眼疾患を処置または診断する際に使用するための抗体の抗原結合フラグメント
本発明は、局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用に関する。本発明は、抗体の完全ヒト結合フラグメントを含んでなる、眼疾患の処置または診断のための眼局所投与のための医薬組成物にさらに関する。特に、前記抗体はＨＳＶ１およびＨＳＶ２を中和する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための抗体の抗原結合フラグメントの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術水準
ＨＳＶは、一般にヒトに影響を及ぼすＤＮＡウイルスである。感染は、ウイルスに感染した病巣または分泌物と皮膚または粘膜の直接接触によって起こる。ＨＳＶ１型（ＨＳＶ−１）が主に口腔顔面および眼の感染に関与するのに対して、一般に、ＨＳＶ２型（ＨＳＶ−２）は性行為によって伝播され、生殖器疾患を引き起こす。ＨＳＶ−２は、生殖器外傷と口腔顔面との接触によって眼に感染する可能性もあり、新生児が生殖器ＨＳＶ−２感染を患っている母親の産道を通過する際に、新生児に伝染することもある。
【０００３】
一次ＨＳＶ−１感染は、最も一般的には、三叉神経の粘膜皮膚の分布領域において起こる。それは、無症候性であることも多いが、非特異的上気道感染として現れることもある。一次感染後、ウイルスは感染した上皮細胞から近くの知覚神経末端に広がり、そして神経軸索に沿って三叉神経節内に位置する細胞体に輸送され得る。そこでは、ウイルスゲノムがニューロンの核に入り、そしてそこで潜伏状態でいつまでも存在し続ける。第Ｖ脳神経の３つ（すなわち、視、上顎、下顎）の枝のいずれかの一次感染は、三叉神経節の神経細胞の潜伏感染につながる可能性がある。神経球内におけるＨＳＶのニューロン間での蔓延は、それまで一次眼ＨＳＶ感染を患うことなしに、その後患者に眼疾患を発症させる。
【０００４】
再発性眼ＨＳＶ感染は、三叉神経節内のウイルスの再活性化として伝統的に考えられており、そしてそれは神経軸索を下り眼球組織における溶解感染を引き起こす。証拠は、ウイルスが角膜組織内に潜在的に存在することもあり、そしてそれが再発疾患の別の潜在源となり、さらに移植角膜においてドナー由来ＨＳＶ疾患を引き起こすことを示唆している。
【０００５】
ＨＳＶ感染は、どこにでも存在し、そして世界中で人口の推定３分の１が再発性感染に罹患している。米国だけでも、約２０，０００の眼ＨＳＶの新規症例と、２８，０００を超える再活性化が毎年発生する。
【０００６】
眼の単純ヘルペスウイルス感染は、先進国の感染性疾患による失明の主な原因である。
【０００７】
眼の単純ヘルペスウイルス感染は、より具体的には、４つのカテゴリー：感染性上皮性角膜炎、神経栄養性角膜症、間質性角膜炎、および内皮炎、に分類することもできる。
【０００８】
診断は、角膜病変の特徴的性質に基づく臨床的根拠により、及び排除（exclusion）によって通常おこなわれる。実験室研究は、典型的な知見を欠いている症例において臨床上の疑いを確認する助けとなることもあるが、それらはほとんどの臨床現場で容易に利用可能なものではない。ギムザ染色した上皮小片は、多核巨大細胞を示すことができ、そしてそれは感染角膜上皮細胞の融合と核内ウイルス封入の結果として生じる。しかしながら、陰性の細胞診の結果は、ＨＳＶ感染を排除するわけではない。ウイルス培養は優れた感度を有するが、結果に至るまでに数日かかる。ＨＳＶ抗原検出試験、例えば酵素結合ウイルス誘導システム（ＥＬＶＩＳ）などは特異的であるが、その低い感度によって制限される。そのため、ＥＬＶＩＳ試験結果が陰性である場合には、ＨＳＶの確認のための細胞培養がどのような場合でも推奨され、そしてそれは再び手間がかかる手順をもたらす。涙液サンプル、角膜上皮、前眼房穿刺、または角膜ボタンを使用したポリメラーゼ連鎖反応では、ヘルペス性角膜炎または角膜ブドウ膜炎の症例においてウイルスＤＮＡを検出し得る。しかしながら、それでは潜在しているか活性なＨＳＶ感染であるかを見分けられない。ウイルス粒子が間質の生検材料中に見られないことも多く、そのため培養物を得ることができないので、円板状内皮炎または間質性疾患の症例において、診断は特に難しい。
【０００９】
処置が懸念事項である限り、治療のための抗ウイルス剤が利用可能であるにもかかわらず、この疾患は重大な健康問題のままである。欧州では、（薬物耐性菌株の出現が心配されているが）「Ｚｏｖｉｒａｘ」（アシクロビル）軟膏剤が眼感染を処置するために承認されている。しかしながら、角膜の損傷がアシクロビルによって予防されることはない。米国では、「Ｖｉｒｏｐｔｉｃ」（トリフルオロチミジンの１％水溶液）がこれらの感染用の唯一の承認薬である。アシクロビルとトリフルオロチミジンの両方ともが再発疾患に対して低い有効性しか有さず、その再発疾患が失明につながる角膜混濁の通常の原因である。両調製物の使用により重大な副作用が起こる可能性があり、そしてその製剤のために、患者コンプライアンスにかかわる問題がある。明らかに、改良された治療法上のまたは診断上の戦略がＨＳＶ眼疾患には必要である。
【００１０】
抗体は、様々な疾患の診断薬や治療薬に次第に使用されるようになっている。抗体の使用は、代替処置が非常に不十分である疾患、例えば先に記載の疾患などの診断および処置に非常に有利であろう。
【００１１】
抗体は、感染部位において治療濃度に達するとき、それらが重大な全身性副作用を引き起こす可能性があるにもかかわらず、全身投与され得る。
【００１２】
角膜または前眼部の免疫病理学的状態を調節するための抗体の局所投与は、これらの副作用を避けるために有利であるだろうが、抗体全体では素早く角膜に入り込むには大きすぎるので、それでは効果がない（Allansmith M, de Ramus A, Maurice D. The dynamics of IgG in the cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci 1979; 18:947-55）。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的は、局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号３および／または配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用を提供することである。
【００１４】
本発明の更なる目的は、局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号１および配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用を提供することである。
【００１５】
本発明の更なる目的は、配列番号３および／または配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列または配列番号１および配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列を有することを特徴とする抗体の完全ヒト結合フラグメントを含んでなる眼疾患の処置および／または診断のための眼局所投与のための医薬組成物を提供することである。
【００１６】
具体的には当該抗体は、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２を中和する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＡＣ−８の４日間の５回の点眼とその後最終日の単一点眼後１時間（ａ〜ｋ）、またはＰＢＳの４日間の５回の点眼とその後最終日の単一点眼後１時間（ビヒクル、ｌ〜ｑ）の角膜（ａ〜ｈ、ｌ〜ｎ）および毛様体（ｉ〜ｋ、ｏ〜ｑ）の分析を示す一連の免疫組織化学像の例を示す。ｄおよびｈは、それぞれ（ｄ）ａｌｅｘａ標識された樹状形態の上皮下細胞および（ｈ）標識された角膜内皮を示している、関連した白い四角部分の高倍率像である。スケールバー＝１００μｍ。
【図２】経強膜経路を通ったＦａｂの移行を実証するＡＣ−８の５回の点眼後２４時間の、角膜（cornea）の中央部（ａ〜ｄ）および周辺部（ｅ〜ｊ）の免疫組織化学像を示す。図２ａ：白い四角部分は、過去の潰瘍の上皮再形成領域を示す。図２ｄおよび２ｉは、それぞれ図２ｃおよび２ｈの白い四角部分の高倍率像である：上皮下の間質細胞はＡＣ−８について陽性に標識される。図２ｇおよび２ｊは、それぞれ図２ｆおよび２ｈの白い四角部分の高倍率像であり、陽性にＡＣ−８標識された内皮を示している。図２ｋ〜ｍは、対照のビヒクルで処置した角膜のＩＨＣ分析である。Ｅｐｉｔｈ＝上皮、Ｅｎｄｏｔｈ＝内皮。Ｓｔｒｏｍａ＝間質。Ｉｒｉs＝虹彩。スケールバー＝２００μｍ。
【図３】マウスにおける眼ウイルス感染後に涙膜力価に対するＡＣ−８の効果を示すダイヤグラムであり、その結果、時間の関数として生体内におけるＡＣ−８によるＨＳＶの中和を実証している。
【図４】５μｇのＡＣ−８の５回の点眼後１および６時間の、正常な角膜を有するマウスの房水および硝子体液中のＡＣ−８濃度を示すヒストグラムである。
【図５】５μｇのＡＣ−８の５回の点眼後１および２４時間の、上皮除去した角膜を有するマウスの房水および硝子体液中のＡＣ−８濃度を示すヒストグラムである。
【図６】ｓｃＦｖ ＡＣ−８の濃度上昇の関数としてのプラーク減少アッセイにおける、ＨＳＶ−１の中和を示すダイヤグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
別段の規定のない限り、本明細書中に使用されるすべての技術用語および学術用語は、本願発明が関係している技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと同様または同等な多くの方法および材料を本発明の実施または試験に使用し得るが、適した方法および材料を以下に記載する。別段の言及のない限り、本発明での使用のために本明細書中に記載した技術は当業者にとって周知の標準的な方法論である。
【００１９】
「Ｆａｂ」または「抗原結合フラグメント」という用語では、その抗原に結合する能力を維持しているあらゆる抗体フラグメントが意図され、そして軽鎖または重鎖のいずれかの少なくとも一方の可変ドメインを含んでいる。
【００２０】
「眼疾患」という用語では、あらゆる（一次または二次）感染、例えば（上皮性および間質性）眼角膜炎（ocular keratitis）、眼瞼炎（blepharitis）、結膜炎（conjunctivitis）、眼瞼結膜炎（blepharoconjuntivitis）、潰瘍形成（ulceration）など、が意図される。
【００２１】
「保持増強剤（retention enhancer）」という用語では、疾患によって影響を受ける眼部における製品の保持時間を長引かせるあらゆる物質または組成物、例えばヒアルロン酸ナトリウム、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ビニルポリアルコール、キサンタンガム、ジェランガム、キトサン、ポリ乳酸およびそれらの誘導体など、が意図される。
【００２２】
「医薬組成物」という用語では、物質のあらゆる治療的の許容され得る混合物または組合せ（combination）を意図する。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明によると、配列番号１および配列番号２の配列を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントは、局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のために使用される。
【００２４】
最終的な分子が抗原に結合する能力を維持するように、それぞれ重鎖（配列番号１）および軽鎖（配列番号２）の定常領域がいずれかの適当なヒト免疫グロブリン定常領域により置き換えられ得ることは、理解されるべきである。
【００２５】
よって、本発明による代替の実施形態では、配列番号３または配列番号４を有するｓｃＦｖが、局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のために使用できる。
【００２６】
特に、本発明の抗体は、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２を中和する。特に、ウイルス表面抗原は、ｇＤである。
