硫酸化グリコサミノグリカンの構造解析法
【課題】硫酸化糖鎖のイオン化における脱硫酸化を抑制して、容易かつ正確に硫酸化糖鎖を分析することができる、硫酸化糖鎖の構造解析手法を提供する。
【解決手段】MALDI法により硫酸化糖鎖をイオン化する工程を含む、硫酸化糖鎖の分析方法および配列解析方法。
【解決手段】MALDI法により硫酸化糖鎖をイオン化する工程を含む、硫酸化糖鎖の分析方法および配列解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸化糖鎖の分析方法および配列解析方法に関する。より詳しくは、MALDI法により硫酸化糖鎖をイオン化する工程を含む、硫酸化糖鎖の分析方法および配列解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類においては、以下の略号を使用する。
ESI：エレクトロスプレーイオン化法
ESI-MS：エレクトロスプレーイオン化質量分析計
FTICR型：フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型
IRレーザー：赤外レーザー
IR-MALDI：マトリック支援赤外レーザー脱離イオン化法
IR-MALDI-MS：マトリック支援赤外レーザー脱離イオン化質量分析計
IR-MALDI-QIT-TOF-MS：マトリック支援赤外レーザー脱離イオン化−四重極イオントラップ型−飛行時間型質量分析計
IT型：イオントラップ型
MALDI：マトリックス支援レーザー脱離イオン化法
MALDI-MS：マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析計
MALDI−FTICR−MS：マトリックス支援レーザー脱離イオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計
MALDI−TOF−MS：マトリックス支援レーザー脱離イオン化―飛行時間型質量分析計
UVレーザー：紫外レーザー
UV-MALDI：マトリック支援紫外レーザー脱離イオン化法
UV-MALDI-MS：マトリック支援紫外レーザー脱離イオン化質量分析計
【０００３】
昨今、糖鎖の構造解析において質量分析が用いられている。質量分析を行うためには試料分子をイオン化する工程が必須である。これまでに開発された十種以上のイオン化法のうち、近年では主にESIおよびMALDIが用いられている。
【０００４】
糖鎖の中でもグリコサミノグリカンに代表される、硫酸基を有する糖鎖（硫酸化糖鎖とも言う）をイオン化する際、従来のUV-MALDIでは容易に硫酸基が脱離してしまう（すなわち、硫酸化糖鎖ではなく「硫酸基を喪失してしまった糖鎖」の質量値がデータとして得られてしまう）という問題点があった。そのため、硫酸化糖鎖のイオン化にはESI-MSが用いられることが多かった。
【０００５】
しかし、ESI-MSは一般にMALDI-MSに比べてより多くの試料量を要する（相対的に低感度である）ことや、試料中の塩の混在によりイオン化が著しく阻害されることなどの問題点があった。そのため、MALDI-MSを用いた実践的な方法の開発が強く望まれていた。
【０００６】
これまでに試みられたUV-MALDI-MSによる硫酸化糖鎖の解析方法として、（１）塩基性の合成ペプチドを硫酸基のカウンター・イオンとして混在させ、硫酸基の脱離を抑制する手法がある（非特許文献１参照）。また、（２）液状マトリックス試薬を用いることにより、同様に硫酸基の脱離を抑制する手法が報告されている（非特許文献２参照）。
【０００７】
しかし、前記（１）の手法においてはこれに用いる合成ペプチドが市販されておらず入手難であるとともに、ペプチドと糖鎖の質量の総和の値が質量情報として得られるため、糖鎖の質量情報を直接的に得ることができず、MS/MS（フラグメンテーション）による構造情報取得が期待できない。また、前記（２）の手法においても硫酸基のカウンター・イオンが種々別のものに置換されたシグナルが生じ、いずれも満足な手法といえるものではなかった。
【０００８】
一方、本発明者らは近年、IRレーザーを搭載したIR-MALDI-QIT-TOF-MSを開発した。そして、この手法により、UVレーザー搭載装置では分析が難しかった、化学的に不安定なペプチドや糖鎖を、比較的安定した状態で構造解析できることを確認した（非特許文献３参照）。
【０００９】
IR-MALDI-MSを用いた硫酸化糖鎖の分析については、非特許文献１に記載された技術（合成ペプチドを硫酸基のカウンター・イオンとして用いる）との組合せにより、脱硫酸化を抑制したイオン化（分析）が可能である旨報告されている（非特許文献４参照）。しかし、上記の通り、これに用いる合成ペプチドが市販されておらず入手難であるとともに、直接的に糖鎖の質量情報が得られない、およびフラグメンテーションによる構造情報の取得が期待できない等の問題があり、不十分であった。
【００１０】
【非特許文献１】P. Juhasz and K. Biemann, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (1994), p. 4333-4337.
【非特許文献２】T. N. Laremore, F. Zhang, and R. J. Linhardt, Anal. Chem., 79 (2007), p. 1604-1610.
【非特許文献３】高橋勝利ら、第５４回質量分析総合討論会予稿集、p.382-383、2006年
【非特許文献４】P. Juhasz and K. Biemann, Carbohydr. Res., 270 (1995), p. 131-147.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、硫酸化糖鎖のイオン化における脱硫酸化を抑制して、容易かつ正確に硫酸化糖鎖を分析することができる、硫酸化糖鎖の構造解析手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化し、得られたイオンを質量分析装置を用いて検出することにより、該硫酸化糖鎖の質量を簡易に測定できることを見出した。
【００１３】
また、硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化し、得られたイオンのフラグメンテーションを1回以上行いグリコシド結合を切断し、得られたグリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから糖鎖配列を解析できることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．以下の工程（１）および（２）を含む硫酸化糖鎖の分析法。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する工程
（２）工程（１）で得られたイオンを質量分析装置により検出し、その質量を測定する工程
２．工程（２）において、イオンを正イオン・モードにおいて検出する前項１に記載の方法。
３．以下の工程（１）〜（３）を含む硫酸化糖鎖の配列解析方法。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する工程
（２）工程（１）で得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行う工程
（３）工程（２）で得られたグリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから糖鎖配列を同定する工程
４．工程（１）において、IRレーザーを搭載するMALDI-MSを用いて試料をイオン化する前項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５． MALDI-MSがMALDI-TOF-MSまたはMALDI-FTICR−MSである前項４に記載の方法。
６．マトリックス試薬としてジヒドロキシ安息香酸またはチオウレアを用いる、前項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
７．工程（１）で得られるイオンが、硫酸化糖鎖にナトリウムが付加したナトリウム付加イオンである前項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
８．硫酸化糖鎖がグリコサミノグリカンである、前項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
