直交遺伝子スイッチ
本発明は対象遺伝子の発現を調節するための直交遺伝子スイッチに関する。遺伝子スイッチは内因性リガンドに応答しないキメラ転写因子と、キメラ転写因子を活性化することができるが、内因性転写因子を活性化することができないリガンドを含む。本発明は直交遺伝子スイッチの構築方法にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の配列:
【化1】
(式中、X1=D又はAであり;X2−6は各々独立してG、A、C、V、I、L、M、F、Y、又はWであり;X7=G又はRであり;X8=H又はVである)を含むポリペプチド。
【請求項2】
X2=L、M、又はVであり;X3=F又はWであり;X4=M、G又はAであり;X5=I、M、V、又はLであり;X6=Lである請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項3】
X1=Dであり;X7=Gであり;X8=Hである請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項4】
配列番号2のアミノ酸配列を含む請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項5】
X4=G又はAである請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項6】
配列番号3−15から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項5に記載のポリペプチド。
【請求項7】
X1=Aであり、X4=G又はAであり、X7=Gであり、X8=Vである請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項8】
配列番号16−28から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項7に記載のポリペプチド。
【請求項9】
X1=Dであり、X4=G又はAであり、X7=Rであり、X8=Hである請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項10】
配列番号29−41から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項9に記載のポリペプチド。
【請求項11】
請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項12】
DNA結合ドメインと、
請求項1に記載のポリペプチドを含むリガンド結合ドメインと、
転写調節ドメインを含む転写因子。
【請求項13】
リガンド結合ドメインが配列番号16−41から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項12に記載の転写因子。
【請求項14】
DNA結合ドメインがGAL4最小DNA結合ドメインである請求項12に記載の転写因子。
【請求項15】
DNA結合ドメインがHNF−1のDNA結合ドメインである請求項12に記載の転写因子。
【請求項16】
転写調節ドメインがVP16最小活性化ドメインである請求項12に記載の転写因子。
【請求項17】
転写調節ドメインがヒトp65の活性化ドメインの一部である請求項12に記載の転写因子。
【請求項18】
配列番号43を含む請求項12に記載の転写因子。
【請求項19】
請求項12に記載の転写因子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項20】
請求項18に記載のポリヌクレオチドを含む組成物で形質転換された宿主細胞。
【請求項21】
請求項12に記載の転写因子と結合して前記転写因子を活性化する化合物。
【請求項22】
CMP1及びCMP4−38から構成される群から選択される化合物。
【請求項23】
対象遺伝子の発現を調節するための直交遺伝子スイッチであって、請求項13に記載の転写因子と;対象遺伝子と対象遺伝子に融合した調節領域を含むベクターを含み、転写因子が調節領域と結合することができる前記遺伝子スイッチ。
【請求項24】
リガンド結合ドメインと結合して転写因子を活性化する化合物を更に含む請求項23に記載の遺伝子スイッチ。
【請求項25】
リガンド結合ドメインが配列番号16−28から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含み、化合物がCMP1、CMP4、CMP5、及びCMP11−38から構成される群から選択される請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
【請求項26】
リガンド結合ドメインが配列番号29−41から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含み、化合物がCMP6−10から構成される群から選択される請求項23に記載の遺伝子スイッチ。
【請求項27】
核内ホルモン受容体からリガンド結合ドメイン(LBD)を選択する段階と;ホルモンの不活性類似体を選択する段階と;選択された不活性類似体の結合を妨害するアミノ酸残基を、結合を助長する各種アミノ酸残基に突然変異させることにより作製される選択されたLBDの修飾変異体を含む転写因子のライブラリーを構築する段階と;選択された不活性類似体でライブラリーをスクリーニングし、不活性類似体により活性化される転写因子を選択する段階を含む直交遺伝子スイッチの作製方法。