【００２７】
本発明の医薬は、好ましくは、眼内への抗原結合フラグメントの保持増強剤と共に製剤化される。本発明において有用な保持増強剤は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、キサンタンガム、ジェランガム、キトサン、ポリ乳酸およびその誘導体から成る群から選択され得る。
【００２８】
本発明の医薬は、好ましくは、点眼剤、軟膏剤、ゲル剤、眼科用クリーム剤の形態で存在する。
【００２９】
眼疾患は、有利なことには、眼角膜炎、眼瞼炎、結膜炎、眼瞼結膜炎、潰瘍形成である。
【００３０】
本発明による完全ヒト抗原結合フラグメントは、眼の一部を、疾患を示唆する抗原結合フラグメントと接触させ、そして抗原結合フラグメントと抗原を含んでなる複合体の存在を検出することを含んでなる診断方法のために使用され得る。複合体の検出は、当該技術分野で知られているあらゆる技術、例えば試験管内および生体内における免疫学的アッセイで続いて検出され得る、そこに結合させた検出可能な標識を有する抗原結合フラグメントなどに従って実施され得る。試験管内における方法の例には、酵素結合免疫吸着アッセイ、すなわちＥＬＩＳＡ（間接、サンドイッチ、競合）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）である。
【００３１】
標識は、直接的または間接的に抗原結合フラグメントに結合されるか、または抗原結合分子のその後の反応生成物に取り付けられ得る。標識は、色素体、触媒、酵素、蛍光色素、化学発光分子、放射性同位元素および色素を含む群から選択され得る。
【００３２】
本発明によると、医薬組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む抗体の完全ヒト結合フラグメントを含んでなり、眼疾患の処置または診断のための眼局所投与向けに提供される。
【００３３】
例えば、本発明による医薬組成物は、１５％のＨ2Ｏ、１５％の白色鉱油、７０％のＡｑｕａｐｈｏｒ（登録商標）（軟膏剤）および本発明のＦａｂフラグメント１ｍｇ／ｍｌから成ることもある。
【００３４】
本発明の抗原結合フラグメントは、当該技術分野で知られている別の方法によっても、例えばパパインを用いた抽出ＩｇＧの酵素分解によっても、または（一過性のもしくは安定した）真核または原核生物発現系による遺伝子組み換え産生とその後のアフィニティー精製によっても得ることができる。
【００３５】
本発明による組成物の主な利点は、完全にヒトのものである、すなわち、ヒト・ポリヌクレオチド配列によってコードされているＦａｂに起因する。ＨＳＶ疾患の診断または処置のための本発明のＦａｂの生体内における使用は、異種間またはキメラ誘導のモノクローナル抗体が使用される場合に重大な問題となる、受動的に投与された抗体に対する宿主免疫反応による有害な影響を大いに低減する。
【００３６】
さらに、Ｆａｂフラグメントは、ＩｇＧ全体に対して有利である。というのも、Ｆａｂフラグメントが、細胞上のＦｃ受容体による影響を受けず、また抗原を沈殿させないので、そのためそれらが低い免疫原性しか示さず、且つ、食作用に対してそれほど影響を受けないからである。そのうえ、Ｆａｂフラグメントは、ＩｇＧ分子全体に比べてより急速に組織から除去される。
【００３７】
Ｆａｂはさらに、それらがＥ．コリ（E.coli）発現系により製造されるので、工程、コストおよび時間の点でＩｇＧ抗体に対して製造がより容易である。
【００３８】
Ｆａｂは、安定しており、且つ、可溶性である（不溶性は免疫原性を高める可能性がある性質である）。これらの性質は、原薬や医薬製品の高い発現レベルや最適な安定性を得ることを可能にする。Ｆａｂの安定性は、それらが長い半減期を示すことを可能にする。
【００３９】
本発明の代替の実施形態によると、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）もまた提供される。
【００４０】
図６に示したように、ｓｃＦｖ ＡＣ−８は、試験管内のプラーク減少アッセイによるＨＳＶ感染の中和において非常に効率的である。
【００４１】
ＡＣ−８で処置したマウスからの涙膜サンプルで計測されるウイルス力価は、非特異的Ｆａｂとの比較においてＨＳＶ１の有効な中和を示した。
【００４２】
局所点眼後、ＡＣ−８は、無傷の眼内に移行するので、房水および硝子体液中では点眼の１時間後の時点で、免疫組織化学試験とＥｌｉｓａ試験の両方を使用して検出できた。角膜の上皮除去（de-epithelialisation）後、眼内移行は、房水および硝子体液において促進される。ＡＣ−８は、無傷の角膜の角膜細胞内で可視化でき、主に経強膜経路を通じて眼内に移行するようである。結膜下注射後、ＡＣ−８の眼内移行は、上皮除去した角膜に対して点眼後に得られたものと類似している。しかしながら、角膜の上皮除去後の眼に対する結膜下注射は、ＡＣ−８の眼内移行の５倍の増大をもたらす。免疫組織化学は、ＡＣ−８が樹状上皮下細胞内に蓄積するように思えることを明らかにし、そしてその角膜透過を実証した。局所点眼後に、ＡＣ−８は効果的な抗ウイルス濃度にて中間透光体中で計測された。
【実施例】
【００４３】
実施例１
ＡＣ−８で処置したマウスからの涙膜サンプルにおいて測定されたウイルス力価は、非特異的Ｆａｂと比較して、ＨＳＶ１の有効な中和を示した。
【００４４】
それぞれ３μｌの処置を、感染眼（右側）に点眼薬によって投与した。処置（１ｍｇ／ｍＬのＡＣ−８または非特異的Ｆａｂフラグメント）を、午前８：００、午前１０：００、午後１２：００、午後２：００、午後４：００、午後６：００、午後８：００、午後１０：００に始めるが、それを感染の翌朝（２日目）から開始し、７日間続けた。群の処置は毎日、同じ順序で進められ、そして開始時刻から１時間以内に終了した。マウスを、各処置に関してイソフルオラン（３〜５％）または同等物で麻酔した。
【００４５】
ウイルス株
ほとんどまたは全く死亡することのない中程度のレベルの角膜炎を引き起こす眼分離物であるＣＪ３９４を使用した。動物は、１Ｘ１０５ＰＦＵで右眼を感染された。
【００４６】
感染プロトコール
感染のために、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ケタミン／キシラジンで麻酔した。右側の角膜を、輪部辺縁近くで剥離し、中央部の角膜を無傷なままにした。接種材料を含むＤＭＥＭの５μｌの液滴を、右側の角膜上に乗せ、角膜を覆って眼瞼を２回閉じ、そして動物をそれらのケージに戻した。
【００４７】
ウイルス力価
右眼のウイルス力価のために涙膜サンプルを、感染後１、３、５、７、９、１１および１３日目に採取した。サンプル採取のために、マウスを簡単に麻酔し、そしてそれらのケージに戻した。サンプルは、それぞれ数日の処置の開始の前に角膜上に１０μｌの細胞培養培地を乗せ、ピペットマンを用いて液体を２〜３回洗い流して、次にウイルス学検査室への輸送のために液体を１９０μｌの培地に移すことによって採集した。次に、そのサンプルを、連続的に希釈し、そしてＶｅｒｏ細胞単層上で滴定した。涙膜サンプルの採集のために、マウスをイソフルオランまたは同等物（３〜５％）で麻酔した。結果を図３に示す。
【００４８】
実施例２
ＡＣ−８は、無傷の眼内に移行するので、点眼の１時間後に免疫組織化学によって、房水中および硝子体液中で検出され得る。
【００４９】
この一連の実験を、局所的に投与したＡＣ−８ Ｆａｂフラグメントの移行を評価するために実施した。特に、この実験を、ラットの正常な角膜上に局所的に投与したときのＦａｂの生体分布を評価するために実施した。
【００５０】
試験した物質は、ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌの濃度のＦａｂフラグメントであった。投与経路は、両眼における点眼または結膜下注射によるものであった。投与容量は、以下のとおりであった：
−支給されたスポイト・バイアルを使用して、１点眼あたり５０μＬ、
−インシュリン用シリンジを使用した結膜下注射のために５０μＬ。
【００５１】
動物は、アルビノＬｅｗｉｓラット（６〜８週齢、１２０〜１５０ｇ、Charles River）であった。動物を、パリ第Ｖ大学の倫理委員会および実験眼科学における動物の使用に関するＡＲＶＯ文書によって認証および認可された条件に維持した。ラットは、ペントバルビタールの致死注射によって生体内実験の最後に屠殺した。
【００５２】
投与のために、ラットには麻酔しなかったが、角膜との接触時間を延ばすために数秒間、体を拘束した状態にそっと保った。１群あたり３匹のラット（６眼）を使用した。動物には、以下のとおり投与した：
【００５３】
【表１】
【００５４】
注意事項１：第２群は、一回分の用量を実現するために実施した。１時間あたり１滴は治療計画に準拠していない。
注意事項２：第３群は、起きている間に１日あたり５回の点眼により実施したが、これは治療計画に準拠している。
【００５５】
サンプリングについて、以下の表中にまとめる：
【００５６】
【表２】
【００５７】
各群（１〜７）のうちの２匹のラット（４眼）を、対物スライド上に平面封入するための角膜を解剖するために使用した。眼を氷上で解剖した。合計２８枚の角膜を解剖し、そして２４ウェルプレート内で平面封入したものを−８０℃にて保存した。
【００５８】
各群の３番目のラットの両眼（１〜７、合計１４個のサンプル）を、−８０℃にてＯＣＴ（Optimum Cutting Temperature compound、Tissue-Tek）中に入れた。すべての右眼を、凍結切片法に使用し、そして必要であれば、すべての左眼を更なる使用のために−８０℃にて保存した。
【００５９】
凍結切片を、角膜層および眼球内のＡＣ−８ Ｆａｂの分布を測定するための標識抗体を用いた免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析に使用した。
【００６０】
凍っている凍結切片（１０μｍ）を、以下のとおり処理した：
−ＲＴにてパラホルム４％中で１５分間、固定し、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中、１０分間で２度すすぎ、
−ＲＴにてＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％中で２×１０分間すすぎ、
−対照をＰＢＳ１Ｘのみの中でインキュベートしたことを除いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Pierce#31132、ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％中に１／５０）と一緒に＋４℃にて一晩インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．１％中で３×１０分間すすぎ、
【００６１】
−分子プローブであるロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（赤色）１／５０と一緒に、暗所内で＋２０℃にて１時間インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中、１０分間で２度すすぎ、
−核標識のために、ＰＢＳ １Ｘ中のＤＡＰＩ（４’、６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（青色）１／５０００中、暗所内でＲＴにて５分間インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中で５×５分間すすぎ、
−ＲＴにて蒸留水中で１０分間で１度すすぎ、そして乾燥させ、
−蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用したレクチャー（lecture）のために顕微鏡用スライド上に乗せた。
【００６２】
角膜上のＡＣ−８の共焦点局在を得るために、ＩＨＣも平面封入した角膜に対して実施した。ＩＨＣプロトコールの最適化を角膜の１／４で実施した。この技術の感度は、入手可能な材料では明確な共焦点像を得るのに十分には最適化できなかった。これらの結果は正しく解釈されないかもしれない。これが、ＡＣ−８の移行を測定するために全眼切片を選択した理由である。
【００６３】
核を、ＤＡＰＩを用いて青色に染色し、そしてＡＣ−８を示すのに使用した抗ヒトＩｇＧ抗体は赤色に見える（二次抗体はＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４標識されている）。
