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神経再生薬
説明

神経再生薬

本発明の課題は、神経再生薬、神経幹細胞のニューロン新生促進剤、該ニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養して得られるニューロンおよび該ニューロンの製造方法を提供することにある。該課題を解決するために、本発明は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−3の活性を阻害する物質を有効成分として含有する神経再生薬、該物質を有効成分として含有する神経幹細胞のニューロン新生促進剤、該ニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養して得られるニューロンおよび該ニューロンの製造方法を提供する。本発明の医薬は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ダウン症、脳血管障害、脳卒中、脊髄損傷、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、不安障害、統合失調症、うつ病、躁鬱病などの神経疾患治療薬として有用である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明はグリコーゲンシンターゼキナーゼ−3(以下、GSK−3と略す)の活性を阻害する物質を有効成分として含有してなる神経再生薬、GSK−3の活性を阻害する物質を有効成分として含有してなるニューロン新生促進剤、該ニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養して得られるニューロン、および該ニューロンの製造方法に関する。
【背景技術】
神経疾患とは、脳や末梢のニューロンが遺伝的要因、環境要因、加齢要因などにより傷害を受ける疾患である神経変性疾患と、神経の変性を伴わないうつ病および躁鬱病等とを総称する。神経変性疾患として、具体的には、パーキンソン病、アルツハイマー病、ポリグルタミン酸病、筋萎縮性側索硬化症、多発ニューロパチー、脊髄損傷、脳血管障害などがあげられる。これら神経変性疾患の一般的治療法は、ニューロンの傷害により失われた神経伝達物質を補充する療法であるが、該療法で症状が改善するのはパーキンソン病、アルツハイマー病などに限定される。また神経伝達物質補充療法では神経細胞死の進行を止めることはできない。
中枢神経系を再生する再生医療は、パーキンソン病で失われたドーパミン作動性ニューロンの機能を積極的に回復させる治療法として検討が進められてきたが、中絶胎児脳を用いる方法であることから様々な問題があり一般的な利用としては応用されていない。
また、胎児脳から取得した神経幹細胞やヒト受精卵から取得したES細胞を生体外で大量培養した後、目的のニューロンへ変換して移植に用いるという治療法も検討されているが、目的とするニューロンへ正確に分化させる技術は確立されておらず、また胎児由来の神経幹細胞やヒトES細胞を用いる方法であることに起因する問題もあり、臨床応用は進んでいない。
一方、成体脳から神経幹細胞が分離され、ヒト成体脳でも生涯にわたりニューロンの新生が起こることが報告されたことから、患者の脳内に内在する神経幹細胞を薬剤などで刺激して再生を誘導して神経変性疾患を治療する方法が検討されている。
インスリン様増殖因子−1[J.Neuroscience,20,2896−2903(2000)]、線維芽細胞増殖因子−2[Pro.Nat.Acad.Sci.USA,98,5874−5879(2001)]、ステムセルファクター[J.Clin.Invest.,110,311−319(2002)]、エリスロポエチン[J.Neuroscience,21,9733−9743(2001)]、全脳虚血[J.Neuroscience,18,7768−7778(1998)]、てんかん刺激[J.Neuroscience,22,3174−3188(2002)]などサイトカインの脳内投与や疾患モデルにより海馬や嗅球でのニューロン新生が促進されることが報告されている。また、腫瘍増殖因子−αの脳内投与により線条体でドーパミン作動性ニューロンが新生し、パーキンソン病の症状が改善することも報告されている[Pro.Nat.Acad.Sci.USA,97,14686−14691(2000)]。さらに、海馬への虚血傷害により失われたCA1錘体細胞が虚血後2日目から5日目にかけて脳内に線維芽細胞増殖因子−2と上皮細胞増殖因子を投与することにより、その40%が完全に回復することも報告されている[Cell,110,429−441(2002)]。
しかし、上記の方法は、いずれも蛋白性の因子を脳内に投与することが必要であり、一般的な医療へと応用することは困難である。
末梢投与可能な低分子化合物によりニューロン新生を惹起できるものとしては、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、セロトニン特異的なトランスポーター阻害剤、フォスフォジエステラーゼIV阻害剤などの抗鬱薬が報告されている[Neuropsychopharmacology,25,836−844(2001)]。これらの薬剤が脳内で神経再生を誘導するメカニズムとしては、セロトニン作動性ニューロンのセロトニン受容体シグナルに直接的または間接的に作用して、神経栄養因子を生産し、セロトニン作動性ニューロン周囲のニューロン新生を促進していることが考えられている。したがって、これらの薬剤はセロトニン作動性ニューロンの変性とは関係しない大部分の神経疾患においては、神経再生薬として利用することはできないと考えられる。
また、気分安定化薬のリチウムが細胞死抑制遺伝子bcl−2の発現を誘導することにより海馬で恒常的に新生している新生ニューロンをニューロン死から保護し、海馬でのニューロン新生を見かけ上増加させることが報告されてい[J.Neurochemistry,75,1729−1734(2000)]。またリチウムは神経栄養因子BDNFの発現を誘導することも報告されている[Neuropharmacology,43,1173−1179(2002)]。しかしながら、リチウムが直接、神経幹細胞に働きかけ、ニューロン分化を促進することによりニューロン新生を促進させることについては報告されておらず、またリチウムの海馬以外でのニューロン新生促進活性についても報告されていない。また、リチウムが何故、神経変性を伴わないうつ病および躁鬱病に対し治療効果があるのかについても知られていない。
アルツハイマー病では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−3(以下、GSK−3と略す)が、微小管関連蛋白質であるタウ蛋白質を過剰にリン酸化することで神経原繊維変化を形成し、神経細胞死を誘導するという仮説が提唱されている[Trends in Molecular Medicine,,126−132(2002)]。またGSK−3の活性を阻害する物質は、in vitroにおいて成熟した神経細胞を保護する活性があると報告されている[J.Neurochemistry,77,94−102(2001)]。該報告に基づき、GSK−3の活性を阻害する物質は、アルツハイマー病をはじめ様々な神経変性疾患の治療薬として用いることができると考えられている(国際公開第00/38675号パンフレット)が、成熟したニューロンを保護することで実際に神経変性疾患を治療することができるか否か、およびGSK−3の活性を阻害する物質にニューロン新生促進作用があることは知られていない。
【発明の開示】
本発明の目的は、GSK−3の活性を阻害する物質を有効成分として含有してなる神経再生薬、該物質を有効成分として含有してなる神経幹細胞のニューロン新生促進剤、該ニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養して得られるニューロンおよび該ニューロンの製造方法を提供することにある。
本発明は以下の(1)〜(41)に関する。
(1) グリコーゲンシンターゼキナーゼー3(以下、GSK−3と略す)の活性を阻害する物質を有効成分として含有してなる神経再生薬。
(2) 神経再生薬が、神経疾患の治療薬である上記(1)の医薬。
(3) 神経疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ダウン症、脳血管障害、脳卒中、脊髄損傷、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、不安障害、統合失調症、うつ病および躁鬱病からなる群より選ばれる神経疾患である上記(2)の医薬。
(4) GSK−3の活性を阻害する物質が、リチウムまたはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(5) GSK−3の活性を阻害する物質が、ビスインドリルマレイミド誘導体、3−アリール−4−インドリルマレイミド誘導体、インドロカルバゾール誘導体、インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン誘導体もしくはインジルビン誘導体またはそれらの薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(6) GSK−3の活性を阻害する物質が、式(I)

[式中、nおよびmは同一または異なって、1〜3の整数を表し、R、RおよびRは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、−COR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)、−COOR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)または−OR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)を表し、RおよびRは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール、カルボキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アミノまたはモノもしくはジ低級アルキルアミノを表し、nおよびmがそれぞれ2または3であるとき、それぞれのRおよびRは同一でも異なっていてもよい]で表される化合物、式(II)

(式中、na、ma、R1A、R2A、R3AおよびR5Aは、それぞれ前記n、m、R、R、RおよびRと同義である)で表される化合物もしくは式(III)

[式中、nb、mb、R1B、R2BおよびR5Bは、それぞれ前記n、m、R、RおよびRと同義であり、R3BおよびR4Bは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、−COR(式中、Rは前記と同義である)、−COOR(式中、Rは前記と同義である)または−OR(式中、Rは前記と同義である)を表すか、またはR3BとR4Bが一緒になって、

(式中、kは1または2を表し、XはCH、NH、酸素原子または硫黄原子を表し、Rはヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイルまたは低級アルコキシカルボニルを表す)を形成する]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(7) GSK−3の活性を阻害する物質が、式(Ia)

(式中、R2aは水素原子、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、アリールまたはニトロを表し、R3aおよびR4aは同一または異なって、置換もしくは非置換の低級アルキルを表す)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(8) GSK−3の活性を阻害する物質が、式(IIa)

(式中、maは前記と同義であり、R3Aaは置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、R5Aaはハロゲンを表す)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(9) GSK−3の活性を阻害する物質が、式(IIIa)

(式中、Rは前記と同義である)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(10) GSK−3の活性を阻害する物質が、3,4−ビス(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(1−メチルインドール−3−イル)−4−(1−プロピルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−シアノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−カルボキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−カルバモイルプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−プロピルオキシインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−フェニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−フェニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−メトキシカルボニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−ニトロインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(1−メチルインドール−3−イル)−4−[1−(3−ヒドロキシプロピル)−5−ニトロインドール−3−イル]−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2−クロロフェニル)−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2,4−ジクロロフェニル)−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2−クロロフェニル)−4−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−1H−ピロール−2,5−ジオン、4−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−3−(2−クロロフェニル)−1H−ピロール−2,5−ジオンおよび

からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(11) GSK−3を阻害する物質が、式(IV)

[式中、Aは単結合または二重結合によって右に結合されている酸素または硫黄であり、R10は水素原子、アリール、低級脂肪族置換基、特にアルキルおよび低級アルキルエステルからなる群より選択され、R11〜R14はアルコキシ、アミノ、アシル、脂肪族置換基、特にアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、脂肪族ニトリル、特にアルキルニトリル、シアノ、ニトロ、カルボキシル、ハロゲン、水素原子、ヒドロキシル、イミノならびにα、β不飽和ケトンからなる群より個別に選択され、R15〜R18は脂肪族置換基、特にアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基、特に低級脂肪族置換基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、アルコキシ、アシル、シアノ、ニトロ、エポキシ、ハロアルキル基、ハロゲン、水素原子ならびにヒドロキシルからなる群より個別に選択され、R19は脂肪族の基、特に低級アルキル基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、カルボン酸、および水素からなる群より選択される]で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(12) GSK−3を阻害する物質が、7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、10−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−4−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−4−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−チオン、9−ブロモ−5,12−ビス−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−12−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−5,7−ビス−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−5,7,12−トリ−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−ヒドロキシエチル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8,10−ジクロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、5−ベンジル−9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−12−エチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−プロペニル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−フルオロ−7,12−ジヒドロ−12−(2−プロペニル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2−(メチルイミノアミン)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2−(カルボン酸)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−10−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−11−ヒドロキシメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,3−ジメトキシ−9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,3−ジメトキシ−9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)プロピオニトリル、2−ブロモ−9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)アクリロニトリル、2−(3−ヒドロキシ−1−プロピニル)−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ヨード−9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−(3−オキソ−1−ブテニル)−9−トリフルオロメチル−7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−クロロ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、2−ヨード−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−メチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−[2−(1−ヒドロキシシクロヘキシル)エチニル]−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ヨード−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−エチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−メチル−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オンおよび3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)アクリル酸メチルエステルからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(13) GSK−3を阻害する物質が、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、10−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−フルオロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−メチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−チオン、8,10−ジクロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−ヒドロキシエチル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンおよび7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(14) GSK−3を阻害する物質が、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オンおよび7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(15) GSK−3を阻害する物質が、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンまたはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(16) GSK−3を阻害する物質が、式(V)