９．グリコサミノグリカンがグリコサミノグリカン・オリゴ糖である、前項８に記載の方法。
１０．グリコサミノグリカン・オリゴ糖が、ケラタン硫酸由来オリゴ糖である、前項９に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法によれば、硫酸化糖鎖の硫酸基の脱離を顕著に抑制したMALDI質量分析が可能となり、続くMSn解析による糖鎖配列の同定も容易に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．分析方法
本発明の硫酸化糖鎖の分析方法は、硫酸化糖鎖を含む試料をIR-MALDIでイオン化してMS分析することを特徴とする分析方法であり、以下の工程（１）および（２）を含む。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する、イオン化工程
（２）工程（１）で得られたイオンを質量分析装置により検出し、その質量を測定する、質量測定工程
【００１７】
以下、各工程について説明する。
（１）イオン化工程
工程（１）は、IR-MALDIによって、分析対象となる硫酸化糖鎖（試料）をイオン化することにより、硫酸化糖鎖にイオンXが付加または脱離したイオンを得る工程である。IR-MALDIは、大過剰のマトリックス試薬中に試料を均一に分散させ、表面にIRレーザー（波長：2.8μｍ〜3.2μｍ、好ましくは3.0μｍ）をパルス照射することにより、試料をイオン化する方法である。IR-MALDIで硫酸化糖鎖をイオン化することにより、硫酸化糖鎖の硫酸基の脱離を抑制した質量分析が可能となる。
【００１８】
後に続く工程（２）において、正イオン・モード（イオン化した試料のうち、陽性に荷電した分子を検出する）でイオンを検出する場合は、イオンは硫酸化糖鎖にイオンXが付加したイオン（X付加イオン、［M＋X］+）である。ここで、Xは糖鎖に付加することができるプラスチャージイオンである。このようなXとして、例えば、プロトンや金属イオンが挙げられる。また、金属イオンとして、例えば、ナトリウムイオンが挙げられる。
【００１９】
また、工程（２）において負イオン・モード（イオン化した試料のうち、陰性に荷電した分子を検出する）でイオンを検出する場合は、イオンは、硫酸化糖鎖にイオン（X）が付加したイオン（X付加イオン、［M＋X］-）、または硫酸化糖鎖からイオン（X）が脱離したイオン（X脱離イオン、［M-X］-）である。このとき、X付加イオンを生成する場合は、Xは硫酸化糖鎖に付加することができるマイナスチャージイオンである。このようなXとして、例えば、塩化物イオンが挙げられる。また、X脱離イオンは、通常、糖鎖におけるプロトン脱離反応により得られるものである。
【００２０】
本発明の方法においては、後述するように高効率なイオン化が達成されることからイオンを正イオン・モードで検出することが好ましい。そのため、イオンはX付加イオン（［M＋X］+）であることが好ましく、ナトリウム付加イオンであることがより好ましい。
【００２１】
MALDIによる硫酸化糖鎖のイオン化に用いる装置として、IRレーザーを搭載するMALDI-MSを用いることが好ましい。当該MALDI-MSを用いることにより、硫酸化糖鎖の硫酸基の脱離を抑制し、後に続く構造解析を簡易および正確に出来るからである。例えば、中赤外波長可変レーザー（サイバーレーザー社製、非特許文献３）を、市販のUV-MALDI-MSに搭載させて使用することができる。市販のUV-MALDI-MSとして、例えば、MALDI-TOF-MS［例えば、AXIMA-QIT（島津製作所社製）等］やMALDI-FTICR−MS［例えば、APEX IV（ブルカー・ダルトニクス社製）等］などを用いることができる。
【００２２】
前記マトリックス試薬としては、照射レーザーのエネルギーを吸収し、かつ高効率に硫酸化糖鎖をイオン化せしめるものであれば特に限定されず、例えば、チオウレア、ジヒドロキシ安息香酸（DHBA）、ウレア、シナピン酸 a-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）、コハク酸、シナピン酸、およびジアミノナフタレン（DAN）などが挙げられる。中でも、シグナル強度、再現性の観点から、チオウレアおよびジヒドロキシ安息香酸が特に好ましい。これらのマトリックス試薬は、各々単独で用いてもよいし、複数種を組合わせてもよい。マトリックス試薬の使用形態（使用溶媒、マトリックス濃度、溶液の量、混合比など）は、当業者が適宜調整することができる。
【００２３】
上記工程（１）に加えて下記工程（２）を行うことにより、硫酸化糖鎖の質量を測定することができる。
【００２４】
（２）質量測定工程
工程（２）は、前記工程（１）で得られたイオン（［M＋X］+または［M-X］-）を任意の質量分析装置を用いて検出することにより、MSの1乗スペクトル（以下、MS1スペクトル等と称する）を得て、硫酸化糖鎖の質量を測定する工程である。この測定結果に基づいて、当該硫酸化糖鎖の分子量を決定することができる。
イオンの検出には、任意の質量分析装置を用いることができるが、IT型分析装置またはFTICR型分析装置を用いることが好ましく、IT型分析装置を用いることがより好ましい。
【００２５】
イオンの検出は、硫酸基やカルボキシル基のような酸性度の高い官能基を持つ糖鎖の解析の場合は、通常は負イオン・モードで行う（T. Minamisawa and J. Hirabayashi, Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 18 (2006), p． 293-312.）が、本発明の方法においては、高効率なイオン化が達成されることから、正イオン・モードで行うことが好ましい。
【００２６】
２．配列解析方法
本発明の硫酸化糖鎖の配列解析方法は、硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化して得られるイオン（前駆イオン）をフラグメンテーションして得られるグリコシド結合切断フラグメント・イオンをMSn測定して糖鎖配列情報を得る方法であり、以下の工程（１）〜（３）を含む。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する、イオン化工程
（２）工程（１）で得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行う、フラグメンテーション工程
（３）工程（２）で得られたグリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから糖鎖配列を同定する、糖鎖配列の同定工程
【００２７】
以下、各工程について説明する。
（１）イオン化工程
工程（１）は、上述した分析方法の工程（１）と同様に、IR-MALDIにより硫酸化糖鎖を含む試料をイオン化してイオン（［M＋X］+または［M-X］-）を得る工程である。IR-MALDIで硫酸化糖鎖を含む試料をイオン化することにより、硫酸化糖鎖の硫酸基の脱離を抑制でき、後に続くMSn分析による糖鎖配列の同定が容易となる。上記した分析方法と同様に、配列解析方法においても、後に続くMSn分析に用いるイオンはX付加イオン（［M＋X］+）であることが好ましく、ナトリウム付加イオンであることがより好ましいが、ナトリウム付加イオン以外（例えば、プロトン付加イオン）であっても、そのシグナル強度が充分に高く得られていれば、付加イオンXは特に制約を受けない。
【００２８】
（２）フラグメンテーション工程
工程（２）は、工程（１）で得られたイオン（［M＋X］+または［M-X］-）を前駆イオンとしてフラグメンテーションを１回以上行い、グリコシド結合切断フラグメント・イオンを得る工程である。当該フラグメント・イオンを検出することによりMS/MS（MS2）分析を行うことができる（この分析により、MS2スペクトルが得られる）。ここで、MS2分析では、MS1スペクトルにおいて充分なシグナル強度を得られたイオン（通常はナトリウム付加イオン）を分析対象とすることが好ましい。
【００２９】
さらに必要に応じてMS2スペクトルにおけるフラグメントイオンについてフラグメンテーションを行いMS3スペクトルを、以下同様にMSの4乗、・・・、n乗スペクトルを得ることができる。MSのn乗スペクトル（MSnスペクトル；nは2以上の整数。以下同じ。）も、上記MS1スペクトルと同様にして得ることができる。
【００３０】
