石見銀山梅花酵母、及びそれを用いて製造される発酵飲食品または飼料
【課題】風味に優れた発酵飲食品を製造することができる酵母、およびそれを用いた発酵飲食品の提供。
【解決手段】上記酵母として、梅の花から採取された酵母であって、サッカロミセス セレビシエに属する「石見銀山梅花酵母−1」（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６）、またはその継代株を用いる。
【解決手段】上記酵母として、梅の花から採取された酵母であって、サッカロミセス セレビシエに属する「石見銀山梅花酵母−1」（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６）、またはその継代株を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、梅花から単離した新規酵母に関する。また本発明は、当該新規酵母を用いて製造される各種発酵飲食品、例えばパンや菓子等のベーカリー類；清酒や焼酎などのアルコール飲食品；漬け物等の発酵食品；並びに家畜や養殖魚用の飼料などに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、従来より発酵飲食品、例えばワイン、ビール、清酒などのアルコール飲料；味噌、醤油、酢及び味醂などの発酵調味料；漬け物やキムチなどの発酵食品；パンや菓子などのベーカリー類等の製造に広く使用されている。
【０００３】
しかし、例えば、現在市販されている製パン用乾燥酵母は、その殆どが外国製のものであるが、これを用いてパンを製造すると、酵母特有の酵母臭が発生し、風味が好ましくない等といった評価がされている。天然酵母については、製パン業界では干しぶどうなどの果実等から種起こしが行なわれているが、発酵力が不安定であるなどの問題がある。さらに市販されている天然酵母は、製造したパンの食感が硬くなるなどといった、出来上がったパンの品質が必ずしもよくないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2003-116523号公報
【特許文献２】特開2001-372313号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述するように、干ブドウ等の果物などから種起こしをした天然酵母は、発酵力が安定していないので、これを用いてパンを製造するためには熟練した技術を要する。このため、製パン酵母として汎用するにはあまり適していない。また既存の天然酵母や乾燥酵母は、香りなどの風味や食感など、パンの品質に悪影響を与えることが多い。
【０００６】
これらのことから、天然由来でありながらも発酵力に安定性があり、かつパン等の発酵飲食品の品質に悪影響を及ぼすことがなく、逆に風味に優れた発酵飲食品を製造することができる酵母の開発が望まれている。
【０００７】
本発明は、かかる従来の課題を解決することを目的とする。具体的には、安定した発酵力を発揮する天然酵母であって、かつパンやアルコール飲食品等の発酵飲食品の品質に悪影響なく、風味に優れた発酵飲食品を製造することができる酵母を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
古来石見銀山では、採掘作業者が防塵マスクとして梅肉を布で挟み込んだマスクを使用し、人体の安全性を確保していた歴史的背景がある。このため、世界遺産に指定された石見銀山地区では現在も梅の木がとても大事にされている。しかしながら、石見銀山地区はもちろん、全国的にも梅の木から酵母などのように発酵食品製造に有用な微生物が分離されて活用されている例はない。
【０００９】
そこで本発明者らは、かかる石見銀山地区の梅の木に着目し、種々検討をしていたところ、梅の花から単離した酵母の中に上記特性を備えた酵母が存在することを見出した。具体的には、当該酵母を用いて製造したパンは、いわゆる酵母臭が少なく、爽やかな香りを有する。また当該酵母は、発酵能力に優れており、現在広く使用されている酒造用酵母に匹敵するため、パンの製造のみならず、清酒や焼酎などのアルコール含有飲食品の製造にも使用できる。また、１５重量％未満、好ましくは１０重量％以下の塩濃度に対して耐性（耐塩性）があるため、浅漬けなど、食塩濃度が１０重量％以下の発酵食品の製造にも広く使用できることを確認した。
【００１０】
本発明は、これらの知見に基づいて、さらなる研究のもとで完成したものであって、以下の実施形態を備えている。
【００１１】
（Ｉ）梅花酵母
（I-1）梅の花から採取された酵母であって、サッカロミセス セレビシエに属する「石見銀山梅花酵母−1」（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６）（以下、「寄託酵母」ともいう）、またはその継代株。
（I-2）上記寄託酵母が島根県石見銀山地区（島根県大田市大森町）に自生する梅の木の花（梅花）から採取された酵母である、（I-1）記載の寄託酵母またはその継代株。
（I-3）パン、アルコール飲食品、及び塩濃度１０重量％以下の発酵飲食品からなる少なくとも１種の発酵飲食品の製造に使用される、（I-1）または（I-2）に記載の寄託酵母またはその継代株。
（I-4）（I-1）乃至（I-3）記載の寄託酵母またはその継代株を乾燥させてなる乾燥酵母。
【００１２】
（II）発酵飲食品または発酵飼料
（II-1）（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を含むパン製造用の中種。
（II-2）冷凍された中種である、（II-1）に記載するパン製造用の中種。
（II-3）（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を含むパン生地。
（II-4）冷凍パン生地である、（II-3）に記載するパン生地。
（II-5）（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を用いて製造されることを特徴とする発酵飲食品または発酵飼料。
（II-6）発酵飲食品が、パン、アルコール飲食品、及び塩濃度１０重量％以下の発酵飲食品からなる群から選択される少なくとも１種の発酵飲食品である、（II-5）に記載する発酵飲食品。
（II-7）アルコール飲食品が、清酒、料理酒、雑酒、濁酒、ビール、発泡酒、果実酒類、ウイスキー、ブランデー、ワイン、スピリッツ類、及びリキュール類からなる群から選択される少なくとも１種の発酵飲食品である、（II-5）に記載する発酵飲食品。
（II-8）塩濃度１０重量％以下の発酵飲食品が、味噌、醤油、魚醤油、漬け物の素、漬け物、及び塩辛からなる群から選択される少なくとも１種の発酵飲食品である、（II-5）に記載する発酵飲食品。
【００１３】
（III）梅花酵母を用いた発酵飲食品及び発酵飼料の製造方法
（III-1）（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を用いて発酵する工程を有する、発酵飲食品または発酵飼料の製造方法。
（III-2）上記発酵飲食品がパンであり、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を用いてパン生地を調製し、これを発酵する工程を有する、（III-1）に記載する製造方法。
（III-3）上記発酵飲食品がアルコール飲食品であり、アルコール飲食品の製造原料に（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を配合し、これを発酵（醸造）する工程を有する、（III-1）に記載する製造方法。
（III-3）上記発酵飲食品が塩濃度１０重量％以下の発酵飲食品であり、発酵飲食品の製造原料を、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株の存在下で、発酵する工程を有する、（III-1）に記載する製造方法。
（III-4）上記発酵飲食品が塩濃度１０重量％以下の漬け物であり、漬け物の調味液の製造原料を（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株の存在下で発酵（培養）する工程、得られた培養物から酵母菌体を除去し培養液を回収する工程、回収した培養液に野菜を漬け込む工程を有する、（III-1）に記載する製造方法。
【００１４】
なお、本明細書において、上記「石見銀山梅花酵母−1」（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６）（寄託酵母）及びその継代株を総称して、「石見銀山梅花酵母」または単に「梅花酵母」と称する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明が提供する「石見銀山梅花酵母」は、石見銀山地区に自生する梅の花から単離された天然由来の酵母でありながらも、パンの製造や醸造に従来から工業的に用いられている酵母と同様に性質が安定しているとともに、発酵飲食品の製造に使用しても酵母臭が少なく、爽やかな香りを有することを特徴とする。また当該酵母は、発酵能力に優れており、現在広く使用されている酒造用酵母に匹敵するため、パンの製造のみならず、清酒や焼酎などのアルコール飲食品の製造にも使用することができる（実験例８）。このため、本発明の「石見銀山梅花酵母」は、ほのかな爽やかな香りを有するパンやアルコール飲料を製造するために有効に利用することができる（実験例４〜６及び９参照）。さらに、本発明の「石見銀山梅花酵母」は、好ましくは１０重量％以下の塩濃度に対して耐性（耐塩性）があるため(実験例１０参照)、塩濃度が１０重量％以下の、例えば味噌、醤油、調味料または漬け物などの発酵飲食品の製造にも広く使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実験例２において、本発明の梅花酵母の生育可能温度（15〜35℃）を評価した結果を示す図である。横軸は培養時間（hr）、縦軸は菌体濃度の指標となる培養液の吸光度（OD595nm）を示す。
【図２】実験例２において、本発明の梅花酵母の死滅温度（50〜100℃）を評価した結果を示す図である。横軸は培養日数（日）、縦軸は菌体濃度の指標となる培養液の吸光度（OD595nm）を示す。
【図３】実験例２において、本発明の梅花酵母の生育可能ｐＨ（pH3〜8）を評価した結果を示す図である。横軸は培養時間（hr）、縦軸は菌体濃度の指標となる培養液の吸光度（OD595nm）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（Ｉ）新規酵母「石見銀山梅花酵母」
本発明が提供する梅花酵母は、石見銀山地区に自生する梅の花から分離した新規酵母であり、下記の科学的性質及び分類学的性質を有するサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属する菌株である。
【００１８】
（1）科学的性質
（1-1）ＹＭ培地を用いて３０℃で２日間培養したときの菌の形態：
・栄養細胞の大きさ：４〜８μｍ
・栄養細胞の形状：卵型
・増殖の形態：出芽。
【００１９】
（1-2）ＹＭ寒天培地を用い、３０℃で２日間培養したときのコロニーの形態：
・形態：円
・隆起：凸円状
・周縁：円滑
・大きさ（直径）：２〜３mm
・色調：白色で不透明
・表面：円滑で光沢あり。
【００２０】
（1-3）炭素源資化性：
・グルコース、ガラクトース、白糖（サッカロース）、ラフィノース、D-マルトース、パラチノースは資化する。
・シクロヘキシミド、N-アセチル-グルコサミン、乳酸、L-アラビノース、D-セロビオース、トレハロース、2-ケト-グルコン酸カルシウム、α-メチル-α-D-グルコシド、D-マンニトール、乳糖、イノシット、D-ソルビトール、D-キシロース、D-リボース、グリセロール、L-ラムノース、エリスリトール、D-メリビオース、グルクロン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、レブリン酸、L-ソルボース、D-グルコサミン塩酸塩、エスクリンは資化しない。
【００２１】
（1-4）耐塩性：
・１０重量％の塩化ナトリウムを含む培地において少なくとも３日間生育可能である。
【００２２】
（1-5）ＴＴＣ染色性：
・秋山・古川の方法（日本農芸化学会誌No37,398-403(1963)）によるＴＴＣ染色性試験によりコロニーの染色性を観察してところ、コロニーは薄いピンク色を示した。
【００２３】
（1-6）耐アルコール性：
・８重量％のエタノールを含む１％グルコース含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（pH4.3）において少なくとも３日間生育可能である。
【００２４】
（2）分類学的性質
