真核細胞におけるエキソンスキッピングの誘導
【課題】細胞による異常型タンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させるための方法であって、異常型タンパク質をコードするエキソンを含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞にいわゆるエキソンスキッピングを誘導することを特徴とする方法を提供する。
【解決手段】エキソンスキッピングは、スキップされたエキソンを有さない成熟ｍＲＮＡを生じ、スキップされたエキソンがアミノ酸をコードしている場合、変化した産物が得られる。エキソンスキッピングはあるエキソンのエキソン封入シグナル、例えばエキソン認識配列、を特異的に阻害することが可能な試薬を細胞に与えることによって行われる。該エキソン封入シグナルはエキソンの一部に対して相補的な核酸によって干渉することができる。医薬、例えば遺伝病の治療を目的とした医薬の調製に用いることができる上記の核酸。
【解決手段】エキソンスキッピングは、スキップされたエキソンを有さない成熟ｍＲＮＡを生じ、スキップされたエキソンがアミノ酸をコードしている場合、変化した産物が得られる。エキソンスキッピングはあるエキソンのエキソン封入シグナル、例えばエキソン認識配列、を特異的に阻害することが可能な試薬を細胞に与えることによって行われる。該エキソン封入シグナルはエキソンの一部に対して相補的な核酸によって干渉することができる。医薬、例えば遺伝病の治療を目的とした医薬の調製に用いることができる上記の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。より詳細には、産生量の減少が求められる望ましくないタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体のエキソンの内部領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１４〜４０個のヌクレオチドを含有し、該エキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド、および上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＲＮＡスプライシングの制御方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
急速なヒトゲノム研究の発展に伴い、専門家及び一般の人々は、病気のメカニズムの解明及び正確かつ信頼性の高い診断法に加えて、数多くの重度の遺伝病の治療法が近い将来確立されることを期待している。
【０００３】
新たな見識によって投与の容易な低分子遺伝子療法が疾病（例えば代謝異常）の治療法として開発されることが期待されるが、その一方で、多くの疾病においては、上記以外の遺伝子療法、即ち、異常な遺伝子産物の修正、付加または置換、が最終的に必要となることが考えられる。
【０００４】
近年、この分野における調査及び開発によって、克服しなければならないいくつかの技術的問題が浮き彫りになった。例えば、遺伝病に関わる複数の遺伝子が広範にわたること（よって治療遺伝子を投与すべき適切な反応系の選択が制限される）、治療用遺伝子の機能すべき組織への到達性（特異的なターゲッティング技術、即ち遺伝子の制限的挿入による物理的ターゲッティング、または組織特異的な親和性を有するシステムの開発による生物学的ターゲッティング、の構築が必要である）、及び投与システムの患者に対する安全性に関連する問題が挙げられる。これらの問題はある程度の相互関係があり、治療用薬剤が小さくなるほど、高効率で、ターゲッティング可能な安全性の高い投与システムの開発が容易であると一般的に結論付けることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明においては、いわゆるエキソンスキッピングを細胞に誘導することによってこれらの問題に対処する。エキソンスキッピングは、スキップされたエキソンを有さない成熟ｍＲＮＡを生じるので、スキップされたエキソンがアミノ酸をコードしている場合、このスキッピングは変化した産物の発現につながる。現在、エキソンスキッピングに関する技術はいわゆる「アンチセンスオリゴヌクレオチド (Anti-sense Oligonucleotide)」（ＡＯＮ）を使用するものであり、その研究のほとんどは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Duchenne muscular dystrophy）（ＤＭＤ）のモデルであるｍｄｘマウスを利用して行われている。ジストロフィン遺伝子のエキソン２３にナンセンス突然変異を有するｍｄｘマウスは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの動物モデルとして利用されている。機能性ジストロフィンタンパク質の合成を排除するはずのｍｄｘ突然変異を有するにもかかわらず、稀に天然のジストロフィン陽性繊維がｍｄｘ筋組織中に観察される。このようなジストロフィン陽性繊維は、体性突然変異、または選択的スプライシングによる、天然のエキソンスキッピング機構によって発生したものと考えられる。ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のイントロン２２及び２３のそれぞれの３’及び５’スプライス部位に特異的なＡＯＮはイントロン２３の除去に通常関与する因子と干渉し、エキソン２３もｍＲＮＡから除去することが示された（Wilton, 1999）。同様の研究において、Dunckleyら（1998）は、３’及び５’スプライス部位に特異的なＡＯＮを使ったエキソンスキッピングが思いがけない結果をもたらしうることを示した。彼らは、エキソン２３のみならず、エキソン２４〜２９のスキッピングを観察し、その結果、エキソン２２とエキソン３０の結合体を有するｍＲＮＡが生成された。思いがけない２２−３０スプライシングバリアントの出現の根底にあるメカニズムは不明である。このようなバリアントの出現は、スプライス部位がコンセンサス配列を含んでおり、その結果、エキソンスキッピングを導くために使用したオリゴヌクレオチドによる非特異的なハイブリダイゼーションが生じたからと考えられる。オリゴヌクレオチドをスキップされるエキソン部位以外のスプライス部位にハイブリダイズさせることによって、当然のことながら、スプライシング反応の精度に容易に干渉することができる。一方、スプライシング反応が精度に欠ける理由としては、（５’及び３’スプライス部位のそれぞれのための）２個のオリゴヌクレオチドの使用が必要であるためと考えられる。１個のオリゴヌクレオチドを有するが、他のオリゴヌクレオチドを有しないｍＲＮＡ前駆体は、思いがけないスプライシングバリアントとなる傾向がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記及びその他の諸問題を克服するために、本発明はＲＮＡスプライシング反応系のｍＲＮＡ前駆体を、該ｍＲＮＡ前駆体に含まれる少なくとも１つのエキソンが有するエキソン封入シグナル（exon inclusion signal）（ＥＩＳ）を特異的に阻害することが可能な試薬と接触させ、そして該ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを行わせしめることを包含する、ＲＮＡスプライシング反応系においてｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを制御するための方法を提供する。エキソン封入シグナルに干渉することの利点は、このような因子がエキソン内に存在するということである。スキップされるエキソン内の配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを与えることによって、エキソン封入シグナルと干渉して、エキソンをスプライシング機構から効果的に遮蔽することができる。スプライシング機構がスキップすべきエキソンを認識しないことによって、最終的なｍＲＮＡからエキソンが排除される。本発明は、スプライシング機構の酵素反応（エキソンの結合）に直接干渉するものではない。このことによって本発明は、確実且つ信頼性の高い方法であると考えられる。ＥＩＳはエキソンに特異的な構造であり、スプライス受容部位及びスプライス供与部位に特定の立体配置を付与するものと考えられる。このような概念においては、特定の立体配置によってスプライシング機構がエキソンを認識すると考えられている。しかしながら、本発明はこのモデルに限定されるものではない。本発明者らは、エキソンに結合可能な試薬がＥＩＳを阻害することを見出した。このような試薬は、エキソンのいかなる部位にも特異的に接触することができるにもかかわらず、ＥＩＳを特異的に阻害することができる。本発明の方法で得られるｍＲＮＡそのものが有用である。例えば、ｍＲＮＡに必要なエキソンが封入されるのを阻害することで、望ましくないタンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させることができる。本発明の方法は、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングによって生じるｍＲＮＡを翻訳する工程を更に包含することが好ましい。また、ｍＲＮＡが機能性タンパク質をコードしていることも好ましい。本発明の好ましい態様においては、タンパク質が２つ以上のドメインを包含し、ドメインの少なくとも１つは、ｍＲＮＡ前駆体に含まれるエキソンの少なくとも一部のスキッピングによって生じたｍＲＮＡにコードされている。エキソンスキッピングが有効な典型的な例としては、これに限定されるわけではないが、少なくとも２つの機能性ドメインを有する野生型構造のタンパク質であって、各ドメインは一次構造であるアミノ酸配列の個別の部分から生成されるものである。具体的には、転写因子が挙げられる。典型的な転写因子はＤＮＡ結合ドメイン及び細胞中の他のタンパク質と反応するドメインを包含する。２つのドメインの間に存在するアミノ酸の一次構造の一部をコードするエキソンのスキッピングによって、少なくとも部分的には同等の機能を発揮する、より短いタンパク質の産生につながる。従って、中間領域における不利益な突然変異（例えばフレームシフト突然変異や停止変異）はエキソンスキッピングを誘導することで少なくとも部分的に修復することが可能であり、（部分的な）機能を有する短いタンパク質を合成することができる。本発明の方法を用いると、エキソンの部分的なスキッピングを誘導することも可能である。この態様においては、試薬とエキソンの接触によって、試薬と接触したエキソンの隠蔽されたスプライス部位が活性化される。この態様は、機能性タンパク質を誘導するｍＲＮＡ前駆体の操作性を拡大する。上記反応系は細胞を包含することが好ましい。細胞は試験管内（in vitro）で培養されるか、または生体内（in vivo）で増殖したものであることが好ましく、これらに限定されるわけではないが、典型的な生物の例にはヒトやマウスが包含される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】エキソン４５の欠失は最も頻発するＤＭＤ突然変異の１種である。この欠失によって、エキソン４４はエキソン４６にスプライシングされ、翻訳読み枠は切断されてエキソン４６の内部に終止コドンが発生し、その結果、ジストロフィンの欠乏が生じる。本発明者らの目的は、更なるエキソン、つまりエキソン４６のスキッピングを人工的に誘導して読み枠を再構築することで、エキソン４５及び４６の欠失を保有する、より穏やかな疾患であるベッカー型筋ジストロフィーの患者に見られるようなわずかに短いが非常に高い機能性を有するジストロフィンタンパク質の合成を復帰させる。
【図２】エキソン４６は、プリン塩基に富んだ、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシング制御を潜在的に担うと考えられる領域を有する。このマウスジストロフィンエキソン４６の内部に存在するプリン塩基に富んだ領域に対して、重なり合う２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートアンチセンスオリゴリボヌクレオチド（ＡＯＮ）からなるプライマー系列を設計した。これらのＡＯＮは長さと配列の両方の点で異なっている。ＡＯＮの化学的修飾は、筋肉細胞内のエンドヌクレアーゼ及びRNase Hに対する抵抗性を付与する。in vitro の研究におけるトランスフェクション効率を調べるために、ＡＯＮはＡＯＮ陽性細胞の同定を可能にする５’フルオレセイン基を含有していた。
【図３】ターゲットとなるエキソン４６のＲＮＡに対する種々のＡＯＮの結合親和性を調べるために、ゲルシフトアッセイを行った。図にはターゲットＲＮＡに最も高い親和性を示す５個のｍＡＯＮ（ｍＡＯＮ＃４，６，８，９及び１１）を示した。ＡＯＮがＲＮＡに結合すると、ゲル移動度の低下した複合体が形成されるので、バンドの変化によって検出することができる。ＡＯＮのターゲットに対する結合は配列特異的である。ランダムｍＡＯＮ、即ちエキソン４６に非特異的なｍＡＯＮはバンドの変化を生じなかった。
【図４】ゲルシフトアッセイで最も高い結合親和性を示したマウス特異的ＡＯＮ及びヒト特異的ＡＯＮをそれぞれマウス培養筋管及びヒト培養筋管にトランスフェクトした。図４Ａ：ｍＡＯＮ＃４，６，９及び１１をトランスフェクトした培養マウス細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析は、エキソン４５がエキソン４７に直接スプライシングされた産物に相当する大きさの部分産物を示した。ランダムＡＯＮをトランスフェクトした場合には、エキソン４６のスキッピングは検出されなかった。図４Ｂ：罹患していない１人（図中の“Ｃ”）及び血縁ではない２人のＤＭＤ患者（図中の“Ｐ１”及び“Ｐ２”）のそれぞれに由来する培養ヒト筋肉細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｈＡＯＮ＃４及びｈＡＯＮ＃８をトランスフェクトした際に部分産物が生じることを明らかにした。対照においては、この産物はエキソン４５がエキソン４７にスプライシングされた産物に相当するが、一方で、患者に見られる断片の大きさは、エキソン４４がエキソン４７にスプライシングされた断片に相当した。トランスフェクトしなかった培養細胞及びランダムｈＡＯＮでトランスフェクトした培養細胞では、エキソン４６のスキッピングは検出されなかった。最も高いエキソン４６スキッピング効率がｈＡＯＮ＃８で得られた。
【図５】患者ＤＬ２７９．１（図４の“Ｐ１”に対応する）から得られたＲＴ−ＰＣＲ産物の配列データであり、このデータによって患者のエキソン４５が欠失しており（上のパネル）、ｈＡＯＮ＃８のトランスフェクションによって更にエキソン４６のスキッピングが起こる（下のパネル）ことを確認した。エキソン４６のスキッピングは特異的であり、エキソン４４はエキソン４７に正確にスプライシングされ、翻訳読み枠を再構築する。
