短縮されたＢＡＦＦレセプター
【課題】明確に特徴付けられ得、そしてＢＡＦＦに対する特異性および親和性を維持しながら真核細胞における凝集を避けるグリコシル化パターンを有する治療用途のためのＢＡＦＦ−Ｒを提供すること。
【解決手段】本開示は、変化したＯ結合型グリコシル化パターンを生じる細胞外ドメインに欠失を有する、天然に存在しないＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を提供する。本開示はまた、Ｂ細胞およびＴ細胞が媒介する障害を処置するための方法および薬学的組成物を提供する。本開示は、ＴＮＦファミリーのリガンドおよびレセプターならびにそれらのアンタゴニストおよびアゴニストならびに免疫応答の調節におけるそれらの使用に関する。本発明は、部分的に、ヒトＢＡＦＦ−Ｒおよびその改変体のグリコシル化パターンの発見および特徴付けを基礎としている。
【解決手段】本開示は、変化したＯ結合型グリコシル化パターンを生じる細胞外ドメインに欠失を有する、天然に存在しないＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を提供する。本開示はまた、Ｂ細胞およびＴ細胞が媒介する障害を処置するための方法および薬学的組成物を提供する。本開示は、ＴＮＦファミリーのリガンドおよびレセプターならびにそれらのアンタゴニストおよびアゴニストならびに免疫応答の調節におけるそれらの使用に関する。本発明は、部分的に、ヒトＢＡＦＦ−Ｒおよびその改変体のグリコシル化パターンの発見および特徴付けを基礎としている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本明細書で全体的に参考として援用されている、２００３年３月２８日に出願された米国出願番号第６０／４５８，７０７号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、ＴＮＦファミリーのリガンドおよびレセプターならびにそれらのアンタゴニストおよびアゴニストならびに免疫応答の調節におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
本発明は、ＴＮＦファミリーレセプタータンパク質のメンバーである、ＢＡＦＦレセプター（「ＢＡＦＦ−Ｒ」、ＢＲ３およびＺｔｎｆｅ１２としても公知）に関する。ＢＡＦＦ−Ｒは、国際特許出願公開公報ＷＯ０２／２４９０９に記載されている。
【０００４】
ＢＡＦＦ−Ｒは、特異的に上記ＴＮＦファミリーリガンドＢＡＦＦ（ＴＡＬＬ−１、ＴＨＡＮＫ、ＢＬｙＳ、ニューロカインα、ＴＮＳ１３ＢおよびｚＴＮＦ４としても公知である）と結合し、国際特許出願公開公報ＷＯ００／４３０３２に記載されている。ＢＡＦＦは、インビトロでＢ細胞の生存率を高め（Ｂａｔｔｅｎら、（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（１０）：１４５３〜１４６６）、そしてインビボでは末梢Ｂ細胞集団の重要なレギュレータとして出現した。このリガンドの異常に高いレベルは、自己反応性のＢ細胞の生存率を高めることにより、自己免疫疾患の病因になり得ると考えられる（Ｂａｔｔｅｎら、（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（１０）：１４５３〜１４６６）。ＢＡＦＦ活性のアゴニストおよびアンタゴニストは、ＷＯ００／４３０３２に記載されている。
【０００５】
最近、ＢＡＦＦ特異的薬剤が、ＢＡＦＦ抗体も含め、自己免疫疾患や他の障害の処置のために開発されてきている（例えば、米国特許出願番号第０９／９１１，７７７号；同第１０／３８０，７０３号；同第１０／０４５，５７４号；および同第６０／５１２，８８０号を参照のこと）；Ｋａｌｌｅｄら、（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｇｅｔｓ、７（１）：１１５〜２３）。
【０００６】
ＢＡＦＦ−Ｒの発見に先立って、ＴＮＦレセプターファミリーの多くのメンバーは、発現配列タグ（ＥＳＴ）分析およびゲノム配列分析により発見されてきた。しかしながら、いくつかのファミリーメンバーは、ＢＡＦＦ−Ｒのように、それらの同定に発現クローニングが必要であった。
【０００７】
ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーであるＢＡＦＦ−Ｒは、多くのファミリーメンバーとはかなり異なっている。特に、ＢＡＦＦ−Ｒは、４個のシステインを有するシステインリッチのドメインをただ一つしか含有せず、一方殆どのＴＮＦレセプターファミリーのメンバーは、典型的に、それぞれ６個のシステインを有する２〜４個のドメインを含有する。正統なレセプターシステインリッチドメインのこの不存在が、配列ベースの探索によるＢＡＦＦ−Ｒの同定を妨げた。ＢＡＦＦ−ＲがいかにしてＢＡＦＦに高親和性の結合を達成するか、そして正確にどのような配列が含まれているかについてもまた、正確には明確でなかった。
【０００８】
ＢＡＦＦ−Ｒは、正統なＴＮＦレセプターファミリーのメンバーとは明らかに異なるだけでなく、ヒトＢＡＦＦ−Ｒ（ｈＢＡＦＦ−Ｒ）は、マウスＢＡＦＦ−Ｒ（ｍＢＡＦＦ−Ｒ）と６０％しか相同性がない。この差は、上記細胞外ドメインが真核細胞で発現する場合のｈＢＡＦＦ−Ｒの凝集（９０％凝集）とｍＢＡＦＦ−Ｒの凝集（１０％凝集）の差を反映している。しかしながら、ｈＢＡＦＦ−Ｒの二つの点変異（配列番号１のＶ２１ＮおよびＬ２８Ｐ）が、凝集を１０％未満に減少させる。ｈＢＡＦＦ−Ｒのこの変異形態は、ｖＢＡＦＦ−Ｒと呼ばれる。
【０００９】
ＴＮＦファミリーのメンバーが、Ｎ結合型グリコシル化部位およびＯ結合型グリコシル化部位の両方を有することは公知である。Ｎ結合型グリコシル化は、異なる共通配列内のアスパラギン残基で起こる。Ｏ結合型グリコシル化は、セリン残基およびスレオニン残基で起こるが、タンパク質の集団内での配列モチーフの欠如および糖の不整合付加がタンパク質へＯ結合型グリカンの上記存在の予測を妨げる。さらに、Ｏ結合型グリコシル化部位はしばしば短いセリン／スレオニンリッチの配列に集約され、グリカンの正確な数および位置の決定を困難にしている。グリコシル化パターンが、特定のタンパク質に決定できる場合でも、Ｏ結合型グリコシル化は、組織依存性で、上記パターンは上記タンパク質が発現される細胞型によって変化する。
【００１０】
１バッチのタンパク質生産物の任意の与えられた特徴を分析する能力は、薬学的用途のためのポリペプチドを生産するのに重要であり得る。Ｏ結合型グリコシル化の予測不可能性および不整合は、製造を困難にする。例えば、多くのＯ結合型グリカンは質量分析によりタンパク質製剤のバッチを特徴付けるのを不可能にしている。
【００１１】
この問題の可能な解決方法は、グリコシル化装置を持っていない原核細胞におけるタンパク質の産生および化学合成によるタンパク質の生産を含む。しかしながら、グリコシル化タンパク質は、非グリコシル化タンパク質より利点を持ち得る。例えば、Ｏ結合型グリコシル化は、フォールディングおよび３次構造の維持を助け、安定性やタンパク質分解酵素に対する抵抗性を増加させ、そして他のタンパク質との相互作用を調節する。Ｏ結合型グリコシル化はまた、タンパク質の生物学的活性にも影響し得る。ＴＮＦαを含む、多くの細胞シグナル伝達分子の活性は、細胞表面のレセプターのグリコシル化により調節される（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎら、（１９９８）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３（３）：１５１〜２０８）。さらに、製剤用途のための化学合成によるタンパク質の生産は、法外に費用がかかり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、明確に特徴付けられ得、そしてＢＡＦＦに対する特異性および親和性を維持しながら真核細胞における凝集を避けるグリコシル化パターンを有する治療用途のためのＢＡＦＦ−Ｒを提供する需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、部分的に、ヒトＢＡＦＦ−Ｒおよびその改変体のグリコシル化パターンの発見および特徴付けを基礎としている。本発明は、部分的に、ＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が、変化したグリコシル化パターンにもかかわらず、リガンド結合の実質的な損失なしで短縮され得るという上記発見および実証を、さらに基礎にしている。本開示は、変化したＯ結合型グリコシル化パターンを生じる上記ＥＣＤにおける欠失を有する、天然に存在しないＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を提供する。ＢＡＦＦ−Ｒのそのような短縮された形態は、以降「ΔＢＡＦＦ−Ｒ」または「ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチド」という。ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドをコードする対応する核酸は、「ΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸」という。
【００１４】
本開示は、少なくとも以下：変化したグリコシル化パターン、１０−９Ｍ以下の見かけの解離定数でのＢＡＦＦとの結合能力および／または減少した凝集傾向の内の一つ以上を有する、遺伝子組換えで発現した可溶型のΔＢＡＦＦ−Ｒを提供する。他の利点の中で、ＢＡＦＦ−Ｒのこれらの短縮された形態は、大スケールでの生産の間、上記タンパク質のより効率的な分析を可能とするグリコシル化パターンを有する。
【００１５】
一つの局面では、本開示は、二つのＯ結合型グリコシル化部位を有するＢＡＦＦ−Ｒの短縮された形態を提供する。特定の実施形態では、上記短縮されたＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ１８でグリコシル化されている。他の実施形態では、上記短縮されたＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ４１でグリコシル化されている。さらに他の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ１８およびＴ４１の両方でグリコシル化されている。そのようなグリコシル化パターンは、ＢＡＦＦ−Ｒの上記完全長ＥＣＤよりも、大スケール生産の間、より効率的に分析され得る。
【００１６】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、ヒト（ｈＢＡＦＦ−Ｒ）である。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、遺伝子組換え発現の間にｈＢＡＦＦ−Ｒの上記凝集傾向を減少させる点変異、例えば配列番号のＶ２１ＮおよびＬ２８Ｐ、を含有する。上記変異ｈＢＡＦＦ−Ｒは「ｖＢＡＦＦ−Ｒ」と呼ばれる。
【００１７】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３を含む。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１の４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、より長いアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９を含む。
【００１８】
さらなる実施形態では、第１アミノ酸配列は、配列番号１のＳ５０、Ｓ５１、Ｔ５６またはＳ６３に変異を含む完全長ＢＡＦＦ−Ｒを含み得、これらの部位にＢＡＦＦ−Ｒ分子が、グリコシル化される上記能力を除いている。いくつかの実施形態では、配列番号１のＳ５０、Ｓ５１、およびＴ５６は、グリコシル化部位を除くように変異されている。他の実施形態では、Ｓ５０、Ｓ５１、Ｔ５６またはＳ６３は、グリコシル化部位を除くように変異されている。
【００１９】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、（ａ）ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドをコードする第１アミノ酸配列ならびに（ｂ）免疫グロブリンの定常領域由来の第２アミノ酸配列および、必要に応じて、これらの配列間のリンカーを含む、ＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドの一部分である。
【００２０】
上記融合ポリペプチドの特定の実施形態では、第１アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３またはアミノ酸１４〜アミノ酸４３と実質的に同一である。他の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１の４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、より長いアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、配列番号１のアミノ酸８〜アミノ酸４９、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９、または配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９を含む。全ての実施形態で、上記第１アミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない。いくつかの実施形態では、上記第１アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸６３を含まない。
【００２１】
上記第２アミノ酸配列は、Ｆｃ部のような免疫グロブリンの定常領域由来であり得る。特定の実施形態では、上記第２アミノ酸配列は、ＩｇＧのＦｃ部由来である。関連する実施形態では、上記Ｆｃ部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４または他のＩｇＧアイソタイプ由来である。特定の実施形態では、第２アミノ酸配列は、配列番号４（ヒトＩｇＧ１）のアミノ酸３〜アミノ酸２２７である。
【００２２】
特定の実施形態では、第２アミノ酸配列は、上記第１アミノ酸配列の上記Ｃ末端または上記Ｎ末端とリンカーにより結合される。上記リンカーの正確な長さおよび配列ならびに上記結合された配列に関係するその配向は、変化し得る。上記リンカーは、タンパク様であり得、または非タンパク様であり得る。タンパク様リンカーの場合、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない。
【００２３】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ融合ポリペプチド（ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ）は、少なくとも配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７に直接融合した配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、アミノ酸８〜アミノ酸４９、アミノ酸１４〜アミノ酸４９、アミノ酸１３〜アミノ酸４３またはアミノ酸１４〜アミノ酸４３を含む。さらなる実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃは、少なくとも配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７に間接的に（すなわちリンカーを介して）結合した（すなわちリンカーを介して）配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、アミノ酸８〜アミノ酸４９、アミノ酸１４〜アミノ酸４９、アミノ酸１３〜アミノ酸４３またはアミノ酸１４〜アミノ酸４３を含む。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃは、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８もしくは１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８もしくは４９である、より長いアミノ酸配列を包含し、これは配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と直接融合しているか、もしくはリンカーを介して結合している。
【００２４】
本開示は、ΔＢＡＦＦ−ＲポリペプチドをコードするΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸を提供する。いくつかの実施形態では、上記核酸は、少なくとも配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３または少なくとも配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３をコードする配列を含む。上記核酸は、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、ΔＢＡＦＦ−Ｒのより長いフラグメントをコードし得る。他の実施形態では、上記核酸は、配列番号２のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６または配列番号３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの定常領域と直接またはリンカーを介して結合しているΔＢＡＦＦ−ＲをコードするＤＮＡ構築物を提供する。特定の実施形態では、上記ＤＮＡ構築物は、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と結合している、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９を有し、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９を有するΔＢＡＦＦ−Ｒをコードする。他の特定の実施形態では、上記ＤＮＡ構築物は、配列番号５のヌクレオチド７〜ヌクレオチド６８１と結合している、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６を含む。
【００２６】
本開示はまた、Ｂ−細胞およびＴ細胞が媒介する状態を処置する方法および薬学的組成物を提供する。本方法は、そのような処置が望まれる被験体に、上記被験体のＢＡＦＦ関連状態を処置、予防もしくは遅延させるのに十分な量のΔＢＡＦＦ−Ｒをコードする核酸またはΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを投与する工程を含む。本発明の上記組成物および方法を用いて処置され得る障害は、制限されないが、本明細書で参考として援用しているＷＯ０２／２４９０９に記載されている。これらの障害としては、制限されないが、免疫学的障害、自己免疫疾患、癌、腎臓病、ウイルス関連病、高血圧症、免疫抑制の必要な状態、炎症性疾患および非悪性増殖性障害が挙げられる。
本開示はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
変化したＯ結合型グリコシル化パターンを生じる細胞外ドメインの欠失を有するが、ＢＡＦＦへの結合能力は保持している、天然に存在しないＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目２）
少なくとも一つのＯ結合型グリカンを有する、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目３）
前記Ｏ結合型グリカンが、配列番号１の１８位のスレオニンまたは４１位のスレオニンに相当するアミノ酸に結合している、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目４）
前記Ｏ結合型グリカンが、配列番号１の１８位のスレオニン、４１位のスレオニンまたは８位のセリンに相当するアミノ酸に結合している、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目５）
ＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質がヒトである、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目６）
前記欠失が、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６である、項目５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目７）
前記欠失が、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸６３である、項目５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目８）
前記欠失が、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸７２である、項目５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目９）
配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１０）
配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１１）
少なくとも２つのアミノ酸置換を有し、該置換アミノ酸が、配列番号１の２１位のアミノ酸および２８位のアミノ酸に対応する、項目５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１２）
以下のアミノ酸配列：
（ａ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸８〜アミノ酸４９；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９；
（ｆ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９；または、
（ｇ）配列番号７のアミノ酸１〜アミノ酸４９
を有するポリペプチドを含む、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１３）
配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９から、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９までのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目１２に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１４）
配列番号１の２１位のアミノ酸がバリンであり、配列番号１の２８位のアミノ酸がロイシンである、項目１２に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１５）
配列番号１の２１位のアミノ酸が、アスパラギンであり、配列番号１の２８位のアミノ酸がプロリンである、項目１２に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１６）
免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分および、必要に応じて、前記ペプチドと免疫グロブリンの定常領域の前記部分とを結合するリンカーをさらに包含し、ここで該リンカーは、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含有しない、項目１２に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１７）
免疫グロブリンの前記部分が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、項目１６に記載の糖タンパク質。
（項目１８）
前記免疫グロブリンの定常領域の前記部分が、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７を含む、項目１７に記載の糖タンパク質。
（項目１９）
項目１に記載の前記ＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質をコードする核酸。
（項目２０）
少なくとも以下の配列：
（ａ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸８〜アミノ酸４９；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９；
（ｆ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９；または、
（ｇ）配列番号７のアミノ酸１〜アミノ酸４９
をコードすることを含む、項目１９に記載の核酸。
（項目２１）
配列番号２または３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６を含む、項目１９に記載の核酸。
（項目２２）
項目１９〜２０のいずれか一項に記載した核酸を含むベクター。
（項目２３）
項目１９〜２１のいずれかに記載の核酸を含む、宿主細胞。
（項目２４）
ＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を産生する方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）項目２２に記載の前記ベクターで、宿主細胞を形質転換する工程；
（ｂ）前記タンパク質の産生を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する工程；および（ｃ）前記宿主細胞からＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を単離する工程を含む、方法。
