神経幹細胞
【課題】細胞を対称的に分裂している自己再生状態に維持できる、大量の神経幹細胞を培養するための方法および条件を開発すること。
【解決手段】神経幹細胞の集団であって、該細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、集団。
【解決手段】神経幹細胞の集団であって、該細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞、ならびに幹細胞の対称分裂および自己再生を促進するための神経幹細胞（ＮＳ細胞またはＮＳＣ）の培養条件および培養方法に関する。組成物、細胞集団、細胞株、および単一の神経幹細胞もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
神経幹細胞は種々の供給源からインビトロで単離されるといわれているが、これまで、これらの細胞を対称分裂している未分化状態で大規模培養で増殖することはできなかった。この状態での細胞の長期の増殖が、実験的観点および治療的観点の両方から、非常に望ましい。純粋な神経幹細胞集団を有することにより、ニューロン、星状細胞、および乏突起膠細胞の３つの細胞型への方向付けられた分化が可能になる。
【０００３】
神経幹細胞を培養する１つの公知の方法は、不均質な細胞集団中の微量成分であるにも関わらず、神経球系である。この系は、不均質な細胞の凝集体の連続継代を包含するが、真の神経幹細胞はほんのわずかな割合でしかない。神経球中の細胞の大部分は、分化が方向付けられた前駆体である。
【０００４】
神経球の異質性および不安定性、ならびにそれがニューロンを生成する能力に制限があることの多くの報告がある（例えば、Morsheadら, 2002）。Rappaら Neuroscience 2003は、フィブロネクチン上にそれらを１〜７日間播種し、次いで神経球を再形成することにより神経球細胞をトランスフェクトするための方法を報告しているが、（ある場合には）神経球内の幹細胞のいかなる顕著な特徴づけも提供していない。
【０００５】
Suslovら 2002は、神経球系が、その中の任意の幹細胞の有意義な特徴づけを可能にするには不均質すぎることの明確なデータを提供している。主な結論は、神経球内の異質性がある−「クローン内神経細胞系統多様性を示す、すなわち、それらは、ＮＳＣに加えて、異なる分化状態のニューロンおよび膠細胞前駆体を含む」−だけでなく、異なるクローン神経球株間の遺伝子発現プロフィールに大きな差異が存在することである。Suslovの遺伝子発現プロファイリングは、「得られた分子表現型は、我々の系の中のクローン原性ＮＳＣが不均質であり、別個の神経発達方向の決定を反映しているサブセットを有することを示している」と論文中に明白に確認されているように、神経球内の幹細胞の定義を構成していない。
【０００６】
この分野における多くの文献は、膠細胞の特性を記載している。Skoghら MCN 2001は、ＧＦＡＰを発現しそしてＲＣ２およびネスチンに対して可変的に染色する膠細胞の培養物を記載している−マウスＧＦＡＰは、インビボにて放射神経膠で発現されていないことに留意されたい（Rakic, 2003）。彼らは、彼らの細胞が、神経原性放射神経膠のホールマークであるＰａｘ６を発現していないことを報告しており（Malatestaら, 2001, 2003）、そして彼らは、他の放射神経膠マーカーはどれも調べていない。彼らは、不均質な培養物を有していたが、クローン分析を実施しなかった。
【０００７】
インビトロでの放射神経膠の他の報告は、それらを分化の中間体または終末産物としてみなしている。したがって、Bibelら（Nat Neurosci, 2004）は、一過性放射神経膠様細胞を介するＥＳ細胞からのニューロンの生成を報告しており、そしてGreggおよびWeiss（J Neurosci, 23: 11587-601,2003; 米国特許公開２００３／００３２１８１）は、放射神経膠への神経球細胞の「分化」を記載している。Hartfussら（Dev Biol, 2001）は、放射神経膠が神経球に存在していることを示している。
【０００８】
GreggおよびWeissは、放射神経膠が神経球の分化産物であることを見出し、「これらの結果は、神経幹細胞がＲＧＣ［放射神経膠細胞］を生じ得ること、およびＲＧＣが導く移動は成体ＣＮＳにおいて繰り返され得ることを示唆している」と結論した。優勢な意見は、放射神経膠が、神経球から生じる分化した細胞型の１つであるというものである。
【０００９】
LiourおよびYu（Glia, 2003）は、放射神経膠細胞分化がＥＳ細胞から得られ得ることを示しているが、この分野の他の報告と同様に、神経原性放射神経膠の発現を報告していない。
【００１０】
Gobbelら Brain Res 2003は、「基材に緩く付着した増殖した細胞の球状塊としての」、すなわち、均一な単層としてではない、多分化能性ラット細胞の増殖を報告している。さらに、この論文の要約は、「これらの細胞は、３つの分裂のうち約２つにおいて分裂終了細胞を生じ、このため増殖を困難にしている」と結論している。それらの培養物中には広範囲の膠原性分化があるが、著者らは「比較的少ない」（＜３％）のニューロンを見出している。彼らは、彼らの細胞の分子表現型を提供していない。
【００１１】
ＷＯ０１／３０９８１は、ニューロンに分化し得る細胞の培養物を記載している。しかし、これらの細胞は、ＧＦＡＰおよびネスチンに対して陽性であり、星状膠細胞として記載され、そして比較的純粋でない混合集団である。
【００１２】
幹細胞が特定の細胞微環境、すなわちニッチを必要とするという概念は、幹細胞生物学において通説である。常に認められているわけではないが、神経球において、幹細胞は、前駆体、芽球細胞、および未熟分化子孫の中で総細胞のほんのわずかな割合しか占めていないことが知られている。この混合細胞型の凝集は、その中で小部分である、幹細胞であり得る細胞のためのニッチを構成し得る。
【００１３】
文献の中で、ＥＳ細胞から神経幹細胞の均質な集団を誘導するとの報告はなく、唯一、神経膠に制限されるようになる前に一過的に増殖され得る神経上皮前駆細胞を誘導するとの報告がある（例えば、Brustleら, Science 1999）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、当該分野には多数の課題が存在している。
【００１５】
全ての報告は、それらの培養物が不均質であることを認めている。対称的に分裂しかつ未分化の状態で神経幹細胞の大規模培養を維持するために、神経球系を使用することはできなかった。多数の神経幹細胞を培養する他の試みは、５〜２０継代を越えてはうまくいかず、また細胞が分化する傾向が高いことによって妨害されてきた。例外は、成体ラット海馬幹細胞における研究であるが、これらは、核型が異常であり、そして低い効率でニューロンを形成する。
【００１６】
一過性の神経発生前駆体が知られているが、永久または半永久の自己再生幹細胞は単離精製されていない。
【００１７】
ＥＳ細胞から神経幹細胞を誘導し、次いでこれらの神経幹細胞を純粋培養で維持することが望まれているが、これは、これまでできていない。また、移植のためにＥＳ細胞から神経幹細胞を誘導することも望まれているが、公知のＥＳ誘導細胞集団中のＥＳおよび他の非神経細胞の残存は、レシピエント動物に腫瘍を生じる。さらに、胎児および出生後ＣＮＳから純粋な神経幹集団を得ることが望まれている。
【００１８】
神経幹細胞の挙動を制御する分子および細胞事象の完全な理解は、胚発生の理解のための経路としてだけではなく、将来の治療適用のために神経幹細胞が単離され増殖されそして制御され得る枠組みとしてもまた、必須である。当該分野で公知の神経幹細胞の培養方法は、上記の理由のために、このような研究および治療適用に使用するには不適切である。したがって、細胞を対称的に分裂している自己再生状態に維持できる、大量の神経幹細胞を培養するための方法および条件を開発することが所望され得る。限定培地の使用は、臨床設定で非常に所望され得るので、上記要件を満たしている、限定した培養培地を有することが特に所望され得る。
【００１９】
本発明は、上記課題の１つ以上を解決する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
より詳細には、本発明は、神経幹（ＮＳ）細胞の対称分裂を促進する方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および
（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地で、該細胞を培養する工程
を含む。
【００２１】
好ましい実施態様では、細胞は、血清の不在下で、例えば、血清を含まずかつ血清抽出物を含まない培地で培養される。さらに、細胞は基材に付着されて、別の言い方をすれば、接着培養で、培養されることが好ましい。また、培養培地が、インスリンまたは細胞上のインスリンレセプターの別のアゴニストを含むことが好ましい。
【００２２】
本発明においては、用語「促進する」は、神経幹細胞を対称的に分裂している状態に維持することを包含すると理解される。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、多くの継代にわたって未分化状態での神経幹細胞の自己再生および対称分裂を支持する、および好ましくは促進する培養培地が提供される。この培地は、神経幹細胞の非対称分裂および分化を実質的に防ぐ。
【００２４】
本発明はさらに、本明細書中のプロトコルに詳細に記載されるように、神経幹細胞を得る方法を提供し、そしてさらに、このような方法により得られる細胞を提供する。
【００２５】
本発明はまた、神経細胞集団、組成物、細胞株、クローン原性細胞株、および単一の神経幹細胞を提供し、これらは、自己再生性の対称的に分裂している神経幹細胞を含む。
【００２６】
本発明のさらなる局面は、ＥＳ細胞から神経幹細胞への分化を促進するための方法、および自己再生性の対称的に分裂している実質的に未分化の状態で得られる神経幹細胞を維持するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｂ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｃ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｄ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｅ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｆ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｇ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図２Ａ】ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す。
【図２Ｂ】ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す。
【図２Ｃ】ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す。
【図３】ＮＳ細胞が成体脳内に取り込まれ分化することを示す。
【図４Ａ】ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。
【図４Ｂ】ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。
【図４Ｃ】ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。
【図５Ａ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【図５Ｂ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【図５Ｃ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【図５Ｄ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【図５Ｅ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（定義の節）
「神経幹細胞」
本明細書中で使用される用語「神経幹細胞」とは、ニューロンおよび神経膠の両方を生成する潜在能を維持しながら２０〜３０よりも多くの細胞分裂を受け得る細胞を記載している。好ましくは、該細胞は、４０より多くの、より好ましくは５０より多くの、最も好ましくは無制限のこのような細胞分裂を受け得る。
【００２９】
神経幹細胞は、対称的または非対称的のいずれかで分裂し得る。対称的に分裂している場合、神経幹細胞は、分裂して２つの娘神経幹細胞または２つの方向付けられた前駆体を形成する。しかし、他に記載されない限り、対称分裂とは、本明細書中では対称的な自己再生をいう。非対称的に分裂している場合、神経幹細胞は、分裂して１つの娘神経幹細胞と１つの方向付けられた前駆体（例えば、ニューロン前駆体または神経膠前駆体のいずれか）とを形成する。
【００３０】
本発明の神経幹細胞は、放射神経膠として記載され得、そして放射神経膠マーカーＲＣ２、３ＣＢ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、およびＰａｘ６の少なくとも１つ（および好ましくは全部）を発現することが示されている。好ましくは、本発明の神経幹細胞は、ＲＣ２、３ＣＢ２、およびＧＬＡＳＴを発現している。より好ましくは、細胞は、ＲＣ２、３ＣＢ２、ＧＬＡＳＴ、および、ＢＬＢＰもしくはＰａｘ−６の少なくとも１つを発現している。本発明の神経幹細胞はまた、それらが神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニンの少なくとも１つ（好ましくは全部）発現に対して陽性であり、そしてＯｃｔ−４またはＮａｎｏｇの少なくとも１つ（好ましくは両方）の発現に対して陰性であることでもまた特徴付けられ得る（実施例１〜３もまた参照のこと）。
【００３１】
本発明の神経幹細胞は、定義により多分化能性である、すなわち、それらは、多数の神経細胞型（例えば、ニューロン／神経膠）に分化し得る。以下の実施例は、本発明の方法に従って培養された神経幹細胞が、それらの潜在能を保持しており、そして全ての期待される細胞型に分化し得ることを確証している。
【００３２】
「神経幹細胞の供給源」
広範な種々の供給源から本発明の神経幹細胞を誘導することができる。例えば、神経幹細胞は、胚から直接、成体組織から、胎児組織から、または胚性幹（ＥＳ）細胞（野生型または遺伝子改変ＥＳ細胞のいずれか）から誘導され得る。好ましくは、本発明の神経幹細胞は、マウスもしくはヒトのＥＳ細胞から誘導されるか、またはマウスもしくはヒトの胎児細胞から誘導される。
【００３３】
本発明の神経幹細胞は、とりわけ、ヒト、霊長類、げっ歯類、および鳥類に由来し得る。好ましくは、神経幹細胞は、哺乳動物、特にマウス、ラット、およびヒトに由来する。
【００３４】
「ＥＧＦレセプターファミリー」
本明細書中で使用される用語「ＥＧＦレセプターファミリー」は、ＥＧＦシグナル伝達因子のファミリーによって活性化され得るレセプター（通常、ホモダイマーもしくはヘテロダイマーレセプター）のファミリーを記載している。レセプターは、４つの非常に相同性の高い膜貫通糖タンパク質ＥｒｂＢ−１（ＥＧＦ−Ｒとしても知られる）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、およびＥｒｂＢ−４のファミリーで構成される。
【００３５】
「ＥＧＦレセプター」というときは、ＥＧＦレセプターファミリーの任意のモノマーもしくはダイマーレセプター複合体を包含する。
【００３６】
各レセプターは、細胞外リガンド結合ドメイン、単一疎水性膜貫通ドメイン、および１型レセプターチロシンキナーゼ活性によってシグナル伝達の原因となる細胞質チロシンキナーゼドメインを有する。これらのレセプターのいずれかへのリガンドの結合は、レセプターの二量体化および自己リン酸化、続いて多数の細胞基質のリン酸化を生じ、種々の生物学的効果に至る。レセプターの二量体化は、レセプターリガンドおよび毒性環境刺激（例えば、ＵＶ照射）を含む種々の刺激によって引き起こされ得る。各ダイマーレセプターは、異なるＳＨ２含有エフェクタータンパク質を補充することによって別個のシグナル伝達経路を開始させる。例えば、ＥＧＦ−Ｒダイマーは、グアニンヌクレオチド放出因子ＳＯＳにカップリングされたアダプタータンパク質Ｇｒｂと複合体化し得る。Ｇｒｂ−ＳＯＳ複合体は、レセプター中のホスホチロシン部位に直接結合し得るか、またはＳｈｃを介して間接的に結合し得る。これらのタンパク質相互作用は、ＳＯＳをＲａｓに近接した位置にもたらし、Ｒａｓを活性化させる。このことは引き続き、ＥＲＫおよびＪＮＫのシグナル伝達経路を活性化させ、引き続き、遺伝子発現を調節する転写因子（例えば、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、およびＥｌｋ−１）を活性化させる。ＥＧＦレセプターはまた、ＰＬＣγシグナル伝達経路も活性化させ得る。
【００３７】
「ＦＧＦレセプター」
本明細書中で使用される用語「ＦＧＦレセプター」は、膜貫通ＦＧＦレセプターチロシンキナーゼのファミリーの任意のメンバーを記載している。これらのレセプターの４つの主要なイソ型ＦＧＦＲ１、２、３、および４が存在し、そしてそれらは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸（ＨＳ）系と密に関連して作用することが知られている。ＦＧＦレセプターというときは、ＦＧＦレセプターファミリーの任意のモノマーまたはダイマー（ホモもしくはヘテロダイマー）複合体を含む。
【００３８】
ＦＧＦレセプターと関連した細胞性シグナル伝達経路は、ＭＡＰキナーゼ経路、およびＰＬＣγ経路を含む。
【００３９】
「培養培地」
本発明で使用される培養培地は、好ましくは、必要に応じて付加成分が添加された基本培地を含む。
【００４０】
基本培地は、神経幹細胞のための炭素および／またはビタミンおよび／またはミネラルの必須供給源を供給する培地である。基本培地は、一般に、タンパク質を含まず、そしてそれ自身単独では神経幹細胞の自己再生／対称分裂を支持し得ない。
【００４１】
好ましくは、本発明で使用される培養培地は、例えば、血清および／またはフィーダー細胞のような非限定である成分、すなわち、その含有量が不明である成分、または未特定の非限定または変動のある因子を含み得る成分、を含まない。血清を含まずかつ血清抽出物を含まない、完全限定培地を用いる利点は、神経幹細胞の培養およびそれに続く操作のために、効率的かつ一貫したプロトコルが導かれ得ることである。
【００４２】
「培養表面」
本発明の全ての局面における神経幹細胞の培養のための代表的な表面は、細胞培養に有用であると当該分野で認識されている培養表面であり、そしてこれらには、プラスチック製表面、金属製表面、複合材製表面が含まれるが、通常は、広く市販されているプラスチック製組織培養プレートのような表面が用いられる。このようなプレートは、しばしば、直径数センチメートルである。スケールアップのために、このタイプのプレートは、ずっとより大きい直径で用いられ得、そして多くの繰り返しプレートユニットが用いられ得る。
【００４３】
培養表面は、通常には表面上にコーティングされた、細胞接着タンパク質をさらに含み得る。幹細胞上に存在するレセプターもしくは他の分子が、該タンパク質または他の細胞培養基材に結合し、そしてこれは、表面への接着を促進し、そして増殖を促進する。ゼラチンでコーティングしたプレートが特に好ましい。
【００４４】
本発明は、ＥＧＦレセプターのアゴニストまたはＥＧＦおよびＦＧＦ−２レセプターの両方のアゴニストを含む培地中の基材に付着した神経幹細胞の培養が、幹細胞の制限のない対称分裂を促進しそしてニューロン／神経膠へのそれらの分化を実質的に防ぐとの知見に基づく。
【００４５】
本発明の種々の局面を、ここに詳述する。
【００４６】
本発明の第一の局面は、神経幹（ＮＳ）細胞の対称分裂を促進する方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および
（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地で、該細胞を培養する工程
を含む。
【００４７】
本発明の別の方法は、神経幹細胞を得るために、以下の工程を含む：
（１）神経幹細胞を含む細胞の混合集団を得る工程；
（２）（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含む培地に該細胞を再播種する工程；
（３）該細胞を培養する工程；
（４）細胞の凝集体を回収する工程；
（５）（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含む培地に該細胞を再播種する工程；
（６）該細胞を培養する工程；
（７）（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含む培地に、単一細胞として細胞を再播種する工程。
【００４８】
この方法は、例えば、このようなマーカーの発現を、それらの分化した子孫でのその発現に比較して神経幹細胞で優先的に活性なプロモーターに連結させることにより、神経幹細胞特異的マーカーを発現している細胞について選択することが付加され得る。好ましくは、この方法は、６５％以下のコンフルエンスで、より好ましくは５５％以下のコンフルエンスで、特に５０％を下回るコンフルエンスで、細胞を継代させる工程を含む。
【００４９】
本発明の方法の他の好ましい特徴は、実施例９で本発明のプロトコルに記載される通りである。
【００５０】
本発明の培養物は、好ましくは、接着培養であり、すなわち細胞が基材に付着されている。
【００５１】
基材は、代表的には、培養容器または別の物理的支持体での表面、例えば、培養ディッシュ、フラスコ、ビーズ、もしくは他のキャリアでの表面である。好ましくは、基材は、細胞の接着性を向上させるためにコーティングされていおり、そして適切なコーティングには、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチン、およびゼラチンが含まれる。細胞が、単層培養で増殖し、懸濁中で増殖せず、細胞のボールもしくは塊として増殖しないこともまた好ましい。より高い密度では、細胞は、互いに積み重なり始め得るが、培養物は、基材に付着されて、本質的に単層であるかまたは単層として開始する。
【００５２】
ＥＧＦファミリーのレセプターから下流の１つ以上のシグナル伝達経路は、好ましくは、ＥＧＦファミリーのレセプターのアゴニストを用いて活性化され得る。ＥＧＦファミリーのレセプターのアゴニストは、適切には、シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーのメンバーであり、そして好ましくは、ＥＧＦレセプターの細胞外ドメインに結合する。用語「アゴニスト」はまた、シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーに対する模倣物、融合タンパク質、抗体、シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーのキメラ、ならびにそれらのフラグメント、改変体および誘導体も包含し、これらは、ＥＧＦファミリーのレセプターを活性化し得る。
【００５３】
シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーを構成する分子は、それらが少なくとも１つのＥＧＦ様ドメインを含む点で特徴付けられ得る。このドメインは、ジスルフィド結合の形成を通して３つのペプチドループを生じる６つのシステイン残基によって定義され得る。
【００５４】
ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターを通して作用し得そしてこれらのレセプターの下流の経路を活性化し得る特定のアゴニストとしては、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、エピレグリン、ベータセルリン、ニューレグリン１〜４、およびＣｒｉｐｔｏ−１が挙げられる。好ましくは、アゴニストは、ＥＧＦそれ自体である。
【００５５】
ＦＧＦのレセプターから下流の１つ以上のシグナル伝達経路は、好ましくは、ＦＧＦのレセプターのアゴニストを用いて活性化され得る。ＦＧＦのレセプターのアゴニストは、適切には、シグナル伝達因子のＦＧＦファミリーのメンバーである。用語「アゴニスト」はまた、シグナル伝達因子のＦＧＦファミリーに対する模倣物、融合タンパク質、抗体、シグナル伝達因子のＦＧＦファミリーのキメラ、ならびにそれらのフラグメント、改変体および誘導体も包含すると意図され、これらは、ＦＧＦのレセプターを活性化し得る。
【００５６】
好ましくは、ＦＧＦレセプターのアゴニストは、ＦＧＦ−２またはラミニン−ＦＧＦである。
【００５７】
ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターまたはＦＧＦレセプターのいずれかの下流のシグナル伝達経路の活性化はまた、構成的に活性なレセプターによって、またはそれぞれのシグナル伝達経路の下流のエフェクター（例えば、ＭＥＫもしくはＢｃｌ２）によっても引き起こされ得ることが理解される。本発明の特に好ましい実施態様では、シグナル伝達経路は、細胞透過性小分子によって活性化される。これは、それぞれのレセプターを迂回し、シグナル伝達経路を直接活性化し得る。したがって、本発明では、用語「アクチベーター」は、ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターまたはＦＧＦレセプターの下流のシグナル伝達経路を活性化し得る全ての分子を包含する。
【００５８】
本発明の神経幹細胞培養物の維持におけるアクチベーターの有効性は、以下の実施例１−１および１−２において実証されている。ここでは、神経幹細胞のバルクおよびクローン集団が、ＥＧＦおよびＦＧＦ−２を含む培地で維持され、そして多数回継代され得る。さらに、試験した細胞集団中では神経幹細胞マーカーが至るところに存在することによって示されるように、神経幹細胞の分化は無視し得る程度であるか全く存在しない（実施例１−３を参照のこと）。そしてそれらはそれらの潜在能を保持し、全ての期待される細胞型に分化し得る（実施例１−４を参照のこと）。
【００５９】
したがって、本発明は、自己再生性の対称的に分裂している未分化状態で神経幹細胞の大きな集団を維持する効率的な方法を提供する。本発明の組成物は、神経幹細胞を含む組成物であって、神経幹細胞が接着培養中にあり、そして組成物中の細胞の少なくとも５０％、７０％、または８０％が神経幹細胞である組成物を包含する。神経幹細胞の割合は、さらに好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、非常に好ましくは少なくとも９７％である。さらに、本発明の神経幹細胞は、大いに継代され得る。神経幹細胞は、少なくとも３０回、より好ましくは少なくとも６０回、非常に好ましくは少なくとも９０回継代されていることが好ましい。なおさらに、本発明の神経細胞の集団では、該細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である。この組成物中の細胞は、単独または組み合わせて、本発明の任意の特徴および全部の特徴によってさらに特徴付けられ得る。
【００６０】
組成物もまた提供され、この組成物は、
神経幹細胞；
ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および
ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む。
【００６１】
組成物は、好ましくは、基本培地を含む。また、組成物中の神経幹細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞であることが好ましい。
【００６２】
上記神経細胞集団および組成物の両方において、神経幹細胞は、好ましくは、オンコジーンをコードする外因性遺伝物質を含まない。すなわち、それらは、不死化ストラテジーを受けていない。特定の実施態様では、集団／組成物の神経幹細胞は、それらが、
神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン；
Ｓｏｘ−２；
放射神経膠細胞特異的マーカーのＲＣ２、３ＣＢ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、もしくはＰａｘ−６；
ルイスＸ抗原；
ムサシ−１；および
プロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であり、そして
Ｏｃｔ４、および
Ｎａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている。
【００６３】
好ましくは、細胞は、ＲＣ２、３ＣＢ２、およびＧＬＡＳＴの発現に対して陽性である。他の実施態様では（必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）、細胞は、ＢＬＢＰ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニンの少なくとも１つの発現に対して陽性である。特に好ましい実施態様では（そして必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）、細胞は、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇの少なくとも１つの発現に対して陰性である。
【００６４】
さらなる実施態様では（必要に応じて上のマーカープロフィールに加え）、細胞は、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して陰性である。マウス由来ＮＳ細胞を含む特定の組成物／集団では、細胞の１％以下が、ＧＦＡＰまたはβIIIチューブリンの発現に対して陽性であり、それにより星状細胞またはニューロンへの細胞の分化が無視し得る程度であることが確認される。他の組成物／集団では、細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である。
【００６５】
本発明はまた、ラット細胞を用いて実施された。したがって、本発明者らは、ラットＣＮＳから細胞を採取し、そして本発明の方法を用いて、ラット神経幹細胞の培養物を得た。ラット神経幹細胞は、（ｉ）高純度、代表的には８０％または９０％を超えるラット神経幹細胞、および（ii）多数回の倍加、５０を超える、１００を超える、さらに２００を超える倍加後に、その高割合（最少で５０％）がニューロンおよび神経膠を形成する能力を保持している細胞であるとの特性を有する。当該分野では、ラット由来の細胞は、明らかに非常に不均質であり、成体海馬からのみであった。本発明者らは、この供給源から細胞を得ずに、代わりにラットＣＮＳから得た。この点において、本発明の方法は、３種（ラット、マウス、ヒト）の全てにわたって有効であったことが注目に値する。本発明の方法に従って、単一の細胞が、神経幹細胞コロニーを形成すれば、ニューロンがそのコロニー中の細胞から得られ得ることが一般に理解される。これは、例えば、（ｉ）核に対して（すなわち、全ての細胞を染色）および（ii）ニューロンに対して（すなわち、ニューロンのみ）個別に染色することによって測定される。染色された細胞の相対数を比較することにより、ニューロンを形成する細胞の割合が算定され得る。
【００６６】