【００６４】
第１群「Ｈ１」（０日目：１回のＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの点眼、１時間後に屠殺）。
【００６５】
ＡＣ−８処置眼（第１群）とＰＢＳ対照眼（第６群）との間で、蛍光に差がないことが示され、ＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの単回点眼の１時間後に、ＡＣ−８移行が眼組織内において観察されないことが実証された。
【００６６】
第２群「Ｈ６」（０日目：５回のＡＣ−８、１０μｇ／ｍｌの点眼、１時間後に屠殺）。
【００６７】
ＡＣ−８を５時間にわたって毎時間ごとに点眼したとき、および屠殺を最後の点眼の１時間後に実施したとき、上皮下間質中に位置している樹状細胞によるＡＣ−８の貪食に相当する可能性もあるドットとして、ＡＣ−８が角膜の周辺部において検出される。角膜の中央部では、染色はまた、広範なシグナルならびにまばらなシグナルとして間質中でも観察される。毛様体および網膜では、ＰＢＳ処置ラット（第６群）と比較すると、広範囲であるが、薄い染色が検出できる。
【００６８】
第３群「Ｄ４」（０日目〜３日目：１日あたり５回のＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの点眼、４日目：１回の点眼、１時間後に屠殺）。
【００６９】
角膜に対する免疫組織化学が、４日間にわたる１日５回の、および５日目の１回のＡＣ−８による処置に続いた。結果を第６ビヒクル群と比較した。ＡＣ−８が、１０μｇ／ｍｌの濃度にて４日間にわたり１日に５回点眼されるとき（図１、ａ〜ｋ）、ＡＣ−８の強い移行が、角膜の周辺部（図１ｅ〜ｈ）、ならびに角膜中央部の前部間質（図１ａ〜ｄ）において観察される。ＡＣ−８の移行は、角膜の中央部より角膜の周辺部、輪部、および毛様体においてはるかに高く、ＡＣ−８が経強膜経路を通して眼内に移行し、その後角膜中に拡散することを示唆している。ここで再び、樹状細胞はＡＣ−８を貪食したように思われる、というのも、ＡＣ−８で陽性に染色された樹状細胞が上皮下間質に位置しているからである（図１ｄ）。網膜では、ＡＣ−８は、内側の網膜の境界の星状細胞内に位置している。
【００７０】
第４群「ＳＣＪ１」（０日目：１回のＡＣ−８、１０μｇ／ｍｌの結膜下注射、１時間後に屠殺）。
【００７１】
ＡＣ−８の単回の結膜下注射は、前眼部と後眼部の両方におけるＡＣ−８の非常に強い染色という結果をもたらす。結果を第７ビヒクル群と比較した。角膜では、ＡＣ−８は、広範囲の染色として上皮内および間質内で濃縮され、ならびに角膜細胞内に位置する。
【００７２】
毛様体では、ＡＣ−８は移行したと思われ、そして上皮細胞内に蓄積される。網膜では、ＡＣ−８は明らかに膠細胞（星状細胞ならびにMuller膠細胞の延長部分）内に位置している。網膜の色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞）では、同様に強いシグナルが観察される。
【００７３】
第５群「ＳＣＪ６」（０日目：１回のＡＣ−８、１０μｇ／ｍｌの結膜下注射、６時間後に屠殺）。
【００７４】
角膜では、ＡＣ−８は、原則的に間質内に一部残っているように見える。毛様体では、第４群と比較して、蛍光シグナルが減少しているが、この時点では輪部はまだ染色されている。網膜では、ＡＣ−８シグナルは、もはや膠細胞および星状細胞内には存在していない。網膜の色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞）では、同様にシグナルが減少している。結果を第７ビヒクル群と比較した。
【００７５】
これらの実験において、最初の抗体を入れない内部対照は陰性であり、そして多少の非特異的バックグラウンドを示したＰＢＳ処置眼とは対照的に、ごくわずかな非特異的バックグラウンドしか示さなかった。
【００７６】
ＩＨＣ検出によるサンプルの分析は、ＡＣ−８を特異的な免疫組織化学プロトコールを使用して検出できることを示唆している。正常な角膜に対するＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの点眼後に、抗体は：
−単回点眼の１時間後の角膜または眼組織のいずれでも検出されず；
−５回の点眼後に角膜では検出され、弱いシグナルが毛様体で観察されたが、網膜ではシグナルを検出できず；
−４日間にわたって１日５回点眼すると、角膜、毛様体および網膜において強く位置している。
【００７７】
角膜移行が観察されるとき、２つのタイプの染色：一方が間質に位置している広範囲の染色、そしてもう一方が上皮下角膜細胞（角化嚢胞または樹状細胞）内の濃厚な染色、が検出される。ＡＣ−８は正常な角膜中の上皮下間質内の細胞および上皮除去した角膜における全間質厚の中の細胞において観察されるので（次の実施例を参照のこと）、ＡＣ−８が樹状細胞により貪食されることは可能である。
【００７８】
ＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの単回結膜下注射の１時間後、抗体は角膜だけに位置するのではなく、毛様体、および網膜の星状細胞や膠細胞内でも観察される。この投与経路を使用して、網膜の深外層（網膜色素上皮細胞）もまた染色される。染色は、点眼後に観察されるように、中央部に比べて角膜の周辺部でより強い。ＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの単回結膜下注射の６時間後、抗体は眼からほとんど排除されている：それは角膜や輪部にわずかに残っているが、もはや毛様体や網膜では検出できない。
【００７９】
結論として、これらの観察は、ＡＣ−８が無傷の角膜を通って、またはその隣接輪部を通って眼の眼組織の内側に移行できること、そしてこの移行が１０μｇ／ｍｌの濃度にて観察し得ることを示唆している。
【００８０】
ＡＣ−８は、輪部の経強膜経路を通って移行しているように見え、そしてそれが網膜移行および角膜周辺部における強い染色を説明している。ＡＣ−８は、樹状細胞または角化嚢胞に相当し得る角膜細胞内に貪食される。ＡＣ−８が樹状細胞の活性化を引き起こすかどうか、依然として明らかにされていない。
【００８１】
実施例３
ＡＣ−８は、無傷の眼内へ移行するので、点眼の１時間後にＥＬＩＳＡ試験を使用することによって、房水中および硝子体液中で検出できる。
【００８２】
ブラウン・ノルウェー系統からの６０（６０）匹の有色ラットを、６（６）匹の動物から成る１０（１０）個の群に無作為に割り付ける。
【００８３】
局所投与（第１〜８群）のために、動物に１日に５回、両眼に１０μｌの試験物またはビヒクルを与えた。
【００８４】
結膜下投与（第９および１０群）のために、動物に、両眼への５０μｌの試験物１の単回注射を与えた。
【００８５】
以下の表には、処置群の動物の割り当てをまとめてある：
【００８６】
【表３】
【００８７】
相当する時点において、動物を麻酔した。血清の調製のために、全血をサンプリングした。安楽死後、房水（ＡＨ）、角膜上皮（Ｃｅｐｉ）、角膜間質＋内皮（Ｃｓｔｒ＋ｅｎｄ）、硝子体液（Ｖ）および網膜（Ｒ）を、両眼からサンプリングし、Ｅｌｉｓａ分析のために各動物について保存した。
【００８８】
投与の経路と方法
第１〜８群について、試験物またはビヒクルを、適当なマイクロピペットを使用して、日中（午前８〜午後４：００）、両眼に５×１０μｌを点眼した。
【００８９】
第９〜１０群について、動物に、麻酔下（キシラジン５ｍｇ／ｋｇ；ケタミン２５ｍｇ／ｋｇの筋肉内注射）、両眼に単回結膜下注射（５０μｌ）を与えた。
【００９０】
先の表中に列挙した時点において、動物を、Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）（キシラジン５ｍｇ／ｋｇ）とＩｍａｌｇｅｎｅ（登録商標）１０００（ケタミン２５ｍｇ／ｋｇ）の混合溶液の筋肉内注射によって麻酔した。
【００９１】
約２ｍｌの血液を、屠殺直前に心臓穿刺によって採取した。各動物について６００μｌの血清を、Ｅｌｉｓａアッセイまで−８０℃にて保存した。
【００９２】
過量のペントバルビタールの心臓注射によって、動物を安楽死させた。
【００９３】
屠殺直後に、房水（ＡＨ）、角膜上皮（Ｃｅｐｉ）、角膜間質＋内皮（Ｃｓｔｒ＋ｅｎｄ）、硝子体液（Ｖ）および網膜（Ｒ）を、２匹のラットの両眼から素早く、且つ、慎重に解剖した。両眼からの眼球構造物を、各群からの各動物について保存した。
【００９４】
房水および硝子体液中のＡＣ−８濃度の結果を、図４に示す。
【００９５】
実施例４
角膜の上皮除去後、眼内移行は、房水および硝子体液において促進される。
【００９６】
ラットの上皮除去した角膜上に局所投与したとき、および角膜の上皮再形成相の間のＦａｂの生体分布を評価するために、この一連の実験を実施した。この実験は、局所投与したＡＣ−８ Ｆａｂフラグメントの移行、および角膜−潰瘍の瘢痕形成の間の角膜内へのＦａｂの移行の評価を可能にした。
【００９７】
試験する物質は、先に記載したとおりのものであったが、濃度は１００μｇ／ｍｌであった。動物は先に記載したとおりのものであった。点眼または結膜下注射は、両眼ではなく片眼で実施した。
【００９８】
０日目には、一般的な麻酔（キシラジン＋ケタミン）および局所麻酔下、調整された生検パンチと外科用メスを使用して、それぞれの動物の片方の眼を調整した角膜の領域において上皮除去した。倫理的理由から、角膜潰瘍モデルとそれに続く処置は、動物１匹あたり１眼に対してのみ実施した。反対側の眼は、手付かずのままにしておかなくてはならない。１群あたり５匹のラット（５眼、右眼のみ）を使用した。動物に、以下のとおり投与した：
【００９９】
【表４】
【０１００】
サンプリングについて、以下の表中にまとめる：
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
各群（１〜８）の４匹のラット（４つの処置眼）を、ＥＬＩＳＡ試験のための房水と硝子体液、血清および神経網膜を採取するのに使用した。血清サンプル（約１〜２ｍＬ）を、屠殺直前に第１〜８群の各群の５匹のラットから採取した。合計３２個の房水（約１０〜２０μＬ）および硝子体液（約２０〜３０μＬ）のサンプル、３２個の角膜および網膜のサンプル、ならびに４０個の血清サンプルを、ねじ蓋の付いたエッペンドルフ・コンテナ内に採取し、そして−８０℃にて保存した。
【０１０３】
各群の５匹のラットの両眼（合計１６個のサンプル）を固定し、そして凍結切片法の準備をした。
【０１０４】
凍結切片を、角膜層および眼球内のＡＣ−８ Ｆａｂの分布を測定するための標識抗体を用いた免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析に使用した。
【０１０５】
凍っている凍結切片（１０μｍ）を、以下のとおり処理した：
−室温（ＲＴ）にてパラホルム４％中で１５分間、固定し、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中、１０分間で２度すすぎ、
−ＲＴにてＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％中で２×１０分間すすぎ、
−対照をＰＢＳ１Ｘのみの中でインキュベートしたことを除いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Pierce#31132、ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％中に１／５０）と一緒に＋４℃にて一晩インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．１％中で３×１０分間すすぎ、
【０１０６】
−分子プローブであるロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（赤色）１／５０と一緒に、暗所内で＋２０℃にて１時間インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中、１０分間で２度すすぎ、
−核標識のために、ＰＢＳ １Ｘ中のＤＡＰＩ（４’、６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（青色）１／５０００中、暗所内でＲＴにて５分間インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中で５×５分間すすぎ、
