説明

目的とする配列を連結するための方法

多重オーバーラップ・エクステンションRT−PCRは、単一反応でヘテロメリックタンパク質のドメインまたはサブユニットをコードする2つもしくはそれ以上のヌクレオチド配列を連結する効率的な方法を提供する。特に、例えば、免疫グロブリン、T細胞受容体、またはB細胞受容体からの可変領域コード配列の連関は、本発明の方法で容易にされる。これは可変領域コード配列のライブラリーを生成するより効率的な方法を可能にする。単離単一細胞由来のテンプレートを使用する多重オーバーラップ・エクステンションRT−PCRを実行する機能は、ハイスループットフォーマットで同族対合ライブラリーの生成を可能にする。



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【特許請求の範囲】
【請求項1】
目的とする複数の非隣接ヌクレオチド配列を連結する方法であって、前記方法が、
a)多重分子増幅手順で、単離単一細胞または同質細胞の集団由来のテンプレートを使用して目的とするヌクレオチド配列を増幅するステップと、
b)ステップa)で増幅された目的とするヌクレオチド配列の連関を生じさせるステップと
を含む方法。
【請求項2】
前記目的とするヌクレオチド配列が、可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が可変領域コード配列の同族対合を生成する、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記目的とするヌクレオチド配列が、免疫グロブリン可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が重鎖可変領域コード配列を伴う軽鎖可変領域コード配列の同族対合を生成する請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
前記目的とするヌクレオチド配列がT細胞受容体可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が、β鎖可変領域コード配列を伴うα鎖可変領域コード配列、またはδ鎖可変領域コード配列を伴うγ鎖可変領域コード配列で構成された同族対合を生成する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項5】
ランダムに目的とする複数の非隣接ヌクレオチド配列を連結する方法であって、前記方法が、
a)多重分子増幅手順で、遺伝学的に多様な細胞の集団由来のテンプレートを使用して目的とするヌクレオチド配列を増幅するステップと、
b)ステップa)で増幅された目的とするヌクレオチド配列の連関を生じさせるステップと
を含む方法。
【請求項6】
前記細胞の集団が溶解される、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
前記目的とするヌクレオチド配列が可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が可変領域コード配列の対合のコンビナトリアルライブラリーを生成する、請求項5または6に記載の方法。
【請求項8】
前記目的とするヌクレオチド配列が免疫グロブリン可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関が軽鎖可変領域と重鎖可変領域コード配列の対合のコンビナトリアルライブラリーを生成する、請求項7に記載の方法。
【請求項9】
前記目的とするヌクレオチド配列がT細胞受容体可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記連関がα鎖可変領域とβ鎖可変領域コード配列の対合のコンビナトリアルライブラリーを生成する、請求項7に記載の方法。
【請求項10】
前記多重分子増幅手順が多重RT−PCR増幅である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記多重RT−PCR増幅が、多重PCR増幅の前に別個の逆転写(RT)ステップを含んで成る2ステップ方法である、請求項10に記載の方法。
【請求項12】
前記多重RT−PCR増幅が、逆転写(RT)および多重PCR増幅を実行するのに必要な成分すべてを単一の容器へ最初に添加するステップを含んで成る単一ステップで実行される、請求項10に記載の方法。
【請求項13】
前記目的とするヌクレオチド配列の連関が、前記多重分子増幅と同じ容器で実行される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記目的とするヌクレオチド配列の連関が、多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスを利用する多重PCR増幅に伴って達成される、請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記目的とするヌクレオチド配列の連関がライゲーションによって達成される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記目的とする連結核酸配列を増幅するために適合されるプライマーミックスを利用する追加の分子増幅が実行される、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスがプライマーセットを含んで成り、ここで各プライマーセットの少なくとも1つのプライマーセットメンバーが、第2のプライマーセットのプライマーセットメンバーのオーバーラップ・エクステンションテールとハイブリダイズすることが可能なオーバーラップ・エクステンションテールを含んで成る、請求項14に記載の方法。
【請求項18】
前記多重オーバーラップ・エクステンションプライマーミックスが、
a)免疫グロブリン軽鎖領域コード配列のセンス鎖を相補する少なくとも1つのCまたはJプライマーと、
b)免疫グロブリン軽鎖可変領域コード配列または軽鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖を相補し、かつステップa)におけるプライマーでプライマーセットを形成することが可能な少なくとも1つのV5’プライマーまたはVLLプライマーと、
c)免疫グロブリン定常重鎖ドメインコード配列または重鎖接合領域コード配列のセンス鎖を相補する少なくとも1つのCまたはJプライマーと、
d)免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列または重鎖可変領域リーダー配列のアンチセンス鎖を相補し、かつステップc)におけるプライマーでプライマーセットを形成することが可能な少なくとも1つのV5’プライマーまたはVHLプライマーと
を含んで成る、請求項14または17に記載の方法。
【請求項19】
ステップb)のプライマーが配列番号93〜98の遺伝子特異的領域との少なくとも90%の配列同一性を有するVLLプライマーであり、かつステップd)のプライマーが配列番号86〜92の遺伝子特異的領域との少なくとも90%の配列同一性を有するVHLプライマーである、請求項18に記載の方法。