[式中、同じか異なってよいR20およびR25は水素原子;ハロゲン;ヒドロキシ基;メチレンヒドロキシ基;直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキルまたはアルコキシまたはメチレンアルコキシ基;必要に応じて1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個−炭素原子を有するシクロアルキル基;必要に応じて1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換のアリール、アラルキルまたはアリールオキシ基;それぞれ互いに独立に、直鎖または分枝鎖のアルキル基中に1から6個の炭素原子を有するモノ−、ジ−またはトリアルキルシリル基;それぞれ互いに独立に置換または非置換アリール基を有するモノ−、ジ−またはトリアリールシリル基;トリフルオロメチル基;−COM;−COOM;あるいは−CHCOOM基(ここでMは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび/またはアミノ基1個または複数で置換された直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキル基、または必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有し、1個または複数のハロゲン、アルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよいアリール基を表す);−NR3031基(ここで同じか異なってよいR30およびR31は水素原子、必要ならば付加的に1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されているC〜C18直鎖または分枝鎖アルキル基、置換または非置換で、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含むアリール基を表す);アシル基;−CH−NR3031メチレンアミノ基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);ベンゼン環が必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有するベンジル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する、炭素原子3から7個を有するメチレンシクロアルキル基;アミドとしての、窒素原子に結合した生理的アミノ酸基;グリコシドが単糖または二糖から選択されるO−グリコシドまたはN−グリコシド;あるいはメチレンスルホネート基を表し;同じか異なってよいR21、R22、R23、R24、R26、R27、R28およびR29は水素原子;ハロゲン;ヒドロキシ基;ニトロソ基;ニトロ基;アルコキシ基;必要ならば1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されている直鎖または分枝鎖のC〜C18アルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換のアリール基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換アラルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換アリールオキシ基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換メチレンアリールオキシ基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個の炭素原子を有するシクロアルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個の炭素原子を有するメチレンシクロアルキル基;トリフルオロメチル基;−COM;−COOM;またはCHCOOM基(ここでMは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび/またはアミノ基1個または複数で付加的に置換された直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキル基、または必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有し、1個または複数のハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよいアリール基を表す);−NR3031基(ここで同じか異なってよいR30およびR31は水素原子、必要ならば付加的に1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されている直鎖または分枝鎖C〜C18アルキル基、置換または非置換で、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含むアリール基、アシル基を表すか、窒素原子が、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、炭素原子3から7個を有するシクロアルキルの一部を形成する);−CONR3031基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);ヒドロキシルアミノ基;ホスフェート基;ホスホネート基;スルフェート基;スルホネート基;スルホンアミド基;−SONR3031基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);−N=N−R32アゾ基(ここでR32は必要ならば1個または複数のカルボキシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された芳香族基あるいはグリコシドが単糖または二糖から選択されているO−グリコシドまたはN−グリコシド基を表す)を表すか;R20およびR24ならびにR25およびR29はそれぞれ一緒になって、互いに独立に必要ならば置換された1から4個のCH基を有する環を形成し;同じか異なってよいYおよびZは酸素;イオウ;セレン;テルルの原子;NR33基(ここでR33は水素原子、必要ならば1個または複数のカルボキシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された直鎖または分枝鎖C〜C18アルキル基、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む置換または非置換のアリール基、アラルキル基またはスルホネート基を表す);あるいは−NOR33(ここでR33基は前記の意味を有する)を表す]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(17) GSK−3を阻害する物質が、インジルビン、5−ヨード−インジルビン、5−ブロモ−インジルビン、5−クロロ−インジルビン、5−フルオロ−インジルビン、5−メチル−インジルビン、5−ニトロ−インジルビン、5−SOH−インジルビン、5’−ブロモ−インジルビン、5−5’−ジブロモ−インジルビンおよび5’−ブロモ−インジルビン5−スルホン酸からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(18) GSK−3を阻害する物質が、インジルビン−3’−モノオキシム、5−ヨード−インジルビン−3’−モノオキシムおよび5−SONa−インジルビン−3’−モノオキシムからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(19) GSK−3を阻害する物質が、インジルビン−3’−モノオキシムまたはその薬理学的に許容される塩である上記(1)〜(3)のいずれか1つの医薬。
(20) GSK−3の活性を阻害する物質を有効成分として含有してなる神経幹細胞のニューロン新生促進剤。
(21) GSK−3の活性を阻害する物質が、リチウムまたはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(22) GSK−3の活性を阻害する物質が、ビスインドリルマレイミド誘導体、3−アリール−4−インドリルマレイミド誘導体、インドロカルバゾール誘導体、インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン誘導体もしくはインジルビン誘導体またはそれらの薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(23) GSK−3の活性を阻害する物質が、式(I)

[式中、nおよびmは同一または異なって、1〜3の整数を表し、R、RおよびRは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、−COR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)、−COOR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)または−OR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)を表し、RおよびRは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール、カルボキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アミノまたはモノもしくはジ低級アルキルアミノを表し、nおよびmがそれぞれ2または3であるとき、それぞれのRおよびRは同一でも異なっていてもよい]で表される化合物、式(II)

(式中、na、ma、R1A、R2A、R3AおよびR5Aは、それぞれ前記n、m、R、R、RおよびRと同義である)で表される化合物もしくは式(III)

[式中、nb、mb、R1B、R2BおよびR5Bは、それぞれ前記n、m、R、RおよびRと同義であり、R3BおよびR4Bは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、−COR(式中、Rは前記と同義である)、−COOR(式中、Rは前記と同義である)または−OR(式中、Rは前記と同義である)を表すか、またはR3BとR4Bが一緒になって、

(式中、kは1または2を表し、XはCH、NH、酸素原子または硫黄原子を表し、Rはヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイルまたは低級アルコキシカルボニルを表す)を形成する]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(24) GSK−3の活性を阻害する物質が、式(Ia)

(式中、R2aは水素原子、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、アリールまたはニトロを表し、R3aおよびR4aは同一または異なって、置換もしくは非置換の低級アルキルを表す)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(25) GSK−3の活性を阻害する物質が、式(IIa)

(式中、maは前記と同義であり、R3Aaは置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、R5Aaはハロゲンを表す)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(26) GSK−3の活性を阻害する物質が、式(IIIa)

(式中、Rは前記と同義である)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(27) GSK−3の活性を阻害する物質が、3,4−ビス(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(1−メチルインドール−3−イル)−4−(1−プロピルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−シアノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−カルボキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−カルバモイルプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−プロピルオキシインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−フェニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−フェニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−メトキシカルボニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−ニトロインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(1−メチルインドール−3−イル)−4−[1−(3−ヒドロキシプロピル)−5−ニトロインドール−3−イル]−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2−クロロフェニル)−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2,4−ジクロロフェニル)−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2−クロロフェニル)−4−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−1H−ピロール−2,5−ジオン、4−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−3−(2−クロロフェニル)−1H−ピロール−2,5−ジオンおよび

からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(28) GSK−3を阻害する物質が、式(IV)

[式中、Aは単結合または二重結合によって右に結合されている酸素または硫黄であり、R10は水素原子、アリール、低級脂肪族置換基、特にアルキルおよび低級アルキルエステルからなる群より選択され、R11〜R14はアルコキシ、アミノ、アシル、脂肪族置換基、特にアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、脂肪族ニトリル、特にアルキルニトリル、シアノ、ニトロ、カルボキシル、ハロゲン、水素原子、ヒドロキシル、イミノならびにα、β不飽和ケトンからなる群より個別に選択され、R15〜R18は脂肪族置換基、特にアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基、特に低級脂肪族置換基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、アルコキシ、アシル、シアノ、ニトロ、エポキシ、ハロアルキル基、ハロゲン、水素原子ならびにヒドロキシルからなる群より個別に選択され、R19は脂肪族の基、特に低級アルキル基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、カルボン酸、および水素からなる群より選択される]で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(29) GSK−3を阻害する物質が、7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、10−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−4−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−4−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−チオン、9−ブロモ−5,12−ビス−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−12−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−5,7−ビス−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−5,7,12−トリ−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−ヒドロキシエチル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8,10−ジクロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、5−ベンジル−9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−12−エチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−プロペニル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−フルオロ−7,12−ジヒドロ−12−(2−プロペニル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2−(メチルイミノアミン)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2−(カルボン酸)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−10−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−11−ヒドロキシメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,3−ジメトキシ−9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,3−ジメトキシ−9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)プロピオニトリル、2−ブロモ−9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)アクリロニトリル、2−(3−ヒドロキシ−1−プロピニル)−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ヨード−9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−(3−オキソ−1−ブテニル)−9−トリフルオロメチル−7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−クロロ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、2−ヨード−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−メチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−[2−(1−ヒドロキシシクロヘキシル)エチニル]−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ヨード−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−エチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−メチル−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オンおよび3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)アクリル酸メチルエステルからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(30) GSK−3を阻害する物質が、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、10−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−フルオロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−メチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−チオン、8,10−ジクロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−ヒドロキシエチル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンおよび7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(31) GSK−3を阻害する物質が、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オンおよび7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(32) GSK−3を阻害する物質が、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンまたはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(33) GSK−3を阻害する物質が、式(V)

[式中、同じか異なってよいR20およびR25は水素原子;ハロゲン;ヒドロキシ基;メチレンヒドロキシ基;直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキルまたはアルコキシまたはメチレンアルコキシ基;必要に応じて1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個−炭素原子を有するシクロアルキル基;必要に応じて1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換のアリール、アラルキルまたはアリールオキシ基;それぞれ互いに独立に、直鎖または分枝鎖のアルキル基中に1から6個の炭素原子を有するモノ−、ジ−またはトリアルキルシリル基;それぞれ互いに独立に置換または非置換アリール基を有するモノ−、ジ−またはトリアリールシリル基;トリフルオロメチル基;−COM;−COOM;あるいは−CHCOOM基(ここでMは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび/またはアミノ基1個または複数で置換された直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキル基、または必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有し、1個または複数のハロゲン、アルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよいアリール基を表す);−NR3031基(ここで同じか異なってよいR30およびR31は水素原子、必要ならば付加的に1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されているC〜C18直鎖または分枝鎖アルキル基、置換または非置換で、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含むアリール基を表す);アシル基;−CH−NR3031メチレンアミノ基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);ベンゼン環が必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有するベンジル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する、炭素原子3から7個を有するメチレンシクロアルキル基;アミドとしての、窒素原子に結合した生理的アミノ酸基;グリコシドが単糖または二糖から選択されるO−グリコシドまたはN−グリコシド;あるいはメチレンスルホネート基を表し;同じか異なってよいR21、R22、R23、R24、R26、R27、R28およびR29は水素原子;ハロゲン;ヒドロキシ基;ニトロソ基;ニトロ基;アルコキシ基;必要ならば1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されている直鎖または分枝鎖のC〜C18アルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換のアリール基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換アラルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換アリールオキシ基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換メチレンアリールオキシ基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個の炭素原子を有するシクロアルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個の炭素原子を有するメチレンシクロアルキル基;トリフルオロメチル基;−COM;−COOM;またはCHCOOM基(ここでMは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび/またはアミノ基1個または複数で付加的に置換された直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキル基、または必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有し、1個または複数のハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよいアリール基を表す);−NR3031基(ここで同じか異なってよいR30およびR31は水素原子、必要ならば付加的に1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されている直鎖または分枝鎖C〜C18アルキル基、置換または非置換で、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含むアリール基、アシル基を表すか、窒素原子が、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、炭素原子3から7個を有するシクロアルキルの一部を形成する);−CONR3031基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);ヒドロキシルアミノ基;ホスフェート基;ホスホネート基;スルフェート基;スルホネート基;スルホンアミド基;−SONR3031基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);−N=N−R32アゾ基(ここでR32は必要ならば1個または複数のカルボキシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された芳香族基あるいはグリコシドが単糖または二糖から選択されているO−グリコシドまたはN−グリコシド基を表す)を表すか;R20およびR24ならびにR25およびR29はそれぞれ一緒になって、互いに独立に必要ならば置換された1から4個のCH基を有する環を形成し;同じか異なってよいYおよびZは酸素;イオウ;セレン;テルルの原子;NR33基(ここでR33は水素原子、必要ならば1個または複数のカルボキシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された直鎖または分枝鎖C〜C18アルキル基、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む置換または非置換のアリール基、アラルキル基またはスルホネート基を表す);あるいは−NOR33(ここでR33基は前記の意味を有する)を表す]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(34) GSK−3を阻害する物質が、インジルビン、5−ヨード−インジルビン、5−ブロモ−インジルビン、5−クロロ−インジルビン、5−フルオロ−インジルビン、5−メチル−インジルビン、5−ニトロ−インジルビン、5−SOH−インジルビン、5’−ブロモ−インジルビン、5−5’−ジブロモ−インジルビンおよび5’−ブロモ−インジルビン5−スルホン酸からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(35) GSK−3を阻害する物質が、インジルビン−3’−モノオキシム、5−ヨード−インジルビン−3’−モノオキシムおよび5−SONa−インジルビン−3’−モノオキシムからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(36) GSK−3を阻害する物質が、インジルビン−3’−モノオキシムまたはその薬理学的に許容される塩である上記(20)のニューロン新生促進剤。
(37) 上記(20)〜(36)のいずれか1つのニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養して得られるニューロン。
(38) 上記(20)〜(36)のいずれか1つのニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養してニューロンを新生させ、培養物中よりニューロンを採取することを特徴とするニューロンの製造方法。
(39) GSK−3を阻害する物質を投与することを特徴とする神経再生方法。
(40) 神経再生薬の製造のためのGSK−3を阻害する物質の使用。
(41) 神経幹細胞のニューロン新生促進剤の製造のためのGSK−3を阻害する物質の使用。
以下、本発明の詳細を説明する。
1.本発明の神経再生薬および神経幹細胞のニューロン新生促進剤に含有されるGSK−3の活性を阻害する物質
GSK−3の活性を阻害する物質としては、GSK−3の活性を阻害する化合物であればいずれでもよいが、例えばリチウム、ビスインドリルマレイミド誘導体、3−アリール−4−インドリルマレイミド誘導体、インドロカルバゾール誘導体、インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン誘導体、インジルビン誘導体等があげられる。
ビスインドリルマレイミド誘導体、3−アリール−4−インドリルマレイミド誘導体、インドロカルバゾール誘導体としては、具体的には、例えば式(I)〜(III)で表される化合物があげられる。中でも3,4−ビス(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(1−メチルインドール−3−イル)−4−(1−プロピルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−シアノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−カルボキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−カルバモイルプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−プロピルオキシインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−フェニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−フェニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−メトキシカルボニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−ニトロインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(1−メチルインドール−3−イル)−4−[1−(3−ヒドロキシプロピル)−5−ニトロインドール−3−イル]−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2−クロロフェニル)−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2,4−ジクロロフェニル)−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2−クロロフェニル)−4−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(2−クロロフェニル)−1H−ピロール−2,5−ジオンおよび

