神経伸長促進剤および伸長阻害剤
【課題】帯状疱疹後神経痛の機序の解明に寄与し、損傷した神経の再生を促進する手段の提供。帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、ヘルペス後神経痛、脳卒中、変性疾患等に伴う神経細胞死による障害や前記疾患の予防または治療に効果的で、しかも副作用の少ない手段の提供。
【解決手段】水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する、神経突起の伸長促進剤；前記抗体を有効成分として含有する、神経性疾患の予防または治療剤；水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子の阻害抗体を有効成分として含有する、神経突起の伸長阻害剤；前記阻害抗体を有効成分として含有する、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患の予防または治療剤。
【解決手段】水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する、神経突起の伸長促進剤；前記抗体を有効成分として含有する、神経性疾患の予防または治療剤；水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子の阻害抗体を有効成分として含有する、神経突起の伸長阻害剤；前記阻害抗体を有効成分として含有する、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患の予防または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経伸長促進剤および伸長阻害剤に関する。詳しくは、水痘帯状疱疹ウイルス前初期抗原を認識する抗体の神経突起の伸長促進、神経再生または神経突起の伸長阻害の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)は、発達中および成人において、生存、分化、シナプス可塑性ならびに末梢および中枢ニューロンの選択伸長に重要な役割を果たしていると認識されている、神経栄養因子ファミリーのメンバーである（特許文献１、非特許文献１、２）。ＢＤＮＦのｃＤＮＡは、２４７アミノ酸残基からなる前駆体タンパク質をコードしている。前駆体タンパク質は、シグナルペプチドおよびプロプロテインを有し、これらは切断されて１１９アミノ酸残基の成熟ＢＤＮＦが生成する。生物活性なＢＤＮＦ(２７ｋＤａ)は、強力な疎水性相互作用により２つの同じサブユニットから形成される二量体である。ＢＤＮＦがシナプスの長期増強、学習および記憶等の頻度依存性可塑性メカニズムに関与していることはよく知られている。ＢＤＮＦは、臨床上の痛覚過敏症の原因となる可塑性に関与している（非特許文献３）。
【０００３】
水痘帯状疱疹ウイルス(ＶＺＶ)感染は、急性小脳失調症（ＡＣＡ）、ヘルペス後神経痛（ＰＨＮ）等の神経学的合併症を生じさせる。ＡＣＡは、水痘感染に伴う最もよく起こる神経学的合併症である。１５歳未満の小児の４０００症例当たり１例で起こると推定されている。ＡＣＡは、発疹の開始の数日前から３週間後に出現し、完全回復まで２−４週間続く。帯状疱疹は、感覚の異常を伴うデルマトームに沿った領域分布中に水疱性発疹が現れ、一般的集団における年間発生率は、英国において１０００人当たり３．４である(非特許文献４)。ＰＨＮは、帯状疱疹の最も頻度の高い合併症であり、患者の７〜３５％（６０歳以上では５０％を越える）で発症する。ＰＨＮは、急性神経炎に伴う痛みとは異なり、休みなく続く痛み、電撃痛およびアロディニアを合併する（非特許文献５）。ＰＨＮの病態生理学は明らかになっていないけれど、両神経学的合併症がウイルス感染の回復期またはそれより後に出現するということは、ＶＺＶに対する免疫応答がそれらの病原性の過程に関与することを示唆する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−３２８９７４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nagappan G. Lu B., Trends in Neurosciences, 28: 464-471, 2005
【非特許文献２】Bramham CR et al., Progress in Neurology, 76: 99-125, 2005
【非特許文献３】Coull, J. A. M. et al., Nature 438: 1017-1021, 2005
【非特許文献４】Johnson, R. W. et al., BMJ 326: 748-750, 2003
【非特許文献５】Donald H. Gilden et al., Neurology 64: 21-25, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、帯状疱疹後神経痛の機序の解明に寄与し、損傷した神経の再生を促進する手段の提供である。また、本発明の目的は、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、ヘルペス後神経痛、脳卒中、変性疾患等に伴う神経細胞死による障害や前記疾患の予防または治療に効果的で、しかも副作用の少ない手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＢＤＮＦが臨床上の痛覚過敏症の原因となる可塑性に関与していることからＰＨＮの病態のメカニズムを解析できるのではないかという仮説を立て、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）とＢＤＮＦとの免疫学的関連を調べた。ＶＺＶは、潜伏感染した神経節で遺伝子４、２１、２９、６２、６３を発現し、前初期タンパク質ＩＥ６２が感染中にウイルス遺伝子の転写活性化に中心的役割を果たす。ＰＨＮ患者を含む水痘回復期血清は、ウェスタンブロット解析でＩＥ６２およびＢＤＮＦを認識した。本発明者らは、ＩＥ６２とＢＤＮＦとの免疫学的関係をさらに調べ、これらの間で免疫学的交差反応性を見出した。交差反応の有意差は、それぞれのモノクローナル抗体を用いて検定した。ＢＤＮＦと交差するＩＥ６２抗体のなかには、ＢＤＮＦの生物活性を阻害するものと、他にもＢＤＮＦによるｔｒｋＢが介在するシグナル伝達および神経突起の伸長を有意に増加するものがあることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本願発明は、以下に示す通りである。
【０００８】
〔１〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する、神経突起の伸長促進剤。
〔２〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が配列番号２の４１４−４２９位のアミノ酸配列を有するペプチドを認識するものである前記〔１〕に記載の促進剤。
〔３〕 前記脳由来神経栄養因子が二量体である前記〔１〕または〔２〕に記載の促進剤。
〔４〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する、神経性疾患の予防または治療剤。
〔５〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が配列番号２の４１４−４２９位のアミノ酸配列を有するペプチドを認識するものである前記〔４〕に記載の予防または治療剤。
〔６〕 前記脳由来神経栄養因子が二量体である前記〔４〕または〔５〕に記載の予防または治療剤。
〔７〕 前記神経性疾患が脳卒中、酸素欠乏症、窒息、身体的損傷、毒への暴露、悪性新生物、痴呆（認知症）、アルツハイマー、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選ばれる状態により引き起こされる損傷した神経細胞を伴う疾患である前記〔４〕〜〔６〕いずれか１項に記載の予防または治療剤。
〔８〕 前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の神経突起の伸長促進剤、および当該促進剤を神経突起の伸長のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該促進剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
〔９〕 前記〔４〕〜〔７〕いずれか１項に記載の神経性疾患の予防または治療剤、および当該予防または治療剤を神経性疾患のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該予防または治療剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
〔１０〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する、神経突起の伸長阻害剤。
〔１１〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が脳由来神経栄養因子の阻害抗体である前記〔１０〕に記載の阻害剤。
〔１２〕 前記抗体が配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものである、前記〔１１〕に記載の阻害剤。
〔１３〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患の予防または治療剤。
〔１４〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が脳由来神経栄養因子の阻害抗体である前記〔１３〕に記載の予防または治療剤。
〔１５〕 前記抗体が配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものである、前記〔１４〕に記載の予防または治療剤。
〔１６〕 前記〔１０〕〜〔１２〕いずれか１項に記載の神経突起の伸長阻害剤、および当該阻害剤を神経突起の伸長阻害のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該阻害剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
〔１７〕 前記〔１３〕〜〔１５〕いずれか１項に記載の予防または治療剤、および当該予防または治療剤を帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該予防または治療剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
〔１８〕 前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載の抗体を製造する方法であって、配列番号２の４１４−４２９位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングする工程を含む製造方法。
〔１９〕 前記抗体ライブラリーがヒト抗体ライブラリーである前記〔１８〕に記載の製造方法。
〔２０〕 前記〔１０〕〜〔１５〕いずれか１項に記載の抗体を製造する方法であって、配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングする工程を含む製造方法。
〔２１〕 前記抗体ライブラリーがヒト抗体ライブラリーである前記〔２０〕に記載の製造方法。
〔２２〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体の有効量を対象に投与することを含む、神経性疾患の予防または治療方法。
〔２３〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が配列番号２の４１４−４２９位のアミノ酸配列を有するペプチドを認識するものである前記〔２２〕に記載の予防または治療方法。
〔２４〕 前記脳由来神経栄養因子が二量体である前記〔２２〕に記載の予防または治療方法。
〔２５〕 前記神経性疾患が脳卒中、酸素欠乏症、窒息、身体的損傷、毒への暴露、悪性新生物、痴呆（認知症）、アルツハイマー、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選ばれる状態により引き起こされる損傷した神経細胞を伴う疾患である前記〔２２〕に記載の予防または治療方法。
〔２６〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体の有効量を対象に投与することを含む、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患の予防または治療方法。
〔２７〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が脳由来神経栄養因子の阻害抗体である前記〔２６〕に記載の予防または治療方法。
〔２８〕 前記抗体が配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものである前記〔２７〕に記載の予防または治療方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の神経突起の伸長促進剤によると、ＢＤＮＦの作用を増強することにより神経突起の伸長を促進することができるので、少ない量のＢＤＮＦ存在下でも効率よく効果を奏することが期待される。前記伸長促進剤に含まれる抗体は、ＢＤＮＦそれ自体と比べて生体内での半減期が長いので、ＢＤＮＦの増強作用が持続するとともに、ＢＤＮＦのオートクラインシステムが活性化され、ＢＤＮＦ産生分泌自体も促進され、持続的に神経細胞に作用するＢＤＮＦ活性が上昇する。さらに時間が経過するとＢＤＮＦ自体の活性は減少していくが、半減期の長い抗体がもたらす持続的効果により、ＢＤＮＦの作用を上昇させ続けることが可能である。本発明の神経性疾患の予防または治療剤によると、これまで有効な手段のなかった神経損傷後の神経の再生が可能となる。また、本発明の神経突起の伸長阻害剤によると、ＢＤＮＦの作用を阻害することにより神経突起の伸長を阻害することができるので、これまで有効な手段のなかった帯状疱疹後の神経痛や慢性疼痛等に効果を奏することが期待される。前記伸長阻害剤に含まれる抗体は、ＢＤＮＦの作用を中和することによってＢＤＮＦのオートクラインシステムの活性化も抑制することができ、さらに、このような相乗的または相加的抑制効果により、分泌されたＢＤＮＦにより神経細胞がさらにＢＤＮＦを誘導する二次反応も抑制可能である。さらに、本発明の予防または治療剤によると、経験依存性社会嫌悪やストレスなどの神経の過敏を伴う疾患に対しても、ＢＮＤＦ作用の阻害を介して当該疾患の改善が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の前初期（ＩＥ）６２タンパク質の断片の位置関係を示す概略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＩＥ６２断片とＧＳＴとの融合タンパク質の電気泳動の写真である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、帯状疱疹およびＰＨＮ患者由来の血清のＩＥ６２およびＢＤＮＦへの反応性を調べたウェスタンブロットのまとめを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、帯状疱疹およびＰＨＮ患者由来の血清のＩＥ６２およびＢＤＮＦへの反応性を調べたウェスタンブロットの一例を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体のＩＥ６２断片に対する反応性を示す電気泳動の写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体を用いたＶＺＶ感染細胞での免疫組織染色を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＢＤＮＦタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真ならびにＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの写真である。
【図３】図３は、ＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体のエピトープを決定した電気泳動の写真である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＩＥ６２モノクローナル抗体がＢＤＮＦエキソン３〜５の転写ならびにＡｒｃの転写を上昇させることを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、無添加(a)およびＩＥ６２とＢＤＮＦ添加(b)で培養した皮質（ＧＡＢＡ性）ニューロンの神経突起の形態を示す。スケールバーは４０μｍを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が神経細胞体の面積を増加させることを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が神経の分岐点の数を増加させることを示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が神経突起の全長を増加させることを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が脊髄神経細胞体の面積を増加させることを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が脊髄ニューロンの分岐点の数を増加させることを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が脊髄ニューロンの神経突起の全長を増加させることを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、無添加対照(a)およびＩＥ６２とＢＤＮＦ添加(b)で培養した脊髄後角ニューロンの神経突起の形態を示す。スケールバーは４０μｍを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、モノクローナル抗体ＫＳＧ１を用いた大脳皮質細胞の免疫染色の写真である。倍率は、１０００倍である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、モノクローナル抗体ＫＳＧ１を用いた中脳細胞の免疫染色の写真である。倍率は、１０００倍である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、モノクローナル抗体ＫＳＧ４を用いた大脳皮質細胞の免疫染色の写真である。倍率は、４００倍である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、モノクローナル抗体ＫＳＧ４を用いた中脳細胞の免疫染色の写真である。倍率は、１０００倍である。
【図７】図７は、ラット胎児初代培養大脳皮質にＰＨＮ患者血清で処理したＢＤＮＦを添加した時のＢＤＮＦ ｍＲＮＡの発現量の変動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の神経突起の伸長促進剤は、水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する。当該抗体は、後述する本発明の神経突起の伸長阻害剤に含まれる阻害抗体と区別する場合、促進抗体と称する。
【００１２】
前記抗体は、水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識する抗体である。ここで、水痘帯状疱疹ウイルス(ＶＺＶ)とは、アルファヘルペス・ウイルス属のメンバーであり、水痘(varicella)および帯状疱疹(zoster)の病原媒体である。ＶＺＶゲノムは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子であり、例えば、J. Gen Virol. (1986), 67, 1759-1816にその全塩基配列およびコードされるタンパク質のアミノ酸配列が開示されている。あるいは、ＶＺＶ（ヒトヘルペスウイルス３）として、Genbank Accession No: NC_001348においても、全ゲノムの塩基配列および当該ゲノムからコードされるタンパク質のアミノ酸配列が開示されている。ＶＺＶゲノムは、約７０種のタンパク質をコードしている。ＶＺＶの全遺伝子は、前初期(ＩＥ)、初期(Ｅ)および後期(Ｌ)という３つの広い動態クラス中で、感染細胞中に発現すると考えられている。ＶＺＶ ＩＥ６２タンパク質は、ＶＺＶタンパク質の３つの動態クラスのすべての発現の活性化に関与している。
【００１３】
前記抗体は、ＶＺＶがコードするタンパク質の中で、前初期タンパク質、より好ましくはＩＥ６２を抗原として製造されたものである。抗原としてのＩＥ６２タンパク質も、前記文献およびGenbank等でそのアミノ酸配列が開示されている。例えば、ヒトヘルペスウイルス３ ＶＺＶ−Ｏｋａ株の場合、Genbank Accession No:AY016449にＩＥ６２の塩基配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）が開示されている。また、ヒトヘルペスウイルス３ ＶＺＶ−野生株（河口株）は、Journal of Virology 2002 p11447-144459を参照のこと。
【００１４】
前記促進抗体は、配列番号２のＩＥ６２のアミノ酸配列において、４１４−４２９位のアミノ酸配列（ＰＧＹＲＳＩＳＧＰＤＰＲＩＲＫＴ：配列番号３）を有するペプチドを認識するものであることが好ましい。かかるペプチドを認識する促進抗体は、後述するＢＤＮＦとの交差反応性をより顕著に有するため、好ましい。前記ペプチドは、本発明における促進抗体のエピトープとして機能するものであり、その抗原決定基としての機能を失わない限りにおいて、配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端から１〜３アミノ酸程度欠失していてもよい。あるいは、前記ペプチドは、その抗原決定基としての機能を失わない限りにおいて、追加のアミノ酸配列を１〜数個（通常１〜５、好ましくは１〜３）、そのＮ末端またはＣ末端に有していてもよい。追加のアミノ酸残基としては、後述する高分子化合物（タンパク質）との結合のために導入されるシステイン残基などがあげられる。
