真菌由来の免疫調節性化合物
【課題】ポリペプチドとポリサッカライドとを含む組成物を提供すること。
【解決手段】本組成物は、概して免疫調節性である。本発明はまた、液体培地で培養された糸状菌を用いるこれらの組成物の製造方法を開示する。本組成物は、例えば、免疫無防備状態の処置において有用である。本発明の方法は、ｉ）真菌を液体増殖培地で培養する工程と、ｉｉ）該液体増殖培地から該組成物を精製する工程とを包含する。この精製は、分子量が少なくとも１０，０００Ｄａであるポリサッカライドを、その他のポリサッカライドから分離する工程を含み得る。
【解決手段】本組成物は、概して免疫調節性である。本発明はまた、液体培地で培養された糸状菌を用いるこれらの組成物の製造方法を開示する。本組成物は、例えば、免疫無防備状態の処置において有用である。本発明の方法は、ｉ）真菌を液体増殖培地で培養する工程と、ｉｉ）該液体増殖培地から該組成物を精製する工程とを包含する。この精製は、分子量が少なくとも１０，０００Ｄａであるポリサッカライドを、その他のポリサッカライドから分離する工程を含み得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００４年７月１６日に出願された米国仮出願番号第１０／８９２，３９３号、２００５年６月１５日に出願された米国仮出願番号第６０／６９０，４８２号、２００５年６月１５日に出願された米国仮出願番号第６０／６９０，４９６号および２００５年６月１５日に出願された米国仮出願番号第６０／６９０，４７７号の利益を主張し、これらは参照によりその全文が本明細書に援用される。これらの特許出願中、または本願中に引用されるすべての特許および非特許参考文献は、参照によりその全文が本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、真菌の液体培養物から単離できるポリサッカライドを含む免疫調節性化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
健康促進効果は、真菌および酵母由来のグルカンに起因することが知られている。「シイタケ」茸（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ）は、多数の医療目的、例えば、免疫賦活、抗ウイルス、抗腫瘍などに利用できる効果をもたらすと考えられてきた。レンチナンの研究により、レンチナンが、種々の形態の癌における、ヘルパーＴ細胞の活性化、インターロイキン１およびインターロイキン２の産生の増加、抗体産生の増加、ならびに血中コレステロールレベルの低下などの様々な方法で宿主の免疫系を刺激することがわかっている（非特許文献１〜６）。
【０００４】
Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓの１種の有効成分は、レンチナンと呼ばれ、β−（１，６）側鎖を有するβ−（１，３）グルカン骨格として記載されるポリサッカライドベースの化合物である。
【０００５】
Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓなどの真菌の培養には、「固体状」リアクターが慣用的に用いられる。これは、堆肥化、生物学的製品（例えば、酵素、醤油、酢酸など）の生産などの多数の目的で用いられる技術である。レンチナンを生産するために、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓを、木の幹または木材のチップによって提供される適した固体マトリックス上で培養でき、これには菌糸体の増殖およびレンチナンのほとんどが局在する子実体の発生を支援する化学化合物が添加されることが多い。子実体を、手作業によってか、機械によって収穫し、続いて、乾燥させ、砕いて粉末にし、これをそのまま使用してもよいし、または錠剤で使用してもよいし、またはレンチナンの抽出などのさらなる加工に送ってもよい。
【０００６】
Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓから調製されるポリサッカライド製品は、「注射用レンチナン（Ｌｅｎｔｉｎａｎ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）」（Ｅｕｒｅｋａ Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｔｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）として市販されている。この製品は何らかの免疫賦活効果を有する（本明細書中、以下の実施例も参照）。
【０００７】
特許文献１には、真菌から細胞外免疫賦活性化合物を精製する多数の方法が記載されている。一般に、これらの方法は沈殿工程を含む。
【特許文献１】国際公開第０３／０２０９４４号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｅｒｂｓ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ，ｊａｎ／ｆｅｂ，１９９７
【非特許文献２】Ｋ．Ｊｏｎｅｓ，「Ｓｈｉｉｔａｋｅ：Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ ａ ｍｕｓｈｒｏｏｍ」，ｐ．４０−５０，５４；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１７（４Ａ），１９９７
【非特許文献３】Ｈ．Ｍａｔｓｏｕｋａ，「Ｌｅｎｔｉｎａｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ ｏｆ ｓｏｍｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ」，ｐ．２７５１−２７５５；Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．３９，１９９３
【非特許文献４】Ｓ．Ｃ．Ｊｏｎｇ，「Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈｉｉｔａｋｅ ｍｕｓｈｒｏｏｍ」，ｐ．１５３−１８４，ｌｎｔ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，Ｖｏｌ．１４，１９９２
【非特許文献５】Ｋ．Ｉｒｉｎｏｄａ，「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｃｉｄａｌ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｇａｉｎｓｔ ａｅｒｏｓｏｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｅｎｔｉｎａｎ」，ｐ．９７１−９７７．，Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．７６（１），１９８５
【非特許文献６】Ｄ．Ｈｅｒｌｙｎ，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ ｉｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｌｅｎｔｉｎａｎ」，ｐ．３７−４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、極めて高い免疫賦活活性を有する組成物は開示されていない。したがって、本発明の目的は、新規組成物、好ましくは、高レベルの免疫調節活性を有する、真菌由来の細胞外免疫賦活性物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、相当な免疫調節活性を有するポリサッカライドを含む組成物を開示する。興味深いことに、本発明は、ポリサッカライド組成物の特定のモノサッカライドの含量が免疫調節活性にとって重要であることを開示する。
【００１０】
したがって、本発明の１つの目的は、１種以上のポリペプチドと、ポリサッカライドの混合物とを含む組成物であって、組成物のポリサッカライドの大部分、好ましくはどのポリサッカライドも、少なくとも１０，０００Ｄａの分子量を有し、前記のポリサッカライドの混合物が、（０〜１．５）：（０〜０．５）〜（１５〜３５）：（０．５〜１．５）〜（４５〜５５）の比で、好ましくは、約１：０〜２５：１〜５０の比で、例えば、１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む組成物を提供することである。
【００１１】
別の実施形態では、１種以上のポリペプチドと、ポリサッカライドの混合物とを含む組成物であって、
ａ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも３０，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
または
ｂ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも１００，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、０〜０．５：０．５〜１０：０．５〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
または
ｃ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも１，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む
組成物を提供する。
【００１２】
本発明の第２の目的は、このような組成物を製造する方法であって、
ｉ）液体増殖培地中で真菌を培養する工程と、
ｉｉ）該液体増殖培地から該組成物を精製する工程と
を包含する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の第３の目的は、医薬として使用するための、上記組成物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、個体の処置法であって、該個体に、有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、免疫無防備状態の処置、場合によっては、予防的処置を必要とする個体の、このような処置のための医薬の製造における本発明の組成物の使用を提供することである。
例えば、本発明は以下を提供する：
（項目１）
１種以上のポリペプチドと、ポリサッカライドの混合物とを含む組成物であって、
ａ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも３０，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
または
ｂ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも１００，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、０〜０．５：０．５〜１０：０．５〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
または
ｃ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも１，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、
組成物。
（項目２）
前記組成物が真菌によって生産された、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物が、以下の工程：
ｉ）真菌を液体増殖培地で培養する工程と、
ｉｉ）該液体増殖培地から該組成物を単離する工程と
を包含する方法により生産された、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記組成物が、超遠心分離、限外濾過、微細濾過またはゲル濾過を含む方法により前記液体増殖培地から単離される、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記真菌が真菌の菌糸体である、項目２に記載の組成物。
（項目６）
前記真菌がＬｅｎｔｉｎｕｓ属に属する、項目２に記載の組成物。
（項目７）
前記真菌が、
【表１Ａ】
からなる群より選択される、項目２に記載の組成物。
（項目８）
前記真菌が、
【表１Ｂ】
からなる群より選択される、項目２に記載の組成物。
（項目９）
免疫調節性である、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
免疫賦活性である、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
インビトロアッセイにおいて少なくとも１種のＩＬ−１産生細胞からのＩＬ−１産生を誘導できる、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
哺乳類に投与した場合に、前記哺乳類において抗体産生を増強できる、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
前記ポリサッカライドの混合物が、１：５〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
前記ポリサッカライドの混合物が、１：１３．４±０．４：１２．６±１．３の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１５）
前記組成物中のどのポリサッカライドも少なくとも１０，０００Ｄａ分子の分子量を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１６）
前記組成物中のどのポリサッカライドも少なくとも５０，０００Ｄａ分子の分子量を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１７）
前記組成物の前記ポリサッカライドが、１：７〜１１：２．５〜３．５の比でモノサッカライドであるガラクトースとマンノースとグルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１８）
分子量が５０，０００〜１００，０００Ｄａの範囲の前記組成物の前記ポリサッカライドが、１：４〜１４：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１９）
前記比がおよそ１：８．９：２．９である、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
分子量が１００，０００〜３００，０００Ｄａの範囲の前記組成物の前記ポリサッカライドが、１：３〜１３：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２１）
前記比がおよそ１：７．３：２．９である、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
分子量が３００，０００〜１，０００，０００Ｄａの範囲の前記組成物の前記ポリサッカライドが、１：５〜１５：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２３）
前記比がおよそ１：９．９：３．１である、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
分子量が１，０００，０００Ｄａより大きい前記組成物の前記ポリサッカライドが、１：５〜１５：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２５）
前記比がおよそ１：１０．３：２．９である、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
少なくとも１０μｇ／Ｌの可溶性ポリペプチドを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２７）
１０〜１０００μｇ／Ｌの範囲の可溶性ポリペプチドを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２８）
項目１〜２７のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、以下の工程：
ｉ）真菌を液体増殖培地で培養する工程と、
ｉｉ）該液体増殖培地から該組成物を精製する工程と
を包含する、方法。
（項目２９）
前記精製が、分子量が少なくとも１０，０００Ｄａであるポリサッカライドを、その他のポリサッカライドから分離する工程を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記分離を超遠心分離、限外濾過、微細濾過またはゲル濾過によって行う、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
医薬として使用するための、項目１に記載の組成物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
（項目３２）
ｉ）免疫無防備状態と診断された、および／または、
ｉｉ）免疫無防備状態になる危険のある、および／または、
ｉｉｉ）手術または病気から回復中であり、かつ、免疫無防備状態になる危険のある、および／または
ｉｖ）後天性免疫不全症候群と診断されたか、もしくは後天性免疫不全症候群になる危険のある、
個体を処置する方法であって、
該個体に、該免疫無防備状態もしくは該症候群を処置するのに、または予防的に処置するのに、あるいは、該個体の免疫系をブーストするのに有効な量の項目１に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目３３）
前記免疫無防備状態が、感染症、寄生虫病、ヘモフィルス髄膜炎、肺炎球菌性髄膜炎、連鎖球菌性髄膜炎、ブドウ球菌性髄膜炎、その他の生物による髄膜炎、脳炎、ウイルス性肺炎、肺炎球菌性肺炎、その他の細菌性肺炎、細菌を除くその他の特定の生物による肺炎、気管支肺炎、生物非特異性肺炎、インフルエンザ、詳細不明の下痢、詳細不明の肝炎、肝臓の急性および亜急性壊死、慢性肝炎ならびに肝臓膿腫からなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記免疫無防備状態が、コレラ、サルモネラ、細菌性赤痢、大腸菌、その他の特定の細菌による腸内感染、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウイルス性胃腸炎、感染性大腸炎、腸炎および胃腸炎、感染性下痢症、結核、リステリア症、パスツレラ症、マイコバクテリア、ジフテリア、百日咳、髄膜炎菌、連鎖球菌敗血症、ブドウ球菌敗血症、肺炎球菌敗血症、嫌気性菌による敗血症、その他のグラム陰性生物による敗血症、放線菌感染、ガス壊疽、トキシックショック症候群、壊死性筋膜炎、フリードレンデル杆菌、インフルエンザ菌、シュードモナス、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ感染、急性灰白髄炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、亜急性硬化性全脳炎、進行性多病巣性白質脳障害、中枢神経系の詳細不明のスローウイルス感染、コクサッキーウイルス、詳細不明のウイルス性髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎、詳細不明のウイルス性脳炎、水痘、帯状疱疹、単純ヘルペス、ウイルス性Ａ型肝炎、ウイルス性Ｂ型肝炎、その他の特定のウイルス性肝炎、慢性肝炎、肝臓の膿腫／急性壊死、伝染性単核球症、巨細胞性封入体病、クラミジア、アデノウイルス、ウイルス感染、梅毒、カンジダ、詳細不明のヒストプラスマ症、アスペルギルス症、クリプトコックス症、真菌症、糞線虫症、腸管寄生、トキソプラスマ症、サルコイドーシス、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ポリオ後症候群、ヘモフィルス髄膜炎、肺炎球菌性髄膜炎、連鎖球菌性髄膜炎、ブドウ球菌性髄膜炎、脳炎、アデノウイルスによる肺炎、ＲＳウイルスによる肺炎、パラインフルエンザウイルスによる肺炎、その他のウイルスによる肺炎、ウイルス性肺炎、肺炎球菌性肺炎、肺炎杆菌による肺炎、シュードモナスによる肺炎、インフルエンザ菌による肺炎、連鎖球菌による肺炎、ブドウ球菌による肺炎ならびに細菌性肺炎によって引き起こされるかまたはそれらから選択される感染病または寄生虫病である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記個体がヒトを含めた哺乳類である、項目３２に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（定義）
ポリサッカライド：本明細書において用語「ポリサッカライド」とは、ポリサッカライド、ならびにペプチド、ポリペプチドなどを含有するポリサッカライド、および／またはペプチド、ポリペプチドなどと共有結合しているポリサッカライド（例えば、プロテオポリサッカライド）を包含する。
【００１７】
モノサッカライドを含むポリサッカライド：ポリサッカライドは、モノサッカライドを含むと言われ、ここでこのモノサッカライドは共有結合してこのポリサッカライドを形成する。ポリサッカライドを加水分解すると、このポリサッカライドを形成していたモノサッカライドが遊離形態で生じる。したがって、ポリサッカライドのモノサッカライド含量は、ポリサッカライドを加水分解し、個々のモノサッカライドの存在を測定することによって決定できる。ポリサッカライドの混合物のモノサッカライド含量は、混合物全体でのモノサッカライド含量を決定することによって決定される。
【００１８】
比：ポリサッカライドまたはポリサッカライドの混合物は、所定の比でガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含み、このポリサッカライドまたはこのポリサッカライドの混合物を加水分解すると、この所定の比のガラクトースと、マンノースと、グルコースとが生じるといわれる。１：ａ〜ｂ：ｃ〜ｄの比のガラクトースと、マンノースと、グルコースとは、ガラクトース１部ごとに、マンノースがａ〜ｂ部の範囲で存在し、グルコースがｃ〜ｄ部の範囲で存在し、ここで、ａ、ｂ、ｃおよびｄは数値を示すということを意味する。したがって、一例として、１：５〜２５：１〜５０の比でガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むポリサッカライド混合物とは、ガラクトース１部ごとに、ポリサッカライド混合物が５〜２５部の範囲のマンノースと、１〜５０部の範囲のグルコースとを含むことを意味する。
【００１９】
分子量：組成物が所定の値の分子量カットオフをもたらす濾過工程を用いて精製されている場合には、この組成物のどのポリサッカライドも、少なくともこの所定の値の分子量を有するといわれる。同様に、組成物が範囲のうちの低い値である低い分子量カットオフと、範囲のうちの高い値である高い分子量カットオフをもたらす、１以上の濾過工程に供されている場合には、この組成物のどのポリサッカライドも所定の範囲内の分子量を有するといわれる。この濾過工程は、例えば、限外濾過、微細濾過、超遠心分離またはゲル濾過であり得る。しかし、他の方法によっても、どのポリサッカライドも少なくとも所定の値の分子量を有するか、またはどのポリサッカライドも所定の範囲内の分子量を有するといわれる組成物を調製することもできる。
【００２０】
ポリペプチド：本明細書において用語「ポリペプチド」とは、タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドを包含し、このタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは翻訳後修飾されている場合も、されていない場合もある。翻訳後修飾は、例えば、リン酸化、メチル化、グルコシル化であり得る。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
（組成物）
本発明による組成物は、１種以上のポリペプチドと、ポリサッカライドの混合物とを含む。このポリペプチドは、ポリサッカライドと場合により共有結合していてもよい。しかし、このポリペプチドがこのポリサッカライドと会合していないか、またはこのポリペプチドがこのポリサッカライドと非共有結合様式で会合していることも本発明内にも含まれる。
【００２２】
したがって、本組成物は、プロテオポリサッカライドである場合もそうでない場合もあるポリサッカライドを含むか、または本組成物は両方の混合物を含む場合もある。
【００２３】
本発明による組成物は、単離または精製された組成物である。すなわち、本発明の組成物は１以上の精製工程に供されている。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、真菌の菌糸体の液体増殖培地から、サイズ分画を含む少なくとも１つの精製工程を用いて精製されている。精製法は以下により詳細に説明する。
【００２４】
好ましい実施形態では、本組成物は、ポリサッカライドと、必要に応じてポリペプチドとから本質的になる。本組成物は、ポリサッカライドと、ポリペプチドとから本質的になることがより好ましい。本組成物は液体組成物であることが多く、その結果、本組成物は、塩とバッファーとを必要に応じて含む水溶液に溶解させた、ポリサッカライドと、必要に応じてポリペプチドとから本質的になることが好ましい。
【００２５】
本発明の組成物のポリサッカライドは、モノサッカライドであるグルコースと、マンノースと、ガラクトースとを含むことが好ましい。本発明の組成物内に含まれ得るポリサッカライドおよびポリペプチドの例としては、β−（１，３），β−（１，６）Ｄ−グルカン、シゾフィラン、グリフォラン、コリオラン（ｃｏｒｉｏｌａｎ）およびコリオラス・ベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）グリコシル化ポリペプチド、例えば、ＰＳＫおよびＰＳＰ、α−マンナンと会合しているポリペプチド、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓから単離できるＫＳ−２、およびガノデルマ・ルシダム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）から単離できるレイシ（ｒｅｉｓｈｉ）；グルクロノキシロマンナン；マンノグルカン；グルコマンナン；ガラクトグルカンおよび／またはガラクトグルコマンナンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２６】
（真菌）
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に開示される組成物は、真菌によって産生されている。本組成物は、真菌の細胞外環境から精製されていることが好ましい。真菌、好ましくは、真菌の菌糸体が、液体増殖培地中で培養されており、この組成物がこの液体増殖培地から精製されていることがさらにより好ましい。
【００２７】
したがって、本発明の組成物は、
ｉ）液体増殖培地中で真菌、例えば、真菌の菌糸体を培養する工程と、
ｉｉ）この液体増殖培地からこの組成物を単離する工程と
を包含する方法によって生産されていることが好ましい。
【００２８】
真菌の菌糸体とは、液中培養において増殖させることができる任意の真菌バイオマスを意図する。真菌バイオマスは、単一菌糸、胞子、菌糸体の集合体および部分分化した菌糸体の形であり得る。
【００２９】
液体増殖培地は、本明細書において以下に記載する液体増殖培地のいずれかであり得る。
【００３０】
この真菌は、任意の真菌であり得、真菌の菌糸体を形成する真菌が好ましく、この真菌は糸状菌であることがより好ましい。この真菌は、以下からなる群より選択されることがさらにより好ましい：
【００３１】
【表１Ｃ】
真菌は、以下からなる群より選択されることがさらにより好ましい：
【００３２】
【表１Ｄ】
別の好ましい実施形態では、この真菌はＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉである。別の好ましい実施形態では、この真菌はＧａｎｏｄｅｒｍａ（例えば、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）である。別の好ましい実施形態では、この真菌はＡｇａｒｉｃｕｓの真菌であり、例えば、Ａ．ｂｌａｚｅｉ、Ａ．ｂｌａｚｅｉ Ｍｕｒｉｌｌ、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ａ．ｈｏｒｔｅｎｓｉｓ、Ａ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓからなる群より選択される。
【００３３】
本発明の極めて好ましい実施形態では、真菌は担子菌綱、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ属の真菌、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓに属する。
【００３４】
【表１Ｅ】
（免疫系の調節）
本発明による組成物は、免疫調節性であることが好ましく、本組成物は免疫賦活性であることが好ましい。免疫系の刺激は、例えば、抗体産生の増加によって、ヘルパーＴ細胞の活性化によって、またはインターロイキン１およびインターロイキン２などのインターロイキンの産生の増加によって実証できる。
【００３５】
組成物が免疫調節性であるかどうかを試験するのに適している、当業者に公知の任意のアッセイを使用して本発明の組成物が免疫調節性であるかどうかを試験してもよい。このようなアッセイはインビトロアッセイであってもインビボアッセイであってもよい。
【００３６】
１つの好ましいアッセイとして、組成物がＩＬ−１産生、例えば、ＩＬ１−α産生および／またはＩＬ１−β産生を誘導できるかどうかを調べることがある。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明による組成物は、インビトロアッセイにおいて少なくとも１種のＩＬ−１産生細胞からＩＬ−１産生を誘導できる。この細胞は任意のＩＬ−１産生細胞、例えば、Ｐ３８８マウスマクロファージ細胞であり得る。この細胞はＩＬ１−β産生細胞であることが好ましい。ＩＬ−１産生は、任意の適したアッセイを用いて決定することができる。一般に、特異的ＩＬ−１抗体、例えば、特異的ＩＬ１−α抗体および／またはＩＬ１−β抗体の使用を含むアッセイが有用である。このようなアッセイは、例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは同様のアッセイであり得る。このアッセイは、実施例４に記載のとおり実施できる。
