石油汚染土壌の浄化方法
【課題】本発明は、微生物による分解が困難である多環芳香族化合物などの石油成分により汚染された土壌を比較的短時間で効率的に浄化できる方法、および当該方法で用いる浄化剤と菌を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明に係る石油汚染土壌の浄化方法は、石油汚染土壌へＳ１３３株（ＮＩＴＥ Ｐ−４６１）を添加することを特徴とする。
【解決手段】本発明に係る石油汚染土壌の浄化方法は、石油汚染土壌へＳ１３３株（ＮＩＴＥ Ｐ−４６１）を添加することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、石油汚染土壌の浄化方法、および当該方法で用いる浄化剤と菌に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
石油の精製工場や備蓄基地、コールタールの製造工場や石炭の処理工場などの敷地内や周辺部では石油成分により土壌が汚染されており、その跡地を住宅地などとして有効利用できない場合がある。また、原油タンカーの座礁事故などによって、沿岸が汚染されることもある。石油や原油には低沸点化合物や比較的親水性の高い化合物など、自然に分解され易い成分も含まれているが、多環芳香族化合物など非常に分解され難い成分も含まれている。かかる成分は長く環境に残留して生物に悪影響を与えるので問題となっている。
【０００３】
難分解性の石油成分に汚染された土壌の処理方法としては、例えば、活性炭等を用いた吸着方法、加熱による熱分解法、汚染土壌の不溶化処理法など、様々な化学的または物理的な処理方法がある。しかし近年では、より穏和な条件で安価に実施でき、省エネルギーの観点からも優れている微生物による処理方法（バイオレメディエーション）の開発が盛んである。
【０００４】
例えば非特許文献１と２では、多環芳香族化合物の分解能を有する細菌として、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属菌やＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ属菌などが特定されている。しかしこれら細菌は、汚染土壌の抽出物や汚染土壌の懸濁液を処理可能なものとして見出されているが、実際における汚染土壌の浄化処理を考慮すれば、膨大な汚染土壌から汚染物質を抽出したり或いは汚染土壌をスラリー化した上で処理することは不可能である。よって、特別なスラリー化工程を経ることなく菌を散布等するのみで汚染土壌を浄化することが好ましいが、これら先行技術文献で見出された菌がかかる浄化処理が可能なほど浄化能に優れるとは限らない。
【０００５】
一方、非特許文献３には、汚染された土壌を固体状態のまま処理することにより、多環芳香族炭化水素の分解能を有するＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属菌等を見出している。しかし、多環芳香族炭化水素を十分に分解するには６ヵ月以上の時間を要している。効率的な浄化処理のためには、より短期間で石油成分を十分に分解できる浄化能に優れた菌が求められている。
【０００６】
ところで、特許文献１にはＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌を使って汚染物質を処理する方法が記載されている。しかし特許文献１に記載の方法は、有機溶媒中に分散した逆ミセルの内部にラッカーゼ含有物を内包させ、当該ラッカーゼにより有機溶媒中の汚染物質を処理するものである。よって、汚染土壌の浄化に当該方法を適用する場合、汚染土壌から汚染物質を抽出した上で有機溶媒に添加したり、有機溶媒に汚染土壌を懸濁させる必要がある。この様な方法は、広範囲にわたる大量の汚染土壌を処理する方法としては到底採用できない。その上、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌は多数例示されたラッカーゼ産生菌の一つとして挙げられているのみであり、しかも例示された菌は逆ミセル中に内包させて用いるとされている。しかし逆ミセル中の菌がラッカーゼを産生し、有機溶媒中の汚染物質を効率的に処理できるとは考え難い。実際、特許文献１の実施例で逆ミセル中に内包されているのは市販のラッカーゼのみであり、菌を内包させた例は全く開示されていない。
【非特許文献１】H.I. ATAGANAら，ウォーター・エアー・アンド・ソイルポリューション（Water, Air, and Soil Pollution），第１４１巻，第２３３〜２４６頁（２００２年）
【非特許文献２】Mikael Erikssonら，アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology），第６９巻、第１号，第２７５〜２８４頁（２００３年）
【非特許文献３】Marc Vinasら，アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology），第７１巻、第１１号，第７００８〜７０１８頁（２００５年）
【特許文献１】特開２００３−５２３６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した様に、石油成分などにより汚染された土壌の範囲や量は、一般的に莫大なものであることから、石油成分の抽出や汚染土壌のスラリー化を前提とした浄化処理技術は実用的でない。一方、汚染土壌を固体状態のままでも浄化できる細菌も知られてはいたが、十分に浄化できるまでには長時間を要するものであった。
【０００８】
そこで本発明が解決すべき課題は、微生物による分解が困難である多環芳香族化合物などの石油成分により汚染された土壌を比較的短時間で効率的に浄化できる方法、および当該方法で用いる浄化剤と菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、多環芳香族化合物などを効率的に分解できる微生物を探索したところ、従来、バイオレメディエーションで主に用いられている細菌類ではなく、担子菌類に属するもので石油成分の分解能に極めて優れる菌株であるＳ１３３株を見出して、本発明を完成した。
【００１０】
本発明に係る石油汚染土壌の浄化方法は、石油汚染土壌へＳ１３３株（ＮＩＴＥ Ｐ−４６１）を添加することを特徴とする。なお、本発明方法では石油汚染土壌をスラリー化したり汚染物質を抽出する必要はなく、石油汚染土壌へＳ１３３株を散布するのみで土壌を浄化することができる。
【００１１】
上記方法においては、さらにＳ１３３株の栄養源、界面活性剤、またはこれらの混合物を添加することが好ましい。栄養源はＳ１３３株の生育を活発化させ、ひいては石油成分の分解を促進することができる。栄養源としては、例えば、植物材料（代表的には、パルプなどの植物材料破砕物）が例示される。また、界面活性剤は、固体状の土壌から疎水性の高い石油成分を脱離し易くしてＳ１３３株による分解を促進することによって、より効率的な土壌浄化処理が可能になると考えられる。
【００１２】
界面活性剤を用いる場合、その添加量は、石油汚染土壌に対して０．０５質量％以上、１．０質量％以下とすることが好ましい。当該量が０．０５質量％以上であればその効果は十分確実に発揮できる一方で、１．０質量％を超えると菌の生育が一部阻害される場合があり得、浄化効率がかえって低下するおそれがある。
【００１３】
本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、Ｓ１３３株を含むことを特徴とする。また、本発明はＳ１３３株に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るＳ１３３株は、多環芳香族化合物などバイオレメディエーションによる処理が難しい石油成分に汚染された土壌を、スラリー化したり石油成分を抽出したりせずとも比較的短時間で浄化することができる。よって本発明は、石油を用いる工場の跡地の浄化処理などにおいて、膨大かつ広大な汚染土壌を効率的に浄化処理できるものとして、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係るＳ１３３株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ） 寄託機関の名称およびあて名