−ＲＴにて蒸留水中において１０分間、１度すすぎ、そして乾燥させ、
−蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用したレクチャー（lecture）のために顕微鏡用スライド上に乗せた。
【０１０７】
核を、ＤＡＰＩを用いて青色に染色した。ＡＣ−８を示すのに使用した抗ヒトＩｇＧ抗体は赤色に見える（二次抗体はＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４標識されている）。
【０１０８】
第１群「Ｈ５」（０日目：５回のＡＣ−８ １００μｇ／ｍＬの点眼、最後の点眼の１時間後に屠殺）。
【０１０９】
ＡＣ−８は、角膜の中央部（特に、上皮形成−上皮除去領域の間の接合点）、および周辺部においてはっきりと検出される：ＡＣ−８は潰瘍形成の境界における上皮下の空間で濃縮される。興味深いことに、ＡＣ−８移行はまた、上皮下の空間において角膜の周辺部でも観察される。角膜内皮では、ＡＣ−８は中央部の領域において検出されないが、周辺部領域でわずかに検出できる。対照であるＰＢＳ処置角膜の免疫組織化学は、非常にわずかなバックグラウンドしか示さない。
【０１１０】
輪部では、ＡＣ−８は毛様体と虹彩にも位置している。ここで留意すべきは、ＡＣ−８がさらに輪部の血管内皮細胞内でも同定されることである。
【０１１１】
上皮除去した角膜上のこのＡＣ−８分布は、Ｆａｂの移行が、直接角膜を透過した移行というよりむしろ、主に輪部および経強膜経路を通して起こっていることを示している。
【０１１２】
第１群では、ＡＣ−８の非常に弱い標識付けが網膜で観察される。
【０１１３】
第２群「Ｈ２９」（０日目：５個のＡＣ−８ １００μｇ／ｍＬの点眼、２４時間後に屠殺）。
【０１１４】
第２群では、角膜中央部の角膜上皮は、再構成された上皮の表面に多少不規則なものがあるが（図２ａの白い四角部分）、実験した切片のすべてほとんど完全に再形成されている（図２ａ〜ｊ）。ＡＣ−８は、上皮下の空間の細胞内に位置したままである。角膜の周辺部（図２ｅ〜ｊ）では、ＡＣ−８が、上皮、上皮下の空間（図２ｉ矢印）において濃縮され、そして内皮に蓄積される（図２ｇおよび２ｊ、矢印）。
【０１１５】
５回の点眼の２４時間後に、ＡＣ−８は、角膜表面から角膜の深層内そして内皮まで移行した。それはまた、この時点で虹彩においてもはっきりと観察される（図２ｆおよび２ｈの矢印）。ＡＣ−８を含む浸潤細胞が、角膜の上皮下の空間に位置している（図２ｆおよび２ｈ、矢印、図２ｃ、高倍率、図２ｉ、矢印）。これらの細胞は、多形核細胞、マクロファージまたは樹状細胞に該当するはずである。
【０１１６】
輪部および毛様体では、ＡＣ−８は、上皮を通って移行し、そして上皮下の領域および毛様体に位置している。
【０１１７】
第２群では、ＡＣ−８は、網膜後部の中央で検出されるのではなく、周辺網膜で検出される。第７対照群と比較すると、ＡＣ−８は、周辺網膜の顆粒層に位置しているように見える。
【０１１８】
第３群「Ｄ２」（０日目〜１日目：ＡＣ−８ １００μｇ／ｍＬの１日あたり５回の点眼、２日目：１回の点眼、１時間後に屠殺）。
【０１１９】
第３群では、上皮は完全に再形成され、そして点眼を瘢痕形成期間中続けた。ＡＣ−８は、ビヒクル対照群と比較すると、角膜上皮細胞、間質細胞では非常に強く、そして内皮ではわずかに検出される。
【０１２０】
第３群の輪部および網膜前部の実験は、ＡＣ−８が、ビヒクル対照群と比較すると、毛様体において深く移行したことを示している。ＡＣ−８は毛様体上皮内で同定される。
【０１２１】
第３群では、ＡＣ−８の顕著な染色は、網膜後部（中央部）ではなく、周辺網膜で認められる。興味深いことに、ＡＣ−８は、すべての網膜層、ならびにＲＰＥ細胞層の中に拡散したように見える。
【０１２２】
無傷の角膜上のＡＣ−８の移行（上記を参照のこと）と比較すると、上皮の潰瘍形成がＡＣ−８の網膜移行を促進したように見える。
【０１２３】
第４群「ＳＣＪ１」（０日目：１回のＡＣ−８溶液、１００μｇ／ｍｌ、の注射、１時間後に屠殺）、第５群「ＳＣＪ６」（０日目：１回のＡＣ−８溶液、１００μｇ／ｍｌ、の注射、６時間後に屠殺）、第６群「ＳＣＪ２４」（０日目：１回のＡＣ−８溶液、１００μｇ／ｍｌ、の注射、２４時間後に屠殺）。
【０１２４】
結膜下の空間へのＡＣ−８の単一投与は、１時間、６時間および２４時間の時点でＡＣ−８が角膜周辺部に移行できるようにするのに効果的である。
【０１２５】
結膜下注射後のＡＣ−８の移行は、周辺角膜において角膜の中央部よりも強く、そしてそこでは、潰瘍角膜（第４群および第５群）でさえ全時点において移行が弱いままであった。上皮の完全性の再形成は、２４時間の時点ですべての角膜層および虹彩におけるＡＣ−８分布に影響を及ぼさない（第６群）。
【０１２６】
輪部および毛様体では、ＡＣ−８は、第６群における輪部の上皮下領域でのＡＣ−８の更なる濃縮と併せて、第４および５群で観察されたように均一に分配される。結膜下注射もまた、１時間（第４群）、６時間（第５群）および２４時間（第６群）の時点で、周辺網膜の網膜層においてだけではなく、よりわずかではあるが、網膜後部においても、角膜潰瘍形成のある眼においてＡＣ−８の移行を可能にするのに効果的である。２４時間の時点で、ＡＣ−８は、周辺網膜で大部分が濃縮されている（第６群）。
【０１２７】
網膜では、ＡＣ−８は、網膜細胞におけるまばらな濃度の染色として検出されるが、ＡＣ−８は網膜全体に均一に分配されていない。
【０１２８】
ＩＣＨ観察を、以下の表中にまとめる：
【０１２９】
【表６】
【０１３０】
上皮再形成過程の間、ＡＣ−８の点眼は、対照と比較すると角膜の瘢痕形成を遅らせず、且つ、いずれかの臨床的または組織学的な炎症反応を顕著に促進することもない。
【０１３１】
角膜（上皮、間質および内皮）のＡＣ−８の移行は、主に角膜輪部および輪部において観察される。ＡＣ−８は角膜細胞（上皮および内皮細胞、ならびに間質細胞）内で検出され、そしてまた、ＡＣ−８注射に対する局所的な免疫学的反応の結果として生じ得た上皮下の浸潤細胞内でも観察される（ＡＣ−８は外来−ヒト−タンパク質として認識される）。
【０１３２】
ＡＣ−８は、もっと遅い時点で、虹彩、毛様体および周辺網膜にも移行し、そして外側から内側の眼組織への拡散を示唆した。興味深いことには、ＡＣ−８がさらに内皮細胞から成る血管内皮においても観察され、それがＡＣ−８の全身的拡散が起こる可能性があり得ることを暗示することである。
【０１３３】
角膜の異なった領域でのＡＣ−８の局在化は、潰瘍が上皮の中央部に存在しているときでさえ、ＡＣ−８移行がほとんど経強膜経路を通して起きていることをはっきりと示している。
【０１３４】
ＡＣ−８の点眼は、すべての病期のヘルペス性角膜炎において、角膜上皮が再形成しているときでさえ、角膜に移行できるはずである。
【０１３５】
結膜下注射は、角膜を標的とするＡＣ−８の反復点眼と同じくらい効果的である。
【０１３６】
角膜におけるＡＣ−８の移行は、点眼または結膜下注射のいずれかを使用した同じ経強膜経路をたどるように見える。
【０１３７】
結膜下注射は、毛様体および網膜を標的とする反復点眼より効果的である。
【０１３８】
上皮除去した角膜の房水および硝子体液に対して得られたＥＬＩＳＡの結果を、図５にまとめる。図から分かるように、房水および硝子体液の両方でのＡＣ−８定量化は、眼内への効果的な移行を実証している。
【０１３９】
結論として、潰瘍角膜に対して実施したこの分布研究から、１日あたりの５回の点眼が上皮除去した角膜に対して無毒であると考えられる。
【０１４０】
１日あたりの５回の点眼後、ＡＣ−８は、２４時間、角膜細胞内に位置したままであり、そして角膜深層、ならびに虹彩および毛様体内に移行する。
【０１４１】
ＡＣ−８の移行は、輪部および経強膜経路を通してほとんど観察され、そしてそれは、ＡＣ−８がすべての病期のヘルペス性角膜炎において、上皮が再形成されるときでさえ、角膜に移行できることを示唆している。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ−１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図１ｇ−１ｈ】
【図１ｉ】
【図１ｊ】
【図１ｋ】
【図１ｌ】
【図１ｍ】
【図１ｎ】
【図１ｏ】
【図１ｐ】
【図１ｑ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ−２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ−２ｇ】
【図２ｈ−２ｊ】
【図２ｋ】
【図２ｌ】
【図２ｍ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための抗体の抗原結合フラグメントの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術水準
ＨＳＶは、一般にヒトに影響を及ぼすＤＮＡウイルスである。感染は、ウイルスに感染した病巣または分泌物と皮膚または粘膜の直接接触によって起こる。ＨＳＶ１型（ＨＳＶ−１）が主に口腔顔面および眼の感染に関与するのに対して、一般に、ＨＳＶ２型（ＨＳＶ−２）は性行為によって伝播され、生殖器疾患を引き起こす。ＨＳＶ−２は、生殖器外傷と口腔顔面との接触によって眼に感染する可能性もあり、新生児が生殖器ＨＳＶ−２感染を患っている母親の産道を通過する際に、新生児に伝染することもある。
【０００３】
一次ＨＳＶ−１感染は、最も一般的には、三叉神経の粘膜皮膚の分布領域において起こる。それは、無症候性であることも多いが、非特異的上気道感染として現れることもある。一次感染後、ウイルスは感染した上皮細胞から近くの知覚神経末端に広がり、そして神経軸索に沿って三叉神経節内に位置する細胞体に輸送され得る。そこでは、ウイルスゲノムがニューロンの核に入り、そしてそこで潜伏状態でいつまでも存在し続ける。第Ｖ脳神経の３つ（すなわち、視、上顎、下顎）の枝のいずれかの一次感染は、三叉神経節の神経細胞の潜伏感染につながる可能性がある。神経球内におけるＨＳＶのニューロン間での蔓延は、それまで一次眼ＨＳＶ感染を患うことなしに、その後患者に眼疾患を発症させる。
【０００４】
再発性眼ＨＳＶ感染は、三叉神経節内のウイルスの再活性化として伝統的に考えられており、そしてそれは神経軸索を下り眼球組織における溶解感染を引き起こす。証拠は、ウイルスが角膜組織内に潜在的に存在することもあり、そしてそれが再発疾患の別の潜在源となり、さらに移植角膜においてドナー由来ＨＳＶ疾患を引き起こすことを示唆している。
【０００５】
ＨＳＶ感染は、どこにでも存在し、そして世界中で人口の推定３分の１が再発性感染に罹患している。米国だけでも、約２０，０００の眼ＨＳＶの新規症例と、２８，０００を超える再活性化が毎年発生する。
【０００６】
眼の単純ヘルペスウイルス感染は、先進国の感染性疾患による失明の主な原因である。
【０００７】
眼の単純ヘルペスウイルス感染は、より具体的には、４つのカテゴリー：感染性上皮性角膜炎、神経栄養性角膜症、間質性角膜炎、および内皮炎、に分類することもできる。
【０００８】
診断は、角膜病変の特徴的性質に基づく臨床的根拠により、及び排除（exclusion）によって通常おこなわれる。実験室研究は、典型的な知見を欠いている症例において臨床上の疑いを確認する助けとなることもあるが、それらはほとんどの臨床現場で容易に利用可能なものではない。ギムザ染色した上皮小片は、多核巨大細胞を示すことができ、そしてそれは感染角膜上皮細胞の融合と核内ウイルス封入の結果として生じる。しかしながら、陰性の細胞診の結果は、ＨＳＶ感染を排除するわけではない。ウイルス培養は優れた感度を有するが、結果に至るまでに数日かかる。ＨＳＶ抗原検出試験、例えば酵素結合ウイルス誘導システム（ＥＬＶＩＳ）などは特異的であるが、その低い感度によって制限される。そのため、ＥＬＶＩＳ試験結果が陰性である場合には、ＨＳＶの確認のための細胞培養がどのような場合でも推奨され、そしてそれは再び手間がかかる手順をもたらす。涙液サンプル、角膜上皮、前眼房穿刺、または角膜ボタンを使用したポリメラーゼ連鎖反応では、ヘルペス性角膜炎または角膜ブドウ膜炎の症例においてウイルスＤＮＡを検出し得る。しかしながら、それでは潜在しているか活性なＨＳＶ感染であるかを見分けられない。ウイルス粒子が間質の生検材料中に見られないことも多く、そのため培養物を得ることができないので、円板状内皮炎または間質性疾患の症例において、診断は特に難しい。
【０００９】