【００３７】
ＩＬ１アッセイを較正することは困難であるので、アッセイは、参照として特定の組成物を用いて実施することが好ましい。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、組成物は、並行して実施される参照実験において市販の注射用レンチナン（Ｅｕｒｅｋａ Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｔｙ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｓｔｒｅｅｔ．Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ ３０００，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて誘導されたＩＬ−１αの量よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも６倍、例えば少なくとも８倍、例えば少なくとも１０倍、例えば少なくとも１５倍、例えば少なくとも２０倍、例えば少なくとも３０倍、例えば、少なくとも４０倍多いＩＬ１−αの産生を誘導できる。本発明の好ましい一実施形態では、本組成物は、並行して実施される参照実験においてＥｕｒｅｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｔｙ．社製の注射用レンチナンを用いて誘導されたＩＬ１−βの量よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも６倍、例えば少なくとも８倍、例えば少なくとも１０倍、例えば少なくとも１５倍、例えば少なくとも２０倍多いＩＬ−１βの産生を誘導できる。上記のアッセイは、実施例４に記載のとおりに実施されることが好ましい。本組成物が上記のようにＩＬ１αとＩＬ１β双方の産生を誘導したことが最も好ましい。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、本組成物は、哺乳類に投与すると、この哺乳類において抗体産生を増強できる。哺乳類は、例えば、マウス、ラット、ウサギまたはヒトでさえあり得る。このようなアッセイは、必要に応じてアジュバントの存在下で、抗原の投与に先立って、および抗原の投与と同時に哺乳類に組成物を投与することによって実施することが好ましい。本組成物は、抗原の投与に先立って、１〜３０日間の範囲で、好ましくは、１〜１０日間の範囲で、より好ましくは、１〜３日間の範囲で投与されることが好ましい。その後、哺乳類における抗体産生を決定することができる。本組成物は、この組成物を投与せずに産生される抗体量と比較して、少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、さらにより好ましくは少なくとも２．５倍、例えば少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、例えば６倍多い抗体の産生を誘導できることが好ましい。このようなアッセイの一例が実施例６に概説されている。
【００３９】
本組成物は、１より多くのアッセイ系において、例えば、本明細書において上記で記載した、いずれかのアッセイ系の組合せにおいて免疫調節性であることが好ましい。
【００４０】
好ましい一実施形態では、本発明の組成物は、ＴＮＦ−α産生を増大するよう作用し、これは、例えば、実施例９に記載されるアッセイによって測定できる。
【００４１】
（モノサッカライド含量）
本発明による組成物は、ポリサッカライドを含むことが好ましく、ここで、ポリサッカライドの大部分、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、さらにより好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％、さらにより好ましくは、本質的にすべてのポリサッカライド、最も好ましくは、どのポリサッカライドも、１０，０００Ｄａを上回る、好ましくは、３０，０００Ｄａを上回る、より好ましくは、４０，０００Ｄａを上回る、さらにより好ましくは、５０，０００Ｄａを上回る、例えば、少なくとも１００，０００Ｄａ、例えば、少なくとも３００，０００Ｄａ、例えば、少なくとも１，０００，０００Ｄａの分子量を有する。本発明の一実施形態では、組成物のポリサッカライドの大部分、好ましくは、組成物のどのポリサッカライドも、１０，０００〜３，０００，０００Ｄａの範囲内の、例えば、３０，０００〜３，０００，０００の範囲内、例えば、４０，０００〜３，０００，０００の範囲内、例えば、５０，０００〜３，０００，０００の範囲内、例えば、５０，０００〜１００，０００の範囲の、例えば、１００，０００〜３００，０００の範囲の、例えば、３００，０００〜１，０００，０００の範囲の、例えば、１，０００，０００〜３，０００，０００の範囲の分子量を有する。
【００４２】
本組成物は、少なくとも１つのサイズ分画工程を含む方法によって精製されていることが好ましい。したがって、本組成物は、所定のカットオフを上回る名目分子量を有する分子（例えば、ポリサッカライド）が、このカットオフを下回る名目分子量を有する分子（例えば、ポリサッカライド）から分離される、少なくとも１つのサイズ分画工程を用いて精製されていることが好ましい。一例として、サイズ分画が限外濾過または微細濾過である場合には、このカットオフを有する膜を使用できる。サイズ分画がゲル濾過である場合には、この分子量カットオフを有するゲルを選択してもよいし、または特定の溶出画分を使用してもよい。本発明の一実施形態では、カットオフが、好ましくは、１０，０００Ｄａ、より好ましくは、３０，０００Ｄａ、さらにより好ましくは、４０，０００Ｄａ、いっそうより好ましくは、５０，０００Ｄａである、より大きな分子量の画分を用いる。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、本組成物は、得られる画分が、所定のカットオフを下回りかつ所定のカットオフを上回る名目分子量を有するポリサッカライドを含む、１以上のサイズ分画工程を含む方法によって精製されている。一例として、サイズ分画が限外濾過または微細濾過である場合には、下の分子量カットオフを有する膜を用いる最初の１回の分画工程を実施できる。より大きな分子量の画分を回収し、上の分子量カットオフを有する膜を用いる第２の限外濾過または微細濾過に供することができる。第２の濾過工程の後、より小さい分子量の画分を回収すればよい。ゲル濾過を用いる場合には、特定の溶出画分を使用してもよい。超遠心分離を用いる場合には、下の分子カットオフを有する膜と上の分子量カットオフを有する膜とを使用できる。
【００４４】
本発明の組成物はポリサッカライドの混合物を含み、この混合物は１：５〜２５：１〜５０の比のモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む。したがって、この比は、ポリサッカライドの混合物全体内の比を反映する。したがって、混合物内の個々のポリサッカライド各々が異なる比のモノサッカライドを含むことは可能である。
【００４５】
一般に、この比は、ポリサッカライドの混合物全体をモノサッカライドに分解し、続いて、このモノサッカライド各々の濃度を測定することによって決定できる。ポリサッカライドは、加水分解によって、例えば、ＨＣｌなどの強酸中での加水分解によって、その構成モノサッカライドに分解できる。加水分解産物は、当業者が利用できる任意の従来法、例えば、ＨＰＬＣ、質量分析法またはＮＭＲによって分析され得る。
【００４６】
本発明の一実施形態では、ポリサッカライドはモノサッカライドであるグルコースとマンノースとを含む。本発明の別の実施形態では、ポリサッカライドは、モノサッカライドであるグルコースとガラクトースとを含む。本発明の好ましい実施形態では、本組成物のポリサッカライドは、モノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む。
【００４７】
ポリサッカライドの混合物が、ガラクトース１部ごとに、５〜２５部の範囲の、好ましくは、５〜２０部の範囲の、より好ましくは、５〜１７部の範囲の、さらにより好ましくは、６〜１５部の範囲の、さらにより好ましくは、７〜１４部の範囲の、例えば、１０〜１７部の範囲の、例えば、１１〜１６部の範囲の、例えば、１２〜１５部の範囲の、例えば、１３〜１４部の範囲の、例えば、およそ１３．４±０．４部、例えば、１３．４±０．４部のマンノースを含むことが好ましい。
【００４８】
ポリサッカライドの混合物が、ガラクトース１部ごとに、１〜５０部の範囲の、好ましくは、１〜４０部の範囲の、より好ましくは、１〜３０部の範囲の、さらにより好ましくは、１〜２５部の範囲の、さらにより好ましくは、１〜２０部の範囲の、さらにより好ましくは、２〜１５部の範囲の、さらにより好ましくは、２〜１４部の範囲の、例えば、８〜１７部の範囲の、例えば、９〜１６部の範囲の、例えば、１０〜１５部の範囲の、例えば、１１〜１４部の範囲の、例えば、およそ１２．６±１．３部、例えば、１２．６±１．３部のグルコースを含むことが好ましい。
【００４９】
混合物が本明細書において上記で示されるマンノース対ガラクトースの比と、本明細書において上記で示されるグルコース対ガラクトースの比とを含むことがさらにより好ましい。
【００５０】
本発明の実施形態では、ポリサッカライドは、マンノースとグルコースとを含む場合には、それらが、マンノース１部ごとに、０．１〜３０部の範囲の、例えば、０．１〜０．２５部の範囲の、例えば、０．２５〜０．５部の範囲の、例えば、０．５〜０．７５部の範囲の、例えば、０．７５〜１部の範囲の、例えば、１〜５部の範囲の、例えば、５〜１０部の範囲の、例えば、１０〜２０部の範囲の、例えば、２０〜３０部の範囲のグルコースを含むことが好ましい。ポリサッカライドは、マンノース１部ごとに、０．５〜２部の範囲のグルコースを含むことが好ましく、１３．４±０．４部のマンノース、１２．６±１．３部のグルコースを含むことがより好ましい。
【００５１】
本発明の極めて好ましい実施形態では、本組成物は、１：５〜２５：１〜５０、より好ましくは、１：１３．４±０．４：１２．６±１．３の比のモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むポリサッカライドの混合物を含む。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、本組成物はポリサッカライドの混合物を含み、５０，０００〜１００，０００の範囲の分子量を有するこの混合物内のポリサッカライドは、ガラクトース１部ごとに、３〜１５部の範囲の、好ましくは、４〜１４部の範囲の、より好ましくは、５〜１３部の範囲の、さらにより好ましくは、６〜１２部の範囲の、さらにより好ましくは、７〜１１部の範囲の、さらにより好ましくは、７．９〜９．９部の範囲の、例えば、およそ８．９部のマンノースを含む。この実施形態では、５０，０００〜１００，０００の範囲の分子量を有するポリサッカライドは、ガラクトース１部ごとに、１〜５部の範囲、好ましくは、２〜４部の範囲、さらにより好ましくは、２．５〜３．５部の範囲、例えば、およそ２．９部のグルコースを含むことが好ましい。５０，０００〜１００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するこの組成物のポリサッカライドは、１：４〜１４：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むことが好ましい。この比は、およそ１：８．９：２．９であることが好ましい。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、組成物は、ポリサッカライドの混合物を含み、１００，０００〜３００，０００の範囲の分子量を有するこの混合物内のポリサッカライドは、ガラクトース１部ごとに、３〜１５部の範囲の、好ましくは、３〜１４部の範囲の、より好ましくは、３〜１３部の範囲の、さらにより好ましくは、３〜１２部の範囲の、なおより好ましくは、４〜１１部の範囲、さらにより好ましくは、５〜１０部の範囲の、なおより好ましくは、６．３〜８．３部の範囲の、例えば、およそ７．３部のマンノースを含む。この実施形態では、１００，０００〜３００，０００の範囲の分子量を有するポリサッカライドが、ガラクトース１部ごとに、１〜５部の範囲の、好ましくは、２〜４部の範囲の、さらにより好ましくは、２．５〜３．５部の範囲、例えば、およそ２．９部のグルコースを含むことが好ましい。５０，０００〜１００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するこの組成物のポリサッカライドが、１：３〜１３：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むことが好ましい。この比はおよそ１：７．３：２．９であることが好ましい。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、本組成物はポリサッカライドの混合物を含み、３００，０００〜１，０００，０００の範囲の分子量を有するこの混合物内のポリサッカライドは、ガラクトース１部ごとに、３〜１６部の範囲の、好ましくは、５〜１５部の範囲の、より好ましくは、５〜１４部の範囲の、さらにより好ましくは、６〜１３部の範囲の、なおより好ましくは、７〜１２部の範囲の、さらにより好ましくは、８．９〜１０．９部の範囲の、例えば、およそ９．９部のマンノースを含む。この実施形態では、３００，０００〜１，０００，０００の範囲の分子量を有するポリサッカライドが、ガラクトース１部ごとに、１〜５部の範囲の、好ましくは、２〜４部の範囲の、さらにより好ましくは、２．５〜３．５部の範囲の、例えば、およそ３．１部のグルコースを含むことが好ましい。３００，０００〜１，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するこの組成物のポリサッカライドが、１：５〜１５：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むことが好ましい。この比はおよそ１：９．９：３．１であることが好ましい。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、本組成物は、ポリサッカライドの混合物を含み、少なくとも１，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するこの混合物内のポリサッカライドが、ガラクトース１部ごとに、３〜１７部の範囲の、好ましくは、４〜１６部の範囲の、より好ましくは、５〜１５部の範囲の、さらにより好ましくは、６〜１４部の範囲の、なおより好ましくは、７〜１３部の範囲の、さらにより好ましくは、８〜１２部の範囲の、さらにより好ましくは、９．３〜１１．３部の範囲の、例えば、およそ１０．３部のマンノースを含む。この実施形態では、少なくとも１，０００，０００の分子量を有するポリサッカライドが、ガラクトース１部ごとに、１〜５部の範囲の、好ましくは、２〜４部の範囲の、さらにより好ましくは、２．５〜３．５部の範囲の、例えば、およそ２．９部のグルコースを含むこと好ましい。少なくとも１，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するこの組成物のポリサッカライドが、１：４〜１：５〜１５：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むことが好ましい。この比はおよそ１：１０．３：２．９であることが好ましくい。
【００５６】
一実施形態では、本発明によるポリサッカライドは、１：１０〜２０：３０〜５０、例えば、１：１２〜１８：３５〜４５、例えば、１：１４〜１６：３８〜４２．例えば、１：約１５：約４０、例えば、１：１５：４０というガラクトース：マンノース：グルコースのモル比を有する。
【００５７】
したがって、一実施形態では、組成物ポリペプチドは、１：０〜２５：１〜５０、例えば、１：１０〜２０：３０〜５０、例えば、１：１２〜１８：３５〜４５、例えば、１：１４〜１６：３８〜４２、例えば、１：約１５：約４０、例えば、１：１５：４０という比（ガラクトース：マンノース：グルコース）でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む。
【００５８】
別の一実施形態では、本発明によるポリサッカライドは、１：０．５〜５：６〜１２、例えば、１：１〜４：７〜１１、例えば、１：１．５〜３．５：７．５〜１０、例えば、１：２．０〜３．０：７．５〜９．５、例えば、１：２．２〜２．８：８．０〜９．０、例えば、１：約２．５：８．０〜９．０、例えば、１：２．５：８．０〜９．０、例えば、１：２．５：８．６というガラクトース：マンノース：グルコースのモル比を有する。
【００５９】
本発明の組成物の２つの好ましい実施形態は、１：１２：４０および１：３：５というガラクトース：マンノース：グルコースのモル比を有する。
【００６０】
本発明の好ましい一実施形態では、糖組成物はアガリクス・ブラゼイ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ）から入手可能であり、１０〜２０部のマンノースと、３０〜５０部のグルコースと、０〜２部のガラクトースとを（例えば、１１〜１７部のマンノースと、３５〜４５部のグルコースと、０〜１部のガラクトースとを）含む。糖組成物はアガリクス・ブラゼイ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ）から入手可能であり、約１５部のマンノースと、約４０部のグルコースと約１部のガラクトースとを含むことがより好ましく、ここで、「約」とは、示した値から２０％以内の差、例えば、示した値から１０％以内の差、例えば、示した値から５％以内の差を意味する。
【００６１】
本発明の別の好ましい実施形態では、糖組成物はガノダーマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）から入手可能であり、０．５〜５部のマンノースと、４〜１５部のグルコースと、０〜２部のガラクトースとを（例えば、２〜３部のマンノースと、７〜９．５部のグルコースと、０．５〜１．５部のガラクトースとを）含む。糖組成物は、ガノダーマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）から入手可能であり、約２．５部のマンノースと、約８．６部のグルコースと、約１部のガラクトースとを含むことがより好ましく、ここで、「約」とは、示した値から２０％以内の差、例えば、示した値から１０％以内の差、例えば、示した値から５％以内の差を意味する。
【００６２】
所定の範囲内の分子量を有するポリサッカライドのモノサッカライド含量の決定は、（例えば、限外濾過、微細濾過、超遠心分離またはゲル濾過により）組成物をサイズによって分画することによって決定できる。これは、例えば、実施例２に記載のとおり行うことができる。
【００６３】
ポリサッカライドの混合物が、モノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを（０〜１．５）：（０〜０．５）〜（１５〜３５）：（０．５〜１．５）〜（４５〜５５）の比（例えば、以下のいずれか）で含むことが好ましい：
【００６４】
【表１Ｆ】
本発明の別の実施形態では、本発明の組成物の糖組成物は、１〜２５部のマンノースと、５〜４５部のグルコースと、０〜１．５部のガラクトースとを含み（本明細書において「部」とは、相対的なモル比、すなわち、１〜２５モルのマンノースごとに、５〜４５モルのグルコースと、０〜１．５モルのガラクトースとが存在することを意味する）、したがって、糖組成物は以下の通りにＡ）と、Ｂ）と、Ｃ）とを含み得る：
Ａ）以下からなる群から選択されるマンノースの１つの量：
１〜２５部
１〜２０部
１〜１５部
１〜１０部
１〜４部
１〜３部
１．５〜２．５部
４〜６部
７〜１５部
７〜２３部
９〜１９部
１２〜２０部
１０〜２５部
１２〜１７部
１４〜１６部
および
Ｂ）以下からなる群から選択されるグルコースの１つの量：
５〜４５部
５〜１３部
７〜１３部
７〜１５部
８〜１５部
８〜１２部
８〜１０部
８〜９部
８．４〜８．７部
８．６部
１０〜２０部
２０〜３０部
３０〜４０部
３０〜４５部
３５〜４５部
３５〜４２部
３７〜４５部
３９〜４１部
４０部
および
Ｃ）以下からなる群から選択されるガラクトースの１つの量：
０〜１．５部
０．２〜１．２部
０．７〜１．５部
０〜０．２
０〜１部
０部
１部
１〜１．５部。
【００６５】
（本発明の好ましい実施形態）
本発明の一実施形態では、１種以上のポリペプチドと、ポリサッカライドの混合物とを含み、
ａ）組成物のポリサッカライドの大部分が少なくとも３０，０００Ｄａの分子量を有し、このポリサッカライドの混合物が１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
ｂ）組成物のポリサッカライドの大部分が少なくとも１００，０００Ｄａの分子量を有し、このポリサッカライドの混合物が０〜０．５：０．５〜１０：０．５〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
または
ｃ）組成物のポリサッカライドの大部分が少なくとも１，０００Ｄａの分子量を有し、このポリサッカライドの混合物が１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む組成物を提供する。
【００６６】
したがって、本発明の一実施形態では、組成物のポリサッカライドの大部分は、少なくとも１０，０００Ｄａ、好ましくは、少なくとも３０，０００Ｄａの分子量を有し、このポリサッカライドの混合物は、１：０〜２５：１〜５０の比、例えば、以下のいずれかの比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む：
１：０〜１５：１〜２５、
１：１５〜２５：１〜２５、
１：０〜２５：２５〜５０、
１：１５〜２５：２５〜５０、
１：０〜７：１〜５０、
１：０〜７：１〜２５、
１：７〜１５：１〜５０、
１：７〜１５：４０〜５０、
１：０〜２５：１〜４０、
１：０〜２５：２５〜４０、
１：０〜１０：１〜５０。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、本組成物のポリサッカライドの大部分は、少なくとも１，０００Ｄａ、例えば、少なくとも５，０００Ｄａ、例えば、少なくとも１０，０００Ｄａ、例えば、少なくとも２０，０００Ｄａ、例えば、少なくとも４０，０００Ｄａ、例えば、少なくとも５０，０００Ｄａ、例えば、少なくとも６０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、例えば、少なくとも８５，０００Ｄａ、最も好ましくは、少なくとも１００，０００Ｄａの分子量を有し、このポリサッカライドの混合物は、０〜０．５：０．５〜１０：０．５〜５０の比、例えば、以下のいずれかの比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む：
【００６８】
【表１Ｇ】
この比は約０：１：１８または約０：１：１であることが好ましい。
【００６９】
本発明の別の実施形態では、組成物のポリサッカライドの大部分は、少なくとも５００Ｄａ、例えば少なくとも８００Ｄａ、例えば少なくとも１，０００Ｄａ、例えば少なくとも５，０００Ｄａ、例えば少なくとも１０，０００Ｄａ、例えば少なくとも２０，０００Ｄａ、例えば少なくとも４０，０００Ｄａ、例えば少なくとも５０，０００Ｄａ、例えば少なくとも６０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、例えば少なくとも８５，０００Ｄａ、例えば少なくとも１００，０００Ｄａ、最も好ましくは少なくとも１，０００Ｄａの分子量を有する；このポリサッカライドの混合物は、１：０〜２５：１〜５０の比、例えば、以下のいずれかの比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む。
【００７０】
【表１Ｈ】
この比は約１：１２：４０または約１：３：５であることが好ましい。
【００７１】
（ポリペプチド）
本発明による組成物は、ポリペプチドを含むことが好ましい。本明細書において、用語ポリペプチドとは、タンパク質と、ペプチドおよびポリペプチドの両方を包含する。このポリペプチドは遊離型であってもよく、それらはポリサッカライドと共有結合していてもよく、または、ポリサッカライドまたは上記の混合物と非共有結合によって会合していてもよい。
【００７２】
本組成物は、本組成物の経口投与を可能にするのに十分なポリペプチドを含むことが好ましい。本組成物があまりにも少ないポリペプチドしか含まない場合には、個体に本組成物を経口投与した後に、この個体において免疫調節が全く得られないかまたはほとんど得られない。したがって、本発明の組成物は、少なくとも１０μｇ／Ｌ、より好ましくは、少なくとも２０μ／Ｌ、さらにより好ましくは、少なくとも２５μｇ／Ｌ、例えば、１０〜１０００μｇ／Ｌの範囲、例えば、２０〜１０００μｇ／Ｌの範囲の、例えば、２５〜１０００μｇ／Ｌの範囲の、例えば、２５〜１００μｇ／Ｌの範囲の、例えば、２５〜３５μｇ／Ｌの範囲のポリペプチド、好ましくは、可溶性ポリペプチドを含むことが好ましい。上記の濃度のポリペプチドを含む組成物は０．１〜２ｍｇ／ｍｌの範囲の、より好ましくは、０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌの範囲の、さらにより好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌのポリサッカライドを含むことが好ましい。本組成物が多かれ少なかれポリサッカライドを含む場合には、ポリペプチドの量は比例的に低減されるか、高められることが好ましい。
【００７３】
（組成物の調製方法）
本発明の組成物は、
ｉ）液体増殖培地中で真菌を培養する工程と、
ｉｉ）この液体増殖培地からこの組成物を精製する工程と
を包含する方法によって調製されることが好ましい。
【００７４】
一般に、液体増殖培地中で真菌を培養することは、この真菌の増殖に必要な栄養化合物を水に溶解することと、溶液をバイオリアクターに移すことと、バイオリアクターに、培養しようとする真菌の細胞または胞子、例えば、真菌の菌糸体、またはその画分を接種することを含む。これは無菌条件下で行われ、真菌に適した化学的および物理的環境を与えるよう環境を制御する。液体増殖培地中で真菌を培養することはまた、「液状」培養とも呼ばれる。
【００７５】
「液状」培養の間、真菌バイオマスを含む培地を、撹拌して勾配の発生を低減し、液中の細胞の酸素の利用可能性を確実にすることが好ましい。真菌をバイオリアクター中で増殖させる場合には、既知の方法によって酸素を液体培地に供給でき、溶存酸素レベルを制御できる。
【００７６】
液体増殖培地は水溶液であり、好ましくは、栄養化合物を含む滅菌水である。液体培地は真菌増殖を支援し、好ましくは、細胞外化合物、例えば、免疫調節物質の産生を刺激する。液体増殖培地には、微生物の増殖に必要な１種以上の代表的な成分、例えば、麦芽抽出物、酵母抽出物、ペプトン、グルコース、スクロース、スクロース、リン酸塩を提供する塩、マグネシウムおよびカリウム、コーンスティープリカーおよびチアミンなどのビタミンを含めることができる。培地は、菌糸体増殖およびポリサッカライドの産生のために、スクロース、コーンスティープリカー、リン酸塩およびマグネシウムを含むことがより好ましい。
【００７７】
増殖培地の接種には、例えば、麦芽抽出物、酵母抽出物、ペプトンおよびグルコースを含有する寒天プレートから得た真菌の菌糸体、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ菌糸体を使用できる。まず、真菌を、真菌の増殖を支援する上記の栄養化合物を含む寒天プレート上で培養できる。このプレートに菌糸体を接種し、プレート上で少なくとも可視的増殖が明らかとなるまでインキュベートする。これは、真菌によっては、通常、１８〜３２℃の範囲の、好ましくは、２２℃〜３０℃の領域の温度、例えば、約２３℃〜２７℃の温度、例えば、およそ２５℃で、約７日間〜約２４日間、または約１０日間〜３０日間、代表的には、１４日間または最大２０日間かかる場合がある。
【００７８】
寒天プレートから得た菌糸体での接種の代替法として、例えば、細胞増殖を支援する栄養化合物を含む振盪フラスコ培地中の発酵ブロスから得た菌糸体を用いることによって増殖培地の接種を行うことができる。まず、真菌の菌糸体を培養するための振盪フラスコに菌糸体を接種でき、これを寒天プレート上で培養する。このプレートから菌糸体を採取し、真菌の菌糸体増殖を支援する溶解した栄養化合物と栄養塩とを含む滅菌水を含む振盪フラスコに無菌的に移す。代表的な増殖培地は、スクロース、コーンスティープリカー、リン酸塩およびマグネシウムを含む。細胞外レンチナンの最大の産生をもたらす接種材料の量は、以下の初期実験の後に選択できる。
【００７９】
振盪フラスコのインキュベーション時間は、特定の真菌に応じて変わる。代表的に、振盪フラスコは、１８から３２℃の範囲の、好ましくは２２〜３０℃の領域の温度、例えば、約２３℃、例えば、２４℃、例えば、２５℃、例えば、２６℃、例えば、２７℃、例えば、２８℃、例えば、２９℃、例えば、３０℃の温度で、６〜２１日間、好ましくは、７〜１８日間、より好ましくは、８〜１４日間振盪することによってインキュベートすればよい。また、振盪フラスコは、８〜２５日間、より好ましくは、１０〜２０日間、より好ましくは、１２〜１８日間インキュベートしてもよい。また、温度は１８〜３７℃、好ましくは、２３〜３２℃、例えば、約２５℃であってもよい。
【００８０】
振盪フラスコの内容物を、バイオリアクターの接種に使用できる。その場合には、リアクターには、担子菌の菌糸体、またはその画分、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ属真菌の菌糸体、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓの単培養のための、栄養化合物と栄養塩との滅菌水溶液を含める。
【００８１】
