真核生物の寿命を変更するための方法
真核生物の寿命を変更するための方法。当該方法は、寿命変更化合物を提供する工程、および有効量のその化合物を真核生物に投与して、その真核生物の寿命を変更させる工程を含む。一実施形態において、前記化合物はＤｅａＤアッセイを用いて同定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年１２月２１日に出願された米国仮特許出願61/016362号および２００８年１月２５日に出願された米国仮特許出願61/023801号に基づく優先権を主張するものであり、これらの出願の開示は参照によりそれぞれ本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本明細書中に記載される研究は、全体的または部分的に、アメリカ国立衛生研究所からの助成金（助成金番号1R03AG023270-0-1A1、1R03MH076395-01および1R03NS05050798-01）によって資金提供を受けた。その結果として、連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、寿命を変更するための方法に関する。詳細には、本発明は、真核生物の寿命を延ばす方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
多くの研究において、カロリー制限（ＣＲ）（同意語として、食事制限）によって、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、蠕形動物（Caenorhabditis elegans）、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）およびマウス（Mus musculus）をはじめとした一連の非ヒト生物において寿命が延長することが確かめられている。動物におけるＣＲの広範な保存に基づいて、ＣＲベースの寿命の延長に対する同様の機構が、ヒトにおいても機能する可能性がある。この興味深い知見は、食事の変更、社会経済的状況、保健医療へのアクセスなどとは対照的に（または、それらに対する補完として）経口薬剤または他の介入によってヒトの寿命延長の可能性を切り開くものである。
【０００５】
寿命に対するＣＲの効果に加えて、他の研究から、ＣＲが、癌、糖尿病および循環器疾患をはじめとしたヒトにおける加齢性疾患の発症を遅延させるか、または発生率を低下させる可能性があることが示唆され、ゆえに、ＣＲの作用に関する機構を研究する第２の重大な理由がもたらされた。例を挙げれば、例えば、赤ワインの成分である植物生成物のリスベラトロールは、例えば、糖尿病（例えば、Baur et al, Nature (2006) 444:337-342を参照のこと）に対する保護的な方法と相関し得る方法で「中年の」または過体重のマウスの健康状態および生存に対して正の効果を有することが示されており、また、代謝性疾患からの保護をもたらすことも示されている（例えば、Lagouge et al., Cell (2006) 127:1109-1122を参照のこと）。両方の場合において、リスベラトロールの作用は、ＣＲベースの寿命の延長と関連する同じ機構のいくつかによって、例えば、ＣＲｒ媒介性の寿命延長応答に関与すると考えられる遺伝子のｔｕｉｎファミリーによって、少なくとも部分的に媒介されると考えられている。それゆえ、この論拠に基づいて、ＣＲの作用に対する論拠または根拠を理解することにより、長寿命を延長する方法に加えて、これらの加齢性疾患に対する処置法がもたらされ得る可能性がある。
【０００６】
上記で観察された長寿命および疾患に対するＣＲの効果に基づいて、例えば、遺伝子を変更するかまたは変異させることによって、およびＣＲ応答を変化させる遺伝子の変更または変異についてスクリーニングすることによって、ＣＲ経路の構成要素を同定することによって、これらの効果をもたらすＣＲの作用機序を理解することに対してかなりの労力が捧げられてきた。そのような研究の１つの結果は、サーチュインとしても知られるタンパク質脱アセチル化酵素のサイレント情報制御因子（silent information regulator）２（Sir2）ファミリーの同定であり、これは、細菌からヒトに及ぶ多岐にわたる生物において見出され、例えば、酵母および線虫において、長寿命を延長すると示された。例えば、Bitterman et al, Microbiol.Mol.Biol.Rev. (2003) 67:376-399を参照のこと。しかしながら、他の研究では、サーチュインが関与する経路と平行して作用する他のＣＲベースの長寿命経路が存在する可能性があることが示され、このことから、ヒトの長寿命を増加させるためまたはヒトの疾患を減少させるための介入に対するさらなる経路の可能性がもたらされる。例えば、Kaeberlein et al.,PLOS Biology (2004) 2:1381-1387およびKaberlein et al., PLOS Biology (2007) 3:0655-0660（plosgenetics.orgにおいて入手可能）を参照のこと；Medvedik et al., PLOS Biology (2007) 5:e261もまた参照のこと。
【０００７】
遺伝子の変更または変異によってＣＲ経路の構成要素を同定することの代替案として、ＣＲ応答を変化させる化合物を同定し、次いで、それらの化合物がどの分子と相互作用するかを決定することによっても、これらの構成要素は、特徴づけられ得る。上述のように、サーチュインは、ＣＲ応答と関与し得るが、他のＣＲベースの長寿命経路、例えば、ＳＩＲＴ１を活性化し（精製されたＳＩＲＴ１を用いてインビトロにおける生化学的スクリーニングによって同定された）、かつマウスにおいて重要な生理学的効果を有する、リスベラトロールに無関係の化合物が存在することを示唆する証拠が存在する。ＳＩＲＴ１は、出芽酵母のサイレント情報制御因子２（ＳＩＲ２）の哺乳動物のホモログであり、これは、ＣＲ制御機構による寿命の制御および加齢関連疾患の緩和に関わるヒストン脱アセチル化酵素をコードする。Milne et al., Nature (2007) 450:712-716を参照のこと。これらの経路の同定は、以前に特徴付けられた経路の外側で作用すると同定された化合物の分子の効果を理解することによって行われ得、いったん同定されると、これらの経路の構成要素は、ＣＲ応答を調節するための新規の標的分子として機能し得る。例えば、Petrascheck et al., Nature (2007) 450:553-557を参照のこと。
【０００８】
さらに、化合物ベースのスクリーニングは、これらのスクリーニングによって同定された化合物が、単に、ＣＲ経路の構成要素の同定の際に有用であるということだけでなく、これらの化合物自体またはその改変型が、ＣＲ応答を刺激するための薬物として使用され得るという理由で、有用性を有するという点において、別の異なる利点を有する。したがって、例えば、特定のモデル系（例えば、酵母、蠕形動物、ショウジョウバエ、マウス）においてＣＲ応答を変化させると示された化合物が、直接または化学的に改変された形態で使用されることにより、サルおよび究極的にはヒトにおいて同じ結果が達成され得る。ＣＲ応答を変化させる種々の化合物についての必要性は、明らかである；例えば、リスベラトロールは、低バイオアベイラビリティを有するので、必ずしも、ＣＲ応答を変化させるために特に好適な化合物ではない。
【０００９】
そのような化合物ベースのスクリーニングの１つの例は、Goldfarbに対する米国特許出願第10/790456号（その内容が、本明細書中にその全体が参考として組み込まれる）に提供されている細胞ベースの表現型の「娘細胞の死(Death of Daughters)」（ＤｅａＤ）アッセイである。この参考文献に記載されているように、ＤｅａＤアッセイは、「複製老化」と呼ばれるもの、すなわち、個別の酵母細胞が死滅するまでに起こす分裂の回数と定義される加齢を延長するかまたは短縮する化合物についての、酵母細胞における化合物のハイスループットスクリーニングを可能にする。酵母では、細胞分裂が非対称であるので、新しく形成された小さい「娘」細胞を、分裂によってその娘を生じさせたそれよりも大きい「母」細胞と識別することは、簡単であり、ゆえに、これらの細胞をその子孫と識別することによって、母細胞が起こす分裂の回数をモニターすることが可能である。典型的には、この識別は、熟練の顕微鏡使用者によって行われるものであり、簡単であるがきわめて大きな労働力および時間を要するものである。しかしながら、ＤｅａＤアッセイは、娘細胞が死滅するように遺伝的に操作された酵母株を利用することにより、娘は死滅するので本質的には母だけである細胞のバルク集団の成長特性に基づいた複製アッセイが可能、すなわち、それらは、詳細な顕微鏡的解析ではなくバルク特性（吸光度）に基づくので、迅速であり、かつ行うのに比較的少ない労力で済む方法が可能になる。
【００１０】
ＤｅａＤアッセイを用いて行われる酵母細胞における化合物のハイスループットスクリーニングは、試験化合物のみに曝露された酵母細胞に対して行われ得る；あるいは、またはさらに、ＤｅａＤアッセイは、長寿命またはＣＲ応答の他の態様を変化させる薬剤の効果を無効にする試験化合物を同定するために、この薬剤で処理された酵母細胞を用いても行われ得る。例えば、Ｓｉｒ２タンパク質は、他のサーチュインと同様に、反応産物としてニコチンアミド（本明細書中でＮＩＣまたはＮＡＭとも称される）を生成するＮＡＤ＋依存性脱アセチル化酵素である。ニコチンアミドは、インビトロおよびインビボにおいて、Ｓｉｒ２タンパク質およびＳｉｒ２様酵素の非競合的阻害剤として作用し、そしてＳｉｒ２を阻害することによって酵母の加齢を加速し得る。例えば、Anderson et al., Nature (2003) 423:181-185を参照のこと。ゆえに、無処理の酵母細胞においてＣＲ応答を変化させる化合物についてスクリーニングするＤｅａＤアッセイを用いることに加えて、ニコチンアミドで処理された酵母細胞を使用することによって、すなわち、化合物が、ニコチンアミドの長寿命短縮効果を無効にする能力に基づいて選択される状況において、ＣＲ応答を変化させる化合物についてのさらなる情報を得ることができる。
【特許文献１】米国特許出願第１０／７９０，４５６号
【非特許文献１】Anderson et al., Nature (2003) 423:181-185
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、真核生物の寿命を変更するための方法に関し、該方法は：寿命変更化合物を提供する工程、および有効量のその化合物を真核生物に投与して、その真核生物の寿命を増加させる工程を包む。
【００１２】
真核生物の例としては、単細胞生物、および高等生物（例えば、ヒトを含む哺乳動物）を含む多細胞生物が挙げられる。
【００１３】
１つの実施形態において、化合物は、長寿命およびＣＲ関連疾患状態に対する効果について化合物をスクリーニングするハイスループット法としてＤｅａＤアッセイを用いて同定される。
【００１４】
１つの実施形態において、化合物は、１０μＭ以下のＥＣ５０を有する。そのような化合物の例は、表１の化合物１〜２４５として提供される。別の実施形態では、化合物は、５μＭ以下のＥＣ５０を有し、そのような化合物の例は、表１に列挙されている最初の７７個の化合物として提供される。さらに他の実施形態において、化合物は、SID 14724551、SID 14732512、SID 7972147およびSID 17511642からなる群から選択される。
【００１５】
１つの態様において、本発明は、ニコチンアミドの長寿命短縮効果を緩和する能力を含む化合物を、ＤｅａＤアッセイを用いてハイスループットスクリーニングすることによる寿命変更化合物の同定に関する。別の態様では、本発明は、このスクリーニングによって得られた化合物の使用方法に関する。ＥＣ５０などの所望の基準を有する化合物が、選択され得る。
【００１６】
例えば、本発明の実施例２および３において同定される特定の化合物の使用に加えて、本発明は、図６に定義されている骨格を含むがこれらに限定されない、本発明において同定される化合物の共通の構造上の特徴の解析によって特定される共通の基礎構造または骨格を有する化合物の使用にも関する。
【００１７】
本発明は、本発明の化合物の効果を媒介する細胞経路の１つ以上の構成要素を単離するための方法にも関し、そのような方法の非限定的な例は、実施例８に提供される。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項ならびに添付の図面から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＤｅａＤアッセイにおける寿命が、ＳＩＲ２発現レベルに適切に応答することを証明しているプロットを提供している。パネルＡ：相対的なＤｅａＤ寿命は、親ＳＩＲ２＋系統（ＳＩＲ２）の寿命に対して正規化されている。染色体のＳＩＲ２遺伝子の上流の強度を増加させる一連のプロモーターの組み込みが、低い発現（弱いＣＹＣプロモーター）によってＤｅａＤ寿命が短縮されること、および高いＳＩＲ２発現（強いＴＥＦおよびＧＤＰプロモーター）によって寿命が延長されることを示している。パネルＢ：標準的な顕微解剖寿命アッセイを用いて、同じ近似の結果が得られた。
【図２】図２は、ＤｅａＤ寿命がニコチンアミドによって減少することを証明しているプロットを提供している。パネルＡ：グルコース中での成長（非許容条件）下において、ＤｅａＤ寿命は、高くなっていく濃度のニコチンアミドによって用量依存的様式で減少する。パネルＢ：ガラクトース中での成長（許容条件）下において、これらの濃度のニコチンアミドは、成長を変更しない。パネルＡに示されている線は、（上から下に向かって）０、０．５、０．７５および１ｍＭ ＮＩＣに対応する。パネルＢに見られる３本の線は、（一番上から一番下に向かって）、０．５、０．７５または１ｍＭ ＮＩＣに対応し、０ｍＭ ＮＩＣの線は、見られない。
【図３】図３は、ニコチンアミドの存在下および非存在下における化合物ＳＩＤ８５５６２０（ナリジクス酸）に対するＤｅａＤアッセイを示しているプロットを提供している。ナリジクス酸を、１．５ｍＭニコチンアミドの存在下および非存在下において、２．５、５．０および１０μＭ（マイクロモル濃度）の濃度での非許容条件下における成長中の細胞とともにインキュベートした。薬物を含まずに、ニコチンアミドの存在下および非存在下における成長に対するコントロール実験を含める。線の表示を示している最後の３つの記載事項は、１．５ｍＭニコチンアミドおよびそれぞれ２．５、５または１０μＭナリジクス酸を用いて得られたすべての結果である。この図に示されているデータの線は（データの線が最も右側に見られるときの一番上から一番下に向かって）：２．５、１０または５μＭナリジクス酸（ニコチンアミド無し）；ブランク細胞（「ｎｏ ＮＩＣ」と表示されている）；５または１０μＭナリジクス酸＋１．５ｍＭニコチンアミド（両方の場合において）；１０μＭナリジクス酸（ニコチンアミド無し）；および１．５ｍＭニコチンアミドを含むブランク細胞（「１．５ｍＭ ＮＩＣ」と表示されている）に対応する。
【図４】図４は、ナリジクス酸の存在下におけるニコチンアミドおよび５ｍＭニコチンアミドに対する標準的な顕微解剖寿命を提供している。３つの濃度のナリジクス酸を含む３つの実験のすべてが、平均寿命（括弧内に示されている）および最長寿命を増加させた。この図において、「＃８６４」とは、ナリジクス酸のことを指し、例えば、凡例における２番目の記載事項は、５４μＭナリジクス酸のことを指し、３番目の記載事項は、１０７μＭナリジクス酸のことを指すなど。この図の凡例における括弧内に示されている数値は、この図に示されている各実験におけるその集団の平均寿命のことを指し、例えば、コントロール集団（５ｍＭニコチンアミドのみ）は、１４．２世代の平均寿命を有するなどである。