【請求項28】
選択された転写因子の修飾LBDに突然変異を導入し、ホルモンに対する親和性と転写因子のリガンド非依存的活性を低下させる段階を更に含む請求項27に記載の方法。
【請求項29】
突然変異をもつ転写因子を活性化することができる不活性類似体を作製する段階を更に含む請求項28に記載の方法。
【請求項30】
核内ホルモン受容体がエストロゲン受容体(ER)、アンドロゲン受容体(AR)、グルココルチコイド受容体(GR)、ミネラロコルチコイド受容体(MR)、プロゲステロン受容体(PR)、ビタミンD3受容体(VDR)、甲状腺ホルモン受容体(TR)、及びレチノイン酸受容体(RAR)から構成される群から選択される請求項27に記載の方法。
【請求項31】
核内ホルモン受容体がヒトエストロゲン受容体α(hERα)である請求項29に記載の方法。
【請求項32】
リガンド結合ドメインが配列番号2を含む請求項30に記載の方法。
【請求項33】
不活性類似体が核内ホルモン受容体特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である請求項27に記載の方法。
【請求項34】
不活性類似体がhERα特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である請求項33に記載の方法。
【請求項35】
不活性類似体がヒトエストロゲン受容体β(hERβ)特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である請求項33に記載の方法。
【請求項36】
不活性類似体がCMP1である請求項35に記載の方法。
【請求項37】
ライブラリーが酵母1ハイブリッドシステムである請求項27に記載の方法。
【請求項38】
転写因子が更にGAL4最小DNA結合ドメイン(DBD)とVP16最小活性化ドメイン(AD)を含む請求項27に記載の方法。
【請求項39】
転写因子のライブラリーがGly、Ala、Cys、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、及びTrpから構成される群から独立して選択されるアミノ酸残基391、404、421、424、及び428をもつ修飾LBDを含む請求項32に記載の方法。
【請求項1】
以下の配列:
【化1】
(式中、X1=D又はAであり;X2−6は各々独立してG、A、C、V、I、L、M、F、Y、又はWであり;X7=G又はRであり;X8=H又はVである)を含むポリペプチド。
【請求項2】
X2=L、M、又はVであり;X3=F又はWであり;X4=M、G又はAであり;X5=I、M、V、又はLであり;X6=Lである請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項3】
X1=Dであり;X7=Gであり;X8=Hである請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項4】
配列番号2のアミノ酸配列を含む請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項5】
X4=G又はAである請求項3に記載のポリペプチド。
【請求項6】
配列番号3−15から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項5に記載のポリペプチド。
【請求項7】
X1=Aであり、X4=G又はAであり、X7=Gであり、X8=Vである請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項8】
配列番号16−28から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項7に記載のポリペプチド。
【請求項9】
X1=Dであり、X4=G又はAであり、X7=Rであり、X8=Hである請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項10】
配列番号29−41から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項9に記載のポリペプチド。
【請求項11】
請求項1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項12】
DNA結合ドメインと、
請求項1に記載のポリペプチドを含むリガンド結合ドメインと、
転写調節ドメインを含む転写因子。
【請求項13】
リガンド結合ドメインが配列番号16−41から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項12に記載の転写因子。
【請求項14】
DNA結合ドメインがGAL4最小DNA結合ドメインである請求項12に記載の転写因子。
【請求項15】
DNA結合ドメインがHNF−1のDNA結合ドメインである請求項12に記載の転写因子。
【請求項16】
転写調節ドメインがVP16最小活性化ドメインである請求項12に記載の転写因子。
【請求項17】
転写調節ドメインがヒトp65の活性化ドメインの一部である請求項12に記載の転写因子。
【請求項18】
配列番号43を含む請求項12に記載の転写因子。
【請求項19】
請求項12に記載の転写因子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項20】