等が好ましい。
インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン誘導体としては、具体的には、例えば式(IV)で表される化合物があげられる。中でも7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、10−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’2’:2,3アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−4−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−4−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−チオン、9−ブロモ−5,12−ビス−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−12−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−5,7−ビス−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−5,7,12−トリ−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−ヒドロキシエチル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8,10−ジクロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、5−ベンジル−9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−12−エチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−プロペニル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−フルオロ−7,12−ジヒドロ−12−(2−プロペニル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2−(メチルイミノアミン)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2−(カルボン酸)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−10−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−11−ヒドロキシメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,3−ジメトキシ−9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,3−ジメトキシ−9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)プロピオニトリル、2−ブロモ−9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)アクリロニトリル、2−(3−ヒドロキシ−1−プロピニル)−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ヨード−9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−(3−オキソ−1−ブテニル)−9−トリフルオロメチル−7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−クロロ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、2−ヨード−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−メチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−[2−(1−ヒドロキシシクロヘキシル)エチニル]−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ヨード−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−エチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−メチル−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オンおよび3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)アクリル酸メチルエステル等が好ましい。
インジルビン誘導体としては、具体的には、例えば式(V)で表される化合物があげられる。中でもインジルビン、5−ヨード−インジルビン、5−ブロモ−インジルビン、5−クロロ−インジルビン、5−フルオロ−インジルビン、5−メチル−インジルビン、5−ニトロ−インジルビン、5−SOH−インジルビン、5’−ブロモ−インジルビン、5−5’−ジブロモ−インジルビン、5’−ブロモ−インジルビン5−スルホン酸、インジルビン−3’−モノオキシム、5−ヨード−インジルビン−3’−モノオキシムおよび5−SONa−インジルビン−3’−モノオキシム等が好ましい。
以下、式(I)〜(V)で表される化合物をそれぞれ化合物(I)〜(V)という。他の式番号の化合物についても同様である。
化合物(I)〜(III)および化合物(Ia)〜(IIIa)の各基の定義において、以下の例示があげられる。
(i)低級アルキル、低級アルコキシおよび低級アルコキシカルボニルの低級アルキル部分としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数1〜10のアルキルがあげられ、具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、6−メチルヘプチル、イソオクチル、ノニル、デシル等があげられる。
(ii)シクロアルキルしては、例えば炭素数3〜8のシクロアルキルがあげられ、具体的にはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等があげられる。
(iii)低級アルケニルとしては、例えば直鎖、分岐または環状の炭素数2〜8のアルケニルがあげられ、具体的にはビニル、アリル、1−プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、シクロヘキセニル、2,6−オクタジエニル等があげられる。
(iv)モノもしくはジ低級アルキルアミノの低級アルキル部分は、前記低級アルキルと同義であり、ジ低級アルキルアミノの2つの低級アルキル部分は、同一でも異なっていてもよい。
(v)ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素の各原子を表す。
(vi)アリールとしては、例えば炭素数6〜14の単環式、二環式または三環式のアリールがあげられ、具体的にはフェニル、ナフチル、インデニル、アントラニル等があげられる。
(vii)置換低級アルキル、置換低級アルケニル、置換低級アルコキシおよび置換低級アルコキシカルボニルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数1〜3の、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイル、アミノ、モノまたはジ低級アルキルアミノ、シクロアルキル、低級アルカノイル、低級アルコキシ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルカノイルオキシ等があげられる。
ここで示したハロゲン、モノもしくはジ低級アルキルアミノ、シクロアルキル、アリールおよびアリールオキシのアリール部分、ならびに低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、低級アルカノイルおよび低級アルカノイルオキシの低級アルキル部分は、それぞれ前記ハロゲン(v)、モノまたはジ低級アルキルアミノ(iv)、シクロアルキル(ii)、アリール(vi)および低級アルキル(i)と同義である。
また、ここで示した置換アリールおよび置換アリールオキシにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数1〜3の、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ等があげられる。
ここで示したハロゲンならびに低級アルキル、低級アルコキシおよび低級アルコキシカルボニルの低級アルキル部分は、それぞれ前記ハロゲン(v)および低級アルキル(i)と同義である。
(viii)置換アリールおよび置換シクロアルキルにおける置換基としては、前記置換低級アルキルにおける置換基(vii)の定義であげた基に加え、例えば低級アルキル、置換低級アルキル等があげられる。
ここで示した置換低級アルキルにおける置換基としては、同一または異なって、例えば置換数1〜3の、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ等があげられる。
ここで示したハロゲンならびに低級アルコキシおよび低級アルコキシカルボニルの低級アルキル部分は、それぞれ前記ハロゲン(v)および低級アルキル(i)と同義である。
また、ここで示した低級アルキルは、前記低級アルキル(i)と同義である。
ビスインドリルマレイミド誘導体、3−アリール−4−インドリルマレイミド誘導体、インドロカルバゾール誘導体、インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン誘導体、インジルビン誘導体、化合物(I)〜(V)および化合物(Ia)〜(IIIa)の薬理学的に許容される塩としては、毒性のない水溶性のものが好ましく、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩などの有機酸塩があげられ、薬理学的に許容される金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩などがあげられ、薬理学的に許容されるアンモニウム塩としては、アンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩があげられ、薬理学的に許容される有機アミン付加塩としては、モルホリン、ピペリジンなどの付加塩等があげられる。
ビスインドリルマレイミド誘導体、3−アリール−4−インドリルマレイミド誘導体、インドロカルバゾール誘導体、インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン誘導体、インジルビン誘導体、化合物(I)〜(V)および化合物(Ia)〜(IIIa)は、EP470490、WO93/18766、WO93/18765、EP397060、WO98/11105、WO98/11103、WO98/11102、WO98/04552、WO98/04551、DE4243321、DE4005970、DE4217964、DE4005970、DE3914764、WO96/04906、WO95/07910、DE42179464、US5856517、US5891901、WO99/42100、EP328026、EP384349、EP540956、DE4005969、EP508792、WO99/65910、WO01/037819等に記載の方法またはそれらに準じた方法により製造することができる。
また、GSK−3の活性を阻害する物質として、short interference RNA(siRNA)を使用することもできる。GSK−3に対するsiRNAは、そのRNAi活性によりGSK−3の発現を抑制し、その結果、GSK−3の活性を阻害することができる。siRNAは、そのもの自身を細胞内に導入することによってGSK−3の活性を阻害することができるほか、siRNAを発現するベクターを細胞内に導入することによっても可能である。
ヒトGSK−3に対する効果的なsiRNAを作製するためには、効果の高いターゲット配列を選択することが重要である。その配列を決定するアルゴリズムは様々な方法が知られているが、例えば、ヒトGSK−3のメッセンジャーRNA配列中の任意の19配列の中で、グアニンまたはシトシンの含量が30〜52%であること、3’末端の5塩基のうち3塩基以上がアデニンまたはウリジンであること、融解温度が20℃未満であること、3番目の塩基がアデニンであること、10番目の塩基がウリジンであること、13番目の塩基がグリシン以外であること、19番目の塩基がアデニンであること、19番目の塩基がグリシン及びシトシンでないことの各条件をより多く満たす配列を選択することにより効果の高いターゲット配列を選択することができる。そのターゲット配列のオリゴRNAの3’末端に2塩基のヌクレオチドを付加したセンス鎖オリゴRNAおよびそのターゲット配列に相補的な配列のオリゴRNAの3’末端に2塩基のヌクレオチドを付加したアンチセンス鎖オリゴRNAの両者をハイブリダイズさせることにより、ヒトGSK−13に対する効果的なsiRNAを作製することができる。siRNAの合成、精製、ハイブリダイズは様々な方法により可能であるが、例えば、Silencer siRNA Construction Kit(Ambion社製)を用い、添付のプロトコールに従うことにより実施することができる。またsiRNAを発現するベクターは、各種プラスミドベクターやレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターなどの各種ウイルスベクターによって可能であるが、例えば、piGENE hU6 Vector(iGENE社製)に上記の方法により選択したターゲット配列のオリゴDNAを添付プロトコールに従って組み込むことにより作製することができる。siRNAやsiRNAを発現するベクターの細胞内への導入は様々な方法により可能であるが、例えばNucleofector Device(Amaxa社製)を用い添付のプロトコールに従うことにより実施することができる。
2.GSK−3の活性を阻害する物質の探索法
GSK−3の活性を阻害する物質の探索法は、[i]被験物質の存在下、GSK−3、GSK−3によりリン酸化されるペプチドおよびATPを共存させた場合と、[ii]被験物質の非存在下、上記[i]のGSK−3、GSK−3によりリン酸化されるペプチドおよびATPを共存させた場合での、[iii]リン酸化されているペプチドの量を測定、比較し、[iv]被験物質の非存在下に比べ、被験物質の存在下におけるリン酸化されているペプチドの量が少ない物質を選択する方法をあげることができる。
被験物質は、特に限定されないが、例えば、ペプチド、蛋白質、細胞抽出液や該抽出液由来の精製物、細胞培養上清や該上清由来の精製物、血清などの生体試料や該生体試料由来の精製物、微生物の菌体抽出液や該抽出液由来の精製物、微生物培養上清や該上清由来の精製物、化合物、コンビナトリアルケミストリーを用いて合成された化合物などをあげることができる。
GSK−3としては、GSK−3の活性を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはほ乳類、より好ましくはラット、マウス、サルまたはヒト由来のGSK−3αまたはβをあげることができ、具体的には配列番号1で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。
GSK−3は、GSK−3をコードする遺伝子を有する発現ベクターを動物細胞に導入し、該動物細胞を培養する方法などにより取得することができる。GSK−3をコードする遺伝子は、GSK−3をコードする遺伝子であれば特に限定されないが、好ましくはほ乳類、より好ましくはラット、マウス、サルまたはヒト由来のGSK−3αまたはβをコードする遺伝子をあげることができ、具体的には配列番号2で表される塩基配列を有する遺伝子をあげることができる。
GSK−3によりリン酸化されるペプチドとしては、グリコーゲン合成酵素をあげることができ、グリコーゲン合成酵素としては、例えば配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをあげることができる。
グリコーゲン合成酵素は、グリコーゲン合成酵素をコードする遺伝子を有する発現ベクターを動物細胞に導入し、該動物細胞を培養する方法などにより取得することができる。グリコーゲン合成酵素をコードする遺伝子は、グリコーゲン合成酵素をコードする遺伝子であれは特に限定されないが、好ましくはほ乳類、より好ましくはラット、マウス、サルまたはヒト由来のグリコーゲン合成酵素をコードする遺伝子をあげることができ、具体的には配列番号4で表される塩基配列を有する遺伝子をあげることができる。
また、蛋白質の翻訳に関与するeukaryotic initiation factor 2B(eIF2B)蛋白質のアミノ酸配列中で、GSK−3によりリン酸化される部位を含むアミノ酸配列を有するペプチドもGSK−3によりリン酸化されるペプチドとして用いることができ、具体的には配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをあげることができる。
GSK−3の活性を測定する方法としては、例えばリン酸の供与体であるATPとして[γ−33P]ATPを用い、被験物質存在下、または被験物質非存在下において、GSK−3によるグリコーゲン合成酵素または該酵素のリン酸化部位を含むペプチドのリン酸化反応を行い、該酵素またはペプチドに取り込まれた33Pの量を液体シンチレーションカウンターなどを用いて測定する方法をあげることができる。
3.神経再生薬
神経再生薬とは、ヒトまたは動物の脳内の神経幹細胞に直接作用することでニューロン新生を促進し、脳内のニューロンを増加させる作用を有する薬剤をいう。
該神経再生薬は、神経の変性または損傷を伴う神経疾患の治療薬として用いることができる。
該神経疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ダウン症、脳血管障害、脳卒中、脊髄損傷、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、不安障害、統合失調症、うつ病および躁鬱病などをあげることができる。
GSK−3の活性を阻害する物質またはその薬理学的に許容される塩は、神経再生薬として、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用されるものである。
本発明の神経再生薬は、活性成分としてGSK−3の活性を阻害する物質またはその薬理学的に許容される塩を単独で、または任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤などがある。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される1種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
GSK−3の活性を阻害する物質またはその薬理学的に許容される塩の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質または重篤度により異なるが、通常経口の場合、成人一人当り0.01mg〜1g、好ましくは0.05〜50mgを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人一人当り0.001〜100mg、好ましくは0.01〜10mgを一日一回ないし数回投与する。
4.神経幹細胞のニューロン新生促進剤
神経幹細胞のニューロン新生促進剤とは、in vivoまたはin vitroにおいて、神経幹細胞と接触させたとき、該神経幹細胞のニューロン新生を促進する薬剤のことをいう。
神経幹細胞は、神経幹細胞であれば特に限定されないが、脳の成体神経幹細胞が好ましい。
脳は、いずれの動物の脳であってもよいが、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラット、マウス、サル、ヒトなどの脳をあげることができる。
GSK−3の活性を阻害する物質またはその薬理学的に許容される塩は、神経幹細胞のニューロン新生促進剤として、そのまま単独で用いることも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用されるものである。