【図５】図５は、細菌ＤＮＡジャイレースのＡサブユニットのインヒビターであり、限定的な殺菌スペクトルを有する合成１，８−ナフチリジン抗菌剤であるナリジクス酸の構造を提供している。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、本発明のアッセイにおいて定義された活性な化合物に対する共有の構造上の骨格を同定するための、そのアッセイのデータの骨格解析を提供している。この図は、１２個のそのような骨格を示している；骨格ｃ１〜ｃ３（６Ａ）、特にｃ１は、偶然そのデータに生じる見込みが低いので、本発明のアッセイの結果をもたらすことができる化合物をさらに定義するための有望な骨格として働く。図６Ｂは、ｃｃ１、ｃｃ２およびｃｃ３ａである。図６Ｃは、ｃｃ３ｂ、ｃｃ４、ｃｃ５、ｃｃ６、ｃｃ７およびｃｃ８である。
【図７】図７は、ｃ１骨格を含み、かつ７７５アッセイにおいて「活性」と同定された、ＳＩＤ Ａ）14732512、Ｂ）14724551、Ｃ）17511642およびＤ）7972147の構造を提供している。
【図８】図８は、ｃ１骨格を含み、かつ７７５アッセイにおいて「不活性」と同定された、ＳＩＤ Ａ）7972920、Ｂ）14732962、Ｃ）4245034およびＤ）842694の構造を提供している。
【図９】図９は、ｃ１骨格を含み、かつ８０９アッセイにおいて「活性」と同定された、ＳＩＤ Ａ）14724551、Ｂ）14732512およびＣ）17511642の構造を提供している。
【図１０−１２】図１０〜１２は、表２に示されているいくつかの化合物に対する顕微解剖アッセイを提供している。表３は、図１０〜１２を作成するために使用したデータを提供している。
【図１３−１４】図１３〜１４は、これらの図に提供されているような種々の化合物に対するＤｅａＤ寿命アッセイを提供している。
【図１５】図１５は、C.elegansにおける本発明の化合物のうちの１つ（化合物３−１１；表２を参照のこと）のアッセイの例を提供している。
【図１６】図１６は、８０９ＤｅａＤアッセイの結果を示している表１を表している。
【図１７】図１７は、市販のＬＡＣ化合物の例を示している表２を表している。
【図１８】図１８は、図１０〜１２に対するデータを示している表３を表している。
【図１９】図１９は、表１の化合物１〜７７の名称を示している表４を表している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、真核生物の寿命を変更するための方法を提供し、該方法は：寿命変更化合物を提供する工程、および有効量のその化合物を真核生物に投与して、その真核生物の寿命を増加させる工程を包む。
【００２１】
寿命変更化合物（「ＬＡＣ」）は、寿命短縮剤（例えば、ニコチンアミドまたはパラコートなどの環境物質）の寿命短縮効果を逆転させる、および／または真核生物（寿命短縮剤に曝露されていないか、または寿命短縮剤で処理されていない真核生物）の寿命を増加させる、化合物である。寿命とは、本明細書中で使用されるとき、細胞もしくは細胞集団が分裂することができる回数（複製寿命）、または細胞もしくは生物が死滅するまでに生存する時間の長さ（例えば、日または年）（経時寿命）のことを意味する。
【００２２】
ＬＡＣは、ＣＲ、食事制限（ＤＲ）または他のいくつかの経路によって寿命を変更し得る。別の実施形態では、ＬＡＣは、真核生物の寿命を短縮する薬剤（例えば、ＮＩＣ）の効果を逆転させる。別の実施形態では、ＬＡＣは、ＤｅａＤアッセイにおいて酵母細胞の複製寿命を増加させる。別の実施形態では、ＬＡＣは、寿命短縮剤（例えば、ＮＩＣ）の存在下または非存在下において酵母細胞の複製寿命を増加させる。さらに別の実施形態において、ＬＡＣは、環境物質（例えば、パラコート）の存在下または非存在下において酵母細胞の複製寿命を増加させる。別の実施形態では、ＬＡＣは、ＤｅａＤアッセイにおいて５マイクロモル濃度以下のＥＣ５０値を有する。さらに別の実施形態において、ＬＡＣは、ＤｅａＤアッセイにおいて１０マイクロモル濃度以下のＥＣ５０値を有する。別の実施形態では、ＬＡＣは、C.elegansなどの高等生物の寿命を増加させる。さらに別の実施形態において、ＬＡＣは、ヒトなどの哺乳動物の寿命を増加させる。
【００２３】
有効量のＬＡＣは、真核生物の寿命を増加させるかまたは減少させる。１つの実施形態において、有効量のＬＡＣは、無処置の生物の寿命と比べて統計学的に有意に真核生物の寿命を増加させる。無処置の生物の寿命は、平行して測定されてもよいし、別々に行われる研究（コントロール）から得られてもよい。別の実施形態では、有効量のＬＡＣは、真核生物の寿命を少なくとも５％増加させる。他の実施形態において、有効量のＬＡＣは、真核生物の寿命を、コントロールに対して少なくとも１０、１５、２０、２５、３５、５０％または１００％増加させる。
【００２４】
真核生物の例としては、単細胞生物、および高等生物（例えば、ヒトを含む哺乳動物）を含む多細胞生物が挙げられる。
【００２５】
１つの実施形態において、本方法は、概して真核生物の細胞の寿命を増加させるため、ならびにその細胞をストレスおよび／またはアポトーシスから保護するために、使用され得る。いかなる特定の理論にも拘束するつもりはないが、本方法の使用は、被験体をホルメシス、すなわち、生物にとって有益であり、その寿命を延長し得る、軽度のストレスに供することと似ていると考えられる。
【００２６】
様々な他の実施形態において、本方法は、被験体において細胞老化によって誘導されるかまたは悪化する疾患または状態を処置するためまたは予防するために；被験体の寿命を延長するために；寿命に関する疾患または状態を処置するためまたは予防するために；細胞の増殖能力に関する疾患または状態を処置するためまたは予防するために；細胞の損傷または死に起因する疾患または状態を処置するためまたは予防するために、使用され得る。
【００２７】
様々な実施形態において、本方法は、加齢および加齢関連の結果または疾患（例えば、脳卒中、心疾患、心不全、関節炎、高血圧およびアルツハイマー病）を予防するために使用され得る。処置され得る他の状態としては、眼球の障害、例えば、眼の加齢に関連する障害（例えば、白内障、緑内障および黄斑変性症）が挙げられる。本方法は、細胞を細胞死から保護するために、細胞死に関連する慢性疾患を処置するためにも使用され得る。例示的な疾患としては、神経細胞死、ニューロンの機能不全または筋細胞の死もしくは機能不全に関連する疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症および筋ジストロフィ）；ＡＩＤＳ；劇症肝炎；クロイツフェルト・ヤコブ病、網膜色素変性症および小脳変性症などの脳の変性に関係する疾患；再生不良性貧血などの脊髄形成異常；心筋梗塞および脳卒中などの虚血性疾患；アルコール性肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎などの肝臓疾患；変形性関節症などの関節疾患；アテローム性動脈硬化症；脱毛症；ＵＶ光に起因する皮膚に対する損傷；扁平苔癬；皮膚の萎縮；白内障；および移植片拒絶が挙げられる。細胞死は、外科術、薬物治療、化学物質曝露または放射線曝露によっても引き起こされ得る。
【００２８】
本方法は、急性疾患、例えば、臓器または組織に対する損傷、例えば、脳卒中もしくは心筋梗塞に罹患している被験体または脊髄損傷に罹患している被験体を処置するためにも使用されてもよいし、アルコール中毒者の肝臓を修復するためにも使用されてもよい。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明は、真核細胞を本発明の化合物と接触させることによって、真核細胞の寿命を延長するか、真核細胞の増殖能力を伸ばすか、真核細胞の加齢を減速させるか、真核細胞の生存を促進するか、真核細胞における細胞老化を遅延させるか、カロリー制限の効果を模倣するか、ストレスに対する真核細胞の抵抗性を高めるか、または真核細胞のアポトーシスを予防する方法を提供する。
【００３０】
例えば、本明細書中に記載される方法は、真核細胞、特に、初代真核細胞（すなわち、生物、例えば、ヒトから得られた細胞）が細胞培養において生存し続け得る時間を増加させるために使用され得る。また、胚性幹（ＥＳ）細胞および多能性細胞、ならびにそれらから分化した細胞は、本発明の化合物で処理されることにより、それらの細胞またはその子孫がより長い期間にわたって培養において維持され得る。そのような細胞は、例えば、エキソビボ修飾の後の、被験体への移植のためにも使用され得る。
【００３１】
別の例として、長い期間にわたって保存されることが意図された真核細胞は、本発明の方法を用いて処理され得る。それらの細胞は、懸濁液（例えば、血液細胞、血清、生物学的増殖培地など）中、または組織もしくは臓器に存在し得る。例えば、輸血の目的で個体から採取された血液または法医学的な活動のために使用される血液は、長期間にわたってその血液細胞を保存するために本発明を用いて処理され得る。寿命を延長するためまたはアポトーシスから保護するために処理され得る他の細胞としては、消費するための細胞、例えば、非ヒト哺乳動物由来の細胞（例えば、肉）または植物細胞（例えば、野菜）が挙げられる。
【００３２】
さらに別の例として、本発明の方法は、例えば、発生プロセスおよび／または成長プロセスを変更するため、遅らせるため、または加速するために、哺乳動物、植物、昆虫または微生物における発生段階および成長段階においても適用され得る。
【００３３】
さらに別の実施形態として、本方法は、例えば、固体組織移植片、臓器移植、細胞懸濁液、幹細胞、骨髄細胞などをはじめとした移植または細胞治療に有用な細胞を処理するために使用され得る。それらの細胞または組織は、自家移植片、同種移植片、同族移植片または異種移植片であり得る。それらの細胞または組織は、被験体への投与／移植の前、投与／移植と同時に、および／または投与／移植の後に、本方法に従って処理され得る。それらの細胞または組織は、ドナー個体から細胞を取り出す前に、ドナー個体から細胞もしくは組織を取り出した後にエキソビボで、またはレシピエントへの移植の後に、処理され得る。
【００３４】
さらに別の例として、細胞は、寿命を増加させるためまたはアポトーシスを予防するために、本発明の方法を用いて処理され得る。例えば、皮膚または上皮細胞を本発明の方法で処置することによって、皮膚は、加齢（例えば、しわの発生、弾性の喪失など）から保護され得る。本明細書中に記載される方法に従って処置され得る例示的な皮膚の苦痛または皮膚の状態としては、炎症、日焼けによる損傷あるいは自然老化に関連するかもしくはそれらによって引き起こされる障害または疾患が挙げられる。例えば、本方法は、接触皮膚炎（刺激性接触皮膚炎およびアレルギー性接触皮膚炎を含む）、アトピー性皮膚炎（アレルギー性湿疹としても知られる）、光線性角化症、角質化障害（湿疹を含む）、表皮水疱症（天疱瘡を含む）、剥脱性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、紅斑（多形性紅斑および結節性紅斑を含む）、日光または他の光源によって引き起こされる損傷、円板状エリテマトーデス、皮膚筋炎、乾癬、皮膚癌および自然老化の効果の予防または処置において有用性を見出し得る。別の実施形態では、本発明の方法は、創傷および／または熱傷（例えば、第１度、第２度または第３度熱傷および／または熱的、化学的もしくは電気的な熱傷を含む）を処置して治癒を促進するために使用され得る。
【００３５】
本化合物は、化合物送達に適した任意の利用可能な方法および経路（経口、非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内経路を含む）を用いて真核生物に送達され得ると予想される。本発明の方法において使用される特定の投薬レジメンの形態および特徴が、投与経路および他の周知の変量（例えば、真核生物のサイズおよび年齢）によって必然的に決定されることが当業者によって認識されるだろう。そのような投薬レジメンの決定は、当業者の範囲内である。本化合物の投与は、局所的、経口または注射可能物質を含む、加齢に関連する疾患または障害を処置することが意図された任意の従来の治療とともに行われ得る。ＬＡＣの投与は、細胞を、有効量のＬＡＣを含む環境（そのような増殖培地または培養液）に曝露するか、または接触させることによっても、行われ得る。
【００３６】
１つの実施形態において、化合物は、長寿命およびＣＲ関連疾患状態に対するそれらの効果について化合物をスクリーニングするハイスループット法としてＤｅａＤアッセイを用いて同定される。他の実施形態は、これらの化合物の活性に関与するそれらの構造上の特徴を、より正確に同定するためにこれらの化合物を使用すること、これらの化合物の活性を媒介する細胞経路を同定する方法、およびこれらの結果を高等生物に外挿する方法を含む。
【００３７】
本発明において、「活性」とは、概して、化合物がＣＲ効果またはＣＲ様効果を発揮する能力のことを指す。「活性」の正確な意味は、使用されるアッセイに依存し、例えば、そのアッセイが、単一の濃度のニコチンアミドを含むか（実施例２）、複数の濃度のこの化合物を含むか（ＥＣ５０活性を定義するために必要である）（実施例３）に依存する。したがって、「活性」は、本明細書中で使用されるとき、これらの意味の両方を包含する。
【００３８】
様々な実施形態において、ＬＡＣは、表１の化合物から選択される。これらの化合物は、当業者によって容易に認識されるＳＩＤ（物質識別）番号によって特定される。そのＳＩＤ番号は、United States National Institutes of Health (NIH)の一部であるNational Library of Medicineの構成機関のNational Center for Biotechnology Information (NCBI)によって維持されている化学分子のＰｕｂＣｈｅｍデータベースにおける分野である。
【００３９】
様々な実施形態において、ＬＡＣは、表１に列挙されている最初の７７個の化合物から選択される。これらの表１に列挙されている最初の７７個の化合物のＩＵＰＡＣ名および一般名は、表４に列挙されている。さらに、表４の化合物１５は、以下の構造：
【化１】
を有する。様々な実施形態において、化合物は、表２に列挙されている化合物からなる群から選択される。様々な実施形態において、化合物は、SID 14724551、SID 14732512およびSID 17511642からなる群から選択される。
【００４０】
以下の非限定的な実施例は、本発明のさらなる説明を提供する。
【実施例】
【００４１】
［実施例１−ＤｅａＤアッセイの確認］
ＤｅａＤアッセイは、酵母の複製老化を測定するために使用される従来の顕微解剖アッセイに対するハイスループットの代用物として開発された。このアッセイが従来の顕微解剖アッセイの結果に相当する結果をもたらす能力を確認するために、ＤｅａＤアッセイ（パネルＡ）を用いるか、または顕微解剖（パネルＢ）を介して、図１のデータを得た。この図が示すように、高いＳＩＲ２発現は、ＤｅａＤアッセイと従来の顕微解剖との間で同様に寿命を増加させる。図２は、ＤｅａＤアッセイの確認の追加の確証を示している；詳細には、図２のデータは、ニコチンアミドが、許容条件下において成長を変更せずに（パネルＢ）、用量依存的様式でＤｅａＤ系統の寿命を減少させること（パネルＡ）を示している。
【００４２】