処置が懸念事項である限り、治療のための抗ウイルス剤が利用可能であるにもかかわらず、この疾患は重大な健康問題のままである。欧州では、（薬物耐性菌株の出現が心配されているが）「Ｚｏｖｉｒａｘ」（アシクロビル）軟膏剤が眼感染を処置するために承認されている。しかしながら、角膜の損傷がアシクロビルによって予防されることはない。米国では、「Ｖｉｒｏｐｔｉｃ」（トリフルオロチミジンの１％水溶液）がこれらの感染用の唯一の承認薬である。アシクロビルとトリフルオロチミジンの両方ともが再発疾患に対して低い有効性しか有さず、その再発疾患が失明につながる角膜混濁の通常の原因である。両調製物の使用により重大な副作用が起こる可能性があり、そしてその製剤のために、患者コンプライアンスにかかわる問題がある。明らかに、改良された治療法上のまたは診断上の戦略がＨＳＶ眼疾患には必要である。
【００１０】
抗体は、様々な疾患の診断薬や治療薬に次第に使用されるようになっている。抗体の使用は、代替処置が非常に不十分である疾患、例えば先に記載の疾患などの診断および処置に非常に有利であろう。
【００１１】
抗体は、感染部位において治療濃度に達するとき、それらが重大な全身性副作用を引き起こす可能性があるにもかかわらず、全身投与され得る。
【００１２】
角膜または前眼部の免疫病理学的状態を調節するための抗体の局所投与は、これらの副作用を避けるために有利であるだろうが、抗体全体では素早く角膜に入り込むには大きすぎるので、それでは効果がない（Allansmith M, de Ramus A, Maurice D. The dynamics of IgG in the cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci 1979; 18:947-55）。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的は、局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号３および／または配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用を提供することである。
【００１４】
本発明の更なる目的は、局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号１および配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用を提供することである。
【００１５】
本発明の更なる目的は、配列番号３および／または配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列または配列番号１および配列番号２に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列を有することを特徴とする抗体の完全ヒト結合フラグメントを含んでなる眼疾患の処置および／または診断のための眼局所投与のための医薬組成物を提供することである。
【００１６】
具体的には当該抗体は、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２を中和する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＡＣ−８の４日間の５回の点眼とその後最終日の単一点眼後１時間（ａ〜ｋ）、またはＰＢＳの４日間の５回の点眼とその後最終日の単一点眼後１時間（ビヒクル、ｌ〜ｑ）の角膜（ａ〜ｈ、ｌ〜ｎ）および毛様体（ｉ〜ｋ、ｏ〜ｑ）の分析を示す一連の免疫組織化学像の例を示す。ｄおよびｈは、それぞれ（ｄ）ａｌｅｘａ標識された樹状形態の上皮下細胞および（ｈ）標識された角膜内皮を示している、関連した白い四角部分の高倍率像である。スケールバー＝１００μｍ。
【図２】経強膜経路を通ったＦａｂの移行を実証するＡＣ−８の５回の点眼後２４時間の、角膜（cornea）の中央部（ａ〜ｄ）および周辺部（ｅ〜ｊ）の免疫組織化学像を示す。図２ａ：白い四角部分は、過去の潰瘍の上皮再形成領域を示す。図２ｄおよび２ｉは、それぞれ図２ｃおよび２ｈの白い四角部分の高倍率像である：上皮下の間質細胞はＡＣ−８について陽性に標識される。図２ｇおよび２ｊは、それぞれ図２ｆおよび２ｈの白い四角部分の高倍率像であり、陽性にＡＣ−８標識された内皮を示している。図２ｋ〜ｍは、対照のビヒクルで処置した角膜のＩＨＣ分析である。Ｅｐｉｔｈ＝上皮、Ｅｎｄｏｔｈ＝内皮。Ｓｔｒｏｍａ＝間質。Ｉｒｉs＝虹彩。スケールバー＝２００μｍ。
【図３】マウスにおける眼ウイルス感染後に涙膜力価に対するＡＣ−８の効果を示すダイヤグラムであり、その結果、時間の関数として生体内におけるＡＣ−８によるＨＳＶの中和を実証している。
【図４】５μｇのＡＣ−８の５回の点眼後１および６時間の、正常な角膜を有するマウスの房水および硝子体液中のＡＣ−８濃度を示すヒストグラムである。
【図５】５μｇのＡＣ−８の５回の点眼後１および２４時間の、上皮除去した角膜を有するマウスの房水および硝子体液中のＡＣ−８濃度を示すヒストグラムである。
【図６】ｓｃＦｖ ＡＣ−８の濃度上昇の関数としてのプラーク減少アッセイにおける、ＨＳＶ−１の中和を示すダイヤグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
別段の規定のない限り、本明細書中に使用されるすべての技術用語および学術用語は、本願発明が関係している技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと同様または同等な多くの方法および材料を本発明の実施または試験に使用し得るが、適した方法および材料を以下に記載する。別段の言及のない限り、本発明での使用のために本明細書中に記載した技術は当業者にとって周知の標準的な方法論である。
【００１９】
「Ｆａｂ」または「抗原結合フラグメント」という用語では、その抗原に結合する能力を維持しているあらゆる抗体フラグメントが意図され、そして軽鎖または重鎖のいずれかの少なくとも一方の可変ドメインを含んでいる。
【００２０】
「眼疾患」という用語では、あらゆる（一次または二次）感染、例えば（上皮性および間質性）眼角膜炎（ocular keratitis）、眼瞼炎（blepharitis）、結膜炎（conjunctivitis）、眼瞼結膜炎（blepharoconjuntivitis）、潰瘍形成（ulceration）など、が意図される。
【００２１】
「保持増強剤（retention enhancer）」という用語では、疾患によって影響を受ける眼部における製品の保持時間を長引かせるあらゆる物質または組成物、例えばヒアルロン酸ナトリウム、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ビニルポリアルコール、キサンタンガム、ジェランガム、キトサン、ポリ乳酸およびそれらの誘導体など、が意図される。
【００２２】
「医薬組成物」という用語では、物質のあらゆる治療的の許容され得る混合物または組合せ（combination）を意図する。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明によると、配列番号１および配列番号２の配列を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントは、局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のために使用される。
【００２４】
最終的な分子が抗原に結合する能力を維持するように、それぞれ重鎖（配列番号１）および軽鎖（配列番号２）の定常領域がいずれかの適当なヒト免疫グロブリン定常領域により置き換えられ得ることは、理解されるべきである。
【００２５】
よって、本発明による代替の実施形態では、配列番号３または配列番号４を有するｓｃＦｖが、局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のために使用できる。
【００２６】
特に、本発明の抗体は、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２を中和する。特に、ウイルス表面抗原は、ｇＤである。
【００２７】
本発明の医薬は、好ましくは、眼内への抗原結合フラグメントの保持増強剤と共に製剤化される。本発明において有用な保持増強剤は、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、キサンタンガム、ジェランガム、キトサン、ポリ乳酸およびその誘導体から成る群から選択され得る。
【００２８】
本発明の医薬は、好ましくは、点眼剤、軟膏剤、ゲル剤、眼科用クリーム剤の形態で存在する。
【００２９】
眼疾患は、有利なことには、眼角膜炎、眼瞼炎、結膜炎、眼瞼結膜炎、潰瘍形成である。
【００３０】
本発明による完全ヒト抗原結合フラグメントは、眼の一部を、疾患を示唆する抗原結合フラグメントと接触させ、そして抗原結合フラグメントと抗原を含んでなる複合体の存在を検出することを含んでなる診断方法のために使用され得る。複合体の検出は、当該技術分野で知られているあらゆる技術、例えば試験管内および生体内における免疫学的アッセイで続いて検出され得る、そこに結合させた検出可能な標識を有する抗原結合フラグメントなどに従って実施され得る。試験管内における方法の例には、酵素結合免疫吸着アッセイ、すなわちＥＬＩＳＡ（間接、サンドイッチ、競合）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）である。
【００３１】
標識は、直接的または間接的に抗原結合フラグメントに結合されるか、または抗原結合分子のその後の反応生成物に取り付けられ得る。標識は、色素体、触媒、酵素、蛍光色素、化学発光分子、放射性同位元素および色素を含む群から選択され得る。
【００３２】
本発明によると、医薬組成物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４を含む抗体の完全ヒト結合フラグメントを含んでなり、眼疾患の処置または診断のための眼局所投与向けに提供される。
【００３３】
例えば、本発明による医薬組成物は、１５％のＨ2Ｏ、１５％の白色鉱油、７０％のＡｑｕａｐｈｏｒ（登録商標）（軟膏剤）および本発明のＦａｂフラグメント１ｍｇ／ｍｌから成ることもある。
【００３４】
本発明の抗原結合フラグメントは、当該技術分野で知られている別の方法によっても、例えばパパインを用いた抽出ＩｇＧの酵素分解によっても、または（一過性のもしくは安定した）真核または原核生物発現系による遺伝子組み換え産生とその後のアフィニティー精製によっても得ることができる。
【００３５】
本発明による組成物の主な利点は、完全にヒトのものである、すなわち、ヒト・ポリヌクレオチド配列によってコードされているＦａｂに起因する。ＨＳＶ疾患の診断または処置のための本発明のＦａｂの生体内における使用は、異種間またはキメラ誘導のモノクローナル抗体が使用される場合に重大な問題となる、受動的に投与された抗体に対する宿主免疫反応による有害な影響を大いに低減する。
【００３６】
さらに、Ｆａｂフラグメントは、ＩｇＧ全体に対して有利である。というのも、Ｆａｂフラグメントが、細胞上のＦｃ受容体による影響を受けず、また抗原を沈殿させないので、そのためそれらが低い免疫原性しか示さず、且つ、食作用に対してそれほど影響を受けないからである。そのうえ、Ｆａｂフラグメントは、ＩｇＧ分子全体に比べてより急速に組織から除去される。
【００３７】
Ｆａｂはさらに、それらがＥ．コリ（E.coli）発現系により製造されるので、工程、コストおよび時間の点でＩｇＧ抗体に対して製造がより容易である。
【００３８】
Ｆａｂは、安定しており、且つ、可溶性である（不溶性は免疫原性を高める可能性がある性質である）。これらの性質は、原薬や医薬製品の高い発現レベルや最適な安定性を得ることを可能にする。Ｆａｂの安定性は、それらが長い半減期を示すことを可能にする。
【００３９】
本発明の代替の実施形態によると、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）もまた提供される。
【００４０】
図６に示したように、ｓｃＦｖ ＡＣ−８は、試験管内のプラーク減少アッセイによるＨＳＶ感染の中和において非常に効率的である。
【００４１】
ＡＣ−８で処置したマウスからの涙膜サンプルで計測されるウイルス力価は、非特異的Ｆａｂとの比較においてＨＳＶ１の有効な中和を示した。
【００４２】
