石灰化組織における可溶化Ｋｌｏｔｈｏ、ＦＧＦ２３およびＦＧＦＲ複合体形成機構を利用した用途
【課題】硬組織および／または血管の石灰化に共通するシグナル伝達が関連する、石灰化調節剤のスクリーニング方法、石灰化調節剤、ならびに骨の石灰化、血管石灰化およびそれに伴う疾患の病態進展を検査する方法およびその検査キットを提供する。
【解決手段】本発明の第１の態様に係る硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法は、被験化合物の非存在下および存在下での検体において、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３とを接触させる工程と、特異的シグナル伝達が変化する化合物を選択する工程を含む。第２の態様に係る石灰化調節剤は可溶化Klothoを含む複合体形成を抑制または促進する化合物を含有する。第３の態様に係る石灰化検査方法は、可溶化Klothoの濃度等を測定する工程を含む。第４の態様に係る石灰化検査キットは、可溶化Klotho等に結合親和性を有するリガンドを含有する。
【解決手段】本発明の第１の態様に係る硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法は、被験化合物の非存在下および存在下での検体において、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３とを接触させる工程と、特異的シグナル伝達が変化する化合物を選択する工程を含む。第２の態様に係る石灰化調節剤は可溶化Klothoを含む複合体形成を抑制または促進する化合物を含有する。第３の態様に係る石灰化検査方法は、可溶化Klothoの濃度等を測定する工程を含む。第４の態様に係る石灰化検査キットは、可溶化Klotho等に結合親和性を有するリガンドを含有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硬組織および／または血管の石灰化に共通するシグナル伝達が関連する、石灰化調節剤のスクリーニング方法、石灰化調節剤、ならびに骨の石灰化、血管石灰化およびそれらに伴う病態進展を検査する方法およびその検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨疾患、例えば骨粗鬆症は、血管石灰化等の循環系疾患と相関（骨血管相関）することが明らかとなり、骨質量減少によって高い死亡リスクを伴うことも報告されている。このような骨または血管の石灰化が係わる疾患の予防・治療薬としては、カルシウム剤、ビタミンＤ製剤、エストロジェン、イプリフラボン、カルシトニン、ビスフォスフォネート、ビタミンＫ２製剤、リン酸吸着剤またはスタチン等を含むものが挙げられる。しかし、より好ましくは、骨または血管の石灰化に直接的に効果を奏する、メカニズムオリエンテッドな新規治療法、治療剤および予防法の確立が望まれる。
【０００３】
線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）は、遺伝性、腫瘍性くる病／骨軟化症の原因因子として同定されたタンパク質であり（非特許文献１ないし非特許文献３参照）、近年ではリンおよびビタミンＤ代謝を調節する生理的ホルモンとして認識されている。ＦＧＦ２３を含むＦＧＦファミリーに対する生物学的応答は、特異的な細胞表面受容体のチロシンキナーゼ型受容体（ＦＧＦＲ、特にＦＧＦＲ１）への結合を介して行われるが、ＦＧＦ２３のＦＧＦＲに対する親和性は低い。
【０００４】
正常時、ＦＧＦ２３は主として骨芽細胞・骨細胞により分泌され、腎尿細管上皮を標的としてII型ナトリウム―リン共輸送体（ＮａＰｉII）の発現、および２５ヒドロキシビタミンＤ３−１α水酸化酵素の発現を抑制する。従って、過剰なＦＧＦ２３の産生により、リンの再吸収が抑制され、血中１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５Ｄ）濃度の低下に伴う腸管からのリン酸の吸収抑制と相まって、血中リン濃度が低下する。さらに、Ｆｇｆ２３欠損マウスが高リン酸、高ビタミンＤ血症を呈することから、ＦＧＦ２３はリン恒常性の中心的役割を果たすことが明らかとなっている。
【０００５】
また、ＦＧＦ２３と骨、歯または血管の石灰化との関係について、ＦＧＦ２３は骨を含む硬組織の生理的石灰化、および血管等の病態と関連した石灰化を調節することもin vitroで確認されている。具体的には、ＦＧＦ２３は骨および血管の生理的石灰化を抑制することが明らかとなっている（特許文献１、非特許文献１および２参照）。
【０００６】
一方、分子量約１３万のI型膜タンパクをコードするKlothoは、単一の遺伝子の変異によりヒトの多様な老化現象を引き起こすマウスの責任遺伝子として同定された。Klothoは、主として腎尿細管、脳の脈絡膜および副甲状腺の主細胞に発現する。
【０００７】
Klothoは腎臓でのリンの再吸収およびビタミンＤ代謝、副甲状腺での副甲状腺ホルモン産生に関与する。また、細胞内でＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰaseと結合し、細胞外のカルシウム濃度の低下に応答してＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰaseを細胞膜へリクルートする。一方、膜型Klothoの細胞外ドメインが切断されて、この細胞外ドメインが血液中に遊離した可溶化Klotho（以下、ＫＬｅと略す場合がある）は、血液中を循環し、発生に関与する分泌タンパクＷｎｔと結合し、Ｗｎｔシグナルを阻害すること、あるいはＴＲＰＶ５の糖鎖修飾を調節し、カルシウムチャンネルとしての機能を調節することが報告されている。
【０００８】
ＦＧＦ２３および膜型Klothoの関係について、特許文献２および非特許文献３に代表されるように、両者が協調して働くことが報告されている。すなわち、両者を強制発現させたＣＨＯ細胞等において、ＦＧＦ２３、膜型KlothoおよびＦＧＦＲは複合体を形成し、ＦＧＦ２３の特異的シグナルであるＥＲＫのリン酸化亢進またはＥｇｒ−１の発現上昇が確認されている。この細胞において、膜型Klothoの代わりにＫＬｅを強制発現させても同様の結果が得られること、さらに、ＫＬｅを強制発現させたＣＨＯ細胞をヌードマウスに移植した場合、ＦＧＦ２３を過剰発現させたと同様に血清中の１，２５Ｄおよびリン酸濃度が低下することも記載されている。
【０００９】
また、特許文献３には、このようなＫＬｅとＦＧＦ（具体的にはＦＧＦ２３）とを含むポリペプチド（polypeptide）からなる、融合タンパク質（a fusion polypeptide）に係る発明について記載されている（活性断片からなるポリペプチドも含む）。詳細には、当該融合タンパク質を用いることによる、加齢現象に伴う種々の病状やメタボリック病状を処置または予防する方法の発明について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００８−１７７９０号公報
【特許文献２】特開２００６−２４０９９０号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０１９２０８７号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Yoshiko Y., et al., Bone ４０, １５６５−１５７３, ２００７
【非特許文献２】Wang H., et al., J Bone Miner Res ２３, ９３９−９４８, ２００８
【非特許文献３】Urakawa I., et al., Nature ４４４, ７７０−７７４, ２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前述のように、特許文献２および非特許文献３において、膜型KlothoあるいはＫＬｅは、ＦＧＦＲをＦＧＦ２３特異的受容体に転換させると記載されている。ＦＧＦ２３が骨芽細胞・骨細胞により分泌され、血流を介して腎、副甲状腺で作用するのは、これらの組織に膜型Klothoが局在するためと説明されている。しかし、少なくとも、腎では、膜型Klothoは遠位尿細管上皮に局在しているため、ＦＧＦ２３の作用部位である近位尿細管において膜型Klotho、ＦＧＦＲおよびＦＧＦ２３と複合体を形成しているとは考え難く、この問題は現在も解決していない。一方、ごく最近、膜型Klothoは近位尿細管にわずかに発現し、ＦＧＦ２３とは無関係に自身が保有するβ−グルクロニダーゼ活性によりＮａＰｉIIａの細胞内輸送と分解に関与し、リンの再吸収を抑制することが報告された（Klotho: a novel phosphaturic substance acting as an autocrine enzyme in the renal proximal tubule. Hu MC, Shi M, Zhang J, Pastor J, Nakatani T, Lanske B, Shawkat Razzaque M, Rosenblatt KP, Baum MG, Kuro-O M, Moe OW. FASEB J. 2010 May 21. http://www.fasebj.org/cgi/rapidpdf/fj.10-154765v2.pdf [Epub ahead of print]）。
【００１３】
このように、腎臓でのKlothoの作用には、必ずしもＦＧＦ２３が関与するとは言い難い。また、特許文献２および特許文献３では、ＦＧＦ２３とＫＬｅの二者が複合体を形成するとの記載があるが、生体で、かつ筋細胞以外においてこの二者が複合体を形成している証拠はない。また、例えばこのような複合体を生体に用いた場合を考慮すると、生体に広く分布するＦＧＦＲと非特異的に結合し、前述のＦＧＦ２３の特性を説明できない。実際に、両者は複合体を形成しないとする最近の論文も見られる（Goetz R, Nakada Y, Hu MC, Kurosu H, Wang L, Nakatani T, Shi M, Eliseenkova AV, Razzaque MS, Moe OW, Kuro-o M, Mohammadi M. Proc Natl Acad Sci U S A. ２０１０ Jan ５；１０７（１）：４０７−４１２）。
【００１４】
一方、前述したように、ＦＧＦ２３が硬組織および／または血管の石灰化の調節に関与していることは確認されているが（特許文献１）、詳細な作用機構に関しては、未だ不明な点が多い。Klotho変異マウス（ｋｌ／ｋｌマウス）においては、骨、歯に異常が見られるが、これらの組織にはKlothoが発現しないことが確認されている。そこで、硬組織および／または血管の石灰化に直接的に効果を奏する新規治療法、治療剤および予防法の確立の為には、硬組織および／または血管におけるＦＧＦ２３の作用機構をより具体的に解明し、ＦＧＦ２３による石灰化抑制に関与し、調節することができる化合物の発見が望まれる。
【００１５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、硬組織および／または血管の石灰化に共通したシグナルが関連する、石灰化調節剤のスクリーニング方法、石灰化調節剤、ならびに、骨の石灰化度、血管石灰化およびそれらに伴う病態進展を検査する方法およびその検査キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成する為、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下の発見を見出すに到った。
（１）ＫＬｅは、Ｏｂｃ細胞（実施例参照）においてＦＧＦ２３およびＦＧＦＲと機能的な複合体を形成し、Ｏｂｃ細胞における特異的シグナル伝達（シグナル伝達に伴うＦＧＦ２３による骨の石灰化抑制を含む）に不可欠である。
（２）（１）の作用は骨に特異的であり、腎臓においては見られない。
（３）（１）の作用は血管平滑筋の石灰化にも見られる。
【００１７】
すなわち、本発明の第１の態様に係る硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法は、被験化合物の非存在下および存在下での検体において、少なくとも、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３とを接触させる工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体におけるＦＧＦ２３特異的シグナル伝達と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体におけるＦＧＦ２３特異的シグナル伝達が変化する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする。
【００１８】
好ましくは、前記特異的シグナル伝達の変化は、ＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化またはＥｇｒ−１の発現量を指標とすることを特徴とする。
【００１９】
または、被験化合物の非存在下および存在下での、検体における、可溶化Klothoの濃度を測定する工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体における前記可溶化Klothoの濃度と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体における前記可溶化Klothoの濃度が増減する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする。
【００２０】
または、被験化合物の非存在下および存在下での検体における可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成を測定する工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体における前記複合体形成と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体における前記複合体形成が増減する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする。
【００２１】
さらに好ましくは、前記石灰化調節剤のスクリーニングは、in vivoで実施することを特徴とする。
【００２２】
本発明の第２の態様に係る硬組織および／または血管の石灰化調節剤は、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成を抑制または促進する化合物を含有することを特徴とする。
【００２３】
好ましくは、前記化合物は、可溶化Klothoであることを特徴とする。
【００２４】
または、好ましくは、前記化合物は、可溶化Klotho、ＦＧＦＲ、または、前記可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体に結合親和性を有するリガンドであることを特徴とする。
【００２５】
さらに好ましくは、前記リガンドは抗体であることを特徴とする。
【００２６】
本発明の第３の態様に係る硬組織および／または血管の石灰化検査方法は、検体における、可溶化Klothoの濃度、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成、または、前記複合体形成に伴うＦＧＦ特異的シグナル伝達を測定する工程を含むことを特徴とする。
【００２７】
好ましくは、前記検体は、動物の血液、血漿、血清、骨髄、骨の組織もしくは細胞、または、血管の組織もしくは細胞であることを特徴とする。
【００２８】
さらに好ましくは、前記動物は、ヒトであることを特徴とする。
【００２９】
本発明の第４の態様に係る硬組織および／または血管の石灰化検査キットは、可溶化Klotho、または、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体に結合親和性を有するリガンドを含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の第１の態様に係る石灰化調節剤のスクリーニング方法によれば、硬組織および／または血管での石灰化を促進または抑制する、新たな石灰化調節剤をスクリーニングすることができる。本発明の第２の態様に係る石灰化調節剤によれば、硬組織および／または血管での石灰化を抑制または促進することができる。本発明の第３および第４の態様に係る、石灰化検査方法および石灰化検査キットによれば、硬組織および／または血管での石灰化を検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１に係る免疫沈降およびイムノブロッティングの結果の様子を示す図である。
【図２】実施例２に係るＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルにおけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果のデータを示す図である。
【図３】実施例２に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。
【図４】実施例３に係るＡＬＰ／von Kossa染色でのｒＫＬｅ添加による石灰化指標の結果のデータを示す図である。
【図５】実施例３に係るｒＫＬｅのウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。
【図６】実施例３に係るＡＬＰ／von Kossa染色でのｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３添加による石灰化指標の結果のデータを示す図である。
【図７】実施例４に係るＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルにおけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果のデータを示す図である。
【図８】実施例４に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。
【図９】実施例５に係るカルセインで二重ラベルした頭蓋骨のプラスチック切片の蛍光顕微鏡での様子を示す図である。
【図１０】図９の蛍光顕微鏡での様子におけるラベル間隔の結果のデータを示す図である。
【図１１】実施例５に係るＨ＆Ｅ染色をした頭蓋骨のパラフィン切片の顕微鏡での様子を示す図である。
【図１２】図１１の顕微鏡での様子における骨芽細胞の数のデータを示す図である。
【図１３】図１１の顕微鏡での様子における骨小腔の数のデータを示す図である。
【図１４】図１１の顕微鏡での様子における骨の厚さのデータを示す図である。
【図１５】実施例５に係るトルイジンブルー／von Kossa染色した頭蓋骨のプラスチック切片の顕微鏡での様子を示す図である。
【図１６】図１５の顕微鏡での様子における類骨の厚みのデータを示す図である。
【図１７】実施例５に係る電子プローブマイクロアナライザーの結果を示す図である。
【図１８】実施例６に係るカルシウム量測定の結果のデータを示す図である。
【図１９】実施例７に係るｋｌ／ｋｌマウスの大動脈の実体顕微鏡での様子を示す図である。
【図２０】実施例８に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。
【図２１】実施例９に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片のアリザリンレッド／トルイジンブルー染色の様子を示す図である。