本発明者らが以前に報告したケラタン硫酸オリゴ糖（硫酸化糖鎖の一種）のESI-MSによる解析ではMS4（MS/MS/MS/MS）解析まで行なってようやく糖鎖配列情報が得られた（T. Minamisawa, et al., Anal. Chem., 78 (2006), p.891-900.;特開2006-292683号公報）。これに対し、本発明の方法によれば、MS2（MS/MS）解析までの操作により同様の構造情報を獲得できることも確かめられた。したがって、本発明の方法によれば、MSnスペクトルを少なくともMS2スペクトルまで求めれば、硫酸化糖鎖の糖鎖配列を解析することができる。
【００３１】
MSnスペクトルを得る際のフラグメンテーションの方法として、例えば、PSD法（post-source decay法）、CID法（collision-induced dissociation、衝突誘起解離法）、IRMPD法（infrared multi-photon dissociation、赤外多光子吸収解離法）などが挙げられる。本発明の方法においては、CID法が好ましい。
【００３２】
（３）糖鎖配列の同定工程
工程（３）は、工程（２）で得られたグリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから糖鎖配列を同定する工程である。上記のようにして得られた硫酸化糖鎖を含む試料のMSnスペクトルを測定することにより、該硫酸化糖鎖における硫酸基の位置情報を得て、糖鎖配列を同定することができる。
【００３３】
また、硫酸化糖鎖配列中に種々の置換基導入などの構造修飾が施された場合に、その修飾部分を含むフラグメントイオンだけがシグナル位置を変える（修飾基の質量分）ため、その修飾基の配列上の位置を決定することができる。修飾基としては、例えば、メチル基、アセチル基、エチル基、ベンジル基、およびリン酸基等が挙げられる。また、水酸基の酸化および還元、並びにウロン酸のエステル化等の修飾も決定可能である。さらに、本発明の方法によれば、修飾基の位置のみならず、修飾基の質量から修飾基の構造も特定することもできる。
【００３４】
３．硫酸化糖鎖
本発明の分析方法および配列解析方法の対象となる硫酸化糖鎖としては、グリコサミノグリカン、ムチン型糖鎖が挙げられ、グリコサミノグリカンが好ましい。グリコサミノグリカンは、D-グルコサミン又はD-ガラクトサミンと、D-グルクロン酸、L-イズロン酸又はD-ガラクトースの2糖の繰り返し単位を基本骨格として構成される多糖であり、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたもの等のいずれであってもよい。
【００３５】
本発明に係る方法の対象となる硫酸化糖鎖の分子量は180〜30,000の範囲内であることが好ましく、180〜5,000の範囲内であることがより好ましい。尚、硫酸化糖鎖の分子量とは、その試料が不均一混合物の場合には通常平均分子量を意味し、一般的にはゲル浸透クロマトグラフィー（GPC-HPLC）を用いて算出される重量平均分子量を指称する。また、本発明に係る方法の対象となる硫酸化糖鎖の糖鎖長は、特に限定されないが、2糖〜20糖であることが好ましく、2糖〜10糖であることがより好ましく、2〜5糖であることが特に好ましい。また、それらオリゴ糖は精製されていることが好ましいが、種々のケラタン硫酸由来オリゴ糖を含む混合物の場合でも本発明の方法により同定可能である。
【００３６】
グリコサミノグリカンは、グリコサミノグリカン由来のオリゴ糖（グリコサミノグリカン・オリゴ糖）であることが好ましい。グリコサミノグリカン・オリゴ糖として、例えば、ケラタン硫酸（ケラタンポリ硫酸も含まれる）オリゴ糖、コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、コンドロイチン硫酸D、コンドロイチン硫酸E、コンドロイチン硫酸K、コンドロイチンポリ硫酸等）オリゴ糖、デルマタン硫酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸オリゴ糖、コンドロイチンオリゴ糖、ヘパリンオリゴ糖等が挙げられ、中でも特にケラタン硫酸オリゴ糖が好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
ケラタン硫酸由来のオリゴ糖は通常、ガラクトース（Gal）とＮ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）とが交互にグリコシド結合した構造を有する。ケラタン硫酸由来のオリゴ糖としては、ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖のみならずケラタン硫酸を分解して得たオリゴ糖の一部の糖を除去又は修飾したものも含まれる。
【００３８】
ケラタン硫酸の分解は、化学的な方法（酸加水分解等）や酵素的な方法（ケラタン硫酸分解酵素による分解等）によって行うことができるが、酵素的な方法を用いることが好ましく、ケラタナーゼIIを用いることがより好ましい。酵素反応は、用いるケラタン硫酸分解酵素の種類に応じて当業者が適宜設定することができるが、例えば、ケラタナーゼIIを用いる場合、pH5.0〜7.0、温度30〜40℃で、0.1〜48時間反応させることが好ましい。
【００３９】
ケラタン硫酸を分解して得られるケラタン硫酸オリゴ糖は、Gal及びGlcNAcにおける6位のヒドロキシル基の一部又は全部が硫酸化されたオリゴ糖、非還元末端のGalにシアル酸等が結合したオリゴ糖等も含まれ、本発明ではこれらのようなオリゴ糖も同定対象とすることができる。シアル酸としては、N-アセチルイラミン酸、N-グリコリルノイラミン酸等が例示される。また、シアル酸とGalとの間のグリコシド結合の様式は特に限定されないが、α2-3結合であることが好ましい。
【００４０】
ケラタン硫酸を上記のように酵素反応を用いて分解すると、通常、種々のサイズの偶数糖を含む混合物が得られる。本発明に係る方法では、この偶数糖をさらに酵素処理して得られる奇数糖も同定対象とすることができる。このような酵素としては、β-ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
【００４１】
また、ケラタン硫酸オリゴ糖における硫酸基を除去したオリゴ糖、非還元末端のシアル酸を除去したオリゴ糖、また、化学的もしくは酵素的に硫酸基を増加したオリゴ糖等も同定対象とすることができる。なお、オリゴ糖の脱硫酸化は、例えば塩酸含有メタノールとの反応（WO98/03524号パンフレット記載の方法）によって行うことができる。また、シアル酸の除去は、オリゴ糖の希硫酸処理またはノイラミニダーゼ処理によって行うことができる。硫酸基の増加は、例えば硫酸基転移酵素を用いた反応や、ジメチルホルムアミド中、三酸化硫黄・ピリジン複合体による処理によって行うことができる。
【００４２】
ケラタン硫酸オリゴ糖の具体例として、例えば、以下のものを挙げることができる。
【００４３】
【化１】
【実施例】
【００４４】
＜オリゴ糖の入手および調製＞
（１）L2L2、L4L4、SL2L4の調製
ウシ角膜由来のケラタン硫酸I（生化学工業株式会社製）又はサメ軟骨由来II（生化学工業株式会社製）の1mg／200μL水溶液に、0.1Mの酢酸緩衝液で希釈したケラタナーゼII（生化学工業会社製）を1mU／μL加え、pH5.0、37℃で2時間反応させた。この反応溶液を分画分子量10000の遠心フィルター（ミリポア社製）にかけ、高分子量成分を除去し、得られた濾液をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）にて分画し、L2L2、L4L4、SL2L4に相当する画分を得た（溶離条件：5mMの酢酸ナトリウム、pH6.0、0.1mL／min．、使用カラム：Superdex Peptide 10/300GL（GEヘルスケア社製））。
（２）L2L4の調製
WO96/16973号パンフレットに記載の方法によって調製した。
（３）L1L2の調製
L4L4を10mg／5mLの濃度で100mMの塩酸メタノール（和光純薬工業社製）に懸濁させ、室温にて5時間反応させた。水酸化ナトリウム希釈水溶液を用いて中和後濃縮し、上記ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）を用いてL1L2に相当する画分を得た。
【００４５】