請求項18に記載のポリヌクレオチドを含む組成物で形質転換された宿主細胞。
【請求項21】
請求項12に記載の転写因子と結合して前記転写因子を活性化する化合物。
【請求項22】
CMP1及びCMP4−38から構成される群から選択される化合物。
【請求項23】
対象遺伝子の発現を調節するための直交遺伝子スイッチであって、請求項13に記載の転写因子と;対象遺伝子と対象遺伝子に融合した調節領域を含むベクターを含み、転写因子が調節領域と結合することができる前記遺伝子スイッチ。
【請求項24】
リガンド結合ドメインと結合して転写因子を活性化する化合物を更に含む請求項23に記載の遺伝子スイッチ。
【請求項25】
リガンド結合ドメインが配列番号16−28から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含み、化合物がCMP1、CMP4、CMP5、及びCMP11−38から構成される群から選択される請求項24に記載の遺伝子スイッチ。
【請求項26】
リガンド結合ドメインが配列番号29−41から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含み、化合物がCMP6−10から構成される群から選択される請求項23に記載の遺伝子スイッチ。
【請求項27】
核内ホルモン受容体からリガンド結合ドメイン(LBD)を選択する段階と;ホルモンの不活性類似体を選択する段階と;選択された不活性類似体の結合を妨害するアミノ酸残基を、結合を助長する各種アミノ酸残基に突然変異させることにより作製される選択されたLBDの修飾変異体を含む転写因子のライブラリーを構築する段階と;選択された不活性類似体でライブラリーをスクリーニングし、不活性類似体により活性化される転写因子を選択する段階を含む直交遺伝子スイッチの作製方法。
【請求項28】
選択された転写因子の修飾LBDに突然変異を導入し、ホルモンに対する親和性と転写因子のリガンド非依存的活性を低下させる段階を更に含む請求項27に記載の方法。
【請求項29】
突然変異をもつ転写因子を活性化することができる不活性類似体を作製する段階を更に含む請求項28に記載の方法。
【請求項30】
核内ホルモン受容体がエストロゲン受容体(ER)、アンドロゲン受容体(AR)、グルココルチコイド受容体(GR)、ミネラロコルチコイド受容体(MR)、プロゲステロン受容体(PR)、ビタミンD3受容体(VDR)、甲状腺ホルモン受容体(TR)、及びレチノイン酸受容体(RAR)から構成される群から選択される請求項27に記載の方法。
【請求項31】
核内ホルモン受容体がヒトエストロゲン受容体α(hERα)である請求項29に記載の方法。
【請求項32】
リガンド結合ドメインが配列番号2を含む請求項30に記載の方法。
【請求項33】
不活性類似体が核内ホルモン受容体特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である請求項27に記載の方法。
【請求項34】
不活性類似体がhERα特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である請求項33に記載の方法。
【請求項35】
不活性類似体がヒトエストロゲン受容体β(hERβ)特異的アゴニスト又はアンタゴニストの不活性類似体である請求項33に記載の方法。
【請求項36】
不活性類似体がCMP1である請求項35に記載の方法。
【請求項37】
ライブラリーが酵母1ハイブリッドシステムである請求項27に記載の方法。
【請求項38】
転写因子が更にGAL4最小DNA結合ドメイン(DBD)とVP16最小活性化ドメイン(AD)を含む請求項27に記載の方法。
【請求項39】
転写因子のライブラリーがGly、Ala、Cys、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、及びTrpから構成される群から独立して選択されるアミノ酸残基391、404、421、424、及び428をもつ修飾LBDを含む請求項32に記載の方法。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【公表番号】特表2007−535906(P2007−535906A)
【公表日】平成19年12月13日(2007.12.13)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−536015(P2006−536015)
【出願日】平成16年10月15日(2004.10.15)
【国際出願番号】PCT/EP2004/011683
【国際公開番号】WO2005/040212
【国際公開日】平成17年5月6日(2005.5.6)
【出願人】(501209427)イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成19年12月13日(2007.12.13)
【国際特許分類】
【出願日】平成16年10月15日(2004.10.15)
【国際出願番号】PCT/EP2004/011683
【国際公開番号】WO2005/040212
【国際公開日】平成17年5月6日(2005.5.6)
【出願人】(501209427)イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Fターム(参考)】
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