バイオリアクター発酵期間は、代表的に、５０時間〜３００時間の範囲、好ましくは、８０時間〜２７０時間の範囲であり、温度は１８〜３２℃の範囲の、好ましくは、２２〜３１℃の領域の、例えば、約２３℃の温度、例えば、２４℃、例えば、２５℃、例えば、２６℃、例えば、２７℃、例えば、２８℃、例えば、２９℃、例えば、３０℃で一定に維持する。また、温度は１８〜３７℃、好ましくは、２３〜３２℃、例えば、約２５℃であり得る。
【００８２】
リアクターに、発酵ブロスに空気を供給するための注入口を取り付け、空気の添加の結果か、またはリアクターの内容物の良好な混合を提供するのに適したミキサーデバイスのいずれかによって、発酵ブロスを連続撹拌下で維持することが好ましい。
【００８３】
増殖培地のｐＨを約３〜約７、例えば、約４．５〜約６．５のｐＨ、例えば、約６のｐＨに調整し、次いで、増殖培地に真菌の菌糸体、またはその画分、例えば、Ｌ．エドデス（Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ）菌糸体を接種することが好ましい。ｐＨは、最初の調整の後、発酵の過程の間に自然に低下する場合もあるし、適したｐＨ制御物質、例えば、酸および塩基の添加を用いてｐＨ３〜７の範囲の特定の値に制御してもよい。増殖培地の温度は、１８〜３２℃の範囲の、好ましくは、２２〜３１℃の領域の、例えば、約２３℃の温度、例えば、２４℃、例えば、２５℃、例えば、２６℃、例えば、２７℃、例えば、２８℃、例えば、２９℃、例えば、３０℃であることが好ましい。また、温度は１８〜３７℃、好ましくは、２３〜３２℃、例えば、約２５℃であり得る。
【００８４】
バイオリアクターからサンプルを得、バイオマス、代謝産物および栄養化合物について分析することができ、それらの決定が、発酵プロセスの稼働中にバイオリアクターの操作者を補助し得る。慣用的に実施される代表的な分析は、バイオマス、残存糖濃度および細胞外ポリサッカライド濃度の決定である。当業者には、この件に使用できる分析法は知られている。
【００８５】
本発明による組成物を調製する方法は、真菌の菌糸体から液体増殖培地の細胞外画分を精製する工程を含むことが好ましい。液体発酵培地の細胞外画分はまた、上清とも呼ばれ、この画分は、例えば、遠心分離または濾過によって、または実際に、中に真菌の菌糸体が本質的に全く存在しない液体画分を得るために利用可能な、任意のその他の手段によって、真菌の菌糸体から分離できる。用語「中に真菌の菌糸体が本質的に全く存在しない」とは、真菌の菌糸体（その画分を含む）の濃度が少なくとも１０３倍低下している、例えば、少なくとも１０４倍低下している、例えば、少なくとも１０５倍低下している、例えば、少なくとも１０６倍低下していることを表すものとする。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態では、精製は少なくとも１つのサイズ分画工程を含む。このサイズ分画工程は細胞外画分で実施することが好ましい。このサイズ分画工程により、組成物中のどのポリサッカライドも、少なくとも所定の値の分子量を有することを確実にできる（本明細書中、上記も参照）。サイズ分画工程は、当業者に公知のいずれのサイズ画分、例えば、超遠心分離、限外濾過、微細濾過またはゲル濾過であってもよい。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本組成物を液体増殖培地から、超遠心分離、限外濾過、微細濾過およびゲル濾過からなる群から選択される１以上の精製工程を含む方法によって精製する。精製工程は、限外濾過、微細濾過および超遠心分離からなる群から選択されることが好ましく、さらにより好ましくは、限外濾過および微細濾過からなる群から選択される。
【００８７】
限外濾過は、膜が液体の成分をサイズによって分画する膜プロセスである。通常、膜の構成は、関連成分を含有する液体が膜を通って流れるクロスフローである。膜の名目孔サイズよりも小さい成分を含有する一部の液体は、膜を通過する。名目孔サイズよりも大きな分子は保持される。所望の産物は残留物または濾液中にあり得る。組成物を調製するために限外濾過を実施する場合には、この組成物内のどのポリサッカライドも所定の値を上回る分子量を有し、所望の産物は残留物中にある。連続分画を行う場合には、産物は残留物または濾液中にあり得る。
【００８８】
微細濾過はＵＦと同様であるが、より大きな粒子が通過するのを可能にするさらに大きな膜孔サイズを有する膜分離プロセスである。
【００８９】
ゲル濾過は、粒子がサイズによって分離されるクロマトグラフィーの技術である。濾過媒体は、代表的に、小さいゲルビーズであり、これがビーズ孔を通過できる分子を取り込む。より大きな分子は、ビーズに取り込まれずにカラムを通過する。
【００９０】
ゲル濾過、限外濾過または微細濾過は、例えば、Ｒ Ｈａｔｔｉ−Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｂ Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ （２００１）、Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ Ｃ Ｒａｔｌｅｄｇｅ ａｎｄ Ｂ Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ） ｐｐ１８９に記載のとおり実施できる。
【００９１】
本発明による組成物を調製する非限定的な方法は、例えば、実施例１、７および８に記載されている。
【００９２】
アルコール沈殿を含む、液体増殖培地から細胞外物質を精製する方法が、記載されている。しかし、アルコール沈殿は免疫調節効果を低減する場合があり、したがって、アルコール沈殿を用いて精製された組成物はあまり望ましいものではない。ゆえに、本発明の一実施形態では、本方法はアルコール沈殿工程を含まない。本方法は沈殿工程を含まないことがより好ましい。
【００９３】
（薬学的組成物およびその使用）
本発明の別の実施形態では、免疫系の刺激を必要とする個体の免疫系を刺激する方法における本発明の組成物の使用を提供する。本組成物は、例えば、個体の免疫系を刺激できる薬剤上有効な量で個体に経口投与または皮下投与できる。免疫系の刺激は、例えば、抗体産生の増加によって、ヘルパーＴ細胞の活性化によって、またはインターロイキン、例えば、インターロイキン１およびインターロイキン２の産生の増加によって実証できる。
【００９４】
本発明のさらに別の実施形態では、免疫無防備状態の処置を必要とする個体において免疫無防備状態を処置するための医薬の製造における本発明の組成物の使用を提供する。個体における免疫無防備状態は、例えば、不十分な量の抗体もしくは抗体産生の減少などの免疫系因子によって、個体における不十分な量のヘルパーＴ細胞もしくはヘルパーＴ細胞の産生の減少によって、個体における不十分な量のＢ細胞もしくはＢ細胞の産生の減少によって、個体における不十分な量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって、もしくはＮＫ細胞の産生の減少によって、または個体における不十分な量のインターロイキン、例えば、インターロイキン１およびインターロイキン２もしくはインターロイキン、例えば、インターロイキン１およびインターロイキン２の産生の減少によって実証できる。免疫無防備状態は以下に開示されるもののうちいずれかであり得る。処置は予防的なもの、改善するものまたは治癒的なものであり得る。
【００９５】
上記の本明細書において、「不十分な量」および「産生の減少」とは、医療関係者が健常な個体と通常関連している所定のレベルまたは値を下回っていると考えるような量および産生を表すものとする。通常、この量および／または産生は、年齢、全身の健康状態などといった因子に応じて変わる。このために、所定のレベルまたは値は、医療関係者によって個体ベースで決定されるものとする。個体における免疫無防備状態の１つの徴候としては、時間をかけて（例えば、数日、数週間、数ヵ月または数年をかけて）測定された単位（血液）サンプル容積当りの、抗体数の漸減、ＣＤ４（陽性）細胞数の漸減、またはヘルパーＴ細胞数の漸減がある。
【００９６】
一態様では、本発明は、本発明の組成物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ １９９５，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに記載されるような従来技術によって調製され得る。本組成物は、従来の形態、例えば、カプセル剤、錠剤、トローチ剤、散剤、シロップ剤、液剤または懸濁剤で現れ得る。
【００９７】
一態様では、本発明は、免疫無防備状態と診断された個体の処置法であって、この個体に、この免疫無防備状態を処置するのに有効な量の本発明による組成物または本発明による薬学的組成物を投与する工程を含む方法に関する。
【００９８】
投与される量は、この免疫無防備状態を予防的に処置するのに有効な量であり得る。
【００９９】
また、手術または病気から回復中であり、かつ、免疫無防備状態になる危険のある個体を処置する方法であって、この個体に、この個体の免疫系をブーストするのに有効な量の本発明による組成物または本発明による薬学的組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【０１００】
さらに、後天性免疫不全症候群と診断されたか、または後天性免疫不全症候群になる危険のある個体の処置法であって、この個体に、この症候群を処置するのに、または予防的に処置するのに有効な量の本発明による組成物または本発明による薬学的組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【０１０１】
免疫無防備状態は、感染症、寄生虫病、ヘモフィルス髄膜炎、肺炎球菌性髄膜炎、連鎖球菌性髄膜炎、ブドウ球菌性髄膜炎、その他の生物による髄膜炎、脳炎、ウイルス性肺炎、肺炎球菌性肺炎、その他の細菌性肺炎、細菌を除くその他の特定の生物による肺炎、気管支肺炎、生物非特異性肺炎、インフルエンザ、詳細不明の下痢、詳細不明の肝炎、肝臓の急性および亜急性壊死、慢性肝炎ならびに肝臓膿腫からなる群から選択され得る。
【０１０２】
さらに、免疫無防備状態は、コレラ、サルモネラ、細菌性赤痢、大腸菌、その他の特定の細菌による腸内感染、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウイルス性胃腸炎、感染性大腸炎、腸炎および胃腸炎、感染性下痢症、結核、リステリア症、パスツレラ症、マイコバクテリア、ジフテリア、百日咳、髄膜炎菌、連鎖球菌敗血症、ブドウ球菌敗血症、肺炎球菌敗血症、嫌気性菌による敗血症、その他のグラム陰性生物による敗血症、放線菌感染、ガス壊疽、トキシックショック症候群、壊死性筋膜炎、フリードレンデル杆菌、インフルエンザ菌、シュードモナス、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ感染、急性灰白髄炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、亜急性硬化性全脳炎、進行性多病巣性白質脳障害、中枢神経系の詳細不明のスローウイルス感染、コクサッキーウイルス、詳細不明のウイルス性髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎、詳細不明のウイルス性脳炎、水痘、帯状疱疹、単純ヘルペス、ウイルス性Ａ型肝炎、ウイルス性Ｂ型肝炎、その他の特定のウイルス性肝炎、慢性肝炎、肝臓の膿腫／急性壊死、伝染性単核球症、巨細胞性封入体病、クラミジア、アデノウイルス、ウイルス感染、梅毒、カンジダ、詳細不明のヒストプラスマ症、アスペルギルス症、クリプトコックス症、真菌症、糞線虫症、腸管寄生、トキソプラスマ症、サルコイドーシス、ニューモシスティス・カリニ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ポリオ後症候群、ヘモフィルス髄膜炎、肺炎球菌性髄膜炎、連鎖球菌性髄膜炎、ブドウ球菌性髄膜炎、脳炎、アデノウイルスによる肺炎、ＲＳウイルスによる肺炎、パラインフルエンザウイルスによる肺炎、その他のウイルスによる肺炎、ウイルス性肺炎、肺炎球菌性肺炎、肺炎杆菌による肺炎、シュードモナスによる肺炎、インフルエンザ菌による肺炎、連鎖球菌による肺炎、ブドウ球菌による肺炎および細菌性肺炎によって引き起こされるかまたはそれらから選択される感染病または寄生虫病であり得る。
【０１０３】
個体は哺乳類、例えば、ヒトであり得る。
【０１０４】
本発明の組成物は、適した投与形態のいずれを用いても投与できるが、通常、投与は経口投与または非経口投与である。本組成物を含むシロップ剤および／または本組成物を含むシロップを含有するカプセル剤の形態の、または本組成物の散剤の形態の経口投与が好ましい。
【０１０５】
必要用量は、用いる特定の組成物、投与経路および処置される特定の個体によって異なる。理想的には、本方法によって処置される個体は、最大寛容用量で薬学的に有効な量の化合物を受け取る。
【０１０６】
一般に一日経口投与レジメンは、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは、０．１〜１０の範囲、さらにより好ましくは、１〜２ｍｇ／全体重１ｋｇの範囲であり得る。また、当業者によれば、組成物の個々の投与量の最適な量および間隔は、処置される状態の性質および程度、投与形態、投与経路および投与部位、ならびに処置される特定の患者によって決まること、ならびにこのような最適条件は従来技術によって決定できるということが認識される。当業者には当然のことであるが、最適処置過程、すなわち、規定の日数にわたって１日当たりに与えられる組成物の用量数は、処置決定試験の従来の過程を用いて当業者によって確認され得る。
【０１０７】
本発明による組成物および薬学的組成物はまた、この組成物と、用量および時間投与の指針を含む投与計画指示書とを含むキットの一部を形成し得る。
【０１０８】
（機能性食品）
本発明の一実施形態では、機能性食品の製造において本発明の組成物を用いる。したがって、本発明の一実施形態では、本明細書に記載される組成物のいずれも、（好ましくはヒトに適した）機能性食品または栄養素補給物質に含めることができる。この機能性食品は、生存促進性、長寿促進性、健康促進性であり、かつ／または微生物集団のモジュレーターであることが好ましい。この機能性食品は健康促進性であり、かつ／または微生物集団のモジュレーターであることがより好ましい。機能性食品は少なくとも毎週の経口摂取、例えば、毎日の経口摂取に適していることが好ましい。あるいは、この機能性食品製品は、非経口または経腸栄養において、好ましくは、当業者に公知のその他の栄養を含む製剤と組み合わせて使用するのに適しているものであり得る。
【０１０９】
本発明の製品は、ヒトの健康を促進するために、例えば、骨または心血管の健康を維持、強化または促進するために使用できる。本発明の好ましい一実施形態では、機能性食品を骨粗しょう症の予防または減少のために使用できる。本発明の別の好ましい実施形態では、この機能性食品の、例えば、１日１回、１日２回または１日３回といった定期的な消費が、風邪、咳などの疾病の危険の低減をもたらし、疲れおよび疲労を減少させる。
【０１１０】
投与法または消費法は異なり得るとはいえ、機能性食品は、ヒトによってその日々の食生活の成分として摂取されることが好ましい。本明細書に記載される組成物のいずれも、液体ビヒクル、例えば、水、ミルク、植物油、ジュースなどと、または摂取可能な固体または半固体食料品と組み合わせることができる。例えば、本組成物は、ミルクセーキ、ミルクセーキミックス、朝食用ドリンク、ジュース、フレーバードリンク、フレーバードリンクミックス、ヨーグルト、プディング、アイスクリーム、アイスミルク、フロスティング、フローズンヨーグルト、チーズケーキフィリング、「ヘルスバー」、例えば、グラノーラおよびフルーツバーをはじめとするキャンディーバー、ガム、ハードキャンディー、マヨネーズ、フルーツフィリングまたはクリームフィリングなどのペストリーフィリング、シリアル、パン、詰め物、ドレッシングおよびインスタントポテトミックスなどの食品に混合することができる。したがって、本発明は、本明細書に記載される（例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ属真菌から得られる）組成物のいずれかを食料品と混合することを含む、機能性食品組成物を製造する方法に関する。
【０１１１】
例えば、この機能性食品製品は、食事代替物、栄養補助食品、アイスクリーム、ソース、ドレッシング、スプレッド、バー、甘い物、スナック、シリアルおよび飲料の群から選択され得る。
【０１１２】
別の好ましい実施形態では、この機能性食品は、（好ましくは、丸剤、カプセル剤、錠剤または液剤の形態での摂取に適した）栄養補助食品である。
【０１１３】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物のいずれか（例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ属由来の）を、組成物のレベルが５〜５０００ｍｇ／１００ｇ製品の間であるように食品製品に添加することによって本発明の製品を調製する。
【０１１４】
（乳製品）
本発明の好ましい一実施形態では、機能性食品は乳製品である。したがって、この機能性食品は、例えば、以下のいずれかから選択され得る：
培養乳製品、ヨーグルト、カッテージチーズ、クリームチーズ、乳製品ディップ、サワークリーム、ミルクセーキ、バター、マーガリン、低脂肪スプレッド、チーズ、カッテージチーズ、チーズスプレッド、子供用チーズ「ストリングス」、チーズスライス、ヨーグルト、ヨーグルトベースの炭酸飲料、飲むことができるヨーグルト、低脂肪ヨーグルト、冷蔵ディップ、サワークリーム、アイスクリーム、クリーム、低脂肪クリーム代用品、ケフィアなどの発酵乳。
【０１１５】
本発明の好ましい一実施形態では、この乳製品は、チーズベースの製品、例えば、低脂肪チーズ、ハードチーズ、ソフトチーズ、カッテージチーズ、チーズスプレッド、子供用チーズ「ストリングス」またはサンドイッチに適したチーズスライスから選択されるものである。
【０１１６】
本発明の別の好ましい実施形態では、この乳製品はヨーグルトベースの製品、例えば、セットヨーグルト、流れやすいまたは注ぐことができるヨーグルト、ヨーグルトベースの炭酸飲料、飲むヨーグルトまたは飲むことができるヨーグルト、低脂肪ヨーグルトから選択されるものである。このヨーグルトベースの製品は、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓおよび／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを用いて発酵させることができる。
【０１１７】
本発明の別の好ましい実施形態では、この乳製品は、培養乳製品、例えば、培養液（例えば、飲むことができるヨーグルト／ヨーグルトスムージー、ケフィア、プロバイオティックショット）、飲むことができないヨーグルト（例えば、カップまたはチューブ入りのもの）、および／または別の注ぐことができない培養乳製品（例えば、カッテージチーズ、クリームチーズ、乳製品ディップまたはサワークリーム）である。
【０１１８】
本発明の別の好ましい実施形態では、この乳製品は別の種類の乳製品、例えば、冷蔵ディップおよびサワークリーム、アイスクリーム、クリーム、低脂肪クリーム代用品、ケフィアなどの発酵乳、飲むことができるヨーグルトおよびケフィアなどの発酵飲料からなる群から選択されるものである。
【０１１９】
（健康ドリンク）
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明による機能性食品は健康ドリンクである。この健康ドリンクは、一実施形態では、果汁ベースのものであり、これは、飲むために希釈される「スカッシュ」として濃縮できる。この果汁またはスカッシュは、濃縮果汁を含むことが好ましい。好ましい果汁としては、柑橘果汁、例えば、オレンジ、グレープフルーツ、レモンまたはライムまたはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。別の好ましい実施形態では、この果汁またはスカッシュは、例えば、ラズベリー、ストロベリー、ブラックベリー、ローガンベリー、クランベリー、アカフサスグリ、クロフサスグリ、ブルーベリーまたはそれらの組み合わせ、および／または柑橘系果汁との組み合わせ由来の（好ましくは、濃縮）ベリージュースを含む。別の好ましい実施形態では、この果汁またはスカッシュは、パイナップル、パッションフルーツ、マンゴー、リンゴ、洋ナシ、アプリコット、ザクロ、グアバ、トマトおよび／またはいずれかのその他の種類の果汁との組み合わせのうちの１種以上に由来するジュースを含む。好ましいジュースベースは以下の群から選択される：
・リンゴ
・アプリコット
・バナナ
・ブラックベリー
・ブルーベリー
・ゴレンシ（スターフルーツ）
・サクランボ
・ナツメヤシ
・イチジク
・フルーツカクテル
・ブドウ
・グレープフルーツ
・キウィフルーツ
・レモン
・マンダリンオレンジ
・マンゴー
・メロン
・ネクタリン
・オレンジ
・パパイヤ
・モモ
・洋ナシ
・パイナップル
・プランタイン
・プラム
・ラズベリー
・ストロベリー
・タンジェリン
・スイカ
またはそれらの組み合わせ。
【０１２０】
さらに好ましいジュースベースは以下の群から選択される：
・リンゴ
・ニンジン
・クランベリー
・ブドウ
・グレープフルーツ（ピンクまたはホワイト）
・レモン
・ライム
・オレンジ
・パイナップル
・パイナップル
・プルーン
・タンジェリン
・トマト
またはそれらの組み合わせ。
【０１２１】
この健康ドリンクはまた、水ベースのもの、例えば、ミネラルウォーターベースの製品、例えば、フレーバーミネラルウォーターベースの製品であってもよい。このフレーバリングは、果汁および／またはその他の天然の産物由来であることが好ましい。
【０１２２】
本発明の好ましい一実施形態では、この健康ドリンクは、例えば、２５または３０ｃｌの瓶に含まれる、糖と、その他のエネルギー供給製品とを含むエネルギーショットである。
【０１２３】
本発明の別の好ましい実施形態では、この健康ドリンクは、アルコール飲料、例えば、乳製品ベースのアルコール飲料である。
【０１２４】
本発明の別の好ましい実施形態では、この健康ドリンクは、食事代替ドリンクである。
【０１２５】
本発明の健康ドリンクはまた、後の段階で、好ましくは消費者によってドリンクに作り上げる準備ができている、濃縮物またはプレミックスとして製造できることが想定される。
【０１２６】
（固形の機能性食品）
本発明の好ましい一実施形態では、機能性食品は固形の機能性食品、例えば、以下からなる群から選択されるものである：ビスケット／クラッカー、朝食用シリアル、スープ、ミューズリー、チューイングガム、甘い物（例えば、ハードキャンディー）、フレッシュベーカリー製品（焼きたてパン、ケーキ、マフィン、ワッフルなど）、ドライベーカリー製品（クリスプブレッド、ビスケット、クラッカーなど）、シリアル製品（朝食用シリアル、ファイバーおよびステロールを強化した小麦粉、ミューズリー、シリアルベースおよびミューズリーバー、例えば、チョコレートを含有する可能性があるバー、パスタ製品、スナックなど）、ふすま製品、（粒状および／または焼きふすま製品、フレーバー付きおよび／またはステロールコートされたふすま製品およびふすま−ふすまミックスなど）。
【０１２７】
本発明の別の好ましい実施形態では、この固形の機能性食品は、食品の調理または製造において用いられる、ベーキング用（例えば、パン、ケーキ、マフィン、ワッフル、ピザ、パンケーキ）か、調理用（例えば、スープ、ソース、デザート、プディング）いずれかの、レディミックス（好ましくは粉末の形の）である。
【０１２８】
本発明の別の好ましい実施形態では、この固形の機能性食品は、肉製品（ソーセージ、ミートボール、コールドカットなど）である。
【０１２９】
本発明の別の好ましい実施形態では、この固形の機能性食品は、パンまたは朝用製品／ベーカリースナックである。したがって、このパンは白パン、黒パンまたは全粒パンであり得る。本発明の別の好ましい実施形態では、このパンは以下のパンの種類から選択され得る：麦芽入り小麦粉、ミルクパン、ふすま強化およびミックスドグレイン（ｍｉｘｅｄ ｇｒａｉｎ）パン。パンは、例えば、小さい塊、コーバーグ、重ねパン（ｃｏｔｔａｇｅ）、チョヤ（ｃｈｏｌｌａ）、ブルーマー（ｂｌｏｏｍｅｒ）、バレル（ｂａｒｒｅｌ）、バッチ（ｂａｔｃｈ）、サンドイッチ、型焼き、ウィーン（ｖｉｅｎｎａ）または田舎風など、どんな形状のものであってもよい。本発明の好ましい一実施形態では、このパンは以下のパンの種類のいずれかから選択される：
全粒パン
黒パン
小麦胚芽パン（１０％もの加工小麦胚芽が添加されて含まれているパン）
ソフトグレインパン（従来の白パンと比較して、繊維含量を高めるために（好ましくは、３０％まで）、軟化したライ麦および小麦粉というさらなる穀物を含む白い小麦粉から製造されたもの）
全麦パン
麦芽パン。
【０１３０】
本発明の別の好ましい実施形態では、このパンは、以下のパンの種類のいずれかから選択される：
チャバタ
ピタ
ナン
チョヤ
フォカッチャ
ソーダブレッドまたはブラウンソーダブレッド（全粒粉を用いて作られる）
ライ麦パン
バゲットまたはフレンチスティック
クロワッサン
ベーグル。
【０１３１】
本発明の別の好ましい実施形態では、このパンは、例えば、以下のパンの種類のいずれかから選択される平たいパンである：チャパティ、パラタ（Ｐａｒａｔａ）およびロティ（Ｒｏｔｉ）、メキシカントルティーヤ、フラット「ラップ」トルティーヤまたはフラワートルティーヤ、パンケーキ。
【０１３２】
本発明の別の好ましい実施形態では、機能性食品は朝用スナックまたはベーカリー製品である。このベーカリー製品は、甘い物か、またはセイボリーのいずれか、例えば、セイボリーであり得る。
【０１３３】
好ましいベーカリー製品としては、ロールパンおよび平たくて柔らかいパン、マフィン、クラムペットおよびピクレット、スコーン、ティーケーキ、丸パンおよびその他の果物を加えた製品などの焼き製品、パンケーキおよびグリドルスコーン、ワッフルおよびポテトケーキなどのホットプレート製品、ホットクロスバン、クロワッサン、ブリオッシュ、パン・オ・ショコラ、ベーグル、アメリカンスイートマフィンおよびその他のセミスイートパン製品が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３４】
（植物油ベースの製品）
本発明の別の好ましい実施形態では、機能性食品は、植物油ベースの製品である（スプレッド、サラダオイル、マヨネーズなど）。
【０１３５】
（冷凍菓子製品）
本発明の別の好ましい実施形態では、機能性食品は冷凍菓子製品である。本発明の目的上、用語、冷凍菓子製品としては、ミルク含有冷凍菓子、例えば、アイスクリーム、フローズンヨーグルト、シャーベット、ソルベ、アイスミルク、フローズンカスタード、氷菓子、グラニタおよびフローズンフルーツピューレが挙げられる。
【０１３６】
冷凍菓子中の固体（例えば、糖、脂肪、香料など）のレベルは、３ｗｔ％より多いことが好ましく、１０〜７０ｗｔ％がより好ましく、例えば、４０〜７０ｗｔ％である。
【０１３７】
アイスクリームは代表的に、２〜２０ｗｔ％の脂肪と、０〜２０ｗｔ％の甘味料と、２〜２０ｗｔ％の脱脂乳成分と、任意成分（例えば、乳化剤、安定剤、保存料、香料成分、ビタミン、ミネラルなど）とを含み、残りは水である。代表的に、アイスクリームには２０〜４００％、より一般的には、４０〜２００％のオーバーランに空気を含ませ、−２〜−２００℃、より一般的には−１０〜−３０℃という温度に凍結する。アイスクリームは、普通は、約０．１ｗｔ％のレベルのカルシウムを含む。
【０１３８】
冷凍菓子材料の平均的１人分の代表的なサイズは６６ｇである。本発明による組成物は、カプセル化してもよいし、または乳化剤、界面活性剤もしくは製品中の物質の可溶化および安定化を確実にするためのその他の物質と合わせてもよい。
【０１３９】
（食事代替物）
本発明の別の好ましい実施形態では、機能性食品は食事代替物である。食事代替ドリンクは、代表的には、液体ベースをベースとし、例えば、これをガムまたはファイバーによって増粘させ、それにミネラルおよびビタミンのカクテルを添加することができる。ドリンクには所望の風味、例えば、フルーツまたはチョコフレーバーにフレーバーを付けることができる。代表的な１人分のサイズは３３０ｍｌまたは３３０ｇであり得る。本発明による組成物は、カプセル化してもよいし、または乳化剤、界面活性剤もしくは飲料中の物質の可溶化および安定化を確実にするためのその他の物質と合わせてもよい。
【０１４０】
食事代替スナックまたはバーは、食用材料のマトリックスを含むことが多く、その中に本発明による組成物を組み込むことができる。例えば、マトリックスは脂肪ベース（例えば、クーベルチュールまたはチョコレート）であってもよいし、ベーカリー製品（パン、生地、クッキーなど）をベースとするものであってもよいし、凝集粒子（米、穀物、ナッツ、レーズン、フルーツ粒子）をベースとするものであってもよい。スナックまたは食事代替バーの代表的なサイズは、２０〜２００ｇ、一般的には、４０〜１００ｇであり得る。製品には、さらなる成分、例えば、香料材料、ビタミン、ミネラルなどを添加することができる。
【０１４１】
（組み合わせ）
本発明の一態様では、機能性食品は、本発明による組成物を、別の生存促進性物質、長寿促進性物質、健康促進性物質および／または微生物集団のモジュレーターと組み合わせて含む。
【０１４２】
例えば、この機能性食品の１つの好ましい実施形態として、１種以上の本発明による組成物と、プロバイオティックとを、例えば、プロバイオティック「ショット」中に含む食品がある。機能性食品の別の好ましい実施形態は、本発明による化合物と、プレバイオティックとを、例えば、プレバイオティック「ショット」中に含む食品である。機能性食品の別の好ましい実施形態は、本発明の組成物と、シンバイオティックとを、例えば、シンバイオティック「ショット」中に含む食品である。本発明の好ましい一実施形態では、上記のショット中に用いるのに好ましい細菌は、以下のうちのいずれかである：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓおよび／またはＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）。本発明の別の好ましい実施形態では、上記のショット中に用いるのに好ましい細菌は以下のうちのいずれかである：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｌａｃｔｉｓおよび／またはＢ．ｌｏｎｇｕｍ）。本発明の別の好ましい実施形態では、上記のショット中に用いるのに好ましい細菌は以下のうちのいずれかである：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ。