本発明の第二の局面は、神経幹細胞の調製のための方法を提供し、この方法は、（ｉ）上記の方法に従って神経幹細胞を培養し、それによって神経幹細胞の培養物を得る工程、および（ii）該培養物から神経幹細胞を単離する工程を含む。好ましくは、単離された神経幹細胞は、対称的な様式で分裂するように条件付けられた細胞である。
【００６７】
多数の細胞供給源が用いられ得、そこから神経幹細胞が誘導される。１つの方法では、細胞は、動物の神経組織から得られ、そして本発明に従って培養され、対称的に分裂している神経幹細胞の培養物が得られる。神経組織は、成体または胎児の組織に由来し得る。神経組織は、ＣＮＳに由来し得、そして神経幹細胞の対称分裂集団は、ヒトおよびマウスの両方からの成体および胎児の両方のＣＮＳから採取された抽出物から得られ得る。神経組織は、好ましくは、放射神経膠表現型を有すると同定された細胞を含む。例えば、この表現型を有する細胞は、小脳および網膜からの抽出物で同定されており、その両方ともが、適切なさらなる細胞供給源を表す。神経幹細胞は、疾患のモデリングに有用な罹患神経組織から得られ得、例えば、細胞は、この目的で脳腫瘍から得られ得る。
【００６８】
本発明を使用する選択肢には、罹患個体から神経幹細胞を誘導し、次いで（ｉ）アッセイのためにこれらの細胞を使用するか、または（ii）その個体に細胞を戻す移植の前に遺伝子改変を実施することがある。したがって、神経変性障害（例はアルツハイマー病およびパーキンソン病を含む）；または脳腫瘍を有する個体から、細胞が得られ得る。
【００６９】
神経幹細胞を得る別の方法は、
（ｉ）神経幹細胞に分化し得る多分化能性もしくは分化多能性幹細胞を得る工程、
（ii）（ｉ）の細胞を、分化多能性細胞に対して非許容性である培地でそして（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストおよび（ｂ）ＦＧＦファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストの存在下で培養する工程
を含む。
【００７０】
使用に際して、混入している可能性のあるＥＳ細胞が、この方法によって除去されるか、または少なくとも実質的に数が減少され、より純粋でかつ移植の際に奇形腫を生じる可能性がより少ない培養物が得られる。
【００７１】
幹細胞は、適切には分化多能性幹細胞であり、特にＥＳまたはＥＧ細胞である。方法は、好ましくは、ＥＧＦレセプターのアゴニストおよびＦＧＦレセプターのアゴニストの存在下で細胞を培養する工程を含む。
【００７２】
本発明のＮＳ細胞を用いて、本発明者らは、ＥＧＦおよびＦＧＦを除去しそして血清またはＢＭＰ４を添加することによって星状細胞を得、本発明者らは、ＥＧＦを除去し、次いで約１週間おいた後にＦＧＦを除去し、そしてラミニン上に細胞を播種することによってニューロンを得、そして本発明者らは、ＥＧＦおよびＦＧＦを両方とも除去することによって乏突起膠細胞を得た。一般に、神経幹細胞を生成するために使用される本発明の方法は全て、必要に応じて、神経幹細胞をニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞に分化する工程、および次いでさらに必要に応じて（例えば、アッセイで、移植のために、またはそれ以外に）、ニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞を用いる工程をさらに含む。
【００７３】
神経幹細胞培養物が単離されると、次いで、それは、神経幹細胞株を樹立するために使用され得る。このような細胞株の樹立は、好ましくは、
（ａ）単一の神経幹細胞を得る工程、
（ｂ）前記の方法のいずれかに従って神経幹細胞を培養する工程
を含み、それによって、神経幹細胞のクローン集団を得る。
【００７４】
特定の実施態様では、細胞株を樹立するために使用される単一の神経幹細胞は、対称的に分裂している神経幹細胞、または対称的な様式で分裂するように条件付けられた神経幹細胞である。好ましくは、単一の神経幹細胞は、神経幹細胞を調製するために、上記の方法に従って得られる。
【００７５】
好ましい実施態様では、上記の方法によって得られる神経幹細胞株は、神経幹細胞のクローン集団（すなわち、その中の細胞の全てが単一の神経幹細胞の子孫である）である。
【００７６】
単一の神経幹細胞および細胞株（必要に応じて上記の方法によって得られ得る）もまた、本発明の一部を形成する。第一の実施態様では、細胞株が提供され、そこでは細胞が、ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアクチベーター、およびＦＧＦレセプターの下流のシグナル伝達経路のアクチベーターの存在下で維持されている。他の実施態様では、単一の神経幹細胞および細胞株の細胞は、それらが、
神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン；
Ｓｏｘ−２；
放射神経膠細胞特異的マーカーであるＲＣ２、３ＣＢ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、もしくはＰａｘ−６；
ルイスＸ抗原；
ムサシ−１；および
プロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であり、そしてそれらが、
Ｏｃｔ４、および
Ｎａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている。
【００７７】
好ましくは、細胞は、ＲＣ２、３ＣＢ２、およびＧＬＡＳＴの発現に対して陽性である。他の実施態様では、（必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）細胞は、ＢＬＢＰ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニンの少なくとも１つの発現に対して陽性である。特に好ましい実施態様（そして必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）細胞は、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇの少なくとも１つの発現に対して陰性である。
【００７８】
他の特定の実施態様では、（必要に応じて上のマーカープロフィールに加え）細胞は、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して陰性である。特定のマウス由来細胞株では、細胞の１％以下が、ＧＦＡＰまたはβIIIチューブリンの発現に対して陽性である。他の（例えば、ヒト）細胞株では、細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である。
【００７９】
単一の神経幹細胞および細胞株の細胞の両方とも、オンコジーンをコードする外因性遺伝物質を含まないこと、すなわち、それらは、不死化ストラテジーを受けていないことが好ましい。記載の細胞株が、神経幹細胞株であることも好ましい。
【００８０】
第三の局面では、本発明は、対称的に分裂している神経幹細胞のトランスフェクトされた集団を得てこれを維持する方法を提供し、この方法は、
（ａ）選択マーカーＡをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程であって、使用に際して、該選択マーカーが、神経前駆細胞特異的プロモーターの制御下で発現される、工程；
（ｂ）該ＥＳ細胞の神経前駆細胞への分化を促進する工程；
（ｃ）該選択マーカーＡを発現している神経前駆細胞について選択する工程；および
（ｄ）該選択された細胞を、前に記載の方法のいずれかに従って培養する工程
を含む。
【００８１】
選択マーカーＡは、抗生物質耐性、細胞表面マーカー、または例えばＥＰ−Ａ−０６９５３５１に記載されるような別の選択マーカーをコードし得る。神経前駆細胞特異的プロモーターは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、ＢＬＢＰ、およびネスチン神経エンハンサーからなる群から選択され得る。この選択ストラテジーのさらなる詳細を、実施例１−１に示す。
【００８２】
本発明の神経幹細胞（すなわち、本発明の単一の神経幹細胞ならびに組成物、細胞株、および集団中に存在する神経幹細胞）は、遺伝子改変され得る。したがって、本発明の神経幹細胞をトランスフェクトする方法が提供され、この方法は、
（ａ）選択マーカーＢおよびポリペプチドをコードする構築物で神経幹細胞をトランスフェクトする工程；および
（ｂ）該選択マーカーＢを発現する神経幹細胞について選択する工程
を含む。
【００８３】
選択マーカーＢは、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードし得、そして選択マーカーＡと同じかまたは異なり得る。適切なトランスフェクション方法は、公知の方法であり、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション（necleofection）、およびレトロウイルストランスフェクションおよびレンチウイルストランスフェクションが含まれる。
【００８４】
遺伝子改変神経幹細胞もまた本発明の一部を形成し、したがって、本発明は、この構築物をさらに含む、本発明の単一の神経幹細胞または組成物、集団、もしくは細胞株中に存在するような神経幹細胞を提供する。このような神経幹細胞は、選択マーカーＢに加え、選択マーカーＡをすでに含み得ることが理解される。
【００８５】
前記のように、本発明の方法は、任意の供給源から誘導された神経幹細胞との使用に適している。１つの特定の実施態様では、本発明は、ＥＳ細胞の供給源から神経幹細胞を得るための方法を提供する。この方法によれば、例えば単層での培養または胚様体分化により、ＥＳ細胞を神経前駆体に転換し、次いでＮＳＡ培地中で該神経前駆体を培養することにより、ＥＳ細胞の神経幹細胞への分化が促進される。さらに、ＮＳＡ培地は、付加成分（例えば、付加グルコースおよびＨＥＰＥＳ）を含み得ることが意図される。代替として、グルコースおよびＨＥＰＥＳが付加された培地（好ましくは基本培地）もまた、この分化を促進するために使用され得る。
【００８６】
ＮＳＡおよび／またはグルコースおよびＨＥＰＥＳの存在下で、条件は、神経幹細胞の増殖が好まれるような条件であり、培養物中に存在するいかなる非神経細胞もが優先的に死滅するという利点が付加される。このことは、実質的に純粋な神経幹細胞培養物（例えば、存在する全細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％）を生じる。実施例１−５は、この方法の更なる詳細を提供する。
【００８７】
好ましい実施態様では、実施例１−５の方法は、対称的に分裂している神経幹細胞の集団を調製するために使用され得る。引き続き、集団は、上記の本発明の培養方法のいずれかを用いて維持される。
【００８８】
実施例１−５の方法はまた、神経幹細胞へのＥＳ細胞の分化に関する因子の効果についてアッセイするために使用され得る。好ましいアッセイ実施態様では、ＥＳ細胞が、試験される因子の存在下で、実施例１−５に記載の方法を用いて培養される。因子の効果は、例えば、得られた細胞のマーカープロフィールを決定する、すなわち、細胞が、本発明の細胞と同様のマーカープロフィールを有するか、またはＥＳマーカープロフィールが維持されているかを示すことにより、評価され得る。試験される因子は、誘導因子またはブロッキング因子のいずれでもあり得る。
【００８９】
神経性疾患および神経変性疾患、および脳損傷の治療において、特に、パーキンソン病およびアルツハイマー病、多発性硬化症、および筋萎縮性側索硬化症のような疾患の治療において、神経幹細胞の使用に大きな関心がある。本発明の方法、組成物、細胞集団、細胞株、および単一の細胞は全て、このような治療において、ならびにこのような治療のための調製物の製造において、用いられ得る。本発明を用いて治療され得る特定の神経性／神経変性疾患としては、以下が挙げられる：パーキンソン病、運動ニューロン疾患、卒中、多発性硬化症、およびハンチントン病。
【００９０】
したがって、第５の局面では、本発明は、細胞療法のため、および神経変性疾患および脳損傷の治療用組成物の製造のための、上に記載の細胞株、神経細胞集団、単一の神経細胞、および組成物の使用を提供する。このような調製物は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に処方され得る。
【００９１】
上に列挙した疾患の治療の方法は、本発明の単一の細胞、細胞株、組成物、または細胞集団の患者への移植を含み得る。好ましくは、患者は哺乳動物であり、より好ましくは、患者はヒトである。このような移植は、胚および成体の両ＣＮＳでの成功が示されており、そして実施例１−６に詳細に記載している。
【００９２】
本発明の細胞、および特に細胞株は、神経幹細胞の分化に関する誘導因子またはブロッキング因子の効果をアッセイするために使用され得る。このようなアッセイは、本発明の神経幹細胞（すなわち、組成物、細胞株、および集団中に存在する細胞、または単一の神経幹細胞）と、試験される因子とを接触させる工程を含み得る。神経幹細胞の分化に関する因子の効果は、適切には、得られた細胞のマーカープロフィールを決定する、すなわち、細胞が、本発明の細胞と同様のマーカープロフィールを有するか、またはこれらのマーカーが失われたかを示すことにより、評価され得る。本発明の細胞はまた、薬剤をアッセイするのにも適している。
【００９３】
ニューロンまたは神経膠を形成する細胞の割合を評価するために、細胞をクローン増殖する。細胞が個々に播種されると全ての細胞がクローンコロニーを形成するわけではないが、クローンコロニーを形成するもののうち一般には５０％以上が、ニューロン（適切なプロトコル下で）または神経膠（再度、適切なプロトコル下で）をつくる。これらの細胞は、従来技術から区別される。従来技術は、神経幹細胞特性を有する細胞の同定およびその増殖さえも議論しているが、それらの集団は非常に不均質であったからである。これは、重要な相違である。純粋でない集団は、残りの神経幹細胞にシグナル伝達を提供する細胞を含むからであり、このことは、分化を刺激しそしてさらには神経幹細胞の割合を減少させる。先行技術の方法は、個々の細胞から神経球を生成し得るが、本発明は、個々の細胞から実質的に純粋な集団の生成を可能にしている。
【００９４】
本発明の特定の実施態様（以下の実施例により詳細に記載する）では、全てのＮＳ細胞コロニーが、１５％以上、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは約２０〜３０％のＴｕＪ陽性ニューロンを生成している。より高い密度の培養で、本発明者らは、ＴｕＪ陽性細胞を計数した。ＬＣ１ ＮＳ細胞の３５％がニューロン形態を獲得し、そして１年よりも長い連続培養である１１５継代後にもβIIIチューブリンを発現していた。これらの細胞は、この期で二倍体核型を保持していた。ＬＣ１は、クローン化されていない集団である。したがって、データは、神経膠に制限された前駆体または遺伝的形質転換に対する選択圧が最小限であったことを示している。
【００９５】
本発明の細胞は、異種細胞と共培養することなくかつ非限定の条件培地、細胞外マトリックス画分または血清を用いることなく増殖され得、これは、ＥＳ細胞以外の幹細胞のタイプについて以前に示されていない特徴である。したがって、本発明によれば、神経幹細胞が、好ましくは、規定された条件で均質な培養で増殖される。マイクロウェル中に単離された単一のＮＳＣでさえも増殖し得、このことは、ＥＧＦおよびＦＧＦ以外の細胞外シグナルへの依存が最小限であること、およびインビトロでは、ＮＳＣにとって必須の外的自己再生シグナルが、ＥＧＦおよびＦＧＦに対して減少され得ることを示している。
【００９６】
実施例により詳細に示したさらなる実施態様では、実質的に全てのコロニー（播種している単一の細胞から発達したコロニーの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％）が、（ｉ）ＦＧＦ＋ＥＧＦにおいて神経前駆体マーカーの同一の均質な発現と分化マーカーの不在とを示し、そして（ii）増殖因子の除去に際してニューロンを生成している。特定の実施例では、全てのコロニーがこれらの特性を有していた。これは、対称的な自己再生の証拠である。さらに、非クローンＮＳ細胞培養物におけるコロニーアッセイからのデータは、クローンＮＳ５株由来のデータと比較可能であった。ＮＳ５からの増殖可能な未分化のコロニーの連続的な形成は、クローン原性細胞が幹細胞であること、およびそれらの数がＮＳ集団と比例して増大していることを示している。形式的に、幹細胞数の増加は、２つの機構を介して生じ得る：デノボ生成または対称的な自己再生分裂。前者は、前幹細胞供給源、すなわち、分化多能性細胞または胎児原基を必要とし、それらのいずれも、本明細書中のＮＳ細胞培養物中には存在しない。そこで、対称的な自己再生がＮＳ細胞培養で生じていなければならない。
【００９７】
以下の実施例で得られた特定のＮＳ細胞は、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、Ｅｍｘ２、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ネスチン、ＢＬＢＰ、ＧＬＡＳＴ、ビメンチンを発現し、そしてＲＣ２、３ＣＢ２、ＳＳＥＡ−１、およびプロミニンに対して免疫反応性である。好ましくは、それらは、Ｓｏｘ１を発現せず、そしてＧＦＡＰおよびニューロン抗原に対して陰性である。これらのＮＳ細胞は、分化多能性マーカーおよび他の胚葉のマーカーを欠く。本発明者らは、ＥＳ細胞での場合と同様に、神経幹細胞の特徴がＣＮＳ発生の間でマスクされており、エクスビボでのみ真に実証可能であることを主張する。Ｓｏｘ１発現がＮＳ細胞で維持されなかったという知見は、新規で予期されないものであり、そしてＳｏｘ１を用いる連続的な系統選択は実りあるものではないことを示している。
【００９８】
本発明のさらなる実施態様では、ＥＳ細胞由来非クローン化（ＣＧＲ８−ＮＳ）およびクローン化（ＮＳ５）ＮＳ株および胎児皮質由来非クローン化（Ｃｏｒ１）およびクローン化（Ｃｏｒ１−３）ＮＳ株により例証されるＮＳ細胞は、培養物中に放射神経膠マーカー３ＣＢ２、ＢＬＢＰ、ＧＬＡＳＴ、ネスチン、ＲＣ２、およびビメンチンの発現を示している。ＧＦＡＰの発現は、これらの培養物のいずれにおいても、好ましくは細胞の１０％未満、より好ましくは５％未満、特に２％未満である。特定の実施例では、ＧＦＡＰ発現は、細胞の１％未満で見られた。本発明者らはまた、１１５継代後のＥＳ細胞由来ＮＳ細胞において、ＧＦＡＰおよびβIIIチューブリンはなく、ネスチンおよびＲＣ２の均一な発現を示した。このことは、ＮＳ細胞表現型が安定であることを示している。本発明の好ましい細胞は、ＥＳ細胞から分化され、そして３０継代後、好ましくは６０継代後、より好ましくは１００継代後に、（１）ネスチンおよびＲＣ２の発現が続きそして（２）ＧＦＡＰおよびβIIIチューブリンの発現がないことが続く。ＧＦＡＰおよびβIIIチューブリンの発現がないとは、細胞の５％未満、好ましくは細胞の２％未満に発現が見られることを意味する。
【００９９】
本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲによって分析を実施し、特定のＮＳ細胞に分化多能性、中胚葉、または内胚葉の特異的転写因子がないことを確認した。本発明者らはまた、アフィメトリックス（ＲＴＭ）発現プロファイリングを実施し、系統の不適切な転写物がないことを確認し、そして３つの異なるＮＳ細胞培養（ＥＳ由来、胎児皮質由来、およびクローン胎児皮質由来）において神経マーカーおよび放射神経膠マーカーの一貫した発現を実証している。
【０１００】
ＥＳ細胞からの分化によりＮＳ細胞を得ることは、好ましくは、連続接着培養で細胞を維持する工程を含み、そしてより好ましくは、神経球を形成する工程を省く。しかし、胎児または成体脳由来の一次細胞単離物からの細胞の分化によりＮＳ細胞を得ることは、必要に応じて、（ｉ）まず懸濁凝集体または神経球を形成する工程、および（ii）引き続き接着培養に細胞を維持する工程を含む。本発明者らは、実施例において、数日後に、これらの凝集体がゼラチンコートされたプラスチックに付着され得、次いでＮＳ細胞が増殖することを見出した。
【０１０１】
本発明者らは、本発明の細胞の初期および後期継代で生成したニューロンおよび星状細胞の割合を、（詳細には、ＬＣ１ ＮＳ細胞に対して、８継代目および１１５継代目で）決定した。後者の培養は、１２ヶ月の増殖を表し、倍加時間は２４時間であった。後期継代で得られたニューロンの数にはささやかに減少があるが、これはなお３５％よりも多くを占める。独立して４６Ｃ ＥＳ細胞から誘導されたＮＳ５クローン株は、３０継代目に同様のレベルのニューロン分化効率を示している。ＧＦＡＰ免疫反応性星状細胞の生成は、ＬＣ１ ＮＳ細胞についておよびＮＳ５細胞についても、両時点で１００％に近づいた。さらに、多数回継代で増殖し、次いでＧＦＰレンチウイルスを形質導入しそして移植前にさらに増殖させたＬＣ１ ＮＳ細胞を用いて、インビボでのデータを得た。このデータは、ニューロンおよび星状細胞の両方の広範な分化を示している。放射神経膠マーカー発現の均一性と組み合わせて、非クローン化ＬＣ１ ＮＳ細胞についての安定な分化能に関するデータは、ＦＧＦおよびＥＧＦにおける接着培養が、幹細胞自己再生を好み、そして神経膠またはニューロンのいずれかの運命への方向付けを抑制することを示している。
【０１０２】
本発明者らは、ＥＳ細胞からの分化により得られたＮＳ細胞が、５週間にわたって腫瘍の形成なく移植され得ること、したがって、マウス脳において４週以内に巨視的な奇形腫を生じたＥＳ細胞とは異なることを見出した。
【０１０３】
本発明はまた、核再プログラミング方法、ならびにこれらの方法によって得られる細胞および動物にも関する。
【０１０４】
核再プログラミングは、体細胞、必要に応じて幹細胞もしくは終末分化細胞の核が、比較的より高い潜在能の細胞の核として挙動するように再プログラミングされる技術である。最終的には、完全に再プログラミングされた核が、分化多能性細胞の核として作用し、そして再プログラミングは、しばしば分化多能性に対して様々に再プログラミングすることを意味する。核移入による再プログラミングの方法は、当該技術分野で十分に確立されており、ＷＯ９６／０７７３２に記載の発明（時に、「ドリー羊」発明といわれる）後に十分に公開されるようになった。したがって、核移入は、非ヒト動物をクローン化するために使用され得る。
【０１０５】
核移入方法は、多くの課題を有する。まず、それらは低効率のままであり、得られた細胞が、真に分化多能性であるように再プログラミングされるのはまれである。再プログラミングの一部として核で遺伝子操作を実施し得ることも所望され得る。しかし、現時点では、この操作は、ドナー核のクローン集団を得るのが困難であるため、可能ではないかまたは信頼性がない。クローン核を用いてさえも、再プログラミング方法は、多くの独立した工程を必要とする複雑な手順である。最後に、いくつかの種に由来するＥＳ細胞は、単離するのがなお困難である。再プログラミング技術の使用は、そのようなことが利用できかつ信頼性があれば、これらの種において分化多能性細胞への代替の経路を提供する。
【０１０６】
本発明のさらなる局面は、上記課題に対する代替のアプローチを提供すること、およびそれらへの解決を提供することを目的として有する。
【０１０７】
したがって、本発明は、核再プログラミングの方法を提供し、この方法では、ドナー核が本発明の神経幹細胞から得られる。
【０１０８】
本発明の神経核細胞は、高い効率で再プログラミング可能であることが見出されており、したがって、本発明は、効率的な再プログラミング方法を提供し、そしてまた、多くの種の遺伝子改変された再プログラミングされた細胞（特に分化多能性幹細胞）の作製を容易にする。本発明によって個々の神経幹細胞をクローン増殖できることとは、全てが同じ遺伝子改変を用いて、遺伝子操作後に細胞のクローン集団が得られ得、そして再プログラミング方法で使用され得ることを意味する。
【０１０９】
特定の細胞表面マーカーの存在および／または他のものの不在に従って神経幹細胞を同定することもまた可能である。このことは、神経幹細胞は、混合集団（例えば、脳ホモジネート）から直接採集され得るので、本明細書中に記載の本発明の局面に従って培養する工程が省かれ得るという利点を有する。
【０１１０】
したがって、核再プログラミングの方法が本明細書中に提供され、この方法では、ドナー核が、本発明の任意の実施態様または局面に従って得られた神経幹細胞に由来する。
【０１１１】
核再プログラミングの特定の方法は
ドナー細胞を得る工程；
レシピエント細胞を得る工程；
該ドナー細胞の核を該レシピエント細胞に移入する工程であって、該ドナー細胞が、（ｉ）神経幹細胞、または（ii）本発明の方法に従って得られた細胞である、工程；および
該細胞を培養して該ドナー細胞の核を再プログラミングし、それによって再プログラミングされた細胞を得る工程
を含む。
【０１１２】
レシピエント細胞の核は、一般に、プロセス中の一段階で除去され、そのため得られる細胞は二倍体であり、これは、必要に応じて該ドナー細胞の核の移入前におよび必要に応じて該ドナー細胞の核の移入後になされる。
【０１１３】
本発明のＮＳ細胞によって提供される関心のある可能性の１つは、遺伝的病変（例えば、悪性を誘導し得る）を導入することである。したがって、さらなる選択肢は、ドナー細胞核を遺伝子操作することである。これは、目的の変異または遺伝子を導入するために使用され得、例えば、アッセイまたは他の試験目的のために細胞または動物を生成し得、複数の細胞が全て同じ操作で得られる。操作の範囲は広範である。一例は、疾患原因遺伝子配列または推定疾患原因遺伝子配列をドナー細胞核に導入することであり、薬物スクリーニングに有用である。さらなる選択肢は、再プログラミングされた細胞から誘導された組織を含む動物を得、そして該組織を用いてアッセイを実施することである。細胞は、例えば卵母細胞への核転移によって、分化多能性に戻るように再プログラミングされることが好ましい。
【０１１４】
本発明の特定の実施態様では、所望の神経幹細胞における細胞表面マーカーの本発明からの知識を利用することにより、そうでなければ混合集団からの神経幹細胞の単離に必要とされる培養工程の省略が可能になる。１つのこのような再プログラミング方法は、細胞の混合集団を提供する工程、その細胞表面マーカープロフィールに基づいて該混合集団から神経幹細胞を単離する工程、および該単離された細胞の核をレシピエント細胞に移入する工程を含む。
【０１１５】
他の方法と同様に、単離された細胞は、レシピエント細胞へのその核の移入の前に遺伝子操作され得る。また、単離された細胞は、集団中の１つの細胞の核をレシピエント細胞に移入する前に細胞のクローン集団を得るために培養され得る。
【０１１６】
より詳細には、本発明の細胞の応用には、高スループット薬物スクリーニングがある。本発明の神経幹細胞とそれから得られるニューロン、神経膠などとの両方ともが、スクリーニングのために、例えば、細胞のいずれかの型で活性である因子を同定するために使用され得る。細胞または子孫は、脳内癌のモデルで使用され得る。細胞および子孫は、神経系（特に、ＣＮＳ）の腫瘍から得られ得、そしてそれに由来する神経細胞およびそれらの子孫が、スクリーンにおいて使用され得る。スクリーンの性質は全てに対して明らかであると考えられるが、概要では、本発明の細胞またはそれらの分化した子孫を得る工程、試験因子の存在下で該細胞または子孫を培養する工程、および該細胞または子孫に関する該因子の効果を決定する工程を含む。特定のスクリーニング使用で、細胞が提供され、この細胞は、本発明の細胞または本発明によって得られる細胞であり、そしてＥＧＦレセプターまたはさらなるＥＧＦレセプターを発現するように改変されている。
【０１１７】
細胞は、スクリーンで使用される前に改変され得る。例えば、細胞は、遺伝子において変異を導入するように、または疾患（特に、神経細胞の疾患であり、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含む）に関与していることが知られているもしくは関与の疑いのある遺伝子産物をコードする核酸を導入するように、遺伝子改変され得る。パーキン変異が導入され得る。アルツハイマー病に関与するタンパク質（例えば、ＡＰＰ）をコードする遺伝子が発現または変異され得、またはその発現を変更され得る。
【０１１８】
本発明の細胞は、細胞療法の細胞の供給源として有用である。それらは、患者からの幹細胞の供給源を提供し、これは、潜在的に核移入のための核の供給源であり得る。それらは、遺伝子療法（神経防御遺伝子療法を含む）の送達のために用いられ得る。一例の療法では、本発明の細胞は、神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を発現している。これらの細胞は、本発明に従いそして細胞を遺伝子操作することにより得られ得る。細胞は、損傷した神経回路の回復および／または脳機能の回復のために移植され得る。
【０１１９】
本発明の利点は、得られる細胞の純度にある。純粋な集団は、移植または培養において制御することがより容易であり、不均質な培養においては、より多くの細胞が神経膠運命に既に方向付けられているのでニューロンが得られる割合が低くなる。いくつかの療法は、ニューロンおよび星状細胞の両方を必要とする。他の療法は、神経膠細胞を必要とする（例えば、ＭＳについては乏突起膠細胞、他の適用については星状細胞、遊走細胞）。
【０１２０】
非ヒト動物をクローン化する方法が本発明によって提供される。非ヒト動物をクローン化する１つの方法は、（ｉ）該非ヒト動物から神経幹細胞を得る工程、（ii）該非ヒト動物と同じ種の卵母細胞を得る工程、（iii）該神経幹細胞の核を該卵母細胞に移入する工程、および（iv）（iii）で得られた細胞を該同じ種の雌に移植する工程を含む。したがって、本発明は、神経幹細胞の単離に基づく非ヒト動物クローニングの効率的な方法を提供する。このクローニング方法は、実質的に全ての非ヒト動物に対して適用できると考えられる。特に家畜動物（ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ニワトリ、および他を含む）およびまた実験動物（マウスおよびラットを含む）に対してである。
【０１２１】
本発明により、初めて、ＥＳ細胞と同様に、二倍体のクローン原性のトランスフェクト可能な組織幹細胞の純粋な集団の増殖が可能になる。これは、種々の新規な実験機会を切り開く、幹細胞生物学において顕著な前進である。例えば、「神経幹細胞」のプロファイリングに関する以前の研究は、不均質な神経球培養（例えば、Suslovら）への信頼に大いに妥協している。さらに、ＮＳ細胞の放射神経膠特徴が、それらのインビボの対応物を定義している。放射神経膠の純粋な集団を培養および遺伝子操作できることはまた、幹細胞および特殊化された足場細胞の両方として機能し得る、これらの目立った細胞の細胞生物学を分析するための新規な機会を切り開く。最後に、異種細胞または細胞抽出物を含まない単純な培地でＮＳ細胞を増殖できることは、自己再生が、増殖因子単独によって駆動され得、そしてこれまで幹細胞生物学者によって不可欠であると考えられていた複雑な微細環境ニッチを必要としないことを確立する。本発明は、細胞を用いる核再プログラミングおよび必要に応じた遺伝子操作への新規なアプローチを切り開く。
【０１２２】
本発明は、ＮＳ細胞からのニューロンの効率的な生成を提供する。本明細書中のプロトコルにより詳細に記載した方法において、ニューロンを得る方法は、（ａ）ＦＧＦレセプターのアゴニストの存在下でかつＥＧＦレセプターのアゴニストの不在下で、神経幹細胞を培養する工程；および（ｂ）その後、ＦＧＦレセプターのアゴニストの不在下でかつＥＧＦレセプターのアゴニストの不在下で、該細胞を培養する工程を含む。例えばＥＧＦが存在しない期間は、例えばＦＧＦが実質的に除去された場合にニューロンになるように細胞を刺激することが見出されている。神経幹細胞は、好ましくは、単層培養で播種される。代表的には、ＮＳ細胞は、ＥＧＦを含まないがＦＧＦ−２を含む培地に移され、そしてある期間（言わば少なくとも２日間または少なくとも４日間）培養され、その後、ＦＧＦ−２もまた培地から除去される（それを含まない培地に細胞が移されることを含む）。特定の方法では、細胞をＥＧＦのないＦＧＦ−２中で１週間増殖させ、次いでＦＧＦ−２を除去する。ＦＧＦの除去により、培養中に幾らかの細胞死が生じるが、良好な割合が生存しニューロンを形成する。この方法は、ＮＳ細胞の誘導のために、本明細書中に記載の方法のいずれかへの必要に応じた追加として使用され得る。