【図２２】実施例９に係るｋｌ／ｋｌマウスおよび野生型マウスのアリザリンレッド染色範囲結果のデータを示す図である。
【図２３】実施例１０に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片の免疫染色の様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、ヒト（Homo sapiens）の「ＦＧＦ２３」、「ＦＧＦＲ１」および「Klotho」は、それぞれGenBankにおいて、アクセッション番号ＡＡＧ０９９１７、ＡＡＨ１５０３５およびＢＡＡ２３３８２に登録されている。
【００３３】
（硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法）
本発明の実施の形態１は、硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法に関する。まず、被験化合物の非存在下および存在下での検体において、可溶化Klotho（ＫＬｅ）とＦＧＦ２３とＦＧＦＲとを接触させる工程と、被験化合物の非存在下での検体における特異的シグナル伝達と比較して、被験化合物の存在下での検体における特異的シグナル伝達が変化する化合物を選択する工程を含む方法が挙げられる。好ましくは、特異的シグナル伝達の変化は、ＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化またはＥｇｒ−１の発現量を指標とすることができる（実施例参照）。
【００３４】
また、被験化合物の非存在下および存在下での検体におけるＫＬｅの濃度を測定する工程と、被験化合物の非存在下での検体におけるＫＬｅの濃度と比較して、被験化合物の存在下での検体におけるＫＬｅの濃度が増減する化合物を選択する工程とを含む方法でもよい。その他、検体において、ＫＬｅとＦＧＦ２３とＦＧＦＲとの複合体（以下、「ＫＬｅを含む複合体」または「複合体」）の形成を測定および比較しても構わない。この場合、直接ＫＬｅを含む複合体形成の程度、有無または濃度等を比較することが可能である。なお、これらのスクリーニングはin vivoにおいて実施する方がより好ましい。
【００３５】
本発明において「可溶化Klotho（ＫＬｅ）」は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコまたはイヌ等の哺乳動物における、Klothoの血液中に循環する細胞外ドメインの部分を指す。このうち好ましくは、ヒトおよびヒトのＫＬｅのアミノ酸配列と相同性が高い非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、サルまたはウサギ等）のＫＬｅを指す。「相同性が高い」とは、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有することを示す。最も好ましくは、ヒトのＫＬｅを指す。例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号１に記載のアミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、かつＦＧＦ２３およびＦＧＦＲと複合体を形成して石灰化を抑制させる機能を有するタンパク質、または、当該機能を有するペプチド断片が挙げられる。このように、本発明において「可溶化Klotho（ＫＬｅ）」とは、これら全てを含有した意味として使用される。
【００３６】
本発明において「調節」とは、石灰化を正に制御する「促進」または「活性化」等の他、負に制御する「抑制」または「阻害」等も含めることができる。「正」に制御する例として、ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴う特異的シグナル伝達の活性化による石灰化の抑制を示す事ができる。また、「負」に制御する例として、ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴う特異的シグナル伝達の抑制による石灰化の促進を示す事ができる。なお、ＫＬｅを含む複合体形成の増大または低下は、例えば、硬組織および／または血管におけるＫＬｅのＦＧＦＲへの結合促進または阻害を挙げることができる。
【００３７】
本発明において「検体」とは、ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴うＦＧＦ特異的シグナル伝達を測定することができ、当業者が利用しうる対象試料全てを意味する。例えば、in vivoまたはin vitroでの生体試料が挙げられる。特に、本実施の形態１に係るスクリーニング方法において最も好ましく適している検体は、in vivoでの対象となる非ヒト動物を指す。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコまたはイヌ等を挙げることができる。
【００３８】
本発明において「硬組織」とは、生体硬組織を意味し、例えば、頭蓋および体幹の骨格を形成する骨組織、歯周組織を構成する歯槽骨およびセメント質、あるいは象牙質（これらを構成する細胞等も含む）を示す。最も好ましくは、哺乳動物の骨組織である。さらに好ましくは、ヒトと遺伝子の相同性が高い非ヒト哺乳動物（例えばラット、マウス、サルまたはウサギ等）の骨組織である。
【００３９】
また、本発明において「被験化合物」（「化合物」）とは、ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴う特異的シグナル伝達の増減を評価することのできるあらゆる物質を利用することができる。例えば、低分子化合物、核酸またはポリペプチド等が挙げられる。低分子化合物、核酸またはポリペプチド等は、天然物から抽出および精製されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。また、精製されたものに限らず、例えば、未精製の細胞抽出液等であっても被験化合物として使用することができる。また、新規な物質に限らず、公知の物質またはその改良物であってもよい。例えば、既存の治療薬もしくは予防薬またはその誘導体において、本実施の形態１のスクリーニング方法により評価をすることも可能である。
【００４０】
本発明において、「ＦＧＦ２３」（線維芽細胞増殖因子２３）とは、ヒトＦＧＦ２３タンパク質だけでなく、ラット、マウス、サルまたはウサギ等のヒトＦＧＦ２３のアミノ酸配列と相同性が高い非ヒト哺乳動物のＦＧＦ２３タンパク質、あるいはこれらの活性領域を含むペプチド断片も含有する。「相同性が高い」の意味は、前述と同様である。
【００４１】
本発明において、「ＦＧＦＲ」についても同様に、ヒトＦＧＦＲのアミノ酸配列と相同性が高い非ヒト哺乳動物のＦＧＦＲも含有する。なお、ＦＧＦ２３への結合が確認されているＦＧＦＲ１、３および４を指すが（Kurosu H, Ogawa Y, Miyoshi M, Yamamoto M, Nandi A, Rosenblatt KP, Baum MG, Schiavi S, Hu MC, Moe OW, Kuro-o M. J Biol Chem. ２００６ Mar １０；２８１（１０）：６１２０−６１２３.参照）、最も好ましくはＦＧＦＲ１である（非特許文献３（Urakawa I., et al., Nature ４４４, ７７０−７７４, ２００６）参照）。
【００４２】
検体におけるＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴うＦＧＦ２３特異的シグナル伝達を測定および比較する具体的な方法については、当該技術分野の当業者に公知であるこれらを測定および比較するあらゆる方法を利用することができる。
【００４３】
詳細には、例えば、まず、前述したような非ヒト哺乳動物に被験化合物を投与または注射等を行い、当該哺乳動物の血液等におけるＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成を測定することができる。また、ＦＧＦＲを発現している硬組織または硬組織の一部に、直接ＦＧＦ２３およびＫＬｅを接触させ、当該硬組織における複合体形成およびそれに伴うＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化あるいはＥｇｒ−１の発現レベルを測定することもできる。その他、より容易に測定およびスクリーニングできるよう、検体として、骨芽細胞・骨細胞または血管平滑筋細胞に、ＫＬｅ、ＦＧＦ２３あるいはＦＧＦＲを強制発現させた実験系を構築してもよい。このような細胞の構成・ＤＮＡの導入は、当該技術分野の当業者にとっては容易であり、例えば、ＤＮＡ導入用プラスミドもしくはウイルスベクターを用いた方法、エレクトロポーレーション、リポフェクションまたはマイクロインジェクション等が挙げられる。このように、本実施の形態１に係るスクリーニング方法は、in vivoで行うことも、in vitroで行うことも可能である。
【００４４】
これらの血液、硬組織または細胞等におけるＫＬｅ、ＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴うＦＧＦ２３特異的シグナル伝達の測定については、例えば、分子間相互分析、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学染色、免疫蛍光またはフローサイトメトリー等の公知のタンパク質検出、定量方法を利用することで、当業者であれば容易に測定可能である。
【００４５】
測定された被験化合物存在下のＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体の形成あるいはそれに伴うＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化またはＥｇｒ−１の発現が、被験化合物の非存在下と比較して増加または減少している場合、当該被験化合物は、硬組織および／または血管の石灰化をそれぞれ抑制または促進する石灰化調節剤となる可能性が高い。
【００４６】
このようにスクリーニングされた石灰化を抑制する硬組織および／または血管の石灰化調節剤は、石灰化が促進されている疾患・状態として変形性関節症、異所性石灰化、動脈硬化症または腎不全における血管石灰化の予防・治療の手段に利用できる。石灰化を促進する石灰化調節剤の場合、石灰化が阻害または抑制されている疾患・状態として、骨粗鬆症、くる病または骨軟化症の予防・治療剤として利用できる。さらに、その他の硬組織疾患または再生医療等の分野での利用も考えられる。
【００４７】
（硬組織および／または血管の石灰化調節剤）
ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体ならびにその下流のＦＧＦ２３特異的シグナル伝達を利用した石灰化調節剤のスクリーニング方法について詳細に述べたが、ＫＬｅそれ自体またはＫＬｅを含む複合体形成に関連する化合物等を有効成分として、石灰化の調節に利用できる可能性もある。そこで、実施の形態２は、硬組織および／または血管の石灰化調節剤について述べる。
【００４８】
具体的には、硬組織および／または血管の石灰化を抑制する調節剤は、ＫＬｅ等、ＫＬｅを含む複合体形成を促進させる化合物を有効成分として含有する。また、硬組織の石灰化を促進する調節剤は、ＫＬｅ、ＫＬｅを含む複合体またはＦＧＦＲに結合親和性を有するリガンドを含有する。好ましくは、当該リガンドは、抗体である。さらに、ＫＬｅを含む複合体形成に伴う特異的シグナル伝達の、他の阻害・促進剤等も同時に有効成分として含有することによって、より有効な石灰化調節剤となることも考えられる。例えば、Ｕ０１２６などのＥＲＫシグナルの阻害剤は容易に入手可能であり、このようなＫＬｅを含む複合体形成に伴う特異的シグナル伝達の他の調節剤を含有しても構わない。
【００４９】
ＫＬｅは容易に入手、製造または精製することができる。ＫＬｅは実施例にて示す通り、例えばＲ＆Ｄ Systemsにおいて容易に購入、入手することができる。また、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質・ペプチドを公知のタンパク質・ペプチド合成法などを用いて製造することができる（例えば、固相合成法、液相合成法等を含む）。また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶等を組み合わせてタンパク質・ペプチドを精製単離することができる。
【００５０】
本発明において、「抗体」とはモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも構わず、ＫＬｅ、ＦＧＦＲまたはＫＬｅを含む複合体に特異的に結合するものであれば特に制限されない。ＫＬｅの複合体形成を促進する抗体、あるいはＫＬｅを含む複合体形成を促進する抗体もこれに含まれる。すなわち、アゴニスト抗体でもアンタゴニスト抗体でも、いずれの抗体でも構わない。また、「抗体」のうち、ＫＬｅの「中和抗体」とは、ＫＬｅによる特異的シグナル伝達の機能を阻害する抗体、例えばＦＧＦＲおよびＦＧＦ２３との複合体形成を阻害する抗体等のことを意味する。なお、実施例において示すが、例えば具体的には、抗Klothoモノクローナル抗体が挙げられる。ＦＧＦＲの「中和抗体」についても同様に、ＦＧＦＲによる特異的シグナル伝達の機能を阻害する抗体のことを意味する。ＫＬｅを含む複合体の「中和抗体」についても同様に、ＫＬｅを含む複合体によって起こされる特異的シグナル伝達の機能を阻害する抗体等のことを意味する。
【００５１】
抗体の製造方法は、すでに当業者にとっては周知であり、本抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. （１９８３） Publish. John Wiley and Sons. Section １１．１２〜１１．１３、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York １９８９）。
【００５２】
実施の形態２に係る硬組織および／または血管の石灰化を抑制する調節剤によると、石灰化が促進されている疾患・状態である変形性関節症、異所性石灰化または動脈硬化症における血管石灰化の病態進展阻止の手段として利用できる。当該調節剤は、直接患者に投与したり、これらのその他の成分も含有する化合物を構成し、これを患者に投与することもできる。投与方法としては、経口、静脈内、動脈内または皮下注射等の公知の方法を用いることができる。
【００５３】
また、硬組織の石灰化を促進する調節剤によると、骨粗鬆症、くる病または骨軟化症の予防・治療の手段として利用できる。投与方法等は前述した石灰化を抑制する調節剤と同様であるが、さらに、注射等により特定の部位（例えば、骨が減少または過剰形成している部位）に直接投与することも考えられる。
【００５４】
（硬組織および／または血管の石灰化検査方法）
前述した通り、ＫＬｅはＦＧＦ２３特異的シグナル伝達による石灰化抑制に必須の因子である為、硬組織の石灰化抑制は、硬組織、血管あるいは血中ＫＬｅ（およびＦＧＦ２３（特許文献１、非特許文献１および２参照））濃度に強く影響されると考えられる。
【００５５】
そこで、実施の形態３として、検体におけるＫＬｅの濃度を測定する工程を含むことを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化検査方法を挙げることができる。なお、ＫＬｅの濃度だけでなく、ＫＬｅを含む複合体形成あるいはそれに伴うＦＧＦ２３特異的シグナル伝達を測定することによっても石灰化の程度を推定することができる。
【００５６】
なお、前述のとおりＫＬｅは血液中を循環する為、測定工程は、血液、血漿、血清、骨髄、骨の組織もしくは細胞、または、血管の組織もしくは細胞におけるＫＬｅの濃度、ＫＬｅを含む複合体形成あるいはそれに伴うＦＧＦ２３特異的シグナル伝達を測定することがより簡便で好ましい。測定方法は、当該分野において当業者に公知の方法である、あらゆる方法を利用することができる。例えば、ＫＬｅの濃度またはＫＬｅを含む複合体形成を測定すればよい。例えば、血液中のＫＬｅの濃度を測定する場合は、免疫沈降、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫組織化学染色、免疫蛍光またはフローサイトメトリー等の方法が挙げられる。複合体形成に伴うＦＧＦ２３特異的シグナル伝達の測定は、前述と同様に、ＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化またはＥｇｒ−１の発現量の測定によって可能である。
【００５７】
測定した血液中などのＫＬｅの濃度は、例えば予め測定・平均を算出しておいた正常値と比較することによって、石灰化の程度およびそれに伴う病態の進展、有効物質のスクリーニングを評価することが可能であると考えられる。また、本実施の形態４に係る石灰化検査方法においてヒトの血液、血漿、血清または骨髄等を検体とすることで、変形性関節症、異所性石灰化もしくは動脈硬化症における血管石灰化の病態把握、モニタリング、または、骨粗鬆症、くる病もしくは骨軟化症における骨の石灰化不全の病態把握、モニタリングとなる可能性が高い。
【００５８】
（硬組織および／または血管の石灰化検査キット）
実施の形態３において述べた通り、血液中のＫＬｅの濃度およびＫＬｅを含む複合体形成の測定によって、硬組織および／または血管の石灰化度の程度の目安となると考えられる。そこで、実施の形態４として、実施の形態３で述べた石灰化検査方法に使用する為の、ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体に結合親和性を有するリガンドを含有する、硬組織および／または血管の石灰化検査キットを挙げることができる。
【００５９】
リガンドとは、測定対象物（ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体）に特異的に結合する物質を意味し、例えば前述したようなＫＬｅまたは複合体の抗体（Klothoの抗体でも一部可能）および該抗体に対する二次抗体を指す。その他、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応器材および／または石灰化不全の程度を比較、評価する説明書等が含まれても構わない。これらの使用方法については実施の形態３において述べた方法と同様である。
【００６０】
他に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語等は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様のまたは等しい方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができる。本明細書中に言及するすべての公開物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照として全体が組み入れられる。相反の場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法および具体例は単に例示的なものであり、限定することを意図していない。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。なお、実施例において使用している試薬について、特に記載のない限り、Sigma-Aldrichのものを使用した。Klotho変異マウス（以下、ｋｌ／ｋｌマウス）は日本クレアより入手し、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびWistarラットは日本チャールズリバーより入手した。
【００６２】
（実施例１）