【０１４３】
本発明による組成物はまた、例えば、植物サプリメントなどの栄養補助食品において、および／またはビタミンＥカプセル剤において、またはセレン丸剤において、他の成分と合わされてもよい。この栄養補助食品におけるさらに好ましい組み合わせは、以下のうち１種以上とであり得る：抗酸化物質、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロテン。
【０１４４】
本発明の機能性食品は、他の健康によい成分、例えば、ビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、カルシウム、カリウム、マグネシウム、鉄、銅、亜鉛、セレンなどのミネラルおよびトコフェロール、ポリフェノールなどの抗酸化物質などをさらに含み得る。例えば、機能性食品は、本発明による組成物（例えば、レンチナン）を、ビタミンＣとともに含むことができ、その組み合わせが、この機能性食品を摂取している個体において風邪およびインフルエンザの減少を引き起こすことができる。
【０１４５】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、骨粗しょう症を減少または予防すると考えられているさらなる成分を含み得る。このような成分の例は、カルシウム、ビタミンＤ、マグネシウムなどである。
【０１４６】
本発明の適した機能性食品の好ましい実施形態を、本明細書において以下に記載する：
０．１〜５％、好ましくは、０．５〜１％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む飲料。
【０１４７】
０．９〜１６％、好ましくは、２．４〜１０％、より好ましくは、３〜５％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含むフレッシュベーカリー製品。
【０１４８】
１．０〜２０％、好ましくは、３．２〜１５％、より好ましくは、４．４〜１０％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む乾燥ベーカリー製品。
【０１４９】
０．８〜２０％、好ましくは、１．６〜１６％、より好ましくは、２〜１０％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含むシリアル製品。
【０１５０】
４％〜２５％、好ましくは、６〜２０％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含むふすま製品。
【０１５１】
０．１〜２０％、好ましくは、０．８〜８％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む乳製品または非乳製品（例えば、発酵シリアル製品）。
【０１５２】
０．６〜１６％、好ましくは、２．６〜１０％、より好ましくは、２．６〜５％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む植物油ベースの製品。
【０１５３】
０．１〜１６％、好ましくは、０．２〜５％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む肉製品。
【０１５４】
０．１〜１６％、好ましくは、０．２〜５％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む乳製品。
【０１５５】
したがって、一実施形態では、本発明は、機能性食品、例えば、本明細書に記載される機能性食品のいずれかの製造における本明細書に記載される組成物のいずれかの使用に関する。
【実施例】
【０１５６】
以下の実施例は、本発明の例示的実施形態を説明するものであって、本発明の制限と見なしてはならない。
【０１５７】
（実施例１）
（炭水化物組成物）
Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓを、振盪フラスコ中、２５℃で、１５ｇ／ｌグルコース、３ｇ／ｌ麦芽抽出物、３ｇ／ｌ酵母抽出物および５ｇ／ｌペプトンを含む培地において液体培養で培養した。培養後、バイオマスを、濾過によって残りの発酵ブロスから分離した。上清を５０，０００Ｄａという名目孔サイズを有する膜を用いる限外濾過に付した。残留物（本明細書では、「ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品」と称する）をモノサッカライド含量の分析に用いた。
【０１５８】
比較のために、市販の注射用レンチナン（Ｅｕｒｅｋａ Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｔｙ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｓｔｒｅｅｔ．Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ ３０００，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を並行して実施した参照実験において用いた（本明細書では以下、この製品を「Ｅｕｒｅｋａ」と称する）。
【０１５９】
サンプルを、１００℃、１Ｎ ＨＣｌにおいて、その構成要素モノサッカライドに加水分解した。加水分解産物を、移動相として６００ｍＭのＮａＯＨを用い、Ｄｉｏｎｅｘ ＭＡ−１カラムを用いてＨＰＬＣによって分析した。検出はパルス電流法によって行った。
【０１６０】
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品の主要なモノサッカライドは、マンノースと、グルコースと、いくらかのガラクトースであった。表Ａは、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品とＥｕｒｅｋａの相対モノサッカライド含量を示す。
【表Ａ】
【０１６１】
（実施例２）
（分子量分画）
それらの生物活性の分子量特性決定のために、ＭｅｄｉＭｕｓｈサンプルを、６℃、７，５００×ｇでＭｉｃｒｏｓｅｐ （Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）遠心分離限外濾過によって遠心分離した。５０，０００〜１，０００，０００の名目ＭＷＣＯ値を有するフィルターを用いた。分析結果（表２参照）は、酸加水分解でマンノース、グルコースおよびガラクトースを生じる材料が、用いた４種のＭＷＣＯ膜すべてを通過することを示した。
【０１６２】
【表２−１】
【０１６３】
（実施例３）
（可溶性タンパク質）
サンプル中の可溶性タンパク質を、クマシー色素結合アッセイのマイクロスケール版によって測定した（Ｍｏｕｓｄａｌｅ，Ｄ．Ｍ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｓｅ−ｓｈｉｋｉｍａｔｅ：ＮＡＤＰ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｅａ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ」．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６７，２１７−２２２（１９８７））。２種の製品中の可溶性タンパク質の量を以下に示す。
【０１６４】
【表２−２】
【０１６５】
（実施例４）
（免疫賦活）
（組織培養）
Ｐ３８８細胞はマウスマクロファージ様細胞であり、これは、刺激されると多量のインターロイキン−１（ＩＬ−１）を分泌する（細胞に関する詳細な情報はＥＣＡＣＣから入手可能である）。分泌されるＩＬ−１の量は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）に基づいた方法を用いて定量でき、細胞がどのように刺激されたかの尺度として使用できる。このようなアッセイを較正する絶対値は存在しないことには留意しなくてはならず、したがって、並行して参照サンプルを分析し、参照サンプルによって誘発されたＩＬ１産生と比較して、ＩＬ１産生を評価することが好ましい。２つの型のＩＬ−１、すなわち、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βがある。Ｐ３８８細胞を、１２ウェル培養プレートに播種し、一晩増殖させる。異なる濃度の種々の賦活薬を加え、３７℃で２４時間インキュベートする。
【０１６６】
（ＥＬＩＳＡ）
各ウェルに由来する５０μｌの刺激を受けた培養培地を、コーティングバッファーと混合し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに分注し、４℃で一晩コーティングさせた。この工程により、抗原（ＩＬ−１）がＥＬＩＳＡプレートの表面と結合することが可能となる。ＩＬ−１を、ヤギで作製される、２種の異なる型のＩＬ−１に対する２種の抗体（一次抗体）を用いて検出する。次の工程では、ヤギ抗体を検出する別の抗体（二次抗体）を用いる。この抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼと結合しており、これによって、基質が加えられると呈色反応が生じる。分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）によって測定される色の量は、存在するＩＬ−１の量と相関し、従って、組織培養細胞がどの程度刺激されているかが定量される。
【０１６７】
（結果）
（全サンプルアッセイ）
２種の製品を、ある範囲の濃度で試験し、最適値は、ＩＬ１αについては５０μｇ／ｍｌであり、ＩＬ１βについては１００μｇ／ｍｌであることがわかった。結果を表３に示す。
【０１６８】
【表３−１】
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品は著しく免疫賦活性であった。Ｅｕｒｅｋａ製品はいくらかの免疫賦活を示したが、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品よりも大幅に弱かった。ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品は、Ｅｕｒｅｋａよりも５８倍多いＩＬ１αおよび２０倍多いおよびＩＬ１−βの産生を誘発した。
【０１６９】
（画分のアッセイ）
フィルターカットオフよりも大きな分子がアッセイ中に存在しないよう、濾液を試験した。結果は吸光度として示されており、相対的な免疫賦活の目安を示すに過ぎない。このようなアッセイを較正する絶対値は存在しない。
【０１７０】
【表４−１】
すべての濾液材料が、有意な免疫賦活を示した。
【０１７１】
（実施例５）
２種の異なる製造法を比較するために、実施例１に記載のとおりに調製されたＭｅｄｉＭｕｓｈ製品の免疫賦活活性を、サイズ分画に付されなかったポリサッカライド組成物の免疫賦活活性と比較した。
【０１７２】
この製品を、実施例１に記載されるように、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓを液体培養において培養することによって調製した。このように得られた上清に、およそ２容積の無水エタノールを加え、生成物を沈殿させた。沈殿物を除去し、無水エタノールで洗浄し、蒸留水に再懸濁した。
【０１７３】
免疫賦活アッセイは、実施例４に記載のとおりに実施した。ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品を用いた結果を表５に示し、沈殿した生成物を用いた結果を表６に示す。
【０１７４】
【表５−１】
【０１７５】
【表６−１】
アッセイを並行して実施しなかったので、得られた数値は比較できない。しかし、両研究においてＥｕｒｅｋａを参照として用いたので、結果をＥｕｒｅｋａ）と比較して何倍増強として比較することができる。これらの値を以下の表７に示す。明らかなように、両組成物とも、Ｅｕｒｅｋａよりも大幅に免疫賦活性が高かった。しかし、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品は、沈殿生成物よりも免疫賦活性が高かった。
【０１７６】
【表７−１】
【０１７７】
（実施例６）
免疫賦活特性を決定するために、以下の方法を使用できる：１２週齢のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに０．０９生理食塩水０．５ｍｌ中、１ｍｇの本発明による組成物を与え（腹腔内）、２日後、免疫する。対照動物には１ｍｇのカゼインを与える。動物を、０．２５「フロイント完全アジュバント」中、ＢＳＡ（０．５ｍｇ）を用いて免疫し、１１日後、抗体応答の測定のために血液サンプルを得る。特異的抗ＢＳＡ抗体濃度を、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡによって、抗体ＢＳＡの絶対的基準に対して求める。
【０１７８】
（実施例７ａ）
（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｓｐ．の培養のためのプロトコール）
培養条件：
温度：２５℃±１℃
ｐＨ：中程度のｐＨ
水：水道水
培地：グルコース３０ｇ／ｌ；
菌学ペプトン１０ｇ／ｌ、
酵母抽出物６ｇ／ｌ
麦芽抽出物６ｇ／ｌ。
【０１７９】
（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｓｐ．の発酵槽（３リットル）培養）
発酵槽に１．７リットルの培地を入れ、１２１℃で２０分間滅菌する。発酵条件を設定する：２５℃、２００〜３００ｒｐｍおよび０．２〜０．５ｖｖｍの空気。発酵培地または良好な増殖を促進する同様の培地を含む、６〜８日培養した振盪フラスコを用いて発酵槽に接種する。必要な場合には（普通は、実施の間中）、適した消泡剤を添加する。６〜８日後に収集する。
【０１８０】
（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｓｐ．の収集）
バイオマス：フィルター媒体として孔サイズ４５のナイロンクロスを用いてバイオマスをブロスから取り出す。バイオマスを水で十分に洗浄し、霜取りに設定した電子レンジ中で乾燥するまで乾燥させる（通常のサンプルサイズには約１５分必要となる）。冷却し秤量するまでデシケーター中で保存する。
【０１８１】
発酵液：発酵液中の免疫賦活物質の濃度を、無水エタノールを用いてｐｐｔで決定する。必要ならば、滅菌蒸留水を加えて濃度を所望のレベルに調整する。得られた液体をオートクレーブし、保存する。
【０１８２】
医療グレード：バイオマスを含まない発酵液を、例えば、３００ｋＤといったｍｗｔカットオフを有するＵＦフィルターに通す。７０〜８０％の液体を除去したら、残留物に水を加えて溶液を洗浄する。溶液がその色の多く（ほとんど）を失い、透明に見えるまで繰り返す。
【０１８３】
（実施例７ｂ）
Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉを、実施例７ａに記載のとおりに液体培養で培養した。培養後、バイオマスを、濾過によって発酵ブロスの残りから分離した。上清を種々のｍｗｔカットオフを有するフィルターを用いる遠心分離濾過に供した。１００ｋＤ未満のすべての成分を除去し、製品ＭｅｄｉＭｕｓｈＩＩを含有する液体を残すことによって、第１の製品（ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＩと表した）を得た。上清から、１ｋＤ未満のｍｗｔを有するすべての成分を除去し、「ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＩＩ」を含有する液体を残すことによって、第２の製品（ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＩＩと表した）を得た。
【０１８４】
サンプルを、１００℃、１Ｎ ＨＣｌにおいて、その構成要素モノサッカライドに加水分解した。加水分解産物を、移動相として６００ｍＭのＮａＯＨを用い、Ｄｉｏｎｅｘ ＭＡ−１カラムを用いてＨＰＬＣによって分析した。検出をパルス電流法によって行った。
【０１８５】
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＩおよびＩＩＩの主要なモノサッカライドは、マンノースと、グルコースと、いくらかのガラクトースであった。表Ｂは、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＩおよびＩＩＩの相対モノサッカライド含量を示す。
【表Ｂ】
【０１８６】
（実施例８）
Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍを、液体培養において、実施例７ａに記載されるとおりＡｇａｒｉｃｕｓ真菌と同様の方法で培養した。培養後、バイオマスを、濾過によって発酵ブロスの残りから分離した。上清を実施例７ａに例示されるように遠心分離濾過に付した。１００ｋＤ未満のすべての成分を除去し、製品ＭｅｄｉＭｕｓｈ ＩＶを含む液体を残すことによって、第１の製品（ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＶと表した）を得た。上清から、１ｋＤ未満のｍｗｔを有するすべての成分を除去し、「ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品Ｖ」を含有する液体を残すことによって、第２の製品（ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品Ｖと表した）を得た。
【０１８７】
サンプルを、１００℃、１Ｎ ＨＣｌにおいて、その構成要素モノサッカライドに加水分解した。加水分解産物を、移動相として６００ｍＭのＮａＯＨを用い、Ｄｉｏｎｅｘ ＭＡ−１カラムを用いてＨＰＬＣによって分析した。検出はパルス電流法によって行った。
【０１８８】
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＶおよびＶの主要なモノサッカライドは、マンノースと、グルコースと、いくらかのガラクトースであった。表Ｃは、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＶおよびＶの相対モノサッカライド含量を示す。
【表Ｃ】
【０１８９】
（実施例９）
（マウス腹腔浸出細胞（ＰＥＣ）および脾細胞による炎症誘発性サイトカイン産生に対する経口および腹膜内ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置の効果）
（材料および方法）
マウス：これらの研究には２４匹の、５週齢の雄のマウスを用いた。それらを、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ部門から購入した。すべての研究を、ＬＳＵ ＩＡＣＵＣ プロトコール０４−１２０に記載される規定にしたがって実施した。
【０１９０】
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置：マウスを４群に分けた。群１には０．１５Ｍ ＮａＣＩ中２ｍｇ／ｋｇのレンチニアン（ｌｅｎｔｉｎｉａｎ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）に与え、群２には、等容積の生理食塩水をｉ．ｐ．で与え、群３には、１０ｍｇ／ｋｇのＭｅｄｉＭｕｓｈ製品水溶液を胃管栄養法（経口）で与え、群４には等容積の水を経口で与えた。すべてのマウスに１日１回５日間処置を与えた。最後の処置の２４時間後、細胞単離のためにマウスを出血させ、安楽死させた。
【０１９１】
腹腔浸出細胞（ＰＥＣ）の単離および刺激：ＰＥＣを、先に記載されたように（１）腹膜洗浄によって収集した。細胞を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０（培地）中１×１０６個／ｍＬに濃縮し、２４ウェル組織培養プレートに１ｍＬ／ウェルで分配した。プレートを１２００×ｇで１０分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間静置した。培地を廃棄し、ウェルを加温した培地で１回洗浄し、１．５ｍＬの加温した、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補充した培地（完全培地）で交換した。各群のウェルの半分を、１０ｎｇ／ｍｌの大腸菌リポ多糖類（ＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１２または２４時間静置した。フィコエリトリンで標識したＣＤ３およびＣＤ１４に対する抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびフルオレセインで標識した抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ）を用いてフローサイトメトリーによって細胞の表現型を調べた。
【０１９２】
脾細胞の単離および刺激：各マウスから脾臓を採取した。一部を、将来のｍＲＮＡ解析のために急速凍結した。残りの脾臓を、群別にプールし、７０μｍのナイロンスクリーン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を通して押しつぶした。脾細胞を１回洗浄し、ペレットを緩衝塩化アンモニウムに氷上で５分間再懸濁した。細胞を２回洗浄し、完全培地に４×１０７個／ｍＬで再懸濁し、１．５ｍＬ／ウェルで２４ウェル組織培養プレートに分配した。代表的なウェルを１０ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳまたは５μｇ／ｍＬのコンカナビリン（Ｃｏｎｃａｎａｖｉｌｉｎ）Ａ（ＣｏｎＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）で刺激し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１２または２４時間静置した。
【０１９３】
サイトカインについてのＥＬＩＳＡ。ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１２に対するサイトカインＥＬＩＳＡを、血清および培養上清で、製造業者（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって記載されたとおり正確に実施した。希釈していない上清を３連で試験した。血清を試験のために１：１０希釈した。
【０１９４】
（結果および考察）
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品には、重量増加によって測定されるそれらの増殖に対して統計的に有意な効果がなかった（表１）。しかし、ｉ．ｐ．ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品には、腹膜洗浄液から単離される細胞数および細胞の表現型に対して効果があった。経口によって曝露されたマウスと、生理食塩水をｉ．ｐ．で与えられたマウスは比較的同様であったが、ｉ．ｐ．ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置を受けたマウスの腹膜から単離される細胞総数が増加した（データは示していない）。細胞数の増加は、主に集団中の好中球の増加によるものであった（表２）。マクロファージと比較したＰＭＮによる観察結果への相対的寄与率はこの段階では推定できないが、ｉ．ｐ．群では異なる観察される相違が達成され得る。対照的に、経口群の数および表現型は極めて類似しており、その比較は統計的に妥当であるはずである。
【０１９５】
腹膜内（ｉ．ｐ．）ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置は、１２時間で腹腔浸出細胞（ＰＥＣ）によるＴＮＦα産生の４倍の増加（表３）および脾細胞による３倍の増加（表４）、ならびにＰＥＣ（３０％増加）および脾細胞（２倍）によるインビトロ ＬＰＳ処理に応じて産生さたＴＮＦα量の増加を引き起こした。経口ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置には、ＰＥＣまたは脾細胞によるＴＮＦα産生に対して有意な効果はなかった。興味深いことに、インビトロ ＬＰＳ刺激後にＰＥＣによるＴＮＦα産生において有意な減少（２０％）があった（表４）。これらの結果は、ＴＮＦαに対する効果は局所レベルで開始され得、かつ／またはＭｅｄｉＭｕｓｈ製品に対する直接曝露が必要であり得るということを示す。
【０１９６】
経口およびｉ．ｐ．ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置の双方により、ＰＥＣによるＩＬ−１β産生が大幅に促進される（それぞれ、１８倍および６倍；表４）。さらに、ｉｐ処置を受けたマウスではインビトロ ＬＰＳに応じてＩＬ−１βも、３倍より多く増加した。ＴＮＦ同様、経口ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品に曝露され、インビトロ ＬＰＳで刺激されたマウス由来のＰＥＣによるＩＬ−１β産生は減少した（２倍）。
【０１９７】
処置を受けたマウスおよび処置を受けていないマウス由来の脾細胞は、最初の１２時間の培養において少量のＩＬ−１βしか産生しない。マウスを、経口またはｉ．ｐ．のいずれかでＭｅｄｉＭｕｓｈ製品に曝露させると、マウス由来の脾細胞は、ＬＰＳまたはＣｏｎＡ（Ｔ細胞分裂促進因子）のいずれかでの処理によって刺激されてＩＬ−１βを産生する。
【０１９８】
概して、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置は、ＰＥＣによるＩＬ−６産生に対して効果を有していたが、これは非ＬＰＳ処理細胞においてのみ統計的に有意であった（表７）。対照的に、ＩＬ−６産生は、刺激を受けていない脾細胞によって緩やかに上昇したが、ＬＰＳまたはＣｏｎＡ刺激を受けた、経口およびｉ．ｐ．曝露双方の脾細胞によって緩やかに減少した。ＩＬ−６レベルは、次の１２時間の培養にわたって上昇し続けた（表９および１０）。
【０１９９】
１２時間でのインターロイキン１２産生は、ＣｏｎＡ刺激を受けた脾細胞培養の場合を除いてアッセイの検出限界であった（表１２）。ｉ．ｐ．ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品曝露では、マウスはＬＰＳに応じて有意な量のＩＬ−１２を産生する。
【０２００】
経口ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品曝露は、概して、ＰＥＣによる炎症誘発性サイトカイン産生を低減させ、脾細胞による炎症誘発性産生を増加させた。このことは、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品（経口）に対する全身性反応が、先の研究において測定された局所応答（経鼻、ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．）と異なり得ることを示唆する。
【０２０１】
ｉ．ｐ．でおよび経口で投与されたＭｅｄｉＭｕｓｈ製品は、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品の投与量が同等ではないために直接比較できなかった。
【０２０２】
（参考文献）
１．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＪＥ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，ＡＭ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，ＤＨ，Ｓｈｅｖａｃｈ，ＥＭ，Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗ（ｅｄｓ．）．１９９４．「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ｐ３．１５．４
【０２０３】
【表１】
【０２０４】
【表２−３】
【０２０５】
【表３−２】
【０２０６】
【表４−２】
【０２０７】
【表５−２】
【０２０８】
【表６−２】
【０２０９】
【表７−２】
【０２１０】
【表８】
【０２１１】
【表９−１】
【０２１２】
【表１０−１】
【０２１３】
【表９−２】
【０２１４】
【表１０−２】
（機能性食品製品の実施例）
本発明を、本発明に用いるのに好ましい機能性食品製品の適した実施形態を記載することによって、以下、さらに例示する。提供される教示を用いること、それとともに本発明のその他の製品を調製することは十分に当業者の能力の範囲内であると考えられる。
【０２１５】
（実施例１０）
（バー）
７５ｇのダークチョコレートを７０℃で溶かし、続いて、６００ｍｇのＭｅｄｉＭｕｓｈ製品と混合する。この混合物をバーの形の型に注ぎ入れ、一晩冷却する。
【０２１６】
（実施例１１）
（ミルクセーキ）
１００ｍｌのバニラフレーバーのアイスクリームを、１００ｍｌの冷却したミルクと、１０ｍｌのストロベリーシロップと、１ｍｌのキノコ培養から得た細胞外液体と混合する。この混合物をブレンダーに通し、直ちに供する。
【０２１７】
（実施例１２）
（ヌガーバー）
成分重量（ｇ）
水 ７０
Ｈｙｆｏａｍａ（乳化剤）３．５
ゼラチン２．０
糖５１５
グルコースシロップ６０ＤＥ ２５０
グルコースシロップ３５ＤＥ ２５０
スキムミルク粉末１１５
脂肪５０
キノコ培養から得た細胞外液体１ｇ。
【０２１８】
調製方法：ｈｙｆｏａｍａおよびゼラチンを水に溶解し、１５０ｇの糖を加え、泡立て、残りの糖を１３０℃に加熱し、泡に徐々に加える。脂肪、グルコースシロップ、ミルク粉末およびキノコ培養から得た細胞外液体１ｇを加える。放冷し、５０ｇのバーに分割する。
【０２１９】
（実施例１３）
（フルーツドリンク）
１１成分の２００ｇの果汁濃縮物（バナナ、パイナップル、オレンジ、ブドウ、アプリコット、レモン、パッションフルーツ、グアバ、マンゴー）、５ｇのフルクトース、１ｇのイヌリン、１０ｇ、０．１ｇのＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＶ、０．９ｇの植物ステロール脂肪酸エステル（＝０．５４ｇのステロール相当物）、５ｇのレシチン、１．５ｇの乳酸カルシウム、７７５ｇの水。