【００１５】
前記抗体は、前初期タンパク質、好ましくはＩＥ６２を高感度かつ高い特異性で認識することができるとともに、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と交差反応することを特徴とする。
【００１６】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、ヒトＢＤＮＦとして、GenBank Accession No.NM_170731-170735、NM_001709にその塩基配列およびアミノ酸配列が開示されている。前記促進抗体が交差反応するＢＤＮＦは、成熟体であり、好ましくは成熟体の二量体である。
【００１７】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、ファージディスプレイによって作製された抗体およびこれらの結合性断片が含まれる。
【００１８】
結合性断片とは、前述した抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fv（variable fragment of antibody）、sFv、dsFv（disulphide stabilised Fv）、dAb（single domain antibody）等があげられる（Exp. Opin. Ther. Patents，Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。
【００１９】
抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはＩｇＧである。
【００２０】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、既知の一般的な製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、例えばポリクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマまたはウシ等、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギに、モノクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスターに免疫する。
【００２１】
一実施態様において、免疫原としてのＩＥ６２ペプチドは、公知の方法により製造することができる。例えば、配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを常法に従って合成し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等の高分子化合物（タンパク質）との複合体を形成させた後、免疫原として用いることができる。
【００２２】
前記ＩＥ６２ペプチドと高分子化合物との複合体を形成させる等の目的で、１個または数個のアミノ酸を付加してもよい。付加されるアミノ酸の数は、特に限られないものの、製造される抗体の特異性を考慮すると、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個である。付加されるアミノ酸の位置はポリペプチドのＮ末端またはＣ末端いずれでもよいが、Ｃ末端が好ましい。
【００２３】
複合体の形成方法は、公知の方法により行なうことができ、特に限定されるものではない。例えば、混合酸無水物法または活性エステル法等により前記ＩＥ６２ペプチドのカルボキシ基と前記高分子化合物の官能基とを反応させて、複合体を形成することができる。あるいは、前記ＩＥ６２ペプチドのＣ末端にシステイン残基を導入し、当該システインの側鎖であるＳＨ基を介して前記高分子化合物と結合させることもできる。
【００２４】
別の実施態様において、例えば、配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチドを他のタンパク質（例、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））をコードするヌクレオチドと連結した発現ベクターを用いて、常法により他のタンパク質との融合タンパク質として宿主で発現させ、精製したものを免疫原として用いることができる。
【００２５】
ポリクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、免疫原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギ、好ましくはヤギ、ウマまたはウサギ、より好ましくはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜５回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から血清が取得される。
【００２６】
血清をポリクローナル抗体として用いることも可能であるが、好ましくは、限外ろ過、硫安分画、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（DEAEまたはDE52等）、抗イムノグロブリンカラムもしくはプロテインＡ/Ｇカラム、免疫原を架橋させたカラム等を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーにより単離および／または精製される。
【００２７】
モノクローナル抗体は、上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた免疫原に対して特異的親和性を示し、かつ、ＢＤＮＦと交差反応性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
【００２８】
モノクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、免疫原を、マウス、ラットまたはハムスター（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内もしくは腹腔内に１〜数回注射するか、または移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞を取得する。
【００２９】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature, Vol.256, p.495-497, 1975）およびそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄または扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合により調製される。
【００３０】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（653；ATCC No.CRL1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14（Sp2/0、Sp2）、PAI、F0またはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11またはCEM-T15を使用することができる。
【００３１】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫原に対する反応性を、さらに、前記上清のＢＤＮＦに対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
【００３２】
前記ハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、上述のポリクローナル抗体と同様に、単離および／または精製されることが好ましい。
【００３３】
また、キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）, Vol.6, No.10, 1988」、特公平3-73280号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平4-506458号公報、特開昭62-296890号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994」、特表平4-504365号公報、国際出願公開WO94/25585号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表平6-500233号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。
【００３４】
ファージディスプレイによる抗体作製は、抗体スクリーニング用に作製されたファージライブラリーから、例えば、バイオパニングにより抗原に親和性を有するファージを回収、濃縮することにより、Ｆａｂ等の抗体等を容易に得ることができる。この場合、配列番号２の４１４−４２９位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングすることが好ましい。好ましい抗体ライブラリーおよび抗体のスクリーニング方法については、国際公開第０１／０６２９０７号パンフレット、特開２００５−１８５２８１号を参照のこと。
ファージライブラリーには、すべての抗原に対して反応できるクローンが存在している。したがって、抗原をＩＥ６２とすると、ＩＥ６２に存在するあらゆるエピトープに対する抗ＩＥ６２抗体のクローンが得られる。このクローン群に対して、次の抗原として、ＢＤＮＦを用いてスクリーニングを行えば、交差する抗体が得られる。そして、ＢＤＮＦ活性に対する作用から、ヒト型のＢＤＮＦ活性を抑制または促進する機能を有する抗体を選択することができる。得られたヒト型抗体は、ヒトへの適応に有利である。
【００３５】
F(ab')2およびFab'は、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素であるペプシンまたはパパインで処理することによりそれぞれ製造することができる。Fabは、Fab発現ファージライブラリーを上記ファージディスプレイによる抗体作製法と同様にスクリーニングすることにより、製造することができる。
【００３６】
このようにして得られたＩＥ６２タンパク質を認識する抗体は、通常の抗原−抗体反応を利用する方法によりＩＥ６２タンパク質を検出または定量することができる。かかる方法としては特に限定されるものではないが、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（例、ＥＬＩＳＡ）、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等(Meth．Enzymol.，92，p.147-523 (1983)， Antibodies Vol.II IRL Press Oxford (1989))があげられる。
【００３７】
本発明の神経突起の伸長促進剤の有効成分である前記促進抗体は、これまで知られていたＶＺＶに対する抗体とは異なり、ＢＤＮＦを介する神経突起の伸長を促進する作用を有するものである。ここで、神経突起とは、神経細胞の外側に形成される軸索、樹状突起および軸索側枝を含むものである。神経突起の伸長促進とは、神経細胞を顕微鏡下で観察して神経突起の長さを測定した場合に、その全長が対照と比べて増加することをいう。この場合の対照とは、本発明の促進剤を添加しないことを除いては同様の条件下に置かれた神経細胞をいう。
【００３８】
本発明の促進剤に含まれる抗体の量は、上記作用効果を奏する限りにおいて特に限定されるものではないが、通常０．００１〜９０重量％であり、好ましくは０．００５〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００３９】
本発明の促進剤は、前記抗体以外に担体を含有してもよい。かかる担体としては、製剤分野において通常用いられる担体を使用することができ、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、グリセリン、ポリエチレングリコール等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の促進剤が作用する細胞としては、神経細胞、特に損傷した神経細胞、などがあげられる。
【００４１】
本発明の促進剤は、研究用試薬として用いることができる。あるいは、試験管内で神経細胞の突起の伸長を促進させることができる。試験管内での適用のためには、例えば、培養中の神経細胞に対して、本発明の促進剤を培地に添加することにより接触させ、適宜培養を続ける方法があげられる。
【００４２】
本発明の促進剤は、生体内に投与して、神経細胞の突起の伸長を促進させることができる。生体内に投与する方法としては限定されず、例えば、皮下注、筋注、腹腔内への注射、点滴などがあげられる。経口投与、静脈内投与、筋肉内投与などの全身投与以外に脳内または髄腔内(髄液中)、一側背側海馬への局所投与があげられる。脳内への局所投与に際しては、本発明の促進剤をコラーゲンからなる担体に含有させることができる。
【００４３】
神経突起の伸長促進作用を有する前記促進抗体は、神経細胞、特に損傷した神経細胞の再生が期待される。本発明は、かかる抗体を有効成分として含有する神経性疾患の予防または治療剤を提供する。
【００４４】
本発明の予防または治療剤中に含まれる促進抗体の量は、上記作用効果を奏する限りにおいて特に限定されるものではないが、通常０．００１〜９０重量％であり、好ましくは０．００５〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００４５】
本発明の予防または治療剤は、前記促進抗体以外に担体を含有してもよい。かかる担体としては、前記促進剤で例示したものがあげられる。
【００４６】
本発明の予防または治療剤が適用される神経性疾患としては、神経突起の伸長を促進することにより病態の改善が期待される疾患である。例えば、脳卒中、酸素欠乏症、窒息、身体的損傷、毒への暴露、悪性新生物、痴呆（認知症）、糖尿病に関連する末梢神経障害、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症など）、免疫性神経疾患（多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、筋炎など）、感染性疾患（脳炎、髄膜炎など）、血管障害（脳梗塞、脳出血など）、その他の神経性疾患（筋ジストロフィー、てんかん、ミトコンドリア脳筋症など）などの状態により引き起こされる損傷した神経細胞を伴う疾患があげられる。好ましくは、酸素欠乏症、窒息、身体的損傷、毒への暴露、悪性新生物、痴呆（認知症）、アルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症である。
【００４７】
本発明の促進剤または予防もしくは治療剤の投与対象としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ヒト等の哺乳動物があげられる。
【００４８】
脳卒中発症時には血液脳関門が局部において破壊されていることから、本発明の促進剤の脳への送達が容易になることが期待できる。血液脳関門開通剤としてマンニトール、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、フラクトオリゴ糖、グルクロン酸、グリセロール、シュークロース、メトラゾール、エトプシド、合成胆汁塩、コール酸類、ジメチルサルフォキシド、アデニル酸類、無機塩類または有機酸類を同時に投与することができる。
【００４９】
促進剤または予防もしくは治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（intracistemally）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内もしくは経口または鼻腔スプレーとして投与することができる。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【００５０】
促進剤または予防もしくは治療剤は、徐放性システムにより適切に投与することも可能である。徐放性の剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【００５１】
本発明の促進剤または予防もしくは治療剤を、個々の患者の臨床状態、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化する。
【００５２】
本発明の神経突起の伸長阻害剤は、水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と交差反応する抗体を有効成分として含有する。前記阻害剤に有効成分として含まれる抗体は、これまで知られていたＶＺＶに対する抗体とは異なり、ＢＤＮＦと交差反応してＢＤＮＦの作用を阻害することにより、神経突起の伸長を阻害する作用を有するものである。かかる抗体を単に阻害抗体とも称する。
【００５３】
前記阻害抗体は、配列番号２のＩＥ６２のアミノ酸配列において、２６８−３４１位のアミノ酸配列（ＧＰＶＥＱＬＹＨＶＬＳＤＳＶＰＡＫＧＡＫＡＤＬＰＦＥＴＤＤＴＲＰＲＫＨＤＡＲＧＩＴＰＲＶＰＧＲＳＳＧＧＫＰＲＡＦＬＡＬＰＧＲＳＨＡＰＤＰＩＥＤＤＳＰ：配列番号１８）から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものであることが好ましい。かかるペプチドを認識する抗体は、ＢＤＮＦと交差反応し、かつＢＤＮＦの作用を阻害するため、好ましい。前記ペプチドは、本発明における抗体のエピトープとして機能するものである。
【００５４】
前記阻害抗体の製造方法は、前記促進抗体の製造方法において、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドの代わりに、配列番号１８のアミノ酸配列からなるペプチドまたは配列番号１８のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを用いること以外は同様にして製造することができる。
【００５５】
本発明の阻害剤に含まれる阻害抗体の量は、上記作用効果を奏する限りにおいて特に限定されるものではないが、通常０．００１〜９０重量％であり、好ましくは０．００５〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００５６】
本発明の阻害剤は、前記阻害抗体以外に担体を含有してもよい。かかる担体としては、製剤分野において通常用いられる担体を使用することができ、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、グリセリン、ポリエチレングリコール等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００５７】
本発明の阻害剤が作用する細胞としては、神経細胞、特に損傷した神経細胞などがあげられる。
【００５８】
本発明の阻害剤は、研究用試薬として用いることができる。あるいは、試験管内で神経細胞の突起の伸長を阻害することができる。試験管内での適用のためには、例えば、培養中の神経細胞に対して、本発明の阻害剤を培地に添加することにより接触させ、適宜培養を続ける方法があげられる。
【００５９】
本発明の阻害剤は、生体内に投与して、神経細胞の突起の伸長を阻害することができる。生体内に投与する方法としては限定されず、例えば、皮下注、筋注、腹腔内への注射、点滴などがあげられる。経口投与、静脈内投与、筋肉内投与などの全身投与以外に脳内または髄腔内(髄液中)、一側背側海馬への局所投与があげられる。脳内への局所投与に際しては、本発明の阻害剤をコラーゲンからなる担体に含有させることができる。
【００６０】
神経突起の伸長阻害作用を有する前記阻害抗体は、神経の過敏状態の抑制が期待される。本発明は、かかる抗体を有効成分として含有する神経の過敏を伴う疾患の予防または治療剤を提供する。
【００６１】
本発明の予防または治療剤中に含まれる阻害抗体の量は、上記作用効果を奏する限りにおいて特に限定されるものではないが、通常０．００１〜９０重量％であり、好ましくは０．００５〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００６２】
本発明の予防または治療剤は、前記阻害抗体以外に担体を含有してもよい。かかる担体としては、前記阻害剤で例示したものがあげられる。
【００６３】
本発明の阻害剤または予防もしくは治療剤が適用される疾患としては、神経突起の伸長を阻害することにより病態の改善が期待される疾患である。例えば、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪、ストレスなどがあげられる。慢性疼痛は、
(1)侵害受容器が持続的に刺激されて生じると考えられる侵害受容性疼痛、
(2)疼痛伝達または抑制機構にかかわる神経線維の働きに異常をきたした結果である神経因性疼痛、および
(3)感情または情動面に重きがおかれる心因性疼痛、に分類される。本明細書でいう慢性疼痛は、神経因性疼痛（神経の損傷や圧迫などからくる痛み）、侵害受容性疼痛（ガンやリウマチなどの痛み）の二種類をいう。経験依存性社会的嫌悪(社会的挫折ストレス)とは、中辺縁ドーパミン経路のＢＤＮＦが必須の役割を果たしている状態である。
【００６４】
本発明の阻害剤または予防もしくは治療剤の投与対象としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ヒト等の哺乳動物があげられる。
【００６５】
阻害剤または予防もしくは治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（intracistemally）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内もしくは経口または鼻腔スプレーとして投与することができる。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【００６６】
