皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の新規な診断及び治療法
【課題】Ｔリンパ腫の新規な診断及び治療法を提供する。
【解決手段】下記の段階を含むことを特徴とする、患者の特定の体内区分内の、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の存在比率の数値を求める方法。p１４０分子を発現するＣＤ４＋細胞の比率の値を、前記患者から得られた生物学的試料を基に測定し、そして、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の、現実に前記体内区分に存在する比率の数値は、前記測定値の約±１０％の範囲内に入る数値と考える。
【解決手段】下記の段階を含むことを特徴とする、患者の特定の体内区分内の、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の存在比率の数値を求める方法。p１４０分子を発現するＣＤ４＋細胞の比率の値を、前記患者から得られた生物学的試料を基に測定し、そして、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の、現実に前記体内区分に存在する比率の数値は、前記測定値の約±１０％の範囲内に入る数値と考える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願はＴリンパ腫の新規な診断及び治療法、更に詳しくは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬと略称する）の新規な診断及び治療法に関する。本発明は現実に、ＣＴＣＬに共通する腫瘍マーカーを提供し、そのバイオテクノロジー的及び医学的用途をも含む。
【背景技術】
【０００２】
ＣＴＣＬは本来皮膚に関するＴリンパ腫のグループである。ＣＴＣＬグループは即ち、形質転換菌状息肉症（形質転換ＭＦと略称する）、セザリー症候群（ＳＳと略称する）、リンパ腫丘疹（ＬＰと略称する）及びＣＤ３０＋リンパ腫からなる。形質転換ＭＦは表現タイプが成長済みＴヘルパー細胞に類似するクローン誘導型悪性Ｔリンパ球の皮膚侵襲に因るものである。ＬＰ及びＣＤ３０＋リンパ腫もまた、皮膚で進展する。より進行性な型のＣＴＣＬは、悪性細胞が非表皮性になったとき発達し、特殊な皮膚関連性を示すようになる。ＳＳはＣＤ４＋／ＣＤ４５＋ＲＯ＋Ｔ細胞のクローン増大及びこれらの悪性Ｔ細胞の血中への出現による、より進行性なＣＴＣＬのタイプである。大部分のＣＴＣＬはＣＤ４＋ＣＴＣＬであり、稀にＣＤ８＋ＣＴＣＬの場合がある。
細胞表面の特殊なマーカーが欠如しているために、悪性細胞の同定が困難であるから、ＣＴＣＬ病の生物学は、十分には、理解されていない状態が継続している。皮膚の病変において、活動性、浸潤性のリンパ球（非腫瘍性の）の中から、ＣＴＣＬ細胞を識別するのは困難である。
ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫の診断は、現時点では、疑わしい体内（脳の細胞核を示す細胞の検知によって、皮膚生検及び／または血液中のＳＳの存在の外観の組織病理学的観察）から採取された試料中に腫瘍細胞が存在するか、しないかを、細胞学的且つ組織病理学的観察によって行なうことに基づいている。このような診断法は、皮膚リンパ球の悪性リンパ球への形質転換の初期では、特に、十分な信頼性に欠ける。このような診断法は病気を現実のものとして捉えることができない。技術的には時間も浪費する。
今日では、ＣＴＣＬの治療は、非特異的化学療法による腫瘍細胞アポトーシスの誘導により試験的に行なわれている。
だから、ＣＴＣＬのような悪性Ｔ細胞の増殖に関連する病気の診断及び治療の問題点のより正確で好適な解決策が、まだ、必要とされている。
【０００３】
このような従来技術の状況に鑑み、発明者等はＣＴＣＬの診断及び治療の問題点を解決する二つの分子を提供する。一つは発明者によってＳＣ５と命名され、他方はp１４０分子（p１４０は、また、ＫＩＲ３ＤＬ２である）である。
本発明におけるＳＣ５分子は生化学的、機能的に新規な蛋白質であり、還元状態で、見かけの分子量は９６kＤである。これは発明者等によって産生されたモノクローナル抗体の抗原として分離された。このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは２０００年１０月３０日、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.（Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.パスツール研究所;２５、rue du Docteur Roux、F-７５７２４ Paris Cedex１５、France）にブダペスト条約（Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.寄託番号I-２５７５）に従がって寄託された。細胞表面で発現され、集合されたとき、ＳＣ５分子は細胞活動及び増殖の阻害受容体として行動する。本発明の第二のマーカー、即ち、p１４０は既に阻害受容体として知られているが、以前に、ＮＫ細胞及び健康なヒトのＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞のサブグループであると述べられていた。発明者等は、ここで、p１４０がＣＴＣＬ細胞のような腫瘍Ｔ細胞の表面で発現されることを示す。
発明者等は、更に、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような悪性のＣＤ４＋Ｔ細胞の表面で、p１４０が発現するのに対し、ＮＫ細胞（p５８.１、p５８.２、p７０ＫＩＲs、CD９４/NKG２A）の表面で通常観察される他の受容体は、悪性のＣＤ４＋Ｔ細胞の表面で観察されないことを示す。勿論、p１４０は皮膚炎（例えば、皮膚結核、苔癬）または毒物による皮膚壊死のような非腫瘍性の皮膚系疾病に罹っている患者から採取されたＣＤ４＋Ｔ細胞の表面では、発明者によって観察されていないことに留意すべきである。
腫瘍性ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面で、p１４０の二つの対立型が発明者によって同定された。即ち、対立型ＫＩＲ３Ｄクローン２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１）及び対立型p１４０クローン１．１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３）である。対立型ＫＩＲ３Ｄクローン２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１）は新規蛋白質（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２）をコード化する新規なポリヌクレオチドである。ＫＩＲ３Ｄクローン２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１）は、前記p１４０クローン１．１ＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３）に比較して、５つの相違点が明らかであり、前記p１４０クローン１．１成熟蛋白（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４）に比較して、成熟蛋白（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２）において、４個のアミノ酸置換になっている。
【０００４】
発明者等は、ＳＣ５及びp１４０の両者が、以下の同じ技術的特徴を共に有することを示す。
ＳＣ５及びp１４０は共に、悪性Ｔ細胞、とりわけ、悪性ＣＤ４＋Ｔ細胞の特徴である、細胞膜分化抗原である。
ＣＤ４＋ＣＴＣＬの何れの型が関与しているにしても、ＳＣ５またはp１４０をそれらの表面（通常、ＳＣ５及びp１４０の両者が発現される）に発現する、悪性のＣＤ４＋Ｔ細胞がある。ＳＣ５及びp１４０のいずれも、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ、特に、セザリー症候群（略語でＳＳ）、形質転換菌状息肉症（略語で形質転換ＭＦ）、リンパ腫症丘疹（略語でＬＰ）及びＣＤ３０＋リンパ腫の全範囲を実際にカバーする。
ＳＣ５またはp１４０のＣＤ４＋Ｔ細胞の表面での存在と、ＣＤ４＋ＣＴＣＬの存在の間には、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ診断が疑わしい体内部分（例えば、形質転換ＭＦが疑われる際の紅皮症の皮膚試料または、ＳＳのような進行性のＣＴＣＬ型が疑われる際の末梢血液試料）から採取したＣＤ４＋細胞表面のＳＣ５またはp１４０の存在の解析に基づき、この信頼性は９０％以上、より好ましくは９５%以上、最も好ましくは１００％である（これまで試験に供された患者については信頼性１００％である）という関連がある。事実、本発明によれば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞表面でのp１４０分子の存在が検知されるか、または、ＳＣ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率の値が、平均標準レベルより高く測定されれば（平均標準レベル１〜１５％、一般には５〜１０％の範囲内にある）、即、腫瘍であると決定される。
また、ＳＣ５またはp１４０のＣＤ４＋Ｔ細胞の表面での存在と、ＣＤ４＋ＣＴＣＬの存在の間には、ＣＤ４＋ＳＣ５＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋p１４０＋Ｔ細胞の両者の存在比率、−これはセザリー症候群（ＳＳ）が疑われる患者から採取された試料から測定されるが、−は本質的に、この患者の末梢血液に現実に存在する悪性のＳＳの存在比率に相当する（ＳＣ５＋ＣＤ４＋細胞は±１０％の範囲内、p１４０＋ＣＤ４＋細胞は±５％の範囲内）。だから、本発明におけるＳＣ５及びp１４０マーカーはＳＳの進行状況を評価できる共通の特別な特徴を共に有する。
【０００５】
発明者の知る限りでは、ＳＣ５及びp１４０分子は共通の技術的特徴を有する最初の分子である。本発明は、かくして、新規なＣＴＣＬに共通のマーカーを提供する。これより以前には、このようなＣＴＣＬに共通のマーカーは知られていない。これらに最も近似するこの種のものは、ＣＤ３０であって、このものの、悪性のＣＤ４＋Ｔ細胞の表面での存在は、患者がＣＤ３０＋リンパ腫に関連するＣＤ４＋ＣＴＣＬの特殊型を有していると結論付ける。それ故、ＣＤ３０はＣＴＣＬのマーカーであるが、その信頼性はＣＴＣＬの特殊型（ＣＤ３０＋リンパ腫）に限られる。そして、ＣＤ３０はＣＤ４＋ＣＴＣＬの全ての型をカバーしない。即ち、ＳＳ、形質転換型ＭＦまたはＬＰのようなＣＤ４＋ＣＴＣＬでは、表面でＣＤ３０を発現する悪性ＣＤ４＋Ｔ細胞は必ずしも存在しない。ＣＤ３０を使用したＣＴＣＬの診断及び治療は、このように、ＣＴＣＬの特殊型に限られる。それに対して、本発明のマーカーはＣＤ４＋ＣＴＣＬの全範囲を好適にカバーする。
【０００６】
p１４０と共有する技術的特徴に加えて、ＳＣ５は、更に、非増殖性のＴ細胞の増殖及び／または機能的活性（例えば、サイトカインプロフィール）の肯定的指標を有する。Ｔ細胞表面のＳＣ５の存在は、事実、正常（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）Ｔ細胞またはウイルス感染ＣＤ４＋Ｔ細胞のような非腫瘍性Ｔ細胞の活性状態に肯定的に関連する。ＳＣ５は、かくして、また、ＨＩＶ感染症、及び自己免疫性（例えば、脊椎関節炎のようなリューマチ性関節炎または乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎のような免疫関連性皮膚病）のようなＴ細胞ウイルス性感染症の診断及び治療のための新規手段として有効である。ＳＣ５は、また、グラフト宿主反応を調節するための有効な標的である。即ち、ＳＣ５の活性化は、エフェクター宿主細胞をグラフトに対して進展させる反応を阻害するために使用できる阻害性シグナルを伝達する。
【０００７】
本発明は、また、ＳＣ５新分子に結合できる産物を提供し、特に、ＳＣ５に対するモノクローナル抗体（抗ＳＣ５mＡbs）を提供する。また、Ｔ細胞、特に悪性ＣＴＣＬ細胞のような腫瘍性Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性の調節ができる抗ＳＣ５モノクローナル抗体を提供する。特に、ハイブリドーマＩ−２５７５で産性されたモノクローナル抗体は、Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性の阻害が可能で、特に有効な特徴によれば、悪性ＣＴＣＬ細胞（下記の例参照）のような悪性Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性の阻害が可能である。ＳＣ５に結合するが、これらを集合させない化合物は、ＳＣ５の阻害性シグナルの伝達を妨げるか、または、化合物がＳＣ５＋細胞（標的マスキング）に到着するのを妨げる。
【０００８】
本発明によれば、一般に、ＳＣ５またはp１４０に結合する化合物は、補体漸増剤、ＡＤＣＣ刺激剤、または、ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫を予防し、一時的緩和し、治療するための治療剤用ベクターとして使用される。
【０００９】
本発明はそれ故に、抗ＳＣ５及び／または抗p１４０モノクローナル抗体及び直接それらから製造された産物（例えば、ヒト化モノクローナル抗体またはＣＤ４−p１４０／ＳＣ５に対する二重特異性を有するモノクローナル抗体）の診断及び治療への使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
２０００年１０月３０日、寄託番号Ｉ−２５７５として、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.（Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.、国立微生物保存機関、パスツール研究所;２５、rue du Docteur Roux、F-７５７２４ Paris Cedex１５、France）に、ブダペスト条約に従がって、寄託されたハイブリドーマを提供し、ハイブリドーマ細胞の好適な代謝条件（例えば、３７℃で３日間、５％炭酸ガス含有湿潤雰囲気下、ＲＰＭＩ１６４０剤：Gibco BRL Cat.N0２１８７５-０３４；１０％牛胎児血清；ぺニシリン１００単位/ミリリットル；ストレプトマイシン１００μｇ/ミリリットルからなる好適な培養液に２．１０6個の細胞を含有したものを使用。）下、ハイブリドーマＩ−２５７５の培養を内容とする、抗ＳＣ５モノクローナル抗体の調製方法を提供する。
本発明は、それ故、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されるか、またはこの寄託されたハイブリドーマの培養上澄み液から得られるモノクローナル抗体（mＡb）を包含する。このmＡbは５種類の抗ＳＣ５ＩgＭである。これは不適当または好ましくないＴ細胞の増殖及び／または機能的活性（サイトカインプロフィール）、不適当または好ましくないＩＬ−２産生の診断及び治療のための有効な手段である。これは正常Ｔ細胞、ウイルス感染Ｔ細胞（例えば、ＨＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞）及び特に、悪性ＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性を阻害する。
【００１１】
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されるモノクローナル抗体は、発明者によってＳＣ５と命名された蛋白質を分離できる。ＳＣ５蛋白質は生化学的、機能的に新規な分子で、見かけ分子量が還元条件下で９６kＤである。これは多くのＰＢＬ細胞中及び細胞上に存在する。即ち、正常細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋部分集合）及び特にＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、正常ＮＫ細胞、Ｂ細胞、顆粒球及びマクロファージ（大食細胞）である。更に、ＳＣ５はＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）及びＣＨＯ−ＫＩ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９６１８）のような他の系統及び他の種の細胞の細胞質中にも存在する。
休眠中の正常ＰＢＬ細胞では、ＳＣ５は主として細胞内に存在する、しかし、ＣＤ３刺激はＳＣ５の細胞膜への移行を誘発する。殊に目立つのは、発明者によって、ＳＣ５が、悪性ＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞、特に悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞で、主として、細胞表面に観られることである（幾ばくかの生体外のＣＤ３刺激なしで）。
【００１２】
更に著しい特徴はＳＣ５の表面発現が、現在まで試験された全てのＣＴＣＬ患者に観られることである（下記例参照）。
本発明の他の更に著しい特徴は、ＳＣ５を共発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の比率が、健常者よりも、腫瘍性ＣＤ４＋Ｔ細胞をもつ患者の方が、統計的に高いことである。ＣＤ４＋ＣＴＣＬの患者におけるＳＣ５＋ＣＤ４＋の比率は、健常者において観察される比率（ＳＣ５＋ＣＤ４細胞の平均標準比率は１〜１５％の範囲内であり、一般には５〜１０％の範囲内である）より有意に高い。
特にセザリー症候群（ＳＳ）のＣＤ４＋ＣＴＣＬの場合、ＳＣ５を共発現するＣＤ４＋細胞の比率は、もっと、統計的に、ＣＴＣＬ患者のＰＢＬにおける悪性ＣＴＣＬ細胞の比率に密接に関連する。即ち、ＳＣ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率は本質的に悪性ＣＴＣＬ細胞の比率と同等である（この比率の±１０％以内）。ＳＣ５蛋白質は、それ故、細胞表面での経膜的な発現が、非腫瘍性Ｔ細胞の活性化及び／または増殖状態に関係があり（例えば、ＨＩＶ感染細胞及び正常ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のようなウイルス感染細胞）、非活性化Ｔ細胞の悪性化状態に関係がある新規分子である。著しい特徴は、ＣＤ４＋ＣＴＣＬが陽性との診断を９０％以上の信頼性で可能にすることである（実際、最新の試験を行ったヒトでは１００％）。
【００１３】
本発明の更に顕著な特徴は、ＳＣ５新分子が、細胞表面で発現されたとき、細胞増殖及び／または機能的活性のための阻害受容体として活動できることである。即ち、ＳＣ５の集合は、それを発現する細胞の増殖及び活性の減少を誘発する。例えば、ハイブリドーマＩ−２５７５により産生される、抗ＳＣ５モノクローナル抗体[５種類のＩg（免疫グロブリンの略語）]は、ヒトまたは動物から採取した、正常ＣＤ３＋Ｔ細胞、または正常ＣＤ３＋Ｔ細胞クローンのようなＳＣ５＋細胞の抗ＣＤ３誘発増殖を阻害し、また、抗ＣＤ３が誘発した、ＣＴＣＬ患者から採取したＣＴＣＬ細胞の試験管内増殖及び動物モデルでのヒトＣＴＣＬ細胞の生体内自然増殖を阻害する。このmＡbは、また、ＨＩＶ感染ＣＤ４＋細胞と結合し、それ故に、感染細胞を殺し、ＨＩＶの増殖を抑制させることを目的とする抗ＨＩＶ薬の実際的原理として有用である。
【００１４】
幾つかのＳＣ５蛋白質の分離可能な方法は、本発明のモノクローナル抗体を製造できる専門家にとって使用できるのものである。標準的な方法は、細胞溶解物からの還元下、親和性クロマトグラフまたは電気泳動による回収からなる。ハイブリドーマＩ−２５７５により産生するモノクローナル抗体が抗原と認識する全てのヒトまたは動物の細胞、あるいは該モノクローナル抗体と細胞溶解物が免疫沈殿反応する全てのヒトまたは動物の細胞は、ＳＣ５分子を分離するための細胞供給源として適当である。そのような細胞には、特に、Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球等の正常細胞（ヒトまたは動物または細胞クローン）を含む。また、悪性Ｔ細胞、例えば、ＣＴＣＬ患者から採取されたＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような腫瘍性細胞、またはＣＴＣＬクローンＨＵＴ７８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）のような腫瘍性クローンも好適な細胞である。好適な細胞源が広範囲なので、粗血球全体またはＰＢＬが何らかの精製を経ずに、直接使用されてもかまわないことが理解される。
【００１５】
正常細胞はＳＣ５の細胞内型及び経膜受容体型の両者を分離できる。ＳＣ５の受容体型またはその部分の分離が望まれるときは、ＳＣ５＋細胞源（例えば、それらの表面でＳＣ５を発現する細胞）を使うのが好ましい。そのような細胞源（ソース）としては、前記されたものであって、細胞表面でＳＣ５発現が増加するように、ＣＤ３刺激されたものが含まれる（下記ＣＤ３刺激法の例参照）。全血球またはＰＢＬがＳＣ５＋細胞の供給源として使用されるとき、全血球またはＰＢＬは、Ｔ細胞及び単核細胞を含有するから、ＣＤ３活性化はＰＨＡ（Wellcome社から入手可能）のような、ポリクローナル活性体の約１μg／ミリリットルと培養することにより誘発される。より均一な正常細胞集団がＳＣ５＋細胞（例えば、ＳＣ５＋のみとＮＫ細胞）の供給源に使用されるときは、ＣＤ３活性化は、好ましくは固定化抗ＣＤ３抗体との培養、または、可溶性抗ＣＤ３抗体及びＰＨＡのようなポリクローナル活性体との培養によって為される。培養段階は、選択的に、ＣＤ３活性化の前及び／または後に、細胞量を増加させるために行なってよい（培養条件は、例えば、ＲＰＭＩ中、１０％牛胎児血清、湿度９５％及び５％炭酸ガス雰囲気）。
ＳＣ５を細胞内型で分離したいときには、ＣＤ３刺激は省かなければならない。
ＣＴＣＬ細胞のような腫瘍性細胞、特に、悪性形質転換ＭＦまたはＳＳ細胞では、生体外ＣＤ３活性化を必要とせずに、受容体型のＳＣ５分子を分離することができる。即ち、ＣＴＣＬ細胞は既に経膜区域でＳＣ５を発現する。
【００１６】
故に、本発明は下記の段階によって得られる分離蛋白質を包含する。
（i）Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球からなる群から選択される細胞を採取する。採取した細胞を固定化抗ＣＤ３抗体、または、可溶性抗ＣＤ３抗体及びＰＨＡの１μg／ミリリットルで刺激するか、または、悪性ＣＤ＋ＣＴＣＬ細胞のような悪性ＣＴＣＬ細胞を採取するか、または、全血球細胞及び末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）からなる群から選択される細胞を採取し、採取した細胞をＰＨＡの約１μg／ミリリットルで刺激する。
(ii) 例えば、TritonX-１００の１%含有の強力な溶解バッファー中での培養によって、多種類のポリペプチド複合体を分離できる条件下に上記細胞を溶解する。
（iii）ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されるモノクローナル抗体が、このモノクローナル抗体が抗原抗体型（例えば、この抗体によって抗原と認められる化合物）の反応を行なうことができる条件下に、結合する蛋白質化合物を溶解物から回収する。
【００１７】
回収された蛋白質化合物のアミノ酸配列は、質量分析のような、なんらかの標準技術によって得ることができる。
上記で示されたように、段階（i）の細胞は活性化細胞であり、それ故に、経膜受容体のときに、ＳＣ５の分離ができる。段階（i）で使用されたＣＳ５のソースが休眠中のＴ細胞（生体外刺激を除く）からなっていれば、このようにして分離された蛋白質化合物はその脂肪質型ＳＣ５であろう。
段階（i）で選択される細胞が活性化された、または、悪性の細胞のときは、段階（ii）の溶解は、それ故に、細胞全体で行なわれるか、または、これらの細胞膜の小部分で行なわれる。
溶解段階自体はその休眠中の多数のポリペプチド複合体の分離技術によって行なわれ得る。例えば、細胞またはその膜小部分はTritonX-１００のような強力な界面活性剤１％含有溶解バッファー中で、１時間、４℃で培養される。これによって、休眠中の細胞成分からの、ＳＣ５蛋白質の分離が行なわれる。もし、ジギトニンの１％またはブリッヂ５８の１％のようなマイルドな界面活性剤が使用されれば、ＳＣ５は、それが自然に結合している、これらの化合物から分離されないであろう。上記段階（ii）でのマイルドな界面活性剤の使用は、だから、ＳＣ５の分離を可能にし、更に、ＳＣ５の形質導入、実施体の分離を可能にする。
故に、本発明は、前記プロセスで得られる化合物を包含する。
次いで、段階（ii）で得られた溶解物は、この抗体が、細胞溶解物含有（例えば、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生された２μgのモノクローナル抗体は、１０7個の溶解物に相当する）マイクロウエルに抗体をコートするような、抗原抗体型反応を行なうのに好適な条件下、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体とともに培養され、次いで、モノクローナル抗体は細胞溶解物とともに２時間、４℃で培養される。
【００１８】
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されるモノクローナル抗体が結合する化合物の回収段階（段階iii）はこの分野のエキスパートにとって熟知の技術で、行ない得る。非還元条件下の回収は、本来の形態のＳＣ５の分離が可能で、ＳＣ５の本来の生物学的特性の維持が望まれるときに行なうのが好ましい。
ＳＣ５蛋白質の非還元条件下での回収の好適な技術は、即ち、親和分離クロマトグラフィ（アフィニティークロマトグラフィー）を含む。好ましくは、濾過前に、濾過を容易にするために、溶解物中の化合物の構造を本質的、部分的に変えて、溶解物を生理学的pＨ、例えば、pＨ６〜８の間の、pＨ７のようなバッファーと混合して、溶解物をハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体（mＡb）が固定されているカラムにより濾過する(例えば、このmＡbを寒天粒に結合させ、この粒を前記カラム内に堆積させる)。カラムを前記生理学的pＨのバッファーで洗い、例えば、本来の化合物の構造を、本質的に変えることなく、mＡbへの化合物の結合をバッファーで攪乱して、溶出させ、固定されたmＡbに結合している化合物を回収する。この溶出バッファーは、通常、弱酸性のpＨ（通常、pＨ２〜５の、例えば、pＨ３）である。抗体分子の通常の方向性を有し、それにより、抗原を高い効率で結合させるマトリックスの調製のため、一段階の精製方法のため、膜蛋白質の分離のために、例えば、Schneider et al.１９８２（J.Biol Chem.２５７:１０７６６〜１０７６９）記載の内容が参考になる。このようにして回収された蛋白質化合物はその本来の構造のＳＣ５蛋白質である。
【００１９】
一方、段階（iii）では還元条件下、段階（ii）で得られた溶解物とハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体とで免疫沈降反応を行なうことができる。このようにして得られた免疫沈降は二十日鼠のＩgＭと結合できる抗体からなるカラムを通して濾過される。ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体に結合する蛋白質化合物は前記と同じ溶出法で回収される。このようにして得られた蛋白質化合物も、また、本来の構造の分離ＳＣ５蛋白質である。休眠中の標準的なＳＣ５蛋白質回収方法[段階（iii）]は、還元条件下の電気泳動法による処理である。これは、特に、四つのステップを包含する。
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体と段階（ii）で得られた溶解物を、このmＡbを抗原抗体型反応させることができる条件下に培養する。かくして、生成した免疫沈降物を採取し、免疫沈降物に含有する化合物を還元条件下に分離し、見掛け分子量９６kＤの蛋白質化合物を回収する。
一方、所望のＳＣ５蛋白質を電気泳動ゲルまたは膜に局在させる方法（続いて、それをゲルまたは膜から分離する）に続いて、溶解に先立ち、細胞の表面ポリペプチド成分をラベルする（例えば、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−biotinによる、１２５ヨードまたは蛍光ラベリング）、ラベリングステップが行なわれる。そして、免疫沈降物からラベルを帯びたこれら化合物を回収する。もし、ラベリングステップが溶解の後に行なわれれば、ＳＣ５の細胞内型及び経膜受容体型の両者が分離されることに注目しなければならぬ（この場合、前記のように、非活性化Ｔ細胞がＳＣ５源として使用され得る。）。変性条件が使用されるから、このようにして得られた蛋白質化合物は、本来の構造ではない。即ち、まだ、本来のアミノ酸配列ではあるが、本来の生物学的特性が失われている。しかし、本来の構造ではないＳＣ５蛋白質が観察され（調べられ）、試験される生物学的試料が変性条件下（例えば、皮膚サンプルのパラフィン薄片）に処理されたときに、本来の構造ではないＳＣ５蛋白質が観察される（調べられる）。本来の構造ではないＳＣ５蛋白質は、それ故、モノクローナル抗体の産生に直接使用され、このような、モノクローナル抗体は変性サンプルのＳＣ５検出に有用である。もし、本来の構造のＳＣ５蛋白質が所望されれば、変性蛋白質の少なくとも１０アミノ酸区分が配列され（例えば、質量分析で）、上記配列区分から理論的に導かれたオリゴヌクレオチッドが合成され、試験的に、ＳＣ５＋細胞から得られるcＤＮＡライブラリー（ＤＮＡコレクション）からのスクリーニングに使用される。このようにして選択されたcＤＮＡが、産生及び、好ましくは、クローン培養によるcＤＮＡコード化産物の排出が可能な条件下、産生され、クローン化される[例えば、ヴァキュロウイルスベクターヘのＳＣ５コード化cＤＮＡの挿入、昆虫細胞、例えば、Sf９細胞の形質転換により、または、ワクチンウイルス及びＥＢＶ細胞により、Rindis Bacher １９９５、J.biol. Chem. ２７０(２３):１４２２０〜１４２２８]。
【００２０】
故に、本発明はその配列が以下のようにして得られる分離蛋白質を包含する。
全血液細胞及び末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からなる群から選択される細胞を採取する。採取した細胞をＰＨＡの１μｇ／ミリリットルで刺激する。刺激された細胞をビオチンのようなポリペプチド特異性ラベルでラベリングする。ラベルされた細胞をTritonX-１００の１％含有溶解バッファー中で、培養して溶解する。溶解物をハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体で免疫沈降させる。免疫沈降物から、ラベリングされた蛋白質化合物を回収する。このようにして得られた蛋白質配列をコード化するcＤＮＡを合成する。昆虫細胞にこのcＤＮＡを、導入させる（transfection：transformationとinfectionの合成語、細胞へ外来ＤＮＡ断片を導入すること）。導入された細胞、例えば、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体で、産生された蛋白質を回収する。
または、以下のようにして得られる。
全血中細胞及び末梢血中リンパ球（ＰＢＬ）からなる群から選択される細胞を採取する。採取した細胞をＰＨＡの１μｇ／ミリリットルで刺激する。ラベリングされた細胞をTritonX-１００の１％含有溶解バッファー中で、培養して溶解する。溶解物をハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体で免疫沈降させる。免疫沈降物から、還元条件下、見掛け分子量９６kＤの蛋白質化合物を回収する。このようにして得られた蛋白質配列をコード化するcＤＮＡを合成する。昆虫細胞にこのcＤＮＡを導入させる。導入された細胞、例えば、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体で、産生された蛋白質を回収する。
【００２１】
本発明は前記プロセスによって得られる分離蛋白質化合物、同様に、その分離蛋白質化合物のアミノ酸配列、及び分離蛋白質の配列を包含する。
【００２２】
本発明の蛋白質化合物または蛋白質が配置される固体サポートが本発明の範囲内に含まれる。そのような固体サポートは特にセファロース粒を含む。
【００２３】
本発明は、また、その配列が本発明の分離蛋白質をコード化する分離ＤＮＡ（またはcＤＮＡ）を包含する。これは、また、ＤＮＡを導入することにより作り変えられた細胞、本発明の分離蛋白質を排出する、作り変えられた細胞及び前記作り変えられた細胞の培養液から分離された分離蛋白質に関する。
【００２４】
本発明は特に、以下の段階から得られるcＤＮＡを包含する。
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体が結合する細胞からなる細胞集団を採取し（例えば、それに対しては、このmＡbが抗原と認められる）、または、その溶解物がこのモノクローナル抗体と免疫沈降反応するような細胞で、例えば、全血中細胞及びＰＢＬからなる群から選択される細胞を採取する。
もし、ＳＣ５の単独の経膜型が所望されるときは、前記細胞集団が主として、非活性化細胞から構成されていれば（例えば、休眠中の非腫瘍性細胞）、ＳＣ５発現が細胞表面で増加するように、例えば、採取された細胞集団をＣＤ３活性化体（例えば、ＰＨＡのようなポリクローナル活性化体の１μg／ミリリットルを、採取された細胞集団がＰＢＬまたは全血液または固定化、抗ＣＤ３抗体またはＰＨＡのようなポリクロナール活性化体及び抗ＣＤ３抗体の両者であり、採取された細胞集団が、ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ４５ＲＯ＋細胞またはＮＫ細胞またはマクロファージまたは顆粒球から、主として、構成されている細胞集団のようにより均一であるときは、）と培養することによって、ＣＤ３経路を刺激する。
もし、採取された細胞集団が主として、活性化細胞（ＣＤ３活性化非腫瘍細胞）から構成されていれば（例えば、休眠中の非腫瘍性細胞、またはＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような腫瘍細胞）、そのときは、ＣＤ３刺激は、ＳＤ５の存在が、これら活性化細胞において、既に、主として、経膜的になっているため不要である。
もし、ＳＣ５の細胞内型及び経膜型の両者が所望されるときは、非活性化細胞が好まれ、ＣＤ３活性化は省略される。
前記細胞集団からのトータルmＲＮＡ集団の抽出及び精製（mＲＮＡの抽出及び精製に使用できる市販キットの例：polydT column）。
各相補的cＤＮＡの合成（逆転写酵素で、例えば、Seed B及びArrufo A １９８７、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８４:３３６５〜３３６９、に参考文献が収録されている。）。
このクローンのcＤＮＡの発現が可能になるように、好適なクローン培養条件で各cＤＮＡのクローン化を行い、各クローンを培養する。
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体が抗原抗体型反応を行なうのに好適な条件下に、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体が結合する化合物を発現するクローンを選択し、及び／または溶解物がハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体と免疫沈降反応を行なう化合物を発現するクローンが選択される。
このようにして選択されたクローンを選択的に増幅し、選択されたクローンから挿入されたcＤＮＡを回収する。
【００２５】
このようにして回収されたcＤＮＡは本発明におけるＳＣ５cＤＮＡであり、標準的なＤＮＡ配列技術により配列される。
このクローンのcＤＮＡの発現が、好適なクローン培養条件で、各クローン培養によって、可能になるように、各cＤＮＡのクローン化が、専門家にとって実施可能な、通常のクローン化法によって行なわれる。クローン化法の１例は、宿主細胞のcＤＮＡの発現のために好適なプロモーターの制御下に、トランスフェクション（遺伝子導入）ベクターに各cＤＮＡを挿入し、宿主細胞にトランスフェクション（遺伝子導入）ベクターを導入し、cＤＮＡを導入された宿主細胞を、それらの代謝に好適な条件で培養する。好適なトランスフェクションベクター及び宿主細胞はBaculoウイルスのようなウイルス及び昆虫細胞（Sf９細胞）のような宿主細胞またはベクターとして牛痘ウイルス、宿主細胞としてＥＶＢ細胞（Rindis Bacher reference supra 参照）。
このようなcＤＮＡは細胞への導入及びこのようにして得られたクローンからのＳＣ５の産生に使用される。これはまた、本来のＳＣ５mＲＮＡの同定及び分離の試験に使用される。
【００２６】
故に、本発明は、また、本発明におけるcＤＮＡに相補的の、前記mＲＮＡ集団から選択可能な分離mＲＮＡを包含する（例えば、前記cＤＮＡに下記の文献記載の厳密な条件下、ハイブリダイズするmＲＮＡの選択によって、Freemann G.J.etal.１９９２ J.Immunol.１４９:３７４５）。前記細胞集団の全mＲＮＡ集団からの回収する試みとして、本発明における分離cＤＮＡを使用して、得られる分離mＲＮＡを包含する。このmＲＮＡは抽出されるcＤＮＡに相補的である。一方、通常の技術の一つが、選択されたクローンから回収されるcＤＮＡを直接配列化し、この配列からmＲＮＡの配列を導き出す。
【００２７】
本発明は、また、本発明における分離されたmＲＮＡをコード化するＤＮＡを包含する。特に、ゲノムバンク（www.ucsc.edu.のような）の上記ＳＣ５cＤＮＡにマッチするゲノムＤＮＡの調査によって、得られるゲノムＤＮＡを包含する。