上記のようにして調製した各ケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2、L4L4、SL2L4、L2L4、L1L2）の構造は、NMRおよび／もしくはESI-MS（既報：T. Minamisawa, et al., Anal. Chem., 78 (2006), 891-900）により事前に確認した。図１に、後に続くIR-MALDI-MSスペクトル測定に用いたケラタン硫酸オリゴ糖の構造式を示す。
【００４６】
＜測定装置の構成＞
既報（高橋勝利ら、第54回質量分析総合討論会予稿集、p.382-383、2006年）のとおり、LD（半導体レーザー）励起Nd：YAGレーザーを基本波光源とし、ビーム径の拡大過程を経て、基本波7.1mJ入力時に0.67mJの高出力レーザー光を得た。このIRレーザー光を平行光とした後、光軸調整し、MALDI-QIT-TOF-MS（AXIMA-QIT、島津製作所製）に導いた。ターゲット・プレート上において、レーザー・フルーエンス0.58J/cm2を達成していることを確認した。
【００４７】
前記YAGとはイットリウム・アルミニウム・ガーネットの略であり、Nd：YAGレーザーとはそれらYAG結晶にNd（ネオジウム）イオンがドープされたロッドやディスクに、LDにより励起して作り出したレーザー光を発振するレーザーを指す。なお、比較実験としてUV-MALDIを用いる場合には、従来AXIMA-QITに搭載されている窒素レーザーを使用した。
【００４８】
＜測定用試料の調製＞
上記方法で調製されたケラタン硫酸オリゴ糖を種々の濃度（主として2μmol/mL）で蒸留水に溶解し、その１μLとマトリックス溶液（IR−MALDIの場合：チオ尿素の80mg／mLエタノール溶液、UV-MALDIの場合：ジヒドロキシ安息香酸の10mg/mL・50％メタノール溶液）4μLとを混合した。この混合液の1μLを、MALDIターゲットプレート（島津製作所）にスポットし、減圧下に5分間置くことにより乾燥した。
【００４９】
＜MSスペクトルの測定＞
IRレーザーおよびUVレーザー（比較対照）を用いたMALDIによるMSスペクトルを正イオン・モードおよび負イオン・モードにて測定した。測定操作およびデータ処理については、標準的装置操作手順に従った。
以下に、測定によって得られたスペクトルを図示する。横軸は質量／電荷比［mass(m)/charge(z)］、縦軸はイオンの相対強度（%int.）を表し、これは全てのスペクトルにおいて同じである。
【００５０】
まず、種々のケラタン硫酸オリゴ糖について、正イオン・モードおよび負イオン・モードにおけるIR-MALDI-TOF-MSスペクトルを測定した。その結果、正イオン・モードにおいてはいくつかの強いシグナルが観測されたが（図２以降に示す）、負イオン・モードでは殆どシグナルが観測されなかった。すなわち、これらのオリゴ糖のIR-MALDI-TOF-MS測定では、正イオン・モードにおいて高効率なイオン化が達成されることが分かり、以後の測定はすべて正イオン・モードにて実施した。
【００５１】
図２〜６は、ケラタン硫酸オリゴ糖（L1L2、L2L2、L2L4、L4L4、SL2L4）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。図２〜６から分かるように、UV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）と比較して、IR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）では、硫酸化糖鎖の硫酸基の脱離および脱水を抑制するとともにシグナル・ノイズ比が向上し、感度が顕著に向上することがわかった。
【００５２】
〈MS/MSスペクトルの測定〉
MS/MSスペクトルは、MSスペクトルにおいて観測されたイオン（［M＋Na］+）をフラグメンテーションさせることによって生じた、グリコシド結合切断フラグメント・イオンを観測することによって得た。図７にケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2（A）、L2L4（B）、L4L4（C））のMS/MSスペクトルを描いた図を示す。また、図８にケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2（A）、L2L4（B）、L4L4（C））のMS/MSスペクトルにおけるグリコシド結合切断様式（取得配列情報）を示した図を示す。
【００５３】
図７および８から分かるように、MS/MSスペクトルを測定することにより、硫酸化糖鎖の配列に対応した開裂様式が観測されることがわかった。このことから、グリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから、硫酸化糖鎖の配列を解析できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】IR-MALDI-MSスペクトル測定に用いた三種類のケラタン硫酸オリゴ糖の構造式を示す。
【図２】ケラタン硫酸オリゴ糖（L1L2）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。
【図３】ケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。
【図４】ケラタン硫酸オリゴ糖（L2L4）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。
【図５】ケラタン硫酸オリゴ糖（L4L4）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。
【図６】ケラタン硫酸オリゴ糖（SL2L4）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。
【図７】ケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2（A）、L2L4（B）、L4L4（C））のMS/MSスペクトルを描いた図である。
【図８】ケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2（A）、L2L4（B）、L4L4（C））のMS/MSスペクトルにおけるグリコシド結合切断様式（取得配列情報）を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸化糖鎖の分析方法および配列解析方法に関する。より詳しくは、MALDI法により硫酸化糖鎖をイオン化する工程を含む、硫酸化糖鎖の分析方法および配列解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類においては、以下の略号を使用する。
ESI：エレクトロスプレーイオン化法
ESI-MS：エレクトロスプレーイオン化質量分析計
FTICR型：フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型
IRレーザー：赤外レーザー
IR-MALDI：マトリック支援赤外レーザー脱離イオン化法
IR-MALDI-MS：マトリック支援赤外レーザー脱離イオン化質量分析計
IR-MALDI-QIT-TOF-MS：マトリック支援赤外レーザー脱離イオン化−四重極イオントラップ型−飛行時間型質量分析計
IT型：イオントラップ型
MALDI：マトリックス支援レーザー脱離イオン化法
MALDI-MS：マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析計
MALDI−FTICR−MS：マトリックス支援レーザー脱離イオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計
MALDI−TOF−MS：マトリックス支援レーザー脱離イオン化―飛行時間型質量分析計
UVレーザー：紫外レーザー
UV-MALDI：マトリック支援紫外レーザー脱離イオン化法
UV-MALDI-MS：マトリック支援紫外レーザー脱離イオン化質量分析計
【０００３】
昨今、糖鎖の構造解析において質量分析が用いられている。質量分析を行うためには試料分子をイオン化する工程が必須である。これまでに開発された十種以上のイオン化法のうち、近年では主にESIおよびMALDIが用いられている。
【０００４】
糖鎖の中でもグリコサミノグリカンに代表される、硫酸基を有する糖鎖（硫酸化糖鎖とも言う）をイオン化する際、従来のUV-MALDIでは容易に硫酸基が脱離してしまう（すなわち、硫酸化糖鎖ではなく「硫酸基を喪失してしまった糖鎖」の質量値がデータとして得られてしまう）という問題点があった。そのため、硫酸化糖鎖のイオン化にはESI-MSが用いられることが多かった。