阻害剤または予防もしくは治療剤は、徐放性システムにより適切に投与することも可能である。徐放性の剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【００６７】
本発明の阻害剤または予防もしくは治療剤を、個々の患者の臨床状態、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化する。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００６９】
ウイルスおよび細胞培養
ＶＺＶの岡株（弱毒水痘ウイルス岡株（日本国特公昭５３−４１２０２号又は米国特許第３，９８５，６１５号）に由来のウイルスをシードに用いて製造され、世界の諸国で広く実用に供されている（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｌｉｖｅ）Ａｄｏｐｔｅｄ １９８４；Ｒｅｖｉｓｅｄ １９９３：ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．８４８，ｐｐ．２２−３８，１９９４）。該弱毒岡株は、寄託番号ＶＲ−７９５として１９７５年３月１４日にＡＴＣＣに寄託されている。）およびＶＺＶの河口株（Journal of Virology, Nov. 2002, P.11447-11459）は、ヒト胎性肺細胞またはヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞で増殖させた。前記細胞はそれぞれ、１０％および２％ウシ胎仔血清を補足したEagle'ｓ最小必須培地中で生育し、維持した。
ラット皮質ニューロンの初代培養細胞は、既報(Tabuchi, A., et al., J. Biol. Chem.277, 35920-35931 (2002))に従って、17〜18日齢胎仔ラット(Sprague-Dawley)の大脳皮質から調製した。要約すると、大脳皮質の小片を酵素（ＤＮアーゼＩ（Sigma）の後にトリプシン（Sigma））処理および機械的分離により断片化し、当該細胞を、60mmの培養皿(Iwaki)に５×１０6個の密度で播種した。前記細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むDulbecco’s 変法Eagle’s 培地(Nissui) 中で４８時間生育させ、次いで、グルコース(4.5mg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、インスリン(5μg/ml)、亜セレン酸ナトリウム(5μg/ml)、ウシ血清アルブミン(1mg/ml)および硫酸カナマイシン(100μg/ml)を含む、無血清Dulbecco’s 変法Eagle’s 培地(ＴＩＳ培地)に交換した。シトシンアラビノシド(Sigma)を２μＭ加え、グリア細胞の増殖を抑制した。ＤＮＡのトランスフェクションの２時間前に、培地を新鮮なＴＩＳ培地（シトシンアラビノシドは不含）と置換した。
【００７０】
実施例１
ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質の発現およびポリクローナル抗体の産生
ＶＺＶのＩＥタンパク質の一部を断片に分割し、ＧＳＴ融合タンパク質として合成した。前記ＧＳＴ融合タンパク質は、図１Ａに示すように、相互に重複して分子全体をカバーしている。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＩＥ６２融合タンパク質を発現する組換えプラスミドは、ＶＺＶ遺伝子のＩＥ６２遺伝子を増幅し、増幅ＤＮＡ断片をベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ファルマシア）に挿入することにより構築した。
【００７１】
１）ＲＮＡの単離および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)
全ＲＮＡを、ISOGEN(日本ジーン)を用いて培養細胞から抽出した。ＲＴ−ＰＣＲは、既報(Kawasaki, E. S., et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego,21−27（1991）)に従って行った。要約すると、全ＲＮＡ（１μｇ）を、２０μlの１×第一鎖緩衝液中でｃＤＮＡに逆転写した。前記緩衝液は、以下のものを含む：
プライマーとして、0.5μM オリゴ(dT)15 (5’-AAGCTTTTTTTTTTV-3’)（配列番号６）、200 unitsのSuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen)、400μM dNTPs、および10 unitsのＲＮアーゼ阻害剤(Invitrogen)。
逆転写反応の後、反応混合物を１．１ユニットのＲＮアーゼＨ(Invitrogen)で３７℃で２０分処理し、ｃＤＮＡ溶液としてＰＣＲに用いた。ＰＣＲは、1μlのｃＤＮＡ溶液、1.25 unitsのAmpliTaq Gold ＤＮＡ ポリメラーゼ(PerkinElmer Life Sciences)、1.5 mM MgCl2、200μM dNTPsおよび0.5μM プライマー対を含む50μlの1×ＰＣＲ緩衝液中で行った。ラットＢＤＮＦ遺伝子の４つのエキソン(エキソンI、エキソンII、エキソンIIIおよびエキソンIV)を区別するため、E-I(5’-ACTCAAAGGGAAACGTGTCTCT-3’)（配列番号７）、E-II(5’-CGGTGTAGGCTGGAATAGACT-3’)（配列番号８）、E-III(5’-CTCCGCCATGCAATTTCCACT-3’)（配列番号９）、E-IV(5’-GTGACAACAATGTGACTCCACT-3’)（配列番号１０）およびE-Vas(5’-GCCTTCATGCAACCGAAGTA-3’)（配列番号１１）を用いた。
【００７２】
内部標準として、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH) cDNA を、GAPDH センス(5’-TCCATGACAACTTTGGCATTGTGG-3’)（配列番号１２）およびアンチセンス(5’-GTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC-3’)（配列番号１３）プライマー対を用いて増幅した。ＢＤＮＦ ｃＤＮＡの増幅では、ＰＣＲ条件は、95℃で10分間前加熱した後、以下の通りであった:変性94℃、1分、アニーリング55℃、1分および伸長72℃、1.5分を32サイクル(エキソンI)、31サイクル(エキソンII)、26サイクル(エキソンIII)および29サイクル(エキソンIV)、ならびに最終伸長を72℃で10分。ＧＡＰＤＨの増幅は、前記と同じ条件下で31サイクル行った。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルでの電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色したＤＮＡのバンドの密度を、Bit-Map loader (ATTO) およびソフトウエア(NIH Image 1.52)を用いて分析した。
【００７３】
２）ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質の発現
構築した組換えプラスミドで大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体を培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して、３７℃で４時間または室温で一晩インキュベートすることにより融合タンパク質の発現を誘導した。誘導した融合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図１Ｂ）。誘導した融合タンパク質を、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア）を用いて、製造者の指示書およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定した分子量に基づいて精製した。組換えプラスミドの構築は、シークエンスにより確認した。ＩＥ６２融合タンパク質の抗原性は、イムノブロッティングで機能した。
【００７４】
３）ポリクローナル抗体の産生
常法にしたがって、融合タンパク質１〜５をウサギに免疫し、その抗血清をイムノブロッティングおよびＶＺＶ感染細胞に対する免疫蛍光抗体試験に使用した。
【００７５】
実施例２
ＩＥ６２に対するモノクローナル抗体の産生
ＩＥ６２に対するモノクローナル抗体は、ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質を用いて、本質的に既報（Okuno et al, Virology 129, 357-368 (1983)）に記載の方法に従って製造した。ハイブリドーマの培養上清をＧＳＴタンパク質に対するＥＬＩＳＡおよびＶＺＶ感染細胞に対する免疫蛍光抗体によりスクリーニングし、ＩＥ−６２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。
【００７６】
実施例３
免疫蛍光抗体（ＩＦＡ）アッセイ
ＶＺＶ感染細胞を−２０℃でアセトン固定し、ＢＤＮＦまたはＩＥ６２に対するモノクローナル抗体およびフルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ血清をそれぞれ一次および二次抗体として用いて染色した。ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質に対するウサギ抗血清は、フルオレセイン結合抗ウサギＩｇＧ血清(Jackson)を二次抗体として用いて、ＶＺＶ感染細胞に対する免疫蛍光抗体により確認した。
【００７７】
実施例４
ウェスタンブロッティング
ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質またはＶＺＶ感染細胞の溶解液をＳＤＳゲルに負荷し、電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜（Millipore）に転写した。前記膜を、ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質に対するウサギ抗血清、ＩＥ６２モノクローナル抗体(1:10,000希釈、阪大微生物学病研究所製)またはヒトＢＤＮＦモノクローナル抗体(0.5μg/mlに希釈、R&Dシステムズ製)でプローブした。ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ血清またはヤギ抗マウスＩｇＧ血清とともにさらに１時間インキュベーションした後、免疫ブロットをＥＣＬ法(ナカライテスク)により展開した。
【００７８】
実施例５
ＩＥ６２モノクローナル抗体により認識されるＩＥ６２のエピトープの決定
ＩＥ６２モノクローナル抗体により認識されるＩＥ６２のエピトープは、合成ペプチドを用いたＩＥ６２のウェスタンブロットのブロッキングにより解析した。エピトープは、図１Ａに示す融合タンパク質ＣとＦの間の重複領域であり、ＩＥ６２の４１４−４４７位のアミノ酸に相当する領域であった。
前記領域を３つの区分に分け、下記アミノ酸配列からなるペプチド：
ペプチドI：PGYRSISGPDPRIRKT（配列番号：３）
ペプチドII：KRLAGEPGRQRQKSF（配列番号：４）
ペプチドIII：SLPRSRTPIIPPVSG（配列番号：５）
の３種を１８０μｇ用いて、ウェスタンブロットでＩＥ６２モノクローナル抗体とＩＥ６２との相互作用をブロッキングした。
【００７９】
実施例６
初代培養ニューロンに対するＢＤＮＦおよびＩＥ６２抗体の作用
Sprague‐Dawleyラット(生後０−１日)をケタミン(50 mg/kg,i.p.)で麻酔し、次いで、頸椎脱臼により犠牲にした。すべての取り組みは、用いる動物の数と動物の苦痛を最小限にするためになされた。実験手法は、大阪大学医学部の動物管理委員会規則、および実験動物の取り扱いに関するＮＩＨのガイドに合致するものであった。通常のミクロアイランド法 (Kimura et al., J Neurophysiol. May; 77(5). 2805-2815, 1997)により、孤立ニューロンを培養した。視覚皮質の一片を脳から取り出し、パパイン(20 U/ml)で酵素的に解離させ、磨きガラス製のピペットで粉砕した。アガロースシートに置いたコラーゲンドット上で前もって調製したミクログリア島上に、ニューロンを載せ、Ｂ２７(Gibco)を補足したニューロベーサルＡ培地(Gibco)を基本とする溶液中で生育した。このように同じ動物から培養したニューロンを２群に分け、ＢＤＮＦ(大腸菌で発現させた組換タンパク質：Sigma製、昆虫細胞で発現させた組換えタンパク質：R&Dシステムズ製)および実施例２で製造したＩＥ６２モノクローナル抗体を所定の濃度で培地に添加し、日齢が合致した娘培養物からデータを取得した。プレーティング後１０−１５日間記録を行った。
【００８０】
次に、脊髄後根ニューロンに対するＢＤＮＦおよびＩＥ６２抗体の作用ならびにＴｒｋ受容体チロシンキナーゼの阻害剤であるＫ２５２ａの作用を調べた。結果を図５Ａ−Ｄに示す。
【００８１】
実施例７
形態の解析
蛍光イメージを記録した後、ニューロンをビオチン結合抗マウスＩｇＧ１とともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＡＢＣキット(Vector Laboratories)を用いて、ＭＡＰ２を可視化した。倒立顕微鏡(TE300; Nikon)に設置したNeurolucida (MicroBrightField)を用いて、ニューロンの神経突起を描写した。神経突起の形態の定量的評価は、分析ソフトウエアNeuroexplore (MicroBrightField)を用いて行った。
【００８２】
実施例８
ＩＥ６２モノクローナル抗体によるＡｒｃ（Activity-regulated cytoskeleton-associated protein）およびＢＤＮＦの転写亢進
実施例６で用いたラット初代培養ニューロンから、全ＲＮＡを、ISOGEN(日本ジーン)を用いて抽出した。定量ＰＣＲは、下記のようにして行った。ラットＢＤＮＦ遺伝子のエキソンIII〜Ｖ（Imamura L. et al., J Pharmacol., Exp. Ther 316: 136-143, 2006）Ａｒｃ ｃＤＮＡ、およびβ−アクチンｃＤＮＡを、Ａｒｃセンス(5’-CGCTGGAAGAAGTCCATCAA-3’)（配列番号１４）、Ａｒｃアンチセンス(5’-GGGCTAACAGTGTAGTCGTA-3’)（配列番号１５）、β−アクチンセンス(5’-TTTGAGACCTTCAACACCCC-3’)（配列番号１６）、β−アクチンアンチセンス(5’-ACGATTTCCCTCTCAGCTGT-3’)（配列番号１７）プライマーを用いて、定量ＰＣＲ増幅を行った。
【００８３】
ＰＣＲの温度プロフィールは、95℃で10分間前変性した後、以下の通りであった:変性95℃、45秒、アニーリング55℃、45秒および伸長72℃、1分を45サイクル(エキソンI)、31サイクル(エキソンII)、26サイクル(エキソンIII)および29サイクル(エキソンIV)、ならびに最終伸長を72℃で10分。ＢＤＮＦ遺伝子のエキソンIII〜Ｖの増幅は、57℃のアニーリング温度を用いた。蛍光は、各72℃の伸長工程の最終段階で獲得した。各ｍＲＮＡの発現レベルは、β−アクチンｍＲＮＡのレベルを用いて標準化した。
【００８４】
結果
融合タンパク質
組換えプラスミドの構築は、シークエンスにより確認した。ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質１〜５の免疫原性は、ＶＺＶの抗血清を用いるウェスタンブロットにより確認した。当該抗血清は、ＩＦＡ試験によりＶＺＶ感染細胞の核染色が陽性であり、ウェスタンブロットでＩＥ６２タンパク質を検出した。次いで、ＩＥ６２−ＧＳＴ融合タンパク質を定量し、ＩＥ６２タンパク質としてさらなるキャラクタリゼーションに使用した。図１Ａは、ＩＥ６２全分子とそれらの産物を含むＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質１〜５とＡ〜Ｇの概略図を示す。
【００８５】
帯状疱疹回復期血清によるＩＥ６２とＢＤＮＦの認識
図１Ｃおよび１Ｄは、帯状疱疹患者由来血清の、ＢＤＮＦ、ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質２との反応のまとめ、ならびにウェスタンブロットの代表的パターンの一例を示す。帯状疱疹患者血清(No.23)は、ウェスタンブロットで、ＩＥ６２の断片２およびＦならびにＢＤＮＦを認識した。一方、患者血清(No.28)は、ＩＥ６２の断片２を認識したが、ＩＥ６２の断片ＦまたはＢＤＮＦを認識しなかった。６名の血清はＢＤＮＦと反応し、それらのうちの５つがＩＥ６２融合タンパク質を認識した。２名の血清は、ＩＥ６２を認識したが、ＢＤＮＦを認識しなかった。ＩＥ６２とＢＤＮＦの認識は、すべての患者において関連付けられなかったが、６名の患者由来の血清は、ＩＥ６２とＢＤＮＦへの抗体応答の関連を示した。
【００８６】
各モノクローナル抗体によるＢＤＮＦおよびＩＥ６２の交差認識
本発明者らは、ＩＥ６２−ＧＳＴ融合タンパク質に対するモノクローナル抗体を製造した。ＩＥ６２分子全体を網羅するＩＥ６２−ＧＳＴ融合タンパク質に対する当該モノクローナル抗体の反応性を図２Ａに示す。図２Ａに示すように、抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体および抗ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体は両方とも、ＶＺＶ ＩＥ６２の同じ領域を同様に認識した。図２Ｂは、抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体および抗ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体により染色されたＩＦＡパターンを示し、両抗体は感染細胞の核を主に染色した。抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体は、ウェスタンブロットおよびＩＦＡによりＩＥ６２タンパク質を認識することが確認された。
【００８７】
図２Ｃに示すように、ＢＤＮＦタンパク質は、抗ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体および抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体の両方でブロットされ、プローブされ、両抗体は同様にＢＤＮＦを認識した。ＢＤＮＦを抗ＩＥ６２モノクローナル抗体でプローブした場合、ＢＤＮＦの単量体よりは二量体と反応した。このことは、抗ＩＥ６２モノクローナル抗体はＢＤＮＦ二量体により形成された立体構造的なエピトープを認識することを示唆する。ＩＥ６２を認識する抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体は、抗ＩＥ６２モノクローナル抗体と同様に、ＢＤＮＦの単量体よりはむしろＢＤＮＦ二量体と反応した。ＶＺＶ ＩＥ６２とＢＤＮＦのこのような免疫学的交差反応性は、それぞれのモノクローナル抗体により確認された。
【００８８】
ＢＤＮＦとＩＥ６２との交差反応エピトープの同定
抗ＩＥ６２モノクローナル抗体は、ＧＳＴ融合タンパク質２に加え、さらに領域ＣおよびＦを認識した（図２Ａ）。領域ＣおよびＦの重複領域は、ＩＥ６２タンパク質のアミノ酸４１４−４４７位を示し、当該領域を含む３つの構成ペプチドを用いて、ウェスタンブロットで反応をブロッキングすることによりＶＺＶ ＩＥ６２のエピトープを決定した。４１４番目から４２９番目のアミノ酸を含有するペプチドは、抗ＶＺＶ ＩＥ６２抗体と抗ＢＤＮＦ抗体の両抗体の相互作用をブロックした。このことは、ＩＥ６２のアミノ酸４１４−４４７位のペプチドのエピトープは、抗ＶＺＶ ＩＥ６２抗体と抗ＢＤＮＦ抗体により認識されることを示す(図３)。しかしながら、このペプチドは、ウェスタンブロットでＢＤＮＦに対する抗ＩＥ６２および抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体の反応をブロックできなかった。したがって、両モノクローナル抗体のエピトープは、ＩＥ６２のアミノ酸４１４−４４７位の線状のエピトープである。いずれのモノクローナル抗体も、同じ条件下で二量体により形成される立体構造的エピトープをブロックしなかった。
【００８９】
以上の結果から、交差反応エピトープはＶＺＶ ＩＥ６２のアミノ酸４１４〜４２９位であることが示唆される。
【００９０】
本発明者らは、培養ニューロンを用いて、ＢＤＮＦの生物活性におけるＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体の作用を特徴付けた。ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体は、図４Ａに示すように、ＡｒｃとＢＤＮＦエキソン３−５の転写を有意に亢進した。さらに、ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体は、神経細胞体の面積、分岐点、ＢＤＮＦにより刺激される神経突起の長さを有意に増やした（図４Ｃ〜Ｅ）。したがって、ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体は、生物学的および生化学的マーカーの観点から、ＢＤＮＦの活性を中和せず、むしろ増大させた。２つの生物活性ＢＤＮＦは、二価のＢＤＮＦとしてＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体によって連結され、当該二価のＢＤＮＦは、２つの近接するＴｒｋＢ分子に結合して、一価のＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ相互作用よりも強いシグナルを伝達し、その結果、ＡｒｃとＢＤＮＦの転写を亢進し、神経細胞の神経突起の進展を促進すると考えられる。あるいは、抗体のＢＤＮＦへの結合が、ＢＤＮＦの構造を安定化させ、レセプターであるＴｒｋＢへの結合を促進することが考えられる。