（項目２５）
ＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドであって、以下：（ａ）第１ポリペプチドであって、該第１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３または配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３から実質的に始まるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列が（ｂ）第２アミノ酸配列と融合し、該第２アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む、アミノ酸配列、および必要に応じて（ｃ）前記第１配列と第２配列を結合するリンカーを含有し、ここで該ＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない、ポリペプチド。
（項目２６）
前記リンカーが、タンパク様である、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目２７）
前記リンカーが、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目２８）
前記第１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸８〜アミノ酸４９のアミノ酸配列を含む、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目２９）
項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目３０）
項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目３１）
項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドであって、少なくとも二つのアミノ酸置換を有し、該置換アミノ酸は、配列番号１の２１位のアミノ酸および２８位のアミノ酸に対応する、ポリペプチド。
（項目３２）
前記第１ポリペプチドが、以下のアミノ酸配列：
（ａ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９；または、
（ｆ）配列番号７のアミノ酸１〜アミノ酸４９
を包含し、そして前記第２ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７を含む、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目３３）
前記第１ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と融合する、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８もしくは１９から、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９までを含む、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目３４）
項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドをコードする核酸。
（項目３５）
以下：
（ａ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９；または、
（ｆ）配列番号７のアミノ酸１〜アミノ酸４９
と融合する、配列番号４のアミノ酸１〜アミノ酸２２７をコードするヌクレオチドを含む、項目３４に記載の核酸。
（項目３６）
（ａ）配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６および（ｂ）配列番号５のヌクレオチド７〜ヌクレオチド６８１を含む、項目３４に記載の核酸。
（項目３７）
項目３３〜３５に記載のいずれか一項の核酸を含む、ベクター。
（項目３８）
項目３３〜３５に記載のいずれか一項の核酸を含む、宿主細胞。
（項目３９）
項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を含む、薬学的組成物。
（項目４０）
項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドを含む、薬学的組成物。
（項目４１）
項目１９に記載の核酸を含む、薬学的組成物。
（項目４２）
処置の必要な患者に項目３９〜４１のいずれか一項に記載されている治療有効量の前記薬学的組成物を投与する工程を包含し、それにより免疫学的障害を処置する、免疫学的障害を処置するための方法。
（項目４３）
処置の必要な患者に項目３９〜４１のいずれか一項に記載されている治療有効量の前記薬学的組成物を投与する工程を含み、それにより免疫学的障害を処置する、免疫学的障害を処置するための方法。
（項目４４）
ナノモル濃度範囲でＢＡＦＦに対する見掛けの親和性を有する、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目４５）
少なくとも１０９Ｍ−１でＢＡＦＦに対する見掛けの親和性を有する、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目４６）
配列番号１のアミノ酸５０、アミノ酸５１およびアミノ酸５６に変異を有する、配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸５６を含む、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドであって、ここでアミノ酸５０が、セリンでもスレオニンでもなく、そしてアミノ酸５６が、セリンでもなくスレオニンでもないポリペプチド。
（項目４７）
配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸６３をさらに包含し、配列番号１のアミノ酸６３に変異を有し、ここでアミノ酸６３は、セリンでもスレオニンでもない、項目４６に記載のＢＡＦＦ−Ｒポリペプチド。
【００２７】
本発明のさらなる目的および利点は、以下の記述に部分的に示され、そしてその記述から明らかになり、または本発明の実施により分かり得る。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素および組み合わせにより認識され、そして達成される。
上記一般的な記述および以下の詳細な説明は、ただ請求されるように、例示的で説明的であるが、本発明を制限するものではないことが理解される。
添付の図面は、本明細書で援用され、本明細書の一部分を構成し、本発明のいくつかの実施形態を記載ととも説明し、本発明の趣旨を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、種々のΔＢＡＦＦ−Ｒ：ＦｃとＢＡＦＦとの免疫共沈殿の結果を示す。レーン１は、配列番号１のアミノ酸Ａ１４〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン２は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｓ５０を示す；レーン３は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｑ５９を示す；レーン４は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｇ６７を示す；レーン５は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン６は、分子量標準を示す；レーン７は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン８およびレーン９は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｒ４３を示す；レーン１０は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｔ４１を示す；およびレーン１１は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｃ３６を示す。
【図２】図２は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびＢＡＦＦのｋＤＡＰＰの決定のための結合アッセイの結果を示す。白抜きおよび黒塗りの印は、２連の実験の結果を示す。
【図３】図３は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびＢＡＦＦの推定ｋＤＡＰＰの分析を示す。白抜きおよび黒塗りの印は、二連の実験の結果を示す。
【図４】図４は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃのＣＨＯ細胞表面に発現するヒトＢＡＦＦ（ｈＢＡＦＦ）への結合を示す。
【図５】図５は、種々の濃度のｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃのビオチン化ｈＢＡＦＦのＢＪＡＢ細胞への結合をブロックする結合アッセイの結果を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、マウスＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ（配列番号６）のＮ結合型グリコシル化部位およびヒトｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）（配列番号１）のＯ結合型グリコシル化部位の位置を示す。
【図７】図７は、ＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｆ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｇ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｈ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図９】図９は、ＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図１０】図１０は、増殖培地中のｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃ濃度の増加の脾臓Ｂ細胞の［３Ｈ］チミジン取り込み能に対する効果を示す。三角は、ヒトＩｇＧをインヒビターとして処置された培養物を示し、四角は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃ処置を示し、そしてダイアモンドは、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃ処置を示す。
【図１１】図１１は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃのＣＤ１９＋脾臓Ｂ細胞の数に対する効果を示す。
【図１２】図１２Ａは、ｈＢＡＦＦが固定され、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃのＢＡＦＦへの結合の結合親和性をＯＤ４０５で測定されたＥＬＩＳＡ捕獲実験の結果を示す。図１２Ｂは、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃが固定され、ＦＬＡＧ−ｈＢＡＦＦの結合がＯＤ４０５で測定された同様なＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（実施形態の説明）
本発明が、より容易に理解されるために、特定の用語について本明細書に定義されている。さらなる定義が詳細な説明の至る所で示されている。
【００３０】
用語「変化したグリコシル化パターン」は、完全長の細胞外ドメインを有するＢＡＦＦ−Ｒと比較して、Ｃ末端において短縮された細胞外ドメインを有する、天然に存在しないＢＡＦＦ−Ｒにおけるグリコシル化パターンをいい、それは野生型配列と異なってもよいし、異ならなくてもよい。ヒトＢＡＦＦ−Ｒにとって、細胞外ドメインのＣ末端の短縮は、少なくとも一つのＯ結合型グリコシル化部位の除去を生じる。
【００３１】
用語「ＢＡＦＦ」は、ＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子をいい、単球、マクロファージ、末梢血リンパ球および樹状細胞による発現、ならびにＢ細胞生存因子としての役割で特徴付けられる。ＢＡＦＦの特徴の要約は、Ｍａｃｋａｙら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：４６５〜４７５により提供される。
【００３２】
本明細書で使用されるように、用語「ＢＡＦＦ−Ｒ」は、ほかで記述されない限り、変異型または野生型ヒトＢＡＦＦレセプターおよびそれらの改変体をいい、配列番号７で示されるアミノ酸５０で付加的アラニンを含有するスプライス改変体、ＢＡＦＦと結合するＴＮＦファミリーレセプタータンパク質を含み、ＷＯ０２／２４９０９で定義されるように、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩにより認識される他のリガンドは含まない。用語「ΔＢＡＦＦ−Ｒ」は、Ｎ末端またはＣ末端のアミノ酸を欠損しているが、ＢＡＦＦとの結合能力は維持しているＢＡＦＦ−Ｒのいかなる形態をもいう。用語「ｈＢＡＦＦ−Ｒ」は、ヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質またはその天然に存在する改変体をいう。用語「ｖＢＡＦＦ−Ｒ」は、少なくとも配列番号１のアミノ酸２１およびアミノ酸２８、例えばＶ２１ＮおよびＬ２８Ｐに変異を有するヒトＢＡＦＦ−Ｒの変異形態をいう。
【００３３】
用語「ＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ」は、ＢＡＦＦ−Ｒおよび免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）配列を有する融合タンパク質をいう。用語「ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ」は、（１）少なくとも配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３のアミノ酸またはその改変体を含むが、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まないアミノ酸、ならびに（２）免疫グロブリンの定常領域、例えば、Ｆｃ由来のアミノ酸配列を含む任意の融合タンパク質をいう。同様に、用語「ｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ」は、マウスＢＡＦＦ−ＲおよびＦｃ配列を含む融合タンパク質をいう。
【００３４】
用語「対応する」およびその類縁は、アミノ酸残基またはその位置を参照して用いられる場合、第１配列および第２配列が最適に整列している場合、第２アミノ酸配列のアミノ酸に関する第１アミノ酸配列のアミノ酸の位置をいう。配列は、両方の配列における最大の可能な数のアミノ酸が一致する場合、最適に整列していると見なされる。
用語「生物学的活性」は、生物系において分子により、インビボまたはインビトロで達成される機能もしくは一連の機能（または上記機能に起因する効果）をいう。生物学的活性は、例えば、リンパ球の増殖、生存率および機能（例えば、サイトカイン分泌）に対する効果、一群の分化マーカーの発現、転写、翻訳もしくは翻訳後レベルにおける遺伝子発現または自己抗体産生に対する効果などで評価され得る。
【００３５】
用語「ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）」は、上記タンパク質を、特に配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸７２を、発現する細胞の外部に存在するタンパク質の上記部分をいう。用語「ストーク（ｓｔａｌｋ）ドメイン」は、上記システインリッチドメインと上記膜貫通ドメインとの間のＴＮＦレセプターファミリーメンバーのタンパク質の上記部分をいう。
【００３６】
用語「免疫学的障害」は、免疫応答が異常である障害および状態をいう。上記異常な応答は、（ａ）免疫細胞、例えばＴ細胞もしくはＢ細胞など、の異常な増殖、異常な成熟、異常な生存率、異常な分化または異常な機能に起因し得る。そのような障害としては、限定されないが、慢性関節リウマチ（ＲＡ），若年性慢性関節炎、喘息、乾癬、脱髄障害、多発性硬化症（ＭＳ），炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、炎症性および線維性肺疾患、クローン病、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、移植拒絶、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、過増殖免疫障害、自己免疫疾患、Ｂ細胞腫瘍、免疫調節、抗体媒介病理（例えば、ＩＴＰ、重症筋無力症など）、腎臓疾患、間接的Ｔ細胞免疫応答、移植拒絶および対宿主性移植片病および免疫抑制障害が挙げられる。
【００３７】
用語「単離された」は、実質的に天然の環境がない分子をいう。例えば単離されたタンパク質は、細胞物質または由来する細胞もしくは組織源からの他のタンパク質が実質的にない。用語「単離された」はまた、上記単離されたタンパク質が、薬学的組成物として投与するのに十分に純粋であり、または少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）の純度で、より好ましくは少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）の純度で、さらにより好ましくは９０〜９５％の純度で、もっとも好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（ｗ／ｗ）の純度である。
【００３８】
用語「調節する」およびその類縁は、ＢＡＦＦ−ＲまたはＢＡＦＦの生物学的活性、例えば、ＢＡＦＦレセプターを発現するリンパ球に対して天然に発現したＢＡＦＦ−ＲまたはＢＡＦＦにより発揮された効果と関連する活性などの、減少もしくは増大をいう。生物学的活性の減少または増大は、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上である。
本明細書で用いられるように、用語「治療化合物」および「治療剤」は、障害の臨床症状を改善できるかまたは望ましい生物学的結果を生じさせることができる任意の化合物を言う。
【００３９】
用語「ポリヌクレオチド」「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）といい、適切な場合、リボ核酸（ＲＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）という。上記用語はまた、ヌクレオチドアナログおよび一重鎖ポリヌクレオチドまたは二重鎖ポリヌクレオチドを含むことが理解される。ポリヌクレオチドの例としては、制限されないが、プラスミドのＤＮＡもしくはそのフラグメント、ウイルスＤＮＡもしくはウイルスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどが挙げられる。用語「プラスミドＤＮＡ」は、円形の二重鎖ＤＮＡをいう。
【００４０】
本発明は、部分的に、ヒトＢＡＦＦ−Ｒおよびその改変体のグリコシル化パターンの発見と特徴づけを、基礎にしている。特に、上記完全長ヒトＢＡＦＦ−Ｒは、多数のＯ結合型グリコシル化部位を含み、上記タンパク質のマウスバージョンは、一つのＮ結合型グリコシル化部位を含有し、Ｏ結合型グリコシル化部位は有しない。ヒトＢＡＦＦ−ＲのＣ末端に５つの潜在的グリコシル化部位があり、配列番号１のＴ４１，Ｓ５０、Ｓ５１、Ｔ５６、およびＳ６３である。全ての５つの部位を含有するタンパク分解フラグメントは、一貫して、＞８０％グリコシル化されている（表２を参照のこと）。
【００４１】
本開示は、変化したＯ結合型グリコシル化パターンを生じる上記ＥＣＤの欠失を有する、天然に存在しないＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を提供する。ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃのストーク領域の欠失分析は、残基４４〜７２の欠失が、結果として生じる融合タンパク質のＢＡＦＦと相互作用する能力を破壊しないことを示す。実施例に示されている上記融合タンパク質ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃは、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃのストーク領域のアミノ酸残基５０〜７２の欠失により生じる（ＷＯ０２／２４９０９に記載されている）。
【００４２】
タンパク質の正確な組成を決定することは、薬学的に受容可能なタンパク質ベースの治療剤を生産するのに必須の工程である。ポリペプチドの上記グリコシル化の変化は、結合親和性および溶解性などのような重要な特徴に変化を生じさせ得る。タンパク質治療剤を製造する場合、各バッチは、糖含量を含む多種の重要な特性を分析されなければならない。生産物を製造している間に、ヒトＢＡＦＦ−Ｒのグリコシル化パターンを、分析および調節することは困難であり得る。さらに、潜在的なバッチからバッチへの変動がある場合、グリコシル化パターンの上記分析は、変動の原因を同定するために必要であり得る。従って、他の利点の中には、ここで開示されるＢＡＦＦ−Ｒの短縮形態は、大スケールでの生産の間、より効率的な分析を可能にする。
【００４３】
アミノ酸４３でのＢＡＦＦ−Ｒの上記Ｃ末端の短縮は、完全長ＢＡＦＦ−Ｒの上記ＢＡＦＦとの結合能力を維持しながら、ちょうど二つのＯ結合型グリコシル化部位を有するポリペプチドを産生する。このΔＢＡＦＦ−Ｒは、真核細胞で発現される場合、通常は、二つの部位（配列番号１のＴ１８およびＴ４１）のみでグリコシル化される。このように、本発明は、完全長タンパク質と比較すると変化したグリコシル化パターンを有する生物学的に活性なΔＢＡＦＦ−Ｒを提供する。
【００４４】
本発明は、部分的に、ＢＡＦＦ−ＲのＢＡＦＦへの結合は、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外ドメインのＮ末端領域および／またはＣ末端領域が欠失した場合でも起こるという発見を、さらに基礎としている。結合は、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸７２の欠失の後でも減少せず、そして配列番号１のアミノ酸４３〜アミノ酸７２の欠失の後にほんの部分的に減少する。
【００４５】
最善には、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃは、ＢＡＦＦへ１ｎＭ未満の見かけの親和性（ｋＤＡＰＰ）で結合する。ΔＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜４９）：Ｆｃは、ＢＡＦＦ発現細胞ならびに上記完全長形態に結合し、ＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃと類似の濃度で、内因性のＢＡＦＦ−Ｒを発現する細胞に対するＢＡＦＦの結合を防止する。これらの発見は、短縮されたおよび完全長のＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃポリペプチドは、ＢＡＦＦに対する同様な結合親和性を有していること、およびこれらの親和性は、ナノモル濃度未満の範囲であるということを示している。これらの結果は、親和性成分を含む見かけの親和性として報告される。
【００４６】
一つの局面では、本開示は、二つのＯ結合型グリコシル化部位を有するＢＡＦＦ−Ｒの短縮された形態を提供する。特定の実施形態では、上記短縮されたＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ１８でグリコシル化される。他の実施形態では、上記短縮されたＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ４１でグリコシル化される。さらに他の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ１８とＴ４１の両方でグリコシル化される。さらなる実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＳ８でグリコシル化される。そのようなグリコシル化パターンは、ＢＡＦＦ−Ｒの完全長ＥＣＤのグリコシル化パターンよりも、大スケール生産の間より効率的に分析され得る。
【００４７】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、ヒト（ｈＢＡＦＦ−Ｒ）である。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、組換え発現の間にｈＢＡＦＦ−Ｒの凝集傾向を減少させる点変異（例えば、配列番号１のＶ２１ＮおよびＬ２８Ｐ）を含有する。上記変異ｈＢＡＦＦ−Ｒは、ｖＢＡＦＦ−Ｒと呼ばれる。
【００４８】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３を含む。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、Ｎ末端アミノ酸が、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が、配列番号１の４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、より長いアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、（ａ）ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドをコードする第１アミノ酸配列および（ｂ）免疫グロブリンの定常領域由来の第２アミノ酸配列、そして必要に応じてこれらの配列の間にリンカーを含むＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドの一部分である。
