験例７）は美白効果が極端に劣り、２０重量％を超えて配合された乳液（試験例１２）は、２０重量％配合された乳液（試験例１１）と比較して、薬剤の顕著な向上がないことがわかる。
【００７３】
ポリ−γ−L−グルタミン酸とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比
〔試験例１３〜１８〕
表７に示すポリ−γ−L−グルタミン酸とＬ−アスコルビン酸誘導体の配合重量比を変えた種々の組成の乳液を実施例２に準じて調製し、試験例１３〜１８とした。また、美白効果の試験を実施例２に準じて行い、それらの評価を表９に合わせて示した。
【００７４】
【表７】
【００７５】
表７の結果から明らかなように、ポリ−γ−L−グルタミン酸とＬ−アスコルビン酸誘導体の配合重量比が１００／１の乳液（試験例１４）は、１０／１の乳液（試験例１５）と比較して美白効果の向上が見られる。これに対して１００／１より多くポリ−γ−L−グルタミン酸の割合を増やした乳液（試験例１３）は、１００／１の乳液（試験例１４）と比較して、美白効果の向上はみられない。また、１／５０００の乳液（試験例１７）は、１／５００の乳液（試験例１６）と比較して美白効果の向上が見られる。これに対して１／５０００より多くＬ−アスコルビン酸誘導体の割合を増やした乳液（試験例１８）は、１／５０００の乳液（試験例１７）と比較して、美白効果の向上はみられない。したがって、ポリ−γ−L−グルタミン酸とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比は、１００／１〜１／５０００が好適であることがわかる。
【００７６】
次に、本発明の皮膚外用剤をより具体的にするため、さらに実施例を示す。なお、配合量は重量％を示す。これらの実施例の皮膚外用剤は実施例２と同様優れた美白効果を示した。
【００７７】
〔実施例３〕 クリーム
【００７８】
−製法−
Ｂの成分を７０℃に加熱溶解し、Ａの成分を７０℃に加熱溶解したもの加え、ホモミキサーで乳化する。乳化後、熱交換装置で冷却し、クリームを得る。
【００７９】
【表８】
【００８０】
〔実施例４〕 化粧水
【００８１】
−製法−
Ａのアルコール相をＢの水相に添加し、可溶化して化粧水を得た。
【００８２】
【表９】
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、ポリ−γ−L−グルタミン酸および／またはその塩ならびにＬ−アスコルビン酸およびその誘導体を含有することにより、薬剤の経皮吸収効果の改善された皮膚外用剤を提供することができる。さらに、従来のポリ−γ−L−グルタミン酸よりも、原料コストが安価であり、大量生産可能となり、長期にわたる使用に十分に耐え得ることからも、産業界に大きく寄与することが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体０．０１〜２０重量％と、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩０．０００１〜１０重量％とを含有し、かつポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比が１００／１〜１／５０００であることを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項２】
ポリ−γ−L−グルタミン酸が、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸分子同士の架橋構造を有することを特徴とするポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が１００万以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の皮膚外用剤。
【請求項４】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が２００万以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が３５０万以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚外用剤。
【請求項６】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の吸水倍率が１０倍以上５０００倍以下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の皮膚外用剤。
【請求項１】
Ｌ−アスコルビン酸およびその誘導体０．０１〜２０重量％と、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩０．０００１〜１０重量％とを含有し、かつポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸および／またはその塩とＬ−アスコルビン酸およびその誘導体の配合重量比が１００／１〜１／５０００であることを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項２】
ポリ−γ−L−グルタミン酸が、ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸分子同士の架橋構造を有することを特徴とするポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸架橋体であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が１００万以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の皮膚外用剤。
【請求項４】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が２００万以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の平均分子量が３５０万以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚外用剤。
【請求項６】
ポリ−γ−Ｌ−グルタミン酸の吸水倍率が１０倍以上５０００倍以下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の皮膚外用剤。
【公開番号】特開２０１２−１４４５（Ｐ２０１２−１４４５Ａ）
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３４９５５（Ｐ２０１０−１３４９５５）
【出願日】平成２２年６月１４日（２０１０．６．１４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１４日（２０１０．６．１４）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]