【００２８】
本発明は、また、本発明における、cＤＮＡ、mＲＮＡまたはＤＮＡが導入された工学的細胞を包含する。
【００２９】
本発明は、また、ＳＣ５特異性試料及びプライマーを包含する。そのような試料及びプライマーは専門家にとって、使用可能な技術によって得られる（例えば、候補配列として、ＳＣ５配列の特異な部分を選択し、これらＤＮＡ／ＲＮＡバンクの候補配列をＳＣ５以外の細胞受容体の配列と対比し、前記対比後、ＳＣ５配列が特異であると見なされる、及び／または、前記対比後、ＳＣ５配列の鎖長が特異であると見なされる候補配列を選択する）。
【００３０】
本発明の範囲内の発明には、cＤＮＡ、mＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを担持するいかなる固体支持体も含まれる。このような固体は特にＤＮＡチップまたはＤＮＡ微小球を含有する。
【００３１】
本発明は、また、本発明に記載される分離cＤＮＡ、mＲＮＡまたはＤＮＡによってコード化された分離蛋白質を含有する。
【００３２】
更に、休眠中の正常な細胞との対比で、ＣＴＣＬ細胞に固有である部分である限り、本発明は、本発明の蛋白質のあらゆる分離部分を含む。特に、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.に寄託番号Ｉ−２５７５として寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によって確認されている部分を包含する。また、前記部分が前記細胞によって発現され、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたmＡbによって接触されたとき、この部分が、正常細胞のＣＤ３誘発増殖の調節（阻害または刺激）を誘発でき、及び／または、ＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞の生体内増殖の調節を誘発でき、及び／または、正常Ｔ細胞または悪性Ｔ細胞のＩＬ−２（インターロイキン−２）産生の調節を誘発できる、ような形態の発明の蛋白質化合物の分離された部分を包含する。特に、この部分が、経膜部分で、悪性Ｔ細胞によって発現され、休眠中の非腫瘍性細胞によって、細胞質小球内で、発現される分子の一部であるような形態の発明の蛋白質化合物の分離された部分を包含する。本発明は、特に、本発明におけるＳＣ５蛋白質の酵素的開裂によって得られるポリペプチド断片のバンクに関与する。好ましい酵素は、Tyr、Phe、Trpレベルを開裂するセリンエンドペプチダーゼ（例えば、α−キモトリプシン）、グルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端での開裂を行なう酵素のような、蛋白質分解酵素から構成される。例えば、Shesberadaran and Payne １９８８、 Proc.Natl.Acad.USA ８５:１〜５参照、この内容はここでも、参考として組込まれている。ＳＣ５ポリペプチド断片のバンクは、質量分析のような特別な分析に使用される。このような分析は、ポリペプチドバンクを特徴によって分類するのに使用され、ＳＣ５の特徴であり、ＳＣ５の検出に使用されるポリペプチドのプロフィールを示す。本発明はこのような用法及びプロフィールを包含する。
本発明は、特に、本発明のＳＣ５蛋白質化合物の細胞外、経膜部及び内部細胞質部分を包含する。受容体分子の細胞外、経膜部及び内部細胞質部分の決定は好適な技術に従がって、専門家によって為され得る。これらは分子全体において、グリコシルサイト（細胞外部分）を含む領域、疎水性（経膜部分）領域及び親水性領域、（内部細胞質領域）の同定によって、同定され得る。そして、それらは開裂または合成によって分離され得る。
本発明の蛋白質化合物の細胞外部分を分離する一つの方法は、前記のように、蛋白質化合物全体を処理するもので、これに、分子全体から細胞外部分を開裂させるために酵素処理の段階を付加する。この開裂のための好適な酵素としては、前記のように、Ｖ８プロテアーゼまたはα−キモトリプシンが含まれる。
【００３３】
このように、本発明に包含されるポリペプチド化合物は以下のようにして得られる。
前記した、例えば、ＰＢＬまたは全血液細胞のようなＳＣ５細胞源を採取する。
もし、ポリペプチド化合物が細胞表面で自然に発現されるときの形態で、分離されることを望むときは、または、採取されたＳＣ５細胞源が、主として休眠中の正常細胞を構成するときは、例えば、適当なＣＤ３活性化体と共に培養して（例えば、ＳＣ５源が全血液細胞またはＰＢＬであるとき、ＰＨＡ１μｇ／ミリリットルによる培養)、ＣＤ３経路を刺激する。そして、例えば、ビオチン（全細胞表面のラベリング）のようなポリペプチド特異性ラベルで該細胞をラベリングする。
そして、マルチポリペプチド複合体を分離するために、ＳＣ５細胞源（例えば、ＰＢＬまたは全血液細胞）を、例えば、Triton X-１００のような強力界面活性剤の１％からなる溶解バッファー中での細胞培養により、溶解する（それによって、自然に結合したトランスデューサーとエフェクターからＳＣ５を分離回収する）。
該溶解物を酵素による消化してＳＣ５を部分に解裂させる。例えば、Ｖ８プロテアーゼまたはアルファ−キモトリプシンからなる群から選択される酵素である蛋白質分解酵素で該溶解物を培養する。そして、該溶解物を、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体と免疫沈降反応を行わせ、該免疫沈降物からラベルを帯びたポリペプチド化合物を回収する。
回収された化合物は、完全なＳＣ５細胞外部分または、完全なＳＣ５細胞外部分の一部であるＳＣ５部分であるか、または、そのようなＳＣ５細胞外部分を構成するものである。このようにして得られるポリペプチド化合物のセットがＳＣ５細胞外部分バンクを構成する。そのようなバンク及びその医療的使途、例えば、Ｔ関連疾病（例えば、質量分析による）の診断のための使用は本発明の範囲内にある。
この分野の通常の専門家は、その溶解及び酵素的消化を一段階で達成できることを知っている。
細胞全体のラベリングは、細胞外部分、または、細胞外部分の一部、または、その部分を構成するＳＣ５部分を同定するために、細胞溶解に先だって為される。
【００３４】
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分を構成する分離された化合物を包含する。
【００３５】
本発明の抗体（mＡb）は、この抗体が結合するＳＣ５エピトープの同定が可能である。通常の強制された突然変異誘発のような技術が好適である（例えば、Chang H.C.et al. １９８９、J.Exp.Med.１６９:２０７３〜２０８３、参照、この内容は本発明の明細書に参考として組み入れてある。）。
【００３６】
本発明の蛋白質及び本発明によるその部分、及び、特にその細胞外部分は、それらに対するモノクローナル抗体の産生を直接できるようにする。そのようなモノクローナル抗体の例はハイブリドーマＩ−２５７５で産生される。本発明のモノクローナル抗体はＳＣ５の検出、ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫の診断に有効であり、且つ、正常ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞；ＨＩＶ感染Ｔ細胞、ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫、の如き、ウイルス感染Ｔ細胞；のようなＴ細胞の好ましくなく、または不適当な増殖、及び／または活性、の調節体として有効である。
故に、本発明は以下の手段により得られるモノクローナル抗体を包含する。
（i）本発明の蛋白質または上記で既定したその部分に対して或動物に免疫性を与える。
（ii）この動物の脾臓細胞からハイブリドーマを産生し、これを培養してその培養上澄み液中にモノクローナル抗体を産生させる。
（iii）段階（i）の免疫源として使用される蛋白質または蛋白質部分に結合し得、且つ、下記のような特性からなる群から選択される少なくとも一種の特性を有する抗体の上澄み液中での存在を調べる（評価する）。
主として細胞質分画中で休眠中の非腫瘍性Ｔ細胞に結合し、且つ、主として細胞表面で悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞に結合する。
Ｔ細胞のＣＤ３活性化経路を調節する。
Ｔ細胞からのＩＬ−２産生を調節する。
Ｔ細胞のＣＤ３誘発増殖を調節する。
ＣＤ３誘発の、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞の試験管内増殖を調節する。
動物中、好ましくはヒト中の、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような、悪性Ｔ細胞増殖を調節する。
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体のような本発明のモノクローナル抗体との、本発明の蛋白質への結合または上記で規定したその部分ヘの結合についての競合、及び、特に、該蛋白質の細胞外部分との競合。
（iv）所望の抗体を産生するハイブリドーマの選択及びクローン化。
（v）上記クローンの上澄み液かの抗体の回収。
【００３７】
ハイブリドーマの産生は通常の技術で行なわれる。これは、前記動物からの脾臓の除去、脾臓細胞の懸濁液の調製、脾臓細胞を骨髄腫細胞と共に溶融プロモーターの存在下で溶融する過程、溶融細胞を別の容器で、非溶融細胞を生育させない培養液で希釈、培養する過程からなる。本発明は前記免疫化動物から採取される腹水をも包含する。
段階（iii）でＴ細胞及び悪性Ｔ細胞は標準法でヒトから採取される。一方のクローンはＣＤ４＋ＣＴＣＬＨＵＴ２８細胞系（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）などが使用され得る。ＣＤ４＋腫瘍の場合は、試料はＣＤ４＋腫瘍細胞を表示する体の部分から採取される（ＳＳにあたるＰＢＬ、形質転換ＭＦにあたる皮膚紅皮症、等）。前記諸特性は、この分野の通常の知識を使用して、専門家によって容易に評価され得る。段階（iii）で挙げられた諸特性の評価のための好適な実験条件の例は、以下の例で見出すことができる。この分野の通常の知識を有する者が、それらを特異な細胞または使用濃度に是正する。細胞増殖の調節は増殖の刺激及び阻害と異なる。ＣＴＣＬ細胞が使用されたとき、増殖阻害は治療用の本発明のmＡbは、診断または治療用であるか、またはその両方であるところの全ての抗ＳＣ５mＡbsである。例えば、蛋白質精製用担体、または、これらができる調節特性の行使用担体のような担体に、これらのmＡbの一種または複数種を固定することが所望される用途がある。本出願は本発明のmＡbが固定される担体を包含する。そのような担体には、特に、親和クロマトグラフのカラム用の好適なものが包含される（例えば、寒天粒）。
【００３８】
本出願は、また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、ＶH、ＶL、Ｆab、Ｆ(ab')２、ＣＤ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３から選択される本発明のmＡbの断片（抗ＳＣ５断片）を含む。本出願は、該断片を含むあらゆる化合物、すなわち、あらゆる抗体を含む。本出願は、特に、少なくとも、上記断片を含むヒト化抗体に関する。ヒト化抗体の産生技術は先行技術で広く述べられている（Farah et al.１９９８、Crit.Rev.Eucaryote Gene Exp.Vol.８ pp ３２１〜３４５、参照、この内容は参考として本明細書に組込まれている）。
それは、特に、化合物、及び特に、少なくとも、一つの、ここで規定された抗ＳＣ５断片及び、また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、ＶH、ＶL、Ｆab、Ｆ(ab')２、ＣＤ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３各断片からなる群から選択された少なくとも、一つの、抗ＣＤ４断片からなる、抗体及びヒト化（人体に適応させた）された抗体に関する（例えば、WO９４／１３８０４、多価、多特異性結合蛋白質及びその製造方法、発明者：Holliger et al.出願人：ケンブリッジ抗体技術有限会社及び医療調査協議会、参照；また、Merchant et al.ヒトの二特異性IgG、Nat.Biotechnol.１９９８ vol.１６ pp ６７７〜６８１、参照）。
【００３９】
先に示したように、本発明は通常の一般的発明構想で結びつく二つの分子、即ち、ＳＣ５及びp１４０を提供する。ＳＣ５は、新規分子で、既に、十分に述べた。p１４０分子は従来技術で、ＮＫ細胞のサブグループ及び健常者（非癌性）からのＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞によって発現される阻害受容体として述べられている。本発明は、p１４０が悪性Ｔ細胞、特に、ＣＴＣＬ細胞によって発現され、新規なp１４０対立遺伝子型（下記例３のクローン２４；ＳＥＱ IＤ Ｎo.１）を提供し、新規蛋白質（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２）をコード化する。この新規な対立遺伝子型のcＤＮＡ及びアミノ酸配列を以下に示す。
【００４０】
ＳＥＱＩＤ Ｎo.１
【００４１】
【００４２】
ＳＥＱＩＤ Ｎo.２
【００４３】
【００４４】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３
前記のp１４０対立遺伝子型（クローン１．１）のＤＮＡ及びアミノ酸配列を下記に示す。
【００４５】
【００４６】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４
【００４７】
【００４８】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１はＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３と５つの部分で異なる。
得られたＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２は先行技術で開示されたp１４０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４)と四個のアミノ酸置換の種類が異なる（その位置を太いアンダー系で目印する）。即ち、２０位のＱの代わりにＲが、９２位のＬの代わりにＶが、１０２位のＴの代わりにＰが、４０１位のＰの代わりにＬが示されている（図１１参照）。
この出願は、配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１及び／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３であるか、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１及び／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３から構成される化合物を包含する。また、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１に相補的であるmＲＮＡ及びＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２をコード化するゲノムＤＮＡを包含する。
【００４９】
好適なp１４０蛋白質産生技術はこの分野の専門家が使用し得るものである。この技術は培養液中でp１４０蛋白質が産生されるように加工された細胞の産生を特に含む。そのような技術の一例は、以下の過程よりなる。ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３をヴァキュロウイルスベクターに挿入し、このベクターで、Sf９細胞系のような昆虫細胞を移入し、培養液中の産生されたp１４０蛋白質を回収する（培養液を、例えば、セファデックスカラムのようなカラムで濾過、蛋白質化合物がその分子量の函数として、次いで、１４０kＤ溶出物の分離）。
生理学的条件下（生体内または生体内を偽装する試験管内の条件下）で、p１４０に結合可能な化合物については既に記載した。そして、好適な、この分野の専門家により、使用可能な技術により得ることができる。経膜受容体部分（例えば、前記細胞の二層リピッドの上層にあるＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２及び／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４部分の認識）で、細胞により発現されるとき、p１４０に結合する化合物、ここで言う、前記生理学的条件下、p１４０分子を抗原（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２及び／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４）として認め得る化合物、によって、為される。
そのようなp１４０に結合する化合物は、特に、ＨＬＡ−Ａ１１及びＨＬＡ−Ａ３分子（天然ＨＬＡ−Ａ１１リガンド）及び特に、Ｆc−ＨＬＡ−Ａ１１のような溶融蛋白質及びＦc−ＨＬＡ−Ａ３のような溶融蛋白質から構成される。
p１４０に結合する化合物は、また、p１４０抗血清から構成される（ウサギのような動物にp１４０に対する免疫性を与え、このようにして産生された抗血清を回収する。付加的な免疫精製段階は、抗血清中のp１４０の濃度を増加させるためのもので、例えば、p１４０カラムによる濾過による）。休眠中の、p１４０に結合する化合物は、例えば、ＡＺ１５８、Ｑ６６、Ｑ２４１のようなPende et al.１９９６ (J.Exp.Med.１８４:５０５〜５１８)に述べられている、p１４０ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４に対するモノクローナル抗体で構成される。そのような抗ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４mＡbsとしては、また、新規なＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２が抗原として認められている。
mＡb産生に使用可能な技術は、抗p１４０mＡbs産生にも好適である。そのような技術の一例は以下の段階からなる。
（i）或動物にp１４０に対する免疫性を与える。
（ii）この動物の脾臓細胞からハイブリドーマを産生し、これらの培養液上澄み中にモノクローナル抗体を産生するために、これらを培養する。
（iii）段階（i）で免疫源として使用されるp１４０分子に結合でき、休眠中の良性Ｔ細胞には、主として、その細胞質小球に結合でき、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞には、主として、その表面に結合する抗体の、上澄み液中における存在を評価する（測定する）。
（iv）所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローン化する。
（v）前記クローン上の上澄み液から抗体を回収する。
好ましいp１４０結合化合物は抗ＣＤ４実在物（例えば、二特異性mＡb）を構成する。
p１４０結合化合物はＣＴＣＬ細胞、特に、ＣＤ４＋ＣＴＣＬのような悪性Ｔ細胞の検出に有効である。かくして、これらはＣＤ４＋癌の検出に有効である。これらは、また、以下で述べるポリペプチド系ベクターとしても有効である。
【００５０】
休眠中の観点によれば、本発明では、抗ＳＣ５mＡbs及び本発明の抗ＳＣ５mＡb断片からなる群から選択される少なくとも一つの要素からなるポリペプチド系ベクターが提供される。このようなポリペプチド系ベクターは活性化されたＴ細胞に到達するか、またはその付近の活性、理論的、分子に有効である（例えば、炎症性疾病またはウイルス感染Ｔ細胞または悪性ＣＴＣＬ細胞及び特に、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞などにおいて、観られる活性化されたＴ細胞）。
また、それは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２及び／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４の細胞外部分に対するmＡbのようなp１４０結合化合物からなるポリペプチド系ベクターに関する。このようなポリペプチド系ベクターは分子送達、または悪性Ｔ細胞、特に、ＣＴＣＬ細胞及び、特に、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞付近に有効である。
分子は、特に、放射性元素または毒素のような細胞死またはアポトーシスを誘発することができる分子からなるＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞に送られて有効な働きをする。そのような分子は、また、カルボキシペプチダーゼのように、抗有糸分裂性のプロドラッグから活性な医薬へと形質転換させることが可能な酵素からなっている。そのような酵素を運ぶポリペプチド系ベクターは、その際、抗有糸分裂性のプロドラッグの組み合わせによって有効に使用される。本発明はそれ故、そのようなベクター及び抗有糸分裂性のプロドラッグからなる医薬品キットを包含する。
これら隣接する細胞から前記悪性Ｔ細胞への抗腫瘍効果を誘発する作用力によって、悪性Ｔ細胞の付近にある細胞の免疫機能を刺激することができる分子、特に、構成するＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞の近傍に送られて有効に働く分子がある。そのような分子の例は、特に、γインターフェロンのようなサイトカイン及びＩＬ−２（例えば、Xu et al.２０００,Cancer Research ６０:４４７５〜４４８４参照）のようなインターロイキンである。
本発明のポリペプチド系ベクターが、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のようなＣＤ４＋細胞を標的にしようとするときは、更に、抗ＣＤ４体を含むことが好ましい。
【００５１】
本発明は、また、前記ポリペプチド系ベクター、特に、前記ポリペプチド系ベクター含有薬剤で構成される医薬品組成物を包含する。そのような薬剤は不適当または好ましくないＴ細胞の増殖及び／または機能的活性（好ましくないＩＬ−２の産生を含む）の制御に有効である。それらは、特に、不適当な免疫活性、の予防、一時的緩和、軽減、または治療；及び、特に、ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫、及び、特に、ＣＤ４＋ＣＴＣＬの妨害及び阻害に有効である。不適当なＴ細胞の増殖及び／または機能的活性の予防、一時的緩和、軽減、または治療を目的とする、薬剤製造のためのこのようなベクターの使用、及び、ＣＴＣＬの増殖の妨害及び阻害は、本出願の一つの目的である。
【００５２】
ＳＣ５に生理学型条件下結合する化合物はＳＣ５の活性を刺激するためのＳＣ５リガンド作用物質として使用可能であり、このＳＣ５分子は細胞阻害受容体として関与する。そのような抗ＳＣ５化合物は、即ち、抗ＳＣ５抗血清、本発明の抗ＳＣ５mＡb、本発明のFab、F(ab')２断片、本発明の人体に適応するmＡbsからなる。ＣＤ４＋細胞が特別に関与するときは、前記抗ＳＣ５化合物は、更に、幸便に、抗ＣＤ４体を含有する。
抗ＳＣ５化合物は、特に、ＳＣ５＋細胞の不適当または好ましくないＴ細胞の増殖及び／または機能的活性の調節に有効である。これらは、Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはウイルス感染Ｔ細胞（例えば、ＨＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＣＬ細胞及び特にＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような悪性ＣＴＣＬ細胞の増殖の調節に有効である。これらはＴ細胞からのＩＬ−２の産生にも有効である。Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.に寄託番号Ｉ−２５７５で寄託されたハイブリドーマによって産生されたmＡbが使用されたとき（５種類のＩgＭ）、この調節は阻害の方に傾く。故に、ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫の阻害に特に好適である。この出願は活性成分として少なくとも一つの抗ＳＣ５化合物からなる薬剤を包含する。このような薬剤はＴリンパ腫、ＣＴＣＬ、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ）のようなＴ感染、自己免疫型の諸症（例えば、リュウマチ性関節炎、脊椎関節症、または、乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎のような皮膚免疫薬物療法性疾病）のような炎症性疾病の予防、一時的緩和、治療が可能である。このような薬剤は移植改善（移植拒絶反応の抑制）も意図され得る。
【００５３】
本発明は、補体漸増剤またはＡＤＣＣ活性化剤または刺激剤としての抗ＳＣ５化合物の使用を包含する。
前記で規定したp１４０結合化合物は、ＣＴＣＬ及び特にＣＤ４＋ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫の予防、一時的緩和、軽減、または治療において、補体漸増剤またはＡＤＣＣ刺激剤または活性化剤として使用され得る。故に、本発明は抗Ｔリンパ腫薬剤、抗ＣＴＣＬ薬剤、抗ＣＤ４＋ＣＴＣＬ薬剤の製造におけるp１４０結合化合物の使用及びその薬剤自体をも包含する。
【００５４】
本発明は開発段階でのＣＴＣＬ（段階化）の評価方法を提供する。即ち、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の患者の体の或一定区分内における比率（例えば、％）が測定できる。この方法によれば、本発明のＳＣ５蛋白質、本発明のＳＣ５部分（特に、細胞外部分）、及びp１４０分子からなる群から選択される一要素をその表面で発現するＣＤ４＋細胞の比率は、前記体内区分から採取された生物学的試料によって測定される。前記体内区分内の現実のＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の比率は、上記で測定された比率と本質的に同等とみなすことができる。それは、通常、この測定値の概略±１０％以内である。
【００５５】
本発明はＣＴＣＬの診断方法をも提供する。そこでは、本発明のＳＣ５蛋白質、本発明のＳＣ５部分（特に、細胞外部分）、及びp１４０分子からなる群から選択される一要素をその表面で発現するＴ細胞の比率は、患者から採取された生物学的試料によって測定され、ヒトの非ＣＴＣＬ（健常者が好ましい）の平均百分率と比較され、前記測定百分率が前記平均百分率より有意に高いとき、ＣＴＣＬ陽性と決定される。
このＣＴＣＬの診断方法は、特に、ＣＤ４＋であるＣＴＣＬに適用される。この場合、測定されたＴ細胞の百分率は、好ましくは、ＣＤ４＋の百分率である。ＳＣ５を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の平均標準比率は、一般に、１〜１５％であり、ヒトの場合で、通常、５〜１０％である。ＳＣ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の測定百分率が前記平均百分率より高いとき、ＣＤ４＋ＣＴＣＬが陽性との診断が結論される。
ＳＣ５蛋白質またはその部分が関与する限り、本発明の方法は一般に、前記体内区分内にあるＣＤ４＋活性化Ｔ細胞の比率が測定できる。これは移植が拒絶反応を誘発するかどうか、及び自己免疫型の諸症（例えば、脊椎間接症のようなリュウマチ性関節炎、乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎のような皮膚免疫薬物療法性疾病）のような炎症性疾病、の診断及び追跡調査の評価に有効である。前記生物学的試料は内部滑液状でもよい。これは、また、非ＣＴＣＬＴリンパ腫の診断及び監視にも有効である（例えば、ＣＤ４＋ＡＬＬまたはＣＤ４＋Ｔ−ＬＬ）。
【００５６】
本発明のＣＴＣＬの評価／診断方法は全ての種類のＣＤ４＋ＣＴＣＬ、特に、形質転換ＭＦ、ＳＳ、ＬＰ及びＣＤ３０＋リンパ腫に著しく有効である。前記生物学的試料は、例えば、紅皮症（例えば，形質転換ＭＦの疑いある）患者から採取した皮膚試料及び／またはＰＢＬまたは総合血液試料（形質転換ＭＦがより進行性のＳＳのような形に進展したかどうかを評価するために）であってもよい。
ＣＤ４＋細胞表面で検出された要素がＳＣ５化合物のときは、細胞学的観察（腫瘍状細胞学的調査）の（前駆的または将来的）段階は、９０％以上の確度で、現実のＣＤ４＋ＣＴＣＬであるとの決定が為されることが好ましい。p１４０がＣＤ４＋細胞表面で検出されたときは、追加の段階は不要であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面でのp１４０の検出という単純な事実が、直ちに、ＣＤ４＋ＣＴＣＬの陽性診断になる。
【００５７】
本発明は好適な要素、特に下記の各要素からなる群から選択される一要素によって実行され得る。即ち、本発明の抗ＳＣ５モノクローナル抗体、本発明のFab、Ｆ(ab')の２断片、本発明から導かれる人体適応mAb、本発明のＳＣ５細胞外バンク（前記で規定した）、ＳＣ５cＤＮＡ、mＲＮＡ、本発明のゲノムＤＮＡ、本発明で規定されるp１４０結合化合物、p１４０ＤＮＡ、ＳＥＱ ＩＤＮo．１またはＳＥＱ ＩＤＮo．３またはコード化ＳＥＱ ＩＤＮo．２またはＳＥＱ ＩＤＮo．４からなるＤＮＡ。
このような要素はＳＣ５またはp１４０細胞表面の発現の検出手段として使用される。前記検出手段はＳＣ５／p１４０＋ＣＤ４＋細胞を直接一段階で行なうための、抗ＣＤ４含有のものである。
cＤＮＡ／mＲＮＡ物質が検出手段として使用され、このとき、ＣＤ４＋細胞は、前記細胞に現実に存在するＳＣ５またはp１４０をハイブリッド化するmＲＮＡを検出するために、溶解されねばならぬ。このようなcＤＮＡ／mＲＮＡ検出手段は、ＤＮＡチップまたはＤＮＡ微小球のような固体担体上またはその中に施されるのが好ましい。
mＡb物質またはmＡbから導かれる物質は検出手段として使用され、これによって、ＳＣ５またはp１４０の表面発現が検出される。好適な抗体抗原技術は好適なものである。その例は特に流動細胞分析である。
【００５８】
本発明は、また、緩和、予防、軽減、特に、ＣＴＣＬ細胞、及び特に、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような、特に、悪性Ｔ細胞の増殖のような、好ましくないか、または、不適当なＴ細胞の活動の治療に有効な化合物の同定方法を包含する。この方法は、前記規定の、ＳＣ５蛋白質、ＳＣポリペプチド化合物、または、p１４０分子（ＳＥＱ ＩＤＮo．２及び／またはＳＥＱ ＩＤＮo．４のような）に結合できる化合物の検出からなることを特徴とする。このような化合物は、前記のように、ポリペプチド系ベクターとして使用される。付加的にＳＣ５化合物に結合するこれら化合物は、細胞表面にこれらＳＣ５分子を集合することができ、ＳＣ５の阻害機能を刺激できる。この同定法を実行する容易な方法は、蛋白質ＡセファロースＣＬ−４Ｂのような固体担体上に、ＳＣ５及び／またはp１４０分子を固定化処理する方法である。この方法を続行するための化合物の候補は、特に、ＳＣ５またはp１４０に対して、免疫性のある血清からなる。
【００５９】
本発明の例を図により説明するが、下記の特別な具体例が、本発明を限定するものではない。この分野の通常の知識を有する者が、二者択一的、試験的に、具体例を実施し、このような、この分野の通常の知識から導かれた具体例は本発明の範囲内にある。通常の知識を有する者は、各種の標準的免疫技術、各種の標準的分子生物学的技術が彼にとって、有効なものであることを評価する（例えば、抗体：実験手引、Ed Harlow、David lane、Cold Spring Harbor Laboratory １９８８;Maniatis １９８２ Molecular cloning:a laboratory manual、Cold Spring Harbor、New York、 Cold Spring Harbor Laboratory；Current protocols in Immunology protocols on CD−ROM、John Wiley、West Sussex、England;Immunological techniques made easy、edited by Olivier Cochet et al.、John Wiley、West Sussex、England；and the publication specifically referred to in the present application）。これら公知文献の内容は参考としてこの明細書に組み入れている。ここに、完全な明細が記載されている、実験における一つの特別な型のＣＤ４＋ＣＴＣＬは、この分野の専門家によって、休眠中の何らかのＣＤ４＋ＣＴＣＬ型に置き換えることができる。
【００６０】
これら実施例では、下記の図が参考のために掲げられている。
図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは健常者のＰＢＬsのＳＣ５分子の細胞膜発現を図解している。健常者のＰＢＭＣを抗ＳＣ５mＡb(腹水１／２００)で汚染させ、次いで、ＦＩＴＣ接合アイソタイプ特殊ヤギ抗マウスＩgＭ２次試薬及び、抗ＣＤ３（図１Ａ）、抗ＣＤ５６（図１Ｃ）及び抗ＣＤ４５ＲＯ（図１Ｂ）のようなＰＥ接合mＡbsの一種で汚染する。二重汚染されたリンパ球通過規制の細胞の比率は下部右象限に示される（図１Ａ：３．３；図１Ｂ：５．１；図１Ｃ：０．６）。この実験は研究１０ドナーの代表である。
【００６１】
図２はＰＢＬsの活性化の間、ＳＣ５分子の細胞膜発現を図解する。ＰＢＭＣは１μｇ／ミリリットルＰＨＡで刺激され、ＳＣ５及びＣＤ６９の発現のカイネチックスはＣＤ３＋細胞と並列に研究された。
図３はＰＢＬのＳＣ５分子の細胞内所在部を図解する。抗ＳＣ５、抗ＣＤ３５、mＡb鎖及び抗ＢＹ５５アイソタイプ適合mＡbが、健常ドナーの透過性及び非透過性の通過規制リンパ球の汚染に使用された。陰を施されたヒストグラムは不適切なコントロールmＡbに対する図示mＡbsから得られたラベリングを表す。
図４ではＳＣ５分子の生化学的分析結果を図解する。ＤＳ６Ｔ細胞クローンはビオチン及び１％Triton X-１００で、表面をラベルされ、溶解物は、抗ＳＣ５mＡbを使用して免疫沈降される。試料はＳＤＳ１０％ＰＡＧＥで還元条件下分析される。抗ＳＣ５mＡbは二種類の濃度、１／２００（レーン２）及び１／５００（レーン３）で使用される。ネガティブコントロールサンプルはヤギ抗マウスＩg単独（レーン１）及びアイソタイプ適合mＡb（レーン４）で免疫沈降させられる。分子量マーカー（kＤ）左に示されている。
【００６２】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄは、抗ＣＤ３誘発増殖及び正常Ｔリンパ球のサイトカイン分泌を、それらの細胞毒活性の影響なしに、抗ＳＣ５mＡbが調節する様子を図解する。即ち、
図５Ａ：ＰＢＬまたはＴ細胞クローンＬＳＯ及びＧＤＳ．３が固定化抗ＣＤ３mＡb（コートされたmＡb１μｇ／源）またはＩＬ−２（５０ＩＵ／ミリリットル）で、抗ＳＣ５mＡb（腹水の、１：２００最終希釈）またはアイソタイプ適合、不適切mＡbの存在で、刺激される。結果は、少なくとも、３通りの実験の代表及び３通りの平均cpm・ＳＤとして表している。
図５Ｂ：ＧＤＳ．３ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは抗ＳＣ５mＡbの異なる濃度の存在下、図示された濃度のプレコート抗ＣＤ３mＡbで刺激される。
図５Ｃ：抗ＳＣ５またはコントロールmＡbの存在下、抗ＣＤ３刺激ＰＢＬの上澄み中のＩＬ−２の分泌は、下記に挙げた物質の存在下、ＩＬ−２依存性Ｔ細胞クローンの増殖の測定によって評価される。上記物質は、（a）剤単独、（b）ＰＢＬ／抗ＣＤ３＋コントロールmＡb、（c）ＰＢＬ／抗ＣＤ３＋抗ＳＣ５mＡb の上澄み。データは３つの代表的実験からの３通りの平均値・ＳＤを表す。
図５Ｄ：細胞毒ＣＤ８＋細胞クローン（ＪＦ１）が、抗ＳＣ５mＡb（腹水の、１：２００最終希釈）またはアイソタイプ適合コントロールmＡbの存在で、Ｅ／Ｔ比が５／１での、ＦcyＲ＋ミューリン腫瘍細胞Ｐ８１５との共培養の前に、培養される。標的の細胞は、表示された抗ＣＤ３の最終濃度で前培養される。結果は３通りの源泉の平均値で示される。
【００６３】
図６Ａ、６ＢはＣＴＣＬ患者のＰＢＬのＳＣ５分子の細胞膜発現を図解する。
８人のセザリー症候群患者、３人の菌状息肉症患者及び８人の健常ドナーの血球の細胞が、ＣＤ４＋リンパ球によるＳＣ５分子の発現のための２色フルオレスッセンスで分析される。
図６Ａ：セザリー症候群患者のＰＢＬのＳＣ５及びＣＤ４分子の共発現を健常者と比較している。
図６Ｂ：ヒストグラムは示された３群におけるＳＣ５発現の平均値を示す。ＳＳ患者と休眠中の２群の間には統計的に有意に差があることが解る（Mann-Witny U test、p＜０.００１）。
図７Ａ、７Ｂ、７Ｃはセザリー症候群患者の悪性細胞の膜表面発現を図解する。
図７Ａ：循環ＴＣＲＶβ２２＋悪性Ｔ細胞クローンの存在で、ＳＳ患者のＰＢＭＣの二色蛍光分析。細胞は抗ＳＣ５mＡbで汚染させ、次いで、ＰＥ接合アイソトープ特殊ヤギ抗マウスＩgＭ及びＦＩＴＣ接合抗ＴＣＲＶβ２２mＡbによる。
図７Ｂ：弱くラベルした、抗ＳＣ５mＡb（陰を付したヒストグラム）ＴＣＲＶ竈２２陽性悪性細胞。
図７Ｃ：同じ患者の細胞を、ＰＥ接合抗ＣＤ６９mＡb及びＦＩＴＣ接合抗ＴＣＲＶβ２２mＡbによって汚染される。
【００６４】
図８は抗ＳＣ５mＡbによるＣＴＣＬ悪性細胞系の抗ＣＤ３誘発増殖の調節を図解する。Pno細胞系は、ＩＬ−７（１０nｇ／ミリリットル）、ＰＭＡ単独（２nｇ／ミリリットル）、固定化抗ＣＤ３mＡbまたはＰＭＡ／抗ＣＤ３mＡbの組み合わせによって刺激される。ＳＣ５mＡbまたはアイソタイプ不適当mＡb（腹水の、１：２００最終希釈）が培養の開始時に添加される。結果は４種の実験の代表及び３通りの源泉の平均cpm・ＳＤとして示される。