【００９１】
ＢＤＮＦによるＧＡＢＡ性ニューロンの形態学的発展の促進
ニューロンの発達阻害におけるＢＤＮＦの効果を評価するために、本発明者らは、抗ＧＡＤ６５抗体と反応することが確認されている皮質（ＧＡＢＡ性）ニューロンの形態を定量的に分析した。図４Ｂの(a)および(b)に示すように、ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦと共に培養した皮質ニューロンが別の対照ニューロンと比べてより大きな細胞体を有し、より多くの神経突起の枝分かれを有していることが明らかである。
【００９２】
この知見を定量するために、本発明者らは体細胞領域と、各ニューロンの神経突起の形態の３つのパラメータを計算した(図４Ｃ〜Ｅ)。ＢＤＮＦと共に培養したニューロン１０個の体細胞の平均領域は、１１個の対照ニューロンの平均よりも有意に大きかった(P＜0.01, ANOVA)(図４Ｃ)。ＢＤＮＦ処理ニューロンの初代神経突起の平均数は、対照ニューロンの数よりも有意に大きかった(P＜0.01, ANOVA)。また、処理ニューロンの神経突起の全長の平均値は、対照ニューロンと比べて、有意に大きかった(P＜0.05, ANOVA)(図４Ｅ)。最後に、ＢＤＮＦ処理ニューロンの神経突起の分岐点の平均数は、対照ニューロンの数と比べて有意に大きかった(P＜0.01, ANOVA)(図４Ｄ)。これらの結果より、ＢＤＮＦは皮質ニューロンの体細胞ニューロンおよび神経突起の発達を促進させることが示唆される。
【００９３】
ＢＤＮＦによる脊髄後根ニューロンの形態学的発展の促進
ＢＤＮＦのこのような作用がＴｒｋＢ受容体の活性化を通じて引き出されることを確認するために、Ｔｒｋ受容体チロシンキナーゼの阻害剤であるＫ２５２ａを、ＢＤＮＦで処理した１つの脊髄後根ニューロンに適用した。前記阻害剤で処理すると、脊髄後根ニューロンに対するＢＤＮＦの増殖作用を阻止することがわかった。このことは、神経突起の体細胞領域と３つのパラメータの定量解析において示された(図５Ａ〜Ｄ、各パネルの右から３つ目のカラム)。Ｋ２５２ａで処理した１０個のニューロンの体細胞の平均領域は、対照ニューロンの値と有意差はなかった。また、Ｋ２５２ａ処理ニューロンの一次神経突起の数は、対照ニューロンの値と有意差はなかった。Ｋ２５２ａ処理ニューロンの神経突起の全長は、対照ニューロンの値と有意差はなかった。Ｋ２５２ａ処理ニューロンの神経突起の分岐点の平均数は、対照ニューロンの値と有意差はなかった。Ｋ２５２ａはＢＤＮＦの作用とともにＩＥ６２抗体（ＩＥ１０）の増強作用も抑制していることがわかる(図５Ａ〜Ｄ、各パネルの右３つのカラム)。脊髄後根ニューロンは興奮性ニューロンであり、このニューロンが痛みを直接伝えることから、本発明の抗体はＢＤＮＦの活性化を通じて脊髄後角の興奮性ニューロンの神経突起の伸長を促進することが明らかになった。
【００９４】
実施例９
ＢＤＮＦ活性の阻害抗体の作製
１）ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質の発現
ＩＥ６２タンパク質として、ＶＺＶの岡株の代わりにＶＺＶの野生株（河口株）を用いて、配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅してＧＳＴをコードするＤＮＡと連結させること以外は実施例１に記載の方法と同様にして、ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質を作製した。
【００９５】
２）モノクローナル抗体の作製およびスクリーニング
前記１）で得られたＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質を用いて、本質的に既報（Okuno et al, Virology 129, 357-368 (1983)）に記載の方法に従って製造した。ハイブリドーマの培養上清をＧＳＴタンパク質に対するＥＬＩＳＡおよびＶＺＶ感染細胞に対する免疫蛍光抗体によりスクリーニングし、ＩＥ−６２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。得られたモノクローナル抗体（ＫＳＧ１〜１３）のＢＤＮＦ作用の阻害を指標とするスクリーニングは、実施例６に記載の方法に準じてニューロンの神経突起の伸長を記録することにより行い、本発明の阻害抗体を得た。
【００９６】
３）モノクローナル抗体とＩＥ６２ペプチドとの反応性
得られたモノクローナル抗体（ＫＳＧ１〜６、８、１２および１３）とＩＥ６２ペプチド（図１Ａの断片Ａもしくは断片Ｅ）またはＧＳＴタンパク質との反応性をウエスタンブロットで確認した。得られたすべてのモノクローナル抗体は、ＧＳＴタンパク質とは反応しなかった。ＫＳＧ１、２および６は断片Ａと反応し、それ以外のモノクローナル抗体は断片Ａおよび断片Ｅに反応した。
次に、モノクローナル抗体（ＫＳＧ１〜８、１０、１２および１３）のＩＥ６２ペプチドとの反応性をドットブロットで確認した。すなわち、ＩＥ６２ペプチド断片Ａまたは断片ＥのＧＳＴ融合タンパク質を、それぞれトリプシン、プロテイナーゼＫ、トロンビンまたはＶ８プロテアーゼで切断した切断物と、前記モノクローナル抗体との反応性をドットブロットで確認した。その結果、ＫＳＧ1、２および６のエピトープは、ＩＥ６２ペプチド断片ＡのＮ末端側に存在し、ＫＳＧ３、４、５、１２および１３のエピトープは、ＩＥ６２ペプチド断片Ａの中央部かつ断片ＥのＮ末端側に存在し、ＫＳＧ８のエピトープは、ＩＥ６２ペプチド断片Ａの中央部かつ断片ＥのＮ末端側と、それよりＣ末端側の２箇所に存在することが推定された。
次に、配列番号１８（GPVEQLYHVLSDSVPAKGAKADLPFETDDTRPRKHDARGITPRVPGRSSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSP）から選択した２種のペプチド
ペプチド１：GRSSGGKPRAFLALP（配列番号１９）および
ペプチド２：DTRPRKHDARGITPR（配列番号２０）を合成して、前記モノクローナル抗体をこれらペプチドで吸収してウエスタンブロットを行ったところ、ＫＳＧ８はペプチド２で吸収されたが、ＫＳＧ３、４、５、１２および１３はペプチド１および２では吸収できなかった。
４）ＢＤＮＦ活性の阻害抗体を用いた神経の染色
ラット胎児脳から大脳皮質および中脳を取り出して初代培養を行い、モノクローナル抗体ＫＳＧ１および４を用いて免疫染色を行った。結果を図６Ａ〜６Ｄに示す。ＢＤＮＦ活性の阻害抗体は、神経細胞を染色することがわかった。
【００９７】
実施例１０
ラット胎児初代培養大脳皮質にＰＨＮ患者血清で処理したＢＤＮＦを添加した時のＢＤＮＦ ｍＲＮＡの発現量の変動
ラット胎児の大脳皮質の初代培養を行い、ＰＨＮ患者血清で処理したＢＤＮＦ蛋白質の添加によるＢＤＮＦ ｍＲＮＡの発現量の変動を調べた。妊娠１７日目のラットの胎児１０匹から大脳皮質を取り出し、トリプシンとＤＮａｓｅで処理し、ポリ−Ｌ−リジンでコートした６穴プレート中で、１０％ＦＣＳを含むダルベッコＭＥＭ存在下で培養した。３日間培養後、血清を含まないダルベッコＭＥＭに培地交換し、さらに３日間培養した。ＰＨＮ患者血清（１０倍希釈したものを２０μl）とＢＤＮＦ蛋白質１０ｎｇ(1０ｎｇ／μｌを１μｌ)を氷中で４時間反応後、ラット胎児大脳皮質初代培養細胞に添加し、さらに３時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで２度洗浄後、ＲＮＡ抽出を行った。得られたＲＮＡに、ｐｏｌｙｄＴ(１５)と逆転写酵素を加えｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡを、ＢＤＮＦのエクソン３とエクソン５の配列から設定したプライマーと、内部標準としてβ-アクチンのプライマーでそれぞれreal time ＰＣＲを行い、ＢＤＮＦのｍＲＮＡの定量を行った。
【００９８】
結果を図７に示す。図７より、ＰＨＮ患者の血清で処理したＢＤＮＦ蛋白質をラット胎児大脳皮質に添加した場合は、ＢＤＮＦ蛋白質単独の時と比較してＢＤＮＦ ｍＲＮＡの発現量がより増大した。
【００９９】
実施例１１
ヒト型抗体の産生
ＢＤＮＦと免疫交差するＩＥ６２の部位が同定されているので、その部位を発現するＩＥ６２−ＧＳＴ融合蛋白を用いて、ヒト抗体ライブラリー（ＡＩＭＳ４）を用いて、そのエピトープに対するヒト型抗体をスクリーニングする。
ＩＥ６２−ＧＳＴ融合蛋白を試験管にコートして、ＡＩＭＳ４ファージライブラリーと反応させ、反応しなかったファージを洗浄して、反応したファージに大腸菌を加えてそのファージを増殖させる。次に、増殖したファージをさらにＩＥ６２−ＧＳＴ融合蛋白をコートした試験管でパニング法で選択することを繰り返す。その増殖したファージを、ＢＤＮＦでコートした試験管で選択し増殖させる。選択されたファージの産生したＣＰ３−Ｆａｂの反応性を、ＩＥ６２−ＧＳＴ融合蛋白とＢＤＮＦに対する反応性をウエスタンブロットで確認する。これまでにＢＤＮＦと交差する抗ＩＥ６２抗体と同様な反応性を示す抗体クローンを選択する。Ｆａｂ抗体のＢＤＮＦ活性調節作用を神経培養細胞で検討し活性を有するクローンのＩｇＧ抗体化を図る。Ｆａｂ抗体とＩｇＧ抗体の調節作用を比較して、適切な方を臨床応用のために実験に使用する。
【０１００】
実施例１２
小脳のプルキンエ細胞の神経突起の成長および発達に対する影響
生後１日のマウスまたはラットに本発明の抗体を接種し、３週後に小脳のプルキンエ細胞の神経突起を染色し、神経突起の成長および発達に対する影響を検討する。プルキンエ細胞は、小脳で均一な細胞なので、神経突起の伸びを定量化することができ、神経細胞への影響を評価する系として好適である。
実施例２で得られた抗体を接種後の神経突起の平均の長さ、分岐点を調べた脳の病理データの評価から、実施例２の抗体は神経突起の成長を促進すると評価される。したがって、ＢＤＮＦを介する神経細胞の活性化、神経連絡の促進、再生など、神経疾患の治療につながる。
実施例９で得られた阻害抗体を接種後の神経突起の平均の長さ、分岐点を調べた脳の病理データの評価から、実施例９の抗体は神経突起の成長を阻害すると評価される。したがって、１）ＢＤＮＦを介する神経突起の成長が阻害されるので、帯状疱疹後神経痛の際に形成されると考えられる過剰な神経連絡が制限され、そのため、痛覚過敏の発症を抑制できる。２）慢性疼痛の際には、同様にＢＤＮＦの作用による神経連絡の形成を阻害することによって慢性疼痛の形成阻止が可能と評価する。
【０１０１】
実施例１３
ＩＥ６２モノクローナル抗体のアルツハイマーモデルマウスにおける記憶障害、軸索の萎縮、シナプス減少の回復
痴呆における神経回路網の破綻を機能的に修復する目的で、神経突起伸長促進作用を指標に好適なＩＥ６２モノクローナル抗体のスクリーニングを行う。いくつかのＩＥ６２モノクローナル抗体（例：ＩＥ６２Ｂ）は神経突起伸長活性を有しており、神経突起伸長活性を示したモノクローナル抗体が、痴呆における記憶障害に対する作用を有するかどうかを検討する目的で、アルツハイマー病の原因物質であるamyloid b (Ab)の活性部分配列25-35ペプチドを単回脳室内投与して作製するアルツハイマー病のモデルマウスの1つを使用する。
Ab(25-35)投与したマウスでは、空間記憶の獲得と保持が対照群と比較すると有意に減弱する。さらに脳切片を免疫染色したところ、大脳皮質および海馬において、軸索とシナプスの有意な減少が観察される。
Ab(25-35)投与７日後からＩＥ６２モノクローナル抗体（例：ＩＥ６２Ｂ）を投与した群では、記憶獲得・保持能力ともに対照群のレベルに維持されており、軸索とシナプスが正常レベルに保たれていること、樹状突起の再形成を確認する。
【０１０２】
次に、初代培養したラット大脳皮質神経細胞におけるＩＥ６２モノクローナル抗体（例：ＩＥ６２Ｂ）の作用を検討する。ＩＥ６２モノクローナル抗体は大脳皮質神経細胞の軸索を特異的に伸長させる。Ab(25-35)を処置することで軸索および樹状突起の萎縮を誘発した状態にＩＥ６２モノクローナル抗体を作用させた場合においても、ＩＥ６２モノクローナル抗体は軸索特異的な伸長を促進する。以上の結果より、ＩＥ６２モノクローナル抗体（例：ＩＥ６２Ｂ）がAb（25-35）に誘発される軸索の萎縮、シナプス減少を抑制し、おそらくそのことによって記憶障害を回復させ、神経回路網の再構築に有効であることが示唆される。
【０１０３】
実施例１４
脳卒中易発性高血圧ラット（ＳＨＲＳＰ）における脳卒中予防効果の検討
脳卒中易発性高血圧ラット（Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rat, ＳＨＲＳＰ）を用いて、脳卒中予防効果を検討する。ＳＨＲＳＰの脳卒中発作時の主な症状として、一方の前肢の持ち上げ運動、歩行異常、過敏、自発運動量の減少、立毛、体重減少、摂餌量減少などが見られる。特徴的な組織変化として脳軟化、脳出血、血管壊死、心肥大、腎硬化症、腸管膜動脈の結節性多発性血管炎、精巣萎縮などが確認されている。
（方法）
ＳＨＲＳＰ（10週令）の雄性に１％食塩水または水道水を与え、ＩＥ６２モノクローナル抗体（ＩＥ６２Ｂ）を所定の用量で静脈内投与し、観察する。実験期間中、摂餌量、飲水量、体重を週１回測定するとともに、脳卒中発症日および死亡日を記録する。血圧は、小動物自動血圧測定装置（ウエダ製作所、UR-5000）を用いてtail cuff法により測定する。
（結果）
1．食塩負荷の影響：
１％食塩負荷により、体重にほとんど影響せずに血圧上昇が促進するとともに水道水飼育に比較して生存期間が１／２以下に短縮されることが明らかとなる。
2．脳卒中予防効果：
ＩＥ６２モノクローナル抗体（ＩＥ６２Ｂ）は極めて顕著に生存期間を延長し、食塩負荷群の約３．５倍、水道水飼育群よりさらに１００日も長期に生存し著効を示すことが明らかとなる。
【０１０４】
実施例１５
Ｇｅｒｂｉｌラット脳血管障害モデルに対するＩＥ６２抗体の神経細胞死抑制作用、再生促進作用
Ｇｅｒｂｉｌラットは椎骨動脈の影響を受けないラットなので、ＩＥ６２抗体を前投与しておき、内頚動脈を５分間結紮し、血管障害（血液脳関門の破壊により抗体が脳内へ浸透）を起こし、再開通させる。１週間後に、ニッスル染色により、神経細胞死を検討する。虚血に感受性が高く、ＢＤＮＦの発現の強い海馬ＣＡ1領域の神経細胞の脱落を指標として、この抗体の影響を検討する。
(結果)
ＩＥ６２抗体によるＣＡ1領域の細胞死を改善することを確認する。
【０１０５】
実施例１６
ラット大脳皮質神経細胞におけるＢＤＮＦおよびＡｒｃ遺伝子の持続的発現の検討
（目的）
脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)は、神経細胞の生存、可塑性の維持に重要であり、Ａｒｃ（Activity-regulated cytoskeleton-associated protein）は、シナプス可塑性との関連が報告されている。ラットにＩＥ６２モノクローナル抗体（ＩＥ６２Ｂ）を投与後のＢＤＮＦおよびＡｒｃ遺伝子の持続的発現制御系について検討する。
（方法）
Ｅ１７ラット大脳皮質初代培養神経細胞は、2.5×106細胞／35mm dishで培養する。培養6日目にＢＤＮＦを添加し、３時間後に培地交換した(BDNF washout)。定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＢＤＮＦおよびＡｒｃ ｍＲＮＡ発現量を測定する。
（結果・考察）
初代培養神経細胞において、ＢＤＮＦおよびＡｒｃ ｍＲＮＡ発現量は、ＢＤＮＦ washoutから４８時間後において有意に増加する。詳細を検討した結果、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現の持続性は、主に神経活動に依存することが明らかとなる。
一方、Ａｒｃ ｍＲＮＡ発現の持続性は、ＢＤＮＦシグナルに依存することが示唆される。さらに、ＢＤＮＦは、シナプス密度と相関のある、細胞内カルシウム振動の頻度を増加させる。以上の結果から、ＢＤＮＦ遺伝子の神経活動依存的かつ持続的な発現制御機構は、Ａｒｃ遺伝子発現にも持続性を付加することで、シナプス機能を維持する上で、基本的な役割を担うものと考えられる。
【０１０６】
実施例１７
ラット大脳皮質神経細胞におけるＢＤＮＦの自立的、持続的発現制御系の検討
（目的）
ＩＥ６２モノクローナル抗体を投与後のＢＤＮＦのｍＲＮＡ発現量を持続的に増加させることを明らかにし、さらに、シナプス可塑性との関連が報告されているＡｒｃのｍＲＮＡ発現量について解析し、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現の場合と比較する。
（方法）
Ｅ１７ラット大脳皮質初代培養神経細胞は、ポリエチレンイミンコートした35mmdishに、2.5×106細胞/2mLで培養する。培養6日目にＢＤＮＦ(100ng/mL)を添加し、3時間後に3回培地交換する(ＢＤＮＦ washout)。 定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によりＢＤＮＦ ｍＲＮＡ及びＡｒｃ ｍＲＮＡ発現量を測定する。
（結果・考察）
初代培養神経細胞において、ＢＤＮＦ添加群、ＢＤＮＦ washout群ともＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現量は２４から７２時間までコントロール群と比較して約２倍と持続的に増加した。このときＡｒｃ ｍＲＮＡ発現量はコントロール群と比較して２４時間で約２０倍に増加し、４８、７２時間で約２倍の発現量を維持している。これらのｍＲＮＡ増加は、ＴｒｋＢ阻害剤Ｋ２５２ａの存在下で抑制される。また、ＢＤＮＦ中和抗体を用いるとＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現量は変化しないが、Ａｒｃ ｍＲＮＡ発現量は有意に減少する。
さらに、各種阻害剤を用いた結果、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡ及びＡｒｃ ｍＲＮＡの持続的発現に至るシグナル伝達が異なることを示す結果を得る。
以上の結果より、ＢＤＮＦによる自律的な遺伝子発現によって合成・分泌されたＢＤＮＦが、ＴｒｋＢを介した複数のシグナル伝達経路を活性化することで、ＢＤＮＦおよびＡｒｃ遺伝子発現を持続的に活性化することが示唆される。
神経細胞に備わるＢＤＮＦを中心とした自律的・持続的発現制御機構は、神経可塑性を維持するための基本的役割を担う。
【０１０７】
実施例１８
ヒトのＡＰＰ遺伝子を導入したトランスジェニックマウスにおける本発明の抗体の作用
ヒト型ＡＰＰ遺伝子を強発現し、加齢とともに脳の老人斑を生じるＰＤ−ＡＰＰマウス（Ｔｇ２５７６マウス）にＩＥ６２モノクローナル抗体を投与すると、老人斑の形成を予防する。
ＩＥ６２モノクローナル抗体（ＩＥ６２Ｂ、ＫＳＧ１〜１３）の投与を受けたマウスは、学習機能が回復する。
ＩＥ６２モノクローナル抗体（ＩＥ６２Ｂ、ＫＳＧ１〜１３）をＴｇ２５７６マウスに１回投与する。接種マウスでは老人斑アミロイドの沈着が有意に減少し、脳炎などの副作用はみられない。この方法はアルツハイマー病の予防・治療法としてヒトに応用できると期待される。
上記Ｔｇ２５７６マウスに、本発明の抗体（ＢＤＮＦと交差するＩＥ６２抗体）を注射し、１ヶ月後の記憶力をプールの浅い場所を覚えさせる「水迷路」の実験で検討する。
本発明の抗体を投与したマウスは、投与前には浅瀬の場所を覚えられなかった記憶力が野生型のマウス並みに回復する。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明の神経突起の伸長促進剤、神経性疾患の予防または治療剤によると、これまで有効な手段のなかった神経損傷後の神経の再生が可能となる。また、本発明の神経突起の伸長阻害剤によると、これまで有効な手段のなかった帯状疱疹後の神経痛や慢性疼痛等に効果を奏することが期待される。さらに、本発明の予防または治療剤によると、経験依存性社会嫌悪やストレスなどの神経の過敏を伴う疾患に対しても改善が期待される。
本出願は、日本で出願された特願２００６−３１２２３６（出願日：２００６年１１月１７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経伸長促進剤および伸長阻害剤に関する。詳しくは、水痘帯状疱疹ウイルス前初期抗原を認識する抗体の神経突起の伸長促進、神経再生または神経突起の伸長阻害の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)は、発達中および成人において、生存、分化、シナプス可塑性ならびに末梢および中枢ニューロンの選択伸長に重要な役割を果たしていると認識されている、神経栄養因子ファミリーのメンバーである（特許文献１、非特許文献１、２）。ＢＤＮＦのｃＤＮＡは、２４７アミノ酸残基からなる前駆体タンパク質をコードしている。前駆体タンパク質は、シグナルペプチドおよびプロプロテインを有し、これらは切断されて１１９アミノ酸残基の成熟ＢＤＮＦが生成する。生物活性なＢＤＮＦ(２７ｋＤａ)は、強力な疎水性相互作用により２つの同じサブユニットから形成される二量体である。ＢＤＮＦがシナプスの長期増強、学習および記憶等の頻度依存性可塑性メカニズムに関与していることはよく知られている。ＢＤＮＦは、臨床上の痛覚過敏症の原因となる可塑性に関与している（非特許文献３）。
【０００３】