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００４年７月１６日に出願された米国仮出願番号第１０／８９２，３９３号、２００５年６月１５日に出願された米国仮出願番号第６０／６９０，４８２号、２００５年６月１５日に出願された米国仮出願番号第６０／６９０，４９６号および２００５年６月１５日に出願された米国仮出願番号第６０／６９０，４７７号の利益を主張し、これらは参照によりその全文が本明細書に援用される。これらの特許出願中、または本願中に引用されるすべての特許および非特許参考文献は、参照によりその全文が本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、真菌の液体培養物から単離できるポリサッカライドを含む免疫調節性化合物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
健康促進効果は、真菌および酵母由来のグルカンに起因することが知られている。「シイタケ」茸（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ）は、多数の医療目的、例えば、免疫賦活、抗ウイルス、抗腫瘍などに利用できる効果をもたらすと考えられてきた。レンチナンの研究により、レンチナンが、種々の形態の癌における、ヘルパーＴ細胞の活性化、インターロイキン１およびインターロイキン２の産生の増加、抗体産生の増加、ならびに血中コレステロールレベルの低下などの様々な方法で宿主の免疫系を刺激することがわかっている（非特許文献１〜６）。
【０００４】
Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓの１種の有効成分は、レンチナンと呼ばれ、β−（１，６）側鎖を有するβ−（１，３）グルカン骨格として記載されるポリサッカライドベースの化合物である。
【０００５】
Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓなどの真菌の培養には、「固体状」リアクターが慣用的に用いられる。これは、堆肥化、生物学的製品（例えば、酵素、醤油、酢酸など）の生産などの多数の目的で用いられる技術である。レンチナンを生産するために、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓを、木の幹または木材のチップによって提供される適した固体マトリックス上で培養でき、これには菌糸体の増殖およびレンチナンのほとんどが局在する子実体の発生を支援する化学化合物が添加されることが多い。子実体を、手作業によってか、機械によって収穫し、続いて、乾燥させ、砕いて粉末にし、これをそのまま使用してもよいし、または錠剤で使用してもよいし、またはレンチナンの抽出などのさらなる加工に送ってもよい。
【０００６】
Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓから調製されるポリサッカライド製品は、「注射用レンチナン（Ｌｅｎｔｉｎａｎ ｆｏｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）」（Ｅｕｒｅｋａ Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｔｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）として市販されている。この製品は何らかの免疫賦活効果を有する（本明細書中、以下の実施例も参照）。
【０００７】
特許文献１には、真菌から細胞外免疫賦活性化合物を精製する多数の方法が記載されている。一般に、これらの方法は沈殿工程を含む。
【特許文献１】国際公開第０３／０２０９４４号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｅｒｂｓ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ，ｊａｎ／ｆｅｂ，１９９７
【非特許文献２】Ｋ．Ｊｏｎｅｓ，「Ｓｈｉｉｔａｋｅ：Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ ａ ｍｕｓｈｒｏｏｍ」，ｐ．４０−５０，５４；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．１７（４Ａ），１９９７
【非特許文献３】Ｈ．Ｍａｔｓｏｕｋａ，「Ｌｅｎｔｉｎａｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ ｏｆ ｓｏｍｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ」，ｐ．２７５１−２７５５；Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．３９，１９９３
【非特許文献４】Ｓ．Ｃ．Ｊｏｎｇ，「Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈｉｉｔａｋｅ ｍｕｓｈｒｏｏｍ」，ｐ．１５３−１８４，ｌｎｔ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，Ｖｏｌ．１４，１９９２
【非特許文献５】Ｋ．Ｉｒｉｎｏｄａ，「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｃｉｄａｌ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｇａｉｎｓｔ ａｅｒｏｓｏｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｌｅｎｔｉｎａｎ」，ｐ．９７１−９７７．，Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，Ｖｏｌ．７６（１），１９８５
【非特許文献６】Ｄ．Ｈｅｒｌｙｎ，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ ｉｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｌｅｎｔｉｎａｎ」，ｐ．３７−４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、極めて高い免疫賦活活性を有する組成物は開示されていない。したがって、本発明の目的は、新規組成物、好ましくは、高レベルの免疫調節活性を有する、真菌由来の細胞外免疫賦活性物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、相当な免疫調節活性を有するポリサッカライドを含む組成物を開示する。興味深いことに、本発明は、ポリサッカライド組成物の特定のモノサッカライドの含量が免疫調節活性にとって重要であることを開示する。
【００１０】
したがって、本発明の１つの目的は、１種以上のポリペプチドと、ポリサッカライドの混合物とを含む組成物であって、組成物のポリサッカライドの大部分、好ましくはどのポリサッカライドも、少なくとも１０，０００Ｄａの分子量を有し、前記のポリサッカライドの混合物が、（０〜１．５）：（０〜０．５）〜（１５〜３５）：（０．５〜１．５）〜（４５〜５５）の比で、好ましくは、約１：０〜２５：１〜５０の比で、例えば、１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む組成物を提供することである。
【００１１】
別の実施形態では、１種以上のポリペプチドと、ポリサッカライドの混合物とを含む組成物であって、
ａ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも３０，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
または
ｂ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも１００，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、０〜０．５：０．５〜１０：０．５〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
または
ｃ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも１，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む
組成物を提供する。
【００１２】
本発明の第２の目的は、このような組成物を製造する方法であって、
ｉ）液体増殖培地中で真菌を培養する工程と、
ｉｉ）該液体増殖培地から該組成物を精製する工程と
を包含する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の第３の目的は、医薬として使用するための、上記組成物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、個体の処置法であって、該個体に、有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、免疫無防備状態の処置、場合によっては、予防的処置を必要とする個体の、このような処置のための医薬の製造における本発明の組成物の使用を提供することである。
例えば、本発明は以下を提供する：
（項目１）
１種以上のポリペプチドと、ポリサッカライドの混合物とを含む組成物であって、
ａ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも３０，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
または
ｂ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも１００，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、０〜０．５：０．５〜１０：０．５〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
または
ｃ）該組成物の該ポリサッカライドの大部分が、少なくとも１，０００Ｄａの分子量を有し、該ポリサッカライドの混合物が、１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、
組成物。
（項目２）
前記組成物が真菌によって生産された、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物が、以下の工程：
ｉ）真菌を液体増殖培地で培養する工程と、
ｉｉ）該液体増殖培地から該組成物を単離する工程と
を包含する方法により生産された、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記組成物が、超遠心分離、限外濾過、微細濾過またはゲル濾過を含む方法により前記液体増殖培地から単離される、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記真菌が真菌の菌糸体である、項目２に記載の組成物。
（項目６）
前記真菌がＬｅｎｔｉｎｕｓ属に属する、項目２に記載の組成物。
（項目７）
前記真菌が、
【表１Ａ】
からなる群より選択される、項目２に記載の組成物。
（項目８）
前記真菌が、
【表１Ｂ】
からなる群より選択される、項目２に記載の組成物。
（項目９）
免疫調節性である、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
免疫賦活性である、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
インビトロアッセイにおいて少なくとも１種のＩＬ−１産生細胞からのＩＬ−１産生を誘導できる、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
哺乳類に投与した場合に、前記哺乳類において抗体産生を増強できる、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
前記ポリサッカライドの混合物が、１：５〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
前記ポリサッカライドの混合物が、１：１３．４±０．４：１２．６±１．３の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１５）
前記組成物中のどのポリサッカライドも少なくとも１０，０００Ｄａ分子の分子量を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１６）
前記組成物中のどのポリサッカライドも少なくとも５０，０００Ｄａ分子の分子量を有する、項目１に記載の組成物。
（項目１７）
前記組成物の前記ポリサッカライドが、１：７〜１１：２．５〜３．５の比でモノサッカライドであるガラクトースとマンノースとグルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１８）
分子量が５０，０００〜１００，０００Ｄａの範囲の前記組成物の前記ポリサッカライドが、１：４〜１４：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目１９）
前記比がおよそ１：８．９：２．９である、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
分子量が１００，０００〜３００，０００Ｄａの範囲の前記組成物の前記ポリサッカライドが、１：３〜１３：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２１）
前記比がおよそ１：７．３：２．９である、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
分子量が３００，０００〜１，０００，０００Ｄａの範囲の前記組成物の前記ポリサッカライドが、１：５〜１５：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２３）
前記比がおよそ１：９．９：３．１である、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
分子量が１，０００，０００Ｄａより大きい前記組成物の前記ポリサッカライドが、１：５〜１５：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２５）
前記比がおよそ１：１０．３：２．９である、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
少なくとも１０μｇ／Ｌの可溶性ポリペプチドを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２７）
１０〜１０００μｇ／Ｌの範囲の可溶性ポリペプチドを含む、項目１に記載の組成物。
（項目２８）
項目１〜２７のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、以下の工程：
ｉ）真菌を液体増殖培地で培養する工程と、
ｉｉ）該液体増殖培地から該組成物を精製する工程と
を包含する、方法。
（項目２９）
前記精製が、分子量が少なくとも１０，０００Ｄａであるポリサッカライドを、その他のポリサッカライドから分離する工程を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記分離を超遠心分離、限外濾過、微細濾過またはゲル濾過によって行う、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
医薬として使用するための、項目１に記載の組成物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
（項目３２）
ｉ）免疫無防備状態と診断された、および／または、
ｉｉ）免疫無防備状態になる危険のある、および／または、
ｉｉｉ）手術または病気から回復中であり、かつ、免疫無防備状態になる危険のある、および／または
ｉｖ）後天性免疫不全症候群と診断されたか、もしくは後天性免疫不全症候群になる危険のある、
個体を処置する方法であって、
該個体に、該免疫無防備状態もしくは該症候群を処置するのに、または予防的に処置するのに、あるいは、該個体の免疫系をブーストするのに有効な量の項目１に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目３３）
前記免疫無防備状態が、感染症、寄生虫病、ヘモフィルス髄膜炎、肺炎球菌性髄膜炎、連鎖球菌性髄膜炎、ブドウ球菌性髄膜炎、その他の生物による髄膜炎、脳炎、ウイルス性肺炎、肺炎球菌性肺炎、その他の細菌性肺炎、細菌を除くその他の特定の生物による肺炎、気管支肺炎、生物非特異性肺炎、インフルエンザ、詳細不明の下痢、詳細不明の肝炎、肝臓の急性および亜急性壊死、慢性肝炎ならびに肝臓膿腫からなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記免疫無防備状態が、コレラ、サルモネラ、細菌性赤痢、大腸菌、その他の特定の細菌による腸内感染、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウイルス性胃腸炎、感染性大腸炎、腸炎および胃腸炎、感染性下痢症、結核、リステリア症、パスツレラ症、マイコバクテリア、ジフテリア、百日咳、髄膜炎菌、連鎖球菌敗血症、ブドウ球菌敗血症、肺炎球菌敗血症、嫌気性菌による敗血症、その他のグラム陰性生物による敗血症、放線菌感染、ガス壊疽、トキシックショック症候群、壊死性筋膜炎、フリードレンデル杆菌、インフルエンザ菌、シュードモナス、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ感染、急性灰白髄炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、亜急性硬化性全脳炎、進行性多病巣性白質脳障害、中枢神経系の詳細不明のスローウイルス感染、コクサッキーウイルス、詳細不明のウイルス性髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎、詳細不明のウイルス性脳炎、水痘、帯状疱疹、単純ヘルペス、ウイルス性Ａ型肝炎、ウイルス性Ｂ型肝炎、その他の特定のウイルス性肝炎、慢性肝炎、肝臓の膿腫／急性壊死、伝染性単核球症、巨細胞性封入体病、クラミジア、アデノウイルス、ウイルス感染、梅毒、カンジダ、詳細不明のヒストプラスマ症、アスペルギルス症、クリプトコックス症、真菌症、糞線虫症、腸管寄生、トキソプラスマ症、サルコイドーシス、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ポリオ後症候群、ヘモフィルス髄膜炎、肺炎球菌性髄膜炎、連鎖球菌性髄膜炎、ブドウ球菌性髄膜炎、脳炎、アデノウイルスによる肺炎、ＲＳウイルスによる肺炎、パラインフルエンザウイルスによる肺炎、その他のウイルスによる肺炎、ウイルス性肺炎、肺炎球菌性肺炎、肺炎杆菌による肺炎、シュードモナスによる肺炎、インフルエンザ菌による肺炎、連鎖球菌による肺炎、ブドウ球菌による肺炎ならびに細菌性肺炎によって引き起こされるかまたはそれらから選択される感染病または寄生虫病である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記個体がヒトを含めた哺乳類である、項目３２に記載の方法。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（定義）
ポリサッカライド：本明細書において用語「ポリサッカライド」とは、ポリサッカライド、ならびにペプチド、ポリペプチドなどを含有するポリサッカライド、および／またはペプチド、ポリペプチドなどと共有結合しているポリサッカライド（例えば、プロテオポリサッカライド）を包含する。
【００１７】
モノサッカライドを含むポリサッカライド：ポリサッカライドは、モノサッカライドを含むと言われ、ここでこのモノサッカライドは共有結合してこのポリサッカライドを形成する。ポリサッカライドを加水分解すると、このポリサッカライドを形成していたモノサッカライドが遊離形態で生じる。したがって、ポリサッカライドのモノサッカライド含量は、ポリサッカライドを加水分解し、個々のモノサッカライドの存在を測定することによって決定できる。ポリサッカライドの混合物のモノサッカライド含量は、混合物全体でのモノサッカライド含量を決定することによって決定される。
【００１８】
比：ポリサッカライドまたはポリサッカライドの混合物は、所定の比でガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含み、このポリサッカライドまたはこのポリサッカライドの混合物を加水分解すると、この所定の比のガラクトースと、マンノースと、グルコースとが生じるといわれる。１：ａ〜ｂ：ｃ〜ｄの比のガラクトースと、マンノースと、グルコースとは、ガラクトース１部ごとに、マンノースがａ〜ｂ部の範囲で存在し、グルコースがｃ〜ｄ部の範囲で存在し、ここで、ａ、ｂ、ｃおよびｄは数値を示すということを意味する。したがって、一例として、１：５〜２５：１〜５０の比でガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むポリサッカライド混合物とは、ガラクトース１部ごとに、ポリサッカライド混合物が５〜２５部の範囲のマンノースと、１〜５０部の範囲のグルコースとを含むことを意味する。
【００１９】
分子量：組成物が所定の値の分子量カットオフをもたらす濾過工程を用いて精製されている場合には、この組成物のどのポリサッカライドも、少なくともこの所定の値の分子量を有するといわれる。同様に、組成物が範囲のうちの低い値である低い分子量カットオフと、範囲のうちの高い値である高い分子量カットオフをもたらす、１以上の濾過工程に供されている場合には、この組成物のどのポリサッカライドも所定の範囲内の分子量を有するといわれる。この濾過工程は、例えば、限外濾過、微細濾過、超遠心分離またはゲル濾過であり得る。しかし、他の方法によっても、どのポリサッカライドも少なくとも所定の値の分子量を有するか、またはどのポリサッカライドも所定の範囲内の分子量を有するといわれる組成物を調製することもできる。
【００２０】
ポリペプチド：本明細書において用語「ポリペプチド」とは、タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドを包含し、このタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドは翻訳後修飾されている場合も、されていない場合もある。翻訳後修飾は、例えば、リン酸化、メチル化、グルコシル化であり得る。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
（組成物）
本発明による組成物は、１種以上のポリペプチドと、ポリサッカライドの混合物とを含む。このポリペプチドは、ポリサッカライドと場合により共有結合していてもよい。しかし、このポリペプチドがこのポリサッカライドと会合していないか、またはこのポリペプチドがこのポリサッカライドと非共有結合様式で会合していることも本発明内にも含まれる。
【００２２】
したがって、本組成物は、プロテオポリサッカライドである場合もそうでない場合もあるポリサッカライドを含むか、または本組成物は両方の混合物を含む場合もある。
【００２３】
本発明による組成物は、単離または精製された組成物である。すなわち、本発明の組成物は１以上の精製工程に供されている。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、真菌の菌糸体の液体増殖培地から、サイズ分画を含む少なくとも１つの精製工程を用いて精製されている。精製法は以下により詳細に説明する。
【００２４】
好ましい実施形態では、本組成物は、ポリサッカライドと、必要に応じてポリペプチドとから本質的になる。本組成物は、ポリサッカライドと、ポリペプチドとから本質的になることがより好ましい。本組成物は液体組成物であることが多く、その結果、本組成物は、塩とバッファーとを必要に応じて含む水溶液に溶解させた、ポリサッカライドと、必要に応じてポリペプチドとから本質的になることが好ましい。
【００２５】
本発明の組成物のポリサッカライドは、モノサッカライドであるグルコースと、マンノースと、ガラクトースとを含むことが好ましい。本発明の組成物内に含まれ得るポリサッカライドおよびポリペプチドの例としては、β−（１，３），β−（１，６）Ｄ−グルカン、シゾフィラン、グリフォラン、コリオラン（ｃｏｒｉｏｌａｎ）およびコリオラス・ベルシカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）グリコシル化ポリペプチド、例えば、ＰＳＫおよびＰＳＰ、α−マンナンと会合しているポリペプチド、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓから単離できるＫＳ−２、およびガノデルマ・ルシダム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）から単離できるレイシ（ｒｅｉｓｈｉ）；グルクロノキシロマンナン；マンノグルカン；グルコマンナン；ガラクトグルカンおよび／またはガラクトグルコマンナンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２６】
（真菌）
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に開示される組成物は、真菌によって産生されている。本組成物は、真菌の細胞外環境から精製されていることが好ましい。真菌、好ましくは、真菌の菌糸体が、液体増殖培地中で培養されており、この組成物がこの液体増殖培地から精製されていることがさらにより好ましい。
【００２７】
したがって、本発明の組成物は、
ｉ）液体増殖培地中で真菌、例えば、真菌の菌糸体を培養する工程と、
ｉｉ）この液体増殖培地からこの組成物を単離する工程と
を包含する方法によって生産されていることが好ましい。
【００２８】
真菌の菌糸体とは、液中培養において増殖させることができる任意の真菌バイオマスを意図する。真菌バイオマスは、単一菌糸、胞子、菌糸体の集合体および部分分化した菌糸体の形であり得る。
【００２９】
液体増殖培地は、本明細書において以下に記載する液体増殖培地のいずれかであり得る。
【００３０】
この真菌は、任意の真菌であり得、真菌の菌糸体を形成する真菌が好ましく、この真菌は糸状菌であることがより好ましい。この真菌は、以下からなる群より選択されることがさらにより好ましい：
【００３１】
【表１Ｃ】
真菌は、以下からなる群より選択されることがさらにより好ましい：
【００３２】
【表１Ｄ】
別の好ましい実施形態では、この真菌はＡｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉである。別の好ましい実施形態では、この真菌はＧａｎｏｄｅｒｍａ（例えば、Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）である。別の好ましい実施形態では、この真菌はＡｇａｒｉｃｕｓの真菌であり、例えば、Ａ．ｂｌａｚｅｉ、Ａ．ｂｌａｚｅｉ Ｍｕｒｉｌｌ、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ａ．ｈｏｒｔｅｎｓｉｓ、Ａ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓからなる群より選択される。
【００３３】
本発明の極めて好ましい実施形態では、真菌は担子菌綱、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ属の真菌、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓに属する。
【００３４】
【表１Ｅ】
（免疫系の調節）
本発明による組成物は、免疫調節性であることが好ましく、本組成物は免疫賦活性であることが好ましい。免疫系の刺激は、例えば、抗体産生の増加によって、ヘルパーＴ細胞の活性化によって、またはインターロイキン１およびインターロイキン２などのインターロイキンの産生の増加によって実証できる。
【００３５】
組成物が免疫調節性であるかどうかを試験するのに適している、当業者に公知の任意のアッセイを使用して本発明の組成物が免疫調節性であるかどうかを試験してもよい。このようなアッセイはインビトロアッセイであってもインビボアッセイであってもよい。
【００３６】
１つの好ましいアッセイとして、組成物がＩＬ−１産生、例えば、ＩＬ１−α産生および／またはＩＬ１−β産生を誘導できるかどうかを調べることがある。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明による組成物は、インビトロアッセイにおいて少なくとも１種のＩＬ−１産生細胞からＩＬ−１産生を誘導できる。この細胞は任意のＩＬ−１産生細胞、例えば、Ｐ３８８マウスマクロファージ細胞であり得る。この細胞はＩＬ１−β産生細胞であることが好ましい。ＩＬ−１産生は、任意の適したアッセイを用いて決定することができる。一般に、特異的ＩＬ−１抗体、例えば、特異的ＩＬ１−α抗体および／またはＩＬ１−β抗体の使用を含むアッセイが有用である。このようなアッセイは、例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡまたは同様のアッセイであり得る。このアッセイは、実施例４に記載のとおり実施できる。
【００３７】