【００５０】
上記融合ポリペプチドの特定の実施形態では、第１アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３または配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３と実質的に同一である。他の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、Ｎ末端アミノ酸が、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、より長いアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、配列番号１のアミノ酸８〜アミノ酸４９、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９、または配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９を含む。全ての実施形態で、第１アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない。いくつかの実施形態では、第１アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸６３を含まない。
【００５１】
第２アミノ酸配列は、Ｆｃ部のような免疫グロブリンの定常領域由来であり得る。特定の実施形態では、上記第２アミノ酸配列は、ＩｇＧのＦｃ部由来である。関連する実施形態では、上記Ｆｃ部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４または別のＩｇＧアイソタイプ由来である。特定の実施形態では、上記第２アミノ酸配列は、配列番号４（ヒトＩｇＧ１）のアミノ酸３〜アミノ酸２２７である。
【００５２】
特定の実施形態では、第２アミノ酸配列は、第１アミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端とリンカーで結合されている。上記リンカー正確な長さおよび配列、ならびに結合された配列に関するその配向は、変化し得る。上記リンカーは、タンパク様または非タンパク様であり得る。タンパク様リンカーの場合、それは、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない。
【００５３】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃ融合ポリペプチド（ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ）は、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と直接融合する、少なくとも配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、アミノ酸８〜アミノ酸４９、アミノ酸１４〜アミノ酸４９、アミノ酸１３〜アミノ酸４３、またはアミノ酸１４〜アミノ酸４３を含む。さらなる実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃは、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と間接的（即ちリンカーを介して）に結合する、配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、アミノ酸８〜アミノ酸４９、アミノ酸１４〜アミノ酸４９、アミノ酸１３〜アミノ酸４３またはアミノ酸１４〜アミノ酸４３を含む。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃは、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、より長いＢＡＦＦ−Ｒ配列を包含し、これは配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と直接融合するかまたはリンカーにより結合される。
【００５４】
本発明はまた、これらの部位でグリコシル化されるＢＡＦＦ−Ｒ分子の能力を除去する、配列番号１のＳ５０、Ｓ５１、Ｔ５６またはＳ６３でのアミノ酸変異を含む完全長ＢＡＦＦ−Ｒ分子を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号１のＳ５０、Ｓ５１およびＴ５６は、上記グリコシル化部位を除去するよう変異されている。他の実施形態では、Ｓ５０、Ｓ５１、Ｔ５６およびＳ６３は、上記グリコシル化部位を除去するよう変異されている。
【００５５】
本開示は、ΔＢＡＦＦ−ＲポリペプチドをコードするＢＡＦＦ−Ｒ核酸を提供する。いくつかの実施形態では、上記核酸は、少なくとも配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３または少なくとも配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３をコードする配列を含む。上記核酸は、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９にＮ末端を、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９にＣ末端を有し、より長いΔＢＡＦＦ−Ｒのフラグメントをコードし得る。他の実施形態では、上記核酸は、配列番号２のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６または配列番号３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明は、免疫グロブリン定常領域に、直接またはリンカーを介してのいずれかで結合する、ΔＢＡＦＦ−ＲをコードするＤＮＡ構築物を提供する。特定の実施形態では、上記ＤＮＡ構築物は、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９にＮ末端を、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９にＣ末端を有し、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７に結合したΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃをコードする。他の特定の実施形態では、上記ＤＮＡ構築物は、配列番号５のヌクレオチド７〜ヌクレオチド６８１と結合した配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６を含む。
【００５７】
融合タンパク質構築物は、それらが１本のオープンリーディングフレームで翻訳されるようなインフレームで、二つの異なるポリペプチドをコードする配列を連結することにより作製され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の定常領域と、直接または配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６をコードする配列を含まないリンカーＤＮＡを介してのいずれかで、融合するΔＢＡＦＦ−Ｒを含むＤＮＡ構築物を提供する。特定の実施形態では、上記核酸は、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９にＮ末端を有し、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９に、Ｃ末端を有し、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と結合しているΔＢＡＦＦ−Ｒタンパク質をコードし得る。他の特定の実施形態では、上記核酸は、配列番号５のヌクレオチド７〜ヌクレオチド６８１と結合している配列番号２のヌクレオチド１〜２１６を含む。
【００５８】
ΔＢＡＦＦ−Ｒおよびそれがコードする核酸分子およびベクターは、任意の適切なクローニング方法を用いて作製され得る。種々の異なる宿主細胞における、ポリペプチドのクローニングおよび発現のシステムは、周知である。適切な宿主細胞は、細菌、哺乳動物および酵母ならびにバキュロウイルスの系を含む。異種のポリペプチドの発現のための当該分野で入手可能な哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞，ＨｅＬａ細胞、新生児ハムスター腎細胞，ＮＳ０マウス黒色腫細胞およびその他多くを含む。通常の細菌宿主はＥ．ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞は、上記ポリペプチドへＮ結合型グリコシル化またはＯ結合型グリコシル化を付加しない。酵母およびバキュロウイルスは、Ｎ結合型グリコシル化修飾またはＯ結合型グリコシル化修飾を行なうが、上記糖鎖は、哺乳動物細胞を用いたときのものとこれらの細胞での組成は異なり得る。ΔＢＡＦＦ−Ｒを生産する他の適切な細胞については、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら編（１９９９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００５９】
プロモータ配列、終止配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適切な他の配列を含み、適切な制御配列を含有する、適切なベクターが、選択され得るかまたは構築され得る。ベクターはプラスミドまたはウイルス（例えば、適切なファージもしくはファージミド）であり得る。さらに詳細には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞内へのＤＮＡ導入および遺伝子発現ならびにタンパク質の分析における、核酸を取り扱う多くの公知の技術およびプロトコルの詳細はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｂｅｌら編、（１９９２）第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓに記載されている。
【００６０】
本発明の上記ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、投与に適切な薬学的組成物に組込まれ得る。そのような組成物は、代表的に上記核酸またはポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書で用いられるように、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意の溶剤、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに薬学的投与に適合するその他のものを含むことが意図されている。適切なキャリアは、ＷＯ０２／２４９０９に詳細が記載されている。
【００６１】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路に適合するよう処方される。治療的に有効なΔＢＡＦＦ−Ｒの量は、その体重１ｋｇあたり０．００１〜３０ｍｇ、好ましくは０．０１〜２５ｍｇ、０．１〜２０ｍｇまたは１〜１０ｍｇの範囲である。投薬量は、必要に応じて、処置についての観察される効果に合わせて、調節され得る。ΔＢＡＦＦ−Ｒは、ボーラス量で与えられ得る。連続注入はまた、上記ボーラス量の後に用いられ得る。適切な用量およびレジメンは、処置医による臨床適応に基づいて選択される。投与経路およびこれらの経路の各々について適切な組成物の例は、ＷＯ０２／２４９０９に詳細に記載されている。さらなる方法および治療レジメンは、米国出願番号第６０／５１２，８８０号に詳細が記載されている。
【００６２】
本発明の核酸は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得るか、または裸のＤＮＡとして送達され得る。遺伝子治療ベクターおよびその送達の例は、ＷＯ０２／２４９０９に見出され得る。
【００６３】
本発明は、ＢＡＦＦ関連障害（例えばＢ細胞およびＴ細胞が媒介する状態のような異常なＢＡＦＦもしくはＢＡＦＦ−Ｒの発現もしくは活性と関連する障害）のリスクのある（またはかかりやすい）被験体を処置する、予防および処置の両方の方法を提供する。ＢＡＦＦの増加したレベルもしくは増加した生物学的活性により特徴づけられる疾患および障害は、ＢＡＦＦもしくはＢＡＦＦ−Ｒ活性と拮抗する治療剤で処置され得る。本方法は、そのような処置が望まれている被験体に上記被験体のＢＡＦＦ関連状態を処置、予防もしくは遅延させるのに十分な量のΔＢＡＦＦ−ＲまたはΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドをコードする核酸を投与する工程を包含する。本発明の組成物および方法を用いて処置され得る障害は、制限されないが、ＷＯ０２／２４９０９に記載されている障害を含む。
【００６４】
上記ΔＢＡＦＦ−Ｒ組成物を投与する工程は、ＢＡＦＦ−Ｒ活性に特徴的な症状が発現する前に、疾患または障害が予防されるか、もしくは代わりにその進行を遅延させるように、発生し得る。
【００６５】
本発明の別の局面は、治療目的のために、ＢＡＦＦまたはＢＡＦＦ−Ｒ発現もしくは活性を調節する方法に関する。本発明の上記調節方法は、細胞を、その細胞と関連するＢＡＦＦ活性の一つ以上の活性を調節するΔＢＡＦＦ−ＲポリペプチドまたはΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸と接触させることを含んでいる。一つの実施形態では、上記ＢＡＦＦ−Ｒ組成物は、一以上のＢＡＦＦ活性を阻害する。上記調節は、インビトロ（例えば、上記組成物とともに細胞を培養することにより）または代わりにインビボ（例えば、上記薬剤を被験体に投与することにより）で実施され得る。従って、本発明は、ＢＡＦＦ活性が関連する疾患または障害に苦しんでいる固体を、ＢＡＦＦ活性をブロックするΔＢＡＦＦ−Ｒタンパク質もしくはΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸を投与することにより、処置する方法を提供する。
【００６６】
本開示は、自己免疫疾患，Ｂ細胞癌、免疫調節、炎症性腸疾患および抗体媒介病理学的症状（例えばＩＴＰ、重症筋無力症など）、腎疾患、間接的Ｔ細胞免疫応答、移植拒絶および対宿主性移植片病、を処置する方法および薬学的組成物を提供する。本発明の組成物は、免疫応答の間に、Ｂ細胞を特異的に調節するように標的化され得る。さらに、本発明の組成物は、Ｂ細胞の発生、他の細胞の発生、抗体産生およびサイトカイン産生を調節するのに使用され得る。本発明の組成物はまた、ＢＡＦＦの増殖性効果を中和することにより、Ｔ細胞およびＢ細胞のコミュニケーションを調節し得る。
【００６７】
上記ΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸およびΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドはまた、限定されないが、狼瘡およびリウマチ関節炎を含む、自己免疫疾患の処置に有用であり得る。ＢＡＦＦ活性を調節することにより、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、これらの疾患の症状を予防または減少し得る。これらの疾患の症状についてのΔＢＡＦＦ−Ｒの媒介性の調節は、Ｂ細胞の発生、他の細胞の発生、抗体産生またはサイトカイン産生の減少により生じ得る。ΔＢＡＦＦ−Ｒの狼瘡に対する効果は、自己抗体レベル、免疫複合体沈着合併症ならびに、腎不全、蛋白尿、巨脾腫症、神経痛症状および死を含む、全身性エリトマトーデスの症状を評価することにより測定され得る。リウマチ関節炎に対するΔＢＡＦＦ−Ｒの効果は、自己抗体レベル、関節炎惹起免疫グロブリンの分泌、関節および異常な腫脹、またはサイトカインレベルを評価することにより測定され得る。さらにΔＢＡＦＦ−Ｒは、重症筋無力症および若年性慢性関節炎のような他の自己免疫障害を処置するのに有用であり得る。
【００６８】
ΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸およびΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドは、前ＢもしくはＢ細胞性白血病（例えば、形質細胞性白血病、慢性もしくは急性リンパ性白血病、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫、形質細胞性骨髄腫、内皮性骨髄腫、および巨細胞骨髄腫）およびリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫））を処置するために、ＢＡＦＦの効果を中和するのに有用であり得る。本明細書で記載されている分子により処置され得るＢ細胞性リンパ腫のさらなる例としては、バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、大細胞型リンパ腫（例えば、免疫芽球性リンパ腫）、辺縁層リンパ腫、外套細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ種および他のＢ細胞性リンパ腫を含む。
【００６９】
本発明は、自己免疫疾患と関連してもしなくてもよい、末期の腎疾患と関連するＢ細胞の作用を選択的に遮断もしくは中和するために、ΔＢＡＦＦ−ＲポリペプチドまたはΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸を用いる方法を提供する。そのような方法は、免疫学的腎疾患（例えば、膜性ニューロパチー，ＩｇＡニューロパシー、バージャー病），ＩｇＭニューロパチー、グッドパスチャーズ病、感染後糸球体腎炎、膜性増殖性疾患、慢性リンパ性白血病および微少変化ネフローゼ症候群のような疾患と関連する糸球体腎炎を、処置するのに有用である。そのような方法はまた、狼瘡、多発性動脈炎、ヘーノホ−シェーンライン病、水腫性硬化症，ＨＩＶ関連疾患、アミロイドーシスもしくは溶血性尿毒症症候群のような疾患と関連する続発性糸球体腎炎もしくは脈管炎を処置する治療用途として役立つ。本発明の方法はまた、慢性腎盂腎炎、鎮痛剤の乱用、腎石灰沈着、他の薬剤によるニューロパシー、腎石症、または慢性もしくは急性間質性腎炎と関連する間質性腎炎あるいは腎盂腎炎を処置する治療用途の一部として有用である。本発明の方法はまた、腎動脈狭窄、もしくは閉塞およびコレステロール塞栓、または腎塞栓、腎新生物もしくは泌尿器系新生物、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖ニューロパシーもしくはアミロイドーシスを含む、高血圧疾患または主幹動脈疾患（ｌａｒｇｅ ｖｅｓｓｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）のΔＢＡＦＦ−Ｒを含む組成物による処置における、ΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸およびΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドの使用を含む。
【００７０】
本発明はまた、喘息ならびに、気管支炎および気腫のような、他の慢性気道疾患の処置のためにΔＢＡＦＦ−Ｒを使用して活性化されたＢ細胞を遮断もしくは阻害する方法を提供する。
【００７１】
ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを用いてエフェクターＴ細胞応答を、阻害するもしくは中和する方法もまた、提供される。これらの方法は、対宿主移植片病および移植拒絶のような、免疫抑制が要求される状態を処置するのに使用され得る。ΔＢＡＦＦ−Ｒの組成物はまた、インスリン依存性糖尿病およびクローン病のような自己免疫疾患の処置に有用である。本発明の方法は、慢性炎症性疾患、特に関節痛（例えば、外傷もしくは骨関節炎における）、腫脹、貧血および他の関連症状を軽減するのに、ならびに敗血症ショックを処置するのに、さらなる治療的価値を有する。
【００７２】
さらに、本発明は、腫瘍とはみなされない増殖性状態、即ち細胞性過増殖（過形成）（例えば、強皮症、リウマチ関節炎におけるパンヌス形成、術後瘢痕および肺線維症、肝線維症および子宮線維症など）の処置に有用である。
【実施例】
【００７３】
（実施例１）
本実施例は、野生型ｈＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃのレセプタードメイン内での種々のペプチド欠失の生成と分析を記載する。これらの欠失変異体のｈＢＡＦＦ結合能を分析した。
【００７４】
ｈＢＡＦＦ−Ｒ：ＦｃのｈＢＡＦＦ−Ｒドメイン内に種々のインフレームペプチド欠失をコードする付着末端を有する２重鎖オリゴヌクレオチドカセットを設計し、そして合成した。上記オリゴヌクレオチドカセットを、相補的末端を有するベクターを含有するｈＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃと連結した。カセットをＮ末端からシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）またはＣ末端からストーク領域の上記ＣＲＤのいずれかの残基を除去するよう設計した。
【００７５】
上記ｈＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ欠失のコード配列を、２９３ＥＢＮＡ細胞での哺乳動物細胞発現のためのベクターにサブクローニングした。発現プラスミドを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、２９３ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞上清を、トランスフェクト後４８時間で採取した。
【００７６】
発現を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに引き続きＰＶＤＦ膜へのウエスタン転写により評価した。膜をＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ）中で、５％脱脂粉乳で１時間ブロックし、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でプローブ化し、ＴＢＳＴ中で３回洗浄し、そして化学蛍光基質（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で検出した。
【００７７】
ｈＢＡＦＦ結合能を免疫共沈降法により分析した。これらの実験では、ｈＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃもしくはその欠失を含有する１００μｌの条件培地を、１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦを含む１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中、４℃で３時間もしくは一晩インキュベートした。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭビーズ（３０μｌ）を加え、攪拌しながらさらに９０分インキュベートを続けた。ビーズを簡単に遠心分離し、１ｍｌの冷ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズを還元Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁し、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。プローブとして用いられる５μｇ／ｍｌの抗ｆｌａｇ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で、上述のごとくウエスタンブロットを、実施した。
【００７８】
ｈＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの種々の欠失のコード配列を、種々の制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により検証した。全ての構築物は、中程度のレベルでＦｃ融合タンパク質を発現したが、凝集は、ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃと比較して減少しなかった。免疫共沈降法の結果を図１に示し、表１にまとめる。図１において、レーン１は、配列番号１のアミノ酸Ａ１４〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン２は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｓ５０を示す；レーン３は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｑ５９を示す；レーン４は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｇ６７を示す；レーン５は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン６は、分子量標準を示す；レーン７は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン８およびレーン９は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｒ４３を示す；レーン１０は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｔ４１を示す；そしてレーン１１は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｃ３６を示す。Ｎ末端欠失ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ａ１４〜Ａ７２）：Ｆｃは、ＢＡＦＦ結合能を維持し、一方ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｃ２０〜Ａ７２）：Ｆｃは維持しない。これは、ｈＢＡＦＦ−Ｒ ＣＲＤについてＮ末端にすぐの５つのアミノ酸残基の全てまたは部分集合が、ｈＢＡＦＦ−Ｒ：ＦｃのＢＡＦＦ結合に必要であることを示している。ＢＡＦＦ結合は、Ｃ末端欠失ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ｃ３６）：ＦｃおよびｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ｔ４１）：Ｆｃで除去され、ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ｒ４３）：Ｆｃでは、大きく減少した。ｈＢＡＦＦ−Ｒストークドメインにおいて、Ｓ５０またはそれ以上を介してＢＡＦＦ−Ｒをコードする試験された全ての他のｈＢＡＦＦ−Ｒ構築物は、完全なストーク改変体である、ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃと同じように効果的に、ｈＢＡＦＦを免疫共沈降し得る。Ｒ４３での短縮は、部分結合活性であり、Ｓ５０での短縮は、全活性であるので、残基Ｐ４４−Ａ４９またはその部分集合は、適切なリガンド結合が起こるのに必要であることは明らかである。