水痘帯状疱疹ウイルス(ＶＺＶ)感染は、急性小脳失調症（ＡＣＡ）、ヘルペス後神経痛（ＰＨＮ）等の神経学的合併症を生じさせる。ＡＣＡは、水痘感染に伴う最もよく起こる神経学的合併症である。１５歳未満の小児の４０００症例当たり１例で起こると推定されている。ＡＣＡは、発疹の開始の数日前から３週間後に出現し、完全回復まで２−４週間続く。帯状疱疹は、感覚の異常を伴うデルマトームに沿った領域分布中に水疱性発疹が現れ、一般的集団における年間発生率は、英国において１０００人当たり３．４である(非特許文献４)。ＰＨＮは、帯状疱疹の最も頻度の高い合併症であり、患者の７〜３５％（６０歳以上では５０％を越える）で発症する。ＰＨＮは、急性神経炎に伴う痛みとは異なり、休みなく続く痛み、電撃痛およびアロディニアを合併する（非特許文献５）。ＰＨＮの病態生理学は明らかになっていないけれど、両神経学的合併症がウイルス感染の回復期またはそれより後に出現するということは、ＶＺＶに対する免疫応答がそれらの病原性の過程に関与することを示唆する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−３２８９７４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nagappan G. Lu B., Trends in Neurosciences, 28: 464-471, 2005
【非特許文献２】Bramham CR et al., Progress in Neurology, 76: 99-125, 2005
【非特許文献３】Coull, J. A. M. et al., Nature 438: 1017-1021, 2005
【非特許文献４】Johnson, R. W. et al., BMJ 326: 748-750, 2003
【非特許文献５】Donald H. Gilden et al., Neurology 64: 21-25, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、帯状疱疹後神経痛の機序の解明に寄与し、損傷した神経の再生を促進する手段の提供である。また、本発明の目的は、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、ヘルペス後神経痛、脳卒中、変性疾患等に伴う神経細胞死による障害や前記疾患の予防または治療に効果的で、しかも副作用の少ない手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＢＤＮＦが臨床上の痛覚過敏症の原因となる可塑性に関与していることからＰＨＮの病態のメカニズムを解析できるのではないかという仮説を立て、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）とＢＤＮＦとの免疫学的関連を調べた。ＶＺＶは、潜伏感染した神経節で遺伝子４、２１、２９、６２、６３を発現し、前初期タンパク質ＩＥ６２が感染中にウイルス遺伝子の転写活性化に中心的役割を果たす。ＰＨＮ患者を含む水痘回復期血清は、ウェスタンブロット解析でＩＥ６２およびＢＤＮＦを認識した。本発明者らは、ＩＥ６２とＢＤＮＦとの免疫学的関係をさらに調べ、これらの間で免疫学的交差反応性を見出した。交差反応の有意差は、それぞれのモノクローナル抗体を用いて検定した。ＢＤＮＦと交差するＩＥ６２抗体のなかには、ＢＤＮＦの生物活性を阻害するものと、他にもＢＤＮＦによるｔｒｋＢが介在するシグナル伝達および神経突起の伸長を有意に増加するものがあることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本願発明は、以下に示す通りである。
【０００８】
〔１〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する、神経突起の伸長促進剤。
〔２〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が配列番号２の４１４−４２９位のアミノ酸配列を有するペプチドを認識するものである前記〔１〕に記載の促進剤。
〔３〕 前記脳由来神経栄養因子が二量体である前記〔１〕または〔２〕に記載の促進剤。
〔４〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する、神経性疾患の予防または治療剤。
〔５〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が配列番号２の４１４−４２９位のアミノ酸配列を有するペプチドを認識するものである前記〔４〕に記載の予防または治療剤。
〔６〕 前記脳由来神経栄養因子が二量体である前記〔４〕または〔５〕に記載の予防または治療剤。
〔７〕 前記神経性疾患が脳卒中、酸素欠乏症、窒息、身体的損傷、毒への暴露、悪性新生物、痴呆（認知症）、アルツハイマー、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選ばれる状態により引き起こされる損傷した神経細胞を伴う疾患である前記〔４〕〜〔６〕いずれか１項に記載の予防または治療剤。
〔８〕 前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の神経突起の伸長促進剤、および当該促進剤を神経突起の伸長のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該促進剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
〔９〕 前記〔４〕〜〔７〕いずれか１項に記載の神経性疾患の予防または治療剤、および当該予防または治療剤を神経性疾患のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該予防または治療剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
〔１０〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する、神経突起の伸長阻害剤。
〔１１〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が脳由来神経栄養因子の阻害抗体である前記〔１０〕に記載の阻害剤。
〔１２〕 前記抗体が配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものである、前記〔１１〕に記載の阻害剤。
〔１３〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患の予防または治療剤。
〔１４〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が脳由来神経栄養因子の阻害抗体である前記〔１３〕に記載の予防または治療剤。
〔１５〕 前記抗体が配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものである、前記〔１４〕に記載の予防または治療剤。
〔１６〕 前記〔１０〕〜〔１２〕いずれか１項に記載の神経突起の伸長阻害剤、および当該阻害剤を神経突起の伸長阻害のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該阻害剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
〔１７〕 前記〔１３〕〜〔１５〕いずれか１項に記載の予防または治療剤、および当該予防または治療剤を帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該予防または治療剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
〔１８〕 前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載の抗体を製造する方法であって、配列番号２の４１４−４２９位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングする工程を含む製造方法。
〔１９〕 前記抗体ライブラリーがヒト抗体ライブラリーである前記〔１８〕に記載の製造方法。
〔２０〕 前記〔１０〕〜〔１５〕いずれか１項に記載の抗体を製造する方法であって、配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングする工程を含む製造方法。
〔２１〕 前記抗体ライブラリーがヒト抗体ライブラリーである前記〔２０〕に記載の製造方法。
〔２２〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体の有効量を対象に投与することを含む、神経性疾患の予防または治療方法。
〔２３〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が配列番号２の４１４−４２９位のアミノ酸配列を有するペプチドを認識するものである前記〔２２〕に記載の予防または治療方法。
〔２４〕 前記脳由来神経栄養因子が二量体である前記〔２２〕に記載の予防または治療方法。
〔２５〕 前記神経性疾患が脳卒中、酸素欠乏症、窒息、身体的損傷、毒への暴露、悪性新生物、痴呆（認知症）、アルツハイマー、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選ばれる状態により引き起こされる損傷した神経細胞を伴う疾患である前記〔２２〕に記載の予防または治療方法。
〔２６〕 水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体の有効量を対象に投与することを含む、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患の予防または治療方法。
〔２７〕 前記タンパク質がＩＥ６２であり、前記抗体が脳由来神経栄養因子の阻害抗体である前記〔２６〕に記載の予防または治療方法。
〔２８〕 前記抗体が配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものである前記〔２７〕に記載の予防または治療方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の神経突起の伸長促進剤によると、ＢＤＮＦの作用を増強することにより神経突起の伸長を促進することができるので、少ない量のＢＤＮＦ存在下でも効率よく効果を奏することが期待される。前記伸長促進剤に含まれる抗体は、ＢＤＮＦそれ自体と比べて生体内での半減期が長いので、ＢＤＮＦの増強作用が持続するとともに、ＢＤＮＦのオートクラインシステムが活性化され、ＢＤＮＦ産生分泌自体も促進され、持続的に神経細胞に作用するＢＤＮＦ活性が上昇する。さらに時間が経過するとＢＤＮＦ自体の活性は減少していくが、半減期の長い抗体がもたらす持続的効果により、ＢＤＮＦの作用を上昇させ続けることが可能である。本発明の神経性疾患の予防または治療剤によると、これまで有効な手段のなかった神経損傷後の神経の再生が可能となる。また、本発明の神経突起の伸長阻害剤によると、ＢＤＮＦの作用を阻害することにより神経突起の伸長を阻害することができるので、これまで有効な手段のなかった帯状疱疹後の神経痛や慢性疼痛等に効果を奏することが期待される。前記伸長阻害剤に含まれる抗体は、ＢＤＮＦの作用を中和することによってＢＤＮＦのオートクラインシステムの活性化も抑制することができ、さらに、このような相乗的または相加的抑制効果により、分泌されたＢＤＮＦにより神経細胞がさらにＢＤＮＦを誘導する二次反応も抑制可能である。さらに、本発明の予防または治療剤によると、経験依存性社会嫌悪やストレスなどの神経の過敏を伴う疾患に対しても、ＢＮＤＦ作用の阻害を介して当該疾患の改善が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の前初期（ＩＥ）６２タンパク質の断片の位置関係を示す概略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＩＥ６２断片とＧＳＴとの融合タンパク質の電気泳動の写真である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、帯状疱疹およびＰＨＮ患者由来の血清のＩＥ６２およびＢＤＮＦへの反応性を調べたウェスタンブロットのまとめを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、帯状疱疹およびＰＨＮ患者由来の血清のＩＥ６２およびＢＤＮＦへの反応性を調べたウェスタンブロットの一例を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体のＩＥ６２断片に対する反応性を示す電気泳動の写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体を用いたＶＺＶ感染細胞での免疫組織染色を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＢＤＮＦタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真ならびにＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの写真である。
【図３】図３は、ＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦモノクローナル抗体のエピトープを決定した電気泳動の写真である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＩＥ６２モノクローナル抗体がＢＤＮＦエキソン３〜５の転写ならびにＡｒｃの転写を上昇させることを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、無添加(a)およびＩＥ６２とＢＤＮＦ添加(b)で培養した皮質（ＧＡＢＡ性）ニューロンの神経突起の形態を示す。スケールバーは４０μｍを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が神経細胞体の面積を増加させることを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が神経の分岐点の数を増加させることを示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が神経突起の全長を増加させることを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が脊髄神経細胞体の面積を増加させることを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が脊髄ニューロンの分岐点の数を増加させることを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＩＥ６２モノクローナル抗体が脊髄ニューロンの神経突起の全長を増加させることを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、無添加対照(a)およびＩＥ６２とＢＤＮＦ添加(b)で培養した脊髄後角ニューロンの神経突起の形態を示す。スケールバーは４０μｍを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、モノクローナル抗体ＫＳＧ１を用いた大脳皮質細胞の免疫染色の写真である。倍率は、１０００倍である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、モノクローナル抗体ＫＳＧ１を用いた中脳細胞の免疫染色の写真である。倍率は、１０００倍である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、モノクローナル抗体ＫＳＧ４を用いた大脳皮質細胞の免疫染色の写真である。倍率は、４００倍である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、モノクローナル抗体ＫＳＧ４を用いた中脳細胞の免疫染色の写真である。倍率は、１０００倍である。
【図７】図７は、ラット胎児初代培養大脳皮質にＰＨＮ患者血清で処理したＢＤＮＦを添加した時のＢＤＮＦ ｍＲＮＡの発現量の変動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の神経突起の伸長促進剤は、水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する抗体を有効成分として含有する。当該抗体は、後述する本発明の神経突起の伸長阻害剤に含まれる阻害抗体と区別する場合、促進抗体と称する。
【００１２】
前記抗体は、水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識する抗体である。ここで、水痘帯状疱疹ウイルス(ＶＺＶ)とは、アルファヘルペス・ウイルス属のメンバーであり、水痘(varicella)および帯状疱疹(zoster)の病原媒体である。ＶＺＶゲノムは、直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子であり、例えば、J. Gen Virol. (1986), 67, 1759-1816にその全塩基配列およびコードされるタンパク質のアミノ酸配列が開示されている。あるいは、ＶＺＶ（ヒトヘルペスウイルス３）として、Genbank Accession No: NC_001348においても、全ゲノムの塩基配列および当該ゲノムからコードされるタンパク質のアミノ酸配列が開示されている。ＶＺＶゲノムは、約７０種のタンパク質をコードしている。ＶＺＶの全遺伝子は、前初期(ＩＥ)、初期(Ｅ)および後期(Ｌ)という３つの広い動態クラス中で、感染細胞中に発現すると考えられている。ＶＺＶ ＩＥ６２タンパク質は、ＶＺＶタンパク質の３つの動態クラスのすべての発現の活性化に関与している。
【００１３】
前記抗体は、ＶＺＶがコードするタンパク質の中で、前初期タンパク質、より好ましくはＩＥ６２を抗原として製造されたものである。抗原としてのＩＥ６２タンパク質も、前記文献およびGenbank等でそのアミノ酸配列が開示されている。例えば、ヒトヘルペスウイルス３ ＶＺＶ−Ｏｋａ株の場合、Genbank Accession No:AY016449にＩＥ６２の塩基配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）が開示されている。また、ヒトヘルペスウイルス３ ＶＺＶ−野生株（河口株）は、Journal of Virology 2002 p11447-144459を参照のこと。
【００１４】
前記促進抗体は、配列番号２のＩＥ６２のアミノ酸配列において、４１４−４２９位のアミノ酸配列（ＰＧＹＲＳＩＳＧＰＤＰＲＩＲＫＴ：配列番号３）を有するペプチドを認識するものであることが好ましい。かかるペプチドを認識する促進抗体は、後述するＢＤＮＦとの交差反応性をより顕著に有するため、好ましい。前記ペプチドは、本発明における促進抗体のエピトープとして機能するものであり、その抗原決定基としての機能を失わない限りにおいて、配列番号３のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端から１〜３アミノ酸程度欠失していてもよい。あるいは、前記ペプチドは、その抗原決定基としての機能を失わない限りにおいて、追加のアミノ酸配列を１〜数個（通常１〜５、好ましくは１〜３）、そのＮ末端またはＣ末端に有していてもよい。追加のアミノ酸残基としては、後述する高分子化合物（タンパク質）との結合のために導入されるシステイン残基などがあげられる。
【００１５】
前記抗体は、前初期タンパク質、好ましくはＩＥ６２を高感度かつ高い特異性で認識することができるとともに、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と交差反応することを特徴とする。
【００１６】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）は、ヒトＢＤＮＦとして、GenBank Accession No.NM_170731-170735、NM_001709にその塩基配列およびアミノ酸配列が開示されている。前記促進抗体が交差反応するＢＤＮＦは、成熟体であり、好ましくは成熟体の二量体である。
【００１７】
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、ファージディスプレイによって作製された抗体およびこれらの結合性断片が含まれる。
【００１８】
結合性断片とは、前述した抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fv（variable fragment of antibody）、sFv、dsFv（disulphide stabilised Fv）、dAb（single domain antibody）等があげられる（Exp. Opin. Ther. Patents，Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。
【００１９】
抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはＩｇＧである。
【００２０】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、既知の一般的な製造方法によって製造することができる。即ち、例えば、免疫原を、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、例えばポリクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマまたはウシ等、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギに、モノクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスターに免疫する。
【００２１】
一実施態様において、免疫原としてのＩＥ６２ペプチドは、公知の方法により製造することができる。例えば、配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを常法に従って合成し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン（ＴＧ）、免疫グロブリン等の高分子化合物（タンパク質）との複合体を形成させた後、免疫原として用いることができる。
【００２２】