本実施例１では、骨芽細胞／骨細胞における、ＫＬｅとＦＧＦ２３およびＦＧＦＲ１との複合体形成に係る実施例について詳細に説明する。
【００６３】
まず、実施例１ないし実施例３において使用した、成熟骨芽細胞／骨細胞（Ｏｂｃ細胞）、および、該Ｏｂｃ細胞の育成、培養方法について説明する。胎生２１日齢胎仔ラット由来の頭蓋冠から細胞を分離し（Yoshiko Y, et al., Endocrinology １４４, ４１３４−４１４３, ２００３参照）、当該頭蓋冠細胞を１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清、Fetal Bovine Serum）（HyClone）および５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含むα−ＭＥＭ（Modified Essential Medium）培地によって培養した。培養期間は１０日、常法どおり、３７℃、湿式５％ＣＯ２気相下で培養した。当該頭蓋冠細胞が類骨様のノジュール（結節）を形成した後に、コラゲナーゼ（タイプＩ）処理により、ノジュールから細胞を選択的に取り出した。その後、取り出した細胞を前述の条件で培養し、Ｏｂｃ細胞として用いた。なお、成熟した骨芽細胞・骨細胞としての特徴を確認するため、Ｏｃｎ（osteocalcin）、Ｄｍｐ−１（dentin matrix protein-１）およびＳｏｓｔの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）法によって測定した（図示せず）。
【００６４】
本実施例１においては、Ｏｂｃ細胞培養を、０．１％ＦＢＳの血清欠乏性の条件において培養したものを使用した。さらに、当該細胞を、遺伝子組み換えＫＬｅ（ｒＫＬｅ）（≦５００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Systems））（配列番号２に記載）および遺伝子組み換えＦＧＦ２３（ｒＦＧＦ２３）（≦５００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Systems））のいずれも含む条件、ｒＫＬｅのみ含む条件、ｒＦＧＦ２３のみ含む条件、または、いずれも含まない条件のいずれかにおいて、１５分間培養した。
【００６５】
このように培養したそれぞれの細胞を、１％Igepal ＣＡ６３０および５０ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）によって可溶化した。抗Klothoモノクローナル抗体（αKlotho Ｍａｂ）（Calbiochem）または抗ＦＧＦＲ１モノクローナル抗体（αＦＧＦＲ１ Ｍａｂ）（Abcam）による免疫沈降（ＩＰ）、および、αＦＧＦＲ１ Ｍａｂまたは抗ＦＧＦ２３ポリクローナル抗体（αＦＧＦ２３）（Ｒ＆Ｄ Systems）によるイムノブロッティング（ＩＢ）を行った。免疫沈降では、可溶化した細胞抽出液を磁気マイクロビーズと結合したプロテインＧ（μＭＡＣＳプロテインＧマイクロビーズ、Miltenyi Biotec）と一緒にインキュベートした。その際、αKlotho ＭａｂまたはαＦＧＦＲ１ Ｍａｂのいずれかを添加し、免疫複合体を得た（ＭＡＣＳ（登録商標）Separators User Manual、Miltenyi Biotec）。その後、このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis）に供し、αＦＧＦＲ１ ＭａｂまたはαＦＧＦ２３（Santa Cruz）でのイムノブロッティング（ＩＢ）を行い、化学発光によりシグナルを検出した。
【００６６】
図１は、実施例１に係る免疫沈降およびイムノブロッティングの結果の様子を示す図である。図１に示すように、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ２３は、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３の両方の存在下においてのみ、それぞれKlothoおよびＦＧＦＲ１と複合体を形成した。これらの結果から、ＫＬｅとＦＧＦ２３およびＦＧＦＲ１とが、骨芽細胞／骨細胞において複合体を形成することが明らかとなった。
【００６７】
（実施例２）
本実施例２では、Ｏｂｃ細胞でのＦＧＦ２３特異的シグナル伝達とＫＬｅとの相関に係る実施例について詳細に説明する。
【００６８】
Ｅｇｒ−１は、ＦＧＦ２３特異的シグナル伝達により発現が促進される遺伝子である（非特許文献３参照）。そこで、本発明者らは、Ｏｂｃ細胞におけるＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって計測した。
【００６９】
細胞は、実施例１において述べた培養条件と同様の条件において、３０分間培養したものを使用した。まず、TRIzol試薬（Invitrogen）を使用して、細胞の全ＲＮＡを調製した。調整したＲＮＡを用い、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った（Y.Yoshiko, G.A.Candeliere, N.Maeda, J.E. Aubin, Mol Cell Biol ２７４, ４６５−４４７４, ２００７、および、H.Wang, Y.Yoshiko, R.Yamamoto, T.Minamizaki, K.Kozai, K.Tanne, J.E. Aubin, N.Maeda, J Bone Miner Res ２３, ９３９−９４８, ２００８参照）。内部標準としてはリボソームタンパクＬ３２を使用した。なお、Ｅｇｒ−１のフォワードプライマーは配列番号３に記載のものを、リバースプライマーは配列番号４に記載のものを使用し、Ｌ３２のフォワードプライマーは配列番号５に記載のものを、リバースプライマーは配列番号６に記載のものを使用した。
【００７０】
図２は、実施例２に係るＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルにおけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果のデータを示す図である。なお、溶媒のみ（−）と比較して有意差がある。図２では、＊＊（有意水準）：ｐ＜０．０１であり、ｎ＝４である。
【００７１】
一方、ＥＲＫ１／２のリン酸化についても、ＦＧＦ２３特異的シグナル伝達の指標となっている（非特許文献３参照）。そこで、本発明者らはＥＲＫ１／２活性を調べる為、ウェスタンブロッティングを行った。
【００７２】
細胞は、実施例１において述べた培養と同条件で５〜３０分間処理した後、リン酸化阻害剤（Phosphatase Inhibitor Cocktail（ナカライテスク））を添加した細胞抽出液（１００ ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Nonidet Ｐ−４０、１ｍＭ phenylmethylsulfonylfluoride、Complete Protease Inhibitor Cocktail（Roche Diagnostics）を含む５０ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で細胞を可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティングおよび化学発光検出を行った。一次抗体には、ＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐ−ＥＲＫ１／２）を使用した。
【００７３】
図３は、実施例２に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。図３に示すように、ｒＦＧＦ２３およびｒＫＬｅのいずれも含む条件において、かつ１０分間処理したものについてＥＲＫ１／２のリン酸化が検出された。このように、図２および図３のいずれの結果でも、ｒＦＧＦ２３およびｒＫＬｅが存在する場合のみ、Ｅｇｒ−１のｍＲＮＡレベルの増加、ＥＲＫ１／２の活性化が確認された。
【００７４】
これらの結果から、Ｏｂｃ細胞において、ＫＬｅとＦＧＦ２３とＦＧＦＲとが結合した複合体がＦＧＦ２３特異的シグナル伝達を促進すると考えられた。
【００７５】
（実施例３）
本実施例３では、Ｏｂｃ細胞でのＦＧＦ２３特異的シグナル伝達による石灰化不全と、ＫＬｅとの相関に係る実施例について詳細に説明する。
【００７６】
本発明者らは、ＫＬｅとＯｂｃ細胞でのＦＧＦ２３特異的シグナル伝達による石灰化抑制との相関を確認するため、骨芽細胞のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性と石灰化を検出するvon Kossa染色を行った。なお、本発明者らにより、１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５Ｄ）はＦＧＦ２３の発現を強力に促進することが確認されている為、ｒＦＧＦ２３だけでなく１０ｎＭの１，２５Ｄを添加して培養したものについても調べた。ＦＢＳにはＫＬｅが含まれていることが確認された為（図示せず、ウェスタンブロッティングにおいて確認）、前述のμＭＡＣＳプロテインＧマイクロビーズおよびαKlotho ＭａｂによってＦＢＳからＫＬｅを取り除いたものを５％となるように培養液に添加した。ｒＫＬｅは回復実験に使用した。培養は試薬添加後３６時間後に終了し、ＰＢＳで洗浄、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した後染色を施した。ｒＦＧＦ２３を添加した群は、培養上清（conditioned media）を回収し、添加したｒＫＬｅのレベルをウェスタンブロッティングにより確認した。なお、石灰化を誘導するため３ｍＭ β−グリセロリン酸を添加した。その後、実体顕微鏡下でＡＬＰ陽性の石灰化ノジュールの数を計測した。数値は陰性対照（溶媒のみ）を１００として表した。
【００７７】
図４は、実施例３に係るＡＬＰ／von Kossa染色でのｒＫＬｅ添加による石灰化指標の結果のデータを示す図である。なお、溶媒のみ（−）と比較して有意差がある。図４では、＊（有意水準）：ｐ＜０．０５であり、＊＊（有意水準）：ｐ＜０．０１であり、ｎ＝４である。図４の石灰化指標（Mineralized foci）に示す通り、１，２５ＤおよびｒＦＧＦ２３のいずれも、ｒＫＬｅを添加していないものはコントロールと比較して石灰化が抑制されず、むしろ促進している。しかし、ｒＫＬｅを添加することによって再び石灰化抑制の状態に戻っている。図５は、実施例３に係るｒＫＬｅのウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。図５に示すように、培養上清のｒＫＬｅ濃度は、図４に示した石灰化抑制作用の濃度依存性と一致していた。これら図４および図５の結果から、ｒＫＬｅ濃度に石灰化の程度が依存していることが示唆される。
【００７８】
さらに、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３による石灰化抑制とＦＧＦ２３特異的シグナルの相関を確認した。実施例１で述べた方法と同様の方法で、０．１％ＦＢＳの血清欠乏性の条件において培養して得たＯｂｃ細胞を、ＭＥＫ１／２阻害剤であるＵ０１２６を１０μＭまたは溶媒のみで２時間前処理を行った。洗浄後、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３または溶媒のみを添加し、３６時間後に前述同様ＡＬＰ／von Kossa染色を施した。ＦＧＦＲ中和抗体（αＦＧＦＲ）２μｇ／ｍｌ（CHEMICON）あるいはその溶媒のみ（陰性対照）については、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３を添加する際に加えた。さらに、前述同様、βグリセロリン酸もｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３と同時に添加した。
【００７９】
図６は、実施例３に係るＡＬＰ／von Kossa染色でのｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３添加による石灰化指標の結果のデータを示す図である。なお、溶媒のみ（−）と比較して有意差がある。図６では、＊＊（有意水準）：ｐ＜０．０１であり、ｎ＝４である。図６に示すとおり、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３による石灰化抑制は、ＦＧＦＲ中和抗体あるいはＵ０１２６によって大部分が回復していることにより、ＫＬｅを含む複合体形成に基づくシグナル伝達が、石灰化抑制に強く関与することが明らかとなった。従って、これら自身はＫＬｅを含む複合体形成に基づく石灰化抑制の治療剤として有効である。また、ＫＬｅは石灰化を抑制する調節剤として、ＫＬｅおよびＫＬｅを含む複合体の中和抗体となるものは石灰化を促進する調節剤として有効であることが示唆される。
【００８０】
本実施例３、および実施例１ならびに実施例２の結果から、ＫＬｅは、Ｏｂｃ細胞において、ＦＧＦ２３およびＦＧＦＲと機能的な複合体を形成し、Ｏｂｃ細胞におけるＦＧＦ２３特異的シグナル伝達（ＦＧＦ２３による骨の石灰化不全を含む）に不可欠であるということが確認された。なお、当該実施例においてＫＬｅと反応するＷｎｔおよびＴＲＰＶ５が影響している可能性があるが、Ｗｎｔについては同様にＡＬＰ／von Kossa染色を行い影響していないことを確認し（図示せず）、ＴＲＰＶ５は骨に存在しないため、影響することはない。
【００８１】
（実施例４）
本実施例４では、骨および腎臓での、ＦＧＦ２３特異的シグナル伝達ならびに石灰化不全とＫＬｅとの相関に係る実施例について詳細に説明する。
【００８２】
前述した実施例で示したＫＬｅの作用が、生体でも見られるか否かを確かめる為、ｒＫＬｅをKlothoを欠如したKlotho変異マウス（ｋｌ／ｋｌマウス）に投与した。なお、本発明者らにより、ＷＴマウス血清と比較すると、ｋｌ／ｋｌマウス血清は、リン酸、カルシウム、１，２５ＤおよびＦＧＦ２３の濃度がいずれも著しく高い値となっていることが確認されている（図示せず、１，２５ＤはＲＩＡキット（ＴＦＢ）、ＦＧＦ２３の濃度の測定はＦＧＦ２３ ＥＬＩＳＡキット（カイノス）により行った。リン酸およびカルシウムはそれぞれホスファＣ−テストワコー、カルシウムＣ−テストワコー（いずれも和光純薬工業）により測定した。このように、ｋｌ／ｋｌマウス血中ＦＧＦ２３濃度が極めて高値であるが（その原因は不明）、Klothoが欠損している為、ＦＧＦ２３は作用しないと推定される。
【００８３】
投与は生後１０日目の雄ｋｌ／ｋｌマウス頭蓋冠皮下に１０μｇを０．３％アテロコラーゲン（高研）と混合して３日間隔で注射し、生後２２日にサンプルを回収した。サンプル回収２日前とその６日前の２回に分けてカルセイン１０ｍｇ／ｋｇ／１回を腹腔注射した。まず、頭頂骨および腎臓から全ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルを計測した。ＲＴ−ＰＣＲのサンプルにおいて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのプライマー、その他詳細な方法については前述した実施例２と同様である。
【００８４】
図７は、実施例４に係るＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルにおけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果のデータを示す図である。頭頂骨（Bone）については、野生型マウス（ＷＴ）のｒＫＬｅを投与しないものについても調べた。なお、ｒＫＬｅを投与していないｋｌ／ｋｌマウスの骨のデータと比較して有意差がある。図７では、＊（有意水準）：ｐ＜０．０５であり、ｎ＝９である。図７に示すように、ｋｌ／ｋｌマウスでの骨においては、ｒＫＬｅを投与するとＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルが上昇する。しかし、同マウスの腎臓（Kidney）においては、ｒＫＬｅの投与によってＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルは、ほとんど変化していない。
【００８５】
さらに実施例２と同様にＥＲＫ１／２活性を調べる為、ウェスタンブロッティングも行った。サンプルに用いるマウスは前述したものと同様の投与を行ったｋｌ／ｋｌマウスを使用し、当該マウスの頭頂骨および腎臓の細胞のサンプルを使用した。ウェスタンブロッティングの方法、その他条件については前述した実施例２と同様である。
【００８６】
図８は、実施例４に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。なお、図は実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。図８に示すように、ｒＫＬｅを投与したマウスの骨には、ＥＲＫ１／２のリン酸化の促進が検出された。しかし、腎臓においてはｒＫＬｅを投与したグループにＥＲＫ１／２の活性化は検出されなかった。すなわち、図７および図８に示す結果から、ｋｌ／ｋｌマウスへのｒＫＬｅの投与によるＦＧＦ特異的シグナル伝達は骨に特異的であり腎臓には見られないということが示唆される。すなわち、ＫＬｅは腎臓においてはＦＧＦ２３と協調作用を示していないと言える。
【００８７】
（実施例５）
本実施例５では、Ｏｂｃ細胞でのＦＧＦ２３特異的シグナル伝達による石灰化抑制とＫＬｅとの相関に係る、in vivoにおける具体的な実施例について詳細に説明する。
【００８８】
本発明者らは、実施例１ないし実施例４において述べた、骨でのＫＬｅのＦＧＦ２３特異的シグナル伝達における石灰化抑制機能についてより具体的に確認する為、当該機能の組織形態計測学的な分析を行った。すなわち、ｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウス等の頭頂骨を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、常法に従ってプラスチック切片またはパラフィン切片を作製し、組織学的に評価した。マウスの種類およびｒＫＬｅの投与方法等は、実施例４において述べた方法と同様である。
【００８９】
まず、カルセインの二重ラベルでの蛍光検出について説明する。図９は、実施例５に係るカルセインで二重ラベルした頭頂骨のプラスチック切片の蛍光顕微鏡での様子を示す図である。図は実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。図１０は、図９の蛍光顕微鏡での様子におけるラベル間隔の結果のデータを示す図である。なお、本実施例５におけるデータを示す図１０、図１２、図１３、図１４および図１６は、溶媒を投与したＷＴマウスおよびｋｌ／ｋｌマウスと比較して有意差がある。これらの図において、ＷＴマウスと比較して＊（有意水準）：ｐ＜０．０５であり、ｋｌ／ｋｌマウスと比較して♯（有意水準）：ｐ＜０．０５である。図９および図１０に示すように、ｒＫＬｅを投与されたｋｌ／ｋｌマウスの頭頂骨では、ｒＫＬｅを投与されていないｋｌ／ｋｌマウスの場合と比較して、ラベル間隔が著しく小さい。すなわち、ｒＫＬｅを投与されたｋｌ／ｋｌマウスの頭頂骨は、石灰化が抑制された。
【００９０】