従って、これらのデータから、試験化合物の従来の顕微解剖アッセイに対するハイスループットの代用物としてのＤｅａＤアッセイの全般的な適用性が確認され、そして以下で述べられるような化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングに対するＤｅａＤアッセイの使用に道を開いた。
【００４３】
［実施例２−ニコチンアミドの寿命短縮を無効にする能力について約１３２，０００個の化合物の「７７５」ＤｅａＤアッセイによる最初のスクリーニング］
顕微解剖に対する代用物としてＤｅａＤアッセイの適合性が確立されたので、ＤｅａＤアッセイを用いることにより、ライブラリー中の化合物がニコチンアミドの寿命短縮効果を無効にする能力について１３２，７９６個の化合物ライブラリーをスクリーニングした。
【００４４】
詳細には、pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi?aid=775における「ＰｕｂＣｈｅｍ」ウェブサイト上のＡＩＤ７７５アッセイの結果（同意語として、「７７５」アッセイ結果）（その内容は、本明細書中でその全体が参照として組み込まれる）に記載されているように、ニコチンアミドの寿命短縮の阻害パーセント、すなわち、寿命に対するニコチンアミド効果の逆転パーセントを、ニコチンアミドの最大寿命短縮作用として１．５ｍＭニコチンアミドで処理された細胞を含んでいるコントロールウェル（ニコチンアミドの０％阻害）および１００％阻害の指標としてニコチンアミドを含まない培地中で生育された細胞を含んでいるウェルにおける光学濃度を用いて計算した。ＰｕｂＣｈｅｍ化合物ライブラリー（約１０００万個の化合物の全ライブラリーから選択された約１３２，０００個の化合物）中の適切な化合物を、１．５ｍＭニコチンアミドの存在下の１０μＭにおいてスクリーニングした。さらなる詳細については、例えば、以下の参考文献：Jarolim, S., Millen, J., Heeren, G., Laun, P., Goldfarb, D.S. and M. Breitenbach. (2004). A novel assay for replicative lifespan in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 5, 169-177; Bitterman, K.J., Anderson, R.M., Cohen, H.Y., Latorre-Esteves, M., and D.A. Sinclair. (2002). Inhibition of silencing and accelerated aging by nicotinamide, a putative negative regulator of yeast Sir2 and human SIRT1. J. Biol. Chem. 277, 45099-45107; Tsuchiya, M., Dang, N., Kerr, E.O., Hu, D., Steffen, K.K., Oakes, J.A. , Kennedy, B.K. and M. Kaeberlein (2006) Sirtuin-independent effects of nicotinamide on lifespan extension from calorie restriction in yeast. Aging Cell. 5, 505-514を参照のこと。
【００４５】
プロトコル
以下のとおりアッセイを行った。細胞を、ＹＰＧａｌ寒天プレート上に画線し、３０℃において４８時間生育した。４つのコロニーを選択し、フラスコ内の５０ｍＬのＹＰＧａｌ培地に接種し、そして振盪しながら３０℃において一晩生育した。ＯＤ６００を測定した。そのＯＤは、対数期の細胞について＜０．７であるべきである。それらの細胞を遠心分離し、１回洗浄し、そしてＣＳＭＭ−Ｄ制限増殖培地に再懸濁した。ＯＤ６００を再度測定した。その培養物を、ＣＳＭＭ−Ｄ制限培地中に０．００２というＯＤ６００に希釈した。その培養物を、３０℃において４時間、振盪しながらフラスコ内でプレインキュベートした。プレインキュベートの終わりに、ＯＤ６００を参照として測定した。ニコチンアミド（ネガティブコントロール）、培地のみ（ポジティブコントロール）、およびニコチンアミドの存在下における化合物を、１０×濃度（最終濃度：ニコチンアミド１．５ｍＭ、化合物１０μＭ、ＤＭＳＯ０．２５％）で、３８４ウェルプレートに：５μＬ／ウェルで、ＤＭＳＯとともにプレーティングした。そのプレートに：４５μＬ／ウェルで酵母を加えた。加湿チャンバー内で３０℃において、プレートをインキュベートした。４８時間のインキュベートの後、プレートを３０秒間振盪し、そしてＥｎＶｉｓｉｏｎ（PerkinElmer）マルチラベルプレートリーダーにおいてＯＤ６１５を読み出した。これらのアッセイのために、ＹＰＧａｌ培地を、１０グラムの酵母抽出物、２０グラムのペプトン、９００ｍＬの水として調製し、１２１℃において１５分間オートクレーブし、１００ｍＬの滅菌２０％（ｗ／ｖ）ガラクトースを加えた。ＣＳＭＭ−Ｄ(Complete Synthetic Minimal Medium-Dextrose)（制限）培地を、アミノ酸を含まない６．７グラムの酵母窒素塩基、２．０グラムのDrop-out mix complete（ＤＯＣ） (USBiological Cat. no. D9515)、１００ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）デキストロース、１．０Ｌとなる量の水として調製し、次いで、濾過滅菌した。
【００４６】
結果
＞２６％の活性閾値を、化合物阻害の中央値から３標準偏差より大きいものとして算出した。ゆえに、＞２６％阻害を示した化合物は、活性と定義される。≦２６％阻害を示した化合物は、不活性と定義される。単一用量のデータを拡大解釈する誤りを含むすべてのハイスループットスクリーニングにおける固有誤差を理由に、この実施例については、段階的スコアリングシステムを採用し、ここで、化合物を０〜４０のスケールにおいて、活性に基づいてスコアづけした（評価された活性閾値は１１である）。この段階的スコアリングシステムを用いて、それらの化合物をランクづけし、これらの化合物のうちの９０６個が、この段階的スコアリングシステムを用いて「活性」と定義された。この実施例において同定された活性および不活性な化合物の詳細な列挙は、pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi?aid=775における「ｓｈｏｗ ｒｅｓｕｌｔｓ」リンクを介して提供される。これらの化合物に対応する化学構造およびＩＵＰＡＣ命名者を確定するために概してncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezを参照のこと；この実施例の化合物に対応する特定の化学構造およびＩＵＰＡＣ命名者について、ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pcassay&cmd=Link&LinkName=pcassay_pccompound&from_uid=775も参照のこと。
【００４７】
考察
この実施例のデータは、上に提供された基準によって判断されるとき、ニコチンアミド阻害を克服する際に「活性」を示す約９００個の化合物を定義するものである。そのような「活性」は、化合物がニコチンアミド阻害を克服する能力を測定するための有用な判定基準であるが、しかしながら、それは、「活性」の単なる１つの尺度でしかない。したがって、この判定基準は、例えば、顕微解剖アッセイなどを用いて、化合物の効果である化合物の用量依存性の効果（以下の実施例３を参照のこと）で補完されるべきである。
【００４８】
［実施例３−５０％有効濃度（ＥＣ５０）値を得るための実施例１において同定された上位５００個の化合物の用量依存性の「８０９」ＤｅａＤアッセイスクリーニング］
すでに述べたように、実施例２は、「７７５」ＤｅａＤアッセイを用いて１．５ｍＭニコチンアミドの寿命減少効果を無効にする化合物を決定するデータを提供しており、この実施例では、約９００個の「活性な」化合物を同定する。実施例２では、１０μＭというただ１つの化合物濃度を用いた；この実施例では、これらの「活性な」化合物のうちの上位５００個を、ＤｅａＤアッセイを用いるが、ここでは０．０７８〜１０μＭの範囲の８つの濃度において、また、１．５ｍＭニコチンアミドの存在下において、再度スクリーニングしたところ、表１に提供されるデータが得られた。このより広範囲のデータから、最大半数有効濃度（ＥＣ５０）の決定が可能になった。pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi?aid=809におけるＰｕｂＣｈｅｍウェブサイト上の「ＡＩＤ８０９」アッセイ（「８０９」アッセイ）の結果を参照のこと。
【００４９】
このように、この実施例では、１．５ｍＭニコチンアミドの存在下における０．０７８〜１０μＭの範囲の８点の２倍希釈系列において、化合物をスクリーニングした。寿命の活性化パーセント、すなわち、寿命に対するニコチンアミド効果の逆転パーセントを、ニコチンアミドの最大寿命短縮効果として１．５ｍＭニコチンアミドで処理された細胞を含んでいるコントロールウェル（０％活性化）および１００％活性化の指標としてニコチンアミドを含まない培地中で生育された細胞を含んでいるウェルにおける光学濃度を用いて計算した。様々な化合物濃度の％活性化値から、ＩＤＢＳ ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェアおよび４パラメータロジスティックフィットに対するＸＬｆｉｔ方程式２０５を用いて最大半数有効濃度（ＥＣ５０）を計算した；最大値および最小値を１００％および０％で固定した。
【００５０】
プロトコル
以下のとおりアッセイを行った。細胞（ＤｅａＤ系統ＢＢ５７９）を、ＹＰＧａｌ寒天プレート上に画線し、３０℃において４８時間生育した。４つのコロニーを選択し、フラスコ内の５０ｍＬのＹＰＧａｌ培地に接種し、そして振盪しながら３０℃において一晩生育した。ＯＤ６００を測定した。そのＯＤは、対数期である細胞について＜０．７であるべきである。それらの細胞を遠心分離し、１回洗浄し、そしてＣＳＭＭ−Ｄ制限増殖培地に再懸濁した。ＯＤ６００を再度測定した。その培養物を、ＣＳＭＭ−Ｄ制限培地中に０．００２というＯＤ６００に希釈した。その培養物を、３０℃において４時間、振盪しながらフラスコ内でプレインキュベートした。プレインキュベートの終わりに、ＯＤ６００を参照として測定した。ニコチンアミド（ネガティブコントロール）、ＣＳＭＭ−Ｄ培地のみ（ポジティブコントロール）、およびニコチンアミドの存在下における化合物を、１０×濃度（最終濃度：ニコチンアミド１．５ｍＭ、化合物０．０７８〜１０μＭ、ＤＭＳＯ０．５％）で、３８４ウェルプレートに：５μＬ／ウェルで、ＤＭＳＯとともにプレーティングした。そのプレートに：４５μＬ／ウェルで酵母を加えた。加湿チャンバー内で３０℃において、プレートをインキュベートした。４８時間のインキュベートの後、プレートを３０秒間振盪し、そしてＥｎＶｉｓｉｏｎ（PerkinElmer）マルチラベルプレートリーダーにおいてＯＤ６１５を読み出した。これらのアッセイのために、ＹＰＧａｌ培地を、１０グラムの酵母抽出物、２０グラムのペプトン、９００ｍＬの水として調製し、１２１℃において１５分間オートクレーブし、１００ｍＬの滅菌２０％（ｗ／ｖ）ガラクトースを加えた。ＣＳＭＭ−Ｄ（Complete Synthetic Minimal Medium-Dextrose）（制限）培地を、アミノ酸を含まない６．７グラムの酵母窒素塩基、２．０グラムのDrop-out mix complete（ＤＯＣ）（USBiological Cat. no. D9515）、１００ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）デキストロース、１．０Ｌとなる量の水として調製し、次いで、濾過滅菌した。
【００５１】
結果
ＥＣ５０≦１０μＭの活性閾値を設定し、そしてこの判定基準を満たす化合物を活性と定義する。ＥＣ５０＞１０μＭを示した化合物を不活性と定義する。
【００５２】
このデータに、表１の「ランクスコア」の欄に示されているように、段階的スコアリングシステムを適用した（これらは、これらの５００個の化合物について得られた結果を示している）。このシステムにおいて、活性な化合物は、０μＭ〜１０μＭのＥＣ５０に対する逆線形相関を用いて、４１〜８０のスケールにおいてスコアづけされた。用量反応スクリーニングにおいて活性と確認されなかった化合物にスコア０を与えた。
【００５３】
表１に示されるように、試験された５００個の化合物のうちの７７個が、５μＭ未満のＥＣ５０値をもたらし（すなわち、表１における＃１〜７７）、ゆえに、これらの７７個の化合物は、このＥＣ５０判定基準によって活性であると考えられた。この実施例におけるおよび表１に示されている、４８時間後において得られた６００ｎｍにおいて１回測定された光学濃度より長い時間にわたってこれらの結果を確証するために、以下の実施例４に示されるように、これらのおおよそ上位７０個の化合物について、最大ＤｅａＤ寿命時間経過を行った。
【００５４】
［実施例４−実施例３において同定された上位約７０個の化合物に対する最大ＤｅａＤアッセイ寿命時間経過］
実施例３の「８０９」実験の結果を実証するために、実施例３において同定された上位７０個の化合物の効果についての時間経過が、例えば、これらの化合物の各々について１４０時間の区間にわたってＤｅａＤアッセイを用いて行われ得る。図３は、表１の化合物＃５２、トポイソメラーゼＩＩの公知のインヒビターであり、ヒトにおける使用について承認されている抗菌薬である化合物のナリジクス酸（ＳＩＤ＃８５５６２０、この化合物の構造については図５を参照のこと）を用いて行われたそのような実験の例示的なデータを提供している。この図が示すように、ナリジクス酸は、ニコチンアミドの存在下と非存在下との両方においてＤｅａＤ寿命を延長する。ナリジクス酸以外の他の化合物に対するデータは、同様に得られ得る。
【００５５】
［実施例５−ナリジクス酸に対する実施例４のデータを実証する顕微解剖結果］
ナリジクス酸に対する実施例４のデータを実証するために、ニコチンアミドの効果を無効にするこの化合物を用いて顕微解剖実験を行った（これらの実験の結果を図４に示す）。
【００５６】
［実施例６−実施例３において同定された他の（非ナリジクス酸）上位７０個の化合物に対する実施例４のデータを実証する顕微解剖結果］
ナリジクス酸以外の実施例３の上位７０個の化合物に対する実施例４のデータを実証するために、図４の実験について提供されたようなコントロールおよび実験条件を用いて、顕微解剖アッセイを行い、結果を得る。
【００５７】
［実施例７−骨格解析］
前に述べたように、本発明の寿命アッセイは、酵母において長寿命を変更する化合物を定義するために有用であり、また、必要である場合には、高等生物、ヒトを含む高等生物に対して、酵母において得られたデータの実験検証によって補足されるようなこれらの機構の進化中の好適な保存によって、有用である。以下の実施例９も参照のこと。
【００５８】