本発明の神経幹細胞のニューロン新生促進剤は、活性成分としてGSK−3の活性を阻害する物質またはその薬理学的に許容される塩を単独で、または任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。それら医薬製剤は、上記した神経再生薬の製剤と同様の方法により製造することができ、同様の投与方法により投与することができる。
本発明の神経幹細胞のニューロン新生促進剤は、in vitroにおいて、神経幹細胞と接触させ、該神経細胞を培養することにより、ニューロンを新生させ、培養物から該ニューロンを採取することを特徴とするニューロンの製造法に用いることができる。in vitroで本発明の神経幹細胞のニューロン新生促進剤を用いる場合、GSK−3の活性を阻害する物質またはその薬理学的に許容される塩を、該物質または該塩を溶解することができる溶液に溶解して用いることが好ましい。該溶液としては、水、DMSOなどをあげることができる。
5.本発明のニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養して得られるニューロン
本発明のニューロン新生促進剤の存在下、動物の神経幹細胞を培養することにより、該神経幹細胞のニューロン新生を積極的に促進させることができる。動物の神経幹細胞は、いずれの動物の神経幹細胞であってもよく、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラット、マウス、サル、ヒト由来の神経幹細胞をあげることができ、神経幹細胞としては、脳由来の神経幹細胞をあげることができる。神経幹細胞は、いずれの週齢、または年齢の動物由来の細胞でもよいが、好ましくは成体神経幹細胞をあげることができる。
動物から成体神経幹細胞を取得する方法としては、J.Neuroscinece,19,8487(1999)およびGenes & Develop.,10,3129(1996)記載の方法に準じて、外科的手法によって成体動物から脳を摘出して、脳細胞粗抽出液を調製し、該粗抽出液から成体幹細胞を濃縮する方法をあげることができる。
また、ヒトから成体神経幹細胞を取得する方法としては、Experimental Cell Research,289,378(2003)記載の方法に準じて、バイオプシーによって神経疾患患者の側脳室壁から組織を採取して、脳細胞粗抽出液を調製し、該抽出液から成体幹細胞を濃縮する方法をあげることができる。
本発明のニューロン新生促進剤存在下、成体神経幹細胞を培養する場合、1.8×10個/cm程度の成体神経幹細胞に対して、該ニューロン新生促進剤を100nmol/l〜100μmol/lの濃度で作用させることが好ましい。ただし、リチウムまたはその薬理学的に許容される塩は100μmol/l〜10mmol/lの濃度で作用させることが好ましい。成体神経幹細胞と本発明のニューロン新生促進剤を接触させ、37℃で5%CO雰囲気下、4〜14日間、2日おきに全量または部分量培地交換しながら静置培養することでニューロン新生を促進させることができる。
成体神経幹細胞の培養に用いる培地は、ニューロン新生の促進を妨げない培地であればいずれの培地でもよいが、1%のN2 supplement(Invitrogen社製)を含むDMEM/F12培地(Invitrogen社製)などを用いるのが好ましい。
上記の培養により取得されるニューロンは、培地から回収し、神経疾患患者の障害部位へ外科的手法で移植することにより該神経疾患の治療に用いることができる。該神経疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ダウン症、脳血管障害、脳卒中、脊髄損傷、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、不安障害、統合失調症、うつ病および躁鬱病などをあげることができる。
6.本発明の神経再生薬の評価法
本発明の神経再生薬が、in vivoにおいてニューロンを再生させ、神経疾患を治療することができることは、以下の方法により確認することができる。
上記した本発明の神経再生薬を、ラットまたはサルなどの実験動物に投与する。実験動物は、傷害を有していない健康な動物であってもよいが、海馬虚血傷害を与えることによりニューロン新生を効果的に観察することができるので[Cell,110,429(2002)]、虚血、6−hydroxydopamine(6−OHDA)投与またはカイニン酸投与等の方法により、脳に傷害を与えた動物が好ましい。投与経路としては、経口、口腔内、皮下、筋肉内、静脈内または脳室内などへの投与をあげることができる。投与量、投与方法としては、例えば体重1kg当り100μg〜10mg、好ましくは500μg〜500ngを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、体重1kg当り10μg〜1mg、好ましくは100μg〜100ngを一日一回ないし数回投与する。
新生したニューロンは以下の方法により検出することができる。
増殖細胞を標識することができるブロモデオキシウリジン(BrdU)、またはGreen Fluorescent Protein(GFP)やベータガラクトシダーゼ等の細胞標識可能な遺伝子を発現できるレトロウイルスベクターを該物質の最初の投与と同時、投与前または投与後に該実験動物に投与した後、該物質を一日一回ないし数回投与して10〜20日間飼育する。その後、該実験動物の脳を摘出し、脳の凍結切片を調製して蛍光顕微鏡を用いて観察し、例えば増殖細胞を標識する薬剤としてBrdUを用いた場合は、単位面積当たりのBrdU陽性細胞数およびBrdU陽性細胞数に対するニューロンマーカーであるTuj1陽性細胞数の割合を、陰性コントロールと比較する。
以上の方法により、本発明の神経再生薬のニューロン新生促進作用および神経疾患治療効果を評価することができる。
7.本発明のニューロン新生促進剤の評価法
参考例2記載の方法で取得できるANSC−7細胞を、1mlの1%のN2supplement(Invitrogen社製)と20ng/mlのFGF−2(PeproTech社製)を含むDMEM/F12培地が入ったポリオルニチンおよびラミニンでコートした12穴培養ディッシュに1穴当たり1.8×10個まき、一晩インキュベートする。培養液を、FGF2を含まず0.5%の胎仔牛血清及び1%のN2supplementを含むDMEM/F12培地(Invitrogen社製。以下、分化誘導培地と称する)に全量交換して分化を誘導する。その際、PBS(Invitrogen社製)またはDMSOで0.01mmol/l〜5mol/lの範囲で段階的に希釈したGSK−3の活性を阻害する物質をそれぞれ1000分の1容量添加する。陰性コントロールとして同容量のPBSまたはDMSOを添加する。
培養液を、それぞれのGSK−3の活性を阻害する物質が入った分化誘導培地で2日おきに交換し、計6日間分化誘導後、15%中性緩衝ホルマリン液(和光純薬工業)に置換し20分間固定する。その後、0.3% TritonX−100(ナカライテスク社製)を含むPBSを用いた5分間の洗浄を3回繰り返す。次に、PBSで希釈した10%ヤギ胎児血清(DAKO社製)を用いて細胞を2時間ブロッキングした後、1次抗体としてPBSで1000倍希釈したマウス抗Tuj1(βチューブリンイソタイプIII)抗体(シグマ アルドリッチ社製)を4℃で16時間反応させる。その後、0.3% TritonX−100を含むPBSを用いた5分間の洗浄を3回繰り返す。
次に、2次抗体として1000倍希釈したAlexa Fluor488コンジュゲートヤギ抗マウスIgG抗体(Molecular Probes社製)を室温で2時間反応さる。同時にBisbenzimide H 33342 Fluorochrome,Trihydrochloride(Calbiochem社製、以下H33342と記す)を終濃度1μg/mlになるように添加し、核を染色する。PBSに浸したのち倒立型蛍光顕微鏡(ニコン社製)により観察し、2.44平方ミリメートルあたりのTuj1陽性ニューロン数をカウントする。
以下、本発明のニューロン新生促進剤のニューロン新生促進作用に関する実験例を示す。
実験例1:塩化リチウムによるニューロン新生促進(1)
上記7の方法により、ANSC−7細胞の分化誘導時にPBSで0.01,0.1,1,3mol/lになるように溶解した塩化リチウムまたは塩化ナトリウム(いずれもナカライテスク社製)を培養液の1000分の1容量、ANSC−7細胞を含有する培地に添加し、分化誘導後6日目のニューロン数を解析した。その結果、Tuj1陽性のニューロン数は終濃度0.01,0.1,1,3mmol/lの塩化リチウムでそれぞれ1.1,1.3,1.8,2.1倍となり(塩化リチウム1mmol/l以上で有意差あり)、塩化リチウム濃度に依存して増加した。また3mmol/lの塩化リチウムによるH33342陽性の総細胞数は塩化リチウムなしのコントロールと比較して1.1倍で有意差がなかった。以上のことから、塩化リチウムはANSC−7細胞のニューロン新生促進作用を有することが明らかとなった。また、ネガティブコントロールである塩化ナトリウムではTuj1陽性のニューロン数は終濃度0.01,0.1,1,3mmol/lでそれぞれ1.0,1.1,1.2,1.2倍で全て有意差は無く、ニューロン新生数の増加は塩濃度や塩化物イオンによる効果ではなくリチウムの効果であると考えられる。
実験例2:塩化リチウムによるニューロン新生促進(2)
ANSC−7細胞に対するニューロン新生促進作用がBDNFおよびBcl−2の発現誘導によるものであるかどうかを明らかにするため、リチウムによりBDNFおよびBcl−2の発現が促進されるか否かを半定量的RT−PCRにより解析した。
ANSC−7細胞を、2mlの1%のN2 supplementと20ng/mlのFGF−2を含むDMEM/F12培地が入ったポリオルニチンとラミニンでコートした6穴培養ディッシュに、1穴あたり4.5×10個になるように計7穴まき、一晩インキュベートした。1穴の細胞からRNeasy mini kit(キアゲン社製)を用いて添付プロトコールに従って全RNAを取得した。残り6穴の培地を分化誘導培地に全量交換して分化を誘導した。そのうち2穴には3mol/lの塩化リチウムを培地の1000分の1容量、別の2穴には1mol/lの塩化リチウムを培地の1000分の1容量添加した。残り2穴には同容量のPBSを添加しコントロールとした。
分化誘導開始から24時間後、各濃度の塩化リチウムを添加した1穴ずつから細胞を採取し、該細胞から上記と同様の方法により全RNAを取得し、残りの細胞からは分化誘導開始から6日後に全RNAを取得した。上記で取得した各5μgの全RNAに、10μlの5×DNase buffer、0.5μlのRNase inhibitor(40U/μl)、2.5μlのRNase−free DNaseI(1U/μl)(以上プロメガ社製)をそれぞれ加え、滅菌水で総容量を50μlとした。37℃で30分間反応させた後、フェノール/クロロホルム処理したのちエタノール沈殿した。
DNase処理した各1μgの全RNAに0.5μg/μlオリゴ(dT)12−18プライマーを1μl加え、滅菌水で総容量を12μlとした。65℃で10分間加熱した後氷上で急冷し、4μlの5×synthesis buffer(インビトロジェン社製)、1μlの10mmol/l dNTP mix、2μlの0.1mol/l DTT、1μlの200U/μl SuperscriptII RT(インビトロジェン社製)を加え、42℃で50分間反応した。90℃で5分間加熱した後氷上に10分間置いた。
次にRNaseH(2U/μl)(インビトロジェン社製)を1μl加え、37℃で20分間反応し、滅菌水を加えて総容量を200μlとすることによりcDNAを作製した。
同様に陽性コントロール用としてラット脳の全RNAからcDNAを作成した。1μlの該cDNAに、2μlの10μmol/lプライマーセット、1μlのDMSO(ナカライテスク社製)、2μlの10×ExTaq buffer、1.6μlのdNTPmix、0.1μlのExTaq(以上、タカラバイオ社製)を加え、サーマルサイクラーを用いて94℃で1分間処理後、94℃で1分間、60℃で1分間、74℃で1分間のサイクルを、Bcl−2増幅用PCRで27サイクル、BDNF増幅用PCRで35サイクル繰り返し、それぞれのcDNA断片を増幅させた。Bcl−2の増幅には配列番号6および7で表される塩基配列からなる合成DNAを、BDNFの増幅には配列番号8および9で表される塩基配列からなる合成DNAをプライマーセットに用いた。
増幅DNAは、1.8%アガロース(ナカライテスク社製)ゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド(ナカライテスク社製)で染色後、トランスイルミネーター(東洋紡社製)で検出した。Bcl−2のバンド強度は分化開始後24時間目および6日目ともに塩化リチウムの濃度差により変化しなかった。BDNFは塩化リチウムの濃度差に関わらず発現は認められなかった。
以上の結果から、塩化リチウムによるニューロン新生促進活性は、Bcl−2およびBDNFを介した細胞死抑制の結果ではなく、塩化リチウムは積極的にニューロン新生を促進することが示唆された。
実験例3:塩化リチウムによるニューロン新生促進(3)
リチウムによるニューロン新生促進作用がアポトーシス抑制による新生細胞数の増加によるものであるのか、または積極的にニューロン分化を誘導していることによるものであるのかを明らかにするため、リチウムによるANSC−7細胞に対するアポトーシス抑制効果を解析した。
上記7の方法により、塩化リチウムを終濃度3mmol/lになるようにANSC−7細胞を含有する培地に添加して6日間培養し、塩化リチウムを添加して培養したANSC−7細胞とコントロールとしてPBSを添加して培養したANSC−7細胞とを、in situ細胞死検出キット、フルオレセイン(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いて添付プロトコールどおり該細胞と反応させた。倒立型蛍光顕微鏡(ニコン社製)を用いて該細胞を観察し、2.44平方ミリメートルあたりのアポトーシス細胞数をカウントした。
その結果、アポトーシス陽性細胞数は塩化リチウム添加により1.0倍となり変化せず、塩化リチウムはANSC−7細胞のアポトーシスを抑制しないことが明らかとなった。従って、リチウムによるニューロン新生促進作用は、積極的なニューロン新生の促進によるものであることが明らかとなった。
実験例4:インスリンおよびフォルスコリンとリチウムとのニューロン新生促進作用に関する拮抗作用
ニューロン新生促進作用が知られるインスリンおよびフォルスコリンとリチウムとのニューロン新生促進作用に関する拮抗作用を解析した。
上記7の方法により、ANSC−7細胞の分化誘導時に、培地中の濃度が5μg/mlまたは25μg/mlになるようにインスリンを培地に添加するとともに、各濃度のインスリンを含む培地に、終濃度が0、1および3mmol/lになるように塩化リチウムを添加し、6日間分化誘導を行った。
その結果、3mmol/lの塩化リチウムによるニューロン増加率は、5μg/mlのインスリン共存時に比べ、25μg/mlのインスリン共存時で0.70倍となり有意に低下していた。よって、インスリンとリチウムの作用が拮抗することが明らかとなった。
また、上記と同様の方法にて、インスリンの代わりに終濃度が0、1および5μmol/lになるようにフォルスコリンを培地に添加し、終濃度が0または3mmol/lの塩化リチウム共存時におけるニューロン増加率を算出した。
その結果、塩化リチウムなしの条件ではフォルスコリンによるニューロン増加率が1,5μmol/lのフォルスコリンでそれぞれ1.9,2.2倍であるのに対し、3mmol/lの塩化リチウム共存時にはそれぞれ1.2,1.1倍と加算しなかった。従って、塩化リチウムとフォルスコリンは、ニューロン新生促進作用において拮抗することが明らかとなった。
リチウムの標的分子としては、GSK−3やイノシトール−1−リン酸フォスファターゼやイノシトール−ポリフォスファターゼが知られており[Nature,417,292−295(2002)]、また、インスリンとフォルスコリンは間接的にGSK−3の活性を阻害することが知られている[Mol.Cell.Biol.,19,4989−5000(1999)]。リチウム、インスリンおよびフォルスコリンのニューロン新生促進作用に関する標的分子は共通であると考えられることから、リチウムはGSK−3の活性を阻害することにより神経幹細胞のニューロン新生を促進していることが示された。
実験例5:GSK−3の選択的阻害剤であるSB−216763によるニューロン新生促進
参考例1記載の方法により合成したGSK−3の選択的阻害剤として知られるSB−216763[Chem.Biol.,,793−803(2000)]を、0.1および0.33mmol/lになるようにDMSOに溶解し、上記7の方法により、その1000分の3容量をANSC−7を含有する培地に、ANSC−7細胞分化誘導時に添加し、分化誘導後6日目のニューロン数を測定した。
その結果、Tuj1陽性のニューロン数は終濃度0.3,1.0μmol/lのSB−216763によってそれぞれ1.2倍、1.8倍となり濃度依存的に有意に増加した。よって、GSK−3を選択的に阻害する活性を持つ化合物によりニューロン新生を促進できることが明らかとなった。
以上より、GSK−3を選択的に阻害する活性を持つ物質は、神経幹細胞のニューロン新生促進剤になるとともに、神経の再生治療薬になることが示された。
実験例6:GSK−3の阻害剤である9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン(Kenpaullone)によるニューロン新生促進
実験例1に示した方法と同様の方法により、GSK−3およびサイクリン依存性キナーゼ(以下、CDKと称す)の阻害剤として知られるKenpaullone[Biochem.J.,371,199−204(2003)、CALBIOCHEM社製]を、0.5、2および5mmol/lになるようにDMSOに溶解し、培養液の1000分の1容量の該DMSO溶液を、ANSC−7細胞を含有する培地に添加し、分化誘導後6日目のTuj1陽性ニューロン数を解析した。陰性コントロールとして同容量のDMSOを添加した。また同様に、CDK阻害剤として知られ、GSK−3はほとんど阻害しないRoscovitine[Biochem.J.,371,199−204(2003)、シグマアルドリッチ社製]を、2、5および10mmol/lになるようにDMSOに溶解し、培養液の1000分の1容量の該DMSO溶液を、ANSC−7細胞を含有する培地に添加し、分化誘導後6日目のTuj1陽性ニューロン数を解析した。
その結果、Tuj1陽性ニューロン数は終濃度0.5μmol/lのKenpaulloneで陰性コントロールと比較して1.3倍、2μmol/lで2.7倍、5μmol/lで3.7倍となり、Kenpaulloneの濃度依存的に有意に増加した。一方、終濃度2μmol/lのRoscovitineで陰性コントロールと比較して1.0倍、5μmol/lで1.2倍、10μmol/lで1.1倍でありそれぞれ有意差は無く、RoscovitineによるTuj1ニューロン数の増加は認められなかった。従って、Kenpaulloneはニューロン新生促進作用を持ち、その作用はKenpaulloneのCDK阻害活性ではなくGSK−3阻害活性によるものであることが明らかとなった。
以上より、リチウム、SB−216763に限らず、GSK−3を阻害する活性を持つ化合物は、神経幹細胞のニューロン新生促進剤になるとともに、神経疾患の再生治療用医薬になることが示された。
実験例7:GSK−3β遺伝子高発現によるニューロン新生の抑制
アルツハイマー病患者の脳内でGSK−3βの高発現が認められることから[J.Neuropathol.Exp.Neurol.,56,70−78(1997)]、アルツハイマー病発症の原因とGSK−3βの関係を明らかにするため、成体神経幹細胞のニューロン分化に対するGSK−3β高発現の影響を、レトロウイルスベクターを用いて検討した。
まず、実験例2に記載したラット脳由来cDNAを鋳型として、野生型ラットGSK−3β遺伝子をコードするcDNAを以下のように調製した。2.5μlの鋳型cDNAに、3μlの配列番号10および11からなる10μmol/lのプライマーセット(プロリゴ社製)、5μlの10×PCR buffer for KOD−plus−、5μlの2mmol/l dNTPs、2μlの25mmol/l MgSO、1μlのKOD−plus−DNA polymerase(以上、東洋紡績社製)および31.5μlの滅菌水を加え、サーマルサイクラーを用いて94℃で2分間保温後、94℃で15秒間、60℃で30秒間、68℃で1分20秒間のサイクルを25サイクル繰り返し、cDNA断片を増幅させた。