【図６】ｈＡＯＮ＃８でトランスフェクトした患者ＤＬ２７９．１由来の培養筋肉細胞の免疫組織化学分析。タンパク質の異なる領域に対して作成した２種のジストロフィン抗体と細胞を接触させた。使用した抗体は、ターゲットであるエキソン４６に近接する領域に対する抗体（ManDys-1、ex. -31-32）及びエキソン４６から離れた領域に対する抗体（Dys-2、ex. -77-79）である。下のパネルは筋管中にジストロフィンタンパク質が存在しないことを示すのに対し、いずれの抗体でもジストロフィンタンパク質が検出されることから、エキソン４６のｈＡＯＮ＃８誘導性スキッピングは明らかにジストロフィンタンパク質の合成を復帰させた（上のパネル）。
【図７】図７Ａ：ｈＡＯＮ＃２３，＃２４，＃２７，＃２８または＃２９で処理した、対照である培養ヒト筋肉細胞から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析。エキソン５０がエキソン５２にスプライシングされた産物に相当する大きさの部分産物が、ｈＡＯＮ＃２３及び＃２８で処理した細胞で検出された。これらの産物の配列を決定したところ、エキソン５１が正確にスキップされていることが確認された（図７Ｂ）。さらに異常スプライシング産物をｈＡＯＮ＃２８及び＃２９で処理した細胞から得た。配列を決定したところ、ＡＯＮ処理に伴い、低い頻度で使用されるエキソン５１のフレーム内の隠蔽されたスプライス部位の存在が明らかになった。ＡＯＮ処理によって生じた産物には復帰した読み枠からなるエキソン５１の部分産物が含まれており、更なる治療価値が確認された。
【図８】図８Ａ：エキソン２９ターゲットＲＮＡに対する種々のｈＡＯＮ＃２９の結合親和性を確認するために、ゲルシフトアッセイを行った。ハイブリダイゼーションしていないＲＮＡ（図中の「なし」）に比べると、ｈ２９ＡＯＮ＃１，＃２，＃４，＃６，＃９，＃１０及び＃１１はゲル移動度の低い複合体を形成し、ＲＮＡに対する結合を示した。ジストロフィンエキソン１９由来のランダムＡＯＮは複合体を形成しなかった。図８Ｂ：ｈ２９ＡＯＮ＃１，＃２，＃４，＃６，＃９，＃１０または＃１１で処理した対照である培養ヒト筋肉細胞から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析は、エキソン２８がエキソン３０にスプライシングされた産物に相当する大きさの部分産物の存在を明らかにした。これらの結果は、エキソン２９内のＥＲＳであると考えられる領域の内側の配列に対するＡＯＮ（ｈ２９ＡＯＮ＃１，＃２，＃４または＃６）あるいは外側の配列に対するＡＯＮ（ｈ２９ＡＯＮ＃９，＃１０または＃１１）を使ってエキソン２９を特異的にスキップすることが可能であることを示す。エキソン２８及び２９の両方のスキッピングによって生じた更なる異常型スプライシング産物が検出された（配列データによって確認したがここには示さない）。この異常型スプライシング産物は未処理の細胞にも存在したが、これはＡＯＮ処理によって促進される天然の選択的なスキッピングによるものと考えられる。ジストロフィンエキソン１９から得たＡＯＮ１９はエキソン２９のスキッピングを誘導しなかった。図８Ｃ：エキソン２９の特異的スキッピングを部分配列であるＲＴ−ＰＣＲ断片の配列データによって確認した。ｈ２９ＡＯＮ＃１で処理した細胞中のエキソン２９スキッピング産物の塩基配列をここに示す。
【図９】図９Ａ：マウス腓腹筋由来ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析であって、ＲＮＡはｍＡＯＮ＃４，＃６または＃１１をそれぞれ５，１０または２０μｇ投与後２日目に単離したものである。エキソン４５がエキソン４７にスプライシングされた産物に相当する大きさの部分産物をすべての処理筋肉から検出した。ＲＴ−ＰＣＲ反応の負の対照として“−ＲＴ”，“−ＲＮＡ”，“ＡＤ−１”及び“ＡＤ−２”について分析した。図９Ｂ：ｍＡＯＮ＃４と＃６（＃１１も実験したが、データは示さない）によって生じた部分産物の配列を決定し、エキソン４６の正確なスキッピングを確認した。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
好ましい態様において、本発明は異常型タンパク質をコードするエキソンを含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞に対して、該エキソンの少なくとも１つが有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能な試薬を細胞に与え、そして該ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングによって生じるｍＲＮＡの翻訳を行わせしめることを包含する、細胞による異常型タンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させるための方法を提供する。
【０００９】
エキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能ないかなる試薬も本発明に用いることができる。該試薬は、核酸またはそれと同等の機能を有する分子を含有することが好ましいが、該核酸は必ずしも一本鎖でなくてもよい。ペプチド核酸及び同程度の核酸結合特性を有する他の分子も用いることができるが、その結合特性は必ずしも結合量が同等でなくてもよい。核酸またはそれと同等の機能を有する分子は付加的な機能性を発揮するために修飾されていてもよい。例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドを使用することができる。このようなリボヌクレオチドは従来のオリゴヌクレオチドよりもＲＮａｓｅ活性に対する抵抗性が高い。
【００１０】
本発明の好ましい態様において、エキソン封入シグナルはエキソン認識配列（exon recognition sequence）（ＥＲＳ）に特異的なアンチセンス核酸による干渉を受ける。このような配列は比較的プリン塩基に富み、スキップされるエキソンの配列情報を精査することで特定することが可能である（Tanakaら、1994, Mol. Cell Biol. 14: p. 1347-1354）。エキソン認識配列は、いわゆる弱いエキソンのｍＲＮＡへの封入を補助すると考えられる（Achselら、1996, J. Biochem. 120; p. 53-60）。このような弱いエキソンは、例えば、スプライシング機構による認識効率が低い５’及び／または３’スプライス部位を包含する。本発明においては、エキソンスキッピングはいわゆる強いエキソン、すなわち細胞のスプライシング機構によって通常効率よく認識されるエキソン、においても誘導することができることを見出した。与えられたいかなる配列からも、その配列がエキソンと推定される領域を包含するかどうかを予測し、そのエキソンが強いか弱いかを確認することが（ほとんどの場合）可能である。エキソンの強度を確認するためのいくつかの手法が存在する。有用な手法としてＮｅｔｇｅｎｅ２スプライス部位予測サーバー（NetGene splice site prediction server）（Brunakら、1991, J. Mol. Biol. 220: p. 49-65）で検索することができる。本発明の方法によるエキソンスキッピングは（ほとんど）すべてのエキソンに誘導することが可能であり、エキソンが弱いエキソンであるか強いエキソンであるか、ならびにエキソンがＥＲＳを包含するかどうかにも依存することはない。好ましい態様において、スキッピングのターゲットとなるエキソンは強いエキソンである。他の１つの好ましい態様において、スキッピングの対象となるエキソンはＥＲＳを包含しない。
【００１１】
本発明の方法は様々な用途に使用することが可能である。１つの態様において、本発明の方法は異常型タンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させるために使用する。このようなタンパク質としては、例えば、腫瘍タンパク質またはウイルス性タンパク質が挙げられる。多くの腫瘍において、腫瘍タンパク質の存在のみならず、その相対的な発現程度が腫瘍細胞の表現型に関係している。同様に、ウイルス性タンパク質の存在のみならず、細胞中のウイルス性タンパク質の量が特定のウイルスの毒性を決定している。さらに、ウイルスの有効な増加及び蔓延のために、ウイルスの生活環における発現の時期及び細胞中の特定のウイルス性タンパク質の量的バランスによって、ウイルスが効率的にまたは非効率的に増殖するかどうかが決定される。本発明の方法を使用して細胞中の異常型タンパク質の量を減少させることで、例えば腫瘍細胞の腫瘍形成性（転移性）及び／またはウイルス感染細胞のウイルス増殖性を低下させることができる。
【００１２】
好ましい態様において、本発明の方法を用いて異常型タンパク質を機能性タンパク質に変更する。１つの態様において、上記のような機能性タンパク質は、細胞に通常存在するが、処理する細胞には存在しないタンパク質の機能を発揮する。大抵の場合、機能を部分的に修復しただけでも、処理した細胞の性能が著しく向上する。向上した性能故に処理した細胞は未処理の細胞よりも選択的な優位性を示すことができ、処理の有効性を高めている。
【００１３】
上述した本発明の態様は、特に欠失した遺伝子の発現を復帰させるのに適している。これはターゲットとなるエキソンの特異的なスキッピングを行い、有害な変異（典型的なものとしては停止変異またはフレームシフト点突然変異、あるいは翻訳停止をもたらす１つ以上のエキソンの欠失または挿入）を回避するか修正することによって達成される。
【００１４】
遺伝子導入法に比べて、本発明の新規なスプライスシング制御型遺伝子治療（splice-modulation gene therapy）は、より小さな治療薬、これに限定されるわけではないが、典型的な例としては１４〜４０個のヌクレオチドからなる治療薬の投与を必要とする。好ましい態様においては、製造が容易であり、細胞による取り込みがより効果的に行われることから、１４〜２５個のヌクレオチドからなる分子を使用する。本発明の方法は、治療薬に付随する、効果的で安全な投与システムの設計をより柔軟に行うことを可能とする。本発明のこのような態様の重要な更なる利点は、大部分またはすべての遺伝子調節回路を未だ保持する内因性遺伝子活性の（少なくとも一部）を復帰させることで、組織特異的なアイソフォームの適切な発現レベルと合成を保障することである。
【００１５】
上述の本発明の態様は、原則として、いかなる遺伝病や遺伝的疾病素質にも適用することができ、配列内部においてわずかに短いタンパク質の翻訳が完全にまたは部分的に機能している場合に限り、特定のエキソンを標的とするスキッピングによって、元々変異によって破壊された翻訳読み枠を復帰させることができる。この方法の適用に治療的価値が見出される態様としては、腫瘍抑制遺伝子の二次変異によって生じる疾病素質が挙げられ、例えば、乳ガン、結腸ガン、結節性硬化症、神経線維腫症などにおいては、活性の（部分的な）回復が二次変異による異数性の発現を排除し、腫瘍形成を防ぐ。他の好ましい態様には、遺伝子産物の欠失が直接的な疾病誘引効果を示す遺伝子の（部分的な）修復が含まれる。例えば、血友病Ａ（血液凝固第ＶＩＩＩ因子の欠乏によるもの）、先天的甲状腺機能不全症のいくつかの形態（チログロブリン合成欠損によるもの）、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）が挙げられる。ＤＭＤは、フレームシフトによって生じるＸ連鎖性ジストロフィン遺伝子の欠失、重複及び停止突然変異が重度の進行性筋力低下をもたらす疾患である。通常ＤＭＤは発症すると青年期の後期または成人期の初期に死に至るが、その一方で、同じ遺伝子座にフレームシフト以外の方法で欠失または重複突然変異が生じて発症したベッカー型筋ジストロフィーは軽症であり、平均余命は３５〜４０年から正常人と同じである。ＤＭＤに適用する本発明の態様においては、本発明の方法によって現存する欠失領域をエキソンスキッピングによって伸張する（または現存する重複突然変異体のｍＲＮＡ産物を改変する）ことができる。これは読み枠を復帰させ、配列内部においてわずかに短くなっているが機能性のタンパク質を産生するのに必要な数の近接したエキソンのスキッピングによって行う。このような欠失の誘導と同等の変異を有するＢＭＤ患者の臨床的症状が軽いことに基づき、ＡＯＮ療法を受けたＤＭＤ患者の症状は軽減されると考えられる。
【００１６】
ジストロフィン遺伝子に生じる種々の変異が機能不全性タンパク質につながる。（総合目録としてhttp://www.dmd.nl、即ち、ＤＭＤ及び関連疾患の国際的に承認されたデータベース、を参照）。機能性ジストロフィンタンパク質を産生させるために実際にスキップすべきエキソンは突然変異によって変化する。表１はスキップすることのできるエキソンの一覧であるが、本願はこれらに制限されることはない。この表においては、上述のエキソンに対して、ヒトで観察された高頻度で発生するジストロフィン遺伝子変異であって、本発明の方法で治療することができるものも示した。表に示したエキソンのスキッピングは、少なくともベッカー型筋ジスロトフィータンパク質の機能を有する変化したジストロフィンタンパク質の産生をもたらす。このように、本発明の１つの態様において、エキソン封入シグナルがヒトジストロフィン遺伝子のエキソン２，８，４３，４４，４５，４６，５０，５１，５２または５３に存在することを特徴とする方法が提供される。ある欠失／挿入変異の発生は、他の変異より高頻度で発生する。本発明の方法でエキソン４６のスキッピングを誘導すると、ＤＭＤの欠失を保有する患者の約７％で治療に成功し、ジストロフィン陽性筋肉繊維がジストロフィン患者に検出されることが明らかとなった。また、本発明の方法でエキソン５１のスキッピングを誘導することによって、ＤＭＤの欠失を保有する患者の約１５％を治療することに成功した。この治療方法によって、該患者は少なくとも少量のジストロフィン陽性筋肉繊維を有するようになった。本発明の方法を使用したエキソン４６または５１のスキッピングによって、ジストロフィン遺伝子の欠失を保有する患者の約２２％を治療することができる。従って、本発明の好ましい態様においては、エキソン封入シグナルはエキソン４６またはエキソン５１に存在する。特に好ましい態様においては、使用する試薬は以下の核酸配列を包含する：ｈＡＯＮ＃４、ｈＡＯＮ＃６、ｈＡＯＮ＃８、ｈＡＯＮ＃９、ｈＡＯＮ＃１１及び／またはｈＡＯＮ＃２１〜３０からなる群から選ばれる少なくとも１つの核酸配列；或いは上記ｈＡＯＮ＃の機能性領域、誘導体及び／または類似体。機能性領域、誘導体及び／または類似体は、上記ｈＡＯＮ＃と同等のエキソンスキッピング活性を有するが、本発明の方法においては、該活性量が必ずしも同等でなくてもよい。
【００１７】
ｍＲＮＡ前駆体に含まれる１つ以上のエキソンのエキソンスキッピングを誘導することは効果的である。例えば、変異の多様性並びにエキソンの長さや変異に隣接するアミノ酸配列といった一定の性質を考慮すると、機能を復帰させるためには１つ以上のエキソンをスキップしなければならないという状況が起こりうる。ＤＭＤ欠失データベースに見られるこのような状況の好ましい例としては、エキソン４６〜５０の欠失が挙げられるが、これに限定されるものではない。エキソン４６〜５０が欠失している患者は機能性ジストロフィンタンパク質を生成しない。しかしながら、エキソン４５及びエキソン５１のスキッピングを誘導することによって少なくとも部分的な機能を有するジストロフィンタンパク質を生成することができる。他の好ましい例としてはエキソン２の重複を有する患者が挙げられるが、これに限定されるものではない。エキソン２のＥＩＳを阻害することが可能な試薬を与えることで、エキソン２の一方または両方を部分的にスキップし、エキソン２の部分配列からなる領域または２つのエキソン２を欠失した領域の隣から野生型タンパク質を得ることが可能である。他の好ましい例として、エキソン４５〜５０のスキッピングが挙げられるが、これに限定されるものではない。このスキッピングにより読み枠内でベッカー様バリアントが生じる。ベッカー様バリアントはエキソン４５，４６，４７，４８，４９及び／または５０あるいはそれらの組み合わせに存在するいかなる変異を治療するためにも誘導することができる。本発明のその他の態様においては、ｍＲＮＡ前駆体に含まれる他のエキソンの有するエキソン封入シグナルを阻害する他の試薬を細胞に与える工程を更に包含することを特徴とする方法が提供される。ｍＲＮＡ前駆体の２つ以上の異なる遺伝子にエキソンスキッピングを誘導するために２つ以上の試薬を使用することは、当然のことながら本発明の範囲に含まれる。