【０１２３】
本発明の全ての局面の方法／使用は、インビボまたはインビトロのいずれかにて実施され得ることが理解される。
【０１２４】
本発明の方法および組成物は、添付の図面において図示される。
【０１２５】
図１は、ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す；
図２は、ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す；
図３は、ＮＳ細胞が成体脳内に取り込まれ分化することを示す；
図４は、ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す；および
図５は、分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【０１２６】
より詳細に図面を参照して、図１は、ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す：Ａ．ＥＧＦおよびＦＧＦ−２中で増殖された接着ＮＳ細胞培養物（ＬＣ１）（ａ）は、ニューロン抗原（ｂ）または星状細胞抗原（ｃ）の発現を示さず、そして前駆体マーカーであるＲＣ２（ｄ）およびネスチン（示さず）の均一な発現を示している。ＬＣ１細胞は、血清の添加に際して免疫陽性星状細胞に分化し（ｅ）、そして増殖因子の除去に際してニューロンを生成する（ｆ〜ｈ）。得られるニューロンの割合は、１１５継代後もなお総細胞の３５％より多い（ｉ）。Ｂ，クローンＮＳ−５細胞は、Ｓｏｘ１神経系統選択によって生成された。ａおよびｃは、それぞれ１継代目および５継代目の神経前駆体の位相画像であり、ｂおよびｄは、対応するＳｏｘ１−ＧＦＰ蛍光である。ｅは、Terasakiウェルへの播種１時間後の単一の細胞。ｆは、２０継代目のクローン細胞株の位相差画像である。Ｃ，ＥＳ細胞および神経幹細胞／放射神経膠細胞マーカーについてのＲＴ−ＰＣＲ（４６Ｃ、親ＥＳ株；Ｐ５、神経分化後５継代目；ＮＳ−５クローンＮＳ株；ＬＣ１、ＮＳ集団（１７継代目）；脳、Ｅ１２．５／Ｅ１６．５マウス脳）。Ｄ，神経幹細胞／放射神経膠マーカーに対するＮＳ−５免疫反応性。Ｅ，ＮＳ−５の星状細胞（ａ，ｂ）およびニューロン（ｄ，ｅ）への分化とネスチン免疫反応性の喪失（ｃ，ｆ）。Ｆ，ＮＳ−５細胞のコロニー（ａ）は、増殖因子除去に際してニューロンを生成し（ｂ）、そしてＥＧＦ／ＦＧＦの存在下で、ＲＣ２およびＢＬＢＰの均質な発現を保持し、ＧＦＡＰに対する免疫反応性を喪失している（ｃ，ｄ）。Ｇ，ＮＳ−５の中期広がり（３１継代目）。
【０１２７】
図２は、ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す：ＮＳ細胞は、独立したＥＳ細胞株（ＣＧＲ８、Ｅ１４Ｔｇ２ａ）または一次皮質（Ｃｏｒ−１）および線条体（Ｓｔｒ−１）組織から誘導した。Ａ，幹細胞／放射神経膠マーカーのＲＴ−ＰＣＲ。Ｂ，転写調節因子についてのＲＴ−ＰＣＲ。Ｃ，ＥＳ由来株（ＣＧＲ８−ＮＳ）および胎児由来株（Ｃｏｒ−１）は、形態学（ａ，ｆ）および神経幹細胞／放射神経膠マーカー免疫反応性（ｂ，ｃ，ｇ，ｈ）ではＬＣ１とは区別不能であり、各々はニューロン（ｄ，ｉ）および星状細胞（ｅ，ｊ）に分化し得る。
【０１２８】
図３は、ＮＳ細胞が成体脳内に取り込まれ分化することを示す：ａ〜ｈ ｅＧＦＰをレンチウイルス形質導入し、海馬（ａ，ｂ）または線条体（ｃ〜ｈ）に移植４週間後のＬＣ１ ＮＳ細胞の共焦点像。ｂ，ｄ，それぞれパネルａおよびｃのより高い倍率の差込図。ｅ，ｆ，ニューロンマーカーＴｕＪ（ｅ，赤）またはＭＡＰ−２（ｆ，赤）の共発現（黄）を示しているｅＧＦＰ移植ＮＳ細胞（緑）の例。ｇ，星状膠マーカーＧＦＡＰ（赤）。ｈ，神経前駆体マーカーネスチン（赤）。ｉ，成体マウス線条体への移植の４週間後の移植片に由来するニューロン（ＭＡＰ２）、星状膠（ＧＦＡＰ）、前駆体（ネスチン）、および増殖（Ｋｉ６７）細胞の定量分析。データは、５匹の独立した動物由来の少なくとも５００のｅＧＦＰ＋細胞の平均（±標準偏差）である。スケールバー：ａ，ｃ，１００μｍ；ｂ，ｄ，ｅ，４０μｍ；ｆ〜ｈ，２０μｍ。
【０１２９】
図４は、ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。Ａ，ヒトＥＳ細胞からの誘導。ａ，ヒトＥＳ一次培養物。ｂ，神経ロゼット構造へのヒトＥＳ細胞の分化。ｃ，ＮＳ増殖培地における９継代目。ｄ，個々の細胞は放射神経膠形態を示す。ｅ〜ｈ，神経幹細胞／放射神経膠マーカーに対する免疫染色。Ｂ，ヒト胎児前脳からの誘導。ｉ，皮質から生成した神経球。ｊ，付着および成長。ｋ，ＮＳ増殖培地における５継代目。ｌ，放射神経膠形態。ｍ〜ｐ，神経幹細胞／放射神経膠マーカー。Ｃ，分化。ｑ，ＴｕＪ陽性未熟ニューロン。ｒ，ＧＦＡＰ陽性星状膠。
【０１３０】
図５は、以下を示す：Ａ．分化培地における６日（ａ）、１２日（ｂ）、および３０日（ｃ）間のインキュベーション後の３つの異なるＮＳ細胞からの異なる膜電位（−９０ｍＶの保持電位から−７０ｍＶと＋４０ｍＶとの間）で得られる内向きおよび外向きの重畳電流追跡。Ｂ．（Ａ）において示される電流記録が得られた直後に電圧クランプから電流クランプに切り替えることによる、（Ａ）と同じ３つの細胞（ａ，ｂおよびｃ）における脱分極矩形電流パルスの注入後に得られた重畳電圧応答。破線は、−６０ｍＶの電圧レベルを表している。Ｃ．ラベルにより示されるように時間が増加している間に分化培地で培養した細胞からの−２０ｍＶで誘発された平均Ｎａ＋電流。バーは、ＳＥを示している。Ｄ．１０ｍＭ Ｂａ２＋中およびＴＴＸの存在下の−４０ｍＶおよび０ｍＶで誘発された内向きの重畳電流；保持電位は−９０ｍＶであった。Ｅ．（Ｄ）と同じ細胞からの電流／電圧関係。
【０１３１】
本発明は、以下の実施例を用いて実証される。
【実施例】
【０１３２】
（実施例１−１）
（ＮＳ細胞のバルク集団の単離および培養）
接着単層培養での５０〜７０％の間のＳｏｘ１陽性神経前駆体の効率的かつ一貫した生成を可能にするＥＳ細胞分化プロトコルが、近年確立された。これらの培養物内の神経前駆体（マウス由来）を単離し増殖しそして特徴付けるために、Ｓｏｘ１遺伝子座にターゲティングしたＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ピューロマイシンレポーターカセットを含む以前に生成された細胞株（４６Ｃ細胞）を使用した（Yingら, 2003b）。ピューロマイシンを７日後に分化培養物に添加し、そして３日以内に、残りの細胞の９５％より多くがＧＦＰ＋神経前駆体となった。この時点で、細胞を、（ピューロマイシンなしで）ＥＧＦ／ＦＧＦ−２を添加したＮ２Ｂ２７培地に再播種した。これらの細胞は迅速に増殖し、数継代内で均質な形態をとった。
【０１３３】
これらの４６Ｃ神経前駆細胞（４６Ｃ−ＮＰ）は、２０継代より多くの間培養物中で継続して維持され、特徴的な二極性の形態を保持していた。これらの培養物は、ほとんど細胞死を示さず、そして高い播種効率を有し、倍加時間は約２５時間であった。
【０１３４】
（実施例１−２）
（細胞株の培養）
クローン細胞株を単離するために、４６Ｃ−ＮＰ細胞の５継代目バルク培養物からの単一の細胞を、マイクロウェルプレートの別々のウェル中に播種した。スコア付けした９５の単一の細胞のうち１５がコロニーに増殖し、そしてこれらのうち４株が１０継代より多くにわたって継続して増殖し続けた。１つの株（ＮＰ５）は、バルク集団で観察されたのと同一である均質な形態を有する特徴的な二極性の細胞を示した。このＮＰ５株は、無期限に培養物中で維持された（ＮＰ５ ４１継代目；５ヶ月以上）。
【０１３５】
（実施例１−３）
（ＮＳ細胞の特徴づけ）
バルク細胞集団およびクローン株の両方ともを特徴付けるために、種々のマーカーについて免疫細胞化学を用いた。予期されるように、細胞株の各々は、神経前駆体マーカーであるネスチンもしくはビメンチンに対して陽性であることが判明した。重要なことに、これらの細胞はまた、放射神経膠特異的マーカーであるＲＣ２、３ＣＢ２および星状細胞特異的グルタミン酸輸送因子（ＧＬＡＳＴ）に対しても陽性であった。細胞の１％未満がＧＦＡＰまたはβIIIチューブリンのいずれかに対して陽性であった。このことは、これらの細胞の継代の間に、星状細胞またはニューロンへの自発的分化がほとんど生じていないことを示唆している。霊長類／ヒト細胞とは異なり、げっ歯類放射神経膠は、ＧＦＡＰに対して陰性である。さらに、これらの細胞は、成体神経幹細胞に対して富化するために以前に使用されたＳＳＥＡ−１、ルイスＸ抗原を認識する抗体に対して免疫反応性である。
【０１３６】
種々のマーカーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施し、放射神経膠としてのそれらの同一性を確認した。４つのクローン株の全てならびにバルク集団は、免疫細胞化学と一致して、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇに対して陰性であり（このことは、それらがＥＳ細胞ではないことを確証している）、一方、それらは、ネスチン、ビメンチン、およびＧＬＡＳＴを発現していた。さらに、各細胞株は、ＢＬＢＰ、放射神経膠マーカーの発現を示した。これらの細胞はまた、ムサシ−１およびプロミニンも発現している。
【０１３７】
興味深いことに、４６Ｃ−ＮＰのバルク培養物は、ＧＦＰレポーターにより評価されるように、Ｓｏｘ１の発現を徐々に喪失し、５継代目まで（約２週間）に、ほとんどの細胞が緑色ではなくなった。また、Ｓｏｘ１駆動ＧＦＰ発現を示したクローン株はなく、ＲＴ−ＰＣＲは、これらの細胞がＳｏｘ１を発現せず、代わりに関連のＳｏｘＢ１クラスのタンパク質であるＳｏｘ２を発現していることを確証した。まとめると、これらの結果は、種々のＳｏｘ１発現神経前駆体が、ピューロマイシン選択ストラテジーを用いて単離され得ること、および前脳放射神経膠の特性を有するＳｏｘ１−，Ｓｏｘ２＋細胞が、単離およびクローン増殖され得ることを示唆している。
【０１３８】
（実施例１−４）
（ニューロンおよび神経膠へのＮＳ細胞株分化）
ＮＳ細胞株により発現された分子マーカーは、それらが神経前駆細胞の型であることを確証している。これらの細胞が真の多分化能性幹細胞である（すなわち、ニューロンまたは神経膠のいずれかとして分化し得る）ことを確認するために、細胞の潜在能を試験するために設計した種々の条件を試験した。
【０１３９】
神経前駆体の以前の研究は、マイトジェンの除去および／または血清もしくは他のサイトカインの添加を包含するプロトコルによって、分化を誘導した。本発明の場合では、ＥＧＦ、ＦＧＦ、または両方を、プラスチック上で培養した増殖中のＮＰ５および４６Ｃ−ＮＰ細胞から除去した。ＥＧＦおよびＦＧＦの両方を同時に除去することにより、２４時間以内に急速かつ広範囲の細胞死が生じた。比べて、ＦＧＦ単独での培養は、３日間かかって細胞死に至った。ＥＧＦ単独での培養では、細胞死も分化も生じなかったが、細胞増殖は減少した。したがって、明らかに、ＥＧＦは、プラスチック上で培養したＮＳ細胞に対して必須の細胞生存シグナル（部分的にＦＧＦシグナル伝達により補償される）として作用している。
【０１４０】
サイトカインの除去後の細胞の増殖に関する血清の効果もまた試験した。このようにして処理した細胞は、ＥＧＦの不在下でさえも生存し、そして同期様式で迅速に分化し、これにより細胞の１００％が、ＧＦＡＰに対して陽性およびネスチンに対して陰性に染色した大きな扁平の星状細胞を獲得した。したがって、増殖集団内の全てのＮＳ細胞が、星状細胞として分化し得る。この効果は、プラスチック上のＥＧＦ／ＦＧＦ除去後の血清の不在下でのＢＭＰ４の添加によって模倣され得る。ＣＮＴＦおよびＴＧＦ−βは、星状細胞形態が異なりそしてより多くの細胞死が初期にあったが、ＢＭＰ４と同様に挙動した。ＢＭＰ、ＣＮＴＦおよびＬＩＦは各々、一次皮質前駆体から星状細胞運命を誘導することが示されている（Grossら, 1996; LillienおよびRaff, 1990; Nakashimaら, 1999）。これらの研究と一致して、ＢＭＰ−４または血清処理でのＩｄ遺伝子（＞３０倍）の迅速な誘導が見られた（データは示さず）。
【０１４１】
ニューロン分化を誘導しようとして、ラミニン処理ディッシュでのＥＧＦの除去を試験した。プラスチック上での細胞の培養で見られた細胞死を回避するために、細胞を、ＦＧＦを含むがＥＧＦを含まないラミニン基材上に播種した。プラスチックまたはゼラチン上でのこれらの条件で見られたＰＣＤは生じておらず、細胞は生存していた。細胞の形態が、より拡張された二極性の突起に変化しており、これは、放射神経膠の特徴的なエンドフィートを有する。これらの細胞は、（ＢｒｄＵ取り込みによって）増殖において激烈な減少を示したが、放射神経膠マーカー（ＲＣ２、ビメンチン、ネスチン）を維持しており、分化しておらず、ほんの少ない割合のニューロンまたは星状細胞のみが高密度の領域で見られた。ニューロン分化を誘導するために、６日後、培地をＮＳＡ／Ｎ２ ＋ＦＧＦ２からＮＳＡ／Ｂ２７（ＦＧＦ２なし）に変更した。このことにより、ＭＡＰ２およびβIIIチューブリン抗体染色により判断されるように約４０〜６０％の細胞のニューロン分化が促進された。これらのニューロンは、ＧＡＢＡ免疫反応性によって評価されるようにＧＡＢＡ原性（GABAergic）であったが、星状細胞（ＧＦＡＰ）はほとんど存在しなかった。これらの結果は、ニューロン分化の妨害におけるＦＧＦの以前に記載された役割と一致している。
【０１４２】
各細胞株が、ＥＳ細胞と同様に首尾よく凍結されそして融解され得ることもまた見出された。
【０１４３】
さらなる試験において、単一の細胞から始まる分化を試みた。このクローン発現および分化は、細胞の全てがニューロンを形成する能力を有することを示した。
【０１４４】
（実施例１−５）
（遺伝子選抜ストラテジーを用いない任意のＥＳ細胞株からのＮＳ細胞の単離）
ＮＰ５を単離するために用いられるＮ２Ｂ２７培地は、ＥＳ細胞の神経前駆体への変換に対してもともと最適化されており、このため、ＥＳ細胞および神経前駆体の両方の良好な生存が可能になった。したがって、ピューロマイシン選択がなければ、ＥＳ細胞および非神経細胞型のキャリーオーバーのために、ＥＧＦおよびＦＧＦ−２を用いて４６Ｃ−ＮＰ細胞を効率的に増殖することができなかった（データは示さず）。これを克服しそして他のターゲティングされないＥＳ株からの放射神経膠細胞の生成を可能にするために、神経前駆体を生存および増殖させるが他の細胞型はそうではない他の基本培地の組合せを試験した。
【０１４５】
市販の培地であるＮＳ−Ａ培地（Euroclone）を用いて、７日目での４６Ｃ ＥＳ細胞単層分化の再播種が、細胞の塊／球の形成ならびに非神経細胞の細胞死を生じることが分かった。引き続いて、これらの細胞塊の付着が生じ、そして細胞の均質な集団が大きくなった。この継代可能な細胞集団（＞７５継代）のさらなる特徴づけにより、ピューロマイシン選択ストラテジーを用いて以前に見られた発現されたマーカーの同一のプロフィールが明らかになった。したがって、細胞は神経前駆体マーカー（ネスチン、ビメンチン）に対して陽性であり、また放射神経膠マーカー（ＲＣ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰおよびＰａｘ６）に対しても陽性であった。４６Ｃ−ＮＰ細胞は、形態においてほんのわずかな差異を有しそしてマーカー遺伝子の差異がないことがかつて確立されているＮ２Ｂ２７またはＮＳＡ培地のいずれにおいても、同様に挙動した。
【０１４６】
このプロトコルを用いて、６つの他のＥＳ株からの細胞株を単離した：ＣＧＲ８、Ｅ１４Ｔ、Ｏｃｔ４−ＧＩＰ、Ｓ１１、Ｒ１およびＶ６．５。これらの細胞株の各々は、同様の形態および発現プロフィールを有し、そして広範に継代され得る。
【０１４７】
（実施例１−６）
（ＮＳ細胞の移植）
インビボでＮＳ細胞の能力を試験するために、それらを、胚性および成体ＣＮＳの両方へ、ならびに腎臓嚢移植片に移植した。
【０１４８】
エレクトロポレーションをＮＰ５において試験した。それらは、矩形波エレクトロポレーターを用いて効率的にエレクトロポレートされることが見出された。細胞はまた、リポフェクタミン添加試薬を用いてトランスフェクト可能である。これは、マウスに用いられる全ての遺伝子操作が利用可能になるので、大きな利点である。
【０１４９】
移植した細胞の迅速な評価を可能にするために、ｅＧＦＰマーカー遺伝子を保有するレンチウイルス粒子で４６Ｃ−ＮＰを形質導入した。感染は非常に効率的であり、細胞のほぼ９５％が首尾よくマーキングされ、ｅＧＦＰシグナルは継代と共に強くかつ安定であった。レンチウイルス感染の使用により、トランスジーンは安定に組み込まれ、そしてシグナルは、移植した細胞の長期分析に安定なままとなった。
【０１５０】
胚性脳（未熟神経細胞を持続しそして分化を方向付けることが可能な分子および因子の全てを含む環境）での移植後の細胞の挙動を評価した。Ｅ１４．５マウス胚をレシピエントとして用い、Magrassiおよび共同研究者（Magrassiら, Development 1999）によって以前に記載された手順に従って、100,000個の細胞を２μＬの最終容量中に再懸濁した。細胞は、移植後良好に生存し（概算により、移植片中で約20000個の細胞であった）、ｅＧＦＰシグナルは、容易に検出可能であり、そしてそれらは、移植後に初期の時点で既に遊走活動を提示した。移植後の種々の時点（４日、７日、２週間、および１ヶ月）で移植した細胞が獲得した運命を分析した。４日目および１週間の時点で、細胞の大部分は、ネスチン免疫反応性によって示されるようになお未熟であったが、２３％は、ニューロンマーカーＴｕｊ−１を発現し、そして１６．３％は、神経膠マーカーＧＦＡＰを獲得していた。これらのデータは、移植したＮＳが、多分化能性ＮＳ細胞から予期されるように、インビボでニューロンおよび神経膠の両方を生成し得ることを示している。
【０１５１】
ＮＳ細胞を、成体線条体にも移植した。これらの移植体では、細胞は良好に生存し（いずれにせよ生存は、胚性移植片におけるよりも低い）、そしてニューロンおよび神経膠の両運命の方向に分化した。移植後２週間目に実施した定量分析は、細胞の４３．３％がニューロン特異的マーカーＴｕｊ−１を発現し、一方、２６．６％が神経膠マーカーＧＦＡＰに対して免疫反応性を提示したことを示した。少ない割合の細胞（１１．１％）が、ネスチンの発現により示されるように未熟な表現型を保持していた。
【０１５２】
腎臓嚢へのＮＰ５−ＧＦＰ細胞は、奇形腫を生じなかった（ｎ＝４、データは示さず）。
【０１５３】
（実施例２）
（実施例２−１）
（方法）
（マウス細胞の培養および分化）
ＥＳ細胞および神経分化は、YingおよびSmith, 2003によって詳述されている。ＬＣ１と命名したＮＳ細胞および他のＥＳ細胞由来ＮＳ細胞を、Ｎ２および１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよびＦＧＦ−２の両方を添加したＮＳ−Ａ培地（Euroclone）（ＮＳ増殖培地）においてコーティングされていないプラスチック上で７日目の神経分化単層培養物を再播種することにより、通常通りに生成した。細胞は凝集体を形成し、引き続いて付着しそしてＮＳ細胞を大きくした。７日目に０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを分化接着培養物に添加した後に生成された細胞を、４６Ｃ−ＮＳ細胞と命名した。３日後に、細胞を、ピューロマイシンのない１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦおよびＦＧＦ−２（Peprotech）の両方を含むＮ２Ｂ２７培地において、コーティングされていないＴ７５フラスコ中に再播種した。クローン株ＮＳ−５を、限定希釈によって９６ウェルマイクロウェルプレート（Nunc）中に単一の細胞を播種することにより生成した（播種１時間後に単一の細胞をスコア付けした）。一次培養物を、Ｅ１６．５マウス胚の皮質／線条体から標準プロトコルを用いて生成し、そして０．１％ゼラチンで処理したフラスコ上に付着させた。次いで、Ｃｏｒ−１およびＳｔｒ−１細胞を、ＮＳ増殖培地を用いてゼラチン上で増殖させた。星状細胞分化のために、ＮＳ細胞を、１％ウシ胎児血清または１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（R&D System）を添加したＮＳ−Ａ培地中に１×１０５細胞／ウェルで、４ウェルプレート上に再播種した。ニューロン分化のために、５×１０４ＮＳ細胞を、ＦＧＦ−２単独を添加したＮＳ−Ａにおいてポリオルニチン／ラミニン処理ウェル中に播種した。７日後、培地を、増殖因子を含まないＢ２７（Gibco）を添加したＮＳ−Ａに切り替えた。クローン分化のために、ＮＳ−５またはＣｏｒ−１培養物からの１０００細胞を、ラミニンで前処理した１０ｃｍプレートに播種し、ＥＧＦ／ＦＧＦ−２中で１２日間増殖させ、そして上記のようにインサイチュで分化させた。
【０１５４】
（ＮＳ細胞の特徴づけ）
免疫細胞化学を、適切なＴＲＩＴＣまたはＦＩＴＣ二次結合体とＤＡＰＩでの核対比染色とを用いて実施した。以下の希釈で一次抗体を用いた：ネスチン（１：１０）、ビメンチン（１：５０）、Ｐａｘ６（１：５）、３ＣＢ２（１：２０）、ＲＣ２（１：５０）（DSHB）；ＴｕＪ（１：２００）（Covance）；ＧＦＡＰ（１：３００）（ポリおよびモノ、Sigma）、ＭＡＰ２（１：２００）（ChemiconおよびBecton Dickinson）；ＮｅｕＮ（１：２００）、ＧＡＢＡ（１：２００）、Ｇａｄ６５／６７（１：２００）（Chemicon）；シナプトフィシン（１：２００）（Sigma）；Ｏｌｉｇ２（１：５０００）（H. Takebayashi）；Ｅｍｘ２（１：２０００）（A. Corte）；ＢＬＢＰ（１：５００）（N. Heintz）；プロミニン／ｍＡｂ１３Ａ４（１：２００）（W. Huttner）。陰性コントロールはＥＳ細胞、分化したＮＳ細胞または二次単独であった。ＲＴ−ＰＣＲのために、全ＲＮＡをRNeasyキット（Qiagen）を用いて抽出し、そしてｃＤＮＡをSuperscript II（Invitrogen）を用いて生成した。β−アクチン（２５サイクル）を除いて、全てのマーカーについてＰＣＲを３０サイクル実施した。中期広がりのために、細胞を５ｍｌの０．５６％ ＫＣｌで２０分間処理し、氷上でメタノール：酢酸（３：１）中に１５分間固定し、スライドガラス上に広げ、そしてＴＯＰＲＯ−３（Molecular probes）で染色した。
【０１５５】
（ヒト胚および胎児培養物）
インフォームドコンセントのもとでのヒト組織に関する研究は、Research Ethics Committee of Lothian Health Boardによって認可された。凍結した余剰のヒト胚が、Human Fertilisation and Embryology Authorityにより発行されたライセンスＲ０１３２下での研究のために贈与された。Polkinghorneガイドライン下の研究のために同意のもとに選択中絶したカーネギー１９／２０期の胎児からヒト皮質を切り出した。
【０１５６】
（移植）
Magrassiら, 1998に記載により胎児手術を実施した。ガラスキャピラリーを用いて、１μＬのＨＢＳＳの容量中に５×１０４個の細胞を、透照下で曝露したE14.5 Sprague Dawleyラット胎児の終脳小胞に注入した。注入された胎児を、満期まで発生のために腹腔内に戻した。分娩後、移植後７日目（出生後日数（Ｐ）１、ｎ＝１６）および５週目（Ｐ３０、ｎ＝８）で動物を屠殺した。成体移植のために、１２９またはＣＤ１マウスをＫｏｐｆ定位枠内に置き、そして５μＬのＨＢＳＳ中に懸濁した２×１０５個のＮＳ細胞を線条体（ｎ＝２２）または海馬（ｎ＝２１）に注入した。移植されたマウスを２週後（ｎ＝１６）および４週後（ｎ＝１０）に屠殺し、そして４％パラホルムアルデヒドを経心臓にて灌流した。低温切片（１６μｍ）を以下の抗体で染色した：（マウス）：ＮｅｕＮ（１：１００）およびＫｉ６７（１：１０）（Chemicon）、ＭＡＰ２（１：２００；Becton Dickinson）、ネスチン（１：５;Ron McKay）；（ウサギ）：βIIIチューブリン（１：５００；Covance）；ＧＦＡＰ（１：２００；Dako）；二次抗体、Texas Red（Vector）（Jackson ImmunoResearch）およびAlexaFluor 488（Molecular Probes）。切片を変退色防止溶液中で保存し、そしてNikon TE2000-S ECLIPSEおよびBiorad Radiance 2100共焦点顕微鏡で分析した。
【０１５７】
（実施例２−２）
本発明者らは、ＥＳ細胞の単層分化を７日間誘導し、次いでＥＧＦおよびＦＧＦ−２を添加した基本培地（ＮＳ−Ａ＋Ｎ２）に再播種した。これらの最少条件（ＥＳ細胞生存に対して非許容）下で生存している細胞が主として結合して浮遊塊となる。３〜５日後、これらの凝集体を採取し、そして新鮮な培地に再播種した。それらは、２〜３日以内に付着し、そして二極細胞の形態的に均質な集団に大きくなった（ＬＣ１と命名）。継代に際して、ＬＣ１細胞は、接着培養物として増殖し続け、しばしば、格子状網を形成した。それらは、連続的かつ迅速に増殖され得、倍加時間は約２４時間である。ＬＣ１細胞は、神経前駆マーカーのネスチンおよびＲＣ２を提示するが、星状細胞分化マーカーのＧＦＡＰまたはニューロン抗原の発現は無視し得る程度である（図１Ａ）。血清またはＢＭＰへの曝露に際して、ＬＣ１細胞は、４８時間以内に代表的な星状細胞形態をとり、そして引き続き、ＧＦＡＰを均一に発現する（図１Ａ，ｅ）。対照的に、ニューロン突起を有する細胞は、ＥＧＦなしで５〜７日間ラミニン上に再播種しそしてＦＧＦ−２を除去した後に出現する。これらの細胞は、ニューロンマーカーのIII型β−チューブリン、ＭＡＰ２（図１Ａ，ｆ，ｇ）およびｎｅｕＮ（示さず）を発現している。ほとんどのニューロンは、ＧＡＤ６７（図１Ａ，ｇ）およびＧＡＢＡ（示さず）に対して染色し、そして７日目まで、亜集団が、成熟マーカーのシナプトフィシンの発現を示す（図１Ａ，ｈ）。１１５継代後でさえも、多数のニューロン（＞３５％）が生成される（図１Ａ，ｉ）。ＬＣ１細胞が後期継代で二倍体染色体内容物を保持しているという所見（示さず）とともに、このことは、自己再生神経幹（ＮＳ）細胞の存在を確証している。
【０１５８】
（実施例２−３）
細胞凝集がＮＳ細胞の生成に必須であるか否かを決定するために、本発明者らは、誘導プロセスを通して細胞付着を維持した。このために、本発明者らは、GFPirespacレポーター／選択カセットがＳｏｘ１遺伝子（神経分化の特異的マーカー（Aubertら, 2003）である）に組み込まれている４６Ｃ ＥＳ細胞を用いる系統選択（Liら, 1998）を利用した。分化誘導後の一過性のピューロマイシン選択により、残余ＥＳ細胞のない神経前駆体の精製された集団を得た（Stavridisら, 2003）（図１Ｂ ａ，ｂ）。次いで、ＦＧＦ−２およびＥＧＦを、富化培地中でＳｏｘ１発現神経前駆体に与えた。この条件で細胞は接着したままであった。細胞異質性は３〜４継代にわたって減少した。二極細胞の数が累進的に増大し、広範囲に格子を形成し始めたからである。興味深いことに、Ｓｏｘ１の発現はこの段階で喪失したが（図１Ｂ ｃ，ｄ）、細胞は、Ｓｏｘ２およびネスチンに対してなお陽性であった。神経幹（ＮＳ）細胞の存在を確立するために、単一の細胞をTerasakiウェルに単離し、そして接着培養として増殖させた（図１Ｂ，ｅ，ｆ）。まず、同様の形態および増殖特性の５つのクローン株を、バルクＬＣ１集団に誘導した。これらの細胞は、分化多能性因子のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ、ならびにまた初期神経マーカーのＳｏｘ１の検出可能な発現を欠いていたが、汎神経上皮マーカーのＳｏｘ２およびネスチンを保持していた（図１Ｃ）。したがって、ＮＳ細胞は、連続接着培養によってＳｏｘ１陽性初期神経外胚葉前駆体から生成された。
【０１５９】
（実施例２−４）
クローンＮＳ−５をさらに詳細に試験し、そしてＰａｘ６、Ｇｌａｓｔ、およびＢＬＢＰのｍＲＮＡを発現していること、および、ＲＣ２、ビメンチン、３ＣＢ２、ＳＳＥＡ１／Ｌｅｘ１、およびプロミニンに対して免疫陽性であることを見出した（図１Ｄ）。このマーカーセットは、神経原性放射神経膠に対する診断に有用であるとみなされており、神経系の発生の間のニューロンおよび星状細胞の両方の前駆体である（Campbellら, 2002; Hartfussら, 2001）。クローン化されていないＬＣ１細胞と同様に、ＮＳ−５細胞は、星状細胞およびニューロン分化に対してコンピテントであった（図１Ｅ）。ＥＧＦ＋ＦＧＦ−２にクローン密度で播種したＮＳ−５細胞は、二極細胞のコロニーを生じた。全てのコロニーが、事実上全ての細胞でのＲＣ２およびＢＬＢＰの発現、ならびにＧＦＡＰの不在を示した（図１Ｆ，ｃ，ｄ）。これらのサブクローンを選抜し、そして連続して増殖させた。ＮＳ培養内でのニューロン分化可能な細胞の頻度を決定するために、本発明者らは、再度、ＮＳ−５細胞をクローン密度で播種し、ＥＧＦ／ＦＧＦ−２中で１２日間、次いでＦＧＦ−２単独で５日間、次いでさらに７日間増殖因子なしで増殖させた。全てのコロニー（１２６／１２６）が、ＴｕＪ陽性細胞を生成した（図１Ｆ，ｂ）。これらのデータは、ＮＳ培養物中の全てのコロニー形成細胞が、ニューロン分化に対してコンピテントであったことを示した。最終的に、ＬＣ１と同様に、ＮＳ−５細胞は、二倍体染色体相補体を維持しており（図１Ｇ）、そして複雑な細胞微細環境の必要なく自己再生する非形質転換クローン神経幹（ＮＳ）細胞株であることを表していた。
【０１６０】
（実施例２−５）
無血清単層誘導プロトコルがＮＳ細胞生成に予め必要であるか否かを評価するために、ＥＳ細胞を、胚様体形成および血清含有培地中のレチン酸への曝露によって分化を誘導した（Bainら, 1995）。凝集体を、Ｇ４１８を用いるＳｏｘ２系統選択（Liら, 1998; Billonら, 2002）に４８時間供し、次いで血清なしでＦＧＦ−２およびＥＧＦの存在下で再播種した。付着した後、Ｓｏｘ２陽性、ネスチン陽性の細胞が増殖した。これらの細胞は、ＮＳ細胞に代表的な二極性の形態および格子状の増殖を提示し、さらに多重継代後に星状細胞およびニューロン分化能を有した（データは示さず）。このように、ＮＳ細胞が、胚様体から誘導された。
【０１６１】
（実施例２−６）
３つの独立したＥＳ細胞単離株Ｅ１４ＴＧ２ａ、ＣＧＲ８、およびＲ１から、ＬＣ１について記載したような系統選択を行わずに単層誘導を用いてＮＳ細胞を誘導した。試験したＮＳ株は全てが、細胞の少なくとも９５％においてネスチンおよびＲＣ２を発現した。ＣＧＲ８およびＥ１４ＴＧ２ａ由来ＮＳ細胞のより詳細な研究により、フルパネルの放射神経膠マーカー（図２Ａ）、神経前駆体マーカーＳｏｘ２およびＳｏｘ３、ならびにｂＨＬＨ転写因子Ｏｌｉｇ２およびＭａｓｈ１（図２Ｂ）を示した。Ｓｏｘ１がダウンレギュレートされたがＳｏｘ２は維持されたことは、これらの転写因子の推定の決定的機能（Pevnyら, 1998）を考慮して、これらのＮＳ細胞の顕著な特徴であった。このように、Ｓｏｘ１は、全ての神経外胚葉前駆体をマークしているが、Ｓｏｘ２が重要な役割を果たしていると考えられる幹細胞においては、これは保持されなかった。ＮＳ細胞はまた、Ｅｍｘ２を発現していた。Ｅｍｘ２は、神経前駆細胞の増殖に関与している（Heinら, 2001; Galliら, 2002）。試験した全てのＮＳ培養物は、形態学および免疫染色の両方によって評価される星状細胞およびニューロンの分化を受けた（図２Ｃ）。