前記ＩＥ６２ペプチドと高分子化合物との複合体を形成させる等の目的で、１個または数個のアミノ酸を付加してもよい。付加されるアミノ酸の数は、特に限られないものの、製造される抗体の特異性を考慮すると、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個である。付加されるアミノ酸の位置はポリペプチドのＮ末端またはＣ末端いずれでもよいが、Ｃ末端が好ましい。
【００２３】
複合体の形成方法は、公知の方法により行なうことができ、特に限定されるものではない。例えば、混合酸無水物法または活性エステル法等により前記ＩＥ６２ペプチドのカルボキシ基と前記高分子化合物の官能基とを反応させて、複合体を形成することができる。あるいは、前記ＩＥ６２ペプチドのＣ末端にシステイン残基を導入し、当該システインの側鎖であるＳＨ基を介して前記高分子化合物と結合させることもできる。
【００２４】
別の実施態様において、例えば、配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドをコードするヌクレオチドを他のタンパク質（例、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ））をコードするヌクレオチドと連結した発現ベクターを用いて、常法により他のタンパク質との融合タンパク質として宿主で発現させ、精製したものを免疫原として用いることができる。
【００２５】
ポリクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、免疫原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギ、好ましくはヤギ、ウマまたはウサギ、より好ましくはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜５回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から血清が取得される。
【００２６】
血清をポリクローナル抗体として用いることも可能であるが、好ましくは、限外ろ過、硫安分画、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（DEAEまたはDE52等）、抗イムノグロブリンカラムもしくはプロテインＡ/Ｇカラム、免疫原を架橋させたカラム等を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーにより単離および／または精製される。
【００２７】
モノクローナル抗体は、上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた免疫原に対して特異的親和性を示し、かつ、ＢＤＮＦと交差反応性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
【００２８】
モノクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、免疫原を、マウス、ラットまたはハムスター（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内もしくは腹腔内に１〜数回注射するか、または移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞を取得する。
【００２９】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature, Vol.256, p.495-497, 1975）およびそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄または扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合により調製される。
【００３０】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（653；ATCC No.CRL1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14（Sp2/0、Sp2）、PAI、F0またはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11またはCEM-T15を使用することができる。
【００３１】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた免疫原に対する反応性を、さらに、前記上清のＢＤＮＦに対する反応性を、例えばＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
【００３２】
前記ハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、上述のポリクローナル抗体と同様に、単離および／または精製されることが好ましい。
【００３３】
また、キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）, Vol.6, No.10, 1988」、特公平3-73280号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平4-506458号公報、特開昭62-296890号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994」、特表平4-504365号公報、国際出願公開WO94/25585号公報、「日経サイエンス、６月号、第４０〜第５０頁、１９９５年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表平6-500233号公報等を参考にそれぞれ製造することができる。
【００３４】
ファージディスプレイによる抗体作製は、抗体スクリーニング用に作製されたファージライブラリーから、例えば、バイオパニングにより抗原に親和性を有するファージを回収、濃縮することにより、Ｆａｂ等の抗体等を容易に得ることができる。この場合、配列番号２の４１４−４２９位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングすることが好ましい。好ましい抗体ライブラリーおよび抗体のスクリーニング方法については、国際公開第０１／０６２９０７号パンフレット、特開２００５−１８５２８１号を参照のこと。
ファージライブラリーには、すべての抗原に対して反応できるクローンが存在している。したがって、抗原をＩＥ６２とすると、ＩＥ６２に存在するあらゆるエピトープに対する抗ＩＥ６２抗体のクローンが得られる。このクローン群に対して、次の抗原として、ＢＤＮＦを用いてスクリーニングを行えば、交差する抗体が得られる。そして、ＢＤＮＦ活性に対する作用から、ヒト型のＢＤＮＦ活性を抑制または促進する機能を有する抗体を選択することができる。得られたヒト型抗体は、ヒトへの適応に有利である。
【００３５】
F(ab')2およびFab'は、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素であるペプシンまたはパパインで処理することによりそれぞれ製造することができる。Fabは、Fab発現ファージライブラリーを上記ファージディスプレイによる抗体作製法と同様にスクリーニングすることにより、製造することができる。
【００３６】
このようにして得られたＩＥ６２タンパク質を認識する抗体は、通常の抗原−抗体反応を利用する方法によりＩＥ６２タンパク質を検出または定量することができる。かかる方法としては特に限定されるものではないが、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（例、ＥＬＩＳＡ）、蛍光もしくは発光測定法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等(Meth．Enzymol.，92，p.147-523 (1983)， Antibodies Vol.II IRL Press Oxford (1989))があげられる。
【００３７】
本発明の神経突起の伸長促進剤の有効成分である前記促進抗体は、これまで知られていたＶＺＶに対する抗体とは異なり、ＢＤＮＦを介する神経突起の伸長を促進する作用を有するものである。ここで、神経突起とは、神経細胞の外側に形成される軸索、樹状突起および軸索側枝を含むものである。神経突起の伸長促進とは、神経細胞を顕微鏡下で観察して神経突起の長さを測定した場合に、その全長が対照と比べて増加することをいう。この場合の対照とは、本発明の促進剤を添加しないことを除いては同様の条件下に置かれた神経細胞をいう。
【００３８】
本発明の促進剤に含まれる抗体の量は、上記作用効果を奏する限りにおいて特に限定されるものではないが、通常０．００１〜９０重量％であり、好ましくは０．００５〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００３９】
本発明の促進剤は、前記抗体以外に担体を含有してもよい。かかる担体としては、製剤分野において通常用いられる担体を使用することができ、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、グリセリン、ポリエチレングリコール等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の促進剤が作用する細胞としては、神経細胞、特に損傷した神経細胞、などがあげられる。
【００４１】
本発明の促進剤は、研究用試薬として用いることができる。あるいは、試験管内で神経細胞の突起の伸長を促進させることができる。試験管内での適用のためには、例えば、培養中の神経細胞に対して、本発明の促進剤を培地に添加することにより接触させ、適宜培養を続ける方法があげられる。
【００４２】
本発明の促進剤は、生体内に投与して、神経細胞の突起の伸長を促進させることができる。生体内に投与する方法としては限定されず、例えば、皮下注、筋注、腹腔内への注射、点滴などがあげられる。経口投与、静脈内投与、筋肉内投与などの全身投与以外に脳内または髄腔内(髄液中)、一側背側海馬への局所投与があげられる。脳内への局所投与に際しては、本発明の促進剤をコラーゲンからなる担体に含有させることができる。
【００４３】
神経突起の伸長促進作用を有する前記促進抗体は、神経細胞、特に損傷した神経細胞の再生が期待される。本発明は、かかる抗体を有効成分として含有する神経性疾患の予防または治療剤を提供する。
【００４４】
本発明の予防または治療剤中に含まれる促進抗体の量は、上記作用効果を奏する限りにおいて特に限定されるものではないが、通常０．００１〜９０重量％であり、好ましくは０．００５〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００４５】
本発明の予防または治療剤は、前記促進抗体以外に担体を含有してもよい。かかる担体としては、前記促進剤で例示したものがあげられる。
【００４６】
本発明の予防または治療剤が適用される神経性疾患としては、神経突起の伸長を促進することにより病態の改善が期待される疾患である。例えば、脳卒中、酸素欠乏症、窒息、身体的損傷、毒への暴露、悪性新生物、痴呆（認知症）、糖尿病に関連する末梢神経障害、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症など）、免疫性神経疾患（多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、筋炎など）、感染性疾患（脳炎、髄膜炎など）、血管障害（脳梗塞、脳出血など）、その他の神経性疾患（筋ジストロフィー、てんかん、ミトコンドリア脳筋症など）などの状態により引き起こされる損傷した神経細胞を伴う疾患があげられる。好ましくは、酸素欠乏症、窒息、身体的損傷、毒への暴露、悪性新生物、痴呆（認知症）、アルツハイマー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症である。
【００４７】
本発明の促進剤または予防もしくは治療剤の投与対象としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ヒト等の哺乳動物があげられる。
【００４８】
脳卒中発症時には血液脳関門が局部において破壊されていることから、本発明の促進剤の脳への送達が容易になることが期待できる。血液脳関門開通剤としてマンニトール、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、フラクトオリゴ糖、グルクロン酸、グリセロール、シュークロース、メトラゾール、エトプシド、合成胆汁塩、コール酸類、ジメチルサルフォキシド、アデニル酸類、無機塩類または有機酸類を同時に投与することができる。
【００４９】
促進剤または予防もしくは治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（intracistemally）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内もしくは経口または鼻腔スプレーとして投与することができる。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【００５０】
促進剤または予防もしくは治療剤は、徐放性システムにより適切に投与することも可能である。徐放性の剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【００５１】
本発明の促進剤または予防もしくは治療剤を、個々の患者の臨床状態、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化する。
【００５２】
本発明の神経突起の伸長阻害剤は、水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と交差反応する抗体を有効成分として含有する。前記阻害剤に有効成分として含まれる抗体は、これまで知られていたＶＺＶに対する抗体とは異なり、ＢＤＮＦと交差反応してＢＤＮＦの作用を阻害することにより、神経突起の伸長を阻害する作用を有するものである。かかる抗体を単に阻害抗体とも称する。
【００５３】
前記阻害抗体は、配列番号２のＩＥ６２のアミノ酸配列において、２６８−３４１位のアミノ酸配列（ＧＰＶＥＱＬＹＨＶＬＳＤＳＶＰＡＫＧＡＫＡＤＬＰＦＥＴＤＤＴＲＰＲＫＨＤＡＲＧＩＴＰＲＶＰＧＲＳＳＧＧＫＰＲＡＦＬＡＬＰＧＲＳＨＡＰＤＰＩＥＤＤＳＰ：配列番号１８）から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものであることが好ましい。かかるペプチドを認識する抗体は、ＢＤＮＦと交差反応し、かつＢＤＮＦの作用を阻害するため、好ましい。前記ペプチドは、本発明における抗体のエピトープとして機能するものである。
【００５４】
前記阻害抗体の製造方法は、前記促進抗体の製造方法において、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドの代わりに、配列番号１８のアミノ酸配列からなるペプチドまたは配列番号１８のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを用いること以外は同様にして製造することができる。
【００５５】
本発明の阻害剤に含まれる阻害抗体の量は、上記作用効果を奏する限りにおいて特に限定されるものではないが、通常０．００１〜９０重量％であり、好ましくは０．００５〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００５６】
本発明の阻害剤は、前記阻害抗体以外に担体を含有してもよい。かかる担体としては、製剤分野において通常用いられる担体を使用することができ、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、グリセリン、ポリエチレングリコール等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００５７】
本発明の阻害剤が作用する細胞としては、神経細胞、特に損傷した神経細胞などがあげられる。
【００５８】
本発明の阻害剤は、研究用試薬として用いることができる。あるいは、試験管内で神経細胞の突起の伸長を阻害することができる。試験管内での適用のためには、例えば、培養中の神経細胞に対して、本発明の阻害剤を培地に添加することにより接触させ、適宜培養を続ける方法があげられる。
【００５９】
本発明の阻害剤は、生体内に投与して、神経細胞の突起の伸長を阻害することができる。生体内に投与する方法としては限定されず、例えば、皮下注、筋注、腹腔内への注射、点滴などがあげられる。経口投与、静脈内投与、筋肉内投与などの全身投与以外に脳内または髄腔内(髄液中)、一側背側海馬への局所投与があげられる。脳内への局所投与に際しては、本発明の阻害剤をコラーゲンからなる担体に含有させることができる。
【００６０】
神経突起の伸長阻害作用を有する前記阻害抗体は、神経の過敏状態の抑制が期待される。本発明は、かかる抗体を有効成分として含有する神経の過敏を伴う疾患の予防または治療剤を提供する。
【００６１】
本発明の予防または治療剤中に含まれる阻害抗体の量は、上記作用効果を奏する限りにおいて特に限定されるものではないが、通常０．００１〜９０重量％であり、好ましくは０．００５〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜１０重量％である。
【００６２】
本発明の予防または治療剤は、前記阻害抗体以外に担体を含有してもよい。かかる担体としては、前記阻害剤で例示したものがあげられる。
【００６３】
本発明の阻害剤または予防もしくは治療剤が適用される疾患としては、神経突起の伸長を阻害することにより病態の改善が期待される疾患である。例えば、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪、ストレスなどがあげられる。慢性疼痛は、
(1)侵害受容器が持続的に刺激されて生じると考えられる侵害受容性疼痛、
(2)疼痛伝達または抑制機構にかかわる神経線維の働きに異常をきたした結果である神経因性疼痛、および
(3)感情または情動面に重きがおかれる心因性疼痛、に分類される。本明細書でいう慢性疼痛は、神経因性疼痛（神経の損傷や圧迫などからくる痛み）、侵害受容性疼痛（ガンやリウマチなどの痛み）の二種類をいう。経験依存性社会的嫌悪(社会的挫折ストレス)とは、中辺縁ドーパミン経路のＢＤＮＦが必須の役割を果たしている状態である。
【００６４】
本発明の阻害剤または予防もしくは治療剤の投与対象としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ヒト等の哺乳動物があげられる。
【００６５】
阻害剤または予防もしくは治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（intracistemally）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内もしくは経口または鼻腔スプレーとして投与することができる。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【００６６】
阻害剤または予防もしくは治療剤は、徐放性システムにより適切に投与することも可能である。徐放性の剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【００６７】
本発明の阻害剤または予防もしくは治療剤を、個々の患者の臨床状態、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化する。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００６９】
ウイルスおよび細胞培養
ＶＺＶの岡株（弱毒水痘ウイルス岡株（日本国特公昭５３−４１２０２号又は米国特許第３，９８５，６１５号）に由来のウイルスをシードに用いて製造され、世界の諸国で広く実用に供されている（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｖａｒｉｃｅｌｌａ Ｖａｃｃｉｎｅ（Ｌｉｖｅ）Ａｄｏｐｔｅｄ １９８４；Ｒｅｖｉｓｅｄ １９９３：ＷＨＯ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ．８４８，ｐｐ．２２−３８，１９９４）。該弱毒岡株は、寄託番号ＶＲ−７９５として１９７５年３月１４日にＡＴＣＣに寄託されている。）およびＶＺＶの河口株（Journal of Virology, Nov. 2002, P.11447-11459）は、ヒト胎性肺細胞またはヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞で増殖させた。前記細胞はそれぞれ、１０％および２％ウシ胎仔血清を補足したEagle'ｓ最小必須培地中で生育し、維持した。
ラット皮質ニューロンの初代培養細胞は、既報(Tabuchi, A., et al., J. Biol. Chem.277, 35920-35931 (2002))に従って、17〜18日齢胎仔ラット(Sprague-Dawley)の大脳皮質から調製した。要約すると、大脳皮質の小片を酵素（ＤＮアーゼＩ（Sigma）の後にトリプシン（Sigma））処理および機械的分離により断片化し、当該細胞を、60mmの培養皿(Iwaki)に５×１０6個の密度で播種した。前記細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むDulbecco’s 変法Eagle’s 培地(Nissui) 中で４８時間生育させ、次いで、グルコース(4.5mg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、インスリン(5μg/ml)、亜セレン酸ナトリウム(5μg/ml)、ウシ血清アルブミン(1mg/ml)および硫酸カナマイシン(100μg/ml)を含む、無血清Dulbecco’s 変法Eagle’s 培地(ＴＩＳ培地)に交換した。シトシンアラビノシド(Sigma)を２μＭ加え、グリア細胞の増殖を抑制した。ＤＮＡのトランスフェクションの２時間前に、培地を新鮮なＴＩＳ培地（シトシンアラビノシドは不含）と置換した。