【００１８】
他の１つの態様において、本発明はスプライシング制御型遺伝子治療に適した試薬を選択するための方法及び選択した試薬の特異的エキソンスキッピング試薬としての有効性を予備実験で確認するための方法を提供する。目的エキソンの一部に対して相補的な試薬が、該エキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能であることを確認するための方法であって、目的のエキソンを含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞に被験試薬を与え、該細胞を培養して該ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡを生成せしめ、そして生成した該ｍＲＮＡに該エキソンが存在しないことを確認することを包含する方法が提供される。好ましい態様において、該試薬が、核酸またはそれと同等の機能を有する分子を含有し、該核酸は目的エキソンの一部に対して相補的である。特異的エキソンスキッピングを誘導することが可能な試薬を本発明の方法で同定することができる。この方法には、該試薬がエキソンを含む核酸、好ましくはＲＮＡ、に比較的高い親和性で結合するかどうかを確認するための予備スクリーニングを行うことも含まれる。この結果、試薬がエキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能であることを確認するための方法が提供され、該方法は試験管内の条件において、該核酸またはそれと同等の機能を有する分子と該目的エキソンを包含するｍＲＮＡ分子との相対的な結合親和性を測定する工程を更に包含する。
【００１９】
他の態様において、本発明の方法によって得られる試薬を提供する。好ましい態様においては、該試薬は核酸またはそれと同等の機能を有する分子を包含する。該試薬は、それを用いて細胞にエキソンスキッピングを誘導した場合、細胞中の異常型タンパク質の量を少なくとも部分的に減少させることが好ましく、該エキソンスキッピングによって、該細胞で機能を発揮しうるタンパク質をコードするＲＮＡを生じることが更に好ましい。特に好ましい態様において、ｍＲＮＡ前駆体はジストロフィン遺伝子から誘導されたものである。機能性タンパク質は変異ジストロフィンタンパク質または正常ジストロフィンタンパク質を包含することが好ましい。また、変異ジストロフィンタンパク質が少なくともベッカー型筋ジストロフィー患者のジストロフィンタンパク質の機能を有することが好ましい。特に好ましい態様においては、使用する試薬は以下の核酸配列を包含する：ｈＡＯＮ＃４、ｈＡＯＮ＃６、ｈＡＯＮ＃８、ｈＡＯＮ＃９、ｈＡＯＮ＃１１及び／またはｈＡＯＮ＃２１〜３０からなる群から選ばれる少なくとも１つの核酸配列；或いは上記ｈＡＯＮ＃の機能性領域、誘導体及び／または類似体。機能性領域、誘導体及び／または類似体は、上記ｈＡＯＮ＃と同等のエキソンスキッピング活性を有するが、本発明の方法においては、該活性量が必ずしも同等でなくてもよい。
【００２０】
細胞に試薬を導入するための種々の方法が当業界では知られている。特に核酸の導入方法は広範にわたって開発されている。当業者はある導入方法が本発明を実施するのに適しているかどうかを十分確認することができる。このような方法の一例は、本発明の試薬をリポソームに封入し、該リポソームを目的ｍＲＮＡ前駆体を有する細胞に与えることを包含するが、本発明はこの例に限定されるものではない。リポソームは核酸を細胞に導入するための運搬体として特に適している。エキソンスキッピングを誘導することのできるアンチセンス分子は、アンチセンスＲＮＡを生成するための転写単位を包含する核酸を導入し、細胞に生成させることが可能である。適切な転写単位としては核内低分子ＲＮＡまたはｔＲＮＡ転写単位が挙げられるが、これらに限定されるものではない。従って、本発明は、エキソン封入シグナルを阻害することが可能な本発明の核酸またはそれと同等の機能を有する分子を包含する核酸運搬体を更に提供する。１つの態様において、該運搬体は本発明の核酸を発現させることが可能である。一本鎖ウイルスを運搬体として利用した場合には、当然のことながら、そのようなウイルスが本発明の試薬のアンチセンス配列だけを包含するものであっても本発明の範囲に含まれる。また、このような一本鎖ウイルスの他の１つの態様においては、本発明のＡＯＮは、運搬体としてのウイルスに封入されているウイルス核に存在する核内低分子ＲＮＡまたはｔＲＮＡ転写単位によってコードされている。好ましい一本鎖ウイルスはアデノ随伴ウイルスである。
【００２１】
更なる１つの態様において、本発明は医薬の調製に用いる、核酸または核酸運搬体を提供する。好ましい態様において、該医薬を遺伝病の治療に使用する。さらに好ましくは、該医薬をデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用する。
【実施例】
【００２２】
エキソン４５はＤＭＤにおいて最も高頻度で欠失が起こるエキソンなので、本発明者らははじめにエキソン４６の特異的なスキッピングの誘導を試みた（図１）。この誘導によってエキソン４５及び４６の欠失を保有するＢＭＤ患者に見られる、短いがより機能的なジストロフィンタンパク質を産生する。マウスジストロフィン遺伝子のジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを制御するための実験系を初めに構成した。その後、エキソン４５の欠失を保有するＤＭＤ患者由来の筋肉細胞において翻訳読み枠とジストロフィン合成を復帰させることを目的として、ヒトジストロフィン遺伝子にねらいを定めた。
【００２３】
ｍＡＯＮｓ及びｈＡＯＮｓの設計
エキソン４６の内部領域に対するマウス特異的ＡＯＮ系列及びヒト特異的ＡＯＮ系列（ｍＡＯＮ及びｈＡＯＮ）を設計した（図２）。使用したエキソン４６の内部領域は、プリン塩基に富んだ配列を有し、エキソン４６のスプライシング制御に係る推定上の機能を有すると考えられる。ゲルシフトアッセイによるＡＯＮの初期スクリーニング（下記参照）のために未修飾のＤＮＡオリゴヌクレオチド（ベルギー国、EuroGentec社に合成を依頼）を使用した。筋肉細胞のトランスフェクション実験を実際に行う際には、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートアンチセンスオリゴリボヌクレオチド（ベルギー国、EuroGentec社に合成を依頼）を使用した。このような修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドはエンドヌクレアーゼ及びRNase Hに対する抵抗性を有し、高い親和性でＲＮＡに結合することが知られている。最終的に有効であると認められ、in vitro で筋肉細胞に与えたＡＯＮの配列を下記に示す。対応するマウス特異的ＡＯＮとヒト特異的ＡＯＮは高い相同性があるが完全に同一ではない。
【００２４】
以下に使用したＡＯＮのデオキシ体を示すが、最終的に使用した２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドにおいては、ＴをＵに置き換える。
【００２５】
【００２６】
【００２７】
ゲルシフトアッセイ
ＡＯＮの有効性は、ターゲット配列に対する結合親和性に基づいて決定した。ＲＮＡフォールディングを予測するためのコンピュータシミュレーションプログラムの近年の発展にもかかわらず、設計したＡＯＮのどれが高い親和性でターゲット配列に結合するかを推測することは難しい。従って、ゲルシフトアッセイを（Bruiceら、１９９７に記載のプロトコールに従って）行った。エキソン４６ターゲットＲＮＡ断片を、（マウスまたはヒト筋肉ｍＲＮＡから、Ｔ７プロモーター配列を有するセンスプライマ−を利用して増幅した）ＰＣＲ断片から32Ｐ−ＣＴＰの存在下のin vitro Ｔ７転写法で生成した。ターゲットである転写断片に対する個々のＡＯＮ（０．５ｐｍｏｌ）の結合親和性は、３７℃で３０分間ハイブリダイゼーションを行い、次いでポリアクリルアミド（８％）ゲル電気泳動を行うことで測定した。これらの分析をマウス特異的ＡＯＮ及びヒト特異的ＡＯＮをスクリーニングするために行った（図３）。少なくとも５個の異なるマウス特異的ＡＯＮ（ｍＡＯＮ＃４、６、８、９及び１１）及びそれらに対応する４個のヒト特異的ＡＯＮ（ｈＡＯＮ＃４、６、８及び９）において移動度の変化が観察され、ターゲットＲＮＡに対して結合親和性を有することを示した。
【００２８】
培養筋肉細胞のトランスフェクション
ＡＯＮによるin vitro の筋肉細胞におけるスキッピング誘導効率を分析するために、ゲルシフトアッセイを用いてターゲットエキソンに対して最も高い結合親和性を示したエキソン４６特異的ＡＯＮを選択した。すべてのトランスフェクション実験において、非特異的ＡＯＮをエキソン４６の特異的スキッピングの負の対照として用いた。前述したように、はじめにマウス筋肉細胞の実験系を構築した。マウス筋肉細胞系であるＣ２Ｃ１２細胞由来の（ジストロフィン発現レベルの高い）培養増殖筋芽細胞及び培養分裂後筋管の両方を使用した。後に行ったヒト由来培養筋肉細胞の実験には、罹患していない１人の筋肉生検材料及びエキソン４５の欠失を保有する、血縁ではない２人のＤＭＤ患者の筋肉生検材料のそれぞれから単離した培養一次筋肉細胞を使用した。これらの異種培養物はおよそ２０〜４０％の筋原細胞を含んでいた。異なるＡＯＮ（濃度：１μＭ）に対して３当量比のカチオンポリマーＰＥＩ（MBI Fermentas社製）を用い、細胞にＡＯＮをトランスフェクトした。これらの実験でトランスフェクトしたＡＯＮは５’フルオレセイン基を有し、そのため蛍光性の核を数えることでトランスフェクション効率を測定することができる。概して、６０％以上の細胞が核に特異的にＡＯＮの取り込みを示した。ＲＴ−ＰＣＲ分析を促進するために、トランスフェクトの２４時間後にＲＮＡｚｏｌＢ（オランダ国、CamPro Scientific社製）を使ってＲＮＡを単離した。
【００２９】
ＲＴ−ＰＣＲ及び配列の決定
ＲＮＡの逆転写をC. therm. ポリメラーゼ（Roche社製）及びエキソン４８特異的逆転写プライマーを使って行った。ジストロフィン遺伝子のエキソン４６のスキッピングを検出するために、ＰＣＲを２サイクル行ってｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、エキソン４４及び４７に含まれるプライマー（ヒト実験系）またはエキソン４５及び４７に含まれるプライマー（マウス実験系）を使用したプライマーシフト増幅（nested amplification）を包含する。培養マウス筋芽細胞及び培養マウス筋管細胞では、エキソン４５がエキソン４７に直接スプライシングされた産物に相当する大きさの部分産物を検出した（図４）。続いて行った配列の決定によって、マウスジストロフィン転写産物におけるエキソン４６の特異的なスキッピングを確認した。エキソンスキッピングの効率は個々のＡＯＮで異なり、ｍＡＯＮ＃４及び＃１１が最も高い効率を示した。これらの好ましい結果に基づき、培養ヒト筋肉細胞においても、ジストロフィンのスプライシングを同様に制御することに着目した実験を行った。その結果、エキソン４５がエキソン４７にスプライシングされた産物に相当する部分産物を対照となる筋肉細胞で検出した。興味深いことに、患者由来筋肉細胞では、エキソン４４がエキソン４７にスプライシングされてなる短い断片が検出された。エキソン４６の特異的なスキッピングをヒトジストロフィン転写産物の配列データによって確認した。マウスとヒトの両方のジストロフィン転写産物に見られたこのようなスプライシングの制御は、トランスフェクトされていない培養細胞や非特異的ＡＯＮでトランスフェクトされた培養細胞には見られなかった。
【００３０】
免疫組織化学分析
ジストロフィンタンパク質の翻訳および合成を復帰させるために、エキソン４５の欠失を保有する患者由来の筋肉細胞においてエキソン４６のスキッピングの誘導を試みた。ｈＡＯＮ＃８でトランスフェクトした際のジストロフィン産物を検出するために、ジストロフィンタンパク質のターゲット領域に隣接するドメインと遠位のドメインのそれぞれに対して作成した２種のジストロフィンモノクローナル抗体（Mandys-1及びDys-2）を使用して、２種の患者由来培養筋肉細胞を免疫細胞化学分析に付した。蛍光分析によって、いずれの患者由来培養細胞においてもジストロフィン合成が復帰していることが明らかになった（図５）。処理したサンプルにおいては、約８０％以上の筋繊維がジストロフィンに対して陽性に染色された。
【００３１】
本発明者らの実験結果は、ＤＭＤ患者由来筋肉細胞の内因性ＤＭＤ遺伝子によるジストロフィン合成の復帰を初めて示す。これは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の目的に応じたスプライシング制御を治療目的で実施するための原理を証明する。
【００３２】
エキソン５１のターゲットスキッピング
ジストロフィンエキソンの同時スキッピング
エキソン５１のターゲットスキッピング。本発明者らは、in vitro のマウス及びヒト筋肉細胞におけるジストロフィンのエキソン４６のＡＯＮによる制御の可能性について明示した。これらの知見はＡＯＮをＤＭＤの治療用の試薬として評価する更なる研究の根拠を示した。ＤＭＤを誘発する欠失の大部分は遺伝子内の突然変異が起こりやすい２つの部位で集中的に発生し、ある１つの特定エキソンのターゲットスキッピングによって種々の突然変異を有する一連の患者の読み枠を復帰することができる（表１を参照）。エキソン５１は興味深いターゲットエキソンである。このエキソンのスキッピングは、エキソン５０，エキソン４５〜５０，エキソン４８〜５０，エキソン４９〜５０，エキソン５２，又はエキソン５２〜６３にわたる領域の欠失を保有する患者の治療に用いることが可能であり、このような患者の合計は本発明者らのライデンデータベース（Leiden database）に登録されている総患者数の１５％に達する。
【００３３】