【請求項20】
前記単一細胞、前記同質細胞の集団または前記遺伝学的に異なる細胞の集団が、細胞分画を含有するリンパ球から得られる、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
連結可変領域コード配列を含んで成る同族対合のライブラリーを製造する方法であって、前記方法が、
a)ドナーからのリンパ球含有細胞分画を提供するステップと、
b)場合により前記細胞分画から特定のリンパ球集団を強化するステップと、
c)細胞を前記細胞分画から個別に複数の容器へ分配するステップを含んで成る、単離単一細胞の集団を得るステップと、
d)請求項1〜4のいずれか1項に依存する限り、請求項1〜4または10〜20のいずれか1項に記載の方法による、単離単一細胞の前記集団に含まれる可変領域コード配列の連関を増幅し、これを生じさせるステップと
を含んで成る方法。
【請求項22】
単一細胞の集団における個々の単離単一細胞が、増幅および連関を実行する(ステップd)前に、同質細胞の集団に拡大される、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
前記リンパ球を含有する細胞分画が、全血、骨髄、単核細胞、または白血球を構成する、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記リンパ球を含有する細胞分画がBリンパ球系列の細胞で強化されている、請求項20〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記リンパ球を含有する細胞分画またはBリンパ球系列が形質細胞で強化されている、請求項20〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記リンパ球を含有する細胞分画、Bリンパ球系列、または形質細胞からの細胞が抗原特異性で強化されている、請求項20〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記リンパ球を含有する細胞分画が、前記Tリンパ球系列の細胞で強化されている、請求項20〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
抗原特異的T細胞がリンパ球を含有する細胞分画の刺激によって生成される、請求項20〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記連結ヌクレオチド配列または同族対合のライブラリーをベクターへ挿入するステップをさらに含んで成る、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記ベクターがクローン化ベクター、シャトルベクター、ディスプレイベクター、または発現ベクターの中から選択される、請求項29に記載の方法。
【請求項31】
前記連結ヌクレオチド配列または前記同族対合のライブラリーの個々のメンバーが、軽鎖可変領域コード化配列を伴う免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記配列が、1つもしくはそれ以上の免疫グロブリン定常ドメインまたはその断片をコードする配列をすでに含有するベクターへインフレーム挿入される、請求項29または30に記載の方法。
【請求項32】
前記連結ヌクレオチド配列または前記同族対合のライブラリーの個々のメンバーが、β鎖可変領域コード配列を伴うT細胞受容体α鎖可変領域コード配列を含んで成り、かつ前記配列が、1つもしくはそれ以上のT細胞受容体定常ドメインまたはその断片をコードする配列をすでに含有するベクターへインフレーム挿入される、請求項29または30に記載の方法。
【請求項33】
所望の標的特異性を有する結合タンパク質をコードする連結可変領域配列の同族対合の一部を選択することによってサブライブラリーを作成し、可変領域コード配列の標的特異的同族対合のライブラリーを生成するステップをさらに含んで成る、請求項21〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記同族対合または可変領域コード配列の標的特異的同族対合のライブラリーを哺乳類発現ベクターへ移動させるステップをさらに含んで成る、請求項31〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記哺乳類発現ベクターが、ヒト免疫グロブリンクラスのIgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、κ軽鎖、またはλ軽鎖、もしくはヒトT細胞受容体α、β、δ、および/またはγ鎖から選択される1つもしくはそれ以上の定常領域ドメインをコードする、請求項34に記載の方法。
【請求項36】
a)連結ヌクレオチド配列の部分をコードするベクターを宿主細胞へ導入するステップと、
b)発現に適合した条件下で前記宿主細胞を培養するステップと、
c)前記宿主細胞へ挿入される前記ベクターから発現されるタンパク質産物を得るステップと
をさらに含んで成る、請求項29〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記タンパク質産物が、重鎖可変領域を伴う軽鎖可変領域の同族対合を含んで成るモノクローナル抗体である、請求項36に記載の方法。
【請求項38】
前記ポリペプチド産物が、β鎖可変領域を伴うα鎖可変領域の同族対合を含んで成るモノクローナルT細胞受容体である、請求項36に記載の方法。
【請求項39】
連結可変領域コード配列から成る同族対合のライブラリー。
【請求項40】
前記可変領域コード配列の同族対合が、請求項21またはそれに従属するいずれかの請求項に記載の方法によって得られる、請求項39に記載のライブラリー。
【請求項41】
前記同族対合の個々のメンバーが、重鎖可変領域コード配列を伴う免疫グロブリン軽鎖可変領域コード配列を含んで成る、請求項39または40に記載のライブラリー。
【請求項42】
前記個々のメンバーが、ヒト免疫グロブリンクラスのIgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはIgMから選択される完全長抗体をコードする、請求項41に記載のライブラリー。
【請求項43】
前記同族対合の個々のメンバーが、β鎖可変領域コード配列を伴うTcRα鎖可変領域コード配列またはδ鎖可変領域コード配列を伴うγ鎖可変領域コード配列を含んで成る、請求項39または40に記載のライブラリー。
【請求項44】
前記個々のメンバーが完全長TcRをコードする、請求項40に記載のライブラリー。
【請求項45】
特定の標的に対して所望の結合特異性を示すタンパク質をコードする可変領域コード配列の同族対合のサブライブラリー。
【請求項46】
請求項39〜44の1つに記載のライブラリーから選択される特定の標的に対する所望の結合特異性を示すタンパク質をコードするサブライブラリー。