【０００５】
しかし、ESI-MSは一般にMALDI-MSに比べてより多くの試料量を要する（相対的に低感度である）ことや、試料中の塩の混在によりイオン化が著しく阻害されることなどの問題点があった。そのため、MALDI-MSを用いた実践的な方法の開発が強く望まれていた。
【０００６】
これまでに試みられたUV-MALDI-MSによる硫酸化糖鎖の解析方法として、（１）塩基性の合成ペプチドを硫酸基のカウンター・イオンとして混在させ、硫酸基の脱離を抑制する手法がある（非特許文献１参照）。また、（２）液状マトリックス試薬を用いることにより、同様に硫酸基の脱離を抑制する手法が報告されている（非特許文献２参照）。
【０００７】
しかし、前記（１）の手法においてはこれに用いる合成ペプチドが市販されておらず入手難であるとともに、ペプチドと糖鎖の質量の総和の値が質量情報として得られるため、糖鎖の質量情報を直接的に得ることができず、MS/MS（フラグメンテーション）による構造情報取得が期待できない。また、前記（２）の手法においても硫酸基のカウンター・イオンが種々別のものに置換されたシグナルが生じ、いずれも満足な手法といえるものではなかった。
【０００８】
一方、本発明者らは近年、IRレーザーを搭載したIR-MALDI-QIT-TOF-MSを開発した。そして、この手法により、UVレーザー搭載装置では分析が難しかった、化学的に不安定なペプチドや糖鎖を、比較的安定した状態で構造解析できることを確認した（非特許文献３参照）。
【０００９】
IR-MALDI-MSを用いた硫酸化糖鎖の分析については、非特許文献１に記載された技術（合成ペプチドを硫酸基のカウンター・イオンとして用いる）との組合せにより、脱硫酸化を抑制したイオン化（分析）が可能である旨報告されている（非特許文献４参照）。しかし、上記の通り、これに用いる合成ペプチドが市販されておらず入手難であるとともに、直接的に糖鎖の質量情報が得られない、およびフラグメンテーションによる構造情報の取得が期待できない等の問題があり、不十分であった。
【００１０】
【非特許文献１】P. Juhasz and K. Biemann, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (1994), p. 4333-4337.
【非特許文献２】T. N. Laremore, F. Zhang, and R. J. Linhardt, Anal. Chem., 79 (2007), p. 1604-1610.
【非特許文献３】高橋勝利ら、第５４回質量分析総合討論会予稿集、p.382-383、2006年
【非特許文献４】P. Juhasz and K. Biemann, Carbohydr. Res., 270 (1995), p. 131-147.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、硫酸化糖鎖のイオン化における脱硫酸化を抑制して、容易かつ正確に硫酸化糖鎖を分析することができる、硫酸化糖鎖の構造解析手法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化し、得られたイオンを質量分析装置を用いて検出することにより、該硫酸化糖鎖の質量を簡易に測定できることを見出した。
【００１３】
また、硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化し、得られたイオンのフラグメンテーションを1回以上行いグリコシド結合を切断し、得られたグリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから糖鎖配列を解析できることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．以下の工程（１）および（２）を含む硫酸化糖鎖の分析法。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する工程
（２）工程（１）で得られたイオンを質量分析装置により検出し、その質量を測定する工程
２．工程（２）において、イオンを正イオン・モードにおいて検出する前項１に記載の方法。
３．以下の工程（１）〜（３）を含む硫酸化糖鎖の配列解析方法。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する工程
（２）工程（１）で得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行う工程
（３）工程（２）で得られたグリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから糖鎖配列を同定する工程
４．工程（１）において、IRレーザーを搭載するMALDI-MSを用いて試料をイオン化する前項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５． MALDI-MSがMALDI-TOF-MSまたはMALDI-FTICR−MSである前項４に記載の方法。
６．マトリックス試薬としてジヒドロキシ安息香酸またはチオウレアを用いる、前項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
７．工程（１）で得られるイオンが、硫酸化糖鎖にナトリウムが付加したナトリウム付加イオンである前項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
８．硫酸化糖鎖がグリコサミノグリカンである、前項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
９．グリコサミノグリカンがグリコサミノグリカン・オリゴ糖である、前項８に記載の方法。
１０．グリコサミノグリカン・オリゴ糖が、ケラタン硫酸由来オリゴ糖である、前項９に記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法によれば、硫酸化糖鎖の硫酸基の脱離を顕著に抑制したMALDI質量分析が可能となり、続くMSn解析による糖鎖配列の同定も容易に行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．分析方法
本発明の硫酸化糖鎖の分析方法は、硫酸化糖鎖を含む試料をIR-MALDIでイオン化してMS分析することを特徴とする分析方法であり、以下の工程（１）および（２）を含む。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する、イオン化工程
（２）工程（１）で得られたイオンを質量分析装置により検出し、その質量を測定する、質量測定工程
【００１７】
以下、各工程について説明する。
（１）イオン化工程
工程（１）は、IR-MALDIによって、分析対象となる硫酸化糖鎖（試料）をイオン化することにより、硫酸化糖鎖にイオンXが付加または脱離したイオンを得る工程である。IR-MALDIは、大過剰のマトリックス試薬中に試料を均一に分散させ、表面にIRレーザー（波長：2.8μｍ〜3.2μｍ、好ましくは3.0μｍ）をパルス照射することにより、試料をイオン化する方法である。IR-MALDIで硫酸化糖鎖をイオン化することにより、硫酸化糖鎖の硫酸基の脱離を抑制した質量分析が可能となる。
【００１８】
後に続く工程（２）において、正イオン・モード（イオン化した試料のうち、陽性に荷電した分子を検出する）でイオンを検出する場合は、イオンは硫酸化糖鎖にイオンXが付加したイオン（X付加イオン、［M＋X］+）である。ここで、Xは糖鎖に付加することができるプラスチャージイオンである。このようなXとして、例えば、プロトンや金属イオンが挙げられる。また、金属イオンとして、例えば、ナトリウムイオンが挙げられる。
【００１９】
また、工程（２）において負イオン・モード（イオン化した試料のうち、陰性に荷電した分子を検出する）でイオンを検出する場合は、イオンは、硫酸化糖鎖にイオン（X）が付加したイオン（X付加イオン、［M＋X］-）、または硫酸化糖鎖からイオン（X）が脱離したイオン（X脱離イオン、［M-X］-）である。このとき、X付加イオンを生成する場合は、Xは硫酸化糖鎖に付加することができるマイナスチャージイオンである。このようなXとして、例えば、塩化物イオンが挙げられる。また、X脱離イオンは、通常、糖鎖におけるプロトン脱離反応により得られるものである。