【００７９】
【表１】
【００８０】
（実施例２）
本実施例では、短縮されたＢＡＦＦ−Ｒストークドメインを含有するｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃ改変体の設計、構築および配列決定を記載する。上記融合タンパク質ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃを、配列番号１の残基Ｓ５０、Ｓ５１、Ｔ５６およびＳ６３に位置する４つの潜在的Ｏ結合型グリコシル化部位を除去するために、作製した。
付着末端を有する２重鎖オリゴヌクレオチドカセットを用いて、ＢＡＦＦ−Ｒアミノ酸残基Ｃ３３〜Ａ７２をコードするヌクレオチドを、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃコード配列の同じ部位への連結により、アミノ酸残基Ｃ３３〜Ａ４９をコードするヌクレオチドで置換した。これらのオリゴヌクレオチドの配列（ｂａｆ−９１１およびｂａｆ−９１２）を、配列番号８および配列番号９に示す。このオリゴヌクレオチド置換は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの残基Ｓ５０〜Ａ７２の除去を生じる。
【００８１】
上記ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃコード配列を、哺乳動物細胞発現用ベクター（具体的には、２９３ＥＢＮＡ細胞またはＣＨＯ細胞）にサブクローニングした。発現プラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて，２９３ＥＢＮＡ細胞へトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞上清を、トランスフェクト後９６時間で採取した。上記融合タンパク質ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃを、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーおよびゲル濾過サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
【００８２】
（実施例３）
本実施例は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭによる液相結合分析による、完全長ｖＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃおよび短縮されたｖＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの両方の、ＢＡＦＦに対する見掛けの結合親和性の決定を例示する。
【００８３】
全ての測定を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ３０００で行なった。ＢＣＭＡ−Ｆｃを、ＣＭ５チップの１つの４分円に高密度に固定し、他の一つの四分円をバックグランドコントロールとして誘導体化せずに残した（ｕｎｄｅｒｉｖｉｔｉｚｅ）。
遊離ＢＡＦＦの量についての標準曲線を、種々の濃度のＢＡＦＦを含有する連続的な試料をチップ表面上を走らせることにより作成した。結合の初速度（Ｖｉ）を、ＢＡＦＦ濃度の関数としてプロットした。用いた条件下では、Ｖｉは、溶液中の遊離ＢＡＦＦ量と比例的である。
【００８４】
図２に示すように、溶液中のＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの各形態に対するＢＡＦＦの結合の平衡を、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃのいずれか一つの固定した量と、種々の濃度のＢＡＦＦとを予備混合し、これらの溶液を平衡に到達させることにより決定した。次いで、これらの溶液をＢＣＭＡ−Ｆｃチップ表面上で操作し、各溶液中の遊離ＢＡＦＦの量を標準曲線との比較により、Ｖｉから決定した。結合の親和性および化学量論を、上記データを適切な２次方程式にあてはめることにより決定した。
【００８５】
図３に示すように、溶液中のｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃに対するＢＡＦＦの結合の平衡およびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃに対するＢＡＦＦの結合の平衡を、固定した量のＢＡＦＦと、改変体ＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの種々の濃度の各形態を、予備混合し、これらの溶液を平衡に到達させることにより決定した。次いで、これらのｖＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ／ＢＡＦＦ混合物を、その後ＢＣＭＡ−Ｆｃチップ上で操作し、各溶液中の遊離ＢＡＦＦ量をＶｉから定量した。結合の親和性および化学量論を、上記データを適切な２次方程式にあてはめることにより決定した。
【００８６】
図２および図３で示すように、ＢＡＦＦに対する、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの結合親和性は、これらの方法で同一である。ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃは、溶液中でＢＡＦＦに対して、みかけＫＤ＜２００ｐＭおよび１：１（ＢＡＦＦ：ＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ）化学量論で、結合する。
【００８７】
（実施例４）
本実施例は、その表面（ＣＨＯ：ｈＢＡＦＦ）にヒトＢＡＦＦを安定に発現するＣＨＯ細胞株へのｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの結合能を例示する。
【００８８】
精製したｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの３倍の連続希釈液（９μｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌの範囲）を、ＣＨＯ：ｈＢＡＦＦ細胞（５×１０６細胞／ｍｌ）を含む氷上で１時間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ロバ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で氷上で３０分間染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を、ＦＡＣＳによりＰＥ蛍光について分析し、そのヒストグラムの平均蛍光をプロットした。
【００８９】
図４は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃのＣＨＯ：ｈＢＡＦＦ細胞への結合曲線を示す。上記二つの曲線は、互いに殆ど重なり、ＣＨＯ：ｈＢＡＦＦ細胞への１／２最大結合（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ）については同様な値を示す。
【００９０】
（実施例５）
本実施例は、その表面にｈＢＡＦＦ−Ｒを発現するヒトＢ細胞株であるＢＪＡＢ細胞へのｈＢＡＦＦの結合を、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃが阻害する能力を例示する。
【００９１】
ビオチン化ｍｙｃ−ｈＢＡＦＦを、ＦＡＣＳＴＭ緩衝液または精製したｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃもしくはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの３倍連続希釈液のいずれかと一緒に、同時に、ＢＪＡＢ細胞（５×１０６細胞／ｍｌ）に添加した。ビオチン化ｈＢＡＦＦの最終濃度は、２００ｎｇ／ｍｌであり、ｖＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ分子の濃度は９μｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌの範囲であった。上記細胞を、これらの溶液と氷上で１時間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳＴＭ緩衝液で洗浄し、３０分間氷上でＳＡＶ−ＰＥで染色し、再び洗浄して、１％パラホルムアルデヒドで固定した。上記細胞を、ＰＥ蛍光についてＦＡＣＳＴＭにより分析し、そのヒストグラムの平均蛍光をプロットした。
【００９２】
図５は、種々の濃度のｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃが、ＢＪＡＢ細胞に対するビオチン化ｈＢＡＦＦの結合を阻害する能力についての曲線を示す。上記二つの曲線は、互いに殆ど正確に重なっている。ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃについてのＢＪＡＢへのｈＢＡＦＦ結合の１／２最大阻害は類似している。
【００９３】
（実施例６）
本実施例は、ヒトｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃのグリコシル化パターンを実証する。マウスＢＡＦＦ−Ｒ分子中のＮ結合型グリコシル化部位およびヒトＢＡＦＦ−Ｒ分子中のＯ結合型グリコシル化部位を、図６Ａおよび図６Ｂに示す。
【００９４】
ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃを発現し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭとのインキュベート、酸溶出およびゲル濾過クロマトグラフィーによりＣＨＯ細胞から精製した。Ｎ結合型グリカンを除去するためにＰＮＧａｓｅＦで処理した後、上記タンパク質をＤＴＴで還元し、分子質量をＺＭＤ質量分析器を用いて決定した。上記分子質量は、ＭａｓＥｎｔ １プログラムで逆重畳積分により生成した。
【００９５】
図７の質量スペクトル中の検出可能なピークは、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃタンパク質の多くのＯ結合型形態があることを示す。各検出可能なピークに関しては、上記分子に存在する６つの潜在的Ｏ結合型グリコシル化の中に多くの異なる潜在的グリコシル化パターンがある。これらの部位のいくつかの％占有率を表２に示す。図８Ａ〜８Ｈは、異なるＣＨＯ細胞株（図８Ａ〜Ｆ）および２９３細胞株（図８Ｇ）で発現されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃタンパク質についての質量スペクトルを示す。図８Ｈは、ｍＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＦｃについての質量スペクトルを示す。
【００９６】
表２は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃタンパク質の特定の潜在的グリコシル化部位のグリコシル化を分析する一連の実験の概要を示す。Ｔ４１、Ｓ５０、Ｓ５１、Ｔ５６およびＳ６３の近接は、どの部位が占有されているか決定することを妨げる。しかしながら、これらの５つの部位を有するタンパク分解フラグメントは、８０％のグリコシル化されるチャンスを有し、一方、ただＴ１８部位のみを含有するフラグメントは２０〜４０％しかグリコシル化されるチャンスはない。グリコシル化パターンが、予測不可能性、および任意の所与の糖タンパク質の由来を決定する不可能性が、上記タンパク質の大スケールでの生産に問題を生じる。
【００９７】
【表２】
ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３−Ａ４９）の質量スペクトルを、図９に示し、そして表３に要約する。
【００９８】
【表３】
ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３−Ａ４９）：Ｆｃポリペプチドの上記グリコシル化パターンは、完全長ＥＣＤ ＢＡＦＦ−Ｒ、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３−Ａ７２）：Ｆｃよりずっと単純である。このより短いポリペプチドは、二つのみ潜在的Ｏ結合型グリコシル化部位（Ｔ１８およびＴ４１）を含有する。このスペクトルには、７つのピークしかなく、そのそれぞれは、わずかの可能なグリコシル化部位を表している。例えば、上記３０５７２ピークは、Ｔ１８またはＴ４１のいずれかに結合している単核２糖（ＨｅｘＮＡｃ）（Ｈｅｘ）を有するΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃタンパク質を表している。最も多くグリコシル化されている種は、上記３１８１０であり、そこでは、２核２糖のそれぞれが、二つのシアル酸（ＮｅｕＡｃ）由来である。上記ＢＡＦＦ−Ｒの完全長細胞外ドメインと比較する場合、この変化したグリコシル化パターンは、ＢＡＦＦ−Ｒを含む薬学的組成物のバッチ間のバラツキを容易に特徴づけることを可能にしている。表４は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃ（Ｔｈｒ−１８およびＴｈｒ−４１）の二つの潜在的グリコシル化部位のグリコシル化部位占有率およびＯ結合糖のプロフィールの分析の要約を表す。
【００９９】
【表４】
（実施例７）
本実施例は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）およびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃが、マウス脾臓Ｂ細胞におけるｈＢＡＦＦのＢ細胞生存活性を阻害する能力を例示している。ＢＡＦＦ誘導細胞増殖アッセイを、マウス脾臓Ｂ細胞を用いて実施した。マウスＢ細胞を、Ｂ細胞回収カラム（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ）を用いて２匹の１ヶ月齢Ｃ５７／ｂｌａｃｋ６マウスの脾臓から単離した。Ｂ細胞を、平底９６穴プレート（１０５細胞／穴 １００μｌ １０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ中）に、５μｇ／ｍｌヤギ抗マウスμ鎖抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）、７５ｎｇ／ｍｌ ｍｙｃ−ｈＢＡＦＦ、およびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの連続希釈液、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの連続希釈液もしくはヒトＩｇＧの連続希釈液の存在下で、７２時間インキュベートした。細胞を、［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／穴）でさらに１８時間パルスし、そして採取した。［３Ｈ］−チミジン取込みを、液体シンチレーション計数により、モニタリングした。図１０は、インビトロでｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）が、ｈＩｇＧとインキュベートした細胞と比較する場合、減少した［３Ｈ］−チミジン取込みにより示されるように、ＢＡＦＦ媒介のＢ細胞増殖を、同じようによく阻害することを示している。
【０１００】
（実施例８）
本実施例は、インビボでｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃでのＢＡＦＦ遮断が、Ｂ細胞生存を障害し、末梢Ｂ細胞の数を減少させ、Ｂ細胞表面マーカーであるＣＤ２１およびＣＤ２３の発現レベルの低下の原因となることを示している。
全部で３７匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表５に示すように、８つの処置群に割当てた。全ての動物に、２００μｌのｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃまたはｈＩｇＧを腹腔内に（１０ｍｌ／ｋｇ容量用量）投与した。投与後９６時間で、マウスを安楽死させ、Ｂ細胞定量化のために脾臓を摘出した。
【０１０１】
【表５】
脾細胞を機械的破砕で調製した。組織片を、１００μｍの細胞ろ過器を通して除去した。赤血球を５ｍｌのＡＣＫ溶液（１５５ｍＭ 塩化アンモニウム、１０ｍＭ重炭酸カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）中で溶解させ、１０ｍｌＰＢＳで３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＦＢＳ、０．０１アジ化ナトリウム）に懸濁した。組織片を、１００μｍの細胞ろ過器を通して除去し、生存細胞をトリパンブルー排除により計数した。
【０１０２】
ＦＡＣＳ染色：１００μｌ容量の試料あたり、２００万個の細胞を染色した。上記ｍＡｂｓのＦｃドメインと脾細胞のＦｃｇＲ（Ｆｃγレセプター）とが、相互作用をするのを防ぎ、それによりバックグランド染色を最小化するために、細胞を、Ｂｌｏｃｋ緩衝液（１０μｇ／ｍｌ ＦｃＢｌｏｃｋ、５％ラット血清を含有するＦＡＣＳＴＭ緩衝液）と氷上でインキュベートした。特定のｍＡｂｓカクテルを、添加しそして氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳＴＭ緩衝液で洗浄し、その後ストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰ（ストレプトアビジン−ペリジニン クロロフィルＩＩ−ａタンパク質、ビオチン化ＣＤ２３プローブを検出するのに用いられる蛍光タグ化したストレプトアビジン）を含有するＦＡＣＳＴＭ緩衝液に懸濁し、３０分間氷上でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒＴＭフローサイトメーターでの分析のために１５０μｌのＰＢＳ中０．５％のパラフォルムアルデヒドに懸濁した。１００，０００事象を集め、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭソフトウエアを用いて分析をした。統計的解析は、スチューデントｔ検定を用いて実施した。
【０１０３】
脾臓Ｂ細胞の数を、全脾細胞数およびＣＤ１９＋細胞％を基礎にして計算した。図１１でわかるように、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃ処置マウスは、コントロールと比較した場合、脾臓Ｂ細胞の著しい損失を示した。Ｂ細胞損失は、０．２５ｍｇ／ｋｇの低い用量で観察され、％損失は、より高用量のｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃで増加した。
【０１０４】
ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃによる、脾臓成熟（ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）ならびに辺縁領域（ＭＺ）（ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）Ｂ細胞ＣＤ２１およびＣＤ２３発現について、ＢＡＦＦの阻害の波及効果を試験した。ＣＤ２１平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ｈＩｇＧ処置コントロールと比較した場合、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃを受けた０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ用量の群で試験された全てのＢ細胞サブセットにおいて有意に、減少した（表６）。
【０１０５】
【表６】
ＣＤ２３発現は、５ｍｇ／ｋｇ用量のｈＩｇＧ処置コントロールと比較した場合、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜４９）：Ｆｃ処置マウスからの成熟Ｂ細胞およびＭＺ Ｂ細胞において、有意に減少していた（表７）。
【０１０６】
【表７】
（実施例９）
本実施例において、二つのＥＬＩＳＡ型式における、ｆｌａｇ−ｈｕＢＡＦＦとｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃとの結合を例示する。ＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ９．６の５０ｍＭ 重炭酸ナトリウム中で、５０μｌ／穴、５μｇ／ｍｌの捕獲抗体で、４℃一晩で、被覆した。捕獲抗体は、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはＭ２抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）であった。プレートを室温（ＲＴ）３０分間、３％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロックし、２５０μｌのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭで３回洗浄した。その後のインキュベーションを、全て室温で３％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈された試薬で行なった。
【０１０７】
抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ被覆プレート上で５０μｌｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃを２μｇ／ｍｌで、２時間で捕獲し、上記の如く洗浄した（図１２Ａ）。１０μｇ／ｍｌの５０μｌのＦＬＡＧ−ｈｕＢＡＦＦから始まる連続１０倍希釈液を加え、３０分間インキュベートして、洗浄した。１００μｌの１μｇ／ｍｌのＭ２抗ＦＬＡＧを３０分間加えて洗浄した。抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１：３０００希釈、１００μｌ、３０分間。
【０１０８】
上記抗ＦＬＡＧコートプレート上で、５０μｌの１０μｇ／ｍｌのＦＬＡＧ−ｈｕＢＡＦＦを添加し、２時間インキュベートし、そして上記のように洗浄した（図１２Ｂ）。１０μｇ／ｍｌの５０μｌのｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃから始まる連続１０倍希釈液を加え、３０分間インキュベートして、上記のように洗浄した。１：３０００希釈の抗ヒトＦｃγアルカリホスファターゼ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（１：３０００希釈）、１００μｌ、３０分間。
【０１０９】
洗浄後、両方のセットのプレートの検出を、十分な発色が観察されるまで、１０％ジエタノ−ルアミン、ｐＨ９．０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＺｎＣｌ２中、１００μｌの２ｍｇ／ｍｌｐＮｐｐ（Ｐｉｅｒｃｅ）と室温で、インキュベートして行なった。ＯＤ４０５を読み取った。
【０１１０】
図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、両方のＥＬＩＳＡ型式のもとで、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃに対するリガンド結合のＩＣ５０は、リガンドまたはレセプターＦｃ融合物が溶液中に存在するか否かに拘わらず、ＦＬＡＧ−ｈｕＢＡＦＦに対して同じ高機能親和性を示している。
【０１１１】
本明細書は、本明細書で引用されている参考文献の教示に鑑みて、ほぼ完全に理解され、それらの参考文献は、本明細書により参考として援用されている。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するが、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明により包含されることを、容易に認識する。引用された全ての刊行物および特許ならびに本開示中のアクセッション番号もしくはデータベース参照番号により同定された配列は、全体が参考として援用される。本明細書に対立するまたは一致しない参考文献に援用されている物質の範囲まで、本明細書はいかなるそのような物質にもとってかわる。本明細書のいずれの参考文献の引用も、そのような参考文献が、本発明に対する先行技術であるという承認を得るものでもない。
【０１１２】