一方、GSK−3βのキナーゼ活性を失う変異である85番目のリジン残基がアルギニン残基に変異した変異型ラットGSK−3β遺伝子[Proc.Nat.Acad.Sci.USA,92,8498−8502(1995)]をコードするcDNAを同様に以下のように調製した。
2.5μlの野生型ラットGSK−3β遺伝子をコードするcDNAを鋳型として、配列番号10および12からなるプライマーセットを用いて変異型ラットGSK−3βの5’末端側部分長cDNAを増幅させ、配列番号11および13からなるプライマーセットを用いて変異型ラットGSK−3βの3’末端側部分長cDNAを増幅させた。それぞれの部分長cDNAの混合物を鋳型として、配列番号10および11からなるプライマーセットを用いて変異型ラットGSK3βの完全長cDNAを増幅させた。
野生型および変異型それぞれの増幅反応液をフェノール/クロロホルム処理したのちエタノールを加えて沈殿させ、QIAquick PCR purification kit(キアゲン社製)で添付プロトコールに従って精製した。
続いて10μgのpCLNCXプラスミドベクター(IMGENEX社製)に10μlの10×Mバッファー、5μlのHindIII(タカラバイオ社製)を加え、滅菌水を加えて100μlとし、37℃で12時間反応させた。反応液をフェノール/クロロホルム処理した後エタノールを加えてDNAを沈殿させ、32μlの滅菌水に溶解した。該DNA溶液に4μlの10×Blunting buffer、4μlのKOD DNA polymeraseを加え、72℃で2分間反応させ平滑末端化した。反応液をフェノール/クロロホルム処理した後エタノールを加えてDNAを沈殿させ、43μlの滅菌水に溶解した後、5μlの10×Alkaline Phosphatase bufferおよび2μlのAlkaline Phosphatase(以上、タカラバイオ社製)を加え65℃で30分間反応させた。反応液をフェノール/クロロホルム処理したのちエタノールを加えてDNAを沈殿させ滅菌水に溶解した。
この切断したpCLNCXプラスミドベクター3μgに上記で調製した3μgの野生型または変異型のラットGSK−3β遺伝子をコードするcDNAを混合し滅菌水を加えて4μlとし、4μlのligation high(東洋紡績社製)を加え16℃で12時間反応させた。これをcoli DH5αコンピテントセル(タカラバイオ社製)にトランスフォーメーションした。定法によりアンピシリン耐性コロニーを液体LB培地で培養し、Endofree Plasmid Maxi Kit(キアゲン社製)を用いて添付プロトコールに従ってpCLNC−GSK3βプラスミドDNAおよびpCLNC−GSK3β(K85R)プラスミドDNAを調製した。
次に、以下のとおりウイルスベクターを作製し、ANSC−7細胞のニューロン分化に関わる機能を解析した。まず、pCLNC−GSK3β、pCLNC−GSK3β(K85R)、または陰性コントロールであるpCLNCXプラスミドベクターDNA15μgと、それぞれpMD.GプラスミドベクターDNA(米国ソーク研究所より分与)5μgを2mlのD−MEM high glucose培地(インビトロジェン社製)に溶解し、Transfast transfection reagent(プロメガ社製)を用いて添付プロトコールに従って、前日に用意した293gp細胞(米国ソーク研究所より分与)にトランスフェクションを行った。
トランスフェクションの3日後に、培養上清を0.45μmのフィルター(Millipore社製)でろ過し、ウイルスベクターを含む溶液を回収した。該ウイルスベクター溶液をポリアロマチューブ(日立工機製)に移し、超遠心機(日立工機製)を用いて50,000×g、18℃で90分間遠心分離した。上清を除去し、沈殿しているウイルスを1%のN2 supplementと20ng/mlのFGF−2と8μg/mlの臭化ヘキサジメトリン(シグマアルドリッチ社製)を含むDMEM/F12培地に懸濁した。実験例1に示した方法と同様の方法により、ポリオルニチンおよびラミニンでコートした12穴培養ディッシュに1穴当たり1.8×10個まいて一晩静置したANSC−7細胞から培養上清を除いて該ウイルス懸濁液を添加し、37℃、5%CO濃度のインキュベーター中で2時間培養して感染させた。続いて培養液を分化誘導培地に全量交換して分化誘導を開始し、実験例1と同様に分化誘導6日後のTuj1陽性ニューロン数を解析した。
その結果、陰性コントロールであるpCLNCXより作製したレトロウイルスを感染させ分化させたANSC−7細胞と比べ、pCLNC−GSK3βより作製したレトロウイルスを感染させGSK−3βを高発現させ分化させた細胞では新生ニューロン数が33%有意に減少した。一方、pCLNC−GSK3β(K85R)より作製したレトロウイルスを感染させキナーゼ活性を持たないGSK−3β(K85R)を高発現させ分化させた細胞では新生ニューロン数が野生型GSK−3βを高発現させた細胞より有意に34%多く、陰性コントロールであるpCLNCXより作製したレトロウイルスを感染させ分化させた場合と同程度であった。よってGSK−3βのキナーゼ活性によりニューロン新生が抑制されることが明らかとなった。
従って、アルツハイマー病は、GSK−3βの高発現による標的分子のリン酸化の促進によってニューロン新生が抑制されることにより脳の自己再生能が抑制され、発症する可能性が示され、GSK−3阻害剤が神経疾患、例えばアルツハイマー病の治療薬となり得ることが示された。
実験例8:会合型ベータアミロイドペプチドによるニューロン新生の抑制とGSK−3阻害剤による抑制の解除(1)
ベータアミロイドペプチド(以下、Aβと称す)は老人斑の主要構成成分であり、アルツハイマー病の原因であると考えられている物質である[Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,98,11039−11041(2001)]。Aβ[1−40](BIOSOURCE社製)を0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸(ナカライテスク社製)で10mg/mlになるように溶解し、25℃で1時間保温した後、PBSで0.5mg/mlに希釈した。25℃で24時間保温して会合体を形成させ[J.Biol.Chem.,276,42027−42034(2001)]、実験例1に示した方法と同様の方法によりANSC−7細胞の分化誘導時に終濃度0.1mg/mlになるように培地に添加し、陰性コントロールには同容量のPBSを添加した。分化誘導2日後、4日後にはそれぞれ分化誘導培地のみで全量培地交換し、分化誘導6日後のニューロン数を測定した。
その結果、Tuj1陽性ニューロン数は会合型Aβの添加により78%有意に減少した。従って、神経疾患の1つであるアルツハイマー病は、会合型Aβによりニューロン新生が抑制されることにより、脳の自己再生能が抑制され、発症する可能性が示された。
実験例9:会合型ベータアミロイドペプチドによるニューロン新生の抑制とGSK−3阻害剤による抑制の解除(2)
会合型Aβによるニューロン新生の抑制がアポトーシス促進による新生細胞数の減少によるものであるのか、またはニューロン分化の抑制によるものであるのかを明らかにするため、会合型AβのANSC−7細胞に対するアポトーシス促進効果を解析した。
実験例8と同様の方法により、終濃度0.1mg/mlの会合型Aβを含有する分化誘導培地により6日間分化誘導したANSC−7細胞とコントロールとしてPBSを含有する分化誘導培地により分化誘導したANSC−7細胞とを、in situ細胞死検出キット、フルオレセイン(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いて添付プロトコールどおり該細胞と反応させた。倒立型蛍光顕微鏡(ニコン社製)を用いて該細胞を観察し、2.44平方ミリメートルあたりのアポトーシス細胞数をカウントした。
その結果、アポトーシス陽性細胞数は会合型Aβ添加により14%増加したが有意差は無かったことから、会合型Aβによる新生ニューロン数の減少は、アポトーシス促進よりもニューロン分化の抑制により主に引き起こされることが明らかとなった。
実験例10:会合型ベータアミロイドペプチドによるニューロン新生の抑制とGSK−3阻害剤による抑制の解除(3)
実験例8と同様の方法により、終濃度0.1mg/mlの会合型Aβを含有する分化誘導培地でANSC−7細胞を分化誘導する際に、塩化リチウムを終濃度3mmol/l、またはKenpaulloneを終濃度2μmol/lになるように加え、分化誘導6日後のTuj1陽性ニューロン数を解析した。
その結果、塩化リチウムまたはKenpaulloneを加えることにより、Tuj1陽性ニューロン数が、会合型Aβのみと比較してそれぞれ73%、400%有意に増加した。
従って、GSK−3阻害剤は会合型Aβによるニューロン新生の抑制を解除する作用を持つことが明らかとなった。
以上より、GSK−3を選択的に阻害する活性を持つ化合物は、アルツハイマー病等の神経疾患の神経再生薬になること、および該化合物は神経幹細胞のニューロン新生促進剤になることが示された。
実験例11:GSK−3の阻害剤であるIndirubin−3’−monoximeによるニューロン新生促進
実験例1に示した方法と同様の方法により、GSK−3の阻害剤として報告されているIndirubin−3’−monoxime[J.Biol.Chem.,276,251−260(2001)、シグマアルドリッチ社製]を、1mmol/lになるようにDMSOに溶解し、培養液の1000分の1容量の該DMSO溶液を、ANSC−7細胞を含有する培地に添加し、分化誘導後6日目のTuj1陽性ニューロン数を解析した。陰性コントロールとして同容量のDMSOを添加した。その結果、終濃度1μmol/lのIndirubin−3’−monoximeの添加条件において、Tuj1陽性ニューロン数は陰性コントロールと比較して1.4倍に有意に増加した。従って、Indirubin−3’−monoximeはニューロン新生促進作用を持つことが明らかとなった。
以上より、リチウム、SB−216763、Kenpaulloneに限らず、GSK−3を阻害する活性を持つ化合物は、神経幹細胞のニューロン新生促進剤になるとともに、神経疾患の再生治療用医薬になることが示された。
実験例12:GSK−3に対する特異的なsiRNAによるニューロン新生促進
short interference RNA(siRNA)は遺伝子を特異的にノックダウンする[Nature,411,494−498(2001)]。成体神経幹細胞に発現するGSK−3を特異的に阻害することによりニューロン新生が促進できることをさらに明らかにするため、GSK−3βに対する特異的な化学合成siRNAをANSC−7細胞に導入し、ニューロン新生に対する効果を検討した。
まず、以下のとおりGSK−3βに対する2種の化学合成siRNAのANSC−7細胞でのノックダウン効果を検討した。ANSC−7細胞に対するsiRNAの導入はRat NSC NucleofectorTM Kit(Amaxa社製)を用いて行なった。1×10個のANSC−7細胞に対して150pmolの配列番号14および15からなる2重鎖siRNA−B1または配列番号16および17からなる2重鎖siRNA−B2(Dharmacon社製)を添付プロトコールに従って導入した。陰性コントロールとしてNon−specific Control Duplex IX(47% GC Content)siRNA(Dharmacon社製)を導入した。導入後直ちに5mlの分化誘導培地に懸濁し、ポリオルニチンおよびラミニンでコートした6センチ培養ディッシュに播種した。播種48時間後に細胞を1%のNonidet P−40、50mMのTris−HCl(pH7.4)、50mMのNaCl(以上、ナカライテスク社製)、10mlあたり一錠のCompletemini,EDTA free(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を含む水溶液に溶解して回収し、定法によりSDS−PAGE法で分離したのちウエスタンブロッティング法でGSK−3β量を検出した。検出にはGSK−3αおよびβを認識する抗GSK−3抗体(シグマ社製)を用いた。その結果、2種のGSK−3βに対するsiRNAを導入した細胞は両者とも陰性コントロールと比較してGSK−3β量が9割以上減少し、GSK−3α量は変化しなかったため、それぞれのsiRNAはGSK−3β特異的にノックダウンできることが明らかになった。
続いてそれら2種のsiRNAをANSC−7に導入後、直ちに1mlの分化誘導培地が入ったポリオルニチンおよびラミニンでコートした12穴培養ディッシュに1穴当たり1.8×10個まき、分化を誘導した。実験例1に示した方法と同様の方法により、分化誘導後6日目のTuj1陽性ニューロン数を解析した。その結果、Tuj1陽性ニューロン数はsiRNA−B1を導入した細胞では陰性コントロールと比較して2.5倍に増加し、siRNA−B2を導入した細胞では1.9倍に増加した。従って、GSK−3βに対するsiRNAはニューロン新生促進作用を持つことが明らかとなった。
以上より、GSK−3を阻害する活性を持つ化合物およびsiRNAを含む核酸は、神経幹細胞のニューロン新生促進剤になるとともに、神経疾患の再生治療用医薬になることが示された。
参考例1:3−(2,4−ジクロロフェニル)−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン(SB−216763)の合成工程1:3−インドールグリオキシル酸メチルエステルの合成
市販の3−インドールグリオキシル酸(9.55g)を塩化メチレン(300mL)に懸濁し、氷冷下、オキサリルクロリド(8.8mL)を加え、20℃で20時間攪拌した。反応液を氷冷し、メタノール(190mL)を加えた後、反応液を25℃で1時間攪拌した。反応液に水および塩化メチレンを加え、析出した結晶を濾取し、結晶を塩化メチレンで洗浄した。結晶を減圧乾燥し、3−インドールグリオキシル酸メチルエステル(7.07g、69%)を得た。
工程2:2−(1−メチルインドール−3−イル)−2−オキソ酢酸メチルエステルの合成
工程1で得られた3−インドールグリオキシル酸メチルエステル(5.88g)をN,N−ジメチルホルムアミド(180mL)に溶解し、0℃で攪拌しながら、水素化ナトリウム(60%オイル分散、1.4g)を少量ずつ加えた。反応混合物を1時間攪拌した後、ヨウ化メチル(1.2mL)を加え、20℃で20時間攪拌した。氷冷水を反応液に添加した後、1mol/L塩酸でpH値を5に調整した。析出した結晶を濾取し、水で洗浄した。結晶を減圧乾燥し、2−(1−メチルインドール−3−イル)−2−オキソ酢酸メチルエステル(1.96g、33%)を得た。
工程3:2,4−ジクロロフェニル酢酸アミド
市販の2,4−ジクロロフェニル酢酸(12.4g)を塩化メチレン(350mL)に溶解し、氷冷下、オキサリルクロリド(10.6mL)を加え、20℃で20時間攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を塩化メチレン(100mL)に溶解した。この溶液を氷冷した28%アンモニア水溶液(250mL)に滴下し、塩化メチレンを減圧留去した。析出した結晶を濾取し、水で洗浄した。結晶を減圧乾燥し、2,4−ジクロロフェニル酢酸アミド(11.14g、90%)を得た。
工程4:SB−216763の合成
tert−ブトキシカリウム(0.5g)をテトラヒドロフラン(35mL)に溶解し、氷冷下、工程2で得られた2−(1−メチルインドール−3−イル)−2−オキソ酢酸メチルエステル(0.4g)、次いで工程3で得られた2,4−ジクロロフェニル酢酸アミド(0.3g)を加え、同温度で3時間攪拌した。水を反応液に添加した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、結晶をエタノールで洗浄した。結晶を減圧乾燥し、SB−216763(390mg、70%)を得た。
H−NMR(CDCl)δ(ppm):3.89(s,3H),6.41(d,J=8.1Hz,1H),6.80(t,J=7.1Hz,1H),7.15(t,J=7.1Hz,1H),7.32−7.38(m,3H),7.49(s,1H),8.01(s,1H),10.94(s,1H)元素分析:理論値(C:61.5、H:3.3、N:7.6)、測定値(C:61.3、H:3.5、N:7.4)
参考例2:ラット脳からの成体神経幹細胞の単離と培養
7週齢のSprague Dawley ratをエテール麻酔によって眠らせた後に断頭し、頭頂部より頭蓋骨を切開して脳を摘出した。摘出した脳から脳室周囲部位を含む組織を顕微鏡下で眼科用のはさみとピンセットを用いて分離した。脳室周囲部位を含む組織は眼科用はさみとメスを用いて1mm程度の断片にした後、2.5U/mlのパパイン、250U/mlのDNase(いずれもWorthington,Freehold,NJ社製)、1u/mlの中性プロテアーゼ(Dispase:Boehringer Manheim社製)を含む5mlのHBSS緩衝液(Invitrogen社製)中で37℃、30分間消化反応を行なった。該反応により得られた細胞と組織の混合物を10%の胎仔牛血清(Hyclone社製)を含むDMEM(Invitrogen社製)で3回洗浄後、10%の胎仔牛血清を含むDMEMに溶解し、10μmのナイロンメッシュを用いて未消化物を除去した。
得られた細胞粗抽出液を、10cmの培養皿上で10%の胎仔牛血清を含むDMEM/F12培地(Invitrogen社製)を用いて37℃のインキュベーター中で1晩培養した。翌日、培地を1%のN2 supplement(Invitrogen社製)と20ng/mlのFGF−2(PeproTech社製)を含むDMEM/F12に置換して培養を開始した。3日に一度、培地の半分を新しい1%のN2 supplementと20ng/mlのFGF−2を含むDMEM/F12に置換し、培養を継続した。小型細胞の小さなコロニーが形成されたら1%のトリプシンで30秒から1分間程度処理し、剥がれた細胞を回収した。該細胞は、10μg/mlのポリオルニチン(シグマ社製)を用いて室温で一晩、および5μg/mlのマウスEHS腫瘍由来ラミニン(Becton Dickinson社製)を用いて37℃で一晩コートしたマルチ・ウエルの培養皿(Fisher Scientific社製)上に撒き、培養を継続した。上記培養を続けることで、小型の突起を有し、厚みのある小型細胞が濃縮された。本細胞を成体神経幹細胞株ANSC−7として上記の実験に使用した。
【発明を実施するための最良の形態】
実施例1:錠剤
常法により、次の組成からなる錠剤を調製する。
(1)処方 SB−216763 5mg
乳糖 62mg
馬鈴薯デンプン 30mg
ポリビニルアルコール 2mg
ステアリン酸マグネシウム 1mg
100mg
(2) Kenpaullone 5mg
乳糖 62mg
馬鈴薯デンプン 30mg
ポリビニルアルコール 2mg
ステアリン酸マグネシウム 1mg
100mg
(3) Indirubin−3’−monoxime 5mg
乳糖 62mg
馬鈴薯デンプン 30mg
ポリビニルアルコール 2mg
ステアリン酸マグネシウム 1mg
100mg
実施例2:神経幹細胞のニューロン新生促進剤(1)
常法により、塩化リチウムを3mol/lになるようにPBSに溶解し、塩化リチウムを含む神経幹細胞のニューロン新生促進剤を調製した。
実施例3:神経幹細胞のニューロン新生促進剤(2)
常法により、SB−216763、KenpaulloneまたはIndirubin−3’−monoximeを0.1mmol/lになるようにDMSOに溶解し、SB−216763、KenpaulloneまたはIndirubin−3’−monoximeを含む神経幹細胞のニューロン新生促進剤を調製した。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−3の活性を阻害する物質を有効成分として含有してなる神経再生薬、該物質を有効成分として含有してなる神経幹細胞のニューロン新生促進剤、該ニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養して得られるニューロンおよび該ニューロンの製造方法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
配列番号5−人工配列の説明:合成蛋白質
配列番号6−人工配列の説明:合成DNA
配列番号7−人工配列の説明:合成DNA
配列番号8−人工配列の説明:合成DNA
配列番号9−人工配列の説明:合成DNA
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配列番号13−人工配列の説明:合成DNA
配列番号14−人工配列の説明:合成RNA
配列番号15−人工配列の説明:合成RNA
配列番号16−人工配列の説明:合成RNA
配列番号17−人工配列の説明:合成RNA
【配列表】

