【００２０】
本発明の方法においては、後述するように高効率なイオン化が達成されることからイオンを正イオン・モードで検出することが好ましい。そのため、イオンはX付加イオン（［M＋X］+）であることが好ましく、ナトリウム付加イオンであることがより好ましい。
【００２１】
MALDIによる硫酸化糖鎖のイオン化に用いる装置として、IRレーザーを搭載するMALDI-MSを用いることが好ましい。当該MALDI-MSを用いることにより、硫酸化糖鎖の硫酸基の脱離を抑制し、後に続く構造解析を簡易および正確に出来るからである。例えば、中赤外波長可変レーザー（サイバーレーザー社製、非特許文献３）を、市販のUV-MALDI-MSに搭載させて使用することができる。市販のUV-MALDI-MSとして、例えば、MALDI-TOF-MS［例えば、AXIMA-QIT（島津製作所社製）等］やMALDI-FTICR−MS［例えば、APEX IV（ブルカー・ダルトニクス社製）等］などを用いることができる。
【００２２】
前記マトリックス試薬としては、照射レーザーのエネルギーを吸収し、かつ高効率に硫酸化糖鎖をイオン化せしめるものであれば特に限定されず、例えば、チオウレア、ジヒドロキシ安息香酸（DHBA）、ウレア、シナピン酸 a-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸（CHCA）、コハク酸、シナピン酸、およびジアミノナフタレン（DAN）などが挙げられる。中でも、シグナル強度、再現性の観点から、チオウレアおよびジヒドロキシ安息香酸が特に好ましい。これらのマトリックス試薬は、各々単独で用いてもよいし、複数種を組合わせてもよい。マトリックス試薬の使用形態（使用溶媒、マトリックス濃度、溶液の量、混合比など）は、当業者が適宜調整することができる。
【００２３】
上記工程（１）に加えて下記工程（２）を行うことにより、硫酸化糖鎖の質量を測定することができる。
【００２４】
（２）質量測定工程
工程（２）は、前記工程（１）で得られたイオン（［M＋X］+または［M-X］-）を任意の質量分析装置を用いて検出することにより、MSの1乗スペクトル（以下、MS1スペクトル等と称する）を得て、硫酸化糖鎖の質量を測定する工程である。この測定結果に基づいて、当該硫酸化糖鎖の分子量を決定することができる。
イオンの検出には、任意の質量分析装置を用いることができるが、IT型分析装置またはFTICR型分析装置を用いることが好ましく、IT型分析装置を用いることがより好ましい。
【００２５】
イオンの検出は、硫酸基やカルボキシル基のような酸性度の高い官能基を持つ糖鎖の解析の場合は、通常は負イオン・モードで行う（T. Minamisawa and J. Hirabayashi, Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 18 (2006), p． 293-312.）が、本発明の方法においては、高効率なイオン化が達成されることから、正イオン・モードで行うことが好ましい。
【００２６】
２．配列解析方法
本発明の硫酸化糖鎖の配列解析方法は、硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化して得られるイオン（前駆イオン）をフラグメンテーションして得られるグリコシド結合切断フラグメント・イオンをMSn測定して糖鎖配列情報を得る方法であり、以下の工程（１）〜（３）を含む。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する、イオン化工程
（２）工程（１）で得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行う、フラグメンテーション工程
（３）工程（２）で得られたグリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから糖鎖配列を同定する、糖鎖配列の同定工程
【００２７】
以下、各工程について説明する。
（１）イオン化工程
工程（１）は、上述した分析方法の工程（１）と同様に、IR-MALDIにより硫酸化糖鎖を含む試料をイオン化してイオン（［M＋X］+または［M-X］-）を得る工程である。IR-MALDIで硫酸化糖鎖を含む試料をイオン化することにより、硫酸化糖鎖の硫酸基の脱離を抑制でき、後に続くMSn分析による糖鎖配列の同定が容易となる。上記した分析方法と同様に、配列解析方法においても、後に続くMSn分析に用いるイオンはX付加イオン（［M＋X］+）であることが好ましく、ナトリウム付加イオンであることがより好ましいが、ナトリウム付加イオン以外（例えば、プロトン付加イオン）であっても、そのシグナル強度が充分に高く得られていれば、付加イオンXは特に制約を受けない。
【００２８】
（２）フラグメンテーション工程
工程（２）は、工程（１）で得られたイオン（［M＋X］+または［M-X］-）を前駆イオンとしてフラグメンテーションを１回以上行い、グリコシド結合切断フラグメント・イオンを得る工程である。当該フラグメント・イオンを検出することによりMS/MS（MS2）分析を行うことができる（この分析により、MS2スペクトルが得られる）。ここで、MS2分析では、MS1スペクトルにおいて充分なシグナル強度を得られたイオン（通常はナトリウム付加イオン）を分析対象とすることが好ましい。
【００２９】
さらに必要に応じてMS2スペクトルにおけるフラグメントイオンについてフラグメンテーションを行いMS3スペクトルを、以下同様にMSの4乗、・・・、n乗スペクトルを得ることができる。MSのn乗スペクトル（MSnスペクトル；nは2以上の整数。以下同じ。）も、上記MS1スペクトルと同様にして得ることができる。
【００３０】
本発明者らが以前に報告したケラタン硫酸オリゴ糖（硫酸化糖鎖の一種）のESI-MSによる解析ではMS4（MS/MS/MS/MS）解析まで行なってようやく糖鎖配列情報が得られた（T. Minamisawa, et al., Anal. Chem., 78 (2006), p.891-900.;特開2006-292683号公報）。これに対し、本発明の方法によれば、MS2（MS/MS）解析までの操作により同様の構造情報を獲得できることも確かめられた。したがって、本発明の方法によれば、MSnスペクトルを少なくともMS2スペクトルまで求めれば、硫酸化糖鎖の糖鎖配列を解析することができる。
【００３１】
MSnスペクトルを得る際のフラグメンテーションの方法として、例えば、PSD法（post-source decay法）、CID法（collision-induced dissociation、衝突誘起解離法）、IRMPD法（infrared multi-photon dissociation、赤外多光子吸収解離法）などが挙げられる。本発明の方法においては、CID法が好ましい。
【００３２】
（３）糖鎖配列の同定工程
工程（３）は、工程（２）で得られたグリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから糖鎖配列を同定する工程である。上記のようにして得られた硫酸化糖鎖を含む試料のMSnスペクトルを測定することにより、該硫酸化糖鎖における硫酸基の位置情報を得て、糖鎖配列を同定することができる。
【００３３】
また、硫酸化糖鎖配列中に種々の置換基導入などの構造修飾が施された場合に、その修飾部分を含むフラグメントイオンだけがシグナル位置を変える（修飾基の質量分）ため、その修飾基の配列上の位置を決定することができる。修飾基としては、例えば、メチル基、アセチル基、エチル基、ベンジル基、およびリン酸基等が挙げられる。また、水酸基の酸化および還元、並びにウロン酸のエステル化等の修飾も決定可能である。さらに、本発明の方法によれば、修飾基の位置のみならず、修飾基の質量から修飾基の構造も特定することもできる。
【００３４】
３．硫酸化糖鎖
本発明の分析方法および配列解析方法の対象となる硫酸化糖鎖としては、グリコサミノグリカン、ムチン型糖鎖が挙げられ、グリコサミノグリカンが好ましい。グリコサミノグリカンは、D-グルコサミン又はD-ガラクトサミンと、D-グルクロン酸、L-イズロン酸又はD-ガラクトースの2糖の繰り返し単位を基本骨格として構成される多糖であり、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物を培養して得られたもの、化学的もしくは酵素的に合成されたもの等のいずれであってもよい。
【００３５】