他に示さなければ、請求項を含め、本明細書で用いられている成分、細胞培養物、処置条件、の量を表現している全ての数は、用語「約」により、全ての例で修飾されるものと理解される。従って、他に反対と示されない限り、数値パラメータは近似値であり、本発明により得ようとしている望ましい性質により依存して変化する。他に示さなければ、一連の要素の前に立つ用語「少なくとも」は、一連のいずれの要素をもいうと理解される。当業者は、本明細書で記述されている本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、単なる慣用的実験を用いて認識するか、またはこれらを確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、本明細書で全体的に参考として援用されている、２００３年３月２８日に出願された米国出願番号第６０／４５８，７０７号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、ＴＮＦファミリーのリガンドおよびレセプターならびにそれらのアンタゴニストおよびアゴニストならびに免疫応答の調節におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
本発明は、ＴＮＦファミリーレセプタータンパク質のメンバーである、ＢＡＦＦレセプター（「ＢＡＦＦ−Ｒ」、ＢＲ３およびＺｔｎｆｅ１２としても公知）に関する。ＢＡＦＦ−Ｒは、国際特許出願公開公報ＷＯ０２／２４９０９に記載されている。
【０００４】
ＢＡＦＦ−Ｒは、特異的に上記ＴＮＦファミリーリガンドＢＡＦＦ（ＴＡＬＬ−１、ＴＨＡＮＫ、ＢＬｙＳ、ニューロカインα、ＴＮＳ１３ＢおよびｚＴＮＦ４としても公知である）と結合し、国際特許出願公開公報ＷＯ００／４３０３２に記載されている。ＢＡＦＦは、インビトロでＢ細胞の生存率を高め（Ｂａｔｔｅｎら、（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（１０）：１４５３〜１４６６）、そしてインビボでは末梢Ｂ細胞集団の重要なレギュレータとして出現した。このリガンドの異常に高いレベルは、自己反応性のＢ細胞の生存率を高めることにより、自己免疫疾患の病因になり得ると考えられる（Ｂａｔｔｅｎら、（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（１０）：１４５３〜１４６６）。ＢＡＦＦ活性のアゴニストおよびアンタゴニストは、ＷＯ００／４３０３２に記載されている。
【０００５】
最近、ＢＡＦＦ特異的薬剤が、ＢＡＦＦ抗体も含め、自己免疫疾患や他の障害の処置のために開発されてきている（例えば、米国特許出願番号第０９／９１１，７７７号；同第１０／３８０，７０３号；同第１０／０４５，５７４号；および同第６０／５１２，８８０号を参照のこと）；Ｋａｌｌｅｄら、（２００３）Ｅｘｐｅｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｇｅｔｓ、７（１）：１１５〜２３）。
【０００６】
ＢＡＦＦ−Ｒの発見に先立って、ＴＮＦレセプターファミリーの多くのメンバーは、発現配列タグ（ＥＳＴ）分析およびゲノム配列分析により発見されてきた。しかしながら、いくつかのファミリーメンバーは、ＢＡＦＦ−Ｒのように、それらの同定に発現クローニングが必要であった。
【０００７】
ＴＮＦレセプターファミリーのメンバーであるＢＡＦＦ−Ｒは、多くのファミリーメンバーとはかなり異なっている。特に、ＢＡＦＦ−Ｒは、４個のシステインを有するシステインリッチのドメインをただ一つしか含有せず、一方殆どのＴＮＦレセプターファミリーのメンバーは、典型的に、それぞれ６個のシステインを有する２〜４個のドメインを含有する。正統なレセプターシステインリッチドメインのこの不存在が、配列ベースの探索によるＢＡＦＦ−Ｒの同定を妨げた。ＢＡＦＦ−ＲがいかにしてＢＡＦＦに高親和性の結合を達成するか、そして正確にどのような配列が含まれているかについてもまた、正確には明確でなかった。
【０００８】
ＢＡＦＦ−Ｒは、正統なＴＮＦレセプターファミリーのメンバーとは明らかに異なるだけでなく、ヒトＢＡＦＦ−Ｒ（ｈＢＡＦＦ−Ｒ）は、マウスＢＡＦＦ−Ｒ（ｍＢＡＦＦ−Ｒ）と６０％しか相同性がない。この差は、上記細胞外ドメインが真核細胞で発現する場合のｈＢＡＦＦ−Ｒの凝集（９０％凝集）とｍＢＡＦＦ−Ｒの凝集（１０％凝集）の差を反映している。しかしながら、ｈＢＡＦＦ−Ｒの二つの点変異（配列番号１のＶ２１ＮおよびＬ２８Ｐ）が、凝集を１０％未満に減少させる。ｈＢＡＦＦ−Ｒのこの変異形態は、ｖＢＡＦＦ−Ｒと呼ばれる。
【０００９】
ＴＮＦファミリーのメンバーが、Ｎ結合型グリコシル化部位およびＯ結合型グリコシル化部位の両方を有することは公知である。Ｎ結合型グリコシル化は、異なる共通配列内のアスパラギン残基で起こる。Ｏ結合型グリコシル化は、セリン残基およびスレオニン残基で起こるが、タンパク質の集団内での配列モチーフの欠如および糖の不整合付加がタンパク質へＯ結合型グリカンの上記存在の予測を妨げる。さらに、Ｏ結合型グリコシル化部位はしばしば短いセリン／スレオニンリッチの配列に集約され、グリカンの正確な数および位置の決定を困難にしている。グリコシル化パターンが、特定のタンパク質に決定できる場合でも、Ｏ結合型グリコシル化は、組織依存性で、上記パターンは上記タンパク質が発現される細胞型によって変化する。
【００１０】
１バッチのタンパク質生産物の任意の与えられた特徴を分析する能力は、薬学的用途のためのポリペプチドを生産するのに重要であり得る。Ｏ結合型グリコシル化の予測不可能性および不整合は、製造を困難にする。例えば、多くのＯ結合型グリカンは質量分析によりタンパク質製剤のバッチを特徴付けるのを不可能にしている。
【００１１】
この問題の可能な解決方法は、グリコシル化装置を持っていない原核細胞におけるタンパク質の産生および化学合成によるタンパク質の生産を含む。しかしながら、グリコシル化タンパク質は、非グリコシル化タンパク質より利点を持ち得る。例えば、Ｏ結合型グリコシル化は、フォールディングおよび３次構造の維持を助け、安定性やタンパク質分解酵素に対する抵抗性を増加させ、そして他のタンパク質との相互作用を調節する。Ｏ結合型グリコシル化はまた、タンパク質の生物学的活性にも影響し得る。ＴＮＦαを含む、多くの細胞シグナル伝達分子の活性は、細胞表面のレセプターのグリコシル化により調節される（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎら、（１９９８）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３（３）：１５１〜２０８）。さらに、製剤用途のための化学合成によるタンパク質の生産は、法外に費用がかかり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、明確に特徴付けられ得、そしてＢＡＦＦに対する特異性および親和性を維持しながら真核細胞における凝集を避けるグリコシル化パターンを有する治療用途のためのＢＡＦＦ−Ｒを提供する需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、部分的に、ヒトＢＡＦＦ−Ｒおよびその改変体のグリコシル化パターンの発見および特徴付けを基礎としている。本発明は、部分的に、ＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）が、変化したグリコシル化パターンにもかかわらず、リガンド結合の実質的な損失なしで短縮され得るという上記発見および実証を、さらに基礎にしている。本開示は、変化したＯ結合型グリコシル化パターンを生じる上記ＥＣＤにおける欠失を有する、天然に存在しないＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を提供する。ＢＡＦＦ−Ｒのそのような短縮された形態は、以降「ΔＢＡＦＦ−Ｒ」または「ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチド」という。ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドをコードする対応する核酸は、「ΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸」という。
【００１４】
本開示は、少なくとも以下：変化したグリコシル化パターン、１０−９Ｍ以下の見かけの解離定数でのＢＡＦＦとの結合能力および／または減少した凝集傾向の内の一つ以上を有する、遺伝子組換えで発現した可溶型のΔＢＡＦＦ−Ｒを提供する。他の利点の中で、ＢＡＦＦ−Ｒのこれらの短縮された形態は、大スケールでの生産の間、上記タンパク質のより効率的な分析を可能とするグリコシル化パターンを有する。
【００１５】
一つの局面では、本開示は、二つのＯ結合型グリコシル化部位を有するＢＡＦＦ−Ｒの短縮された形態を提供する。特定の実施形態では、上記短縮されたＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ１８でグリコシル化されている。他の実施形態では、上記短縮されたＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ４１でグリコシル化されている。さらに他の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ１８およびＴ４１の両方でグリコシル化されている。そのようなグリコシル化パターンは、ＢＡＦＦ−Ｒの上記完全長ＥＣＤよりも、大スケール生産の間、より効率的に分析され得る。
【００１６】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、ヒト（ｈＢＡＦＦ−Ｒ）である。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、遺伝子組換え発現の間にｈＢＡＦＦ−Ｒの上記凝集傾向を減少させる点変異、例えば配列番号のＶ２１ＮおよびＬ２８Ｐ、を含有する。上記変異ｈＢＡＦＦ−Ｒは「ｖＢＡＦＦ−Ｒ」と呼ばれる。
【００１７】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３を含む。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１の４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、より長いアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９を含む。
【００１８】
さらなる実施形態では、第１アミノ酸配列は、配列番号１のＳ５０、Ｓ５１、Ｔ５６またはＳ６３に変異を含む完全長ＢＡＦＦ−Ｒを含み得、これらの部位にＢＡＦＦ−Ｒ分子が、グリコシル化される上記能力を除いている。いくつかの実施形態では、配列番号１のＳ５０、Ｓ５１、およびＴ５６は、グリコシル化部位を除くように変異されている。他の実施形態では、Ｓ５０、Ｓ５１、Ｔ５６またはＳ６３は、グリコシル化部位を除くように変異されている。
【００１９】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、（ａ）ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドをコードする第１アミノ酸配列ならびに（ｂ）免疫グロブリンの定常領域由来の第２アミノ酸配列および、必要に応じて、これらの配列間のリンカーを含む、ＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドの一部分である。
【００２０】
上記融合ポリペプチドの特定の実施形態では、第１アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３またはアミノ酸１４〜アミノ酸４３と実質的に同一である。他の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１の４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、より長いアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、配列番号１のアミノ酸８〜アミノ酸４９、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９、または配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９を含む。全ての実施形態で、上記第１アミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない。いくつかの実施形態では、上記第１アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸６３を含まない。
【００２１】
上記第２アミノ酸配列は、Ｆｃ部のような免疫グロブリンの定常領域由来であり得る。特定の実施形態では、上記第２アミノ酸配列は、ＩｇＧのＦｃ部由来である。関連する実施形態では、上記Ｆｃ部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４または他のＩｇＧアイソタイプ由来である。特定の実施形態では、第２アミノ酸配列は、配列番号４（ヒトＩｇＧ１）のアミノ酸３〜アミノ酸２２７である。
【００２２】
特定の実施形態では、第２アミノ酸配列は、上記第１アミノ酸配列の上記Ｃ末端または上記Ｎ末端とリンカーにより結合される。上記リンカーの正確な長さおよび配列ならびに上記結合された配列に関係するその配向は、変化し得る。上記リンカーは、タンパク様であり得、または非タンパク様であり得る。タンパク様リンカーの場合、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない。
【００２３】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ融合ポリペプチド（ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ）は、少なくとも配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７に直接融合した配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、アミノ酸８〜アミノ酸４９、アミノ酸１４〜アミノ酸４９、アミノ酸１３〜アミノ酸４３またはアミノ酸１４〜アミノ酸４３を含む。さらなる実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃは、少なくとも配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７に間接的に（すなわちリンカーを介して）結合した（すなわちリンカーを介して）配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、アミノ酸８〜アミノ酸４９、アミノ酸１４〜アミノ酸４９、アミノ酸１３〜アミノ酸４３またはアミノ酸１４〜アミノ酸４３を含む。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃは、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８もしくは１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８もしくは４９である、より長いアミノ酸配列を包含し、これは配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と直接融合しているか、もしくはリンカーを介して結合している。
【００２４】
本開示は、ΔＢＡＦＦ−ＲポリペプチドをコードするΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸を提供する。いくつかの実施形態では、上記核酸は、少なくとも配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３または少なくとも配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３をコードする配列を含む。上記核酸は、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、ΔＢＡＦＦ−Ｒのより長いフラグメントをコードし得る。他の実施形態では、上記核酸は、配列番号２のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６または配列番号３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明は、免疫グロブリンの定常領域と直接またはリンカーを介して結合しているΔＢＡＦＦ−ＲをコードするＤＮＡ構築物を提供する。特定の実施形態では、上記ＤＮＡ構築物は、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と結合している、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９を有し、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９を有するΔＢＡＦＦ−Ｒをコードする。他の特定の実施形態では、上記ＤＮＡ構築物は、配列番号５のヌクレオチド７〜ヌクレオチド６８１と結合している、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６を含む。
【００２６】
本開示はまた、Ｂ−細胞およびＴ細胞が媒介する状態を処置する方法および薬学的組成物を提供する。本方法は、そのような処置が望まれる被験体に、上記被験体のＢＡＦＦ関連状態を処置、予防もしくは遅延させるのに十分な量のΔＢＡＦＦ−Ｒをコードする核酸またはΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを投与する工程を含む。本発明の上記組成物および方法を用いて処置され得る障害は、制限されないが、本明細書で参考として援用しているＷＯ０２／２４９０９に記載されている。これらの障害としては、制限されないが、免疫学的障害、自己免疫疾患、癌、腎臓病、ウイルス関連病、高血圧症、免疫抑制の必要な状態、炎症性疾患および非悪性増殖性障害が挙げられる。
本開示はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
変化したＯ結合型グリコシル化パターンを生じる細胞外ドメインの欠失を有するが、ＢＡＦＦへの結合能力は保持している、天然に存在しないＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目２）
少なくとも一つのＯ結合型グリカンを有する、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目３）
前記Ｏ結合型グリカンが、配列番号１の１８位のスレオニンまたは４１位のスレオニンに相当するアミノ酸に結合している、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目４）
前記Ｏ結合型グリカンが、配列番号１の１８位のスレオニン、４１位のスレオニンまたは８位のセリンに相当するアミノ酸に結合している、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目５）
ＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質がヒトである、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目６）
前記欠失が、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６である、項目５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目７）
前記欠失が、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸６３である、項目５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目８）
前記欠失が、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸７２である、項目５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目９）
配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１０）
配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１１）
少なくとも２つのアミノ酸置換を有し、該置換アミノ酸が、配列番号１の２１位のアミノ酸および２８位のアミノ酸に対応する、項目５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１２）
以下のアミノ酸配列：
（ａ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸８〜アミノ酸４９；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９；
（ｆ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９；または、
（ｇ）配列番号７のアミノ酸１〜アミノ酸４９
を有するポリペプチドを含む、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１３）
配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９から、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９までのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目１２に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１４）
配列番号１の２１位のアミノ酸がバリンであり、配列番号１の２８位のアミノ酸がロイシンである、項目１２に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１５）
配列番号１の２１位のアミノ酸が、アスパラギンであり、配列番号１の２８位のアミノ酸がプロリンである、項目１２に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１６）
免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分および、必要に応じて、前記ペプチドと免疫グロブリンの定常領域の前記部分とを結合するリンカーをさらに包含し、ここで該リンカーは、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含有しない、項目１２に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目１７）
免疫グロブリンの前記部分が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、項目１６に記載の糖タンパク質。
（項目１８）
前記免疫グロブリンの定常領域の前記部分が、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７を含む、項目１７に記載の糖タンパク質。
（項目１９）
項目１に記載の前記ＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質をコードする核酸。
（項目２０）
少なくとも以下の配列：
（ａ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸８〜アミノ酸４９；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９；
（ｆ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９；または、
（ｇ）配列番号７のアミノ酸１〜アミノ酸４９
をコードすることを含む、項目１９に記載の核酸。
（項目２１）
配列番号２または３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６を含む、項目１９に記載の核酸。
（項目２２）
項目１９〜２０のいずれか一項に記載した核酸を含むベクター。
（項目２３）
項目１９〜２１のいずれかに記載の核酸を含む、宿主細胞。
（項目２４）
ＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を産生する方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）項目２２に記載の前記ベクターで、宿主細胞を形質転換する工程；
（ｂ）前記タンパク質の産生を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する工程；および（ｃ）前記宿主細胞からＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を単離する工程を含む、方法。
（項目２５）
ＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドであって、以下：（ａ）第１ポリペプチドであって、該第１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３または配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３から実質的に始まるアミノ酸配列であって、該アミノ酸配列が（ｂ）第２アミノ酸配列と融合し、該第２アミノ酸配列が、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む、アミノ酸配列、および必要に応じて（ｃ）前記第１配列と第２配列を結合するリンカーを含有し、ここで該ＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない、ポリペプチド。
（項目２６）
前記リンカーが、タンパク様である、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目２７）