遺伝子解析により、上記梅花酵母の28rRNA遺伝子（rDNA）D1/D2領域塩基配列を決定し、NCBIデータベースに登録されている塩基配列と比較した結果、上記梅花酵母は、Saccharomyces cerevisiae に属する酵母であると判断された。
【００２５】
かかる酵母は、微生物の表示（識別の表示）を「石見銀山梅花酵母−１」として、日本国千葉県木更津かずさ鎌足２−５−８に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、２０１１年２月８日に「受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６」として寄託されている（受託証：通知番号10-401、通知年月日2011年2月28日）。
【００２６】
本発明が対象とする梅花酵母は、本来的に梅花に由来し、上記の科学的性質及び分類学的性質を有するサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属する菌株であればよく、上記寄託酵母だけでなく、その継代株も含まれる。
【００２７】
なお、酵母菌の継代は、定法に従って行うことができ、特に制限されない。例えば、小型試験管にＹＭ寒天培地のスラントをつくり、これに継代する対象の酵母を植菌して、３０℃程度で１８〜４８時間程度培養する方法を挙げることができる。培養により継代された酵母は、通常５℃程度の条件で保存することができるが、この場合、保存開始前に殺菌処理した流動パラフィンを、培地が隠れるまで重層しておくことが望ましい。また、酵母の植え継ぎ期間は４〜６ヶ月ごとに行うことが望ましい。
【００２８】
本発明の梅花酵母の培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じ有機微量栄養素を含有する通常の培地が使用できる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物またはこれを含有するものであればよく、例えば、前述するように、グルコース、ガラクトース、サッカロース、ラフィノース、Ｄ−マルトース、及びパラチノースなどの炭水化物が良好に用いられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物またはこれを含有するものであればよく、例えば、硫安、カザミノ酸、ペプトンなどが使用される。また、リン酸、鉄、カリウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、銅、カルシウムなどの無機塩類を適宜使用することができる。さらに必要に応じて、菌の生育に必要なアミノ酸、ビオチン、リボフラビン、ピリドキシン、ニコチン酸、パントテン酸、葉酸、チアミンなどのビタミン類などを培地に添加して用いることができる。
【００２９】
使用できる培地としては、例えば、麦芽汁培地、麦芽汁寒天培地、ＹＭ寒天培地（酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、グルコース、寒天、蒸留水、pH 5〜6)、ＰＧＹ 培地（酵母エキス、ペプトン、グルコース、蒸留水、pH 5〜6)、Ｖ−８ジュース培地（V-8 ジュース、圧搾パン酵母、KOH 、寒天、蒸留水）、ゴロドワ(Gorodkowa) 寒天培地（グルコース、ペプトン、NaCl、寒天、蒸留水）などが挙げられる。
【００３０】
特に好適な培地としては、酵母エキス、ポリペプトン、グルコースなどよりなる培地が挙げられる。培養は、温度１０〜４０℃程度、好ましくは１５〜３７℃程度で、ｐＨ３〜７程度、好ましくは３.５〜６程度で行われる。酵母の培養は、振盪培養、通気培養、攪拌培養、静置培養などの好気的または嫌気的培養など、適宜好ましい方法を選択して行うことができる。
【００３１】
（II）発酵飲食品または発酵飼料及びこれらの製造方法
本発明が対象とする発酵飲食品及び発酵飼料には、酵母を用いて発酵して製造される飲食品及び飼料、並びに酵母で発酵されたものを用いて製造される飲食品及び飼料が広く含まれる。かかる発酵飲食品としては、具体的には、パン（発酵パン）等のベーカリー製品、アルコール飲食品、塩濃度が１５重量％未満、好ましくは１０重量％以下の発酵飲食品を挙げることができる。
【００３２】
ここでパン（発酵パン）とは、小麦粉（強力粉、準強力粉、中力粉、薄力粉）またはその代替粉をパン酵母によって発酵させて製造されるものであり、砂糖を１０％以下の割合で含む食パン類、及び砂糖をそれ以上、例えば２０〜３０％の割合で含む菓子パン類に分類することができる。小麦粉の代替粉としては、米粉、ライ麦または蕎麦粉等の穀物類の粉を挙げることができ、これらの代替粉は、小麦粉に代えて、または小麦粉と共に使用することができる。なお、本発明が対象とするパンには、酒饅頭などの和菓子や中華饅頭等のパン酵母を用いて生地を発酵して製造される食品も含まれる。
【００３３】
アルコール飲食品としては、清酒、料理酒、雑酒、濁酒、焼酎、ビール、発泡酒、果実酒類、ウイスキーやブランデー類、ワイン、スピリッツ類、及びリキュール類等を挙げることができる。好ましくは清酒、料理酒、雑酒、濁酒、発泡酒、リキュール類及び焼酎であり、より好ましくは清酒、料理酒、雑酒、濁酒、焼酎である。
【００３４】
また塩濃度が１５重量％未満、好ましくは１０重量％以下の発酵食品としては、食塩濃度が上記濃度範囲である味噌、醤油、魚醤油、及び漬け物の素などの調味料；並びに当該調味料を用いて製造される漬け物や塩辛等を挙げることができる。好ましくは味噌、漬け物の素、漬け物、及び塩辛である。
【００３５】
また本発明が対象とする飼料は、飼料原料に酵母自体を含むもの、または酵母によって発酵させて製造されるものであり、例えば、乾燥酵母菌体、また雑草、破棄果物やオカラなどの食品廃棄物を酵母を用いて発酵処理したものを挙げることができる。かかる飼料を供給する対象の動物としては、例えば牛、豚、家禽類等の家畜、並びに魚介類などの養殖魚を挙げることができる。
【００３６】
（1）パンの製造方法
本発明において、パン（発酵パン）は、製パン酵母として本発明の梅花酵母を使用する以外は、通常の製パン方法に従って製造することができる。パンの製法には、全原料を一度に捏ねて発酵させる「直捏法」と、小麦粉または代替粉の一部とパン酵母だけで中種を作り、発酵させた後に、残りの全原料を加えて再度混捏し、仕上げ、焙炉、焼成を行う「中種法」がある。本発明の梅花酵母は、これら両方の製造方法においてパン酵母として使用することができる。
【００３７】
一例を挙げると、「直捏法」の場合、小麦粉またはその代替粉１００重量部に対して梅花酵母を乾燥菌体重量として通常２〜６重量部程度の割合で用い、その他の成分として食塩及び砂糖等の副原料、並びに必要に応じて製パン用改良剤（フード）、油脂（バター又はマーガリン）または卵を、水とともに混捏し、これを温度２５〜３２℃程度、相対湿度７０〜９０％程度の条件で、６０〜１２０分間程度発酵する（一次発酵）。次いで、ガス抜きをした後、再び温度３０〜４２℃程度、相対湿度８０〜９５％程度の条件で、８０〜１８０分間程度発酵する（二次発酵）。斯くして調製した生地を、定法に従って、分割、丸め、ねかし、整形、焙炉（最終発酵）、及び焼成を行うことでパンが製造される。
【００３８】
他の例を挙げると、「中種法」の場合、小麦粉またはその代替粉７０重量部程度に対して梅花酵母を乾燥菌体重量として通常２〜６重量部程度の割合で用い、これを水、及び必要に応じて製パン用改良剤（フード）とともに混捏し（中種）、これを温度２０〜３０℃程度、相対湿度７０〜９０％程度の条件で、１２０〜６００分間程度発酵する（中種発酵）。生成した中種に、小麦粉またはその代替粉３０重量部程度、食塩及び砂糖等の副原料、並びに必要に応じて油脂（バターやマーガリン）または卵を、水とともに混捏し、斯くして調製した生地を、定法に従って、分割、丸め、ねかし、整形、焙炉（最終発酵）、及び焼成を行うことでパンが製造される。
【００３９】
斯くして製造されるパンは、発酵に使用する梅花酵母に起因して、爽やかな香りを有している（実施例３〜５）。
【００４０】
（2）アルコール飲食品の製造方法
本発明の梅花酵母を用いて芳香を持つ清酒などのアルコール飲食品を製造する場合、梅花酵母は予め前培養しておくことが好ましい。例えば、寒天斜面培地などに保持されている梅花酵母は、適当な液体栄養培地で静置培養され、それを酵母源とすることができる。
【００４１】
清酒製造などでは、例えばもろみの約７％にあたる米と麹を用いて酒母の製造がなされる。発酵の原料としては、糖質を含有するもの、セルロース質あるいはデンプン質のもの、例えば、サトウキビやこれから採った糖蜜、サツマイモ、ジャガイモ、トウモロコシ、キャサバ、テンサイなど、果物あるいは野菜の汁、例えば、麦芽汁、ブドウ、リンゴ、マルメロ、グレープフルーツ、オレンジ、ミカンなどの柑橘類、カリン、ナシ、西洋ナシ、ビワ、アンズ、ウメ、カキ、サクランボ、スモモ、ナツメ、モモ、ネクタリン、イチジク、キイチゴ、グミ、ザクロ、キウイフルーツ、マンゴー、バナナ、パインアップル、パパイヤ、グアバ、ヤシなどの果汁、穀物、例えば、米、小麦などから調整されたもろみなど、小麦粉を主として含むもの、例えば、パン生地、菓子パン生地、饅頭生地などが挙げられる。穀物、例えば、米、小麦など、ジャガイモ、サツマイモなどのイモ類などに含まれるセルロース質あるいはデンプン質のものを利用する場合、それらセルロース質あるいはデンプン質のものを予め発酵可能な糖類に変換しておくことが好ましい。清酒用のもろみは特に好ましく用いられる。
【００４２】
アルコール飲食品を製造する場合、目的とする飲料の種類に応じ、酒税法及び酒税法施行令や規則などの法令に定められた原料を用いることが好ましい。例えば、清酒や雑酒では、米、麦、ヒエ、アワ、トウモロコシ、コウリャン、キビ、及びこれらから得られる糖質を用いることができる。糖質は酵母によりそのまま発酵するが、デンプン質、セルロース質などは、まず液化酵素や糖化酵素などにより発酵可能な糖質に転化された後、酵母の作用を受けて発酵する。このような酵素源としては当該分野で公知のもののうちから選択して用いることができ、例えば、麦芽や麹などに含まれる酵素、具体的には、乳酸菌、糸状菌；例えば、アスペルギルス オリゼー(Aspergillus oryzae)などの麹生産菌などが生産する酵素、具体的にはα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ジアスターゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ラクターゼなどの酵素を挙げることができる。
【００４３】
醸造は、アルコール飲食品の種類により異なるが、例えば、清酒では温度５ 〜２５℃程度、好ましくは１０〜２０℃程度で行われる。
【００４４】
例えば、清酒では、まずもろみの約７％にあたる蒸米と麹を用い酵母の培養物たる酒母の製造がなされる。次に炭素源とする原料、水及び無機塩類を温度管理のできるタンクに仕込み、酒母を添加して発酵を開始する。一般に清酒、焼酎などの製造では、発酵の始めに炭素源の一部を仕込み、発酵に伴い残りの炭素源を追加していく段仕込みが行われる。もろみの製造は、清酒では、おおよそ約１５℃を中心に１０℃〜約１８℃で管理されるが、より低温で処理し香りを重視した方法を採ることもできる。もろみの発酵は、約１５日〜４５日程度で終了するのが一般的である。焼酎製造では、清酒よりやや高い温度で処理され、かつもろみの期間も短縮できる。もろみは発酵が順調に進むように攪拌することもできるし、その温度も各段階に応じて変化調整することができる。
【００４５】
清酒では、こうして得られたもろみは圧搾濾過などにより酒粕と分離されて原酒となる。本発明の梅花酵母を用いて得られる芳香を持つアルコール飲食品としては、ビール、発泡酒、ワイン、清酒、料理酒、雑酒、濁酒、老酒、紹興酒など、また発酵製品をさらに蒸留して得られるウイスキー、ブランデー、焼酎、ジン、テキーラ、ウォッカ、その他の酒類などが挙げられる。特に好ましいものとしては清酒、料理酒、雑酒、濁酒、焼酎が挙げられる。果実から得られる果汁、例えば、ブドウ果汁、ミカン果汁を利用すれば、ワインが得られる。
【００４６】
なお、アルコール飲食品の製造に使用する梅花酵母の割合としては、制限はされないが、例えばアルコール飲食品として清酒またはワインを製造する場合、酒母１ml（g）に対して、純粋培養した酵母の割合が約１０5cell/ml(g)〜約１０7cell/ml(g)程度になるように設定し調整することが好ましい。
【００４７】
斯くして製造されるアルコール飲食品、発酵に使用する梅花酵母に起因して、フルーティーな爽やかな香りを有している（実施例８）。
【００４８】
（3）塩濃度が１０重量％以下の発酵飲食品の製造方法
ここで対象とする発酵飲食品としては、前述するように、食塩濃度が１０重量％以下にある味噌、醤油、魚醤油、及び漬け物の素などの調味料；並びに当該調味料を用いて製造される漬け物や塩辛等を挙げることができる。
【００４９】