【０１６２】
（実施例２−７）
それらの放射神経膠への明らかな関係を考慮して、本発明者らは、ＮＳ細胞が、エクスビボ増殖へのＥＳ細胞の前適応から生じるか、または胎児神経組織から誘導され得るかを調べた。Ｅ１６．５胎児脳からの一次胎児ＣＮＳ細胞は、増殖因子を添加した基本培地ではプラスチックへの接着はわずかであり、自発的に凝集体を形成した。６〜７日後、これらの凝集体は、ゼラチンコーティングしたプラスチック上に定着した。１４日後、成長体をトリプシン処理し、そしてゼラチンコーティングしたプラスチック上に播種した。３つの別個の実験において、ＮＳ細胞と形態学的に同定可能な細胞が増殖し、そして引き続き増殖させて、連続細胞株になった。これらの胎児脳誘導物は、ＥＳ細胞由来ＮＳ細胞と同じ放射神経膠および神経原性マーカーを発現し（図２Ａ、Ｂ）、そして一致したｍＲＮＡプロフィールを示した。それらは、同様に、星状細胞およびニューロン分化に対してコンピテントであった（図２Ｃ）。ＮＳ−５について記載したように、皮質誘導Ｃｏｒ−１細胞を単一の細胞として播種し、次いでコロニーを引き続く増殖因子除去に供した。全てのコロニーが、ＴｕＪ陽性ニューロンを生成していた。このことは、Ｃｏｒ１培養物中の全てのクローン原性細胞が神経原性であることを示していた。Ｃｏｒ−１細胞もまた、個々の細胞から容易にサブクローン化されそして連続的に増殖された。これは、自己再生を示す。このように、ＮＳ細胞が胎児脳から誘導され、そしてこれは、ＥＳ細胞由来ＮＳ細胞の重要な特性を共有していた。
【０１６３】
ほとんどのＮＳ細胞は、放射神経膠であると認められる、伸長した二極性の形態、平板状の伸長部、エンドフィートおよび卵形の核（Rakic, 2003）を有していた。短い伸長部を有する扁平状の緻密な細胞もまた存在していた。中期マーカーであるリン酸化ヒストンＨ３に対する免疫染色により、緻密な細胞は、有系分裂しているものであることが示された。時間差ビデオ顕微鏡により、細胞分裂前に形態が活発に変化していることが確認された。さらに、この時間差により、ＮＳ細胞が、運動間の核移動を受けていることが明らかになった。これは、インビボでの神経上皮および放射神経膠細胞の十分に特徴付けられた特徴である。
【０１６４】
したがって、ＮＳ細胞は、神経原性放射神経膠の連続的に増殖可能なインビトロアナログであった。
【０１６５】
（実施例２−８）
凍結／融解した４０継代目のマウス神経球を、ＮＳ増殖培地中でゼラチンコーティングしたプラスチックに付着させた。ＮＳ細胞と区別不能な二極細胞が生じた。これらの細胞は、均一なＲＣ２陽性ＧＦＡＰ陰性の集団として連続的に増殖され得、次いで星状細胞またはニューロンへの分化が誘導され得る。
【０１６６】
（実施例２−９）
本発明者らは、マウス脳への移植の際のＮＳ細胞の挙動を調べた。レンチウイルスｅＧＦＰ発現ベクターを用いて形質導入したＥＳ細胞由来ＬＣ１細胞を、Ｅ１４．５での子宮内注入により発生中の脳に導入した（Magrassiら, 1998）。出生後、動物を屠殺し、そして脳切片のｅＧＦＰ陽性細胞の存在を調べた。ＮＳ細胞子孫は、種々の脳領域に遊走していた。免疫組織化学分析により、ｅＧＦＰと、前駆体マーカーネスチン、ニューロンマーカーＴｕＪ、ＮｅｕＮ、およびＭＡＰ２と、ならびに数は少なくなるがＧＦＡＰとが共発現していることが明らかになった。ＮＳ細胞を成体マウス線条体にも注入した。この場合、ＧＦＰ陽性細胞は、注入部位の近辺に局在したままであった。移植４週間後、ＧＦＰ発現細胞の４４．４±５．７％がニューロン形態を有しそしてＭＡＰ２に対して免疫陽性であり、３７．４±６．１％がＧＦＡＰを発現し、そして４．２±１．９％がネスチンの発現を保持していた（図３）。増殖マーカーＫｉ６７は、ＧＦＰ陽性細胞の１．０±０．６％でのみ検出された。このことは、ＮＳ細胞がインビボで細胞周期から回収されたことを示している。このことと一致して、本発明者らは、移植の１ヵ月後に調べた全部で３５の脳において、制御されない増殖または腫瘍形成の組織学的証拠がないことを認めた。さらに、マウス腎臓嚢に移植されたＮＳ細胞は、増殖せず、奇形腫も生じなかった。これらのデータは、ＮＳ細胞が胎児脳および成体脳の両環境において生存しそして分化し得ること、およびＥＳ細胞（Brustleら, 1997）とは異なり、それらは奇形腫を生じないことを示していた。さらに、この比較的高い頻度でのニューロン分化は、継代した神経球の移植片（Rossiら, 2002）とは非常に対照的である。
【０１６７】
（実施例２−１０）
最後に、本発明者らは、同様のＮＳ細胞が、ヒト供給源から単離され得るか否かを調べた。贈与された余剰胚からヒトＥＳ細胞を誘導する過程において、本発明者らは、培養５〜６週後に、神経上皮細胞に代表的であるロゼット状構造への広範な分化を認めた。これらの細胞をＮＳ増殖培地に移した。さらに３〜４週後、ＮＳ細胞に類似の二極細胞がこれらの培養物から出現し（図４Ａ）、そして５ヶ月間連続的に培養した。本発明者らはまた、選択中絶からカーネギー１９〜２０期のヒト胎児皮質組織を確保した。解離した細胞はまず浮遊凝集体を形成した。マウス胎児脳からのＮＳ細胞の誘導と同様に、その７日後に再播種し、そしてゼラチンコーティングしたプラスチックに付着させた。増殖している培養物が樹立された（図４Ｂ）。ＥＳ細胞および胎児組織の両方からのヒトＮＳ培養物は、二極細胞が付随した扁平状の細胞の存在によって特徴付けられた。しかし、全ての細胞が、未熟前駆体マーカーであるネスチン、ビメンチン、および３ＣＢ２を発現していた（図４Ｂ）。時間差モニタリングによって、２つの細胞形態が形成されかつこれらは互換性であることが確証された。これらのヒト細胞はまた、低レベルのＧＦＡＰを提示し、これは、放射神経膠中のヒトＧＦＡＰプロモーターの活性（Rakic, 2003; Malatestaら, 2000）と一致した。それらは、マウス細胞よりもゆっくりと増殖した。倍加時間は数日間であった。ＥＧＦおよびＦＧＦ−２を引き続き除去した後、それらは、未熟なニューロン細胞を生成しているようであった（図４Ｃ）。強いＧＦＡＰ免疫反応性を有する代表的な星状細胞形態の細胞が、血清中の継代後に生成された（図４Ｃ）。
【０１６８】
（実施例３）
特定の処理後、これらの細胞が、成熟した機能的なニューロンに効率的に転換し得るか否かを電気生理学的観点から知るために、インビトロでの分化の間、培養物におけるＮＳ細胞の電気生理学特性を、パッチクランプ技術のホールセル改変型を用いることにより調べた。
【０１６９】
（電気生理学記録用溶液）
電極と細胞との間のシールを、以下からなるバス溶液中で確立した（ミリモル／ｌで表す）：１５５ ＮａＣｌ、１．０ ＣａＣｌ２、１ ＭｇＣｌ２、３．０ ＫＣｌ、１０ グルコース、１０ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）。ホールセルコンフィギュレーションを確立した後、電流クランプ記録および電圧クランプ中の総電流記録のために、ピペット充填溶液は以下を含んだ（ミリモル／ｌで表す）：１２８ ＫＣｌ、１０ ＮａＣｌ、１１ ＥＧＴＡ、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）。電圧クランプ条件下での電圧ゲートＮａ＋チャネルの研究のために、パッチピペットを以下で満たした（ミリモル／ｌで表す）：１３０ ＣｓＣｌ、１０ ＮａＣｌ、２０ ＴＥＡ−Ｃｌ、１０ ＥＧＴＡ、２ ＭｇＣｌ２、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ ＨＥＰＥＳ／ＣｓＯＨ（ｐＨ７．４）。そして細胞外溶液は以下を含んだ（ミリモル／ｌで表す）：１３０ ＮａＣｌ、２ ＣａＣ１２、２ ＭｇＣｌ２、１０ グルコース、５ テトラエチルアンモニウム−Ｃｌ、ＣｄＣｌ２ ０．２、１０ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）。電圧ゲートＣａ２＋チャネルの研究のために、パッチピペットを以下で満たした（ミリモル／ｌで表す）：１２０ ＣｓＣｌ、２０ ＴＥＡ−Ｃｌ、１０ ＥＧＴＡ、２ ＭｇＣｌ２、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ ＨＥＰＥＳ／ＣｓＯＨ（ｐＨ７．４）。そして細胞外溶液は以下を含んだ（ミリモル／ｌで表す）：１３０ ＮａＣｌ、１０ ＢａＣｌ２、１０ グルコース、５ テトラエチルアンモニウム−Ｃｌ、１０ ４−ＡＰ １、ＴＴＸ １０−３、ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）。
【０１７０】
（パッチクランプ記録）
イオン電流を、Axopatch 200Bパッチクランプ増幅器（Axon Instruments Inc., Burlingame, CA）によって室温（２０〜２４℃）でパッチクランプホールセル配置（１９）を用いて電圧クランプ条件下で記録し、そしてＩＢＭ互換ＰＣとインターフェースしたDigidata 1322A Ａ／Ｄ変換器（Axon Instruments Inc., Burlingame, CA）を用いて、２６〜１００μｓｅｃのサンプリング間隔でデジタル化した。刺激、データの取得、およびデータ分析は、以下のソフトウェアパッケージを用いて実施した：pClamp 9（Axon Instruments Inc., Burlingame, CA）およびORIGIN 6（Microcal Software Inc., Northampton, MA）。電圧クランプ実験のために、まず、漏洩および容量の電流の線形成分をアナログサーキットリによって減少させ、次いでＰ／Ｎ法でほぼ完全にキャンセルした。パッチピペットをホウケイ酸ガラス管から作製し、火入れした。ピペットは、内部溶液で満たしたときに３〜４ＭΩの最終抵抗を有していた。電流は５ＫＨｚでフィルタリングした。
【０１７１】
図５Ａは、内向き（Ｎａ＋）および外向き（Ｋ＋）の両電圧ゲートイオン電流の分離に適したバスおよびピペット充填溶液を用いた、インビトロ分化の異なる段階での３つのＮＳ細胞（それぞれ分化培地中で６日、２０日、および３０日間培養）における脱分極試験電位に対するホールセル電圧クランプ工程の間に得られた電流記録を示す。電流追跡の簡単な観察から、相当に大きな外向きの電圧ゲート電流がインビトロ分化の初期段階で既に存在していることが明らかである（６日、トレースａ）。この電流は、５ｍＭテトラエチルアンモニウム−Ｃｌを含む細胞外生理食塩水の適用によってブロックされ、遅延整流Ｋ＋電流の特徴を有する。その振幅は、分化の後期段階でわずかにのみ増大した（２０〜３０日、それぞれトレースｂおよびｃ）。対照的に、内向き電流の振幅は、６日後では無視し得る程度であるが、分化培地への曝露時間の増加によって劇的に増大している。図５Ｂは、図５Ａに示した同じ細胞における電圧クランプから電流クランプモードへの切り替え後に、約−８０ｍＶの保持電位からの７０〜３００ｐＡの間の矩形脱分極電流刺激の細胞内注入後に誘発された電圧応答を示す。確かに、電圧ゲート内向き電流の振幅の増大は、分化している細胞が活動電位を誘発する能力を反映している。実際、６日間のみ分化剤に曝露されて無視し得る程度の内向きを示している細胞は、再生電圧応答を誘発することができなかった（図５Ｂに（ａ）で示したトレース）。対照的に、比較的速い脱分極速度を有するオーバーシュート作用電位が、３０日間分化培地で培養され（図５Ｂに（ｃ）で示したトレース）そして大きな内向き電流を提示する（図Ａのトレースｃ）細胞において誘発され得た。中間型の状況（不全活動電位を有する）が、分化剤で２０日間処理され（図５Ｂに（ｂ）で示したトレース）そして中位の内向き電流を提示している（図Ａのトレースｂ）細胞で見られた。この予備分析から、これらの細胞の興奮特性が、内向き電圧ゲートコンダクタンスの大きさに対して厳密に相関していることが分かる。分化培地への曝露時間の関数としてのこのコンダクタンスの定量分析のために、内向き電流は、分化の異なる段階の細胞を用いそして電圧ゲートＮａ＋チャネルの活動の研究に特異的な細胞内および細胞外生理食塩水を適用して、誘発される（方法を参照のこと）。細胞分化の任意の時間で、速い不活性化内向き電流は、選択的Ｎａチャネルブロッカーであるテトロドトキシン（１μＭ）によって完全にブロックされ、そして−２０〜−１０ｍＶの間の試験電位でピークとなった。これは、ニューロンにおける電圧ゲートＮａ＋電流の代表的な特徴を示している（データは示さず）。図５Ｃには、分化培地への曝露時間の関数として−２０ｍＶでのＮａ＋電流振幅の発生が示される。興味深いことに、Ｎａ＋コンダクタンスの増大は、分化培地への細胞曝露の増大と十分に相関している。確かに、平均して、Ｎａ＋電流振幅は処理３０日以内で約１０倍増大している（最初の５日間の５５±１４ｐＡ（ｎ＝１７）から２５日より長い間の−４３４±１３５ｐＡ（ｎ＝１３）へ）。同じように、電流クランプ条件下のＮａ＋電流により誘発された再生電位（閾値とピーク値との間で測定されたΔＶ）は、インビトロ分化の最初の１５日間（ｎ＝６）は０から＋２０ｍＶの間であったが、処理が２５日より長ければ、＋３０から＋７０ｍＶの間の値に達した（ｎ＝６）。全体では、分化培地で２５日より長く処理されたＮＳ細胞で見られた興奮特性および原電圧ゲートＮａ＋コンダクタンスの特性は、それらの成体表現型に発達しているニューロンに代表的である。以前の結論を立証する別の特徴は、少なくとも７日間またはそれより長く分化培地に曝露した後に試験した細胞のほとんどにおける電圧ゲートＣａ２＋チャネルコンダクタンスの存在である。図５Ｄは、１０ｍＭ Ｂａ２＋のバス中に入れた同じ細胞からの示した試験電位に対する膜脱分極により得られるサンプル追跡を示す。−４０ｍＶで誘発された速い活性化およびやや速い不活性化（Δｈ＝２１ｍｓ）電流成分は、ニューロンＬＶＡ Ｃａ２＋チャネル電流（CarboneおよびLux, 1987）を暗示している。対照的に、０ｍＶで誘発されたＢａ２＋電流は、ゆっくりとした（Δｈ＝７３ｍｓ）不完全な不活性化を提示し、ニューロンＨＶＡ Ｃａ２＋チャネル電流の代表的な特徴を有する。この細胞における２つの別個（ＬＶＡおよびＨＶＡ）のＣａ２＋チャネルコンダクタンスの存在は、図５Ｅの電流−電圧関係によって確証される。平均して、ＬＶＡ電流は−４０ｍＶでピークであるが、ＨＶＡ電流についてＩ／Ｖ関係は０ｍＶでピークであった。ＨＶＡ Ｂａ２＋電流は、２７細胞のうち１９で検出可能であったが、ＬＶＡ電流成分は、ＨＶＡ Ｃａ２＋電流を既に発現している細胞の６０％で測定された（ｎ＝１３）。
【０１７２】
このデータは、本発明の神経幹細胞から生成されたニューロンが機能し得ることを示している：それらは、活動電位を刺激し得、これは、活性ニューロンの顕著な特徴である。
【０１７３】
したがって、本発明にしたがって、本発明者らは、所定のＮＳ細胞をＥＳ細胞および胎児脳抽出物の分化した子孫として誘導しそして均質に増殖した。ＮＳ細胞は、簡単な接着単層培養でクローン増殖し、そして二倍体を維持した。増殖の延長後、それらは、インビトロおよび成体脳への移植の両方で、ニューロンおよび星状細胞に効率的に分化した。ＮＳ細胞はまた、インビトロで乏突起膠細胞も形成した。ＮＳ細胞は、放射神経膠の形態および分子特徴、ニューロンおよび星状細胞の胎児前駆体、を均一に発現していた。本発明者らは、マウスおよびヒトの両方の胎児脳から接着ＮＳ細胞株を樹立できた。
【０１７４】
（実施例６）
以下のプロトコルを用いて、ＮＳ細胞を、マウスＥＳ細胞および胎児皮質から得た。誘導されたＮＳ細胞は、放射神経膠マーカーを均一に発現していた。ＣＧＲ８ ＥＳ細胞またはＥ１６胎児皮質（内部参照：Ｃｏｒ−１およびクローン誘導体Ｃｏｒ−１．３）から特異的に誘導されたＮＳ細胞を、免疫化学により指示マーカーの発現について分析した。ハイパワーでの試験は、放射神経膠マーカーが、ほとんど全ての細胞において各々発現されており、一方、均一にＧＦＡＰに対して陰性であったことを示した。
【０１７５】
（実施例７）
以下のプロトコルを用いて、ＮＳ細胞を、増殖させたマウス胎児前脳神経球から誘導した。長期胎児神経球培養物（４０継代）由来のＮＳ株は、ＥＳ由来ＮＳ株と同一の形態を示し、神経前駆細胞／放射神経膠マーカー免疫反応性を発現し、そしてニューロンおよび星状細胞に分化し得た。これは、新鮮な胎児神経球から得られたＮＳ細胞が、凍結し次いで長期間神経球として増殖した神経球から得られたものと同じであることを示した。
【０１７６】
（実施例８）
ＬＣ１マウスＮＳ細胞を胎児ラット脳に移植した。ｅＧＦＰを用いてレンチウイルス形質導入したＮＳ細胞の共焦点像を、Ｅ１４．５ラットの脳室への移植１週間後に撮影した。ドナー細胞は、塊状でおよび単一の細胞として、脳室から柔組織に移動した。移植された細胞は、ｅＧＦＰとニューロンマーカーＭＡＰ２、星状膠マーカーＧＦＡＰまたは前駆細胞マーカーネスチンとの共局在を示した。したがって、ＮＳ細胞は、胎児ラット脳における移植後、移動しそして分化した。
【０１７７】
（実施例９）
（ＮＳ細胞株の誘導および操作のためのプロトコル）
本発明者らは、ＮＳ細胞株の誘導および操作のために、以下のプロトコルを案出した。
【０１７８】
（ＥＳ細胞からのマウスＮＳ細胞株の誘導）
ＥＳ細胞は、接着単層培養においてＳｏｘ１発現神経前駆体に効率的に変換され得る［Ｐ１］。このＥＳ細胞分化に関する詳細なプロトコルおよびトラブルシューティングは他にも記載される［Ｐ２］。簡潔には、ＥＳ細胞を、ゼラチンコーティングした組織培養プラスチック上で１０％ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍｌ組換え白血病阻害因子（ＬＩＦ）を添加した培地中にフィーダーを与えない条件下で通常通りに培養する［Ｐ３］。未分化のＥＳ細胞を、Ｔ７５フラスコ（Iwaki）中で約８０％コンフルエンスまで増殖させ、トリプシン処理し、そしてＮ２Ｂ２７培地中に再懸濁する［Ｐ２］。細胞を、少なくとも１０分間０．１％ゼラチン溶液（Sigma）でコーティングし次いで乾燥させておいた９ｃｍプレート（Iwaki）上に播種する。初期播種密度は、効率的な神経誘導にとって重大なパラメーターであり、そしてＥＳ細胞株間で変動し得るので、本発明者らは、プレート当たりいくつかの異なる細胞密度（０．８×１０６、１×１０６、および１．２×１０６）で、通常通りに播種する。脱着または死亡した細胞を除去する過程で、毎日、培養培地を入れ替える。これらの条件下では、５０〜８０％の細胞が４〜５日以内に神経系統分化を受け、そして５日目から先では明白なニューロン分化が検出可能となる。
【０１７９】
不均質な前駆体培養物の均質ＮＳ細胞株への変換は、以下のようにして達成され得る。７日目の分化培養物をトリプシン処理し、そして２〜３×１０６個の細胞を、ＮＳ増殖培地（これはＬ−グルタミン、２ｍＭ 最終（Gibco）、改変Ｎ２補充物（ウマからの調製直後のもの）［Ｐ２］ならびに１０ｎｇ／ｍｌのマウスＥＧＦ（Peprotech）およびヒトＦＧＦ−２（Peprotech）を添加したＮＳ−Ａ培地（Euroclone）を含む）中で非コーティングＴ７５フラスコ中に再播種する。増殖培地は、４週間までの間、４℃で保存され得る。２〜３日以内に、フラスコは、懸濁培養物中に数千もの浮遊凝集体を含むようになる（絶対数は、初期ＥＳ細胞分化の効率に従って変動する）。細胞凝集体は、穏やかな遠心分離によって回収するか、または１０分間３０ｍｌユニバーサル管中で重力に従って静置させる。この工程は、破片および死細胞を除去することによりＮＳ細胞創始物を濃縮し、そして完全な培地交換を確実にする。細胞を、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコ（Iwaki）上で１０ｍｌの新鮮なＮＳ増殖培地に再播種する。さらに３〜７日後、細胞凝集体は、フラスコに付着し、そしてその後まもなく、特徴的な二極ＮＳ細胞形態を有する細胞が生じる。広範な細胞成長後（さらに３〜４日後）、集団全体をトリプシン処理し、そして増殖培地中でゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコ上に単一の細胞として再播種する。細胞は、非常に迅速に増殖し（倍加時間約２５時間）、そして接着したままである。数継代以内に、残りの分化した細胞および芽球細胞は排除され（ＧＦＡＰおよびＴｕＪ１免疫染色によってモニタリングする）、そして培養物は、ＮＳ細胞マーカーに対して均一に陽性である。
【０１８０】
４６Ｃ ＥＳ細胞（Ｓｏｘｌ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｐａｃノックイン）［Ｐ４］のために、ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を用いる一過性の選択が、非神経細胞を排除しそして連続接着培養を介してＮＳ細胞を誘導するために使用され得る。４６Ｃ ＥＳ細胞（１×１０６）を、ゼラチンコーティングした９ｃｍディッシュ上でＮ２Ｂ２７培地中に播種して、神経方向付けを誘導する。６日後、ピューロマイシンを４８時間添加する。次いで、富化されたＳｏｘ１発現細胞集団（約３〜５×１０６）を、ゼラチンコーティングした９ｃｍプレート上でＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むＮ２Ｂ２７培地中に再播種する。初期に形態学的に不均質なＳｏｘ１を発現する集団は、Ｓｏｘ１陰性特徴を、そして３〜４継代後には、均一なＮＳ細胞形態およびマーカー発現を、累進的に獲得する。
【０１８１】
（胎児ＣＮＳおよび神経球からのマウスＮＳ細胞株の誘導）
細胞クラスターは、ＮＳ細胞増殖培地中での胎児Ｅ１６．５皮質および一次培養物の解離の際に懸濁液中で形成される。これらの一次凝集体は、増殖培地中でゼラチンコーティング基材上に播種することにより、接着ＮＳ細胞株に容易に変換され得る。付着を促進するために、まず破片／死細胞を沈降によって有効に除去し、そして培地を完全に交換することが重要である。細胞凝集体が付着し、そして２〜５日にわたって増殖する。引き続き、増殖している細胞をトリプシン処理して単一の細胞にし、再播種し、そしてＮＳ細胞増殖培地中で増殖させ得る。継代した胎児神経球［Ｐ５］から、ＮＳ細胞は、便宜的には、解離およびＮＳ増殖培地中でのゼラチンコーティングしたプラスチック上への直接播種によって樹立され得る。初期の数継代の間、誘導されたＮＳ株は、特に細胞密度が高くなる場合には、凝集する傾向を有し、フラスコから脱着し、そして神経球を再形成する。したがって、培養物は、５０％以下のコンフルエンスで継代されるべきである。自発的に凝集する傾向は、可変性であるが、一般には、さらなる継代の際にまたはクローン細胞株の樹立を通して減少される。
【０１８２】
（ＮＳ細胞の継代および増殖）
一旦樹立されると、ＮＳ細胞をＮＳ増殖培地で増殖させる。ＮＳ細胞を、ゼラチンコーティングしたプラスチック／フラスコ上で増殖させ、そして１／２から１／５に通常通りに分割する。ＮＳ細胞は、約２５時間の倍加時間を有する。トリプシン／ＥＤＴＡを用いて、またはカルシウムマグネシウム非含有ＰＢＳ（Sigma）とのインキュベーションによって、細胞を継代させる。クローン株の樹立のために、単一の細胞を、増殖培地中でゼラチンコーティングしたマイクロウェル中に堆積させ得る。より厳格ではないが、細胞は、非常に低い密度で播種し得る（９ｃｍディッシュ当たり１０００細胞）。コロニーが、２週間以内に出現し、そして選抜され増殖され得る。
【０１８３】
（ＮＳ細胞の凍結保存および回収）
ＮＳ細胞は、凍結／融解後に容易に回収される。通常通りに、本発明者らは、６０〜９０％のコンフルエンスであるＴ７５フラスコをトリプシン処理し、そして１．５ｍｌ ＮＳ増殖培地＋１０％ ＤＭＳＯ中にペレットを再懸濁する。次いで、これを３つの１ｍｌ凍結管（Nunc）に分け、そして−８０℃で貯蔵する。ＮＳ細胞は、これらの条件では６ヶ月より長い貯蔵後でも回収可能である。長期貯蔵のために、凍結バイアルを液体窒素に移す。バイアルを急速に３７℃にし、続いて１０ｍｌの予温ＮＳ増殖培地に移すことにより、ＮＳ細胞を融解する。細胞をペレット化し、次いで新鮮な増殖培地中に再懸濁してＤＭＳＯを除去する。凍結保存後の細胞回収率は、ＮＳ細胞については９５％を超える。
【０１８４】
（ＮＳ細胞の星状細胞およびニューロン分化）
ＮＳ細胞のＧＦＡＰ陽性星状細胞への迅速な分化は、ゼラチンコーティングしたフラスコ／プレート上でＮＳ−Ａ（Ｎ２あり、ＥＧＦ／ＦＧＦなし）中でＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）または１％ ＦＣＳにＮＳ細胞を曝露してから２日以内に生じる。細胞密度は、星状細胞分化にとって重要なパラメーターではない。
【０１８５】
ニューロン分化のために、ＮＳ細胞を、Accutase（Sigma）またはカルシウム／マグネシウム非含有ＰＢＳを用いて細胞を脱着して回収し、そして０．５〜１．０×１０４個の細胞を、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）、改変Ｎ２、およびＢ２７（Gibco）を添加したＮＳ−Ａ培地中で、ポリオルニチン／ラミニンコーティングした４ウェルマルチディッシュプレート（Nunc）の各ウェル中に再播種する。本発明者らは、ＮＳ−Ａ基本培地が、他の基本培地よりもニューロン分化に対してより許容性であることを見出している。培地の容量の半分を２〜３日ごとに取り替え、培地の条件付けを維持する。これらの条件で７日後、本発明者らは、ＥＧＦもＦＧＦも含まない０．２５×Ｎ２およびＢ２７を添加したNeurobasal培地（Gibco）と１：１の比で混合したＮＳ−Ａに、培地を交換する。この処方物は、さらなるニューロン分化および成熟を促進する。より長期のニューロン培養（１４日を越える）のために、本発明者らは、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＢ２７を含むがＮ２を含まないNeurobasalに、培地を交換する。
【０１８６】
（ヒトＮＳ細胞の培養およびニューロン分化）
１００Ｕ／ｍｌ組換えヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ）をさらに添加したマウスＮＳ細胞と同様の増殖培地中で、ヒトＮＳ細胞を、０．１％ゼラチン（Sigma）でコーティングしたフラスコ／プレート上で増殖させる。細胞は、約１週の倍加時間を有する。それらを、約３０％のコンフルエンスに達するとトリプシンで継代させ、そして１／２に分ける。単層培養を維持しそして凝集および脱着を防ぐために、過剰増殖は避けるべきである。
【０１８７】
ニューロン分化のために、ヒトＮＳ細胞を、Accutase（Sigma）を用いて回収し、そして約１×１０４個の細胞を、増殖培地中で、ポリオルニチン／ラミニン（Sigma）コーティングした１２ウェルプレート（Iwaki）の各ウェル中に再播種する。細胞を、それらが約８０％のコンフルエンスに達するまで増殖させる。ニューロン分化は、増殖培地からＥＧＦおよびＬＩＦを除去することにより誘導する。ＥＧＦおよびＬＩＦのない状態で７日後、０．５×Ｎ２、Ｂ２７、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したNeurobasal培地（Gibco）と１：１の比で混合したＮＳ−Ａに、培地を交換する。これらの条件でさらに７日後、培地を、Ｎ２もＦＧＦ−２も含まないＢ２７およびＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したNeurobasal培地に交換する。このプロトコル全体を通して、マウスＮＳ細胞と同様に、培地の容量の半分を２〜３日ごとに取り替える。さらに１０日後、ＴｕＪ１およびＭＡＰ２と免疫反応性であるニューロン形態の細胞は、全細胞数の４０％までになる。ＧＦＡＰ陽性細胞がほとんど出現しないニューロン分化に関するマウスＮＳ細胞プロトコルとは対照的に、有意な数の星状細胞もまた生成される。
【０１８８】
したがって、本発明は、対称的に分裂している未分化状態で、多くの種の神経幹細胞を得て維持するための方法および培地を提供する。本発明は、ＥＳ細胞、胎児および成体供給源から得られるまたは摘出される細胞を用いて実施されている。全ての場合において、本明細書中に記載の方法に従うことにより得られた結果の細胞は、実質的に同じように見え、挙動する；それらは全て、多数（例えば数百）の倍加にわたって高純度培養で維持され得、高い割合の細胞が、ニューロンおよび神経膠を形成する能力を保持している。特に、ヒト（ＥＳ、胎児ＣＮＳ）、マウス（ＥＳ、胎児ＣＮＳ、成体ＣＮＳ）およびラット（胎児ＣＮＳ）から、ＮＳ細胞が首尾よく得られている。マウス神経幹細胞は、培養物中で純粋な集団で増殖され、そして移植された後、腫瘍を形成することなく増殖するが、インビボで分化している。
【０１８９】
（参考文献）
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（プロトコル参考文献）
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P5. Reynolds BA, Weiss S (1996) Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev Biol 175: 1-13.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経幹細胞、ならびに幹細胞の対称分裂および自己再生を促進するための神経幹細胞（ＮＳ細胞またはＮＳＣ）の培養条件および培養方法に関する。組成物、細胞集団、細胞株、および単一の神経幹細胞もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
神経幹細胞は種々の供給源からインビトロで単離されるといわれているが、これまで、これらの細胞を対称分裂している未分化状態で大規模培養で増殖することはできなかった。この状態での細胞の長期の増殖が、実験的観点および治療的観点の両方から、非常に望ましい。純粋な神経幹細胞集団を有することにより、ニューロン、星状細胞、および乏突起膠細胞の３つの細胞型への方向付けられた分化が可能になる。
【０００３】
神経幹細胞を培養する１つの公知の方法は、不均質な細胞集団中の微量成分であるにも関わらず、神経球系である。この系は、不均質な細胞の凝集体の連続継代を包含するが、真の神経幹細胞はほんのわずかな割合でしかない。神経球中の細胞の大部分は、分化が方向付けられた前駆体である。
【０００４】
神経球の異質性および不安定性、ならびにそれがニューロンを生成する能力に制限があることの多くの報告がある（例えば、Morsheadら, 2002）。Rappaら Neuroscience 2003は、フィブロネクチン上にそれらを１〜７日間播種し、次いで神経球を再形成することにより神経球細胞をトランスフェクトするための方法を報告しているが、（ある場合には）神経球内の幹細胞のいかなる顕著な特徴づけも提供していない。
【０００５】
Suslovら 2002は、神経球系が、その中の任意の幹細胞の有意義な特徴づけを可能にするには不均質すぎることの明確なデータを提供している。主な結論は、神経球内の異質性がある−「クローン内神経細胞系統多様性を示す、すなわち、それらは、ＮＳＣに加えて、異なる分化状態のニューロンおよび膠細胞前駆体を含む」−だけでなく、異なるクローン神経球株間の遺伝子発現プロフィールに大きな差異が存在することである。Suslovの遺伝子発現プロファイリングは、「得られた分子表現型は、我々の系の中のクローン原性ＮＳＣが不均質であり、別個の神経発達方向の決定を反映しているサブセットを有することを示している」と論文中に明白に確認されているように、神経球内の幹細胞の定義を構成していない。
【０００６】
この分野における多くの文献は、膠細胞の特性を記載している。Skoghら MCN 2001は、ＧＦＡＰを発現しそしてＲＣ２およびネスチンに対して可変的に染色する膠細胞の培養物を記載している−マウスＧＦＡＰは、インビボにて放射神経膠で発現されていないことに留意されたい（Rakic, 2003）。彼らは、彼らの細胞が、神経原性放射神経膠のホールマークであるＰａｘ６を発現していないことを報告しており（Malatestaら, 2001, 2003）、そして彼らは、他の放射神経膠マーカーはどれも調べていない。彼らは、不均質な培養物を有していたが、クローン分析を実施しなかった。