【特許請求の範囲】
【請求項1】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−3(以下、GSK−3と略す)の活性を阻害する物質を有効成分として含有してなる神経再生薬。
【請求項2】
神経再生薬が、神経疾患の治療薬である請求項1記載の医薬。
【請求項3】
神経疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ダウン症、脳血管障害、脳卒中、脊髄損傷、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、不安障害、統合失調症、うつ病および躁鬱病からなる群より選ばれる神経疾患である請求項2記載の医薬。
【請求項4】
GSK−3の活性を阻害する物質が、リチウムまたはその薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項5】
GSK−3の活性を阻害する物質が、ビスインドリルマレイミド誘導体、3−アリール−4−インドリルマレイミド誘導体、インドロカルバゾール誘導体、インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン誘導体もしくはインジルビン誘導体またはそれらの薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項6】
GSK−3の活性を阻害する物質が、式(I)

[式中、nおよびmは同一または異なって、1〜3の整数を表し、R、RおよびRは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、−COR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)、−COOR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)または−OR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)を表し、RおよびRは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール、カルボキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アミノまたはモノもしくはジ低級アルキルアミノを表し、nおよびmがそれぞれ2または3であるとき、それぞれのRおよびRは同一でも異なっていてもよい]で表される化合物、式(II)