次に、Ｈ＆Ｅ（Hematoxilin-Eosin）染色について説明する。図１１は、実施例５に係るＨ＆Ｅ染色をした頭蓋骨のパラフィン切片の顕微鏡での様子を示す図である。なお、図は実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。図中、「］」の部分は類骨を示す。図１２は、図１１の顕微鏡での様子における骨芽細胞の数のデータを示す図である。図１３は、図１１の顕微鏡での様子における骨小腔の数のデータを示す図である。図１４は、図１１の顕微鏡での様子における骨の厚みのデータを示す図である。図１２、図１３および図１４に示すように、前述したカルセインにおけるラベリングとは異なり、ｋｌ／ｋｌマウスにおいてｒＫＬｅの投与の有無に拘わらず、結果に著しい変化は見られなかった。
【００９１】
さらに、プラスチック切片のvon Kossa染色および電子プローブマイクロアナライザーによる結果について説明する。von Kossa染色では、トルイジンブルーで対比染色した。
【００９２】
図１５は、実施例５に係るトルイジンブルー／von Kossa染色した頭蓋骨のプラスチック切片の顕微鏡での様子を示す図である。図１６は、図１５の顕微鏡での様子における類骨の厚みのデータを示す図である。図１５および図１６に示すように、ｒＫＬｅを投与されたｋｌ／ｋｌマウスの頭頂骨では、ｒＫＬｅを投与されていないｋｌ／ｋｌマウスの場合と比較して、著しく類骨（非石灰化骨）が増加していた。なお、図はいずれも実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。
【００９３】
電子プローブマイクロアナライザーは、ＪＸＡ−８２００（日本電子）を当該アナライザーの使用説明書に沿って使用した（照射電流値２０ｎＡ、加速電圧１５ｋＶ、計測時間０．０５秒／１ピクセル）。
【００９４】
図１７は、実施例５に係る電子プローブマイクロアナライザーの結果を示す図である。図は実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。それぞれの図において、左からマグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）およびリン（Ｐ）の元素マッピングを示している。図１７に示すように、ｒＫＬｅを投与されたｋｌ／ｋｌマウスの頭蓋骨では、ｒＫＬｅを投与されていないｋｌ／ｋｌマウスの場合と比較して、Ｍｇ、ＣａおよびＰが減少している。すなわち、電子プローブマイクロアナライザーの結果からも、ｒＫＬｅの投与によって骨の石灰化が減少するということが示された。
【００９５】
本実施例５において、Ｏｂｃ細胞でのＦＧＦ２３はin vivoにおいてｒＫＬｅと協調的に作用することが示唆される。これは、前述した実施例の結果も含めると、循環しているＫＬｅのレベルは、骨芽細胞・骨細胞におけるＦＧＦ２３シグナリング経由での骨の石灰化に直接関連する（ＫＬｅの循環レベルが多いほど、骨の石灰化は抑制される）ということを指し示している。すなわち、体内に循環するＫＬｅの量またはＦＧＦ２３とＫＬｅとの結合を調整することによって、骨の石灰化・形成もコントロールできることを示唆している。
【００９６】
（実施例６）
本発明者らは、骨血管相関から血管の石灰化についても前述したようなＫＬｅの機能が関与すると考察した。そこで、本実施例６では大動脈平滑筋細胞におけるカルシウム量測定に係る実施例について詳細に説明する。
【００９７】
ラット大動脈平滑筋細胞を、１５％のＦＢＳ ＤＭＥＭ（Dulbecco's Moodified Eagle's Medium）において、実施例１において述べた方法と同様にインキュベーター内で培養した。細胞がコンフルエンスになった後、０．１％ＦＢＳの血清欠乏症の条件とし、リン酸水素ナトリウム２ｍＭを負荷して培養を継続した。血清欠乏症の条件で培養を始めた２日後、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３をそれぞれ単独または同時に添加し、さらに１週間培養した。培地は２ないし３日おきに新鮮培地と交換した。培養終了後、細胞はＰＢＳで洗浄し、一晩０．６Ｎ塩酸処理した。その上澄のカルシウム量を前述のカルシウムＣ−テストワコーにより測定した。
【００９８】
図１８は、実施例６に係るカルシウム量測定の結果のデータを示す図である。なお、溶媒のみ（−）と比較して有意差がある。図１８では、＊＊（有意水準）：ｐ＜０．０１であり、ｎ＝４である。図１８に示すように、リン酸負荷による血管平滑筋の石灰化はｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３同時添加により抑制されており、血管石灰化の抑制にＫＬｅを含む複合体が関与することが示唆される。
【００９９】
（実施例７）
本実施例７では、前述した実施例６において示した血管石灰化抑制の複合体の関与が生体でも見られるか否かを確かめる為の、in vivoでの大動脈の石灰化に係る実施例について詳細に説明する。
【０１００】
実施例４および実施例５において示したｋｌ／ｋｌマウスの実験において、同様の方法においてｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウス、および、溶媒（ＰＢＳ−アテロコラーゲン）を投与したｋｌ／ｋｌマウスから大動脈を採取した。採取した大動脈を４％パラフォルムアルデヒドによって固定し、水洗後、０．５％水酸化カリウムに浸透させた。その後、同溶液に２０μｇ／ｍｌアリザリンレッドを溶解した液において染色した。
【０１０１】
図１９は、実施例７に係るｋｌ／ｋｌマウスの大動脈の実体顕微鏡での様子を示す図である。図は実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。左は溶媒のみ投与したｋｌ／ｋｌマウスの大動脈の図であり、右はｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウスの大動脈の図である。いずれの図も９例のうちの代表例を示す。図１９に示すように、アリザリンレッドで染色される石灰化巣が、ｒＫＬｅを投与したマウスの方が、溶媒のみを投与したマウスと比較し、明らかに減少している。すなわち、in vivoにおいてもＫＬｅを含む複合体が血管石灰化を抑制すると考えられる。
【０１０２】
（実施例８）
本実施例８では、前述した実施例３において簡単に示した、ｒＫＬｅ濃度と石灰化の程度との依存性を確認する為のさらなる実施例について詳細に説明する。
【０１０３】
４週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、あらかじめ１，２５Ｄを６μｇ／ｋｇ／１日を２回皮下に投与し、ＦＧＦ２３の発現を誘導した。２回目の投与の２４時間後、ｒＫＬｅを２または１０μｇを単回静注し、２時間後に頭頂骨および腎臓を回収し、細胞抽出液（実施例２において使用したものと同様のもの）で可溶化した。この抽出液を実施例１に記載の方法と同様の方法において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、実施例２に記載した方法と同様の方法においてＥＲＫ１／２のリン酸化をウェスタンブロッティングで確認した。
【０１０４】
図２０は、実施例８に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。図は実施した各群５例の個体のうちの代表例を示す。図２０に示すように、ｒＫＬｅの投与量に依存して頭頂骨におけるＥＲＫ１／２のリン酸化促進を認めた。すなわち、実施例３において簡単に示したｒＫＬｅ濃度と石灰化の程度との依存性の結果を考慮すると、マウスの血液、血漿、血清、骨髄、骨および血管の細胞または組織等におけるｒＫＬｅ濃度と石灰化の程度との依存性が、さらに強く示唆されたことを意味する。この結果を利用すると、例えばヒト等の動物の血液等のＫＬｅ濃度を測定することにより、硬組織および／または血管の石灰化の程度を検査できる可能性が高い。このような検査・石灰化の程度の判断においては、例えば、当該動物における正常時の血液中のＫＬｅの濃度と比較することが考えられる。なお、このようなリン酸化促進は腎臓では見られなかった（図示せず）。
【０１０５】
（実施例９）
本実施例９では、in vivoでの大動脈血管壁の石灰化のアリザリンレッド／トルイジンブルー染色に係る実施例について、詳細に説明する。
【０１０６】
まず、ｒＫＬｅの投与は、直接、生後４週間目（２８日目）の雄ｋｌ／ｋｌマウスの皮下へ、アルゼット（登録商標）の浸透圧ポンプを用いて行った（１５０ｎｇ／ｈ流速）。ｒＫＬｅを投与した後、生後６週間目（４２日目）において、ｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のサンプリングを行った。マウスの胸部大動脈は、４％パラフォルムアルデヒド／ＰＢＳにおいて４℃で１６時間置き、次いで洗浄を行った。その後、常法において、マウスの胸部大動脈の１２μＭのパラフィン切片を作製し、当該パラフィン切片に、アリザリンレッド／トルイジンブルー染色を行った。当該アリザリンレッド／トルイジンブルー染色の詳細な方法は、前述の実施例５および実施例７と同様である。一方、同様の方法において、溶媒を投与したｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のパラフィン切片も作製し染色した。
【０１０７】
図２１は、実施例９に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片のアリザリンレッド／トルイジンブルー染色の様子を示す図である。図は実施したｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のうちの代表例を示す。−ｒＫＬｅは溶媒を投与したｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のパラフィン切片の図であり、＋ｒＫＬｅはｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のパラフィン切片の図である。図２１に示すように、ｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウスの大動脈のパラフィン切片の方が、アリザリンレッドによって染色される石灰化巣が減少しており、対比染色に用いたトルイジンブルーのみの範囲が増加していた。
【０１０８】
また、図２２は、実施例９に係るｋｌ／ｋｌマウスおよび野生型マウスのアリザリンレッド染色範囲結果のデータを示す図である。すなわち、石灰化範囲（Calcification area）を示す図である。図２２では、溶媒を投与したｋｌ／ｋｌマウス（ｋｌ／ｋｌ（−））を１００とした場合における、ｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウス（ｋｌ／ｋｌ（＋））の値、および、同様の方法を用いてパラフィン切片を作製し染色した、溶媒を投与した野生型マウス（ＷＴ（−））の値を示している。ｋｌ／ｋｌマウス（＋）にはｋｌ／ｋｌマウス（−）と比較して有意差があり、図２２では＊（有意水準）：ｐ＜０．０５である。図２２に示すように、やはり、ｋｌ／ｋｌマウスにｒＫＬｅを投与すると、ｋｌ／ｋｌマウスの血管石灰化範囲は抑制されていた。
【０１０９】
（実施例１０）
本実施例１０では、in vivoでの大動脈血管壁の石灰化の免疫染色に係る実施例について、詳細に説明する。
【０１１０】
本実施例１０は、溶媒を投与したｋｌ／ｋｌマウス、および、ｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウスに対して行い、実験方法のパラフィン切片の作製までは、前述の実施例９と同様である。その後、室温で１時間、Protein Block（DAKO）を用いてブロッキングを行い、次いで洗浄を行った。一次抗体としては、Anti−Ｒｕｎｘ２、Anti−phosphorylated ＥＲＫ、Anti−ＦＧＦ２３およびAnti−Klotho（いずれもSanta Cruz、希釈倍率×５０）を用い、４℃で１６時間置いた。次に、Ｃｙ２／３標識二次抗体（Jackson Immunoresearch Lab.、希釈倍率×４００）を用い、室温で１時間置いた。その後、蛍光顕微鏡を用いてそれぞれを観察した。
【０１１１】
図２３は、実施例１０に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片の免疫染色の様子を示す図である。図は実施したｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のうちの代表例を示す。−ｒＫＬｅは溶媒を投与したｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のパラフィン切片の図であり、＋ｒＫＬｅはｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のパラフィン切片の図である。図２３のそれぞれの図において、線で区切られたＬの部分は血管内腔を示し、Ｍの矢印は血管の中膜の部分を示し、Ａの矢印は血管の外膜の部分を示す。また、それぞれの図の右上に、用いた一次抗体を示す。
【０１１２】
図２３に示すように、まず、−ｒＫＬｅのKlotho、ＦＧＦ２３あるいはｐ−ＥＲＫのいずれかの一次抗体を用いた場合、大動脈壁はいずれの抗体でも明らかな陽性反応はみられなかった。一方、Ｒｕｎｘ２の抗体によって、ｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈の一部石灰化領域に、Ｒｕｎｘ２陽性の骨芽細胞様細胞を確認することができた。しかし、−ｒＫＬｅのＲｕｎｘ２と＋ｒＫＬｅのＲｕｎｘ２とを比較することによって、ＫＬｅの投与により当該石灰化の進行が抑制されることも確認することができた。また、＋ｒＫＬｅのKlothoおよびＦＧＦ２３の図からは、ｋｌ／ｋｌマウス大動脈血管壁中膜外側に内在性のＦＧＦ２３および投与したＫＬｅの集積が見られることが確認された。さらに、ｐ−ＥＲＫの図からは、ＫＬｅとＦＧＦ２３の集積部位とＥＲＫのリン酸化部位が一致していることより、この領域でＦＧＦ２３特異的シグナル伝達が活性化されていることを明確に指し示している。
【０１１３】
各実施例に用いたｒＫＬｅは、煮沸して失活させたものについても検証し、各実施例で溶媒のみ用いた場合と同様の結果であったことを追記する（図示せず）。
【０１１４】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【０１１５】
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報および特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明によれば、ＦＧＦ２３による硬組織（例えば骨）および／または血管での石灰化を抑制または促進することができる石灰化調節（抑制または促進）剤およびそのスクリーニング方法、ならびに、ＦＧＦ２３による硬組織および／または血管での石灰化を検査することができる石灰化検査方法・石灰化検査キットが提供される。石灰化調節剤は、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、変形性関節症、異所性石灰化または動脈硬化症の予防・治療をする重要な手段となる。石灰化調節剤のスクリーニング方法は、これらの病状の新たな予防剤・治療剤を開発する上で重要な手段となる。石灰化検査方法・検査キットの提供は、石灰化抑制が関連するこれらの症状の予防となる可能性が高い。
【０１１７】
特に、前述の疾患のうち、骨疾患の治療薬は多く開発されているが、血管石灰化に係る治療剤については、シグナル伝達の作用機構（ＫＬｅとＦＧＦ２３とＦＧＦＲとの複合体によるもの）が明確には解明されていなかったこともあり、あまり多く開発されていない。その為、血管石灰化に起因する動脈硬化症治療剤等の開発については、本発明を用いることにより新規で有用な医薬品の開発に繋がるものと考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硬組織および／または血管の石灰化に共通するシグナル伝達が関連する、石灰化調節剤のスクリーニング方法、石灰化調節剤、ならびに骨の石灰化、血管石灰化およびそれらに伴う病態進展を検査する方法およびその検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、骨疾患、例えば骨粗鬆症は、血管石灰化等の循環系疾患と相関（骨血管相関）することが明らかとなり、骨質量減少によって高い死亡リスクを伴うことも報告されている。このような骨または血管の石灰化が係わる疾患の予防・治療薬としては、カルシウム剤、ビタミンＤ製剤、エストロジェン、イプリフラボン、カルシトニン、ビスフォスフォネート、ビタミンＫ２製剤、リン酸吸着剤またはスタチン等を含むものが挙げられる。しかし、より好ましくは、骨または血管の石灰化に直接的に効果を奏する、メカニズムオリエンテッドな新規治療法、治療剤および予防法の確立が望まれる。
【０００３】
線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）は、遺伝性、腫瘍性くる病／骨軟化症の原因因子として同定されたタンパク質であり（非特許文献１ないし非特許文献３参照）、近年ではリンおよびビタミンＤ代謝を調節する生理的ホルモンとして認識されている。ＦＧＦ２３を含むＦＧＦファミリーに対する生物学的応答は、特異的な細胞表面受容体のチロシンキナーゼ型受容体（ＦＧＦＲ、特にＦＧＦＲ１）への結合を介して行われるが、ＦＧＦ２３のＦＧＦＲに対する親和性は低い。
【０００４】
正常時、ＦＧＦ２３は主として骨芽細胞・骨細胞により分泌され、腎尿細管上皮を標的としてII型ナトリウム―リン共輸送体（ＮａＰｉII）の発現、および２５ヒドロキシビタミンＤ３−１α水酸化酵素の発現を抑制する。従って、過剰なＦＧＦ２３の産生により、リンの再吸収が抑制され、血中１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５Ｄ）濃度の低下に伴う腸管からのリン酸の吸収抑制と相まって、血中リン濃度が低下する。さらに、Ｆｇｆ２３欠損マウスが高リン酸、高ビタミンＤ血症を呈することから、ＦＧＦ２３はリン恒常性の中心的役割を果たすことが明らかとなっている。
【０００５】
また、ＦＧＦ２３と骨、歯または血管の石灰化との関係について、ＦＧＦ２３は骨を含む硬組織の生理的石灰化、および血管等の病態と関連した石灰化を調節することもin vitroで確認されている。具体的には、ＦＧＦ２３は骨および血管の生理的石灰化を抑制することが明らかとなっている（特許文献１、非特許文献１および２参照）。
【０００６】
一方、分子量約１３万のI型膜タンパクをコードするKlothoは、単一の遺伝子の変異によりヒトの多様な老化現象を引き起こすマウスの責任遺伝子として同定された。Klothoは、主として腎尿細管、脳の脈絡膜および副甲状腺の主細胞に発現する。
【０００７】
Klothoは腎臓でのリンの再吸収およびビタミンＤ代謝、副甲状腺での副甲状腺ホルモン産生に関与する。また、細胞内でＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰaseと結合し、細胞外のカルシウム濃度の低下に応答してＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰaseを細胞膜へリクルートする。一方、膜型Klothoの細胞外ドメインが切断されて、この細胞外ドメインが血液中に遊離した可溶化Klotho（以下、ＫＬｅと略す場合がある）は、血液中を循環し、発生に関与する分泌タンパクＷｎｔと結合し、Ｗｎｔシグナルを阻害すること、あるいはＴＲＰＶ５の糖鎖修飾を調節し、カルシウムチャンネルとしての機能を調節することが報告されている。
【０００８】