名称： 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名： 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（ｉｉ） 寄託日： 平成１９年（２００７年）１１月２８日
（ｉｉｉ） 受領番号： ＮＩＴＥ ＡＰ−４６１
（ｉｖ） 受託番号： ＮＩＴＥ Ｐ−４６１
【００１６】
Ｓ１３３株を麦芽エキス寒天培地上で生育させ光学顕微鏡を用いて観察した形態的特徴は、以下の通りである。即ち、白色でハニカム状の直径２〜１０ｃｍ程度のかさを有する担子菌であり、柄は１〜８ｃｍ程度と比較的短い。かさにおけるハニカムの大きさは、１〜６ｍｍ程度である。その胞子は、白色で楕円形のものであり、その大きさは７〜１５×２〜５μｍ程度である。Ｓ１３３株は倍地上で白色の菌糸として生育し、この菌糸にはクランプコネクションが見られる。以上の形態的特徴から、Ｓ１３３株はＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属に属する担子菌であると判断した。また、Ｓ１３３株は好気性である。
【００１７】
Ｓ１３３株を２０℃、２５℃、３０℃および３５℃で培養したところ、いずれの温度でも生育したが、最も良好に生育したのは３０℃であった。よって、Ｓ１３３株を培養する際の温度やＳ１３３株により石油成分を分解する際の温度は、２０℃以上、３５℃以下程度が好適である。
【００１８】
Ｓ１３３株を麦芽エキス液体培地で培養したところ、培地にはマンガンペルオキシダーゼ活性、リグニンペルオキシダーゼ活性、ラッカーゼ活性およびジオキシゲナーゼ活性が認められた。よって、Ｓ１３３株による石油成分の分解能には、これら酵素のうち少なくとも１つが関与している可能性がある。
【００１９】
本発明に係るＳ１３３株は、置換基を有さず極めて分解され難い多環芳香族化合物であるクリセンを効率良く分解できることが実験的に確認されている。また、本発明者らによる知見によれば、Ｓ１３３株は１，２−ジオキシゲナーゼなどを活発に発現する。Ｓ１３３株は、これら酵素によりクリセンを酸化しつつその炭素−炭素結合を切断していき、水酸基やカルボキシル基などの親水性基を有するベンゼン化合物に導き、最終的に二酸化炭素まで分解する。よってＳ１３３株は、クリセンと同様の多環芳香族化合物であるテンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、フルオレン、フェナレン、フェナンスレン、アントラセン、トリフェニレン、ピレン、ベンゾピレン、ナフタセン、ペリレンなども分解できると考えられる。またＳ１３３株は、ベンゼン、アルキルフェノール類、ハロゲン化フェノール類、ビスフェノール類、ダイオキシン類といった化合物も同様に分解し得る。
【００２０】
なお、本発明においてＳ１３３株が分解し得る石油成分は、原油や石油に含まれ得るものであれば原油由来のものや石油由来のものに限定されないものとする。例えばクリセンなどの多環芳香族化合物は山火事によっても発生する。その一方で、かかる多環芳香族化合物は自然には分解され難い。よって、本発明で処理すべき石油成分は、原油や石油に含まれる成分であれば、その起源は問わないものとする。なお、一般的に精製前の石油を特に原油というが、本発明では石油と原油を特に区別しないものとする。原油には、原油を用いた石油製品（例えば、重油、ガソリン、灯油、軽油など）も含まれる。
【００２１】
本発明に係るＳ１３３株は極めて優れた石油成分分解能を有することから、石油汚染土壌をスラリー化したり汚染土壌中の石油成分を抽出しなくても、石油汚染土壌へＳ１３３株を添加してＳ１３３株と石油汚染土壌を接触させるのみで石油成分を分解することができる。
【００２２】
しかも本発明によれば、上述した種々の石油成分を高濃度に含む汚染土壌を効率よく分解することができる。本発明によって処理可能な石油汚染土壌の濃度は、Ｓ１３３株を、好ましくは後記する栄養源や界面活性剤などと併用したり、当該菌株式の培養期間を長くするなどして高めることができ、おおむね、２０，０００〜５０，０００ｐｐｍ程度の汚染土壌を処理することができる。
【００２３】
Ｓ１３３株と石油汚染土壌を接触させる方法は常法に従えばよい。例えば、Ｓ１３３株を液体培地で培養した場合には、その培養液を石油汚染土壌に散布すればよい。或いは、Ｓ１３３株は担子菌であるので、菌床となり得る植物残渣を用いて培養したＳ１３３株を石油汚染土壌に散布してもよい。
【００２４】
石油汚染土壌に散布すべきＳ１３３株の液体培地は、希釈してもよい。また、当該液体培地のｐＨは、Ｓ１３３株の至適ｐＨに合わせて４．５〜６程度に調整することが好ましい。
【００２５】
Ｓ１３３株を培養するために用いる植物残渣としては、木屑、おが屑、鋸屑、米糠、おから、油粕、大豆粕などを挙げることができる。
【００２６】
Ｓ１３３株を石油汚染土壌に添加する場合には、Ｓ１３３株の栄養源や界面活性剤も添加することが好ましい。栄養源はＳ１３３株の生育を活発化し、ひいては石油成分の分解能を活性化することができる。また、界面活性剤は、脂溶性が高く親水性の低い石油成分を固体状の土壌から脱離させてＳ１３３株の生育環境に存在し易くし、分解を促進する作用を有する。
【００２７】
Ｓ１３３株の栄養源としては、昭和産業社製の「しいたけの里」など担子菌の栄養源として市販されているものを用いてもよいし、グルコースなどの炭素源；ポリペプトンなどの窒素源；マグネシウム塩やマンガン塩などの微量元素源；クエン酸などのｐＨ調整剤などを適宜選択して用いてもよい。また、Ｓ１３３株の栄養源として、植物材料も好ましく用いられ、代表的には、植物繊維の破砕物（パルプ）が挙げられる。Ｓ１３３株は、白色腐朽菌に属するＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属の一種であり、植物などの木材中のリグニン分解能力を有しているからである。パルプの原料としては、白色腐朽菌が利用できるものであれば特に限定されないが、針葉樹や広葉樹などの木材、綿、麻、ケナフ、バガスなどが挙げられる。具体的には、例えば、カポックの木を用いたカポックパルプ、綿の実に付着する短毛（綿クズ）を用いたリンターパルプ、綿の紡績から出る繊維（綿ボロ）を利用したラグパルプ、麻を原料としたリネンパルプなどが代表的に例示される。また、古紙パルプ（再生紙）を利用しても良い。
【００２８】
栄養源の添加量は、Ｓ１３３株の量などに応じて適宜調整すればよいが、一般的には栄養源の量は多いほどＳ１３３株の生育は良好であり、石油成分の分解効率は向上する。その一方で、植物材料の天然素材を除く炭素源や窒素源などの栄養源が多過ぎると環境への悪影響が懸念される。以上を考慮して、添加する栄養源の量は、処理対象である石油汚染土壌に対して５〜３０質量％程度にすることが好ましい。
【００２９】
使用する界面活性剤としては、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤など特に制限されないが、Ｓ１３３株への悪影響が少ないことから非イオン界面活性剤が好適である。非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルなどを挙げることができる。より具体的には、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０を用いることができる。
【００３０】
界面活性剤は、Ｓ１３３株の生育環境に対する石油成分の分散性を向上させることの他、炭素源となるなどＳ１３３株の生育を促進する可能性もある。しかし、界面活性剤の量が多過ぎるとかえってＳ１３３株の生育に悪影響を与え得る。そこで、界面活性剤の添加量は、処理すべき石油汚染土壌に対して０．０５質量％以上、１．０質量％以下程度にすることが好ましく、０．１質量％以上、０．７５質量％以下程度にすることがより好ましい。