ジストロフィンのエキソン５１内に存在するプリン塩基に富んだ種々の領域に対するヒト特異的ＡＯＮ１０種（ｈＡＯＮ＃２１〜３０、下記参照）を設計した。このようなプリン塩基に富んだ領域は、エキソンのスプライシング反応の制御を担うと推定される因子、すなわちスプライシング反応の際にエキソンの除去を誘導するために遮蔽を試みた領域の存在を示唆した。すべての実験をエキソン４６のスキッピングに用いたプロトコール（上記参照）に従って行った。ターゲットＲＮＡに高い結合親和性を有するｈＡＯＮを確認するために、ゲルシフトアッセイを行った。最も高い親和性を示す５種のｈＡＯＮを選択した。エキソン５１のスキッピングの可能性をin vitro で分析するために、これらのｈＡＯＮを対照となるヒト筋肉細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後にＲＮＡを単離し、エキソン５３または６５に特異的な逆転写用プライマーを使ってｃＤＮＡを作製した。ターゲット領域のＰＣＲによる増幅は、エキソン５１に隣接する種々のプライマーを組み合わせて行った。ＲＴ−ＰＣＲ及び配列の決定によって、エキソン５１の特異的なスキッピングが誘導されていたことがヒトジストロフィン転写産物から明らかとなった。続いて、エキソンのスキッピングを誘導することが示されている２種のｈＡＯＮ（＃２３及び＃２９）を、上記の突然変異の１つを有するＤＭＤ患者由来の６種の培養筋肉細胞にトランスフェクトした。これらの培養細胞におけるエキソン５１のスキッピングをＲＴ−ＰＣＲ及び配列の決定によって確認した（図７）。更に重要なことに、ジストロフィンタンパク質の異なる部分に対して作成した複数の抗体を用いた免疫組織化学分析によると、すべての分析結果がエキソン５１のスキッピングによってジストロフィンタンパク質の合成が復帰したことを示していた。
【００３４】
【００３５】
複数のジストロフィンエキソンの同時スキッピング。
欠失変異に加えて１つのエキソン、例えばエキソン４６またはエキソン５１、のスキッピングを行うことで、多種にわたるＤＭＤ突然変異の読み枠を復帰させることができる。この方法が適用可能な突然変異の範囲は、１つ以上のエキソンを同時にスキッピングすることによって拡大することができる。例えば、エキソン４６からエキソン５０の欠失を有するＤＭＤ患者において、欠失領域に隣接したエキソン４５及び５１の両方のスキッピングを行うだけで翻訳読み枠の再構成を可能にした。
【００３６】
ＥＲＳ非依存性のエキソンスキッピング。
２人のベッカー型筋ジストロフィー患者に見られるエキソン２９の突然変異はエキソン２９のスキッピングを生じた（Ginjaarら、2000, EJHG, vol. 8: p. 793-796）。ＡＯＮを用いた突然変異部位ターゲッティングによってエキソン２９のスキッピングを誘導する可能性について検討した。突然変異はＥＲＳ活性と関連しうるプリン塩基に富んだ領域に位置している。ＥＲＳであると考えられる領域の内側（ｈ２９ＡＯＮ＃１〜ｈ２９ＡＯＮ＃６）及び外側（ｈ２９ＡＯＮ＃７〜ｈ２９ＡＯＮ＃１１）に対するＡＯＮ系列を設計した（下記参照）。ターゲットＲＮＡに対して高い親和性を示すＡＯＮを同定するために、ゲルシフトアッセイを（前述のように）行った（図８）。続いて、ｈ２９ＡＯＮ＃１，＃２，＃４，＃６，＃９，＃１０及び＃１１を対照である培養ヒト筋管にＰＥＩトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後にＲＮＡを単離し、エキソン３１に特異的な逆転写プライマーを使ってｃＤＮＡの逆転写を行った。ターゲット領域のＰＣＲによる増幅はエキソン２９に隣接する種々のプライマーを組み合わせて行った。このＲＴ−ＰＣＲ及びそれに続く配列の決定（図８ＢとＣ）によって、ヒトジストロフィン転写産物においてエキソン２９のスキッピングが誘導されたことが明らかになった。しかしながら、エキソン２９のスキッピングを促進するこれらのＡＯＮは、ＡＯＮが結合すると考えられるＥＲＳの内側と外側の両方の配列に基づいて設計されたものだった（ｈ２９ＡＯＮ＃１，＃２，＃４，＃６，＃９及び＃１１）。これらの結果から、エキソン２９のスキッピングはエキソン２９がＥＲＳを含むか含まないかには依存せず、従ってＡＯＮのエキソン２９に対する結合はＥＲＳよりもエキソン封入シグナルを不活性化すると考えられる。ここに証明したＥＲＳ非依存性エキソンスキッピングは、本発明の治療方法の適応範囲全体をＥＲＳを含まないエキソンにまで広げる可能性がある。
【００３７】
【００３８】
【００３９】
マウス筋肉組織におけるin vivo のＡＯＮ誘導性エキソン４６スキッピング。
培養筋肉細胞を用いた実験で見込みのある結果が得られたので、次にin vivo で種々のマウスジストロフィンエキソン４６に特異的なＡＯＮを試験した。試験はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に結合させたマウスジストロフィンエキソン４６に特異的ＡＯＮを対照となるマウスの腓腹筋に筋肉注射することで行った。in vitro のマウス筋肉細胞における有効性が既に明らかとなっているｍＡＯＮ＃４，＃６及び＃１１は、ＲＴ−ＰＣＲ及び配列の決定によってin vivo の筋肉組織でエキソン４６のスキッピングを誘導することが判明した（図９）。in vivo のエキソン４６のスキッピングは投与量に依存しており、２０μｇ／筋肉／日の２日間にわたる注射で最も高い効率（最大１０％）を示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００４０】
【非特許文献１】Achsel et al., 1996, J. Biochem. 120: p. 53-60.
【非特許文献２】Bruice T.W. and Lima, W.F. (1997) Biochemistry 36 (16): p. 5004-5019.
【非特許文献３】Brunak et al., 1991, J. Mol. Biol. 220: p. 49-65.
【非特許文献４】Dunckley, MG et al, (1998) Human molecular genetics 7: p. 1083-1090.
【非特許文献５】Ginjaar et al., 2000, EJHG, vol. 8, p. 793-796.
【非特許文献６】Mann et al., 2001, PNAS vol. 98, p. 42-47.
【非特許文献７】Tanaka et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: p. 1347-1354.
【非特許文献８】Wilton SD et al., (1999) Neuromuscular disorders 9: p. 330-338.
【００４１】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー及び関連疾患の詳細及び背景はウェブサイトhttp://www.dmd.nlで検索することができる。
【００４２】
【表１】
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号１： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃２
配列番号２： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃３
配列番号３： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃４
配列番号４： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃５
配列番号５： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃６
配列番号６： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃７
配列番号７： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃８
配列番号８： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃９
配列番号９： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃１０
配列番号１０： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃１１
配列番号１１： ヒト特異的ＡＯＮであるｈＡＯＮ＃４
配列番号１２： ヒト特異的ＡＯＮであるｈＡＯＮ＃６
配列番号１３： ヒト特異的ＡＯＮであるｈＡＯＮ＃８
配列番号１４： ヒト特異的ＡＯＮであるｈＡＯＮ＃９
配列番号１５： ヒト特異的ＡＯＮであるｈＡＯＮ＃１１
配列番号１６： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２１
配列番号１７： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２２
配列番号１８： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２３
配列番号１９： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２４
配列番号２０： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２５
配列番号２１： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２６
配列番号２２： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２７
配列番号２３： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２８
配列番号２４： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２９
配列番号２５： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃３０
配列番号２６： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃１
配列番号２７： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃２
配列番号２８： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃３
配列番号２９： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃４
配列番号３０： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃５
配列番号３１： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃６
配列番号３２： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃７
配列番号３３： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃８
配列番号３４： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃９
配列番号３５： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃１０
配列番号３６： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃１１
配列番号３８： ｈＡＯＮ＃８で処理した細胞に見られる、エクソン４４がエクソン４７にスプライシングしたものに相当するサイズの短縮産物
配列番号３９： ｈＡＯＮ＃２３で処理した細胞に見られる、エクソン５０がエクソン５２にスプライシングしたものに相当するサイズの短縮産物
配列番号４０： ｈ２９ＡＯＮ＃１で処理した細胞に見られる、エクソン２８がエクソン３０にスプライシングしたものに相当するサイズの短縮産物
配列番号４１： ｍＡＯＮ＃４で処理したマウスに見られる、エクソン４５がエクソン４７にスプライシングしたものに相当するサイズの短縮産物
配列番号４２： ｍＡＯＮ＃６で処理したマウスに見られる、エクソン４５がエクソン４７にスプライシングしたものに相当するサイズの短縮産物
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。より詳細には、産生量の減少が求められる望ましくないタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体のエキソンの内部領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１４〜４０個のヌクレオチドを含有し、該エキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド、および上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＲＮＡスプライシングの制御方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
急速なヒトゲノム研究の発展に伴い、専門家及び一般の人々は、病気のメカニズムの解明及び正確かつ信頼性の高い診断法に加えて、数多くの重度の遺伝病の治療法が近い将来確立されることを期待している。
【０００３】
新たな見識によって投与の容易な低分子遺伝子療法が疾病（例えば代謝異常）の治療法として開発されることが期待されるが、その一方で、多くの疾病においては、上記以外の遺伝子療法、即ち、異常な遺伝子産物の修正、付加または置換、が最終的に必要となることが考えられる。
【０００４】