ＦＧＦ２３および膜型Klothoの関係について、特許文献２および非特許文献３に代表されるように、両者が協調して働くことが報告されている。すなわち、両者を強制発現させたＣＨＯ細胞等において、ＦＧＦ２３、膜型KlothoおよびＦＧＦＲは複合体を形成し、ＦＧＦ２３の特異的シグナルであるＥＲＫのリン酸化亢進またはＥｇｒ−１の発現上昇が確認されている。この細胞において、膜型Klothoの代わりにＫＬｅを強制発現させても同様の結果が得られること、さらに、ＫＬｅを強制発現させたＣＨＯ細胞をヌードマウスに移植した場合、ＦＧＦ２３を過剰発現させたと同様に血清中の１，２５Ｄおよびリン酸濃度が低下することも記載されている。
【０００９】
また、特許文献３には、このようなＫＬｅとＦＧＦ（具体的にはＦＧＦ２３）とを含むポリペプチド（polypeptide）からなる、融合タンパク質（a fusion polypeptide）に係る発明について記載されている（活性断片からなるポリペプチドも含む）。詳細には、当該融合タンパク質を用いることによる、加齢現象に伴う種々の病状やメタボリック病状を処置または予防する方法の発明について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００８−１７７９０号公報
【特許文献２】特開２００６−２４０９９０号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０１９２０８７号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Yoshiko Y., et al., Bone ４０, １５６５−１５７３, ２００７
【非特許文献２】Wang H., et al., J Bone Miner Res ２３, ９３９−９４８, ２００８
【非特許文献３】Urakawa I., et al., Nature ４４４, ７７０−７７４, ２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前述のように、特許文献２および非特許文献３において、膜型KlothoあるいはＫＬｅは、ＦＧＦＲをＦＧＦ２３特異的受容体に転換させると記載されている。ＦＧＦ２３が骨芽細胞・骨細胞により分泌され、血流を介して腎、副甲状腺で作用するのは、これらの組織に膜型Klothoが局在するためと説明されている。しかし、少なくとも、腎では、膜型Klothoは遠位尿細管上皮に局在しているため、ＦＧＦ２３の作用部位である近位尿細管において膜型Klotho、ＦＧＦＲおよびＦＧＦ２３と複合体を形成しているとは考え難く、この問題は現在も解決していない。一方、ごく最近、膜型Klothoは近位尿細管にわずかに発現し、ＦＧＦ２３とは無関係に自身が保有するβ−グルクロニダーゼ活性によりＮａＰｉIIａの細胞内輸送と分解に関与し、リンの再吸収を抑制することが報告された（Klotho: a novel phosphaturic substance acting as an autocrine enzyme in the renal proximal tubule. Hu MC, Shi M, Zhang J, Pastor J, Nakatani T, Lanske B, Shawkat Razzaque M, Rosenblatt KP, Baum MG, Kuro-O M, Moe OW. FASEB J. 2010 May 21. http://www.fasebj.org/cgi/rapidpdf/fj.10-154765v2.pdf [Epub ahead of print]）。
【００１３】
このように、腎臓でのKlothoの作用には、必ずしもＦＧＦ２３が関与するとは言い難い。また、特許文献２および特許文献３では、ＦＧＦ２３とＫＬｅの二者が複合体を形成するとの記載があるが、生体で、かつ筋細胞以外においてこの二者が複合体を形成している証拠はない。また、例えばこのような複合体を生体に用いた場合を考慮すると、生体に広く分布するＦＧＦＲと非特異的に結合し、前述のＦＧＦ２３の特性を説明できない。実際に、両者は複合体を形成しないとする最近の論文も見られる（Goetz R, Nakada Y, Hu MC, Kurosu H, Wang L, Nakatani T, Shi M, Eliseenkova AV, Razzaque MS, Moe OW, Kuro-o M, Mohammadi M. Proc Natl Acad Sci U S A. ２０１０ Jan ５；１０７（１）：４０７−４１２）。
【００１４】
一方、前述したように、ＦＧＦ２３が硬組織および／または血管の石灰化の調節に関与していることは確認されているが（特許文献１）、詳細な作用機構に関しては、未だ不明な点が多い。Klotho変異マウス（ｋｌ／ｋｌマウス）においては、骨、歯に異常が見られるが、これらの組織にはKlothoが発現しないことが確認されている。そこで、硬組織および／または血管の石灰化に直接的に効果を奏する新規治療法、治療剤および予防法の確立の為には、硬組織および／または血管におけるＦＧＦ２３の作用機構をより具体的に解明し、ＦＧＦ２３による石灰化抑制に関与し、調節することができる化合物の発見が望まれる。
【００１５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、硬組織および／または血管の石灰化に共通したシグナルが関連する、石灰化調節剤のスクリーニング方法、石灰化調節剤、ならびに、骨の石灰化度、血管石灰化およびそれらに伴う病態進展を検査する方法およびその検査キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成する為、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下の発見を見出すに到った。
（１）ＫＬｅは、Ｏｂｃ細胞（実施例参照）においてＦＧＦ２３およびＦＧＦＲと機能的な複合体を形成し、Ｏｂｃ細胞における特異的シグナル伝達（シグナル伝達に伴うＦＧＦ２３による骨の石灰化抑制を含む）に不可欠である。
（２）（１）の作用は骨に特異的であり、腎臓においては見られない。
（３）（１）の作用は血管平滑筋の石灰化にも見られる。
【００１７】
すなわち、本発明の第１の態様に係る硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法は、被験化合物の非存在下および存在下での検体において、少なくとも、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３とを接触させる工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体におけるＦＧＦ２３特異的シグナル伝達と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体におけるＦＧＦ２３特異的シグナル伝達が変化する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする。
【００１８】
好ましくは、前記特異的シグナル伝達の変化は、ＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化またはＥｇｒ−１の発現量を指標とすることを特徴とする。
【００１９】
または、被験化合物の非存在下および存在下での、検体における、可溶化Klothoの濃度を測定する工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体における前記可溶化Klothoの濃度と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体における前記可溶化Klothoの濃度が増減する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする。
【００２０】
または、被験化合物の非存在下および存在下での検体における可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成を測定する工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体における前記複合体形成と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体における前記複合体形成が増減する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする。
【００２１】
さらに好ましくは、前記石灰化調節剤のスクリーニングは、in vivoで実施することを特徴とする。
【００２２】
本発明の第２の態様に係る硬組織および／または血管の石灰化調節剤は、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成を抑制または促進する化合物を含有することを特徴とする。
【００２３】
好ましくは、前記化合物は、可溶化Klothoであることを特徴とする。
【００２４】
または、好ましくは、前記化合物は、可溶化Klotho、ＦＧＦＲ、または、前記可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体に結合親和性を有するリガンドであることを特徴とする。
【００２５】
さらに好ましくは、前記リガンドは抗体であることを特徴とする。
【００２６】
本発明の第３の態様に係る硬組織および／または血管の石灰化検査方法は、検体における、可溶化Klothoの濃度、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成、または、前記複合体形成に伴うＦＧＦ特異的シグナル伝達を測定する工程を含むことを特徴とする。
【００２７】
好ましくは、前記検体は、動物の血液、血漿、血清、骨髄、骨の組織もしくは細胞、または、血管の組織もしくは細胞であることを特徴とする。
【００２８】
さらに好ましくは、前記動物は、ヒトであることを特徴とする。
【００２９】
本発明の第４の態様に係る硬組織および／または血管の石灰化検査キットは、可溶化Klotho、または、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体に結合親和性を有するリガンドを含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の第１の態様に係る石灰化調節剤のスクリーニング方法によれば、硬組織および／または血管での石灰化を促進または抑制する、新たな石灰化調節剤をスクリーニングすることができる。本発明の第２の態様に係る石灰化調節剤によれば、硬組織および／または血管での石灰化を抑制または促進することができる。本発明の第３および第４の態様に係る、石灰化検査方法および石灰化検査キットによれば、硬組織および／または血管での石灰化を検査することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１に係る免疫沈降およびイムノブロッティングの結果の様子を示す図である。
【図２】実施例２に係るＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルにおけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果のデータを示す図である。
【図３】実施例２に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。
【図４】実施例３に係るＡＬＰ／von Kossa染色でのｒＫＬｅ添加による石灰化指標の結果のデータを示す図である。
【図５】実施例３に係るｒＫＬｅのウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。
【図６】実施例３に係るＡＬＰ／von Kossa染色でのｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３添加による石灰化指標の結果のデータを示す図である。
【図７】実施例４に係るＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルにおけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果のデータを示す図である。
【図８】実施例４に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。
【図９】実施例５に係るカルセインで二重ラベルした頭蓋骨のプラスチック切片の蛍光顕微鏡での様子を示す図である。
【図１０】図９の蛍光顕微鏡での様子におけるラベル間隔の結果のデータを示す図である。
【図１１】実施例５に係るＨ＆Ｅ染色をした頭蓋骨のパラフィン切片の顕微鏡での様子を示す図である。
【図１２】図１１の顕微鏡での様子における骨芽細胞の数のデータを示す図である。
【図１３】図１１の顕微鏡での様子における骨小腔の数のデータを示す図である。
【図１４】図１１の顕微鏡での様子における骨の厚さのデータを示す図である。
【図１５】実施例５に係るトルイジンブルー／von Kossa染色した頭蓋骨のプラスチック切片の顕微鏡での様子を示す図である。
【図１６】図１５の顕微鏡での様子における類骨の厚みのデータを示す図である。
【図１７】実施例５に係る電子プローブマイクロアナライザーの結果を示す図である。
【図１８】実施例６に係るカルシウム量測定の結果のデータを示す図である。
【図１９】実施例７に係るｋｌ／ｋｌマウスの大動脈の実体顕微鏡での様子を示す図である。
【図２０】実施例８に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。
【図２１】実施例９に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片のアリザリンレッド／トルイジンブルー染色の様子を示す図である。
【図２２】実施例９に係るｋｌ／ｋｌマウスおよび野生型マウスのアリザリンレッド染色範囲結果のデータを示す図である。
【図２３】実施例１０に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片の免疫染色の様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、ヒト（Homo sapiens）の「ＦＧＦ２３」、「ＦＧＦＲ１」および「Klotho」は、それぞれGenBankにおいて、アクセッション番号ＡＡＧ０９９１７、ＡＡＨ１５０３５およびＢＡＡ２３３８２に登録されている。
【００３３】
（硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法）
本発明の実施の形態１は、硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法に関する。まず、被験化合物の非存在下および存在下での検体において、可溶化Klotho（ＫＬｅ）とＦＧＦ２３とＦＧＦＲとを接触させる工程と、被験化合物の非存在下での検体における特異的シグナル伝達と比較して、被験化合物の存在下での検体における特異的シグナル伝達が変化する化合物を選択する工程を含む方法が挙げられる。好ましくは、特異的シグナル伝達の変化は、ＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化またはＥｇｒ−１の発現量を指標とすることができる（実施例参照）。
【００３４】
また、被験化合物の非存在下および存在下での検体におけるＫＬｅの濃度を測定する工程と、被験化合物の非存在下での検体におけるＫＬｅの濃度と比較して、被験化合物の存在下での検体におけるＫＬｅの濃度が増減する化合物を選択する工程とを含む方法でもよい。その他、検体において、ＫＬｅとＦＧＦ２３とＦＧＦＲとの複合体（以下、「ＫＬｅを含む複合体」または「複合体」）の形成を測定および比較しても構わない。この場合、直接ＫＬｅを含む複合体形成の程度、有無または濃度等を比較することが可能である。なお、これらのスクリーニングはin vivoにおいて実施する方がより好ましい。
【００３５】
本発明において「可溶化Klotho（ＫＬｅ）」は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコまたはイヌ等の哺乳動物における、Klothoの血液中に循環する細胞外ドメインの部分を指す。このうち好ましくは、ヒトおよびヒトのＫＬｅのアミノ酸配列と相同性が高い非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、サルまたはウサギ等）のＫＬｅを指す。「相同性が高い」とは、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有することを示す。最も好ましくは、ヒトのＫＬｅを指す。例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号１に記載のアミノ酸配列中の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、かつＦＧＦ２３およびＦＧＦＲと複合体を形成して石灰化を抑制させる機能を有するタンパク質、または、当該機能を有するペプチド断片が挙げられる。このように、本発明において「可溶化Klotho（ＫＬｅ）」とは、これら全てを含有した意味として使用される。
【００３６】
本発明において「調節」とは、石灰化を正に制御する「促進」または「活性化」等の他、負に制御する「抑制」または「阻害」等も含めることができる。「正」に制御する例として、ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴う特異的シグナル伝達の活性化による石灰化の抑制を示す事ができる。また、「負」に制御する例として、ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴う特異的シグナル伝達の抑制による石灰化の促進を示す事ができる。なお、ＫＬｅを含む複合体形成の増大または低下は、例えば、硬組織および／または血管におけるＫＬｅのＦＧＦＲへの結合促進または阻害を挙げることができる。
【００３７】
本発明において「検体」とは、ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴うＦＧＦ特異的シグナル伝達を測定することができ、当業者が利用しうる対象試料全てを意味する。例えば、in vivoまたはin vitroでの生体試料が挙げられる。特に、本実施の形態１に係るスクリーニング方法において最も好ましく適している検体は、in vivoでの対象となる非ヒト動物を指す。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコまたはイヌ等を挙げることができる。
【００３８】
本発明において「硬組織」とは、生体硬組織を意味し、例えば、頭蓋および体幹の骨格を形成する骨組織、歯周組織を構成する歯槽骨およびセメント質、あるいは象牙質（これらを構成する細胞等も含む）を示す。最も好ましくは、哺乳動物の骨組織である。さらに好ましくは、ヒトと遺伝子の相同性が高い非ヒト哺乳動物（例えばラット、マウス、サルまたはウサギ等）の骨組織である。
【００３９】
また、本発明において「被験化合物」（「化合物」）とは、ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴う特異的シグナル伝達の増減を評価することのできるあらゆる物質を利用することができる。例えば、低分子化合物、核酸またはポリペプチド等が挙げられる。低分子化合物、核酸またはポリペプチド等は、天然物から抽出および精製されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。また、精製されたものに限らず、例えば、未精製の細胞抽出液等であっても被験化合物として使用することができる。また、新規な物質に限らず、公知の物質またはその改良物であってもよい。例えば、既存の治療薬もしくは予防薬またはその誘導体において、本実施の形態１のスクリーニング方法により評価をすることも可能である。