ＩＬ１アッセイを較正することは困難であるので、アッセイは、参照として特定の組成物を用いて実施することが好ましい。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、組成物は、並行して実施される参照実験において市販の注射用レンチナン（Ｅｕｒｅｋａ Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｔｙ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｓｔｒｅｅｔ．Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ ３０００，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて誘導されたＩＬ−１αの量よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも６倍、例えば少なくとも８倍、例えば少なくとも１０倍、例えば少なくとも１５倍、例えば少なくとも２０倍、例えば少なくとも３０倍、例えば、少なくとも４０倍多いＩＬ１−αの産生を誘導できる。本発明の好ましい一実施形態では、本組成物は、並行して実施される参照実験においてＥｕｒｅｋａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｔｙ．社製の注射用レンチナンを用いて誘導されたＩＬ１−βの量よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも６倍、例えば少なくとも８倍、例えば少なくとも１０倍、例えば少なくとも１５倍、例えば少なくとも２０倍多いＩＬ−１βの産生を誘導できる。上記のアッセイは、実施例４に記載のとおりに実施されることが好ましい。本組成物が上記のようにＩＬ１αとＩＬ１β双方の産生を誘導したことが最も好ましい。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、本組成物は、哺乳類に投与すると、この哺乳類において抗体産生を増強できる。哺乳類は、例えば、マウス、ラット、ウサギまたはヒトでさえあり得る。このようなアッセイは、必要に応じてアジュバントの存在下で、抗原の投与に先立って、および抗原の投与と同時に哺乳類に組成物を投与することによって実施することが好ましい。本組成物は、抗原の投与に先立って、１〜３０日間の範囲で、好ましくは、１〜１０日間の範囲で、より好ましくは、１〜３日間の範囲で投与されることが好ましい。その後、哺乳類における抗体産生を決定することができる。本組成物は、この組成物を投与せずに産生される抗体量と比較して、少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍、さらにより好ましくは少なくとも２．５倍、例えば少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、例えば６倍多い抗体の産生を誘導できることが好ましい。このようなアッセイの一例が実施例６に概説されている。
【００３９】
本組成物は、１より多くのアッセイ系において、例えば、本明細書において上記で記載した、いずれかのアッセイ系の組合せにおいて免疫調節性であることが好ましい。
【００４０】
好ましい一実施形態では、本発明の組成物は、ＴＮＦ−α産生を増大するよう作用し、これは、例えば、実施例９に記載されるアッセイによって測定できる。
【００４１】
（モノサッカライド含量）
本発明による組成物は、ポリサッカライドを含むことが好ましく、ここで、ポリサッカライドの大部分、好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、さらにより好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％、さらにより好ましくは、本質的にすべてのポリサッカライド、最も好ましくは、どのポリサッカライドも、１０，０００Ｄａを上回る、好ましくは、３０，０００Ｄａを上回る、より好ましくは、４０，０００Ｄａを上回る、さらにより好ましくは、５０，０００Ｄａを上回る、例えば、少なくとも１００，０００Ｄａ、例えば、少なくとも３００，０００Ｄａ、例えば、少なくとも１，０００，０００Ｄａの分子量を有する。本発明の一実施形態では、組成物のポリサッカライドの大部分、好ましくは、組成物のどのポリサッカライドも、１０，０００〜３，０００，０００Ｄａの範囲内の、例えば、３０，０００〜３，０００，０００の範囲内、例えば、４０，０００〜３，０００，０００の範囲内、例えば、５０，０００〜３，０００，０００の範囲内、例えば、５０，０００〜１００，０００の範囲の、例えば、１００，０００〜３００，０００の範囲の、例えば、３００，０００〜１，０００，０００の範囲の、例えば、１，０００，０００〜３，０００，０００の範囲の分子量を有する。
【００４２】
本組成物は、少なくとも１つのサイズ分画工程を含む方法によって精製されていることが好ましい。したがって、本組成物は、所定のカットオフを上回る名目分子量を有する分子（例えば、ポリサッカライド）が、このカットオフを下回る名目分子量を有する分子（例えば、ポリサッカライド）から分離される、少なくとも１つのサイズ分画工程を用いて精製されていることが好ましい。一例として、サイズ分画が限外濾過または微細濾過である場合には、このカットオフを有する膜を使用できる。サイズ分画がゲル濾過である場合には、この分子量カットオフを有するゲルを選択してもよいし、または特定の溶出画分を使用してもよい。本発明の一実施形態では、カットオフが、好ましくは、１０，０００Ｄａ、より好ましくは、３０，０００Ｄａ、さらにより好ましくは、４０，０００Ｄａ、いっそうより好ましくは、５０，０００Ｄａである、より大きな分子量の画分を用いる。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、本組成物は、得られる画分が、所定のカットオフを下回りかつ所定のカットオフを上回る名目分子量を有するポリサッカライドを含む、１以上のサイズ分画工程を含む方法によって精製されている。一例として、サイズ分画が限外濾過または微細濾過である場合には、下の分子量カットオフを有する膜を用いる最初の１回の分画工程を実施できる。より大きな分子量の画分を回収し、上の分子量カットオフを有する膜を用いる第２の限外濾過または微細濾過に供することができる。第２の濾過工程の後、より小さい分子量の画分を回収すればよい。ゲル濾過を用いる場合には、特定の溶出画分を使用してもよい。超遠心分離を用いる場合には、下の分子カットオフを有する膜と上の分子量カットオフを有する膜とを使用できる。
【００４４】
本発明の組成物はポリサッカライドの混合物を含み、この混合物は１：５〜２５：１〜５０の比のモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む。したがって、この比は、ポリサッカライドの混合物全体内の比を反映する。したがって、混合物内の個々のポリサッカライド各々が異なる比のモノサッカライドを含むことは可能である。
【００４５】
一般に、この比は、ポリサッカライドの混合物全体をモノサッカライドに分解し、続いて、このモノサッカライド各々の濃度を測定することによって決定できる。ポリサッカライドは、加水分解によって、例えば、ＨＣｌなどの強酸中での加水分解によって、その構成モノサッカライドに分解できる。加水分解産物は、当業者が利用できる任意の従来法、例えば、ＨＰＬＣ、質量分析法またはＮＭＲによって分析され得る。
【００４６】
本発明の一実施形態では、ポリサッカライドはモノサッカライドであるグルコースとマンノースとを含む。本発明の別の実施形態では、ポリサッカライドは、モノサッカライドであるグルコースとガラクトースとを含む。本発明の好ましい実施形態では、本組成物のポリサッカライドは、モノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む。
【００４７】
ポリサッカライドの混合物が、ガラクトース１部ごとに、５〜２５部の範囲の、好ましくは、５〜２０部の範囲の、より好ましくは、５〜１７部の範囲の、さらにより好ましくは、６〜１５部の範囲の、さらにより好ましくは、７〜１４部の範囲の、例えば、１０〜１７部の範囲の、例えば、１１〜１６部の範囲の、例えば、１２〜１５部の範囲の、例えば、１３〜１４部の範囲の、例えば、およそ１３．４±０．４部、例えば、１３．４±０．４部のマンノースを含むことが好ましい。
【００４８】
ポリサッカライドの混合物が、ガラクトース１部ごとに、１〜５０部の範囲の、好ましくは、１〜４０部の範囲の、より好ましくは、１〜３０部の範囲の、さらにより好ましくは、１〜２５部の範囲の、さらにより好ましくは、１〜２０部の範囲の、さらにより好ましくは、２〜１５部の範囲の、さらにより好ましくは、２〜１４部の範囲の、例えば、８〜１７部の範囲の、例えば、９〜１６部の範囲の、例えば、１０〜１５部の範囲の、例えば、１１〜１４部の範囲の、例えば、およそ１２．６±１．３部、例えば、１２．６±１．３部のグルコースを含むことが好ましい。
【００４９】
混合物が本明細書において上記で示されるマンノース対ガラクトースの比と、本明細書において上記で示されるグルコース対ガラクトースの比とを含むことがさらにより好ましい。
【００５０】
本発明の実施形態では、ポリサッカライドは、マンノースとグルコースとを含む場合には、それらが、マンノース１部ごとに、０．１〜３０部の範囲の、例えば、０．１〜０．２５部の範囲の、例えば、０．２５〜０．５部の範囲の、例えば、０．５〜０．７５部の範囲の、例えば、０．７５〜１部の範囲の、例えば、１〜５部の範囲の、例えば、５〜１０部の範囲の、例えば、１０〜２０部の範囲の、例えば、２０〜３０部の範囲のグルコースを含むことが好ましい。ポリサッカライドは、マンノース１部ごとに、０．５〜２部の範囲のグルコースを含むことが好ましく、１３．４±０．４部のマンノース、１２．６±１．３部のグルコースを含むことがより好ましい。
【００５１】
本発明の極めて好ましい実施形態では、本組成物は、１：５〜２５：１〜５０、より好ましくは、１：１３．４±０．４：１２．６±１．３の比のモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むポリサッカライドの混合物を含む。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、本組成物はポリサッカライドの混合物を含み、５０，０００〜１００，０００の範囲の分子量を有するこの混合物内のポリサッカライドは、ガラクトース１部ごとに、３〜１５部の範囲の、好ましくは、４〜１４部の範囲の、より好ましくは、５〜１３部の範囲の、さらにより好ましくは、６〜１２部の範囲の、さらにより好ましくは、７〜１１部の範囲の、さらにより好ましくは、７．９〜９．９部の範囲の、例えば、およそ８．９部のマンノースを含む。この実施形態では、５０，０００〜１００，０００の範囲の分子量を有するポリサッカライドは、ガラクトース１部ごとに、１〜５部の範囲、好ましくは、２〜４部の範囲、さらにより好ましくは、２．５〜３．５部の範囲、例えば、およそ２．９部のグルコースを含むことが好ましい。５０，０００〜１００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するこの組成物のポリサッカライドは、１：４〜１４：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むことが好ましい。この比は、およそ１：８．９：２．９であることが好ましい。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、組成物は、ポリサッカライドの混合物を含み、１００，０００〜３００，０００の範囲の分子量を有するこの混合物内のポリサッカライドは、ガラクトース１部ごとに、３〜１５部の範囲の、好ましくは、３〜１４部の範囲の、より好ましくは、３〜１３部の範囲の、さらにより好ましくは、３〜１２部の範囲の、なおより好ましくは、４〜１１部の範囲、さらにより好ましくは、５〜１０部の範囲の、なおより好ましくは、６．３〜８．３部の範囲の、例えば、およそ７．３部のマンノースを含む。この実施形態では、１００，０００〜３００，０００の範囲の分子量を有するポリサッカライドが、ガラクトース１部ごとに、１〜５部の範囲の、好ましくは、２〜４部の範囲の、さらにより好ましくは、２．５〜３．５部の範囲、例えば、およそ２．９部のグルコースを含むことが好ましい。５０，０００〜１００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するこの組成物のポリサッカライドが、１：３〜１３：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むことが好ましい。この比はおよそ１：７．３：２．９であることが好ましい。
【００５４】
本発明の別の実施形態では、本組成物はポリサッカライドの混合物を含み、３００，０００〜１，０００，０００の範囲の分子量を有するこの混合物内のポリサッカライドは、ガラクトース１部ごとに、３〜１６部の範囲の、好ましくは、５〜１５部の範囲の、より好ましくは、５〜１４部の範囲の、さらにより好ましくは、６〜１３部の範囲の、なおより好ましくは、７〜１２部の範囲の、さらにより好ましくは、８．９〜１０．９部の範囲の、例えば、およそ９．９部のマンノースを含む。この実施形態では、３００，０００〜１，０００，０００の範囲の分子量を有するポリサッカライドが、ガラクトース１部ごとに、１〜５部の範囲の、好ましくは、２〜４部の範囲の、さらにより好ましくは、２．５〜３．５部の範囲の、例えば、およそ３．１部のグルコースを含むことが好ましい。３００，０００〜１，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するこの組成物のポリサッカライドが、１：５〜１５：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むことが好ましい。この比はおよそ１：９．９：３．１であることが好ましい。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、本組成物は、ポリサッカライドの混合物を含み、少なくとも１，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するこの混合物内のポリサッカライドが、ガラクトース１部ごとに、３〜１７部の範囲の、好ましくは、４〜１６部の範囲の、より好ましくは、５〜１５部の範囲の、さらにより好ましくは、６〜１４部の範囲の、なおより好ましくは、７〜１３部の範囲の、さらにより好ましくは、８〜１２部の範囲の、さらにより好ましくは、９．３〜１１．３部の範囲の、例えば、およそ１０．３部のマンノースを含む。この実施形態では、少なくとも１，０００，０００の分子量を有するポリサッカライドが、ガラクトース１部ごとに、１〜５部の範囲の、好ましくは、２〜４部の範囲の、さらにより好ましくは、２．５〜３．５部の範囲の、例えば、およそ２．９部のグルコースを含むこと好ましい。少なくとも１，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有するこの組成物のポリサッカライドが、１：４〜１：５〜１５：１〜５の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むことが好ましい。この比はおよそ１：１０．３：２．９であることが好ましくい。
【００５６】
一実施形態では、本発明によるポリサッカライドは、１：１０〜２０：３０〜５０、例えば、１：１２〜１８：３５〜４５、例えば、１：１４〜１６：３８〜４２．例えば、１：約１５：約４０、例えば、１：１５：４０というガラクトース：マンノース：グルコースのモル比を有する。
【００５７】
したがって、一実施形態では、組成物ポリペプチドは、１：０〜２５：１〜５０、例えば、１：１０〜２０：３０〜５０、例えば、１：１２〜１８：３５〜４５、例えば、１：１４〜１６：３８〜４２、例えば、１：約１５：約４０、例えば、１：１５：４０という比（ガラクトース：マンノース：グルコース）でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む。
【００５８】
別の一実施形態では、本発明によるポリサッカライドは、１：０．５〜５：６〜１２、例えば、１：１〜４：７〜１１、例えば、１：１．５〜３．５：７．５〜１０、例えば、１：２．０〜３．０：７．５〜９．５、例えば、１：２．２〜２．８：８．０〜９．０、例えば、１：約２．５：８．０〜９．０、例えば、１：２．５：８．０〜９．０、例えば、１：２．５：８．６というガラクトース：マンノース：グルコースのモル比を有する。
【００５９】
本発明の組成物の２つの好ましい実施形態は、１：１２：４０および１：３：５というガラクトース：マンノース：グルコースのモル比を有する。
【００６０】
本発明の好ましい一実施形態では、糖組成物はアガリクス・ブラゼイ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ）から入手可能であり、１０〜２０部のマンノースと、３０〜５０部のグルコースと、０〜２部のガラクトースとを（例えば、１１〜１７部のマンノースと、３５〜４５部のグルコースと、０〜１部のガラクトースとを）含む。糖組成物はアガリクス・ブラゼイ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ）から入手可能であり、約１５部のマンノースと、約４０部のグルコースと約１部のガラクトースとを含むことがより好ましく、ここで、「約」とは、示した値から２０％以内の差、例えば、示した値から１０％以内の差、例えば、示した値から５％以内の差を意味する。
【００６１】
本発明の別の好ましい実施形態では、糖組成物はガノダーマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）から入手可能であり、０．５〜５部のマンノースと、４〜１５部のグルコースと、０〜２部のガラクトースとを（例えば、２〜３部のマンノースと、７〜９．５部のグルコースと、０．５〜１．５部のガラクトースとを）含む。糖組成物は、ガノダーマ（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）から入手可能であり、約２．５部のマンノースと、約８．６部のグルコースと、約１部のガラクトースとを含むことがより好ましく、ここで、「約」とは、示した値から２０％以内の差、例えば、示した値から１０％以内の差、例えば、示した値から５％以内の差を意味する。
【００６２】
所定の範囲内の分子量を有するポリサッカライドのモノサッカライド含量の決定は、（例えば、限外濾過、微細濾過、超遠心分離またはゲル濾過により）組成物をサイズによって分画することによって決定できる。これは、例えば、実施例２に記載のとおり行うことができる。
【００６３】
ポリサッカライドの混合物が、モノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを（０〜１．５）：（０〜０．５）〜（１５〜３５）：（０．５〜１．５）〜（４５〜５５）の比（例えば、以下のいずれか）で含むことが好ましい：
【００６４】
【表１Ｆ】
本発明の別の実施形態では、本発明の組成物の糖組成物は、１〜２５部のマンノースと、５〜４５部のグルコースと、０〜１．５部のガラクトースとを含み（本明細書において「部」とは、相対的なモル比、すなわち、１〜２５モルのマンノースごとに、５〜４５モルのグルコースと、０〜１．５モルのガラクトースとが存在することを意味する）、したがって、糖組成物は以下の通りにＡ）と、Ｂ）と、Ｃ）とを含み得る：
Ａ）以下からなる群から選択されるマンノースの１つの量：
１〜２５部
１〜２０部
１〜１５部
１〜１０部
１〜４部
１〜３部
１．５〜２．５部
４〜６部
７〜１５部
７〜２３部
９〜１９部
１２〜２０部
１０〜２５部
１２〜１７部
１４〜１６部
および
Ｂ）以下からなる群から選択されるグルコースの１つの量：
５〜４５部
５〜１３部
７〜１３部
７〜１５部
８〜１５部
８〜１２部
８〜１０部
８〜９部
８．４〜８．７部
８．６部
１０〜２０部
２０〜３０部
３０〜４０部
３０〜４５部
３５〜４５部
３５〜４２部
３７〜４５部
３９〜４１部
４０部
および
Ｃ）以下からなる群から選択されるガラクトースの１つの量：
０〜１．５部
０．２〜１．２部
０．７〜１．５部
０〜０．２
０〜１部
０部
１部
１〜１．５部。
【００６５】
（本発明の好ましい実施形態）
本発明の一実施形態では、１種以上のポリペプチドと、ポリサッカライドの混合物とを含み、
ａ）組成物のポリサッカライドの大部分が少なくとも３０，０００Ｄａの分子量を有し、このポリサッカライドの混合物が１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
ｂ）組成物のポリサッカライドの大部分が少なくとも１００，０００Ｄａの分子量を有し、このポリサッカライドの混合物が０〜０．５：０．５〜１０：０．５〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含むか、
または
ｃ）組成物のポリサッカライドの大部分が少なくとも１，０００Ｄａの分子量を有し、このポリサッカライドの混合物が１：０〜２５：１〜５０の比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む組成物を提供する。
【００６６】
したがって、本発明の一実施形態では、組成物のポリサッカライドの大部分は、少なくとも１０，０００Ｄａ、好ましくは、少なくとも３０，０００Ｄａの分子量を有し、このポリサッカライドの混合物は、１：０〜２５：１〜５０の比、例えば、以下のいずれかの比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む：
１：０〜１５：１〜２５、
１：１５〜２５：１〜２５、
１：０〜２５：２５〜５０、
１：１５〜２５：２５〜５０、
１：０〜７：１〜５０、
１：０〜７：１〜２５、
１：７〜１５：１〜５０、
１：７〜１５：４０〜５０、
１：０〜２５：１〜４０、
１：０〜２５：２５〜４０、
１：０〜１０：１〜５０。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、本組成物のポリサッカライドの大部分は、少なくとも１，０００Ｄａ、例えば、少なくとも５，０００Ｄａ、例えば、少なくとも１０，０００Ｄａ、例えば、少なくとも２０，０００Ｄａ、例えば、少なくとも４０，０００Ｄａ、例えば、少なくとも５０，０００Ｄａ、例えば、少なくとも６０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、例えば、少なくとも８５，０００Ｄａ、最も好ましくは、少なくとも１００，０００Ｄａの分子量を有し、このポリサッカライドの混合物は、０〜０．５：０．５〜１０：０．５〜５０の比、例えば、以下のいずれかの比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む：
【００６８】
【表１Ｇ】
この比は約０：１：１８または約０：１：１であることが好ましい。
【００６９】
本発明の別の実施形態では、組成物のポリサッカライドの大部分は、少なくとも５００Ｄａ、例えば少なくとも８００Ｄａ、例えば少なくとも１，０００Ｄａ、例えば少なくとも５，０００Ｄａ、例えば少なくとも１０，０００Ｄａ、例えば少なくとも２０，０００Ｄａ、例えば少なくとも４０，０００Ｄａ、例えば少なくとも５０，０００Ｄａ、例えば少なくとも６０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、例えば少なくとも８５，０００Ｄａ、例えば少なくとも１００，０００Ｄａ、最も好ましくは少なくとも１，０００Ｄａの分子量を有する；このポリサッカライドの混合物は、１：０〜２５：１〜５０の比、例えば、以下のいずれかの比でモノサッカライドであるガラクトースと、マンノースと、グルコースとを含む。
【００７０】
【表１Ｈ】
この比は約１：１２：４０または約１：３：５であることが好ましい。
【００７１】
（ポリペプチド）
本発明による組成物は、ポリペプチドを含むことが好ましい。本明細書において、用語ポリペプチドとは、タンパク質と、ペプチドおよびポリペプチドの両方を包含する。このポリペプチドは遊離型であってもよく、それらはポリサッカライドと共有結合していてもよく、または、ポリサッカライドまたは上記の混合物と非共有結合によって会合していてもよい。
【００７２】
本組成物は、本組成物の経口投与を可能にするのに十分なポリペプチドを含むことが好ましい。本組成物があまりにも少ないポリペプチドしか含まない場合には、個体に本組成物を経口投与した後に、この個体において免疫調節が全く得られないかまたはほとんど得られない。したがって、本発明の組成物は、少なくとも１０μｇ／Ｌ、より好ましくは、少なくとも２０μ／Ｌ、さらにより好ましくは、少なくとも２５μｇ／Ｌ、例えば、１０〜１０００μｇ／Ｌの範囲、例えば、２０〜１０００μｇ／Ｌの範囲の、例えば、２５〜１０００μｇ／Ｌの範囲の、例えば、２５〜１００μｇ／Ｌの範囲の、例えば、２５〜３５μｇ／Ｌの範囲のポリペプチド、好ましくは、可溶性ポリペプチドを含むことが好ましい。上記の濃度のポリペプチドを含む組成物は０．１〜２ｍｇ／ｍｌの範囲の、より好ましくは、０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌの範囲の、さらにより好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌのポリサッカライドを含むことが好ましい。本組成物が多かれ少なかれポリサッカライドを含む場合には、ポリペプチドの量は比例的に低減されるか、高められることが好ましい。
【００７３】
（組成物の調製方法）
本発明の組成物は、
ｉ）液体増殖培地中で真菌を培養する工程と、
ｉｉ）この液体増殖培地からこの組成物を精製する工程と
を包含する方法によって調製されることが好ましい。
【００７４】
一般に、液体増殖培地中で真菌を培養することは、この真菌の増殖に必要な栄養化合物を水に溶解することと、溶液をバイオリアクターに移すことと、バイオリアクターに、培養しようとする真菌の細胞または胞子、例えば、真菌の菌糸体、またはその画分を接種することを含む。これは無菌条件下で行われ、真菌に適した化学的および物理的環境を与えるよう環境を制御する。液体増殖培地中で真菌を培養することはまた、「液状」培養とも呼ばれる。
【００７５】
「液状」培養の間、真菌バイオマスを含む培地を、撹拌して勾配の発生を低減し、液中の細胞の酸素の利用可能性を確実にすることが好ましい。真菌をバイオリアクター中で増殖させる場合には、既知の方法によって酸素を液体培地に供給でき、溶存酸素レベルを制御できる。
【００７６】
液体増殖培地は水溶液であり、好ましくは、栄養化合物を含む滅菌水である。液体培地は真菌増殖を支援し、好ましくは、細胞外化合物、例えば、免疫調節物質の産生を刺激する。液体増殖培地には、微生物の増殖に必要な１種以上の代表的な成分、例えば、麦芽抽出物、酵母抽出物、ペプトン、グルコース、スクロース、スクロース、リン酸塩を提供する塩、マグネシウムおよびカリウム、コーンスティープリカーおよびチアミンなどのビタミンを含めることができる。培地は、菌糸体増殖およびポリサッカライドの産生のために、スクロース、コーンスティープリカー、リン酸塩およびマグネシウムを含むことがより好ましい。
【００７７】
増殖培地の接種には、例えば、麦芽抽出物、酵母抽出物、ペプトンおよびグルコースを含有する寒天プレートから得た真菌の菌糸体、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ菌糸体を使用できる。まず、真菌を、真菌の増殖を支援する上記の栄養化合物を含む寒天プレート上で培養できる。このプレートに菌糸体を接種し、プレート上で少なくとも可視的増殖が明らかとなるまでインキュベートする。これは、真菌によっては、通常、１８〜３２℃の範囲の、好ましくは、２２℃〜３０℃の領域の温度、例えば、約２３℃〜２７℃の温度、例えば、およそ２５℃で、約７日間〜約２４日間、または約１０日間〜３０日間、代表的には、１４日間または最大２０日間かかる場合がある。
【００７８】
寒天プレートから得た菌糸体での接種の代替法として、例えば、細胞増殖を支援する栄養化合物を含む振盪フラスコ培地中の発酵ブロスから得た菌糸体を用いることによって増殖培地の接種を行うことができる。まず、真菌の菌糸体を培養するための振盪フラスコに菌糸体を接種でき、これを寒天プレート上で培養する。このプレートから菌糸体を採取し、真菌の菌糸体増殖を支援する溶解した栄養化合物と栄養塩とを含む滅菌水を含む振盪フラスコに無菌的に移す。代表的な増殖培地は、スクロース、コーンスティープリカー、リン酸塩およびマグネシウムを含む。細胞外レンチナンの最大の産生をもたらす接種材料の量は、以下の初期実験の後に選択できる。
【００７９】
振盪フラスコのインキュベーション時間は、特定の真菌に応じて変わる。代表的に、振盪フラスコは、１８から３２℃の範囲の、好ましくは２２〜３０℃の領域の温度、例えば、約２３℃、例えば、２４℃、例えば、２５℃、例えば、２６℃、例えば、２７℃、例えば、２８℃、例えば、２９℃、例えば、３０℃の温度で、６〜２１日間、好ましくは、７〜１８日間、より好ましくは、８〜１４日間振盪することによってインキュベートすればよい。また、振盪フラスコは、８〜２５日間、より好ましくは、１０〜２０日間、より好ましくは、１２〜１８日間インキュベートしてもよい。また、温度は１８〜３７℃、好ましくは、２３〜３２℃、例えば、約２５℃であってもよい。
【００８０】
振盪フラスコの内容物を、バイオリアクターの接種に使用できる。その場合には、リアクターには、担子菌の菌糸体、またはその画分、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ属真菌の菌糸体、例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓの単培養のための、栄養化合物と栄養塩との滅菌水溶液を含める。
【００８１】
バイオリアクター発酵期間は、代表的に、５０時間〜３００時間の範囲、好ましくは、８０時間〜２７０時間の範囲であり、温度は１８〜３２℃の範囲の、好ましくは、２２〜３１℃の領域の、例えば、約２３℃の温度、例えば、２４℃、例えば、２５℃、例えば、２６℃、例えば、２７℃、例えば、２８℃、例えば、２９℃、例えば、３０℃で一定に維持する。また、温度は１８〜３７℃、好ましくは、２３〜３２℃、例えば、約２５℃であり得る。
【００８２】
リアクターに、発酵ブロスに空気を供給するための注入口を取り付け、空気の添加の結果か、またはリアクターの内容物の良好な混合を提供するのに適したミキサーデバイスのいずれかによって、発酵ブロスを連続撹拌下で維持することが好ましい。
【００８３】
増殖培地のｐＨを約３〜約７、例えば、約４．５〜約６．５のｐＨ、例えば、約６のｐＨに調整し、次いで、増殖培地に真菌の菌糸体、またはその画分、例えば、Ｌ．エドデス（Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ）菌糸体を接種することが好ましい。ｐＨは、最初の調整の後、発酵の過程の間に自然に低下する場合もあるし、適したｐＨ制御物質、例えば、酸および塩基の添加を用いてｐＨ３〜７の範囲の特定の値に制御してもよい。増殖培地の温度は、１８〜３２℃の範囲の、好ましくは、２２〜３１℃の領域の、例えば、約２３℃の温度、例えば、２４℃、例えば、２５℃、例えば、２６℃、例えば、２７℃、例えば、２８℃、例えば、２９℃、例えば、３０℃であることが好ましい。また、温度は１８〜３７℃、好ましくは、２３〜３２℃、例えば、約２５℃であり得る。