局所点眼後、ＡＣ−８は、無傷の眼内に移行するので、房水および硝子体液中では点眼の１時間後の時点で、免疫組織化学試験とＥｌｉｓａ試験の両方を使用して検出できた。角膜の上皮除去（de-epithelialisation）後、眼内移行は、房水および硝子体液において促進される。ＡＣ−８は、無傷の角膜の角膜細胞内で可視化でき、主に経強膜経路を通じて眼内に移行するようである。結膜下注射後、ＡＣ−８の眼内移行は、上皮除去した角膜に対して点眼後に得られたものと類似している。しかしながら、角膜の上皮除去後の眼に対する結膜下注射は、ＡＣ−８の眼内移行の５倍の増大をもたらす。免疫組織化学は、ＡＣ−８が樹状上皮下細胞内に蓄積するように思えることを明らかにし、そしてその角膜透過を実証した。局所点眼後に、ＡＣ−８は効果的な抗ウイルス濃度にて中間透光体中で計測された。
【実施例】
【００４３】
実施例１
ＡＣ−８で処置したマウスからの涙膜サンプルにおいて測定されたウイルス力価は、非特異的Ｆａｂと比較して、ＨＳＶ１の有効な中和を示した。
【００４４】
それぞれ３μｌの処置を、感染眼（右側）に点眼薬によって投与した。処置（１ｍｇ／ｍＬのＡＣ−８または非特異的Ｆａｂフラグメント）を、午前８：００、午前１０：００、午後１２：００、午後２：００、午後４：００、午後６：００、午後８：００、午後１０：００に始めるが、それを感染の翌朝（２日目）から開始し、７日間続けた。群の処置は毎日、同じ順序で進められ、そして開始時刻から１時間以内に終了した。マウスを、各処置に関してイソフルオラン（３〜５％）または同等物で麻酔した。
【００４５】
ウイルス株
ほとんどまたは全く死亡することのない中程度のレベルの角膜炎を引き起こす眼分離物であるＣＪ３９４を使用した。動物は、１Ｘ１０５ＰＦＵで右眼を感染された。
【００４６】
感染プロトコール
感染のために、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ケタミン／キシラジンで麻酔した。右側の角膜を、輪部辺縁近くで剥離し、中央部の角膜を無傷なままにした。接種材料を含むＤＭＥＭの５μｌの液滴を、右側の角膜上に乗せ、角膜を覆って眼瞼を２回閉じ、そして動物をそれらのケージに戻した。
【００４７】
ウイルス力価
右眼のウイルス力価のために涙膜サンプルを、感染後１、３、５、７、９、１１および１３日目に採取した。サンプル採取のために、マウスを簡単に麻酔し、そしてそれらのケージに戻した。サンプルは、それぞれ数日の処置の開始の前に角膜上に１０μｌの細胞培養培地を乗せ、ピペットマンを用いて液体を２〜３回洗い流して、次にウイルス学検査室への輸送のために液体を１９０μｌの培地に移すことによって採集した。次に、そのサンプルを、連続的に希釈し、そしてＶｅｒｏ細胞単層上で滴定した。涙膜サンプルの採集のために、マウスをイソフルオランまたは同等物（３〜５％）で麻酔した。結果を図３に示す。
【００４８】
実施例２
ＡＣ−８は、無傷の眼内に移行するので、点眼の１時間後に免疫組織化学によって、房水中および硝子体液中で検出され得る。
【００４９】
この一連の実験を、局所的に投与したＡＣ−８ Ｆａｂフラグメントの移行を評価するために実施した。特に、この実験を、ラットの正常な角膜上に局所的に投与したときのＦａｂの生体分布を評価するために実施した。
【００５０】
試験した物質は、ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌの濃度のＦａｂフラグメントであった。投与経路は、両眼における点眼または結膜下注射によるものであった。投与容量は、以下のとおりであった：
−支給されたスポイト・バイアルを使用して、１点眼あたり５０μＬ、
−インシュリン用シリンジを使用した結膜下注射のために５０μＬ。
【００５１】
動物は、アルビノＬｅｗｉｓラット（６〜８週齢、１２０〜１５０ｇ、Charles River）であった。動物を、パリ第Ｖ大学の倫理委員会および実験眼科学における動物の使用に関するＡＲＶＯ文書によって認証および認可された条件に維持した。ラットは、ペントバルビタールの致死注射によって生体内実験の最後に屠殺した。
【００５２】
投与のために、ラットには麻酔しなかったが、角膜との接触時間を延ばすために数秒間、体を拘束した状態にそっと保った。１群あたり３匹のラット（６眼）を使用した。動物には、以下のとおり投与した：
【００５３】
【表１】
【００５４】
注意事項１：第２群は、一回分の用量を実現するために実施した。１時間あたり１滴は治療計画に準拠していない。
注意事項２：第３群は、起きている間に１日あたり５回の点眼により実施したが、これは治療計画に準拠している。
【００５５】
サンプリングについて、以下の表中にまとめる：
【００５６】
【表２】
【００５７】
各群（１〜７）のうちの２匹のラット（４眼）を、対物スライド上に平面封入するための角膜を解剖するために使用した。眼を氷上で解剖した。合計２８枚の角膜を解剖し、そして２４ウェルプレート内で平面封入したものを−８０℃にて保存した。
【００５８】
各群の３番目のラットの両眼（１〜７、合計１４個のサンプル）を、−８０℃にてＯＣＴ（Optimum Cutting Temperature compound、Tissue-Tek）中に入れた。すべての右眼を、凍結切片法に使用し、そして必要であれば、すべての左眼を更なる使用のために−８０℃にて保存した。
【００５９】
凍結切片を、角膜層および眼球内のＡＣ−８ Ｆａｂの分布を測定するための標識抗体を用いた免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析に使用した。
【００６０】
凍っている凍結切片（１０μｍ）を、以下のとおり処理した：
−ＲＴにてパラホルム４％中で１５分間、固定し、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中、１０分間で２度すすぎ、
−ＲＴにてＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％中で２×１０分間すすぎ、
−対照をＰＢＳ１Ｘのみの中でインキュベートしたことを除いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Pierce#31132、ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％中に１／５０）と一緒に＋４℃にて一晩インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．１％中で３×１０分間すすぎ、
【００６１】
−分子プローブであるロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（赤色）１／５０と一緒に、暗所内で＋２０℃にて１時間インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中、１０分間で２度すすぎ、
−核標識のために、ＰＢＳ １Ｘ中のＤＡＰＩ（４’、６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（青色）１／５０００中、暗所内でＲＴにて５分間インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中で５×５分間すすぎ、
−ＲＴにて蒸留水中で１０分間で１度すすぎ、そして乾燥させ、
−蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用したレクチャー（lecture）のために顕微鏡用スライド上に乗せた。
【００６２】
角膜上のＡＣ−８の共焦点局在を得るために、ＩＨＣも平面封入した角膜に対して実施した。ＩＨＣプロトコールの最適化を角膜の１／４で実施した。この技術の感度は、入手可能な材料では明確な共焦点像を得るのに十分には最適化できなかった。これらの結果は正しく解釈されないかもしれない。これが、ＡＣ−８の移行を測定するために全眼切片を選択した理由である。
【００６３】
核を、ＤＡＰＩを用いて青色に染色し、そしてＡＣ−８を示すのに使用した抗ヒトＩｇＧ抗体は赤色に見える（二次抗体はＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４標識されている）。
【００６４】
第１群「Ｈ１」（０日目：１回のＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの点眼、１時間後に屠殺）。
【００６５】
ＡＣ−８処置眼（第１群）とＰＢＳ対照眼（第６群）との間で、蛍光に差がないことが示され、ＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの単回点眼の１時間後に、ＡＣ−８移行が眼組織内において観察されないことが実証された。
【００６６】
第２群「Ｈ６」（０日目：５回のＡＣ−８、１０μｇ／ｍｌの点眼、１時間後に屠殺）。
【００６７】
ＡＣ−８を５時間にわたって毎時間ごとに点眼したとき、および屠殺を最後の点眼の１時間後に実施したとき、上皮下間質中に位置している樹状細胞によるＡＣ−８の貪食に相当する可能性もあるドットとして、ＡＣ−８が角膜の周辺部において検出される。角膜の中央部では、染色はまた、広範なシグナルならびにまばらなシグナルとして間質中でも観察される。毛様体および網膜では、ＰＢＳ処置ラット（第６群）と比較すると、広範囲であるが、薄い染色が検出できる。
【００６８】
第３群「Ｄ４」（０日目〜３日目：１日あたり５回のＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの点眼、４日目：１回の点眼、１時間後に屠殺）。
【００６９】
角膜に対する免疫組織化学が、４日間にわたる１日５回の、および５日目の１回のＡＣ−８による処置に続いた。結果を第６ビヒクル群と比較した。ＡＣ−８が、１０μｇ／ｍｌの濃度にて４日間にわたり１日に５回点眼されるとき（図１、ａ〜ｋ）、ＡＣ−８の強い移行が、角膜の周辺部（図１ｅ〜ｈ）、ならびに角膜中央部の前部間質（図１ａ〜ｄ）において観察される。ＡＣ−８の移行は、角膜の中央部より角膜の周辺部、輪部、および毛様体においてはるかに高く、ＡＣ−８が経強膜経路を通して眼内に移行し、その後角膜中に拡散することを示唆している。ここで再び、樹状細胞はＡＣ−８を貪食したように思われる、というのも、ＡＣ−８で陽性に染色された樹状細胞が上皮下間質に位置しているからである（図１ｄ）。網膜では、ＡＣ−８は、内側の網膜の境界の星状細胞内に位置している。
【００７０】
第４群「ＳＣＪ１」（０日目：１回のＡＣ−８、１０μｇ／ｍｌの結膜下注射、１時間後に屠殺）。
【００７１】
ＡＣ−８の単回の結膜下注射は、前眼部と後眼部の両方におけるＡＣ−８の非常に強い染色という結果をもたらす。結果を第７ビヒクル群と比較した。角膜では、ＡＣ−８は、広範囲の染色として上皮内および間質内で濃縮され、ならびに角膜細胞内に位置する。
【００７２】
毛様体では、ＡＣ−８は移行したと思われ、そして上皮細胞内に蓄積される。網膜では、ＡＣ−８は明らかに膠細胞（星状細胞ならびにMuller膠細胞の延長部分）内に位置している。網膜の色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞）では、同様に強いシグナルが観察される。
【００７３】
第５群「ＳＣＪ６」（０日目：１回のＡＣ−８、１０μｇ／ｍｌの結膜下注射、６時間後に屠殺）。
【００７４】
角膜では、ＡＣ−８は、原則的に間質内に一部残っているように見える。毛様体では、第４群と比較して、蛍光シグナルが減少しているが、この時点では輪部はまだ染色されている。網膜では、ＡＣ−８シグナルは、もはや膠細胞および星状細胞内には存在していない。網膜の色素上皮細胞（ＲＰＥ細胞）では、同様にシグナルが減少している。結果を第７ビヒクル群と比較した。
【００７５】
これらの実験において、最初の抗体を入れない内部対照は陰性であり、そして多少の非特異的バックグラウンドを示したＰＢＳ処置眼とは対照的に、ごくわずかな非特異的バックグラウンドしか示さなかった。
【００７６】
ＩＨＣ検出によるサンプルの分析は、ＡＣ−８を特異的な免疫組織化学プロトコールを使用して検出できることを示唆している。正常な角膜に対するＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの点眼後に、抗体は：
−単回点眼の１時間後の角膜または眼組織のいずれでも検出されず；
−５回の点眼後に角膜では検出され、弱いシグナルが毛様体で観察されたが、網膜ではシグナルを検出できず；