【請求項47】
前記ライブラリーから発現可能な前記免疫グロブリンが、破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な連結免疫グロブリン重鎖可変領域および軽鎖可変領域コード配列の同族対合のサブライブラリー。
【請求項48】
請求項39〜47のいずれか一項に記載のライブラリーまたはサブライブラリーを含んで成る宿主細胞の集団。
【請求項49】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項48に記載の宿主細胞の集団。
【請求項50】
請求項48または49に記載の宿主細胞から発現される組換えポリクローナルタンパク質。
【請求項51】
破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル免疫グロブリンまたはその断片。
【請求項52】
前記個々のメンバーが同族対合である、請求項51に記載の組換えポリクローナル免疫グロブリン。
【請求項53】
配列番号の対合229:276、262:309、240:287、245:292、267:314、246:293、258:305、242:289、231:278、263:310、232:279、237:284、255:302、260:307、251:298、233:280、228:275、244:291、250:297、252:299、264:311、272:319、235:282、または238:285より成る群から選択される個々の配列番号の対合と少なくとも90%の同一性を有する軽鎖可変領域コード配列を伴う免疫グロブリン重鎖可変領域コード配列を含んで成る少なくとも2つの個々の同族対合を含んで成る、請求項51または52に記載の組換えポリクローナル免疫グロブリン。
【請求項54】
領域(CDR1、CDR2、およびCDR3)を決定する相補性が、請求項53に記載の1つもしくはそれ以上の配列番号対合由来である、破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換え免疫グロブリンまたはその断片。
【請求項55】
少なくとも1つの薬剤として許容される賦形剤と組合せた有効成分として請求項50に記載の組換えポリクローナル免疫グロブリンを含んで成る医薬組成物。
【請求項56】
場合により薬剤として許容される賦形剤と組合せた有効成分として破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル抗体を含んで成る医薬組成物。
【請求項57】
薬剤として使用するための請求項55または56に記載の医薬組成物。
【請求項58】
破傷風毒素と反応し、または結合することが可能な組換えポリクローナル抗体を含んで成る組成物をそれを必要とする患者に投与することによって破傷風を発症するリスクがある患者を予防または治療する方法。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6】
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【図7】
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【図8】
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【図9】
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【図10】
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【図11】
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【図12】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22a】
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【図22b】
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【図22c】
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【図22d】
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【図22e】
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【図22f】
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【図22g】
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【図22h】
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【図23a】
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【図23b】
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【図23c】
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【図23d】
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【図23e】
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【図23f】
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【図23g】
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【図23h】
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【図24】
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【図25】
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【公表番号】特表2007−505611(P2007−505611A)
【公表日】平成19年3月15日(2007.3.15)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−526523(P2006−526523)
【出願日】平成16年9月17日(2004.9.17)
【国際出願番号】PCT/DK2004/000633
【国際公開番号】WO2005/042774
【国際公開日】平成17年5月12日(2005.5.12)
【出願人】(505257682)シムフォゲン・アクティーゼルスカブ (24)
【氏名又は名称原語表記】SYMPHOGEN A/S
【Fターム(参考)】