近年、この分野における調査及び開発によって、克服しなければならないいくつかの技術的問題が浮き彫りになった。例えば、遺伝病に関わる複数の遺伝子が広範にわたること（よって治療遺伝子を投与すべき適切な反応系の選択が制限される）、治療用遺伝子の機能すべき組織への到達性（特異的なターゲッティング技術、即ち遺伝子の制限的挿入による物理的ターゲッティング、または組織特異的な親和性を有するシステムの開発による生物学的ターゲッティング、の構築が必要である）、及び投与システムの患者に対する安全性に関連する問題が挙げられる。これらの問題はある程度の相互関係があり、治療用薬剤が小さくなるほど、高効率で、ターゲッティング可能な安全性の高い投与システムの開発が容易であると一般的に結論付けることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明においては、いわゆるエキソンスキッピングを細胞に誘導することによってこれらの問題に対処する。エキソンスキッピングは、スキップされたエキソンを有さない成熟ｍＲＮＡを生じるので、スキップされたエキソンがアミノ酸をコードしている場合、このスキッピングは変化した産物の発現につながる。現在、エキソンスキッピングに関する技術はいわゆる「アンチセンスオリゴヌクレオチド (Anti-sense Oligonucleotide)」（ＡＯＮ）を使用するものであり、その研究のほとんどは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Duchenne muscular dystrophy）（ＤＭＤ）のモデルであるｍｄｘマウスを利用して行われている。ジストロフィン遺伝子のエキソン２３にナンセンス突然変異を有するｍｄｘマウスは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの動物モデルとして利用されている。機能性ジストロフィンタンパク質の合成を排除するはずのｍｄｘ突然変異を有するにもかかわらず、稀に天然のジストロフィン陽性繊維がｍｄｘ筋組織中に観察される。このようなジストロフィン陽性繊維は、体性突然変異、または選択的スプライシングによる、天然のエキソンスキッピング機構によって発生したものと考えられる。ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のイントロン２２及び２３のそれぞれの３’及び５’スプライス部位に特異的なＡＯＮはイントロン２３の除去に通常関与する因子と干渉し、エキソン２３もｍＲＮＡから除去することが示された（Wilton, 1999）。同様の研究において、Dunckleyら（1998）は、３’及び５’スプライス部位に特異的なＡＯＮを使ったエキソンスキッピングが思いがけない結果をもたらしうることを示した。彼らは、エキソン２３のみならず、エキソン２４〜２９のスキッピングを観察し、その結果、エキソン２２とエキソン３０の結合体を有するｍＲＮＡが生成された。思いがけない２２−３０スプライシングバリアントの出現の根底にあるメカニズムは不明である。このようなバリアントの出現は、スプライス部位がコンセンサス配列を含んでおり、その結果、エキソンスキッピングを導くために使用したオリゴヌクレオチドによる非特異的なハイブリダイゼーションが生じたからと考えられる。オリゴヌクレオチドをスキップされるエキソン部位以外のスプライス部位にハイブリダイズさせることによって、当然のことながら、スプライシング反応の精度に容易に干渉することができる。一方、スプライシング反応が精度に欠ける理由としては、（５’及び３’スプライス部位のそれぞれのための）２個のオリゴヌクレオチドの使用が必要であるためと考えられる。１個のオリゴヌクレオチドを有するが、他のオリゴヌクレオチドを有しないｍＲＮＡ前駆体は、思いがけないスプライシングバリアントとなる傾向がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記及びその他の諸問題を克服するために、本発明はＲＮＡスプライシング反応系のｍＲＮＡ前駆体を、該ｍＲＮＡ前駆体に含まれる少なくとも１つのエキソンが有するエキソン封入シグナル（exon inclusion signal）（ＥＩＳ）を特異的に阻害することが可能な試薬と接触させ、そして該ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを行わせしめることを包含する、ＲＮＡスプライシング反応系においてｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを制御するための方法を提供する。エキソン封入シグナルに干渉することの利点は、このような因子がエキソン内に存在するということである。スキップされるエキソン内の配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを与えることによって、エキソン封入シグナルと干渉して、エキソンをスプライシング機構から効果的に遮蔽することができる。スプライシング機構がスキップすべきエキソンを認識しないことによって、最終的なｍＲＮＡからエキソンが排除される。本発明は、スプライシング機構の酵素反応（エキソンの結合）に直接干渉するものではない。このことによって本発明は、確実且つ信頼性の高い方法であると考えられる。ＥＩＳはエキソンに特異的な構造であり、スプライス受容部位及びスプライス供与部位に特定の立体配置を付与するものと考えられる。このような概念においては、特定の立体配置によってスプライシング機構がエキソンを認識すると考えられている。しかしながら、本発明はこのモデルに限定されるものではない。本発明者らは、エキソンに結合可能な試薬がＥＩＳを阻害することを見出した。このような試薬は、エキソンのいかなる部位にも特異的に接触することができるにもかかわらず、ＥＩＳを特異的に阻害することができる。本発明の方法で得られるｍＲＮＡそのものが有用である。例えば、ｍＲＮＡに必要なエキソンが封入されるのを阻害することで、望ましくないタンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させることができる。本発明の方法は、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングによって生じるｍＲＮＡを翻訳する工程を更に包含することが好ましい。また、ｍＲＮＡが機能性タンパク質をコードしていることも好ましい。本発明の好ましい態様においては、タンパク質が２つ以上のドメインを包含し、ドメインの少なくとも１つは、ｍＲＮＡ前駆体に含まれるエキソンの少なくとも一部のスキッピングによって生じたｍＲＮＡにコードされている。エキソンスキッピングが有効な典型的な例としては、これに限定されるわけではないが、少なくとも２つの機能性ドメインを有する野生型構造のタンパク質であって、各ドメインは一次構造であるアミノ酸配列の個別の部分から生成されるものである。具体的には、転写因子が挙げられる。典型的な転写因子はＤＮＡ結合ドメイン及び細胞中の他のタンパク質と反応するドメインを包含する。２つのドメインの間に存在するアミノ酸の一次構造の一部をコードするエキソンのスキッピングによって、少なくとも部分的には同等の機能を発揮する、より短いタンパク質の産生につながる。従って、中間領域における不利益な突然変異（例えばフレームシフト突然変異や停止変異）はエキソンスキッピングを誘導することで少なくとも部分的に修復することが可能であり、（部分的な）機能を有する短いタンパク質を合成することができる。本発明の方法を用いると、エキソンの部分的なスキッピングを誘導することも可能である。この態様においては、試薬とエキソンの接触によって、試薬と接触したエキソンの隠蔽されたスプライス部位が活性化される。この態様は、機能性タンパク質を誘導するｍＲＮＡ前駆体の操作性を拡大する。上記反応系は細胞を包含することが好ましい。細胞は試験管内（in vitro）で培養されるか、または生体内（in vivo）で増殖したものであることが好ましく、これらに限定されるわけではないが、典型的な生物の例にはヒトやマウスが包含される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】エキソン４５の欠失は最も頻発するＤＭＤ突然変異の１種である。この欠失によって、エキソン４４はエキソン４６にスプライシングされ、翻訳読み枠は切断されてエキソン４６の内部に終止コドンが発生し、その結果、ジストロフィンの欠乏が生じる。本発明者らの目的は、更なるエキソン、つまりエキソン４６のスキッピングを人工的に誘導して読み枠を再構築することで、エキソン４５及び４６の欠失を保有する、より穏やかな疾患であるベッカー型筋ジストロフィーの患者に見られるようなわずかに短いが非常に高い機能性を有するジストロフィンタンパク質の合成を復帰させる。
【図２】エキソン４６は、プリン塩基に富んだ、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシング制御を潜在的に担うと考えられる領域を有する。このマウスジストロフィンエキソン４６の内部に存在するプリン塩基に富んだ領域に対して、重なり合う２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートアンチセンスオリゴリボヌクレオチド（ＡＯＮ）からなるプライマー系列を設計した。これらのＡＯＮは長さと配列の両方の点で異なっている。ＡＯＮの化学的修飾は、筋肉細胞内のエンドヌクレアーゼ及びRNase Hに対する抵抗性を付与する。in vitro の研究におけるトランスフェクション効率を調べるために、ＡＯＮはＡＯＮ陽性細胞の同定を可能にする５’フルオレセイン基を含有していた。
【図３】ターゲットとなるエキソン４６のＲＮＡに対する種々のＡＯＮの結合親和性を調べるために、ゲルシフトアッセイを行った。図にはターゲットＲＮＡに最も高い親和性を示す５個のｍＡＯＮ（ｍＡＯＮ＃４，６，８，９及び１１）を示した。ＡＯＮがＲＮＡに結合すると、ゲル移動度の低下した複合体が形成されるので、バンドの変化によって検出することができる。ＡＯＮのターゲットに対する結合は配列特異的である。ランダムｍＡＯＮ、即ちエキソン４６に非特異的なｍＡＯＮはバンドの変化を生じなかった。
【図４】ゲルシフトアッセイで最も高い結合親和性を示したマウス特異的ＡＯＮ及びヒト特異的ＡＯＮをそれぞれマウス培養筋管及びヒト培養筋管にトランスフェクトした。図４Ａ：ｍＡＯＮ＃４，６，９及び１１をトランスフェクトした培養マウス細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析は、エキソン４５がエキソン４７に直接スプライシングされた産物に相当する大きさの部分産物を示した。ランダムＡＯＮをトランスフェクトした場合には、エキソン４６のスキッピングは検出されなかった。図４Ｂ：罹患していない１人（図中の“Ｃ”）及び血縁ではない２人のＤＭＤ患者（図中の“Ｐ１”及び“Ｐ２”）のそれぞれに由来する培養ヒト筋肉細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｈＡＯＮ＃４及びｈＡＯＮ＃８をトランスフェクトした際に部分産物が生じることを明らかにした。対照においては、この産物はエキソン４５がエキソン４７にスプライシングされた産物に相当するが、一方で、患者に見られる断片の大きさは、エキソン４４がエキソン４７にスプライシングされた断片に相当した。トランスフェクトしなかった培養細胞及びランダムｈＡＯＮでトランスフェクトした培養細胞では、エキソン４６のスキッピングは検出されなかった。最も高いエキソン４６スキッピング効率がｈＡＯＮ＃８で得られた。
【図５】患者ＤＬ２７９．１（図４の“Ｐ１”に対応する）から得られたＲＴ−ＰＣＲ産物の配列データであり、このデータによって患者のエキソン４５が欠失しており（上のパネル）、ｈＡＯＮ＃８のトランスフェクションによって更にエキソン４６のスキッピングが起こる（下のパネル）ことを確認した。エキソン４６のスキッピングは特異的であり、エキソン４４はエキソン４７に正確にスプライシングされ、翻訳読み枠を再構築する。
【図６】ｈＡＯＮ＃８でトランスフェクトした患者ＤＬ２７９．１由来の培養筋肉細胞の免疫組織化学分析。タンパク質の異なる領域に対して作成した２種のジストロフィン抗体と細胞を接触させた。使用した抗体は、ターゲットであるエキソン４６に近接する領域に対する抗体（ManDys-1、ex. -31-32）及びエキソン４６から離れた領域に対する抗体（Dys-2、ex. -77-79）である。下のパネルは筋管中にジストロフィンタンパク質が存在しないことを示すのに対し、いずれの抗体でもジストロフィンタンパク質が検出されることから、エキソン４６のｈＡＯＮ＃８誘導性スキッピングは明らかにジストロフィンタンパク質の合成を復帰させた（上のパネル）。
【図７】図７Ａ：ｈＡＯＮ＃２３，＃２４，＃２７，＃２８または＃２９で処理した、対照である培養ヒト筋肉細胞から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析。エキソン５０がエキソン５２にスプライシングされた産物に相当する大きさの部分産物が、ｈＡＯＮ＃２３及び＃２８で処理した細胞で検出された。これらの産物の配列を決定したところ、エキソン５１が正確にスキップされていることが確認された（図７Ｂ）。さらに異常スプライシング産物をｈＡＯＮ＃２８及び＃２９で処理した細胞から得た。配列を決定したところ、ＡＯＮ処理に伴い、低い頻度で使用されるエキソン５１のフレーム内の隠蔽されたスプライス部位の存在が明らかになった。ＡＯＮ処理によって生じた産物には復帰した読み枠からなるエキソン５１の部分産物が含まれており、更なる治療価値が確認された。
【図８】図８Ａ：エキソン２９ターゲットＲＮＡに対する種々のｈＡＯＮ＃２９の結合親和性を確認するために、ゲルシフトアッセイを行った。ハイブリダイゼーションしていないＲＮＡ（図中の「なし」）に比べると、ｈ２９ＡＯＮ＃１，＃２，＃４，＃６，＃９，＃１０及び＃１１はゲル移動度の低い複合体を形成し、ＲＮＡに対する結合を示した。ジストロフィンエキソン１９由来のランダムＡＯＮは複合体を形成しなかった。図８Ｂ：ｈ２９ＡＯＮ＃１，＃２，＃４，＃６，＃９，＃１０または＃１１で処理した対照である培養ヒト筋肉細胞から単離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析は、エキソン２８がエキソン３０にスプライシングされた産物に相当する大きさの部分産物の存在を明らかにした。これらの結果は、エキソン２９内のＥＲＳであると考えられる領域の内側の配列に対するＡＯＮ（ｈ２９ＡＯＮ＃１，＃２，＃４または＃６）あるいは外側の配列に対するＡＯＮ（ｈ２９ＡＯＮ＃９，＃１０または＃１１）を使ってエキソン２９を特異的にスキップすることが可能であることを示す。エキソン２８及び２９の両方のスキッピングによって生じた更なる異常型スプライシング産物が検出された（配列データによって確認したがここには示さない）。この異常型スプライシング産物は未処理の細胞にも存在したが、これはＡＯＮ処理によって促進される天然の選択的なスキッピングによるものと考えられる。ジストロフィンエキソン１９から得たＡＯＮ１９はエキソン２９のスキッピングを誘導しなかった。図８Ｃ：エキソン２９の特異的スキッピングを部分配列であるＲＴ−ＰＣＲ断片の配列データによって確認した。ｈ２９ＡＯＮ＃１で処理した細胞中のエキソン２９スキッピング産物の塩基配列をここに示す。
【図９】図９Ａ：マウス腓腹筋由来ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析であって、ＲＮＡはｍＡＯＮ＃４，＃６または＃１１をそれぞれ５，１０または２０μｇ投与後２日目に単離したものである。エキソン４５がエキソン４７にスプライシングされた産物に相当する大きさの部分産物をすべての処理筋肉から検出した。ＲＴ−ＰＣＲ反応の負の対照として“−ＲＴ”，“−ＲＮＡ”，“ＡＤ−１”及び“ＡＤ−２”について分析した。図９Ｂ：ｍＡＯＮ＃４と＃６（＃１１も実験したが、データは示さない）によって生じた部分産物の配列を決定し、エキソン４６の正確なスキッピングを確認した。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
好ましい態様において、本発明は異常型タンパク質をコードするエキソンを含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞に対して、該エキソンの少なくとも１つが有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能な試薬を細胞に与え、そして該ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングによって生じるｍＲＮＡの翻訳を行わせしめることを包含する、細胞による異常型タンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させるための方法を提供する。
【０００９】
エキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能ないかなる試薬も本発明に用いることができる。該試薬は、核酸またはそれと同等の機能を有する分子を含有することが好ましいが、該核酸は必ずしも一本鎖でなくてもよい。ペプチド核酸及び同程度の核酸結合特性を有する他の分子も用いることができるが、その結合特性は必ずしも結合量が同等でなくてもよい。核酸またはそれと同等の機能を有する分子は付加的な機能性を発揮するために修飾されていてもよい。例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドを使用することができる。このようなリボヌクレオチドは従来のオリゴヌクレオチドよりもＲＮａｓｅ活性に対する抵抗性が高い。
【００１０】
本発明の好ましい態様において、エキソン封入シグナルはエキソン認識配列（exon recognition sequence）（ＥＲＳ）に特異的なアンチセンス核酸による干渉を受ける。このような配列は比較的プリン塩基に富み、スキップされるエキソンの配列情報を精査することで特定することが可能である（Tanakaら、1994, Mol. Cell Biol. 14: p. 1347-1354）。エキソン認識配列は、いわゆる弱いエキソンのｍＲＮＡへの封入を補助すると考えられる（Achselら、1996, J. Biochem. 120; p. 53-60）。このような弱いエキソンは、例えば、スプライシング機構による認識効率が低い５’及び／または３’スプライス部位を包含する。本発明においては、エキソンスキッピングはいわゆる強いエキソン、すなわち細胞のスプライシング機構によって通常効率よく認識されるエキソン、においても誘導することができることを見出した。与えられたいかなる配列からも、その配列がエキソンと推定される領域を包含するかどうかを予測し、そのエキソンが強いか弱いかを確認することが（ほとんどの場合）可能である。エキソンの強度を確認するためのいくつかの手法が存在する。有用な手法としてＮｅｔｇｅｎｅ２スプライス部位予測サーバー（NetGene splice site prediction server）（Brunakら、1991, J. Mol. Biol. 220: p. 49-65）で検索することができる。本発明の方法によるエキソンスキッピングは（ほとんど）すべてのエキソンに誘導することが可能であり、エキソンが弱いエキソンであるか強いエキソンであるか、ならびにエキソンがＥＲＳを包含するかどうかにも依存することはない。好ましい態様において、スキッピングのターゲットとなるエキソンは強いエキソンである。他の１つの好ましい態様において、スキッピングの対象となるエキソンはＥＲＳを包含しない。
【００１１】
本発明の方法は様々な用途に使用することが可能である。１つの態様において、本発明の方法は異常型タンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させるために使用する。このようなタンパク質としては、例えば、腫瘍タンパク質またはウイルス性タンパク質が挙げられる。多くの腫瘍において、腫瘍タンパク質の存在のみならず、その相対的な発現程度が腫瘍細胞の表現型に関係している。同様に、ウイルス性タンパク質の存在のみならず、細胞中のウイルス性タンパク質の量が特定のウイルスの毒性を決定している。さらに、ウイルスの有効な増加及び蔓延のために、ウイルスの生活環における発現の時期及び細胞中の特定のウイルス性タンパク質の量的バランスによって、ウイルスが効率的にまたは非効率的に増殖するかどうかが決定される。本発明の方法を使用して細胞中の異常型タンパク質の量を減少させることで、例えば腫瘍細胞の腫瘍形成性（転移性）及び／またはウイルス感染細胞のウイルス増殖性を低下させることができる。
【００１２】
好ましい態様において、本発明の方法を用いて異常型タンパク質を機能性タンパク質に変更する。１つの態様において、上記のような機能性タンパク質は、細胞に通常存在するが、処理する細胞には存在しないタンパク質の機能を発揮する。大抵の場合、機能を部分的に修復しただけでも、処理した細胞の性能が著しく向上する。向上した性能故に処理した細胞は未処理の細胞よりも選択的な優位性を示すことができ、処理の有効性を高めている。
【００１３】
上述した本発明の態様は、特に欠失した遺伝子の発現を復帰させるのに適している。これはターゲットとなるエキソンの特異的なスキッピングを行い、有害な変異（典型的なものとしては停止変異またはフレームシフト点突然変異、あるいは翻訳停止をもたらす１つ以上のエキソンの欠失または挿入）を回避するか修正することによって達成される。
【００１４】
遺伝子導入法に比べて、本発明の新規なスプライスシング制御型遺伝子治療（splice-modulation gene therapy）は、より小さな治療薬、これに限定されるわけではないが、典型的な例としては１４〜４０個のヌクレオチドからなる治療薬の投与を必要とする。好ましい態様においては、製造が容易であり、細胞による取り込みがより効果的に行われることから、１４〜２５個のヌクレオチドからなる分子を使用する。本発明の方法は、治療薬に付随する、効果的で安全な投与システムの設計をより柔軟に行うことを可能とする。本発明のこのような態様の重要な更なる利点は、大部分またはすべての遺伝子調節回路を未だ保持する内因性遺伝子活性の（少なくとも一部）を復帰させることで、組織特異的なアイソフォームの適切な発現レベルと合成を保障することである。
【００１５】
上述の本発明の態様は、原則として、いかなる遺伝病や遺伝的疾病素質にも適用することができ、配列内部においてわずかに短いタンパク質の翻訳が完全にまたは部分的に機能している場合に限り、特定のエキソンを標的とするスキッピングによって、元々変異によって破壊された翻訳読み枠を復帰させることができる。この方法の適用に治療的価値が見出される態様としては、腫瘍抑制遺伝子の二次変異によって生じる疾病素質が挙げられ、例えば、乳ガン、結腸ガン、結節性硬化症、神経線維腫症などにおいては、活性の（部分的な）回復が二次変異による異数性の発現を排除し、腫瘍形成を防ぐ。他の好ましい態様には、遺伝子産物の欠失が直接的な疾病誘引効果を示す遺伝子の（部分的な）修復が含まれる。例えば、血友病Ａ（血液凝固第ＶＩＩＩ因子の欠乏によるもの）、先天的甲状腺機能不全症のいくつかの形態（チログロブリン合成欠損によるもの）、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）が挙げられる。ＤＭＤは、フレームシフトによって生じるＸ連鎖性ジストロフィン遺伝子の欠失、重複及び停止突然変異が重度の進行性筋力低下をもたらす疾患である。通常ＤＭＤは発症すると青年期の後期または成人期の初期に死に至るが、その一方で、同じ遺伝子座にフレームシフト以外の方法で欠失または重複突然変異が生じて発症したベッカー型筋ジストロフィーは軽症であり、平均余命は３５〜４０年から正常人と同じである。ＤＭＤに適用する本発明の態様においては、本発明の方法によって現存する欠失領域をエキソンスキッピングによって伸張する（または現存する重複突然変異体のｍＲＮＡ産物を改変する）ことができる。これは読み枠を復帰させ、配列内部においてわずかに短くなっているが機能性のタンパク質を産生するのに必要な数の近接したエキソンのスキッピングによって行う。このような欠失の誘導と同等の変異を有するＢＭＤ患者の臨床的症状が軽いことに基づき、ＡＯＮ療法を受けたＤＭＤ患者の症状は軽減されると考えられる。
【００１６】
ジストロフィン遺伝子に生じる種々の変異が機能不全性タンパク質につながる。（総合目録としてhttp://www.dmd.nl、即ち、ＤＭＤ及び関連疾患の国際的に承認されたデータベース、を参照）。機能性ジストロフィンタンパク質を産生させるために実際にスキップすべきエキソンは突然変異によって変化する。表１はスキップすることのできるエキソンの一覧であるが、本願はこれらに制限されることはない。この表においては、上述のエキソンに対して、ヒトで観察された高頻度で発生するジストロフィン遺伝子変異であって、本発明の方法で治療することができるものも示した。表に示したエキソンのスキッピングは、少なくともベッカー型筋ジスロトフィータンパク質の機能を有する変化したジストロフィンタンパク質の産生をもたらす。このように、本発明の１つの態様において、エキソン封入シグナルがヒトジストロフィン遺伝子のエキソン２，８，４３，４４，４５，４６，５０，５１，５２または５３に存在することを特徴とする方法が提供される。ある欠失／挿入変異の発生は、他の変異より高頻度で発生する。本発明の方法でエキソン４６のスキッピングを誘導すると、ＤＭＤの欠失を保有する患者の約７％で治療に成功し、ジストロフィン陽性筋肉繊維がジストロフィン患者に検出されることが明らかとなった。また、本発明の方法でエキソン５１のスキッピングを誘導することによって、ＤＭＤの欠失を保有する患者の約１５％を治療することに成功した。この治療方法によって、該患者は少なくとも少量のジストロフィン陽性筋肉繊維を有するようになった。本発明の方法を使用したエキソン４６または５１のスキッピングによって、ジストロフィン遺伝子の欠失を保有する患者の約２２％を治療することができる。従って、本発明の好ましい態様においては、エキソン封入シグナルはエキソン４６またはエキソン５１に存在する。特に好ましい態様においては、使用する試薬は以下の核酸配列を包含する：ｈＡＯＮ＃４、ｈＡＯＮ＃６、ｈＡＯＮ＃８、ｈＡＯＮ＃９、ｈＡＯＮ＃１１及び／またはｈＡＯＮ＃２１〜３０からなる群から選ばれる少なくとも１つの核酸配列；或いは上記ｈＡＯＮ＃の機能性領域、誘導体及び／または類似体。機能性領域、誘導体及び／または類似体は、上記ｈＡＯＮ＃と同等のエキソンスキッピング活性を有するが、本発明の方法においては、該活性量が必ずしも同等でなくてもよい。
【００１７】
ｍＲＮＡ前駆体に含まれる１つ以上のエキソンのエキソンスキッピングを誘導することは効果的である。例えば、変異の多様性並びにエキソンの長さや変異に隣接するアミノ酸配列といった一定の性質を考慮すると、機能を復帰させるためには１つ以上のエキソンをスキップしなければならないという状況が起こりうる。ＤＭＤ欠失データベースに見られるこのような状況の好ましい例としては、エキソン４６〜５０の欠失が挙げられるが、これに限定されるものではない。エキソン４６〜５０が欠失している患者は機能性ジストロフィンタンパク質を生成しない。しかしながら、エキソン４５及びエキソン５１のスキッピングを誘導することによって少なくとも部分的な機能を有するジストロフィンタンパク質を生成することができる。他の好ましい例としてはエキソン２の重複を有する患者が挙げられるが、これに限定されるものではない。エキソン２のＥＩＳを阻害することが可能な試薬を与えることで、エキソン２の一方または両方を部分的にスキップし、エキソン２の部分配列からなる領域または２つのエキソン２を欠失した領域の隣から野生型タンパク質を得ることが可能である。他の好ましい例として、エキソン４５〜５０のスキッピングが挙げられるが、これに限定されるものではない。このスキッピングにより読み枠内でベッカー様バリアントが生じる。ベッカー様バリアントはエキソン４５，４６，４７，４８，４９及び／または５０あるいはそれらの組み合わせに存在するいかなる変異を治療するためにも誘導することができる。本発明のその他の態様においては、ｍＲＮＡ前駆体に含まれる他のエキソンの有するエキソン封入シグナルを阻害する他の試薬を細胞に与える工程を更に包含することを特徴とする方法が提供される。ｍＲＮＡ前駆体の２つ以上の異なる遺伝子にエキソンスキッピングを誘導するために２つ以上の試薬を使用することは、当然のことながら本発明の範囲に含まれる。
【００１８】
他の１つの態様において、本発明はスプライシング制御型遺伝子治療に適した試薬を選択するための方法及び選択した試薬の特異的エキソンスキッピング試薬としての有効性を予備実験で確認するための方法を提供する。目的エキソンの一部に対して相補的な試薬が、該エキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能であることを確認するための方法であって、目的のエキソンを含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞に被験試薬を与え、該細胞を培養して該ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡを生成せしめ、そして生成した該ｍＲＮＡに該エキソンが存在しないことを確認することを包含する方法が提供される。好ましい態様において、該試薬が、核酸またはそれと同等の機能を有する分子を含有し、該核酸は目的エキソンの一部に対して相補的である。特異的エキソンスキッピングを誘導することが可能な試薬を本発明の方法で同定することができる。この方法には、該試薬がエキソンを含む核酸、好ましくはＲＮＡ、に比較的高い親和性で結合するかどうかを確認するための予備スクリーニングを行うことも含まれる。この結果、試薬がエキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能であることを確認するための方法が提供され、該方法は試験管内の条件において、該核酸またはそれと同等の機能を有する分子と該目的エキソンを包含するｍＲＮＡ分子との相対的な結合親和性を測定する工程を更に包含する。
【００１９】
他の態様において、本発明の方法によって得られる試薬を提供する。好ましい態様においては、該試薬は核酸またはそれと同等の機能を有する分子を包含する。該試薬は、それを用いて細胞にエキソンスキッピングを誘導した場合、細胞中の異常型タンパク質の量を少なくとも部分的に減少させることが好ましく、該エキソンスキッピングによって、該細胞で機能を発揮しうるタンパク質をコードするＲＮＡを生じることが更に好ましい。特に好ましい態様において、ｍＲＮＡ前駆体はジストロフィン遺伝子から誘導されたものである。機能性タンパク質は変異ジストロフィンタンパク質または正常ジストロフィンタンパク質を包含することが好ましい。また、変異ジストロフィンタンパク質が少なくともベッカー型筋ジストロフィー患者のジストロフィンタンパク質の機能を有することが好ましい。特に好ましい態様においては、使用する試薬は以下の核酸配列を包含する：ｈＡＯＮ＃４、ｈＡＯＮ＃６、ｈＡＯＮ＃８、ｈＡＯＮ＃９、ｈＡＯＮ＃１１及び／またはｈＡＯＮ＃２１〜３０からなる群から選ばれる少なくとも１つの核酸配列；或いは上記ｈＡＯＮ＃の機能性領域、誘導体及び／または類似体。機能性領域、誘導体及び／または類似体は、上記ｈＡＯＮ＃と同等のエキソンスキッピング活性を有するが、本発明の方法においては、該活性量が必ずしも同等でなくてもよい。
【００２０】
細胞に試薬を導入するための種々の方法が当業界では知られている。特に核酸の導入方法は広範にわたって開発されている。当業者はある導入方法が本発明を実施するのに適しているかどうかを十分確認することができる。このような方法の一例は、本発明の試薬をリポソームに封入し、該リポソームを目的ｍＲＮＡ前駆体を有する細胞に与えることを包含するが、本発明はこの例に限定されるものではない。リポソームは核酸を細胞に導入するための運搬体として特に適している。エキソンスキッピングを誘導することのできるアンチセンス分子は、アンチセンスＲＮＡを生成するための転写単位を包含する核酸を導入し、細胞に生成させることが可能である。適切な転写単位としては核内低分子ＲＮＡまたはｔＲＮＡ転写単位が挙げられるが、これらに限定されるものではない。従って、本発明は、エキソン封入シグナルを阻害することが可能な本発明の核酸またはそれと同等の機能を有する分子を包含する核酸運搬体を更に提供する。１つの態様において、該運搬体は本発明の核酸を発現させることが可能である。一本鎖ウイルスを運搬体として利用した場合には、当然のことながら、そのようなウイルスが本発明の試薬のアンチセンス配列だけを包含するものであっても本発明の範囲に含まれる。また、このような一本鎖ウイルスの他の１つの態様においては、本発明のＡＯＮは、運搬体としてのウイルスに封入されているウイルス核に存在する核内低分子ＲＮＡまたはｔＲＮＡ転写単位によってコードされている。好ましい一本鎖ウイルスはアデノ随伴ウイルスである。