−４日間にわたって１日５回点眼すると、角膜、毛様体および網膜において強く位置している。
【００７７】
角膜移行が観察されるとき、２つのタイプの染色：一方が間質に位置している広範囲の染色、そしてもう一方が上皮下角膜細胞（角化嚢胞または樹状細胞）内の濃厚な染色、が検出される。ＡＣ−８は正常な角膜中の上皮下間質内の細胞および上皮除去した角膜における全間質厚の中の細胞において観察されるので（次の実施例を参照のこと）、ＡＣ−８が樹状細胞により貪食されることは可能である。
【００７８】
ＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの単回結膜下注射の１時間後、抗体は角膜だけに位置するのではなく、毛様体、および網膜の星状細胞や膠細胞内でも観察される。この投与経路を使用して、網膜の深外層（網膜色素上皮細胞）もまた染色される。染色は、点眼後に観察されるように、中央部に比べて角膜の周辺部でより強い。ＡＣ−８ １０μｇ／ｍｌの単回結膜下注射の６時間後、抗体は眼からほとんど排除されている：それは角膜や輪部にわずかに残っているが、もはや毛様体や網膜では検出できない。
【００７９】
結論として、これらの観察は、ＡＣ−８が無傷の角膜を通って、またはその隣接輪部を通って眼の眼組織の内側に移行できること、そしてこの移行が１０μｇ／ｍｌの濃度にて観察し得ることを示唆している。
【００８０】
ＡＣ−８は、輪部の経強膜経路を通って移行しているように見え、そしてそれが網膜移行および角膜周辺部における強い染色を説明している。ＡＣ−８は、樹状細胞または角化嚢胞に相当し得る角膜細胞内に貪食される。ＡＣ−８が樹状細胞の活性化を引き起こすかどうか、依然として明らかにされていない。
【００８１】
実施例３
ＡＣ−８は、無傷の眼内へ移行するので、点眼の１時間後にＥＬＩＳＡ試験を使用することによって、房水中および硝子体液中で検出できる。
【００８２】
ブラウン・ノルウェー系統からの６０（６０）匹の有色ラットを、６（６）匹の動物から成る１０（１０）個の群に無作為に割り付ける。
【００８３】
局所投与（第１〜８群）のために、動物に１日に５回、両眼に１０μｌの試験物またはビヒクルを与えた。
【００８４】
結膜下投与（第９および１０群）のために、動物に、両眼への５０μｌの試験物１の単回注射を与えた。
【００８５】
以下の表には、処置群の動物の割り当てをまとめてある：
【００８６】
【表３】
【００８７】
相当する時点において、動物を麻酔した。血清の調製のために、全血をサンプリングした。安楽死後、房水（ＡＨ）、角膜上皮（Ｃｅｐｉ）、角膜間質＋内皮（Ｃｓｔｒ＋ｅｎｄ）、硝子体液（Ｖ）および網膜（Ｒ）を、両眼からサンプリングし、Ｅｌｉｓａ分析のために各動物について保存した。
【００８８】
投与の経路と方法
第１〜８群について、試験物またはビヒクルを、適当なマイクロピペットを使用して、日中（午前８〜午後４：００）、両眼に５×１０μｌを点眼した。
【００８９】
第９〜１０群について、動物に、麻酔下（キシラジン５ｍｇ／ｋｇ；ケタミン２５ｍｇ／ｋｇの筋肉内注射）、両眼に単回結膜下注射（５０μｌ）を与えた。
【００９０】
先の表中に列挙した時点において、動物を、Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）（キシラジン５ｍｇ／ｋｇ）とＩｍａｌｇｅｎｅ（登録商標）１０００（ケタミン２５ｍｇ／ｋｇ）の混合溶液の筋肉内注射によって麻酔した。
【００９１】
約２ｍｌの血液を、屠殺直前に心臓穿刺によって採取した。各動物について６００μｌの血清を、Ｅｌｉｓａアッセイまで−８０℃にて保存した。
【００９２】
過量のペントバルビタールの心臓注射によって、動物を安楽死させた。
【００９３】
屠殺直後に、房水（ＡＨ）、角膜上皮（Ｃｅｐｉ）、角膜間質＋内皮（Ｃｓｔｒ＋ｅｎｄ）、硝子体液（Ｖ）および網膜（Ｒ）を、２匹のラットの両眼から素早く、且つ、慎重に解剖した。両眼からの眼球構造物を、各群からの各動物について保存した。
【００９４】
房水および硝子体液中のＡＣ−８濃度の結果を、図４に示す。
【００９５】
実施例４
角膜の上皮除去後、眼内移行は、房水および硝子体液において促進される。
【００９６】
ラットの上皮除去した角膜上に局所投与したとき、および角膜の上皮再形成相の間のＦａｂの生体分布を評価するために、この一連の実験を実施した。この実験は、局所投与したＡＣ−８ Ｆａｂフラグメントの移行、および角膜−潰瘍の瘢痕形成の間の角膜内へのＦａｂの移行の評価を可能にした。
【００９７】
試験する物質は、先に記載したとおりのものであったが、濃度は１００μｇ／ｍｌであった。動物は先に記載したとおりのものであった。点眼または結膜下注射は、両眼ではなく片眼で実施した。
【００９８】
０日目には、一般的な麻酔（キシラジン＋ケタミン）および局所麻酔下、調整された生検パンチと外科用メスを使用して、それぞれの動物の片方の眼を調整した角膜の領域において上皮除去した。倫理的理由から、角膜潰瘍モデルとそれに続く処置は、動物１匹あたり１眼に対してのみ実施した。反対側の眼は、手付かずのままにしておかなくてはならない。１群あたり５匹のラット（５眼、右眼のみ）を使用した。動物に、以下のとおり投与した：
【００９９】
【表４】
【０１００】
サンプリングについて、以下の表中にまとめる：
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
各群（１〜８）の４匹のラット（４つの処置眼）を、ＥＬＩＳＡ試験のための房水と硝子体液、血清および神経網膜を採取するのに使用した。血清サンプル（約１〜２ｍＬ）を、屠殺直前に第１〜８群の各群の５匹のラットから採取した。合計３２個の房水（約１０〜２０μＬ）および硝子体液（約２０〜３０μＬ）のサンプル、３２個の角膜および網膜のサンプル、ならびに４０個の血清サンプルを、ねじ蓋の付いたエッペンドルフ・コンテナ内に採取し、そして−８０℃にて保存した。
【０１０３】
各群の５匹のラットの両眼（合計１６個のサンプル）を固定し、そして凍結切片法の準備をした。
【０１０４】
凍結切片を、角膜層および眼球内のＡＣ−８ Ｆａｂの分布を測定するための標識抗体を用いた免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析に使用した。
【０１０５】
凍っている凍結切片（１０μｍ）を、以下のとおり処理した：
−室温（ＲＴ）にてパラホルム４％中で１５分間、固定し、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中、１０分間で２度すすぎ、
−ＲＴにてＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％中で２×１０分間すすぎ、
−対照をＰＢＳ１Ｘのみの中でインキュベートしたことを除いて、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Pierce#31132、ＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％中に１／５０）と一緒に＋４℃にて一晩インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、０．１％中で３×１０分間すすぎ、
【０１０６】
−分子プローブであるロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ５９４（赤色）１／５０と一緒に、暗所内で＋２０℃にて１時間インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中、１０分間で２度すすぎ、
−核標識のために、ＰＢＳ １Ｘ中のＤＡＰＩ（４’、６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（青色）１／５０００中、暗所内でＲＴにて５分間インキュベートし、
−ＲＴにてＰＢＳ １Ｘ中で５×５分間すすぎ、
−ＲＴにて蒸留水中において１０分間、１度すすぎ、そして乾燥させ、
−蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用したレクチャー（lecture）のために顕微鏡用スライド上に乗せた。
【０１０７】
核を、ＤＡＰＩを用いて青色に染色した。ＡＣ−８を示すのに使用した抗ヒトＩｇＧ抗体は赤色に見える（二次抗体はＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４標識されている）。
【０１０８】
第１群「Ｈ５」（０日目：５回のＡＣ−８ １００μｇ／ｍＬの点眼、最後の点眼の１時間後に屠殺）。
【０１０９】
ＡＣ−８は、角膜の中央部（特に、上皮形成−上皮除去領域の間の接合点）、および周辺部においてはっきりと検出される：ＡＣ−８は潰瘍形成の境界における上皮下の空間で濃縮される。興味深いことに、ＡＣ−８移行はまた、上皮下の空間において角膜の周辺部でも観察される。角膜内皮では、ＡＣ−８は中央部の領域において検出されないが、周辺部領域でわずかに検出できる。対照であるＰＢＳ処置角膜の免疫組織化学は、非常にわずかなバックグラウンドしか示さない。
【０１１０】
輪部では、ＡＣ−８は毛様体と虹彩にも位置している。ここで留意すべきは、ＡＣ−８がさらに輪部の血管内皮細胞内でも同定されることである。
【０１１１】
上皮除去した角膜上のこのＡＣ−８分布は、Ｆａｂの移行が、直接角膜を透過した移行というよりむしろ、主に輪部および経強膜経路を通して起こっていることを示している。
【０１１２】
第１群では、ＡＣ−８の非常に弱い標識付けが網膜で観察される。
【０１１３】
第２群「Ｈ２９」（０日目：５個のＡＣ−８ １００μｇ／ｍＬの点眼、２４時間後に屠殺）。
【０１１４】
第２群では、角膜中央部の角膜上皮は、再構成された上皮の表面に多少不規則なものがあるが（図２ａの白い四角部分）、実験した切片のすべてほとんど完全に再形成されている（図２ａ〜ｊ）。ＡＣ−８は、上皮下の空間の細胞内に位置したままである。角膜の周辺部（図２ｅ〜ｊ）では、ＡＣ−８が、上皮、上皮下の空間（図２ｉ矢印）において濃縮され、そして内皮に蓄積される（図２ｇおよび２ｊ、矢印）。
【０１１５】
５回の点眼の２４時間後に、ＡＣ−８は、角膜表面から角膜の深層内そして内皮まで移行した。それはまた、この時点で虹彩においてもはっきりと観察される（図２ｆおよび２ｈの矢印）。ＡＣ−８を含む浸潤細胞が、角膜の上皮下の空間に位置している（図２ｆおよび２ｈ、矢印、図２ｃ、高倍率、図２ｉ、矢印）。これらの細胞は、多形核細胞、マクロファージまたは樹状細胞に該当するはずである。
【０１１６】
輪部および毛様体では、ＡＣ−８は、上皮を通って移行し、そして上皮下の領域および毛様体に位置している。
【０１１７】
第２群では、ＡＣ−８は、網膜後部の中央で検出されるのではなく、周辺網膜で検出される。第７対照群と比較すると、ＡＣ−８は、周辺網膜の顆粒層に位置しているように見える。
【０１１８】
第３群「Ｄ２」（０日目〜１日目：ＡＣ−８ １００μｇ／ｍＬの１日あたり５回の点眼、２日目：１回の点眼、１時間後に屠殺）。
【０１１９】
第３群では、上皮は完全に再形成され、そして点眼を瘢痕形成期間中続けた。ＡＣ−８は、ビヒクル対照群と比較すると、角膜上皮細胞、間質細胞では非常に強く、そして内皮ではわずかに検出される。
【０１２０】
第３群の輪部および網膜前部の実験は、ＡＣ−８が、ビヒクル対照群と比較すると、毛様体において深く移行したことを示している。ＡＣ−８は毛様体上皮内で同定される。
【０１２１】
第３群では、ＡＣ−８の顕著な染色は、網膜後部（中央部）ではなく、周辺網膜で認められる。興味深いことに、ＡＣ−８は、すべての網膜層、ならびにＲＰＥ細胞層の中に拡散したように見える。
【０１２２】
無傷の角膜上のＡＣ−８の移行（上記を参照のこと）と比較すると、上皮の潰瘍形成がＡＣ−８の網膜移行を促進したように見える。
【０１２３】
第４群「ＳＣＪ１」（０日目：１回のＡＣ−８溶液、１００μｇ／ｍｌ、の注射、１時間後に屠殺）、第５群「ＳＣＪ６」（０日目：１回のＡＣ−８溶液、１００μｇ／ｍｌ、の注射、６時間後に屠殺）、第６群「ＳＣＪ２４」（０日目：１回のＡＣ−８溶液、１００μｇ／ｍｌ、の注射、２４時間後に屠殺）。
【０１２４】
結膜下の空間へのＡＣ−８の単一投与は、１時間、６時間および２４時間の時点でＡＣ−８が角膜周辺部に移行できるようにするのに効果的である。
【０１２５】