本発明に係る方法の対象となる硫酸化糖鎖の分子量は180〜30,000の範囲内であることが好ましく、180〜5,000の範囲内であることがより好ましい。尚、硫酸化糖鎖の分子量とは、その試料が不均一混合物の場合には通常平均分子量を意味し、一般的にはゲル浸透クロマトグラフィー（GPC-HPLC）を用いて算出される重量平均分子量を指称する。また、本発明に係る方法の対象となる硫酸化糖鎖の糖鎖長は、特に限定されないが、2糖〜20糖であることが好ましく、2糖〜10糖であることがより好ましく、2〜5糖であることが特に好ましい。また、それらオリゴ糖は精製されていることが好ましいが、種々のケラタン硫酸由来オリゴ糖を含む混合物の場合でも本発明の方法により同定可能である。
【００３６】
グリコサミノグリカンは、グリコサミノグリカン由来のオリゴ糖（グリコサミノグリカン・オリゴ糖）であることが好ましい。グリコサミノグリカン・オリゴ糖として、例えば、ケラタン硫酸（ケラタンポリ硫酸も含まれる）オリゴ糖、コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、コンドロイチン硫酸D、コンドロイチン硫酸E、コンドロイチン硫酸K、コンドロイチンポリ硫酸等）オリゴ糖、デルマタン硫酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸オリゴ糖、コンドロイチンオリゴ糖、ヘパリンオリゴ糖等が挙げられ、中でも特にケラタン硫酸オリゴ糖が好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
ケラタン硫酸由来のオリゴ糖は通常、ガラクトース（Gal）とＮ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）とが交互にグリコシド結合した構造を有する。ケラタン硫酸由来のオリゴ糖としては、ケラタン硫酸を分解して得られるオリゴ糖のみならずケラタン硫酸を分解して得たオリゴ糖の一部の糖を除去又は修飾したものも含まれる。
【００３８】
ケラタン硫酸の分解は、化学的な方法（酸加水分解等）や酵素的な方法（ケラタン硫酸分解酵素による分解等）によって行うことができるが、酵素的な方法を用いることが好ましく、ケラタナーゼIIを用いることがより好ましい。酵素反応は、用いるケラタン硫酸分解酵素の種類に応じて当業者が適宜設定することができるが、例えば、ケラタナーゼIIを用いる場合、pH5.0〜7.0、温度30〜40℃で、0.1〜48時間反応させることが好ましい。
【００３９】
ケラタン硫酸を分解して得られるケラタン硫酸オリゴ糖は、Gal及びGlcNAcにおける6位のヒドロキシル基の一部又は全部が硫酸化されたオリゴ糖、非還元末端のGalにシアル酸等が結合したオリゴ糖等も含まれ、本発明ではこれらのようなオリゴ糖も同定対象とすることができる。シアル酸としては、N-アセチルイラミン酸、N-グリコリルノイラミン酸等が例示される。また、シアル酸とGalとの間のグリコシド結合の様式は特に限定されないが、α2-3結合であることが好ましい。
【００４０】
ケラタン硫酸を上記のように酵素反応を用いて分解すると、通常、種々のサイズの偶数糖を含む混合物が得られる。本発明に係る方法では、この偶数糖をさらに酵素処理して得られる奇数糖も同定対象とすることができる。このような酵素としては、β-ガラクトシダーゼ等が挙げられる。
【００４１】
また、ケラタン硫酸オリゴ糖における硫酸基を除去したオリゴ糖、非還元末端のシアル酸を除去したオリゴ糖、また、化学的もしくは酵素的に硫酸基を増加したオリゴ糖等も同定対象とすることができる。なお、オリゴ糖の脱硫酸化は、例えば塩酸含有メタノールとの反応（WO98/03524号パンフレット記載の方法）によって行うことができる。また、シアル酸の除去は、オリゴ糖の希硫酸処理またはノイラミニダーゼ処理によって行うことができる。硫酸基の増加は、例えば硫酸基転移酵素を用いた反応や、ジメチルホルムアミド中、三酸化硫黄・ピリジン複合体による処理によって行うことができる。
【００４２】
ケラタン硫酸オリゴ糖の具体例として、例えば、以下のものを挙げることができる。
【００４３】
【化１】
【実施例】
【００４４】
＜オリゴ糖の入手および調製＞
（１）L2L2、L4L4、SL2L4の調製
ウシ角膜由来のケラタン硫酸I（生化学工業株式会社製）又はサメ軟骨由来II（生化学工業株式会社製）の1mg／200μL水溶液に、0.1Mの酢酸緩衝液で希釈したケラタナーゼII（生化学工業会社製）を1mU／μL加え、pH5.0、37℃で2時間反応させた。この反応溶液を分画分子量10000の遠心フィルター（ミリポア社製）にかけ、高分子量成分を除去し、得られた濾液をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）にて分画し、L2L2、L4L4、SL2L4に相当する画分を得た（溶離条件：5mMの酢酸ナトリウム、pH6.0、0.1mL／min．、使用カラム：Superdex Peptide 10/300GL（GEヘルスケア社製））。
（２）L2L4の調製
WO96/16973号パンフレットに記載の方法によって調製した。
（３）L1L2の調製
L4L4を10mg／5mLの濃度で100mMの塩酸メタノール（和光純薬工業社製）に懸濁させ、室温にて5時間反応させた。水酸化ナトリウム希釈水溶液を用いて中和後濃縮し、上記ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）を用いてL1L2に相当する画分を得た。
【００４５】
上記のようにして調製した各ケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2、L4L4、SL2L4、L2L4、L1L2）の構造は、NMRおよび／もしくはESI-MS（既報：T. Minamisawa, et al., Anal. Chem., 78 (2006), 891-900）により事前に確認した。図１に、後に続くIR-MALDI-MSスペクトル測定に用いたケラタン硫酸オリゴ糖の構造式を示す。
【００４６】
＜測定装置の構成＞
既報（高橋勝利ら、第54回質量分析総合討論会予稿集、p.382-383、2006年）のとおり、LD（半導体レーザー）励起Nd：YAGレーザーを基本波光源とし、ビーム径の拡大過程を経て、基本波7.1mJ入力時に0.67mJの高出力レーザー光を得た。このIRレーザー光を平行光とした後、光軸調整し、MALDI-QIT-TOF-MS（AXIMA-QIT、島津製作所製）に導いた。ターゲット・プレート上において、レーザー・フルーエンス0.58J/cm2を達成していることを確認した。
【００４７】
前記YAGとはイットリウム・アルミニウム・ガーネットの略であり、Nd：YAGレーザーとはそれらYAG結晶にNd（ネオジウム）イオンがドープされたロッドやディスクに、LDにより励起して作り出したレーザー光を発振するレーザーを指す。なお、比較実験としてUV-MALDIを用いる場合には、従来AXIMA-QITに搭載されている窒素レーザーを使用した。
【００４８】
＜測定用試料の調製＞
上記方法で調製されたケラタン硫酸オリゴ糖を種々の濃度（主として2μmol/mL）で蒸留水に溶解し、その１μLとマトリックス溶液（IR−MALDIの場合：チオ尿素の80mg／mLエタノール溶液、UV-MALDIの場合：ジヒドロキシ安息香酸の10mg/mL・50％メタノール溶液）4μLとを混合した。この混合液の1μLを、MALDIターゲットプレート（島津製作所）にスポットし、減圧下に5分間置くことにより乾燥した。
【００４９】
＜MSスペクトルの測定＞
IRレーザーおよびUVレーザー（比較対照）を用いたMALDIによるMSスペクトルを正イオン・モードおよび負イオン・モードにて測定した。測定操作およびデータ処理については、標準的装置操作手順に従った。
以下に、測定によって得られたスペクトルを図示する。横軸は質量／電荷比［mass(m)/charge(z)］、縦軸はイオンの相対強度（%int.）を表し、これは全てのスペクトルにおいて同じである。
【００５０】
まず、種々のケラタン硫酸オリゴ糖について、正イオン・モードおよび負イオン・モードにおけるIR-MALDI-TOF-MSスペクトルを測定した。その結果、正イオン・モードにおいてはいくつかの強いシグナルが観測されたが（図２以降に示す）、負イオン・モードでは殆どシグナルが観測されなかった。すなわち、これらのオリゴ糖のIR-MALDI-TOF-MS測定では、正イオン・モードにおいて高効率なイオン化が達成されることが分かり、以後の測定はすべて正イオン・モードにて実施した。