(式中、na、ma、R1A、R2A、R3AおよびR5Aは、それぞれ前記n、m、R、R、RおよびRと同義である)で表される化合物もしくは式(III)

[式中、nb、mb、R1B、R2BおよびR5Bは、それぞれ前記n、m、R、RおよびRと同義であり、R3BおよびR4Bは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、−COR(式中、Rは前記と同義である)、−COOR(式中、Rは前記と同義である)または−OR(式中、Rは前記と同義である)を表すか、またはR3BとR4Bが一緒になって、

(式中、kは1または2を表し、XはCH、NH、酸素原子または硫黄原子を表し、Rはヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイルまたは低級アルコキシカルボニルを表す)を形成する]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項7】
GSK−3の活性を阻害する物質が、式(Ia)

(式中、R2aは水素原子、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、アリールまたはニトロを表し、R3aおよびR4aは同一または異なって、置換もしくは非置換の低級アルキルを表す)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項8】
GSK−3の活性を阻害する物質が、式(IIa)

(式中、maは前記と同義であり、R3Aaは置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、R5Aaはハロゲンを表す)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項9】
GSK−3の活性を阻害する物質が、式(IIIa)

(式中、Rは前記と同義である)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項10】
GSK−3の活性を阻害する物質が、3,4−ビス(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(1−メチルインドール−3−イル)−4−(1−プロピルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−シアノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−カルボキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−カルバモイルプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−プロピルオキシインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−フェニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−フェニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−メトキシカルボニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−ニトロインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(1−メチルインドール−3−イル)−4−[1−(3−ヒドロキシプロピル)−5−ニトロインドール−3−イル]−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2−クロロフェニル)−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2,4−ジクロロフェニル)−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2−クロロフェニル)−4−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−1H−ピロール−2,5−ジオン、4−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−3−(2−クロロフェニル)−1H−ピロール−2,5−ジオンおよび

からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項11】
GSK−3を阻害する物質が、式(IV)

[式中、Aは単結合または二重結合によって右に結合されている酸素または硫黄であり、R10は水素原子、アリール、低級脂肪族置換基、特にアルキルおよび低級アルキルエステルからなる群より選択され、R11〜R14はアルコキシ、アミノ、アシル、脂肪族置換基、特にアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、脂肪族ニトリル、特にアルキルニトリル、シアノ、ニトロ、カルボキシル、ハロゲン、水素原子、ヒドロキシル、イミノならびにα、β不飽和ケトンからなる群より個別に選択され、R15〜R18は脂肪族置換基、特にアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基、特に低級脂肪族置換基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、アルコキシ、アシル、シアノ、ニトロ、エポキシ、ハロアルキル基、ハロゲン、水素原子ならびにヒドロキシルからなる群より個別に選択され、R19は脂肪族の基、特に低級アルキル基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、カルボン酸、および水素からなる群より選択される]で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項12】
GSK−3を阻害する物質が、7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、10−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−4−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−4−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−チオン、9−ブロモ−5,12−ビス−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−12−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−5,7−ビス−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−5,7,12−トリ−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−ヒドロキシエチル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8,10−ジクロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、5−ベンジル−9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−12−エチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−プロペニル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−フルオロ−7,12−ジヒドロ−12−(2−プロペニル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2−(メチルイミノアミン)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2−(カルボン酸)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−10−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−11−ヒドロキシメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,3−ジメトキシ−9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,3−ジメトキシ−9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)プロピオニトリル、2−ブロモ−9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)アクリロニトリル、2−(3−ヒドロキシ−1−プロピニル)−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ヨード−9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−(3−オキソ−1−ブテニル)−9−トリフルオロメチル−7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−クロロ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、2−ヨード−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−メチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−[2−(1−ヒドロキシシクロヘキシル)エチニル]−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ヨード−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−エチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−メチル−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オンおよび3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)アクリル酸メチルエステルからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項13】
GSK−3を阻害する物質が、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、10−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−フルオロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−メチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−チオン、8,10−ジクロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−ヒドロキシエチル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンおよび7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項14】
9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項15】
9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項16】
GSK−3を阻害する物質が、式(V)

[式中、同じか異なってよいR20およびR25は水素原子;ハロゲン;ヒドロキシ基;メチレンヒドロキシ基;直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキルまたはアルコキシまたはメチレンアルコキシ基;必要に応じて1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個−炭素原子を有するシクロアルキル基;必要に応じて1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換のアリール、アラルキルまたはアリールオキシ基;それぞれ互いに独立に、直鎖または分枝鎖のアルキル基中に1から6個の炭素原子を有するモノ−、ジ−またはトリアルキルシリル基;それぞれ互いに独立に置換または非置換アリール基を有するモノ−、ジ−またはトリアリールシリル基;トリフルオロメチル基;−COM;−COOM;あるいは−CHCOOM基(ここでMは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび/またはアミノ基1個または複数で置換された直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキル基、または必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有し、1個または複数のハロゲン、アルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよいアリール基を表す);−NR3031基(ここで同じか異なってよいR30およびR31は水素原子、必要ならば付加的に1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されているC〜C18直鎖または分枝鎖アルキル基、置換または非置換で、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含むアリール基を表す);アシル基;−CH−NR3031メチレンアミノ基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);ベンゼン環が必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有するベンジル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する、炭素原子3から7個を有するメチレンシクロアルキル基;アミドとしての、窒素原子に結合した生理的アミノ酸基;グリコシドが単糖または二糖から選択されるO−グリコシドまたはN−グリコシド;あるいはメチレンスルホネート基を表し;同じか異なってよいR21、R22、R23、R24、R26、R27、R28およびR29は水素原子;ハロゲン;ヒドロキシ基;ニトロソ基;ニトロ基;アルコキシ基;必要ならば1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されている直鎖または分枝鎖のC〜C18アルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換のアリール基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換アラルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換アリールオキシ基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換メチレンアリールオキシ基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個の炭素原子を有するシクロアルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個の炭素原子を有するメチレンシクロアルキル基;トリフルオロメチル基;−COM;−COOM;またはCHCOOM基(ここでMは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび/またはアミノ基1個または複数で付加的に置換された直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキル基、または必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有し、1個または複数のハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよいアリール基を表す);−NR3031基(ここで同じか異なってよいR30およびR31は水素原子、必要ならば付加的に1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されている直鎖または分枝鎖C〜C18アルキル基、置換または非置換で、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含むアリール基、アシル基を表すか、窒素原子が、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、炭素原子3から7個を有するシクロアルキルの一部を形成する);−CONR3031基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);ヒドロキシルアミノ基;ホスフェート基;ホスホネート基;スルフェート基;スルホネート基;スルホンアミド基;−SONR3031基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);−N=N−R32アゾ基(ここでR32は必要ならば1個または複数のカルボキシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された芳香族基あるいはグリコシドが単糖または二糖から選択されているO−グリコシドまたはN−グリコシド基を表す)を表すか;R20およびR24ならびにR25およびR29はそれぞれ一緒になって、互いに独立に必要ならば置換された1から4個のCH基を有する環を形成し;同じか異なってよいYおよびZは酸素;イオウ;セレン;テルルの原子;NR33基(ここでR33は水素原子、必要ならば1個または複数のカルボキシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された直鎖または分枝鎖C〜C18アルキル基、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む置換または非置換のアリール基、アラルキル基またはスルホネート基を表す);あるいは−NOR33(ここでR33基は前記の意味を有する)を表す]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項17】
GSK−3を阻害する物質が、インジルビン、5−ヨード−インジルビン、5−ブロモ−インジルビン、5−クロロ−インジルビン、5−フルオロ−インジルビン、5−メチル−インジルビン、5−ニトロ−インジルビン、5−SOH−インジルビン、5’−ブロモ−インジルビン、5−5’−ジブロモ−インジルビンおよび5’−ブロモ−インジルビン5−スルホン酸からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項18】
GSK−3を阻害する物質が、インジルビン−3’−モノオキシム、5−ヨード−インジルビン−3’−モノオキシムおよび5−SONa−インジルビン−3’−モノオキシムからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項19】
GSK−3を阻害する物質が、インジルビン−3’−モノオキシムまたはその薬理学的に許容される塩である請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬。
【請求項20】
GSK−3の活性を阻害する物質を有効成分として含有してなる神経幹細胞のニューロン新生促進剤。
【請求項21】
GSK−3の活性を阻害する物質が、リチウムまたはその薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項22】
GSK−3の活性を阻害する物質が、ビスインドリルマレイミド誘導体、3−アリール−4−インドリルマレイミド誘導体、インドロカルバゾール誘導体もしくはインドロ[3,2d−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン誘導体またはそれらの薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項23】
GSK−3の活性を阻害する物質が、式(I)