より詳細には、上に記載された実施例は、最初にスクリーニングされたもとの約１３２，０００個のうち約７０個の化合物という小さい活性サブセットを定義するＤｅａＤアッセイを用いた酵母における化合物のスクリーニングを提供しており、ここで、活性は、上で述べたようなＤｅａＤアッセイにおけるＥＣ５０によって定義される。これらの化合物自体が、長寿命またはＣＲ効果に関連する疾患を変更する介入のための潜在的な薬物分子、ならびに潜在的に以前に特徴付けられていないかまたは未知のＣＲ経路を同定するために使用され得る分子を提供する。しかしながら、前の実施例において得られたＤｅａＤアッセイにおけるこれらの分子の活性を支持するそれらの分子の鍵となる機能的な態様、例えば、これらの化合物とＤｅａＤアッセイにおいて見られた効果を媒介する細胞経路との相互作用に関与する、機能的部分または他の活性を付与する化学構造、骨格、側基などを同定するためには、これらの特定の化合物から推定することが特に有利である。
【００５９】
それらの実施例において定義された活性な分子の鍵となる特徴に関するそのような情報を得るために、骨格解析を、これらの実施例のデータに基づいて行った（この解析の結果を図６に提供する）。
【００６０】
したがって、例えば、図６の群「ｃ１」とは、図６のｃ１列に示されている化学的骨格のことを指す。図６が示すように、この骨格は、本発明のアッセイの３つの「活性な」ヒットの基礎構造（すなわち、少なくともこの構造を含むが通常はさらなる化学構造を含む化合物内のその完全な形態におけるもの）として見られる。これが生じる見込みは、比較的まれであると計算され得る；それゆえ、ｃ１骨格が本発明の活性な化合物とこれらの化合物の活性を媒介する細胞機構との相互作用にとって重要である妥当な確率が存在する。
【００６１】
図６に示されている結果のさらなる詳説は、ＰｕｂＣｈｅｍウェブサイトを介して行われ得る。ｃ１群について、例えば、この群について示されている骨格を、http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/search.cgi（SMILES/STARTSフォーマット）の検索入力フィールドにおいてSMILES string C1(CC(CC(C1C(C)=O)=O)C)=Oとして入力し、次いで、「Substructure」に設定された「Search Type」を用いてこのページから検索され得る。この検索によって、この基礎構造を含む約１０００万個の化合物（そのうちの約１３２，０００個が本発明の活性アッセイに使用された；上記を参照のこと）のＰｕｂＣｈｅｍデータベース全体において３５１個の化合物が同定される。
【００６２】
これらの３５１個の化合物のうち、２１個が、ＰｕｂＣｈｅｍ生物活性アッセイにおいて見出される。この後者の群は、その検索を行った後に表示されるＰｕｂＣｈｅｍページの「BioAssay」タブをクリックし、次いで、「Display」ドロップダウンフォーマットを「Summary」から「PubChem BioActivity Summary」に変更することによって表示され得る。７７５アッセイにおいて活性と同定されたｃ１基礎構造を含む４つの化合物およびそのアッセイにおいて不活性と同定された４つのさらなる化合物が存在し、ここで、「活性」および「不活性」は、７７５アッセイに特有の定義である（上記の実施例２の「結果」の項を参照のこと）。これらの特定の化合物は、上記のように得られたＰｕｂＣｈｅｍの結果に表示される数字の記載事項をクリックすることによって表示され得る；本願において、これらの結果は、それらの図に対する凡例に提供されているこれらの化合物に対するPubChem Substance ID（ＳＩＤ）番号を用いて、それぞれ図７および８として示されている。
【００６３】
同様に、図９は、ｃ１骨格を含み、かつ８０９アッセイにおいて「活性」と同定された３つの化合物のＳＩＤを提供している。これらの化合物がすべて、７７５アッセイにおいても活性と同定されたことに注意すること（すなわち、図９における３つの化合物は図７に要約されている結果にも示されている）。図９における化合物が、以下のとおり、表１の８０９アッセイの結果における列の記載事項に対応することにも注意すること：SID 14724551（図８Ａ）は、表１の列２１に見られ；SID 14732512（図８Ｂ）は、表１の列２５に見られ；そしてSID 17511642（図８Ｃ）は、表１の列６６に見られる。
【００６４】
ＰｕｂＣｈｅｍデータベースを用いて骨格ｃ１について上で得られた結果は、図６に示されている残りの骨格についても同様に得られ得る。したがって、例えば、骨格ｃ２は、SMILES string C1=CC=CC2=C1C(=C(C=O)CN2)Oに対応し、骨格ｃ３は、SMILES string C1=CC=CC(=C1)N=CC2=C(CC(CC2=O)C3=CC=CC=C3)Oに対応するなどし、これらのストリング（string）を用いることにより、ｃ１骨格について上で記載したようにＰｕｂＣｈｅｍデータベースが検索され得る。
【００６５】
上述のように、この実施例におけるデータは、前の実施例の活性アッセイの結果から共通の化学構造または骨格を同定することに関し、この骨格は、１）活性、理想的には、より高い活性および／または選択性を有するさらなる化合物を見つけ出すために、および２）これらの洗練された化学構造データを使用することによって、これらの化合物の活性効果をもたらす、その化合物が相互作用する細胞経路を同定する化合物をより効果的に設計するために、使用され得る。
【００６６】
したがって、さらなる化合物の同定に関しては、例えば、骨格ｃ１は、例えば、８０９アッセイにおいて高活性を有する３つの化合物（これらの３つの化合物は、図９に示されている）が共有する共通の構造を定義する。この構造におけるどの化学基がこの共通の骨格を有する化合物によって示される活性を支持するのかを定義するために、この情報を用いることにより、ｃ１構造またはｃ１構造のバリアントを含むさらなる化合物がＰｕｂＣｈｅｍデータベースから選択され得る。例えば、ｃ１におけるＣ＝Ｏ部分の１つ以上の除去、他の基によるこれらの部分の置換などを用いることにより、ｃ１基を含む化合物の全体的な結合に対するこれらのＣ＝Ｏ部分の各々の寄与が特徴づけられ得る。
【００６７】
［実施例８−経路の同定］
本発明の化合物は、疾患を処置するため、長寿命を延長するためなどのために、その現在の形態、または例えば、医薬品化学者によって設計され得るような変更された形態で、直接使用され得る（以下の実施例９も参照のこと）。すでに述べたように、インビボにおいてこれらの化合物の活性を媒介する経路の知識によって、これらの経路と相互作用する他の化合物の設計、またはこれらの経路の構成要素の正常な相互作用を妨害する化合物の設計などが可能になり得るので、これらの化合物は、さらに、それらの経路を同定するためにも使用され得る。
【００６８】
細胞経路を同定するための本発明の化合物の使用に関して、当業者は、これらの経路を同定する多数の手法を認識するだろう。そのような手法としては：酵母変異体ライブラリーを用いることにより、どの酵母変異体が本発明の化合物の活性を無くすかを決定する遺伝的手法；細胞抽出物が、本発明の化合物（または図６の規定された骨格から得られる化合物である、これらの化合物のバリアントなど）への結合についてスクリーニングされる手法などの直接的な手法；直接的な結合の他の方法；などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
［実施例９−高等真核生物におけるアッセイ］
前の実施例は、酵母におけるＤｅａＤアッセイおよび顕微解剖アッセイの使用に関する。ＣＲ経路の広く高度に保存された性質に鑑みて、そのような結果がヒトを含む高等真核生物におそらく適用可能であることを示唆する広範なデータが存在する。さらに、直接的な実験データがなかったとしても、酵母における結果は、他のモデル系についてのデータに対する酵母の結果のインシリコ解析に基づいて、おそらく高等生物に外挿され得る。したがって、例えば、前の実施例において同定された化合物の標的として酵母において定義された特定の経路が、高等生物についてのデータに対してインシリコにおいて比較されることにより、そのような経路に対する遺伝子が、それらの高等生物に存在するか否か、それらの経路におけるタンパク質／核酸の相互作用が、高等生物においても酵母におけるときとおそらく同じであるか否かなどが判定され得る。
【００７０】
さらに、酵母モデル系に対して本願において得られた結果を拡張するために、高等生物において実験研究が行われ得る。したがって、例えば、発生中の蠕形動物、ショウジョウバエなどのモデル系に対して、ＣＲ効果についての相当な試みがなされており（本願の背景の項およびそこに引用されている参考文献を参照のこと）、そしてこれらのモデル系を用いることにより、前述の実施例において得られた結果が、これらの実施例において得られた化合物について実証され得るかまたは拡張され得る。
【００７１】
この点において、例えば、Petrascheck et al. (Nature (2007) 450:553-557)において使用された手法が、線形動物に対して上に記載した結果を拡張するために使用され得る。当業者に公知であり得るようなさらなる方法もまた、この点において使用され得る。
【００７２】
［実施例１０−さらなる化合物のＤｅａＤおよび顕微解剖アッセイ］
図１３〜１４に示されるＤｅａＤアッセイの結果について、ＤｅａＤアッセイ系統ＢＢ５７９を、ＳＣＲａｆｆ／Ｇａｌ（２％ラフィノース／０．１％ガラクトース）中で対数初期まで一晩生育し、次いで、０．７５ｍＭニコチンアミドを含むかまたは含まず、かつその濃度の記載される化学物質を含むＳＣＤまたはＳＣＲａｆｆ／Ｇａｌ中に０．０００１というＯＤ６００に希釈した。培養物を３０℃のＢｉｏＳｃｒｅｅｎにおいて生育し、２０分ごとにＯＤ６００を記録した。ＳＣＤ中の６０時間後における培養物のＯＤ６００を、ＳＣＲａｆｆ／Ｇａｌ中の２４時間後の培養物のＯＤ６００で除算し、次いで、この値を「薬物なし」コントロールについて正規化することによって、ＤｅａＤ寿命を計算した。表２のデータについては、すべての培養物が０．７５ｍＭニコチンアミドを含むＳＣＤにおけるものであり、６０時間後におけるＯＤ６００を「薬物なし」コントロールに対する同じ値について正規化したことを除いて、プロトコルは同様のものだった。
【００７３】
図１０〜１２の顕微解剖アッセイの結果については、野生株ＦＹ８３９を、対数中期までＹＰグリセロール中で一晩生育し、そして５ｍＭニコチンアミドおよび記載されている濃度の化学物質（Ｓ１−６またはＳ１−９）を含むＹＰＤプレート上に撒いた。各濃度について、２０個の出芽細胞を整列させ、そして各出芽細胞の娘を移動させ、そしてその娘を、その系統に対する未分裂の母細胞とした。次いで、分裂し終わるまでに、その母細胞をその娘の各世代から取り除き、そして分裂の回数を記録した（表３）。全く分裂しなかったかまたはその娘細胞と区別できなかった未分裂の母は、解析から省かれた（そして、表３において空欄として記録されている）。
【００７４】
［実施例１１−蠕形動物における化合物３−１１のアッセイ］
図１５は、蠕形動物（C.elegans）における本発明の化合物のうちの１つ（この場合、化合物３−１１）のアッセイの例を提供している。
【００７５】
蠕形動物のC.elegansは、加齢および寿命を調査するための強力な系である。さらに、酵母におけるように、ＮＡＭは、Ｐｎｃ１およびＳＩＲ２のオルソログに依存的な様式でC.elegansの寿命を減少すると示されている（Van der horst et al., mech.ageing Develop.128:346-349, 2007）。図１５に示されるように、ＤｅａＤアッセイを用いて同定された化合物３−１１は、C.elegansの寿命を再現性よく延長し、蠕形動物における２５ｍＭ ＮＡＭの寿命短縮効果を部分的に逆転する。この結果は、ＤｅａＤアッセイが、蠕形動物のような後生動物において加齢および寿命を変更する小分子を発見することができるという実証である。この結果は、ＤｅａＤアッセイがこの菌類だけに関連性がある結果をもたらし得るという懸念を退けるものである。これは、実証されるように事実と異なる。
【００７６】
本願では、ＣＲ応答を変更する化合物をスクリーニングするためのＤｅａＤアッセイの使用が説明され、それらのスクリーニングの結果についてのデータが示される。
【００７７】
本発明の特定の例示的な実施形態および例を用いて、前述のものにおいて本発明を説明してきたが、添付の請求項に定義されているような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの等価物、改変、置換および変更が本発明に対して行われ得ることが、当業者によって認識されるだろう。
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年１２月２１日に出願された米国仮特許出願61/016362号および２００８年１月２５日に出願された米国仮特許出願61/023801号に基づく優先権を主張するものであり、これらの出願の開示は参照によりそれぞれ本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本明細書中に記載される研究は、全体的または部分的に、アメリカ国立衛生研究所からの助成金（助成金番号1R03AG023270-0-1A1、1R03MH076395-01および1R03NS05050798-01）によって資金提供を受けた。その結果として、連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、寿命を変更するための方法に関する。詳細には、本発明は、真核生物の寿命を延ばす方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
多くの研究において、カロリー制限（ＣＲ）（同意語として、食事制限）によって、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、蠕形動物（Caenorhabditis elegans）、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）およびマウス（Mus musculus）をはじめとした一連の非ヒト生物において寿命が延長することが確かめられている。動物におけるＣＲの広範な保存に基づいて、ＣＲベースの寿命の延長に対する同様の機構が、ヒトにおいても機能する可能性がある。この興味深い知見は、食事の変更、社会経済的状況、保健医療へのアクセスなどとは対照的に（または、それらに対する補完として）経口薬剤または他の介入によってヒトの寿命延長の可能性を切り開くものである。
【０００５】
寿命に対するＣＲの効果に加えて、他の研究から、ＣＲが、癌、糖尿病および循環器疾患をはじめとしたヒトにおける加齢性疾患の発症を遅延させるか、または発生率を低下させる可能性があることが示唆され、ゆえに、ＣＲの作用に関する機構を研究する第２の重大な理由がもたらされた。例を挙げれば、例えば、赤ワインの成分である植物生成物のリスベラトロールは、例えば、糖尿病（例えば、Baur et al, Nature (2006) 444:337-342を参照のこと）に対する保護的な方法と相関し得る方法で「中年の」または過体重のマウスの健康状態および生存に対して正の効果を有することが示されており、また、代謝性疾患からの保護をもたらすことも示されている（例えば、Lagouge et al., Cell (2006) 127:1109-1122を参照のこと）。両方の場合において、リスベラトロールの作用は、ＣＲベースの寿命の延長と関連する同じ機構のいくつかによって、例えば、ＣＲｒ媒介性の寿命延長応答に関与すると考えられる遺伝子のｔｕｉｎファミリーによって、少なくとも部分的に媒介されると考えられている。それゆえ、この論拠に基づいて、ＣＲの作用に対する論拠または根拠を理解することにより、長寿命を延長する方法に加えて、これらの加齢性疾患に対する処置法がもたらされ得る可能性がある。