【００３１】
処理対象である石油汚染土壌は、採掘した上で容器に挿入し、Ｓ１３３株や栄養源などを添加し、Ｓ１３３株が良好に生育できるように温度や湿度を調整してもよい。しかし、土壌汚染は広範囲に及ぶことが多く、処理すべき土壌を逐一採掘するとかえって処理効率が低下し得る。よって、石油汚染土壌にそのままＳ１３３株を添加してもよい。なお、Ｓ１３３株は２５℃で十分に生育することから、日本国内であれば、Ｓ１３３株は温度調節せずとも常温で石油成分を分解できると考えられる。但し、湿度は比較的高く保つべきであるので、適時水を散布するなどすべきである。
【００３２】
Ｓ１３３株の添加量は、汚染土壌の汚染状態などに応じて適宜調整すればよい。
【００３３】
本発明者らによる知見によれば、Ｓ１３３株による石油汚染土壌の処理中は、遮光した方が効率が良い。よって、石油汚染土壌にＳ１３３株を添加した後は、ブルーシート等で被覆するなどして照射光量を抑えることが好ましい。
【００３４】
本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、Ｓ１３３株を含むことを特徴とする。より具体的には、上述した通り、本発明の浄化剤はＳ１３３株を含む液体培地であってもよいし、Ｓ１３３株を生育させた木屑などの菌床であってもよい。また、栄養源や界面活性剤などを含むものであってもよい。
【００３５】
本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、液体培地や菌床上などでＳ１３３株を十分に生育させたものであってもよいし、或いは生育させたものを冷蔵保存したものであってもよい。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３７】
なお、以下における「％」は、全て「質量％」である。
【００３８】
実施例１ Ｓ１３３株の単離
蒸留水（１００ｍＬ）に麦芽（２０ｇ／Ｌ）、グルコース（２０ｇ／Ｌ）、ポリペプトン（１ｇ／Ｌ）および寒天（２０ｇ／Ｌ）を添加した。さらに、当該混合物（２０ｍｌ）に、雑細菌や酵母などの繁殖を抑制するためにクロラムフェニコール（６ｍｇ）またはベニミル（６ｍｇ）を加え、麦芽エキス寒天培地を調製した。別途、１％のＴｗｅｅｎ８０を含むジメチルホルムアミドの１％クリセン溶液を調製した。上記麦芽エキス寒天培地（２０ｍｌ）上に、上記クリセン溶液（１ｍｌ）を添加して均一になるように広げた。
【００３９】
愛媛大学農学部構内およびその近縁から採取した１２４種の土壌（乾燥重量で１ｇ）を滅菌水（９ｍＬ）に懸濁し、攪拌した後に１０分間静置した。次いで、各上澄液（１ｍＬ）を上記麦芽エキス寒天培地に添加し、暗所にて２５℃で２週間培養した。培地上に生育してきた８７種の菌をそれぞれ採取し、同様の麦芽エキス寒天培地にて２５℃で７日間培養した。生育速度の速い菌を７種採取し、同様の操作をもう一度繰り返すことによって、特にクリセン存在下における生育が活発であった担子菌であるＳ１３３株を単離した。
【００４０】
得られたＳ１３３株を顕微鏡により観察したところ、中央に窪みがある平らで白色のカサを有し、その表面には褐色の鱗片が存在するものであった。柄は中心生であり、胞子は白色で長楕円形であった。これらはＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌の形態学的特徴であることから（今関六也ら編、「日本のキノコ」山と渓谷社、第４５０〜４５１頁（１９８８年）；およびＴｏｍａｓ Ｌａｅｓｓoｅ著，「ＤＯＲＬＩＧ ＫＩＮＤＥＲＳＬＥＹ −ＨＡＮＤＢＯＯＫＳ− ＭＵＳＨＲＯＯＭＳ」，Ｄｏｒｌｉｎｇ Ｋｉｎｄｅｒｓｌｅｙ Ｌｔｄ．，ＬＯＮＤＯＮ，２０４，ｐｐ．２０２〜２１０（１９９８年）を参照）、Ｓ１３３株はＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌と同定した。
【００４１】
実施例２ Ｓ１３３株による石油汚染土壌の浄化（その１）
（１） クリセン汚染土壌の調製
愛媛大学農学部附属農場から採取した土壌を３ｍｍのメッシュで篩い分けし、１２０℃で２時間滅菌した。別途、１％のＴｗｅｅｎ８０を含むジメチルホルムアミドに１ｐｐｍの濃度でクリセンを添加した。上記滅菌土壌（乾燥重量で２００ｇ）に上記クリセン溶液（２ｍＬ）を加えた。また、比較のために、滅菌処理を行っていない土壌に対して、同様に上記クリセン溶液を添加した。いずれも土壌中のクリセン濃度は１ｐｐｍである。
【００４２】
（２） 石油汚染土壌の浄化処理
プラスチックバックに、木粉（乾燥重量で２００ｇ）と栄養源（昭和産業社製、「しいたけの里」、木粉に対する乾燥重量で１５％）を加え、さらに水を加えて含水率を６０％に調整した。これをオートクレーブにより１２１℃で２時間滅菌した後、上記実施例１で単離したＳ１３３株を接種し、暗所にて２５℃で３０日間培養した。
【００４３】
上記（１）で調製した石油汚染土壌に対して、栄養源として、実験例１−しいたけの里のみ（１５％）、実験例２−ポリペプトンのみ（１５％）、実験例３−グルコース（１５％）、実験例４−しいたけの里＋グルコース（各７．５％）、実験例５−しいたけの里＋ポリペプトン（各７．５％）（各５％）を添加した。さらに、上記培養物を１５％となるように加え、よく混合した後、暗所にて２５℃で培養した。また、比較のために、滅菌処理を行っていないクリセン添加土壌を実験例６とし、当該土壌に栄養源としてしいたけの里（１５％）を添加した土壌を実験例７として、同様に実験を行った。
【００４４】
（３） クリセン分解率の測定
培養開始から１５日間および３０日間経過後に土壌の一部を採取し、ジクロロメタンで１６時間ソックスレー抽出した。抽出液を減圧濃縮後、内部標準液である４−クロロビフェニールを加え、シリカゲルカラムで精製した。ジクロロメタンで溶出する画分を濃縮後、ＧＣ−ＭＳにより残留クリセンを定量した。ＧＣ−ＭＳの条件は、以下の通りである。
カラム： ジーエルサイエンス社製のＴＣ−１ （長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）
キャリヤーガス： ヘリウム
昇温条件： ８０℃で２分間保持→２００℃まで２０℃／分で昇温→２６０℃まで７．５℃／分で昇温→２６０℃で４分間保持
カラム流速： １．５ｍＬ／分
注入口温度： ２６０℃
イオン化電圧： ７０ｅＶ
【００４５】
処理前のクリセン量から、分解率を算出した。結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
表１の通り、土壌に存在する菌のみでは、栄養源を添加しても、石油に含まれる多環芳香族化合物であるクリセンを分解することはできない（実験例６および７）。一方、本発明に係るＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌であるＳ１３３株を添加した場合、クリセンを３０日間で約７０％以上分解できることが証明された。
【００４８】
実施例３ Ｓ１３３株による石油汚染土壌の浄化（その２）
上記実施例２において、各栄養源の代わりに界面活性剤であるＴｗｅｅｎ８０を石油汚染土壌に対して０．０５％加えた例（実験例８）、０．２５％加えた例（実験例９）、０．５％加えた例（実験例１０）、０．７５％加えた例（実験例１１）でも同様の実験を行った。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
表２の通り、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ８０を加えた場合、栄養源を添加しなくても、３０日間という比較的短期間でクリセンを十分に分解できた。しかし、界面活性剤の添加量が０．５％の場合をピークとして、それ以上添加した場合には分解率は低下した。これは、過剰な界面活性剤により菌の生育が一部阻害されることによる可能性がある。よって、Ｓ１３３株と共に界面活性剤を添加すれば石油成分を効率的に分解できるが、その量が過剰であるとかえって分解率が低下することが分かった。