当該発酵飲食品は、食塩を１０重量％以下の割合で含むこれら飲食品の原材料を、梅花酵母の存在下、発酵条件におくことによって製造することができる。発酵条件としては、空気存在下（好気条件下）、温度２５〜３０℃程度を例示することができる。例えば、漬け物の素は、梅花酵母を糖度１０（Brix:10）の麹汁中で培養し、その後、酵母菌体を除去することにより調製することができ、回収した培養液はそのまま若しくは希釈した状態で液状の漬け物の素としてもよいし、また凍結乾燥若しくは噴霧乾燥した乾燥物の状態で漬け物の素とすることもできる。
【００５０】
本発明の発酵飲食品には、上記漬け物の素を調味液として、これに野菜を漬け込むことによって製造される漬け物（浅漬けを含む）が含まれる。例えば、浅漬けとしてハクサイ漬けやダイコン漬けを調製する方法として、上記漬け物の素を２．５〜５％（乾燥重量）の割合で含む食塩濃度３％の浸漬液に、原料の白菜や大根１０ｋｇを漬ける方法；キュウリ漬けやナス漬けを調製する方法として、上記漬け物の素を５〜７％（乾燥重量）の割合で含む食塩濃度３％の浸漬液に、原料の胡瓜や茄子１０ｋｇを漬ける方法などを例示することができる。
【実施例】
【００５１】
実験例１
（１）梅花酵母の単離
本発明に用いられる酵母「石見銀山梅花酵母−１」は、次の方法で梅花より分離した。
【００５２】
島根県大田市大森町（石見銀山地区）に自生する梅の木に咲いていた花を採取し、この花全体を１０輪ずつ２５０ｍｌのＹＭ培地（ペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、ブドウ糖１０ｇ、蒸留水１Ｌの割合）に入れ、２５℃で５日間静置培養した。このうちガスの発生が確認されたものについて、適宜希釈して０．１ｍｌずつ真菌（酵母）測定用培地（ポテトデキストロース寒天培地１Ｌ当たりにクロラムフェニコール１００ｍｇ、塩化ナトリウム５０ｇ、プロピオン酸ナトリウム２ｇ、ｐＨ５.４）に塗抹して、２５℃で５日間培養した。この培地において成育したコロニーを、１００ｍｌの麹汁培地（米麹に３倍の水を添加して５５℃で５時間糖化した後、ろ過して得られた液汁を水で糖度８（Brix:8）に調製したもの）に接種して、３０℃で５日間培養した。これらのうち、ガス発酵、表面膜の発生が無いこと、官能的に立ち香が良いことなどを確認して、特に香りが優れていると判断された酵母について、再度５００ｍｌ麹汁培地で培養して香りなどの確認を行った。
【００５３】
以上の作業を、梅花の採取場所を変えて３回行い、特に香りが優れていると判断した酵母を「石見銀山梅花酵母」とした。
【００５４】
（２）梅花酵母の同定
上記方法で単離した酵母「石見銀山梅花酵母」の分類学的な性質は次のとおりであった。
【００５５】
（2-1）．科学的性質
（i）ＹＭ培地を用い30℃で2日間培養したときの菌の形態
（a）栄養細胞の大きさ：4〜8μm、
（b）栄養細胞の形状：卵形、
（c）増殖の形態：出芽。
【００５６】
（ii）ＹＭ培地を用い30℃で2日間培養したときのコロニーの形態
（a）形状：円、
（b）隆起：凸型、
（c）コロニーの直径：2〜3mm、
（d）色調：白色で不透明、
（e）表面：円滑で光沢有り。
【００５７】
（iii）炭素源資化性
酵母同定検査キット（「アピID32シリーズ（ID32C）」シスメックス（株）製）を用い、３０℃で２日間培養して表１に記載する炭素源の資化性を評価した。比較のため、市販パン酵母（「スーパーカメリア ドライイースト」日清製粉（株）製）の炭素源資化性、及びこの同定検査キットに記載されているSaccharomyces cerevisiaeの炭素源資化性と併せて、結果を表1に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
（iv）耐塩性
１０重量％の塩化ナトリウムを含む培地において少なくとも３日間生育可能である。
【００６０】
（ｖ）アルコール耐性：
８重量％のエタノールを含む１％グルコース含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（pH4.3）において少なくとも３日間生育可能である。
【００６１】
（vi）ＴＴＣ染色性
秋山・古川の方法（日本農芸化学会誌No37,398-403(1963)）により、ＴＴＣ染色性試験を行った。具体的には、菌体を適当に希釈し（１プレートに約200程度となるよう）、ＴＴＣ下層培地（1リットルに４４．１７ｇの割合で使用。４４．１７ｇの内容はブドウ糖１０．０ｇ、ペプトン２．０ｇ、酵母エキス１．５ｇ、酸性リン酸カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム０．４ｇ、クエン酸０．２７ｇ、寒天３０．０ｇ、pH４．５±０．１）に30℃で2日間プレート培養したコロニーへ、ＴＴＣ上層培地（１００mlに２ｇ使用。２ｇの内容は、ＴＴＣ０．０５ｇ、ブドウ糖０．５ｇ、寒天１．５ｇ）を溶解後４５℃程度にしてから静かに重層し、固まった後30℃に２〜３時間放置し、コロニーの染色を観察した。この染色結果、本発明の酵母は薄いピンク色を示した。これに対して、日本醸造協会の頒布酵母（協会７号及び９号）は赤色を示したので、本発明の酵母は日本醸造協会の酵母とは異なることが確認された。
【００６２】
（2-2）．部分塩基配列
寄託菌の部分塩基配列を解析し、NCBIデータベースに登録されている塩基配列と比較した。その結果、Saccharomyces cerevisiae に属すると判断された（ID%＝99.9%、T index＝0.89）（委託検査先：ビジョンバイオ株式会社、食品検査センター：福岡県久留米市）。
【００６３】
以上のことから、「石見銀山梅花酵母」は、安全性が確認され、広くパン製造や酒造などの食品製造に使用されている、Saccharomyces cerevisiaeに属する酵母であり、また清酒製造において島根県で最も普及している協会酵母（協会７号、9号）とも、また市販の製パン酵母とも異なるものであると判断された。
【００６４】
実験例２ 梅花酵母の生理的性質に関する実験
本発明の「石見銀山梅花酵母」（梅花酵母）について、生理的性質（生育可能温度、死滅温度、生育可能ｐＨ）を評価した。
【００６５】
１．生存可能温度の評価
（1）測定方法
YPD培地（1％Yeast Extract，2％Polypeptone，2％Glucose）50mLを入れ殺菌した100mL容三角フラスコに、液体培養した梅花酵母の懸濁液（1mL）を加え、15℃〜35℃の温度条件（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃）で培養し、経時的に培養液を採取して菌体濃度を測定し、梅花酵母の発育状況を確認した。培養液中の菌体濃度の測定は、経時的に採取した培養液を96穴プレートに200μLを取り、マルチラベルカウンタ（Wallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウンタ（PerkinElmer））で595nmの吸光度（OD595）を計測することにより行った（サンプルOD595）。具体的には、同時に菌体を植菌していない培地（対照培地）を同様に培養し、それから経時的に採取した培養液の吸光度（OD595）を「ブランクOD595」とし、当該ブランクOD595を上記サンプルOD595から差し引くことで、培養液中の菌体濃度を算出した。
【００６６】
【数１】
【００６７】
（2）測定結果
結果を図１に示す。図１に示すように、梅花酵母は35℃の培養温度で最も増殖の立ち上がりが早かった。30℃、25℃、20℃及び15℃と培養温度が低くなるにつれて増殖速度に遅延が見られたが、いずれも24〜48時間培養することで（15℃の場合は、48時間）、ほぼ同じ菌体濃度に達することが確認された。この結果から、梅花酵母は15℃〜35℃のいずれの温度条件でも生育可能であること、最適生育温度は30℃〜35℃であることが確認された。
【００６８】
２．死滅温度の測定
（1）測定方法
YPD培地10mLを入れ殺菌した試験管を、50℃〜100℃の各種温度の湯浴中に浸しておき、この状態の試験管に、新しくYPD培地にて培養した梅花酵母の懸濁液を0.5mLずつ無菌的に移植した。10分後、直ちに30℃前後まで冷やして、引き続き30℃の定温器中で培養した。培養から２日目に、培養液を採取して菌体濃度を測定して、梅花酵母が増殖しなかった試験管の適用温度を死滅温度とした。対照試験として、高温処理をしない試験管に梅花酵母の懸濁液を移植し、同様に菌体濃度を測定した。培養液中の菌体濃度は、１と同様に、採取した培養液を96穴プレートに200μLを取り、マルチラベルカウンタで595nmの吸光度（OD595）を計測することにより行い（サンプルOD595）、ブランクOD595を上記サンプルOD595から差し引くことで算出した。
【００６９】
（2）測定結果
結果を図２に示す。図２に示すように、梅花酵母は50℃の高温処理を行ってもコントロールと同様の生育を示した。しかし、60℃以上の高温になると菌体の増殖が見られず死滅していた。このことから、梅花酵母は50℃まで生育可能であり、60℃以上で死滅することが確認された。
【００７０】
３．生育可能ｐＨの測定
（1）測定方法
YPD培地に酸またはアルカリを加えてpH3.0〜8.0に調節したもの10mLずつを試験管に入れて殺菌し、これに、ＹPD培地にて培養した梅花酵母の懸濁液を0.5mLずつ無菌的に移植し、30℃にて培養を行った。培養から24時間目及び48時間目に、培養液を採取して１及び２と同様に、菌体濃度を測定して、梅花酵母の発育状況から、生育可能ｐＨを評価した。
【００７１】
（2）測定結果
結果を図３に示す。図３に示すように、梅花酵母はpH3.0〜8.0のいずれのｐＨ条件でも生育可能であった。ただ、pH7〜8の弱アルカリ性に比べ、pH4〜6の弱酸性側で比較的早く増殖する傾向が認められた。最も増殖が良いpH条件はpH5であった。また、アルカリ性条件下よりも、酸性条件下の方が炭酸ガスの発生が多く、よく効率的に発酵している傾向が認められた。
【００７２】
以上の試験結果を纏めると、梅花酵母の生育に適した温度は30℃〜35℃であり、これは一般的な酵母の最適温度（30℃前後）と一致していた。梅花酵母の死滅温度は、一般の酵母と同様に60℃以上であった。パン酵母の場合、酸性側でよく発酵し、最適pHは4.5〜4.8とされるが、上記生存可能ｐHの試験結果から、本発明の梅花酵母もアルカリ性よりも酸性側を好み、よく発酵することが判明した。以上のことから、梅花酵母の生理的性質は、パンの製造や醸造に従来から工業的に用いられている酵母と同様に、性質が安定していることが確認された。特に梅花酵母は、特にパン酵母として相応しい性質を備えていると考えられた。
【００７３】
実験例３ パン酵母としての発酵試験
日本イースト工業会の定めたパン用酵母試験法（平成８年８月）に基づき、本発明の「石見銀山梅花酵母」及び市販の乾燥酵母を用いて、発酵試験を行った。
【００７４】
「石見銀山梅花酵母」は、前記した麹汁培地で３０℃、７日間静置培養してから８０００ｒｐｍで遠心分離を行い、回収したものを用いた（水分含量78％）。また比較用の乾燥酵母は市販品（商品名「スーパーカメリア ドライイースト」、日清製粉(株)製）（水分含量３％）を使用した。
【００７５】
１．低糖生地膨張力試験
各酵母（石見銀山梅花酵母５ｇ、乾燥酵母１ｇ：いずれも乾燥重量が約１gになるように調整）、小麦粉１００ｇ、ショ糖５ｇ、食塩２ｇ、及び水６２ｍｌを用いてパン用生地を調製した（糖濃度約３％）。この生地を、直径６．７ｃｍ、高さ２４．０ｃｍで１０ｍｌ刻みの目盛りのついた両端が開いたシリンダーへ、底から詰めた。これを３０℃のインキュベーター内に６０分静置し１次発酵させた。次いで室温で手作業により生地のガス抜きをし、それから再び同じく３０℃のインキュベーター内に４０分静置し、２次発酵させた。
【００７６】
１次発酵後及び２次発酵後にそれぞれ生地の膨張率をシリンダーの目盛り（体積）を読むことで測定した。乾燥酵母の膨張率を１００として、石見銀山梅花酵母の膨張率の相対値を求めた結果を表２に示す。
【００７７】
【表２】
【００７８】
２．高糖生地膨張力試験
各酵母（石見銀山梅花酵母５ｇ（乾燥重量1.1g）、乾燥酵母１.５ｇ（乾燥重量1.45g））、小麦粉１００ｇ、ショ糖３０ｇ、食塩０．５ｇ、及び水５２ｍｌを用いてパン用生地を調製した（糖濃度約１６％）。この生地をシリンダーに詰めて、３０℃のインキュベーター内に８０分静置し1次発酵させた。次いでガス抜きした後、３０℃で４０分２次発酵させた。
【００７９】
１次発酵後及び２次発酵後にそれぞれ生地の膨張率は体積を測定して求めた。乾燥酵母の膨張率を１００として、石見銀山梅花酵母の膨張率の相対値を求めた結果を表３に示す。
【００８０】
【表３】
【００８１】
３．無糖生地膨張力試験
各酵母（石見銀山梅花酵母５ｇ（乾燥重量1.1g）、乾燥酵母１.５ｇ（乾燥重量約1g））、小麦粉１００ｇ、食塩２ｇ、及び水６５ｍｌを用いてパン用生地を調製した（糖濃度０％）。これを３０℃のインキュベーター内に６０分静置し１次発酵させた。次いでガス抜きをし、それから再び同じく３０℃のインキュベーター内に４０分静置し２次発酵させた。