図９Ａ、９Ｂは、ＣＴＣＬ細胞系（図９Ａ）のp１４０／ＫＩＲ分子及び新鮮なリンパ球腫瘍（図９Ｂ）の検出を図解する。ダブル免疫汚染流動細胞分析は、Bagot et al.１９９８（Blood ９１：４３３１〜４３４１）及びPoszepczynska et al.２０００（Blood ９６：１０５６〜１０６３）の記載によって行なった。
図１０はp１４０分子の生化学的分析を図解する。即ち、健常者ドナーから導かれたＮＫクローンＡＭ６１（p１４０＋／p７０−）及びPno細胞系及びCou-Lがビオチンで表面をラベルされ、抗p１４０及び抗ＣＤ８mＡbsで免疫沈降される。試料はＮ−グリコシダーゼＦで処理（＋）または非処理（−）され、還元条件下、８％（左パネル）または１１％（右パネル）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。セファロース蛋白−Ａ単独はネガティブコントロールである。分子量マーカー（kＤ）は右に示される。
図１１は蛋白質でコードされたＫＩＲ３Ｄ cl.２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２）及びcl.１.１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４）のアミノ酸配列を示す。信号ペプチドに一致するアミノ酸は小文字で示し、一方、経膜通過領域は一致する配列にアンダー系を施した。一致配列と同じアミノ酸はドットで示した。
【実施例１】
【００６５】
ＳＣ５の分離、ＳＣ５の生化学的機能的特徴、抗ＳＣ５mＡbsの産生。
Ｔリンパ球免疫応答は抗原特異性クローンを拡大させるポジティブ信号及び抗原自体への過剰な刺激または応答を抑制するネガティブ信号を発する機能的な細胞表面分子によって制御される。休眠中のＴリンパ球の活性化は二つの同一の信号を必要とする。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与によって発される信号は、通常のＴ細胞で応答を発させるために、２番目のポジティブ信号を同伴しなければならぬ。ＣＤ２８はＴリンパ球活性化及びＩＬ−２合成を誘発し、細胞死を阻害するメジャー共刺激性受容体と見なされる。最近の研究はＣＤ３／ＴＣＲ刺激が、ＴＣＲ／ＣＤ３が集合し、且つ、ＤＩＧ結合性の信号導入分子となる、界面活性剤溶解性グリコリピッド強化膜フラクション（ＤＩＧ）またはラフトの再配布に導くことを明らかにしている。ＣＤ２８が、ＴＣＲ関与サイトヘのラフトの再配布を惹起することが発表されている。更に、一連の休眠中の分子は異なる時点で活動し、特別な部分集合に影響し、または明確な実施機能を振興するＴ細胞に同時刺激を与えることができる。Ｔリンパ球の応答のネガティブな規制はＣＤ１５２誘発信号またはＴＮＦ上科受容体メンバーを通しての細胞死に影響され得る。最近、ＮＫ部分集合及びＣＤ８＋リンパ球についての新しいタイプのネガティブな規制が報告された（Lan９９８、Annu.Rev.Immunol.１６:３５９〜３９３）。免疫グロブリン様（ＫＩＲs）またはＣ型レクチン構造はこれらの信号に応じて、ＣＴＬ活性の強化またはサイトカイン産生のような好ましくない実施体機能を阻害する。
さて、我々は、健常者の末梢血球の小集団を詳細に描写する新しい９６kＤ経膜受容体について述べる。抗ＳＣ５mＡbは主として、ＣＤ８及びＣＤ４小集団並びにＮＫ系統の細胞由来のＣＤ４５ＲＯ＋リンパ球を汚染する。我々は、ＳＣ５が、主として、休眠中のＴリンパ球の細胞内小球に局在し、細胞活性化後に、その表面膜発現が急速に増加することを発見した。ＳＣ５分子の関与が、抗ＣＤ３mＡbに誘発される、休眠中のＴリンパ球またはＴ細胞クローンの増殖を阻害した。それはこれら細胞のサイトカイン誘発増殖になんの効果も与えない。同時に、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンに左右されるエファクター細胞毒活性は抗ＳＣ５mＡbによって変更されない。更に、我々は、ＳＣ５＋ＣＤ４＋循環リンパ球の比率が、セザリー症候群（ＳＳ）患者においては、健常者の血中リンパ球に比較して、著しく増加していることを発見した。これは大切なことだが、我々は、セザリー細胞がＳＣ５分子を発現することを明確に示すことができる。更に、我々は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の細胞系におけるＳＣ５分子のライゲーションが、抗ＣＤ３mＡbにより誘発される悪性細胞増殖の強力な阻害をすることを発見した。このように、ＳＣ５分子の発現はＳＳ患者の循環、悪性ＣＤ４＋細胞の存在の検知に役立つことができる。更に、ライゲーションにネガティブ信号を送る細胞表面分子が一致することは病理学的Ｔ細胞の機構の解明の新手段となり、その阻害に使用される。
【００６６】
原料及び方法
抗ＳＣ５mＡの産生
ＳＣ５mＡは出版されているプロトコル（David et al.１９９０;J.Immunol.１４４:１〜６）を使用して、ＮＫ細胞系統Ytindiで６wk old Balb/c miceを免疫化して得られる。ハイブリドーマ上澄み液は、免疫化された細胞系及びPnoと称するＣＴＣＬ細胞系（Poszcepczynska et al.２０００;Blood ９６:１０５６〜１０６３）とともに、間接的免疫蛍光及び流動血球計で、選択的再活性のために濾過された。Pno細胞系が患者のＣＴＣＬ細胞から由来し、ＣＴＣＬ細胞はＣＤ３＋Ｖβ２２＋ＣＤ４＋ＣＤ８αα＋ＣＤ２５フェノタイプを有し、ＩＬ−７０及び抗ＣＤ３mＡbヘの応答として増殖する。ＣＴＣＬ細胞系はこのスクリーンニングに好適である。休眠中のＣＴＣＬ細胞系の例は、ＨＵＴ７８細胞系（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）を含む。反応性上澄み液は、更に、末梢血中リンパ球（ＰＢＬ）との再活性を試験される。ハイブリドーマ上澄み液は腫瘍性細胞系及びＰＢＬ小集団の両者との、その再活性について選別される。ハイブリドーマは二回クローン化され、クローン化ハイブリドーマはプリスタン投与Balb/c マウス（複数）腹水を産生させるために継代接種された。抗体アイソタイプはＩgＭと決定され、抗ＳＣ５mＡbと命名された。腹水はＰＢＳで透析され、限外濾過で滅菌され、更に、１／２００で最終希釈された。このハイブリドーマは２０００年１０月３０日、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.（Collection Nationale de Microorganismes パスツール研究所;２５、rue du Docteur Roux、F-７５７２４ Paris Cedex１５、France）にブダペスト条約（Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.寄託番号I-２５７５）に従がって寄託され、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.寄託番号はＩ−２５７５である。この実施例の抗ＳＣ５mＡbはハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたmＡbに起因する。
【００６７】
患者
インフォームド・コンセントの後、倫理委員会（CCPPRB、Hopital、Henri、Mondor、Creteil、France）の承認を受け、我々は１１人のＣＴＣＬ患者から血液試料を得た。８人の患者は、セザリー症候群に罹っており、１０〜８０％の循環ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−セザリー細胞を有し、３人の患者は形質転換菌状息肉症（ＭＦ）で、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−フェノタイプを有する伝播性皮膚腫瘍と診断されていた。患者全員がこれまで化学療法を受けていなかった。
【００６８】
細胞及び細胞系統
末梢血中モノクロナール細胞（ＰＢＭＣ）はFicoll-Isopaque の技法（Pharmacia、fine、Chemicals、Piscataway、NJ）で、密度勾配遠心分離で、分離される。ヒトＴ細胞クローンＧＤＳ.３（ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋ＣＤ８−）、ＤＳ６（ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋ＣＤ４−ＣＤ８−）、ＬＳＯ（ＣＤ３＋ＴＣＲ聿＋ＣＤ４−ＣＤ８−）及びＪＦ１（ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋ＣＤ４−ＣＤ８＋）がBensussan等、１９８４（J.Exp.Med.１５９:９４７〜９５２）及びYssel et al.１９８４(J.Immunol.Methods ７２:２１９)に記載されているが、これらを８日毎に、同種の放射線照射ＰＢＭＣと共に、下記からなる培養液に供給した。
ＲＰＭＩ１６４０（GIBCO、Paisley、UK）、２mmol／l Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００U/ミリリットル）、ストレプトマイシン（１００mg/ミリリットル）、１０%熱非活性化ヒト血清、５０ＩＵ／ミリリットル組替えインターロイキン−２（γIL-２、Sanofi、Synthelabo、Labege、France）、及び１μg／ミリリットル植物性赤血球凝集素（ＰＨＡ）（Wellcome、Beckenham、UK）。機能的研究は供給７日後に行なわれた。標準的なヒト白血病（患者の）細胞系はマイコプラズマ・フリーで、完全なＲＰＭＩ剤に１０％子牛血清（ＦＣＳ）及び抗体を補強した培養液中で対数函数的な生育カーブを保持した。ヒトＣＴＣＬ細胞クローンPnoは、セザリー患者の末梢血液から得て、これを前記のように培養、保持した（Poszcepczynska et al.２０００;supra参照）。Pno細胞系はＣＤ３＋Ｖβ２２＋ＣＤ４＋ＣＤ８αα＋ＣＤ２５−フェノタイプを有し、ＩＬ−７及び抗ＣＤ３mＡb刺激に応答して増殖する。休眠中のＣＴＣＬ細胞系はＨＵＴ７８細胞である（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）。
【００６９】
モノクローナル抗体及び流動細胞計数の研究
間接的免疫蛍光物汚染ハイブリドーマ上澄み液または腹水液とともに、カルタグ研究所（カリフォルニア州、サンフランシスコ）調製のＦＩＴＣ接合ヤギ抗マウスＩgＭを使用して行なわれた。２色分析には、免疫蛍光汚染が、抗ＳＣ５mＡbと３×１０5個の細胞が、３０分、４℃の培養によって行なわれた。次いで、細胞は洗浄され、ＦＩＴＣ接合ヤギ抗マウスＩgＭ（カルタグ研究所）とともに培養、次いで、ＩgＧアイソタイプのＰＥ−、ＥＣＤ−、ＴＲＩ−接合、特殊mＡbで培養された。汚染細胞の分析はアルゴン単独流動細胞分析計（Epics XL、Bekman-Coulter、Miami、FL）を使用して、(Schiavon V et al.１９９９;Tissue Antigens ５３:２３〜３２)に記載のようにして行なった。細胞内ラベリングには、細胞をＰＢＳ４％含有パラフォルムアルデヒド中で４℃、２０分固定した。次いで洗浄、それから、０．１％サポニン含有汚染緩衝液とともに透過させた。接合抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４５ＲＯ、抗ＣＤ６９及び抗ＴＣＲＶβ２２mＡbsはインミュノテク（Immunotech、Marseille、France）から購入した。
休眠中のmＡbsはBeckman Coulterから入手可能である。即ち、下記のカタログ番号参照抗。
ＣＤ３（ＰＥ）は、細胞分析２０００カタログのＩＭ１２８２、精製抗ＣＤ３は細胞分析２０００カタログのＩＭ０１７８、抗ＣＤ４は細胞分析２０００カタログのＩＭ０４４９、抗ＣＤ８は細胞分析２０００カタログのＩＭ０４５２、抗ＣＤ４５ＲＯは細胞分析２０００カタログのＩＭ１３０７、抗ＣＤ６９は細胞分析２０００カタログのＩＭ１９４３、抗ＣＤ９４は細胞分析２０００カタログのＩＭ２２７６、抗ＣＤ１５８aは細胞分析２０００カタログのＩＭ２２７７、抗ＣＤ１５８bは細胞分析２０００カタログのＩＭ２２７８、抗ＮＫＧ２aは細胞分析２０００カタログのＩＭ３２９１、抗ＢＹ５５は細胞分析２０００カタログのＩＭ２７４５。
【００７０】
ビオチンラベル表面分子の免疫沈降
２×１０7個の細胞が、ＰＢＳ中で２回洗浄され、Sulfo-NHS-LCビオチン（Pier Europe、Interchim、Montlucon、France）（PBS中２mg/ミリリットル）で、２０分、４℃で、表面をラベルされた。ＲＰＭＩ１６４０で２０分間、急冷した後、細胞はＰＢＳで２回洗浄、下記の組成の溶解緩衝液中に１時間、４℃で、再懸濁された。
溶解緩衝液組成：（２０mM Tris-HCl pH ７.５、１５０ mM 塩化ナトリウム、１％ TritonX-１００、１mMナトリウムヴァナデイト、１０mM ＮaＦ、１mM PMSF、１μg/ミリリットルアプロチニン及び１μg/ミリリットルロイペプチン）。それから、ポスト細胞核上澄みが、２時間、４℃で、９６-wellプレート（Maxisorp Nunc immuno-plate）で、ヤギ抗マウスＩgＧ＋ＩgＭ（カルタグ研究所）で予備コートされ、次いで、抗ＳＣ５mＡbまたは抗ＴＣＲβ（抗ＴＣＲβＣ３０５アイソタイプに適合するmＡb、細胞分析２０００カタログのＩＭ１４６６参照；抗ＴＣＲＶβ２２、細胞分析２０００カタログのＩＭ２０５１参照；抗ＴＣＲゼータ、細胞分析２０００カタログのＩＭ３１６９参照；全てはBeckman Coulterから入手可能。）で予備コートされた。免疫沈降物は洗浄用緩衝液（２０mM Tris-HCl pH ７.５、１５０ mM 塩化ナトリウム、０.１％ TritonX-１００、１mMナトリウムヴァナデイト、１０mM ＮaＦ、１mM PMSF）で４回洗浄し、沈降蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用する。ウエスタンブロット分析はストレプトアビジン−パーオキシダーゼ（インミュノテク）とＥＣＬ検出システムをメーカーの推薦（Amersham Pharmacia、Orsay、France）に従がって使用して行なった。
【００７１】
増殖アッセイ
リンパ球活性化のために、ＰＢＭＣを、１μg/ミリリットルＰＨＡ（Wellcome、Beckenham、UK）添加の、１５％ヒト血清含有培養媒体で培養した。増殖アッセイには、５×１０4個の細胞は３通りの９６源泉丸底培養皿（Greiner、Nuertingen、Germany）で、最終容量０．２ミリリットルの培養媒体で行なった。必要なら、培養皿を前記濃度（Poszcepczynska et al.２０００;supra参照）の抗ＣＤ３mＡbで予備コートする。
ＣＴＣＬ細胞系Pnoの刺激のため、予備コートされた抗ＣＤ３mＡbが２ng/ミリリットルホルボール１２β−ミリステート１３α−アセテート（ＰＭＡ、シグマバイオケミカルス）との組合わせで使用される。細胞は４日間培養し、培養の終期の８〜１６時間の間に3Ｈ[ＴdＲ]の１μＣiを適用した。3Ｈ[ＴdＲ]の適用量は液状シンチレーションカウンター（Topcount;Packard Instrument Co,Meriden、CT）で計測した。ＩＬ−２産生量の定量では、１０5ＰＢＬが固定化抗ＣＤ３mＡbで、抗ＳＣ５またはコントロールmＡbの存在下刺激される。培養の３２時間後、ＩＬ−２依存Ｔ細胞クローンから１００μリットルの上澄み液が１０5個の細胞に加えられた。
【００７２】
ＣＤ３誘発・転送・細胞毒アッセイ
転送・細胞毒アッセイは、Le Cleach et al.２０００、Clin.Exp.Immunol.１１９：２２５〜２３０に記載されたように実施した。標的の二十日鼠肥満腫瘍のＰ８１５腫瘍細胞に１００μｌの51Ｃr(２５mCi/ミリリットル)を３７℃、９０分付加し、洗浄、次いで抗ＣＤ３mＡbで、１５分間室温で培養した。エフェクター細胞は抗ＳＣ５mＡb（腹水の最終希釈１：２００）で前培養し、次いで、標的細胞に５：１の比で、添加し、最終容積１５０μｌで、９６源泉Ｖ字型底マイクロ滴定皿で、４時間培養した。遠心分離後、１００μｌ部分標本を51Ｃrの放出量を定量するために、γカウンターで計測した。自発的放出は常に最高値の２０％減であった（１％ＮＰ４０で標的細胞）。特異的51Ｃrの放出量比率はDavid et al.１９８７、J.Immunol.１３８:２８３１〜２８３６に記載のようにして計算した。
【００７３】
統計的分析
この結果の統計的分析は、スタティスティカソフトウエア５．０（StatSoft、Los Angeles、CA）によって行なった。患者とコントロールグループのＳＣ５発現の間の大きな相違は、Mann-Whitney Uテストで評価され、ＳＣ５＋ＣＤ４＋細胞の比率及び患者の末梢血中の悪性細胞の比率の間の関係は、Spearman Rank Order Correlations testによって評価された。
【００７４】
成果
ここに提出する成果はＣＴＣＬ細胞系Pno及び患者から採取されたＣＴＣＬ細胞によって得られたものである。例えば、ＨＵＴ７８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）のような、どのＣＴＣＬ細胞でも同等の実験が行なわれ、同等の成果が得られた。
【００７５】
正常で、休眠中且つ、活性化末梢血リンパ球内のＳＣ５分子の発現。
機能的腫瘍細胞系Pno Ytindiに対して、高められたモノクローナル抗体は、ＣＴＣＬ細胞系Pno（Poszcepczynska et al.２０００、supra参照）及び末梢血中のＴ細胞について、同時反応性が分析された。IgMアイソタイプのＳＣ５特異性mAbは免疫化とＣＴＣＬ細胞系の両者を汚染した。末梢血リンパ球中、抗ＳＣ５mAbは、小集団（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ参照）の輪郭を描いた。抗ＳＣ５mAb反応性分子は、２０％を超えない（平均１０．５％、ＳＤ±５．６）ＣＤ３＋Ｔ細胞の可変比率によって発現される。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球の両者は、抗ＳＣ５mAbで汚染される。個人間の差異（平均１９．４％、ＳＤ±１１．４；表１参照）がより重要ではあるが、末梢血中ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の小集団も、また、抗ＳＣ５mAbで反応する。
【００７６】
末梢血リンパ球小集団におけるＳＣ５の発現。
【００７７】
【表１】
【００７８】
正常ドナー（提供者）のＰＢＬのゲイトリンパ球における、ＳＣ５の、ＣＤ３またはＣＤ５６との、共発現の代表例が図１、１Ａに示される。大部分のＳＣ５が図１、１Ｂに示されるように、活性化／記憶−プールに属することに注意すべきである。ＳＣ５陽性細胞の７０％以上が共発現ＣＤ４５ＲＯである。
試験された全ＩＬ−２依存性Ｔリンパ球クローンでＳＣ５分子の発現が検出されたので、我々はＴリンパ球活性化の間に、表面発現が誘発されたか、どうかを、立証した。我々は、ＰＢＬのＰＨＡによる刺激がＣＤ３＋リンパ球におけるＳＣ５の発現を増加させたことを見出した。ＳＣ%＋Ｔ細胞の比率及びＳＣ５発現のレベル、の両者が、刺激の後に急速に増加する（図２参照）。ＰＨＡの刺激後４時間で、ＳＣ５＋ＣＤ３＋細胞の比率が２倍から３倍に増加し、２４〜４８時間後に最高値に達した。５〜７日の試験管内の刺激の過程で、ＳＣ５発現は基本レベルに戻った。これと並行して、我々はＣＤ６９抗原の活性化の最初の発現を研究し、ＣＤ３＋リンパ球におけるＣＤ６９及びＳＣ５の類似した速動性的プロフィールを観察した。ＣＤ６９分子と異なり、低レベルＳＣ５が既に、刺激前に循環ＰＢＬに存在することに注目すべきである（図２）。
活性化誘導抗原発現はデ・ノボ蛋白質合成または細胞内先在分子の細胞表面排出の何れかの帰結をとる。それ故に、我々は、非活性化透過性ＰＢＬにおけるＳＣ５発現を研究した。図３に示すように、抗ＳＣ５mAbは、非透過性細胞の１６％に対して、透過性リンパ球の９０％以上を汚染する。抗ＳＣ５mAb汚染の特異性が、循環リンパ球の小集団によって発現される、ＧＰＩ固定細胞表面構造を検出する、アイソタイプ適合mAbＢＹ５５を使用して、確認される（Agrawal et al.１９９９、J.Immunol.１６２:１２２３〜１２２６参照）。ＢＹ５５＋細胞の比率は、透過性及び非透過性リンパ球において見出される。細胞内抗原決定基の検出のための陽性コントロールとして、我々は透過性Ｔリンパ球のみをラベルする抗ＣＤ３ζ鎖mAbを使用した。このようにして、ＳＣ５の表面発現は、細胞の活性化状態によってダイナミックに規制され、且つ、Ｔ細胞活性化の間の、その誘発は細胞内プールから表面膜への分子の輸送を振興することになる。
【００７９】
ＳＣ５抗原の生化学的特徴
抗ＳＣ５mAb、ＩＬ−２依存性ＴＣＲγδ＋クローン、ＤＳ６と呼ばれるものによって同定される構造の分子量を特徴付けるために、表面がビオチンによってラベルされ、細胞溶解物が抗ＳＣ５mAbまたはアイソタイプ適合抗ＴＣＲβmAb（陰性コントロールとして）の何れかで、免疫沈降される。抗ＳＣ５mAb還元条件下、見掛け分子量９６kＤで単一分子を確認する。腫瘍細胞系（免疫化Ytindi細胞）が、たびたび、炭水化物抗原決定基（２０、２２）の異常型発現によって、特徴付けられるので、我々は、ニュウラミニダーゼまたは過沃素酸ナトリウムを、公知のシアル化抗原決定基を分解するような濃度で、処理した後の、抗ＳＣ５mAbの、ＳＣ５＋ＮＫ細胞系ＮＫ３．３及びＣＴＣＬ細胞系ＨＵＴ７８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）との反応性を研究した。ＳＣ５の発現は、ニュウラミニダーゼまたは過沃素酸ナトリウムの処理によっては影響されない。このようにして、我々は、抗原決定基の炭水化物の可能性を除外した。
【００８０】
抗ＣＤ３mA誘発Ｔリンパ球の抗ＳＣ５mAbによる増殖の阻害。
正常細胞のＳＣ５分子の可能な機能を調べるために、我々は、抗ＳＣ５mAb単独の効果を、または、固定化、抗ＣＤ３mAbで誘発された、増殖応答の期間にこれを研究した。我々は抗ＳＣ５mAb単独またはＰＭＡとの組み合わせが、末梢血中Ｔリンパ球の増殖を誘発しないことを見出した。興味あることに、溶解性の抗ＳＣ５mAbが固定化抗ＣＤ３mAbと共存しているときは、リンパ球の増殖の著しい阻害が観察された。阻害は、ドナーによっては、アイソタイプ適合の不適切なコントロールmAbの効果に比較して、３３〜６６％の間で変化した（図５Ａ上部参照）。ＳＣ５分子が単球で発現されるので、阻害効果が単球依存性であるかどうかを決めるのに重要であった。我々は、二つのＴ細胞クローン、即ち、抗ＳＣ５mAbまたはアイソタイプコントロールmAbの存在で、抗ＣＤ３mAbによって、刺激される、ＧＤＳ３及びＬＳＯの増殖を研究した。二つのＴ細胞クローンから得られた結果は、ＳＣ５分子の結合は、抗ＣＤ３mAbヘの増殖を阻害する結果となることを示した（図５Ａ下部参照）。抗ＳＣ５mAbのＴ細胞増殖の阻害効果はその濃度及び拮抗的、抗ＣＤ３mAbの濃度に依存したことに注目すべきである。抗ＳＣ５mAbで得られた阻害は、Ｔ細胞が普通に希釈された抗ＣＤ３mAbで刺激されたときにのみ、著しいものだった（図５Ｂ参照）。このような阻害挙動は抗ＫＩＲs mAbsについても報告されている（Cambiaggi et al.１９９９、Blood ９４：２３９６〜２４０２）。
【００８１】
ＳＣ５の結合に続くＴ細胞増殖の低下は、細胞死、ＩＬ−２Ｒ発現の摂動またはサイトカイン合成の阻害に起因し得る。我々は、抗ＳＣ５mAbがＰＢＬまたはＴ細胞クローンのＩＬ−２依存性増殖の阻害をしないことを見出した（図５Ａ）。更に、抗ＳＣ５mAb（希釈腹水１／２００）と抗ＣＤ３mAbとの組み合わせによって４８時間前培養した、Ｔ細胞へのγＩＬ−２の添加はこれらの増殖を復興させる。特異性のmAbがＩＬ−２Ｒ発現の阻害をしたり、細胞死の原因になったりすることはあり得ない。終わりに、ＳＣ５がサイトカイン産生の阻害の原因になることを解決するために、我々は、ＩＬ−２依存性Ｔ細胞系を使用して、抗ＳＣ５mAbの存在下または不存在下で、ＣＤ３活性化ＰＢＬにより排出されるＩＬ−２の量を比較した。抗ＳＣ５mAbの存在下で産生されたＩＬ−２の品質は、アイソタイプ適合抗体で得られるコントロール値の４０〜６５％で表される（図５Ｃ参照）。このようにして、ＳＣ５及びＣＤ３分子の同時結合はサイトカイン産生を減少させる。
次に我々は、FcgR＋二十日鼠細胞系Ｐ８１５に対するキラーアッセイに書き換えられた、抗ＣＤ３mAbを使用して、Ｔ細胞エフェクター細胞毒活性への抗ＳＣ５mAbの効果について研究した。図５ＤはＥ／Ｔ比５／１で、細胞毒のＴ細胞クローンによって行なった代表的実験を示す。大量のＳＣ５分子を発現する、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＪＦ１は抗ＣＤ３mAb刺激に続いて、二十日鼠標的細胞を殺すために誘発された。その特異的mAbによる、ＳＣ５の同時標的化は、Ｅ／Ｔ比または抗ＣＤ３mAbを刺激する濃度に関係なく、ＪＦ１細胞毒活性に影響しない。
【００８２】
セザリー症候群患者から採取した悪性リンパ球におけるＳＣ５分子の発現。
我々は、最初に、ＣＴＣＬ細胞系との反応性について、抗ＳＣ５mAbのスクリーニングを行なったので、更に、８人のセザリー症候群患者から採取した、末梢血中リンパ球のＳＣ５分子の発現を研究した。二色細胞流量計分析が、ＳＣ５発現がＣＤ４＋小集団で非常に増加したことを示した（図６Ａの一患者から得られた代表的結果参照）。平均で、ＳＳ患者の血液中のＣＤ４＋リンパ球の３５．５％ＳＣ５を発現し、健常なコントロール（p＞０.００１）の９．４％に比較される（図６Ｂ）。８人のＳＳ患者についての研究で、ＣＤ４＋細胞のＳＣ５発現が細胞生態学（r=０.９１、p=０.００１２）によって検出される循環、悪性細胞の比率と関連があることが解った。これらの患者の、トータルＣＤ４＋細胞の比率（平均８８％、ＳＤ±８．８）はセザリー患者の細胞の比率（平均２６％、ＳＤ±１２．８）より高いことに注目すべきである。
我々は、３人の、血液に関連しない、ＭＦ患者の末梢血液試料における、ＳＣ５分子の発現をも研究した。末梢血中ＣＤ４＋細胞におけるＳＣ５発現のレベルでは、ＭＦ患者と健常ドナーの間に大きな差異はなかった（図６Ｂ参照）。増加するＳＣ５＋ＣＤ４＋の比率は、我々が試験できた、これら二人の患者の皮膚試料から検出された（それぞれ、２６％、１９％）。
一人のＳＳ患者では、我々は、予め、循環悪性、細胞が、ＣＤ４＋ＴＣＲＶβ２２＋フェノタイプ（Poszcepczynska et al.２０００ supra参照）のクロナールリンパ球であることを示した。ここで我々は、ＳＣ５が、例えば、悪性細胞集団によって、ＴＣＲＶβ２２＋細胞で共発現されることを示した（図７Ａ）。ＴＣＲＶβ２２＋細胞に結合するＳＣ５mAbのプロフィールが、全ての、悪性、クローン集団における弱い均一な発現に該当することは注目すべきである（図７）。興味あるのは、悪性ＴＣＲＶβ２２＋細胞は前記のように（Poszcepczynska et al.２０００ supra参照）、共通の活性化マーカーとしてのＣＤ６９（図７Ｃ）、ＣＤ２５またはＣＤ３０を共発現しないことである。このように、増加した、ＳＳＰＢＬにおけるＳＣ５のレベルは殆ど、循環、悪性、Ｔ細胞における抗原の発現に起因する。
【００８３】
抗ＳＣ５mAbによる抗ＣＤ３mAb誘発ＣＴＣＬ細胞系の増殖の阻害
次に、我々はＳＣ５分子が悪性ＣＴＣＬ細胞におけるネガティブ信号を提供できるか否かを調べた。我々は、ＩＬ−７の存在下、著しく増殖する長期間培養Pno CTCL腫瘍Ｔ細胞系を使用した。先に報告したように、固定化、抗ＣＤ３mAbまたは溶解性抗ＣＤ３mAbs及びＰＭＡの組み合わせはこれらの増殖を著しく誘発するから、（Poszcepczynska et al.２０００ supra参照）、Pno細胞系は機能的Ｔ細胞受容体を発現する。我々はPno細胞の増殖でのＳＣ５分子の結合効果を調べた。図８は、抗ＳＣ５mAbが、ＣＴＣＬ細胞系の抗ＣＤ３mAb誘発増殖を強力に阻害することを示す。対照的に、ＰＭＡ単独（２ng/ミリリットル）では、抗ＳＣ５によっては、それほど影響されない低レベルの増殖を為す。抗ＳＣ５mAbの存在下、ＩＬ−７で培養したPno細胞はアイソタイプコントロールmAbの存在下と同じ強さで、増殖したので、抗ＳＣ５mAbはＩＬ−７依存性増殖に何ら影響を与えない。
かくして、我々は、ＳＣ５抗原がＣＴＣＬ悪性細胞で、機能的であり、且つ、特異的、予見的に、ＴＣＲＣＤ３信号経路によって惹起されるこれらの増殖を阻害するとの結論を出した。
次いで、ＣＴＣＬ腫瘍が、機能的、活性なＮＫ細胞及びＴリンパ球の両者を、本質的に有しない（欠落または欠損）遺伝子導入マウス（ＳＣＩＤマウス）に接種された[（Charley
et al.(１９９０)、CB-１７ SCID、 ヒト皮膚Ｔ細胞リンパ腫のマウスへの移植、J.Invest.Dermatol.９４:３８１〜３８４に記載のように]、（またＵＳ５，５３０，１７９
Cornelius P.Terhorst and Baoping Wang for obtention of SCID mice参照）。抗ＳＣ５mAbについては、マウスの半数に、静脈または皮下に、複数回、マウス体重１ｇあたり、複数種の濃度の精製mAbが投与された。ＰＢＬ及び皮膚細胞が、浸潤性，大Ｔ細胞の標準細胞観察基準に則って採取され、ＣＴＣＬ細胞の比率が、各供試マウスについて計算された。この方法は専門家が、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.に寄託番号Ｉ−２５７５として寄託されているハイブリドーマによって産生されるmＡbのような、抗ＳＣ５化合物が、ヒトＣＴＣＬの生体内増殖を阻害できること、をチェックできる方法の一例である。
【００８４】
討論
多くのダイナミックな表面発現を有する受容体は他の免疫細胞またはサイトカインとの相互作用に影響を与え、その結果としてＴ細胞免疫応答を制御する。この研究で、我々は、その表面発現が試験管内Ｔ細胞活性化の間に急速に誘発されるところの、ＰＢＬの矮小集団により発現される、新規な９６kＤ機能性分子を同定した。ＳＣ５は類似の分子量及び／またはＴ細胞制御機能を有する移植分子とは明瞭に異なる。第一に、ＳＣ５は、４時間後に検知される、その表面発現の重要な増加によって、非常に早期にＴ細胞活性化上で誘発される。同様の速動性が、刺激の２４時間後に細胞表面で検知される、非常に早期の活性化抗原ＣＤ６９について観察される。４ＩＩ−Ｂ、ＯＸ−４０ ＬＩＧＨＴまたはＣＤ−１５２（ＣＴＬＡ−４）のような、大部分が移植されたＴ細胞特異的、誘発可能な、受容体が、刺激に続いて、１０〜２４時間の間に、Ｔ細胞表面に現われる。更に、ＳＣ５発現はＴ細胞で限定されていない。抗原はＮＫ小集団及びＢリンパ球、単球及び顆粒球上で検知される。このような広い分布形態は、NK細胞、Ｔ及びＢリンパ球、脊髄性及び他の抗原含有細胞などの上に見出される、最近発表されたAIRM１及びIRp６０のような、ある種のキラー細胞Ig様受容体（ＫＩＲs）の典型である。免疫グロブリンファミリーは、転写（ＩＬＴ）阻害受容体のように、全白血球タイプの発現を有し、個々の受容体は異なるＮＫ、Ｔ、Ｂ及び脊髄性小集団上で検出される。その上、ＩＬＴ４はＳＣ５に極く近い分子量を有する。しかし、AIRM１及びIRp６０、ILTRsはともに細胞の活性化状態に依存しない。
【００８５】
我々が細胞透過の後に、大部分の非活性化Ｔリンパ球で、ＳＣ５を迅速に検出したので、ＳＣ５分子の活性化Ｔ細胞表面での誘発に、次いで、細胞内分子の細胞膜及び副ヴァーサ（versa）への通行に起因する制御緩和が続いた。そのような制御の機構は他のＴ細胞受容体、ＣＤ１５２、について報告されている。更に、膜蛋白（ＬＡＭＰ）に結合するリゾソームの不均一ファミリーが存在し、包含する分子はエンドサイトーシス、リゾソーム通行及び細胞内顆粒からの排出に関与し、単球、ニュウトロフィルＮＫ、ＢまたはＴ細胞の表面で活性化へと、誘発される。細胞内の局在性及びＳＣ５の移出の付加的研究結果は、Ｔ細胞活性化及び機能におけるその役割について正確である。抗ＣＤ３mAb誘発Ｔ細胞増殖を阻害するその特異的mAbによるＳＣ５の惹起を明らかにした。この阻害効果は、ＰＢＬにおける最大ＳＣ５表面発現を誘発するのに必要な、通常の抗ＣＤ３mAb刺激を必要とする（図５Ｂ参照）。Ａ：抗ＳＣ５腹水の１：２００の最終希釈物は、抗ＣＤ３mAbの２μｇ／wellで誘発される増殖を著しく阻害し、この阻害効果は抗ＣＤ３mAbの低濃度（１μｇ／well）で増加する。即ち、０．５μｇ／well−抗ＳＣ５腹水の１：４００の最終希釈物は抗ＣＤ３mAbの２μｇ／wellで誘発される増殖を十分には阻害しないが、抗ＣＤ３mAbの低濃度（１μｇ／well；０．５μｇ／well）では阻害は著しい。この分野の専門家は、ここで述べた特別な結果または彼自身の試みから得られる標準的書き加えによる修正を行なうことができる。
【００８６】
同時に、ＳＣ５結合が提起した阻害閾値は過度の抗ＣＤ３mAb刺激により、迂回される。ＳＣ５分子の連結で得られた阻害機能的効果はＡＰＣ非依存性機構で観察されることに注目すべきである。更なる実験は、ＳＣ５刺激がAPCＴ細胞または同種被刺激Ｔ細胞の増殖に異なる効果を与えるか否かを決定するのに必要である。近年、免疫応答の陰性制御の研究が、特に、Ｔリンパ球及びＮＫ細胞について、徹底的に行なわれた。最もよく研究されたＴ細胞特異的阻害受容体、即ち、ＣＤ１５２(ＣＴＬＡ−４)は、ＣＤ−２８共刺激受容体に機能的に結合する、典型的な活性化誘発抗原である。実に、ＣＤ１５２は、低い抗原濃度で、ＣＤ−２８に打ち勝ち、免疫応答を阻害するである。ＣＤ−２８で誘発されるＴ細胞増殖をＩＬ−２Ｒ発現及びＩＬ−２合成に影響することによって、制御緩和及び終結させる。ＣＤ１５２と同様に、ＳＣ５は表面発現が細胞の活性化状態によって制御される細胞内分子である。両受容体とも、ＩＬ−２合成に影響することによって、それらの効果を左右する。ＳＣ５特異的リガンド及び信号経路の同定は、これらの陰性Ｔ細胞制御体間の時間的、空間的、関係を要約するだろう。この広い細胞分布を考慮すると、ＳＣ５機能効果は、多分、Ｔ細胞を制限しないだろう。
数種の観点で、ＳＣ５はＮＫ細胞阻害受容体に、Ｔ細胞及び他のリンパ球小集団によって発現される点が同じことから、比肩し得る。ＫＩＲs及びCD９４／NKG２受容体の両者は、抗原特異性及び、細胞毒、増殖及びサイトカイン排出を含むＴＣＲαβ及びＴＣＲγδＴ細胞のスーパー抗原駆動活性化を阻害することが示されている。Ｔ細胞の活性化状態及びＴ細胞刺激の効力に依存するＫＩＲ誘発阻害は、特異的生体内条件下で、迂回され得る。しかし、我々が、抗ＣＤ３mAb刺激Ｔ細胞の増殖を選択的に阻害したことを、これらのエフェクター細胞毒機能なしで、示したので、ＳＣ５は、ＫＩＲsとは明らかに別のものであることになる。
【００８７】
ＳＣ５分子の重要な特徴は、ＳＳ患者の末梢血液リンパ球における発現が、健常者のそれに比較して非常に増加することである。ＳＳは成熟したフェノタイプの、初期類表皮悪性Ｔ細胞クローンという概念で特徴付けられる。事実、移植されたＴ細胞機能性受容体は末梢血液ＳＳ腫瘍細胞とは同一でないとの結論が出ている。ＭＦ／ＳＳは、特殊フェノタイプＴ細胞小集団、通常のＴメモリー小集団に相当する、ＣＤ＋ＣＤ７−が増大したものと考えられている。しかし、近年の研究は、ＣＤ＋ＣＤ７−集団が、ＳＳ患者の優勢なＴ細胞クローンを常には、代表するものではないことを示した（Dummer et al.1999、Arch.Dermatol.Res.291:307〜311）。ＳＳはその刺激性は知られていないが、特異的活性化Ｔ細胞の増殖であるとみなされる（Fargnoli et al 1997、Leukemia 11:1338〜1346）。この理由から、ＳＳ及び通常のＴ細胞での、活性化誘発抗原の明瞭な発現が特に興味ある点である。ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ３０のような移植された活性化抗原は、我々自身の研究で確認したように、セザリー細胞に常に検出されるものではない。ＣＤ２５の発現はむしろ、病気の進行と各種少数ケースの大細胞へのＭＦ／ＳＳ細胞の形質転換に関係する。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２５またはＳＳ中のＣＤ７１のようなＴ細胞活性化分子の発現の増加率は反応性腫瘍浸潤Ｔ細胞に優先的に関与する。７８kＤの活性化が非常に遅い抗原ＢＥ２は、正常Ｔ細胞では検出されないのに対して、特に、ＳＳ末梢血液で増加すると報告されている。事実、ＢＥ２は、報告された悪性細胞の比率に関して、末梢血中細胞の低比率のものは、ＢＥ２陽性であったのに比較して、研究された全てのＳＳ患者において、常に検出されるわけではない。そして、ＢＥ２は、血液関与の臨床的証明なしに、患者において検出される。それと対照的に、ＳＣは研究された８／８ＳＳケースで検出された。悪性細胞の比率は細胞生態学で決められ、患者によってかなり差が出るが（１０〜８０％）、ＣＤ４＋細胞のＳＣ５発現はこの比率に関与する。終わりに、ＣＤ４＋細胞のアップしないＳＣ５発現は、血液の関与なしに、ＭＦ患者で検出される。更に、我々はセザリー細胞はクローンタイプＴＣＲＶβ鎖共発現ＳＣ５分子の発現によって同定されることを示し、ＳＳ患者の末梢血液におけるＳＣ５の増加レベルは、悪性Ｔ細胞クローンにおけるその発現に原因があることを確認した。
【００８８】
非常に重要な観察は、セザリー細胞のＳＣ５トリガーがＣＤ３に影響される腫瘍細胞の増殖の制御緩和を誘発することであり、これは正常Ｔ細胞において観察される阻害に類似する。悪性ＣＴＣＬリンパ球が、サイトカインの異常型産生ではあるが、基礎的な信号経路によって活性化されるような、ある機能的性質を保護することは既に示された。我々は阻害経路がＣＴＣＬ腫瘍細胞中で保護され、これらの増殖を平衡状態に保持することを示した。特に、阻害効果は抗ＳＣ５mAbが抗ＣＤ３mAbに結合した後に観察され、ＣＴＣＬPno細胞で刺激されたＣＴＣＬPno細胞は正常Ｔ細胞におけるよりも重要である。それがrIL誘発増殖を制御しないので、抗ＳＣ５mAbは正常細胞またはセザリーＴ細胞の何れの細胞死にも、直接関与するようには見えない。更に、抗ＳＣ５mAbの存在下で培養されたＴ細胞はrILの添加によって再刺激され得る。同時に、我々は、少なくとも部分的にそれらの増殖阻害の原因になる、抗ＳＣ５mAb処理Ｔ細胞によるＩＬ−２産生の減少を観察した。