【０００７】
インビトロでの放射神経膠の他の報告は、それらを分化の中間体または終末産物としてみなしている。したがって、Bibelら（Nat Neurosci, 2004）は、一過性放射神経膠様細胞を介するＥＳ細胞からのニューロンの生成を報告しており、そしてGreggおよびWeiss（J Neurosci, 23: 11587-601,2003; 米国特許公開２００３／００３２１８１）は、放射神経膠への神経球細胞の「分化」を記載している。Hartfussら（Dev Biol, 2001）は、放射神経膠が神経球に存在していることを示している。
【０００８】
GreggおよびWeissは、放射神経膠が神経球の分化産物であることを見出し、「これらの結果は、神経幹細胞がＲＧＣ［放射神経膠細胞］を生じ得ること、およびＲＧＣが導く移動は成体ＣＮＳにおいて繰り返され得ることを示唆している」と結論した。優勢な意見は、放射神経膠が、神経球から生じる分化した細胞型の１つであるというものである。
【０００９】
LiourおよびYu（Glia, 2003）は、放射神経膠細胞分化がＥＳ細胞から得られ得ることを示しているが、この分野の他の報告と同様に、神経原性放射神経膠の発現を報告していない。
【００１０】
Gobbelら Brain Res 2003は、「基材に緩く付着した増殖した細胞の球状塊としての」、すなわち、均一な単層としてではない、多分化能性ラット細胞の増殖を報告している。さらに、この論文の要約は、「これらの細胞は、３つの分裂のうち約２つにおいて分裂終了細胞を生じ、このため増殖を困難にしている」と結論している。それらの培養物中には広範囲の膠原性分化があるが、著者らは「比較的少ない」（＜３％）のニューロンを見出している。彼らは、彼らの細胞の分子表現型を提供していない。
【００１１】
ＷＯ０１／３０９８１は、ニューロンに分化し得る細胞の培養物を記載している。しかし、これらの細胞は、ＧＦＡＰおよびネスチンに対して陽性であり、星状膠細胞として記載され、そして比較的純粋でない混合集団である。
【００１２】
幹細胞が特定の細胞微環境、すなわちニッチを必要とするという概念は、幹細胞生物学において通説である。常に認められているわけではないが、神経球において、幹細胞は、前駆体、芽球細胞、および未熟分化子孫の中で総細胞のほんのわずかな割合しか占めていないことが知られている。この混合細胞型の凝集は、その中で小部分である、幹細胞であり得る細胞のためのニッチを構成し得る。
【００１３】
文献の中で、ＥＳ細胞から神経幹細胞の均質な集団を誘導するとの報告はなく、唯一、神経膠に制限されるようになる前に一過的に増殖され得る神経上皮前駆細胞を誘導するとの報告がある（例えば、Brustleら, Science 1999）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、当該分野には多数の課題が存在している。
【００１５】
全ての報告は、それらの培養物が不均質であることを認めている。対称的に分裂しかつ未分化の状態で神経幹細胞の大規模培養を維持するために、神経球系を使用することはできなかった。多数の神経幹細胞を培養する他の試みは、５〜２０継代を越えてはうまくいかず、また細胞が分化する傾向が高いことによって妨害されてきた。例外は、成体ラット海馬幹細胞における研究であるが、これらは、核型が異常であり、そして低い効率でニューロンを形成する。
【００１６】
一過性の神経発生前駆体が知られているが、永久または半永久の自己再生幹細胞は単離精製されていない。
【００１７】
ＥＳ細胞から神経幹細胞を誘導し、次いでこれらの神経幹細胞を純粋培養で維持することが望まれているが、これは、これまでできていない。また、移植のためにＥＳ細胞から神経幹細胞を誘導することも望まれているが、公知のＥＳ誘導細胞集団中のＥＳおよび他の非神経細胞の残存は、レシピエント動物に腫瘍を生じる。さらに、胎児および出生後ＣＮＳから純粋な神経幹集団を得ることが望まれている。
【００１８】
神経幹細胞の挙動を制御する分子および細胞事象の完全な理解は、胚発生の理解のための経路としてだけではなく、将来の治療適用のために神経幹細胞が単離され増殖されそして制御され得る枠組みとしてもまた、必須である。当該分野で公知の神経幹細胞の培養方法は、上記の理由のために、このような研究および治療適用に使用するには不適切である。したがって、細胞を対称的に分裂している自己再生状態に維持できる、大量の神経幹細胞を培養するための方法および条件を開発することが所望され得る。限定培地の使用は、臨床設定で非常に所望され得るので、上記要件を満たしている、限定した培養培地を有することが特に所望され得る。
【００１９】
本発明は、上記課題の１つ以上を解決する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
より詳細には、本発明は、神経幹（ＮＳ）細胞の対称分裂を促進する方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および
（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地で、該細胞を培養する工程
を含む。
【００２１】
好ましい実施態様では、細胞は、血清の不在下で、例えば、血清を含まずかつ血清抽出物を含まない培地で培養される。さらに、細胞は基材に付着されて、別の言い方をすれば、接着培養で、培養されることが好ましい。また、培養培地が、インスリンまたは細胞上のインスリンレセプターの別のアゴニストを含むことが好ましい。
【００２２】
本発明においては、用語「促進する」は、神経幹細胞を対称的に分裂している状態に維持することを包含すると理解される。
【００２３】
本発明の別の局面によれば、多くの継代にわたって未分化状態での神経幹細胞の自己再生および対称分裂を支持する、および好ましくは促進する培養培地が提供される。この培地は、神経幹細胞の非対称分裂および分化を実質的に防ぐ。
【００２４】
本発明はさらに、本明細書中のプロトコルに詳細に記載されるように、神経幹細胞を得る方法を提供し、そしてさらに、このような方法により得られる細胞を提供する。
【００２５】
本発明はまた、神経細胞集団、組成物、細胞株、クローン原性細胞株、および単一の神経幹細胞を提供し、これらは、自己再生性の対称的に分裂している神経幹細胞を含む。
【００２６】
本発明のさらなる局面は、ＥＳ細胞から神経幹細胞への分化を促進するための方法、および自己再生性の対称的に分裂している実質的に未分化の状態で得られる神経幹細胞を維持するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｂ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｃ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｄ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｅ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｆ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図１Ｇ】ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す。
【図２Ａ】ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す。
【図２Ｂ】ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す。
【図２Ｃ】ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す。
【図３】ＮＳ細胞が成体脳内に取り込まれ分化することを示す。
【図４Ａ】ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。
【図４Ｂ】ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。
【図４Ｃ】ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。
【図５Ａ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【図５Ｂ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【図５Ｃ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【図５Ｄ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【図５Ｅ】分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（定義の節）
「神経幹細胞」
本明細書中で使用される用語「神経幹細胞」とは、ニューロンおよび神経膠の両方を生成する潜在能を維持しながら２０〜３０よりも多くの細胞分裂を受け得る細胞を記載している。好ましくは、該細胞は、４０より多くの、より好ましくは５０より多くの、最も好ましくは無制限のこのような細胞分裂を受け得る。
【００２９】
神経幹細胞は、対称的または非対称的のいずれかで分裂し得る。対称的に分裂している場合、神経幹細胞は、分裂して２つの娘神経幹細胞または２つの方向付けられた前駆体を形成する。しかし、他に記載されない限り、対称分裂とは、本明細書中では対称的な自己再生をいう。非対称的に分裂している場合、神経幹細胞は、分裂して１つの娘神経幹細胞と１つの方向付けられた前駆体（例えば、ニューロン前駆体または神経膠前駆体のいずれか）とを形成する。
【００３０】
本発明の神経幹細胞は、放射神経膠として記載され得、そして放射神経膠マーカーＲＣ２、３ＣＢ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、およびＰａｘ６の少なくとも１つ（および好ましくは全部）を発現することが示されている。好ましくは、本発明の神経幹細胞は、ＲＣ２、３ＣＢ２、およびＧＬＡＳＴを発現している。より好ましくは、細胞は、ＲＣ２、３ＣＢ２、ＧＬＡＳＴ、および、ＢＬＢＰもしくはＰａｘ−６の少なくとも１つを発現している。本発明の神経幹細胞はまた、それらが神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニンの少なくとも１つ（好ましくは全部）発現に対して陽性であり、そしてＯｃｔ−４またはＮａｎｏｇの少なくとも１つ（好ましくは両方）の発現に対して陰性であることでもまた特徴付けられ得る（実施例１〜３もまた参照のこと）。
【００３１】
本発明の神経幹細胞は、定義により多分化能性である、すなわち、それらは、多数の神経細胞型（例えば、ニューロン／神経膠）に分化し得る。以下の実施例は、本発明の方法に従って培養された神経幹細胞が、それらの潜在能を保持しており、そして全ての期待される細胞型に分化し得ることを確証している。
【００３２】
「神経幹細胞の供給源」
広範な種々の供給源から本発明の神経幹細胞を誘導することができる。例えば、神経幹細胞は、胚から直接、成体組織から、胎児組織から、または胚性幹（ＥＳ）細胞（野生型または遺伝子改変ＥＳ細胞のいずれか）から誘導され得る。好ましくは、本発明の神経幹細胞は、マウスもしくはヒトのＥＳ細胞から誘導されるか、またはマウスもしくはヒトの胎児細胞から誘導される。
【００３３】
本発明の神経幹細胞は、とりわけ、ヒト、霊長類、げっ歯類、および鳥類に由来し得る。好ましくは、神経幹細胞は、哺乳動物、特にマウス、ラット、およびヒトに由来する。
【００３４】
「ＥＧＦレセプターファミリー」
本明細書中で使用される用語「ＥＧＦレセプターファミリー」は、ＥＧＦシグナル伝達因子のファミリーによって活性化され得るレセプター（通常、ホモダイマーもしくはヘテロダイマーレセプター）のファミリーを記載している。レセプターは、４つの非常に相同性の高い膜貫通糖タンパク質ＥｒｂＢ−１（ＥＧＦ−Ｒとしても知られる）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、およびＥｒｂＢ−４のファミリーで構成される。
【００３５】
「ＥＧＦレセプター」というときは、ＥＧＦレセプターファミリーの任意のモノマーもしくはダイマーレセプター複合体を包含する。
【００３６】
各レセプターは、細胞外リガンド結合ドメイン、単一疎水性膜貫通ドメイン、および１型レセプターチロシンキナーゼ活性によってシグナル伝達の原因となる細胞質チロシンキナーゼドメインを有する。これらのレセプターのいずれかへのリガンドの結合は、レセプターの二量体化および自己リン酸化、続いて多数の細胞基質のリン酸化を生じ、種々の生物学的効果に至る。レセプターの二量体化は、レセプターリガンドおよび毒性環境刺激（例えば、ＵＶ照射）を含む種々の刺激によって引き起こされ得る。各ダイマーレセプターは、異なるＳＨ２含有エフェクタータンパク質を補充することによって別個のシグナル伝達経路を開始させる。例えば、ＥＧＦ−Ｒダイマーは、グアニンヌクレオチド放出因子ＳＯＳにカップリングされたアダプタータンパク質Ｇｒｂと複合体化し得る。Ｇｒｂ−ＳＯＳ複合体は、レセプター中のホスホチロシン部位に直接結合し得るか、またはＳｈｃを介して間接的に結合し得る。これらのタンパク質相互作用は、ＳＯＳをＲａｓに近接した位置にもたらし、Ｒａｓを活性化させる。このことは引き続き、ＥＲＫおよびＪＮＫのシグナル伝達経路を活性化させ、引き続き、遺伝子発現を調節する転写因子（例えば、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、およびＥｌｋ−１）を活性化させる。ＥＧＦレセプターはまた、ＰＬＣγシグナル伝達経路も活性化させ得る。
【００３７】
「ＦＧＦレセプター」
本明細書中で使用される用語「ＦＧＦレセプター」は、膜貫通ＦＧＦレセプターチロシンキナーゼのファミリーの任意のメンバーを記載している。これらのレセプターの４つの主要なイソ型ＦＧＦＲ１、２、３、および４が存在し、そしてそれらは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸（ＨＳ）系と密に関連して作用することが知られている。ＦＧＦレセプターというときは、ＦＧＦレセプターファミリーの任意のモノマーまたはダイマー（ホモもしくはヘテロダイマー）複合体を含む。
【００３８】
ＦＧＦレセプターと関連した細胞性シグナル伝達経路は、ＭＡＰキナーゼ経路、およびＰＬＣγ経路を含む。
【００３９】
「培養培地」
本発明で使用される培養培地は、好ましくは、必要に応じて付加成分が添加された基本培地を含む。
【００４０】
基本培地は、神経幹細胞のための炭素および／またはビタミンおよび／またはミネラルの必須供給源を供給する培地である。基本培地は、一般に、タンパク質を含まず、そしてそれ自身単独では神経幹細胞の自己再生／対称分裂を支持し得ない。
【００４１】
好ましくは、本発明で使用される培養培地は、例えば、血清および／またはフィーダー細胞のような非限定である成分、すなわち、その含有量が不明である成分、または未特定の非限定または変動のある因子を含み得る成分、を含まない。血清を含まずかつ血清抽出物を含まない、完全限定培地を用いる利点は、神経幹細胞の培養およびそれに続く操作のために、効率的かつ一貫したプロトコルが導かれ得ることである。
【００４２】
「培養表面」
本発明の全ての局面における神経幹細胞の培養のための代表的な表面は、細胞培養に有用であると当該分野で認識されている培養表面であり、そしてこれらには、プラスチック製表面、金属製表面、複合材製表面が含まれるが、通常は、広く市販されているプラスチック製組織培養プレートのような表面が用いられる。このようなプレートは、しばしば、直径数センチメートルである。スケールアップのために、このタイプのプレートは、ずっとより大きい直径で用いられ得、そして多くの繰り返しプレートユニットが用いられ得る。
【００４３】
培養表面は、通常には表面上にコーティングされた、細胞接着タンパク質をさらに含み得る。幹細胞上に存在するレセプターもしくは他の分子が、該タンパク質または他の細胞培養基材に結合し、そしてこれは、表面への接着を促進し、そして増殖を促進する。ゼラチンでコーティングしたプレートが特に好ましい。
【００４４】
本発明は、ＥＧＦレセプターのアゴニストまたはＥＧＦおよびＦＧＦ−２レセプターの両方のアゴニストを含む培地中の基材に付着した神経幹細胞の培養が、幹細胞の制限のない対称分裂を促進しそしてニューロン／神経膠へのそれらの分化を実質的に防ぐとの知見に基づく。
【００４５】
本発明の種々の局面を、ここに詳述する。
【００４６】
本発明の第一の局面は、神経幹（ＮＳ）細胞の対称分裂を促進する方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および
（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む培地で、該細胞を培養する工程
を含む。
【００４７】
本発明の別の方法は、神経幹細胞を得るために、以下の工程を含む：
（１）神経幹細胞を含む細胞の混合集団を得る工程；
（２）（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含む培地に該細胞を再播種する工程；
（３）該細胞を培養する工程；
（４）細胞の凝集体を回収する工程；
（５）（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含む培地に該細胞を再播種する工程；
（６）該細胞を培養する工程；
（７）（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および（ｂ）ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーターを含む培地に、単一細胞として細胞を再播種する工程。
【００４８】
この方法は、例えば、このようなマーカーの発現を、それらの分化した子孫でのその発現に比較して神経幹細胞で優先的に活性なプロモーターに連結させることにより、神経幹細胞特異的マーカーを発現している細胞について選択することが付加され得る。好ましくは、この方法は、６５％以下のコンフルエンスで、より好ましくは５５％以下のコンフルエンスで、特に５０％を下回るコンフルエンスで、細胞を継代させる工程を含む。
【００４９】
本発明の方法の他の好ましい特徴は、実施例９で本発明のプロトコルに記載される通りである。
【００５０】
本発明の培養物は、好ましくは、接着培養であり、すなわち細胞が基材に付着されている。
【００５１】
基材は、代表的には、培養容器または別の物理的支持体での表面、例えば、培養ディッシュ、フラスコ、ビーズ、もしくは他のキャリアでの表面である。好ましくは、基材は、細胞の接着性を向上させるためにコーティングされていおり、そして適切なコーティングには、ラミニン、ポリリジン、ポリオルニチン、およびゼラチンが含まれる。細胞が、単層培養で増殖し、懸濁中で増殖せず、細胞のボールもしくは塊として増殖しないこともまた好ましい。より高い密度では、細胞は、互いに積み重なり始め得るが、培養物は、基材に付着されて、本質的に単層であるかまたは単層として開始する。
【００５２】
ＥＧＦファミリーのレセプターから下流の１つ以上のシグナル伝達経路は、好ましくは、ＥＧＦファミリーのレセプターのアゴニストを用いて活性化され得る。ＥＧＦファミリーのレセプターのアゴニストは、適切には、シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーのメンバーであり、そして好ましくは、ＥＧＦレセプターの細胞外ドメインに結合する。用語「アゴニスト」はまた、シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーに対する模倣物、融合タンパク質、抗体、シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーのキメラ、ならびにそれらのフラグメント、改変体および誘導体も包含し、これらは、ＥＧＦファミリーのレセプターを活性化し得る。
【００５３】
シグナル伝達因子のＥＧＦファミリーを構成する分子は、それらが少なくとも１つのＥＧＦ様ドメインを含む点で特徴付けられ得る。このドメインは、ジスルフィド結合の形成を通して３つのペプチドループを生じる６つのシステイン残基によって定義され得る。
【００５４】
ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターを通して作用し得そしてこれらのレセプターの下流の経路を活性化し得る特定のアゴニストとしては、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、エピレグリン、ベータセルリン、ニューレグリン１〜４、およびＣｒｉｐｔｏ−１が挙げられる。好ましくは、アゴニストは、ＥＧＦそれ自体である。
【００５５】
ＦＧＦのレセプターから下流の１つ以上のシグナル伝達経路は、好ましくは、ＦＧＦのレセプターのアゴニストを用いて活性化され得る。ＦＧＦのレセプターのアゴニストは、適切には、シグナル伝達因子のＦＧＦファミリーのメンバーである。用語「アゴニスト」はまた、シグナル伝達因子のＦＧＦファミリーに対する模倣物、融合タンパク質、抗体、シグナル伝達因子のＦＧＦファミリーのキメラ、ならびにそれらのフラグメント、改変体および誘導体も包含すると意図され、これらは、ＦＧＦのレセプターを活性化し得る。
【００５６】
好ましくは、ＦＧＦレセプターのアゴニストは、ＦＧＦ−２またはラミニン−ＦＧＦである。
【００５７】
ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターまたはＦＧＦレセプターのいずれかの下流のシグナル伝達経路の活性化はまた、構成的に活性なレセプターによって、またはそれぞれのシグナル伝達経路の下流のエフェクター（例えば、ＭＥＫもしくはＢｃｌ２）によっても引き起こされ得ることが理解される。本発明の特に好ましい実施態様では、シグナル伝達経路は、細胞透過性小分子によって活性化される。これは、それぞれのレセプターを迂回し、シグナル伝達経路を直接活性化し得る。したがって、本発明では、用語「アクチベーター」は、ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターまたはＦＧＦレセプターの下流のシグナル伝達経路を活性化し得る全ての分子を包含する。
【００５８】
本発明の神経幹細胞培養物の維持におけるアクチベーターの有効性は、以下の実施例１−１および１−２において実証されている。ここでは、神経幹細胞のバルクおよびクローン集団が、ＥＧＦおよびＦＧＦ−２を含む培地で維持され、そして多数回継代され得る。さらに、試験した細胞集団中では神経幹細胞マーカーが至るところに存在することによって示されるように、神経幹細胞の分化は無視し得る程度であるか全く存在しない（実施例１−３を参照のこと）。そしてそれらはそれらの潜在能を保持し、全ての期待される細胞型に分化し得る（実施例１−４を参照のこと）。
【００５９】
したがって、本発明は、自己再生性の対称的に分裂している未分化状態で神経幹細胞の大きな集団を維持する効率的な方法を提供する。本発明の組成物は、神経幹細胞を含む組成物であって、神経幹細胞が接着培養中にあり、そして組成物中の細胞の少なくとも５０％、７０％、または８０％が神経幹細胞である組成物を包含する。神経幹細胞の割合は、さらに好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、非常に好ましくは少なくとも９７％である。さらに、本発明の神経幹細胞は、大いに継代され得る。神経幹細胞は、少なくとも３０回、より好ましくは少なくとも６０回、非常に好ましくは少なくとも９０回継代されていることが好ましい。なおさらに、本発明の神経細胞の集団では、該細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である。この組成物中の細胞は、単独または組み合わせて、本発明の任意の特徴および全部の特徴によってさらに特徴付けられ得る。
【００６０】
組成物もまた提供され、この組成物は、
神経幹細胞；
ＥＧＦファミリーのレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター；および
ＦＧＦレセプターから下流のシグナル伝達経路のアクチベーター
を含む。
【００６１】
組成物は、好ましくは、基本培地を含む。また、組成物中の神経幹細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞であることが好ましい。
【００６２】
上記神経細胞集団および組成物の両方において、神経幹細胞は、好ましくは、オンコジーンをコードする外因性遺伝物質を含まない。すなわち、それらは、不死化ストラテジーを受けていない。特定の実施態様では、集団／組成物の神経幹細胞は、それらが、
神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン；
Ｓｏｘ−２；
放射神経膠細胞特異的マーカーのＲＣ２、３ＣＢ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、もしくはＰａｘ−６；
ルイスＸ抗原；
ムサシ−１；および
プロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であり、そして
Ｏｃｔ４、および
Ｎａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている。
【００６３】
好ましくは、細胞は、ＲＣ２、３ＣＢ２、およびＧＬＡＳＴの発現に対して陽性である。他の実施態様では（必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）、細胞は、ＢＬＢＰ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニンの少なくとも１つの発現に対して陽性である。特に好ましい実施態様では（そして必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）、細胞は、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇの少なくとも１つの発現に対して陰性である。
【００６４】
さらなる実施態様では（必要に応じて上のマーカープロフィールに加え）、細胞は、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して陰性である。マウス由来ＮＳ細胞を含む特定の組成物／集団では、細胞の１％以下が、ＧＦＡＰまたはβIIIチューブリンの発現に対して陽性であり、それにより星状細胞またはニューロンへの細胞の分化が無視し得る程度であることが確認される。他の組成物／集団では、細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である。
【００６５】
本発明はまた、ラット細胞を用いて実施された。したがって、本発明者らは、ラットＣＮＳから細胞を採取し、そして本発明の方法を用いて、ラット神経幹細胞の培養物を得た。ラット神経幹細胞は、（ｉ）高純度、代表的には８０％または９０％を超えるラット神経幹細胞、および（ii）多数回の倍加、５０を超える、１００を超える、さらに２００を超える倍加後に、その高割合（最少で５０％）がニューロンおよび神経膠を形成する能力を保持している細胞であるとの特性を有する。当該分野では、ラット由来の細胞は、明らかに非常に不均質であり、成体海馬からのみであった。本発明者らは、この供給源から細胞を得ずに、代わりにラットＣＮＳから得た。この点において、本発明の方法は、３種（ラット、マウス、ヒト）の全てにわたって有効であったことが注目に値する。本発明の方法に従って、単一の細胞が、神経幹細胞コロニーを形成すれば、ニューロンがそのコロニー中の細胞から得られ得ることが一般に理解される。これは、例えば、（ｉ）核に対して（すなわち、全ての細胞を染色）および（ii）ニューロンに対して（すなわち、ニューロンのみ）個別に染色することによって測定される。染色された細胞の相対数を比較することにより、ニューロンを形成する細胞の割合が算定され得る。
【００６６】
本発明の第二の局面は、神経幹細胞の調製のための方法を提供し、この方法は、（ｉ）上記の方法に従って神経幹細胞を培養し、それによって神経幹細胞の培養物を得る工程、および（ii）該培養物から神経幹細胞を単離する工程を含む。好ましくは、単離された神経幹細胞は、対称的な様式で分裂するように条件付けられた細胞である。
【００６７】
多数の細胞供給源が用いられ得、そこから神経幹細胞が誘導される。１つの方法では、細胞は、動物の神経組織から得られ、そして本発明に従って培養され、対称的に分裂している神経幹細胞の培養物が得られる。神経組織は、成体または胎児の組織に由来し得る。神経組織は、ＣＮＳに由来し得、そして神経幹細胞の対称分裂集団は、ヒトおよびマウスの両方からの成体および胎児の両方のＣＮＳから採取された抽出物から得られ得る。神経組織は、好ましくは、放射神経膠表現型を有すると同定された細胞を含む。例えば、この表現型を有する細胞は、小脳および網膜からの抽出物で同定されており、その両方ともが、適切なさらなる細胞供給源を表す。神経幹細胞は、疾患のモデリングに有用な罹患神経組織から得られ得、例えば、細胞は、この目的で脳腫瘍から得られ得る。
【００６８】
本発明を使用する選択肢には、罹患個体から神経幹細胞を誘導し、次いで（ｉ）アッセイのためにこれらの細胞を使用するか、または（ii）その個体に細胞を戻す移植の前に遺伝子改変を実施することがある。したがって、神経変性障害（例はアルツハイマー病およびパーキンソン病を含む）；または脳腫瘍を有する個体から、細胞が得られ得る。
【００６９】
神経幹細胞を得る別の方法は、
（ｉ）神経幹細胞に分化し得る多分化能性もしくは分化多能性幹細胞を得る工程、
（ii）（ｉ）の細胞を、分化多能性細胞に対して非許容性である培地でそして（ａ）ＥＧＦファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストおよび（ｂ）ＦＧＦファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアゴニストの存在下で培養する工程
を含む。
【００７０】
使用に際して、混入している可能性のあるＥＳ細胞が、この方法によって除去されるか、または少なくとも実質的に数が減少され、より純粋でかつ移植の際に奇形腫を生じる可能性がより少ない培養物が得られる。
【００７１】
幹細胞は、適切には分化多能性幹細胞であり、特にＥＳまたはＥＧ細胞である。方法は、好ましくは、ＥＧＦレセプターのアゴニストおよびＦＧＦレセプターのアゴニストの存在下で細胞を培養する工程を含む。
【００７２】
本発明のＮＳ細胞を用いて、本発明者らは、ＥＧＦおよびＦＧＦを除去しそして血清またはＢＭＰ４を添加することによって星状細胞を得、本発明者らは、ＥＧＦを除去し、次いで約１週間おいた後にＦＧＦを除去し、そしてラミニン上に細胞を播種することによってニューロンを得、そして本発明者らは、ＥＧＦおよびＦＧＦを両方とも除去することによって乏突起膠細胞を得た。一般に、神経幹細胞を生成するために使用される本発明の方法は全て、必要に応じて、神経幹細胞をニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞に分化する工程、および次いでさらに必要に応じて（例えば、アッセイで、移植のために、またはそれ以外に）、ニューロン、星状細胞、または乏突起膠細胞を用いる工程をさらに含む。
【００７３】