【００５１】
実施例４ Ｓ１３３株による石油汚染土壌の浄化（その３）
本実施例では、実施例２および３で用いた石油汚染土壌（クリセン濃度１ｐｐｍ）よりも高濃度の石油汚染土壌（Ｃ重油濃度１５０００ｐｐｍ）を用いたときの分解効率を調べた。Ｃ重油は、動粘度によって分類された３種の重油であり、軽油のほか９０％以上が残渣油である。
【００５２】
（１） Ｃ重油汚染土壌の調製
愛媛大学農学部附属農場から採取した土壌を３ｍｍのメッシュで篩い分けし、１２０℃で２時間滅菌した。別途、Ｃ重油（３g）［重油規格（ＪＩＳＫ２２０５）の３種１号に相当するＣ重油であり、太陽石油株式会社製のＣ重油］をヘキサン（１５ｍＬ）に溶解させ、２０％のＣ重油溶液を調製した。上記滅菌土壌（乾燥重量で２００ｇ）に上記Ｃ重油溶液（１５ｍＬ）を加えた。土壌中のＣ重油濃度は１５０００ｐｐｍである。
【００５３】
（２） 石油汚染土壌の浄化処理
プラスチックバックに、木粉（乾燥重量で２００ｇ）と栄養源（昭和産業社製、「しいたけの里」、木粉に対する乾燥重量で１５％）を加え、さらに水を加えて含水率を６０％に調整した。これをオートクレーブにより１２１℃で２時間滅菌した後、上記実施例１で単離したＳ１３３株を接種し、暗所にて２５℃で３０日間培養した。
【００５４】
上記（１）で調製した石油汚染土壌に対して、栄養源として、実験例１２−カポックパルプ（三木特種製紙（株）から提供されたカポックパルプ、１５％）、実験例１３−リンターパルプ（三木特種製紙（株）から提供されたリンターパルプ、１５％）を添加した。さらに、上記培養物を１５％となるように加え、よく混合した後、暗所にて２５℃で培養した。また、栄養源を添加せずに上記培養物（１５％）のみを添加したものを同様に培養したものを実験例１４とした。比較のために、市販のバクテリア浄化剤（バイオジェネシステクノロジー社製のオイルスポンジ）、１５％）を添加した土壌を実験例１５として、同様に実験を行った。
【００５５】
（３） Ｃ重油分解率の測定
Ｃ重油の分解率を、Ｍｉｓｈｒａらの方法（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｎ Ｏｉｌｙ Ｓｌｕｄｇｅ−Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｓａｎｊｅｅｔ Ｍｉｓｈｒａ，Ｊｅｅｖａｎ Ｊｙｏｔ，Ｒａｍｅｓｈ Ｃｈａｎｄｅｒ Ｋｕｈａｄ，Ｂａｎｗａｒｉ， Ｌａｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４３，３２８−３３５（２００１））を参考にして測定した。ここでは、Ｃ重油量［全石油炭化水素（ｔｏｔａｌ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ、ＴＰＨ）の量］およびＣ重油を構成する下記成分の分解率の両方を測定した。
炭化水素（ａｌｋａｎｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）
芳香族化合物
窒素、硫黄および酸素を含む化合物（ＮＳＯ）
アスファルト（ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）
【００５６】
測定方法の概要は以下のとおりである。まず、培養開始から３０日間および６０日間経過後に土壌の一部を採取し、ヘキサン、ジクロロメタン、およびクロロホルムで順次抽出した。それぞれの抽出液を合わせて濃縮し、抽出物を得た。一方、Ｃ重油汚染土壌（菌株の添加なし）の一部を採取し、上記と同様にして、ヘキサン、ジクロロメタン、およびクロロホルムで順次抽出した各抽出液を合わせて濃縮し、抽出物を得た。このようにして得られた各抽出物の重量を比較し、全石油炭化水素部（ＴＰＨ）の分解率を算出した。
【００５７】
さらに、各抽出物にヘキサンを加え、ヘキサン可溶部と不溶部に分けた。このうちヘキサン可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン、トルエン、およびクロロホルム：メタノール（１：１）で順次溶出した。このようにして得られたヘキサン溶出部は炭化水素を、トルエン溶出部は芳香族化合物を、クロロホルム：メタノール（１：１）溶出部は窒素、硫黄および酸素を含む化合物（ＮＳＯ）並びにアスファルテンを、それぞれ含む。このうち炭化水素および芳香族化合物の分解率は、ヘキサン溶出部およびトルエン溶出部をガスクロマトグライー（ＧＣ）で分析し、処理前後のそれぞれの溶出物のピーク面積を比較して算出した。ＧＣ条件は、以下の通りである。また、ＮＳＯおよびアスファルトの分解率は、クロロホルム：メタノール（１：１）可溶部およびアスファルトからなるヘキサン不溶部を合わせたものの重量を測定し、処理前後の重量を比較して算出した。
カラム： ジーエルサイエンス社製のＴＣ−５（長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）
キャリヤーガス： ヘリウム
昇温条件： ８０℃〜２４０℃まで５℃／分で昇温→２４０℃で３０分間保持
カラム流速： １．５ｍＬ／分
注入口温度： ３００℃
【００５８】
ＴＰＨ、炭化水素、芳香族化合物、並びにＮＳＯおよびアスファルトの分解率を、表３〜表６に、それぞれ示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
【表４】
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
【００６３】
表３のＴＰＨ分解率の結果から明らかなように、栄養源としてパルプ材を添加した実験例１２および１３では、パルプの種類にかかわらず、１５０００ｐｐｍの極めて高濃度の重油を、約２ヶ月間の比較的短期間で効率よく分解できることが確認された（実験例１２で約９３％、実験例１３で約８２％）のに対し、市販のバクテリア添加剤を用いた実験例１５では、約２ヶ月間経過後でもせいぜい約６６％しか分解されなかった。
【００６４】
同様の傾向は、Ｃ重油を構成する各成分についても認められた（表４〜表６を参照）。すなわち、市販のバクテリア添加剤を用いた実験例１５に比べて、Ｓ１３株にパルプ材を添加した実験例１２および１３では、各成分の分解率が上昇し、分解が特に困難であったＮＳＯおよびアスファルトについても、約２ヶ月間経過後で半分以上を分解することができた。
【００６５】
以上の結果より、本発明法は、従来法では短時間の高い分解処理が困難であった高濃度汚石油汚染土壌を十分に浄化できる技術として極めて有用であることが十分実証された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、石油汚染土壌の浄化方法、および当該方法で用いる浄化剤と菌に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
石油の精製工場や備蓄基地、コールタールの製造工場や石炭の処理工場などの敷地内や周辺部では石油成分により土壌が汚染されており、その跡地を住宅地などとして有効利用できない場合がある。また、原油タンカーの座礁事故などによって、沿岸が汚染されることもある。石油や原油には低沸点化合物や比較的親水性の高い化合物など、自然に分解され易い成分も含まれているが、多環芳香族化合物など非常に分解され難い成分も含まれている。かかる成分は長く環境に残留して生物に悪影響を与えるので問題となっている。
【０００３】
難分解性の石油成分に汚染された土壌の処理方法としては、例えば、活性炭等を用いた吸着方法、加熱による熱分解法、汚染土壌の不溶化処理法など、様々な化学的または物理的な処理方法がある。しかし近年では、より穏和な条件で安価に実施でき、省エネルギーの観点からも優れている微生物による処理方法（バイオレメディエーション）の開発が盛んである。
【０００４】