【００４０】
本発明において、「ＦＧＦ２３」（線維芽細胞増殖因子２３）とは、ヒトＦＧＦ２３タンパク質だけでなく、ラット、マウス、サルまたはウサギ等のヒトＦＧＦ２３のアミノ酸配列と相同性が高い非ヒト哺乳動物のＦＧＦ２３タンパク質、あるいはこれらの活性領域を含むペプチド断片も含有する。「相同性が高い」の意味は、前述と同様である。
【００４１】
本発明において、「ＦＧＦＲ」についても同様に、ヒトＦＧＦＲのアミノ酸配列と相同性が高い非ヒト哺乳動物のＦＧＦＲも含有する。なお、ＦＧＦ２３への結合が確認されているＦＧＦＲ１、３および４を指すが（Kurosu H, Ogawa Y, Miyoshi M, Yamamoto M, Nandi A, Rosenblatt KP, Baum MG, Schiavi S, Hu MC, Moe OW, Kuro-o M. J Biol Chem. ２００６ Mar １０；２８１（１０）：６１２０−６１２３.参照）、最も好ましくはＦＧＦＲ１である（非特許文献３（Urakawa I., et al., Nature ４４４, ７７０−７７４, ２００６）参照）。
【００４２】
検体におけるＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴うＦＧＦ２３特異的シグナル伝達を測定および比較する具体的な方法については、当該技術分野の当業者に公知であるこれらを測定および比較するあらゆる方法を利用することができる。
【００４３】
詳細には、例えば、まず、前述したような非ヒト哺乳動物に被験化合物を投与または注射等を行い、当該哺乳動物の血液等におけるＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体形成を測定することができる。また、ＦＧＦＲを発現している硬組織または硬組織の一部に、直接ＦＧＦ２３およびＫＬｅを接触させ、当該硬組織における複合体形成およびそれに伴うＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化あるいはＥｇｒ−１の発現レベルを測定することもできる。その他、より容易に測定およびスクリーニングできるよう、検体として、骨芽細胞・骨細胞または血管平滑筋細胞に、ＫＬｅ、ＦＧＦ２３あるいはＦＧＦＲを強制発現させた実験系を構築してもよい。このような細胞の構成・ＤＮＡの導入は、当該技術分野の当業者にとっては容易であり、例えば、ＤＮＡ導入用プラスミドもしくはウイルスベクターを用いた方法、エレクトロポーレーション、リポフェクションまたはマイクロインジェクション等が挙げられる。このように、本実施の形態１に係るスクリーニング方法は、in vivoで行うことも、in vitroで行うことも可能である。
【００４４】
これらの血液、硬組織または細胞等におけるＫＬｅ、ＫＬｅを含む複合体形成ならびにそれに伴うＦＧＦ２３特異的シグナル伝達の測定については、例えば、分子間相互分析、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学染色、免疫蛍光またはフローサイトメトリー等の公知のタンパク質検出、定量方法を利用することで、当業者であれば容易に測定可能である。
【００４５】
測定された被験化合物存在下のＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体の形成あるいはそれに伴うＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化またはＥｇｒ−１の発現が、被験化合物の非存在下と比較して増加または減少している場合、当該被験化合物は、硬組織および／または血管の石灰化をそれぞれ抑制または促進する石灰化調節剤となる可能性が高い。
【００４６】
このようにスクリーニングされた石灰化を抑制する硬組織および／または血管の石灰化調節剤は、石灰化が促進されている疾患・状態として変形性関節症、異所性石灰化、動脈硬化症または腎不全における血管石灰化の予防・治療の手段に利用できる。石灰化を促進する石灰化調節剤の場合、石灰化が阻害または抑制されている疾患・状態として、骨粗鬆症、くる病または骨軟化症の予防・治療剤として利用できる。さらに、その他の硬組織疾患または再生医療等の分野での利用も考えられる。
【００４７】
（硬組織および／または血管の石灰化調節剤）
ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体ならびにその下流のＦＧＦ２３特異的シグナル伝達を利用した石灰化調節剤のスクリーニング方法について詳細に述べたが、ＫＬｅそれ自体またはＫＬｅを含む複合体形成に関連する化合物等を有効成分として、石灰化の調節に利用できる可能性もある。そこで、実施の形態２は、硬組織および／または血管の石灰化調節剤について述べる。
【００４８】
具体的には、硬組織および／または血管の石灰化を抑制する調節剤は、ＫＬｅ等、ＫＬｅを含む複合体形成を促進させる化合物を有効成分として含有する。また、硬組織の石灰化を促進する調節剤は、ＫＬｅ、ＫＬｅを含む複合体またはＦＧＦＲに結合親和性を有するリガンドを含有する。好ましくは、当該リガンドは、抗体である。さらに、ＫＬｅを含む複合体形成に伴う特異的シグナル伝達の、他の阻害・促進剤等も同時に有効成分として含有することによって、より有効な石灰化調節剤となることも考えられる。例えば、Ｕ０１２６などのＥＲＫシグナルの阻害剤は容易に入手可能であり、このようなＫＬｅを含む複合体形成に伴う特異的シグナル伝達の他の調節剤を含有しても構わない。
【００４９】
ＫＬｅは容易に入手、製造または精製することができる。ＫＬｅは実施例にて示す通り、例えばＲ＆Ｄ Systemsにおいて容易に購入、入手することができる。また、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質・ペプチドを公知のタンパク質・ペプチド合成法などを用いて製造することができる（例えば、固相合成法、液相合成法等を含む）。また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶等を組み合わせてタンパク質・ペプチドを精製単離することができる。
【００５０】
本発明において、「抗体」とはモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも構わず、ＫＬｅ、ＦＧＦＲまたはＫＬｅを含む複合体に特異的に結合するものであれば特に制限されない。ＫＬｅの複合体形成を促進する抗体、あるいはＫＬｅを含む複合体形成を促進する抗体もこれに含まれる。すなわち、アゴニスト抗体でもアンタゴニスト抗体でも、いずれの抗体でも構わない。また、「抗体」のうち、ＫＬｅの「中和抗体」とは、ＫＬｅによる特異的シグナル伝達の機能を阻害する抗体、例えばＦＧＦＲおよびＦＧＦ２３との複合体形成を阻害する抗体等のことを意味する。なお、実施例において示すが、例えば具体的には、抗Klothoモノクローナル抗体が挙げられる。ＦＧＦＲの「中和抗体」についても同様に、ＦＧＦＲによる特異的シグナル伝達の機能を阻害する抗体のことを意味する。ＫＬｅを含む複合体の「中和抗体」についても同様に、ＫＬｅを含む複合体によって起こされる特異的シグナル伝達の機能を阻害する抗体等のことを意味する。
【００５１】
抗体の製造方法は、すでに当業者にとっては周知であり、本抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. （１９８３） Publish. John Wiley and Sons. Section １１．１２〜１１．１３、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York １９８９）。
【００５２】
実施の形態２に係る硬組織および／または血管の石灰化を抑制する調節剤によると、石灰化が促進されている疾患・状態である変形性関節症、異所性石灰化または動脈硬化症における血管石灰化の病態進展阻止の手段として利用できる。当該調節剤は、直接患者に投与したり、これらのその他の成分も含有する化合物を構成し、これを患者に投与することもできる。投与方法としては、経口、静脈内、動脈内または皮下注射等の公知の方法を用いることができる。
【００５３】
また、硬組織の石灰化を促進する調節剤によると、骨粗鬆症、くる病または骨軟化症の予防・治療の手段として利用できる。投与方法等は前述した石灰化を抑制する調節剤と同様であるが、さらに、注射等により特定の部位（例えば、骨が減少または過剰形成している部位）に直接投与することも考えられる。
【００５４】
（硬組織および／または血管の石灰化検査方法）
前述した通り、ＫＬｅはＦＧＦ２３特異的シグナル伝達による石灰化抑制に必須の因子である為、硬組織の石灰化抑制は、硬組織、血管あるいは血中ＫＬｅ（およびＦＧＦ２３（特許文献１、非特許文献１および２参照））濃度に強く影響されると考えられる。
【００５５】
そこで、実施の形態３として、検体におけるＫＬｅの濃度を測定する工程を含むことを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化検査方法を挙げることができる。なお、ＫＬｅの濃度だけでなく、ＫＬｅを含む複合体形成あるいはそれに伴うＦＧＦ２３特異的シグナル伝達を測定することによっても石灰化の程度を推定することができる。
【００５６】
なお、前述のとおりＫＬｅは血液中を循環する為、測定工程は、血液、血漿、血清、骨髄、骨の組織もしくは細胞、または、血管の組織もしくは細胞におけるＫＬｅの濃度、ＫＬｅを含む複合体形成あるいはそれに伴うＦＧＦ２３特異的シグナル伝達を測定することがより簡便で好ましい。測定方法は、当該分野において当業者に公知の方法である、あらゆる方法を利用することができる。例えば、ＫＬｅの濃度またはＫＬｅを含む複合体形成を測定すればよい。例えば、血液中のＫＬｅの濃度を測定する場合は、免疫沈降、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫組織化学染色、免疫蛍光またはフローサイトメトリー等の方法が挙げられる。複合体形成に伴うＦＧＦ２３特異的シグナル伝達の測定は、前述と同様に、ＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化またはＥｇｒ−１の発現量の測定によって可能である。
【００５７】
測定した血液中などのＫＬｅの濃度は、例えば予め測定・平均を算出しておいた正常値と比較することによって、石灰化の程度およびそれに伴う病態の進展、有効物質のスクリーニングを評価することが可能であると考えられる。また、本実施の形態４に係る石灰化検査方法においてヒトの血液、血漿、血清または骨髄等を検体とすることで、変形性関節症、異所性石灰化もしくは動脈硬化症における血管石灰化の病態把握、モニタリング、または、骨粗鬆症、くる病もしくは骨軟化症における骨の石灰化不全の病態把握、モニタリングとなる可能性が高い。
【００５８】
（硬組織および／または血管の石灰化検査キット）
実施の形態３において述べた通り、血液中のＫＬｅの濃度およびＫＬｅを含む複合体形成の測定によって、硬組織および／または血管の石灰化度の程度の目安となると考えられる。そこで、実施の形態４として、実施の形態３で述べた石灰化検査方法に使用する為の、ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体に結合親和性を有するリガンドを含有する、硬組織および／または血管の石灰化検査キットを挙げることができる。
【００５９】
リガンドとは、測定対象物（ＫＬｅまたはＫＬｅを含む複合体）に特異的に結合する物質を意味し、例えば前述したようなＫＬｅまたは複合体の抗体（Klothoの抗体でも一部可能）および該抗体に対する二次抗体を指す。その他、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応器材および／または石灰化不全の程度を比較、評価する説明書等が含まれても構わない。これらの使用方法については実施の形態３において述べた方法と同様である。
【００６０】
他に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語等は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様のまたは等しい方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができる。本明細書中に言及するすべての公開物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照として全体が組み入れられる。相反の場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法および具体例は単に例示的なものであり、限定することを意図していない。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。なお、実施例において使用している試薬について、特に記載のない限り、Sigma-Aldrichのものを使用した。Klotho変異マウス（以下、ｋｌ／ｋｌマウス）は日本クレアより入手し、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびWistarラットは日本チャールズリバーより入手した。
【００６２】
（実施例１）
本実施例１では、骨芽細胞／骨細胞における、ＫＬｅとＦＧＦ２３およびＦＧＦＲ１との複合体形成に係る実施例について詳細に説明する。
【００６３】
まず、実施例１ないし実施例３において使用した、成熟骨芽細胞／骨細胞（Ｏｂｃ細胞）、および、該Ｏｂｃ細胞の育成、培養方法について説明する。胎生２１日齢胎仔ラット由来の頭蓋冠から細胞を分離し（Yoshiko Y, et al., Endocrinology １４４, ４１３４−４１４３, ２００３参照）、当該頭蓋冠細胞を１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清、Fetal Bovine Serum）（HyClone）および５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含むα−ＭＥＭ（Modified Essential Medium）培地によって培養した。培養期間は１０日、常法どおり、３７℃、湿式５％ＣＯ２気相下で培養した。当該頭蓋冠細胞が類骨様のノジュール（結節）を形成した後に、コラゲナーゼ（タイプＩ）処理により、ノジュールから細胞を選択的に取り出した。その後、取り出した細胞を前述の条件で培養し、Ｏｂｃ細胞として用いた。なお、成熟した骨芽細胞・骨細胞としての特徴を確認するため、Ｏｃｎ（osteocalcin）、Ｄｍｐ−１（dentin matrix protein-１）およびＳｏｓｔの発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）法によって測定した（図示せず）。
【００６４】
本実施例１においては、Ｏｂｃ細胞培養を、０．１％ＦＢＳの血清欠乏性の条件において培養したものを使用した。さらに、当該細胞を、遺伝子組み換えＫＬｅ（ｒＫＬｅ）（≦５００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Systems））（配列番号２に記載）および遺伝子組み換えＦＧＦ２３（ｒＦＧＦ２３）（≦５００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Systems））のいずれも含む条件、ｒＫＬｅのみ含む条件、ｒＦＧＦ２３のみ含む条件、または、いずれも含まない条件のいずれかにおいて、１５分間培養した。
【００６５】
このように培養したそれぞれの細胞を、１％Igepal ＣＡ６３０および５０ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）によって可溶化した。抗Klothoモノクローナル抗体（αKlotho Ｍａｂ）（Calbiochem）または抗ＦＧＦＲ１モノクローナル抗体（αＦＧＦＲ１ Ｍａｂ）（Abcam）による免疫沈降（ＩＰ）、および、αＦＧＦＲ１ Ｍａｂまたは抗ＦＧＦ２３ポリクローナル抗体（αＦＧＦ２３）（Ｒ＆Ｄ Systems）によるイムノブロッティング（ＩＢ）を行った。免疫沈降では、可溶化した細胞抽出液を磁気マイクロビーズと結合したプロテインＧ（μＭＡＣＳプロテインＧマイクロビーズ、Miltenyi Biotec）と一緒にインキュベートした。その際、αKlotho ＭａｂまたはαＦＧＦＲ１ Ｍａｂのいずれかを添加し、免疫複合体を得た（ＭＡＣＳ（登録商標）Separators User Manual、Miltenyi Biotec）。その後、このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis）に供し、αＦＧＦＲ１ ＭａｂまたはαＦＧＦ２３（Santa Cruz）でのイムノブロッティング（ＩＢ）を行い、化学発光によりシグナルを検出した。
【００６６】
図１は、実施例１に係る免疫沈降およびイムノブロッティングの結果の様子を示す図である。図１に示すように、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ２３は、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３の両方の存在下においてのみ、それぞれKlothoおよびＦＧＦＲ１と複合体を形成した。これらの結果から、ＫＬｅとＦＧＦ２３およびＦＧＦＲ１とが、骨芽細胞／骨細胞において複合体を形成することが明らかとなった。
【００６７】
（実施例２）
本実施例２では、Ｏｂｃ細胞でのＦＧＦ２３特異的シグナル伝達とＫＬｅとの相関に係る実施例について詳細に説明する。
【００６８】
Ｅｇｒ−１は、ＦＧＦ２３特異的シグナル伝達により発現が促進される遺伝子である（非特許文献３参照）。そこで、本発明者らは、Ｏｂｃ細胞におけるＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって計測した。
【００６９】
細胞は、実施例１において述べた培養条件と同様の条件において、３０分間培養したものを使用した。まず、TRIzol試薬（Invitrogen）を使用して、細胞の全ＲＮＡを調製した。調整したＲＮＡを用い、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った（Y.Yoshiko, G.A.Candeliere, N.Maeda, J.E. Aubin, Mol Cell Biol ２７４, ４６５−４４７４, ２００７、および、H.Wang, Y.Yoshiko, R.Yamamoto, T.Minamizaki, K.Kozai, K.Tanne, J.E. Aubin, N.Maeda, J Bone Miner Res ２３, ９３９−９４８, ２００８参照）。内部標準としてはリボソームタンパクＬ３２を使用した。なお、Ｅｇｒ−１のフォワードプライマーは配列番号３に記載のものを、リバースプライマーは配列番号４に記載のものを使用し、Ｌ３２のフォワードプライマーは配列番号５に記載のものを、リバースプライマーは配列番号６に記載のものを使用した。
【００７０】