【０００６】
上記で観察された長寿命および疾患に対するＣＲの効果に基づいて、例えば、遺伝子を変更するかまたは変異させることによって、およびＣＲ応答を変化させる遺伝子の変更または変異についてスクリーニングすることによって、ＣＲ経路の構成要素を同定することによって、これらの効果をもたらすＣＲの作用機序を理解することに対してかなりの労力が捧げられてきた。そのような研究の１つの結果は、サーチュインとしても知られるタンパク質脱アセチル化酵素のサイレント情報制御因子（silent information regulator）２（Sir2）ファミリーの同定であり、これは、細菌からヒトに及ぶ多岐にわたる生物において見出され、例えば、酵母および線虫において、長寿命を延長すると示された。例えば、Bitterman et al, Microbiol.Mol.Biol.Rev. (2003) 67:376-399を参照のこと。しかしながら、他の研究では、サーチュインが関与する経路と平行して作用する他のＣＲベースの長寿命経路が存在する可能性があることが示され、このことから、ヒトの長寿命を増加させるためまたはヒトの疾患を減少させるための介入に対するさらなる経路の可能性がもたらされる。例えば、Kaeberlein et al.,PLOS Biology (2004) 2:1381-1387およびKaberlein et al., PLOS Biology (2007) 3:0655-0660（plosgenetics.orgにおいて入手可能）を参照のこと；Medvedik et al., PLOS Biology (2007) 5:e261もまた参照のこと。
【０００７】
遺伝子の変更または変異によってＣＲ経路の構成要素を同定することの代替案として、ＣＲ応答を変化させる化合物を同定し、次いで、それらの化合物がどの分子と相互作用するかを決定することによっても、これらの構成要素は、特徴づけられ得る。上述のように、サーチュインは、ＣＲ応答と関与し得るが、他のＣＲベースの長寿命経路、例えば、ＳＩＲＴ１を活性化し（精製されたＳＩＲＴ１を用いてインビトロにおける生化学的スクリーニングによって同定された）、かつマウスにおいて重要な生理学的効果を有する、リスベラトロールに無関係の化合物が存在することを示唆する証拠が存在する。ＳＩＲＴ１は、出芽酵母のサイレント情報制御因子２（ＳＩＲ２）の哺乳動物のホモログであり、これは、ＣＲ制御機構による寿命の制御および加齢関連疾患の緩和に関わるヒストン脱アセチル化酵素をコードする。Milne et al., Nature (2007) 450:712-716を参照のこと。これらの経路の同定は、以前に特徴付けられた経路の外側で作用すると同定された化合物の分子の効果を理解することによって行われ得、いったん同定されると、これらの経路の構成要素は、ＣＲ応答を調節するための新規の標的分子として機能し得る。例えば、Petrascheck et al., Nature (2007) 450:553-557を参照のこと。
【０００８】
さらに、化合物ベースのスクリーニングは、これらのスクリーニングによって同定された化合物が、単に、ＣＲ経路の構成要素の同定の際に有用であるということだけでなく、これらの化合物自体またはその改変型が、ＣＲ応答を刺激するための薬物として使用され得るという理由で、有用性を有するという点において、別の異なる利点を有する。したがって、例えば、特定のモデル系（例えば、酵母、蠕形動物、ショウジョウバエ、マウス）においてＣＲ応答を変化させると示された化合物が、直接または化学的に改変された形態で使用されることにより、サルおよび究極的にはヒトにおいて同じ結果が達成され得る。ＣＲ応答を変化させる種々の化合物についての必要性は、明らかである；例えば、リスベラトロールは、低バイオアベイラビリティを有するので、必ずしも、ＣＲ応答を変化させるために特に好適な化合物ではない。
【０００９】
そのような化合物ベースのスクリーニングの１つの例は、Goldfarbに対する米国特許出願第10/790456号（その内容が、本明細書中にその全体が参考として組み込まれる）に提供されている細胞ベースの表現型の「娘細胞の死(Death of Daughters)」（ＤｅａＤ）アッセイである。この参考文献に記載されているように、ＤｅａＤアッセイは、「複製老化」と呼ばれるもの、すなわち、個別の酵母細胞が死滅するまでに起こす分裂の回数と定義される加齢を延長するかまたは短縮する化合物についての、酵母細胞における化合物のハイスループットスクリーニングを可能にする。酵母では、細胞分裂が非対称であるので、新しく形成された小さい「娘」細胞を、分裂によってその娘を生じさせたそれよりも大きい「母」細胞と識別することは、簡単であり、ゆえに、これらの細胞をその子孫と識別することによって、母細胞が起こす分裂の回数をモニターすることが可能である。典型的には、この識別は、熟練の顕微鏡使用者によって行われるものであり、簡単であるがきわめて大きな労働力および時間を要するものである。しかしながら、ＤｅａＤアッセイは、娘細胞が死滅するように遺伝的に操作された酵母株を利用することにより、娘は死滅するので本質的には母だけである細胞のバルク集団の成長特性に基づいた複製アッセイが可能、すなわち、それらは、詳細な顕微鏡的解析ではなくバルク特性（吸光度）に基づくので、迅速であり、かつ行うのに比較的少ない労力で済む方法が可能になる。
【００１０】
ＤｅａＤアッセイを用いて行われる酵母細胞における化合物のハイスループットスクリーニングは、試験化合物のみに曝露された酵母細胞に対して行われ得る；あるいは、またはさらに、ＤｅａＤアッセイは、長寿命またはＣＲ応答の他の態様を変化させる薬剤の効果を無効にする試験化合物を同定するために、この薬剤で処理された酵母細胞を用いても行われ得る。例えば、Ｓｉｒ２タンパク質は、他のサーチュインと同様に、反応産物としてニコチンアミド（本明細書中でＮＩＣまたはＮＡＭとも称される）を生成するＮＡＤ＋依存性脱アセチル化酵素である。ニコチンアミドは、インビトロおよびインビボにおいて、Ｓｉｒ２タンパク質およびＳｉｒ２様酵素の非競合的阻害剤として作用し、そしてＳｉｒ２を阻害することによって酵母の加齢を加速し得る。例えば、Anderson et al., Nature (2003) 423:181-185を参照のこと。ゆえに、無処理の酵母細胞においてＣＲ応答を変化させる化合物についてスクリーニングするＤｅａＤアッセイを用いることに加えて、ニコチンアミドで処理された酵母細胞を使用することによって、すなわち、化合物が、ニコチンアミドの長寿命短縮効果を無効にする能力に基づいて選択される状況において、ＣＲ応答を変化させる化合物についてのさらなる情報を得ることができる。
【特許文献１】米国特許出願第１０／７９０，４５６号
【非特許文献１】Anderson et al., Nature (2003) 423:181-185
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、真核生物の寿命を変更するための方法に関し、該方法は：寿命変更化合物を提供する工程、および有効量のその化合物を真核生物に投与して、その真核生物の寿命を増加させる工程を包む。
【００１２】
真核生物の例としては、単細胞生物、および高等生物（例えば、ヒトを含む哺乳動物）を含む多細胞生物が挙げられる。
【００１３】
１つの実施形態において、化合物は、長寿命およびＣＲ関連疾患状態に対する効果について化合物をスクリーニングするハイスループット法としてＤｅａＤアッセイを用いて同定される。
【００１４】
１つの実施形態において、化合物は、１０μＭ以下のＥＣ５０を有する。そのような化合物の例は、表１の化合物１〜２４５として提供される。別の実施形態では、化合物は、５μＭ以下のＥＣ５０を有し、そのような化合物の例は、表１に列挙されている最初の７７個の化合物として提供される。さらに他の実施形態において、化合物は、SID 14724551、SID 14732512、SID 7972147およびSID 17511642からなる群から選択される。
【００１５】
１つの態様において、本発明は、ニコチンアミドの長寿命短縮効果を緩和する能力を含む化合物を、ＤｅａＤアッセイを用いてハイスループットスクリーニングすることによる寿命変更化合物の同定に関する。別の態様では、本発明は、このスクリーニングによって得られた化合物の使用方法に関する。ＥＣ５０などの所望の基準を有する化合物が、選択され得る。
【００１６】
例えば、本発明の実施例２および３において同定される特定の化合物の使用に加えて、本発明は、図６に定義されている骨格を含むがこれらに限定されない、本発明において同定される化合物の共通の構造上の特徴の解析によって特定される共通の基礎構造または骨格を有する化合物の使用にも関する。
【００１７】
本発明は、本発明の化合物の効果を媒介する細胞経路の１つ以上の構成要素を単離するための方法にも関し、そのような方法の非限定的な例は、実施例８に提供される。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項ならびに添付の図面から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＤｅａＤアッセイにおける寿命が、ＳＩＲ２発現レベルに適切に応答することを証明しているプロットを提供している。パネルＡ：相対的なＤｅａＤ寿命は、親ＳＩＲ２＋系統（ＳＩＲ２）の寿命に対して正規化されている。染色体のＳＩＲ２遺伝子の上流の強度を増加させる一連のプロモーターの組み込みが、低い発現（弱いＣＹＣプロモーター）によってＤｅａＤ寿命が短縮されること、および高いＳＩＲ２発現（強いＴＥＦおよびＧＤＰプロモーター）によって寿命が延長されることを示している。パネルＢ：標準的な顕微解剖寿命アッセイを用いて、同じ近似の結果が得られた。
【図２】図２は、ＤｅａＤ寿命がニコチンアミドによって減少することを証明しているプロットを提供している。パネルＡ：グルコース中での成長（非許容条件）下において、ＤｅａＤ寿命は、高くなっていく濃度のニコチンアミドによって用量依存的様式で減少する。パネルＢ：ガラクトース中での成長（許容条件）下において、これらの濃度のニコチンアミドは、成長を変更しない。パネルＡに示されている線は、（上から下に向かって）０、０．５、０．７５および１ｍＭ ＮＩＣに対応する。パネルＢに見られる３本の線は、（一番上から一番下に向かって）、０．５、０．７５または１ｍＭ ＮＩＣに対応し、０ｍＭ ＮＩＣの線は、見られない。
【図３】図３は、ニコチンアミドの存在下および非存在下における化合物ＳＩＤ８５５６２０（ナリジクス酸）に対するＤｅａＤアッセイを示しているプロットを提供している。ナリジクス酸を、１．５ｍＭニコチンアミドの存在下および非存在下において、２．５、５．０および１０μＭ（マイクロモル濃度）の濃度での非許容条件下における成長中の細胞とともにインキュベートした。薬物を含まずに、ニコチンアミドの存在下および非存在下における成長に対するコントロール実験を含める。線の表示を示している最後の３つの記載事項は、１．５ｍＭニコチンアミドおよびそれぞれ２．５、５または１０μＭナリジクス酸を用いて得られたすべての結果である。この図に示されているデータの線は（データの線が最も右側に見られるときの一番上から一番下に向かって）：２．５、１０または５μＭナリジクス酸（ニコチンアミド無し）；ブランク細胞（「ｎｏ ＮＩＣ」と表示されている）；５または１０μＭナリジクス酸＋１．５ｍＭニコチンアミド（両方の場合において）；１０μＭナリジクス酸（ニコチンアミド無し）；および１．５ｍＭニコチンアミドを含むブランク細胞（「１．５ｍＭ ＮＩＣ」と表示されている）に対応する。
【図４】図４は、ナリジクス酸の存在下におけるニコチンアミドおよび５ｍＭニコチンアミドに対する標準的な顕微解剖寿命を提供している。３つの濃度のナリジクス酸を含む３つの実験のすべてが、平均寿命（括弧内に示されている）および最長寿命を増加させた。この図において、「＃８６４」とは、ナリジクス酸のことを指し、例えば、凡例における２番目の記載事項は、５４μＭナリジクス酸のことを指し、３番目の記載事項は、１０７μＭナリジクス酸のことを指すなど。この図の凡例における括弧内に示されている数値は、この図に示されている各実験におけるその集団の平均寿命のことを指し、例えば、コントロール集団（５ｍＭニコチンアミドのみ）は、１４．２世代の平均寿命を有するなどである。
【図５】図５は、細菌ＤＮＡジャイレースのＡサブユニットのインヒビターであり、限定的な殺菌スペクトルを有する合成１，８−ナフチリジン抗菌剤であるナリジクス酸の構造を提供している。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、本発明のアッセイにおいて定義された活性な化合物に対する共有の構造上の骨格を同定するための、そのアッセイのデータの骨格解析を提供している。この図は、１２個のそのような骨格を示している；骨格ｃ１〜ｃ３（６Ａ）、特にｃ１は、偶然そのデータに生じる見込みが低いので、本発明のアッセイの結果をもたらすことができる化合物をさらに定義するための有望な骨格として働く。図６Ｂは、ｃｃ１、ｃｃ２およびｃｃ３ａである。図６Ｃは、ｃｃ３ｂ、ｃｃ４、ｃｃ５、ｃｃ６、ｃｃ７およびｃｃ８である。
【図７】図７は、ｃ１骨格を含み、かつ７７５アッセイにおいて「活性」と同定された、ＳＩＤ Ａ）14732512、Ｂ）14724551、Ｃ）17511642およびＤ）7972147の構造を提供している。
【図８】図８は、ｃ１骨格を含み、かつ７７５アッセイにおいて「不活性」と同定された、ＳＩＤ Ａ）7972920、Ｂ）14732962、Ｃ）4245034およびＤ）842694の構造を提供している。
【図９】図９は、ｃ１骨格を含み、かつ８０９アッセイにおいて「活性」と同定された、ＳＩＤ Ａ）14724551、Ｂ）14732512およびＣ）17511642の構造を提供している。
【図１０−１２】図１０〜１２は、表２に示されているいくつかの化合物に対する顕微解剖アッセイを提供している。表３は、図１０〜１２を作成するために使用したデータを提供している。
【図１３−１４】図１３〜１４は、これらの図に提供されているような種々の化合物に対するＤｅａＤ寿命アッセイを提供している。
【図１５】図１５は、C.elegansにおける本発明の化合物のうちの１つ（化合物３−１１；表２を参照のこと）のアッセイの例を提供している。
【図１６】図１６は、８０９ＤｅａＤアッセイの結果を示している表１を表している。
【図１７】図１７は、市販のＬＡＣ化合物の例を示している表２を表している。
【図１８】図１８は、図１０〜１２に対するデータを示している表３を表している。
【図１９】図１９は、表１の化合物１〜７７の名称を示している表４を表している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、真核生物の寿命を変更するための方法を提供し、該方法は：寿命変更化合物を提供する工程、および有効量のその化合物を真核生物に投与して、その真核生物の寿命を増加させる工程を包む。
【００２１】
寿命変更化合物（「ＬＡＣ」）は、寿命短縮剤（例えば、ニコチンアミドまたはパラコートなどの環境物質）の寿命短縮効果を逆転させる、および／または真核生物（寿命短縮剤に曝露されていないか、または寿命短縮剤で処理されていない真核生物）の寿命を増加させる、化合物である。寿命とは、本明細書中で使用されるとき、細胞もしくは細胞集団が分裂することができる回数（複製寿命）、または細胞もしくは生物が死滅するまでに生存する時間の長さ（例えば、日または年）（経時寿命）のことを意味する。
【００２２】