例えば非特許文献１と２では、多環芳香族化合物の分解能を有する細菌として、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属菌やＡｃｉｄｏｖｏｒａｘ属菌などが特定されている。しかしこれら細菌は、汚染土壌の抽出物や汚染土壌の懸濁液を処理可能なものとして見出されているが、実際における汚染土壌の浄化処理を考慮すれば、膨大な汚染土壌から汚染物質を抽出したり或いは汚染土壌をスラリー化した上で処理することは不可能である。よって、特別なスラリー化工程を経ることなく菌を散布等するのみで汚染土壌を浄化することが好ましいが、これら先行技術文献で見出された菌がかかる浄化処理が可能なほど浄化能に優れるとは限らない。
【０００５】
一方、非特許文献３には、汚染された土壌を固体状態のまま処理することにより、多環芳香族炭化水素の分解能を有するＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属菌等を見出している。しかし、多環芳香族炭化水素を十分に分解するには６ヵ月以上の時間を要している。効率的な浄化処理のためには、より短期間で石油成分を十分に分解できる浄化能に優れた菌が求められている。
【０００６】
ところで、特許文献１にはＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌を使って汚染物質を処理する方法が記載されている。しかし特許文献１に記載の方法は、有機溶媒中に分散した逆ミセルの内部にラッカーゼ含有物を内包させ、当該ラッカーゼにより有機溶媒中の汚染物質を処理するものである。よって、汚染土壌の浄化に当該方法を適用する場合、汚染土壌から汚染物質を抽出した上で有機溶媒に添加したり、有機溶媒に汚染土壌を懸濁させる必要がある。この様な方法は、広範囲にわたる大量の汚染土壌を処理する方法としては到底採用できない。その上、Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌は多数例示されたラッカーゼ産生菌の一つとして挙げられているのみであり、しかも例示された菌は逆ミセル中に内包させて用いるとされている。しかし逆ミセル中の菌がラッカーゼを産生し、有機溶媒中の汚染物質を効率的に処理できるとは考え難い。実際、特許文献１の実施例で逆ミセル中に内包されているのは市販のラッカーゼのみであり、菌を内包させた例は全く開示されていない。
【非特許文献１】H.I. ATAGANAら，ウォーター・エアー・アンド・ソイルポリューション（Water, Air, and Soil Pollution），第１４１巻，第２３３〜２４６頁（２００２年）
【非特許文献２】Mikael Erikssonら，アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology），第６９巻、第１号，第２７５〜２８４頁（２００３年）
【非特許文献３】Marc Vinasら，アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Applied and Environmental Microbiology），第７１巻、第１１号，第７００８〜７０１８頁（２００５年）
【特許文献１】特開２００３−５２３６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した様に、石油成分などにより汚染された土壌の範囲や量は、一般的に莫大なものであることから、石油成分の抽出や汚染土壌のスラリー化を前提とした浄化処理技術は実用的でない。一方、汚染土壌を固体状態のままでも浄化できる細菌も知られてはいたが、十分に浄化できるまでには長時間を要するものであった。
【０００８】
そこで本発明が解決すべき課題は、微生物による分解が困難である多環芳香族化合物などの石油成分により汚染された土壌を比較的短時間で効率的に浄化できる方法、および当該方法で用いる浄化剤と菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、多環芳香族化合物などを効率的に分解できる微生物を探索したところ、従来、バイオレメディエーションで主に用いられている細菌類ではなく、担子菌類に属するもので石油成分の分解能に極めて優れる菌株であるＳ１３３株を見出して、本発明を完成した。
【００１０】
本発明に係る石油汚染土壌の浄化方法は、石油汚染土壌へＳ１３３株（ＮＩＴＥ Ｐ−４６１）を添加することを特徴とする。なお、本発明方法では石油汚染土壌をスラリー化したり汚染物質を抽出する必要はなく、石油汚染土壌へＳ１３３株を散布するのみで土壌を浄化することができる。
【００１１】
上記方法においては、さらにＳ１３３株の栄養源、界面活性剤、またはこれらの混合物を添加することが好ましい。栄養源はＳ１３３株の生育を活発化させ、ひいては石油成分の分解を促進することができる。栄養源としては、例えば、植物材料（代表的には、パルプなどの植物材料破砕物）が例示される。また、界面活性剤は、固体状の土壌から疎水性の高い石油成分を脱離し易くしてＳ１３３株による分解を促進することによって、より効率的な土壌浄化処理が可能になると考えられる。
【００１２】
界面活性剤を用いる場合、その添加量は、石油汚染土壌に対して０．０５質量％以上、１．０質量％以下とすることが好ましい。当該量が０．０５質量％以上であればその効果は十分確実に発揮できる一方で、１．０質量％を超えると菌の生育が一部阻害される場合があり得、浄化効率がかえって低下するおそれがある。
【００１３】
本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、Ｓ１３３株を含むことを特徴とする。また、本発明はＳ１３３株に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係るＳ１３３株は、多環芳香族化合物などバイオレメディエーションによる処理が難しい石油成分に汚染された土壌を、スラリー化したり石油成分を抽出したりせずとも比較的短時間で浄化することができる。よって本発明は、石油を用いる工場の跡地の浄化処理などにおいて、膨大かつ広大な汚染土壌を効率的に浄化処理できるものとして、産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に係るＳ１３３株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ） 寄託機関の名称およびあて名
名称： 独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
あて名： 日本国 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（ｉｉ） 寄託日： 平成１９年（２００７年）１１月２８日
（ｉｉｉ） 受領番号： ＮＩＴＥ ＡＰ−４６１
（ｉｖ） 受託番号： ＮＩＴＥ Ｐ−４６１
【００１６】
Ｓ１３３株を麦芽エキス寒天培地上で生育させ光学顕微鏡を用いて観察した形態的特徴は、以下の通りである。即ち、白色でハニカム状の直径２〜１０ｃｍ程度のかさを有する担子菌であり、柄は１〜８ｃｍ程度と比較的短い。かさにおけるハニカムの大きさは、１〜６ｍｍ程度である。その胞子は、白色で楕円形のものであり、その大きさは７〜１５×２〜５μｍ程度である。Ｓ１３３株は倍地上で白色の菌糸として生育し、この菌糸にはクランプコネクションが見られる。以上の形態的特徴から、Ｓ１３３株はＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属に属する担子菌であると判断した。また、Ｓ１３３株は好気性である。
【００１７】
Ｓ１３３株を２０℃、２５℃、３０℃および３５℃で培養したところ、いずれの温度でも生育したが、最も良好に生育したのは３０℃であった。よって、Ｓ１３３株を培養する際の温度やＳ１３３株により石油成分を分解する際の温度は、２０℃以上、３５℃以下程度が好適である。
【００１８】