神経幹細胞培養物が単離されると、次いで、それは、神経幹細胞株を樹立するために使用され得る。このような細胞株の樹立は、好ましくは、
（ａ）単一の神経幹細胞を得る工程、
（ｂ）前記の方法のいずれかに従って神経幹細胞を培養する工程
を含み、それによって、神経幹細胞のクローン集団を得る。
【００７４】
特定の実施態様では、細胞株を樹立するために使用される単一の神経幹細胞は、対称的に分裂している神経幹細胞、または対称的な様式で分裂するように条件付けられた神経幹細胞である。好ましくは、単一の神経幹細胞は、神経幹細胞を調製するために、上記の方法に従って得られる。
【００７５】
好ましい実施態様では、上記の方法によって得られる神経幹細胞株は、神経幹細胞のクローン集団（すなわち、その中の細胞の全てが単一の神経幹細胞の子孫である）である。
【００７６】
単一の神経幹細胞および細胞株（必要に応じて上記の方法によって得られ得る）もまた、本発明の一部を形成する。第一の実施態様では、細胞株が提供され、そこでは細胞が、ＥＧＦレセプターファミリーのレセプターの下流のシグナル伝達経路のアクチベーター、およびＦＧＦレセプターの下流のシグナル伝達経路のアクチベーターの存在下で維持されている。他の実施態様では、単一の神経幹細胞および細胞株の細胞は、それらが、
神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン；
Ｓｏｘ−２；
放射神経膠細胞特異的マーカーであるＲＣ２、３ＣＢ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰ、もしくはＰａｘ−６；
ルイスＸ抗原；
ムサシ−１；および
プロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であり、そしてそれらが、
Ｏｃｔ４、および
Ｎａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている。
【００７７】
好ましくは、細胞は、ＲＣ２、３ＣＢ２、およびＧＬＡＳＴの発現に対して陽性である。他の実施態様では、（必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）細胞は、ＢＬＢＰ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニンの少なくとも１つの発現に対して陽性である。特に好ましい実施態様（そして必要に応じて先行のマーカープロフィールに加え）細胞は、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇの少なくとも１つの発現に対して陰性である。
【００７８】
他の特定の実施態様では、（必要に応じて上のマーカープロフィールに加え）細胞は、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して陰性である。特定のマウス由来細胞株では、細胞の１％以下が、ＧＦＡＰまたはβIIIチューブリンの発現に対して陽性である。他の（例えば、ヒト）細胞株では、細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、または乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である。
【００７９】
単一の神経幹細胞および細胞株の細胞の両方とも、オンコジーンをコードする外因性遺伝物質を含まないこと、すなわち、それらは、不死化ストラテジーを受けていないことが好ましい。記載の細胞株が、神経幹細胞株であることも好ましい。
【００８０】
第三の局面では、本発明は、対称的に分裂している神経幹細胞のトランスフェクトされた集団を得てこれを維持する方法を提供し、この方法は、
（ａ）選択マーカーＡをコードする構築物でＥＳ細胞をトランスフェクトする工程であって、使用に際して、該選択マーカーが、神経前駆細胞特異的プロモーターの制御下で発現される、工程；
（ｂ）該ＥＳ細胞の神経前駆細胞への分化を促進する工程；
（ｃ）該選択マーカーＡを発現している神経前駆細胞について選択する工程；および
（ｄ）該選択された細胞を、前に記載の方法のいずれかに従って培養する工程
を含む。
【００８１】
選択マーカーＡは、抗生物質耐性、細胞表面マーカー、または例えばＥＰ−Ａ−０６９５３５１に記載されるような別の選択マーカーをコードし得る。神経前駆細胞特異的プロモーターは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、ＢＬＢＰ、およびネスチン神経エンハンサーからなる群から選択され得る。この選択ストラテジーのさらなる詳細を、実施例１−１に示す。
【００８２】
本発明の神経幹細胞（すなわち、本発明の単一の神経幹細胞ならびに組成物、細胞株、および集団中に存在する神経幹細胞）は、遺伝子改変され得る。したがって、本発明の神経幹細胞をトランスフェクトする方法が提供され、この方法は、
（ａ）選択マーカーＢおよびポリペプチドをコードする構築物で神経幹細胞をトランスフェクトする工程；および
（ｂ）該選択マーカーＢを発現する神経幹細胞について選択する工程
を含む。
【００８３】
選択マーカーＢは、抗生物質耐性または細胞表面マーカーをコードし得、そして選択マーカーＡと同じかまたは異なり得る。適切なトランスフェクション方法は、公知の方法であり、エレクトロポレーション、リポフェクション、ヌクレオフェクション（necleofection）、およびレトロウイルストランスフェクションおよびレンチウイルストランスフェクションが含まれる。
【００８４】
遺伝子改変神経幹細胞もまた本発明の一部を形成し、したがって、本発明は、この構築物をさらに含む、本発明の単一の神経幹細胞または組成物、集団、もしくは細胞株中に存在するような神経幹細胞を提供する。このような神経幹細胞は、選択マーカーＢに加え、選択マーカーＡをすでに含み得ることが理解される。
【００８５】
前記のように、本発明の方法は、任意の供給源から誘導された神経幹細胞との使用に適している。１つの特定の実施態様では、本発明は、ＥＳ細胞の供給源から神経幹細胞を得るための方法を提供する。この方法によれば、例えば単層での培養または胚様体分化により、ＥＳ細胞を神経前駆体に転換し、次いでＮＳＡ培地中で該神経前駆体を培養することにより、ＥＳ細胞の神経幹細胞への分化が促進される。さらに、ＮＳＡ培地は、付加成分（例えば、付加グルコースおよびＨＥＰＥＳ）を含み得ることが意図される。代替として、グルコースおよびＨＥＰＥＳが付加された培地（好ましくは基本培地）もまた、この分化を促進するために使用され得る。
【００８６】
ＮＳＡおよび／またはグルコースおよびＨＥＰＥＳの存在下で、条件は、神経幹細胞の増殖が好まれるような条件であり、培養物中に存在するいかなる非神経細胞もが優先的に死滅するという利点が付加される。このことは、実質的に純粋な神経幹細胞培養物（例えば、存在する全細胞の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％）を生じる。実施例１−５は、この方法の更なる詳細を提供する。
【００８７】
好ましい実施態様では、実施例１−５の方法は、対称的に分裂している神経幹細胞の集団を調製するために使用され得る。引き続き、集団は、上記の本発明の培養方法のいずれかを用いて維持される。
【００８８】
実施例１−５の方法はまた、神経幹細胞へのＥＳ細胞の分化に関する因子の効果についてアッセイするために使用され得る。好ましいアッセイ実施態様では、ＥＳ細胞が、試験される因子の存在下で、実施例１−５に記載の方法を用いて培養される。因子の効果は、例えば、得られた細胞のマーカープロフィールを決定する、すなわち、細胞が、本発明の細胞と同様のマーカープロフィールを有するか、またはＥＳマーカープロフィールが維持されているかを示すことにより、評価され得る。試験される因子は、誘導因子またはブロッキング因子のいずれでもあり得る。
【００８９】
神経性疾患および神経変性疾患、および脳損傷の治療において、特に、パーキンソン病およびアルツハイマー病、多発性硬化症、および筋萎縮性側索硬化症のような疾患の治療において、神経幹細胞の使用に大きな関心がある。本発明の方法、組成物、細胞集団、細胞株、および単一の細胞は全て、このような治療において、ならびにこのような治療のための調製物の製造において、用いられ得る。本発明を用いて治療され得る特定の神経性／神経変性疾患としては、以下が挙げられる：パーキンソン病、運動ニューロン疾患、卒中、多発性硬化症、およびハンチントン病。
【００９０】
したがって、第５の局面では、本発明は、細胞療法のため、および神経変性疾患および脳損傷の治療用組成物の製造のための、上に記載の細胞株、神経細胞集団、単一の神経細胞、および組成物の使用を提供する。このような調製物は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に処方され得る。
【００９１】
上に列挙した疾患の治療の方法は、本発明の単一の細胞、細胞株、組成物、または細胞集団の患者への移植を含み得る。好ましくは、患者は哺乳動物であり、より好ましくは、患者はヒトである。このような移植は、胚および成体の両ＣＮＳでの成功が示されており、そして実施例１−６に詳細に記載している。
【００９２】
本発明の細胞、および特に細胞株は、神経幹細胞の分化に関する誘導因子またはブロッキング因子の効果をアッセイするために使用され得る。このようなアッセイは、本発明の神経幹細胞（すなわち、組成物、細胞株、および集団中に存在する細胞、または単一の神経幹細胞）と、試験される因子とを接触させる工程を含み得る。神経幹細胞の分化に関する因子の効果は、適切には、得られた細胞のマーカープロフィールを決定する、すなわち、細胞が、本発明の細胞と同様のマーカープロフィールを有するか、またはこれらのマーカーが失われたかを示すことにより、評価され得る。本発明の細胞はまた、薬剤をアッセイするのにも適している。
【００９３】
ニューロンまたは神経膠を形成する細胞の割合を評価するために、細胞をクローン増殖する。細胞が個々に播種されると全ての細胞がクローンコロニーを形成するわけではないが、クローンコロニーを形成するもののうち一般には５０％以上が、ニューロン（適切なプロトコル下で）または神経膠（再度、適切なプロトコル下で）をつくる。これらの細胞は、従来技術から区別される。従来技術は、神経幹細胞特性を有する細胞の同定およびその増殖さえも議論しているが、それらの集団は非常に不均質であったからである。これは、重要な相違である。純粋でない集団は、残りの神経幹細胞にシグナル伝達を提供する細胞を含むからであり、このことは、分化を刺激しそしてさらには神経幹細胞の割合を減少させる。先行技術の方法は、個々の細胞から神経球を生成し得るが、本発明は、個々の細胞から実質的に純粋な集団の生成を可能にしている。
【００９４】
本発明の特定の実施態様（以下の実施例により詳細に記載する）では、全てのＮＳ細胞コロニーが、１５％以上、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは約２０〜３０％のＴｕＪ陽性ニューロンを生成している。より高い密度の培養で、本発明者らは、ＴｕＪ陽性細胞を計数した。ＬＣ１ ＮＳ細胞の３５％がニューロン形態を獲得し、そして１年よりも長い連続培養である１１５継代後にもβIIIチューブリンを発現していた。これらの細胞は、この期で二倍体核型を保持していた。ＬＣ１は、クローン化されていない集団である。したがって、データは、神経膠に制限された前駆体または遺伝的形質転換に対する選択圧が最小限であったことを示している。
【００９５】
本発明の細胞は、異種細胞と共培養することなくかつ非限定の条件培地、細胞外マトリックス画分または血清を用いることなく増殖され得、これは、ＥＳ細胞以外の幹細胞のタイプについて以前に示されていない特徴である。したがって、本発明によれば、神経幹細胞が、好ましくは、規定された条件で均質な培養で増殖される。マイクロウェル中に単離された単一のＮＳＣでさえも増殖し得、このことは、ＥＧＦおよびＦＧＦ以外の細胞外シグナルへの依存が最小限であること、およびインビトロでは、ＮＳＣにとって必須の外的自己再生シグナルが、ＥＧＦおよびＦＧＦに対して減少され得ることを示している。
【００９６】
実施例により詳細に示したさらなる実施態様では、実質的に全てのコロニー（播種している単一の細胞から発達したコロニーの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％）が、（ｉ）ＦＧＦ＋ＥＧＦにおいて神経前駆体マーカーの同一の均質な発現と分化マーカーの不在とを示し、そして（ii）増殖因子の除去に際してニューロンを生成している。特定の実施例では、全てのコロニーがこれらの特性を有していた。これは、対称的な自己再生の証拠である。さらに、非クローンＮＳ細胞培養物におけるコロニーアッセイからのデータは、クローンＮＳ５株由来のデータと比較可能であった。ＮＳ５からの増殖可能な未分化のコロニーの連続的な形成は、クローン原性細胞が幹細胞であること、およびそれらの数がＮＳ集団と比例して増大していることを示している。形式的に、幹細胞数の増加は、２つの機構を介して生じ得る：デノボ生成または対称的な自己再生分裂。前者は、前幹細胞供給源、すなわち、分化多能性細胞または胎児原基を必要とし、それらのいずれも、本明細書中のＮＳ細胞培養物中には存在しない。そこで、対称的な自己再生がＮＳ細胞培養で生じていなければならない。
【００９７】
以下の実施例で得られた特定のＮＳ細胞は、Ｓｏｘ２、Ｐａｘ６、Ｅｍｘ２、Ｏｌｉｇ１、Ｏｌｉｇ２、ネスチン、ＢＬＢＰ、ＧＬＡＳＴ、ビメンチンを発現し、そしてＲＣ２、３ＣＢ２、ＳＳＥＡ−１、およびプロミニンに対して免疫反応性である。好ましくは、それらは、Ｓｏｘ１を発現せず、そしてＧＦＡＰおよびニューロン抗原に対して陰性である。これらのＮＳ細胞は、分化多能性マーカーおよび他の胚葉のマーカーを欠く。本発明者らは、ＥＳ細胞での場合と同様に、神経幹細胞の特徴がＣＮＳ発生の間でマスクされており、エクスビボでのみ真に実証可能であることを主張する。Ｓｏｘ１発現がＮＳ細胞で維持されなかったという知見は、新規で予期されないものであり、そしてＳｏｘ１を用いる連続的な系統選択は実りあるものではないことを示している。
【００９８】
本発明のさらなる実施態様では、ＥＳ細胞由来非クローン化（ＣＧＲ８−ＮＳ）およびクローン化（ＮＳ５）ＮＳ株および胎児皮質由来非クローン化（Ｃｏｒ１）およびクローン化（Ｃｏｒ１−３）ＮＳ株により例証されるＮＳ細胞は、培養物中に放射神経膠マーカー３ＣＢ２、ＢＬＢＰ、ＧＬＡＳＴ、ネスチン、ＲＣ２、およびビメンチンの発現を示している。ＧＦＡＰの発現は、これらの培養物のいずれにおいても、好ましくは細胞の１０％未満、より好ましくは５％未満、特に２％未満である。特定の実施例では、ＧＦＡＰ発現は、細胞の１％未満で見られた。本発明者らはまた、１１５継代後のＥＳ細胞由来ＮＳ細胞において、ＧＦＡＰおよびβIIIチューブリンはなく、ネスチンおよびＲＣ２の均一な発現を示した。このことは、ＮＳ細胞表現型が安定であることを示している。本発明の好ましい細胞は、ＥＳ細胞から分化され、そして３０継代後、好ましくは６０継代後、より好ましくは１００継代後に、（１）ネスチンおよびＲＣ２の発現が続きそして（２）ＧＦＡＰおよびβIIIチューブリンの発現がないことが続く。ＧＦＡＰおよびβIIIチューブリンの発現がないとは、細胞の５％未満、好ましくは細胞の２％未満に発現が見られることを意味する。
【００９９】
本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲによって分析を実施し、特定のＮＳ細胞に分化多能性、中胚葉、または内胚葉の特異的転写因子がないことを確認した。本発明者らはまた、アフィメトリックス（ＲＴＭ）発現プロファイリングを実施し、系統の不適切な転写物がないことを確認し、そして３つの異なるＮＳ細胞培養（ＥＳ由来、胎児皮質由来、およびクローン胎児皮質由来）において神経マーカーおよび放射神経膠マーカーの一貫した発現を実証している。
【０１００】
ＥＳ細胞からの分化によりＮＳ細胞を得ることは、好ましくは、連続接着培養で細胞を維持する工程を含み、そしてより好ましくは、神経球を形成する工程を省く。しかし、胎児または成体脳由来の一次細胞単離物からの細胞の分化によりＮＳ細胞を得ることは、必要に応じて、（ｉ）まず懸濁凝集体または神経球を形成する工程、および（ii）引き続き接着培養に細胞を維持する工程を含む。本発明者らは、実施例において、数日後に、これらの凝集体がゼラチンコートされたプラスチックに付着され得、次いでＮＳ細胞が増殖することを見出した。
【０１０１】
本発明者らは、本発明の細胞の初期および後期継代で生成したニューロンおよび星状細胞の割合を、（詳細には、ＬＣ１ ＮＳ細胞に対して、８継代目および１１５継代目で）決定した。後者の培養は、１２ヶ月の増殖を表し、倍加時間は２４時間であった。後期継代で得られたニューロンの数にはささやかに減少があるが、これはなお３５％よりも多くを占める。独立して４６Ｃ ＥＳ細胞から誘導されたＮＳ５クローン株は、３０継代目に同様のレベルのニューロン分化効率を示している。ＧＦＡＰ免疫反応性星状細胞の生成は、ＬＣ１ ＮＳ細胞についておよびＮＳ５細胞についても、両時点で１００％に近づいた。さらに、多数回継代で増殖し、次いでＧＦＰレンチウイルスを形質導入しそして移植前にさらに増殖させたＬＣ１ ＮＳ細胞を用いて、インビボでのデータを得た。このデータは、ニューロンおよび星状細胞の両方の広範な分化を示している。放射神経膠マーカー発現の均一性と組み合わせて、非クローン化ＬＣ１ ＮＳ細胞についての安定な分化能に関するデータは、ＦＧＦおよびＥＧＦにおける接着培養が、幹細胞自己再生を好み、そして神経膠またはニューロンのいずれかの運命への方向付けを抑制することを示している。
【０１０２】
本発明者らは、ＥＳ細胞からの分化により得られたＮＳ細胞が、５週間にわたって腫瘍の形成なく移植され得ること、したがって、マウス脳において４週以内に巨視的な奇形腫を生じたＥＳ細胞とは異なることを見出した。
【０１０３】
本発明はまた、核再プログラミング方法、ならびにこれらの方法によって得られる細胞および動物にも関する。
【０１０４】
核再プログラミングは、体細胞、必要に応じて幹細胞もしくは終末分化細胞の核が、比較的より高い潜在能の細胞の核として挙動するように再プログラミングされる技術である。最終的には、完全に再プログラミングされた核が、分化多能性細胞の核として作用し、そして再プログラミングは、しばしば分化多能性に対して様々に再プログラミングすることを意味する。核移入による再プログラミングの方法は、当該技術分野で十分に確立されており、ＷＯ９６／０７７３２に記載の発明（時に、「ドリー羊」発明といわれる）後に十分に公開されるようになった。したがって、核移入は、非ヒト動物をクローン化するために使用され得る。
【０１０５】
核移入方法は、多くの課題を有する。まず、それらは低効率のままであり、得られた細胞が、真に分化多能性であるように再プログラミングされるのはまれである。再プログラミングの一部として核で遺伝子操作を実施し得ることも所望され得る。しかし、現時点では、この操作は、ドナー核のクローン集団を得るのが困難であるため、可能ではないかまたは信頼性がない。クローン核を用いてさえも、再プログラミング方法は、多くの独立した工程を必要とする複雑な手順である。最後に、いくつかの種に由来するＥＳ細胞は、単離するのがなお困難である。再プログラミング技術の使用は、そのようなことが利用できかつ信頼性があれば、これらの種において分化多能性細胞への代替の経路を提供する。
【０１０６】
本発明のさらなる局面は、上記課題に対する代替のアプローチを提供すること、およびそれらへの解決を提供することを目的として有する。
【０１０７】
したがって、本発明は、核再プログラミングの方法を提供し、この方法では、ドナー核が本発明の神経幹細胞から得られる。
【０１０８】
本発明の神経核細胞は、高い効率で再プログラミング可能であることが見出されており、したがって、本発明は、効率的な再プログラミング方法を提供し、そしてまた、多くの種の遺伝子改変された再プログラミングされた細胞（特に分化多能性幹細胞）の作製を容易にする。本発明によって個々の神経幹細胞をクローン増殖できることとは、全てが同じ遺伝子改変を用いて、遺伝子操作後に細胞のクローン集団が得られ得、そして再プログラミング方法で使用され得ることを意味する。
【０１０９】
特定の細胞表面マーカーの存在および／または他のものの不在に従って神経幹細胞を同定することもまた可能である。このことは、神経幹細胞は、混合集団（例えば、脳ホモジネート）から直接採集され得るので、本明細書中に記載の本発明の局面に従って培養する工程が省かれ得るという利点を有する。
【０１１０】
したがって、核再プログラミングの方法が本明細書中に提供され、この方法では、ドナー核が、本発明の任意の実施態様または局面に従って得られた神経幹細胞に由来する。
【０１１１】
核再プログラミングの特定の方法は
ドナー細胞を得る工程；
レシピエント細胞を得る工程；
該ドナー細胞の核を該レシピエント細胞に移入する工程であって、該ドナー細胞が、（ｉ）神経幹細胞、または（ii）本発明の方法に従って得られた細胞である、工程；および
該細胞を培養して該ドナー細胞の核を再プログラミングし、それによって再プログラミングされた細胞を得る工程
を含む。
【０１１２】
レシピエント細胞の核は、一般に、プロセス中の一段階で除去され、そのため得られる細胞は二倍体であり、これは、必要に応じて該ドナー細胞の核の移入前におよび必要に応じて該ドナー細胞の核の移入後になされる。
【０１１３】
本発明のＮＳ細胞によって提供される関心のある可能性の１つは、遺伝的病変（例えば、悪性を誘導し得る）を導入することである。したがって、さらなる選択肢は、ドナー細胞核を遺伝子操作することである。これは、目的の変異または遺伝子を導入するために使用され得、例えば、アッセイまたは他の試験目的のために細胞または動物を生成し得、複数の細胞が全て同じ操作で得られる。操作の範囲は広範である。一例は、疾患原因遺伝子配列または推定疾患原因遺伝子配列をドナー細胞核に導入することであり、薬物スクリーニングに有用である。さらなる選択肢は、再プログラミングされた細胞から誘導された組織を含む動物を得、そして該組織を用いてアッセイを実施することである。細胞は、例えば卵母細胞への核転移によって、分化多能性に戻るように再プログラミングされることが好ましい。
【０１１４】
本発明の特定の実施態様では、所望の神経幹細胞における細胞表面マーカーの本発明からの知識を利用することにより、そうでなければ混合集団からの神経幹細胞の単離に必要とされる培養工程の省略が可能になる。１つのこのような再プログラミング方法は、細胞の混合集団を提供する工程、その細胞表面マーカープロフィールに基づいて該混合集団から神経幹細胞を単離する工程、および該単離された細胞の核をレシピエント細胞に移入する工程を含む。
【０１１５】
他の方法と同様に、単離された細胞は、レシピエント細胞へのその核の移入の前に遺伝子操作され得る。また、単離された細胞は、集団中の１つの細胞の核をレシピエント細胞に移入する前に細胞のクローン集団を得るために培養され得る。
【０１１６】
より詳細には、本発明の細胞の応用には、高スループット薬物スクリーニングがある。本発明の神経幹細胞とそれから得られるニューロン、神経膠などとの両方ともが、スクリーニングのために、例えば、細胞のいずれかの型で活性である因子を同定するために使用され得る。細胞または子孫は、脳内癌のモデルで使用され得る。細胞および子孫は、神経系（特に、ＣＮＳ）の腫瘍から得られ得、そしてそれに由来する神経細胞およびそれらの子孫が、スクリーンにおいて使用され得る。スクリーンの性質は全てに対して明らかであると考えられるが、概要では、本発明の細胞またはそれらの分化した子孫を得る工程、試験因子の存在下で該細胞または子孫を培養する工程、および該細胞または子孫に関する該因子の効果を決定する工程を含む。特定のスクリーニング使用で、細胞が提供され、この細胞は、本発明の細胞または本発明によって得られる細胞であり、そしてＥＧＦレセプターまたはさらなるＥＧＦレセプターを発現するように改変されている。
【０１１７】
細胞は、スクリーンで使用される前に改変され得る。例えば、細胞は、遺伝子において変異を導入するように、または疾患（特に、神経細胞の疾患であり、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含む）に関与していることが知られているもしくは関与の疑いのある遺伝子産物をコードする核酸を導入するように、遺伝子改変され得る。パーキン変異が導入され得る。アルツハイマー病に関与するタンパク質（例えば、ＡＰＰ）をコードする遺伝子が発現または変異され得、またはその発現を変更され得る。
【０１１８】
本発明の細胞は、細胞療法の細胞の供給源として有用である。それらは、患者からの幹細胞の供給源を提供し、これは、潜在的に核移入のための核の供給源であり得る。それらは、遺伝子療法（神経防御遺伝子療法を含む）の送達のために用いられ得る。一例の療法では、本発明の細胞は、神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を発現している。これらの細胞は、本発明に従いそして細胞を遺伝子操作することにより得られ得る。細胞は、損傷した神経回路の回復および／または脳機能の回復のために移植され得る。
【０１１９】
本発明の利点は、得られる細胞の純度にある。純粋な集団は、移植または培養において制御することがより容易であり、不均質な培養においては、より多くの細胞が神経膠運命に既に方向付けられているのでニューロンが得られる割合が低くなる。いくつかの療法は、ニューロンおよび星状細胞の両方を必要とする。他の療法は、神経膠細胞を必要とする（例えば、ＭＳについては乏突起膠細胞、他の適用については星状細胞、遊走細胞）。
【０１２０】
非ヒト動物をクローン化する方法が本発明によって提供される。非ヒト動物をクローン化する１つの方法は、（ｉ）該非ヒト動物から神経幹細胞を得る工程、（ii）該非ヒト動物と同じ種の卵母細胞を得る工程、（iii）該神経幹細胞の核を該卵母細胞に移入する工程、および（iv）（iii）で得られた細胞を該同じ種の雌に移植する工程を含む。したがって、本発明は、神経幹細胞の単離に基づく非ヒト動物クローニングの効率的な方法を提供する。このクローニング方法は、実質的に全ての非ヒト動物に対して適用できると考えられる。特に家畜動物（ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ニワトリ、および他を含む）およびまた実験動物（マウスおよびラットを含む）に対してである。
【０１２１】
本発明により、初めて、ＥＳ細胞と同様に、二倍体のクローン原性のトランスフェクト可能な組織幹細胞の純粋な集団の増殖が可能になる。これは、種々の新規な実験機会を切り開く、幹細胞生物学において顕著な前進である。例えば、「神経幹細胞」のプロファイリングに関する以前の研究は、不均質な神経球培養（例えば、Suslovら）への信頼に大いに妥協している。さらに、ＮＳ細胞の放射神経膠特徴が、それらのインビボの対応物を定義している。放射神経膠の純粋な集団を培養および遺伝子操作できることはまた、幹細胞および特殊化された足場細胞の両方として機能し得る、これらの目立った細胞の細胞生物学を分析するための新規な機会を切り開く。最後に、異種細胞または細胞抽出物を含まない単純な培地でＮＳ細胞を増殖できることは、自己再生が、増殖因子単独によって駆動され得、そしてこれまで幹細胞生物学者によって不可欠であると考えられていた複雑な微細環境ニッチを必要としないことを確立する。本発明は、細胞を用いる核再プログラミングおよび必要に応じた遺伝子操作への新規なアプローチを切り開く。
【０１２２】
本発明は、ＮＳ細胞からのニューロンの効率的な生成を提供する。本明細書中のプロトコルにより詳細に記載した方法において、ニューロンを得る方法は、（ａ）ＦＧＦレセプターのアゴニストの存在下でかつＥＧＦレセプターのアゴニストの不在下で、神経幹細胞を培養する工程；および（ｂ）その後、ＦＧＦレセプターのアゴニストの不在下でかつＥＧＦレセプターのアゴニストの不在下で、該細胞を培養する工程を含む。例えばＥＧＦが存在しない期間は、例えばＦＧＦが実質的に除去された場合にニューロンになるように細胞を刺激することが見出されている。神経幹細胞は、好ましくは、単層培養で播種される。代表的には、ＮＳ細胞は、ＥＧＦを含まないがＦＧＦ−２を含む培地に移され、そしてある期間（言わば少なくとも２日間または少なくとも４日間）培養され、その後、ＦＧＦ−２もまた培地から除去される（それを含まない培地に細胞が移されることを含む）。特定の方法では、細胞をＥＧＦのないＦＧＦ−２中で１週間増殖させ、次いでＦＧＦ−２を除去する。ＦＧＦの除去により、培養中に幾らかの細胞死が生じるが、良好な割合が生存しニューロンを形成する。この方法は、ＮＳ細胞の誘導のために、本明細書中に記載の方法のいずれかへの必要に応じた追加として使用され得る。
【０１２３】
本発明の全ての局面の方法／使用は、インビボまたはインビトロのいずれかにて実施され得ることが理解される。
【０１２４】
本発明の方法および組成物は、添付の図面において図示される。
【０１２５】
図１は、ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す；
図２は、ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す；
図３は、ＮＳ細胞が成体脳内に取り込まれ分化することを示す；
図４は、ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す；および
図５は、分化培地中で培養したＮＳ細胞の電圧および電流クランプ条件下での電気活動を示す。
【０１２６】
より詳細に図面を参照して、図１は、ＥＳ細胞からの神経幹（ＮＳ）細胞の生成を示す：Ａ．ＥＧＦおよびＦＧＦ−２中で増殖された接着ＮＳ細胞培養物（ＬＣ１）（ａ）は、ニューロン抗原（ｂ）または星状細胞抗原（ｃ）の発現を示さず、そして前駆体マーカーであるＲＣ２（ｄ）およびネスチン（示さず）の均一な発現を示している。ＬＣ１細胞は、血清の添加に際して免疫陽性星状細胞に分化し（ｅ）、そして増殖因子の除去に際してニューロンを生成する（ｆ〜ｈ）。得られるニューロンの割合は、１１５継代後もなお総細胞の３５％より多い（ｉ）。Ｂ，クローンＮＳ−５細胞は、Ｓｏｘ１神経系統選択によって生成された。ａおよびｃは、それぞれ１継代目および５継代目の神経前駆体の位相画像であり、ｂおよびｄは、対応するＳｏｘ１−ＧＦＰ蛍光である。ｅは、Terasakiウェルへの播種１時間後の単一の細胞。ｆは、２０継代目のクローン細胞株の位相差画像である。Ｃ，ＥＳ細胞および神経幹細胞／放射神経膠細胞マーカーについてのＲＴ−ＰＣＲ（４６Ｃ、親ＥＳ株；Ｐ５、神経分化後５継代目；ＮＳ−５クローンＮＳ株；ＬＣ１、ＮＳ集団（１７継代目）；脳、Ｅ１２．５／Ｅ１６．５マウス脳）。Ｄ，神経幹細胞／放射神経膠マーカーに対するＮＳ−５免疫反応性。Ｅ，ＮＳ−５の星状細胞（ａ，ｂ）およびニューロン（ｄ，ｅ）への分化とネスチン免疫反応性の喪失（ｃ，ｆ）。Ｆ，ＮＳ−５細胞のコロニー（ａ）は、増殖因子除去に際してニューロンを生成し（ｂ）、そしてＥＧＦ／ＦＧＦの存在下で、ＲＣ２およびＢＬＢＰの均質な発現を保持し、ＧＦＡＰに対する免疫反応性を喪失している（ｃ，ｄ）。Ｇ，ＮＳ−５の中期広がり（３１継代目）。
【０１２７】
図２は、ＮＳ細胞が種々のＥＳ細胞株および胎児前脳から誘導され得ることを示す：ＮＳ細胞は、独立したＥＳ細胞株（ＣＧＲ８、Ｅ１４Ｔｇ２ａ）または一次皮質（Ｃｏｒ−１）および線条体（Ｓｔｒ−１）組織から誘導した。Ａ，幹細胞／放射神経膠マーカーのＲＴ−ＰＣＲ。Ｂ，転写調節因子についてのＲＴ−ＰＣＲ。Ｃ，ＥＳ由来株（ＣＧＲ８−ＮＳ）および胎児由来株（Ｃｏｒ−１）は、形態学（ａ，ｆ）および神経幹細胞／放射神経膠マーカー免疫反応性（ｂ，ｃ，ｇ，ｈ）ではＬＣ１とは区別不能であり、各々はニューロン（ｄ，ｉ）および星状細胞（ｅ，ｊ）に分化し得る。
【０１２８】