【００２１】
更なる１つの態様において、本発明は医薬の調製に用いる、核酸または核酸運搬体を提供する。好ましい態様において、該医薬を遺伝病の治療に使用する。さらに好ましくは、該医薬をデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用する。
【実施例】
【００２２】
エキソン４５はＤＭＤにおいて最も高頻度で欠失が起こるエキソンなので、本発明者らははじめにエキソン４６の特異的なスキッピングの誘導を試みた（図１）。この誘導によってエキソン４５及び４６の欠失を保有するＢＭＤ患者に見られる、短いがより機能的なジストロフィンタンパク質を産生する。マウスジストロフィン遺伝子のジストロフィンｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを制御するための実験系を初めに構成した。その後、エキソン４５の欠失を保有するＤＭＤ患者由来の筋肉細胞において翻訳読み枠とジストロフィン合成を復帰させることを目的として、ヒトジストロフィン遺伝子にねらいを定めた。
【００２３】
ｍＡＯＮｓ及びｈＡＯＮｓの設計
エキソン４６の内部領域に対するマウス特異的ＡＯＮ系列及びヒト特異的ＡＯＮ系列（ｍＡＯＮ及びｈＡＯＮ）を設計した（図２）。使用したエキソン４６の内部領域は、プリン塩基に富んだ配列を有し、エキソン４６のスプライシング制御に係る推定上の機能を有すると考えられる。ゲルシフトアッセイによるＡＯＮの初期スクリーニング（下記参照）のために未修飾のＤＮＡオリゴヌクレオチド（ベルギー国、EuroGentec社に合成を依頼）を使用した。筋肉細胞のトランスフェクション実験を実際に行う際には、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートアンチセンスオリゴリボヌクレオチド（ベルギー国、EuroGentec社に合成を依頼）を使用した。このような修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドはエンドヌクレアーゼ及びRNase Hに対する抵抗性を有し、高い親和性でＲＮＡに結合することが知られている。最終的に有効であると認められ、in vitro で筋肉細胞に与えたＡＯＮの配列を下記に示す。対応するマウス特異的ＡＯＮとヒト特異的ＡＯＮは高い相同性があるが完全に同一ではない。
【００２４】
以下に使用したＡＯＮのデオキシ体を示すが、最終的に使用した２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドにおいては、ＴをＵに置き換える。
【００２５】
【００２６】
【００２７】
ゲルシフトアッセイ
ＡＯＮの有効性は、ターゲット配列に対する結合親和性に基づいて決定した。ＲＮＡフォールディングを予測するためのコンピュータシミュレーションプログラムの近年の発展にもかかわらず、設計したＡＯＮのどれが高い親和性でターゲット配列に結合するかを推測することは難しい。従って、ゲルシフトアッセイを（Bruiceら、１９９７に記載のプロトコールに従って）行った。エキソン４６ターゲットＲＮＡ断片を、（マウスまたはヒト筋肉ｍＲＮＡから、Ｔ７プロモーター配列を有するセンスプライマ−を利用して増幅した）ＰＣＲ断片から32Ｐ−ＣＴＰの存在下のin vitro Ｔ７転写法で生成した。ターゲットである転写断片に対する個々のＡＯＮ（０．５ｐｍｏｌ）の結合親和性は、３７℃で３０分間ハイブリダイゼーションを行い、次いでポリアクリルアミド（８％）ゲル電気泳動を行うことで測定した。これらの分析をマウス特異的ＡＯＮ及びヒト特異的ＡＯＮをスクリーニングするために行った（図３）。少なくとも５個の異なるマウス特異的ＡＯＮ（ｍＡＯＮ＃４、６、８、９及び１１）及びそれらに対応する４個のヒト特異的ＡＯＮ（ｈＡＯＮ＃４、６、８及び９）において移動度の変化が観察され、ターゲットＲＮＡに対して結合親和性を有することを示した。
【００２８】
培養筋肉細胞のトランスフェクション
ＡＯＮによるin vitro の筋肉細胞におけるスキッピング誘導効率を分析するために、ゲルシフトアッセイを用いてターゲットエキソンに対して最も高い結合親和性を示したエキソン４６特異的ＡＯＮを選択した。すべてのトランスフェクション実験において、非特異的ＡＯＮをエキソン４６の特異的スキッピングの負の対照として用いた。前述したように、はじめにマウス筋肉細胞の実験系を構築した。マウス筋肉細胞系であるＣ２Ｃ１２細胞由来の（ジストロフィン発現レベルの高い）培養増殖筋芽細胞及び培養分裂後筋管の両方を使用した。後に行ったヒト由来培養筋肉細胞の実験には、罹患していない１人の筋肉生検材料及びエキソン４５の欠失を保有する、血縁ではない２人のＤＭＤ患者の筋肉生検材料のそれぞれから単離した培養一次筋肉細胞を使用した。これらの異種培養物はおよそ２０〜４０％の筋原細胞を含んでいた。異なるＡＯＮ（濃度：１μＭ）に対して３当量比のカチオンポリマーＰＥＩ（MBI Fermentas社製）を用い、細胞にＡＯＮをトランスフェクトした。これらの実験でトランスフェクトしたＡＯＮは５’フルオレセイン基を有し、そのため蛍光性の核を数えることでトランスフェクション効率を測定することができる。概して、６０％以上の細胞が核に特異的にＡＯＮの取り込みを示した。ＲＴ−ＰＣＲ分析を促進するために、トランスフェクトの２４時間後にＲＮＡｚｏｌＢ（オランダ国、CamPro Scientific社製）を使ってＲＮＡを単離した。
【００２９】
ＲＴ−ＰＣＲ及び配列の決定
ＲＮＡの逆転写をC. therm. ポリメラーゼ（Roche社製）及びエキソン４８特異的逆転写プライマーを使って行った。ジストロフィン遺伝子のエキソン４６のスキッピングを検出するために、ＰＣＲを２サイクル行ってｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、エキソン４４及び４７に含まれるプライマー（ヒト実験系）またはエキソン４５及び４７に含まれるプライマー（マウス実験系）を使用したプライマーシフト増幅（nested amplification）を包含する。培養マウス筋芽細胞及び培養マウス筋管細胞では、エキソン４５がエキソン４７に直接スプライシングされた産物に相当する大きさの部分産物を検出した（図４）。続いて行った配列の決定によって、マウスジストロフィン転写産物におけるエキソン４６の特異的なスキッピングを確認した。エキソンスキッピングの効率は個々のＡＯＮで異なり、ｍＡＯＮ＃４及び＃１１が最も高い効率を示した。これらの好ましい結果に基づき、培養ヒト筋肉細胞においても、ジストロフィンのスプライシングを同様に制御することに着目した実験を行った。その結果、エキソン４５がエキソン４７にスプライシングされた産物に相当する部分産物を対照となる筋肉細胞で検出した。興味深いことに、患者由来筋肉細胞では、エキソン４４がエキソン４７にスプライシングされてなる短い断片が検出された。エキソン４６の特異的なスキッピングをヒトジストロフィン転写産物の配列データによって確認した。マウスとヒトの両方のジストロフィン転写産物に見られたこのようなスプライシングの制御は、トランスフェクトされていない培養細胞や非特異的ＡＯＮでトランスフェクトされた培養細胞には見られなかった。
【００３０】
免疫組織化学分析
ジストロフィンタンパク質の翻訳および合成を復帰させるために、エキソン４５の欠失を保有する患者由来の筋肉細胞においてエキソン４６のスキッピングの誘導を試みた。ｈＡＯＮ＃８でトランスフェクトした際のジストロフィン産物を検出するために、ジストロフィンタンパク質のターゲット領域に隣接するドメインと遠位のドメインのそれぞれに対して作成した２種のジストロフィンモノクローナル抗体（Mandys-1及びDys-2）を使用して、２種の患者由来培養筋肉細胞を免疫細胞化学分析に付した。蛍光分析によって、いずれの患者由来培養細胞においてもジストロフィン合成が復帰していることが明らかになった（図５）。処理したサンプルにおいては、約８０％以上の筋繊維がジストロフィンに対して陽性に染色された。
【００３１】
本発明者らの実験結果は、ＤＭＤ患者由来筋肉細胞の内因性ＤＭＤ遺伝子によるジストロフィン合成の復帰を初めて示す。これは、ジストロフィンｍＲＮＡ前駆体の目的に応じたスプライシング制御を治療目的で実施するための原理を証明する。
【００３２】
エキソン５１のターゲットスキッピング
ジストロフィンエキソンの同時スキッピング
エキソン５１のターゲットスキッピング。本発明者らは、in vitro のマウス及びヒト筋肉細胞におけるジストロフィンのエキソン４６のＡＯＮによる制御の可能性について明示した。これらの知見はＡＯＮをＤＭＤの治療用の試薬として評価する更なる研究の根拠を示した。ＤＭＤを誘発する欠失の大部分は遺伝子内の突然変異が起こりやすい２つの部位で集中的に発生し、ある１つの特定エキソンのターゲットスキッピングによって種々の突然変異を有する一連の患者の読み枠を復帰することができる（表１を参照）。エキソン５１は興味深いターゲットエキソンである。このエキソンのスキッピングは、エキソン５０，エキソン４５〜５０，エキソン４８〜５０，エキソン４９〜５０，エキソン５２，又はエキソン５２〜６３にわたる領域の欠失を保有する患者の治療に用いることが可能であり、このような患者の合計は本発明者らのライデンデータベース（Leiden database）に登録されている総患者数の１５％に達する。
【００３３】
ジストロフィンのエキソン５１内に存在するプリン塩基に富んだ種々の領域に対するヒト特異的ＡＯＮ１０種（ｈＡＯＮ＃２１〜３０、下記参照）を設計した。このようなプリン塩基に富んだ領域は、エキソンのスプライシング反応の制御を担うと推定される因子、すなわちスプライシング反応の際にエキソンの除去を誘導するために遮蔽を試みた領域の存在を示唆した。すべての実験をエキソン４６のスキッピングに用いたプロトコール（上記参照）に従って行った。ターゲットＲＮＡに高い結合親和性を有するｈＡＯＮを確認するために、ゲルシフトアッセイを行った。最も高い親和性を示す５種のｈＡＯＮを選択した。エキソン５１のスキッピングの可能性をin vitro で分析するために、これらのｈＡＯＮを対照となるヒト筋肉細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後にＲＮＡを単離し、エキソン５３または６５に特異的な逆転写用プライマーを使ってｃＤＮＡを作製した。ターゲット領域のＰＣＲによる増幅は、エキソン５１に隣接する種々のプライマーを組み合わせて行った。ＲＴ−ＰＣＲ及び配列の決定によって、エキソン５１の特異的なスキッピングが誘導されていたことがヒトジストロフィン転写産物から明らかとなった。続いて、エキソンのスキッピングを誘導することが示されている２種のｈＡＯＮ（＃２３及び＃２９）を、上記の突然変異の１つを有するＤＭＤ患者由来の６種の培養筋肉細胞にトランスフェクトした。これらの培養細胞におけるエキソン５１のスキッピングをＲＴ−ＰＣＲ及び配列の決定によって確認した（図７）。更に重要なことに、ジストロフィンタンパク質の異なる部分に対して作成した複数の抗体を用いた免疫組織化学分析によると、すべての分析結果がエキソン５１のスキッピングによってジストロフィンタンパク質の合成が復帰したことを示していた。
【００３４】
【００３５】
複数のジストロフィンエキソンの同時スキッピング。
欠失変異に加えて１つのエキソン、例えばエキソン４６またはエキソン５１、のスキッピングを行うことで、多種にわたるＤＭＤ突然変異の読み枠を復帰させることができる。この方法が適用可能な突然変異の範囲は、１つ以上のエキソンを同時にスキッピングすることによって拡大することができる。例えば、エキソン４６からエキソン５０の欠失を有するＤＭＤ患者において、欠失領域に隣接したエキソン４５及び５１の両方のスキッピングを行うだけで翻訳読み枠の再構成を可能にした。
【００３６】
ＥＲＳ非依存性のエキソンスキッピング。
２人のベッカー型筋ジストロフィー患者に見られるエキソン２９の突然変異はエキソン２９のスキッピングを生じた（Ginjaarら、2000, EJHG, vol. 8: p. 793-796）。ＡＯＮを用いた突然変異部位ターゲッティングによってエキソン２９のスキッピングを誘導する可能性について検討した。突然変異はＥＲＳ活性と関連しうるプリン塩基に富んだ領域に位置している。ＥＲＳであると考えられる領域の内側（ｈ２９ＡＯＮ＃１〜ｈ２９ＡＯＮ＃６）及び外側（ｈ２９ＡＯＮ＃７〜ｈ２９ＡＯＮ＃１１）に対するＡＯＮ系列を設計した（下記参照）。ターゲットＲＮＡに対して高い親和性を示すＡＯＮを同定するために、ゲルシフトアッセイを（前述のように）行った（図８）。続いて、ｈ２９ＡＯＮ＃１，＃２，＃４，＃６，＃９，＃１０及び＃１１を対照である培養ヒト筋管にＰＥＩトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後にＲＮＡを単離し、エキソン３１に特異的な逆転写プライマーを使ってｃＤＮＡの逆転写を行った。ターゲット領域のＰＣＲによる増幅はエキソン２９に隣接する種々のプライマーを組み合わせて行った。このＲＴ−ＰＣＲ及びそれに続く配列の決定（図８ＢとＣ）によって、ヒトジストロフィン転写産物においてエキソン２９のスキッピングが誘導されたことが明らかになった。しかしながら、エキソン２９のスキッピングを促進するこれらのＡＯＮは、ＡＯＮが結合すると考えられるＥＲＳの内側と外側の両方の配列に基づいて設計されたものだった（ｈ２９ＡＯＮ＃１，＃２，＃４，＃６，＃９及び＃１１）。これらの結果から、エキソン２９のスキッピングはエキソン２９がＥＲＳを含むか含まないかには依存せず、従ってＡＯＮのエキソン２９に対する結合はＥＲＳよりもエキソン封入シグナルを不活性化すると考えられる。ここに証明したＥＲＳ非依存性エキソンスキッピングは、本発明の治療方法の適応範囲全体をＥＲＳを含まないエキソンにまで広げる可能性がある。
【００３７】
【００３８】
【００３９】
マウス筋肉組織におけるin vivo のＡＯＮ誘導性エキソン４６スキッピング。
培養筋肉細胞を用いた実験で見込みのある結果が得られたので、次にin vivo で種々のマウスジストロフィンエキソン４６に特異的なＡＯＮを試験した。試験はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に結合させたマウスジストロフィンエキソン４６に特異的ＡＯＮを対照となるマウスの腓腹筋に筋肉注射することで行った。in vitro のマウス筋肉細胞における有効性が既に明らかとなっているｍＡＯＮ＃４，＃６及び＃１１は、ＲＴ−ＰＣＲ及び配列の決定によってin vivo の筋肉組織でエキソン４６のスキッピングを誘導することが判明した（図９）。in vivo のエキソン４６のスキッピングは投与量に依存しており、２０μｇ／筋肉／日の２日間にわたる注射で最も高い効率（最大１０％）を示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００４０】
【非特許文献１】Achsel et al., 1996, J. Biochem. 120: p. 53-60.