前記リンカーが、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目２８）
前記第１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸８〜アミノ酸４９のアミノ酸配列を含む、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目２９）
項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目３０）
項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目３１）
項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドであって、少なくとも二つのアミノ酸置換を有し、該置換アミノ酸は、配列番号１の２１位のアミノ酸および２８位のアミノ酸に対応する、ポリペプチド。
（項目３２）
前記第１ポリペプチドが、以下のアミノ酸配列：
（ａ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９；または、
（ｆ）配列番号７のアミノ酸１〜アミノ酸４９
を包含し、そして前記第２ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７を含む、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目３３）
前記第１ポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と融合する、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８もしくは１９から、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９までを含む、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目３４）
項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドをコードする核酸。
（項目３５）
以下：
（ａ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９；
（ｅ）配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９；または、
（ｆ）配列番号７のアミノ酸１〜アミノ酸４９
と融合する、配列番号４のアミノ酸１〜アミノ酸２２７をコードするヌクレオチドを含む、項目３４に記載の核酸。
（項目３６）
（ａ）配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６および（ｂ）配列番号５のヌクレオチド７〜ヌクレオチド６８１を含む、項目３４に記載の核酸。
（項目３７）
項目３３〜３５に記載のいずれか一項の核酸を含む、ベクター。
（項目３８）
項目３３〜３５に記載のいずれか一項の核酸を含む、宿主細胞。
（項目３９）
項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を含む、薬学的組成物。
（項目４０）
項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドを含む、薬学的組成物。
（項目４１）
項目１９に記載の核酸を含む、薬学的組成物。
（項目４２）
処置の必要な患者に項目３９〜４１のいずれか一項に記載されている治療有効量の前記薬学的組成物を投与する工程を包含し、それにより免疫学的障害を処置する、免疫学的障害を処置するための方法。
（項目４３）
処置の必要な患者に項目３９〜４１のいずれか一項に記載されている治療有効量の前記薬学的組成物を投与する工程を含み、それにより免疫学的障害を処置する、免疫学的障害を処置するための方法。
（項目４４）
ナノモル濃度範囲でＢＡＦＦに対する見掛けの親和性を有する、項目１に記載のＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質。
（項目４５）
少なくとも１０９Ｍ−１でＢＡＦＦに対する見掛けの親和性を有する、項目２５に記載のＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチド。
（項目４６）
配列番号１のアミノ酸５０、アミノ酸５１およびアミノ酸５６に変異を有する、配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸５６を含む、ＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドであって、ここでアミノ酸５０が、セリンでもスレオニンでもなく、そしてアミノ酸５６が、セリンでもなくスレオニンでもないポリペプチド。
（項目４７）
配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸６３をさらに包含し、配列番号１のアミノ酸６３に変異を有し、ここでアミノ酸６３は、セリンでもスレオニンでもない、項目４６に記載のＢＡＦＦ−Ｒポリペプチド。
【００２７】
本発明のさらなる目的および利点は、以下の記述に部分的に示され、そしてその記述から明らかになり、または本発明の実施により分かり得る。本発明の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素および組み合わせにより認識され、そして達成される。
上記一般的な記述および以下の詳細な説明は、ただ請求されるように、例示的で説明的であるが、本発明を制限するものではないことが理解される。
添付の図面は、本明細書で援用され、本明細書の一部分を構成し、本発明のいくつかの実施形態を記載ととも説明し、本発明の趣旨を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、種々のΔＢＡＦＦ−Ｒ：ＦｃとＢＡＦＦとの免疫共沈殿の結果を示す。レーン１は、配列番号１のアミノ酸Ａ１４〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン２は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｓ５０を示す；レーン３は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｑ５９を示す；レーン４は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｇ６７を示す；レーン５は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン６は、分子量標準を示す；レーン７は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン８およびレーン９は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｒ４３を示す；レーン１０は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｔ４１を示す；およびレーン１１は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｃ３６を示す。
【図２】図２は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびＢＡＦＦのｋＤＡＰＰの決定のための結合アッセイの結果を示す。白抜きおよび黒塗りの印は、２連の実験の結果を示す。
【図３】図３は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびＢＡＦＦの推定ｋＤＡＰＰの分析を示す。白抜きおよび黒塗りの印は、二連の実験の結果を示す。
【図４】図４は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃのＣＨＯ細胞表面に発現するヒトＢＡＦＦ（ｈＢＡＦＦ）への結合を示す。
【図５】図５は、種々の濃度のｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃのビオチン化ｈＢＡＦＦのＢＪＡＢ細胞への結合をブロックする結合アッセイの結果を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、マウスＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ（配列番号６）のＮ結合型グリコシル化部位およびヒトｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）（配列番号１）のＯ結合型グリコシル化部位の位置を示す。
【図７】図７は、ＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｆ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｇ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図８Ｈ】図８Ａ〜８Ｂは、種々のＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの質量スペクトルを示す。図８Ｇ〜８Ｈは、２９３ＥＢＮＡ細胞により産生されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図９】図９は、ＣＨＯクローンから単離されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの質量スペクトルを示し、これは各ピークと関連するＯ結合型グリコシル化形態の分子量を示す。
【図１０】図１０は、増殖培地中のｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃ濃度の増加の脾臓Ｂ細胞の［３Ｈ］チミジン取り込み能に対する効果を示す。三角は、ヒトＩｇＧをインヒビターとして処置された培養物を示し、四角は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃ処置を示し、そしてダイアモンドは、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃ処置を示す。
【図１１】図１１は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃのＣＤ１９＋脾臓Ｂ細胞の数に対する効果を示す。
【図１２】図１２Ａは、ｈＢＡＦＦが固定され、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃのＢＡＦＦへの結合の結合親和性をＯＤ４０５で測定されたＥＬＩＳＡ捕獲実験の結果を示す。図１２Ｂは、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃが固定され、ＦＬＡＧ−ｈＢＡＦＦの結合がＯＤ４０５で測定された同様なＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（実施形態の説明）
本発明が、より容易に理解されるために、特定の用語について本明細書に定義されている。さらなる定義が詳細な説明の至る所で示されている。
【００３０】
用語「変化したグリコシル化パターン」は、完全長の細胞外ドメインを有するＢＡＦＦ−Ｒと比較して、Ｃ末端において短縮された細胞外ドメインを有する、天然に存在しないＢＡＦＦ−Ｒにおけるグリコシル化パターンをいい、それは野生型配列と異なってもよいし、異ならなくてもよい。ヒトＢＡＦＦ−Ｒにとって、細胞外ドメインのＣ末端の短縮は、少なくとも一つのＯ結合型グリコシル化部位の除去を生じる。
【００３１】
用語「ＢＡＦＦ」は、ＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子をいい、単球、マクロファージ、末梢血リンパ球および樹状細胞による発現、ならびにＢ細胞生存因子としての役割で特徴付けられる。ＢＡＦＦの特徴の要約は、Ｍａｃｋａｙら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：４６５〜４７５により提供される。
【００３２】
本明細書で使用されるように、用語「ＢＡＦＦ−Ｒ」は、ほかで記述されない限り、変異型または野生型ヒトＢＡＦＦレセプターおよびそれらの改変体をいい、配列番号７で示されるアミノ酸５０で付加的アラニンを含有するスプライス改変体、ＢＡＦＦと結合するＴＮＦファミリーレセプタータンパク質を含み、ＷＯ０２／２４９０９で定義されるように、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩにより認識される他のリガンドは含まない。用語「ΔＢＡＦＦ−Ｒ」は、Ｎ末端またはＣ末端のアミノ酸を欠損しているが、ＢＡＦＦとの結合能力は維持しているＢＡＦＦ−Ｒのいかなる形態をもいう。用語「ｈＢＡＦＦ−Ｒ」は、ヒトＢＡＦＦ−Ｒタンパク質またはその天然に存在する改変体をいう。用語「ｖＢＡＦＦ−Ｒ」は、少なくとも配列番号１のアミノ酸２１およびアミノ酸２８、例えばＶ２１ＮおよびＬ２８Ｐに変異を有するヒトＢＡＦＦ−Ｒの変異形態をいう。
【００３３】
用語「ＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ」は、ＢＡＦＦ−Ｒおよび免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）配列を有する融合タンパク質をいう。用語「ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ」は、（１）少なくとも配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３のアミノ酸またはその改変体を含むが、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まないアミノ酸、ならびに（２）免疫グロブリンの定常領域、例えば、Ｆｃ由来のアミノ酸配列を含む任意の融合タンパク質をいう。同様に、用語「ｍＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ」は、マウスＢＡＦＦ−ＲおよびＦｃ配列を含む融合タンパク質をいう。
【００３４】
用語「対応する」およびその類縁は、アミノ酸残基またはその位置を参照して用いられる場合、第１配列および第２配列が最適に整列している場合、第２アミノ酸配列のアミノ酸に関する第１アミノ酸配列のアミノ酸の位置をいう。配列は、両方の配列における最大の可能な数のアミノ酸が一致する場合、最適に整列していると見なされる。
用語「生物学的活性」は、生物系において分子により、インビボまたはインビトロで達成される機能もしくは一連の機能（または上記機能に起因する効果）をいう。生物学的活性は、例えば、リンパ球の増殖、生存率および機能（例えば、サイトカイン分泌）に対する効果、一群の分化マーカーの発現、転写、翻訳もしくは翻訳後レベルにおける遺伝子発現または自己抗体産生に対する効果などで評価され得る。
【００３５】
用語「ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）」は、上記タンパク質を、特に配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸７２を、発現する細胞の外部に存在するタンパク質の上記部分をいう。用語「ストーク（ｓｔａｌｋ）ドメイン」は、上記システインリッチドメインと上記膜貫通ドメインとの間のＴＮＦレセプターファミリーメンバーのタンパク質の上記部分をいう。
【００３６】
用語「免疫学的障害」は、免疫応答が異常である障害および状態をいう。上記異常な応答は、（ａ）免疫細胞、例えばＴ細胞もしくはＢ細胞など、の異常な増殖、異常な成熟、異常な生存率、異常な分化または異常な機能に起因し得る。そのような障害としては、限定されないが、慢性関節リウマチ（ＲＡ），若年性慢性関節炎、喘息、乾癬、脱髄障害、多発性硬化症（ＭＳ），炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、炎症性および線維性肺疾患、クローン病、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、移植拒絶、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）、過増殖免疫障害、自己免疫疾患、Ｂ細胞腫瘍、免疫調節、抗体媒介病理（例えば、ＩＴＰ、重症筋無力症など）、腎臓疾患、間接的Ｔ細胞免疫応答、移植拒絶および対宿主性移植片病および免疫抑制障害が挙げられる。
【００３７】
用語「単離された」は、実質的に天然の環境がない分子をいう。例えば単離されたタンパク質は、細胞物質または由来する細胞もしくは組織源からの他のタンパク質が実質的にない。用語「単離された」はまた、上記単離されたタンパク質が、薬学的組成物として投与するのに十分に純粋であり、または少なくとも７０〜８０％（ｗ／ｗ）の純度で、より好ましくは少なくとも８０〜９０％（ｗ／ｗ）の純度で、さらにより好ましくは９０〜９５％の純度で、もっとも好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（ｗ／ｗ）の純度である。
【００３８】
用語「調節する」およびその類縁は、ＢＡＦＦ−ＲまたはＢＡＦＦの生物学的活性、例えば、ＢＡＦＦレセプターを発現するリンパ球に対して天然に発現したＢＡＦＦ−ＲまたはＢＡＦＦにより発揮された効果と関連する活性などの、減少もしくは増大をいう。生物学的活性の減少または増大は、好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれ以上である。
本明細書で用いられるように、用語「治療化合物」および「治療剤」は、障害の臨床症状を改善できるかまたは望ましい生物学的結果を生じさせることができる任意の化合物を言う。
【００３９】
用語「ポリヌクレオチド」「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）といい、適切な場合、リボ核酸（ＲＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）という。上記用語はまた、ヌクレオチドアナログおよび一重鎖ポリヌクレオチドまたは二重鎖ポリヌクレオチドを含むことが理解される。ポリヌクレオチドの例としては、制限されないが、プラスミドのＤＮＡもしくはそのフラグメント、ウイルスＤＮＡもしくはウイルスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどが挙げられる。用語「プラスミドＤＮＡ」は、円形の二重鎖ＤＮＡをいう。
【００４０】
本発明は、部分的に、ヒトＢＡＦＦ−Ｒおよびその改変体のグリコシル化パターンの発見と特徴づけを、基礎にしている。特に、上記完全長ヒトＢＡＦＦ−Ｒは、多数のＯ結合型グリコシル化部位を含み、上記タンパク質のマウスバージョンは、一つのＮ結合型グリコシル化部位を含有し、Ｏ結合型グリコシル化部位は有しない。ヒトＢＡＦＦ−ＲのＣ末端に５つの潜在的グリコシル化部位があり、配列番号１のＴ４１，Ｓ５０、Ｓ５１、Ｔ５６、およびＳ６３である。全ての５つの部位を含有するタンパク分解フラグメントは、一貫して、＞８０％グリコシル化されている（表２を参照のこと）。
【００４１】
本開示は、変化したＯ結合型グリコシル化パターンを生じる上記ＥＣＤの欠失を有する、天然に存在しないＢＡＦＦ−Ｒ糖タンパク質を提供する。ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃのストーク領域の欠失分析は、残基４４〜７２の欠失が、結果として生じる融合タンパク質のＢＡＦＦと相互作用する能力を破壊しないことを示す。実施例に示されている上記融合タンパク質ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃは、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃのストーク領域のアミノ酸残基５０〜７２の欠失により生じる（ＷＯ０２／２４９０９に記載されている）。
【００４２】
タンパク質の正確な組成を決定することは、薬学的に受容可能なタンパク質ベースの治療剤を生産するのに必須の工程である。ポリペプチドの上記グリコシル化の変化は、結合親和性および溶解性などのような重要な特徴に変化を生じさせ得る。タンパク質治療剤を製造する場合、各バッチは、糖含量を含む多種の重要な特性を分析されなければならない。生産物を製造している間に、ヒトＢＡＦＦ−Ｒのグリコシル化パターンを、分析および調節することは困難であり得る。さらに、潜在的なバッチからバッチへの変動がある場合、グリコシル化パターンの上記分析は、変動の原因を同定するために必要であり得る。従って、他の利点の中には、ここで開示されるＢＡＦＦ−Ｒの短縮形態は、大スケールでの生産の間、より効率的な分析を可能にする。
【００４３】
アミノ酸４３でのＢＡＦＦ−Ｒの上記Ｃ末端の短縮は、完全長ＢＡＦＦ−Ｒの上記ＢＡＦＦとの結合能力を維持しながら、ちょうど二つのＯ結合型グリコシル化部位を有するポリペプチドを産生する。このΔＢＡＦＦ−Ｒは、真核細胞で発現される場合、通常は、二つの部位（配列番号１のＴ１８およびＴ４１）のみでグリコシル化される。このように、本発明は、完全長タンパク質と比較すると変化したグリコシル化パターンを有する生物学的に活性なΔＢＡＦＦ−Ｒを提供する。
【００４４】
本発明は、部分的に、ＢＡＦＦ−ＲのＢＡＦＦへの結合は、ＢＡＦＦ−Ｒの細胞外ドメインのＮ末端領域および／またはＣ末端領域が欠失した場合でも起こるという発見を、さらに基礎としている。結合は、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸７２の欠失の後でも減少せず、そして配列番号１のアミノ酸４３〜アミノ酸７２の欠失の後にほんの部分的に減少する。
【００４５】
最善には、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃは、ＢＡＦＦへ１ｎＭ未満の見かけの親和性（ｋＤＡＰＰ）で結合する。ΔＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜４９）：Ｆｃは、ＢＡＦＦ発現細胞ならびに上記完全長形態に結合し、ＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃと類似の濃度で、内因性のＢＡＦＦ−Ｒを発現する細胞に対するＢＡＦＦの結合を防止する。これらの発見は、短縮されたおよび完全長のＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃポリペプチドは、ＢＡＦＦに対する同様な結合親和性を有していること、およびこれらの親和性は、ナノモル濃度未満の範囲であるということを示している。これらの結果は、親和性成分を含む見かけの親和性として報告される。
【００４６】
一つの局面では、本開示は、二つのＯ結合型グリコシル化部位を有するＢＡＦＦ−Ｒの短縮された形態を提供する。特定の実施形態では、上記短縮されたＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ１８でグリコシル化される。他の実施形態では、上記短縮されたＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ４１でグリコシル化される。さらに他の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＴ１８とＴ４１の両方でグリコシル化される。さらなる実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のＳ８でグリコシル化される。そのようなグリコシル化パターンは、ＢＡＦＦ−Ｒの完全長ＥＣＤのグリコシル化パターンよりも、大スケール生産の間より効率的に分析され得る。
【００４７】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、ヒト（ｈＢＡＦＦ−Ｒ）である。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、組換え発現の間にｈＢＡＦＦ−Ｒの凝集傾向を減少させる点変異（例えば、配列番号１のＶ２１ＮおよびＬ２８Ｐ）を含有する。上記変異ｈＢＡＦＦ−Ｒは、ｖＢＡＦＦ−Ｒと呼ばれる。
【００４８】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３を含む。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、Ｎ末端アミノ酸が、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が、配列番号１の４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、より長いアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、（ａ）ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドをコードする第１アミノ酸配列および（ｂ）免疫グロブリンの定常領域由来の第２アミノ酸配列、そして必要に応じてこれらの配列の間にリンカーを含むＢＡＦＦ−Ｒ融合ポリペプチドの一部分である。
【００５０】
上記融合ポリペプチドの特定の実施形態では、第１アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３または配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３と実質的に同一である。他の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、Ｎ末端アミノ酸が、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、より長いアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、配列番号１のアミノ酸８〜アミノ酸４９、配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４９、または配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４９を含む。全ての実施形態で、第１アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない。いくつかの実施形態では、第１アミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸６３を含まない。