【００７０】
実施例１
ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質の発現およびポリクローナル抗体の産生
ＶＺＶのＩＥタンパク質の一部を断片に分割し、ＧＳＴ融合タンパク質として合成した。前記ＧＳＴ融合タンパク質は、図１Ａに示すように、相互に重複して分子全体をカバーしている。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＩＥ６２融合タンパク質を発現する組換えプラスミドは、ＶＺＶ遺伝子のＩＥ６２遺伝子を増幅し、増幅ＤＮＡ断片をベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ファルマシア）に挿入することにより構築した。
【００７１】
１）ＲＮＡの単離および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)
全ＲＮＡを、ISOGEN(日本ジーン)を用いて培養細胞から抽出した。ＲＴ−ＰＣＲは、既報(Kawasaki, E. S., et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego,21−27（1991）)に従って行った。要約すると、全ＲＮＡ（１μｇ）を、２０μlの１×第一鎖緩衝液中でｃＤＮＡに逆転写した。前記緩衝液は、以下のものを含む：
プライマーとして、0.5μM オリゴ(dT)15 (5’-AAGCTTTTTTTTTTV-3’)（配列番号６）、200 unitsのSuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen)、400μM dNTPs、および10 unitsのＲＮアーゼ阻害剤(Invitrogen)。
逆転写反応の後、反応混合物を１．１ユニットのＲＮアーゼＨ(Invitrogen)で３７℃で２０分処理し、ｃＤＮＡ溶液としてＰＣＲに用いた。ＰＣＲは、1μlのｃＤＮＡ溶液、1.25 unitsのAmpliTaq Gold ＤＮＡ ポリメラーゼ(PerkinElmer Life Sciences)、1.5 mM MgCl2、200μM dNTPsおよび0.5μM プライマー対を含む50μlの1×ＰＣＲ緩衝液中で行った。ラットＢＤＮＦ遺伝子の４つのエキソン(エキソンI、エキソンII、エキソンIIIおよびエキソンIV)を区別するため、E-I(5’-ACTCAAAGGGAAACGTGTCTCT-3’)（配列番号７）、E-II(5’-CGGTGTAGGCTGGAATAGACT-3’)（配列番号８）、E-III(5’-CTCCGCCATGCAATTTCCACT-3’)（配列番号９）、E-IV(5’-GTGACAACAATGTGACTCCACT-3’)（配列番号１０）およびE-Vas(5’-GCCTTCATGCAACCGAAGTA-3’)（配列番号１１）を用いた。
【００７２】
内部標準として、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH) cDNA を、GAPDH センス(5’-TCCATGACAACTTTGGCATTGTGG-3’)（配列番号１２）およびアンチセンス(5’-GTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC-3’)（配列番号１３）プライマー対を用いて増幅した。ＢＤＮＦ ｃＤＮＡの増幅では、ＰＣＲ条件は、95℃で10分間前加熱した後、以下の通りであった:変性94℃、1分、アニーリング55℃、1分および伸長72℃、1.5分を32サイクル(エキソンI)、31サイクル(エキソンII)、26サイクル(エキソンIII)および29サイクル(エキソンIV)、ならびに最終伸長を72℃で10分。ＧＡＰＤＨの増幅は、前記と同じ条件下で31サイクル行った。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルでの電気泳動により分離し、臭化エチジウムで染色したＤＮＡのバンドの密度を、Bit-Map loader (ATTO) およびソフトウエア(NIH Image 1.52)を用いて分析した。
【００７３】
２）ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質の発現
構築した組換えプラスミドで大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体を培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して、３７℃で４時間または室温で一晩インキュベートすることにより融合タンパク質の発現を誘導した。誘導した融合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した（図１Ｂ）。誘導した融合タンパク質を、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア）を用いて、製造者の指示書およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定した分子量に基づいて精製した。組換えプラスミドの構築は、シークエンスにより確認した。ＩＥ６２融合タンパク質の抗原性は、イムノブロッティングで機能した。
【００７４】
３）ポリクローナル抗体の産生
常法にしたがって、融合タンパク質１〜５をウサギに免疫し、その抗血清をイムノブロッティングおよびＶＺＶ感染細胞に対する免疫蛍光抗体試験に使用した。
【００７５】
実施例２
ＩＥ６２に対するモノクローナル抗体の産生
ＩＥ６２に対するモノクローナル抗体は、ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質を用いて、本質的に既報（Okuno et al, Virology 129, 357-368 (1983)）に記載の方法に従って製造した。ハイブリドーマの培養上清をＧＳＴタンパク質に対するＥＬＩＳＡおよびＶＺＶ感染細胞に対する免疫蛍光抗体によりスクリーニングし、ＩＥ−６２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。
【００７６】
実施例３
免疫蛍光抗体（ＩＦＡ）アッセイ
ＶＺＶ感染細胞を−２０℃でアセトン固定し、ＢＤＮＦまたはＩＥ６２に対するモノクローナル抗体およびフルオレセイン結合抗マウスＩｇＧ血清をそれぞれ一次および二次抗体として用いて染色した。ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質に対するウサギ抗血清は、フルオレセイン結合抗ウサギＩｇＧ血清(Jackson)を二次抗体として用いて、ＶＺＶ感染細胞に対する免疫蛍光抗体により確認した。
【００７７】
実施例４
ウェスタンブロッティング
ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質またはＶＺＶ感染細胞の溶解液をＳＤＳゲルに負荷し、電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜（Millipore）に転写した。前記膜を、ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質に対するウサギ抗血清、ＩＥ６２モノクローナル抗体(1:10,000希釈、阪大微生物学病研究所製)またはヒトＢＤＮＦモノクローナル抗体(0.5μg/mlに希釈、R&Dシステムズ製)でプローブした。ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ血清またはヤギ抗マウスＩｇＧ血清とともにさらに１時間インキュベーションした後、免疫ブロットをＥＣＬ法(ナカライテスク)により展開した。
【００７８】
実施例５
ＩＥ６２モノクローナル抗体により認識されるＩＥ６２のエピトープの決定
ＩＥ６２モノクローナル抗体により認識されるＩＥ６２のエピトープは、合成ペプチドを用いたＩＥ６２のウェスタンブロットのブロッキングにより解析した。エピトープは、図１Ａに示す融合タンパク質ＣとＦの間の重複領域であり、ＩＥ６２の４１４−４４７位のアミノ酸に相当する領域であった。
前記領域を３つの区分に分け、下記アミノ酸配列からなるペプチド：
ペプチドI：PGYRSISGPDPRIRKT（配列番号：３）
ペプチドII：KRLAGEPGRQRQKSF（配列番号：４）
ペプチドIII：SLPRSRTPIIPPVSG（配列番号：５）
の３種を１８０μｇ用いて、ウェスタンブロットでＩＥ６２モノクローナル抗体とＩＥ６２との相互作用をブロッキングした。
【００７９】
実施例６
初代培養ニューロンに対するＢＤＮＦおよびＩＥ６２抗体の作用
Sprague‐Dawleyラット(生後０−１日)をケタミン(50 mg/kg,i.p.)で麻酔し、次いで、頸椎脱臼により犠牲にした。すべての取り組みは、用いる動物の数と動物の苦痛を最小限にするためになされた。実験手法は、大阪大学医学部の動物管理委員会規則、および実験動物の取り扱いに関するＮＩＨのガイドに合致するものであった。通常のミクロアイランド法 (Kimura et al., J Neurophysiol. May; 77(5). 2805-2815, 1997)により、孤立ニューロンを培養した。視覚皮質の一片を脳から取り出し、パパイン(20 U/ml)で酵素的に解離させ、磨きガラス製のピペットで粉砕した。アガロースシートに置いたコラーゲンドット上で前もって調製したミクログリア島上に、ニューロンを載せ、Ｂ２７(Gibco)を補足したニューロベーサルＡ培地(Gibco)を基本とする溶液中で生育した。このように同じ動物から培養したニューロンを２群に分け、ＢＤＮＦ(大腸菌で発現させた組換タンパク質：Sigma製、昆虫細胞で発現させた組換えタンパク質：R&Dシステムズ製)および実施例２で製造したＩＥ６２モノクローナル抗体を所定の濃度で培地に添加し、日齢が合致した娘培養物からデータを取得した。プレーティング後１０−１５日間記録を行った。
【００８０】
次に、脊髄後根ニューロンに対するＢＤＮＦおよびＩＥ６２抗体の作用ならびにＴｒｋ受容体チロシンキナーゼの阻害剤であるＫ２５２ａの作用を調べた。結果を図５Ａ−Ｄに示す。
【００８１】
実施例７
形態の解析
蛍光イメージを記録した後、ニューロンをビオチン結合抗マウスＩｇＧ１とともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＡＢＣキット(Vector Laboratories)を用いて、ＭＡＰ２を可視化した。倒立顕微鏡(TE300; Nikon)に設置したNeurolucida (MicroBrightField)を用いて、ニューロンの神経突起を描写した。神経突起の形態の定量的評価は、分析ソフトウエアNeuroexplore (MicroBrightField)を用いて行った。
【００８２】
実施例８
ＩＥ６２モノクローナル抗体によるＡｒｃ（Activity-regulated cytoskeleton-associated protein）およびＢＤＮＦの転写亢進
実施例６で用いたラット初代培養ニューロンから、全ＲＮＡを、ISOGEN(日本ジーン)を用いて抽出した。定量ＰＣＲは、下記のようにして行った。ラットＢＤＮＦ遺伝子のエキソンIII〜Ｖ（Imamura L. et al., J Pharmacol., Exp. Ther 316: 136-143, 2006）Ａｒｃ ｃＤＮＡ、およびβ−アクチンｃＤＮＡを、Ａｒｃセンス(5’-CGCTGGAAGAAGTCCATCAA-3’)（配列番号１４）、Ａｒｃアンチセンス(5’-GGGCTAACAGTGTAGTCGTA-3’)（配列番号１５）、β−アクチンセンス(5’-TTTGAGACCTTCAACACCCC-3’)（配列番号１６）、β−アクチンアンチセンス(5’-ACGATTTCCCTCTCAGCTGT-3’)（配列番号１７）プライマーを用いて、定量ＰＣＲ増幅を行った。
【００８３】
ＰＣＲの温度プロフィールは、95℃で10分間前変性した後、以下の通りであった:変性95℃、45秒、アニーリング55℃、45秒および伸長72℃、1分を45サイクル(エキソンI)、31サイクル(エキソンII)、26サイクル(エキソンIII)および29サイクル(エキソンIV)、ならびに最終伸長を72℃で10分。ＢＤＮＦ遺伝子のエキソンIII〜Ｖの増幅は、57℃のアニーリング温度を用いた。蛍光は、各72℃の伸長工程の最終段階で獲得した。各ｍＲＮＡの発現レベルは、β−アクチンｍＲＮＡのレベルを用いて標準化した。
【００８４】
結果
融合タンパク質
組換えプラスミドの構築は、シークエンスにより確認した。ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質１〜５の免疫原性は、ＶＺＶの抗血清を用いるウェスタンブロットにより確認した。当該抗血清は、ＩＦＡ試験によりＶＺＶ感染細胞の核染色が陽性であり、ウェスタンブロットでＩＥ６２タンパク質を検出した。次いで、ＩＥ６２−ＧＳＴ融合タンパク質を定量し、ＩＥ６２タンパク質としてさらなるキャラクタリゼーションに使用した。図１Ａは、ＩＥ６２全分子とそれらの産物を含むＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質１〜５とＡ〜Ｇの概略図を示す。
【００８５】
帯状疱疹回復期血清によるＩＥ６２とＢＤＮＦの認識
図１Ｃおよび１Ｄは、帯状疱疹患者由来血清の、ＢＤＮＦ、ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質２との反応のまとめ、ならびにウェスタンブロットの代表的パターンの一例を示す。帯状疱疹患者血清(No.23)は、ウェスタンブロットで、ＩＥ６２の断片２およびＦならびにＢＤＮＦを認識した。一方、患者血清(No.28)は、ＩＥ６２の断片２を認識したが、ＩＥ６２の断片ＦまたはＢＤＮＦを認識しなかった。６名の血清はＢＤＮＦと反応し、それらのうちの５つがＩＥ６２融合タンパク質を認識した。２名の血清は、ＩＥ６２を認識したが、ＢＤＮＦを認識しなかった。ＩＥ６２とＢＤＮＦの認識は、すべての患者において関連付けられなかったが、６名の患者由来の血清は、ＩＥ６２とＢＤＮＦへの抗体応答の関連を示した。
【００８６】
各モノクローナル抗体によるＢＤＮＦおよびＩＥ６２の交差認識
本発明者らは、ＩＥ６２−ＧＳＴ融合タンパク質に対するモノクローナル抗体を製造した。ＩＥ６２分子全体を網羅するＩＥ６２−ＧＳＴ融合タンパク質に対する当該モノクローナル抗体の反応性を図２Ａに示す。図２Ａに示すように、抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体および抗ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体は両方とも、ＶＺＶ ＩＥ６２の同じ領域を同様に認識した。図２Ｂは、抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体および抗ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体により染色されたＩＦＡパターンを示し、両抗体は感染細胞の核を主に染色した。抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体は、ウェスタンブロットおよびＩＦＡによりＩＥ６２タンパク質を認識することが確認された。
【００８７】
図２Ｃに示すように、ＢＤＮＦタンパク質は、抗ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体および抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体の両方でブロットされ、プローブされ、両抗体は同様にＢＤＮＦを認識した。ＢＤＮＦを抗ＩＥ６２モノクローナル抗体でプローブした場合、ＢＤＮＦの単量体よりは二量体と反応した。このことは、抗ＩＥ６２モノクローナル抗体はＢＤＮＦ二量体により形成された立体構造的なエピトープを認識することを示唆する。ＩＥ６２を認識する抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体は、抗ＩＥ６２モノクローナル抗体と同様に、ＢＤＮＦの単量体よりはむしろＢＤＮＦ二量体と反応した。ＶＺＶ ＩＥ６２とＢＤＮＦのこのような免疫学的交差反応性は、それぞれのモノクローナル抗体により確認された。
【００８８】
ＢＤＮＦとＩＥ６２との交差反応エピトープの同定
抗ＩＥ６２モノクローナル抗体は、ＧＳＴ融合タンパク質２に加え、さらに領域ＣおよびＦを認識した（図２Ａ）。領域ＣおよびＦの重複領域は、ＩＥ６２タンパク質のアミノ酸４１４−４４７位を示し、当該領域を含む３つの構成ペプチドを用いて、ウェスタンブロットで反応をブロッキングすることによりＶＺＶ ＩＥ６２のエピトープを決定した。４１４番目から４２９番目のアミノ酸を含有するペプチドは、抗ＶＺＶ ＩＥ６２抗体と抗ＢＤＮＦ抗体の両抗体の相互作用をブロックした。このことは、ＩＥ６２のアミノ酸４１４−４４７位のペプチドのエピトープは、抗ＶＺＶ ＩＥ６２抗体と抗ＢＤＮＦ抗体により認識されることを示す(図３)。しかしながら、このペプチドは、ウェスタンブロットでＢＤＮＦに対する抗ＩＥ６２および抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体の反応をブロックできなかった。したがって、両モノクローナル抗体のエピトープは、ＩＥ６２のアミノ酸４１４−４４７位の線状のエピトープである。いずれのモノクローナル抗体も、同じ条件下で二量体により形成される立体構造的エピトープをブロックしなかった。
【００８９】
以上の結果から、交差反応エピトープはＶＺＶ ＩＥ６２のアミノ酸４１４〜４２９位であることが示唆される。
【００９０】
本発明者らは、培養ニューロンを用いて、ＢＤＮＦの生物活性におけるＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体の作用を特徴付けた。ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体は、図４Ａに示すように、ＡｒｃとＢＤＮＦエキソン３−５の転写を有意に亢進した。さらに、ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体は、神経細胞体の面積、分岐点、ＢＤＮＦにより刺激される神経突起の長さを有意に増やした（図４Ｃ〜Ｅ）。したがって、ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体は、生物学的および生化学的マーカーの観点から、ＢＤＮＦの活性を中和せず、むしろ増大させた。２つの生物活性ＢＤＮＦは、二価のＢＤＮＦとしてＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体によって連結され、当該二価のＢＤＮＦは、２つの近接するＴｒｋＢ分子に結合して、一価のＢＤＮＦ−ＴｒｋＢ相互作用よりも強いシグナルを伝達し、その結果、ＡｒｃとＢＤＮＦの転写を亢進し、神経細胞の神経突起の進展を促進すると考えられる。あるいは、抗体のＢＤＮＦへの結合が、ＢＤＮＦの構造を安定化させ、レセプターであるＴｒｋＢへの結合を促進することが考えられる。
【００９１】
ＢＤＮＦによるＧＡＢＡ性ニューロンの形態学的発展の促進
ニューロンの発達阻害におけるＢＤＮＦの効果を評価するために、本発明者らは、抗ＧＡＤ６５抗体と反応することが確認されている皮質（ＧＡＢＡ性）ニューロンの形態を定量的に分析した。図４Ｂの(a)および(b)に示すように、ＶＺＶ ＩＥ６２モノクローナル抗体およびＢＤＮＦと共に培養した皮質ニューロンが別の対照ニューロンと比べてより大きな細胞体を有し、より多くの神経突起の枝分かれを有していることが明らかである。
【００９２】
この知見を定量するために、本発明者らは体細胞領域と、各ニューロンの神経突起の形態の３つのパラメータを計算した(図４Ｃ〜Ｅ)。ＢＤＮＦと共に培養したニューロン１０個の体細胞の平均領域は、１１個の対照ニューロンの平均よりも有意に大きかった(P＜0.01, ANOVA)(図４Ｃ)。ＢＤＮＦ処理ニューロンの初代神経突起の平均数は、対照ニューロンの数よりも有意に大きかった(P＜0.01, ANOVA)。また、処理ニューロンの神経突起の全長の平均値は、対照ニューロンと比べて、有意に大きかった(P＜0.05, ANOVA)(図４Ｅ)。最後に、ＢＤＮＦ処理ニューロンの神経突起の分岐点の平均数は、対照ニューロンの数と比べて有意に大きかった(P＜0.01, ANOVA)(図４Ｄ)。これらの結果より、ＢＤＮＦは皮質ニューロンの体細胞ニューロンおよび神経突起の発達を促進させることが示唆される。
【００９３】
ＢＤＮＦによる脊髄後根ニューロンの形態学的発展の促進
ＢＤＮＦのこのような作用がＴｒｋＢ受容体の活性化を通じて引き出されることを確認するために、Ｔｒｋ受容体チロシンキナーゼの阻害剤であるＫ２５２ａを、ＢＤＮＦで処理した１つの脊髄後根ニューロンに適用した。前記阻害剤で処理すると、脊髄後根ニューロンに対するＢＤＮＦの増殖作用を阻止することがわかった。このことは、神経突起の体細胞領域と３つのパラメータの定量解析において示された(図５Ａ〜Ｄ、各パネルの右から３つ目のカラム)。Ｋ２５２ａで処理した１０個のニューロンの体細胞の平均領域は、対照ニューロンの値と有意差はなかった。また、Ｋ２５２ａ処理ニューロンの一次神経突起の数は、対照ニューロンの値と有意差はなかった。Ｋ２５２ａ処理ニューロンの神経突起の全長は、対照ニューロンの値と有意差はなかった。Ｋ２５２ａ処理ニューロンの神経突起の分岐点の平均数は、対照ニューロンの値と有意差はなかった。Ｋ２５２ａはＢＤＮＦの作用とともにＩＥ６２抗体（ＩＥ１０）の増強作用も抑制していることがわかる(図５Ａ〜Ｄ、各パネルの右３つのカラム)。脊髄後根ニューロンは興奮性ニューロンであり、このニューロンが痛みを直接伝えることから、本発明の抗体はＢＤＮＦの活性化を通じて脊髄後角の興奮性ニューロンの神経突起の伸長を促進することが明らかになった。
【００９４】
実施例９
ＢＤＮＦ活性の阻害抗体の作製
１）ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質の発現