【００８４】
バイオリアクターからサンプルを得、バイオマス、代謝産物および栄養化合物について分析することができ、それらの決定が、発酵プロセスの稼働中にバイオリアクターの操作者を補助し得る。慣用的に実施される代表的な分析は、バイオマス、残存糖濃度および細胞外ポリサッカライド濃度の決定である。当業者には、この件に使用できる分析法は知られている。
【００８５】
本発明による組成物を調製する方法は、真菌の菌糸体から液体増殖培地の細胞外画分を精製する工程を含むことが好ましい。液体発酵培地の細胞外画分はまた、上清とも呼ばれ、この画分は、例えば、遠心分離または濾過によって、または実際に、中に真菌の菌糸体が本質的に全く存在しない液体画分を得るために利用可能な、任意のその他の手段によって、真菌の菌糸体から分離できる。用語「中に真菌の菌糸体が本質的に全く存在しない」とは、真菌の菌糸体（その画分を含む）の濃度が少なくとも１０３倍低下している、例えば、少なくとも１０４倍低下している、例えば、少なくとも１０５倍低下している、例えば、少なくとも１０６倍低下していることを表すものとする。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態では、精製は少なくとも１つのサイズ分画工程を含む。このサイズ分画工程は細胞外画分で実施することが好ましい。このサイズ分画工程により、組成物中のどのポリサッカライドも、少なくとも所定の値の分子量を有することを確実にできる（本明細書中、上記も参照）。サイズ分画工程は、当業者に公知のいずれのサイズ画分、例えば、超遠心分離、限外濾過、微細濾過またはゲル濾過であってもよい。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本組成物を液体増殖培地から、超遠心分離、限外濾過、微細濾過およびゲル濾過からなる群から選択される１以上の精製工程を含む方法によって精製する。精製工程は、限外濾過、微細濾過および超遠心分離からなる群から選択されることが好ましく、さらにより好ましくは、限外濾過および微細濾過からなる群から選択される。
【００８７】
限外濾過は、膜が液体の成分をサイズによって分画する膜プロセスである。通常、膜の構成は、関連成分を含有する液体が膜を通って流れるクロスフローである。膜の名目孔サイズよりも小さい成分を含有する一部の液体は、膜を通過する。名目孔サイズよりも大きな分子は保持される。所望の産物は残留物または濾液中にあり得る。組成物を調製するために限外濾過を実施する場合には、この組成物内のどのポリサッカライドも所定の値を上回る分子量を有し、所望の産物は残留物中にある。連続分画を行う場合には、産物は残留物または濾液中にあり得る。
【００８８】
微細濾過はＵＦと同様であるが、より大きな粒子が通過するのを可能にするさらに大きな膜孔サイズを有する膜分離プロセスである。
【００８９】
ゲル濾過は、粒子がサイズによって分離されるクロマトグラフィーの技術である。濾過媒体は、代表的に、小さいゲルビーズであり、これがビーズ孔を通過できる分子を取り込む。より大きな分子は、ビーズに取り込まれずにカラムを通過する。
【００９０】
ゲル濾過、限外濾過または微細濾過は、例えば、Ｒ Ｈａｔｔｉ−Ｋａｕｌ ａｎｄ Ｂ Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ （２００１）、Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ Ｃ Ｒａｔｌｅｄｇｅ ａｎｄ Ｂ Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ） ｐｐ１８９に記載のとおり実施できる。
【００９１】
本発明による組成物を調製する非限定的な方法は、例えば、実施例１、７および８に記載されている。
【００９２】
アルコール沈殿を含む、液体増殖培地から細胞外物質を精製する方法が、記載されている。しかし、アルコール沈殿は免疫調節効果を低減する場合があり、したがって、アルコール沈殿を用いて精製された組成物はあまり望ましいものではない。ゆえに、本発明の一実施形態では、本方法はアルコール沈殿工程を含まない。本方法は沈殿工程を含まないことがより好ましい。
【００９３】
（薬学的組成物およびその使用）
本発明の別の実施形態では、免疫系の刺激を必要とする個体の免疫系を刺激する方法における本発明の組成物の使用を提供する。本組成物は、例えば、個体の免疫系を刺激できる薬剤上有効な量で個体に経口投与または皮下投与できる。免疫系の刺激は、例えば、抗体産生の増加によって、ヘルパーＴ細胞の活性化によって、またはインターロイキン、例えば、インターロイキン１およびインターロイキン２の産生の増加によって実証できる。
【００９４】
本発明のさらに別の実施形態では、免疫無防備状態の処置を必要とする個体において免疫無防備状態を処置するための医薬の製造における本発明の組成物の使用を提供する。個体における免疫無防備状態は、例えば、不十分な量の抗体もしくは抗体産生の減少などの免疫系因子によって、個体における不十分な量のヘルパーＴ細胞もしくはヘルパーＴ細胞の産生の減少によって、個体における不十分な量のＢ細胞もしくはＢ細胞の産生の減少によって、個体における不十分な量のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって、もしくはＮＫ細胞の産生の減少によって、または個体における不十分な量のインターロイキン、例えば、インターロイキン１およびインターロイキン２もしくはインターロイキン、例えば、インターロイキン１およびインターロイキン２の産生の減少によって実証できる。免疫無防備状態は以下に開示されるもののうちいずれかであり得る。処置は予防的なもの、改善するものまたは治癒的なものであり得る。
【００９５】
上記の本明細書において、「不十分な量」および「産生の減少」とは、医療関係者が健常な個体と通常関連している所定のレベルまたは値を下回っていると考えるような量および産生を表すものとする。通常、この量および／または産生は、年齢、全身の健康状態などといった因子に応じて変わる。このために、所定のレベルまたは値は、医療関係者によって個体ベースで決定されるものとする。個体における免疫無防備状態の１つの徴候としては、時間をかけて（例えば、数日、数週間、数ヵ月または数年をかけて）測定された単位（血液）サンプル容積当りの、抗体数の漸減、ＣＤ４（陽性）細胞数の漸減、またはヘルパーＴ細胞数の漸減がある。
【００９６】
一態様では、本発明は、本発明の組成物と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ １９９５，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに記載されるような従来技術によって調製され得る。本組成物は、従来の形態、例えば、カプセル剤、錠剤、トローチ剤、散剤、シロップ剤、液剤または懸濁剤で現れ得る。
【００９７】
一態様では、本発明は、免疫無防備状態と診断された個体の処置法であって、この個体に、この免疫無防備状態を処置するのに有効な量の本発明による組成物または本発明による薬学的組成物を投与する工程を含む方法に関する。
【００９８】
投与される量は、この免疫無防備状態を予防的に処置するのに有効な量であり得る。
【００９９】
また、手術または病気から回復中であり、かつ、免疫無防備状態になる危険のある個体を処置する方法であって、この個体に、この個体の免疫系をブーストするのに有効な量の本発明による組成物または本発明による薬学的組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【０１００】
さらに、後天性免疫不全症候群と診断されたか、または後天性免疫不全症候群になる危険のある個体の処置法であって、この個体に、この症候群を処置するのに、または予防的に処置するのに有効な量の本発明による組成物または本発明による薬学的組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【０１０１】
免疫無防備状態は、感染症、寄生虫病、ヘモフィルス髄膜炎、肺炎球菌性髄膜炎、連鎖球菌性髄膜炎、ブドウ球菌性髄膜炎、その他の生物による髄膜炎、脳炎、ウイルス性肺炎、肺炎球菌性肺炎、その他の細菌性肺炎、細菌を除くその他の特定の生物による肺炎、気管支肺炎、生物非特異性肺炎、インフルエンザ、詳細不明の下痢、詳細不明の肝炎、肝臓の急性および亜急性壊死、慢性肝炎ならびに肝臓膿腫からなる群から選択され得る。
【０１０２】
さらに、免疫無防備状態は、コレラ、サルモネラ、細菌性赤痢、大腸菌、その他の特定の細菌による腸内感染、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウイルス性胃腸炎、感染性大腸炎、腸炎および胃腸炎、感染性下痢症、結核、リステリア症、パスツレラ症、マイコバクテリア、ジフテリア、百日咳、髄膜炎菌、連鎖球菌敗血症、ブドウ球菌敗血症、肺炎球菌敗血症、嫌気性菌による敗血症、その他のグラム陰性生物による敗血症、放線菌感染、ガス壊疽、トキシックショック症候群、壊死性筋膜炎、フリードレンデル杆菌、インフルエンザ菌、シュードモナス、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ感染、急性灰白髄炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、亜急性硬化性全脳炎、進行性多病巣性白質脳障害、中枢神経系の詳細不明のスローウイルス感染、コクサッキーウイルス、詳細不明のウイルス性髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎、詳細不明のウイルス性脳炎、水痘、帯状疱疹、単純ヘルペス、ウイルス性Ａ型肝炎、ウイルス性Ｂ型肝炎、その他の特定のウイルス性肝炎、慢性肝炎、肝臓の膿腫／急性壊死、伝染性単核球症、巨細胞性封入体病、クラミジア、アデノウイルス、ウイルス感染、梅毒、カンジダ、詳細不明のヒストプラスマ症、アスペルギルス症、クリプトコックス症、真菌症、糞線虫症、腸管寄生、トキソプラスマ症、サルコイドーシス、ニューモシスティス・カリニ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ポリオ後症候群、ヘモフィルス髄膜炎、肺炎球菌性髄膜炎、連鎖球菌性髄膜炎、ブドウ球菌性髄膜炎、脳炎、アデノウイルスによる肺炎、ＲＳウイルスによる肺炎、パラインフルエンザウイルスによる肺炎、その他のウイルスによる肺炎、ウイルス性肺炎、肺炎球菌性肺炎、肺炎杆菌による肺炎、シュードモナスによる肺炎、インフルエンザ菌による肺炎、連鎖球菌による肺炎、ブドウ球菌による肺炎および細菌性肺炎によって引き起こされるかまたはそれらから選択される感染病または寄生虫病であり得る。
【０１０３】
個体は哺乳類、例えば、ヒトであり得る。
【０１０４】
本発明の組成物は、適した投与形態のいずれを用いても投与できるが、通常、投与は経口投与または非経口投与である。本組成物を含むシロップ剤および／または本組成物を含むシロップを含有するカプセル剤の形態の、または本組成物の散剤の形態の経口投与が好ましい。
【０１０５】
必要用量は、用いる特定の組成物、投与経路および処置される特定の個体によって異なる。理想的には、本方法によって処置される個体は、最大寛容用量で薬学的に有効な量の化合物を受け取る。
【０１０６】
一般に一日経口投与レジメンは、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは、０．１〜１０の範囲、さらにより好ましくは、１〜２ｍｇ／全体重１ｋｇの範囲であり得る。また、当業者によれば、組成物の個々の投与量の最適な量および間隔は、処置される状態の性質および程度、投与形態、投与経路および投与部位、ならびに処置される特定の患者によって決まること、ならびにこのような最適条件は従来技術によって決定できるということが認識される。当業者には当然のことであるが、最適処置過程、すなわち、規定の日数にわたって１日当たりに与えられる組成物の用量数は、処置決定試験の従来の過程を用いて当業者によって確認され得る。
【０１０７】
本発明による組成物および薬学的組成物はまた、この組成物と、用量および時間投与の指針を含む投与計画指示書とを含むキットの一部を形成し得る。
【０１０８】
（機能性食品）
本発明の一実施形態では、機能性食品の製造において本発明の組成物を用いる。したがって、本発明の一実施形態では、本明細書に記載される組成物のいずれも、（好ましくはヒトに適した）機能性食品または栄養素補給物質に含めることができる。この機能性食品は、生存促進性、長寿促進性、健康促進性であり、かつ／または微生物集団のモジュレーターであることが好ましい。この機能性食品は健康促進性であり、かつ／または微生物集団のモジュレーターであることがより好ましい。機能性食品は少なくとも毎週の経口摂取、例えば、毎日の経口摂取に適していることが好ましい。あるいは、この機能性食品製品は、非経口または経腸栄養において、好ましくは、当業者に公知のその他の栄養を含む製剤と組み合わせて使用するのに適しているものであり得る。
【０１０９】
本発明の製品は、ヒトの健康を促進するために、例えば、骨または心血管の健康を維持、強化または促進するために使用できる。本発明の好ましい一実施形態では、機能性食品を骨粗しょう症の予防または減少のために使用できる。本発明の別の好ましい実施形態では、この機能性食品の、例えば、１日１回、１日２回または１日３回といった定期的な消費が、風邪、咳などの疾病の危険の低減をもたらし、疲れおよび疲労を減少させる。
【０１１０】
投与法または消費法は異なり得るとはいえ、機能性食品は、ヒトによってその日々の食生活の成分として摂取されることが好ましい。本明細書に記載される組成物のいずれも、液体ビヒクル、例えば、水、ミルク、植物油、ジュースなどと、または摂取可能な固体または半固体食料品と組み合わせることができる。例えば、本組成物は、ミルクセーキ、ミルクセーキミックス、朝食用ドリンク、ジュース、フレーバードリンク、フレーバードリンクミックス、ヨーグルト、プディング、アイスクリーム、アイスミルク、フロスティング、フローズンヨーグルト、チーズケーキフィリング、「ヘルスバー」、例えば、グラノーラおよびフルーツバーをはじめとするキャンディーバー、ガム、ハードキャンディー、マヨネーズ、フルーツフィリングまたはクリームフィリングなどのペストリーフィリング、シリアル、パン、詰め物、ドレッシングおよびインスタントポテトミックスなどの食品に混合することができる。したがって、本発明は、本明細書に記載される（例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ属真菌から得られる）組成物のいずれかを食料品と混合することを含む、機能性食品組成物を製造する方法に関する。
【０１１１】
例えば、この機能性食品製品は、食事代替物、栄養補助食品、アイスクリーム、ソース、ドレッシング、スプレッド、バー、甘い物、スナック、シリアルおよび飲料の群から選択され得る。
【０１１２】
別の好ましい実施形態では、この機能性食品は、（好ましくは、丸剤、カプセル剤、錠剤または液剤の形態での摂取に適した）栄養補助食品である。
【０１１３】
一実施形態では、本明細書に記載される組成物のいずれか（例えば、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ属由来の）を、組成物のレベルが５〜５０００ｍｇ／１００ｇ製品の間であるように食品製品に添加することによって本発明の製品を調製する。
【０１１４】
（乳製品）
本発明の好ましい一実施形態では、機能性食品は乳製品である。したがって、この機能性食品は、例えば、以下のいずれかから選択され得る：
培養乳製品、ヨーグルト、カッテージチーズ、クリームチーズ、乳製品ディップ、サワークリーム、ミルクセーキ、バター、マーガリン、低脂肪スプレッド、チーズ、カッテージチーズ、チーズスプレッド、子供用チーズ「ストリングス」、チーズスライス、ヨーグルト、ヨーグルトベースの炭酸飲料、飲むことができるヨーグルト、低脂肪ヨーグルト、冷蔵ディップ、サワークリーム、アイスクリーム、クリーム、低脂肪クリーム代用品、ケフィアなどの発酵乳。
【０１１５】
本発明の好ましい一実施形態では、この乳製品は、チーズベースの製品、例えば、低脂肪チーズ、ハードチーズ、ソフトチーズ、カッテージチーズ、チーズスプレッド、子供用チーズ「ストリングス」またはサンドイッチに適したチーズスライスから選択されるものである。
【０１１６】
本発明の別の好ましい実施形態では、この乳製品はヨーグルトベースの製品、例えば、セットヨーグルト、流れやすいまたは注ぐことができるヨーグルト、ヨーグルトベースの炭酸飲料、飲むヨーグルトまたは飲むことができるヨーグルト、低脂肪ヨーグルトから選択されるものである。このヨーグルトベースの製品は、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓおよび／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓを用いて発酵させることができる。
【０１１７】
本発明の別の好ましい実施形態では、この乳製品は、培養乳製品、例えば、培養液（例えば、飲むことができるヨーグルト／ヨーグルトスムージー、ケフィア、プロバイオティックショット）、飲むことができないヨーグルト（例えば、カップまたはチューブ入りのもの）、および／または別の注ぐことができない培養乳製品（例えば、カッテージチーズ、クリームチーズ、乳製品ディップまたはサワークリーム）である。
【０１１８】
本発明の別の好ましい実施形態では、この乳製品は別の種類の乳製品、例えば、冷蔵ディップおよびサワークリーム、アイスクリーム、クリーム、低脂肪クリーム代用品、ケフィアなどの発酵乳、飲むことができるヨーグルトおよびケフィアなどの発酵飲料からなる群から選択されるものである。
【０１１９】
（健康ドリンク）
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明による機能性食品は健康ドリンクである。この健康ドリンクは、一実施形態では、果汁ベースのものであり、これは、飲むために希釈される「スカッシュ」として濃縮できる。この果汁またはスカッシュは、濃縮果汁を含むことが好ましい。好ましい果汁としては、柑橘果汁、例えば、オレンジ、グレープフルーツ、レモンまたはライムまたはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。別の好ましい実施形態では、この果汁またはスカッシュは、例えば、ラズベリー、ストロベリー、ブラックベリー、ローガンベリー、クランベリー、アカフサスグリ、クロフサスグリ、ブルーベリーまたはそれらの組み合わせ、および／または柑橘系果汁との組み合わせ由来の（好ましくは、濃縮）ベリージュースを含む。別の好ましい実施形態では、この果汁またはスカッシュは、パイナップル、パッションフルーツ、マンゴー、リンゴ、洋ナシ、アプリコット、ザクロ、グアバ、トマトおよび／またはいずれかのその他の種類の果汁との組み合わせのうちの１種以上に由来するジュースを含む。好ましいジュースベースは以下の群から選択される：
・リンゴ
・アプリコット
・バナナ
・ブラックベリー
・ブルーベリー
・ゴレンシ（スターフルーツ）
・サクランボ
・ナツメヤシ
・イチジク
・フルーツカクテル
・ブドウ
・グレープフルーツ
・キウィフルーツ
・レモン
・マンダリンオレンジ
・マンゴー
・メロン
・ネクタリン
・オレンジ
・パパイヤ
・モモ
・洋ナシ
・パイナップル
・プランタイン
・プラム
・ラズベリー
・ストロベリー
・タンジェリン
・スイカ
またはそれらの組み合わせ。
【０１２０】
さらに好ましいジュースベースは以下の群から選択される：
・リンゴ
・ニンジン
・クランベリー
・ブドウ
・グレープフルーツ（ピンクまたはホワイト）
・レモン
・ライム
・オレンジ
・パイナップル
・パイナップル
・プルーン
・タンジェリン
・トマト
またはそれらの組み合わせ。
【０１２１】
この健康ドリンクはまた、水ベースのもの、例えば、ミネラルウォーターベースの製品、例えば、フレーバーミネラルウォーターベースの製品であってもよい。このフレーバリングは、果汁および／またはその他の天然の産物由来であることが好ましい。
【０１２２】
本発明の好ましい一実施形態では、この健康ドリンクは、例えば、２５または３０ｃｌの瓶に含まれる、糖と、その他のエネルギー供給製品とを含むエネルギーショットである。
【０１２３】
本発明の別の好ましい実施形態では、この健康ドリンクは、アルコール飲料、例えば、乳製品ベースのアルコール飲料である。
【０１２４】
本発明の別の好ましい実施形態では、この健康ドリンクは、食事代替ドリンクである。
【０１２５】
本発明の健康ドリンクはまた、後の段階で、好ましくは消費者によってドリンクに作り上げる準備ができている、濃縮物またはプレミックスとして製造できることが想定される。
【０１２６】
（固形の機能性食品）
本発明の好ましい一実施形態では、機能性食品は固形の機能性食品、例えば、以下からなる群から選択されるものである：ビスケット／クラッカー、朝食用シリアル、スープ、ミューズリー、チューイングガム、甘い物（例えば、ハードキャンディー）、フレッシュベーカリー製品（焼きたてパン、ケーキ、マフィン、ワッフルなど）、ドライベーカリー製品（クリスプブレッド、ビスケット、クラッカーなど）、シリアル製品（朝食用シリアル、ファイバーおよびステロールを強化した小麦粉、ミューズリー、シリアルベースおよびミューズリーバー、例えば、チョコレートを含有する可能性があるバー、パスタ製品、スナックなど）、ふすま製品、（粒状および／または焼きふすま製品、フレーバー付きおよび／またはステロールコートされたふすま製品およびふすま−ふすまミックスなど）。
【０１２７】
本発明の別の好ましい実施形態では、この固形の機能性食品は、食品の調理または製造において用いられる、ベーキング用（例えば、パン、ケーキ、マフィン、ワッフル、ピザ、パンケーキ）か、調理用（例えば、スープ、ソース、デザート、プディング）いずれかの、レディミックス（好ましくは粉末の形の）である。
【０１２８】
本発明の別の好ましい実施形態では、この固形の機能性食品は、肉製品（ソーセージ、ミートボール、コールドカットなど）である。
【０１２９】
本発明の別の好ましい実施形態では、この固形の機能性食品は、パンまたは朝用製品／ベーカリースナックである。したがって、このパンは白パン、黒パンまたは全粒パンであり得る。本発明の別の好ましい実施形態では、このパンは以下のパンの種類から選択され得る：麦芽入り小麦粉、ミルクパン、ふすま強化およびミックスドグレイン（ｍｉｘｅｄ ｇｒａｉｎ）パン。パンは、例えば、小さい塊、コーバーグ、重ねパン（ｃｏｔｔａｇｅ）、チョヤ（ｃｈｏｌｌａ）、ブルーマー（ｂｌｏｏｍｅｒ）、バレル（ｂａｒｒｅｌ）、バッチ（ｂａｔｃｈ）、サンドイッチ、型焼き、ウィーン（ｖｉｅｎｎａ）または田舎風など、どんな形状のものであってもよい。本発明の好ましい一実施形態では、このパンは以下のパンの種類のいずれかから選択される：
全粒パン
黒パン
小麦胚芽パン（１０％もの加工小麦胚芽が添加されて含まれているパン）
ソフトグレインパン（従来の白パンと比較して、繊維含量を高めるために（好ましくは、３０％まで）、軟化したライ麦および小麦粉というさらなる穀物を含む白い小麦粉から製造されたもの）
全麦パン
麦芽パン。
【０１３０】
本発明の別の好ましい実施形態では、このパンは、以下のパンの種類のいずれかから選択される：
チャバタ
ピタ
ナン
チョヤ
フォカッチャ
ソーダブレッドまたはブラウンソーダブレッド（全粒粉を用いて作られる）
ライ麦パン
バゲットまたはフレンチスティック
クロワッサン
ベーグル。
【０１３１】
本発明の別の好ましい実施形態では、このパンは、例えば、以下のパンの種類のいずれかから選択される平たいパンである：チャパティ、パラタ（Ｐａｒａｔａ）およびロティ（Ｒｏｔｉ）、メキシカントルティーヤ、フラット「ラップ」トルティーヤまたはフラワートルティーヤ、パンケーキ。
【０１３２】
本発明の別の好ましい実施形態では、機能性食品は朝用スナックまたはベーカリー製品である。このベーカリー製品は、甘い物か、またはセイボリーのいずれか、例えば、セイボリーであり得る。
【０１３３】
好ましいベーカリー製品としては、ロールパンおよび平たくて柔らかいパン、マフィン、クラムペットおよびピクレット、スコーン、ティーケーキ、丸パンおよびその他の果物を加えた製品などの焼き製品、パンケーキおよびグリドルスコーン、ワッフルおよびポテトケーキなどのホットプレート製品、ホットクロスバン、クロワッサン、ブリオッシュ、パン・オ・ショコラ、ベーグル、アメリカンスイートマフィンおよびその他のセミスイートパン製品が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３４】
（植物油ベースの製品）
本発明の別の好ましい実施形態では、機能性食品は、植物油ベースの製品である（スプレッド、サラダオイル、マヨネーズなど）。
【０１３５】
（冷凍菓子製品）
本発明の別の好ましい実施形態では、機能性食品は冷凍菓子製品である。本発明の目的上、用語、冷凍菓子製品としては、ミルク含有冷凍菓子、例えば、アイスクリーム、フローズンヨーグルト、シャーベット、ソルベ、アイスミルク、フローズンカスタード、氷菓子、グラニタおよびフローズンフルーツピューレが挙げられる。
【０１３６】
冷凍菓子中の固体（例えば、糖、脂肪、香料など）のレベルは、３ｗｔ％より多いことが好ましく、１０〜７０ｗｔ％がより好ましく、例えば、４０〜７０ｗｔ％である。
【０１３７】
アイスクリームは代表的に、２〜２０ｗｔ％の脂肪と、０〜２０ｗｔ％の甘味料と、２〜２０ｗｔ％の脱脂乳成分と、任意成分（例えば、乳化剤、安定剤、保存料、香料成分、ビタミン、ミネラルなど）とを含み、残りは水である。代表的に、アイスクリームには２０〜４００％、より一般的には、４０〜２００％のオーバーランに空気を含ませ、−２〜−２００℃、より一般的には−１０〜−３０℃という温度に凍結する。アイスクリームは、普通は、約０．１ｗｔ％のレベルのカルシウムを含む。
【０１３８】
冷凍菓子材料の平均的１人分の代表的なサイズは６６ｇである。本発明による組成物は、カプセル化してもよいし、または乳化剤、界面活性剤もしくは製品中の物質の可溶化および安定化を確実にするためのその他の物質と合わせてもよい。
【０１３９】
（食事代替物）
本発明の別の好ましい実施形態では、機能性食品は食事代替物である。食事代替ドリンクは、代表的には、液体ベースをベースとし、例えば、これをガムまたはファイバーによって増粘させ、それにミネラルおよびビタミンのカクテルを添加することができる。ドリンクには所望の風味、例えば、フルーツまたはチョコフレーバーにフレーバーを付けることができる。代表的な１人分のサイズは３３０ｍｌまたは３３０ｇであり得る。本発明による組成物は、カプセル化してもよいし、または乳化剤、界面活性剤もしくは飲料中の物質の可溶化および安定化を確実にするためのその他の物質と合わせてもよい。
【０１４０】
食事代替スナックまたはバーは、食用材料のマトリックスを含むことが多く、その中に本発明による組成物を組み込むことができる。例えば、マトリックスは脂肪ベース（例えば、クーベルチュールまたはチョコレート）であってもよいし、ベーカリー製品（パン、生地、クッキーなど）をベースとするものであってもよいし、凝集粒子（米、穀物、ナッツ、レーズン、フルーツ粒子）をベースとするものであってもよい。スナックまたは食事代替バーの代表的なサイズは、２０〜２００ｇ、一般的には、４０〜１００ｇであり得る。製品には、さらなる成分、例えば、香料材料、ビタミン、ミネラルなどを添加することができる。
【０１４１】
（組み合わせ）
本発明の一態様では、機能性食品は、本発明による組成物を、別の生存促進性物質、長寿促進性物質、健康促進性物質および／または微生物集団のモジュレーターと組み合わせて含む。
【０１４２】
例えば、この機能性食品の１つの好ましい実施形態として、１種以上の本発明による組成物と、プロバイオティックとを、例えば、プロバイオティック「ショット」中に含む食品がある。機能性食品の別の好ましい実施形態は、本発明による化合物と、プレバイオティックとを、例えば、プレバイオティック「ショット」中に含む食品である。機能性食品の別の好ましい実施形態は、本発明の組成物と、シンバイオティックとを、例えば、シンバイオティック「ショット」中に含む食品である。本発明の好ましい一実施形態では、上記のショット中に用いるのに好ましい細菌は、以下のうちのいずれかである：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓおよび／またはＬ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）。本発明の別の好ましい実施形態では、上記のショット中に用いるのに好ましい細菌は以下のうちのいずれかである：Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．（例えば、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｌａｃｔｉｓおよび／またはＢ．ｌｏｎｇｕｍ）。本発明の別の好ましい実施形態では、上記のショット中に用いるのに好ましい細菌は以下のうちのいずれかである：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび／またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ。
【０１４３】
本発明による組成物はまた、例えば、植物サプリメントなどの栄養補助食品において、および／またはビタミンＥカプセル剤において、またはセレン丸剤において、他の成分と合わされてもよい。この栄養補助食品におけるさらに好ましい組み合わせは、以下のうち１種以上とであり得る：抗酸化物質、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロテン。
【０１４４】
本発明の機能性食品は、他の健康によい成分、例えば、ビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、カルシウム、カリウム、マグネシウム、鉄、銅、亜鉛、セレンなどのミネラルおよびトコフェロール、ポリフェノールなどの抗酸化物質などをさらに含み得る。例えば、機能性食品は、本発明による組成物（例えば、レンチナン）を、ビタミンＣとともに含むことができ、その組み合わせが、この機能性食品を摂取している個体において風邪およびインフルエンザの減少を引き起こすことができる。