【００５１】
第２アミノ酸配列は、Ｆｃ部のような免疫グロブリンの定常領域由来であり得る。特定の実施形態では、上記第２アミノ酸配列は、ＩｇＧのＦｃ部由来である。関連する実施形態では、上記Ｆｃ部は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４または別のＩｇＧアイソタイプ由来である。特定の実施形態では、上記第２アミノ酸配列は、配列番号４（ヒトＩｇＧ１）のアミノ酸３〜アミノ酸２２７である。
【００５２】
特定の実施形態では、第２アミノ酸配列は、第１アミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端とリンカーで結合されている。上記リンカー正確な長さおよび配列、ならびに結合された配列に関するその配向は、変化し得る。上記リンカーは、タンパク様または非タンパク様であり得る。タンパク様リンカーの場合、それは、配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６を含まない。
【００５３】
特定の実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ−Ｆｃ融合ポリペプチド（ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ）は、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と直接融合する、少なくとも配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、アミノ酸８〜アミノ酸４９、アミノ酸１４〜アミノ酸４９、アミノ酸１３〜アミノ酸４３、またはアミノ酸１４〜アミノ酸４３を含む。さらなる実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃは、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と間接的（即ちリンカーを介して）に結合する、配列番号１のアミノ酸１〜アミノ酸４９、アミノ酸８〜アミノ酸４９、アミノ酸１４〜アミノ酸４９、アミノ酸１３〜アミノ酸４３またはアミノ酸１４〜アミノ酸４３を含む。いくつかの実施形態では、ΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃは、Ｎ末端アミノ酸が配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９であり、Ｃ末端のアミノ酸が配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９である、より長いＢＡＦＦ−Ｒ配列を包含し、これは配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と直接融合するかまたはリンカーにより結合される。
【００５４】
本発明はまた、これらの部位でグリコシル化されるＢＡＦＦ−Ｒ分子の能力を除去する、配列番号１のＳ５０、Ｓ５１、Ｔ５６またはＳ６３でのアミノ酸変異を含む完全長ＢＡＦＦ−Ｒ分子を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号１のＳ５０、Ｓ５１およびＴ５６は、上記グリコシル化部位を除去するよう変異されている。他の実施形態では、Ｓ５０、Ｓ５１、Ｔ５６およびＳ６３は、上記グリコシル化部位を除去するよう変異されている。
【００５５】
本開示は、ΔＢＡＦＦ−ＲポリペプチドをコードするＢＡＦＦ−Ｒ核酸を提供する。いくつかの実施形態では、上記核酸は、少なくとも配列番号１のアミノ酸１３〜アミノ酸４３または少なくとも配列番号１のアミノ酸１４〜アミノ酸４３をコードする配列を含む。上記核酸は、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９にＮ末端を、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９にＣ末端を有し、より長いΔＢＡＦＦ−Ｒのフラグメントをコードし得る。他の実施形態では、上記核酸は、配列番号２のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６または配列番号３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明は、免疫グロブリン定常領域に、直接またはリンカーを介してのいずれかで結合する、ΔＢＡＦＦ−ＲをコードするＤＮＡ構築物を提供する。特定の実施形態では、上記ＤＮＡ構築物は、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９にＮ末端を、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９にＣ末端を有し、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７に結合したΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃをコードする。他の特定の実施形態では、上記ＤＮＡ構築物は、配列番号５のヌクレオチド７〜ヌクレオチド６８１と結合した配列番号２もしくは配列番号３のヌクレオチド１〜ヌクレオチド２１６を含む。
【００５７】
融合タンパク質構築物は、それらが１本のオープンリーディングフレームで翻訳されるようなインフレームで、二つの異なるポリペプチドをコードする配列を連結することにより作製され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、抗体の定常領域と、直接または配列番号１のアミノ酸５０〜アミノ酸５６をコードする配列を含まないリンカーＤＮＡを介してのいずれかで、融合するΔＢＡＦＦ−Ｒを含むＤＮＡ構築物を提供する。特定の実施形態では、上記核酸は、配列番号１のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９にＮ末端を有し、配列番号１のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９に、Ｃ末端を有し、配列番号４のアミノ酸３〜アミノ酸２２７と結合しているΔＢＡＦＦ−Ｒタンパク質をコードし得る。他の特定の実施形態では、上記核酸は、配列番号５のヌクレオチド７〜ヌクレオチド６８１と結合している配列番号２のヌクレオチド１〜２１６を含む。
【００５８】
ΔＢＡＦＦ−Ｒおよびそれがコードする核酸分子およびベクターは、任意の適切なクローニング方法を用いて作製され得る。種々の異なる宿主細胞における、ポリペプチドのクローニングおよび発現のシステムは、周知である。適切な宿主細胞は、細菌、哺乳動物および酵母ならびにバキュロウイルスの系を含む。異種のポリペプチドの発現のための当該分野で入手可能な哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞，ＨｅＬａ細胞、新生児ハムスター腎細胞，ＮＳ０マウス黒色腫細胞およびその他多くを含む。通常の細菌宿主はＥ．ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞は、上記ポリペプチドへＮ結合型グリコシル化またはＯ結合型グリコシル化を付加しない。酵母およびバキュロウイルスは、Ｎ結合型グリコシル化修飾またはＯ結合型グリコシル化修飾を行なうが、上記糖鎖は、哺乳動物細胞を用いたときのものとこれらの細胞での組成は異なり得る。ΔＢＡＦＦ−Ｒを生産する他の適切な細胞については、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら編（１９９９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【００５９】
プロモータ配列、終止配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適切な他の配列を含み、適切な制御配列を含有する、適切なベクターが、選択され得るかまたは構築され得る。ベクターはプラスミドまたはウイルス（例えば、適切なファージもしくはファージミド）であり得る。さらに詳細には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞内へのＤＮＡ導入および遺伝子発現ならびにタンパク質の分析における、核酸を取り扱う多くの公知の技術およびプロトコルの詳細はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｂｅｌら編、（１９９２）第２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓに記載されている。
【００６０】
本発明の上記ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドおよびそれらをコードする核酸は、投与に適切な薬学的組成物に組込まれ得る。そのような組成物は、代表的に上記核酸またはポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書で用いられるように、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意の溶剤、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに薬学的投与に適合するその他のものを含むことが意図されている。適切なキャリアは、ＷＯ０２／２４９０９に詳細が記載されている。
【００６１】
本発明の薬学的組成物は、その意図された投与経路に適合するよう処方される。治療的に有効なΔＢＡＦＦ−Ｒの量は、その体重１ｋｇあたり０．００１〜３０ｍｇ、好ましくは０．０１〜２５ｍｇ、０．１〜２０ｍｇまたは１〜１０ｍｇの範囲である。投薬量は、必要に応じて、処置についての観察される効果に合わせて、調節され得る。ΔＢＡＦＦ−Ｒは、ボーラス量で与えられ得る。連続注入はまた、上記ボーラス量の後に用いられ得る。適切な用量およびレジメンは、処置医による臨床適応に基づいて選択される。投与経路およびこれらの経路の各々について適切な組成物の例は、ＷＯ０２／２４９０９に詳細に記載されている。さらなる方法および治療レジメンは、米国出願番号第６０／５１２，８８０号に詳細が記載されている。
【００６２】
本発明の核酸は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得るか、または裸のＤＮＡとして送達され得る。遺伝子治療ベクターおよびその送達の例は、ＷＯ０２／２４９０９に見出され得る。
【００６３】
本発明は、ＢＡＦＦ関連障害（例えばＢ細胞およびＴ細胞が媒介する状態のような異常なＢＡＦＦもしくはＢＡＦＦ−Ｒの発現もしくは活性と関連する障害）のリスクのある（またはかかりやすい）被験体を処置する、予防および処置の両方の方法を提供する。ＢＡＦＦの増加したレベルもしくは増加した生物学的活性により特徴づけられる疾患および障害は、ＢＡＦＦもしくはＢＡＦＦ−Ｒ活性と拮抗する治療剤で処置され得る。本方法は、そのような処置が望まれている被験体に上記被験体のＢＡＦＦ関連状態を処置、予防もしくは遅延させるのに十分な量のΔＢＡＦＦ−ＲまたはΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドをコードする核酸を投与する工程を包含する。本発明の組成物および方法を用いて処置され得る障害は、制限されないが、ＷＯ０２／２４９０９に記載されている障害を含む。
【００６４】
上記ΔＢＡＦＦ−Ｒ組成物を投与する工程は、ＢＡＦＦ−Ｒ活性に特徴的な症状が発現する前に、疾患または障害が予防されるか、もしくは代わりにその進行を遅延させるように、発生し得る。
【００６５】
本発明の別の局面は、治療目的のために、ＢＡＦＦまたはＢＡＦＦ−Ｒ発現もしくは活性を調節する方法に関する。本発明の上記調節方法は、細胞を、その細胞と関連するＢＡＦＦ活性の一つ以上の活性を調節するΔＢＡＦＦ−ＲポリペプチドまたはΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸と接触させることを含んでいる。一つの実施形態では、上記ＢＡＦＦ−Ｒ組成物は、一以上のＢＡＦＦ活性を阻害する。上記調節は、インビトロ（例えば、上記組成物とともに細胞を培養することにより）または代わりにインビボ（例えば、上記薬剤を被験体に投与することにより）で実施され得る。従って、本発明は、ＢＡＦＦ活性が関連する疾患または障害に苦しんでいる固体を、ＢＡＦＦ活性をブロックするΔＢＡＦＦ−Ｒタンパク質もしくはΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸を投与することにより、処置する方法を提供する。
【００６６】
本開示は、自己免疫疾患，Ｂ細胞癌、免疫調節、炎症性腸疾患および抗体媒介病理学的症状（例えばＩＴＰ、重症筋無力症など）、腎疾患、間接的Ｔ細胞免疫応答、移植拒絶および対宿主性移植片病、を処置する方法および薬学的組成物を提供する。本発明の組成物は、免疫応答の間に、Ｂ細胞を特異的に調節するように標的化され得る。さらに、本発明の組成物は、Ｂ細胞の発生、他の細胞の発生、抗体産生およびサイトカイン産生を調節するのに使用され得る。本発明の組成物はまた、ＢＡＦＦの増殖性効果を中和することにより、Ｔ細胞およびＢ細胞のコミュニケーションを調節し得る。
【００６７】
上記ΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸およびΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドはまた、限定されないが、狼瘡およびリウマチ関節炎を含む、自己免疫疾患の処置に有用であり得る。ＢＡＦＦ活性を調節することにより、ΔＢＡＦＦ−Ｒは、これらの疾患の症状を予防または減少し得る。これらの疾患の症状についてのΔＢＡＦＦ−Ｒの媒介性の調節は、Ｂ細胞の発生、他の細胞の発生、抗体産生またはサイトカイン産生の減少により生じ得る。ΔＢＡＦＦ−Ｒの狼瘡に対する効果は、自己抗体レベル、免疫複合体沈着合併症ならびに、腎不全、蛋白尿、巨脾腫症、神経痛症状および死を含む、全身性エリトマトーデスの症状を評価することにより測定され得る。リウマチ関節炎に対するΔＢＡＦＦ−Ｒの効果は、自己抗体レベル、関節炎惹起免疫グロブリンの分泌、関節および異常な腫脹、またはサイトカインレベルを評価することにより測定され得る。さらにΔＢＡＦＦ−Ｒは、重症筋無力症および若年性慢性関節炎のような他の自己免疫障害を処置するのに有用であり得る。
【００６８】
ΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸およびΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドは、前ＢもしくはＢ細胞性白血病（例えば、形質細胞性白血病、慢性もしくは急性リンパ性白血病、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫、形質細胞性骨髄腫、内皮性骨髄腫、および巨細胞骨髄腫）およびリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫））を処置するために、ＢＡＦＦの効果を中和するのに有用であり得る。本明細書で記載されている分子により処置され得るＢ細胞性リンパ腫のさらなる例としては、バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、大細胞型リンパ腫（例えば、免疫芽球性リンパ腫）、辺縁層リンパ腫、外套細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ種および他のＢ細胞性リンパ腫を含む。
【００６９】
本発明は、自己免疫疾患と関連してもしなくてもよい、末期の腎疾患と関連するＢ細胞の作用を選択的に遮断もしくは中和するために、ΔＢＡＦＦ−ＲポリペプチドまたはΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸を用いる方法を提供する。そのような方法は、免疫学的腎疾患（例えば、膜性ニューロパチー，ＩｇＡニューロパシー、バージャー病），ＩｇＭニューロパチー、グッドパスチャーズ病、感染後糸球体腎炎、膜性増殖性疾患、慢性リンパ性白血病および微少変化ネフローゼ症候群のような疾患と関連する糸球体腎炎を、処置するのに有用である。そのような方法はまた、狼瘡、多発性動脈炎、ヘーノホ−シェーンライン病、水腫性硬化症，ＨＩＶ関連疾患、アミロイドーシスもしくは溶血性尿毒症症候群のような疾患と関連する続発性糸球体腎炎もしくは脈管炎を処置する治療用途として役立つ。本発明の方法はまた、慢性腎盂腎炎、鎮痛剤の乱用、腎石灰沈着、他の薬剤によるニューロパシー、腎石症、または慢性もしくは急性間質性腎炎と関連する間質性腎炎あるいは腎盂腎炎を処置する治療用途の一部として有用である。本発明の方法はまた、腎動脈狭窄、もしくは閉塞およびコレステロール塞栓、または腎塞栓、腎新生物もしくは泌尿器系新生物、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖ニューロパシーもしくはアミロイドーシスを含む、高血圧疾患または主幹動脈疾患（ｌａｒｇｅ ｖｅｓｓｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）のΔＢＡＦＦ−Ｒを含む組成物による処置における、ΔＢＡＦＦ−Ｒ核酸およびΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドの使用を含む。
【００７０】
本発明はまた、喘息ならびに、気管支炎および気腫のような、他の慢性気道疾患の処置のためにΔＢＡＦＦ−Ｒを使用して活性化されたＢ細胞を遮断もしくは阻害する方法を提供する。
【００７１】
ΔＢＡＦＦ−Ｒポリペプチドを用いてエフェクターＴ細胞応答を、阻害するもしくは中和する方法もまた、提供される。これらの方法は、対宿主移植片病および移植拒絶のような、免疫抑制が要求される状態を処置するのに使用され得る。ΔＢＡＦＦ−Ｒの組成物はまた、インスリン依存性糖尿病およびクローン病のような自己免疫疾患の処置に有用である。本発明の方法は、慢性炎症性疾患、特に関節痛（例えば、外傷もしくは骨関節炎における）、腫脹、貧血および他の関連症状を軽減するのに、ならびに敗血症ショックを処置するのに、さらなる治療的価値を有する。
【００７２】
さらに、本発明は、腫瘍とはみなされない増殖性状態、即ち細胞性過増殖（過形成）（例えば、強皮症、リウマチ関節炎におけるパンヌス形成、術後瘢痕および肺線維症、肝線維症および子宮線維症など）の処置に有用である。
【実施例】
【００７３】
（実施例１）
本実施例は、野生型ｈＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃのレセプタードメイン内での種々のペプチド欠失の生成と分析を記載する。これらの欠失変異体のｈＢＡＦＦ結合能を分析した。
【００７４】
ｈＢＡＦＦ−Ｒ：ＦｃのｈＢＡＦＦ−Ｒドメイン内に種々のインフレームペプチド欠失をコードする付着末端を有する２重鎖オリゴヌクレオチドカセットを設計し、そして合成した。上記オリゴヌクレオチドカセットを、相補的末端を有するベクターを含有するｈＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃと連結した。カセットをＮ末端からシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）またはＣ末端からストーク領域の上記ＣＲＤのいずれかの残基を除去するよう設計した。
【００７５】
上記ｈＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ欠失のコード配列を、２９３ＥＢＮＡ細胞での哺乳動物細胞発現のためのベクターにサブクローニングした。発現プラスミドを、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、２９３ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞上清を、トランスフェクト後４８時間で採取した。
【００７６】
発現を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに引き続きＰＶＤＦ膜へのウエスタン転写により評価した。膜をＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ）中で、５％脱脂粉乳で１時間ブロックし、ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でプローブ化し、ＴＢＳＴ中で３回洗浄し、そして化学蛍光基質（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で検出した。
【００７７】
ｈＢＡＦＦ結合能を免疫共沈降法により分析した。これらの実験では、ｈＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃもしくはその欠失を含有する１００μｌの条件培地を、１００ｎｇ／ｍｌの可溶性ｆｌａｇ−ｈＢＡＦＦを含む１ｍｌのＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中、４℃で３時間もしくは一晩インキュベートした。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭビーズ（３０μｌ）を加え、攪拌しながらさらに９０分インキュベートを続けた。ビーズを簡単に遠心分離し、１ｍｌの冷ＰＢＳで３回洗浄した。ビーズを還元Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に再懸濁し、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。プローブとして用いられる５μｇ／ｍｌの抗ｆｌａｇ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で、上述のごとくウエスタンブロットを、実施した。
【００７８】
ｈＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの種々の欠失のコード配列を、種々の制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により検証した。全ての構築物は、中程度のレベルでＦｃ融合タンパク質を発現したが、凝集は、ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃと比較して減少しなかった。免疫共沈降法の結果を図１に示し、表１にまとめる。図１において、レーン１は、配列番号１のアミノ酸Ａ１４〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン２は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｓ５０を示す；レーン３は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｑ５９を示す；レーン４は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｇ６７を示す；レーン５は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン６は、分子量標準を示す；レーン７は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ａ７２を示す；レーン８およびレーン９は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｒ４３を示す；レーン１０は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｔ４１を示す；そしてレーン１１は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３〜アミノ酸Ｃ３６を示す。Ｎ末端欠失ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ａ１４〜Ａ７２）：Ｆｃは、ＢＡＦＦ結合能を維持し、一方ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｃ２０〜Ａ７２）：Ｆｃは維持しない。これは、ｈＢＡＦＦ−Ｒ ＣＲＤについてＮ末端にすぐの５つのアミノ酸残基の全てまたは部分集合が、ｈＢＡＦＦ−Ｒ：ＦｃのＢＡＦＦ結合に必要であることを示している。ＢＡＦＦ結合は、Ｃ末端欠失ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ｃ３６）：ＦｃおよびｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ｔ４１）：Ｆｃで除去され、ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ｒ４３）：Ｆｃでは、大きく減少した。ｈＢＡＦＦ−Ｒストークドメインにおいて、Ｓ５０またはそれ以上を介してＢＡＦＦ−Ｒをコードする試験された全ての他のｈＢＡＦＦ−Ｒ構築物は、完全なストーク改変体である、ｈＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃと同じように効果的に、ｈＢＡＦＦを免疫共沈降し得る。Ｒ４３での短縮は、部分結合活性であり、Ｓ５０での短縮は、全活性であるので、残基Ｐ４４−Ａ４９またはその部分集合は、適切なリガンド結合が起こるのに必要であることは明らかである。
【００７９】
【表１】
【００８０】
（実施例２）
本実施例では、短縮されたＢＡＦＦ−Ｒストークドメインを含有するｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃ改変体の設計、構築および配列決定を記載する。上記融合タンパク質ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃを、配列番号１の残基Ｓ５０、Ｓ５１、Ｔ５６およびＳ６３に位置する４つの潜在的Ｏ結合型グリコシル化部位を除去するために、作製した。