ＬＡＣは、ＣＲ、食事制限（ＤＲ）または他のいくつかの経路によって寿命を変更し得る。別の実施形態では、ＬＡＣは、真核生物の寿命を短縮する薬剤（例えば、ＮＩＣ）の効果を逆転させる。別の実施形態では、ＬＡＣは、ＤｅａＤアッセイにおいて酵母細胞の複製寿命を増加させる。別の実施形態では、ＬＡＣは、寿命短縮剤（例えば、ＮＩＣ）の存在下または非存在下において酵母細胞の複製寿命を増加させる。さらに別の実施形態において、ＬＡＣは、環境物質（例えば、パラコート）の存在下または非存在下において酵母細胞の複製寿命を増加させる。別の実施形態では、ＬＡＣは、ＤｅａＤアッセイにおいて５マイクロモル濃度以下のＥＣ５０値を有する。さらに別の実施形態において、ＬＡＣは、ＤｅａＤアッセイにおいて１０マイクロモル濃度以下のＥＣ５０値を有する。別の実施形態では、ＬＡＣは、C.elegansなどの高等生物の寿命を増加させる。さらに別の実施形態において、ＬＡＣは、ヒトなどの哺乳動物の寿命を増加させる。
【００２３】
有効量のＬＡＣは、真核生物の寿命を増加させるかまたは減少させる。１つの実施形態において、有効量のＬＡＣは、無処置の生物の寿命と比べて統計学的に有意に真核生物の寿命を増加させる。無処置の生物の寿命は、平行して測定されてもよいし、別々に行われる研究（コントロール）から得られてもよい。別の実施形態では、有効量のＬＡＣは、真核生物の寿命を少なくとも５％増加させる。他の実施形態において、有効量のＬＡＣは、真核生物の寿命を、コントロールに対して少なくとも１０、１５、２０、２５、３５、５０％または１００％増加させる。
【００２４】
真核生物の例としては、単細胞生物、および高等生物（例えば、ヒトを含む哺乳動物）を含む多細胞生物が挙げられる。
【００２５】
１つの実施形態において、本方法は、概して真核生物の細胞の寿命を増加させるため、ならびにその細胞をストレスおよび／またはアポトーシスから保護するために、使用され得る。いかなる特定の理論にも拘束するつもりはないが、本方法の使用は、被験体をホルメシス、すなわち、生物にとって有益であり、その寿命を延長し得る、軽度のストレスに供することと似ていると考えられる。
【００２６】
様々な他の実施形態において、本方法は、被験体において細胞老化によって誘導されるかまたは悪化する疾患または状態を処置するためまたは予防するために；被験体の寿命を延長するために；寿命に関する疾患または状態を処置するためまたは予防するために；細胞の増殖能力に関する疾患または状態を処置するためまたは予防するために；細胞の損傷または死に起因する疾患または状態を処置するためまたは予防するために、使用され得る。
【００２７】
様々な実施形態において、本方法は、加齢および加齢関連の結果または疾患（例えば、脳卒中、心疾患、心不全、関節炎、高血圧およびアルツハイマー病）を予防するために使用され得る。処置され得る他の状態としては、眼球の障害、例えば、眼の加齢に関連する障害（例えば、白内障、緑内障および黄斑変性症）が挙げられる。本方法は、細胞を細胞死から保護するために、細胞死に関連する慢性疾患を処置するためにも使用され得る。例示的な疾患としては、神経細胞死、ニューロンの機能不全または筋細胞の死もしくは機能不全に関連する疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症および筋ジストロフィ）；ＡＩＤＳ；劇症肝炎；クロイツフェルト・ヤコブ病、網膜色素変性症および小脳変性症などの脳の変性に関係する疾患；再生不良性貧血などの脊髄形成異常；心筋梗塞および脳卒中などの虚血性疾患；アルコール性肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎などの肝臓疾患；変形性関節症などの関節疾患；アテローム性動脈硬化症；脱毛症；ＵＶ光に起因する皮膚に対する損傷；扁平苔癬；皮膚の萎縮；白内障；および移植片拒絶が挙げられる。細胞死は、外科術、薬物治療、化学物質曝露または放射線曝露によっても引き起こされ得る。
【００２８】
本方法は、急性疾患、例えば、臓器または組織に対する損傷、例えば、脳卒中もしくは心筋梗塞に罹患している被験体または脊髄損傷に罹患している被験体を処置するためにも使用されてもよいし、アルコール中毒者の肝臓を修復するためにも使用されてもよい。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明は、真核細胞を本発明の化合物と接触させることによって、真核細胞の寿命を延長するか、真核細胞の増殖能力を伸ばすか、真核細胞の加齢を減速させるか、真核細胞の生存を促進するか、真核細胞における細胞老化を遅延させるか、カロリー制限の効果を模倣するか、ストレスに対する真核細胞の抵抗性を高めるか、または真核細胞のアポトーシスを予防する方法を提供する。
【００３０】
例えば、本明細書中に記載される方法は、真核細胞、特に、初代真核細胞（すなわち、生物、例えば、ヒトから得られた細胞）が細胞培養において生存し続け得る時間を増加させるために使用され得る。また、胚性幹（ＥＳ）細胞および多能性細胞、ならびにそれらから分化した細胞は、本発明の化合物で処理されることにより、それらの細胞またはその子孫がより長い期間にわたって培養において維持され得る。そのような細胞は、例えば、エキソビボ修飾の後の、被験体への移植のためにも使用され得る。
【００３１】
別の例として、長い期間にわたって保存されることが意図された真核細胞は、本発明の方法を用いて処理され得る。それらの細胞は、懸濁液（例えば、血液細胞、血清、生物学的増殖培地など）中、または組織もしくは臓器に存在し得る。例えば、輸血の目的で個体から採取された血液または法医学的な活動のために使用される血液は、長期間にわたってその血液細胞を保存するために本発明を用いて処理され得る。寿命を延長するためまたはアポトーシスから保護するために処理され得る他の細胞としては、消費するための細胞、例えば、非ヒト哺乳動物由来の細胞（例えば、肉）または植物細胞（例えば、野菜）が挙げられる。
【００３２】
さらに別の例として、本発明の方法は、例えば、発生プロセスおよび／または成長プロセスを変更するため、遅らせるため、または加速するために、哺乳動物、植物、昆虫または微生物における発生段階および成長段階においても適用され得る。
【００３３】
さらに別の実施形態として、本方法は、例えば、固体組織移植片、臓器移植、細胞懸濁液、幹細胞、骨髄細胞などをはじめとした移植または細胞治療に有用な細胞を処理するために使用され得る。それらの細胞または組織は、自家移植片、同種移植片、同族移植片または異種移植片であり得る。それらの細胞または組織は、被験体への投与／移植の前、投与／移植と同時に、および／または投与／移植の後に、本方法に従って処理され得る。それらの細胞または組織は、ドナー個体から細胞を取り出す前に、ドナー個体から細胞もしくは組織を取り出した後にエキソビボで、またはレシピエントへの移植の後に、処理され得る。
【００３４】
さらに別の例として、細胞は、寿命を増加させるためまたはアポトーシスを予防するために、本発明の方法を用いて処理され得る。例えば、皮膚または上皮細胞を本発明の方法で処置することによって、皮膚は、加齢（例えば、しわの発生、弾性の喪失など）から保護され得る。本明細書中に記載される方法に従って処置され得る例示的な皮膚の苦痛または皮膚の状態としては、炎症、日焼けによる損傷あるいは自然老化に関連するかもしくはそれらによって引き起こされる障害または疾患が挙げられる。例えば、本方法は、接触皮膚炎（刺激性接触皮膚炎およびアレルギー性接触皮膚炎を含む）、アトピー性皮膚炎（アレルギー性湿疹としても知られる）、光線性角化症、角質化障害（湿疹を含む）、表皮水疱症（天疱瘡を含む）、剥脱性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、紅斑（多形性紅斑および結節性紅斑を含む）、日光または他の光源によって引き起こされる損傷、円板状エリテマトーデス、皮膚筋炎、乾癬、皮膚癌および自然老化の効果の予防または処置において有用性を見出し得る。別の実施形態では、本発明の方法は、創傷および／または熱傷（例えば、第１度、第２度または第３度熱傷および／または熱的、化学的もしくは電気的な熱傷を含む）を処置して治癒を促進するために使用され得る。
【００３５】
本化合物は、化合物送達に適した任意の利用可能な方法および経路（経口、非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内経路を含む）を用いて真核生物に送達され得ると予想される。本発明の方法において使用される特定の投薬レジメンの形態および特徴が、投与経路および他の周知の変量（例えば、真核生物のサイズおよび年齢）によって必然的に決定されることが当業者によって認識されるだろう。そのような投薬レジメンの決定は、当業者の範囲内である。本化合物の投与は、局所的、経口または注射可能物質を含む、加齢に関連する疾患または障害を処置することが意図された任意の従来の治療とともに行われ得る。ＬＡＣの投与は、細胞を、有効量のＬＡＣを含む環境（そのような増殖培地または培養液）に曝露するか、または接触させることによっても、行われ得る。
【００３６】
１つの実施形態において、化合物は、長寿命およびＣＲ関連疾患状態に対するそれらの効果について化合物をスクリーニングするハイスループット法としてＤｅａＤアッセイを用いて同定される。他の実施形態は、これらの化合物の活性に関与するそれらの構造上の特徴を、より正確に同定するためにこれらの化合物を使用すること、これらの化合物の活性を媒介する細胞経路を同定する方法、およびこれらの結果を高等生物に外挿する方法を含む。
【００３７】
本発明において、「活性」とは、概して、化合物がＣＲ効果またはＣＲ様効果を発揮する能力のことを指す。「活性」の正確な意味は、使用されるアッセイに依存し、例えば、そのアッセイが、単一の濃度のニコチンアミドを含むか（実施例２）、複数の濃度のこの化合物を含むか（ＥＣ５０活性を定義するために必要である）（実施例３）に依存する。したがって、「活性」は、本明細書中で使用されるとき、これらの意味の両方を包含する。
【００３８】
様々な実施形態において、ＬＡＣは、表１の化合物から選択される。これらの化合物は、当業者によって容易に認識されるＳＩＤ（物質識別）番号によって特定される。そのＳＩＤ番号は、United States National Institutes of Health (NIH)の一部であるNational Library of Medicineの構成機関のNational Center for Biotechnology Information (NCBI)によって維持されている化学分子のＰｕｂＣｈｅｍデータベースにおける分野である。
【００３９】
様々な実施形態において、ＬＡＣは、表１に列挙されている最初の７７個の化合物から選択される。これらの表１に列挙されている最初の７７個の化合物のＩＵＰＡＣ名および一般名は、表４に列挙されている。さらに、表４の化合物１５は、以下の構造：
【化１】
を有する。様々な実施形態において、化合物は、表２に列挙されている化合物からなる群から選択される。様々な実施形態において、化合物は、SID 14724551、SID 14732512およびSID 17511642からなる群から選択される。
【００４０】
以下の非限定的な実施例は、本発明のさらなる説明を提供する。
【実施例】
【００４１】
［実施例１−ＤｅａＤアッセイの確認］
ＤｅａＤアッセイは、酵母の複製老化を測定するために使用される従来の顕微解剖アッセイに対するハイスループットの代用物として開発された。このアッセイが従来の顕微解剖アッセイの結果に相当する結果をもたらす能力を確認するために、ＤｅａＤアッセイ（パネルＡ）を用いるか、または顕微解剖（パネルＢ）を介して、図１のデータを得た。この図が示すように、高いＳＩＲ２発現は、ＤｅａＤアッセイと従来の顕微解剖との間で同様に寿命を増加させる。図２は、ＤｅａＤアッセイの確認の追加の確証を示している；詳細には、図２のデータは、ニコチンアミドが、許容条件下において成長を変更せずに（パネルＢ）、用量依存的様式でＤｅａＤ系統の寿命を減少させること（パネルＡ）を示している。
【００４２】
従って、これらのデータから、試験化合物の従来の顕微解剖アッセイに対するハイスループットの代用物としてのＤｅａＤアッセイの全般的な適用性が確認され、そして以下で述べられるような化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングに対するＤｅａＤアッセイの使用に道を開いた。
【００４３】
［実施例２−ニコチンアミドの寿命短縮を無効にする能力について約１３２，０００個の化合物の「７７５」ＤｅａＤアッセイによる最初のスクリーニング］
顕微解剖に対する代用物としてＤｅａＤアッセイの適合性が確立されたので、ＤｅａＤアッセイを用いることにより、ライブラリー中の化合物がニコチンアミドの寿命短縮効果を無効にする能力について１３２，７９６個の化合物ライブラリーをスクリーニングした。
【００４４】
詳細には、pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi?aid=775における「ＰｕｂＣｈｅｍ」ウェブサイト上のＡＩＤ７７５アッセイの結果（同意語として、「７７５」アッセイ結果）（その内容は、本明細書中でその全体が参照として組み込まれる）に記載されているように、ニコチンアミドの寿命短縮の阻害パーセント、すなわち、寿命に対するニコチンアミド効果の逆転パーセントを、ニコチンアミドの最大寿命短縮作用として１．５ｍＭニコチンアミドで処理された細胞を含んでいるコントロールウェル（ニコチンアミドの０％阻害）および１００％阻害の指標としてニコチンアミドを含まない培地中で生育された細胞を含んでいるウェルにおける光学濃度を用いて計算した。ＰｕｂＣｈｅｍ化合物ライブラリー（約１０００万個の化合物の全ライブラリーから選択された約１３２，０００個の化合物）中の適切な化合物を、１．５ｍＭニコチンアミドの存在下の１０μＭにおいてスクリーニングした。さらなる詳細については、例えば、以下の参考文献：Jarolim, S., Millen, J., Heeren, G., Laun, P., Goldfarb, D.S. and M. Breitenbach. (2004). A novel assay for replicative lifespan in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 5, 169-177; Bitterman, K.J., Anderson, R.M., Cohen, H.Y., Latorre-Esteves, M., and D.A. Sinclair. (2002). Inhibition of silencing and accelerated aging by nicotinamide, a putative negative regulator of yeast Sir2 and human SIRT1. J. Biol. Chem. 277, 45099-45107; Tsuchiya, M., Dang, N., Kerr, E.O., Hu, D., Steffen, K.K., Oakes, J.A. , Kennedy, B.K. and M. Kaeberlein (2006) Sirtuin-independent effects of nicotinamide on lifespan extension from calorie restriction in yeast. Aging Cell. 5, 505-514を参照のこと。
【００４５】
プロトコル