【００８９】
悪性細胞増殖の機能的受容体の阻害効果は、既に観察された。近年、同族ＮＫ細胞唾液粘性受容体ＡＩＲＭＩ及びＣＤ３３骨髄特異性抗原受容体によって影響される正常細胞及び白血病骨髄細胞の増殖阻害が報告された（Vitale et al.1999、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15091〜15096）。ＳＣ５に類似せず、これらの受容体は、生育因子の存在で、最も可能性ある細胞死の誘発によって阻害される。興味あることは、他のＴ細胞活性化抗原、正常ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の小集団によって発現されるＣＤ３０は、ＭＦ／ＳＳより優勢なＣＴＣＬの退行を左右する。
この効果はＣＤ３０（ＣＤ３０Ｌ）のナチュラルリガンドに関与する。これは悪性細胞の細胞質内に共存し、細胞死をFas／FasLに無関係に誘発する（Mori et al.1999、Blood 94:3077〜3083）。この観点で、ＳＣ５リガンドの同定はその阻害行動のメカニズムを解明するであろう。
【００９０】
結論として、我々は早期のフェノタイプ的生化学及び機能的基準が移植されたＴリンパ球受容体と異なる活性化抗原を同定した。アンダーラインしたように、ＳＣ５分子はポスト−活性化／記憶末梢血液Ｔ細胞小集団によって発現される。同様に、ＫＩＲsの継続的発現が腫瘍Ｔ細胞クローン上に発現され、この発現は特異的抗原によるＴＣＲの占有に依存するように見える。近年、そのようなクローンは自己反応性で、且つ、ＫＩＲs信号によって、耐性が保存されることが報告されている。我々は、セザリー症候群腫瘍細胞はそのようなクローンが起源となる可能性があることを示唆し、ＳＣ５発現も自己反応性Ｔ細胞上で保護されるものと推定した。ＣＴＣＬ悪性Ｔ細胞上でのＳＣ５発現が、それらの起源、及び通常のＴ細胞が制御不能な増殖をするように駆り立てる信号の性質をよりよく規定するのに役立つことが重要である。更に、腫瘍Ｔ細胞上の抗ＳＣ５mAbの阻害効果は、進行性ＣＴＣＬ患者に対する新規な治療法を構成する。
更に、ＳＣ５発現も、ＣＤ８＋形質転換ＭＦのようなＣＤ８＋ＣＴＣＬの表面で観察される。
【実施例２】
【００９１】
Ｐ１４０はＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞によって発現されること及び新規P１４０対立遺伝子型の同定。
皮膚Ｔ細胞リンパ種（ＣＴＣＬ）は主として、皮膚に関与するリンパ腫の外生群である。菌状息肉症（ＭＦ）は本来のＴ細胞ヘルパー細胞に類似する、フェノタイプの、クローン由来の悪性ＣＤ４＋Ｔリンパ球の皮膚侵襲が特徴である。よりアグレッシブなＣＴＣＬ型は悪性細胞が類皮的になり、皮膚異常に関与する。セザリー症候群（ＳＳ）は、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のクローン拡大及びこれら悪性細胞の血液中への出現が特徴であるところの、ＣＴＣＬのより進行性のタイプである。特異的細胞表面のマーカーがないために、悪性細胞を同定するのが困難なので、病気の生物学はよく理解されない状態が続いている。皮膚の病変では、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞を反応性、浸潤性ＣＤ４＋Ｔリンパ球から区別することは困難である。バゴット（Bagot）等は、以前に、ＣＴＣＬ病変由来のユニークなＣＤ４＋Ｔ細胞系について述べている（Bagot et al.1998、Blood 91:4331〜4341）。この細胞系及び生体内腫瘍細胞は、ＴＣＲ−Ｖβ転写の相補的に決定する領域３と同一サイズで発現した。極く最近、Poszepczynska等は(Blood 2000、96：1056〜1063)他の皮膚紅皮症ＣＴＣＬ患者の血液から採取された、ＩＬ−７依存性ＣＤ４＋ＣＤ８αα＋腫瘍Ｔ細胞系を機能的に特徴付けた。ＴＣＲ−Ｖβ２２の発現及びＴＣＲβ−ＶＤＪ配列の同一性によって示されるので、この腫瘍Ｔ細胞系は大循環性Ｔ細胞集団と同一だった。ここで、我々はこれら二つの異なるＣＴＣＬ系が、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のためのP１４０／ＫＩＲ阻害受容体を発現することを示す。重要なのは、同じ患者由来の新しい分離腫瘍細胞で検出されることである。更にその上、P１４０／ＫＩＲは他の７人のＳＳ患者のＣＤ４＋リンパ球のメジャーな集団及び進行した２人の追加ＭＦ患者の皮膚ＣＤ４＋腫瘍の両者によって共発現される。P１４０／ＫＩＲは健常者のマイナーＮＫ細胞小集団及び稀な末梢血中ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞で検出される。その上、皮膚炎及び毒物による表皮融解のような皮膚病患者の皮膚から得られたＴ細胞は、この受容体を発現しない（Le Cleach et al.2000、Clin.Exp.Immunol．119:225〜230）。このようにして、我々の研究成果は、P１４０／ＫＩＲがＣＴＣＬの同定のための、ＣＤ４＋細胞上の好適なマーカーを表すことを示した。
【００９２】
材料及び方法
患者
インフォームド・コンセントの後、倫理委員会の承認を受け、我々は１１人のＣＴＣＬ患者から皮膚及び血液試料を得た。８人の患者は、セザリー症候群に罹っており、１０〜４５％の循環性セザリー細胞を血液中に有していた。７例で、腫瘍細胞のフェノタイプがＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−であった。1例がＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８αα＋（患者Pno）であった。３人の患者は形質転換菌状息肉症(Lez、Cou、Bic)で、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−フェノタイプを有する伝播性皮膚腫瘍の症状を呈していた。患者全員がこれまで化学療法を受けていなかった。
【００９３】
腫瘍リンパ球の分離
新鮮な腫瘍細胞は腫瘍断片を機械的に単細胞懸濁液に分散させたものから得た（Bagot et al.1998、Blood 91:4331〜4341）。次で、単核細胞は洗浄され、後の使用のために、ヒト血清プラス１０％ジメチルスルフォキシド中で凍結された。
セザリー症候群患者の場合は、単核血中細胞がフィコール・アイソパクウ技法（Pharmacia fine Chemicals、Piscataway、NJ）で分離された。
【００９４】
腫瘍細胞系の長時間培養
我々は前記の（Bagot et al.1998、Blood 91:4331〜4341）患者の末梢血液からの試験管内Pno細胞系（ＴＣＲ−Ｖβ２２＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８αα＋、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ）の長時間培養を実施した。我々は患者の血中を循環する悪性クローン及び培養されたＴ細胞系の両者がそれらの細胞表面フェノタイプ及びそれらのサイズ及びＴＣＲβＶＤＪ領域（Poszepczynska et al.2000、cf.supra）に関して同一であることを示した。ＳＳ細胞系の他の供給源はＡＴＣＣ（例えば、HUT 78 ATCC TIB-161）で見つけることができる。
Cou−L細胞系（ＴＣＲＶβ１３＋）は試験管内でγＩＬ−２と共に、３年以上培養された。それは前記のＣＤ４＋Cou−LSCTCL系のサブクローンに相当する（Bagot et al.1998、cf.supra）。Cou−L細胞系、本来のＴＣＲＶβ１３＋ＣＤ４＋Cou−ＬＳＣＴＣＬ及び皮膚から新たに分離された腫瘍細胞は、同じサイズで、且つＴＣＲβＶＤＪ領域の配列を分担する（Bagot et al.1998、cf.supra）。
【００９５】
モノクローナル抗体（mAbs）及び流動細胞計数の研究
１色または２色の免疫蛍光分析が前記のように（Bagot et al.1998、cf.supra）行なわれた。抗ＣＤ３（細胞分析２０００カタログ番号６６０４６２９）、抗ＣＤ４（細胞分析２０００カタログ番号６６０２１３８）、抗ＭＮＣクラスＩ（細胞分析２０００カタログ番号ＩＭ０１０７）及びＩＩ（細胞分析２０００カタログ番号ＩＭ０１０８）はBeckman
Coulter（細胞分析２０００カタログ番号ＩＭ２０１４）から入手可能である。
抗ＴＣＲＶβ１３はBioadvance（Emerainville、France、catalogue番号TCR1738）、ＴＣＲ−Ｖβ２２＋mAb はBeckman Coulterから入手された（Marseille、France、細胞分析２０００カタログ番号ＩＭ１４８４／ＩＭ１３６５）。抗ＣＤ８αβ２ＳＴ８．５Ｈ７mAbはBeckman Coulter（細胞分析２０００カタログ番号Ｉｍ２０１４）から入手可能である。抗P１４０mAbsとして、Ｑ６６（IgM、抗P１４０）及びＡＺ１５８（IgG2a、p70／NKB1及びP１４０の両者を確認）（これらは、Pande et al.1996により報告された。J.Exp.Med.184:505〜518）が使用された。しかし、抗P１４０結合化合物が好適である（例えば、抗P１４０抗血清、Fc-HLA-A11 Fc-HLA-A3溶融蛋白）。Ｚ２７（IgG1、抗p70／NKB1）、ＥＢ６（IgG1、抗p58.1／p50.1）、ＧＬ１８３（IgG1、抗p58.2／p50.2）、ＸＡ１８５（IgG1、抗ＣＤ９４）、Ｚ１９９及びＺ２７０（IgG2b、及びIgG2aの各々、抗ＮＫＧ2Ａ）及びＢ９．４（IgG2b、抗ＣＤ８）mAbsは全て、Beckman Coulter（細胞分析２０００カタログ番号ＩＭ２７４８、ＩＭ２２７７、ＩＭ２２７８、ＩＭ１６１０、ＩＭ２７５０、ＩＭ０１０２）から入手可能である。
ヤギ抗マウスＩgＭＦＩＴＣ及びヤギ抗マウスＩgＭＰＥもまた、Beckman Coulterから入手され得る（細胞分析カタログ番号ＩＭ０８及びＩＭ０５５５参照）。
【００９６】
生化学的特徴
２０×１０6個の細胞が、培養され（１５分、２０℃）２５０μｇのＥＺ−ＬＩＮＫ ＳＵＬＦＯ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩＯＴＩＮ（Pierce、Rockford、IL）含有１ミリリットルＰＢＳpH８中で培養され（１５分、２０℃）、洗浄用バッファー（10mM TRIS pH8、0.14M塩化ナトリウム）で３回洗浄された。次いで、細胞は１％ＮＰ４０に溶解され、次いで、セファロースＰＡ（Pharmacia Biotech Inc.Piscataway、NJ）結合ＡＺ１５８（IgG2a抗p70/、１４０）またはＢ９．４（IgG2b抗CD8）mAbで免疫沈降された。試料は不連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用し、Ｎ−グリコシダーゼ（ベーリンガーマンハイム、GmbH、Germany、製）による消化または非消化で、分析された。次いで、Immobilon P（ミリポアCorp.Bedform MAの商品名）ヘ移した。Neutravidin(Pierceの商品名)で汚染後、検出にはルネッサンス・ケミルミネッセンス・キット（NeN、Boston、MAの商品名）が使用された。ＮＫ細胞クローンはペンデ（Pende、1996）等が（J.Exp.Med.184:505〜518）報告したように、限定希釈で得られた。
【００９７】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
トータルＲＮＡはＣＴＣＬ細胞系Pno及びCou-LCD８ααからＲＮＡクリーンシステム（AGS GmbH、ハイデルベルグ、ドイツ）を使用して抽出した。cＤＮＡ合成はオリゴットＴプライミング（oligod T priming）を使用して行なった。ＫＩＲディスプレー３Ig様ドナーの完全なＯＲＦ（open reading frame）cＤＮＡ増幅のために使用された。使用されたプライマーを以下に示す。５'ＣＡＴＧＴ（ＣＴ）ＧＣＴＣＡ（ＣＴ）ＧＧＴＣＧＴＣ（Ig3 UP;SEQ ID No.5）及び５'ＧＧＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＧＧＧＣＴＧ（Ig3 DOWN;SEQ ID No.6）。増幅は３０秒サイクル（３０秒９４℃、３０秒５５℃、３０秒７２℃）、次いで、Ampli TAQ（パーキンエルマー−Applied Biosystems、Foster City、CA）を使用して７分、７２℃の培養を行なった。ＰＣＲ産物はpcDNA3.1/V5-HisTOPOベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA製)のサブクローン化物であった。ＤＮＡ配列はd-ローダミン（生物体汚染用顔料）ターミネーターサイクル配列キット及び３７７Applied Biosystems自動配列機（パーキンエルマー−Applied Biosystems）を使用して行なった。
【００９８】
過渡的移入
ＣＯＳ−７細胞がpcDNA3.1TOPO−ＫＩＲ3Dcl.24またはpCR3cl.1.1（Pende et al.1996、J.Exp.Med.184:505〜518）でFugene-6 (Roche、Monza Italy)を使用して移入された。細胞を５×１０5／プレートの量でシードした。２４時間後、これらを６μｇプラスミド及び１０μｌのFugene-6試薬と共に、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養した。４８時間から７２時間後、移入細胞は血球弗素計量分析にかけられた。移入細胞はＱ６６及びＡＺ１５８mAbsで汚染され、次いで、フィコエリトリン被接合ヤギ抗体接合マウスのIgG2aまたはIgMで汚染され、血球流量計により、ＦＡＣソート（Becton Dickinson、San、Jose、CA）を使用して分析した。
【００９９】
結果
ＣＴＣＬ細胞系がp１４０/ＫＩＲヘの抗体で汚染される。
二つの長期ＣＴＣＬ腫瘍系Pno（抗TCR−Vβ22mAbでラベル）（Poszepczynska et al.2000、cf.supra）及びCou-L（抗CD3mAbでラベル）（Bagot et al.1998、cf.supra）は反応的に、異なる抗ＫＩＲmAbsで分析された。
我々は両細胞系がmAbsＱ６６（図９Ａ参照）及びＡＺ１５８と反応性であり、両者はp１４０/ＫＩＲと結合することを見出した。対照的に、これらの細胞系は他のp58.1、p58.2、p70ＫＩＲsを含有するHLAクラスI分子に特異的な阻害受容体及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレクチン様受容体（Poszepczynska et al.2000、cf.supra）を発現しない。
【０１００】
ＣＴＣＬ患者から新たに採取された腫瘍Ｔリンパ球の抗p１４０／ＫＩＲmAbsによる汚染。
p１４０/ＫＩＲが新たに採取された腫瘍細胞により発現されるか否かを決定すべく、我々は、Ｑ６６mAbの、ＳＳ患者Pno及びＭＦ患者Couの腫瘍性皮膚断片から採取した非培養腫瘍細胞との反応性を試験した。我々は腫瘍細胞の大部分がこのmAbによって汚染されることを確認した（図９Ｂ参照）。特に、我々は、患者Pnoの血液から採取された大部分のTCRVβ22＋腫瘍リンパ球がＱ６６抗体と反応性があり、患者Couの皮膚から採取された大部分のTCRVβ13＋腫瘍リンパ球が同じ抗体と反応性があることを観察した（図９Ｂ参照）。次に、我々は、その循環性ＣＤ４＋リンパ球の１０〜４５％が悪性細胞である、追加の７人のセザリー症候群患者から採取した腫瘍Ｔリンパ球及び他の２人のＭＦ患者の皮膚腫瘍から採取した腫瘍Ｔリンパ球、の両者のフェノタイプを研究した。供試全患者が共発現ＣＤ４及びp１４０/ＫＩＲの大集団を顕著に示していた（下記表２参照）。
【０１０１】
形質転換菌状息肉症患者の皮膚、及びセザリー症候群患者の血液、から採取されたＣＤ４＋リンパ球汚染、抗Ｑ６６mAb。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
全てのＱ６６＋細胞がＣＤ４＋細胞集団に含まれていることに注目すべきである。かくして、健常者のp１４０／ＫＩＲ発現は、皮膚及び血液中にあるＣＴＣＬ腫瘍ＣＤ４＋Ｔリンパ球の特徴を表すＮＫ及びＣＤ８＋集団から得られる、リンパ球小集団に限定される。Ｔリンパ球発現の多種類のＫＩＲの比率が低いところの、他の皮膚病、毒物による皮膚溶解（Le Cleach et al.2000、Clin.Exp.Immunol.119:225〜230）、由来の皮膚Ｔ細胞はp１４０／ＫＩＲの発現制御ができない。
【０１０４】
ＣＴＣＬによって発現されるp１４０受容体の分子的特徴
Pno及びCou-L細胞系はビオチンでその表面をラベルされており、細胞溶解物は抗p１４０（ＡＺ１５８mAb）で免疫沈降する。図１０に示すように、このmAbはその分子量が還元条件下で約７０kDである、ＮＫクローン及びPno及びCou-L細胞系から免疫沈降される。Ｎ−グリコシダーゼによる処理によって、ＮＫクローンに比較してPno及びCou-Lの移動性がやや高く、分子量が約５０kDである蛋白質主鎖を明らかにした。これらのデータは、これらＣＴＣＬ腫瘍細胞系によって発現されるp１４０阻害受容体が、前記正常ＮＫ細胞で検出されたものと殆ど同じであることを示唆した（Pende et al.1996、J.Exp.Med.184:505〜518）。
【０１０５】
次に、我々はPno及びCou-L細胞系上のＱ６６及びＡＺ１５８mAbが前記p１４０／ＫＩＲ（SEQ ID No.3）をコード化するcＤＮＡの一つに相当するかどうかを決定した。この末尾で、ＲＴ−ＰＣＲは、三個のＩg様ドメインを有するＫＩＲをコード化する全てのcＤＮＡを増幅できるプライマーのセットを使用して、これらの細胞から由来するＲＮＡ上で行なわれた。Pno細胞系から、ＫＩＲ３D cl.24と名付けられた、フル鎖長のcＤＮＡを採取した（SEQ ID No.1）。そのヌクレオチッド配列と、三つの細胞外Ｉg様ドメインが特徴である、全てのＫＩＲをコード化するＤＮＡ配列との比較は、ＫＩＲ３D cl.24pが、１４０受容体の新規な対立遺伝子型を表すことを明らかにした。特に、そのヌクレオチド配列は前記の成熟蛋白質（図１１参照、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．２：クローン２４蛋白質；ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．４：クローン１．１蛋白質）における４個のアミノ酸置換となる1.1 cＤＮＡに比較される５個の異なるものを表示する（Pende et al.1996、J.Exp.Med.184:505〜518）。４個の置換のうち３個は細胞外Ｉg様ドメイン（成熟蛋白質のうちのpos.20、92及び111）であり、他方はサイトプラズマ領域に局在する（pos.401）。Cou-ＬＣＴＣＬ細胞系で行なわれるＲＴ−ＰＣＲはp１４０／ＫＩＲの二つの異なる対立遺伝子型を明らかにした。一つはcl.１.１cＤＮＡに相当し、他方は、ＫＩＲ３D cl.24(Pno細胞系から分離)と同一である。ＣＴＣＬ細胞系由来のcＤＮＡはＣＯＳ−７細胞へ移入される。期待したように、全ての移入された細胞は、Ｑ６６及びＡＺ１５８mAbによって明瞭に汚染される。
一方、これらはネガティブコントロールとして使用されるp７０／ＫＩＲ特異性Ｚ２７mAbと反応しない。終わりに、ＲＴ−ＰＣＲが三人のＳＳ患者（患者のPno含有）由来のＰＢＬから抽出及び一人の追加のＭＦ患者の皮膚由来のＴ細胞から抽出されたＲＮＡ上で行なわれる。また、これらの試料で、上記のp１４０／ＫＩＲの一つまたは他の対立遺伝子型が同定される。
同じ結果が患者から採取された悪性細胞上で得られた。
【０１０６】
討議
ＣＴＣＬの皮膚病変は、殆どＣＤ４＋で、非新形成の腫瘍浸潤性Ｔリンパ球である悪性Ｔ細胞からなる異成分のリンパ球の浸潤物を含む。我々は、以前に、ＣＤ４＋細胞毒腫瘍浸潤性Ｔリンパ球は特異的に、自家組織の悪性ＣＴＣＬＣＤ４＋細胞系を支配することを報告した。しかし、腫瘍細胞で発現されるクローン型のＴＣＲのみならず、非腫瘍とされている細胞表面構造がＣＴＣＬ上で同定された。非悪性、反応性ＣＤ４＋リンパ球と悪性のものとを区別する標準法を使用することは困難である。
我々は、この研究で、最初に、ＭＦ及びＳＳ患者から採取した腫瘍細胞が、p１４０／ＫＩＲを発現すると報告した。この受容体は長期培養ＣＴＣＬ系と同様に、ＣＴＣＬ患者からの皮膚及び血液中の腫瘍細胞と同定された。二色蛍光分析はp１４０／ＫＩＲ発現は、以前に腫瘍細胞で同定され、与えられた、ＴＣＲβ−ＶＤＪにより、特徴付けられているＴ細胞として限定される。このようにして、p１４０／ＫＩＲは、Ｔリンパ球ＣＤ４＋集団中の腫瘍反応性細胞からの腫瘍細胞の同定を迅速化させる。これは、特に、その腫瘍Ｔ細胞クローンが末梢血中ＣＤ４＋リンパ球集団内で、常には、容易に同定されないようなＳＳ患者に対しては有効である。更に、病気の間または処置後に、ＣＤ４＋集団の増加が腫瘍細胞集団の増加が原因なのか、反応性Ｔリンパ球の増加が原因なのかを評価するのは困難である。抗p１４０／ＫＩＲmAbが、既に解析された全ＣＴＣＬ患者の腫瘍細胞を認知するために出現するので、それらは、ＣＴＣＬの直接的同定のためには公的な手段と考えられる。その上、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞上での、p１４０／ＫＩＲ共発現の使用は悪性細胞と正常細胞を区別するユニークな手段を提供する。これは個々の患者にとって独特であるＴＣＲ決定法とは対照的である。その上、p１４０／ＫＩＲは、ＣＴＣＬの新規な特異的免疫療法の発展のための可能なターゲットである。
【０１０７】
これまでの研究は、この受容体がＨＬＡ．Ａ３及びＨＬＡ．Ａ１１対立遺伝子の認知への阻害信号を送ることができることを示した。しかし、解析された各種の患者におけるp１４０／ＫＩＲ発現それら自体のＨＬＡクラスＩハロタイプには明らかに依存しないと見なされることに留意すべきである。それにも拘らずp１４０／ＫＩＲのＣＴＣＬの異常病態生理学における現実の役割は、それ自体への耐性での受容体の潜在的役割を考慮することで、研究が続けられるという重要な特徴である。結論として、この研究は最初に、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞におけるp１４０／ＫＩＲの発現及び腫瘍細胞におけるこの受容体の新規な対立遺伝子型の病変を示している。この発見はＣＴＣＬ患者の異常病態生理学及び臨床管理の両者についての重要な論点である。更に、p１４０発現がＣＤ８＋形質転換ＭＦのようなＣＤ８＋ＣＴＣＬの表面に観察される。
【実施例３】
【０１０８】
抗ＣＴＣＬ薬の製造
当該分野の専門家は、下記の図の意図による概要に従がって抗ＣＴＣＬ薬を製造できる。
ＣＴＣＬ細胞近傍の細胞の免疫システムを刺激するために、抗ＳＣ５または抗p１４０mAbをサイトカインと共に使用する。
抗ＣＴＣＬ成分をＣＴＣＬ細胞に向けて送り出すためのベクターとして、これらの抗ＳＣ５または抗p１４０mAbを使用する。抗ＣＴＣＬ成分の例は、放射性元素、トキシンなどのキミオセラピーで使用される標準化合物がある。
放射性元素用mAbベクターは、本発明の抗ＳＣ５mAbに使用された標準技法により産生できる[Press OW et al.置換B細胞リンパ腫への自家幹細胞移植を伴うフェイス２試行沃素131B1（抗CD20）抗体療法、Lancet 1995 vol.346 pp336〜340参照、この内容は，この明細書に参考のために記載されている。]。
トキシン用mAbベクターは、本発明の抗ＳＣ５mAbに使用された標準技法により産生できる[Ghetie U et al.ヒト組換えＣＤ４及び脱グリコシルリシンＡ鎖構成免疫接合物の大スケール調製、J.Immunol.Methods 1990、vol.126 pp 135〜141、この内容は，この明細書に参考のために記載されている。]。
抗有糸分裂性のプロドラッグ及び抗ＳＣ５mAb及び／または抗p１４０mAbベクターの両者の結合されたものを使用すると、抗有糸分裂性のプロドラッグを活性な医薬型（機能型の抗有糸分裂性製剤）へと形質転換することができる酵素を送り届ける。
抗有糸分裂性のプロドラッグを活性な医薬型へ形質転換することができる酵素を送り届ける抗ＳＣ５mAb及び抗p１４０mAbベクターは、本発明の抗ＳＣ５mAb及び抗p１４０mAbに適用される次の標準的技術で産生され得る（ＡＤＥＰＴtechnique、for Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy、described in Plakey TC et al. Anti-tumor effects of an antibodycarboxypeptidase G2 conjuguate in combination with phenol mustard prodrugs、British J. Cancer 1995 vol.72 pp 1083〜1088、of which content is herein incorporated by reference、参照）。
リガンド作用物質（ＳＣ５刺激またはp１４０刺激）としての抗ＳＣ５または抗p１４０／抗ＣＤ４の使用。
補体漸増剤としての抗ＳＣ５または抗p１４０mAbの使用。
上記用途のために抗ＳＣ５／抗ＣＤ４または抗p１４０／抗ＣＤ４特異性の共用のmAbが好ましい。
ＡＤＣＣ（Antibody Dependent Cell Cytotoxicity）の活性化体としての、抗ＳＣ５または抗p１４０（ＣＤ４特異性は不要）の使用：多核細胞、マクロファージ、Ｆc受容体含有ＮＫ細胞抗はＳＣ５及び抗p１４０mAbのＦc含量によって活性化され、それ故、これらmAbはＣＴＣＬの近傍でＡＤＣＣ活性化ができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明はＣＴＣＬの診断及び治療の問題点を解決する二つの分子を提供する。
これは、特に、悪性ＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性を阻害する。また、Ｔ細胞、特に悪性ＣＴＣＬ細胞のような腫瘍性Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性の調節ができる、ハイブリドーマＩ−２５７５で産性された抗ＳＣ５モノクローナル抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは健常者のＰＢＬsのＳＣ５分子の細胞膜発現を図解している。 図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃはそれぞれ、健常者のＰＢＭＣを抗ＳＣ５mＡb(腹水１／２００)で汚染させ、次いで、ＦＩＴＣ接合アイソタイプ特殊ヤギ抗マウスＩgＭ２次試薬及び、抗ＣＤ３（図１Ａ）、抗ＣＤ５６（図１Ｃ）及び抗ＣＤ４５ＲＯ（図１Ｂ）のようなＰＥ接合mＡbsの一種で汚染した場合である。
【図２】図２はＰＢＬsの活性化の間、ＳＣ５分子の細胞膜発現を図解している。
【図３】図３はＰＢＬのＳＣ５分子の細胞内所在部を図解している。
【図４】図４はＳＣ５分子の生化学的分析結果を図解している。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄは、抗ＣＤ３誘発増殖及び正常Ｔリンパ球のサイトカイン分泌を、それらの細胞毒活性の影響なしに、抗ＳＣ５mＡbが調節する様子を図解している。図５Ａ：ＰＢＬまたはＴ細胞クローンＬＳＯ及びＧＤＳ．３が固定化抗ＣＤ３mＡb（コートされたmＡb１μｇ／源）またはＩＬ−２（５０ＩＵ／ミリリットル）で、抗ＳＣ５mＡb（腹水の、１：２００最終希釈）またはアイソタイプ適合、不適切mＡbの存在で、刺激した場合。図５Ｂ：ＧＤＳ．３ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは抗ＳＣ５mＡbの異なる濃度の存在下、図示された濃度のプレコート抗ＣＤ３mＡbで刺激した場合。 図５Ｃ：抗ＳＣ５またはコントロールmＡbの存在下、抗ＣＤ３刺激の場合。図５Ｄ：細胞毒ＣＤ８＋細胞クローン（ＪＦ１）が、抗ＳＣ５mＡb（腹水の、１：２００最終希釈）またはアイソタイプ適合コントロールmＡbの存在で、Ｅ／Ｔ比が５／１での、ＦcyＲ＋ミューリン腫瘍細胞Ｐ８１５との共培養の前に、培養した場合。
【図６】図６Ａ、６ＢはＣＴＣＬ患者のＰＢＬのＳＣ５分子の細胞膜発現を図解する。図６Ａ：セザリー症候群患者のＰＢＬのＳＣ５及びＣＤ４分子の共発現を健常者と比較した場合。図６Ｂ：ヒストグラムは示された３群におけるＳＣ５発現の平均値を示す
【図７】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃはセザリー症候群患者の悪性細胞の膜表面発現を図解する。 図７Ａ：循環ＴＣＲＶβ２２＋悪性Ｔ細胞クローンの存在で、ＳＳ患者のＰＢＭＣの二色蛍光分析。図７Ｂ：弱くラベルした、抗ＳＣ５mＡb（陰を付したヒストグラム）ＴＣＲＶβ２２陽性悪性細胞。図７Ｃ：同じ患者の細胞を、ＰＥ接合抗ＣＤ６９mＡb及びＦＩＴＣ接合抗ＴＣＲＶβ２２mＡbによって汚染させた場合。
【図８】図８は抗ＳＣ５mＡbによるＣＴＣＬ悪性細胞系の抗ＣＤ３誘発増殖の調節を図解している。
【図９】図９Ａ、９Ｂは、ＣＴＣＬ細胞系（図９Ａ）のp１４０／ＫＩＲ分子及び新鮮なリンパ球腫瘍（図９Ｂ）の検出を図解いている。
【図１０】図１０はp１４０分子の生化学的分析を図解している。
【図１１】図１１は蛋白質でコードされたＫＩＲ３Ｄ cl.２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２）及びcl.１.１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４）のアミノ酸配列を示す。
【０１１１】
略語
ＡＰＣ：抗原提示細胞、ＣＴＣＬ：皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ＤＩＧ：界面活性剤不溶グリコリピッド富化分画、ＩＬＴ：免疫グロブリン様転写、ＫＩＲ：キラー細胞免疫グロブリン受容体、mAb：モノクローナル抗体、ＭＦ：菌状息肉症、ＰＢＬ：末梢血中リンパ球、ＰＢＭＣ：末梢血中単核細胞、ＰＨＡ：フィトヘマグルチニン、ＰＭＡ：ホルボール１２β−ミリステート１３α−アセテート、ＳＳ：セザリー症候群、ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体。
【技術分野】
【０００１】
この出願はＴリンパ腫の新規な診断及び治療法、更に詳しくは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬと略称する）の新規な診断及び治療法に関する。本発明は現実に、ＣＴＣＬに共通する腫瘍マーカーを提供し、そのバイオテクノロジー的及び医学的用途をも含む。
【背景技術】
【０００２】
ＣＴＣＬは本来皮膚に関するＴリンパ腫のグループである。ＣＴＣＬグループは即ち、形質転換菌状息肉症（形質転換ＭＦと略称する）、セザリー症候群（ＳＳと略称する）、リンパ腫丘疹（ＬＰと略称する）及びＣＤ３０＋リンパ腫からなる。形質転換ＭＦは表現タイプが成長済みＴヘルパー細胞に類似するクローン誘導型悪性Ｔリンパ球の皮膚侵襲に因るものである。ＬＰ及びＣＤ３０＋リンパ腫もまた、皮膚で進展する。より進行性な型のＣＴＣＬは、悪性細胞が非表皮性になったとき発達し、特殊な皮膚関連性を示すようになる。ＳＳはＣＤ４＋／ＣＤ４５＋ＲＯ＋Ｔ細胞のクローン増大及びこれらの悪性Ｔ細胞の血中への出現による、より進行性なＣＴＣＬのタイプである。大部分のＣＴＣＬはＣＤ４＋ＣＴＣＬであり、稀にＣＤ８＋ＣＴＣＬの場合がある。
細胞表面の特殊なマーカーが欠如しているために、悪性細胞の同定が困難であるから、ＣＴＣＬ病の生物学は、十分には、理解されていない状態が継続している。皮膚の病変において、活動性、浸潤性のリンパ球（非腫瘍性の）の中から、ＣＴＣＬ細胞を識別するのは困難である。
ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫の診断は、現時点では、疑わしい体内（脳の細胞核を示す細胞の検知によって、皮膚生検及び／または血液中のＳＳの存在の外観の組織病理学的観察）から採取された試料中に腫瘍細胞が存在するか、しないかを、細胞学的且つ組織病理学的観察によって行なうことに基づいている。このような診断法は、皮膚リンパ球の悪性リンパ球への形質転換の初期では、特に、十分な信頼性に欠ける。このような診断法は病気を現実のものとして捉えることができない。技術的には時間も浪費する。
今日では、ＣＴＣＬの治療は、非特異的化学療法による腫瘍細胞アポトーシスの誘導により試験的に行なわれている。
だから、ＣＴＣＬのような悪性Ｔ細胞の増殖に関連する病気の診断及び治療の問題点のより正確で好適な解決策が、まだ、必要とされている。
【０００３】
このような従来技術の状況に鑑み、発明者等はＣＴＣＬの診断及び治療の問題点を解決する二つの分子を提供する。一つは発明者によってＳＣ５と命名され、他方はp１４０分子（p１４０は、また、ＫＩＲ３ＤＬ２である）である。
本発明におけるＳＣ５分子は生化学的、機能的に新規な蛋白質であり、還元状態で、見かけの分子量は９６kＤである。これは発明者等によって産生されたモノクローナル抗体の抗原として分離された。このモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは２０００年１０月３０日、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.（Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.パスツール研究所;２５、rue du Docteur Roux、F-７５７２４ Paris Cedex１５、France）にブダペスト条約（Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.寄託番号I-２５７５）に従がって寄託された。細胞表面で発現され、集合されたとき、ＳＣ５分子は細胞活動及び増殖の阻害受容体として行動する。本発明の第二のマーカー、即ち、p１４０は既に阻害受容体として知られているが、以前に、ＮＫ細胞及び健康なヒトのＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞のサブグループであると述べられていた。発明者等は、ここで、p１４０がＣＴＣＬ細胞のような腫瘍Ｔ細胞の表面で発現されることを示す。
発明者等は、更に、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような悪性のＣＤ４＋Ｔ細胞の表面で、p１４０が発現するのに対し、ＮＫ細胞（p５８.１、p５８.２、p７０ＫＩＲs、CD９４/NKG２A）の表面で通常観察される他の受容体は、悪性のＣＤ４＋Ｔ細胞の表面で観察されないことを示す。勿論、p１４０は皮膚炎（例えば、皮膚結核、苔癬）または毒物による皮膚壊死のような非腫瘍性の皮膚系疾病に罹っている患者から採取されたＣＤ４＋Ｔ細胞の表面では、発明者によって観察されていないことに留意すべきである。
腫瘍性ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面で、p１４０の二つの対立型が発明者によって同定された。即ち、対立型ＫＩＲ３Ｄクローン２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１）及び対立型p１４０クローン１．１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３）である。対立型ＫＩＲ３Ｄクローン２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１）は新規蛋白質（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２）をコード化する新規なポリヌクレオチドである。ＫＩＲ３Ｄクローン２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１）は、前記p１４０クローン１．１ＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３）に比較して、５つの相違点が明らかであり、前記p１４０クローン１．１成熟蛋白（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４）に比較して、成熟蛋白（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２）において、４個のアミノ酸置換になっている。
【０００４】
発明者等は、ＳＣ５及びp１４０の両者が、以下の同じ技術的特徴を共に有することを示す。
ＳＣ５及びp１４０は共に、悪性Ｔ細胞、とりわけ、悪性ＣＤ４＋Ｔ細胞の特徴である、細胞膜分化抗原である。
ＣＤ４＋ＣＴＣＬの何れの型が関与しているにしても、ＳＣ５またはp１４０をそれらの表面（通常、ＳＣ５及びp１４０の両者が発現される）に発現する、悪性のＣＤ４＋Ｔ細胞がある。ＳＣ５及びp１４０のいずれも、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ、特に、セザリー症候群（略語でＳＳ）、形質転換菌状息肉症（略語で形質転換ＭＦ）、リンパ腫症丘疹（略語でＬＰ）及びＣＤ３０＋リンパ腫の全範囲を実際にカバーする。
ＳＣ５またはp１４０のＣＤ４＋Ｔ細胞の表面での存在と、ＣＤ４＋ＣＴＣＬの存在の間には、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ診断が疑わしい体内部分（例えば、形質転換ＭＦが疑われる際の紅皮症の皮膚試料または、ＳＳのような進行性のＣＴＣＬ型が疑われる際の末梢血液試料）から採取したＣＤ４＋細胞表面のＳＣ５またはp１４０の存在の解析に基づき、この信頼性は９０％以上、より好ましくは９５%以上、最も好ましくは１００％である（これまで試験に供された患者については信頼性１００％である）という関連がある。事実、本発明によれば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞表面でのp１４０分子の存在が検知されるか、または、ＳＣ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率の値が、平均標準レベルより高く測定されれば（平均標準レベル１〜１５％、一般には５〜１０％の範囲内にある）、即、腫瘍であると決定される。