付着末端を有する２重鎖オリゴヌクレオチドカセットを用いて、ＢＡＦＦ−Ｒアミノ酸残基Ｃ３３〜Ａ７２をコードするヌクレオチドを、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃコード配列の同じ部位への連結により、アミノ酸残基Ｃ３３〜Ａ４９をコードするヌクレオチドで置換した。これらのオリゴヌクレオチドの配列（ｂａｆ−９１１およびｂａｆ−９１２）を、配列番号８および配列番号９に示す。このオリゴヌクレオチド置換は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの残基Ｓ５０〜Ａ７２の除去を生じる。
【００８１】
上記ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃコード配列を、哺乳動物細胞発現用ベクター（具体的には、２９３ＥＢＮＡ細胞またはＣＨＯ細胞）にサブクローニングした。発現プラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて，２９３ＥＢＮＡ細胞へトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞上清を、トランスフェクト後９６時間で採取した。上記融合タンパク質ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃを、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーおよびゲル濾過サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
【００８２】
（実施例３）
本実施例は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭによる液相結合分析による、完全長ｖＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃおよび短縮されたｖＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの両方の、ＢＡＦＦに対する見掛けの結合親和性の決定を例示する。
【００８３】
全ての測定を、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ３０００で行なった。ＢＣＭＡ−Ｆｃを、ＣＭ５チップの１つの４分円に高密度に固定し、他の一つの四分円をバックグランドコントロールとして誘導体化せずに残した（ｕｎｄｅｒｉｖｉｔｉｚｅ）。
遊離ＢＡＦＦの量についての標準曲線を、種々の濃度のＢＡＦＦを含有する連続的な試料をチップ表面上を走らせることにより作成した。結合の初速度（Ｖｉ）を、ＢＡＦＦ濃度の関数としてプロットした。用いた条件下では、Ｖｉは、溶液中の遊離ＢＡＦＦ量と比例的である。
【００８４】
図２に示すように、溶液中のＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの各形態に対するＢＡＦＦの結合の平衡を、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃのいずれか一つの固定した量と、種々の濃度のＢＡＦＦとを予備混合し、これらの溶液を平衡に到達させることにより決定した。次いで、これらの溶液をＢＣＭＡ−Ｆｃチップ表面上で操作し、各溶液中の遊離ＢＡＦＦの量を標準曲線との比較により、Ｖｉから決定した。結合の親和性および化学量論を、上記データを適切な２次方程式にあてはめることにより決定した。
【００８５】
図３に示すように、溶液中のｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃに対するＢＡＦＦの結合の平衡およびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃに対するＢＡＦＦの結合の平衡を、固定した量のＢＡＦＦと、改変体ＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃの種々の濃度の各形態を、予備混合し、これらの溶液を平衡に到達させることにより決定した。次いで、これらのｖＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ／ＢＡＦＦ混合物を、その後ＢＣＭＡ−Ｆｃチップ上で操作し、各溶液中の遊離ＢＡＦＦ量をＶｉから定量した。結合の親和性および化学量論を、上記データを適切な２次方程式にあてはめることにより決定した。
【００８６】
図２および図３で示すように、ＢＡＦＦに対する、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの結合親和性は、これらの方法で同一である。ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃは、溶液中でＢＡＦＦに対して、みかけＫＤ＜２００ｐＭおよび１：１（ＢＡＦＦ：ＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ）化学量論で、結合する。
【００８７】
（実施例４）
本実施例は、その表面（ＣＨＯ：ｈＢＡＦＦ）にヒトＢＡＦＦを安定に発現するＣＨＯ細胞株へのｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの結合能を例示する。
【００８８】
精製したｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの３倍の連続希釈液（９μｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌの範囲）を、ＣＨＯ：ｈＢＡＦＦ細胞（５×１０６細胞／ｍｌ）を含む氷上で１時間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ロバ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で氷上で３０分間染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を、ＦＡＣＳによりＰＥ蛍光について分析し、そのヒストグラムの平均蛍光をプロットした。
【００８９】
図４は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃのＣＨＯ：ｈＢＡＦＦ細胞への結合曲線を示す。上記二つの曲線は、互いに殆ど重なり、ＣＨＯ：ｈＢＡＦＦ細胞への１／２最大結合（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ）については同様な値を示す。
【００９０】
（実施例５）
本実施例は、その表面にｈＢＡＦＦ−Ｒを発現するヒトＢ細胞株であるＢＪＡＢ細胞へのｈＢＡＦＦの結合を、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃが阻害する能力を例示する。
【００９１】
ビオチン化ｍｙｃ−ｈＢＡＦＦを、ＦＡＣＳＴＭ緩衝液または精製したｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃもしくはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの３倍連続希釈液のいずれかと一緒に、同時に、ＢＪＡＢ細胞（５×１０６細胞／ｍｌ）に添加した。ビオチン化ｈＢＡＦＦの最終濃度は、２００ｎｇ／ｍｌであり、ｖＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃ分子の濃度は９μｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌの範囲であった。上記細胞を、これらの溶液と氷上で１時間インキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳＴＭ緩衝液で洗浄し、３０分間氷上でＳＡＶ−ＰＥで染色し、再び洗浄して、１％パラホルムアルデヒドで固定した。上記細胞を、ＰＥ蛍光についてＦＡＣＳＴＭにより分析し、そのヒストグラムの平均蛍光をプロットした。
【００９２】
図５は、種々の濃度のｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃが、ＢＪＡＢ細胞に対するビオチン化ｈＢＡＦＦの結合を阻害する能力についての曲線を示す。上記二つの曲線は、互いに殆ど正確に重なっている。ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃについてのＢＪＡＢへのｈＢＡＦＦ結合の１／２最大阻害は類似している。
【００９３】
（実施例６）
本実施例は、ヒトｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃのグリコシル化パターンを実証する。マウスＢＡＦＦ−Ｒ分子中のＮ結合型グリコシル化部位およびヒトＢＡＦＦ−Ｒ分子中のＯ結合型グリコシル化部位を、図６Ａおよび図６Ｂに示す。
【００９４】
ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃを発現し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭとのインキュベート、酸溶出およびゲル濾過クロマトグラフィーによりＣＨＯ細胞から精製した。Ｎ結合型グリカンを除去するためにＰＮＧａｓｅＦで処理した後、上記タンパク質をＤＴＴで還元し、分子質量をＺＭＤ質量分析器を用いて決定した。上記分子質量は、ＭａｓＥｎｔ １プログラムで逆重畳積分により生成した。
【００９５】
図７の質量スペクトル中の検出可能なピークは、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃタンパク質の多くのＯ結合型形態があることを示す。各検出可能なピークに関しては、上記分子に存在する６つの潜在的Ｏ結合型グリコシル化の中に多くの異なる潜在的グリコシル化パターンがある。これらの部位のいくつかの％占有率を表２に示す。図８Ａ〜８Ｈは、異なるＣＨＯ細胞株（図８Ａ〜Ｆ）および２９３細胞株（図８Ｇ）で発現されたｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃタンパク質についての質量スペクトルを示す。図８Ｈは、ｍＢＡＦＦ−Ｒ：ｈＦｃについての質量スペクトルを示す。
【００９６】
表２は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃタンパク質の特定の潜在的グリコシル化部位のグリコシル化を分析する一連の実験の概要を示す。Ｔ４１、Ｓ５０、Ｓ５１、Ｔ５６およびＳ６３の近接は、どの部位が占有されているか決定することを妨げる。しかしながら、これらの５つの部位を有するタンパク分解フラグメントは、８０％のグリコシル化されるチャンスを有し、一方、ただＴ１８部位のみを含有するフラグメントは２０〜４０％しかグリコシル化されるチャンスはない。グリコシル化パターンが、予測不可能性、および任意の所与の糖タンパク質の由来を決定する不可能性が、上記タンパク質の大スケールでの生産に問題を生じる。
【００９７】
【表２】
ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３−Ａ４９）の質量スペクトルを、図９に示し、そして表３に要約する。
【００９８】
【表３】
ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３−Ａ４９）：Ｆｃポリペプチドの上記グリコシル化パターンは、完全長ＥＣＤ ＢＡＦＦ−Ｒ、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３−Ａ７２）：Ｆｃよりずっと単純である。このより短いポリペプチドは、二つのみ潜在的Ｏ結合型グリコシル化部位（Ｔ１８およびＴ４１）を含有する。このスペクトルには、７つのピークしかなく、そのそれぞれは、わずかの可能なグリコシル化部位を表している。例えば、上記３０５７２ピークは、Ｔ１８またはＴ４１のいずれかに結合している単核２糖（ＨｅｘＮＡｃ）（Ｈｅｘ）を有するΔＢＡＦＦ−Ｒ：Ｆｃタンパク質を表している。最も多くグリコシル化されている種は、上記３１８１０であり、そこでは、２核２糖のそれぞれが、二つのシアル酸（ＮｅｕＡｃ）由来である。上記ＢＡＦＦ−Ｒの完全長細胞外ドメインと比較する場合、この変化したグリコシル化パターンは、ＢＡＦＦ−Ｒを含む薬学的組成物のバッチ間のバラツキを容易に特徴づけることを可能にしている。表４は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃ（Ｔｈｒ−１８およびＴｈｒ−４１）の二つの潜在的グリコシル化部位のグリコシル化部位占有率およびＯ結合糖のプロフィールの分析の要約を表す。
【００９９】
【表４】
（実施例７）
本実施例は、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）およびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃが、マウス脾臓Ｂ細胞におけるｈＢＡＦＦのＢ細胞生存活性を阻害する能力を例示している。ＢＡＦＦ誘導細胞増殖アッセイを、マウス脾臓Ｂ細胞を用いて実施した。マウスＢ細胞を、Ｂ細胞回収カラム（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ）を用いて２匹の１ヶ月齢Ｃ５７／ｂｌａｃｋ６マウスの脾臓から単離した。Ｂ細胞を、平底９６穴プレート（１０５細胞／穴 １００μｌ １０％ＦＢＳ加ＲＰＭＩ中）に、５μｇ／ｍｌヤギ抗マウスμ鎖抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）、７５ｎｇ／ｍｌ ｍｙｃ−ｈＢＡＦＦ、およびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃの連続希釈液、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃの連続希釈液もしくはヒトＩｇＧの連続希釈液の存在下で、７２時間インキュベートした。細胞を、［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／穴）でさらに１８時間パルスし、そして採取した。［３Ｈ］−チミジン取込みを、液体シンチレーション計数により、モニタリングした。図１０は、インビトロでｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）が、ｈＩｇＧとインキュベートした細胞と比較する場合、減少した［３Ｈ］−チミジン取込みにより示されるように、ＢＡＦＦ媒介のＢ細胞増殖を、同じようによく阻害することを示している。
【０１００】
（実施例８）
本実施例は、インビボでｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃでのＢＡＦＦ遮断が、Ｂ細胞生存を障害し、末梢Ｂ細胞の数を減少させ、Ｂ細胞表面マーカーであるＣＤ２１およびＣＤ２３の発現レベルの低下の原因となることを示している。
全部で３７匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、表５に示すように、８つの処置群に割当てた。全ての動物に、２００μｌのｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃまたはｈＩｇＧを腹腔内に（１０ｍｌ／ｋｇ容量用量）投与した。投与後９６時間で、マウスを安楽死させ、Ｂ細胞定量化のために脾臓を摘出した。
【０１０１】
【表５】
脾細胞を機械的破砕で調製した。組織片を、１００μｍの細胞ろ過器を通して除去した。赤血球を５ｍｌのＡＣＫ溶液（１５５ｍＭ 塩化アンモニウム、１０ｍＭ重炭酸カリウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）中で溶解させ、１０ｍｌＰＢＳで３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％ＦＢＳ、０．０１アジ化ナトリウム）に懸濁した。組織片を、１００μｍの細胞ろ過器を通して除去し、生存細胞をトリパンブルー排除により計数した。
【０１０２】
ＦＡＣＳ染色：１００μｌ容量の試料あたり、２００万個の細胞を染色した。上記ｍＡｂｓのＦｃドメインと脾細胞のＦｃｇＲ（Ｆｃγレセプター）とが、相互作用をするのを防ぎ、それによりバックグランド染色を最小化するために、細胞を、Ｂｌｏｃｋ緩衝液（１０μｇ／ｍｌ ＦｃＢｌｏｃｋ、５％ラット血清を含有するＦＡＣＳＴＭ緩衝液）と氷上でインキュベートした。特定のｍＡｂｓカクテルを、添加しそして氷上で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳＴＭ緩衝液で洗浄し、その後ストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰ（ストレプトアビジン−ペリジニン クロロフィルＩＩ−ａタンパク質、ビオチン化ＣＤ２３プローブを検出するのに用いられる蛍光タグ化したストレプトアビジン）を含有するＦＡＣＳＴＭ緩衝液に懸濁し、３０分間氷上でインキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒＴＭフローサイトメーターでの分析のために１５０μｌのＰＢＳ中０．５％のパラフォルムアルデヒドに懸濁した。１００，０００事象を集め、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＴＭソフトウエアを用いて分析をした。統計的解析は、スチューデントｔ検定を用いて実施した。
【０１０３】
脾臓Ｂ細胞の数を、全脾細胞数およびＣＤ１９＋細胞％を基礎にして計算した。図１１でわかるように、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃ処置マウスは、コントロールと比較した場合、脾臓Ｂ細胞の著しい損失を示した。Ｂ細胞損失は、０．２５ｍｇ／ｋｇの低い用量で観察され、％損失は、より高用量のｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃで増加した。
【０１０４】
ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃによる、脾臓成熟（ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）ならびに辺縁領域（ＭＺ）（ＩｇＭｌｏＩｇＤｈｉ）Ｂ細胞ＣＤ２１およびＣＤ２３発現について、ＢＡＦＦの阻害の波及効果を試験した。ＣＤ２１平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ｈＩｇＧ処置コントロールと比較した場合、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：Ｆｃを受けた０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ用量の群で試験された全てのＢ細胞サブセットにおいて有意に、減少した（表６）。
【０１０５】
【表６】
ＣＤ２３発現は、５ｍｇ／ｋｇ用量のｈＩｇＧ処置コントロールと比較した場合、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜４９）：Ｆｃ処置マウスからの成熟Ｂ細胞およびＭＺ Ｂ細胞において、有意に減少していた（表７）。
【０１０６】
【表７】
（実施例９）
本実施例において、二つのＥＬＩＳＡ型式における、ｆｌａｇ−ｈｕＢＡＦＦとｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃとの結合を例示する。ＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ９．６の５０ｍＭ 重炭酸ナトリウム中で、５０μｌ／穴、５μｇ／ｍｌの捕獲抗体で、４℃一晩で、被覆した。捕獲抗体は、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはＭ２抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）であった。プレートを室温（ＲＴ）３０分間、３％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロックし、２５０μｌのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭで３回洗浄した。その後のインキュベーションを、全て室温で３％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈された試薬で行なった。
【０１０７】
抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ被覆プレート上で５０μｌｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃまたはｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃを２μｇ／ｍｌで、２時間で捕獲し、上記の如く洗浄した（図１２Ａ）。１０μｇ／ｍｌの５０μｌのＦＬＡＧ−ｈｕＢＡＦＦから始まる連続１０倍希釈液を加え、３０分間インキュベートして、洗浄した。１００μｌの１μｇ／ｍｌのＭ２抗ＦＬＡＧを３０分間加えて洗浄した。抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の１：３０００希釈、１００μｌ、３０分間。
【０１０８】
上記抗ＦＬＡＧコートプレート上で、５０μｌの１０μｇ／ｍｌのＦＬＡＧ−ｈｕＢＡＦＦを添加し、２時間インキュベートし、そして上記のように洗浄した（図１２Ｂ）。１０μｇ／ｍｌの５０μｌのｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃから始まる連続１０倍希釈液を加え、３０分間インキュベートして、上記のように洗浄した。１：３０００希釈の抗ヒトＦｃγアルカリホスファターゼ結合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）（１：３０００希釈）、１００μｌ、３０分間。
【０１０９】
洗浄後、両方のセットのプレートの検出を、十分な発色が観察されるまで、１０％ジエタノ−ルアミン、ｐＨ９．０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＺｎＣｌ２中、１００μｌの２ｍｇ／ｍｌｐＮｐｐ（Ｐｉｅｒｃｅ）と室温で、インキュベートして行なった。ＯＤ４０５を読み取った。
【０１１０】
図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、両方のＥＬＩＳＡ型式のもとで、ｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ４９）：ＦｃおよびｖＢＡＦＦ−Ｒ（Ｒ３〜Ａ７２）：Ｆｃに対するリガンド結合のＩＣ５０は、リガンドまたはレセプターＦｃ融合物が溶液中に存在するか否かに拘わらず、ＦＬＡＧ−ｈｕＢＡＦＦに対して同じ高機能親和性を示している。
【０１１１】
本明細書は、本明細書で引用されている参考文献の教示に鑑みて、ほぼ完全に理解され、それらの参考文献は、本明細書により参考として援用されている。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するが、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明により包含されることを、容易に認識する。引用された全ての刊行物および特許ならびに本開示中のアクセッション番号もしくはデータベース参照番号により同定された配列は、全体が参考として援用される。本明細書に対立するまたは一致しない参考文献に援用されている物質の範囲まで、本明細書はいかなるそのような物質にもとってかわる。本明細書のいずれの参考文献の引用も、そのような参考文献が、本発明に対する先行技術であるという承認を得るものでもない。
【０１１２】
他に示さなければ、請求項を含め、本明細書で用いられている成分、細胞培養物、処置条件、の量を表現している全ての数は、用語「約」により、全ての例で修飾されるものと理解される。従って、他に反対と示されない限り、数値パラメータは近似値であり、本発明により得ようとしている望ましい性質により依存して変化する。他に示さなければ、一連の要素の前に立つ用語「少なくとも」は、一連のいずれの要素をもいうと理解される。当業者は、本明細書で記述されている本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、単なる慣用的実験を用いて認識するか、またはこれらを確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図８Ｇ】
【図８Ｈ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図８Ｆ】
【図８Ｇ】
【図８Ｈ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−１５８２５４（Ｐ２０１０−１５８２５４Ａ）
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８５５５７（Ｐ２０１０−８５５５７）
【出願日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【分割の表示】特願２００６−５０７１４１（Ｐ２００６−５０７１４１）の分割
【原出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１日（２０１０．４．１）
【分割の表示】特願２００６−５０７１４１（Ｐ２００６−５０７１４１）の分割
【原出願日】平成１６年３月２６日（２００４．３．２６）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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