【００８２】
１次発酵後及び２次発酵後にそれぞれ生地の膨張率は体積を測定して求めた。乾燥酵母の膨張率を１００として、石見銀山梅花酵母の膨張率の相対値を求めた結果を表４に示す。
【００８３】
【表４】
【００８４】
４．発酵温度と発酵時間の検討
（１）発酵温度の検討
各酵母（石見銀山梅花酵母、乾燥酵母）について、発酵温度を３３℃、３５℃、及び３８℃に設定して、上記「２．低糖生地膨張力試験」を行った。１次発酵後及び２次発酵後にそれぞれの生地の膨張率を測定した。乾燥酵母の膨張率を１００として、石見銀山梅花酵母の膨張率の相対値を求めた結果を表５に示す。
【００８５】
【表５】
【００８６】
（２）発酵時間の検討
各酵母（石見銀山梅花酵母、乾燥酵母）について、発酵温度を３０℃、３３℃、３５℃、３８℃に設定して、上記「２．低糖生地膨張力試験」を行った。乾燥酵母については、低糖生地膨張力試験における発酵時間を通常の１次発酵６０分、２次発酵４０分に設定した。一方、石見銀山梅花酵母については、生地の膨張度（体積）が上記乾燥酵母を用いた生地と同じになるまで１次発酵も２次発酵も発酵時間を延長し、延長に要した追加時間を測定した。
【００８７】
その結果、石見銀山梅花酵母を用いて乾燥酵母と同様の生地膨張度を得るには、１次発酵で３０分間の延長（合計９０分）、２次発酵で１０分間の延長（合計５０分）が必要であった。なお膨張度（体積）が２次発酵で最も大きくなったのは、３０℃での膨脹度の１．２倍になった３８℃であった。
【００８８】
以上のことから、石見銀山梅花酵母は乾燥酵母と比較して、高糖耐性は低いが、食パンなどの仕込み配合と同様な低糖生地では、発酵温度が３８℃で、発酵時間を乾燥酵母より若干長くすれば、同等な発酵能力を示すことがわかった。
【００８９】
実験例４ パンの製造試験とパンの評価
表６に示す配合割合を用いて、定法に従ってパンを製造した。
【００９０】
１．パンの製造
【００９１】
【表６】
【００９２】
１次発酵は３０℃で、乾燥酵母については６０分間、石見銀山梅花酵母については７０分間行った。次いで、ガス抜きをした後、３０℃で１５分間のベンチタイムをとり、その後、生地を食パン型のケースに入れ、３８℃に設定したインキュベーター内で、乾燥酵母については８０分間、石見銀山梅花酵母については１００分間、発酵させた（２次発酵）。こうすることで体積が発酵開始時の約２倍に膨れた。次にこれらを１８０℃にセットした電気オーブンで３０分間焼成した。なおパンの膨れた状況を比較するために、パン切断面（山の一番膨れた部分を切断した）の面積を求めた結果、比較例１のパン切断面の面積を１００として、比較例２は１０７、実施例は１０２となり、「石見銀山梅花酵母」によるパンの膨脹度は、乾燥酵母によるそれとほぼ同等であることが示された。
【００９３】
２．パンの評価
（1）官能評価
上記で製造した各パンについて官能評価を行った。パンの種類が分からない状態にして、パネラーの４名で、パンの香り、味、及び総合評価（香味全体のバランス）について、３段階（Ａ：好ましい、Ｂ:どちらでもない、Ｃ：好ましくない）で検査した。その結果を表７に示す。
【００９４】
【表７】
【００９５】
上記の結果からわかるように「石見銀山梅花酵母」を用いて製造したパンは、酵母特有の臭いがなく、爽やかな香りがするという評価が得られた。
【００９６】
（2）焼き色の評価
焼成後のパンについて、表面の焼き色を、色差計（日本電色工業製：NF333）を用いてL*a*b*を測定し、評価した。
【００９７】
結果を表８に示す。
【００９８】
【表８】
【００９９】
実施例１のパンのL*の値（明るさ）が有意に低いことから判るように、「石見銀山梅花酵母」を用いて製造したパンは、乾燥酵母を用いて製造したパンと比べて、焼き色が濃く、香ばしい色に焼けることが判明した。
【０１００】
実験例５ 米粉パンの製造試験と米粉パンの評価
各酵母（石見銀山梅花酵母、乾燥酵母）と市販のグルテン入りの米粉を用いて米粉パンを製造し、出来上がった米粉パンについて官能試験を行った。
【０１０１】
１．米粉パンの製造
表９に示す配合割合を用いて、米粉用のホームベーカリー（サンヨー（株）製、米粉ベーカリー：SPM-MP3）を用いて、パンを製造した。
【０１０２】
【表９】
【０１０３】
１次発酵は３０℃で４０分間行った。次いで、ガス抜きをした後、３０℃で１５分間のベンチタイムをとり、その後、生地を食パン型のケースに入れ、３８℃に設定したインキュベーター内で、乾燥酵母については５０分間、石見銀山梅花酵母については７０分間、発酵させた（２次発酵）。こうすることで体積が発酵開始時の約２倍に膨れた。次にこれらを１８０℃にセットした電気オーブンで３０分間焼成した。いずれのパンもきつね色に焼き上がった。
【０１０４】
２．パンの評価
（1）官能評価
上記で製造した米粉パン（実施例３、比較例３）について官能評価を行った。パンの種類が分からない状態にして、パネラー１４名で、パンの香り、味、及び総合評価（香味のバランス）について、３段階（Ａ：好ましい、Ｂ:どちらでもない、Ｃ：好ましくない）で検査した。結果を表１０に示す。
【０１０５】
【表１０】
【０１０６】
以上のように、石見銀山梅花酵母で作った米パンの方が、香りが爽やかであるなど、乾燥酵母のパンよりも風味が優れているという評価が得られた。
【０１０７】
実験例６ パンの香気成分の分析
実験例５で香り及び味を評価した米粉パン（比較例３及び実施例３）について、それに含まれる香気成分を分析した。
【０１０８】
１．分析方法
焼成した２種類の米粉パン（比較例３及び実施例３）を細かく切り刻み、5ｇずつサンプル瓶に密閉し、ヘッドスペースガスクロマトグラフ（ガスクロマトグラフ：GC-2014、島津製作所製＋ヘッドスペースサンプラ：TurboMatrix40、パーキンエルマー社製、カラム：TC-WAX）で揮発成分を測定した。サンプル瓶は50℃で15分間保持してから、瓶内のヘッドスペースガスを採取して、分析に用いた。
【０１０９】
２．分析結果
パン100ｇ当たりのエタノール、およびイソブチルアルコール、イソアミルアルコールの量を表１１に示す。
【０１１０】
【表１１】
【０１１１】
この結果から、梅花酵母を用いて製造したパンは、市販パン酵母を用いて製造したパンと比較して、エタノール含有量が１.３倍高く、一方、油臭と表現される香気成分であるイソブチルアルコールとイソアミルアルコールの含有量は、それぞれ０.５４倍（45/84）及び０.６７倍（48/72）低いことが判明した。
【０１１２】
実験例７ 耐アルコール性試験
本発明の石見銀山梅花酵母が、清酒などのアルコール飲食品の製造に使用できるかどうかを調べるために、耐アルコール性について調べた。
【０１１３】
具体的には、石見銀山梅花酵母および協会701号を、それぞれYPD培地で３０℃で２日間培養した後、集菌し、これを各種エタノール濃度（８％、１１％、１４％）の１％グルコース含有０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ４.３）６ｍｌにそれぞれ懸濁して、３０℃で３日間静置し、生存率％を測定した。
【０１１４】
結果を表１２に示す。
【０１１５】
【表１２】
【０１１６】
これからわかるように、石見銀山梅花酵母は、アルコール耐性が予め確認されている日本醸造協会が頒布している協会７０１号と同等のアルコール耐性を備えていることが確認された。
【０１１７】
実験例８ 清酒の小仕込み試験
実験例７でアルコール耐性が確認された協会７０１号と本発明の石見銀山梅花酵母を使用して、清酒の仕込み試験を行った。
【０１１８】
１．清酒の仕込み
仕込み配合を表１３に示す。原料米は精米歩合５０％の五百万石を用い、２０００ｍｌ綿栓三角フラスコに三段仕込み（麹歩合２２％、汲み水歩合１４５％）を行った。なお各酵母（石見銀山梅花酵母、協会７０１号）は３０ｍｌの麹汁培地で５日間培養したものを、初添に添加した。仕込み温度は、初添１５℃、仲添と留添１０℃とし、もろみ最高温度１３℃、もろみ日数２５日とした。
【０１１９】
【表１３】
【０１２０】
２．清酒製造能の評価
仕込み期間中、フラスコの重量変化を経時的に測定した。重量変化は、協会７０１号を用いた場合も、また石見銀山梅花酵母を用いた場合もほぼ同様の傾向を示した。いずれも留添後７日間は約１０ｇずつ減少したが、減少の程度は徐々に少なくなり、１４日目以降は１日約２ｇずつの減少ペースとなった。
【０１２１】
協会７０１号及び石見銀山梅花酵母を用いて、それぞれもろみ日数２５日目に遠心分離して得られた清酒（比較例４、実施例４）の成分を測定した。その結果を表１４に示す。
【０１２２】
【表１４】
【０１２３】
これからわかるように、石見銀山梅花酵母は、日本酒醸造において多く使用されている酵母（協会７０１号）と比較して、もろみ経過、またアルコール生成能力（アルコール分、日本酒度）や酸度及びアミノ酸度等の成分についてほぼ同じ値を示した。このことから、石見銀山梅花酵母は、清酒に対しても十分な製造能力を有すると考えられた。
【０１２４】
実験例９ 清酒の香気成分及び有機酸の分析
実験例８で製造した清酒（比較例４及び実施例４）について、それに含まれる香気成分と有機酸を分析した。
【０１２５】
１．分析方法
（1-1）香気成分の分析
２種類の清酒（実施例４及び比較例４）は、それぞれ5mlずつサンプル瓶に充填密閉し、ヘッドスペースガスクロマトグラフ（ガスクロマトグラフ：島津製作所製GC-2014＋ヘッドスペースサンプラ：パーキンエルマー社製TurboMatrix40、カラム：TC-WAX）で揮発成分を測定した。サンプル瓶は50℃で15分間保持してから、瓶内のヘッドスペースガスを採取して、分析に用いた。
【０１２６】
（1-2）有機酸の分析
有機酸は、高速液体クロマトグラフ（島津製作所製：LC-10、カラム:Shim-pack SCR-102H）で行った。
【０１２７】
２．分析結果
香気成分及び有機酸の分析結果をそれぞれ表１５及び表１６に示す。
【０１２８】
【表１５】
【０１２９】
【表１６】
【０１３０】
この結果からわかるように、実施例４と比較例４の清酒に含まれる香気成分と有機酸成分の含有量に大きな差は見られなかった。しかし、梅花酵母で製造した実施例４の清酒には、協会７０１号で製造した比較例４の清酒よりも、果物のリンゴ様の香りであるカプロン酸エチルが１.２倍高い割合で含まれていた。カプロン酸エチルの匂いの閾値は、3ppmと言われているので、これが要因で、実施例４の清酒のほうが比較例４の清酒よりも、フルーティーで爽やかな印象を与えているものと考えられる。
【０１３１】
また有機酸の含有量は、梅花酵母で製造した実施例４の清酒の方が、協会７０１号で製造した比較例４の清酒よりも若干低く、酸度がわずかに低いことから、これが、実施例４の清酒がフルーティーで爽やかな風味を有する一つの要因になっていると考えられる。
【０１３２】
実施例１０ 耐塩性試験
本発明の石見銀山梅花酵母が、漬物などの塩蔵食品の発酵（製造）に使用できるかどうかを調べるために、耐塩性について調べた。
【０１３３】
糖度１０（Brix:10）に調整した麹汁培地に対して、塩濃度が０％、２％、５％、１０％、１５％、２０％になるように食塩を加え、この液に５日間培養した石見銀山梅花酵母を１０％添加して（１.９×１０７cfu/ml）、３０℃、３日間静置して、それぞれの培養液の生菌数を測定した。
【０１３４】
結果を表１７に示す。
【０１３５】
【表１７】
【０１３６】
表１７に示すように、石見銀山梅花酵母は食塩濃度が１０重量％の培地中で、少なくとも３０℃で３日生存することが確認された。このことから、石見銀山梅花酵母は、食塩濃度が１５％を超える醤油などの発酵調味料の製造には使用できないが、食塩濃度が１５％未満、好ましくは１０％以下の発酵調味料の製造や、サラダ感覚で消費される浅漬けのような漬物類の製造には使用が可能であると判断された。
【受託番号】
【０１３７】
ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６
【技術分野】
【０００１】
本発明は、梅花から単離した新規酵母に関する。また本発明は、当該新規酵母を用いて製造される各種発酵飲食品、例えばパンや菓子等のベーカリー類；清酒や焼酎などのアルコール飲食品；漬け物等の発酵食品；並びに家畜や養殖魚用の飼料などに関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、従来より発酵飲食品、例えばワイン、ビール、清酒などのアルコール飲料；味噌、醤油、酢及び味醂などの発酵調味料；漬け物やキムチなどの発酵食品；パンや菓子などのベーカリー類等の製造に広く使用されている。
【０００３】