Ｓ１３３株を麦芽エキス液体培地で培養したところ、培地にはマンガンペルオキシダーゼ活性、リグニンペルオキシダーゼ活性、ラッカーゼ活性およびジオキシゲナーゼ活性が認められた。よって、Ｓ１３３株による石油成分の分解能には、これら酵素のうち少なくとも１つが関与している可能性がある。
【００１９】
本発明に係るＳ１３３株は、置換基を有さず極めて分解され難い多環芳香族化合物であるクリセンを効率良く分解できることが実験的に確認されている。また、本発明者らによる知見によれば、Ｓ１３３株は１，２−ジオキシゲナーゼなどを活発に発現する。Ｓ１３３株は、これら酵素によりクリセンを酸化しつつその炭素−炭素結合を切断していき、水酸基やカルボキシル基などの親水性基を有するベンゼン化合物に導き、最終的に二酸化炭素まで分解する。よってＳ１３３株は、クリセンと同様の多環芳香族化合物であるテンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、フルオレン、フェナレン、フェナンスレン、アントラセン、トリフェニレン、ピレン、ベンゾピレン、ナフタセン、ペリレンなども分解できると考えられる。またＳ１３３株は、ベンゼン、アルキルフェノール類、ハロゲン化フェノール類、ビスフェノール類、ダイオキシン類といった化合物も同様に分解し得る。
【００２０】
なお、本発明においてＳ１３３株が分解し得る石油成分は、原油や石油に含まれ得るものであれば原油由来のものや石油由来のものに限定されないものとする。例えばクリセンなどの多環芳香族化合物は山火事によっても発生する。その一方で、かかる多環芳香族化合物は自然には分解され難い。よって、本発明で処理すべき石油成分は、原油や石油に含まれる成分であれば、その起源は問わないものとする。なお、一般的に精製前の石油を特に原油というが、本発明では石油と原油を特に区別しないものとする。原油には、原油を用いた石油製品（例えば、重油、ガソリン、灯油、軽油など）も含まれる。
【００２１】
本発明に係るＳ１３３株は極めて優れた石油成分分解能を有することから、石油汚染土壌をスラリー化したり汚染土壌中の石油成分を抽出しなくても、石油汚染土壌へＳ１３３株を添加してＳ１３３株と石油汚染土壌を接触させるのみで石油成分を分解することができる。
【００２２】
しかも本発明によれば、上述した種々の石油成分を高濃度に含む汚染土壌を効率よく分解することができる。本発明によって処理可能な石油汚染土壌の濃度は、Ｓ１３３株を、好ましくは後記する栄養源や界面活性剤などと併用したり、当該菌株式の培養期間を長くするなどして高めることができ、おおむね、２０，０００〜５０，０００ｐｐｍ程度の汚染土壌を処理することができる。
【００２３】
Ｓ１３３株と石油汚染土壌を接触させる方法は常法に従えばよい。例えば、Ｓ１３３株を液体培地で培養した場合には、その培養液を石油汚染土壌に散布すればよい。或いは、Ｓ１３３株は担子菌であるので、菌床となり得る植物残渣を用いて培養したＳ１３３株を石油汚染土壌に散布してもよい。
【００２４】
石油汚染土壌に散布すべきＳ１３３株の液体培地は、希釈してもよい。また、当該液体培地のｐＨは、Ｓ１３３株の至適ｐＨに合わせて４．５〜６程度に調整することが好ましい。
【００２５】
Ｓ１３３株を培養するために用いる植物残渣としては、木屑、おが屑、鋸屑、米糠、おから、油粕、大豆粕などを挙げることができる。
【００２６】
Ｓ１３３株を石油汚染土壌に添加する場合には、Ｓ１３３株の栄養源や界面活性剤も添加することが好ましい。栄養源はＳ１３３株の生育を活発化し、ひいては石油成分の分解能を活性化することができる。また、界面活性剤は、脂溶性が高く親水性の低い石油成分を固体状の土壌から脱離させてＳ１３３株の生育環境に存在し易くし、分解を促進する作用を有する。
【００２７】
Ｓ１３３株の栄養源としては、昭和産業社製の「しいたけの里」など担子菌の栄養源として市販されているものを用いてもよいし、グルコースなどの炭素源；ポリペプトンなどの窒素源；マグネシウム塩やマンガン塩などの微量元素源；クエン酸などのｐＨ調整剤などを適宜選択して用いてもよい。また、Ｓ１３３株の栄養源として、植物材料も好ましく用いられ、代表的には、植物繊維の破砕物（パルプ）が挙げられる。Ｓ１３３株は、白色腐朽菌に属するＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属の一種であり、植物などの木材中のリグニン分解能力を有しているからである。パルプの原料としては、白色腐朽菌が利用できるものであれば特に限定されないが、針葉樹や広葉樹などの木材、綿、麻、ケナフ、バガスなどが挙げられる。具体的には、例えば、カポックの木を用いたカポックパルプ、綿の実に付着する短毛（綿クズ）を用いたリンターパルプ、綿の紡績から出る繊維（綿ボロ）を利用したラグパルプ、麻を原料としたリネンパルプなどが代表的に例示される。また、古紙パルプ（再生紙）を利用しても良い。
【００２８】
栄養源の添加量は、Ｓ１３３株の量などに応じて適宜調整すればよいが、一般的には栄養源の量は多いほどＳ１３３株の生育は良好であり、石油成分の分解効率は向上する。その一方で、植物材料の天然素材を除く炭素源や窒素源などの栄養源が多過ぎると環境への悪影響が懸念される。以上を考慮して、添加する栄養源の量は、処理対象である石油汚染土壌に対して５〜３０質量％程度にすることが好ましい。
【００２９】
使用する界面活性剤としては、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤など特に制限されないが、Ｓ１３３株への悪影響が少ないことから非イオン界面活性剤が好適である。非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグルコシド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルなどを挙げることができる。より具体的には、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０を用いることができる。
【００３０】
界面活性剤は、Ｓ１３３株の生育環境に対する石油成分の分散性を向上させることの他、炭素源となるなどＳ１３３株の生育を促進する可能性もある。しかし、界面活性剤の量が多過ぎるとかえってＳ１３３株の生育に悪影響を与え得る。そこで、界面活性剤の添加量は、処理すべき石油汚染土壌に対して０．０５質量％以上、１．０質量％以下程度にすることが好ましく、０．１質量％以上、０．７５質量％以下程度にすることがより好ましい。
【００３１】
処理対象である石油汚染土壌は、採掘した上で容器に挿入し、Ｓ１３３株や栄養源などを添加し、Ｓ１３３株が良好に生育できるように温度や湿度を調整してもよい。しかし、土壌汚染は広範囲に及ぶことが多く、処理すべき土壌を逐一採掘するとかえって処理効率が低下し得る。よって、石油汚染土壌にそのままＳ１３３株を添加してもよい。なお、Ｓ１３３株は２５℃で十分に生育することから、日本国内であれば、Ｓ１３３株は温度調節せずとも常温で石油成分を分解できると考えられる。但し、湿度は比較的高く保つべきであるので、適時水を散布するなどすべきである。
【００３２】
Ｓ１３３株の添加量は、汚染土壌の汚染状態などに応じて適宜調整すればよい。
【００３３】
本発明者らによる知見によれば、Ｓ１３３株による石油汚染土壌の処理中は、遮光した方が効率が良い。よって、石油汚染土壌にＳ１３３株を添加した後は、ブルーシート等で被覆するなどして照射光量を抑えることが好ましい。
【００３４】
本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、Ｓ１３３株を含むことを特徴とする。より具体的には、上述した通り、本発明の浄化剤はＳ１３３株を含む液体培地であってもよいし、Ｓ１３３株を生育させた木屑などの菌床であってもよい。また、栄養源や界面活性剤などを含むものであってもよい。
【００３５】