また、ＳＣ５またはp１４０のＣＤ４＋Ｔ細胞の表面での存在と、ＣＤ４＋ＣＴＣＬの存在の間には、ＣＤ４＋ＳＣ５＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋p１４０＋Ｔ細胞の両者の存在比率、−これはセザリー症候群（ＳＳ）が疑われる患者から採取された試料から測定されるが、−は本質的に、この患者の末梢血液に現実に存在する悪性のＳＳの存在比率に相当する（ＳＣ５＋ＣＤ４＋細胞は±１０％の範囲内、p１４０＋ＣＤ４＋細胞は±５％の範囲内）。だから、本発明におけるＳＣ５及びp１４０マーカーはＳＳの進行状況を評価できる共通の特別な特徴を共に有する。
【０００５】
発明者の知る限りでは、ＳＣ５及びp１４０分子は共通の技術的特徴を有する最初の分子である。本発明は、かくして、新規なＣＴＣＬに共通のマーカーを提供する。これより以前には、このようなＣＴＣＬに共通のマーカーは知られていない。これらに最も近似するこの種のものは、ＣＤ３０であって、このものの、悪性のＣＤ４＋Ｔ細胞の表面での存在は、患者がＣＤ３０＋リンパ腫に関連するＣＤ４＋ＣＴＣＬの特殊型を有していると結論付ける。それ故、ＣＤ３０はＣＴＣＬのマーカーであるが、その信頼性はＣＴＣＬの特殊型（ＣＤ３０＋リンパ腫）に限られる。そして、ＣＤ３０はＣＤ４＋ＣＴＣＬの全ての型をカバーしない。即ち、ＳＳ、形質転換型ＭＦまたはＬＰのようなＣＤ４＋ＣＴＣＬでは、表面でＣＤ３０を発現する悪性ＣＤ４＋Ｔ細胞は必ずしも存在しない。ＣＤ３０を使用したＣＴＣＬの診断及び治療は、このように、ＣＴＣＬの特殊型に限られる。それに対して、本発明のマーカーはＣＤ４＋ＣＴＣＬの全範囲を好適にカバーする。
【０００６】
p１４０と共有する技術的特徴に加えて、ＳＣ５は、更に、非増殖性のＴ細胞の増殖及び／または機能的活性（例えば、サイトカインプロフィール）の肯定的指標を有する。Ｔ細胞表面のＳＣ５の存在は、事実、正常（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）Ｔ細胞またはウイルス感染ＣＤ４＋Ｔ細胞のような非腫瘍性Ｔ細胞の活性状態に肯定的に関連する。ＳＣ５は、かくして、また、ＨＩＶ感染症、及び自己免疫性（例えば、脊椎関節炎のようなリューマチ性関節炎または乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎のような免疫関連性皮膚病）のようなＴ細胞ウイルス性感染症の診断及び治療のための新規手段として有効である。ＳＣ５は、また、グラフト宿主反応を調節するための有効な標的である。即ち、ＳＣ５の活性化は、エフェクター宿主細胞をグラフトに対して進展させる反応を阻害するために使用できる阻害性シグナルを伝達する。
【０００７】
本発明は、また、ＳＣ５新分子に結合できる産物を提供し、特に、ＳＣ５に対するモノクローナル抗体（抗ＳＣ５mＡbs）を提供する。また、Ｔ細胞、特に悪性ＣＴＣＬ細胞のような腫瘍性Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性の調節ができる抗ＳＣ５モノクローナル抗体を提供する。特に、ハイブリドーマＩ−２５７５で産性されたモノクローナル抗体は、Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性の阻害が可能で、特に有効な特徴によれば、悪性ＣＴＣＬ細胞（下記の例参照）のような悪性Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性の阻害が可能である。ＳＣ５に結合するが、これらを集合させない化合物は、ＳＣ５の阻害性シグナルの伝達を妨げるか、または、化合物がＳＣ５＋細胞（標的マスキング）に到着するのを妨げる。
【０００８】
本発明によれば、一般に、ＳＣ５またはp１４０に結合する化合物は、補体漸増剤、ＡＤＣＣ刺激剤、または、ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫を予防し、一時的緩和し、治療するための治療剤用ベクターとして使用される。
【０００９】
本発明はそれ故に、抗ＳＣ５及び／または抗p１４０モノクローナル抗体及び直接それらから製造された産物（例えば、ヒト化モノクローナル抗体またはＣＤ４−p１４０／ＳＣ５に対する二重特異性を有するモノクローナル抗体）の診断及び治療への使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
２０００年１０月３０日、寄託番号Ｉ−２５７５として、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.（Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.、国立微生物保存機関、パスツール研究所;２５、rue du Docteur Roux、F-７５７２４ Paris Cedex１５、France）に、ブダペスト条約に従がって、寄託されたハイブリドーマを提供し、ハイブリドーマ細胞の好適な代謝条件（例えば、３７℃で３日間、５％炭酸ガス含有湿潤雰囲気下、ＲＰＭＩ１６４０剤：Gibco BRL Cat.N0２１８７５-０３４；１０％牛胎児血清；ぺニシリン１００単位/ミリリットル；ストレプトマイシン１００μｇ/ミリリットルからなる好適な培養液に２．１０6個の細胞を含有したものを使用。）下、ハイブリドーマＩ−２５７５の培養を内容とする、抗ＳＣ５モノクローナル抗体の調製方法を提供する。
本発明は、それ故、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されるか、またはこの寄託されたハイブリドーマの培養上澄み液から得られるモノクローナル抗体（mＡb）を包含する。このmＡbは５種類の抗ＳＣ５ＩgＭである。これは不適当または好ましくないＴ細胞の増殖及び／または機能的活性（サイトカインプロフィール）、不適当または好ましくないＩＬ−２産生の診断及び治療のための有効な手段である。これは正常Ｔ細胞、ウイルス感染Ｔ細胞（例えば、ＨＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞）及び特に、悪性ＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性を阻害する。
【００１１】
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されるモノクローナル抗体は、発明者によってＳＣ５と命名された蛋白質を分離できる。ＳＣ５蛋白質は生化学的、機能的に新規な分子で、見かけ分子量が還元条件下で９６kＤである。これは多くのＰＢＬ細胞中及び細胞上に存在する。即ち、正常細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋部分集合）及び特にＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、正常ＮＫ細胞、Ｂ細胞、顆粒球及びマクロファージ（大食細胞）である。更に、ＳＣ５はＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）及びＣＨＯ−ＫＩ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９６１８）のような他の系統及び他の種の細胞の細胞質中にも存在する。
休眠中の正常ＰＢＬ細胞では、ＳＣ５は主として細胞内に存在する、しかし、ＣＤ３刺激はＳＣ５の細胞膜への移行を誘発する。殊に目立つのは、発明者によって、ＳＣ５が、悪性ＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞、特に悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞で、主として、細胞表面に観られることである（幾ばくかの生体外のＣＤ３刺激なしで）。
【００１２】
更に著しい特徴はＳＣ５の表面発現が、現在まで試験された全てのＣＴＣＬ患者に観られることである（下記例参照）。
本発明の他の更に著しい特徴は、ＳＣ５を共発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の比率が、健常者よりも、腫瘍性ＣＤ４＋Ｔ細胞をもつ患者の方が、統計的に高いことである。ＣＤ４＋ＣＴＣＬの患者におけるＳＣ５＋ＣＤ４＋の比率は、健常者において観察される比率（ＳＣ５＋ＣＤ４細胞の平均標準比率は１〜１５％の範囲内であり、一般には５〜１０％の範囲内である）より有意に高い。
特にセザリー症候群（ＳＳ）のＣＤ４＋ＣＴＣＬの場合、ＳＣ５を共発現するＣＤ４＋細胞の比率は、もっと、統計的に、ＣＴＣＬ患者のＰＢＬにおける悪性ＣＴＣＬ細胞の比率に密接に関連する。即ち、ＳＣ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率は本質的に悪性ＣＴＣＬ細胞の比率と同等である（この比率の±１０％以内）。ＳＣ５蛋白質は、それ故、細胞表面での経膜的な発現が、非腫瘍性Ｔ細胞の活性化及び／または増殖状態に関係があり（例えば、ＨＩＶ感染細胞及び正常ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のようなウイルス感染細胞）、非活性化Ｔ細胞の悪性化状態に関係がある新規分子である。著しい特徴は、ＣＤ４＋ＣＴＣＬが陽性との診断を９０％以上の信頼性で可能にすることである（実際、最新の試験を行ったヒトでは１００％）。
【００１３】
本発明の更に顕著な特徴は、ＳＣ５新分子が、細胞表面で発現されたとき、細胞増殖及び／または機能的活性のための阻害受容体として活動できることである。即ち、ＳＣ５の集合は、それを発現する細胞の増殖及び活性の減少を誘発する。例えば、ハイブリドーマＩ−２５７５により産生される、抗ＳＣ５モノクローナル抗体[５種類のＩg（免疫グロブリンの略語）]は、ヒトまたは動物から採取した、正常ＣＤ３＋Ｔ細胞、または正常ＣＤ３＋Ｔ細胞クローンのようなＳＣ５＋細胞の抗ＣＤ３誘発増殖を阻害し、また、抗ＣＤ３が誘発した、ＣＴＣＬ患者から採取したＣＴＣＬ細胞の試験管内増殖及び動物モデルでのヒトＣＴＣＬ細胞の生体内自然増殖を阻害する。このmＡbは、また、ＨＩＶ感染ＣＤ４＋細胞と結合し、それ故に、感染細胞を殺し、ＨＩＶの増殖を抑制させることを目的とする抗ＨＩＶ薬の実際的原理として有用である。
【００１４】
幾つかのＳＣ５蛋白質の分離可能な方法は、本発明のモノクローナル抗体を製造できる専門家にとって使用できるのものである。標準的な方法は、細胞溶解物からの還元下、親和性クロマトグラフまたは電気泳動による回収からなる。ハイブリドーマＩ−２５７５により産生するモノクローナル抗体が抗原と認識する全てのヒトまたは動物の細胞、あるいは該モノクローナル抗体と細胞溶解物が免疫沈殿反応する全てのヒトまたは動物の細胞は、ＳＣ５分子を分離するための細胞供給源として適当である。そのような細胞には、特に、Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球等の正常細胞（ヒトまたは動物または細胞クローン）を含む。また、悪性Ｔ細胞、例えば、ＣＴＣＬ患者から採取されたＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような腫瘍性細胞、またはＣＴＣＬクローンＨＵＴ７８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）のような腫瘍性クローンも好適な細胞である。好適な細胞源が広範囲なので、粗血球全体またはＰＢＬが何らかの精製を経ずに、直接使用されてもかまわないことが理解される。
【００１５】
正常細胞はＳＣ５の細胞内型及び経膜受容体型の両者を分離できる。ＳＣ５の受容体型またはその部分の分離が望まれるときは、ＳＣ５＋細胞源（例えば、それらの表面でＳＣ５を発現する細胞）を使うのが好ましい。そのような細胞源（ソース）としては、前記されたものであって、細胞表面でＳＣ５発現が増加するように、ＣＤ３刺激されたものが含まれる（下記ＣＤ３刺激法の例参照）。全血球またはＰＢＬがＳＣ５＋細胞の供給源として使用されるとき、全血球またはＰＢＬは、Ｔ細胞及び単核細胞を含有するから、ＣＤ３活性化はＰＨＡ（Wellcome社から入手可能）のような、ポリクローナル活性体の約１μg／ミリリットルと培養することにより誘発される。より均一な正常細胞集団がＳＣ５＋細胞（例えば、ＳＣ５＋のみとＮＫ細胞）の供給源に使用されるときは、ＣＤ３活性化は、好ましくは固定化抗ＣＤ３抗体との培養、または、可溶性抗ＣＤ３抗体及びＰＨＡのようなポリクローナル活性体との培養によって為される。培養段階は、選択的に、ＣＤ３活性化の前及び／または後に、細胞量を増加させるために行なってよい（培養条件は、例えば、ＲＰＭＩ中、１０％牛胎児血清、湿度９５％及び５％炭酸ガス雰囲気）。
ＳＣ５を細胞内型で分離したいときには、ＣＤ３刺激は省かなければならない。
ＣＴＣＬ細胞のような腫瘍性細胞、特に、悪性形質転換ＭＦまたはＳＳ細胞では、生体外ＣＤ３活性化を必要とせずに、受容体型のＳＣ５分子を分離することができる。即ち、ＣＴＣＬ細胞は既に経膜区域でＳＣ５を発現する。
【００１６】
故に、本発明は下記の段階によって得られる分離蛋白質を包含する。
（i）Ｔ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、顆粒球からなる群から選択される細胞を採取する。採取した細胞を固定化抗ＣＤ３抗体、または、可溶性抗ＣＤ３抗体及びＰＨＡの１μg／ミリリットルで刺激するか、または、悪性ＣＤ＋ＣＴＣＬ細胞のような悪性ＣＴＣＬ細胞を採取するか、または、全血球細胞及び末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）からなる群から選択される細胞を採取し、採取した細胞をＰＨＡの約１μg／ミリリットルで刺激する。
(ii) 例えば、TritonX-１００の１%含有の強力な溶解バッファー中での培養によって、多種類のポリペプチド複合体を分離できる条件下に上記細胞を溶解する。
（iii）ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されるモノクローナル抗体が、このモノクローナル抗体が抗原抗体型（例えば、この抗体によって抗原と認められる化合物）の反応を行なうことができる条件下に、結合する蛋白質化合物を溶解物から回収する。
【００１７】
回収された蛋白質化合物のアミノ酸配列は、質量分析のような、なんらかの標準技術によって得ることができる。
上記で示されたように、段階（i）の細胞は活性化細胞であり、それ故に、経膜受容体のときに、ＳＣ５の分離ができる。段階（i）で使用されたＣＳ５のソースが休眠中のＴ細胞（生体外刺激を除く）からなっていれば、このようにして分離された蛋白質化合物はその脂肪質型ＳＣ５であろう。
段階（i）で選択される細胞が活性化された、または、悪性の細胞のときは、段階（ii）の溶解は、それ故に、細胞全体で行なわれるか、または、これらの細胞膜の小部分で行なわれる。
溶解段階自体はその休眠中の多数のポリペプチド複合体の分離技術によって行なわれ得る。例えば、細胞またはその膜小部分はTritonX-１００のような強力な界面活性剤１％含有溶解バッファー中で、１時間、４℃で培養される。これによって、休眠中の細胞成分からの、ＳＣ５蛋白質の分離が行なわれる。もし、ジギトニンの１％またはブリッヂ５８の１％のようなマイルドな界面活性剤が使用されれば、ＳＣ５は、それが自然に結合している、これらの化合物から分離されないであろう。上記段階（ii）でのマイルドな界面活性剤の使用は、だから、ＳＣ５の分離を可能にし、更に、ＳＣ５の形質導入、実施体の分離を可能にする。
故に、本発明は、前記プロセスで得られる化合物を包含する。
次いで、段階（ii）で得られた溶解物は、この抗体が、細胞溶解物含有（例えば、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生された２μgのモノクローナル抗体は、１０7個の溶解物に相当する）マイクロウエルに抗体をコートするような、抗原抗体型反応を行なうのに好適な条件下、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体とともに培養され、次いで、モノクローナル抗体は細胞溶解物とともに２時間、４℃で培養される。
【００１８】
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されるモノクローナル抗体が結合する化合物の回収段階（段階iii）はこの分野のエキスパートにとって熟知の技術で、行ない得る。非還元条件下の回収は、本来の形態のＳＣ５の分離が可能で、ＳＣ５の本来の生物学的特性の維持が望まれるときに行なうのが好ましい。
ＳＣ５蛋白質の非還元条件下での回収の好適な技術は、即ち、親和分離クロマトグラフィ（アフィニティークロマトグラフィー）を含む。好ましくは、濾過前に、濾過を容易にするために、溶解物中の化合物の構造を本質的、部分的に変えて、溶解物を生理学的pＨ、例えば、pＨ６〜８の間の、pＨ７のようなバッファーと混合して、溶解物をハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体（mＡb）が固定されているカラムにより濾過する(例えば、このmＡbを寒天粒に結合させ、この粒を前記カラム内に堆積させる)。カラムを前記生理学的pＨのバッファーで洗い、例えば、本来の化合物の構造を、本質的に変えることなく、mＡbへの化合物の結合をバッファーで攪乱して、溶出させ、固定されたmＡbに結合している化合物を回収する。この溶出バッファーは、通常、弱酸性のpＨ（通常、pＨ２〜５の、例えば、pＨ３）である。抗体分子の通常の方向性を有し、それにより、抗原を高い効率で結合させるマトリックスの調製のため、一段階の精製方法のため、膜蛋白質の分離のために、例えば、Schneider et al.１９８２（J.Biol Chem.２５７:１０７６６〜１０７６９）記載の内容が参考になる。このようにして回収された蛋白質化合物はその本来の構造のＳＣ５蛋白質である。
【００１９】
一方、段階（iii）では還元条件下、段階（ii）で得られた溶解物とハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体とで免疫沈降反応を行なうことができる。このようにして得られた免疫沈降は二十日鼠のＩgＭと結合できる抗体からなるカラムを通して濾過される。ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体に結合する蛋白質化合物は前記と同じ溶出法で回収される。このようにして得られた蛋白質化合物も、また、本来の構造の分離ＳＣ５蛋白質である。休眠中の標準的なＳＣ５蛋白質回収方法[段階（iii）]は、還元条件下の電気泳動法による処理である。これは、特に、四つのステップを包含する。
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体と段階（ii）で得られた溶解物を、このmＡbを抗原抗体型反応させることができる条件下に培養する。かくして、生成した免疫沈降物を採取し、免疫沈降物に含有する化合物を還元条件下に分離し、見掛け分子量９６kＤの蛋白質化合物を回収する。
一方、所望のＳＣ５蛋白質を電気泳動ゲルまたは膜に局在させる方法（続いて、それをゲルまたは膜から分離する）に続いて、溶解に先立ち、細胞の表面ポリペプチド成分をラベルする（例えば、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−biotinによる、１２５ヨードまたは蛍光ラベリング）、ラベリングステップが行なわれる。そして、免疫沈降物からラベルを帯びたこれら化合物を回収する。もし、ラベリングステップが溶解の後に行なわれれば、ＳＣ５の細胞内型及び経膜受容体型の両者が分離されることに注目しなければならぬ（この場合、前記のように、非活性化Ｔ細胞がＳＣ５源として使用され得る。）。変性条件が使用されるから、このようにして得られた蛋白質化合物は、本来の構造ではない。即ち、まだ、本来のアミノ酸配列ではあるが、本来の生物学的特性が失われている。しかし、本来の構造ではないＳＣ５蛋白質が観察され（調べられ）、試験される生物学的試料が変性条件下（例えば、皮膚サンプルのパラフィン薄片）に処理されたときに、本来の構造ではないＳＣ５蛋白質が観察される（調べられる）。本来の構造ではないＳＣ５蛋白質は、それ故、モノクローナル抗体の産生に直接使用され、このような、モノクローナル抗体は変性サンプルのＳＣ５検出に有用である。もし、本来の構造のＳＣ５蛋白質が所望されれば、変性蛋白質の少なくとも１０アミノ酸区分が配列され（例えば、質量分析で）、上記配列区分から理論的に導かれたオリゴヌクレオチッドが合成され、試験的に、ＳＣ５＋細胞から得られるcＤＮＡライブラリー（ＤＮＡコレクション）からのスクリーニングに使用される。このようにして選択されたcＤＮＡが、産生及び、好ましくは、クローン培養によるcＤＮＡコード化産物の排出が可能な条件下、産生され、クローン化される[例えば、ヴァキュロウイルスベクターヘのＳＣ５コード化cＤＮＡの挿入、昆虫細胞、例えば、Sf９細胞の形質転換により、または、ワクチンウイルス及びＥＢＶ細胞により、Rindis Bacher １９９５、J.biol. Chem. ２７０(２３):１４２２０〜１４２２８]。
【００２０】
故に、本発明はその配列が以下のようにして得られる分離蛋白質を包含する。
全血液細胞及び末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からなる群から選択される細胞を採取する。採取した細胞をＰＨＡの１μｇ／ミリリットルで刺激する。刺激された細胞をビオチンのようなポリペプチド特異性ラベルでラベリングする。ラベルされた細胞をTritonX-１００の１％含有溶解バッファー中で、培養して溶解する。溶解物をハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体で免疫沈降させる。免疫沈降物から、ラベリングされた蛋白質化合物を回収する。このようにして得られた蛋白質配列をコード化するcＤＮＡを合成する。昆虫細胞にこのcＤＮＡを、導入させる（transfection：transformationとinfectionの合成語、細胞へ外来ＤＮＡ断片を導入すること）。導入された細胞、例えば、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体で、産生された蛋白質を回収する。
または、以下のようにして得られる。
全血中細胞及び末梢血中リンパ球（ＰＢＬ）からなる群から選択される細胞を採取する。採取した細胞をＰＨＡの１μｇ／ミリリットルで刺激する。ラベリングされた細胞をTritonX-１００の１％含有溶解バッファー中で、培養して溶解する。溶解物をハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体で免疫沈降させる。免疫沈降物から、還元条件下、見掛け分子量９６kＤの蛋白質化合物を回収する。このようにして得られた蛋白質配列をコード化するcＤＮＡを合成する。昆虫細胞にこのcＤＮＡを導入させる。導入された細胞、例えば、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体で、産生された蛋白質を回収する。
【００２１】
本発明は前記プロセスによって得られる分離蛋白質化合物、同様に、その分離蛋白質化合物のアミノ酸配列、及び分離蛋白質の配列を包含する。
【００２２】
本発明の蛋白質化合物または蛋白質が配置される固体サポートが本発明の範囲内に含まれる。そのような固体サポートは特にセファロース粒を含む。
【００２３】
本発明は、また、その配列が本発明の分離蛋白質をコード化する分離ＤＮＡ（またはcＤＮＡ）を包含する。これは、また、ＤＮＡを導入することにより作り変えられた細胞、本発明の分離蛋白質を排出する、作り変えられた細胞及び前記作り変えられた細胞の培養液から分離された分離蛋白質に関する。
【００２４】
本発明は特に、以下の段階から得られるcＤＮＡを包含する。
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体が結合する細胞からなる細胞集団を採取し（例えば、それに対しては、このmＡbが抗原と認められる）、または、その溶解物がこのモノクローナル抗体と免疫沈降反応するような細胞で、例えば、全血中細胞及びＰＢＬからなる群から選択される細胞を採取する。
もし、ＳＣ５の単独の経膜型が所望されるときは、前記細胞集団が主として、非活性化細胞から構成されていれば（例えば、休眠中の非腫瘍性細胞）、ＳＣ５発現が細胞表面で増加するように、例えば、採取された細胞集団をＣＤ３活性化体（例えば、ＰＨＡのようなポリクローナル活性化体の１μg／ミリリットルを、採取された細胞集団がＰＢＬまたは全血液または固定化、抗ＣＤ３抗体またはＰＨＡのようなポリクロナール活性化体及び抗ＣＤ３抗体の両者であり、採取された細胞集団が、ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ４５ＲＯ＋細胞またはＮＫ細胞またはマクロファージまたは顆粒球から、主として、構成されている細胞集団のようにより均一であるときは、）と培養することによって、ＣＤ３経路を刺激する。
もし、採取された細胞集団が主として、活性化細胞（ＣＤ３活性化非腫瘍細胞）から構成されていれば（例えば、休眠中の非腫瘍性細胞、またはＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような腫瘍細胞）、そのときは、ＣＤ３刺激は、ＳＤ５の存在が、これら活性化細胞において、既に、主として、経膜的になっているため不要である。
もし、ＳＣ５の細胞内型及び経膜型の両者が所望されるときは、非活性化細胞が好まれ、ＣＤ３活性化は省略される。
前記細胞集団からのトータルmＲＮＡ集団の抽出及び精製（mＲＮＡの抽出及び精製に使用できる市販キットの例：polydT column）。
各相補的cＤＮＡの合成（逆転写酵素で、例えば、Seed B及びArrufo A １９８７、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８４:３３６５〜３３６９、に参考文献が収録されている。）。
このクローンのcＤＮＡの発現が可能になるように、好適なクローン培養条件で各cＤＮＡのクローン化を行い、各クローンを培養する。
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体が抗原抗体型反応を行なうのに好適な条件下に、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体が結合する化合物を発現するクローンを選択し、及び／または溶解物がハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体と免疫沈降反応を行なう化合物を発現するクローンが選択される。
このようにして選択されたクローンを選択的に増幅し、選択されたクローンから挿入されたcＤＮＡを回収する。
【００２５】
このようにして回収されたcＤＮＡは本発明におけるＳＣ５cＤＮＡであり、標準的なＤＮＡ配列技術により配列される。
このクローンのcＤＮＡの発現が、好適なクローン培養条件で、各クローン培養によって、可能になるように、各cＤＮＡのクローン化が、専門家にとって実施可能な、通常のクローン化法によって行なわれる。クローン化法の１例は、宿主細胞のcＤＮＡの発現のために好適なプロモーターの制御下に、トランスフェクション（遺伝子導入）ベクターに各cＤＮＡを挿入し、宿主細胞にトランスフェクション（遺伝子導入）ベクターを導入し、cＤＮＡを導入された宿主細胞を、それらの代謝に好適な条件で培養する。好適なトランスフェクションベクター及び宿主細胞はBaculoウイルスのようなウイルス及び昆虫細胞（Sf９細胞）のような宿主細胞またはベクターとして牛痘ウイルス、宿主細胞としてＥＶＢ細胞（Rindis Bacher reference supra 参照）。
このようなcＤＮＡは細胞への導入及びこのようにして得られたクローンからのＳＣ５の産生に使用される。これはまた、本来のＳＣ５mＲＮＡの同定及び分離の試験に使用される。
【００２６】
故に、本発明は、また、本発明におけるcＤＮＡに相補的の、前記mＲＮＡ集団から選択可能な分離mＲＮＡを包含する（例えば、前記cＤＮＡに下記の文献記載の厳密な条件下、ハイブリダイズするmＲＮＡの選択によって、Freemann G.J.etal.１９９２ J.Immunol.１４９:３７４５）。前記細胞集団の全mＲＮＡ集団からの回収する試みとして、本発明における分離cＤＮＡを使用して、得られる分離mＲＮＡを包含する。このmＲＮＡは抽出されるcＤＮＡに相補的である。一方、通常の技術の一つが、選択されたクローンから回収されるcＤＮＡを直接配列化し、この配列からmＲＮＡの配列を導き出す。
【００２７】
本発明は、また、本発明における分離されたmＲＮＡをコード化するＤＮＡを包含する。特に、ゲノムバンク（www.ucsc.edu.のような）の上記ＳＣ５cＤＮＡにマッチするゲノムＤＮＡの調査によって、得られるゲノムＤＮＡを包含する。
【００２８】
本発明は、また、本発明における、cＤＮＡ、mＲＮＡまたはＤＮＡが導入された工学的細胞を包含する。
【００２９】
本発明は、また、ＳＣ５特異性試料及びプライマーを包含する。そのような試料及びプライマーは専門家にとって、使用可能な技術によって得られる（例えば、候補配列として、ＳＣ５配列の特異な部分を選択し、これらＤＮＡ／ＲＮＡバンクの候補配列をＳＣ５以外の細胞受容体の配列と対比し、前記対比後、ＳＣ５配列が特異であると見なされる、及び／または、前記対比後、ＳＣ５配列の鎖長が特異であると見なされる候補配列を選択する）。
【００３０】
本発明の範囲内の発明には、cＤＮＡ、mＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを担持するいかなる固体支持体も含まれる。このような固体は特にＤＮＡチップまたはＤＮＡ微小球を含有する。
【００３１】
本発明は、また、本発明に記載される分離cＤＮＡ、mＲＮＡまたはＤＮＡによってコード化された分離蛋白質を含有する。
【００３２】
更に、休眠中の正常な細胞との対比で、ＣＴＣＬ細胞に固有である部分である限り、本発明は、本発明の蛋白質のあらゆる分離部分を含む。特に、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.に寄託番号Ｉ−２５７５として寄託されているハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体によって確認されている部分を包含する。また、前記部分が前記細胞によって発現され、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたmＡbによって接触されたとき、この部分が、正常細胞のＣＤ３誘発増殖の調節（阻害または刺激）を誘発でき、及び／または、ＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞の生体内増殖の調節を誘発でき、及び／または、正常Ｔ細胞または悪性Ｔ細胞のＩＬ−２（インターロイキン−２）産生の調節を誘発できる、ような形態の発明の蛋白質化合物の分離された部分を包含する。特に、この部分が、経膜部分で、悪性Ｔ細胞によって発現され、休眠中の非腫瘍性細胞によって、細胞質小球内で、発現される分子の一部であるような形態の発明の蛋白質化合物の分離された部分を包含する。本発明は、特に、本発明におけるＳＣ５蛋白質の酵素的開裂によって得られるポリペプチド断片のバンクに関与する。好ましい酵素は、Tyr、Phe、Trpレベルを開裂するセリンエンドペプチダーゼ（例えば、α−キモトリプシン）、グルタミン酸及びアスパラギン酸のＣ末端での開裂を行なう酵素のような、蛋白質分解酵素から構成される。例えば、Shesberadaran and Payne １９８８、 Proc.Natl.Acad.USA ８５:１〜５参照、この内容はここでも、参考として組込まれている。ＳＣ５ポリペプチド断片のバンクは、質量分析のような特別な分析に使用される。このような分析は、ポリペプチドバンクを特徴によって分類するのに使用され、ＳＣ５の特徴であり、ＳＣ５の検出に使用されるポリペプチドのプロフィールを示す。本発明はこのような用法及びプロフィールを包含する。
本発明は、特に、本発明のＳＣ５蛋白質化合物の細胞外、経膜部及び内部細胞質部分を包含する。受容体分子の細胞外、経膜部及び内部細胞質部分の決定は好適な技術に従がって、専門家によって為され得る。これらは分子全体において、グリコシルサイト（細胞外部分）を含む領域、疎水性（経膜部分）領域及び親水性領域、（内部細胞質領域）の同定によって、同定され得る。そして、それらは開裂または合成によって分離され得る。
本発明の蛋白質化合物の細胞外部分を分離する一つの方法は、前記のように、蛋白質化合物全体を処理するもので、これに、分子全体から細胞外部分を開裂させるために酵素処理の段階を付加する。この開裂のための好適な酵素としては、前記のように、Ｖ８プロテアーゼまたはα−キモトリプシンが含まれる。
【００３３】
このように、本発明に包含されるポリペプチド化合物は以下のようにして得られる。
前記した、例えば、ＰＢＬまたは全血液細胞のようなＳＣ５細胞源を採取する。
もし、ポリペプチド化合物が細胞表面で自然に発現されるときの形態で、分離されることを望むときは、または、採取されたＳＣ５細胞源が、主として休眠中の正常細胞を構成するときは、例えば、適当なＣＤ３活性化体と共に培養して（例えば、ＳＣ５源が全血液細胞またはＰＢＬであるとき、ＰＨＡ１μｇ／ミリリットルによる培養)、ＣＤ３経路を刺激する。そして、例えば、ビオチン（全細胞表面のラベリング）のようなポリペプチド特異性ラベルで該細胞をラベリングする。
そして、マルチポリペプチド複合体を分離するために、ＳＣ５細胞源（例えば、ＰＢＬまたは全血液細胞）を、例えば、Triton X-１００のような強力界面活性剤の１％からなる溶解バッファー中での細胞培養により、溶解する（それによって、自然に結合したトランスデューサーとエフェクターからＳＣ５を分離回収する）。
該溶解物を酵素による消化してＳＣ５を部分に解裂させる。例えば、Ｖ８プロテアーゼまたはアルファ−キモトリプシンからなる群から選択される酵素である蛋白質分解酵素で該溶解物を培養する。そして、該溶解物を、ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体と免疫沈降反応を行わせ、該免疫沈降物からラベルを帯びたポリペプチド化合物を回収する。
回収された化合物は、完全なＳＣ５細胞外部分または、完全なＳＣ５細胞外部分の一部であるＳＣ５部分であるか、または、そのようなＳＣ５細胞外部分を構成するものである。このようにして得られるポリペプチド化合物のセットがＳＣ５細胞外部分バンクを構成する。そのようなバンク及びその医療的使途、例えば、Ｔ関連疾病（例えば、質量分析による）の診断のための使用は本発明の範囲内にある。
この分野の通常の専門家は、その溶解及び酵素的消化を一段階で達成できることを知っている。
細胞全体のラベリングは、細胞外部分、または、細胞外部分の一部、または、その部分を構成するＳＣ５部分を同定するために、細胞溶解に先だって為される。
【００３４】
本発明は、また、本発明の蛋白質の部分を構成する分離された化合物を包含する。
【００３５】
本発明の抗体（mＡb）は、この抗体が結合するＳＣ５エピトープの同定が可能である。通常の強制された突然変異誘発のような技術が好適である（例えば、Chang H.C.et al. １９８９、J.Exp.Med.１６９:２０７３〜２０８３、参照、この内容は本発明の明細書に参考として組み入れてある。）。
【００３６】
本発明の蛋白質及び本発明によるその部分、及び、特にその細胞外部分は、それらに対するモノクローナル抗体の産生を直接できるようにする。そのようなモノクローナル抗体の例はハイブリドーマＩ−２５７５で産生される。本発明のモノクローナル抗体はＳＣ５の検出、ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫の診断に有効であり、且つ、正常ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞；ＨＩＶ感染Ｔ細胞、ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫、の如き、ウイルス感染Ｔ細胞；のようなＴ細胞の好ましくなく、または不適当な増殖、及び／または活性、の調節体として有効である。
故に、本発明は以下の手段により得られるモノクローナル抗体を包含する。
（i）本発明の蛋白質または上記で既定したその部分に対して或動物に免疫性を与える。
（ii）この動物の脾臓細胞からハイブリドーマを産生し、これを培養してその培養上澄み液中にモノクローナル抗体を産生させる。
（iii）段階（i）の免疫源として使用される蛋白質または蛋白質部分に結合し得、且つ、下記のような特性からなる群から選択される少なくとも一種の特性を有する抗体の上澄み液中での存在を調べる（評価する）。
主として細胞質分画中で休眠中の非腫瘍性Ｔ細胞に結合し、且つ、主として細胞表面で悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞に結合する。
Ｔ細胞のＣＤ３活性化経路を調節する。
Ｔ細胞からのＩＬ−２産生を調節する。
Ｔ細胞のＣＤ３誘発増殖を調節する。
ＣＤ３誘発の、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞の試験管内増殖を調節する。
動物中、好ましくはヒト中の、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような、悪性Ｔ細胞増殖を調節する。
ハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたモノクローナル抗体のような本発明のモノクローナル抗体との、本発明の蛋白質への結合または上記で規定したその部分ヘの結合についての競合、及び、特に、該蛋白質の細胞外部分との競合。
（iv）所望の抗体を産生するハイブリドーマの選択及びクローン化。
（v）上記クローンの上澄み液かの抗体の回収。
【００３７】