しかし、例えば、現在市販されている製パン用乾燥酵母は、その殆どが外国製のものであるが、これを用いてパンを製造すると、酵母特有の酵母臭が発生し、風味が好ましくない等といった評価がされている。天然酵母については、製パン業界では干しぶどうなどの果実等から種起こしが行なわれているが、発酵力が不安定であるなどの問題がある。さらに市販されている天然酵母は、製造したパンの食感が硬くなるなどといった、出来上がったパンの品質が必ずしもよくないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2003-116523号公報
【特許文献２】特開2001-372313号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前述するように、干ブドウ等の果物などから種起こしをした天然酵母は、発酵力が安定していないので、これを用いてパンを製造するためには熟練した技術を要する。このため、製パン酵母として汎用するにはあまり適していない。また既存の天然酵母や乾燥酵母は、香りなどの風味や食感など、パンの品質に悪影響を与えることが多い。
【０００６】
これらのことから、天然由来でありながらも発酵力に安定性があり、かつパン等の発酵飲食品の品質に悪影響を及ぼすことがなく、逆に風味に優れた発酵飲食品を製造することができる酵母の開発が望まれている。
【０００７】
本発明は、かかる従来の課題を解決することを目的とする。具体的には、安定した発酵力を発揮する天然酵母であって、かつパンやアルコール飲食品等の発酵飲食品の品質に悪影響なく、風味に優れた発酵飲食品を製造することができる酵母を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
古来石見銀山では、採掘作業者が防塵マスクとして梅肉を布で挟み込んだマスクを使用し、人体の安全性を確保していた歴史的背景がある。このため、世界遺産に指定された石見銀山地区では現在も梅の木がとても大事にされている。しかしながら、石見銀山地区はもちろん、全国的にも梅の木から酵母などのように発酵食品製造に有用な微生物が分離されて活用されている例はない。
【０００９】
そこで本発明者らは、かかる石見銀山地区の梅の木に着目し、種々検討をしていたところ、梅の花から単離した酵母の中に上記特性を備えた酵母が存在することを見出した。具体的には、当該酵母を用いて製造したパンは、いわゆる酵母臭が少なく、爽やかな香りを有する。また当該酵母は、発酵能力に優れており、現在広く使用されている酒造用酵母に匹敵するため、パンの製造のみならず、清酒や焼酎などのアルコール含有飲食品の製造にも使用できる。また、１５重量％未満、好ましくは１０重量％以下の塩濃度に対して耐性（耐塩性）があるため、浅漬けなど、食塩濃度が１０重量％以下の発酵食品の製造にも広く使用できることを確認した。
【００１０】
本発明は、これらの知見に基づいて、さらなる研究のもとで完成したものであって、以下の実施形態を備えている。
【００１１】
（Ｉ）梅花酵母
（I-1）梅の花から採取された酵母であって、サッカロミセス セレビシエに属する「石見銀山梅花酵母−1」（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６）（以下、「寄託酵母」ともいう）、またはその継代株。
（I-2）上記寄託酵母が島根県石見銀山地区（島根県大田市大森町）に自生する梅の木の花（梅花）から採取された酵母である、（I-1）記載の寄託酵母またはその継代株。
（I-3）パン、アルコール飲食品、及び塩濃度１０重量％以下の発酵飲食品からなる少なくとも１種の発酵飲食品の製造に使用される、（I-1）または（I-2）に記載の寄託酵母またはその継代株。
（I-4）（I-1）乃至（I-3）記載の寄託酵母またはその継代株を乾燥させてなる乾燥酵母。
【００１２】
（II）発酵飲食品または発酵飼料
（II-1）（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を含むパン製造用の中種。
（II-2）冷凍された中種である、（II-1）に記載するパン製造用の中種。
（II-3）（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を含むパン生地。
（II-4）冷凍パン生地である、（II-3）に記載するパン生地。
（II-5）（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を用いて製造されることを特徴とする発酵飲食品または発酵飼料。
（II-6）発酵飲食品が、パン、アルコール飲食品、及び塩濃度１０重量％以下の発酵飲食品からなる群から選択される少なくとも１種の発酵飲食品である、（II-5）に記載する発酵飲食品。
（II-7）アルコール飲食品が、清酒、料理酒、雑酒、濁酒、ビール、発泡酒、果実酒類、ウイスキー、ブランデー、ワイン、スピリッツ類、及びリキュール類からなる群から選択される少なくとも１種の発酵飲食品である、（II-5）に記載する発酵飲食品。
（II-8）塩濃度１０重量％以下の発酵飲食品が、味噌、醤油、魚醤油、漬け物の素、漬け物、及び塩辛からなる群から選択される少なくとも１種の発酵飲食品である、（II-5）に記載する発酵飲食品。
【００１３】
（III）梅花酵母を用いた発酵飲食品及び発酵飼料の製造方法
（III-1）（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を用いて発酵する工程を有する、発酵飲食品または発酵飼料の製造方法。
（III-2）上記発酵飲食品がパンであり、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を用いてパン生地を調製し、これを発酵する工程を有する、（III-1）に記載する製造方法。
（III-3）上記発酵飲食品がアルコール飲食品であり、アルコール飲食品の製造原料に（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株を配合し、これを発酵（醸造）する工程を有する、（III-1）に記載する製造方法。
（III-3）上記発酵飲食品が塩濃度１０重量％以下の発酵飲食品であり、発酵飲食品の製造原料を、（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株の存在下で、発酵する工程を有する、（III-1）に記載する製造方法。
（III-4）上記発酵飲食品が塩濃度１０重量％以下の漬け物であり、漬け物の調味液の製造原料を（I-1）乃至（I-4）のいずれかに記載する寄託酵母またはその継代株の存在下で発酵（培養）する工程、得られた培養物から酵母菌体を除去し培養液を回収する工程、回収した培養液に野菜を漬け込む工程を有する、（III-1）に記載する製造方法。
【００１４】
なお、本明細書において、上記「石見銀山梅花酵母−1」（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６）（寄託酵母）及びその継代株を総称して、「石見銀山梅花酵母」または単に「梅花酵母」と称する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明が提供する「石見銀山梅花酵母」は、石見銀山地区に自生する梅の花から単離された天然由来の酵母でありながらも、パンの製造や醸造に従来から工業的に用いられている酵母と同様に性質が安定しているとともに、発酵飲食品の製造に使用しても酵母臭が少なく、爽やかな香りを有することを特徴とする。また当該酵母は、発酵能力に優れており、現在広く使用されている酒造用酵母に匹敵するため、パンの製造のみならず、清酒や焼酎などのアルコール飲食品の製造にも使用することができる（実験例８）。このため、本発明の「石見銀山梅花酵母」は、ほのかな爽やかな香りを有するパンやアルコール飲料を製造するために有効に利用することができる（実験例４〜６及び９参照）。さらに、本発明の「石見銀山梅花酵母」は、好ましくは１０重量％以下の塩濃度に対して耐性（耐塩性）があるため(実験例１０参照)、塩濃度が１０重量％以下の、例えば味噌、醤油、調味料または漬け物などの発酵飲食品の製造にも広く使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実験例２において、本発明の梅花酵母の生育可能温度（15〜35℃）を評価した結果を示す図である。横軸は培養時間（hr）、縦軸は菌体濃度の指標となる培養液の吸光度（OD595nm）を示す。
【図２】実験例２において、本発明の梅花酵母の死滅温度（50〜100℃）を評価した結果を示す図である。横軸は培養日数（日）、縦軸は菌体濃度の指標となる培養液の吸光度（OD595nm）を示す。
【図３】実験例２において、本発明の梅花酵母の生育可能ｐＨ（pH3〜8）を評価した結果を示す図である。横軸は培養時間（hr）、縦軸は菌体濃度の指標となる培養液の吸光度（OD595nm）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（Ｉ）新規酵母「石見銀山梅花酵母」
本発明が提供する梅花酵母は、石見銀山地区に自生する梅の花から分離した新規酵母であり、下記の科学的性質及び分類学的性質を有するサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属する菌株である。
【００１８】
（1）科学的性質
（1-1）ＹＭ培地を用いて３０℃で２日間培養したときの菌の形態：
・栄養細胞の大きさ：４〜８μｍ
・栄養細胞の形状：卵型
・増殖の形態：出芽。
【００１９】
（1-2）ＹＭ寒天培地を用い、３０℃で２日間培養したときのコロニーの形態：
・形態：円
・隆起：凸円状
・周縁：円滑
・大きさ（直径）：２〜３mm
・色調：白色で不透明
・表面：円滑で光沢あり。
【００２０】
（1-3）炭素源資化性：
・グルコース、ガラクトース、白糖（サッカロース）、ラフィノース、D-マルトース、パラチノースは資化する。
・シクロヘキシミド、N-アセチル-グルコサミン、乳酸、L-アラビノース、D-セロビオース、トレハロース、2-ケト-グルコン酸カルシウム、α-メチル-α-D-グルコシド、D-マンニトール、乳糖、イノシット、D-ソルビトール、D-キシロース、D-リボース、グリセロール、L-ラムノース、エリスリトール、D-メリビオース、グルクロン酸ナトリウム、グルコン酸カリウム、レブリン酸、L-ソルボース、D-グルコサミン塩酸塩、エスクリンは資化しない。
【００２１】
（1-4）耐塩性：
・１０重量％の塩化ナトリウムを含む培地において少なくとも３日間生育可能である。
【００２２】
（1-5）ＴＴＣ染色性：
・秋山・古川の方法（日本農芸化学会誌No37,398-403(1963)）によるＴＴＣ染色性試験によりコロニーの染色性を観察してところ、コロニーは薄いピンク色を示した。
【００２３】
（1-6）耐アルコール性：
・８重量％のエタノールを含む１％グルコース含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（pH4.3）において少なくとも３日間生育可能である。
【００２４】
（2）分類学的性質
遺伝子解析により、上記梅花酵母の28rRNA遺伝子（rDNA）D1/D2領域塩基配列を決定し、NCBIデータベースに登録されている塩基配列と比較した結果、上記梅花酵母は、Saccharomyces cerevisiae に属する酵母であると判断された。
【００２５】
かかる酵母は、微生物の表示（識別の表示）を「石見銀山梅花酵母−１」として、日本国千葉県木更津かずさ鎌足２−５−８に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、２０１１年２月８日に「受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６」として寄託されている（受託証：通知番号10-401、通知年月日2011年2月28日）。
【００２６】
本発明が対象とする梅花酵母は、本来的に梅花に由来し、上記の科学的性質及び分類学的性質を有するサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に属する菌株であればよく、上記寄託酵母だけでなく、その継代株も含まれる。
【００２７】
なお、酵母菌の継代は、定法に従って行うことができ、特に制限されない。例えば、小型試験管にＹＭ寒天培地のスラントをつくり、これに継代する対象の酵母を植菌して、３０℃程度で１８〜４８時間程度培養する方法を挙げることができる。培養により継代された酵母は、通常５℃程度の条件で保存することができるが、この場合、保存開始前に殺菌処理した流動パラフィンを、培地が隠れるまで重層しておくことが望ましい。また、酵母の植え継ぎ期間は４〜６ヶ月ごとに行うことが望ましい。
【００２８】