本発明に係る石油汚染土壌の浄化剤は、液体培地や菌床上などでＳ１３３株を十分に生育させたものであってもよいし、或いは生育させたものを冷蔵保存したものであってもよい。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３７】
なお、以下における「％」は、全て「質量％」である。
【００３８】
実施例１ Ｓ１３３株の単離
蒸留水（１００ｍＬ）に麦芽（２０ｇ／Ｌ）、グルコース（２０ｇ／Ｌ）、ポリペプトン（１ｇ／Ｌ）および寒天（２０ｇ／Ｌ）を添加した。さらに、当該混合物（２０ｍｌ）に、雑細菌や酵母などの繁殖を抑制するためにクロラムフェニコール（６ｍｇ）またはベニミル（６ｍｇ）を加え、麦芽エキス寒天培地を調製した。別途、１％のＴｗｅｅｎ８０を含むジメチルホルムアミドの１％クリセン溶液を調製した。上記麦芽エキス寒天培地（２０ｍｌ）上に、上記クリセン溶液（１ｍｌ）を添加して均一になるように広げた。
【００３９】
愛媛大学農学部構内およびその近縁から採取した１２４種の土壌（乾燥重量で１ｇ）を滅菌水（９ｍＬ）に懸濁し、攪拌した後に１０分間静置した。次いで、各上澄液（１ｍＬ）を上記麦芽エキス寒天培地に添加し、暗所にて２５℃で２週間培養した。培地上に生育してきた８７種の菌をそれぞれ採取し、同様の麦芽エキス寒天培地にて２５℃で７日間培養した。生育速度の速い菌を７種採取し、同様の操作をもう一度繰り返すことによって、特にクリセン存在下における生育が活発であった担子菌であるＳ１３３株を単離した。
【００４０】
得られたＳ１３３株を顕微鏡により観察したところ、中央に窪みがある平らで白色のカサを有し、その表面には褐色の鱗片が存在するものであった。柄は中心生であり、胞子は白色で長楕円形であった。これらはＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌の形態学的特徴であることから（今関六也ら編、「日本のキノコ」山と渓谷社、第４５０〜４５１頁（１９８８年）；およびＴｏｍａｓ Ｌａｅｓｓoｅ著，「ＤＯＲＬＩＧ ＫＩＮＤＥＲＳＬＥＹ −ＨＡＮＤＢＯＯＫＳ− ＭＵＳＨＲＯＯＭＳ」，Ｄｏｒｌｉｎｇ Ｋｉｎｄｅｒｓｌｅｙ Ｌｔｄ．，ＬＯＮＤＯＮ，２０４，ｐｐ．２０２〜２１０（１９９８年）を参照）、Ｓ１３３株はＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌と同定した。
【００４１】
実施例２ Ｓ１３３株による石油汚染土壌の浄化（その１）
（１） クリセン汚染土壌の調製
愛媛大学農学部附属農場から採取した土壌を３ｍｍのメッシュで篩い分けし、１２０℃で２時間滅菌した。別途、１％のＴｗｅｅｎ８０を含むジメチルホルムアミドに１ｐｐｍの濃度でクリセンを添加した。上記滅菌土壌（乾燥重量で２００ｇ）に上記クリセン溶液（２ｍＬ）を加えた。また、比較のために、滅菌処理を行っていない土壌に対して、同様に上記クリセン溶液を添加した。いずれも土壌中のクリセン濃度は１ｐｐｍである。
【００４２】
（２） 石油汚染土壌の浄化処理
プラスチックバックに、木粉（乾燥重量で２００ｇ）と栄養源（昭和産業社製、「しいたけの里」、木粉に対する乾燥重量で１５％）を加え、さらに水を加えて含水率を６０％に調整した。これをオートクレーブにより１２１℃で２時間滅菌した後、上記実施例１で単離したＳ１３３株を接種し、暗所にて２５℃で３０日間培養した。
【００４３】
上記（１）で調製した石油汚染土壌に対して、栄養源として、実験例１−しいたけの里のみ（１５％）、実験例２−ポリペプトンのみ（１５％）、実験例３−グルコース（１５％）、実験例４−しいたけの里＋グルコース（各７．５％）、実験例５−しいたけの里＋ポリペプトン（各７．５％）（各５％）を添加した。さらに、上記培養物を１５％となるように加え、よく混合した後、暗所にて２５℃で培養した。また、比較のために、滅菌処理を行っていないクリセン添加土壌を実験例６とし、当該土壌に栄養源としてしいたけの里（１５％）を添加した土壌を実験例７として、同様に実験を行った。
【００４４】
（３） クリセン分解率の測定
培養開始から１５日間および３０日間経過後に土壌の一部を採取し、ジクロロメタンで１６時間ソックスレー抽出した。抽出液を減圧濃縮後、内部標準液である４−クロロビフェニールを加え、シリカゲルカラムで精製した。ジクロロメタンで溶出する画分を濃縮後、ＧＣ−ＭＳにより残留クリセンを定量した。ＧＣ−ＭＳの条件は、以下の通りである。
カラム： ジーエルサイエンス社製のＴＣ−１ （長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）
キャリヤーガス： ヘリウム
昇温条件： ８０℃で２分間保持→２００℃まで２０℃／分で昇温→２６０℃まで７．５℃／分で昇温→２６０℃で４分間保持
カラム流速： １．５ｍＬ／分
注入口温度： ２６０℃
イオン化電圧： ７０ｅＶ
【００４５】
処理前のクリセン量から、分解率を算出した。結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
表１の通り、土壌に存在する菌のみでは、栄養源を添加しても、石油に含まれる多環芳香族化合物であるクリセンを分解することはできない（実験例６および７）。一方、本発明に係るＰｏｌｙｐｏｒｕｓ属菌であるＳ１３３株を添加した場合、クリセンを３０日間で約７０％以上分解できることが証明された。
【００４８】
実施例３ Ｓ１３３株による石油汚染土壌の浄化（その２）
上記実施例２において、各栄養源の代わりに界面活性剤であるＴｗｅｅｎ８０を石油汚染土壌に対して０．０５％加えた例（実験例８）、０．２５％加えた例（実験例９）、０．５％加えた例（実験例１０）、０．７５％加えた例（実験例１１）でも同様の実験を行った。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
【００５０】
表２の通り、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ８０を加えた場合、栄養源を添加しなくても、３０日間という比較的短期間でクリセンを十分に分解できた。しかし、界面活性剤の添加量が０．５％の場合をピークとして、それ以上添加した場合には分解率は低下した。これは、過剰な界面活性剤により菌の生育が一部阻害されることによる可能性がある。よって、Ｓ１３３株と共に界面活性剤を添加すれば石油成分を効率的に分解できるが、その量が過剰であるとかえって分解率が低下することが分かった。
【００５１】
実施例４ Ｓ１３３株による石油汚染土壌の浄化（その３）
本実施例では、実施例２および３で用いた石油汚染土壌（クリセン濃度１ｐｐｍ）よりも高濃度の石油汚染土壌（Ｃ重油濃度１５０００ｐｐｍ）を用いたときの分解効率を調べた。Ｃ重油は、動粘度によって分類された３種の重油であり、軽油のほか９０％以上が残渣油である。
【００５２】
（１） Ｃ重油汚染土壌の調製
愛媛大学農学部附属農場から採取した土壌を３ｍｍのメッシュで篩い分けし、１２０℃で２時間滅菌した。別途、Ｃ重油（３g）［重油規格（ＪＩＳＫ２２０５）の３種１号に相当するＣ重油であり、太陽石油株式会社製のＣ重油］をヘキサン（１５ｍＬ）に溶解させ、２０％のＣ重油溶液を調製した。上記滅菌土壌（乾燥重量で２００ｇ）に上記Ｃ重油溶液（１５ｍＬ）を加えた。土壌中のＣ重油濃度は１５０００ｐｐｍである。
【００５３】
（２） 石油汚染土壌の浄化処理
プラスチックバックに、木粉（乾燥重量で２００ｇ）と栄養源（昭和産業社製、「しいたけの里」、木粉に対する乾燥重量で１５％）を加え、さらに水を加えて含水率を６０％に調整した。これをオートクレーブにより１２１℃で２時間滅菌した後、上記実施例１で単離したＳ１３３株を接種し、暗所にて２５℃で３０日間培養した。
【００５４】
上記（１）で調製した石油汚染土壌に対して、栄養源として、実験例１２−カポックパルプ（三木特種製紙（株）から提供されたカポックパルプ、１５％）、実験例１３−リンターパルプ（三木特種製紙（株）から提供されたリンターパルプ、１５％）を添加した。さらに、上記培養物を１５％となるように加え、よく混合した後、暗所にて２５℃で培養した。また、栄養源を添加せずに上記培養物（１５％）のみを添加したものを同様に培養したものを実験例１４とした。比較のために、市販のバクテリア浄化剤（バイオジェネシステクノロジー社製のオイルスポンジ）、１５％）を添加した土壌を実験例１５として、同様に実験を行った。