結膜下注射後のＡＣ−８の移行は、周辺角膜において角膜の中央部よりも強く、そしてそこでは、潰瘍角膜（第４群および第５群）でさえ全時点において移行が弱いままであった。上皮の完全性の再形成は、２４時間の時点ですべての角膜層および虹彩におけるＡＣ−８分布に影響を及ぼさない（第６群）。
【０１２６】
輪部および毛様体では、ＡＣ−８は、第６群における輪部の上皮下領域でのＡＣ−８の更なる濃縮と併せて、第４および５群で観察されたように均一に分配される。結膜下注射もまた、１時間（第４群）、６時間（第５群）および２４時間（第６群）の時点で、周辺網膜の網膜層においてだけではなく、よりわずかではあるが、網膜後部においても、角膜潰瘍形成のある眼においてＡＣ−８の移行を可能にするのに効果的である。２４時間の時点で、ＡＣ−８は、周辺網膜で大部分が濃縮されている（第６群）。
【０１２７】
網膜では、ＡＣ−８は、網膜細胞におけるまばらな濃度の染色として検出されるが、ＡＣ−８は網膜全体に均一に分配されていない。
【０１２８】
ＩＣＨ観察を、以下の表中にまとめる：
【０１２９】
【表６】
【０１３０】
上皮再形成過程の間、ＡＣ−８の点眼は、対照と比較すると角膜の瘢痕形成を遅らせず、且つ、いずれかの臨床的または組織学的な炎症反応を顕著に促進することもない。
【０１３１】
角膜（上皮、間質および内皮）のＡＣ−８の移行は、主に角膜輪部および輪部において観察される。ＡＣ−８は角膜細胞（上皮および内皮細胞、ならびに間質細胞）内で検出され、そしてまた、ＡＣ−８注射に対する局所的な免疫学的反応の結果として生じ得た上皮下の浸潤細胞内でも観察される（ＡＣ−８は外来−ヒト−タンパク質として認識される）。
【０１３２】
ＡＣ−８は、もっと遅い時点で、虹彩、毛様体および周辺網膜にも移行し、そして外側から内側の眼組織への拡散を示唆した。興味深いことには、ＡＣ−８がさらに内皮細胞から成る血管内皮においても観察され、それがＡＣ−８の全身的拡散が起こる可能性があり得ることを暗示することである。
【０１３３】
角膜の異なった領域でのＡＣ−８の局在化は、潰瘍が上皮の中央部に存在しているときでさえ、ＡＣ−８移行がほとんど経強膜経路を通して起きていることをはっきりと示している。
【０１３４】
ＡＣ−８の点眼は、すべての病期のヘルペス性角膜炎において、角膜上皮が再形成しているときでさえ、角膜に移行できるはずである。
【０１３５】
結膜下注射は、角膜を標的とするＡＣ−８の反復点眼と同じくらい効果的である。
【０１３６】
角膜におけるＡＣ−８の移行は、点眼または結膜下注射のいずれかを使用した同じ経強膜経路をたどるように見える。
【０１３７】
結膜下注射は、毛様体および網膜を標的とする反復点眼より効果的である。
【０１３８】
上皮除去した角膜の房水および硝子体液に対して得られたＥＬＩＳＡの結果を、図５にまとめる。図から分かるように、房水および硝子体液の両方でのＡＣ−８定量化は、眼内への効果的な移行を実証している。
【０１３９】
結論として、潰瘍角膜に対して実施したこの分布研究から、１日あたりの５回の点眼が上皮除去した角膜に対して無毒であると考えられる。
【０１４０】
１日あたりの５回の点眼後、ＡＣ−８は、２４時間、角膜細胞内に位置したままであり、そして角膜深層、ならびに虹彩および毛様体内に移行する。
【０１４１】
ＡＣ−８の移行は、輪部および経強膜経路を通してほとんど観察され、そしてそれは、ＡＣ−８がすべての病期のヘルペス性角膜炎において、上皮が再形成されるときでさえ、角膜に移行できることを示唆している。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ−１ｄ】
【図１ｅ】
【図１ｆ】
【図１ｇ−１ｈ】
【図１ｉ】
【図１ｊ】
【図１ｋ】
【図１ｌ】
【図１ｍ】
【図１ｎ】
【図１ｏ】
【図１ｐ】
【図１ｑ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ−２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ−２ｇ】
【図２ｈ−２ｊ】
【図２ｋ】
【図２ｌ】
【図２ｍ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号３または配列番号４に対して９０％の相同性を有する配列を含む抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項２】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号３または配列番号４を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項３】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号３および配列番号４に対して９０％の相同性を有する配列を含む抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項４】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号３および配列番号４を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項５】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号１および配列番号２に対して９０％の相同性を有する配列を含む抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項６】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号１および配列番号２を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項７】
前記抗体が、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２を中和することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ウイルス表面抗原がｇＤであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記医薬が、眼内への抗原結合フラグメントの保持増強剤と共に製剤化されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記保持増強剤が、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ビニルポリアルコール、キサンタンガム、ジェランガム、キトサン、ポリ乳酸およびそれらの誘導体から成る群の中から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬が、点眼剤、軟膏剤、ゲル剤、眼科用クリーム剤の形態で存在することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記眼疾患が、眼角膜炎、眼瞼炎、結膜炎、眼瞼結膜炎、潰瘍形成であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記完全ヒト結合フラグメントが、そこに結合させた検出可能な標識を有することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体の完全ヒト結合フラグメントを含んでなる、眼疾患の処置または診断のための眼局所投与のための医薬組成物。
【請求項１】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号３または配列番号４に対して９０％の相同性を有する配列を含む抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項２】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号３または配列番号４を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項３】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号３および配列番号４に対して９０％の相同性を有する配列を含む抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項４】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号３および配列番号４を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項５】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号１および配列番号２に対して９０％の相同性を有する配列を含む抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項６】
局所投与による眼疾患の処置または診断のための医薬の製造のための、配列番号１および配列番号２を有する抗体の完全ヒト抗原結合フラグメントの使用。
【請求項７】
前記抗体が、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２を中和することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ウイルス表面抗原がｇＤであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記医薬が、眼内への抗原結合フラグメントの保持増強剤と共に製剤化されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記保持増強剤が、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ビニルポリアルコール、キサンタンガム、ジェランガム、キトサン、ポリ乳酸およびそれらの誘導体から成る群の中から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬が、点眼剤、軟膏剤、ゲル剤、眼科用クリーム剤の形態で存在することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記眼疾患が、眼角膜炎、眼瞼炎、結膜炎、眼瞼結膜炎、潰瘍形成であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記完全ヒト結合フラグメントが、そこに結合させた検出可能な標識を有することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体の完全ヒト結合フラグメントを含んでなる、眼疾患の処置または診断のための眼局所投与のための医薬組成物。
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１２−５２６０７５（Ｐ２０１２−５２６０７５Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０９０１６（Ｐ２０１２−５０９０１６）
【出願日】平成２２年５月４日（２０１０．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６０４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２８０５３
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５０８１７８４７８）リボバックス バイオテクノロジーズ ソシエテ アノニム (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月２５日（２０１２．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月４日（２０１０．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５６０４７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２８０５３
【国際公開日】平成２２年１１月１１日（２０１０．１１．１１）
【出願人】（５０８１７８４７８）リボバックス バイオテクノロジーズ ソシエテ アノニム (6)
【Ｆターム（参考）】
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