【０１４５】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、骨粗しょう症を減少または予防すると考えられているさらなる成分を含み得る。このような成分の例は、カルシウム、ビタミンＤ、マグネシウムなどである。
【０１４６】
本発明の適した機能性食品の好ましい実施形態を、本明細書において以下に記載する：
０．１〜５％、好ましくは、０．５〜１％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む飲料。
【０１４７】
０．９〜１６％、好ましくは、２．４〜１０％、より好ましくは、３〜５％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含むフレッシュベーカリー製品。
【０１４８】
１．０〜２０％、好ましくは、３．２〜１５％、より好ましくは、４．４〜１０％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む乾燥ベーカリー製品。
【０１４９】
０．８〜２０％、好ましくは、１．６〜１６％、より好ましくは、２〜１０％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含むシリアル製品。
【０１５０】
４％〜２５％、好ましくは、６〜２０％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含むふすま製品。
【０１５１】
０．１〜２０％、好ましくは、０．８〜８％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む乳製品または非乳製品（例えば、発酵シリアル製品）。
【０１５２】
０．６〜１６％、好ましくは、２．６〜１０％、より好ましくは、２．６〜５％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む植物油ベースの製品。
【０１５３】
０．１〜１６％、好ましくは、０．２〜５％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む肉製品。
【０１５４】
０．１〜１６％、好ましくは、０．２〜５％の量の本明細書に記載される組成物のいずれかを含む乳製品。
【０１５５】
したがって、一実施形態では、本発明は、機能性食品、例えば、本明細書に記載される機能性食品のいずれかの製造における本明細書に記載される組成物のいずれかの使用に関する。
【実施例】
【０１５６】
以下の実施例は、本発明の例示的実施形態を説明するものであって、本発明の制限と見なしてはならない。
【０１５７】
（実施例１）
（炭水化物組成物）
Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓを、振盪フラスコ中、２５℃で、１５ｇ／ｌグルコース、３ｇ／ｌ麦芽抽出物、３ｇ／ｌ酵母抽出物および５ｇ／ｌペプトンを含む培地において液体培養で培養した。培養後、バイオマスを、濾過によって残りの発酵ブロスから分離した。上清を５０，０００Ｄａという名目孔サイズを有する膜を用いる限外濾過に付した。残留物（本明細書では、「ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品」と称する）をモノサッカライド含量の分析に用いた。
【０１５８】
比較のために、市販の注射用レンチナン（Ｅｕｒｅｋａ Ｂｉｏ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｐｔｙ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｓｔｒｅｅｔ．Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ ３０００，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を並行して実施した参照実験において用いた（本明細書では以下、この製品を「Ｅｕｒｅｋａ」と称する）。
【０１５９】
サンプルを、１００℃、１Ｎ ＨＣｌにおいて、その構成要素モノサッカライドに加水分解した。加水分解産物を、移動相として６００ｍＭのＮａＯＨを用い、Ｄｉｏｎｅｘ ＭＡ−１カラムを用いてＨＰＬＣによって分析した。検出はパルス電流法によって行った。
【０１６０】
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品の主要なモノサッカライドは、マンノースと、グルコースと、いくらかのガラクトースであった。表Ａは、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品とＥｕｒｅｋａの相対モノサッカライド含量を示す。
【表Ａ】
【０１６１】
（実施例２）
（分子量分画）
それらの生物活性の分子量特性決定のために、ＭｅｄｉＭｕｓｈサンプルを、６℃、７，５００×ｇでＭｉｃｒｏｓｅｐ （Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）遠心分離限外濾過によって遠心分離した。５０，０００〜１，０００，０００の名目ＭＷＣＯ値を有するフィルターを用いた。分析結果（表２参照）は、酸加水分解でマンノース、グルコースおよびガラクトースを生じる材料が、用いた４種のＭＷＣＯ膜すべてを通過することを示した。
【０１６２】
【表２−１】
【０１６３】
（実施例３）
（可溶性タンパク質）
サンプル中の可溶性タンパク質を、クマシー色素結合アッセイのマイクロスケール版によって測定した（Ｍｏｕｓｄａｌｅ，Ｄ．Ｍ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍ．Ｓ．，Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｓｅ−ｓｈｉｋｉｍａｔｅ：ＮＡＤＰ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｐｅａ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ」．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６７，２１７−２２２（１９８７））。２種の製品中の可溶性タンパク質の量を以下に示す。
【０１６４】
【表２−２】
【０１６５】
（実施例４）
（免疫賦活）
（組織培養）
Ｐ３８８細胞はマウスマクロファージ様細胞であり、これは、刺激されると多量のインターロイキン−１（ＩＬ−１）を分泌する（細胞に関する詳細な情報はＥＣＡＣＣから入手可能である）。分泌されるＩＬ−１の量は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）に基づいた方法を用いて定量でき、細胞がどのように刺激されたかの尺度として使用できる。このようなアッセイを較正する絶対値は存在しないことには留意しなくてはならず、したがって、並行して参照サンプルを分析し、参照サンプルによって誘発されたＩＬ１産生と比較して、ＩＬ１産生を評価することが好ましい。２つの型のＩＬ−１、すなわち、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βがある。Ｐ３８８細胞を、１２ウェル培養プレートに播種し、一晩増殖させる。異なる濃度の種々の賦活薬を加え、３７℃で２４時間インキュベートする。
【０１６６】
（ＥＬＩＳＡ）
各ウェルに由来する５０μｌの刺激を受けた培養培地を、コーティングバッファーと混合し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに分注し、４℃で一晩コーティングさせた。この工程により、抗原（ＩＬ−１）がＥＬＩＳＡプレートの表面と結合することが可能となる。ＩＬ−１を、ヤギで作製される、２種の異なる型のＩＬ−１に対する２種の抗体（一次抗体）を用いて検出する。次の工程では、ヤギ抗体を検出する別の抗体（二次抗体）を用いる。この抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼと結合しており、これによって、基質が加えられると呈色反応が生じる。分光光度計（ＥＬＩＳＡリーダー）によって測定される色の量は、存在するＩＬ−１の量と相関し、従って、組織培養細胞がどの程度刺激されているかが定量される。
【０１６７】
（結果）
（全サンプルアッセイ）
２種の製品を、ある範囲の濃度で試験し、最適値は、ＩＬ１αについては５０μｇ／ｍｌであり、ＩＬ１βについては１００μｇ／ｍｌであることがわかった。結果を表３に示す。
【０１６８】
【表３−１】
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品は著しく免疫賦活性であった。Ｅｕｒｅｋａ製品はいくらかの免疫賦活を示したが、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品よりも大幅に弱かった。ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品は、Ｅｕｒｅｋａよりも５８倍多いＩＬ１αおよび２０倍多いおよびＩＬ１−βの産生を誘発した。
【０１６９】
（画分のアッセイ）
フィルターカットオフよりも大きな分子がアッセイ中に存在しないよう、濾液を試験した。結果は吸光度として示されており、相対的な免疫賦活の目安を示すに過ぎない。このようなアッセイを較正する絶対値は存在しない。
【０１７０】
【表４−１】
すべての濾液材料が、有意な免疫賦活を示した。
【０１７１】
（実施例５）
２種の異なる製造法を比較するために、実施例１に記載のとおりに調製されたＭｅｄｉＭｕｓｈ製品の免疫賦活活性を、サイズ分画に付されなかったポリサッカライド組成物の免疫賦活活性と比較した。
【０１７２】
この製品を、実施例１に記載されるように、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓを液体培養において培養することによって調製した。このように得られた上清に、およそ２容積の無水エタノールを加え、生成物を沈殿させた。沈殿物を除去し、無水エタノールで洗浄し、蒸留水に再懸濁した。
【０１７３】
免疫賦活アッセイは、実施例４に記載のとおりに実施した。ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品を用いた結果を表５に示し、沈殿した生成物を用いた結果を表６に示す。
【０１７４】
【表５−１】
【０１７５】
【表６−１】
アッセイを並行して実施しなかったので、得られた数値は比較できない。しかし、両研究においてＥｕｒｅｋａを参照として用いたので、結果をＥｕｒｅｋａ）と比較して何倍増強として比較することができる。これらの値を以下の表７に示す。明らかなように、両組成物とも、Ｅｕｒｅｋａよりも大幅に免疫賦活性が高かった。しかし、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品は、沈殿生成物よりも免疫賦活性が高かった。
【０１７６】
【表７−１】
【０１７７】
（実施例６）
免疫賦活特性を決定するために、以下の方法を使用できる：１２週齢のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに０．０９生理食塩水０．５ｍｌ中、１ｍｇの本発明による組成物を与え（腹腔内）、２日後、免疫する。対照動物には１ｍｇのカゼインを与える。動物を、０．２５「フロイント完全アジュバント」中、ＢＳＡ（０．５ｍｇ）を用いて免疫し、１１日後、抗体応答の測定のために血液サンプルを得る。特異的抗ＢＳＡ抗体濃度を、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡによって、抗体ＢＳＡの絶対的基準に対して求める。
【０１７８】
（実施例７ａ）
（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｓｐ．の培養のためのプロトコール）
培養条件：
温度：２５℃±１℃
ｐＨ：中程度のｐＨ
水：水道水
培地：グルコース３０ｇ／ｌ；
菌学ペプトン１０ｇ／ｌ、
酵母抽出物６ｇ／ｌ
麦芽抽出物６ｇ／ｌ。
【０１７９】
（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｓｐ．の発酵槽（３リットル）培養）
発酵槽に１．７リットルの培地を入れ、１２１℃で２０分間滅菌する。発酵条件を設定する：２５℃、２００〜３００ｒｐｍおよび０．２〜０．５ｖｖｍの空気。発酵培地または良好な増殖を促進する同様の培地を含む、６〜８日培養した振盪フラスコを用いて発酵槽に接種する。必要な場合には（普通は、実施の間中）、適した消泡剤を添加する。６〜８日後に収集する。
【０１８０】
（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｓｐ．の収集）
バイオマス：フィルター媒体として孔サイズ４５のナイロンクロスを用いてバイオマスをブロスから取り出す。バイオマスを水で十分に洗浄し、霜取りに設定した電子レンジ中で乾燥するまで乾燥させる（通常のサンプルサイズには約１５分必要となる）。冷却し秤量するまでデシケーター中で保存する。
【０１８１】
発酵液：発酵液中の免疫賦活物質の濃度を、無水エタノールを用いてｐｐｔで決定する。必要ならば、滅菌蒸留水を加えて濃度を所望のレベルに調整する。得られた液体をオートクレーブし、保存する。
【０１８２】
医療グレード：バイオマスを含まない発酵液を、例えば、３００ｋＤといったｍｗｔカットオフを有するＵＦフィルターに通す。７０〜８０％の液体を除去したら、残留物に水を加えて溶液を洗浄する。溶液がその色の多く（ほとんど）を失い、透明に見えるまで繰り返す。
【０１８３】
（実施例７ｂ）
Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉを、実施例７ａに記載のとおりに液体培養で培養した。培養後、バイオマスを、濾過によって発酵ブロスの残りから分離した。上清を種々のｍｗｔカットオフを有するフィルターを用いる遠心分離濾過に供した。１００ｋＤ未満のすべての成分を除去し、製品ＭｅｄｉＭｕｓｈＩＩを含有する液体を残すことによって、第１の製品（ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＩと表した）を得た。上清から、１ｋＤ未満のｍｗｔを有するすべての成分を除去し、「ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＩＩ」を含有する液体を残すことによって、第２の製品（ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＩＩと表した）を得た。
【０１８４】
サンプルを、１００℃、１Ｎ ＨＣｌにおいて、その構成要素モノサッカライドに加水分解した。加水分解産物を、移動相として６００ｍＭのＮａＯＨを用い、Ｄｉｏｎｅｘ ＭＡ−１カラムを用いてＨＰＬＣによって分析した。検出をパルス電流法によって行った。
【０１８５】
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＩおよびＩＩＩの主要なモノサッカライドは、マンノースと、グルコースと、いくらかのガラクトースであった。表Ｂは、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＩおよびＩＩＩの相対モノサッカライド含量を示す。
【表Ｂ】
【０１８６】
（実施例８）
Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍを、液体培養において、実施例７ａに記載されるとおりＡｇａｒｉｃｕｓ真菌と同様の方法で培養した。培養後、バイオマスを、濾過によって発酵ブロスの残りから分離した。上清を実施例７ａに例示されるように遠心分離濾過に付した。１００ｋＤ未満のすべての成分を除去し、製品ＭｅｄｉＭｕｓｈ ＩＶを含む液体を残すことによって、第１の製品（ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＶと表した）を得た。上清から、１ｋＤ未満のｍｗｔを有するすべての成分を除去し、「ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品Ｖ」を含有する液体を残すことによって、第２の製品（ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品Ｖと表した）を得た。
【０１８７】
サンプルを、１００℃、１Ｎ ＨＣｌにおいて、その構成要素モノサッカライドに加水分解した。加水分解産物を、移動相として６００ｍＭのＮａＯＨを用い、Ｄｉｏｎｅｘ ＭＡ−１カラムを用いてＨＰＬＣによって分析した。検出はパルス電流法によって行った。
【０１８８】
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＶおよびＶの主要なモノサッカライドは、マンノースと、グルコースと、いくらかのガラクトースであった。表Ｃは、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＶおよびＶの相対モノサッカライド含量を示す。
【表Ｃ】
【０１８９】
（実施例９）
（マウス腹腔浸出細胞（ＰＥＣ）および脾細胞による炎症誘発性サイトカイン産生に対する経口および腹膜内ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置の効果）
（材料および方法）
マウス：これらの研究には２４匹の、５週齢の雄のマウスを用いた。それらを、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ部門から購入した。すべての研究を、ＬＳＵ ＩＡＣＵＣ プロトコール０４−１２０に記載される規定にしたがって実施した。
【０１９０】
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置：マウスを４群に分けた。群１には０．１５Ｍ ＮａＣＩ中２ｍｇ／ｋｇのレンチニアン（ｌｅｎｔｉｎｉａｎ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）に与え、群２には、等容積の生理食塩水をｉ．ｐ．で与え、群３には、１０ｍｇ／ｋｇのＭｅｄｉＭｕｓｈ製品水溶液を胃管栄養法（経口）で与え、群４には等容積の水を経口で与えた。すべてのマウスに１日１回５日間処置を与えた。最後の処置の２４時間後、細胞単離のためにマウスを出血させ、安楽死させた。
【０１９１】
腹腔浸出細胞（ＰＥＣ）の単離および刺激：ＰＥＣを、先に記載されたように（１）腹膜洗浄によって収集した。細胞を、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０（培地）中１×１０６個／ｍＬに濃縮し、２４ウェル組織培養プレートに１ｍＬ／ウェルで分配した。プレートを１２００×ｇで１０分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間静置した。培地を廃棄し、ウェルを加温した培地で１回洗浄し、１．５ｍＬの加温した、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ．Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補充した培地（完全培地）で交換した。各群のウェルの半分を、１０ｎｇ／ｍｌの大腸菌リポ多糖類（ＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１２または２４時間静置した。フィコエリトリンで標識したＣＤ３およびＣＤ１４に対する抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびフルオレセインで標識した抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ａｖｏｎｄａｌｅ，ＰＡ）を用いてフローサイトメトリーによって細胞の表現型を調べた。
【０１９２】
脾細胞の単離および刺激：各マウスから脾臓を採取した。一部を、将来のｍＲＮＡ解析のために急速凍結した。残りの脾臓を、群別にプールし、７０μｍのナイロンスクリーン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を通して押しつぶした。脾細胞を１回洗浄し、ペレットを緩衝塩化アンモニウムに氷上で５分間再懸濁した。細胞を２回洗浄し、完全培地に４×１０７個／ｍＬで再懸濁し、１．５ｍＬ／ウェルで２４ウェル組織培養プレートに分配した。代表的なウェルを１０ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳまたは５μｇ／ｍＬのコンカナビリン（Ｃｏｎｃａｎａｖｉｌｉｎ）Ａ（ＣｏｎＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）で刺激し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１２または２４時間静置した。
【０１９３】
サイトカインについてのＥＬＩＳＡ。ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１２に対するサイトカインＥＬＩＳＡを、血清および培養上清で、製造業者（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって記載されたとおり正確に実施した。希釈していない上清を３連で試験した。血清を試験のために１：１０希釈した。
【０１９４】
（結果および考察）
ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品には、重量増加によって測定されるそれらの増殖に対して統計的に有意な効果がなかった（表１）。しかし、ｉ．ｐ．ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品には、腹膜洗浄液から単離される細胞数および細胞の表現型に対して効果があった。経口によって曝露されたマウスと、生理食塩水をｉ．ｐ．で与えられたマウスは比較的同様であったが、ｉ．ｐ．ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置を受けたマウスの腹膜から単離される細胞総数が増加した（データは示していない）。細胞数の増加は、主に集団中の好中球の増加によるものであった（表２）。マクロファージと比較したＰＭＮによる観察結果への相対的寄与率はこの段階では推定できないが、ｉ．ｐ．群では異なる観察される相違が達成され得る。対照的に、経口群の数および表現型は極めて類似しており、その比較は統計的に妥当であるはずである。
【０１９５】
腹膜内（ｉ．ｐ．）ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置は、１２時間で腹腔浸出細胞（ＰＥＣ）によるＴＮＦα産生の４倍の増加（表３）および脾細胞による３倍の増加（表４）、ならびにＰＥＣ（３０％増加）および脾細胞（２倍）によるインビトロ ＬＰＳ処理に応じて産生さたＴＮＦα量の増加を引き起こした。経口ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置には、ＰＥＣまたは脾細胞によるＴＮＦα産生に対して有意な効果はなかった。興味深いことに、インビトロ ＬＰＳ刺激後にＰＥＣによるＴＮＦα産生において有意な減少（２０％）があった（表４）。これらの結果は、ＴＮＦαに対する効果は局所レベルで開始され得、かつ／またはＭｅｄｉＭｕｓｈ製品に対する直接曝露が必要であり得るということを示す。
【０１９６】
経口およびｉ．ｐ．ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置の双方により、ＰＥＣによるＩＬ−１β産生が大幅に促進される（それぞれ、１８倍および６倍；表４）。さらに、ｉｐ処置を受けたマウスではインビトロ ＬＰＳに応じてＩＬ−１βも、３倍より多く増加した。ＴＮＦ同様、経口ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品に曝露され、インビトロ ＬＰＳで刺激されたマウス由来のＰＥＣによるＩＬ−１β産生は減少した（２倍）。
【０１９７】
処置を受けたマウスおよび処置を受けていないマウス由来の脾細胞は、最初の１２時間の培養において少量のＩＬ−１βしか産生しない。マウスを、経口またはｉ．ｐ．のいずれかでＭｅｄｉＭｕｓｈ製品に曝露させると、マウス由来の脾細胞は、ＬＰＳまたはＣｏｎＡ（Ｔ細胞分裂促進因子）のいずれかでの処理によって刺激されてＩＬ−１βを産生する。
【０１９８】
概して、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品処置は、ＰＥＣによるＩＬ−６産生に対して効果を有していたが、これは非ＬＰＳ処理細胞においてのみ統計的に有意であった（表７）。対照的に、ＩＬ−６産生は、刺激を受けていない脾細胞によって緩やかに上昇したが、ＬＰＳまたはＣｏｎＡ刺激を受けた、経口およびｉ．ｐ．曝露双方の脾細胞によって緩やかに減少した。ＩＬ−６レベルは、次の１２時間の培養にわたって上昇し続けた（表９および１０）。
【０１９９】
１２時間でのインターロイキン１２産生は、ＣｏｎＡ刺激を受けた脾細胞培養の場合を除いてアッセイの検出限界であった（表１２）。ｉ．ｐ．ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品曝露では、マウスはＬＰＳに応じて有意な量のＩＬ−１２を産生する。
【０２００】
経口ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品曝露は、概して、ＰＥＣによる炎症誘発性サイトカイン産生を低減させ、脾細胞による炎症誘発性産生を増加させた。このことは、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品（経口）に対する全身性反応が、先の研究において測定された局所応答（経鼻、ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．）と異なり得ることを示唆する。
【０２０１】
ｉ．ｐ．でおよび経口で投与されたＭｅｄｉＭｕｓｈ製品は、ＭｅｄｉＭｕｓｈ製品の投与量が同等ではないために直接比較できなかった。
【０２０２】
（参考文献）
１．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＪＥ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，ＡＭ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，ＤＨ，Ｓｈｅｖａｃｈ，ＥＭ，Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗ（ｅｄｓ．）．１９９４．「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ｐ３．１５．４
【０２０３】
【表１】
【０２０４】
【表２−３】
【０２０５】
【表３−２】
【０２０６】
【表４−２】
【０２０７】
【表５−２】
【０２０８】
【表６−２】
【０２０９】
【表７−２】
【０２１０】
【表８】
【０２１１】
【表９−１】
【０２１２】
【表１０−１】
【０２１３】
【表９−２】
【０２１４】
【表１０−２】
（機能性食品製品の実施例）
本発明を、本発明に用いるのに好ましい機能性食品製品の適した実施形態を記載することによって、以下、さらに例示する。提供される教示を用いること、それとともに本発明のその他の製品を調製することは十分に当業者の能力の範囲内であると考えられる。
【０２１５】
（実施例１０）
（バー）
７５ｇのダークチョコレートを７０℃で溶かし、続いて、６００ｍｇのＭｅｄｉＭｕｓｈ製品と混合する。この混合物をバーの形の型に注ぎ入れ、一晩冷却する。
【０２１６】
（実施例１１）
（ミルクセーキ）
１００ｍｌのバニラフレーバーのアイスクリームを、１００ｍｌの冷却したミルクと、１０ｍｌのストロベリーシロップと、１ｍｌのキノコ培養から得た細胞外液体と混合する。この混合物をブレンダーに通し、直ちに供する。
【０２１７】
（実施例１２）
（ヌガーバー）
成分重量（ｇ）
水 ７０
Ｈｙｆｏａｍａ（乳化剤）３．５
ゼラチン２．０
糖５１５
グルコースシロップ６０ＤＥ ２５０
グルコースシロップ３５ＤＥ ２５０
スキムミルク粉末１１５
脂肪５０
キノコ培養から得た細胞外液体１ｇ。
【０２１８】
調製方法：ｈｙｆｏａｍａおよびゼラチンを水に溶解し、１５０ｇの糖を加え、泡立て、残りの糖を１３０℃に加熱し、泡に徐々に加える。脂肪、グルコースシロップ、ミルク粉末およびキノコ培養から得た細胞外液体１ｇを加える。放冷し、５０ｇのバーに分割する。
【０２１９】
（実施例１３）
（フルーツドリンク）
１１成分の２００ｇの果汁濃縮物（バナナ、パイナップル、オレンジ、ブドウ、アプリコット、レモン、パッションフルーツ、グアバ、マンゴー）、５ｇのフルクトース、１ｇのイヌリン、１０ｇ、０．１ｇのＭｅｄｉＭｕｓｈ製品ＩＶ、０．９ｇの植物ステロール脂肪酸エステル（＝０．５４ｇのステロール相当物）、５ｇのレシチン、１．５ｇの乳酸カルシウム、７７５ｇの水。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【公開番号】特開２０１２−１７３４７（Ｐ２０１２−１７３４７Ａ）
【公開日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２３３４４８（Ｐ２０１１−２３３４４８）
【出願日】平成２３年１０月２４日（２０１１．１０．２４）
【分割の表示】特願２００７−５２０６６６（Ｐ２００７−５２０６６６）の分割
【原出願日】平成１７年７月１５日（２００５．７．１５）
【出願人】（５０７０１３９３６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３３４４８（Ｐ２０１１−２３３４４８）
【出願日】平成２３年１０月２４日（２０１１．１０．２４）
【分割の表示】特願２００７−５２０６６６（Ｐ２００７−５２０６６６）の分割
【原出願日】平成１７年７月１５日（２００５．７．１５）
【出願人】（５０７０１３９３６）
【Ｆターム（参考）】
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