【００５５】
（３） Ｃ重油分解率の測定
Ｃ重油の分解率を、Ｍｉｓｈｒａらの方法（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ａｎ Ｏｉｌｙ Ｓｌｕｄｇｅ−Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｓａｎｊｅｅｔ Ｍｉｓｈｒａ，Ｊｅｅｖａｎ Ｊｙｏｔ，Ｒａｍｅｓｈ Ｃｈａｎｄｅｒ Ｋｕｈａｄ，Ｂａｎｗａｒｉ， Ｌａｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４３，３２８−３３５（２００１））を参考にして測定した。ここでは、Ｃ重油量［全石油炭化水素（ｔｏｔａｌ ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ、ＴＰＨ）の量］およびＣ重油を構成する下記成分の分解率の両方を測定した。
炭化水素（ａｌｋａｎｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）
芳香族化合物
窒素、硫黄および酸素を含む化合物（ＮＳＯ）
アスファルト（ａｓｐｈａｌｔｅｎｅ）
【００５６】
測定方法の概要は以下のとおりである。まず、培養開始から３０日間および６０日間経過後に土壌の一部を採取し、ヘキサン、ジクロロメタン、およびクロロホルムで順次抽出した。それぞれの抽出液を合わせて濃縮し、抽出物を得た。一方、Ｃ重油汚染土壌（菌株の添加なし）の一部を採取し、上記と同様にして、ヘキサン、ジクロロメタン、およびクロロホルムで順次抽出した各抽出液を合わせて濃縮し、抽出物を得た。このようにして得られた各抽出物の重量を比較し、全石油炭化水素部（ＴＰＨ）の分解率を算出した。
【００５７】
さらに、各抽出物にヘキサンを加え、ヘキサン可溶部と不溶部に分けた。このうちヘキサン可溶部をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、ヘキサン、トルエン、およびクロロホルム：メタノール（１：１）で順次溶出した。このようにして得られたヘキサン溶出部は炭化水素を、トルエン溶出部は芳香族化合物を、クロロホルム：メタノール（１：１）溶出部は窒素、硫黄および酸素を含む化合物（ＮＳＯ）並びにアスファルテンを、それぞれ含む。このうち炭化水素および芳香族化合物の分解率は、ヘキサン溶出部およびトルエン溶出部をガスクロマトグライー（ＧＣ）で分析し、処理前後のそれぞれの溶出物のピーク面積を比較して算出した。ＧＣ条件は、以下の通りである。また、ＮＳＯおよびアスファルトの分解率は、クロロホルム：メタノール（１：１）可溶部およびアスファルトからなるヘキサン不溶部を合わせたものの重量を測定し、処理前後の重量を比較して算出した。
カラム： ジーエルサイエンス社製のＴＣ−５（長さ３０ｍ×内径０．２５ｍｍ）
キャリヤーガス： ヘリウム
昇温条件： ８０℃〜２４０℃まで５℃／分で昇温→２４０℃で３０分間保持
カラム流速： １．５ｍＬ／分
注入口温度： ３００℃
【００５８】
ＴＰＨ、炭化水素、芳香族化合物、並びにＮＳＯおよびアスファルトの分解率を、表３〜表６に、それぞれ示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
【表４】
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
【００６３】
表３のＴＰＨ分解率の結果から明らかなように、栄養源としてパルプ材を添加した実験例１２および１３では、パルプの種類にかかわらず、１５０００ｐｐｍの極めて高濃度の重油を、約２ヶ月間の比較的短期間で効率よく分解できることが確認された（実験例１２で約９３％、実験例１３で約８２％）のに対し、市販のバクテリア添加剤を用いた実験例１５では、約２ヶ月間経過後でもせいぜい約６６％しか分解されなかった。
【００６４】
同様の傾向は、Ｃ重油を構成する各成分についても認められた（表４〜表６を参照）。すなわち、市販のバクテリア添加剤を用いた実験例１５に比べて、Ｓ１３株にパルプ材を添加した実験例１２および１３では、各成分の分解率が上昇し、分解が特に困難であったＮＳＯおよびアスファルトについても、約２ヶ月間経過後で半分以上を分解することができた。
【００６５】
以上の結果より、本発明法は、従来法では短時間の高い分解処理が困難であった高濃度汚石油汚染土壌を十分に浄化できる技術として極めて有用であることが十分実証された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
石油汚染土壌へＳ１３３株（ＮＩＴＥ Ｐ−４６１）を添加することを特徴とする石油汚染土壌の浄化方法。
【請求項２】
さらに、Ｓ１３３株の栄養源、界面活性剤、またはこれらの混合物を添加する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤を、石油汚染土壌に対して０．０５質量％以上、１．０質量％以下添加する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記栄養源は植物材料である請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
Ｓ１３３株（ＮＩＴＥ Ｐ−４６１）を含むことを特徴とする石油汚染土壌の浄化剤。
【請求項６】
Ｓ１３３株（ＮＩＴＥ Ｐ−４６１）。
【請求項１】
石油汚染土壌へＳ１３３株（ＮＩＴＥ Ｐ−４６１）を添加することを特徴とする石油汚染土壌の浄化方法。
【請求項２】
さらに、Ｓ１３３株の栄養源、界面活性剤、またはこれらの混合物を添加する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤を、石油汚染土壌に対して０．０５質量％以上、１．０質量％以下添加する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記栄養源は植物材料である請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
Ｓ１３３株（ＮＩＴＥ Ｐ−４６１）を含むことを特徴とする石油汚染土壌の浄化剤。
【請求項６】
Ｓ１３３株（ＮＩＴＥ Ｐ−４６１）。
【公開番号】特開２００９−１６６０２７（Ｐ２００９−１６６０２７Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２３５２８２（Ｐ２００８−２３５２８２）
【出願日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年７月２０日 日本木材学会発行の「第５７回日本木材学会大会研究発表要旨集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年１０月３１日 第５２回リグニン討論会事務局発行の「第５２回リグニン討論会講演集」に発表
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１２日（２００８．９．１２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年７月２０日 日本木材学会発行の「第５７回日本木材学会大会研究発表要旨集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年１０月３１日 第５２回リグニン討論会事務局発行の「第５２回リグニン討論会講演集」に発表
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【Ｆターム（参考）】
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