図２は、実施例２に係るＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルにおけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果のデータを示す図である。なお、溶媒のみ（−）と比較して有意差がある。図２では、＊＊（有意水準）：ｐ＜０．０１であり、ｎ＝４である。
【００７１】
一方、ＥＲＫ１／２のリン酸化についても、ＦＧＦ２３特異的シグナル伝達の指標となっている（非特許文献３参照）。そこで、本発明者らはＥＲＫ１／２活性を調べる為、ウェスタンブロッティングを行った。
【００７２】
細胞は、実施例１において述べた培養と同条件で５〜３０分間処理した後、リン酸化阻害剤（Phosphatase Inhibitor Cocktail（ナカライテスク））を添加した細胞抽出液（１００ ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Nonidet Ｐ−４０、１ｍＭ phenylmethylsulfonylfluoride、Complete Protease Inhibitor Cocktail（Roche Diagnostics）を含む５０ｍＭ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で細胞を可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティングおよび化学発光検出を行った。一次抗体には、ＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐ−ＥＲＫ１／２）を使用した。
【００７３】
図３は、実施例２に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。図３に示すように、ｒＦＧＦ２３およびｒＫＬｅのいずれも含む条件において、かつ１０分間処理したものについてＥＲＫ１／２のリン酸化が検出された。このように、図２および図３のいずれの結果でも、ｒＦＧＦ２３およびｒＫＬｅが存在する場合のみ、Ｅｇｒ−１のｍＲＮＡレベルの増加、ＥＲＫ１／２の活性化が確認された。
【００７４】
これらの結果から、Ｏｂｃ細胞において、ＫＬｅとＦＧＦ２３とＦＧＦＲとが結合した複合体がＦＧＦ２３特異的シグナル伝達を促進すると考えられた。
【００７５】
（実施例３）
本実施例３では、Ｏｂｃ細胞でのＦＧＦ２３特異的シグナル伝達による石灰化不全と、ＫＬｅとの相関に係る実施例について詳細に説明する。
【００７６】
本発明者らは、ＫＬｅとＯｂｃ細胞でのＦＧＦ２３特異的シグナル伝達による石灰化抑制との相関を確認するため、骨芽細胞のマーカー酵素であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性と石灰化を検出するvon Kossa染色を行った。なお、本発明者らにより、１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５Ｄ）はＦＧＦ２３の発現を強力に促進することが確認されている為、ｒＦＧＦ２３だけでなく１０ｎＭの１，２５Ｄを添加して培養したものについても調べた。ＦＢＳにはＫＬｅが含まれていることが確認された為（図示せず、ウェスタンブロッティングにおいて確認）、前述のμＭＡＣＳプロテインＧマイクロビーズおよびαKlotho ＭａｂによってＦＢＳからＫＬｅを取り除いたものを５％となるように培養液に添加した。ｒＫＬｅは回復実験に使用した。培養は試薬添加後３６時間後に終了し、ＰＢＳで洗浄、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した後染色を施した。ｒＦＧＦ２３を添加した群は、培養上清（conditioned media）を回収し、添加したｒＫＬｅのレベルをウェスタンブロッティングにより確認した。なお、石灰化を誘導するため３ｍＭ β−グリセロリン酸を添加した。その後、実体顕微鏡下でＡＬＰ陽性の石灰化ノジュールの数を計測した。数値は陰性対照（溶媒のみ）を１００として表した。
【００７７】
図４は、実施例３に係るＡＬＰ／von Kossa染色でのｒＫＬｅ添加による石灰化指標の結果のデータを示す図である。なお、溶媒のみ（−）と比較して有意差がある。図４では、＊（有意水準）：ｐ＜０．０５であり、＊＊（有意水準）：ｐ＜０．０１であり、ｎ＝４である。図４の石灰化指標（Mineralized foci）に示す通り、１，２５ＤおよびｒＦＧＦ２３のいずれも、ｒＫＬｅを添加していないものはコントロールと比較して石灰化が抑制されず、むしろ促進している。しかし、ｒＫＬｅを添加することによって再び石灰化抑制の状態に戻っている。図５は、実施例３に係るｒＫＬｅのウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。図５に示すように、培養上清のｒＫＬｅ濃度は、図４に示した石灰化抑制作用の濃度依存性と一致していた。これら図４および図５の結果から、ｒＫＬｅ濃度に石灰化の程度が依存していることが示唆される。
【００７８】
さらに、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３による石灰化抑制とＦＧＦ２３特異的シグナルの相関を確認した。実施例１で述べた方法と同様の方法で、０．１％ＦＢＳの血清欠乏性の条件において培養して得たＯｂｃ細胞を、ＭＥＫ１／２阻害剤であるＵ０１２６を１０μＭまたは溶媒のみで２時間前処理を行った。洗浄後、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３または溶媒のみを添加し、３６時間後に前述同様ＡＬＰ／von Kossa染色を施した。ＦＧＦＲ中和抗体（αＦＧＦＲ）２μｇ／ｍｌ（CHEMICON）あるいはその溶媒のみ（陰性対照）については、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３を添加する際に加えた。さらに、前述同様、βグリセロリン酸もｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３と同時に添加した。
【００７９】
図６は、実施例３に係るＡＬＰ／von Kossa染色でのｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３添加による石灰化指標の結果のデータを示す図である。なお、溶媒のみ（−）と比較して有意差がある。図６では、＊＊（有意水準）：ｐ＜０．０１であり、ｎ＝４である。図６に示すとおり、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３による石灰化抑制は、ＦＧＦＲ中和抗体あるいはＵ０１２６によって大部分が回復していることにより、ＫＬｅを含む複合体形成に基づくシグナル伝達が、石灰化抑制に強く関与することが明らかとなった。従って、これら自身はＫＬｅを含む複合体形成に基づく石灰化抑制の治療剤として有効である。また、ＫＬｅは石灰化を抑制する調節剤として、ＫＬｅおよびＫＬｅを含む複合体の中和抗体となるものは石灰化を促進する調節剤として有効であることが示唆される。
【００８０】
本実施例３、および実施例１ならびに実施例２の結果から、ＫＬｅは、Ｏｂｃ細胞において、ＦＧＦ２３およびＦＧＦＲと機能的な複合体を形成し、Ｏｂｃ細胞におけるＦＧＦ２３特異的シグナル伝達（ＦＧＦ２３による骨の石灰化不全を含む）に不可欠であるということが確認された。なお、当該実施例においてＫＬｅと反応するＷｎｔおよびＴＲＰＶ５が影響している可能性があるが、Ｗｎｔについては同様にＡＬＰ／von Kossa染色を行い影響していないことを確認し（図示せず）、ＴＲＰＶ５は骨に存在しないため、影響することはない。
【００８１】
（実施例４）
本実施例４では、骨および腎臓での、ＦＧＦ２３特異的シグナル伝達ならびに石灰化不全とＫＬｅとの相関に係る実施例について詳細に説明する。
【００８２】
前述した実施例で示したＫＬｅの作用が、生体でも見られるか否かを確かめる為、ｒＫＬｅをKlothoを欠如したKlotho変異マウス（ｋｌ／ｋｌマウス）に投与した。なお、本発明者らにより、ＷＴマウス血清と比較すると、ｋｌ／ｋｌマウス血清は、リン酸、カルシウム、１，２５ＤおよびＦＧＦ２３の濃度がいずれも著しく高い値となっていることが確認されている（図示せず、１，２５ＤはＲＩＡキット（ＴＦＢ）、ＦＧＦ２３の濃度の測定はＦＧＦ２３ ＥＬＩＳＡキット（カイノス）により行った。リン酸およびカルシウムはそれぞれホスファＣ−テストワコー、カルシウムＣ−テストワコー（いずれも和光純薬工業）により測定した。このように、ｋｌ／ｋｌマウス血中ＦＧＦ２３濃度が極めて高値であるが（その原因は不明）、Klothoが欠損している為、ＦＧＦ２３は作用しないと推定される。
【００８３】
投与は生後１０日目の雄ｋｌ／ｋｌマウス頭蓋冠皮下に１０μｇを０．３％アテロコラーゲン（高研）と混合して３日間隔で注射し、生後２２日にサンプルを回収した。サンプル回収２日前とその６日前の２回に分けてカルセイン１０ｍｇ／ｋｇ／１回を腹腔注射した。まず、頭頂骨および腎臓から全ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルを計測した。ＲＴ−ＰＣＲのサンプルにおいて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのプライマー、その他詳細な方法については前述した実施例２と同様である。
【００８４】
図７は、実施例４に係るＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルにおけるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果のデータを示す図である。頭頂骨（Bone）については、野生型マウス（ＷＴ）のｒＫＬｅを投与しないものについても調べた。なお、ｒＫＬｅを投与していないｋｌ／ｋｌマウスの骨のデータと比較して有意差がある。図７では、＊（有意水準）：ｐ＜０．０５であり、ｎ＝９である。図７に示すように、ｋｌ／ｋｌマウスでの骨においては、ｒＫＬｅを投与するとＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルが上昇する。しかし、同マウスの腎臓（Kidney）においては、ｒＫＬｅの投与によってＥｇｒ−１のｍＲＮＡレベルは、ほとんど変化していない。
【００８５】
さらに実施例２と同様にＥＲＫ１／２活性を調べる為、ウェスタンブロッティングも行った。サンプルに用いるマウスは前述したものと同様の投与を行ったｋｌ／ｋｌマウスを使用し、当該マウスの頭頂骨および腎臓の細胞のサンプルを使用した。ウェスタンブロッティングの方法、その他条件については前述した実施例２と同様である。
【００８６】
図８は、実施例４に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。なお、図は実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。図８に示すように、ｒＫＬｅを投与したマウスの骨には、ＥＲＫ１／２のリン酸化の促進が検出された。しかし、腎臓においてはｒＫＬｅを投与したグループにＥＲＫ１／２の活性化は検出されなかった。すなわち、図７および図８に示す結果から、ｋｌ／ｋｌマウスへのｒＫＬｅの投与によるＦＧＦ特異的シグナル伝達は骨に特異的であり腎臓には見られないということが示唆される。すなわち、ＫＬｅは腎臓においてはＦＧＦ２３と協調作用を示していないと言える。
【００８７】
（実施例５）
本実施例５では、Ｏｂｃ細胞でのＦＧＦ２３特異的シグナル伝達による石灰化抑制とＫＬｅとの相関に係る、in vivoにおける具体的な実施例について詳細に説明する。
【００８８】
本発明者らは、実施例１ないし実施例４において述べた、骨でのＫＬｅのＦＧＦ２３特異的シグナル伝達における石灰化抑制機能についてより具体的に確認する為、当該機能の組織形態計測学的な分析を行った。すなわち、ｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウス等の頭頂骨を４％パラフォルムアルデヒドで固定し、常法に従ってプラスチック切片またはパラフィン切片を作製し、組織学的に評価した。マウスの種類およびｒＫＬｅの投与方法等は、実施例４において述べた方法と同様である。
【００８９】
まず、カルセインの二重ラベルでの蛍光検出について説明する。図９は、実施例５に係るカルセインで二重ラベルした頭頂骨のプラスチック切片の蛍光顕微鏡での様子を示す図である。図は実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。図１０は、図９の蛍光顕微鏡での様子におけるラベル間隔の結果のデータを示す図である。なお、本実施例５におけるデータを示す図１０、図１２、図１３、図１４および図１６は、溶媒を投与したＷＴマウスおよびｋｌ／ｋｌマウスと比較して有意差がある。これらの図において、ＷＴマウスと比較して＊（有意水準）：ｐ＜０．０５であり、ｋｌ／ｋｌマウスと比較して♯（有意水準）：ｐ＜０．０５である。図９および図１０に示すように、ｒＫＬｅを投与されたｋｌ／ｋｌマウスの頭頂骨では、ｒＫＬｅを投与されていないｋｌ／ｋｌマウスの場合と比較して、ラベル間隔が著しく小さい。すなわち、ｒＫＬｅを投与されたｋｌ／ｋｌマウスの頭頂骨は、石灰化が抑制された。
【００９０】
次に、Ｈ＆Ｅ（Hematoxilin-Eosin）染色について説明する。図１１は、実施例５に係るＨ＆Ｅ染色をした頭蓋骨のパラフィン切片の顕微鏡での様子を示す図である。なお、図は実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。図中、「］」の部分は類骨を示す。図１２は、図１１の顕微鏡での様子における骨芽細胞の数のデータを示す図である。図１３は、図１１の顕微鏡での様子における骨小腔の数のデータを示す図である。図１４は、図１１の顕微鏡での様子における骨の厚みのデータを示す図である。図１２、図１３および図１４に示すように、前述したカルセインにおけるラベリングとは異なり、ｋｌ／ｋｌマウスにおいてｒＫＬｅの投与の有無に拘わらず、結果に著しい変化は見られなかった。
【００９１】
さらに、プラスチック切片のvon Kossa染色および電子プローブマイクロアナライザーによる結果について説明する。von Kossa染色では、トルイジンブルーで対比染色した。
【００９２】
図１５は、実施例５に係るトルイジンブルー／von Kossa染色した頭蓋骨のプラスチック切片の顕微鏡での様子を示す図である。図１６は、図１５の顕微鏡での様子における類骨の厚みのデータを示す図である。図１５および図１６に示すように、ｒＫＬｅを投与されたｋｌ／ｋｌマウスの頭頂骨では、ｒＫＬｅを投与されていないｋｌ／ｋｌマウスの場合と比較して、著しく類骨（非石灰化骨）が増加していた。なお、図はいずれも実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。
【００９３】
電子プローブマイクロアナライザーは、ＪＸＡ−８２００（日本電子）を当該アナライザーの使用説明書に沿って使用した（照射電流値２０ｎＡ、加速電圧１５ｋＶ、計測時間０．０５秒／１ピクセル）。
【００９４】
図１７は、実施例５に係る電子プローブマイクロアナライザーの結果を示す図である。図は実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。それぞれの図において、左からマグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）およびリン（Ｐ）の元素マッピングを示している。図１７に示すように、ｒＫＬｅを投与されたｋｌ／ｋｌマウスの頭蓋骨では、ｒＫＬｅを投与されていないｋｌ／ｋｌマウスの場合と比較して、Ｍｇ、ＣａおよびＰが減少している。すなわち、電子プローブマイクロアナライザーの結果からも、ｒＫＬｅの投与によって骨の石灰化が減少するということが示された。
【００９５】
本実施例５において、Ｏｂｃ細胞でのＦＧＦ２３はin vivoにおいてｒＫＬｅと協調的に作用することが示唆される。これは、前述した実施例の結果も含めると、循環しているＫＬｅのレベルは、骨芽細胞・骨細胞におけるＦＧＦ２３シグナリング経由での骨の石灰化に直接関連する（ＫＬｅの循環レベルが多いほど、骨の石灰化は抑制される）ということを指し示している。すなわち、体内に循環するＫＬｅの量またはＦＧＦ２３とＫＬｅとの結合を調整することによって、骨の石灰化・形成もコントロールできることを示唆している。
【００９６】
（実施例６）
本発明者らは、骨血管相関から血管の石灰化についても前述したようなＫＬｅの機能が関与すると考察した。そこで、本実施例６では大動脈平滑筋細胞におけるカルシウム量測定に係る実施例について詳細に説明する。
【００９７】
ラット大動脈平滑筋細胞を、１５％のＦＢＳ ＤＭＥＭ（Dulbecco's Moodified Eagle's Medium）において、実施例１において述べた方法と同様にインキュベーター内で培養した。細胞がコンフルエンスになった後、０．１％ＦＢＳの血清欠乏症の条件とし、リン酸水素ナトリウム２ｍＭを負荷して培養を継続した。血清欠乏症の条件で培養を始めた２日後、ｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３をそれぞれ単独または同時に添加し、さらに１週間培養した。培地は２ないし３日おきに新鮮培地と交換した。培養終了後、細胞はＰＢＳで洗浄し、一晩０．６Ｎ塩酸処理した。その上澄のカルシウム量を前述のカルシウムＣ−テストワコーにより測定した。
【００９８】
図１８は、実施例６に係るカルシウム量測定の結果のデータを示す図である。なお、溶媒のみ（−）と比較して有意差がある。図１８では、＊＊（有意水準）：ｐ＜０．０１であり、ｎ＝４である。図１８に示すように、リン酸負荷による血管平滑筋の石灰化はｒＫＬｅおよびｒＦＧＦ２３同時添加により抑制されており、血管石灰化の抑制にＫＬｅを含む複合体が関与することが示唆される。
【００９９】
（実施例７）
本実施例７では、前述した実施例６において示した血管石灰化抑制の複合体の関与が生体でも見られるか否かを確かめる為の、in vivoでの大動脈の石灰化に係る実施例について詳細に説明する。
【０１００】
実施例４および実施例５において示したｋｌ／ｋｌマウスの実験において、同様の方法においてｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウス、および、溶媒（ＰＢＳ−アテロコラーゲン）を投与したｋｌ／ｋｌマウスから大動脈を採取した。採取した大動脈を４％パラフォルムアルデヒドによって固定し、水洗後、０．５％水酸化カリウムに浸透させた。その後、同溶液に２０μｇ／ｍｌアリザリンレッドを溶解した液において染色した。
【０１０１】
図１９は、実施例７に係るｋｌ／ｋｌマウスの大動脈の実体顕微鏡での様子を示す図である。図は実施した各群９例の個体のうちの代表例を示す。左は溶媒のみ投与したｋｌ／ｋｌマウスの大動脈の図であり、右はｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウスの大動脈の図である。いずれの図も９例のうちの代表例を示す。図１９に示すように、アリザリンレッドで染色される石灰化巣が、ｒＫＬｅを投与したマウスの方が、溶媒のみを投与したマウスと比較し、明らかに減少している。すなわち、in vivoにおいてもＫＬｅを含む複合体が血管石灰化を抑制すると考えられる。
【０１０２】
（実施例８）
本実施例８では、前述した実施例３において簡単に示した、ｒＫＬｅ濃度と石灰化の程度との依存性を確認する為のさらなる実施例について詳細に説明する。
【０１０３】