ハイブリドーマの産生は通常の技術で行なわれる。これは、前記動物からの脾臓の除去、脾臓細胞の懸濁液の調製、脾臓細胞を骨髄腫細胞と共に溶融プロモーターの存在下で溶融する過程、溶融細胞を別の容器で、非溶融細胞を生育させない培養液で希釈、培養する過程からなる。本発明は前記免疫化動物から採取される腹水をも包含する。
段階（iii）でＴ細胞及び悪性Ｔ細胞は標準法でヒトから採取される。一方のクローンはＣＤ４＋ＣＴＣＬＨＵＴ２８細胞系（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）などが使用され得る。ＣＤ４＋腫瘍の場合は、試料はＣＤ４＋腫瘍細胞を表示する体の部分から採取される（ＳＳにあたるＰＢＬ、形質転換ＭＦにあたる皮膚紅皮症、等）。前記諸特性は、この分野の通常の知識を使用して、専門家によって容易に評価され得る。段階（iii）で挙げられた諸特性の評価のための好適な実験条件の例は、以下の例で見出すことができる。この分野の通常の知識を有する者が、それらを特異な細胞または使用濃度に是正する。細胞増殖の調節は増殖の刺激及び阻害と異なる。ＣＴＣＬ細胞が使用されたとき、増殖阻害は治療用の本発明のmＡbは、診断または治療用であるか、またはその両方であるところの全ての抗ＳＣ５mＡbsである。例えば、蛋白質精製用担体、または、これらができる調節特性の行使用担体のような担体に、これらのmＡbの一種または複数種を固定することが所望される用途がある。本出願は本発明のmＡbが固定される担体を包含する。そのような担体には、特に、親和クロマトグラフのカラム用の好適なものが包含される（例えば、寒天粒）。
【００３８】
本出願は、また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、ＶH、ＶL、Ｆab、Ｆ(ab')２、ＣＤ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３から選択される本発明のmＡbの断片（抗ＳＣ５断片）を含む。本出願は、該断片を含むあらゆる化合物、すなわち、あらゆる抗体を含む。本出願は、特に、少なくとも、上記断片を含むヒト化抗体に関する。ヒト化抗体の産生技術は先行技術で広く述べられている（Farah et al.１９９８、Crit.Rev.Eucaryote Gene Exp.Vol.８ pp ３２１〜３４５、参照、この内容は参考として本明細書に組込まれている）。
それは、特に、化合物、及び特に、少なくとも、一つの、ここで規定された抗ＳＣ５断片及び、また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、ＶH、ＶL、Ｆab、Ｆ(ab')２、ＣＤ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３各断片からなる群から選択された少なくとも、一つの、抗ＣＤ４断片からなる、抗体及びヒト化（人体に適応させた）された抗体に関する（例えば、WO９４／１３８０４、多価、多特異性結合蛋白質及びその製造方法、発明者：Holliger et al.出願人：ケンブリッジ抗体技術有限会社及び医療調査協議会、参照；また、Merchant et al.ヒトの二特異性IgG、Nat.Biotechnol.１９９８ vol.１６ pp ６７７〜６８１、参照）。
【００３９】
先に示したように、本発明は通常の一般的発明構想で結びつく二つの分子、即ち、ＳＣ５及びp１４０を提供する。ＳＣ５は、新規分子で、既に、十分に述べた。p１４０分子は従来技術で、ＮＫ細胞のサブグループ及び健常者（非癌性）からのＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞によって発現される阻害受容体として述べられている。本発明は、p１４０が悪性Ｔ細胞、特に、ＣＴＣＬ細胞によって発現され、新規なp１４０対立遺伝子型（下記例３のクローン２４；ＳＥＱ IＤ Ｎo.１）を提供し、新規蛋白質（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２）をコード化する。この新規な対立遺伝子型のcＤＮＡ及びアミノ酸配列を以下に示す。
【００４０】
ＳＥＱＩＤ Ｎo.１
【００４１】
【００４２】
ＳＥＱＩＤ Ｎo.２
【００４３】
【００４４】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３
前記のp１４０対立遺伝子型（クローン１．１）のＤＮＡ及びアミノ酸配列を下記に示す。
【００４５】
【００４６】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４
【００４７】
【００４８】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１はＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３と５つの部分で異なる。
得られたＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２は先行技術で開示されたp１４０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４)と四個のアミノ酸置換の種類が異なる（その位置を太いアンダー系で目印する）。即ち、２０位のＱの代わりにＲが、９２位のＬの代わりにＶが、１０２位のＴの代わりにＰが、４０１位のＰの代わりにＬが示されている（図１１参照）。
この出願は、配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１及び／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３であるか、またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１及び／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３から構成される化合物を包含する。また、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１に相補的であるmＲＮＡ及びＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２をコード化するゲノムＤＮＡを包含する。
【００４９】
好適なp１４０蛋白質産生技術はこの分野の専門家が使用し得るものである。この技術は培養液中でp１４０蛋白質が産生されるように加工された細胞の産生を特に含む。そのような技術の一例は、以下の過程よりなる。ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.３をヴァキュロウイルスベクターに挿入し、このベクターで、Sf９細胞系のような昆虫細胞を移入し、培養液中の産生されたp１４０蛋白質を回収する（培養液を、例えば、セファデックスカラムのようなカラムで濾過、蛋白質化合物がその分子量の函数として、次いで、１４０kＤ溶出物の分離）。
生理学的条件下（生体内または生体内を偽装する試験管内の条件下）で、p１４０に結合可能な化合物については既に記載した。そして、好適な、この分野の専門家により、使用可能な技術により得ることができる。経膜受容体部分（例えば、前記細胞の二層リピッドの上層にあるＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２及び／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４部分の認識）で、細胞により発現されるとき、p１４０に結合する化合物、ここで言う、前記生理学的条件下、p１４０分子を抗原（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２及び／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４）として認め得る化合物、によって、為される。
そのようなp１４０に結合する化合物は、特に、ＨＬＡ−Ａ１１及びＨＬＡ−Ａ３分子（天然ＨＬＡ−Ａ１１リガンド）及び特に、Ｆc−ＨＬＡ−Ａ１１のような溶融蛋白質及びＦc−ＨＬＡ−Ａ３のような溶融蛋白質から構成される。
p１４０に結合する化合物は、また、p１４０抗血清から構成される（ウサギのような動物にp１４０に対する免疫性を与え、このようにして産生された抗血清を回収する。付加的な免疫精製段階は、抗血清中のp１４０の濃度を増加させるためのもので、例えば、p１４０カラムによる濾過による）。休眠中の、p１４０に結合する化合物は、例えば、ＡＺ１５８、Ｑ６６、Ｑ２４１のようなPende et al.１９９６ (J.Exp.Med.１８４:５０５〜５１８)に述べられている、p１４０ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４に対するモノクローナル抗体で構成される。そのような抗ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４mＡbsとしては、また、新規なＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２が抗原として認められている。
mＡb産生に使用可能な技術は、抗p１４０mＡbs産生にも好適である。そのような技術の一例は以下の段階からなる。
（i）或動物にp１４０に対する免疫性を与える。
（ii）この動物の脾臓細胞からハイブリドーマを産生し、これらの培養液上澄み中にモノクローナル抗体を産生するために、これらを培養する。
（iii）段階（i）で免疫源として使用されるp１４０分子に結合でき、休眠中の良性Ｔ細胞には、主として、その細胞質小球に結合でき、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞には、主として、その表面に結合する抗体の、上澄み液中における存在を評価する（測定する）。
（iv）所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、クローン化する。
（v）前記クローン上の上澄み液から抗体を回収する。
好ましいp１４０結合化合物は抗ＣＤ４実在物（例えば、二特異性mＡb）を構成する。
p１４０結合化合物はＣＴＣＬ細胞、特に、ＣＤ４＋ＣＴＣＬのような悪性Ｔ細胞の検出に有効である。かくして、これらはＣＤ４＋癌の検出に有効である。これらは、また、以下で述べるポリペプチド系ベクターとしても有効である。
【００５０】
休眠中の観点によれば、本発明では、抗ＳＣ５mＡbs及び本発明の抗ＳＣ５mＡb断片からなる群から選択される少なくとも一つの要素からなるポリペプチド系ベクターが提供される。このようなポリペプチド系ベクターは活性化されたＴ細胞に到達するか、またはその付近の活性、理論的、分子に有効である（例えば、炎症性疾病またはウイルス感染Ｔ細胞または悪性ＣＴＣＬ細胞及び特に、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞などにおいて、観られる活性化されたＴ細胞）。
また、それは、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２及び／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４の細胞外部分に対するmＡbのようなp１４０結合化合物からなるポリペプチド系ベクターに関する。このようなポリペプチド系ベクターは分子送達、または悪性Ｔ細胞、特に、ＣＴＣＬ細胞及び、特に、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞付近に有効である。
分子は、特に、放射性元素または毒素のような細胞死またはアポトーシスを誘発することができる分子からなるＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞に送られて有効な働きをする。そのような分子は、また、カルボキシペプチダーゼのように、抗有糸分裂性のプロドラッグから活性な医薬へと形質転換させることが可能な酵素からなっている。そのような酵素を運ぶポリペプチド系ベクターは、その際、抗有糸分裂性のプロドラッグの組み合わせによって有効に使用される。本発明はそれ故、そのようなベクター及び抗有糸分裂性のプロドラッグからなる医薬品キットを包含する。
これら隣接する細胞から前記悪性Ｔ細胞への抗腫瘍効果を誘発する作用力によって、悪性Ｔ細胞の付近にある細胞の免疫機能を刺激することができる分子、特に、構成するＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞の近傍に送られて有効に働く分子がある。そのような分子の例は、特に、γインターフェロンのようなサイトカイン及びＩＬ−２（例えば、Xu et al.２０００,Cancer Research ６０:４４７５〜４４８４参照）のようなインターロイキンである。
本発明のポリペプチド系ベクターが、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のようなＣＤ４＋細胞を標的にしようとするときは、更に、抗ＣＤ４体を含むことが好ましい。
【００５１】
本発明は、また、前記ポリペプチド系ベクター、特に、前記ポリペプチド系ベクター含有薬剤で構成される医薬品組成物を包含する。そのような薬剤は不適当または好ましくないＴ細胞の増殖及び／または機能的活性（好ましくないＩＬ−２の産生を含む）の制御に有効である。それらは、特に、不適当な免疫活性、の予防、一時的緩和、軽減、または治療；及び、特に、ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫、及び、特に、ＣＤ４＋ＣＴＣＬの妨害及び阻害に有効である。不適当なＴ細胞の増殖及び／または機能的活性の予防、一時的緩和、軽減、または治療を目的とする、薬剤製造のためのこのようなベクターの使用、及び、ＣＴＣＬの増殖の妨害及び阻害は、本出願の一つの目的である。
【００５２】
ＳＣ５に生理学型条件下結合する化合物はＳＣ５の活性を刺激するためのＳＣ５リガンド作用物質として使用可能であり、このＳＣ５分子は細胞阻害受容体として関与する。そのような抗ＳＣ５化合物は、即ち、抗ＳＣ５抗血清、本発明の抗ＳＣ５mＡb、本発明のFab、F(ab')２断片、本発明の人体に適応するmＡbsからなる。ＣＤ４＋細胞が特別に関与するときは、前記抗ＳＣ５化合物は、更に、幸便に、抗ＣＤ４体を含有する。
抗ＳＣ５化合物は、特に、ＳＣ５＋細胞の不適当または好ましくないＴ細胞の増殖及び／または機能的活性の調節に有効である。これらは、Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはウイルス感染Ｔ細胞（例えば、ＨＩＶ感染ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＣＬ細胞及び特にＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような悪性ＣＴＣＬ細胞の増殖の調節に有効である。これらはＴ細胞からのＩＬ−２の産生にも有効である。Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.に寄託番号Ｉ−２５７５で寄託されたハイブリドーマによって産生されたmＡbが使用されたとき（５種類のＩgＭ）、この調節は阻害の方に傾く。故に、ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫の阻害に特に好適である。この出願は活性成分として少なくとも一つの抗ＳＣ５化合物からなる薬剤を包含する。このような薬剤はＴリンパ腫、ＣＴＣＬ、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ）のようなＴ感染、自己免疫型の諸症（例えば、リュウマチ性関節炎、脊椎関節症、または、乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎のような皮膚免疫薬物療法性疾病）のような炎症性疾病の予防、一時的緩和、治療が可能である。このような薬剤は移植改善（移植拒絶反応の抑制）も意図され得る。
【００５３】
本発明は、補体漸増剤またはＡＤＣＣ活性化剤または刺激剤としての抗ＳＣ５化合物の使用を包含する。
前記で規定したp１４０結合化合物は、ＣＴＣＬ及び特にＣＤ４＋ＣＴＣＬのようなＴリンパ腫の予防、一時的緩和、軽減、または治療において、補体漸増剤またはＡＤＣＣ刺激剤または活性化剤として使用され得る。故に、本発明は抗Ｔリンパ腫薬剤、抗ＣＴＣＬ薬剤、抗ＣＤ４＋ＣＴＣＬ薬剤の製造におけるp１４０結合化合物の使用及びその薬剤自体をも包含する。
【００５４】
本発明は開発段階でのＣＴＣＬ（段階化）の評価方法を提供する。即ち、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の患者の体の或一定区分内における比率（例えば、％）が測定できる。この方法によれば、本発明のＳＣ５蛋白質、本発明のＳＣ５部分（特に、細胞外部分）、及びp１４０分子からなる群から選択される一要素をその表面で発現するＣＤ４＋細胞の比率は、前記体内区分から採取された生物学的試料によって測定される。前記体内区分内の現実のＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の比率は、上記で測定された比率と本質的に同等とみなすことができる。それは、通常、この測定値の概略±１０％以内である。
【００５５】
本発明はＣＴＣＬの診断方法をも提供する。そこでは、本発明のＳＣ５蛋白質、本発明のＳＣ５部分（特に、細胞外部分）、及びp１４０分子からなる群から選択される一要素をその表面で発現するＴ細胞の比率は、患者から採取された生物学的試料によって測定され、ヒトの非ＣＴＣＬ（健常者が好ましい）の平均百分率と比較され、前記測定百分率が前記平均百分率より有意に高いとき、ＣＴＣＬ陽性と決定される。
このＣＴＣＬの診断方法は、特に、ＣＤ４＋であるＣＴＣＬに適用される。この場合、測定されたＴ細胞の百分率は、好ましくは、ＣＤ４＋の百分率である。ＳＣ５を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の平均標準比率は、一般に、１〜１５％であり、ヒトの場合で、通常、５〜１０％である。ＳＣ５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の測定百分率が前記平均百分率より高いとき、ＣＤ４＋ＣＴＣＬが陽性との診断が結論される。
ＳＣ５蛋白質またはその部分が関与する限り、本発明の方法は一般に、前記体内区分内にあるＣＤ４＋活性化Ｔ細胞の比率が測定できる。これは移植が拒絶反応を誘発するかどうか、及び自己免疫型の諸症（例えば、脊椎間接症のようなリュウマチ性関節炎、乾癬、湿疹、アトピー性皮膚炎のような皮膚免疫薬物療法性疾病）のような炎症性疾病、の診断及び追跡調査の評価に有効である。前記生物学的試料は内部滑液状でもよい。これは、また、非ＣＴＣＬＴリンパ腫の診断及び監視にも有効である（例えば、ＣＤ４＋ＡＬＬまたはＣＤ４＋Ｔ−ＬＬ）。
【００５６】
本発明のＣＴＣＬの評価／診断方法は全ての種類のＣＤ４＋ＣＴＣＬ、特に、形質転換ＭＦ、ＳＳ、ＬＰ及びＣＤ３０＋リンパ腫に著しく有効である。前記生物学的試料は、例えば、紅皮症（例えば，形質転換ＭＦの疑いある）患者から採取した皮膚試料及び／またはＰＢＬまたは総合血液試料（形質転換ＭＦがより進行性のＳＳのような形に進展したかどうかを評価するために）であってもよい。
ＣＤ４＋細胞表面で検出された要素がＳＣ５化合物のときは、細胞学的観察（腫瘍状細胞学的調査）の（前駆的または将来的）段階は、９０％以上の確度で、現実のＣＤ４＋ＣＴＣＬであるとの決定が為されることが好ましい。p１４０がＣＤ４＋細胞表面で検出されたときは、追加の段階は不要であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面でのp１４０の検出という単純な事実が、直ちに、ＣＤ４＋ＣＴＣＬの陽性診断になる。
【００５７】
本発明は好適な要素、特に下記の各要素からなる群から選択される一要素によって実行され得る。即ち、本発明の抗ＳＣ５モノクローナル抗体、本発明のFab、Ｆ(ab')の２断片、本発明から導かれる人体適応mAb、本発明のＳＣ５細胞外バンク（前記で規定した）、ＳＣ５cＤＮＡ、mＲＮＡ、本発明のゲノムＤＮＡ、本発明で規定されるp１４０結合化合物、p１４０ＤＮＡ、ＳＥＱ ＩＤＮo．１またはＳＥＱ ＩＤＮo．３またはコード化ＳＥＱ ＩＤＮo．２またはＳＥＱ ＩＤＮo．４からなるＤＮＡ。
このような要素はＳＣ５またはp１４０細胞表面の発現の検出手段として使用される。前記検出手段はＳＣ５／p１４０＋ＣＤ４＋細胞を直接一段階で行なうための、抗ＣＤ４含有のものである。
cＤＮＡ／mＲＮＡ物質が検出手段として使用され、このとき、ＣＤ４＋細胞は、前記細胞に現実に存在するＳＣ５またはp１４０をハイブリッド化するmＲＮＡを検出するために、溶解されねばならぬ。このようなcＤＮＡ／mＲＮＡ検出手段は、ＤＮＡチップまたはＤＮＡ微小球のような固体担体上またはその中に施されるのが好ましい。
mＡb物質またはmＡbから導かれる物質は検出手段として使用され、これによって、ＳＣ５またはp１４０の表面発現が検出される。好適な抗体抗原技術は好適なものである。その例は特に流動細胞分析である。
【００５８】
本発明は、また、緩和、予防、軽減、特に、ＣＴＣＬ細胞、及び特に、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞のような、特に、悪性Ｔ細胞の増殖のような、好ましくないか、または、不適当なＴ細胞の活動の治療に有効な化合物の同定方法を包含する。この方法は、前記規定の、ＳＣ５蛋白質、ＳＣポリペプチド化合物、または、p１４０分子（ＳＥＱ ＩＤＮo．２及び／またはＳＥＱ ＩＤＮo．４のような）に結合できる化合物の検出からなることを特徴とする。このような化合物は、前記のように、ポリペプチド系ベクターとして使用される。付加的にＳＣ５化合物に結合するこれら化合物は、細胞表面にこれらＳＣ５分子を集合することができ、ＳＣ５の阻害機能を刺激できる。この同定法を実行する容易な方法は、蛋白質ＡセファロースＣＬ−４Ｂのような固体担体上に、ＳＣ５及び／またはp１４０分子を固定化処理する方法である。この方法を続行するための化合物の候補は、特に、ＳＣ５またはp１４０に対して、免疫性のある血清からなる。
【００５９】
本発明の例を図により説明するが、下記の特別な具体例が、本発明を限定するものではない。この分野の通常の知識を有する者が、二者択一的、試験的に、具体例を実施し、このような、この分野の通常の知識から導かれた具体例は本発明の範囲内にある。通常の知識を有する者は、各種の標準的免疫技術、各種の標準的分子生物学的技術が彼にとって、有効なものであることを評価する（例えば、抗体：実験手引、Ed Harlow、David lane、Cold Spring Harbor Laboratory １９８８;Maniatis １９８２ Molecular cloning:a laboratory manual、Cold Spring Harbor、New York、 Cold Spring Harbor Laboratory；Current protocols in Immunology protocols on CD−ROM、John Wiley、West Sussex、England;Immunological techniques made easy、edited by Olivier Cochet et al.、John Wiley、West Sussex、England；and the publication specifically referred to in the present application）。これら公知文献の内容は参考としてこの明細書に組み入れている。ここに、完全な明細が記載されている、実験における一つの特別な型のＣＤ４＋ＣＴＣＬは、この分野の専門家によって、休眠中の何らかのＣＤ４＋ＣＴＣＬ型に置き換えることができる。
【００６０】
これら実施例では、下記の図が参考のために掲げられている。
図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは健常者のＰＢＬsのＳＣ５分子の細胞膜発現を図解している。健常者のＰＢＭＣを抗ＳＣ５mＡb(腹水１／２００)で汚染させ、次いで、ＦＩＴＣ接合アイソタイプ特殊ヤギ抗マウスＩgＭ２次試薬及び、抗ＣＤ３（図１Ａ）、抗ＣＤ５６（図１Ｃ）及び抗ＣＤ４５ＲＯ（図１Ｂ）のようなＰＥ接合mＡbsの一種で汚染する。二重汚染されたリンパ球通過規制の細胞の比率は下部右象限に示される（図１Ａ：３．３；図１Ｂ：５．１；図１Ｃ：０．６）。この実験は研究１０ドナーの代表である。
【００６１】
図２はＰＢＬsの活性化の間、ＳＣ５分子の細胞膜発現を図解する。ＰＢＭＣは１μｇ／ミリリットルＰＨＡで刺激され、ＳＣ５及びＣＤ６９の発現のカイネチックスはＣＤ３＋細胞と並列に研究された。
図３はＰＢＬのＳＣ５分子の細胞内所在部を図解する。抗ＳＣ５、抗ＣＤ３５、mＡb鎖及び抗ＢＹ５５アイソタイプ適合mＡbが、健常ドナーの透過性及び非透過性の通過規制リンパ球の汚染に使用された。陰を施されたヒストグラムは不適切なコントロールmＡbに対する図示mＡbsから得られたラベリングを表す。
図４ではＳＣ５分子の生化学的分析結果を図解する。ＤＳ６Ｔ細胞クローンはビオチン及び１％Triton X-１００で、表面をラベルされ、溶解物は、抗ＳＣ５mＡbを使用して免疫沈降される。試料はＳＤＳ１０％ＰＡＧＥで還元条件下分析される。抗ＳＣ５mＡbは二種類の濃度、１／２００（レーン２）及び１／５００（レーン３）で使用される。ネガティブコントロールサンプルはヤギ抗マウスＩg単独（レーン１）及びアイソタイプ適合mＡb（レーン４）で免疫沈降させられる。分子量マーカー（kＤ）左に示されている。
【００６２】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄは、抗ＣＤ３誘発増殖及び正常Ｔリンパ球のサイトカイン分泌を、それらの細胞毒活性の影響なしに、抗ＳＣ５mＡbが調節する様子を図解する。即ち、
図５Ａ：ＰＢＬまたはＴ細胞クローンＬＳＯ及びＧＤＳ．３が固定化抗ＣＤ３mＡb（コートされたmＡb１μｇ／源）またはＩＬ−２（５０ＩＵ／ミリリットル）で、抗ＳＣ５mＡb（腹水の、１：２００最終希釈）またはアイソタイプ適合、不適切mＡbの存在で、刺激される。結果は、少なくとも、３通りの実験の代表及び３通りの平均cpm・ＳＤとして表している。
図５Ｂ：ＧＤＳ．３ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは抗ＳＣ５mＡbの異なる濃度の存在下、図示された濃度のプレコート抗ＣＤ３mＡbで刺激される。
図５Ｃ：抗ＳＣ５またはコントロールmＡbの存在下、抗ＣＤ３刺激ＰＢＬの上澄み中のＩＬ−２の分泌は、下記に挙げた物質の存在下、ＩＬ−２依存性Ｔ細胞クローンの増殖の測定によって評価される。上記物質は、（a）剤単独、（b）ＰＢＬ／抗ＣＤ３＋コントロールmＡb、（c）ＰＢＬ／抗ＣＤ３＋抗ＳＣ５mＡb の上澄み。データは３つの代表的実験からの３通りの平均値・ＳＤを表す。
図５Ｄ：細胞毒ＣＤ８＋細胞クローン（ＪＦ１）が、抗ＳＣ５mＡb（腹水の、１：２００最終希釈）またはアイソタイプ適合コントロールmＡbの存在で、Ｅ／Ｔ比が５／１での、ＦcyＲ＋ミューリン腫瘍細胞Ｐ８１５との共培養の前に、培養される。標的の細胞は、表示された抗ＣＤ３の最終濃度で前培養される。結果は３通りの源泉の平均値で示される。
【００６３】
図６Ａ、６ＢはＣＴＣＬ患者のＰＢＬのＳＣ５分子の細胞膜発現を図解する。
８人のセザリー症候群患者、３人の菌状息肉症患者及び８人の健常ドナーの血球の細胞が、ＣＤ４＋リンパ球によるＳＣ５分子の発現のための２色フルオレスッセンスで分析される。
図６Ａ：セザリー症候群患者のＰＢＬのＳＣ５及びＣＤ４分子の共発現を健常者と比較している。
図６Ｂ：ヒストグラムは示された３群におけるＳＣ５発現の平均値を示す。ＳＳ患者と休眠中の２群の間には統計的に有意に差があることが解る（Mann-Witny U test、p＜０.００１）。
図７Ａ、７Ｂ、７Ｃはセザリー症候群患者の悪性細胞の膜表面発現を図解する。
図７Ａ：循環ＴＣＲＶβ２２＋悪性Ｔ細胞クローンの存在で、ＳＳ患者のＰＢＭＣの二色蛍光分析。細胞は抗ＳＣ５mＡbで汚染させ、次いで、ＰＥ接合アイソトープ特殊ヤギ抗マウスＩgＭ及びＦＩＴＣ接合抗ＴＣＲＶβ２２mＡbによる。
図７Ｂ：弱くラベルした、抗ＳＣ５mＡb（陰を付したヒストグラム）ＴＣＲＶ竈２２陽性悪性細胞。
図７Ｃ：同じ患者の細胞を、ＰＥ接合抗ＣＤ６９mＡb及びＦＩＴＣ接合抗ＴＣＲＶβ２２mＡbによって汚染される。
【００６４】
図８は抗ＳＣ５mＡbによるＣＴＣＬ悪性細胞系の抗ＣＤ３誘発増殖の調節を図解する。Pno細胞系は、ＩＬ−７（１０nｇ／ミリリットル）、ＰＭＡ単独（２nｇ／ミリリットル）、固定化抗ＣＤ３mＡbまたはＰＭＡ／抗ＣＤ３mＡbの組み合わせによって刺激される。ＳＣ５mＡbまたはアイソタイプ不適当mＡb（腹水の、１：２００最終希釈）が培養の開始時に添加される。結果は４種の実験の代表及び３通りの源泉の平均cpm・ＳＤとして示される。
図９Ａ、９Ｂは、ＣＴＣＬ細胞系（図９Ａ）のp１４０／ＫＩＲ分子及び新鮮なリンパ球腫瘍（図９Ｂ）の検出を図解する。ダブル免疫汚染流動細胞分析は、Bagot et al.１９９８（Blood ９１：４３３１〜４３４１）及びPoszepczynska et al.２０００（Blood ９６：１０５６〜１０６３）の記載によって行なった。
図１０はp１４０分子の生化学的分析を図解する。即ち、健常者ドナーから導かれたＮＫクローンＡＭ６１（p１４０＋／p７０−）及びPno細胞系及びCou-Lがビオチンで表面をラベルされ、抗p１４０及び抗ＣＤ８mＡbsで免疫沈降される。試料はＮ−グリコシダーゼＦで処理（＋）または非処理（−）され、還元条件下、８％（左パネル）または１１％（右パネル）ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。セファロース蛋白−Ａ単独はネガティブコントロールである。分子量マーカー（kＤ）は右に示される。
図１１は蛋白質でコードされたＫＩＲ３Ｄ cl.２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２）及びcl.１.１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４）のアミノ酸配列を示す。信号ペプチドに一致するアミノ酸は小文字で示し、一方、経膜通過領域は一致する配列にアンダー系を施した。一致配列と同じアミノ酸はドットで示した。
【実施例１】
【００６５】
ＳＣ５の分離、ＳＣ５の生化学的機能的特徴、抗ＳＣ５mＡbsの産生。
Ｔリンパ球免疫応答は抗原特異性クローンを拡大させるポジティブ信号及び抗原自体への過剰な刺激または応答を抑制するネガティブ信号を発する機能的な細胞表面分子によって制御される。休眠中のＴリンパ球の活性化は二つの同一の信号を必要とする。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与によって発される信号は、通常のＴ細胞で応答を発させるために、２番目のポジティブ信号を同伴しなければならぬ。ＣＤ２８はＴリンパ球活性化及びＩＬ−２合成を誘発し、細胞死を阻害するメジャー共刺激性受容体と見なされる。最近の研究はＣＤ３／ＴＣＲ刺激が、ＴＣＲ／ＣＤ３が集合し、且つ、ＤＩＧ結合性の信号導入分子となる、界面活性剤溶解性グリコリピッド強化膜フラクション（ＤＩＧ）またはラフトの再配布に導くことを明らかにしている。ＣＤ２８が、ＴＣＲ関与サイトヘのラフトの再配布を惹起することが発表されている。更に、一連の休眠中の分子は異なる時点で活動し、特別な部分集合に影響し、または明確な実施機能を振興するＴ細胞に同時刺激を与えることができる。Ｔリンパ球の応答のネガティブな規制はＣＤ１５２誘発信号またはＴＮＦ上科受容体メンバーを通しての細胞死に影響され得る。最近、ＮＫ部分集合及びＣＤ８＋リンパ球についての新しいタイプのネガティブな規制が報告された（Lan９９８、Annu.Rev.Immunol.１６:３５９〜３９３）。免疫グロブリン様（ＫＩＲs）またはＣ型レクチン構造はこれらの信号に応じて、ＣＴＬ活性の強化またはサイトカイン産生のような好ましくない実施体機能を阻害する。
さて、我々は、健常者の末梢血球の小集団を詳細に描写する新しい９６kＤ経膜受容体について述べる。抗ＳＣ５mＡbは主として、ＣＤ８及びＣＤ４小集団並びにＮＫ系統の細胞由来のＣＤ４５ＲＯ＋リンパ球を汚染する。我々は、ＳＣ５が、主として、休眠中のＴリンパ球の細胞内小球に局在し、細胞活性化後に、その表面膜発現が急速に増加することを発見した。ＳＣ５分子の関与が、抗ＣＤ３mＡbに誘発される、休眠中のＴリンパ球またはＴ細胞クローンの増殖を阻害した。それはこれら細胞のサイトカイン誘発増殖になんの効果も与えない。同時に、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンに左右されるエファクター細胞毒活性は抗ＳＣ５mＡbによって変更されない。更に、我々は、ＳＣ５＋ＣＤ４＋循環リンパ球の比率が、セザリー症候群（ＳＳ）患者においては、健常者の血中リンパ球に比較して、著しく増加していることを発見した。これは大切なことだが、我々は、セザリー細胞がＳＣ５分子を発現することを明確に示すことができる。更に、我々は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の細胞系におけるＳＣ５分子のライゲーションが、抗ＣＤ３mＡbにより誘発される悪性細胞増殖の強力な阻害をすることを発見した。このように、ＳＣ５分子の発現はＳＳ患者の循環、悪性ＣＤ４＋細胞の存在の検知に役立つことができる。更に、ライゲーションにネガティブ信号を送る細胞表面分子が一致することは病理学的Ｔ細胞の機構の解明の新手段となり、その阻害に使用される。
【００６６】
原料及び方法
抗ＳＣ５mＡの産生
ＳＣ５mＡは出版されているプロトコル（David et al.１９９０;J.Immunol.１４４:１〜６）を使用して、ＮＫ細胞系統Ytindiで６wk old Balb/c miceを免疫化して得られる。ハイブリドーマ上澄み液は、免疫化された細胞系及びPnoと称するＣＴＣＬ細胞系（Poszcepczynska et al.２０００;Blood ９６:１０５６〜１０６３）とともに、間接的免疫蛍光及び流動血球計で、選択的再活性のために濾過された。Pno細胞系が患者のＣＴＣＬ細胞から由来し、ＣＴＣＬ細胞はＣＤ３＋Ｖβ２２＋ＣＤ４＋ＣＤ８αα＋ＣＤ２５フェノタイプを有し、ＩＬ−７０及び抗ＣＤ３mＡbヘの応答として増殖する。ＣＴＣＬ細胞系はこのスクリーンニングに好適である。休眠中のＣＴＣＬ細胞系の例は、ＨＵＴ７８細胞系（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）を含む。反応性上澄み液は、更に、末梢血中リンパ球（ＰＢＬ）との再活性を試験される。ハイブリドーマ上澄み液は腫瘍性細胞系及びＰＢＬ小集団の両者との、その再活性について選別される。ハイブリドーマは二回クローン化され、クローン化ハイブリドーマはプリスタン投与Balb/c マウス（複数）腹水を産生させるために継代接種された。抗体アイソタイプはＩgＭと決定され、抗ＳＣ５mＡbと命名された。腹水はＰＢＳで透析され、限外濾過で滅菌され、更に、１／２００で最終希釈された。このハイブリドーマは２０００年１０月３０日、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.（Collection Nationale de Microorganismes パスツール研究所;２５、rue du Docteur Roux、F-７５７２４ Paris Cedex１５、France）にブダペスト条約（Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.寄託番号I-２５７５）に従がって寄託され、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.寄託番号はＩ−２５７５である。この実施例の抗ＳＣ５mＡbはハイブリドーマＩ−２５７５によって産生されたmＡbに起因する。
【００６７】
患者
インフォームド・コンセントの後、倫理委員会（CCPPRB、Hopital、Henri、Mondor、Creteil、France）の承認を受け、我々は１１人のＣＴＣＬ患者から血液試料を得た。８人の患者は、セザリー症候群に罹っており、１０〜８０％の循環ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−セザリー細胞を有し、３人の患者は形質転換菌状息肉症（ＭＦ）で、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−フェノタイプを有する伝播性皮膚腫瘍と診断されていた。患者全員がこれまで化学療法を受けていなかった。
【００６８】
細胞及び細胞系統
末梢血中モノクロナール細胞（ＰＢＭＣ）はFicoll-Isopaque の技法（Pharmacia、fine、Chemicals、Piscataway、NJ）で、密度勾配遠心分離で、分離される。ヒトＴ細胞クローンＧＤＳ.３（ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋ＣＤ４＋ＣＤ８−）、ＤＳ６（ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋ＣＤ４−ＣＤ８−）、ＬＳＯ（ＣＤ３＋ＴＣＲ聿＋ＣＤ４−ＣＤ８−）及びＪＦ１（ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋ＣＤ４−ＣＤ８＋）がBensussan等、１９８４（J.Exp.Med.１５９:９４７〜９５２）及びYssel et al.１９８４(J.Immunol.Methods ７２:２１９)に記載されているが、これらを８日毎に、同種の放射線照射ＰＢＭＣと共に、下記からなる培養液に供給した。