【００５１】
図２〜６は、ケラタン硫酸オリゴ糖（L1L2、L2L2、L2L4、L4L4、SL2L4）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。図２〜６から分かるように、UV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）と比較して、IR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）では、硫酸化糖鎖の硫酸基の脱離および脱水を抑制するとともにシグナル・ノイズ比が向上し、感度が顕著に向上することがわかった。
【００５２】
〈MS/MSスペクトルの測定〉
MS/MSスペクトルは、MSスペクトルにおいて観測されたイオン（［M＋Na］+）をフラグメンテーションさせることによって生じた、グリコシド結合切断フラグメント・イオンを観測することによって得た。図７にケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2（A）、L2L4（B）、L4L4（C））のMS/MSスペクトルを描いた図を示す。また、図８にケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2（A）、L2L4（B）、L4L4（C））のMS/MSスペクトルにおけるグリコシド結合切断様式（取得配列情報）を示した図を示す。
【００５３】
図７および８から分かるように、MS/MSスペクトルを測定することにより、硫酸化糖鎖の配列に対応した開裂様式が観測されることがわかった。このことから、グリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから、硫酸化糖鎖の配列を解析できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】IR-MALDI-MSスペクトル測定に用いた三種類のケラタン硫酸オリゴ糖の構造式を示す。
【図２】ケラタン硫酸オリゴ糖（L1L2）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。
【図３】ケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。
【図４】ケラタン硫酸オリゴ糖（L2L4）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。
【図５】ケラタン硫酸オリゴ糖（L4L4）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。
【図６】ケラタン硫酸オリゴ糖（SL2L4）の正イオン・モードIR-MALDI-TOF-MSスペクトル（A）とUV-MALDI-TOF-MSスペクトル（B）を比較した図である。
【図７】ケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2（A）、L2L4（B）、L4L4（C））のMS/MSスペクトルを描いた図である。
【図８】ケラタン硫酸オリゴ糖（L2L2（A）、L2L4（B）、L4L4（C））のMS/MSスペクトルにおけるグリコシド結合切断様式（取得配列情報）を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）および（２）を含む硫酸化糖鎖の分析法。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する工程
（２）工程（１）で得られたイオンを質量分析装置により検出し、その質量を測定する工程
【請求項２】
工程（２）において、イオンを正イオン・モードにおいて検出する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程（１）〜（３）を含む硫酸化糖鎖の配列解析方法。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する工程
（２）工程（１）で得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行う工程
（３）工程（２）で得られたグリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから糖鎖配列を同定する工程
【請求項４】
工程（１）において、IRレーザーを搭載するMALDI-MSを用いて試料をイオン化する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
MALDI-MSがMALDI-TOF-MSまたはMALDI-FTICR−MSである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
マトリックス試薬としてジヒドロキシ安息香酸またはチオウレアを用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（１）で得られるイオンが、硫酸化糖鎖にナトリウムが付加したナトリウム付加イオンである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
硫酸化糖鎖がグリコサミノグリカンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
グリコサミノグリカンがグリコサミノグリカン・オリゴ糖である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
グリコサミノグリカン・オリゴ糖が、ケラタン硫酸由来オリゴ糖である、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
以下の工程（１）および（２）を含む硫酸化糖鎖の分析法。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する工程
（２）工程（１）で得られたイオンを質量分析装置により検出し、その質量を測定する工程
【請求項２】
工程（２）において、イオンを正イオン・モードにおいて検出する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程（１）〜（３）を含む硫酸化糖鎖の配列解析方法。
（１）硫酸化糖鎖をIR-MALDIでイオン化する工程
（２）工程（１）で得られたイオンのフラグメンテーションを１回以上行う工程
（３）工程（２）で得られたグリコシド結合切断フラグメント・イオンのスペクトルデータから糖鎖配列を同定する工程
【請求項４】
工程（１）において、IRレーザーを搭載するMALDI-MSを用いて試料をイオン化する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
MALDI-MSがMALDI-TOF-MSまたはMALDI-FTICR−MSである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
マトリックス試薬としてジヒドロキシ安息香酸またはチオウレアを用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（１）で得られるイオンが、硫酸化糖鎖にナトリウムが付加したナトリウム付加イオンである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
硫酸化糖鎖がグリコサミノグリカンである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
グリコサミノグリカンがグリコサミノグリカン・オリゴ糖である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
グリコサミノグリカン・オリゴ糖が、ケラタン硫酸由来オリゴ糖である、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００８−２４９３９２（Ｐ２００８−２４９３９２Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８８６０３（Ｐ２００７−８８６０３）
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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