【非特許文献２】Bruice T.W. and Lima, W.F. (1997) Biochemistry 36 (16): p. 5004-5019.
【非特許文献３】Brunak et al., 1991, J. Mol. Biol. 220: p. 49-65.
【非特許文献４】Dunckley, MG et al, (1998) Human molecular genetics 7: p. 1083-1090.
【非特許文献５】Ginjaar et al., 2000, EJHG, vol. 8, p. 793-796.
【非特許文献６】Mann et al., 2001, PNAS vol. 98, p. 42-47.
【非特許文献７】Tanaka et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: p. 1347-1354.
【非特許文献８】Wilton SD et al., (1999) Neuromuscular disorders 9: p. 330-338.
【００４１】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー及び関連疾患の詳細及び背景はウェブサイトhttp://www.dmd.nlで検索することができる。
【００４２】
【表１】
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号１： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃２
配列番号２： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃３
配列番号３： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃４
配列番号４： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃５
配列番号５： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃６
配列番号６： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃７
配列番号７： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃８
配列番号８： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃９
配列番号９： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃１０
配列番号１０： マウス特異的ＡＯＮであるｍＡＯＮ＃１１
配列番号１１： ヒト特異的ＡＯＮであるｈＡＯＮ＃４
配列番号１２： ヒト特異的ＡＯＮであるｈＡＯＮ＃６
配列番号１３： ヒト特異的ＡＯＮであるｈＡＯＮ＃８
配列番号１４： ヒト特異的ＡＯＮであるｈＡＯＮ＃９
配列番号１５： ヒト特異的ＡＯＮであるｈＡＯＮ＃１１
配列番号１６： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２１
配列番号１７： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２２
配列番号１８： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２３
配列番号１９： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２４
配列番号２０： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２５
配列番号２１： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２６
配列番号２２： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２７
配列番号２３： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２８
配列番号２４： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃２９
配列番号２５： エキソン５１特異的なｈＡＯＮ＃３０
配列番号２６： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃１
配列番号２７： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃２
配列番号２８： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃３
配列番号２９： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃４
配列番号３０： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃５
配列番号３１： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃６
配列番号３２： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃７
配列番号３３： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃８
配列番号３４： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃９
配列番号３５： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃１０
配列番号３６： ヒト特異的ＡＯＮであるｈ２９ＡＯＮ＃１１
配列番号３８： ｈＡＯＮ＃８で処理した細胞に見られる、エクソン４４がエクソン４７にスプライシングしたものに相当するサイズの短縮産物
配列番号３９： ｈＡＯＮ＃２３で処理した細胞に見られる、エクソン５０がエクソン５２にスプライシングしたものに相当するサイズの短縮産物
配列番号４０： ｈ２９ＡＯＮ＃１で処理した細胞に見られる、エクソン２８がエクソン３０にスプライシングしたものに相当するサイズの短縮産物
配列番号４１： ｍＡＯＮ＃４で処理したマウスに見られる、エクソン４５がエクソン４７にスプライシングしたものに相当するサイズの短縮産物
配列番号４２： ｍＡＯＮ＃６で処理したマウスに見られる、エクソン４５がエクソン４７にスプライシングしたものに相当するサイズの短縮産物
【特許請求の範囲】
【請求項１】
産生量の減少が求められる望ましくないタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体のエキソンの内部領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１４〜４０個のヌクレオチドを含有し、該エキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
該望ましくないタンパク質の産生を減少させるための医薬の製造用である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖を包含する核酸運搬体。
【請求項４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを放出することが可能な、請求項３に記載の核酸運搬体。
【請求項５】
ＲＮＡスプライシング反応を実施可能な細胞による望ましくないタンパク質の細胞内産生の減少を目的として、該細胞内におけるｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを制御するためのin vitroの方法であって、該細胞内のｍＲＮＡ前駆体を、該ｍＲＮＡ前駆体に含まれる少なくとも１つのエキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを包含し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜４０個のヌクレオチドを含有し、該少なくとも１つのエキソンの内部領域に対するものであることを特徴とする方法。
【請求項６】
該ｍＲＮＡが機能性タンパク質をコードしていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該タンパク質が２つ以上のドメインを包含し、該ドメインの少なくとも１つは、該ｍＲＮＡ前駆体に含まれるエキソンの少なくとも一部のスキッピングによって生じたｍＲＮＡにコードされていることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
該接触によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触したエキソンの隠蔽されたスプライス部位が活性化されることを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該エキソン封入シグナルがエキソン認識配列を包含することを特徴とする、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該エキソン封入シグナルが強いスプライス供与部位／受容部位対を有するエキソンに存在することを特徴とする、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１５〜２５個のヌクレオチドを含有することを特徴とする、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該ｍＲＮＡ前駆体に含まれる他のエキソンの有するエキソン封入シグナルを阻害しうる別のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、該細胞内の該ｍＲＮＡ前駆体と接触させる工程を更に包含することを特徴とする、請求項５〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
異常型タンパク質をコードするエキソンを含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞による異常型タンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させるためのin vitroの方法であって、
該エキソンの少なくとも１つが有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該少なくとも１つのエキソンの内部領域に対するものであり、１４〜４０個のヌクレオチドを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを該細胞に与え、そして
該ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングによって生じるｍＲＮＡの翻訳を行わせしめる
ことを包含する方法。
【請求項１４】
該エキソン封入シグナルがエキソン認識配列を包含することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該エキソン封入シグナルが強いスプライス供与部位／受容部位対を有するエキソンに存在することを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１５〜２５個のヌクレオチドを含有することを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
該ｍＲＮＡ前駆体に含まれる他のエキソンの有するエキソン封入シグナルを阻害しうる別のアンチセンスオリゴヌクレオチドを該細胞に与える工程を更に包含することを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
目的エキソンの一部に対して相補的な核酸が、該エキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能であることを確認するためのin vitroの方法であって、
目的のエキソンを含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞に被験核酸を与え、
該細胞を培養して該ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡを生成せしめ、そして
生成した該ｍＲＮＡに該エキソンが存在しないことを確認する
ことを包含する方法。
【請求項１９】
該目的エキソンを包含するＲＮＡ分子と該核酸との相対的な結合親和性をin vitroで測定する工程を更に包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１または２のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した、ヒト以外の動物。
【請求項２１】
ヒトタンパク質をコードする核酸を更に包含する、請求項２０に記載のヒト以外の動物。
【請求項２２】
該ヒト以外の動物は、自らが有する該ヒトタンパク質の相同体をコードする遺伝子にサイレント突然変異が導入されていることを特徴とする、請求項２１に記載のヒト以外の動物。
【請求項２３】
ｍＲＮＡ前駆体に含まれる少なくとも１つのエキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、細胞内の望ましくないタンパク質の産生を減少させるための医薬の製造方法であって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、該少なくとも１つのエキソンの内部領域に対するものであり、１４〜４０個のヌクレオチドを含有することを特徴とする方法。
【請求項２４】
該望ましくないタンパク質が、野生型構造の時に少なくとも２つの機能性ドメインを有し、各ドメインは一次構造であるアミノ酸配列の個別の部分から生成されたものであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該望ましくないタンパク質が、異常型タンパク質であることを特徴とする、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
該異常型タンパク質が、腫瘍タンパク質またはウイルス性タンパク質であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該医薬が、遺伝病の治療用または遺伝的疾病素質の改善用の医薬であることを特徴とする、請求項２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
該医薬が、腫瘍およびウイルス感染からなる群より選ばれる少なくとも１種の治療を目的とした医薬であることを特徴とする、請求項２３〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
該医薬が、乳ガン、結腸ガン、結節性硬化症、神経線維腫症、血友病Ａおよび先天的甲状腺機能不全症からなる群より選ばれる少なくとも１種の治療を目的とした医薬であることを特徴とする、請求項２７または２８のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
産生量の減少が求められる望ましくないタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体のエキソンの内部領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１４〜４０個のヌクレオチドを含有し、該エキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
該望ましくないタンパク質の産生を減少させるための医薬の製造用である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖を包含する核酸運搬体。
【請求項４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを放出することが可能な、請求項３に記載の核酸運搬体。
【請求項５】
ＲＮＡスプライシング反応を実施可能な細胞による望ましくないタンパク質の細胞内産生の減少を目的として、該細胞内におけるｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを制御するためのin vitroの方法であって、該細胞内のｍＲＮＡ前駆体を、該ｍＲＮＡ前駆体に含まれる少なくとも１つのエキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを包含し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜４０個のヌクレオチドを含有し、該少なくとも１つのエキソンの内部領域に対するものであることを特徴とする方法。
【請求項６】
該ｍＲＮＡが機能性タンパク質をコードしていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該タンパク質が２つ以上のドメインを包含し、該ドメインの少なくとも１つは、該ｍＲＮＡ前駆体に含まれるエキソンの少なくとも一部のスキッピングによって生じたｍＲＮＡにコードされていることを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
該接触によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触したエキソンの隠蔽されたスプライス部位が活性化されることを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該エキソン封入シグナルがエキソン認識配列を包含することを特徴とする、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該エキソン封入シグナルが強いスプライス供与部位／受容部位対を有するエキソンに存在することを特徴とする、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１５〜２５個のヌクレオチドを含有することを特徴とする、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該ｍＲＮＡ前駆体に含まれる他のエキソンの有するエキソン封入シグナルを阻害しうる別のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、該細胞内の該ｍＲＮＡ前駆体と接触させる工程を更に包含することを特徴とする、請求項５〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
異常型タンパク質をコードするエキソンを含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞による異常型タンパク質の産生を少なくとも部分的に減少させるためのin vitroの方法であって、
該エキソンの少なくとも１つが有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該少なくとも１つのエキソンの内部領域に対するものであり、１４〜４０個のヌクレオチドを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを該細胞に与え、そして
該ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングによって生じるｍＲＮＡの翻訳を行わせしめる
ことを包含する方法。
【請求項１４】
該エキソン封入シグナルがエキソン認識配列を包含することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該エキソン封入シグナルが強いスプライス供与部位／受容部位対を有するエキソンに存在することを特徴とする、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１５〜２５個のヌクレオチドを含有することを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
該ｍＲＮＡ前駆体に含まれる他のエキソンの有するエキソン封入シグナルを阻害しうる別のアンチセンスオリゴヌクレオチドを該細胞に与える工程を更に包含することを特徴とする、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
目的エキソンの一部に対して相補的な核酸が、該エキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能であることを確認するためのin vitroの方法であって、
目的のエキソンを含むｍＲＮＡ前駆体を有する細胞に被験核酸を与え、
該細胞を培養して該ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡを生成せしめ、そして
生成した該ｍＲＮＡに該エキソンが存在しないことを確認する
ことを包含する方法。
【請求項１９】
該目的エキソンを包含するＲＮＡ分子と該核酸との相対的な結合親和性をin vitroで測定する工程を更に包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１または２のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した、ヒト以外の動物。
【請求項２１】
ヒトタンパク質をコードする核酸を更に包含する、請求項２０に記載のヒト以外の動物。
【請求項２２】
該ヒト以外の動物は、自らが有する該ヒトタンパク質の相同体をコードする遺伝子にサイレント突然変異が導入されていることを特徴とする、請求項２１に記載のヒト以外の動物。
【請求項２３】
ｍＲＮＡ前駆体に含まれる少なくとも１つのエキソンの有するエキソン封入シグナルを特異的に阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた、細胞内の望ましくないタンパク質の産生を減少させるための医薬の製造方法であって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、該少なくとも１つのエキソンの内部領域に対するものであり、１４〜４０個のヌクレオチドを含有することを特徴とする方法。
【請求項２４】
該望ましくないタンパク質が、野生型構造の時に少なくとも２つの機能性ドメインを有し、各ドメインは一次構造であるアミノ酸配列の個別の部分から生成されたものであることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該望ましくないタンパク質が、異常型タンパク質であることを特徴とする、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
該異常型タンパク質が、腫瘍タンパク質またはウイルス性タンパク質であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該医薬が、遺伝病の治療用または遺伝的疾病素質の改善用の医薬であることを特徴とする、請求項２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
該医薬が、腫瘍およびウイルス感染からなる群より選ばれる少なくとも１種の治療を目的とした医薬であることを特徴とする、請求項２３〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
該医薬が、乳ガン、結腸ガン、結節性硬化症、神経線維腫症、血友病Ａおよび先天的甲状腺機能不全症からなる群より選ばれる少なくとも１種の治療を目的とした医薬であることを特徴とする、請求項２７または２８のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−２００２３５（Ｐ２０１１−２００２３５Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−９８９５２（Ｐ２０１１−９８９５２）
【出願日】平成２３年４月２７日（２０１１．４．２７）
【分割の表示】特願２００２−５２９４９９（Ｐ２００２−５２９４９９）の分割
【原出願日】平成１３年９月２１日（２００１．９．２１）
【出願人】（５０３１０７４３９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２７日（２０１１．４．２７）
【分割の表示】特願２００２−５２９４９９（Ｐ２００２−５２９４９９）の分割
【原出願日】平成１３年９月２１日（２００１．９．２１）
【出願人】（５０３１０７４３９）
【Ｆターム（参考）】
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