本発明の梅花酵母の培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じ有機微量栄養素を含有する通常の培地が使用できる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物またはこれを含有するものであればよく、例えば、前述するように、グルコース、ガラクトース、サッカロース、ラフィノース、Ｄ−マルトース、及びパラチノースなどの炭水化物が良好に用いられる。窒素源としては、資化可能な窒素化合物またはこれを含有するものであればよく、例えば、硫安、カザミノ酸、ペプトンなどが使用される。また、リン酸、鉄、カリウム、マグネシウム、亜鉛、マンガン、銅、カルシウムなどの無機塩類を適宜使用することができる。さらに必要に応じて、菌の生育に必要なアミノ酸、ビオチン、リボフラビン、ピリドキシン、ニコチン酸、パントテン酸、葉酸、チアミンなどのビタミン類などを培地に添加して用いることができる。
【００２９】
使用できる培地としては、例えば、麦芽汁培地、麦芽汁寒天培地、ＹＭ寒天培地（酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、グルコース、寒天、蒸留水、pH 5〜6)、ＰＧＹ 培地（酵母エキス、ペプトン、グルコース、蒸留水、pH 5〜6)、Ｖ−８ジュース培地（V-8 ジュース、圧搾パン酵母、KOH 、寒天、蒸留水）、ゴロドワ(Gorodkowa) 寒天培地（グルコース、ペプトン、NaCl、寒天、蒸留水）などが挙げられる。
【００３０】
特に好適な培地としては、酵母エキス、ポリペプトン、グルコースなどよりなる培地が挙げられる。培養は、温度１０〜４０℃程度、好ましくは１５〜３７℃程度で、ｐＨ３〜７程度、好ましくは３.５〜６程度で行われる。酵母の培養は、振盪培養、通気培養、攪拌培養、静置培養などの好気的または嫌気的培養など、適宜好ましい方法を選択して行うことができる。
【００３１】
（II）発酵飲食品または発酵飼料及びこれらの製造方法
本発明が対象とする発酵飲食品及び発酵飼料には、酵母を用いて発酵して製造される飲食品及び飼料、並びに酵母で発酵されたものを用いて製造される飲食品及び飼料が広く含まれる。かかる発酵飲食品としては、具体的には、パン（発酵パン）等のベーカリー製品、アルコール飲食品、塩濃度が１５重量％未満、好ましくは１０重量％以下の発酵飲食品を挙げることができる。
【００３２】
ここでパン（発酵パン）とは、小麦粉（強力粉、準強力粉、中力粉、薄力粉）またはその代替粉をパン酵母によって発酵させて製造されるものであり、砂糖を１０％以下の割合で含む食パン類、及び砂糖をそれ以上、例えば２０〜３０％の割合で含む菓子パン類に分類することができる。小麦粉の代替粉としては、米粉、ライ麦または蕎麦粉等の穀物類の粉を挙げることができ、これらの代替粉は、小麦粉に代えて、または小麦粉と共に使用することができる。なお、本発明が対象とするパンには、酒饅頭などの和菓子や中華饅頭等のパン酵母を用いて生地を発酵して製造される食品も含まれる。
【００３３】
アルコール飲食品としては、清酒、料理酒、雑酒、濁酒、焼酎、ビール、発泡酒、果実酒類、ウイスキーやブランデー類、ワイン、スピリッツ類、及びリキュール類等を挙げることができる。好ましくは清酒、料理酒、雑酒、濁酒、発泡酒、リキュール類及び焼酎であり、より好ましくは清酒、料理酒、雑酒、濁酒、焼酎である。
【００３４】
また塩濃度が１５重量％未満、好ましくは１０重量％以下の発酵食品としては、食塩濃度が上記濃度範囲である味噌、醤油、魚醤油、及び漬け物の素などの調味料；並びに当該調味料を用いて製造される漬け物や塩辛等を挙げることができる。好ましくは味噌、漬け物の素、漬け物、及び塩辛である。
【００３５】
また本発明が対象とする飼料は、飼料原料に酵母自体を含むもの、または酵母によって発酵させて製造されるものであり、例えば、乾燥酵母菌体、また雑草、破棄果物やオカラなどの食品廃棄物を酵母を用いて発酵処理したものを挙げることができる。かかる飼料を供給する対象の動物としては、例えば牛、豚、家禽類等の家畜、並びに魚介類などの養殖魚を挙げることができる。
【００３６】
（1）パンの製造方法
本発明において、パン（発酵パン）は、製パン酵母として本発明の梅花酵母を使用する以外は、通常の製パン方法に従って製造することができる。パンの製法には、全原料を一度に捏ねて発酵させる「直捏法」と、小麦粉または代替粉の一部とパン酵母だけで中種を作り、発酵させた後に、残りの全原料を加えて再度混捏し、仕上げ、焙炉、焼成を行う「中種法」がある。本発明の梅花酵母は、これら両方の製造方法においてパン酵母として使用することができる。
【００３７】
一例を挙げると、「直捏法」の場合、小麦粉またはその代替粉１００重量部に対して梅花酵母を乾燥菌体重量として通常２〜６重量部程度の割合で用い、その他の成分として食塩及び砂糖等の副原料、並びに必要に応じて製パン用改良剤（フード）、油脂（バター又はマーガリン）または卵を、水とともに混捏し、これを温度２５〜３２℃程度、相対湿度７０〜９０％程度の条件で、６０〜１２０分間程度発酵する（一次発酵）。次いで、ガス抜きをした後、再び温度３０〜４２℃程度、相対湿度８０〜９５％程度の条件で、８０〜１８０分間程度発酵する（二次発酵）。斯くして調製した生地を、定法に従って、分割、丸め、ねかし、整形、焙炉（最終発酵）、及び焼成を行うことでパンが製造される。
【００３８】
他の例を挙げると、「中種法」の場合、小麦粉またはその代替粉７０重量部程度に対して梅花酵母を乾燥菌体重量として通常２〜６重量部程度の割合で用い、これを水、及び必要に応じて製パン用改良剤（フード）とともに混捏し（中種）、これを温度２０〜３０℃程度、相対湿度７０〜９０％程度の条件で、１２０〜６００分間程度発酵する（中種発酵）。生成した中種に、小麦粉またはその代替粉３０重量部程度、食塩及び砂糖等の副原料、並びに必要に応じて油脂（バターやマーガリン）または卵を、水とともに混捏し、斯くして調製した生地を、定法に従って、分割、丸め、ねかし、整形、焙炉（最終発酵）、及び焼成を行うことでパンが製造される。
【００３９】
斯くして製造されるパンは、発酵に使用する梅花酵母に起因して、爽やかな香りを有している（実施例３〜５）。
【００４０】
（2）アルコール飲食品の製造方法
本発明の梅花酵母を用いて芳香を持つ清酒などのアルコール飲食品を製造する場合、梅花酵母は予め前培養しておくことが好ましい。例えば、寒天斜面培地などに保持されている梅花酵母は、適当な液体栄養培地で静置培養され、それを酵母源とすることができる。
【００４１】
清酒製造などでは、例えばもろみの約７％にあたる米と麹を用いて酒母の製造がなされる。発酵の原料としては、糖質を含有するもの、セルロース質あるいはデンプン質のもの、例えば、サトウキビやこれから採った糖蜜、サツマイモ、ジャガイモ、トウモロコシ、キャサバ、テンサイなど、果物あるいは野菜の汁、例えば、麦芽汁、ブドウ、リンゴ、マルメロ、グレープフルーツ、オレンジ、ミカンなどの柑橘類、カリン、ナシ、西洋ナシ、ビワ、アンズ、ウメ、カキ、サクランボ、スモモ、ナツメ、モモ、ネクタリン、イチジク、キイチゴ、グミ、ザクロ、キウイフルーツ、マンゴー、バナナ、パインアップル、パパイヤ、グアバ、ヤシなどの果汁、穀物、例えば、米、小麦などから調整されたもろみなど、小麦粉を主として含むもの、例えば、パン生地、菓子パン生地、饅頭生地などが挙げられる。穀物、例えば、米、小麦など、ジャガイモ、サツマイモなどのイモ類などに含まれるセルロース質あるいはデンプン質のものを利用する場合、それらセルロース質あるいはデンプン質のものを予め発酵可能な糖類に変換しておくことが好ましい。清酒用のもろみは特に好ましく用いられる。
【００４２】
アルコール飲食品を製造する場合、目的とする飲料の種類に応じ、酒税法及び酒税法施行令や規則などの法令に定められた原料を用いることが好ましい。例えば、清酒や雑酒では、米、麦、ヒエ、アワ、トウモロコシ、コウリャン、キビ、及びこれらから得られる糖質を用いることができる。糖質は酵母によりそのまま発酵するが、デンプン質、セルロース質などは、まず液化酵素や糖化酵素などにより発酵可能な糖質に転化された後、酵母の作用を受けて発酵する。このような酵素源としては当該分野で公知のもののうちから選択して用いることができ、例えば、麦芽や麹などに含まれる酵素、具体的には、乳酸菌、糸状菌；例えば、アスペルギルス オリゼー(Aspergillus oryzae)などの麹生産菌などが生産する酵素、具体的にはα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ジアスターゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、ラクターゼなどの酵素を挙げることができる。
【００４３】
醸造は、アルコール飲食品の種類により異なるが、例えば、清酒では温度５ 〜２５℃程度、好ましくは１０〜２０℃程度で行われる。
【００４４】
例えば、清酒では、まずもろみの約７％にあたる蒸米と麹を用い酵母の培養物たる酒母の製造がなされる。次に炭素源とする原料、水及び無機塩類を温度管理のできるタンクに仕込み、酒母を添加して発酵を開始する。一般に清酒、焼酎などの製造では、発酵の始めに炭素源の一部を仕込み、発酵に伴い残りの炭素源を追加していく段仕込みが行われる。もろみの製造は、清酒では、おおよそ約１５℃を中心に１０℃〜約１８℃で管理されるが、より低温で処理し香りを重視した方法を採ることもできる。もろみの発酵は、約１５日〜４５日程度で終了するのが一般的である。焼酎製造では、清酒よりやや高い温度で処理され、かつもろみの期間も短縮できる。もろみは発酵が順調に進むように攪拌することもできるし、その温度も各段階に応じて変化調整することができる。
【００４５】
清酒では、こうして得られたもろみは圧搾濾過などにより酒粕と分離されて原酒となる。本発明の梅花酵母を用いて得られる芳香を持つアルコール飲食品としては、ビール、発泡酒、ワイン、清酒、料理酒、雑酒、濁酒、老酒、紹興酒など、また発酵製品をさらに蒸留して得られるウイスキー、ブランデー、焼酎、ジン、テキーラ、ウォッカ、その他の酒類などが挙げられる。特に好ましいものとしては清酒、料理酒、雑酒、濁酒、焼酎が挙げられる。果実から得られる果汁、例えば、ブドウ果汁、ミカン果汁を利用すれば、ワインが得られる。
【００４６】
なお、アルコール飲食品の製造に使用する梅花酵母の割合としては、制限はされないが、例えばアルコール飲食品として清酒またはワインを製造する場合、酒母１ml（g）に対して、純粋培養した酵母の割合が約１０5cell/ml(g)〜約１０7cell/ml(g)程度になるように設定し調整することが好ましい。
【００４７】
斯くして製造されるアルコール飲食品、発酵に使用する梅花酵母に起因して、フルーティーな爽やかな香りを有している（実施例８）。
【００４８】
（3）塩濃度が１０重量％以下の発酵飲食品の製造方法
ここで対象とする発酵飲食品としては、前述するように、食塩濃度が１０重量％以下にある味噌、醤油、魚醤油、及び漬け物の素などの調味料；並びに当該調味料を用いて製造される漬け物や塩辛等を挙げることができる。
【００４９】
当該発酵飲食品は、食塩を１０重量％以下の割合で含むこれら飲食品の原材料を、梅花酵母の存在下、発酵条件におくことによって製造することができる。発酵条件としては、空気存在下（好気条件下）、温度２５〜３０℃程度を例示することができる。例えば、漬け物の素は、梅花酵母を糖度１０（Brix:10）の麹汁中で培養し、その後、酵母菌体を除去することにより調製することができ、回収した培養液はそのまま若しくは希釈した状態で液状の漬け物の素としてもよいし、また凍結乾燥若しくは噴霧乾燥した乾燥物の状態で漬け物の素とすることもできる。
【００５０】
本発明の発酵飲食品には、上記漬け物の素を調味液として、これに野菜を漬け込むことによって製造される漬け物（浅漬けを含む）が含まれる。例えば、浅漬けとしてハクサイ漬けやダイコン漬けを調製する方法として、上記漬け物の素を２．５〜５％（乾燥重量）の割合で含む食塩濃度３％の浸漬液に、原料の白菜や大根１０ｋｇを漬ける方法；キュウリ漬けやナス漬けを調製する方法として、上記漬け物の素を５〜７％（乾燥重量）の割合で含む食塩濃度３％の浸漬液に、原料の胡瓜や茄子１０ｋｇを漬ける方法などを例示することができる。
【実施例】
【００５１】
実験例１
（１）梅花酵母の単離
本発明に用いられる酵母「石見銀山梅花酵母−１」は、次の方法で梅花より分離した。
【００５２】
島根県大田市大森町（石見銀山地区）に自生する梅の木に咲いていた花を採取し、この花全体を１０輪ずつ２５０ｍｌのＹＭ培地（ペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、ブドウ糖１０ｇ、蒸留水１Ｌの割合）に入れ、２５℃で５日間静置培養した。このうちガスの発生が確認されたものについて、適宜希釈して０．１ｍｌずつ真菌（酵母）測定用培地（ポテトデキストロース寒天培地１Ｌ当たりにクロラムフェニコール１００ｍｇ、塩化ナトリウム５０ｇ、プロピオン酸ナトリウム２ｇ、ｐＨ５.４）に塗抹して、２５℃で５日間培養した。この培地において成育したコロニーを、１００ｍｌの麹汁培地（米麹に３倍の水を添加して５５℃で５時間糖化した後、ろ過して得られた液汁を水で糖度８（Brix:8）に調製したもの）に接種して、３０℃で５日間培養した。これらのうち、ガス発酵、表面膜の発生が無いこと、官能的に立ち香が良いことなどを確認して、特に香りが優れていると判断された酵母について、再度５００ｍｌ麹汁培地で培養して香りなどの確認を行った。