ＲＰＭＩ１６４０（GIBCO、Paisley、UK）、２mmol／l Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００U/ミリリットル）、ストレプトマイシン（１００mg/ミリリットル）、１０%熱非活性化ヒト血清、５０ＩＵ／ミリリットル組替えインターロイキン−２（γIL-２、Sanofi、Synthelabo、Labege、France）、及び１μg／ミリリットル植物性赤血球凝集素（ＰＨＡ）（Wellcome、Beckenham、UK）。機能的研究は供給７日後に行なわれた。標準的なヒト白血病（患者の）細胞系はマイコプラズマ・フリーで、完全なＲＰＭＩ剤に１０％子牛血清（ＦＣＳ）及び抗体を補強した培養液中で対数函数的な生育カーブを保持した。ヒトＣＴＣＬ細胞クローンPnoは、セザリー患者の末梢血液から得て、これを前記のように培養、保持した（Poszcepczynska et al.２０００;supra参照）。Pno細胞系はＣＤ３＋Ｖβ２２＋ＣＤ４＋ＣＤ８αα＋ＣＤ２５−フェノタイプを有し、ＩＬ−７及び抗ＣＤ３mＡb刺激に応答して増殖する。休眠中のＣＴＣＬ細胞系はＨＵＴ７８細胞である（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）。
【００６９】
モノクローナル抗体及び流動細胞計数の研究
間接的免疫蛍光物汚染ハイブリドーマ上澄み液または腹水液とともに、カルタグ研究所（カリフォルニア州、サンフランシスコ）調製のＦＩＴＣ接合ヤギ抗マウスＩgＭを使用して行なわれた。２色分析には、免疫蛍光汚染が、抗ＳＣ５mＡbと３×１０5個の細胞が、３０分、４℃の培養によって行なわれた。次いで、細胞は洗浄され、ＦＩＴＣ接合ヤギ抗マウスＩgＭ（カルタグ研究所）とともに培養、次いで、ＩgＧアイソタイプのＰＥ−、ＥＣＤ−、ＴＲＩ−接合、特殊mＡbで培養された。汚染細胞の分析はアルゴン単独流動細胞分析計（Epics XL、Bekman-Coulter、Miami、FL）を使用して、(Schiavon V et al.１９９９;Tissue Antigens ５３:２３〜３２)に記載のようにして行なった。細胞内ラベリングには、細胞をＰＢＳ４％含有パラフォルムアルデヒド中で４℃、２０分固定した。次いで洗浄、それから、０．１％サポニン含有汚染緩衝液とともに透過させた。接合抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４５ＲＯ、抗ＣＤ６９及び抗ＴＣＲＶβ２２mＡbsはインミュノテク（Immunotech、Marseille、France）から購入した。
休眠中のmＡbsはBeckman Coulterから入手可能である。即ち、下記のカタログ番号参照抗。
ＣＤ３（ＰＥ）は、細胞分析２０００カタログのＩＭ１２８２、精製抗ＣＤ３は細胞分析２０００カタログのＩＭ０１７８、抗ＣＤ４は細胞分析２０００カタログのＩＭ０４４９、抗ＣＤ８は細胞分析２０００カタログのＩＭ０４５２、抗ＣＤ４５ＲＯは細胞分析２０００カタログのＩＭ１３０７、抗ＣＤ６９は細胞分析２０００カタログのＩＭ１９４３、抗ＣＤ９４は細胞分析２０００カタログのＩＭ２２７６、抗ＣＤ１５８aは細胞分析２０００カタログのＩＭ２２７７、抗ＣＤ１５８bは細胞分析２０００カタログのＩＭ２２７８、抗ＮＫＧ２aは細胞分析２０００カタログのＩＭ３２９１、抗ＢＹ５５は細胞分析２０００カタログのＩＭ２７４５。
【００７０】
ビオチンラベル表面分子の免疫沈降
２×１０7個の細胞が、ＰＢＳ中で２回洗浄され、Sulfo-NHS-LCビオチン（Pier Europe、Interchim、Montlucon、France）（PBS中２mg/ミリリットル）で、２０分、４℃で、表面をラベルされた。ＲＰＭＩ１６４０で２０分間、急冷した後、細胞はＰＢＳで２回洗浄、下記の組成の溶解緩衝液中に１時間、４℃で、再懸濁された。
溶解緩衝液組成：（２０mM Tris-HCl pH ７.５、１５０ mM 塩化ナトリウム、１％ TritonX-１００、１mMナトリウムヴァナデイト、１０mM ＮaＦ、１mM PMSF、１μg/ミリリットルアプロチニン及び１μg/ミリリットルロイペプチン）。それから、ポスト細胞核上澄みが、２時間、４℃で、９６-wellプレート（Maxisorp Nunc immuno-plate）で、ヤギ抗マウスＩgＧ＋ＩgＭ（カルタグ研究所）で予備コートされ、次いで、抗ＳＣ５mＡbまたは抗ＴＣＲβ（抗ＴＣＲβＣ３０５アイソタイプに適合するmＡb、細胞分析２０００カタログのＩＭ１４６６参照；抗ＴＣＲＶβ２２、細胞分析２０００カタログのＩＭ２０５１参照；抗ＴＣＲゼータ、細胞分析２０００カタログのＩＭ３１６９参照；全てはBeckman Coulterから入手可能。）で予備コートされた。免疫沈降物は洗浄用緩衝液（２０mM Tris-HCl pH ７.５、１５０ mM 塩化ナトリウム、０.１％ TritonX-１００、１mMナトリウムヴァナデイト、１０mM ＮaＦ、１mM PMSF）で４回洗浄し、沈降蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用する。ウエスタンブロット分析はストレプトアビジン−パーオキシダーゼ（インミュノテク）とＥＣＬ検出システムをメーカーの推薦（Amersham Pharmacia、Orsay、France）に従がって使用して行なった。
【００７１】
増殖アッセイ
リンパ球活性化のために、ＰＢＭＣを、１μg/ミリリットルＰＨＡ（Wellcome、Beckenham、UK）添加の、１５％ヒト血清含有培養媒体で培養した。増殖アッセイには、５×１０4個の細胞は３通りの９６源泉丸底培養皿（Greiner、Nuertingen、Germany）で、最終容量０．２ミリリットルの培養媒体で行なった。必要なら、培養皿を前記濃度（Poszcepczynska et al.２０００;supra参照）の抗ＣＤ３mＡbで予備コートする。
ＣＴＣＬ細胞系Pnoの刺激のため、予備コートされた抗ＣＤ３mＡbが２ng/ミリリットルホルボール１２β−ミリステート１３α−アセテート（ＰＭＡ、シグマバイオケミカルス）との組合わせで使用される。細胞は４日間培養し、培養の終期の８〜１６時間の間に3Ｈ[ＴdＲ]の１μＣiを適用した。3Ｈ[ＴdＲ]の適用量は液状シンチレーションカウンター（Topcount;Packard Instrument Co,Meriden、CT）で計測した。ＩＬ−２産生量の定量では、１０5ＰＢＬが固定化抗ＣＤ３mＡbで、抗ＳＣ５またはコントロールmＡbの存在下刺激される。培養の３２時間後、ＩＬ−２依存Ｔ細胞クローンから１００μリットルの上澄み液が１０5個の細胞に加えられた。
【００７２】
ＣＤ３誘発・転送・細胞毒アッセイ
転送・細胞毒アッセイは、Le Cleach et al.２０００、Clin.Exp.Immunol.１１９：２２５〜２３０に記載されたように実施した。標的の二十日鼠肥満腫瘍のＰ８１５腫瘍細胞に１００μｌの51Ｃr(２５mCi/ミリリットル)を３７℃、９０分付加し、洗浄、次いで抗ＣＤ３mＡbで、１５分間室温で培養した。エフェクター細胞は抗ＳＣ５mＡb（腹水の最終希釈１：２００）で前培養し、次いで、標的細胞に５：１の比で、添加し、最終容積１５０μｌで、９６源泉Ｖ字型底マイクロ滴定皿で、４時間培養した。遠心分離後、１００μｌ部分標本を51Ｃrの放出量を定量するために、γカウンターで計測した。自発的放出は常に最高値の２０％減であった（１％ＮＰ４０で標的細胞）。特異的51Ｃrの放出量比率はDavid et al.１９８７、J.Immunol.１３８:２８３１〜２８３６に記載のようにして計算した。
【００７３】
統計的分析
この結果の統計的分析は、スタティスティカソフトウエア５．０（StatSoft、Los Angeles、CA）によって行なった。患者とコントロールグループのＳＣ５発現の間の大きな相違は、Mann-Whitney Uテストで評価され、ＳＣ５＋ＣＤ４＋細胞の比率及び患者の末梢血中の悪性細胞の比率の間の関係は、Spearman Rank Order Correlations testによって評価された。
【００７４】
成果
ここに提出する成果はＣＴＣＬ細胞系Pno及び患者から採取されたＣＴＣＬ細胞によって得られたものである。例えば、ＨＵＴ７８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）のような、どのＣＴＣＬ細胞でも同等の実験が行なわれ、同等の成果が得られた。
【００７５】
正常で、休眠中且つ、活性化末梢血リンパ球内のＳＣ５分子の発現。
機能的腫瘍細胞系Pno Ytindiに対して、高められたモノクローナル抗体は、ＣＴＣＬ細胞系Pno（Poszcepczynska et al.２０００、supra参照）及び末梢血中のＴ細胞について、同時反応性が分析された。IgMアイソタイプのＳＣ５特異性mAbは免疫化とＣＴＣＬ細胞系の両者を汚染した。末梢血リンパ球中、抗ＳＣ５mAbは、小集団（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ参照）の輪郭を描いた。抗ＳＣ５mAb反応性分子は、２０％を超えない（平均１０．５％、ＳＤ±５．６）ＣＤ３＋Ｔ細胞の可変比率によって発現される。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球の両者は、抗ＳＣ５mAbで汚染される。個人間の差異（平均１９．４％、ＳＤ±１１．４；表１参照）がより重要ではあるが、末梢血中ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の小集団も、また、抗ＳＣ５mAbで反応する。
【００７６】
末梢血リンパ球小集団におけるＳＣ５の発現。
【００７７】
【表１】
【００７８】
正常ドナー（提供者）のＰＢＬのゲイトリンパ球における、ＳＣ５の、ＣＤ３またはＣＤ５６との、共発現の代表例が図１、１Ａに示される。大部分のＳＣ５が図１、１Ｂに示されるように、活性化／記憶−プールに属することに注意すべきである。ＳＣ５陽性細胞の７０％以上が共発現ＣＤ４５ＲＯである。
試験された全ＩＬ−２依存性Ｔリンパ球クローンでＳＣ５分子の発現が検出されたので、我々はＴリンパ球活性化の間に、表面発現が誘発されたか、どうかを、立証した。我々は、ＰＢＬのＰＨＡによる刺激がＣＤ３＋リンパ球におけるＳＣ５の発現を増加させたことを見出した。ＳＣ%＋Ｔ細胞の比率及びＳＣ５発現のレベル、の両者が、刺激の後に急速に増加する（図２参照）。ＰＨＡの刺激後４時間で、ＳＣ５＋ＣＤ３＋細胞の比率が２倍から３倍に増加し、２４〜４８時間後に最高値に達した。５〜７日の試験管内の刺激の過程で、ＳＣ５発現は基本レベルに戻った。これと並行して、我々はＣＤ６９抗原の活性化の最初の発現を研究し、ＣＤ３＋リンパ球におけるＣＤ６９及びＳＣ５の類似した速動性的プロフィールを観察した。ＣＤ６９分子と異なり、低レベルＳＣ５が既に、刺激前に循環ＰＢＬに存在することに注目すべきである（図２）。
活性化誘導抗原発現はデ・ノボ蛋白質合成または細胞内先在分子の細胞表面排出の何れかの帰結をとる。それ故に、我々は、非活性化透過性ＰＢＬにおけるＳＣ５発現を研究した。図３に示すように、抗ＳＣ５mAbは、非透過性細胞の１６％に対して、透過性リンパ球の９０％以上を汚染する。抗ＳＣ５mAb汚染の特異性が、循環リンパ球の小集団によって発現される、ＧＰＩ固定細胞表面構造を検出する、アイソタイプ適合mAbＢＹ５５を使用して、確認される（Agrawal et al.１９９９、J.Immunol.１６２:１２２３〜１２２６参照）。ＢＹ５５＋細胞の比率は、透過性及び非透過性リンパ球において見出される。細胞内抗原決定基の検出のための陽性コントロールとして、我々は透過性Ｔリンパ球のみをラベルする抗ＣＤ３ζ鎖mAbを使用した。このようにして、ＳＣ５の表面発現は、細胞の活性化状態によってダイナミックに規制され、且つ、Ｔ細胞活性化の間の、その誘発は細胞内プールから表面膜への分子の輸送を振興することになる。
【００７９】
ＳＣ５抗原の生化学的特徴
抗ＳＣ５mAb、ＩＬ−２依存性ＴＣＲγδ＋クローン、ＤＳ６と呼ばれるものによって同定される構造の分子量を特徴付けるために、表面がビオチンによってラベルされ、細胞溶解物が抗ＳＣ５mAbまたはアイソタイプ適合抗ＴＣＲβmAb（陰性コントロールとして）の何れかで、免疫沈降される。抗ＳＣ５mAb還元条件下、見掛け分子量９６kＤで単一分子を確認する。腫瘍細胞系（免疫化Ytindi細胞）が、たびたび、炭水化物抗原決定基（２０、２２）の異常型発現によって、特徴付けられるので、我々は、ニュウラミニダーゼまたは過沃素酸ナトリウムを、公知のシアル化抗原決定基を分解するような濃度で、処理した後の、抗ＳＣ５mAbの、ＳＣ５＋ＮＫ細胞系ＮＫ３．３及びＣＴＣＬ細胞系ＨＵＴ７８（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６１）との反応性を研究した。ＳＣ５の発現は、ニュウラミニダーゼまたは過沃素酸ナトリウムの処理によっては影響されない。このようにして、我々は、抗原決定基の炭水化物の可能性を除外した。
【００８０】
抗ＣＤ３mA誘発Ｔリンパ球の抗ＳＣ５mAbによる増殖の阻害。
正常細胞のＳＣ５分子の可能な機能を調べるために、我々は、抗ＳＣ５mAb単独の効果を、または、固定化、抗ＣＤ３mAbで誘発された、増殖応答の期間にこれを研究した。我々は抗ＳＣ５mAb単独またはＰＭＡとの組み合わせが、末梢血中Ｔリンパ球の増殖を誘発しないことを見出した。興味あることに、溶解性の抗ＳＣ５mAbが固定化抗ＣＤ３mAbと共存しているときは、リンパ球の増殖の著しい阻害が観察された。阻害は、ドナーによっては、アイソタイプ適合の不適切なコントロールmAbの効果に比較して、３３〜６６％の間で変化した（図５Ａ上部参照）。ＳＣ５分子が単球で発現されるので、阻害効果が単球依存性であるかどうかを決めるのに重要であった。我々は、二つのＴ細胞クローン、即ち、抗ＳＣ５mAbまたはアイソタイプコントロールmAbの存在で、抗ＣＤ３mAbによって、刺激される、ＧＤＳ３及びＬＳＯの増殖を研究した。二つのＴ細胞クローンから得られた結果は、ＳＣ５分子の結合は、抗ＣＤ３mAbヘの増殖を阻害する結果となることを示した（図５Ａ下部参照）。抗ＳＣ５mAbのＴ細胞増殖の阻害効果はその濃度及び拮抗的、抗ＣＤ３mAbの濃度に依存したことに注目すべきである。抗ＳＣ５mAbで得られた阻害は、Ｔ細胞が普通に希釈された抗ＣＤ３mAbで刺激されたときにのみ、著しいものだった（図５Ｂ参照）。このような阻害挙動は抗ＫＩＲs mAbsについても報告されている（Cambiaggi et al.１９９９、Blood ９４：２３９６〜２４０２）。
【００８１】
ＳＣ５の結合に続くＴ細胞増殖の低下は、細胞死、ＩＬ−２Ｒ発現の摂動またはサイトカイン合成の阻害に起因し得る。我々は、抗ＳＣ５mAbがＰＢＬまたはＴ細胞クローンのＩＬ−２依存性増殖の阻害をしないことを見出した（図５Ａ）。更に、抗ＳＣ５mAb（希釈腹水１／２００）と抗ＣＤ３mAbとの組み合わせによって４８時間前培養した、Ｔ細胞へのγＩＬ−２の添加はこれらの増殖を復興させる。特異性のmAbがＩＬ−２Ｒ発現の阻害をしたり、細胞死の原因になったりすることはあり得ない。終わりに、ＳＣ５がサイトカイン産生の阻害の原因になることを解決するために、我々は、ＩＬ−２依存性Ｔ細胞系を使用して、抗ＳＣ５mAbの存在下または不存在下で、ＣＤ３活性化ＰＢＬにより排出されるＩＬ−２の量を比較した。抗ＳＣ５mAbの存在下で産生されたＩＬ−２の品質は、アイソタイプ適合抗体で得られるコントロール値の４０〜６５％で表される（図５Ｃ参照）。このようにして、ＳＣ５及びＣＤ３分子の同時結合はサイトカイン産生を減少させる。
次に我々は、FcgR＋二十日鼠細胞系Ｐ８１５に対するキラーアッセイに書き換えられた、抗ＣＤ３mAbを使用して、Ｔ細胞エフェクター細胞毒活性への抗ＳＣ５mAbの効果について研究した。図５ＤはＥ／Ｔ比５／１で、細胞毒のＴ細胞クローンによって行なった代表的実験を示す。大量のＳＣ５分子を発現する、ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＪＦ１は抗ＣＤ３mAb刺激に続いて、二十日鼠標的細胞を殺すために誘発された。その特異的mAbによる、ＳＣ５の同時標的化は、Ｅ／Ｔ比または抗ＣＤ３mAbを刺激する濃度に関係なく、ＪＦ１細胞毒活性に影響しない。
【００８２】
セザリー症候群患者から採取した悪性リンパ球におけるＳＣ５分子の発現。
我々は、最初に、ＣＴＣＬ細胞系との反応性について、抗ＳＣ５mAbのスクリーニングを行なったので、更に、８人のセザリー症候群患者から採取した、末梢血中リンパ球のＳＣ５分子の発現を研究した。二色細胞流量計分析が、ＳＣ５発現がＣＤ４＋小集団で非常に増加したことを示した（図６Ａの一患者から得られた代表的結果参照）。平均で、ＳＳ患者の血液中のＣＤ４＋リンパ球の３５．５％ＳＣ５を発現し、健常なコントロール（p＞０.００１）の９．４％に比較される（図６Ｂ）。８人のＳＳ患者についての研究で、ＣＤ４＋細胞のＳＣ５発現が細胞生態学（r=０.９１、p=０.００１２）によって検出される循環、悪性細胞の比率と関連があることが解った。これらの患者の、トータルＣＤ４＋細胞の比率（平均８８％、ＳＤ±８．８）はセザリー患者の細胞の比率（平均２６％、ＳＤ±１２．８）より高いことに注目すべきである。
我々は、３人の、血液に関連しない、ＭＦ患者の末梢血液試料における、ＳＣ５分子の発現をも研究した。末梢血中ＣＤ４＋細胞におけるＳＣ５発現のレベルでは、ＭＦ患者と健常ドナーの間に大きな差異はなかった（図６Ｂ参照）。増加するＳＣ５＋ＣＤ４＋の比率は、我々が試験できた、これら二人の患者の皮膚試料から検出された（それぞれ、２６％、１９％）。
一人のＳＳ患者では、我々は、予め、循環悪性、細胞が、ＣＤ４＋ＴＣＲＶβ２２＋フェノタイプ（Poszcepczynska et al.２０００ supra参照）のクロナールリンパ球であることを示した。ここで我々は、ＳＣ５が、例えば、悪性細胞集団によって、ＴＣＲＶβ２２＋細胞で共発現されることを示した（図７Ａ）。ＴＣＲＶβ２２＋細胞に結合するＳＣ５mAbのプロフィールが、全ての、悪性、クローン集団における弱い均一な発現に該当することは注目すべきである（図７）。興味あるのは、悪性ＴＣＲＶβ２２＋細胞は前記のように（Poszcepczynska et al.２０００ supra参照）、共通の活性化マーカーとしてのＣＤ６９（図７Ｃ）、ＣＤ２５またはＣＤ３０を共発現しないことである。このように、増加した、ＳＳＰＢＬにおけるＳＣ５のレベルは殆ど、循環、悪性、Ｔ細胞における抗原の発現に起因する。
【００８３】
抗ＳＣ５mAbによる抗ＣＤ３mAb誘発ＣＴＣＬ細胞系の増殖の阻害
次に、我々はＳＣ５分子が悪性ＣＴＣＬ細胞におけるネガティブ信号を提供できるか否かを調べた。我々は、ＩＬ−７の存在下、著しく増殖する長期間培養Pno CTCL腫瘍Ｔ細胞系を使用した。先に報告したように、固定化、抗ＣＤ３mAbまたは溶解性抗ＣＤ３mAbs及びＰＭＡの組み合わせはこれらの増殖を著しく誘発するから、（Poszcepczynska et al.２０００ supra参照）、Pno細胞系は機能的Ｔ細胞受容体を発現する。我々はPno細胞の増殖でのＳＣ５分子の結合効果を調べた。図８は、抗ＳＣ５mAbが、ＣＴＣＬ細胞系の抗ＣＤ３mAb誘発増殖を強力に阻害することを示す。対照的に、ＰＭＡ単独（２ng/ミリリットル）では、抗ＳＣ５によっては、それほど影響されない低レベルの増殖を為す。抗ＳＣ５mAbの存在下、ＩＬ−７で培養したPno細胞はアイソタイプコントロールmAbの存在下と同じ強さで、増殖したので、抗ＳＣ５mAbはＩＬ−７依存性増殖に何ら影響を与えない。
かくして、我々は、ＳＣ５抗原がＣＴＣＬ悪性細胞で、機能的であり、且つ、特異的、予見的に、ＴＣＲＣＤ３信号経路によって惹起されるこれらの増殖を阻害するとの結論を出した。
次いで、ＣＴＣＬ腫瘍が、機能的、活性なＮＫ細胞及びＴリンパ球の両者を、本質的に有しない（欠落または欠損）遺伝子導入マウス（ＳＣＩＤマウス）に接種された[（Charley
et al.(１９９０)、CB-１７ SCID、 ヒト皮膚Ｔ細胞リンパ腫のマウスへの移植、J.Invest.Dermatol.９４:３８１〜３８４に記載のように]、（またＵＳ５，５３０，１７９
Cornelius P.Terhorst and Baoping Wang for obtention of SCID mice参照）。抗ＳＣ５mAbについては、マウスの半数に、静脈または皮下に、複数回、マウス体重１ｇあたり、複数種の濃度の精製mAbが投与された。ＰＢＬ及び皮膚細胞が、浸潤性，大Ｔ細胞の標準細胞観察基準に則って採取され、ＣＴＣＬ細胞の比率が、各供試マウスについて計算された。この方法は専門家が、Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.に寄託番号Ｉ−２５７５として寄託されているハイブリドーマによって産生されるmＡbのような、抗ＳＣ５化合物が、ヒトＣＴＣＬの生体内増殖を阻害できること、をチェックできる方法の一例である。
【００８４】
討論
多くのダイナミックな表面発現を有する受容体は他の免疫細胞またはサイトカインとの相互作用に影響を与え、その結果としてＴ細胞免疫応答を制御する。この研究で、我々は、その表面発現が試験管内Ｔ細胞活性化の間に急速に誘発されるところの、ＰＢＬの矮小集団により発現される、新規な９６kＤ機能性分子を同定した。ＳＣ５は類似の分子量及び／またはＴ細胞制御機能を有する移植分子とは明瞭に異なる。第一に、ＳＣ５は、４時間後に検知される、その表面発現の重要な増加によって、非常に早期にＴ細胞活性化上で誘発される。同様の速動性が、刺激の２４時間後に細胞表面で検知される、非常に早期の活性化抗原ＣＤ６９について観察される。４ＩＩ−Ｂ、ＯＸ−４０ ＬＩＧＨＴまたはＣＤ−１５２（ＣＴＬＡ−４）のような、大部分が移植されたＴ細胞特異的、誘発可能な、受容体が、刺激に続いて、１０〜２４時間の間に、Ｔ細胞表面に現われる。更に、ＳＣ５発現はＴ細胞で限定されていない。抗原はＮＫ小集団及びＢリンパ球、単球及び顆粒球上で検知される。このような広い分布形態は、NK細胞、Ｔ及びＢリンパ球、脊髄性及び他の抗原含有細胞などの上に見出される、最近発表されたAIRM１及びIRp６０のような、ある種のキラー細胞Ig様受容体（ＫＩＲs）の典型である。免疫グロブリンファミリーは、転写（ＩＬＴ）阻害受容体のように、全白血球タイプの発現を有し、個々の受容体は異なるＮＫ、Ｔ、Ｂ及び脊髄性小集団上で検出される。その上、ＩＬＴ４はＳＣ５に極く近い分子量を有する。しかし、AIRM１及びIRp６０、ILTRsはともに細胞の活性化状態に依存しない。
【００８５】
我々が細胞透過の後に、大部分の非活性化Ｔリンパ球で、ＳＣ５を迅速に検出したので、ＳＣ５分子の活性化Ｔ細胞表面での誘発に、次いで、細胞内分子の細胞膜及び副ヴァーサ（versa）への通行に起因する制御緩和が続いた。そのような制御の機構は他のＴ細胞受容体、ＣＤ１５２、について報告されている。更に、膜蛋白（ＬＡＭＰ）に結合するリゾソームの不均一ファミリーが存在し、包含する分子はエンドサイトーシス、リゾソーム通行及び細胞内顆粒からの排出に関与し、単球、ニュウトロフィルＮＫ、ＢまたはＴ細胞の表面で活性化へと、誘発される。細胞内の局在性及びＳＣ５の移出の付加的研究結果は、Ｔ細胞活性化及び機能におけるその役割について正確である。抗ＣＤ３mAb誘発Ｔ細胞増殖を阻害するその特異的mAbによるＳＣ５の惹起を明らかにした。この阻害効果は、ＰＢＬにおける最大ＳＣ５表面発現を誘発するのに必要な、通常の抗ＣＤ３mAb刺激を必要とする（図５Ｂ参照）。Ａ：抗ＳＣ５腹水の１：２００の最終希釈物は、抗ＣＤ３mAbの２μｇ／wellで誘発される増殖を著しく阻害し、この阻害効果は抗ＣＤ３mAbの低濃度（１μｇ／well）で増加する。即ち、０．５μｇ／well−抗ＳＣ５腹水の１：４００の最終希釈物は抗ＣＤ３mAbの２μｇ／wellで誘発される増殖を十分には阻害しないが、抗ＣＤ３mAbの低濃度（１μｇ／well；０．５μｇ／well）では阻害は著しい。この分野の専門家は、ここで述べた特別な結果または彼自身の試みから得られる標準的書き加えによる修正を行なうことができる。
【００８６】
同時に、ＳＣ５結合が提起した阻害閾値は過度の抗ＣＤ３mAb刺激により、迂回される。ＳＣ５分子の連結で得られた阻害機能的効果はＡＰＣ非依存性機構で観察されることに注目すべきである。更なる実験は、ＳＣ５刺激がAPCＴ細胞または同種被刺激Ｔ細胞の増殖に異なる効果を与えるか否かを決定するのに必要である。近年、免疫応答の陰性制御の研究が、特に、Ｔリンパ球及びＮＫ細胞について、徹底的に行なわれた。最もよく研究されたＴ細胞特異的阻害受容体、即ち、ＣＤ１５２(ＣＴＬＡ−４)は、ＣＤ−２８共刺激受容体に機能的に結合する、典型的な活性化誘発抗原である。実に、ＣＤ１５２は、低い抗原濃度で、ＣＤ−２８に打ち勝ち、免疫応答を阻害するである。ＣＤ−２８で誘発されるＴ細胞増殖をＩＬ−２Ｒ発現及びＩＬ−２合成に影響することによって、制御緩和及び終結させる。ＣＤ１５２と同様に、ＳＣ５は表面発現が細胞の活性化状態によって制御される細胞内分子である。両受容体とも、ＩＬ−２合成に影響することによって、それらの効果を左右する。ＳＣ５特異的リガンド及び信号経路の同定は、これらの陰性Ｔ細胞制御体間の時間的、空間的、関係を要約するだろう。この広い細胞分布を考慮すると、ＳＣ５機能効果は、多分、Ｔ細胞を制限しないだろう。
数種の観点で、ＳＣ５はＮＫ細胞阻害受容体に、Ｔ細胞及び他のリンパ球小集団によって発現される点が同じことから、比肩し得る。ＫＩＲs及びCD９４／NKG２受容体の両者は、抗原特異性及び、細胞毒、増殖及びサイトカイン排出を含むＴＣＲαβ及びＴＣＲγδＴ細胞のスーパー抗原駆動活性化を阻害することが示されている。Ｔ細胞の活性化状態及びＴ細胞刺激の効力に依存するＫＩＲ誘発阻害は、特異的生体内条件下で、迂回され得る。しかし、我々が、抗ＣＤ３mAb刺激Ｔ細胞の増殖を選択的に阻害したことを、これらのエフェクター細胞毒機能なしで、示したので、ＳＣ５は、ＫＩＲsとは明らかに別のものであることになる。
【００８７】
ＳＣ５分子の重要な特徴は、ＳＳ患者の末梢血液リンパ球における発現が、健常者のそれに比較して非常に増加することである。ＳＳは成熟したフェノタイプの、初期類表皮悪性Ｔ細胞クローンという概念で特徴付けられる。事実、移植されたＴ細胞機能性受容体は末梢血液ＳＳ腫瘍細胞とは同一でないとの結論が出ている。ＭＦ／ＳＳは、特殊フェノタイプＴ細胞小集団、通常のＴメモリー小集団に相当する、ＣＤ＋ＣＤ７−が増大したものと考えられている。しかし、近年の研究は、ＣＤ＋ＣＤ７−集団が、ＳＳ患者の優勢なＴ細胞クローンを常には、代表するものではないことを示した（Dummer et al.1999、Arch.Dermatol.Res.291:307〜311）。ＳＳはその刺激性は知られていないが、特異的活性化Ｔ細胞の増殖であるとみなされる（Fargnoli et al 1997、Leukemia 11:1338〜1346）。この理由から、ＳＳ及び通常のＴ細胞での、活性化誘発抗原の明瞭な発現が特に興味ある点である。ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ３０のような移植された活性化抗原は、我々自身の研究で確認したように、セザリー細胞に常に検出されるものではない。ＣＤ２５の発現はむしろ、病気の進行と各種少数ケースの大細胞へのＭＦ／ＳＳ細胞の形質転換に関係する。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２５またはＳＳ中のＣＤ７１のようなＴ細胞活性化分子の発現の増加率は反応性腫瘍浸潤Ｔ細胞に優先的に関与する。７８kＤの活性化が非常に遅い抗原ＢＥ２は、正常Ｔ細胞では検出されないのに対して、特に、ＳＳ末梢血液で増加すると報告されている。事実、ＢＥ２は、報告された悪性細胞の比率に関して、末梢血中細胞の低比率のものは、ＢＥ２陽性であったのに比較して、研究された全てのＳＳ患者において、常に検出されるわけではない。そして、ＢＥ２は、血液関与の臨床的証明なしに、患者において検出される。それと対照的に、ＳＣは研究された８／８ＳＳケースで検出された。悪性細胞の比率は細胞生態学で決められ、患者によってかなり差が出るが（１０〜８０％）、ＣＤ４＋細胞のＳＣ５発現はこの比率に関与する。終わりに、ＣＤ４＋細胞のアップしないＳＣ５発現は、血液の関与なしに、ＭＦ患者で検出される。更に、我々はセザリー細胞はクローンタイプＴＣＲＶβ鎖共発現ＳＣ５分子の発現によって同定されることを示し、ＳＳ患者の末梢血液におけるＳＣ５の増加レベルは、悪性Ｔ細胞クローンにおけるその発現に原因があることを確認した。
【００８８】
非常に重要な観察は、セザリー細胞のＳＣ５トリガーがＣＤ３に影響される腫瘍細胞の増殖の制御緩和を誘発することであり、これは正常Ｔ細胞において観察される阻害に類似する。悪性ＣＴＣＬリンパ球が、サイトカインの異常型産生ではあるが、基礎的な信号経路によって活性化されるような、ある機能的性質を保護することは既に示された。我々は阻害経路がＣＴＣＬ腫瘍細胞中で保護され、これらの増殖を平衡状態に保持することを示した。特に、阻害効果は抗ＳＣ５mAbが抗ＣＤ３mAbに結合した後に観察され、ＣＴＣＬPno細胞で刺激されたＣＴＣＬPno細胞は正常Ｔ細胞におけるよりも重要である。それがrIL誘発増殖を制御しないので、抗ＳＣ５mAbは正常細胞またはセザリーＴ細胞の何れの細胞死にも、直接関与するようには見えない。更に、抗ＳＣ５mAbの存在下で培養されたＴ細胞はrILの添加によって再刺激され得る。同時に、我々は、少なくとも部分的にそれらの増殖阻害の原因になる、抗ＳＣ５mAb処理Ｔ細胞によるＩＬ−２産生の減少を観察した。
【００８９】
悪性細胞増殖の機能的受容体の阻害効果は、既に観察された。近年、同族ＮＫ細胞唾液粘性受容体ＡＩＲＭＩ及びＣＤ３３骨髄特異性抗原受容体によって影響される正常細胞及び白血病骨髄細胞の増殖阻害が報告された（Vitale et al.1999、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15091〜15096）。ＳＣ５に類似せず、これらの受容体は、生育因子の存在で、最も可能性ある細胞死の誘発によって阻害される。興味あることは、他のＴ細胞活性化抗原、正常ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の小集団によって発現されるＣＤ３０は、ＭＦ／ＳＳより優勢なＣＴＣＬの退行を左右する。
この効果はＣＤ３０（ＣＤ３０Ｌ）のナチュラルリガンドに関与する。これは悪性細胞の細胞質内に共存し、細胞死をFas／FasLに無関係に誘発する（Mori et al.1999、Blood 94:3077〜3083）。この観点で、ＳＣ５リガンドの同定はその阻害行動のメカニズムを解明するであろう。
【００９０】
結論として、我々は早期のフェノタイプ的生化学及び機能的基準が移植されたＴリンパ球受容体と異なる活性化抗原を同定した。アンダーラインしたように、ＳＣ５分子はポスト−活性化／記憶末梢血液Ｔ細胞小集団によって発現される。同様に、ＫＩＲsの継続的発現が腫瘍Ｔ細胞クローン上に発現され、この発現は特異的抗原によるＴＣＲの占有に依存するように見える。近年、そのようなクローンは自己反応性で、且つ、ＫＩＲs信号によって、耐性が保存されることが報告されている。我々は、セザリー症候群腫瘍細胞はそのようなクローンが起源となる可能性があることを示唆し、ＳＣ５発現も自己反応性Ｔ細胞上で保護されるものと推定した。ＣＴＣＬ悪性Ｔ細胞上でのＳＣ５発現が、それらの起源、及び通常のＴ細胞が制御不能な増殖をするように駆り立てる信号の性質をよりよく規定するのに役立つことが重要である。更に、腫瘍Ｔ細胞上の抗ＳＣ５mAbの阻害効果は、進行性ＣＴＣＬ患者に対する新規な治療法を構成する。
更に、ＳＣ５発現も、ＣＤ８＋形質転換ＭＦのようなＣＤ８＋ＣＴＣＬの表面で観察される。
【実施例２】
【００９１】
Ｐ１４０はＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞によって発現されること及び新規P１４０対立遺伝子型の同定。
皮膚Ｔ細胞リンパ種（ＣＴＣＬ）は主として、皮膚に関与するリンパ腫の外生群である。菌状息肉症（ＭＦ）は本来のＴ細胞ヘルパー細胞に類似する、フェノタイプの、クローン由来の悪性ＣＤ４＋Ｔリンパ球の皮膚侵襲が特徴である。よりアグレッシブなＣＴＣＬ型は悪性細胞が類皮的になり、皮膚異常に関与する。セザリー症候群（ＳＳ）は、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞のクローン拡大及びこれら悪性細胞の血液中への出現が特徴であるところの、ＣＴＣＬのより進行性のタイプである。特異的細胞表面のマーカーがないために、悪性細胞を同定するのが困難なので、病気の生物学はよく理解されない状態が続いている。皮膚の病変では、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞を反応性、浸潤性ＣＤ４＋Ｔリンパ球から区別することは困難である。バゴット（Bagot）等は、以前に、ＣＴＣＬ病変由来のユニークなＣＤ４＋Ｔ細胞系について述べている（Bagot et al.1998、Blood 91:4331〜4341）。この細胞系及び生体内腫瘍細胞は、ＴＣＲ−Ｖβ転写の相補的に決定する領域３と同一サイズで発現した。極く最近、Poszepczynska等は(Blood 2000、96：1056〜1063)他の皮膚紅皮症ＣＴＣＬ患者の血液から採取された、ＩＬ−７依存性ＣＤ４＋ＣＤ８αα＋腫瘍Ｔ細胞系を機能的に特徴付けた。ＴＣＲ−Ｖβ２２の発現及びＴＣＲβ−ＶＤＪ配列の同一性によって示されるので、この腫瘍Ｔ細胞系は大循環性Ｔ細胞集団と同一だった。ここで、我々はこれら二つの異なるＣＴＣＬ系が、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子のためのP１４０／ＫＩＲ阻害受容体を発現することを示す。重要なのは、同じ患者由来の新しい分離腫瘍細胞で検出されることである。更にその上、P１４０／ＫＩＲは他の７人のＳＳ患者のＣＤ４＋リンパ球のメジャーな集団及び進行した２人の追加ＭＦ患者の皮膚ＣＤ４＋腫瘍の両者によって共発現される。P１４０／ＫＩＲは健常者のマイナーＮＫ細胞小集団及び稀な末梢血中ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞で検出される。その上、皮膚炎及び毒物による表皮融解のような皮膚病患者の皮膚から得られたＴ細胞は、この受容体を発現しない（Le Cleach et al.2000、Clin.Exp.Immunol．119:225〜230）。このようにして、我々の研究成果は、P１４０／ＫＩＲがＣＴＣＬの同定のための、ＣＤ４＋細胞上の好適なマーカーを表すことを示した。
【００９２】
材料及び方法
患者
インフォームド・コンセントの後、倫理委員会の承認を受け、我々は１１人のＣＴＣＬ患者から皮膚及び血液試料を得た。８人の患者は、セザリー症候群に罹っており、１０〜４５％の循環性セザリー細胞を血液中に有していた。７例で、腫瘍細胞のフェノタイプがＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−であった。1例がＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８αα＋（患者Pno）であった。３人の患者は形質転換菌状息肉症(Lez、Cou、Bic)で、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−フェノタイプを有する伝播性皮膚腫瘍の症状を呈していた。患者全員がこれまで化学療法を受けていなかった。
【００９３】
腫瘍リンパ球の分離
新鮮な腫瘍細胞は腫瘍断片を機械的に単細胞懸濁液に分散させたものから得た（Bagot et al.1998、Blood 91:4331〜4341）。次で、単核細胞は洗浄され、後の使用のために、ヒト血清プラス１０％ジメチルスルフォキシド中で凍結された。
セザリー症候群患者の場合は、単核血中細胞がフィコール・アイソパクウ技法（Pharmacia fine Chemicals、Piscataway、NJ）で分離された。
【００９４】
腫瘍細胞系の長時間培養
我々は前記の（Bagot et al.1998、Blood 91:4331〜4341）患者の末梢血液からの試験管内Pno細胞系（ＴＣＲ−Ｖβ２２＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８αα＋、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ）の長時間培養を実施した。我々は患者の血中を循環する悪性クローン及び培養されたＴ細胞系の両者がそれらの細胞表面フェノタイプ及びそれらのサイズ及びＴＣＲβＶＤＪ領域（Poszepczynska et al.2000、cf.supra）に関して同一であることを示した。ＳＳ細胞系の他の供給源はＡＴＣＣ（例えば、HUT 78 ATCC TIB-161）で見つけることができる。
Cou−L細胞系（ＴＣＲＶβ１３＋）は試験管内でγＩＬ−２と共に、３年以上培養された。それは前記のＣＤ４＋Cou−LSCTCL系のサブクローンに相当する（Bagot et al.1998、cf.supra）。Cou−L細胞系、本来のＴＣＲＶβ１３＋ＣＤ４＋Cou−ＬＳＣＴＣＬ及び皮膚から新たに分離された腫瘍細胞は、同じサイズで、且つＴＣＲβＶＤＪ領域の配列を分担する（Bagot et al.1998、cf.supra）。
【００９５】
モノクローナル抗体（mAbs）及び流動細胞計数の研究
１色または２色の免疫蛍光分析が前記のように（Bagot et al.1998、cf.supra）行なわれた。抗ＣＤ３（細胞分析２０００カタログ番号６６０４６２９）、抗ＣＤ４（細胞分析２０００カタログ番号６６０２１３８）、抗ＭＮＣクラスＩ（細胞分析２０００カタログ番号ＩＭ０１０７）及びＩＩ（細胞分析２０００カタログ番号ＩＭ０１０８）はBeckman
Coulter（細胞分析２０００カタログ番号ＩＭ２０１４）から入手可能である。
抗ＴＣＲＶβ１３はBioadvance（Emerainville、France、catalogue番号TCR1738）、ＴＣＲ−Ｖβ２２＋mAb はBeckman Coulterから入手された（Marseille、France、細胞分析２０００カタログ番号ＩＭ１４８４／ＩＭ１３６５）。抗ＣＤ８αβ２ＳＴ８．５Ｈ７mAbはBeckman Coulter（細胞分析２０００カタログ番号Ｉｍ２０１４）から入手可能である。抗P１４０mAbsとして、Ｑ６６（IgM、抗P１４０）及びＡＺ１５８（IgG2a、p70／NKB1及びP１４０の両者を確認）（これらは、Pande et al.1996により報告された。J.Exp.Med.184:505〜518）が使用された。しかし、抗P１４０結合化合物が好適である（例えば、抗P１４０抗血清、Fc-HLA-A11 Fc-HLA-A3溶融蛋白）。Ｚ２７（IgG1、抗p70／NKB1）、ＥＢ６（IgG1、抗p58.1／p50.1）、ＧＬ１８３（IgG1、抗p58.2／p50.2）、ＸＡ１８５（IgG1、抗ＣＤ９４）、Ｚ１９９及びＺ２７０（IgG2b、及びIgG2aの各々、抗ＮＫＧ2Ａ）及びＢ９．４（IgG2b、抗ＣＤ８）mAbsは全て、Beckman Coulter（細胞分析２０００カタログ番号ＩＭ２７４８、ＩＭ２２７７、ＩＭ２２７８、ＩＭ１６１０、ＩＭ２７５０、ＩＭ０１０２）から入手可能である。