[式中、nおよびmは同一または異なって、1〜3の整数を表し、R、RおよびRは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、−COR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)、−COOR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)または−OR(式中、Rは水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換のアリールまたは置換もしくは非置換のシクロアルキルを表す)を表し、RおよびRは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、置換もしくは非置換の低級アルコキシ、置換もしくは非置換の低級アルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリール、カルボキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、アミノまたはモノもしくはジ低級アルキルアミノを表し、nおよびmがそれぞれ2または3であるとき、それぞれのRおよびRは同一でも異なっていてもよい]で表される化合物、式(II)

(式中、na、ma、R1A、R2A、R3AおよびR5Aは、それぞれ前記n、m、R、R、RおよびRと同義である)で表される化合物もしくは式(III)

[式中、nb、mb、R1B、R2BおよびR5Bは、それぞれ前記n、m、R、RおよびRと同義であり、R3BおよびR4Bは同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置極の低級アルキル、置換もしくは非置換の低級アルケニル、−COR(式中、Rは前記と同義である)、−COOR(式中、Rは前記と同義である)または−OR(式中、Rは前記と同義である)を表すか、またはR3BとR4Bが一緒になって、

(式中、kは1または2を表し、XはCH、NH、酸素原子または硫黄原子を表し、Rはヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイルまたは低級アルコキシカルボニルを表す)を形成する]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項24】
GSK−3の活性を阻害する物質が、式(Ia)

(式中、R2aは水素原子、低級アルコキシ、低級アルコキシカルボニル、アリールまたはニトロを表し、R3aおよびR4aは同一または異なって、置換もしくは非置換の低級アルキルを表す)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項25】
GSK−3の活性を阻害する物質が、式(IIa)

(式中、maは前記と同義であり、R3Aaは置換もしくは非置換の低級アルキルを表し、R5Aaはハロゲンを表す)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項26】
GSK−3の活性を阻害する物質が、式(IIIa)

(式中、Rは前記と同義である)で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項27】
GSK−3の活性を阻害する物質が、3,4−ビス(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(1−メチルインドール−3−イル)−4−(1−プロピルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−シアノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−カルボキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−カルバモイルプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−プロピルオキシインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−フェニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−フェニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−メトキシカルボニルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−4−(1−メチル−5−ニトロインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(1−メチルインドール−3−イル)−4−[1−(3−ヒドロキシプロピル)−5−ニトロインドール−3−イル]−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2−クロロフェニル)−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2,4−ジクロロフェニル)−4−(1−メチルインドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン、3−(2−クロロフェニル)−4−[1−(3−ヒドロキシプロピル)インドール−3−イル]−1H−ピロール−2,5−ジオン、4−[1−(3−アミノプロピル)インドール−3−イル]−3−(2−クロロフェニル)−1H−ピロール−2,5−ジオンおよび

からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項28】
GSK−3を阻害する物質が、式(IV)

[式中、Aは単結合または二重結合によって右に結合されている酸素または硫黄であり、R10は水素原子、アリール、低級脂肪族置換基、特にアルキルおよび低級アルキルエステルからなる群より選択され、R11〜R14はアルコキシ、アミノ、アシル、脂肪族置換基、特にアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、脂肪族ニトリル、特にアルキルニトリル、シアノ、ニトロ、カルボキシル、ハロゲン、水素原子、ヒドロキシル、イミノならびにα、β不飽和ケトンからなる群より個別に選択され、R15〜R18は脂肪族置換基、特にアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基、特に低級脂肪族置換基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、アルコキシ、アシル、シアノ、ニトロ、エポキシ、ハロアルキル基、ハロゲン、水素原子ならびにヒドロキシルからなる群より個別に選択され、R19は脂肪族の基、特に低級アルキル基、脂肪族アルコール、特にアルキルアルコール、カルボン酸、および水素からなる群より選択される]で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項29】
7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、10−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−4−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−4−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−チオン、9−ブロモ−5,12−ビス−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−12−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−5,7−ビス−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−5,7,12−トリ−(t−ブチルオキシカルボニル)−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−ヒドロキシエチル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8,10−ジクロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、5−ベンジル−9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−12−エチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−プロペニル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−フルオロ−7,12−ジヒドロ−12−(2−プロペニル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2−(メチルイミノアミン)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2−(カルボン酸)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−10−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−11−ヒドロキシメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−4−ヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,3−ジメトキシ−9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,3−ジメトキシ−9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)プロピオニトリル、2−ブロモ−9−ニトロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)アクリロニトリル、2−(3−ヒドロキシ−1−プロピニル)−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ヨード−9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−(3−オキソ−1−ブテニル)−9−トリフルオロメチル−7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−クロロ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、2−ヨード−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−メチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−[2−(1−ヒドロキシシクロヘキシル)エチニル]−9−トリフルオロメチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ヨード−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−エチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−メチル−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オンおよび3−(6−オキソ−9−トリフルオロメチル−5,6,7,12−テトラヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−2−イル)アクリル酸メチルエステルからなる群より選択される、請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項30】
9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、10−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、11−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−フルオロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−メチル−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−チオン、8,10−ジクロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−(2−ヒドロキシエチル)−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジヒドロキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−12−メチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−5−メチルオキシカルボニルメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンおよび7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンからなる群より選択される、請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項31】
9−シアノ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2−ブロモ−7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−2,3−ジメトキシ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、2,9−ジブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−トリフルオロメチル−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、9−クロロ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オン、8−ブロモ−6,11−ジヒドロ−チエノ[3’,2’:2,3]アゼピノ[4,5−b]インドール−5(4H)−オン、7,12−ジヒドロ−9−メトキシ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンからなる群より選択される、請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項32】
9−ブロモ−7,12−ジヒドロ−インドロ[3,2−d][1]ベンズアゼピン−6(5H)−オンからなる群より選択される、請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項33】
GSK−3を阻害する物質が、式(V)

[式中、同じか異なってよいR20およびR25は水素原子;ハロゲン;ヒドロキシ基;メチレンヒドロキシ基;直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキルまたはアルコキシまたはメチレンアルコキシ基;必要に応じて1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個−炭素原子を有するシクロアルキル基;必要に応じて1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換のアリール、アラルキルまたはアリールオキシ基;それぞれ互いに独立に、直鎖または分枝鎖のアルキル基中に1から6個の炭素原子を有するモノ−、ジ−またはトリアルキルシリル基;それぞれ互いに独立に置換または非置換アリール基を有するモノ−、ジ−またはトリアリールシリル基;トリフルオロメチル基;−COM;−COOM;あるいは−CHCOOM基(ここでMは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび/またはアミノ基1個または複数で置換された直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキル基、または必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有し、1個または複数のハロゲン、アルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよいアリール基を表す);−NR3031基(ここで同じか異なってよいR30およびR31は水素原子、必要ならば付加的に1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されているC〜C18直鎖または分枝鎖アルキル基、置換または非置換で、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含むアリール基を表す);アシル基;−CH−NR3031メチレンアミノ基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);ベンゼン環が必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有するベンジル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する、炭素原子3から7個を有するメチレンシクロアルキル基;アミドとしての、窒素原子に結合した生理的アミノ酸基;グリコシドが単糖または二糖から選択されるO−グリコシドまたはN−グリコシド;あるいはメチレンスルホネート基を表し;同じか異なってよいR21、R22、R23、R24、R26、R27、R28およびR29は水素原子;ハロゲン;ヒドロキシ基;ニトロソ基;ニトロ基;アルコキシ基;必要ならば1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されている直鎖または分枝鎖のC〜C18アルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換のアリール基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換アラルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換アリールオキシ基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有する置換または非置換メチレンアリールオキシ基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個の炭素原子を有するシクロアルキル基;必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、3から7個の炭素原子を有するメチレンシクロアルキル基;トリフルオロメチル基;−COM;−COOM;またはCHCOOM基(ここでMは水素原子、必要ならばヒドロキシおよび/またはアミノ基1個または複数で付加的に置換された直鎖または分枝鎖のC〜C18−アルキル基、または必要ならば1個または複数のヘテロ原子を有し、1個または複数のハロゲン原子、アルキル基またはアルコキシ基で置換されていてよいアリール基を表す);−NR3031基(ここで同じか異なってよいR30およびR31は水素原子、必要ならば付加的に1個または複数のヒドロキシおよび/またはアミノ基で置換されている直鎖または分枝鎖C〜C18アルキル基、置換または非置換で、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含むアリール基、アシル基を表すか、窒素原子が、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む、炭素原子3から7個を有するシクロアルキルの一部を形成する);−CONR3031基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);ヒドロキシルアミノ基;ホスフェート基;ホスホネート基;スルフェート基;スルホネート基;スルホンアミド基;−SONR3031基(ここでR30およびR31は前記の意味を有する);−N=N−R32アゾ基(ここでR32は必要ならば1個または複数のカルボキシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された芳香族基あるいはグリコシドが単糖または二糖から選択されているO−グリコシドまたはN−グリコシド基を表す)を表すか;R20およびR24ならびにR25およびR29はそれぞれ一緒になって、互いに独立に必要ならば置換された1から4個のCH基を有する環を形成し;同じか異なってよいYおよびZは酸素;イオウ;セレン;テルルの原子;NR33基(ここでR33は水素原子、必要ならば1個または複数のカルボキシル、ホスホリルまたはスルホネート基で置換された直鎖または分枝鎖C〜C18アルキル基、必要ならば1個または複数のヘテロ原子を含む置換または非置換のアリール基、アラルキル基またはスルホネート基を表す);あるいは−NOR33(ここでR33基は前記の意味を有する)を表す]で表される化合物またはそれらの薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項34】
GSK−3を阻害する物質が、インジルビン、5−ヨード−インジルビン、5−ブロモ−インジルビン、5−クロロ−インジルビン、5−フルオロ−インジルビン、5−メチル−インジルビン、5−ニトロ−インジルビン、5−SOH−インジルビン、5’−ブロモ−インジルビン、5−5’−ジブロモ−インジルビンおよび5’−ブロモ−インジルビン5−スルホン酸からなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項35】
GSK−3を阻害する物質が、インジルビン−3’−モノオキシム、5−ヨード−インジルビン−3’−モノオキシムおよび5−SONa−インジルビン−3’−モノオキシムからなる群より選ばれる化合物またはその薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項36】
GSK−3を阻害する物質が、インジルビン−3’−モノオキシムまたはその薬理学的に許容される塩である請求項20記載のニューロン新生促進剤。
【請求項37】
請求項20〜36のいずれか1項に記載のニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養して得られるニューロン。
【請求項38】
請求項20〜36のいずれか1項に記載のニューロン新生促進剤の存在下、神経幹細胞を培養してニューロンを新生させ、培養物中よりニューロンを採取することを特徴とするニューロンの製造方法。
【請求項39】
GSK−3を阻害する物質を投与することを特徴とする神経再生方法。
【請求項40】
神経再生薬の製造のためのGSK−3を阻害する物質の使用。
【請求項41】
神経幹細胞のニューロン新生促進剤の製造のためのGSK−3を阻害する物質の使用。

【国際公開番号】WO2004/091663
【国際公開日】平成16年10月28日(2004.10.28)
【発行日】平成18年7月6日(2006.7.6)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2005−505483(P2005−505483)
【国際出願番号】PCT/JP2004/005503
【国際出願日】平成16年4月16日(2004.4.16)
【出願人】(000001029)協和醗酵工業株式会社 (276)
【Fターム(参考)】