【００５３】
以上の作業を、梅花の採取場所を変えて３回行い、特に香りが優れていると判断した酵母を「石見銀山梅花酵母」とした。
【００５４】
（２）梅花酵母の同定
上記方法で単離した酵母「石見銀山梅花酵母」の分類学的な性質は次のとおりであった。
【００５５】
（2-1）．科学的性質
（i）ＹＭ培地を用い30℃で2日間培養したときの菌の形態
（a）栄養細胞の大きさ：4〜8μm、
（b）栄養細胞の形状：卵形、
（c）増殖の形態：出芽。
【００５６】
（ii）ＹＭ培地を用い30℃で2日間培養したときのコロニーの形態
（a）形状：円、
（b）隆起：凸型、
（c）コロニーの直径：2〜3mm、
（d）色調：白色で不透明、
（e）表面：円滑で光沢有り。
【００５７】
（iii）炭素源資化性
酵母同定検査キット（「アピID32シリーズ（ID32C）」シスメックス（株）製）を用い、３０℃で２日間培養して表１に記載する炭素源の資化性を評価した。比較のため、市販パン酵母（「スーパーカメリア ドライイースト」日清製粉（株）製）の炭素源資化性、及びこの同定検査キットに記載されているSaccharomyces cerevisiaeの炭素源資化性と併せて、結果を表1に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
（iv）耐塩性
１０重量％の塩化ナトリウムを含む培地において少なくとも３日間生育可能である。
【００６０】
（ｖ）アルコール耐性：
８重量％のエタノールを含む１％グルコース含有０．１Ｍ酢酸緩衝液（pH4.3）において少なくとも３日間生育可能である。
【００６１】
（vi）ＴＴＣ染色性
秋山・古川の方法（日本農芸化学会誌No37,398-403(1963)）により、ＴＴＣ染色性試験を行った。具体的には、菌体を適当に希釈し（１プレートに約200程度となるよう）、ＴＴＣ下層培地（1リットルに４４．１７ｇの割合で使用。４４．１７ｇの内容はブドウ糖１０．０ｇ、ペプトン２．０ｇ、酵母エキス１．５ｇ、酸性リン酸カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム０．４ｇ、クエン酸０．２７ｇ、寒天３０．０ｇ、pH４．５±０．１）に30℃で2日間プレート培養したコロニーへ、ＴＴＣ上層培地（１００mlに２ｇ使用。２ｇの内容は、ＴＴＣ０．０５ｇ、ブドウ糖０．５ｇ、寒天１．５ｇ）を溶解後４５℃程度にしてから静かに重層し、固まった後30℃に２〜３時間放置し、コロニーの染色を観察した。この染色結果、本発明の酵母は薄いピンク色を示した。これに対して、日本醸造協会の頒布酵母（協会７号及び９号）は赤色を示したので、本発明の酵母は日本醸造協会の酵母とは異なることが確認された。
【００６２】
（2-2）．部分塩基配列
寄託菌の部分塩基配列を解析し、NCBIデータベースに登録されている塩基配列と比較した。その結果、Saccharomyces cerevisiae に属すると判断された（ID%＝99.9%、T index＝0.89）（委託検査先：ビジョンバイオ株式会社、食品検査センター：福岡県久留米市）。
【００６３】
以上のことから、「石見銀山梅花酵母」は、安全性が確認され、広くパン製造や酒造などの食品製造に使用されている、Saccharomyces cerevisiaeに属する酵母であり、また清酒製造において島根県で最も普及している協会酵母（協会７号、9号）とも、また市販の製パン酵母とも異なるものであると判断された。
【００６４】
実験例２ 梅花酵母の生理的性質に関する実験
本発明の「石見銀山梅花酵母」（梅花酵母）について、生理的性質（生育可能温度、死滅温度、生育可能ｐＨ）を評価した。
【００６５】
１．生存可能温度の評価
（1）測定方法
YPD培地（1％Yeast Extract，2％Polypeptone，2％Glucose）50mLを入れ殺菌した100mL容三角フラスコに、液体培養した梅花酵母の懸濁液（1mL）を加え、15℃〜35℃の温度条件（15℃、20℃、25℃、30℃、35℃）で培養し、経時的に培養液を採取して菌体濃度を測定し、梅花酵母の発育状況を確認した。培養液中の菌体濃度の測定は、経時的に採取した培養液を96穴プレートに200μLを取り、マルチラベルカウンタ（Wallac 1420 ARVOsx マルチラベルカウンタ（PerkinElmer））で595nmの吸光度（OD595）を計測することにより行った（サンプルOD595）。具体的には、同時に菌体を植菌していない培地（対照培地）を同様に培養し、それから経時的に採取した培養液の吸光度（OD595）を「ブランクOD595」とし、当該ブランクOD595を上記サンプルOD595から差し引くことで、培養液中の菌体濃度を算出した。
【００６６】
【数１】
【００６７】
（2）測定結果
結果を図１に示す。図１に示すように、梅花酵母は35℃の培養温度で最も増殖の立ち上がりが早かった。30℃、25℃、20℃及び15℃と培養温度が低くなるにつれて増殖速度に遅延が見られたが、いずれも24〜48時間培養することで（15℃の場合は、48時間）、ほぼ同じ菌体濃度に達することが確認された。この結果から、梅花酵母は15℃〜35℃のいずれの温度条件でも生育可能であること、最適生育温度は30℃〜35℃であることが確認された。
【００６８】
２．死滅温度の測定
（1）測定方法
YPD培地10mLを入れ殺菌した試験管を、50℃〜100℃の各種温度の湯浴中に浸しておき、この状態の試験管に、新しくYPD培地にて培養した梅花酵母の懸濁液を0.5mLずつ無菌的に移植した。10分後、直ちに30℃前後まで冷やして、引き続き30℃の定温器中で培養した。培養から２日目に、培養液を採取して菌体濃度を測定して、梅花酵母が増殖しなかった試験管の適用温度を死滅温度とした。対照試験として、高温処理をしない試験管に梅花酵母の懸濁液を移植し、同様に菌体濃度を測定した。培養液中の菌体濃度は、１と同様に、採取した培養液を96穴プレートに200μLを取り、マルチラベルカウンタで595nmの吸光度（OD595）を計測することにより行い（サンプルOD595）、ブランクOD595を上記サンプルOD595から差し引くことで算出した。
【００６９】
（2）測定結果
結果を図２に示す。図２に示すように、梅花酵母は50℃の高温処理を行ってもコントロールと同様の生育を示した。しかし、60℃以上の高温になると菌体の増殖が見られず死滅していた。このことから、梅花酵母は50℃まで生育可能であり、60℃以上で死滅することが確認された。
【００７０】
３．生育可能ｐＨの測定
（1）測定方法
YPD培地に酸またはアルカリを加えてpH3.0〜8.0に調節したもの10mLずつを試験管に入れて殺菌し、これに、ＹPD培地にて培養した梅花酵母の懸濁液を0.5mLずつ無菌的に移植し、30℃にて培養を行った。培養から24時間目及び48時間目に、培養液を採取して１及び２と同様に、菌体濃度を測定して、梅花酵母の発育状況から、生育可能ｐＨを評価した。
【００７１】
（2）測定結果
結果を図３に示す。図３に示すように、梅花酵母はpH3.0〜8.0のいずれのｐＨ条件でも生育可能であった。ただ、pH7〜8の弱アルカリ性に比べ、pH4〜6の弱酸性側で比較的早く増殖する傾向が認められた。最も増殖が良いpH条件はpH5であった。また、アルカリ性条件下よりも、酸性条件下の方が炭酸ガスの発生が多く、よく効率的に発酵している傾向が認められた。
【００７２】
以上の試験結果を纏めると、梅花酵母の生育に適した温度は30℃〜35℃であり、これは一般的な酵母の最適温度（30℃前後）と一致していた。梅花酵母の死滅温度は、一般の酵母と同様に60℃以上であった。パン酵母の場合、酸性側でよく発酵し、最適pHは4.5〜4.8とされるが、上記生存可能ｐHの試験結果から、本発明の梅花酵母もアルカリ性よりも酸性側を好み、よく発酵することが判明した。以上のことから、梅花酵母の生理的性質は、パンの製造や醸造に従来から工業的に用いられている酵母と同様に、性質が安定していることが確認された。特に梅花酵母は、特にパン酵母として相応しい性質を備えていると考えられた。
【００７３】
実験例３ パン酵母としての発酵試験
日本イースト工業会の定めたパン用酵母試験法（平成８年８月）に基づき、本発明の「石見銀山梅花酵母」及び市販の乾燥酵母を用いて、発酵試験を行った。
【００７４】
「石見銀山梅花酵母」は、前記した麹汁培地で３０℃、７日間静置培養してから８０００ｒｐｍで遠心分離を行い、回収したものを用いた（水分含量78％）。また比較用の乾燥酵母は市販品（商品名「スーパーカメリア ドライイースト」、日清製粉(株)製）（水分含量３％）を使用した。
【００７５】
１．低糖生地膨張力試験
各酵母（石見銀山梅花酵母５ｇ、乾燥酵母１ｇ：いずれも乾燥重量が約１gになるように調整）、小麦粉１００ｇ、ショ糖５ｇ、食塩２ｇ、及び水６２ｍｌを用いてパン用生地を調製した（糖濃度約３％）。この生地を、直径６．７ｃｍ、高さ２４．０ｃｍで１０ｍｌ刻みの目盛りのついた両端が開いたシリンダーへ、底から詰めた。これを３０℃のインキュベーター内に６０分静置し１次発酵させた。次いで室温で手作業により生地のガス抜きをし、それから再び同じく３０℃のインキュベーター内に４０分静置し、２次発酵させた。
【００７６】
１次発酵後及び２次発酵後にそれぞれ生地の膨張率をシリンダーの目盛り（体積）を読むことで測定した。乾燥酵母の膨張率を１００として、石見銀山梅花酵母の膨張率の相対値を求めた結果を表２に示す。
【００７７】
【表２】
【００７８】
２．高糖生地膨張力試験
各酵母（石見銀山梅花酵母５ｇ（乾燥重量1.1g）、乾燥酵母１.５ｇ（乾燥重量1.45g））、小麦粉１００ｇ、ショ糖３０ｇ、食塩０．５ｇ、及び水５２ｍｌを用いてパン用生地を調製した（糖濃度約１６％）。この生地をシリンダーに詰めて、３０℃のインキュベーター内に８０分静置し1次発酵させた。次いでガス抜きした後、３０℃で４０分２次発酵させた。
【００７９】
１次発酵後及び２次発酵後にそれぞれ生地の膨張率は体積を測定して求めた。乾燥酵母の膨張率を１００として、石見銀山梅花酵母の膨張率の相対値を求めた結果を表３に示す。
【００８０】
【表３】
【００８１】
３．無糖生地膨張力試験
各酵母（石見銀山梅花酵母５ｇ（乾燥重量1.1g）、乾燥酵母１.５ｇ（乾燥重量約1g））、小麦粉１００ｇ、食塩２ｇ、及び水６５ｍｌを用いてパン用生地を調製した（糖濃度０％）。これを３０℃のインキュベーター内に６０分静置し１次発酵させた。次いでガス抜きをし、それから再び同じく３０℃のインキュベーター内に４０分静置し２次発酵させた。
【００８２】
１次発酵後及び２次発酵後にそれぞれ生地の膨張率は体積を測定して求めた。乾燥酵母の膨張率を１００として、石見銀山梅花酵母の膨張率の相対値を求めた結果を表４に示す。
【００８３】
【表４】
【００８４】
４．発酵温度と発酵時間の検討
（１）発酵温度の検討
各酵母（石見銀山梅花酵母、乾燥酵母）について、発酵温度を３３℃、３５℃、及び３８℃に設定して、上記「２．低糖生地膨張力試験」を行った。１次発酵後及び２次発酵後にそれぞれの生地の膨張率を測定した。乾燥酵母の膨張率を１００として、石見銀山梅花酵母の膨張率の相対値を求めた結果を表５に示す。
【００８５】
【表５】
【００８６】
（２）発酵時間の検討
各酵母（石見銀山梅花酵母、乾燥酵母）について、発酵温度を３０℃、３３℃、３５℃、３８℃に設定して、上記「２．低糖生地膨張力試験」を行った。乾燥酵母については、低糖生地膨張力試験における発酵時間を通常の１次発酵６０分、２次発酵４０分に設定した。一方、石見銀山梅花酵母については、生地の膨張度（体積）が上記乾燥酵母を用いた生地と同じになるまで１次発酵も２次発酵も発酵時間を延長し、延長に要した追加時間を測定した。
【００８７】
その結果、石見銀山梅花酵母を用いて乾燥酵母と同様の生地膨張度を得るには、１次発酵で３０分間の延長（合計９０分）、２次発酵で１０分間の延長（合計５０分）が必要であった。なお膨張度（体積）が２次発酵で最も大きくなったのは、３０℃での膨脹度の１．２倍になった３８℃であった。
【００８８】
以上のことから、石見銀山梅花酵母は乾燥酵母と比較して、高糖耐性は低いが、食パンなどの仕込み配合と同様な低糖生地では、発酵温度が３８℃で、発酵時間を乾燥酵母より若干長くすれば、同等な発酵能力を示すことがわかった。
【００８９】
実験例４ パンの製造試験とパンの評価
表６に示す配合割合を用いて、定法に従ってパンを製造した。
【００９０】
１．パンの製造
【００９１】
【表６】
【００９２】