ヤギ抗マウスＩgＭＦＩＴＣ及びヤギ抗マウスＩgＭＰＥもまた、Beckman Coulterから入手され得る（細胞分析カタログ番号ＩＭ０８及びＩＭ０５５５参照）。
【００９６】
生化学的特徴
２０×１０6個の細胞が、培養され（１５分、２０℃）２５０μｇのＥＺ−ＬＩＮＫ ＳＵＬＦＯ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩＯＴＩＮ（Pierce、Rockford、IL）含有１ミリリットルＰＢＳpH８中で培養され（１５分、２０℃）、洗浄用バッファー（10mM TRIS pH8、0.14M塩化ナトリウム）で３回洗浄された。次いで、細胞は１％ＮＰ４０に溶解され、次いで、セファロースＰＡ（Pharmacia Biotech Inc.Piscataway、NJ）結合ＡＺ１５８（IgG2a抗p70/、１４０）またはＢ９．４（IgG2b抗CD8）mAbで免疫沈降された。試料は不連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用し、Ｎ−グリコシダーゼ（ベーリンガーマンハイム、GmbH、Germany、製）による消化または非消化で、分析された。次いで、Immobilon P（ミリポアCorp.Bedform MAの商品名）ヘ移した。Neutravidin(Pierceの商品名)で汚染後、検出にはルネッサンス・ケミルミネッセンス・キット（NeN、Boston、MAの商品名）が使用された。ＮＫ細胞クローンはペンデ（Pende、1996）等が（J.Exp.Med.184:505〜518）報告したように、限定希釈で得られた。
【００９７】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
トータルＲＮＡはＣＴＣＬ細胞系Pno及びCou-LCD８ααからＲＮＡクリーンシステム（AGS GmbH、ハイデルベルグ、ドイツ）を使用して抽出した。cＤＮＡ合成はオリゴットＴプライミング（oligod T priming）を使用して行なった。ＫＩＲディスプレー３Ig様ドナーの完全なＯＲＦ（open reading frame）cＤＮＡ増幅のために使用された。使用されたプライマーを以下に示す。５'ＣＡＴＧＴ（ＣＴ）ＧＣＴＣＡ（ＣＴ）ＧＧＴＣＧＴＣ（Ig3 UP;SEQ ID No.5）及び５'ＧＧＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＧＧＧＣＴＧ（Ig3 DOWN;SEQ ID No.6）。増幅は３０秒サイクル（３０秒９４℃、３０秒５５℃、３０秒７２℃）、次いで、Ampli TAQ（パーキンエルマー−Applied Biosystems、Foster City、CA）を使用して７分、７２℃の培養を行なった。ＰＣＲ産物はpcDNA3.1/V5-HisTOPOベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA製)のサブクローン化物であった。ＤＮＡ配列はd-ローダミン（生物体汚染用顔料）ターミネーターサイクル配列キット及び３７７Applied Biosystems自動配列機（パーキンエルマー−Applied Biosystems）を使用して行なった。
【００９８】
過渡的移入
ＣＯＳ−７細胞がpcDNA3.1TOPO−ＫＩＲ3Dcl.24またはpCR3cl.1.1（Pende et al.1996、J.Exp.Med.184:505〜518）でFugene-6 (Roche、Monza Italy)を使用して移入された。細胞を５×１０5／プレートの量でシードした。２４時間後、これらを６μｇプラスミド及び１０μｌのFugene-6試薬と共に、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で培養した。４８時間から７２時間後、移入細胞は血球弗素計量分析にかけられた。移入細胞はＱ６６及びＡＺ１５８mAbsで汚染され、次いで、フィコエリトリン被接合ヤギ抗体接合マウスのIgG2aまたはIgMで汚染され、血球流量計により、ＦＡＣソート（Becton Dickinson、San、Jose、CA）を使用して分析した。
【００９９】
結果
ＣＴＣＬ細胞系がp１４０/ＫＩＲヘの抗体で汚染される。
二つの長期ＣＴＣＬ腫瘍系Pno（抗TCR−Vβ22mAbでラベル）（Poszepczynska et al.2000、cf.supra）及びCou-L（抗CD3mAbでラベル）（Bagot et al.1998、cf.supra）は反応的に、異なる抗ＫＩＲmAbsで分析された。
我々は両細胞系がmAbsＱ６６（図９Ａ参照）及びＡＺ１５８と反応性であり、両者はp１４０/ＫＩＲと結合することを見出した。対照的に、これらの細胞系は他のp58.1、p58.2、p70ＫＩＲsを含有するHLAクラスI分子に特異的な阻害受容体及びＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａレクチン様受容体（Poszepczynska et al.2000、cf.supra）を発現しない。
【０１００】
ＣＴＣＬ患者から新たに採取された腫瘍Ｔリンパ球の抗p１４０／ＫＩＲmAbsによる汚染。
p１４０/ＫＩＲが新たに採取された腫瘍細胞により発現されるか否かを決定すべく、我々は、Ｑ６６mAbの、ＳＳ患者Pno及びＭＦ患者Couの腫瘍性皮膚断片から採取した非培養腫瘍細胞との反応性を試験した。我々は腫瘍細胞の大部分がこのmAbによって汚染されることを確認した（図９Ｂ参照）。特に、我々は、患者Pnoの血液から採取された大部分のTCRVβ22＋腫瘍リンパ球がＱ６６抗体と反応性があり、患者Couの皮膚から採取された大部分のTCRVβ13＋腫瘍リンパ球が同じ抗体と反応性があることを観察した（図９Ｂ参照）。次に、我々は、その循環性ＣＤ４＋リンパ球の１０〜４５％が悪性細胞である、追加の７人のセザリー症候群患者から採取した腫瘍Ｔリンパ球及び他の２人のＭＦ患者の皮膚腫瘍から採取した腫瘍Ｔリンパ球、の両者のフェノタイプを研究した。供試全患者が共発現ＣＤ４及びp１４０/ＫＩＲの大集団を顕著に示していた（下記表２参照）。
【０１０１】
形質転換菌状息肉症患者の皮膚、及びセザリー症候群患者の血液、から採取されたＣＤ４＋リンパ球汚染、抗Ｑ６６mAb。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
全てのＱ６６＋細胞がＣＤ４＋細胞集団に含まれていることに注目すべきである。かくして、健常者のp１４０／ＫＩＲ発現は、皮膚及び血液中にあるＣＴＣＬ腫瘍ＣＤ４＋Ｔリンパ球の特徴を表すＮＫ及びＣＤ８＋集団から得られる、リンパ球小集団に限定される。Ｔリンパ球発現の多種類のＫＩＲの比率が低いところの、他の皮膚病、毒物による皮膚溶解（Le Cleach et al.2000、Clin.Exp.Immunol.119:225〜230）、由来の皮膚Ｔ細胞はp１４０／ＫＩＲの発現制御ができない。
【０１０４】
ＣＴＣＬによって発現されるp１４０受容体の分子的特徴
Pno及びCou-L細胞系はビオチンでその表面をラベルされており、細胞溶解物は抗p１４０（ＡＺ１５８mAb）で免疫沈降する。図１０に示すように、このmAbはその分子量が還元条件下で約７０kDである、ＮＫクローン及びPno及びCou-L細胞系から免疫沈降される。Ｎ−グリコシダーゼによる処理によって、ＮＫクローンに比較してPno及びCou-Lの移動性がやや高く、分子量が約５０kDである蛋白質主鎖を明らかにした。これらのデータは、これらＣＴＣＬ腫瘍細胞系によって発現されるp１４０阻害受容体が、前記正常ＮＫ細胞で検出されたものと殆ど同じであることを示唆した（Pende et al.1996、J.Exp.Med.184:505〜518）。
【０１０５】
次に、我々はPno及びCou-L細胞系上のＱ６６及びＡＺ１５８mAbが前記p１４０／ＫＩＲ（SEQ ID No.3）をコード化するcＤＮＡの一つに相当するかどうかを決定した。この末尾で、ＲＴ−ＰＣＲは、三個のＩg様ドメインを有するＫＩＲをコード化する全てのcＤＮＡを増幅できるプライマーのセットを使用して、これらの細胞から由来するＲＮＡ上で行なわれた。Pno細胞系から、ＫＩＲ３D cl.24と名付けられた、フル鎖長のcＤＮＡを採取した（SEQ ID No.1）。そのヌクレオチッド配列と、三つの細胞外Ｉg様ドメインが特徴である、全てのＫＩＲをコード化するＤＮＡ配列との比較は、ＫＩＲ３D cl.24pが、１４０受容体の新規な対立遺伝子型を表すことを明らかにした。特に、そのヌクレオチド配列は前記の成熟蛋白質（図１１参照、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．２：クローン２４蛋白質；ＳＥＱ ＩＤ Ｎo．４：クローン１．１蛋白質）における４個のアミノ酸置換となる1.1 cＤＮＡに比較される５個の異なるものを表示する（Pende et al.1996、J.Exp.Med.184:505〜518）。４個の置換のうち３個は細胞外Ｉg様ドメイン（成熟蛋白質のうちのpos.20、92及び111）であり、他方はサイトプラズマ領域に局在する（pos.401）。Cou-ＬＣＴＣＬ細胞系で行なわれるＲＴ−ＰＣＲはp１４０／ＫＩＲの二つの異なる対立遺伝子型を明らかにした。一つはcl.１.１cＤＮＡに相当し、他方は、ＫＩＲ３D cl.24(Pno細胞系から分離)と同一である。ＣＴＣＬ細胞系由来のcＤＮＡはＣＯＳ−７細胞へ移入される。期待したように、全ての移入された細胞は、Ｑ６６及びＡＺ１５８mAbによって明瞭に汚染される。
一方、これらはネガティブコントロールとして使用されるp７０／ＫＩＲ特異性Ｚ２７mAbと反応しない。終わりに、ＲＴ−ＰＣＲが三人のＳＳ患者（患者のPno含有）由来のＰＢＬから抽出及び一人の追加のＭＦ患者の皮膚由来のＴ細胞から抽出されたＲＮＡ上で行なわれる。また、これらの試料で、上記のp１４０／ＫＩＲの一つまたは他の対立遺伝子型が同定される。
同じ結果が患者から採取された悪性細胞上で得られた。
【０１０６】
討議
ＣＴＣＬの皮膚病変は、殆どＣＤ４＋で、非新形成の腫瘍浸潤性Ｔリンパ球である悪性Ｔ細胞からなる異成分のリンパ球の浸潤物を含む。我々は、以前に、ＣＤ４＋細胞毒腫瘍浸潤性Ｔリンパ球は特異的に、自家組織の悪性ＣＴＣＬＣＤ４＋細胞系を支配することを報告した。しかし、腫瘍細胞で発現されるクローン型のＴＣＲのみならず、非腫瘍とされている細胞表面構造がＣＴＣＬ上で同定された。非悪性、反応性ＣＤ４＋リンパ球と悪性のものとを区別する標準法を使用することは困難である。
我々は、この研究で、最初に、ＭＦ及びＳＳ患者から採取した腫瘍細胞が、p１４０／ＫＩＲを発現すると報告した。この受容体は長期培養ＣＴＣＬ系と同様に、ＣＴＣＬ患者からの皮膚及び血液中の腫瘍細胞と同定された。二色蛍光分析はp１４０／ＫＩＲ発現は、以前に腫瘍細胞で同定され、与えられた、ＴＣＲβ−ＶＤＪにより、特徴付けられているＴ細胞として限定される。このようにして、p１４０／ＫＩＲは、Ｔリンパ球ＣＤ４＋集団中の腫瘍反応性細胞からの腫瘍細胞の同定を迅速化させる。これは、特に、その腫瘍Ｔ細胞クローンが末梢血中ＣＤ４＋リンパ球集団内で、常には、容易に同定されないようなＳＳ患者に対しては有効である。更に、病気の間または処置後に、ＣＤ４＋集団の増加が腫瘍細胞集団の増加が原因なのか、反応性Ｔリンパ球の増加が原因なのかを評価するのは困難である。抗p１４０／ＫＩＲmAbが、既に解析された全ＣＴＣＬ患者の腫瘍細胞を認知するために出現するので、それらは、ＣＴＣＬの直接的同定のためには公的な手段と考えられる。その上、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞上での、p１４０／ＫＩＲ共発現の使用は悪性細胞と正常細胞を区別するユニークな手段を提供する。これは個々の患者にとって独特であるＴＣＲ決定法とは対照的である。その上、p１４０／ＫＩＲは、ＣＴＣＬの新規な特異的免疫療法の発展のための可能なターゲットである。
【０１０７】
これまでの研究は、この受容体がＨＬＡ．Ａ３及びＨＬＡ．Ａ１１対立遺伝子の認知への阻害信号を送ることができることを示した。しかし、解析された各種の患者におけるp１４０／ＫＩＲ発現それら自体のＨＬＡクラスＩハロタイプには明らかに依存しないと見なされることに留意すべきである。それにも拘らずp１４０／ＫＩＲのＣＴＣＬの異常病態生理学における現実の役割は、それ自体への耐性での受容体の潜在的役割を考慮することで、研究が続けられるという重要な特徴である。結論として、この研究は最初に、ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞におけるp１４０／ＫＩＲの発現及び腫瘍細胞におけるこの受容体の新規な対立遺伝子型の病変を示している。この発見はＣＴＣＬ患者の異常病態生理学及び臨床管理の両者についての重要な論点である。更に、p１４０発現がＣＤ８＋形質転換ＭＦのようなＣＤ８＋ＣＴＣＬの表面に観察される。
【実施例３】
【０１０８】
抗ＣＴＣＬ薬の製造
当該分野の専門家は、下記の図の意図による概要に従がって抗ＣＴＣＬ薬を製造できる。
ＣＴＣＬ細胞近傍の細胞の免疫システムを刺激するために、抗ＳＣ５または抗p１４０mAbをサイトカインと共に使用する。
抗ＣＴＣＬ成分をＣＴＣＬ細胞に向けて送り出すためのベクターとして、これらの抗ＳＣ５または抗p１４０mAbを使用する。抗ＣＴＣＬ成分の例は、放射性元素、トキシンなどのキミオセラピーで使用される標準化合物がある。
放射性元素用mAbベクターは、本発明の抗ＳＣ５mAbに使用された標準技法により産生できる[Press OW et al.置換B細胞リンパ腫への自家幹細胞移植を伴うフェイス２試行沃素131B1（抗CD20）抗体療法、Lancet 1995 vol.346 pp336〜340参照、この内容は，この明細書に参考のために記載されている。]。
トキシン用mAbベクターは、本発明の抗ＳＣ５mAbに使用された標準技法により産生できる[Ghetie U et al.ヒト組換えＣＤ４及び脱グリコシルリシンＡ鎖構成免疫接合物の大スケール調製、J.Immunol.Methods 1990、vol.126 pp 135〜141、この内容は，この明細書に参考のために記載されている。]。
抗有糸分裂性のプロドラッグ及び抗ＳＣ５mAb及び／または抗p１４０mAbベクターの両者の結合されたものを使用すると、抗有糸分裂性のプロドラッグを活性な医薬型（機能型の抗有糸分裂性製剤）へと形質転換することができる酵素を送り届ける。
抗有糸分裂性のプロドラッグを活性な医薬型へ形質転換することができる酵素を送り届ける抗ＳＣ５mAb及び抗p１４０mAbベクターは、本発明の抗ＳＣ５mAb及び抗p１４０mAbに適用される次の標準的技術で産生され得る（ＡＤＥＰＴtechnique、for Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy、described in Plakey TC et al. Anti-tumor effects of an antibodycarboxypeptidase G2 conjuguate in combination with phenol mustard prodrugs、British J. Cancer 1995 vol.72 pp 1083〜1088、of which content is herein incorporated by reference、参照）。
リガンド作用物質（ＳＣ５刺激またはp１４０刺激）としての抗ＳＣ５または抗p１４０／抗ＣＤ４の使用。
補体漸増剤としての抗ＳＣ５または抗p１４０mAbの使用。
上記用途のために抗ＳＣ５／抗ＣＤ４または抗p１４０／抗ＣＤ４特異性の共用のmAbが好ましい。
ＡＤＣＣ（Antibody Dependent Cell Cytotoxicity）の活性化体としての、抗ＳＣ５または抗p１４０（ＣＤ４特異性は不要）の使用：多核細胞、マクロファージ、Ｆc受容体含有ＮＫ細胞抗はＳＣ５及び抗p１４０mAbのＦc含量によって活性化され、それ故、これらmAbはＣＴＣＬの近傍でＡＤＣＣ活性化ができる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明はＣＴＣＬの診断及び治療の問題点を解決する二つの分子を提供する。
これは、特に、悪性ＣＴＣＬ細胞のような悪性Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性を阻害する。また、Ｔ細胞、特に悪性ＣＴＣＬ細胞のような腫瘍性Ｔ細胞の増殖及び／または機能的活性の調節ができる、ハイブリドーマＩ−２５７５で産性された抗ＳＣ５モノクローナル抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは健常者のＰＢＬsのＳＣ５分子の細胞膜発現を図解している。 図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃはそれぞれ、健常者のＰＢＭＣを抗ＳＣ５mＡb(腹水１／２００)で汚染させ、次いで、ＦＩＴＣ接合アイソタイプ特殊ヤギ抗マウスＩgＭ２次試薬及び、抗ＣＤ３（図１Ａ）、抗ＣＤ５６（図１Ｃ）及び抗ＣＤ４５ＲＯ（図１Ｂ）のようなＰＥ接合mＡbsの一種で汚染した場合である。
【図２】図２はＰＢＬsの活性化の間、ＳＣ５分子の細胞膜発現を図解している。
【図３】図３はＰＢＬのＳＣ５分子の細胞内所在部を図解している。
【図４】図４はＳＣ５分子の生化学的分析結果を図解している。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄは、抗ＣＤ３誘発増殖及び正常Ｔリンパ球のサイトカイン分泌を、それらの細胞毒活性の影響なしに、抗ＳＣ５mＡbが調節する様子を図解している。図５Ａ：ＰＢＬまたはＴ細胞クローンＬＳＯ及びＧＤＳ．３が固定化抗ＣＤ３mＡb（コートされたmＡb１μｇ／源）またはＩＬ−２（５０ＩＵ／ミリリットル）で、抗ＳＣ５mＡb（腹水の、１：２００最終希釈）またはアイソタイプ適合、不適切mＡbの存在で、刺激した場合。図５Ｂ：ＧＤＳ．３ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは抗ＳＣ５mＡbの異なる濃度の存在下、図示された濃度のプレコート抗ＣＤ３mＡbで刺激した場合。 図５Ｃ：抗ＳＣ５またはコントロールmＡbの存在下、抗ＣＤ３刺激の場合。図５Ｄ：細胞毒ＣＤ８＋細胞クローン（ＪＦ１）が、抗ＳＣ５mＡb（腹水の、１：２００最終希釈）またはアイソタイプ適合コントロールmＡbの存在で、Ｅ／Ｔ比が５／１での、ＦcyＲ＋ミューリン腫瘍細胞Ｐ８１５との共培養の前に、培養した場合。
【図６】図６Ａ、６ＢはＣＴＣＬ患者のＰＢＬのＳＣ５分子の細胞膜発現を図解する。図６Ａ：セザリー症候群患者のＰＢＬのＳＣ５及びＣＤ４分子の共発現を健常者と比較した場合。図６Ｂ：ヒストグラムは示された３群におけるＳＣ５発現の平均値を示す
【図７】図７Ａ、７Ｂ、７Ｃはセザリー症候群患者の悪性細胞の膜表面発現を図解する。 図７Ａ：循環ＴＣＲＶβ２２＋悪性Ｔ細胞クローンの存在で、ＳＳ患者のＰＢＭＣの二色蛍光分析。図７Ｂ：弱くラベルした、抗ＳＣ５mＡb（陰を付したヒストグラム）ＴＣＲＶβ２２陽性悪性細胞。図７Ｃ：同じ患者の細胞を、ＰＥ接合抗ＣＤ６９mＡb及びＦＩＴＣ接合抗ＴＣＲＶβ２２mＡbによって汚染させた場合。
【図８】図８は抗ＳＣ５mＡbによるＣＴＣＬ悪性細胞系の抗ＣＤ３誘発増殖の調節を図解している。
【図９】図９Ａ、９Ｂは、ＣＴＣＬ細胞系（図９Ａ）のp１４０／ＫＩＲ分子及び新鮮なリンパ球腫瘍（図９Ｂ）の検出を図解いている。
【図１０】図１０はp１４０分子の生化学的分析を図解している。
【図１１】図１１は蛋白質でコードされたＫＩＲ３Ｄ cl.２４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.２）及びcl.１.１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎo.４）のアミノ酸配列を示す。
【０１１１】
略語
ＡＰＣ：抗原提示細胞、ＣＴＣＬ：皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ＤＩＧ：界面活性剤不溶グリコリピッド富化分画、ＩＬＴ：免疫グロブリン様転写、ＫＩＲ：キラー細胞免疫グロブリン受容体、mAb：モノクローナル抗体、ＭＦ：菌状息肉症、ＰＢＬ：末梢血中リンパ球、ＰＢＭＣ：末梢血中単核細胞、ＰＨＡ：フィトヘマグルチニン、ＰＭＡ：ホルボール１２β−ミリステート１３α−アセテート、ＳＳ：セザリー症候群、ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含むことを特徴とする、患者の特定の体内区分内の、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の存在比率の数値を求める方法。
p１４０分子を発現するＣＤ４＋細胞の比率の値を、前記患者から得られた生物学的試料を基に測定し、そして、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の、現実に前記体内区分に存在する比率の数値は、前記測定値の約±１０％の範囲内に入る数値と考える。
【請求項２】
p１４０分子を発現するＴ細胞の比率の値を、前記患者から得られた生物学的試料を基に測定し、そして、この値を非ＣＴＣＬのヒトで観察される平均比率の値と比較し、前記測定値が平均比率の値より有意に高いとき、ＣＴＣＬが陽性であるという診断を下すことを特徴とするＣＴＣＬの診断方法。
【請求項３】
p１４０を発現するＣＤ４＋細胞の存在を、潜在的にＣＴＣＬ細胞を含む生物学的試料で調べ、その存在が検知されるとき、ＣＴＣＬの診断を終了することを特徴とするＣＴＣＬの診断方法。
【請求項４】
前記比率の測定が、p１４０結合化合物、p１４０ＤＮＡ、及びＳＥＱＩＤＮo.４のタンパク質からなる群から選択される一つの要素を使用することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
p１４０結合化合物、p１４０ＤＮＡ、ＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質からなる群から選択される一つの要素を含む、ＣＴＣＬの進行レベルの評価又はＣＴＣＬの診断のためのキット。
【請求項６】
p１４０分子に結合可能な化合物の検知を含むことを特徴とする、悪性ＣＴＣＬ細胞の増殖に対する一時的緩和、予防、軽減、治療に有効な化合物の同定方法。
【請求項７】
p１４０分子が、ＳＥＱＩＤＮo.２またはＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＣＴＣＬの治療薬を調製するためのポリペプチドベクターの使用であって、該ベクターはp１４０結合化合物を含むポリペプチドベクターの使用。
【請求項９】
抗p１４０結合化合物が抗体である請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質に対する抗体である請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質及びＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
ベクターがさらに毒性元素及び放射性元素からなる群より選択される元素を含む請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
p１４０結合化合物が、補体の漸増を介在する請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
p１４０結合化合物が、抗体依存性細胞傷害を介在する請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
ＣＴＣＬが、セザリー症候群である請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
ＣＴＣＬが、菌状息肉症である請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
ＣＴＣＬを治療するためのポリペプチドベクターであり、該ポリペプチドベクターはp１４０結合化合物を含むポリペプチドベクター。
【請求項１９】
抗p１４０結合化合物が抗体である請求項１８に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２０】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質に対する抗体である請求項１９に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２１】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項１９に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２２】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質及びＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項２０又は２１に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２３】
ベクターがさらに毒性元素及び放射性元素からなる群より選択される元素を含む請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２４】
p１４０結合化合物が、補体の漸増を介在する請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２５】
p１４０結合化合物が、抗体依存性細胞傷害を介在する請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２６】
ＣＴＣＬが、セザリー症候群である請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２７】
ＣＴＣＬが、菌状息肉症である請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２８】
抗p１４０化合物を含む抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項２９】
抗p１４０結合化合物が抗体である請求項２８に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３０】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質に対する抗体である請求項２９に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３１】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項２９に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３２】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質及びＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項２８又は２９に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３３】
ベクターがさらに毒性元素及び放射性元素からなる群より選択される元素を含む請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３４】
p１４０結合化合物が、補体の漸増を介在する請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３５】
p１４０結合化合物が、抗体依存性細胞傷害を介在する請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３６】
ＣＴＣＬが、セザリー症候群である請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３７】
ＣＴＣＬが、菌状息肉症である請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３８】
抗p１４０結合化合物が抗体である請求項５に記載のキット。
【請求項３９】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質に対する抗体である請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項３８に記載のキット。
【請求項１】
下記の段階を含むことを特徴とする、患者の特定の体内区分内の、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の存在比率の数値を求める方法。
p１４０分子を発現するＣＤ４＋細胞の比率の値を、前記患者から得られた生物学的試料を基に測定し、そして、悪性ＣＤ４＋ＣＴＣＬ細胞の、現実に前記体内区分に存在する比率の数値は、前記測定値の約±１０％の範囲内に入る数値と考える。
【請求項２】
p１４０分子を発現するＴ細胞の比率の値を、前記患者から得られた生物学的試料を基に測定し、そして、この値を非ＣＴＣＬのヒトで観察される平均比率の値と比較し、前記測定値が平均比率の値より有意に高いとき、ＣＴＣＬが陽性であるという診断を下すことを特徴とするＣＴＣＬの診断方法。
【請求項３】
p１４０を発現するＣＤ４＋細胞の存在を、潜在的にＣＴＣＬ細胞を含む生物学的試料で調べ、その存在が検知されるとき、ＣＴＣＬの診断を終了することを特徴とするＣＴＣＬの診断方法。
【請求項４】
前記比率の測定が、p１４０結合化合物、p１４０ＤＮＡ、及びＳＥＱＩＤＮo.４のタンパク質からなる群から選択される一つの要素を使用することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
p１４０結合化合物、p１４０ＤＮＡ、ＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質からなる群から選択される一つの要素を含む、ＣＴＣＬの進行レベルの評価又はＣＴＣＬの診断のためのキット。
【請求項６】
p１４０分子に結合可能な化合物の検知を含むことを特徴とする、悪性ＣＴＣＬ細胞の増殖に対する一時的緩和、予防、軽減、治療に有効な化合物の同定方法。
【請求項７】
p１４０分子が、ＳＥＱＩＤＮo.２またはＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＣＴＣＬの治療薬を調製するためのポリペプチドベクターの使用であって、該ベクターはp１４０結合化合物を含むポリペプチドベクターの使用。
【請求項９】
抗p１４０結合化合物が抗体である請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質に対する抗体である請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質及びＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
ベクターがさらに毒性元素及び放射性元素からなる群より選択される元素を含む請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
p１４０結合化合物が、補体の漸増を介在する請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
p１４０結合化合物が、抗体依存性細胞傷害を介在する請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
ＣＴＣＬが、セザリー症候群である請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
ＣＴＣＬが、菌状息肉症である請求項８〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
ＣＴＣＬを治療するためのポリペプチドベクターであり、該ポリペプチドベクターはp１４０結合化合物を含むポリペプチドベクター。
【請求項１９】
抗p１４０結合化合物が抗体である請求項１８に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２０】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質に対する抗体である請求項１９に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２１】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項１９に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２２】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質及びＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項２０又は２１に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２３】
ベクターがさらに毒性元素及び放射性元素からなる群より選択される元素を含む請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２４】
p１４０結合化合物が、補体の漸増を介在する請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２５】
p１４０結合化合物が、抗体依存性細胞傷害を介在する請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２６】
ＣＴＣＬが、セザリー症候群である請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチドベクター。
【請求項２７】
ＣＴＣＬが、菌状息肉症である請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２８】
抗p１４０化合物を含む抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項２９】
抗p１４０結合化合物が抗体である請求項２８に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３０】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質に対する抗体である請求項２９に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３１】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項２９に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３２】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質及びＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項２８又は２９に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３３】
ベクターがさらに毒性元素及び放射性元素からなる群より選択される元素を含む請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３４】
p１４０結合化合物が、補体の漸増を介在する請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３５】
p１４０結合化合物が、抗体依存性細胞傷害を介在する請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３６】
ＣＴＣＬが、セザリー症候群である請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３７】
ＣＴＣＬが、菌状息肉症である請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の抗ＣＴＣＬ薬。
【請求項３８】
抗p１４０結合化合物が抗体である請求項５に記載のキット。
【請求項３９】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.２の蛋白質に対する抗体である請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
p１４０結合化合物が、ＳＥＱＩＤＮo.４の蛋白質に対する抗体である請求項３８に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００８−２６１８７５（Ｐ２００８−２６１８７５Ａ）
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１４９６４２（Ｐ２００８−１４９６４２）
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【分割の表示】特願２００２−５５２０１５（Ｐ２００２−５５２０１５）の分割
【原出願日】平成１３年１２月１８日（２００１．１２．１８）
【出願人】（５０３２１８６３２）アーンスティテュ ナシオナール ド ラ サント エ ド ラ ルシェルシェ メディカル（イー．エンヌ．エス．ウー．エール．エンム．） (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月６日（２００８．６．６）
【分割の表示】特願２００２−５５２０１５（Ｐ２００２−５５２０１５）の分割
【原出願日】平成１３年１２月１８日（２００１．１２．１８）
【出願人】（５０３２１８６３２）アーンスティテュ ナシオナール ド ラ サント エ ド ラ ルシェルシェ メディカル（イー．エンヌ．エス．ウー．エール．エンム．） (2)
【Ｆターム（参考）】
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