以下のとおりアッセイを行った。細胞を、ＹＰＧａｌ寒天プレート上に画線し、３０℃において４８時間生育した。４つのコロニーを選択し、フラスコ内の５０ｍＬのＹＰＧａｌ培地に接種し、そして振盪しながら３０℃において一晩生育した。ＯＤ６００を測定した。そのＯＤは、対数期の細胞について＜０．７であるべきである。それらの細胞を遠心分離し、１回洗浄し、そしてＣＳＭＭ−Ｄ制限増殖培地に再懸濁した。ＯＤ６００を再度測定した。その培養物を、ＣＳＭＭ−Ｄ制限培地中に０．００２というＯＤ６００に希釈した。その培養物を、３０℃において４時間、振盪しながらフラスコ内でプレインキュベートした。プレインキュベートの終わりに、ＯＤ６００を参照として測定した。ニコチンアミド（ネガティブコントロール）、培地のみ（ポジティブコントロール）、およびニコチンアミドの存在下における化合物を、１０×濃度（最終濃度：ニコチンアミド１．５ｍＭ、化合物１０μＭ、ＤＭＳＯ０．２５％）で、３８４ウェルプレートに：５μＬ／ウェルで、ＤＭＳＯとともにプレーティングした。そのプレートに：４５μＬ／ウェルで酵母を加えた。加湿チャンバー内で３０℃において、プレートをインキュベートした。４８時間のインキュベートの後、プレートを３０秒間振盪し、そしてＥｎＶｉｓｉｏｎ（PerkinElmer）マルチラベルプレートリーダーにおいてＯＤ６１５を読み出した。これらのアッセイのために、ＹＰＧａｌ培地を、１０グラムの酵母抽出物、２０グラムのペプトン、９００ｍＬの水として調製し、１２１℃において１５分間オートクレーブし、１００ｍＬの滅菌２０％（ｗ／ｖ）ガラクトースを加えた。ＣＳＭＭ−Ｄ(Complete Synthetic Minimal Medium-Dextrose)（制限）培地を、アミノ酸を含まない６．７グラムの酵母窒素塩基、２．０グラムのDrop-out mix complete（ＤＯＣ） (USBiological Cat. no. D9515)、１００ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）デキストロース、１．０Ｌとなる量の水として調製し、次いで、濾過滅菌した。
【００４６】
結果
＞２６％の活性閾値を、化合物阻害の中央値から３標準偏差より大きいものとして算出した。ゆえに、＞２６％阻害を示した化合物は、活性と定義される。≦２６％阻害を示した化合物は、不活性と定義される。単一用量のデータを拡大解釈する誤りを含むすべてのハイスループットスクリーニングにおける固有誤差を理由に、この実施例については、段階的スコアリングシステムを採用し、ここで、化合物を０〜４０のスケールにおいて、活性に基づいてスコアづけした（評価された活性閾値は１１である）。この段階的スコアリングシステムを用いて、それらの化合物をランクづけし、これらの化合物のうちの９０６個が、この段階的スコアリングシステムを用いて「活性」と定義された。この実施例において同定された活性および不活性な化合物の詳細な列挙は、pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi?aid=775における「ｓｈｏｗ ｒｅｓｕｌｔｓ」リンクを介して提供される。これらの化合物に対応する化学構造およびＩＵＰＡＣ命名者を確定するために概してncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezを参照のこと；この実施例の化合物に対応する特定の化学構造およびＩＵＰＡＣ命名者について、ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pcassay&cmd=Link&LinkName=pcassay_pccompound&from_uid=775も参照のこと。
【００４７】
考察
この実施例のデータは、上に提供された基準によって判断されるとき、ニコチンアミド阻害を克服する際に「活性」を示す約９００個の化合物を定義するものである。そのような「活性」は、化合物がニコチンアミド阻害を克服する能力を測定するための有用な判定基準であるが、しかしながら、それは、「活性」の単なる１つの尺度でしかない。したがって、この判定基準は、例えば、顕微解剖アッセイなどを用いて、化合物の効果である化合物の用量依存性の効果（以下の実施例３を参照のこと）で補完されるべきである。
【００４８】
［実施例３−５０％有効濃度（ＥＣ５０）値を得るための実施例１において同定された上位５００個の化合物の用量依存性の「８０９」ＤｅａＤアッセイスクリーニング］
すでに述べたように、実施例２は、「７７５」ＤｅａＤアッセイを用いて１．５ｍＭニコチンアミドの寿命減少効果を無効にする化合物を決定するデータを提供しており、この実施例では、約９００個の「活性な」化合物を同定する。実施例２では、１０μＭというただ１つの化合物濃度を用いた；この実施例では、これらの「活性な」化合物のうちの上位５００個を、ＤｅａＤアッセイを用いるが、ここでは０．０７８〜１０μＭの範囲の８つの濃度において、また、１．５ｍＭニコチンアミドの存在下において、再度スクリーニングしたところ、表１に提供されるデータが得られた。このより広範囲のデータから、最大半数有効濃度（ＥＣ５０）の決定が可能になった。pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi?aid=809におけるＰｕｂＣｈｅｍウェブサイト上の「ＡＩＤ８０９」アッセイ（「８０９」アッセイ）の結果を参照のこと。
【００４９】
このように、この実施例では、１．５ｍＭニコチンアミドの存在下における０．０７８〜１０μＭの範囲の８点の２倍希釈系列において、化合物をスクリーニングした。寿命の活性化パーセント、すなわち、寿命に対するニコチンアミド効果の逆転パーセントを、ニコチンアミドの最大寿命短縮効果として１．５ｍＭニコチンアミドで処理された細胞を含んでいるコントロールウェル（０％活性化）および１００％活性化の指標としてニコチンアミドを含まない培地中で生育された細胞を含んでいるウェルにおける光学濃度を用いて計算した。様々な化合物濃度の％活性化値から、ＩＤＢＳ ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェアおよび４パラメータロジスティックフィットに対するＸＬｆｉｔ方程式２０５を用いて最大半数有効濃度（ＥＣ５０）を計算した；最大値および最小値を１００％および０％で固定した。
【００５０】
プロトコル
以下のとおりアッセイを行った。細胞（ＤｅａＤ系統ＢＢ５７９）を、ＹＰＧａｌ寒天プレート上に画線し、３０℃において４８時間生育した。４つのコロニーを選択し、フラスコ内の５０ｍＬのＹＰＧａｌ培地に接種し、そして振盪しながら３０℃において一晩生育した。ＯＤ６００を測定した。そのＯＤは、対数期である細胞について＜０．７であるべきである。それらの細胞を遠心分離し、１回洗浄し、そしてＣＳＭＭ−Ｄ制限増殖培地に再懸濁した。ＯＤ６００を再度測定した。その培養物を、ＣＳＭＭ−Ｄ制限培地中に０．００２というＯＤ６００に希釈した。その培養物を、３０℃において４時間、振盪しながらフラスコ内でプレインキュベートした。プレインキュベートの終わりに、ＯＤ６００を参照として測定した。ニコチンアミド（ネガティブコントロール）、ＣＳＭＭ−Ｄ培地のみ（ポジティブコントロール）、およびニコチンアミドの存在下における化合物を、１０×濃度（最終濃度：ニコチンアミド１．５ｍＭ、化合物０．０７８〜１０μＭ、ＤＭＳＯ０．５％）で、３８４ウェルプレートに：５μＬ／ウェルで、ＤＭＳＯとともにプレーティングした。そのプレートに：４５μＬ／ウェルで酵母を加えた。加湿チャンバー内で３０℃において、プレートをインキュベートした。４８時間のインキュベートの後、プレートを３０秒間振盪し、そしてＥｎＶｉｓｉｏｎ（PerkinElmer）マルチラベルプレートリーダーにおいてＯＤ６１５を読み出した。これらのアッセイのために、ＹＰＧａｌ培地を、１０グラムの酵母抽出物、２０グラムのペプトン、９００ｍＬの水として調製し、１２１℃において１５分間オートクレーブし、１００ｍＬの滅菌２０％（ｗ／ｖ）ガラクトースを加えた。ＣＳＭＭ−Ｄ（Complete Synthetic Minimal Medium-Dextrose）（制限）培地を、アミノ酸を含まない６．７グラムの酵母窒素塩基、２．０グラムのDrop-out mix complete（ＤＯＣ）（USBiological Cat. no. D9515）、１００ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）デキストロース、１．０Ｌとなる量の水として調製し、次いで、濾過滅菌した。
【００５１】
結果
ＥＣ５０≦１０μＭの活性閾値を設定し、そしてこの判定基準を満たす化合物を活性と定義する。ＥＣ５０＞１０μＭを示した化合物を不活性と定義する。
【００５２】
このデータに、表１の「ランクスコア」の欄に示されているように、段階的スコアリングシステムを適用した（これらは、これらの５００個の化合物について得られた結果を示している）。このシステムにおいて、活性な化合物は、０μＭ〜１０μＭのＥＣ５０に対する逆線形相関を用いて、４１〜８０のスケールにおいてスコアづけされた。用量反応スクリーニングにおいて活性と確認されなかった化合物にスコア０を与えた。
【００５３】
表１に示されるように、試験された５００個の化合物のうちの７７個が、５μＭ未満のＥＣ５０値をもたらし（すなわち、表１における＃１〜７７）、ゆえに、これらの７７個の化合物は、このＥＣ５０判定基準によって活性であると考えられた。この実施例におけるおよび表１に示されている、４８時間後において得られた６００ｎｍにおいて１回測定された光学濃度より長い時間にわたってこれらの結果を確証するために、以下の実施例４に示されるように、これらのおおよそ上位７０個の化合物について、最大ＤｅａＤ寿命時間経過を行った。
【００５４】
［実施例４−実施例３において同定された上位約７０個の化合物に対する最大ＤｅａＤアッセイ寿命時間経過］
実施例３の「８０９」実験の結果を実証するために、実施例３において同定された上位７０個の化合物の効果についての時間経過が、例えば、これらの化合物の各々について１４０時間の区間にわたってＤｅａＤアッセイを用いて行われ得る。図３は、表１の化合物＃５２、トポイソメラーゼＩＩの公知のインヒビターであり、ヒトにおける使用について承認されている抗菌薬である化合物のナリジクス酸（ＳＩＤ＃８５５６２０、この化合物の構造については図５を参照のこと）を用いて行われたそのような実験の例示的なデータを提供している。この図が示すように、ナリジクス酸は、ニコチンアミドの存在下と非存在下との両方においてＤｅａＤ寿命を延長する。ナリジクス酸以外の他の化合物に対するデータは、同様に得られ得る。
【００５５】
［実施例５−ナリジクス酸に対する実施例４のデータを実証する顕微解剖結果］
ナリジクス酸に対する実施例４のデータを実証するために、ニコチンアミドの効果を無効にするこの化合物を用いて顕微解剖実験を行った（これらの実験の結果を図４に示す）。
【００５６】
［実施例６−実施例３において同定された他の（非ナリジクス酸）上位７０個の化合物に対する実施例４のデータを実証する顕微解剖結果］
ナリジクス酸以外の実施例３の上位７０個の化合物に対する実施例４のデータを実証するために、図４の実験について提供されたようなコントロールおよび実験条件を用いて、顕微解剖アッセイを行い、結果を得る。
【００５７】
［実施例７−骨格解析］
前に述べたように、本発明の寿命アッセイは、酵母において長寿命を変更する化合物を定義するために有用であり、また、必要である場合には、高等生物、ヒトを含む高等生物に対して、酵母において得られたデータの実験検証によって補足されるようなこれらの機構の進化中の好適な保存によって、有用である。以下の実施例９も参照のこと。
【００５８】
より詳細には、上に記載された実施例は、最初にスクリーニングされたもとの約１３２，０００個のうち約７０個の化合物という小さい活性サブセットを定義するＤｅａＤアッセイを用いた酵母における化合物のスクリーニングを提供しており、ここで、活性は、上で述べたようなＤｅａＤアッセイにおけるＥＣ５０によって定義される。これらの化合物自体が、長寿命またはＣＲ効果に関連する疾患を変更する介入のための潜在的な薬物分子、ならびに潜在的に以前に特徴付けられていないかまたは未知のＣＲ経路を同定するために使用され得る分子を提供する。しかしながら、前の実施例において得られたＤｅａＤアッセイにおけるこれらの分子の活性を支持するそれらの分子の鍵となる機能的な態様、例えば、これらの化合物とＤｅａＤアッセイにおいて見られた効果を媒介する細胞経路との相互作用に関与する、機能的部分または他の活性を付与する化学構造、骨格、側基などを同定するためには、これらの特定の化合物から推定することが特に有利である。
【００５９】
それらの実施例において定義された活性な分子の鍵となる特徴に関するそのような情報を得るために、骨格解析を、これらの実施例のデータに基づいて行った（この解析の結果を図６に提供する）。
【００６０】
したがって、例えば、図６の群「ｃ１」とは、図６のｃ１列に示されている化学的骨格のことを指す。図６が示すように、この骨格は、本発明のアッセイの３つの「活性な」ヒットの基礎構造（すなわち、少なくともこの構造を含むが通常はさらなる化学構造を含む化合物内のその完全な形態におけるもの）として見られる。これが生じる見込みは、比較的まれであると計算され得る；それゆえ、ｃ１骨格が本発明の活性な化合物とこれらの化合物の活性を媒介する細胞機構との相互作用にとって重要である妥当な確率が存在する。
【００６１】
図６に示されている結果のさらなる詳説は、ＰｕｂＣｈｅｍウェブサイトを介して行われ得る。ｃ１群について、例えば、この群について示されている骨格を、http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/search.cgi（SMILES/STARTSフォーマット）の検索入力フィールドにおいてSMILES string C1(CC(CC(C1C(C)=O)=O)C)=Oとして入力し、次いで、「Substructure」に設定された「Search Type」を用いてこのページから検索され得る。この検索によって、この基礎構造を含む約１０００万個の化合物（そのうちの約１３２，０００個が本発明の活性アッセイに使用された；上記を参照のこと）のＰｕｂＣｈｅｍデータベース全体において３５１個の化合物が同定される。
【００６２】
これらの３５１個の化合物のうち、２１個が、ＰｕｂＣｈｅｍ生物活性アッセイにおいて見出される。この後者の群は、その検索を行った後に表示されるＰｕｂＣｈｅｍページの「BioAssay」タブをクリックし、次いで、「Display」ドロップダウンフォーマットを「Summary」から「PubChem BioActivity Summary」に変更することによって表示され得る。７７５アッセイにおいて活性と同定されたｃ１基礎構造を含む４つの化合物およびそのアッセイにおいて不活性と同定された４つのさらなる化合物が存在し、ここで、「活性」および「不活性」は、７７５アッセイに特有の定義である（上記の実施例２の「結果」の項を参照のこと）。これらの特定の化合物は、上記のように得られたＰｕｂＣｈｅｍの結果に表示される数字の記載事項をクリックすることによって表示され得る；本願において、これらの結果は、それらの図に対する凡例に提供されているこれらの化合物に対するPubChem Substance ID（ＳＩＤ）番号を用いて、それぞれ図７および８として示されている。
【００６３】