１次発酵は３０℃で、乾燥酵母については６０分間、石見銀山梅花酵母については７０分間行った。次いで、ガス抜きをした後、３０℃で１５分間のベンチタイムをとり、その後、生地を食パン型のケースに入れ、３８℃に設定したインキュベーター内で、乾燥酵母については８０分間、石見銀山梅花酵母については１００分間、発酵させた（２次発酵）。こうすることで体積が発酵開始時の約２倍に膨れた。次にこれらを１８０℃にセットした電気オーブンで３０分間焼成した。なおパンの膨れた状況を比較するために、パン切断面（山の一番膨れた部分を切断した）の面積を求めた結果、比較例１のパン切断面の面積を１００として、比較例２は１０７、実施例は１０２となり、「石見銀山梅花酵母」によるパンの膨脹度は、乾燥酵母によるそれとほぼ同等であることが示された。
【００９３】
２．パンの評価
（1）官能評価
上記で製造した各パンについて官能評価を行った。パンの種類が分からない状態にして、パネラーの４名で、パンの香り、味、及び総合評価（香味全体のバランス）について、３段階（Ａ：好ましい、Ｂ:どちらでもない、Ｃ：好ましくない）で検査した。その結果を表７に示す。
【００９４】
【表７】
【００９５】
上記の結果からわかるように「石見銀山梅花酵母」を用いて製造したパンは、酵母特有の臭いがなく、爽やかな香りがするという評価が得られた。
【００９６】
（2）焼き色の評価
焼成後のパンについて、表面の焼き色を、色差計（日本電色工業製：NF333）を用いてL*a*b*を測定し、評価した。
【００９７】
結果を表８に示す。
【００９８】
【表８】
【００９９】
実施例１のパンのL*の値（明るさ）が有意に低いことから判るように、「石見銀山梅花酵母」を用いて製造したパンは、乾燥酵母を用いて製造したパンと比べて、焼き色が濃く、香ばしい色に焼けることが判明した。
【０１００】
実験例５ 米粉パンの製造試験と米粉パンの評価
各酵母（石見銀山梅花酵母、乾燥酵母）と市販のグルテン入りの米粉を用いて米粉パンを製造し、出来上がった米粉パンについて官能試験を行った。
【０１０１】
１．米粉パンの製造
表９に示す配合割合を用いて、米粉用のホームベーカリー（サンヨー（株）製、米粉ベーカリー：SPM-MP3）を用いて、パンを製造した。
【０１０２】
【表９】
【０１０３】
１次発酵は３０℃で４０分間行った。次いで、ガス抜きをした後、３０℃で１５分間のベンチタイムをとり、その後、生地を食パン型のケースに入れ、３８℃に設定したインキュベーター内で、乾燥酵母については５０分間、石見銀山梅花酵母については７０分間、発酵させた（２次発酵）。こうすることで体積が発酵開始時の約２倍に膨れた。次にこれらを１８０℃にセットした電気オーブンで３０分間焼成した。いずれのパンもきつね色に焼き上がった。
【０１０４】
２．パンの評価
（1）官能評価
上記で製造した米粉パン（実施例３、比較例３）について官能評価を行った。パンの種類が分からない状態にして、パネラー１４名で、パンの香り、味、及び総合評価（香味のバランス）について、３段階（Ａ：好ましい、Ｂ:どちらでもない、Ｃ：好ましくない）で検査した。結果を表１０に示す。
【０１０５】
【表１０】
【０１０６】
以上のように、石見銀山梅花酵母で作った米パンの方が、香りが爽やかであるなど、乾燥酵母のパンよりも風味が優れているという評価が得られた。
【０１０７】
実験例６ パンの香気成分の分析
実験例５で香り及び味を評価した米粉パン（比較例３及び実施例３）について、それに含まれる香気成分を分析した。
【０１０８】
１．分析方法
焼成した２種類の米粉パン（比較例３及び実施例３）を細かく切り刻み、5ｇずつサンプル瓶に密閉し、ヘッドスペースガスクロマトグラフ（ガスクロマトグラフ：GC-2014、島津製作所製＋ヘッドスペースサンプラ：TurboMatrix40、パーキンエルマー社製、カラム：TC-WAX）で揮発成分を測定した。サンプル瓶は50℃で15分間保持してから、瓶内のヘッドスペースガスを採取して、分析に用いた。
【０１０９】
２．分析結果
パン100ｇ当たりのエタノール、およびイソブチルアルコール、イソアミルアルコールの量を表１１に示す。
【０１１０】
【表１１】
【０１１１】
この結果から、梅花酵母を用いて製造したパンは、市販パン酵母を用いて製造したパンと比較して、エタノール含有量が１.３倍高く、一方、油臭と表現される香気成分であるイソブチルアルコールとイソアミルアルコールの含有量は、それぞれ０.５４倍（45/84）及び０.６７倍（48/72）低いことが判明した。
【０１１２】
実験例７ 耐アルコール性試験
本発明の石見銀山梅花酵母が、清酒などのアルコール飲食品の製造に使用できるかどうかを調べるために、耐アルコール性について調べた。
【０１１３】
具体的には、石見銀山梅花酵母および協会701号を、それぞれYPD培地で３０℃で２日間培養した後、集菌し、これを各種エタノール濃度（８％、１１％、１４％）の１％グルコース含有０．１M酢酸緩衝液（ｐＨ４.３）６ｍｌにそれぞれ懸濁して、３０℃で３日間静置し、生存率％を測定した。
【０１１４】
結果を表１２に示す。
【０１１５】
【表１２】
【０１１６】
これからわかるように、石見銀山梅花酵母は、アルコール耐性が予め確認されている日本醸造協会が頒布している協会７０１号と同等のアルコール耐性を備えていることが確認された。
【０１１７】
実験例８ 清酒の小仕込み試験
実験例７でアルコール耐性が確認された協会７０１号と本発明の石見銀山梅花酵母を使用して、清酒の仕込み試験を行った。
【０１１８】
１．清酒の仕込み
仕込み配合を表１３に示す。原料米は精米歩合５０％の五百万石を用い、２０００ｍｌ綿栓三角フラスコに三段仕込み（麹歩合２２％、汲み水歩合１４５％）を行った。なお各酵母（石見銀山梅花酵母、協会７０１号）は３０ｍｌの麹汁培地で５日間培養したものを、初添に添加した。仕込み温度は、初添１５℃、仲添と留添１０℃とし、もろみ最高温度１３℃、もろみ日数２５日とした。
【０１１９】
【表１３】
【０１２０】
２．清酒製造能の評価
仕込み期間中、フラスコの重量変化を経時的に測定した。重量変化は、協会７０１号を用いた場合も、また石見銀山梅花酵母を用いた場合もほぼ同様の傾向を示した。いずれも留添後７日間は約１０ｇずつ減少したが、減少の程度は徐々に少なくなり、１４日目以降は１日約２ｇずつの減少ペースとなった。
【０１２１】
協会７０１号及び石見銀山梅花酵母を用いて、それぞれもろみ日数２５日目に遠心分離して得られた清酒（比較例４、実施例４）の成分を測定した。その結果を表１４に示す。
【０１２２】
【表１４】
【０１２３】
これからわかるように、石見銀山梅花酵母は、日本酒醸造において多く使用されている酵母（協会７０１号）と比較して、もろみ経過、またアルコール生成能力（アルコール分、日本酒度）や酸度及びアミノ酸度等の成分についてほぼ同じ値を示した。このことから、石見銀山梅花酵母は、清酒に対しても十分な製造能力を有すると考えられた。
【０１２４】
実験例９ 清酒の香気成分及び有機酸の分析
実験例８で製造した清酒（比較例４及び実施例４）について、それに含まれる香気成分と有機酸を分析した。
【０１２５】
１．分析方法
（1-1）香気成分の分析
２種類の清酒（実施例４及び比較例４）は、それぞれ5mlずつサンプル瓶に充填密閉し、ヘッドスペースガスクロマトグラフ（ガスクロマトグラフ：島津製作所製GC-2014＋ヘッドスペースサンプラ：パーキンエルマー社製TurboMatrix40、カラム：TC-WAX）で揮発成分を測定した。サンプル瓶は50℃で15分間保持してから、瓶内のヘッドスペースガスを採取して、分析に用いた。
【０１２６】
（1-2）有機酸の分析
有機酸は、高速液体クロマトグラフ（島津製作所製：LC-10、カラム:Shim-pack SCR-102H）で行った。
【０１２７】
２．分析結果
香気成分及び有機酸の分析結果をそれぞれ表１５及び表１６に示す。
【０１２８】
【表１５】
【０１２９】
【表１６】
【０１３０】
この結果からわかるように、実施例４と比較例４の清酒に含まれる香気成分と有機酸成分の含有量に大きな差は見られなかった。しかし、梅花酵母で製造した実施例４の清酒には、協会７０１号で製造した比較例４の清酒よりも、果物のリンゴ様の香りであるカプロン酸エチルが１.２倍高い割合で含まれていた。カプロン酸エチルの匂いの閾値は、3ppmと言われているので、これが要因で、実施例４の清酒のほうが比較例４の清酒よりも、フルーティーで爽やかな印象を与えているものと考えられる。
【０１３１】
また有機酸の含有量は、梅花酵母で製造した実施例４の清酒の方が、協会７０１号で製造した比較例４の清酒よりも若干低く、酸度がわずかに低いことから、これが、実施例４の清酒がフルーティーで爽やかな風味を有する一つの要因になっていると考えられる。
【０１３２】
実施例１０ 耐塩性試験
本発明の石見銀山梅花酵母が、漬物などの塩蔵食品の発酵（製造）に使用できるかどうかを調べるために、耐塩性について調べた。
【０１３３】
糖度１０（Brix:10）に調整した麹汁培地に対して、塩濃度が０％、２％、５％、１０％、１５％、２０％になるように食塩を加え、この液に５日間培養した石見銀山梅花酵母を１０％添加して（１.９×１０７cfu/ml）、３０℃、３日間静置して、それぞれの培養液の生菌数を測定した。
【０１３４】
結果を表１７に示す。
【０１３５】
【表１７】
【０１３６】
表１７に示すように、石見銀山梅花酵母は食塩濃度が１０重量％の培地中で、少なくとも３０℃で３日生存することが確認された。このことから、石見銀山梅花酵母は、食塩濃度が１５％を超える醤油などの発酵調味料の製造には使用できないが、食塩濃度が１５％未満、好ましくは１０％以下の発酵調味料の製造や、サラダ感覚で消費される浅漬けのような漬物類の製造には使用が可能であると判断された。
【受託番号】
【０１３７】
ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６
【特許請求の範囲】
【請求項１】
梅の花から採取された酵母であって、サッカロミセス セレビシエに属する「石見銀山梅花酵母−1」（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６）、またはその継代株。
【請求項２】
請求項１に記載する寄託酵母またはその継代株を含むことを特徴とするパン製造用の中種。
【請求項３】
請求項１に記載する寄託酵母またはその継代株を含むことを特徴とするパン生地。
【請求項４】
請求項１に記載する寄託酵母またはその継代株を用いて製造されることを特徴とする発酵飲食品または発酵飼料。
【請求項５】
上記発酵飲食品が、パン、アルコール飲食品、及び塩濃度１０重量％以下の発酵飲食品からなる少なくとも１種である、請求項４に記載する発酵飲食品。
【請求項６】
請求項１に記載する寄託酵母またはその継代株を用いて発酵する工程を有する、発酵飲食品または発酵飼料の製造方法。
【請求項１】
梅の花から採取された酵母であって、サッカロミセス セレビシエに属する「石見銀山梅花酵母−1」（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１０５６）、またはその継代株。
【請求項２】
請求項１に記載する寄託酵母またはその継代株を含むことを特徴とするパン製造用の中種。
【請求項３】
請求項１に記載する寄託酵母またはその継代株を含むことを特徴とするパン生地。
【請求項４】
請求項１に記載する寄託酵母またはその継代株を用いて製造されることを特徴とする発酵飲食品または発酵飼料。
【請求項５】
上記発酵飲食品が、パン、アルコール飲食品、及び塩濃度１０重量％以下の発酵飲食品からなる少なくとも１種である、請求項４に記載する発酵飲食品。
【請求項６】
請求項１に記載する寄託酵母またはその継代株を用いて発酵する工程を有する、発酵飲食品または発酵飼料の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１９１８５１（Ｐ２０１２−１９１８５１Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５９６１（Ｐ２０１１−５５９６１）
【出願日】平成２３年３月１４日（２０１１．３．１４）
【特許番号】特許第４８９９１３８号（Ｐ４８９９１３８）
【特許公報発行日】平成２４年３月２１日（２０１２．３．２１）
【出願人】（５９１２８２２０５）島根県 (122)
【出願人】（３０２０２５７２９）株式会社石見銀山生活文化研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１４日（２０１１．３．１４）
【特許番号】特許第４８９９１３８号（Ｐ４８９９１３８）
【特許公報発行日】平成２４年３月２１日（２０１２．３．２１）
【出願人】（５９１２８２２０５）島根県 (122)
【出願人】（３０２０２５７２９）株式会社石見銀山生活文化研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
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