４週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、あらかじめ１，２５Ｄを６μｇ／ｋｇ／１日を２回皮下に投与し、ＦＧＦ２３の発現を誘導した。２回目の投与の２４時間後、ｒＫＬｅを２または１０μｇを単回静注し、２時間後に頭頂骨および腎臓を回収し、細胞抽出液（実施例２において使用したものと同様のもの）で可溶化した。この抽出液を実施例１に記載の方法と同様の方法において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、実施例２に記載した方法と同様の方法においてＥＲＫ１／２のリン酸化をウェスタンブロッティングで確認した。
【０１０４】
図２０は、実施例８に係るＥＲＫ１／２およびリン酸化ＥＲＫ１／２のウェスタンブロッティングの結果の様子を示す図である。図は実施した各群５例の個体のうちの代表例を示す。図２０に示すように、ｒＫＬｅの投与量に依存して頭頂骨におけるＥＲＫ１／２のリン酸化促進を認めた。すなわち、実施例３において簡単に示したｒＫＬｅ濃度と石灰化の程度との依存性の結果を考慮すると、マウスの血液、血漿、血清、骨髄、骨および血管の細胞または組織等におけるｒＫＬｅ濃度と石灰化の程度との依存性が、さらに強く示唆されたことを意味する。この結果を利用すると、例えばヒト等の動物の血液等のＫＬｅ濃度を測定することにより、硬組織および／または血管の石灰化の程度を検査できる可能性が高い。このような検査・石灰化の程度の判断においては、例えば、当該動物における正常時の血液中のＫＬｅの濃度と比較することが考えられる。なお、このようなリン酸化促進は腎臓では見られなかった（図示せず）。
【０１０５】
（実施例９）
本実施例９では、in vivoでの大動脈血管壁の石灰化のアリザリンレッド／トルイジンブルー染色に係る実施例について、詳細に説明する。
【０１０６】
まず、ｒＫＬｅの投与は、直接、生後４週間目（２８日目）の雄ｋｌ／ｋｌマウスの皮下へ、アルゼット（登録商標）の浸透圧ポンプを用いて行った（１５０ｎｇ／ｈ流速）。ｒＫＬｅを投与した後、生後６週間目（４２日目）において、ｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のサンプリングを行った。マウスの胸部大動脈は、４％パラフォルムアルデヒド／ＰＢＳにおいて４℃で１６時間置き、次いで洗浄を行った。その後、常法において、マウスの胸部大動脈の１２μＭのパラフィン切片を作製し、当該パラフィン切片に、アリザリンレッド／トルイジンブルー染色を行った。当該アリザリンレッド／トルイジンブルー染色の詳細な方法は、前述の実施例５および実施例７と同様である。一方、同様の方法において、溶媒を投与したｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のパラフィン切片も作製し染色した。
【０１０７】
図２１は、実施例９に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片のアリザリンレッド／トルイジンブルー染色の様子を示す図である。図は実施したｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のうちの代表例を示す。−ｒＫＬｅは溶媒を投与したｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のパラフィン切片の図であり、＋ｒＫＬｅはｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のパラフィン切片の図である。図２１に示すように、ｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウスの大動脈のパラフィン切片の方が、アリザリンレッドによって染色される石灰化巣が減少しており、対比染色に用いたトルイジンブルーのみの範囲が増加していた。
【０１０８】
また、図２２は、実施例９に係るｋｌ／ｋｌマウスおよび野生型マウスのアリザリンレッド染色範囲結果のデータを示す図である。すなわち、石灰化範囲（Calcification area）を示す図である。図２２では、溶媒を投与したｋｌ／ｋｌマウス（ｋｌ／ｋｌ（−））を１００とした場合における、ｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウス（ｋｌ／ｋｌ（＋））の値、および、同様の方法を用いてパラフィン切片を作製し染色した、溶媒を投与した野生型マウス（ＷＴ（−））の値を示している。ｋｌ／ｋｌマウス（＋）にはｋｌ／ｋｌマウス（−）と比較して有意差があり、図２２では＊（有意水準）：ｐ＜０．０５である。図２２に示すように、やはり、ｋｌ／ｋｌマウスにｒＫＬｅを投与すると、ｋｌ／ｋｌマウスの血管石灰化範囲は抑制されていた。
【０１０９】
（実施例１０）
本実施例１０では、in vivoでの大動脈血管壁の石灰化の免疫染色に係る実施例について、詳細に説明する。
【０１１０】
本実施例１０は、溶媒を投与したｋｌ／ｋｌマウス、および、ｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウスに対して行い、実験方法のパラフィン切片の作製までは、前述の実施例９と同様である。その後、室温で１時間、Protein Block（DAKO）を用いてブロッキングを行い、次いで洗浄を行った。一次抗体としては、Anti−Ｒｕｎｘ２、Anti−phosphorylated ＥＲＫ、Anti−ＦＧＦ２３およびAnti−Klotho（いずれもSanta Cruz、希釈倍率×５０）を用い、４℃で１６時間置いた。次に、Ｃｙ２／３標識二次抗体（Jackson Immunoresearch Lab.、希釈倍率×４００）を用い、室温で１時間置いた。その後、蛍光顕微鏡を用いてそれぞれを観察した。
【０１１１】
図２３は、実施例１０に係るｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のパラフィン切片の免疫染色の様子を示す図である。図は実施したｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈のうちの代表例を示す。−ｒＫＬｅは溶媒を投与したｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のパラフィン切片の図であり、＋ｒＫＬｅはｒＫＬｅを投与したｋｌ／ｋｌマウスの胸部大動脈のパラフィン切片の図である。図２３のそれぞれの図において、線で区切られたＬの部分は血管内腔を示し、Ｍの矢印は血管の中膜の部分を示し、Ａの矢印は血管の外膜の部分を示す。また、それぞれの図の右上に、用いた一次抗体を示す。
【０１１２】
図２３に示すように、まず、−ｒＫＬｅのKlotho、ＦＧＦ２３あるいはｐ−ＥＲＫのいずれかの一次抗体を用いた場合、大動脈壁はいずれの抗体でも明らかな陽性反応はみられなかった。一方、Ｒｕｎｘ２の抗体によって、ｋｌ／ｋｌマウス胸部大動脈の一部石灰化領域に、Ｒｕｎｘ２陽性の骨芽細胞様細胞を確認することができた。しかし、−ｒＫＬｅのＲｕｎｘ２と＋ｒＫＬｅのＲｕｎｘ２とを比較することによって、ＫＬｅの投与により当該石灰化の進行が抑制されることも確認することができた。また、＋ｒＫＬｅのKlothoおよびＦＧＦ２３の図からは、ｋｌ／ｋｌマウス大動脈血管壁中膜外側に内在性のＦＧＦ２３および投与したＫＬｅの集積が見られることが確認された。さらに、ｐ−ＥＲＫの図からは、ＫＬｅとＦＧＦ２３の集積部位とＥＲＫのリン酸化部位が一致していることより、この領域でＦＧＦ２３特異的シグナル伝達が活性化されていることを明確に指し示している。
【０１１３】
各実施例に用いたｒＫＬｅは、煮沸して失活させたものについても検証し、各実施例で溶媒のみ用いた場合と同様の結果であったことを追記する（図示せず）。
【０１１４】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【０１１５】
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報および特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明によれば、ＦＧＦ２３による硬組織（例えば骨）および／または血管での石灰化を抑制または促進することができる石灰化調節（抑制または促進）剤およびそのスクリーニング方法、ならびに、ＦＧＦ２３による硬組織および／または血管での石灰化を検査することができる石灰化検査方法・石灰化検査キットが提供される。石灰化調節剤は、骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、変形性関節症、異所性石灰化または動脈硬化症の予防・治療をする重要な手段となる。石灰化調節剤のスクリーニング方法は、これらの病状の新たな予防剤・治療剤を開発する上で重要な手段となる。石灰化検査方法・検査キットの提供は、石灰化抑制が関連するこれらの症状の予防となる可能性が高い。
【０１１７】
特に、前述の疾患のうち、骨疾患の治療薬は多く開発されているが、血管石灰化に係る治療剤については、シグナル伝達の作用機構（ＫＬｅとＦＧＦ２３とＦＧＦＲとの複合体によるもの）が明確には解明されていなかったこともあり、あまり多く開発されていない。その為、血管石灰化に起因する動脈硬化症治療剤等の開発については、本発明を用いることにより新規で有用な医薬品の開発に繋がるものと考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験化合物の非存在下および存在下での検体において、少なくとも、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３とを接触させる工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体におけるＦＧＦ２３特異的シグナル伝達と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体におけるＦＧＦ２３特異的シグナル伝達が変化する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記特異的シグナル伝達の変化は、ＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化またはＥｇｒ−１の発現量を指標とすることを特徴とする請求項１に記載の硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
被験化合物の非存在下および存在下での、検体における、可溶化Klothoの濃度を測定する工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体における前記可溶化Klothoの濃度と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体における前記可溶化Klothoの濃度が増減する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
被験化合物の非存在下および存在下での検体における可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成を測定する工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体における前記複合体形成と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体における前記複合体形成が増減する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記石灰化調節剤のスクリーニングは、in vivoで実施することを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成を抑制または促進する化合物を含有することを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化調節剤。
【請求項７】
前記化合物は、可溶化Klothoであることを特徴とする請求項６に記載の硬組織および／または血管の石灰化調節剤。
【請求項８】
前記化合物は、可溶化Klotho、ＦＧＦＲ、または、前記可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体に結合親和性を有するリガンドであることを特徴とする請求項６に記載の硬組織および／または血管の石灰化調節剤。
【請求項９】
前記リガンドは抗体であることを特徴とする請求項８に記載の硬組織および／または血管の石灰化調節剤。
【請求項１０】
検体における、可溶化Klothoの濃度、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成、または、前記複合体形成に伴うＦＧＦ特異的シグナル伝達を測定する工程を含むことを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化検査方法。
【請求項１１】
前記検体は、動物の血液、血漿、血清、骨髄、骨の組織もしくは細胞、または、血管の組織もしくは細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の硬組織および／または血管の石灰化検査方法。
【請求項１２】
前記動物は、ヒトであることを特徴とする請求項１１に記載の硬組織および／または血管の石灰化検査方法。
【請求項１３】
可溶化Klotho、または、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体に結合親和性を有するリガンドを含有することを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化検査キット。
【請求項１】
被験化合物の非存在下および存在下での検体において、少なくとも、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３とを接触させる工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体におけるＦＧＦ２３特異的シグナル伝達と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体におけるＦＧＦ２３特異的シグナル伝達が変化する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記特異的シグナル伝達の変化は、ＦＧＦＲのリン酸化、ＥＲＫのリン酸化またはＥｇｒ−１の発現量を指標とすることを特徴とする請求項１に記載の硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
被験化合物の非存在下および存在下での、検体における、可溶化Klothoの濃度を測定する工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体における前記可溶化Klothoの濃度と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体における前記可溶化Klothoの濃度が増減する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
被験化合物の非存在下および存在下での検体における可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成を測定する工程と、
前記被験化合物の非存在下での前記検体における前記複合体形成と比較して、前記被験化合物の存在下での前記検体における前記複合体形成が増減する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記石灰化調節剤のスクリーニングは、in vivoで実施することを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の硬組織および／または血管の石灰化調節剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成を抑制または促進する化合物を含有することを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化調節剤。
【請求項７】
前記化合物は、可溶化Klothoであることを特徴とする請求項６に記載の硬組織および／または血管の石灰化調節剤。
【請求項８】
前記化合物は、可溶化Klotho、ＦＧＦＲ、または、前記可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体に結合親和性を有するリガンドであることを特徴とする請求項６に記載の硬組織および／または血管の石灰化調節剤。
【請求項９】
前記リガンドは抗体であることを特徴とする請求項８に記載の硬組織および／または血管の石灰化調節剤。
【請求項１０】
検体における、可溶化Klothoの濃度、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体形成、または、前記複合体形成に伴うＦＧＦ特異的シグナル伝達を測定する工程を含むことを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化検査方法。
【請求項１１】
前記検体は、動物の血液、血漿、血清、骨髄、骨の組織もしくは細胞、または、血管の組織もしくは細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の硬組織および／または血管の石灰化検査方法。
【請求項１２】
前記動物は、ヒトであることを特徴とする請求項１１に記載の硬組織および／または血管の石灰化検査方法。
【請求項１３】
可溶化Klotho、または、可溶化KlothoとＦＧＦＲとＦＧＦ２３との複合体に結合親和性を有するリガンドを含有することを特徴とする硬組織および／または血管の石灰化検査キット。
【図２】
【図４】
【図６】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１８】
【図１】
【図３】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１５】
【図１７】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図４】
【図６】
【図１０】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１８】
【図１】
【図３】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１５】
【図１７】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２０１２−２１９７４（Ｐ２０１２−２１９７４Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１２３８５３（Ｐ２０１１−１２３８５３）
【出願日】平成２３年６月１日（２０１１．６．１）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０２３１０４１６）株式会社ラフィーネインターナショナル (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月１日（２０１１．６．１）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【出願人】（５０２３１０４１６）株式会社ラフィーネインターナショナル (8)
【Ｆターム（参考）】
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