図３は、ＮＳ細胞が成体脳内に取り込まれ分化することを示す：ａ〜ｈ ｅＧＦＰをレンチウイルス形質導入し、海馬（ａ，ｂ）または線条体（ｃ〜ｈ）に移植４週間後のＬＣ１ ＮＳ細胞の共焦点像。ｂ，ｄ，それぞれパネルａおよびｃのより高い倍率の差込図。ｅ，ｆ，ニューロンマーカーＴｕＪ（ｅ，赤）またはＭＡＰ−２（ｆ，赤）の共発現（黄）を示しているｅＧＦＰ移植ＮＳ細胞（緑）の例。ｇ，星状膠マーカーＧＦＡＰ（赤）。ｈ，神経前駆体マーカーネスチン（赤）。ｉ，成体マウス線条体への移植の４週間後の移植片に由来するニューロン（ＭＡＰ２）、星状膠（ＧＦＡＰ）、前駆体（ネスチン）、および増殖（Ｋｉ６７）細胞の定量分析。データは、５匹の独立した動物由来の少なくとも５００のｅＧＦＰ＋細胞の平均（±標準偏差）である。スケールバー：ａ，ｃ，１００μｍ；ｂ，ｄ，ｅ，４０μｍ；ｆ〜ｈ，２０μｍ。
【０１２９】
図４は、ヒトＥＳ細胞または胎児由来ＮＳ細胞を示す。Ａ，ヒトＥＳ細胞からの誘導。ａ，ヒトＥＳ一次培養物。ｂ，神経ロゼット構造へのヒトＥＳ細胞の分化。ｃ，ＮＳ増殖培地における９継代目。ｄ，個々の細胞は放射神経膠形態を示す。ｅ〜ｈ，神経幹細胞／放射神経膠マーカーに対する免疫染色。Ｂ，ヒト胎児前脳からの誘導。ｉ，皮質から生成した神経球。ｊ，付着および成長。ｋ，ＮＳ増殖培地における５継代目。ｌ，放射神経膠形態。ｍ〜ｐ，神経幹細胞／放射神経膠マーカー。Ｃ，分化。ｑ，ＴｕＪ陽性未熟ニューロン。ｒ，ＧＦＡＰ陽性星状膠。
【０１３０】
図５は、以下を示す：Ａ．分化培地における６日（ａ）、１２日（ｂ）、および３０日（ｃ）間のインキュベーション後の３つの異なるＮＳ細胞からの異なる膜電位（−９０ｍＶの保持電位から−７０ｍＶと＋４０ｍＶとの間）で得られる内向きおよび外向きの重畳電流追跡。Ｂ．（Ａ）において示される電流記録が得られた直後に電圧クランプから電流クランプに切り替えることによる、（Ａ）と同じ３つの細胞（ａ，ｂおよびｃ）における脱分極矩形電流パルスの注入後に得られた重畳電圧応答。破線は、−６０ｍＶの電圧レベルを表している。Ｃ．ラベルにより示されるように時間が増加している間に分化培地で培養した細胞からの−２０ｍＶで誘発された平均Ｎａ＋電流。バーは、ＳＥを示している。Ｄ．１０ｍＭ Ｂａ２＋中およびＴＴＸの存在下の−４０ｍＶおよび０ｍＶで誘発された内向きの重畳電流；保持電位は−９０ｍＶであった。Ｅ．（Ｄ）と同じ細胞からの電流／電圧関係。
【０１３１】
本発明は、以下の実施例を用いて実証される。
【実施例】
【０１３２】
（実施例１−１）
（ＮＳ細胞のバルク集団の単離および培養）
接着単層培養での５０〜７０％の間のＳｏｘ１陽性神経前駆体の効率的かつ一貫した生成を可能にするＥＳ細胞分化プロトコルが、近年確立された。これらの培養物内の神経前駆体（マウス由来）を単離し増殖しそして特徴付けるために、Ｓｏｘ１遺伝子座にターゲティングしたＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ピューロマイシンレポーターカセットを含む以前に生成された細胞株（４６Ｃ細胞）を使用した（Yingら, 2003b）。ピューロマイシンを７日後に分化培養物に添加し、そして３日以内に、残りの細胞の９５％より多くがＧＦＰ＋神経前駆体となった。この時点で、細胞を、（ピューロマイシンなしで）ＥＧＦ／ＦＧＦ−２を添加したＮ２Ｂ２７培地に再播種した。これらの細胞は迅速に増殖し、数継代内で均質な形態をとった。
【０１３３】
これらの４６Ｃ神経前駆細胞（４６Ｃ−ＮＰ）は、２０継代より多くの間培養物中で継続して維持され、特徴的な二極性の形態を保持していた。これらの培養物は、ほとんど細胞死を示さず、そして高い播種効率を有し、倍加時間は約２５時間であった。
【０１３４】
（実施例１−２）
（細胞株の培養）
クローン細胞株を単離するために、４６Ｃ−ＮＰ細胞の５継代目バルク培養物からの単一の細胞を、マイクロウェルプレートの別々のウェル中に播種した。スコア付けした９５の単一の細胞のうち１５がコロニーに増殖し、そしてこれらのうち４株が１０継代より多くにわたって継続して増殖し続けた。１つの株（ＮＰ５）は、バルク集団で観察されたのと同一である均質な形態を有する特徴的な二極性の細胞を示した。このＮＰ５株は、無期限に培養物中で維持された（ＮＰ５ ４１継代目；５ヶ月以上）。
【０１３５】
（実施例１−３）
（ＮＳ細胞の特徴づけ）
バルク細胞集団およびクローン株の両方ともを特徴付けるために、種々のマーカーについて免疫細胞化学を用いた。予期されるように、細胞株の各々は、神経前駆体マーカーであるネスチンもしくはビメンチンに対して陽性であることが判明した。重要なことに、これらの細胞はまた、放射神経膠特異的マーカーであるＲＣ２、３ＣＢ２および星状細胞特異的グルタミン酸輸送因子（ＧＬＡＳＴ）に対しても陽性であった。細胞の１％未満がＧＦＡＰまたはβIIIチューブリンのいずれかに対して陽性であった。このことは、これらの細胞の継代の間に、星状細胞またはニューロンへの自発的分化がほとんど生じていないことを示唆している。霊長類／ヒト細胞とは異なり、げっ歯類放射神経膠は、ＧＦＡＰに対して陰性である。さらに、これらの細胞は、成体神経幹細胞に対して富化するために以前に使用されたＳＳＥＡ−１、ルイスＸ抗原を認識する抗体に対して免疫反応性である。
【０１３６】
種々のマーカーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施し、放射神経膠としてのそれらの同一性を確認した。４つのクローン株の全てならびにバルク集団は、免疫細胞化学と一致して、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇに対して陰性であり（このことは、それらがＥＳ細胞ではないことを確証している）、一方、それらは、ネスチン、ビメンチン、およびＧＬＡＳＴを発現していた。さらに、各細胞株は、ＢＬＢＰ、放射神経膠マーカーの発現を示した。これらの細胞はまた、ムサシ−１およびプロミニンも発現している。
【０１３７】
興味深いことに、４６Ｃ−ＮＰのバルク培養物は、ＧＦＰレポーターにより評価されるように、Ｓｏｘ１の発現を徐々に喪失し、５継代目まで（約２週間）に、ほとんどの細胞が緑色ではなくなった。また、Ｓｏｘ１駆動ＧＦＰ発現を示したクローン株はなく、ＲＴ−ＰＣＲは、これらの細胞がＳｏｘ１を発現せず、代わりに関連のＳｏｘＢ１クラスのタンパク質であるＳｏｘ２を発現していることを確証した。まとめると、これらの結果は、種々のＳｏｘ１発現神経前駆体が、ピューロマイシン選択ストラテジーを用いて単離され得ること、および前脳放射神経膠の特性を有するＳｏｘ１−，Ｓｏｘ２＋細胞が、単離およびクローン増殖され得ることを示唆している。
【０１３８】
（実施例１−４）
（ニューロンおよび神経膠へのＮＳ細胞株分化）
ＮＳ細胞株により発現された分子マーカーは、それらが神経前駆細胞の型であることを確証している。これらの細胞が真の多分化能性幹細胞である（すなわち、ニューロンまたは神経膠のいずれかとして分化し得る）ことを確認するために、細胞の潜在能を試験するために設計した種々の条件を試験した。
【０１３９】
神経前駆体の以前の研究は、マイトジェンの除去および／または血清もしくは他のサイトカインの添加を包含するプロトコルによって、分化を誘導した。本発明の場合では、ＥＧＦ、ＦＧＦ、または両方を、プラスチック上で培養した増殖中のＮＰ５および４６Ｃ−ＮＰ細胞から除去した。ＥＧＦおよびＦＧＦの両方を同時に除去することにより、２４時間以内に急速かつ広範囲の細胞死が生じた。比べて、ＦＧＦ単独での培養は、３日間かかって細胞死に至った。ＥＧＦ単独での培養では、細胞死も分化も生じなかったが、細胞増殖は減少した。したがって、明らかに、ＥＧＦは、プラスチック上で培養したＮＳ細胞に対して必須の細胞生存シグナル（部分的にＦＧＦシグナル伝達により補償される）として作用している。
【０１４０】
サイトカインの除去後の細胞の増殖に関する血清の効果もまた試験した。このようにして処理した細胞は、ＥＧＦの不在下でさえも生存し、そして同期様式で迅速に分化し、これにより細胞の１００％が、ＧＦＡＰに対して陽性およびネスチンに対して陰性に染色した大きな扁平の星状細胞を獲得した。したがって、増殖集団内の全てのＮＳ細胞が、星状細胞として分化し得る。この効果は、プラスチック上のＥＧＦ／ＦＧＦ除去後の血清の不在下でのＢＭＰ４の添加によって模倣され得る。ＣＮＴＦおよびＴＧＦ−βは、星状細胞形態が異なりそしてより多くの細胞死が初期にあったが、ＢＭＰ４と同様に挙動した。ＢＭＰ、ＣＮＴＦおよびＬＩＦは各々、一次皮質前駆体から星状細胞運命を誘導することが示されている（Grossら, 1996; LillienおよびRaff, 1990; Nakashimaら, 1999）。これらの研究と一致して、ＢＭＰ−４または血清処理でのＩｄ遺伝子（＞３０倍）の迅速な誘導が見られた（データは示さず）。
【０１４１】
ニューロン分化を誘導しようとして、ラミニン処理ディッシュでのＥＧＦの除去を試験した。プラスチック上での細胞の培養で見られた細胞死を回避するために、細胞を、ＦＧＦを含むがＥＧＦを含まないラミニン基材上に播種した。プラスチックまたはゼラチン上でのこれらの条件で見られたＰＣＤは生じておらず、細胞は生存していた。細胞の形態が、より拡張された二極性の突起に変化しており、これは、放射神経膠の特徴的なエンドフィートを有する。これらの細胞は、（ＢｒｄＵ取り込みによって）増殖において激烈な減少を示したが、放射神経膠マーカー（ＲＣ２、ビメンチン、ネスチン）を維持しており、分化しておらず、ほんの少ない割合のニューロンまたは星状細胞のみが高密度の領域で見られた。ニューロン分化を誘導するために、６日後、培地をＮＳＡ／Ｎ２ ＋ＦＧＦ２からＮＳＡ／Ｂ２７（ＦＧＦ２なし）に変更した。このことにより、ＭＡＰ２およびβIIIチューブリン抗体染色により判断されるように約４０〜６０％の細胞のニューロン分化が促進された。これらのニューロンは、ＧＡＢＡ免疫反応性によって評価されるようにＧＡＢＡ原性（GABAergic）であったが、星状細胞（ＧＦＡＰ）はほとんど存在しなかった。これらの結果は、ニューロン分化の妨害におけるＦＧＦの以前に記載された役割と一致している。
【０１４２】
各細胞株が、ＥＳ細胞と同様に首尾よく凍結されそして融解され得ることもまた見出された。
【０１４３】
さらなる試験において、単一の細胞から始まる分化を試みた。このクローン発現および分化は、細胞の全てがニューロンを形成する能力を有することを示した。
【０１４４】
（実施例１−５）
（遺伝子選抜ストラテジーを用いない任意のＥＳ細胞株からのＮＳ細胞の単離）
ＮＰ５を単離するために用いられるＮ２Ｂ２７培地は、ＥＳ細胞の神経前駆体への変換に対してもともと最適化されており、このため、ＥＳ細胞および神経前駆体の両方の良好な生存が可能になった。したがって、ピューロマイシン選択がなければ、ＥＳ細胞および非神経細胞型のキャリーオーバーのために、ＥＧＦおよびＦＧＦ−２を用いて４６Ｃ−ＮＰ細胞を効率的に増殖することができなかった（データは示さず）。これを克服しそして他のターゲティングされないＥＳ株からの放射神経膠細胞の生成を可能にするために、神経前駆体を生存および増殖させるが他の細胞型はそうではない他の基本培地の組合せを試験した。
【０１４５】
市販の培地であるＮＳ−Ａ培地（Euroclone）を用いて、７日目での４６Ｃ ＥＳ細胞単層分化の再播種が、細胞の塊／球の形成ならびに非神経細胞の細胞死を生じることが分かった。引き続いて、これらの細胞塊の付着が生じ、そして細胞の均質な集団が大きくなった。この継代可能な細胞集団（＞７５継代）のさらなる特徴づけにより、ピューロマイシン選択ストラテジーを用いて以前に見られた発現されたマーカーの同一のプロフィールが明らかになった。したがって、細胞は神経前駆体マーカー（ネスチン、ビメンチン）に対して陽性であり、また放射神経膠マーカー（ＲＣ２、ＧＬＡＳＴ、ＢＬＢＰおよびＰａｘ６）に対しても陽性であった。４６Ｃ−ＮＰ細胞は、形態においてほんのわずかな差異を有しそしてマーカー遺伝子の差異がないことがかつて確立されているＮ２Ｂ２７またはＮＳＡ培地のいずれにおいても、同様に挙動した。
【０１４６】
このプロトコルを用いて、６つの他のＥＳ株からの細胞株を単離した：ＣＧＲ８、Ｅ１４Ｔ、Ｏｃｔ４−ＧＩＰ、Ｓ１１、Ｒ１およびＶ６．５。これらの細胞株の各々は、同様の形態および発現プロフィールを有し、そして広範に継代され得る。
【０１４７】
（実施例１−６）
（ＮＳ細胞の移植）
インビボでＮＳ細胞の能力を試験するために、それらを、胚性および成体ＣＮＳの両方へ、ならびに腎臓嚢移植片に移植した。
【０１４８】
エレクトロポレーションをＮＰ５において試験した。それらは、矩形波エレクトロポレーターを用いて効率的にエレクトロポレートされることが見出された。細胞はまた、リポフェクタミン添加試薬を用いてトランスフェクト可能である。これは、マウスに用いられる全ての遺伝子操作が利用可能になるので、大きな利点である。
【０１４９】
移植した細胞の迅速な評価を可能にするために、ｅＧＦＰマーカー遺伝子を保有するレンチウイルス粒子で４６Ｃ−ＮＰを形質導入した。感染は非常に効率的であり、細胞のほぼ９５％が首尾よくマーキングされ、ｅＧＦＰシグナルは継代と共に強くかつ安定であった。レンチウイルス感染の使用により、トランスジーンは安定に組み込まれ、そしてシグナルは、移植した細胞の長期分析に安定なままとなった。
【０１５０】
胚性脳（未熟神経細胞を持続しそして分化を方向付けることが可能な分子および因子の全てを含む環境）での移植後の細胞の挙動を評価した。Ｅ１４．５マウス胚をレシピエントとして用い、Magrassiおよび共同研究者（Magrassiら, Development 1999）によって以前に記載された手順に従って、100,000個の細胞を２μＬの最終容量中に再懸濁した。細胞は、移植後良好に生存し（概算により、移植片中で約20000個の細胞であった）、ｅＧＦＰシグナルは、容易に検出可能であり、そしてそれらは、移植後に初期の時点で既に遊走活動を提示した。移植後の種々の時点（４日、７日、２週間、および１ヶ月）で移植した細胞が獲得した運命を分析した。４日目および１週間の時点で、細胞の大部分は、ネスチン免疫反応性によって示されるようになお未熟であったが、２３％は、ニューロンマーカーＴｕｊ−１を発現し、そして１６．３％は、神経膠マーカーＧＦＡＰを獲得していた。これらのデータは、移植したＮＳが、多分化能性ＮＳ細胞から予期されるように、インビボでニューロンおよび神経膠の両方を生成し得ることを示している。
【０１５１】
ＮＳ細胞を、成体線条体にも移植した。これらの移植体では、細胞は良好に生存し（いずれにせよ生存は、胚性移植片におけるよりも低い）、そしてニューロンおよび神経膠の両運命の方向に分化した。移植後２週間目に実施した定量分析は、細胞の４３．３％がニューロン特異的マーカーＴｕｊ−１を発現し、一方、２６．６％が神経膠マーカーＧＦＡＰに対して免疫反応性を提示したことを示した。少ない割合の細胞（１１．１％）が、ネスチンの発現により示されるように未熟な表現型を保持していた。
【０１５２】
腎臓嚢へのＮＰ５−ＧＦＰ細胞は、奇形腫を生じなかった（ｎ＝４、データは示さず）。
【０１５３】
（実施例２）
（実施例２−１）
（方法）
（マウス細胞の培養および分化）
ＥＳ細胞および神経分化は、YingおよびSmith, 2003によって詳述されている。ＬＣ１と命名したＮＳ細胞および他のＥＳ細胞由来ＮＳ細胞を、Ｎ２および１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよびＦＧＦ−２の両方を添加したＮＳ−Ａ培地（Euroclone）（ＮＳ増殖培地）においてコーティングされていないプラスチック上で７日目の神経分化単層培養物を再播種することにより、通常通りに生成した。細胞は凝集体を形成し、引き続いて付着しそしてＮＳ細胞を大きくした。７日目に０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを分化接着培養物に添加した後に生成された細胞を、４６Ｃ−ＮＳ細胞と命名した。３日後に、細胞を、ピューロマイシンのない１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦおよびＦＧＦ−２（Peprotech）の両方を含むＮ２Ｂ２７培地において、コーティングされていないＴ７５フラスコ中に再播種した。クローン株ＮＳ−５を、限定希釈によって９６ウェルマイクロウェルプレート（Nunc）中に単一の細胞を播種することにより生成した（播種１時間後に単一の細胞をスコア付けした）。一次培養物を、Ｅ１６．５マウス胚の皮質／線条体から標準プロトコルを用いて生成し、そして０．１％ゼラチンで処理したフラスコ上に付着させた。次いで、Ｃｏｒ−１およびＳｔｒ−１細胞を、ＮＳ増殖培地を用いてゼラチン上で増殖させた。星状細胞分化のために、ＮＳ細胞を、１％ウシ胎児血清または１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（R&D System）を添加したＮＳ−Ａ培地中に１×１０５細胞／ウェルで、４ウェルプレート上に再播種した。ニューロン分化のために、５×１０４ＮＳ細胞を、ＦＧＦ−２単独を添加したＮＳ−Ａにおいてポリオルニチン／ラミニン処理ウェル中に播種した。７日後、培地を、増殖因子を含まないＢ２７（Gibco）を添加したＮＳ−Ａに切り替えた。クローン分化のために、ＮＳ−５またはＣｏｒ−１培養物からの１０００細胞を、ラミニンで前処理した１０ｃｍプレートに播種し、ＥＧＦ／ＦＧＦ−２中で１２日間増殖させ、そして上記のようにインサイチュで分化させた。
【０１５４】
（ＮＳ細胞の特徴づけ）
免疫細胞化学を、適切なＴＲＩＴＣまたはＦＩＴＣ二次結合体とＤＡＰＩでの核対比染色とを用いて実施した。以下の希釈で一次抗体を用いた：ネスチン（１：１０）、ビメンチン（１：５０）、Ｐａｘ６（１：５）、３ＣＢ２（１：２０）、ＲＣ２（１：５０）（DSHB）；ＴｕＪ（１：２００）（Covance）；ＧＦＡＰ（１：３００）（ポリおよびモノ、Sigma）、ＭＡＰ２（１：２００）（ChemiconおよびBecton Dickinson）；ＮｅｕＮ（１：２００）、ＧＡＢＡ（１：２００）、Ｇａｄ６５／６７（１：２００）（Chemicon）；シナプトフィシン（１：２００）（Sigma）；Ｏｌｉｇ２（１：５０００）（H. Takebayashi）；Ｅｍｘ２（１：２０００）（A. Corte）；ＢＬＢＰ（１：５００）（N. Heintz）；プロミニン／ｍＡｂ１３Ａ４（１：２００）（W. Huttner）。陰性コントロールはＥＳ細胞、分化したＮＳ細胞または二次単独であった。ＲＴ−ＰＣＲのために、全ＲＮＡをRNeasyキット（Qiagen）を用いて抽出し、そしてｃＤＮＡをSuperscript II（Invitrogen）を用いて生成した。β−アクチン（２５サイクル）を除いて、全てのマーカーについてＰＣＲを３０サイクル実施した。中期広がりのために、細胞を５ｍｌの０．５６％ ＫＣｌで２０分間処理し、氷上でメタノール：酢酸（３：１）中に１５分間固定し、スライドガラス上に広げ、そしてＴＯＰＲＯ−３（Molecular probes）で染色した。
【０１５５】
（ヒト胚および胎児培養物）
インフォームドコンセントのもとでのヒト組織に関する研究は、Research Ethics Committee of Lothian Health Boardによって認可された。凍結した余剰のヒト胚が、Human Fertilisation and Embryology Authorityにより発行されたライセンスＲ０１３２下での研究のために贈与された。Polkinghorneガイドライン下の研究のために同意のもとに選択中絶したカーネギー１９／２０期の胎児からヒト皮質を切り出した。
【０１５６】
（移植）
Magrassiら, 1998に記載により胎児手術を実施した。ガラスキャピラリーを用いて、１μＬのＨＢＳＳの容量中に５×１０４個の細胞を、透照下で曝露したE14.5 Sprague Dawleyラット胎児の終脳小胞に注入した。注入された胎児を、満期まで発生のために腹腔内に戻した。分娩後、移植後７日目（出生後日数（Ｐ）１、ｎ＝１６）および５週目（Ｐ３０、ｎ＝８）で動物を屠殺した。成体移植のために、１２９またはＣＤ１マウスをＫｏｐｆ定位枠内に置き、そして５μＬのＨＢＳＳ中に懸濁した２×１０５個のＮＳ細胞を線条体（ｎ＝２２）または海馬（ｎ＝２１）に注入した。移植されたマウスを２週後（ｎ＝１６）および４週後（ｎ＝１０）に屠殺し、そして４％パラホルムアルデヒドを経心臓にて灌流した。低温切片（１６μｍ）を以下の抗体で染色した：（マウス）：ＮｅｕＮ（１：１００）およびＫｉ６７（１：１０）（Chemicon）、ＭＡＰ２（１：２００；Becton Dickinson）、ネスチン（１：５;Ron McKay）；（ウサギ）：βIIIチューブリン（１：５００；Covance）；ＧＦＡＰ（１：２００；Dako）；二次抗体、Texas Red（Vector）（Jackson ImmunoResearch）およびAlexaFluor 488（Molecular Probes）。切片を変退色防止溶液中で保存し、そしてNikon TE2000-S ECLIPSEおよびBiorad Radiance 2100共焦点顕微鏡で分析した。
【０１５７】
（実施例２−２）
本発明者らは、ＥＳ細胞の単層分化を７日間誘導し、次いでＥＧＦおよびＦＧＦ−２を添加した基本培地（ＮＳ−Ａ＋Ｎ２）に再播種した。これらの最少条件（ＥＳ細胞生存に対して非許容）下で生存している細胞が主として結合して浮遊塊となる。３〜５日後、これらの凝集体を採取し、そして新鮮な培地に再播種した。それらは、２〜３日以内に付着し、そして二極細胞の形態的に均質な集団に大きくなった（ＬＣ１と命名）。継代に際して、ＬＣ１細胞は、接着培養物として増殖し続け、しばしば、格子状網を形成した。それらは、連続的かつ迅速に増殖され得、倍加時間は約２４時間である。ＬＣ１細胞は、神経前駆マーカーのネスチンおよびＲＣ２を提示するが、星状細胞分化マーカーのＧＦＡＰまたはニューロン抗原の発現は無視し得る程度である（図１Ａ）。血清またはＢＭＰへの曝露に際して、ＬＣ１細胞は、４８時間以内に代表的な星状細胞形態をとり、そして引き続き、ＧＦＡＰを均一に発現する（図１Ａ，ｅ）。対照的に、ニューロン突起を有する細胞は、ＥＧＦなしで５〜７日間ラミニン上に再播種しそしてＦＧＦ−２を除去した後に出現する。これらの細胞は、ニューロンマーカーのIII型β−チューブリン、ＭＡＰ２（図１Ａ，ｆ，ｇ）およびｎｅｕＮ（示さず）を発現している。ほとんどのニューロンは、ＧＡＤ６７（図１Ａ，ｇ）およびＧＡＢＡ（示さず）に対して染色し、そして７日目まで、亜集団が、成熟マーカーのシナプトフィシンの発現を示す（図１Ａ，ｈ）。１１５継代後でさえも、多数のニューロン（＞３５％）が生成される（図１Ａ，ｉ）。ＬＣ１細胞が後期継代で二倍体染色体内容物を保持しているという所見（示さず）とともに、このことは、自己再生神経幹（ＮＳ）細胞の存在を確証している。
【０１５８】
（実施例２−３）
細胞凝集がＮＳ細胞の生成に必須であるか否かを決定するために、本発明者らは、誘導プロセスを通して細胞付着を維持した。このために、本発明者らは、GFPirespacレポーター／選択カセットがＳｏｘ１遺伝子（神経分化の特異的マーカー（Aubertら, 2003）である）に組み込まれている４６Ｃ ＥＳ細胞を用いる系統選択（Liら, 1998）を利用した。分化誘導後の一過性のピューロマイシン選択により、残余ＥＳ細胞のない神経前駆体の精製された集団を得た（Stavridisら, 2003）（図１Ｂ ａ，ｂ）。次いで、ＦＧＦ−２およびＥＧＦを、富化培地中でＳｏｘ１発現神経前駆体に与えた。この条件で細胞は接着したままであった。細胞異質性は３〜４継代にわたって減少した。二極細胞の数が累進的に増大し、広範囲に格子を形成し始めたからである。興味深いことに、Ｓｏｘ１の発現はこの段階で喪失したが（図１Ｂ ｃ，ｄ）、細胞は、Ｓｏｘ２およびネスチンに対してなお陽性であった。神経幹（ＮＳ）細胞の存在を確立するために、単一の細胞をTerasakiウェルに単離し、そして接着培養として増殖させた（図１Ｂ，ｅ，ｆ）。まず、同様の形態および増殖特性の５つのクローン株を、バルクＬＣ１集団に誘導した。これらの細胞は、分化多能性因子のＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ、ならびにまた初期神経マーカーのＳｏｘ１の検出可能な発現を欠いていたが、汎神経上皮マーカーのＳｏｘ２およびネスチンを保持していた（図１Ｃ）。したがって、ＮＳ細胞は、連続接着培養によってＳｏｘ１陽性初期神経外胚葉前駆体から生成された。
【０１５９】
（実施例２−４）
クローンＮＳ−５をさらに詳細に試験し、そしてＰａｘ６、Ｇｌａｓｔ、およびＢＬＢＰのｍＲＮＡを発現していること、および、ＲＣ２、ビメンチン、３ＣＢ２、ＳＳＥＡ１／Ｌｅｘ１、およびプロミニンに対して免疫陽性であることを見出した（図１Ｄ）。このマーカーセットは、神経原性放射神経膠に対する診断に有用であるとみなされており、神経系の発生の間のニューロンおよび星状細胞の両方の前駆体である（Campbellら, 2002; Hartfussら, 2001）。クローン化されていないＬＣ１細胞と同様に、ＮＳ−５細胞は、星状細胞およびニューロン分化に対してコンピテントであった（図１Ｅ）。ＥＧＦ＋ＦＧＦ−２にクローン密度で播種したＮＳ−５細胞は、二極細胞のコロニーを生じた。全てのコロニーが、事実上全ての細胞でのＲＣ２およびＢＬＢＰの発現、ならびにＧＦＡＰの不在を示した（図１Ｆ，ｃ，ｄ）。これらのサブクローンを選抜し、そして連続して増殖させた。ＮＳ培養内でのニューロン分化可能な細胞の頻度を決定するために、本発明者らは、再度、ＮＳ−５細胞をクローン密度で播種し、ＥＧＦ／ＦＧＦ−２中で１２日間、次いでＦＧＦ−２単独で５日間、次いでさらに７日間増殖因子なしで増殖させた。全てのコロニー（１２６／１２６）が、ＴｕＪ陽性細胞を生成した（図１Ｆ，ｂ）。これらのデータは、ＮＳ培養物中の全てのコロニー形成細胞が、ニューロン分化に対してコンピテントであったことを示した。最終的に、ＬＣ１と同様に、ＮＳ−５細胞は、二倍体染色体相補体を維持しており（図１Ｇ）、そして複雑な細胞微細環境の必要なく自己再生する非形質転換クローン神経幹（ＮＳ）細胞株であることを表していた。
【０１６０】
（実施例２−５）
無血清単層誘導プロトコルがＮＳ細胞生成に予め必要であるか否かを評価するために、ＥＳ細胞を、胚様体形成および血清含有培地中のレチン酸への曝露によって分化を誘導した（Bainら, 1995）。凝集体を、Ｇ４１８を用いるＳｏｘ２系統選択（Liら, 1998; Billonら, 2002）に４８時間供し、次いで血清なしでＦＧＦ−２およびＥＧＦの存在下で再播種した。付着した後、Ｓｏｘ２陽性、ネスチン陽性の細胞が増殖した。これらの細胞は、ＮＳ細胞に代表的な二極性の形態および格子状の増殖を提示し、さらに多重継代後に星状細胞およびニューロン分化能を有した（データは示さず）。このように、ＮＳ細胞が、胚様体から誘導された。
【０１６１】
（実施例２−６）
３つの独立したＥＳ細胞単離株Ｅ１４ＴＧ２ａ、ＣＧＲ８、およびＲ１から、ＬＣ１について記載したような系統選択を行わずに単層誘導を用いてＮＳ細胞を誘導した。試験したＮＳ株は全てが、細胞の少なくとも９５％においてネスチンおよびＲＣ２を発現した。ＣＧＲ８およびＥ１４ＴＧ２ａ由来ＮＳ細胞のより詳細な研究により、フルパネルの放射神経膠マーカー（図２Ａ）、神経前駆体マーカーＳｏｘ２およびＳｏｘ３、ならびにｂＨＬＨ転写因子Ｏｌｉｇ２およびＭａｓｈ１（図２Ｂ）を示した。Ｓｏｘ１がダウンレギュレートされたがＳｏｘ２は維持されたことは、これらの転写因子の推定の決定的機能（Pevnyら, 1998）を考慮して、これらのＮＳ細胞の顕著な特徴であった。このように、Ｓｏｘ１は、全ての神経外胚葉前駆体をマークしているが、Ｓｏｘ２が重要な役割を果たしていると考えられる幹細胞においては、これは保持されなかった。ＮＳ細胞はまた、Ｅｍｘ２を発現していた。Ｅｍｘ２は、神経前駆細胞の増殖に関与している（Heinら, 2001; Galliら, 2002）。試験した全てのＮＳ培養物は、形態学および免疫染色の両方によって評価される星状細胞およびニューロンの分化を受けた（図２Ｃ）。
【０１６２】
（実施例２−７）
それらの放射神経膠への明らかな関係を考慮して、本発明者らは、ＮＳ細胞が、エクスビボ増殖へのＥＳ細胞の前適応から生じるか、または胎児神経組織から誘導され得るかを調べた。Ｅ１６．５胎児脳からの一次胎児ＣＮＳ細胞は、増殖因子を添加した基本培地ではプラスチックへの接着はわずかであり、自発的に凝集体を形成した。６〜７日後、これらの凝集体は、ゼラチンコーティングしたプラスチック上に定着した。１４日後、成長体をトリプシン処理し、そしてゼラチンコーティングしたプラスチック上に播種した。３つの別個の実験において、ＮＳ細胞と形態学的に同定可能な細胞が増殖し、そして引き続き増殖させて、連続細胞株になった。これらの胎児脳誘導物は、ＥＳ細胞由来ＮＳ細胞と同じ放射神経膠および神経原性マーカーを発現し（図２Ａ、Ｂ）、そして一致したｍＲＮＡプロフィールを示した。それらは、同様に、星状細胞およびニューロン分化に対してコンピテントであった（図２Ｃ）。ＮＳ−５について記載したように、皮質誘導Ｃｏｒ−１細胞を単一の細胞として播種し、次いでコロニーを引き続く増殖因子除去に供した。全てのコロニーが、ＴｕＪ陽性ニューロンを生成していた。このことは、Ｃｏｒ１培養物中の全てのクローン原性細胞が神経原性であることを示していた。Ｃｏｒ−１細胞もまた、個々の細胞から容易にサブクローン化されそして連続的に増殖された。これは、自己再生を示す。このように、ＮＳ細胞が胎児脳から誘導され、そしてこれは、ＥＳ細胞由来ＮＳ細胞の重要な特性を共有していた。
【０１６３】
ほとんどのＮＳ細胞は、放射神経膠であると認められる、伸長した二極性の形態、平板状の伸長部、エンドフィートおよび卵形の核（Rakic, 2003）を有していた。短い伸長部を有する扁平状の緻密な細胞もまた存在していた。中期マーカーであるリン酸化ヒストンＨ３に対する免疫染色により、緻密な細胞は、有系分裂しているものであることが示された。時間差ビデオ顕微鏡により、細胞分裂前に形態が活発に変化していることが確認された。さらに、この時間差により、ＮＳ細胞が、運動間の核移動を受けていることが明らかになった。これは、インビボでの神経上皮および放射神経膠細胞の十分に特徴付けられた特徴である。
【０１６４】
したがって、ＮＳ細胞は、神経原性放射神経膠の連続的に増殖可能なインビトロアナログであった。
【０１６５】
（実施例２−８）
凍結／融解した４０継代目のマウス神経球を、ＮＳ増殖培地中でゼラチンコーティングしたプラスチックに付着させた。ＮＳ細胞と区別不能な二極細胞が生じた。これらの細胞は、均一なＲＣ２陽性ＧＦＡＰ陰性の集団として連続的に増殖され得、次いで星状細胞またはニューロンへの分化が誘導され得る。
【０１６６】
（実施例２−９）
本発明者らは、マウス脳への移植の際のＮＳ細胞の挙動を調べた。レンチウイルスｅＧＦＰ発現ベクターを用いて形質導入したＥＳ細胞由来ＬＣ１細胞を、Ｅ１４．５での子宮内注入により発生中の脳に導入した（Magrassiら, 1998）。出生後、動物を屠殺し、そして脳切片のｅＧＦＰ陽性細胞の存在を調べた。ＮＳ細胞子孫は、種々の脳領域に遊走していた。免疫組織化学分析により、ｅＧＦＰと、前駆体マーカーネスチン、ニューロンマーカーＴｕＪ、ＮｅｕＮ、およびＭＡＰ２と、ならびに数は少なくなるがＧＦＡＰとが共発現していることが明らかになった。ＮＳ細胞を成体マウス線条体にも注入した。この場合、ＧＦＰ陽性細胞は、注入部位の近辺に局在したままであった。移植４週間後、ＧＦＰ発現細胞の４４．４±５．７％がニューロン形態を有しそしてＭＡＰ２に対して免疫陽性であり、３７．４±６．１％がＧＦＡＰを発現し、そして４．２±１．９％がネスチンの発現を保持していた（図３）。増殖マーカーＫｉ６７は、ＧＦＰ陽性細胞の１．０±０．６％でのみ検出された。このことは、ＮＳ細胞がインビボで細胞周期から回収されたことを示している。このことと一致して、本発明者らは、移植の１ヵ月後に調べた全部で３５の脳において、制御されない増殖または腫瘍形成の組織学的証拠がないことを認めた。さらに、マウス腎臓嚢に移植されたＮＳ細胞は、増殖せず、奇形腫も生じなかった。これらのデータは、ＮＳ細胞が胎児脳および成体脳の両環境において生存しそして分化し得ること、およびＥＳ細胞（Brustleら, 1997）とは異なり、それらは奇形腫を生じないことを示していた。さらに、この比較的高い頻度でのニューロン分化は、継代した神経球の移植片（Rossiら, 2002）とは非常に対照的である。
