【課題】４塩基コドンに応答してホモグルタミンを蛋白質に組込む蛋白質生合成機構の成分として、直交リシルｔＲＮＡ、直交リシル−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びリシルｔＲＮＡ／シンテターゼ直交対の組成物とその作製方法の提供。
【解決手段】蛋白質が野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列に少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む、前記蛋白質がホモグルタミンを含む、組成物。直交リシル−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びリシルｔＲＮＡ／シンテターゼ直交対の直交対の同定方法と、これらの直交対を使用してホモグルタミンを組込んだ蛋白質を生産する方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質を含有する組成物であって、前記蛋白質がホモグルタミンを含む前記組成物。
【請求項２】
蛋白質が野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列に少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物が医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ホモグルタミンを直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）に負荷する活性直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の選択方法であって、
１）Ｏ−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡはＯ−ｔＲＮＡを含む細胞集団のメンバーに直交性である）と；
２）集団の１個以上の細胞においてＯ−ｔＲＮＡにホモグルタミンを負荷する１個以上の活性Ｏ−ＲＳメンバーを含む複数のＯ−ＲＳと；
３）選択マーカーをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドと；
４）ホモグルタミン
を併有する細胞集団に選択を実施し、複数のＲＳを含まず且つＯ−ｔＲＮＡを含む対照細胞の抑圧効率に比較して選択マーカーの抑圧効率の増加により活性Ｏ−ＲＳを含むターゲット細胞を集団から同定する段階と；
ターゲット細胞を選択することにより、活性Ｏ−ＲＳを選択する段階を含む前記方法。
【請求項５】
Ｏ−ｔＲＮＡにホモグルタミン以外のアミノ酸を負荷する非ターゲットＯ−ＲＳを含む細胞を排除するように細胞を更に選択する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
選択がポジティブ選択を含み、選択マーカーがポジティブ選択マーカーを含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】
複数のＲＳが突然変異体ＲＳ、第１の種以外の１種以上の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両者を含む請求項４に記載の方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ。
【請求項９】
特定位置にホモグルタミンを組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法であって、
少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と；
ホモグルタミンを提供する段階を含み；
前記細胞が更に、
セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
Ｏ−ｔＲＮＡをホモグルタミンで優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み；
更に、セレクターコドンに応答してホモグルタミンを特定位置に組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む前記方法。
【請求項１０】
Ｏ−ＲＳがＥ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体に対応するアミノ酸配列を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
４塩基セレクターコドンを認識する第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
前記Ｏ−ｔＲＮＡに第１の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
終止セレクターコドンを認識する第２のＯ−ｔＲＮＡと；
第２のＯ−ｔＲＮＡに第２の非天然アミノ酸を優先的に負荷する第２のＯ−ＲＳを含む翻訳系。
【請求項１２】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡである；
終止コドンがＵＡＧである；或いは
翻訳系が細胞を含む；請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１３】
第１又は第２のＯ−ｔＲＮＡが直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体である；或いは
第１のＯ−ｔＲＮＡが直交リシルｔＲＮＡ（リシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体であり、第２のＯ−ｔＲＮＡが直交チロシルｔＲＮＡ（チロシルＯ−ｔＲＮＡ）又はその修飾変異体である；請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１４】
少なくとも４塩基セレクターコドンと終止セレクターコドンを含む核酸を更に含む請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１５】
４塩基セレクターコドンがＡＧＧＡであり、終止セレクターコドンがＴＡＧ又はＵＡＧである；或いは
核酸が発現されたＲＮＡである；請求項１４に記載の翻訳系。
【請求項１６】
翻訳系が核酸によりコードされる蛋白質を含み、前記蛋白質が少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を含む請求項１４に記載の翻訳系。
【請求項１７】
蛋白質がホモグルタミンを含む；或いは
蛋白質がミオグロビンに相同である；請求項１６に記載の翻訳系。
【請求項１８】
ホモグルタミンを含む請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１９】
ＰｈＫＲＳ、Ｅ４４４Ｇ、ＰｈΔＡＤ、ＰｈΔＡＤのＩ４１及び／又はＳ２６８突然変異体、又はその保存変異体をコードする核酸。
【請求項２０】
配列番号２４もしくは配列番号２６又はその保存変異体に対応するｔＲＮＡを含むか又はコードする核酸。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【公開番号】特開２０１１−１０１６５６（Ｐ２０１１−１０１６５６Ａ）
【公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４２５９（Ｐ２０１１−４２５９）
【出願日】平成２３年１月１２日（２０１１．１．１２）
【分割の表示】特願２００６−５１８９５２（Ｐ２００６−５１８９５２）の分割
【原出願日】平成１６年７月７日（２００４．７．７）
【出願人】（３９９０３８６２０）ザ　スクリプス　リサーチ　インスティチュート (51)
【Ｆターム（参考）】