同様に、図９は、ｃ１骨格を含み、かつ８０９アッセイにおいて「活性」と同定された３つの化合物のＳＩＤを提供している。これらの化合物がすべて、７７５アッセイにおいても活性と同定されたことに注意すること（すなわち、図９における３つの化合物は図７に要約されている結果にも示されている）。図９における化合物が、以下のとおり、表１の８０９アッセイの結果における列の記載事項に対応することにも注意すること：SID 14724551（図８Ａ）は、表１の列２１に見られ；SID 14732512（図８Ｂ）は、表１の列２５に見られ；そしてSID 17511642（図８Ｃ）は、表１の列６６に見られる。
【００６４】
ＰｕｂＣｈｅｍデータベースを用いて骨格ｃ１について上で得られた結果は、図６に示されている残りの骨格についても同様に得られ得る。したがって、例えば、骨格ｃ２は、SMILES string C1=CC=CC2=C1C(=C(C=O)CN2)Oに対応し、骨格ｃ３は、SMILES string C1=CC=CC(=C1)N=CC2=C(CC(CC2=O)C3=CC=CC=C3)Oに対応するなどし、これらのストリング（string）を用いることにより、ｃ１骨格について上で記載したようにＰｕｂＣｈｅｍデータベースが検索され得る。
【００６５】
上述のように、この実施例におけるデータは、前の実施例の活性アッセイの結果から共通の化学構造または骨格を同定することに関し、この骨格は、１）活性、理想的には、より高い活性および／または選択性を有するさらなる化合物を見つけ出すために、および２）これらの洗練された化学構造データを使用することによって、これらの化合物の活性効果をもたらす、その化合物が相互作用する細胞経路を同定する化合物をより効果的に設計するために、使用され得る。
【００６６】
したがって、さらなる化合物の同定に関しては、例えば、骨格ｃ１は、例えば、８０９アッセイにおいて高活性を有する３つの化合物（これらの３つの化合物は、図９に示されている）が共有する共通の構造を定義する。この構造におけるどの化学基がこの共通の骨格を有する化合物によって示される活性を支持するのかを定義するために、この情報を用いることにより、ｃ１構造またはｃ１構造のバリアントを含むさらなる化合物がＰｕｂＣｈｅｍデータベースから選択され得る。例えば、ｃ１におけるＣ＝Ｏ部分の１つ以上の除去、他の基によるこれらの部分の置換などを用いることにより、ｃ１基を含む化合物の全体的な結合に対するこれらのＣ＝Ｏ部分の各々の寄与が特徴づけられ得る。
【００６７】
［実施例８−経路の同定］
本発明の化合物は、疾患を処置するため、長寿命を延長するためなどのために、その現在の形態、または例えば、医薬品化学者によって設計され得るような変更された形態で、直接使用され得る（以下の実施例９も参照のこと）。すでに述べたように、インビボにおいてこれらの化合物の活性を媒介する経路の知識によって、これらの経路と相互作用する他の化合物の設計、またはこれらの経路の構成要素の正常な相互作用を妨害する化合物の設計などが可能になり得るので、これらの化合物は、さらに、それらの経路を同定するためにも使用され得る。
【００６８】
細胞経路を同定するための本発明の化合物の使用に関して、当業者は、これらの経路を同定する多数の手法を認識するだろう。そのような手法としては：酵母変異体ライブラリーを用いることにより、どの酵母変異体が本発明の化合物の活性を無くすかを決定する遺伝的手法；細胞抽出物が、本発明の化合物（または図６の規定された骨格から得られる化合物である、これらの化合物のバリアントなど）への結合についてスクリーニングされる手法などの直接的な手法；直接的な結合の他の方法；などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
［実施例９−高等真核生物におけるアッセイ］
前の実施例は、酵母におけるＤｅａＤアッセイおよび顕微解剖アッセイの使用に関する。ＣＲ経路の広く高度に保存された性質に鑑みて、そのような結果がヒトを含む高等真核生物におそらく適用可能であることを示唆する広範なデータが存在する。さらに、直接的な実験データがなかったとしても、酵母における結果は、他のモデル系についてのデータに対する酵母の結果のインシリコ解析に基づいて、おそらく高等生物に外挿され得る。したがって、例えば、前の実施例において同定された化合物の標的として酵母において定義された特定の経路が、高等生物についてのデータに対してインシリコにおいて比較されることにより、そのような経路に対する遺伝子が、それらの高等生物に存在するか否か、それらの経路におけるタンパク質／核酸の相互作用が、高等生物においても酵母におけるときとおそらく同じであるか否かなどが判定され得る。
【００７０】
さらに、酵母モデル系に対して本願において得られた結果を拡張するために、高等生物において実験研究が行われ得る。したがって、例えば、発生中の蠕形動物、ショウジョウバエなどのモデル系に対して、ＣＲ効果についての相当な試みがなされており（本願の背景の項およびそこに引用されている参考文献を参照のこと）、そしてこれらのモデル系を用いることにより、前述の実施例において得られた結果が、これらの実施例において得られた化合物について実証され得るかまたは拡張され得る。
【００７１】
この点において、例えば、Petrascheck et al. (Nature (2007) 450:553-557)において使用された手法が、線形動物に対して上に記載した結果を拡張するために使用され得る。当業者に公知であり得るようなさらなる方法もまた、この点において使用され得る。
【００７２】
［実施例１０−さらなる化合物のＤｅａＤおよび顕微解剖アッセイ］
図１３〜１４に示されるＤｅａＤアッセイの結果について、ＤｅａＤアッセイ系統ＢＢ５７９を、ＳＣＲａｆｆ／Ｇａｌ（２％ラフィノース／０．１％ガラクトース）中で対数初期まで一晩生育し、次いで、０．７５ｍＭニコチンアミドを含むかまたは含まず、かつその濃度の記載される化学物質を含むＳＣＤまたはＳＣＲａｆｆ／Ｇａｌ中に０．０００１というＯＤ６００に希釈した。培養物を３０℃のＢｉｏＳｃｒｅｅｎにおいて生育し、２０分ごとにＯＤ６００を記録した。ＳＣＤ中の６０時間後における培養物のＯＤ６００を、ＳＣＲａｆｆ／Ｇａｌ中の２４時間後の培養物のＯＤ６００で除算し、次いで、この値を「薬物なし」コントロールについて正規化することによって、ＤｅａＤ寿命を計算した。表２のデータについては、すべての培養物が０．７５ｍＭニコチンアミドを含むＳＣＤにおけるものであり、６０時間後におけるＯＤ６００を「薬物なし」コントロールに対する同じ値について正規化したことを除いて、プロトコルは同様のものだった。
【００７３】
図１０〜１２の顕微解剖アッセイの結果については、野生株ＦＹ８３９を、対数中期までＹＰグリセロール中で一晩生育し、そして５ｍＭニコチンアミドおよび記載されている濃度の化学物質（Ｓ１−６またはＳ１−９）を含むＹＰＤプレート上に撒いた。各濃度について、２０個の出芽細胞を整列させ、そして各出芽細胞の娘を移動させ、そしてその娘を、その系統に対する未分裂の母細胞とした。次いで、分裂し終わるまでに、その母細胞をその娘の各世代から取り除き、そして分裂の回数を記録した（表３）。全く分裂しなかったかまたはその娘細胞と区別できなかった未分裂の母は、解析から省かれた（そして、表３において空欄として記録されている）。
【００７４】
［実施例１１−蠕形動物における化合物３−１１のアッセイ］
図１５は、蠕形動物（C.elegans）における本発明の化合物のうちの１つ（この場合、化合物３−１１）のアッセイの例を提供している。
【００７５】
蠕形動物のC.elegansは、加齢および寿命を調査するための強力な系である。さらに、酵母におけるように、ＮＡＭは、Ｐｎｃ１およびＳＩＲ２のオルソログに依存的な様式でC.elegansの寿命を減少すると示されている（Van der horst et al., mech.ageing Develop.128:346-349, 2007）。図１５に示されるように、ＤｅａＤアッセイを用いて同定された化合物３−１１は、C.elegansの寿命を再現性よく延長し、蠕形動物における２５ｍＭ ＮＡＭの寿命短縮効果を部分的に逆転する。この結果は、ＤｅａＤアッセイが、蠕形動物のような後生動物において加齢および寿命を変更する小分子を発見することができるという実証である。この結果は、ＤｅａＤアッセイがこの菌類だけに関連性がある結果をもたらし得るという懸念を退けるものである。これは、実証されるように事実と異なる。
【００７６】
本願では、ＣＲ応答を変更する化合物をスクリーニングするためのＤｅａＤアッセイの使用が説明され、それらのスクリーニングの結果についてのデータが示される。
【００７７】
本発明の特定の例示的な実施形態および例を用いて、前述のものにおいて本発明を説明してきたが、添付の請求項に定義されているような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの等価物、改変、置換および変更が本発明に対して行われ得ることが、当業者によって認識されるだろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）１０μＭ以下のＥＣ５０を有する、表１に記載の化合物１〜２４５からなる群から選択される寿命変更化合物を提供する工程；および
ｂ）有効量のその化合物を真核生物に投与して、その真核生物の寿命を変更させる工程
を含む、真核生物の寿命を変更するための方法。
【請求項２】
前記寿命変更化合物が、５μＭ以下のＥＣ５０を有し、表１に記載の化合物１〜７７からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記寿命変更化合物の化学構造が図６の骨格のいずれかを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記骨格が、骨格ｃ１，ｃ２およびｃ３からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記骨格がｃ１である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記骨格がｃ２である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記骨格がｃ３である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記寿命変更化合物が、ＳＩＤ １４７２４５５１、ＳＩＤ １４７３２５１２、ＳＩＤ ７９７２１４７およびＳＩＤ １７５１１６４２からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ａ）表２に記載の化合物からなる群から選択される寿命変更化合物を提供する工程；および
ｂ）有効量のその化合物を真核生物に投与して、その真核生物の寿命を変更させる工程
を含む、真核生物の寿命を変更するための方法。
【請求項１】
ａ）１０μＭ以下のＥＣ５０を有する、表１に記載の化合物１〜２４５からなる群から選択される寿命変更化合物を提供する工程；および
ｂ）有効量のその化合物を真核生物に投与して、その真核生物の寿命を変更させる工程
を含む、真核生物の寿命を変更するための方法。
【請求項２】
前記寿命変更化合物が、５μＭ以下のＥＣ５０を有し、表１に記載の化合物１〜７７からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記寿命変更化合物の化学構造が図６の骨格のいずれかを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記骨格が、骨格ｃ１，ｃ２およびｃ３からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記骨格がｃ１である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記骨格がｃ２である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記骨格がｃ３である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記寿命変更化合物が、ＳＩＤ １４７２４５５１、ＳＩＤ １４７３２５１２、ＳＩＤ ７９７２１４７およびＳＩＤ １７５１１６４２からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ａ）表２に記載の化合物からなる群から選択される寿命変更化合物を提供する工程；および
ｂ）有効量のその化合物を真核生物に投与して、その真核生物の寿命を変更させる工程
を含む、真核生物の寿命を変更するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１６−３】
【図１６−４】
【図１６−５】
【図１６−６】
【図１６−７】
【図１６−８】
【図１６−９】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１７−３】
【図１７−４】
【図１７−５】
【図１７−６】
【図１７−７】
【図１７−８】
【図１７−９】
【図１７−１０】
【図１７−１１】
【図１７−１２】
【図１７−１３】
【図１７−１４】
【図１７−１５】
【図１７−１６】
【図１７−１７】
【図１７−１８】
【図１７−１９】
【図１７−２０】
【図１８】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図１９−３】
【図１９−４】
【図１９−５】
【図１９−６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６−１】
【図１６−２】
【図１６−３】
【図１６−４】
【図１６−５】
【図１６−６】
【図１６−７】
【図１６−８】
【図１６−９】
【図１７−１】
【図１７−２】
【図１７−３】
【図１７−４】
【図１７−５】
【図１７−６】
【図１７−７】
【図１７−８】
【図１７−９】
【図１７−１０】
【図１７−１１】
【図１７−１２】
【図１７−１３】
【図１７−１４】
【図１７−１５】
【図１７−１６】
【図１７−１７】
【図１７−１８】
【図１７−１９】
【図１７−２０】
【図１８】
【図１９−１】
【図１９−２】
【図１９−３】
【図１９−４】
【図１９−５】
【図１９−６】
【公表番号】特表２０１１−５０７９１０（Ｐ２０１１−５０７９１０Ａ）
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３９９３６（Ｐ２０１０−５３９９３６）
【出願日】平成２０年１２月２２日（２００８．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８８０１６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８６３０３
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５１０１７０７１８）ユニバーシティー オブ ロチェスター (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２２日（２００８．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８８０１６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８６３０３
【国際公開日】平成２１年７月９日（２００９．７．９）
【出願人】（５１０１７０７１８）ユニバーシティー オブ ロチェスター (1)
【Ｆターム（参考）】
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