ＩＥ６２タンパク質として、ＶＺＶの岡株の代わりにＶＺＶの野生株（河口株）を用いて、配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅してＧＳＴをコードするＤＮＡと連結させること以外は実施例１に記載の方法と同様にして、ＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質を作製した。
【００９５】
２）モノクローナル抗体の作製およびスクリーニング
前記１）で得られたＧＳＴ−ＩＥ６２融合タンパク質を用いて、本質的に既報（Okuno et al, Virology 129, 357-368 (1983)）に記載の方法に従って製造した。ハイブリドーマの培養上清をＧＳＴタンパク質に対するＥＬＩＳＡおよびＶＺＶ感染細胞に対する免疫蛍光抗体によりスクリーニングし、ＩＥ−６２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。得られたモノクローナル抗体（ＫＳＧ１〜１３）のＢＤＮＦ作用の阻害を指標とするスクリーニングは、実施例６に記載の方法に準じてニューロンの神経突起の伸長を記録することにより行い、本発明の阻害抗体を得た。
【００９６】
３）モノクローナル抗体とＩＥ６２ペプチドとの反応性
得られたモノクローナル抗体（ＫＳＧ１〜６、８、１２および１３）とＩＥ６２ペプチド（図１Ａの断片Ａもしくは断片Ｅ）またはＧＳＴタンパク質との反応性をウエスタンブロットで確認した。得られたすべてのモノクローナル抗体は、ＧＳＴタンパク質とは反応しなかった。ＫＳＧ１、２および６は断片Ａと反応し、それ以外のモノクローナル抗体は断片Ａおよび断片Ｅに反応した。
次に、モノクローナル抗体（ＫＳＧ１〜８、１０、１２および１３）のＩＥ６２ペプチドとの反応性をドットブロットで確認した。すなわち、ＩＥ６２ペプチド断片Ａまたは断片ＥのＧＳＴ融合タンパク質を、それぞれトリプシン、プロテイナーゼＫ、トロンビンまたはＶ８プロテアーゼで切断した切断物と、前記モノクローナル抗体との反応性をドットブロットで確認した。その結果、ＫＳＧ1、２および６のエピトープは、ＩＥ６２ペプチド断片ＡのＮ末端側に存在し、ＫＳＧ３、４、５、１２および１３のエピトープは、ＩＥ６２ペプチド断片Ａの中央部かつ断片ＥのＮ末端側に存在し、ＫＳＧ８のエピトープは、ＩＥ６２ペプチド断片Ａの中央部かつ断片ＥのＮ末端側と、それよりＣ末端側の２箇所に存在することが推定された。
次に、配列番号１８（GPVEQLYHVLSDSVPAKGAKADLPFETDDTRPRKHDARGITPRVPGRSSGGKPRAFLALPGRSHAPDPIEDDSP）から選択した２種のペプチド
ペプチド１：GRSSGGKPRAFLALP（配列番号１９）および
ペプチド２：DTRPRKHDARGITPR（配列番号２０）を合成して、前記モノクローナル抗体をこれらペプチドで吸収してウエスタンブロットを行ったところ、ＫＳＧ８はペプチド２で吸収されたが、ＫＳＧ３、４、５、１２および１３はペプチド１および２では吸収できなかった。
４）ＢＤＮＦ活性の阻害抗体を用いた神経の染色
ラット胎児脳から大脳皮質および中脳を取り出して初代培養を行い、モノクローナル抗体ＫＳＧ１および４を用いて免疫染色を行った。結果を図６Ａ〜６Ｄに示す。ＢＤＮＦ活性の阻害抗体は、神経細胞を染色することがわかった。
【００９７】
実施例１０
ラット胎児初代培養大脳皮質にＰＨＮ患者血清で処理したＢＤＮＦを添加した時のＢＤＮＦ ｍＲＮＡの発現量の変動
ラット胎児の大脳皮質の初代培養を行い、ＰＨＮ患者血清で処理したＢＤＮＦ蛋白質の添加によるＢＤＮＦ ｍＲＮＡの発現量の変動を調べた。妊娠１７日目のラットの胎児１０匹から大脳皮質を取り出し、トリプシンとＤＮａｓｅで処理し、ポリ−Ｌ−リジンでコートした６穴プレート中で、１０％ＦＣＳを含むダルベッコＭＥＭ存在下で培養した。３日間培養後、血清を含まないダルベッコＭＥＭに培地交換し、さらに３日間培養した。ＰＨＮ患者血清（１０倍希釈したものを２０μl）とＢＤＮＦ蛋白質１０ｎｇ(1０ｎｇ／μｌを１μｌ)を氷中で４時間反応後、ラット胎児大脳皮質初代培養細胞に添加し、さらに３時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで２度洗浄後、ＲＮＡ抽出を行った。得られたＲＮＡに、ｐｏｌｙｄＴ(１５)と逆転写酵素を加えｃＤＮＡ合成を行った。得られたｃＤＮＡを、ＢＤＮＦのエクソン３とエクソン５の配列から設定したプライマーと、内部標準としてβ-アクチンのプライマーでそれぞれreal time ＰＣＲを行い、ＢＤＮＦのｍＲＮＡの定量を行った。
【００９８】
結果を図７に示す。図７より、ＰＨＮ患者の血清で処理したＢＤＮＦ蛋白質をラット胎児大脳皮質に添加した場合は、ＢＤＮＦ蛋白質単独の時と比較してＢＤＮＦ ｍＲＮＡの発現量がより増大した。
【００９９】
実施例１１
ヒト型抗体の産生
ＢＤＮＦと免疫交差するＩＥ６２の部位が同定されているので、その部位を発現するＩＥ６２−ＧＳＴ融合蛋白を用いて、ヒト抗体ライブラリー（ＡＩＭＳ４）を用いて、そのエピトープに対するヒト型抗体をスクリーニングする。
ＩＥ６２−ＧＳＴ融合蛋白を試験管にコートして、ＡＩＭＳ４ファージライブラリーと反応させ、反応しなかったファージを洗浄して、反応したファージに大腸菌を加えてそのファージを増殖させる。次に、増殖したファージをさらにＩＥ６２−ＧＳＴ融合蛋白をコートした試験管でパニング法で選択することを繰り返す。その増殖したファージを、ＢＤＮＦでコートした試験管で選択し増殖させる。選択されたファージの産生したＣＰ３−Ｆａｂの反応性を、ＩＥ６２−ＧＳＴ融合蛋白とＢＤＮＦに対する反応性をウエスタンブロットで確認する。これまでにＢＤＮＦと交差する抗ＩＥ６２抗体と同様な反応性を示す抗体クローンを選択する。Ｆａｂ抗体のＢＤＮＦ活性調節作用を神経培養細胞で検討し活性を有するクローンのＩｇＧ抗体化を図る。Ｆａｂ抗体とＩｇＧ抗体の調節作用を比較して、適切な方を臨床応用のために実験に使用する。
【０１００】
実施例１２
小脳のプルキンエ細胞の神経突起の成長および発達に対する影響
生後１日のマウスまたはラットに本発明の抗体を接種し、３週後に小脳のプルキンエ細胞の神経突起を染色し、神経突起の成長および発達に対する影響を検討する。プルキンエ細胞は、小脳で均一な細胞なので、神経突起の伸びを定量化することができ、神経細胞への影響を評価する系として好適である。
実施例２で得られた抗体を接種後の神経突起の平均の長さ、分岐点を調べた脳の病理データの評価から、実施例２の抗体は神経突起の成長を促進すると評価される。したがって、ＢＤＮＦを介する神経細胞の活性化、神経連絡の促進、再生など、神経疾患の治療につながる。
実施例９で得られた阻害抗体を接種後の神経突起の平均の長さ、分岐点を調べた脳の病理データの評価から、実施例９の抗体は神経突起の成長を阻害すると評価される。したがって、１）ＢＤＮＦを介する神経突起の成長が阻害されるので、帯状疱疹後神経痛の際に形成されると考えられる過剰な神経連絡が制限され、そのため、痛覚過敏の発症を抑制できる。２）慢性疼痛の際には、同様にＢＤＮＦの作用による神経連絡の形成を阻害することによって慢性疼痛の形成阻止が可能と評価する。
【０１０１】
実施例１３
ＩＥ６２モノクローナル抗体のアルツハイマーモデルマウスにおける記憶障害、軸索の萎縮、シナプス減少の回復
痴呆における神経回路網の破綻を機能的に修復する目的で、神経突起伸長促進作用を指標に好適なＩＥ６２モノクローナル抗体のスクリーニングを行う。いくつかのＩＥ６２モノクローナル抗体（例：ＩＥ６２Ｂ）は神経突起伸長活性を有しており、神経突起伸長活性を示したモノクローナル抗体が、痴呆における記憶障害に対する作用を有するかどうかを検討する目的で、アルツハイマー病の原因物質であるamyloid b (Ab)の活性部分配列25-35ペプチドを単回脳室内投与して作製するアルツハイマー病のモデルマウスの1つを使用する。
Ab(25-35)投与したマウスでは、空間記憶の獲得と保持が対照群と比較すると有意に減弱する。さらに脳切片を免疫染色したところ、大脳皮質および海馬において、軸索とシナプスの有意な減少が観察される。
Ab(25-35)投与７日後からＩＥ６２モノクローナル抗体（例：ＩＥ６２Ｂ）を投与した群では、記憶獲得・保持能力ともに対照群のレベルに維持されており、軸索とシナプスが正常レベルに保たれていること、樹状突起の再形成を確認する。
【０１０２】
次に、初代培養したラット大脳皮質神経細胞におけるＩＥ６２モノクローナル抗体（例：ＩＥ６２Ｂ）の作用を検討する。ＩＥ６２モノクローナル抗体は大脳皮質神経細胞の軸索を特異的に伸長させる。Ab(25-35)を処置することで軸索および樹状突起の萎縮を誘発した状態にＩＥ６２モノクローナル抗体を作用させた場合においても、ＩＥ６２モノクローナル抗体は軸索特異的な伸長を促進する。以上の結果より、ＩＥ６２モノクローナル抗体（例：ＩＥ６２Ｂ）がAb（25-35）に誘発される軸索の萎縮、シナプス減少を抑制し、おそらくそのことによって記憶障害を回復させ、神経回路網の再構築に有効であることが示唆される。
【０１０３】
実施例１４
脳卒中易発性高血圧ラット（ＳＨＲＳＰ）における脳卒中予防効果の検討
脳卒中易発性高血圧ラット（Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rat, ＳＨＲＳＰ）を用いて、脳卒中予防効果を検討する。ＳＨＲＳＰの脳卒中発作時の主な症状として、一方の前肢の持ち上げ運動、歩行異常、過敏、自発運動量の減少、立毛、体重減少、摂餌量減少などが見られる。特徴的な組織変化として脳軟化、脳出血、血管壊死、心肥大、腎硬化症、腸管膜動脈の結節性多発性血管炎、精巣萎縮などが確認されている。
（方法）
ＳＨＲＳＰ（10週令）の雄性に１％食塩水または水道水を与え、ＩＥ６２モノクローナル抗体（ＩＥ６２Ｂ）を所定の用量で静脈内投与し、観察する。実験期間中、摂餌量、飲水量、体重を週１回測定するとともに、脳卒中発症日および死亡日を記録する。血圧は、小動物自動血圧測定装置（ウエダ製作所、UR-5000）を用いてtail cuff法により測定する。
（結果）
1．食塩負荷の影響：
１％食塩負荷により、体重にほとんど影響せずに血圧上昇が促進するとともに水道水飼育に比較して生存期間が１／２以下に短縮されることが明らかとなる。
2．脳卒中予防効果：
ＩＥ６２モノクローナル抗体（ＩＥ６２Ｂ）は極めて顕著に生存期間を延長し、食塩負荷群の約３．５倍、水道水飼育群よりさらに１００日も長期に生存し著効を示すことが明らかとなる。
【０１０４】
実施例１５
Ｇｅｒｂｉｌラット脳血管障害モデルに対するＩＥ６２抗体の神経細胞死抑制作用、再生促進作用
Ｇｅｒｂｉｌラットは椎骨動脈の影響を受けないラットなので、ＩＥ６２抗体を前投与しておき、内頚動脈を５分間結紮し、血管障害（血液脳関門の破壊により抗体が脳内へ浸透）を起こし、再開通させる。１週間後に、ニッスル染色により、神経細胞死を検討する。虚血に感受性が高く、ＢＤＮＦの発現の強い海馬ＣＡ1領域の神経細胞の脱落を指標として、この抗体の影響を検討する。
(結果)
ＩＥ６２抗体によるＣＡ1領域の細胞死を改善することを確認する。
【０１０５】
実施例１６
ラット大脳皮質神経細胞におけるＢＤＮＦおよびＡｒｃ遺伝子の持続的発現の検討
（目的）
脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)は、神経細胞の生存、可塑性の維持に重要であり、Ａｒｃ（Activity-regulated cytoskeleton-associated protein）は、シナプス可塑性との関連が報告されている。ラットにＩＥ６２モノクローナル抗体（ＩＥ６２Ｂ）を投与後のＢＤＮＦおよびＡｒｃ遺伝子の持続的発現制御系について検討する。
（方法）
Ｅ１７ラット大脳皮質初代培養神経細胞は、2.5×106細胞／35mm dishで培養する。培養6日目にＢＤＮＦを添加し、３時間後に培地交換した(BDNF washout)。定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＢＤＮＦおよびＡｒｃ ｍＲＮＡ発現量を測定する。
（結果・考察）
初代培養神経細胞において、ＢＤＮＦおよびＡｒｃ ｍＲＮＡ発現量は、ＢＤＮＦ washoutから４８時間後において有意に増加する。詳細を検討した結果、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現の持続性は、主に神経活動に依存することが明らかとなる。
一方、Ａｒｃ ｍＲＮＡ発現の持続性は、ＢＤＮＦシグナルに依存することが示唆される。さらに、ＢＤＮＦは、シナプス密度と相関のある、細胞内カルシウム振動の頻度を増加させる。以上の結果から、ＢＤＮＦ遺伝子の神経活動依存的かつ持続的な発現制御機構は、Ａｒｃ遺伝子発現にも持続性を付加することで、シナプス機能を維持する上で、基本的な役割を担うものと考えられる。
【０１０６】
実施例１７
ラット大脳皮質神経細胞におけるＢＤＮＦの自立的、持続的発現制御系の検討
（目的）
ＩＥ６２モノクローナル抗体を投与後のＢＤＮＦのｍＲＮＡ発現量を持続的に増加させることを明らかにし、さらに、シナプス可塑性との関連が報告されているＡｒｃのｍＲＮＡ発現量について解析し、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現の場合と比較する。
（方法）
Ｅ１７ラット大脳皮質初代培養神経細胞は、ポリエチレンイミンコートした35mmdishに、2.5×106細胞/2mLで培養する。培養6日目にＢＤＮＦ(100ng/mL)を添加し、3時間後に3回培地交換する(ＢＤＮＦ washout)。 定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によりＢＤＮＦ ｍＲＮＡ及びＡｒｃ ｍＲＮＡ発現量を測定する。
（結果・考察）
初代培養神経細胞において、ＢＤＮＦ添加群、ＢＤＮＦ washout群ともＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現量は２４から７２時間までコントロール群と比較して約２倍と持続的に増加した。このときＡｒｃ ｍＲＮＡ発現量はコントロール群と比較して２４時間で約２０倍に増加し、４８、７２時間で約２倍の発現量を維持している。これらのｍＲＮＡ増加は、ＴｒｋＢ阻害剤Ｋ２５２ａの存在下で抑制される。また、ＢＤＮＦ中和抗体を用いるとＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現量は変化しないが、Ａｒｃ ｍＲＮＡ発現量は有意に減少する。
さらに、各種阻害剤を用いた結果、ＢＤＮＦ ｍＲＮＡ及びＡｒｃ ｍＲＮＡの持続的発現に至るシグナル伝達が異なることを示す結果を得る。
以上の結果より、ＢＤＮＦによる自律的な遺伝子発現によって合成・分泌されたＢＤＮＦが、ＴｒｋＢを介した複数のシグナル伝達経路を活性化することで、ＢＤＮＦおよびＡｒｃ遺伝子発現を持続的に活性化することが示唆される。
神経細胞に備わるＢＤＮＦを中心とした自律的・持続的発現制御機構は、神経可塑性を維持するための基本的役割を担う。
【０１０７】
実施例１８
ヒトのＡＰＰ遺伝子を導入したトランスジェニックマウスにおける本発明の抗体の作用
ヒト型ＡＰＰ遺伝子を強発現し、加齢とともに脳の老人斑を生じるＰＤ−ＡＰＰマウス（Ｔｇ２５７６マウス）にＩＥ６２モノクローナル抗体を投与すると、老人斑の形成を予防する。
ＩＥ６２モノクローナル抗体（ＩＥ６２Ｂ、ＫＳＧ１〜１３）の投与を受けたマウスは、学習機能が回復する。
ＩＥ６２モノクローナル抗体（ＩＥ６２Ｂ、ＫＳＧ１〜１３）をＴｇ２５７６マウスに１回投与する。接種マウスでは老人斑アミロイドの沈着が有意に減少し、脳炎などの副作用はみられない。この方法はアルツハイマー病の予防・治療法としてヒトに応用できると期待される。
上記Ｔｇ２５７６マウスに、本発明の抗体（ＢＤＮＦと交差するＩＥ６２抗体）を注射し、１ヶ月後の記憶力をプールの浅い場所を覚えさせる「水迷路」の実験で検討する。
本発明の抗体を投与したマウスは、投与前には浅瀬の場所を覚えられなかった記憶力が野生型のマウス並みに回復する。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明の神経突起の伸長促進剤、神経性疾患の予防または治療剤によると、これまで有効な手段のなかった神経損傷後の神経の再生が可能となる。また、本発明の神経突起の伸長阻害剤によると、これまで有効な手段のなかった帯状疱疹後の神経痛や慢性疼痛等に効果を奏することが期待される。さらに、本発明の予防または治療剤によると、経験依存性社会嫌悪やストレスなどの神経の過敏を伴う疾患に対しても改善が期待される。
本出願は、日本で出願された特願２００６−３１２２３６（出願日：２００６年１１月１７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質ＩＥ６２を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する脳由来神経栄養因子の阻害抗体を有効成分として含有する、神経突起の伸長阻害剤であって、前記抗体が配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものである、阻害剤。
【請求項２】
水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質ＩＥ６２を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する脳由来神経栄養因子の阻害抗体を有効成分として含有する、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患の予防または治療剤であって、前記抗体が配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものである、予防または治療剤。
【請求項３】
請求項１に記載の神経突起の伸長阻害剤、および当該阻害剤を神経突起の伸長阻害のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該阻害剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
【請求項４】
請求項２に記載の予防または治療剤、および当該予防または治療剤を帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該予防または治療剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
【請求項５】
請求項１または２に記載の抗体を製造する方法であって、配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングする工程を含む製造方法。
【請求項６】
前記抗体ライブラリーがヒト抗体ライブラリーである請求項５に記載の製造方法。
【請求項１】
水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質ＩＥ６２を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する脳由来神経栄養因子の阻害抗体を有効成分として含有する、神経突起の伸長阻害剤であって、前記抗体が配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものである、阻害剤。
【請求項２】
水痘帯状疱疹ウイルス前初期タンパク質ＩＥ６２を認識し、かつ、脳由来神経栄養因子と交差反応する脳由来神経栄養因子の阻害抗体を有効成分として含有する、帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患の予防または治療剤であって、前記抗体が配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを認識するものである、予防または治療剤。
【請求項３】
請求項１に記載の神経突起の伸長阻害剤、および当該阻害剤を神経突起の伸長阻害のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該阻害剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
【請求項４】
請求項２に記載の予防または治療剤、および当該予防または治療剤を帯状疱疹後神経痛、慢性疼痛、経験依存性社会嫌悪およびストレスからなる群より選ばれる状態により引き起こされる神経の過敏を伴う疾患のために使用することができること、または使用すべきであることを記載した当該予防または治療剤に関する記載物を含有してなる商業パッケージ。
【請求項５】
請求項１または２に記載の抗体を製造する方法であって、配列番号２の２６８−３４１位のアミノ酸配列から選ばれる連続する少なくとも７アミノ酸を有するペプチドを抗原として用いて、抗体ライブラリーをスクリーニングする工程を含む製造方法。
【請求項６】
前記抗体ライブラリーがヒト抗体ライブラリーである請求項５に記載の製造方法。
【図１Ａ】
【図１Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【図１Ｃ】
【図１Ｂ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７】
【公開番号】特開２０１３−１００３４８（Ｐ２０１３−１００３４８Ａ）
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１３−２２９２８（Ｐ２０１３−２２９２８）
【出願日】平成２５年２月８日（２０１３．２．８）
【分割の表示】特願２００８−５４４２０７（Ｐ２００８−５４４２０７）の分割
【原出願日】平成１９年１１月１６日（２００７．１１．１６）
【出願人】（０００１７３６９２）一般財団法人阪大微生物病研究会 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２３日（２０１３．５．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２５年２月８日（２０１３．２．８）
【分割の表示】特願２００８−５４４２０７（Ｐ２００８−５４４２０７）の分割
【原出願日】平成１９年１１月１６日（２００７．１１．１６）
【出願人】（０００１７３６９２）一般財団法人阪大微生物病研究会 (23)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]