【０１６７】
（実施例２−１０）
最後に、本発明者らは、同様のＮＳ細胞が、ヒト供給源から単離され得るか否かを調べた。贈与された余剰胚からヒトＥＳ細胞を誘導する過程において、本発明者らは、培養５〜６週後に、神経上皮細胞に代表的であるロゼット状構造への広範な分化を認めた。これらの細胞をＮＳ増殖培地に移した。さらに３〜４週後、ＮＳ細胞に類似の二極細胞がこれらの培養物から出現し（図４Ａ）、そして５ヶ月間連続的に培養した。本発明者らはまた、選択中絶からカーネギー１９〜２０期のヒト胎児皮質組織を確保した。解離した細胞はまず浮遊凝集体を形成した。マウス胎児脳からのＮＳ細胞の誘導と同様に、その７日後に再播種し、そしてゼラチンコーティングしたプラスチックに付着させた。増殖している培養物が樹立された（図４Ｂ）。ＥＳ細胞および胎児組織の両方からのヒトＮＳ培養物は、二極細胞が付随した扁平状の細胞の存在によって特徴付けられた。しかし、全ての細胞が、未熟前駆体マーカーであるネスチン、ビメンチン、および３ＣＢ２を発現していた（図４Ｂ）。時間差モニタリングによって、２つの細胞形態が形成されかつこれらは互換性であることが確証された。これらのヒト細胞はまた、低レベルのＧＦＡＰを提示し、これは、放射神経膠中のヒトＧＦＡＰプロモーターの活性（Rakic, 2003; Malatestaら, 2000）と一致した。それらは、マウス細胞よりもゆっくりと増殖した。倍加時間は数日間であった。ＥＧＦおよびＦＧＦ−２を引き続き除去した後、それらは、未熟なニューロン細胞を生成しているようであった（図４Ｃ）。強いＧＦＡＰ免疫反応性を有する代表的な星状細胞形態の細胞が、血清中の継代後に生成された（図４Ｃ）。
【０１６８】
（実施例３）
特定の処理後、これらの細胞が、成熟した機能的なニューロンに効率的に転換し得るか否かを電気生理学的観点から知るために、インビトロでの分化の間、培養物におけるＮＳ細胞の電気生理学特性を、パッチクランプ技術のホールセル改変型を用いることにより調べた。
【０１６９】
（電気生理学記録用溶液）
電極と細胞との間のシールを、以下からなるバス溶液中で確立した（ミリモル／ｌで表す）：１５５ ＮａＣｌ、１．０ ＣａＣｌ２、１ ＭｇＣｌ２、３．０ ＫＣｌ、１０ グルコース、１０ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）。ホールセルコンフィギュレーションを確立した後、電流クランプ記録および電圧クランプ中の総電流記録のために、ピペット充填溶液は以下を含んだ（ミリモル／ｌで表す）：１２８ ＫＣｌ、１０ ＮａＣｌ、１１ ＥＧＴＡ、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４）。電圧クランプ条件下での電圧ゲートＮａ＋チャネルの研究のために、パッチピペットを以下で満たした（ミリモル／ｌで表す）：１３０ ＣｓＣｌ、１０ ＮａＣｌ、２０ ＴＥＡ−Ｃｌ、１０ ＥＧＴＡ、２ ＭｇＣｌ２、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ ＨＥＰＥＳ／ＣｓＯＨ（ｐＨ７．４）。そして細胞外溶液は以下を含んだ（ミリモル／ｌで表す）：１３０ ＮａＣｌ、２ ＣａＣ１２、２ ＭｇＣｌ２、１０ グルコース、５ テトラエチルアンモニウム−Ｃｌ、ＣｄＣｌ２ ０．２、１０ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）。電圧ゲートＣａ２＋チャネルの研究のために、パッチピペットを以下で満たした（ミリモル／ｌで表す）：１２０ ＣｓＣｌ、２０ ＴＥＡ−Ｃｌ、１０ ＥＧＴＡ、２ ＭｇＣｌ２、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、１０ ＨＥＰＥＳ／ＣｓＯＨ（ｐＨ７．４）。そして細胞外溶液は以下を含んだ（ミリモル／ｌで表す）：１３０ ＮａＣｌ、１０ ＢａＣｌ２、１０ グルコース、５ テトラエチルアンモニウム−Ｃｌ、１０ ４−ＡＰ １、ＴＴＸ １０−３、ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（ｐＨ７．４）。
【０１７０】
（パッチクランプ記録）
イオン電流を、Axopatch 200Bパッチクランプ増幅器（Axon Instruments Inc., Burlingame, CA）によって室温（２０〜２４℃）でパッチクランプホールセル配置（１９）を用いて電圧クランプ条件下で記録し、そしてＩＢＭ互換ＰＣとインターフェースしたDigidata 1322A Ａ／Ｄ変換器（Axon Instruments Inc., Burlingame, CA）を用いて、２６〜１００μｓｅｃのサンプリング間隔でデジタル化した。刺激、データの取得、およびデータ分析は、以下のソフトウェアパッケージを用いて実施した：pClamp 9（Axon Instruments Inc., Burlingame, CA）およびORIGIN 6（Microcal Software Inc., Northampton, MA）。電圧クランプ実験のために、まず、漏洩および容量の電流の線形成分をアナログサーキットリによって減少させ、次いでＰ／Ｎ法でほぼ完全にキャンセルした。パッチピペットをホウケイ酸ガラス管から作製し、火入れした。ピペットは、内部溶液で満たしたときに３〜４ＭΩの最終抵抗を有していた。電流は５ＫＨｚでフィルタリングした。
【０１７１】
図５Ａは、内向き（Ｎａ＋）および外向き（Ｋ＋）の両電圧ゲートイオン電流の分離に適したバスおよびピペット充填溶液を用いた、インビトロ分化の異なる段階での３つのＮＳ細胞（それぞれ分化培地中で６日、２０日、および３０日間培養）における脱分極試験電位に対するホールセル電圧クランプ工程の間に得られた電流記録を示す。電流追跡の簡単な観察から、相当に大きな外向きの電圧ゲート電流がインビトロ分化の初期段階で既に存在していることが明らかである（６日、トレースａ）。この電流は、５ｍＭテトラエチルアンモニウム−Ｃｌを含む細胞外生理食塩水の適用によってブロックされ、遅延整流Ｋ＋電流の特徴を有する。その振幅は、分化の後期段階でわずかにのみ増大した（２０〜３０日、それぞれトレースｂおよびｃ）。対照的に、内向き電流の振幅は、６日後では無視し得る程度であるが、分化培地への曝露時間の増加によって劇的に増大している。図５Ｂは、図５Ａに示した同じ細胞における電圧クランプから電流クランプモードへの切り替え後に、約−８０ｍＶの保持電位からの７０〜３００ｐＡの間の矩形脱分極電流刺激の細胞内注入後に誘発された電圧応答を示す。確かに、電圧ゲート内向き電流の振幅の増大は、分化している細胞が活動電位を誘発する能力を反映している。実際、６日間のみ分化剤に曝露されて無視し得る程度の内向きを示している細胞は、再生電圧応答を誘発することができなかった（図５Ｂに（ａ）で示したトレース）。対照的に、比較的速い脱分極速度を有するオーバーシュート作用電位が、３０日間分化培地で培養され（図５Ｂに（ｃ）で示したトレース）そして大きな内向き電流を提示する（図Ａのトレースｃ）細胞において誘発され得た。中間型の状況（不全活動電位を有する）が、分化剤で２０日間処理され（図５Ｂに（ｂ）で示したトレース）そして中位の内向き電流を提示している（図Ａのトレースｂ）細胞で見られた。この予備分析から、これらの細胞の興奮特性が、内向き電圧ゲートコンダクタンスの大きさに対して厳密に相関していることが分かる。分化培地への曝露時間の関数としてのこのコンダクタンスの定量分析のために、内向き電流は、分化の異なる段階の細胞を用いそして電圧ゲートＮａ＋チャネルの活動の研究に特異的な細胞内および細胞外生理食塩水を適用して、誘発される（方法を参照のこと）。細胞分化の任意の時間で、速い不活性化内向き電流は、選択的Ｎａチャネルブロッカーであるテトロドトキシン（１μＭ）によって完全にブロックされ、そして−２０〜−１０ｍＶの間の試験電位でピークとなった。これは、ニューロンにおける電圧ゲートＮａ＋電流の代表的な特徴を示している（データは示さず）。図５Ｃには、分化培地への曝露時間の関数として−２０ｍＶでのＮａ＋電流振幅の発生が示される。興味深いことに、Ｎａ＋コンダクタンスの増大は、分化培地への細胞曝露の増大と十分に相関している。確かに、平均して、Ｎａ＋電流振幅は処理３０日以内で約１０倍増大している（最初の５日間の５５±１４ｐＡ（ｎ＝１７）から２５日より長い間の−４３４±１３５ｐＡ（ｎ＝１３）へ）。同じように、電流クランプ条件下のＮａ＋電流により誘発された再生電位（閾値とピーク値との間で測定されたΔＶ）は、インビトロ分化の最初の１５日間（ｎ＝６）は０から＋２０ｍＶの間であったが、処理が２５日より長ければ、＋３０から＋７０ｍＶの間の値に達した（ｎ＝６）。全体では、分化培地で２５日より長く処理されたＮＳ細胞で見られた興奮特性および原電圧ゲートＮａ＋コンダクタンスの特性は、それらの成体表現型に発達しているニューロンに代表的である。以前の結論を立証する別の特徴は、少なくとも７日間またはそれより長く分化培地に曝露した後に試験した細胞のほとんどにおける電圧ゲートＣａ２＋チャネルコンダクタンスの存在である。図５Ｄは、１０ｍＭ Ｂａ２＋のバス中に入れた同じ細胞からの示した試験電位に対する膜脱分極により得られるサンプル追跡を示す。−４０ｍＶで誘発された速い活性化およびやや速い不活性化（Δｈ＝２１ｍｓ）電流成分は、ニューロンＬＶＡ Ｃａ２＋チャネル電流（CarboneおよびLux, 1987）を暗示している。対照的に、０ｍＶで誘発されたＢａ２＋電流は、ゆっくりとした（Δｈ＝７３ｍｓ）不完全な不活性化を提示し、ニューロンＨＶＡ Ｃａ２＋チャネル電流の代表的な特徴を有する。この細胞における２つの別個（ＬＶＡおよびＨＶＡ）のＣａ２＋チャネルコンダクタンスの存在は、図５Ｅの電流−電圧関係によって確証される。平均して、ＬＶＡ電流は−４０ｍＶでピークであるが、ＨＶＡ電流についてＩ／Ｖ関係は０ｍＶでピークであった。ＨＶＡ Ｂａ２＋電流は、２７細胞のうち１９で検出可能であったが、ＬＶＡ電流成分は、ＨＶＡ Ｃａ２＋電流を既に発現している細胞の６０％で測定された（ｎ＝１３）。
【０１７２】
このデータは、本発明の神経幹細胞から生成されたニューロンが機能し得ることを示している：それらは、活動電位を刺激し得、これは、活性ニューロンの顕著な特徴である。
【０１７３】
したがって、本発明にしたがって、本発明者らは、所定のＮＳ細胞をＥＳ細胞および胎児脳抽出物の分化した子孫として誘導しそして均質に増殖した。ＮＳ細胞は、簡単な接着単層培養でクローン増殖し、そして二倍体を維持した。増殖の延長後、それらは、インビトロおよび成体脳への移植の両方で、ニューロンおよび星状細胞に効率的に分化した。ＮＳ細胞はまた、インビトロで乏突起膠細胞も形成した。ＮＳ細胞は、放射神経膠の形態および分子特徴、ニューロンおよび星状細胞の胎児前駆体、を均一に発現していた。本発明者らは、マウスおよびヒトの両方の胎児脳から接着ＮＳ細胞株を樹立できた。
【０１７４】
（実施例６）
以下のプロトコルを用いて、ＮＳ細胞を、マウスＥＳ細胞および胎児皮質から得た。誘導されたＮＳ細胞は、放射神経膠マーカーを均一に発現していた。ＣＧＲ８ ＥＳ細胞またはＥ１６胎児皮質（内部参照：Ｃｏｒ−１およびクローン誘導体Ｃｏｒ−１．３）から特異的に誘導されたＮＳ細胞を、免疫化学により指示マーカーの発現について分析した。ハイパワーでの試験は、放射神経膠マーカーが、ほとんど全ての細胞において各々発現されており、一方、均一にＧＦＡＰに対して陰性であったことを示した。
【０１７５】
（実施例７）
以下のプロトコルを用いて、ＮＳ細胞を、増殖させたマウス胎児前脳神経球から誘導した。長期胎児神経球培養物（４０継代）由来のＮＳ株は、ＥＳ由来ＮＳ株と同一の形態を示し、神経前駆細胞／放射神経膠マーカー免疫反応性を発現し、そしてニューロンおよび星状細胞に分化し得た。これは、新鮮な胎児神経球から得られたＮＳ細胞が、凍結し次いで長期間神経球として増殖した神経球から得られたものと同じであることを示した。
【０１７６】
（実施例８）
ＬＣ１マウスＮＳ細胞を胎児ラット脳に移植した。ｅＧＦＰを用いてレンチウイルス形質導入したＮＳ細胞の共焦点像を、Ｅ１４．５ラットの脳室への移植１週間後に撮影した。ドナー細胞は、塊状でおよび単一の細胞として、脳室から柔組織に移動した。移植された細胞は、ｅＧＦＰとニューロンマーカーＭＡＰ２、星状膠マーカーＧＦＡＰまたは前駆細胞マーカーネスチンとの共局在を示した。したがって、ＮＳ細胞は、胎児ラット脳における移植後、移動しそして分化した。
【０１７７】
（実施例９）
（ＮＳ細胞株の誘導および操作のためのプロトコル）
本発明者らは、ＮＳ細胞株の誘導および操作のために、以下のプロトコルを案出した。
【０１７８】
（ＥＳ細胞からのマウスＮＳ細胞株の誘導）
ＥＳ細胞は、接着単層培養においてＳｏｘ１発現神経前駆体に効率的に変換され得る［Ｐ１］。このＥＳ細胞分化に関する詳細なプロトコルおよびトラブルシューティングは他にも記載される［Ｐ２］。簡潔には、ＥＳ細胞を、ゼラチンコーティングした組織培養プラスチック上で１０％ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍｌ組換え白血病阻害因子（ＬＩＦ）を添加した培地中にフィーダーを与えない条件下で通常通りに培養する［Ｐ３］。未分化のＥＳ細胞を、Ｔ７５フラスコ（Iwaki）中で約８０％コンフルエンスまで増殖させ、トリプシン処理し、そしてＮ２Ｂ２７培地中に再懸濁する［Ｐ２］。細胞を、少なくとも１０分間０．１％ゼラチン溶液（Sigma）でコーティングし次いで乾燥させておいた９ｃｍプレート（Iwaki）上に播種する。初期播種密度は、効率的な神経誘導にとって重大なパラメーターであり、そしてＥＳ細胞株間で変動し得るので、本発明者らは、プレート当たりいくつかの異なる細胞密度（０．８×１０６、１×１０６、および１．２×１０６）で、通常通りに播種する。脱着または死亡した細胞を除去する過程で、毎日、培養培地を入れ替える。これらの条件下では、５０〜８０％の細胞が４〜５日以内に神経系統分化を受け、そして５日目から先では明白なニューロン分化が検出可能となる。
【０１７９】
不均質な前駆体培養物の均質ＮＳ細胞株への変換は、以下のようにして達成され得る。７日目の分化培養物をトリプシン処理し、そして２〜３×１０６個の細胞を、ＮＳ増殖培地（これはＬ−グルタミン、２ｍＭ 最終（Gibco）、改変Ｎ２補充物（ウマからの調製直後のもの）［Ｐ２］ならびに１０ｎｇ／ｍｌのマウスＥＧＦ（Peprotech）およびヒトＦＧＦ−２（Peprotech）を添加したＮＳ−Ａ培地（Euroclone）を含む）中で非コーティングＴ７５フラスコ中に再播種する。増殖培地は、４週間までの間、４℃で保存され得る。２〜３日以内に、フラスコは、懸濁培養物中に数千もの浮遊凝集体を含むようになる（絶対数は、初期ＥＳ細胞分化の効率に従って変動する）。細胞凝集体は、穏やかな遠心分離によって回収するか、または１０分間３０ｍｌユニバーサル管中で重力に従って静置させる。この工程は、破片および死細胞を除去することによりＮＳ細胞創始物を濃縮し、そして完全な培地交換を確実にする。細胞を、ゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコ（Iwaki）上で１０ｍｌの新鮮なＮＳ増殖培地に再播種する。さらに３〜７日後、細胞凝集体は、フラスコに付着し、そしてその後まもなく、特徴的な二極ＮＳ細胞形態を有する細胞が生じる。広範な細胞成長後（さらに３〜４日後）、集団全体をトリプシン処理し、そして増殖培地中でゼラチンコーティングしたＴ７５フラスコ上に単一の細胞として再播種する。細胞は、非常に迅速に増殖し（倍加時間約２５時間）、そして接着したままである。数継代以内に、残りの分化した細胞および芽球細胞は排除され（ＧＦＡＰおよびＴｕＪ１免疫染色によってモニタリングする）、そして培養物は、ＮＳ細胞マーカーに対して均一に陽性である。
【０１８０】
４６Ｃ ＥＳ細胞（Ｓｏｘｌ−ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ｐａｃノックイン）［Ｐ４］のために、ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を用いる一過性の選択が、非神経細胞を排除しそして連続接着培養を介してＮＳ細胞を誘導するために使用され得る。４６Ｃ ＥＳ細胞（１×１０６）を、ゼラチンコーティングした９ｃｍディッシュ上でＮ２Ｂ２７培地中に播種して、神経方向付けを誘導する。６日後、ピューロマイシンを４８時間添加する。次いで、富化されたＳｏｘ１発現細胞集団（約３〜５×１０６）を、ゼラチンコーティングした９ｃｍプレート上でＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むＮ２Ｂ２７培地中に再播種する。初期に形態学的に不均質なＳｏｘ１を発現する集団は、Ｓｏｘ１陰性特徴を、そして３〜４継代後には、均一なＮＳ細胞形態およびマーカー発現を、累進的に獲得する。
【０１８１】
（胎児ＣＮＳおよび神経球からのマウスＮＳ細胞株の誘導）
細胞クラスターは、ＮＳ細胞増殖培地中での胎児Ｅ１６．５皮質および一次培養物の解離の際に懸濁液中で形成される。これらの一次凝集体は、増殖培地中でゼラチンコーティング基材上に播種することにより、接着ＮＳ細胞株に容易に変換され得る。付着を促進するために、まず破片／死細胞を沈降によって有効に除去し、そして培地を完全に交換することが重要である。細胞凝集体が付着し、そして２〜５日にわたって増殖する。引き続き、増殖している細胞をトリプシン処理して単一の細胞にし、再播種し、そしてＮＳ細胞増殖培地中で増殖させ得る。継代した胎児神経球［Ｐ５］から、ＮＳ細胞は、便宜的には、解離およびＮＳ増殖培地中でのゼラチンコーティングしたプラスチック上への直接播種によって樹立され得る。初期の数継代の間、誘導されたＮＳ株は、特に細胞密度が高くなる場合には、凝集する傾向を有し、フラスコから脱着し、そして神経球を再形成する。したがって、培養物は、５０％以下のコンフルエンスで継代されるべきである。自発的に凝集する傾向は、可変性であるが、一般には、さらなる継代の際にまたはクローン細胞株の樹立を通して減少される。
【０１８２】
（ＮＳ細胞の継代および増殖）
一旦樹立されると、ＮＳ細胞をＮＳ増殖培地で増殖させる。ＮＳ細胞を、ゼラチンコーティングしたプラスチック／フラスコ上で増殖させ、そして１／２から１／５に通常通りに分割する。ＮＳ細胞は、約２５時間の倍加時間を有する。トリプシン／ＥＤＴＡを用いて、またはカルシウムマグネシウム非含有ＰＢＳ（Sigma）とのインキュベーションによって、細胞を継代させる。クローン株の樹立のために、単一の細胞を、増殖培地中でゼラチンコーティングしたマイクロウェル中に堆積させ得る。より厳格ではないが、細胞は、非常に低い密度で播種し得る（９ｃｍディッシュ当たり１０００細胞）。コロニーが、２週間以内に出現し、そして選抜され増殖され得る。
【０１８３】
（ＮＳ細胞の凍結保存および回収）
ＮＳ細胞は、凍結／融解後に容易に回収される。通常通りに、本発明者らは、６０〜９０％のコンフルエンスであるＴ７５フラスコをトリプシン処理し、そして１．５ｍｌ ＮＳ増殖培地＋１０％ ＤＭＳＯ中にペレットを再懸濁する。次いで、これを３つの１ｍｌ凍結管（Nunc）に分け、そして−８０℃で貯蔵する。ＮＳ細胞は、これらの条件では６ヶ月より長い貯蔵後でも回収可能である。長期貯蔵のために、凍結バイアルを液体窒素に移す。バイアルを急速に３７℃にし、続いて１０ｍｌの予温ＮＳ増殖培地に移すことにより、ＮＳ細胞を融解する。細胞をペレット化し、次いで新鮮な増殖培地中に再懸濁してＤＭＳＯを除去する。凍結保存後の細胞回収率は、ＮＳ細胞については９５％を超える。
【０１８４】
（ＮＳ細胞の星状細胞およびニューロン分化）
ＮＳ細胞のＧＦＡＰ陽性星状細胞への迅速な分化は、ゼラチンコーティングしたフラスコ／プレート上でＮＳ−Ａ（Ｎ２あり、ＥＧＦ／ＦＧＦなし）中でＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）または１％ ＦＣＳにＮＳ細胞を曝露してから２日以内に生じる。細胞密度は、星状細胞分化にとって重要なパラメーターではない。
【０１８５】
ニューロン分化のために、ＮＳ細胞を、Accutase（Sigma）またはカルシウム／マグネシウム非含有ＰＢＳを用いて細胞を脱着して回収し、そして０．５〜１．０×１０４個の細胞を、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）、改変Ｎ２、およびＢ２７（Gibco）を添加したＮＳ−Ａ培地中で、ポリオルニチン／ラミニンコーティングした４ウェルマルチディッシュプレート（Nunc）の各ウェル中に再播種する。本発明者らは、ＮＳ−Ａ基本培地が、他の基本培地よりもニューロン分化に対してより許容性であることを見出している。培地の容量の半分を２〜３日ごとに取り替え、培地の条件付けを維持する。これらの条件で７日後、本発明者らは、ＥＧＦもＦＧＦも含まない０．２５×Ｎ２およびＢ２７を添加したNeurobasal培地（Gibco）と１：１の比で混合したＮＳ−Ａに、培地を交換する。この処方物は、さらなるニューロン分化および成熟を促進する。より長期のニューロン培養（１４日を越える）のために、本発明者らは、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＢ２７を含むがＮ２を含まないNeurobasalに、培地を交換する。
【０１８６】
（ヒトＮＳ細胞の培養およびニューロン分化）
１００Ｕ／ｍｌ組換えヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ）をさらに添加したマウスＮＳ細胞と同様の増殖培地中で、ヒトＮＳ細胞を、０．１％ゼラチン（Sigma）でコーティングしたフラスコ／プレート上で増殖させる。細胞は、約１週の倍加時間を有する。それらを、約３０％のコンフルエンスに達するとトリプシンで継代させ、そして１／２に分ける。単層培養を維持しそして凝集および脱着を防ぐために、過剰増殖は避けるべきである。
【０１８７】
ニューロン分化のために、ヒトＮＳ細胞を、Accutase（Sigma）を用いて回収し、そして約１×１０４個の細胞を、増殖培地中で、ポリオルニチン／ラミニン（Sigma）コーティングした１２ウェルプレート（Iwaki）の各ウェル中に再播種する。細胞を、それらが約８０％のコンフルエンスに達するまで増殖させる。ニューロン分化は、増殖培地からＥＧＦおよびＬＩＦを除去することにより誘導する。ＥＧＦおよびＬＩＦのない状態で７日後、０．５×Ｎ２、Ｂ２７、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍｌ）、およびＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したNeurobasal培地（Gibco）と１：１の比で混合したＮＳ−Ａに、培地を交換する。これらの条件でさらに７日後、培地を、Ｎ２もＦＧＦ−２も含まないＢ２７およびＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したNeurobasal培地に交換する。このプロトコル全体を通して、マウスＮＳ細胞と同様に、培地の容量の半分を２〜３日ごとに取り替える。さらに１０日後、ＴｕＪ１およびＭＡＰ２と免疫反応性であるニューロン形態の細胞は、全細胞数の４０％までになる。ＧＦＡＰ陽性細胞がほとんど出現しないニューロン分化に関するマウスＮＳ細胞プロトコルとは対照的に、有意な数の星状細胞もまた生成される。
【０１８８】
したがって、本発明は、対称的に分裂している未分化状態で、多くの種の神経幹細胞を得て維持するための方法および培地を提供する。本発明は、ＥＳ細胞、胎児および成体供給源から得られるまたは摘出される細胞を用いて実施されている。全ての場合において、本明細書中に記載の方法に従うことにより得られた結果の細胞は、実質的に同じように見え、挙動する；それらは全て、多数（例えば数百）の倍加にわたって高純度培養で維持され得、高い割合の細胞が、ニューロンおよび神経膠を形成する能力を保持している。特に、ヒト（ＥＳ、胎児ＣＮＳ）、マウス（ＥＳ、胎児ＣＮＳ、成体ＣＮＳ）およびラット（胎児ＣＮＳ）から、ＮＳ細胞が首尾よく得られている。マウス神経幹細胞は、培養物中で純粋な集団で増殖され、そして移植された後、腫瘍を形成することなく増殖するが、インビボで分化している。
【０１８９】
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P5. Reynolds BA, Weiss S (1996) Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev Biol 175: 1-13.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹細胞の集団であって、該細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、集団。
【請求項２】
神経幹細胞の集団であって、該細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、集団。
【請求項３】
前記細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項２に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項４】
前記細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項２に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項５】
前記神経幹細胞がヒト神経幹細胞である、請求項１から４のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項６】
前記神経幹細胞がラット神経幹細胞である、請求項１から４のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項７】
前記神経幹細胞がマウス神経幹細胞である、請求項１から４のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項８】
前記集団中の神経幹細胞が、それらがマーカーＲＣ２、３ＣＢ２、およびＢＬＢＰの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項１から７のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項９】
前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項８に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１０】
前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項８または９に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１１】
前記集団中の神経幹細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して陰性である、請求項８から１０のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１２】
前記集団中の神経幹細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または前記神経幹細胞が、不死化幹細胞ではない、請求項８から１１のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１３】
細胞が、ＥＧＦファミリーのレセプターのアゴニスト、およびＦＧＦレセプターのアゴニストの存在下で維持され、該細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、細胞株。
【請求項１４】
前記細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項１３に記載の細胞株。
【請求項１５】
前記細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項１３に記載の細胞株。
【請求項１６】
神経幹細胞を含む組成物であって、該神経幹細胞が接着培養中にあり、該組成物中の該細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、組成物。
【請求項１７】
前記細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
神経幹細胞を含む組成物であって、該組成物中の該細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、組成物。
【請求項２０】
前記神経幹細胞がヒト神経幹細胞である、請求項１６から１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記神経幹細胞がラット神経幹細胞である、請求項１６から１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記神経幹細胞がマウス神経幹細胞である、請求項１６から１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
神経変性疾患および脳損傷の治療用調製物の製造のための、請求項１から１２に記載の集団、請求項１３から１５に記載の細胞株、または請求項１６から２２に記載の組成物中に存在する神経幹細胞の使用。
【請求項１】
神経幹細胞の集団であって、該細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、集団。
【請求項２】
神経幹細胞の集団であって、該細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、集団。
【請求項３】
前記細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項２に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項４】
前記細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項２に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項５】
前記神経幹細胞がヒト神経幹細胞である、請求項１から４のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項６】
前記神経幹細胞がラット神経幹細胞である、請求項１から４のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項７】
前記神経幹細胞がマウス神経幹細胞である、請求項１から４のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項８】
前記集団中の神経幹細胞が、それらがマーカーＲＣ２、３ＣＢ２、およびＢＬＢＰの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項１から７のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項９】
前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
ＧＬＡＳＴ、Ｐａｘ−６、神経前駆体マーカーのネスチンもしくはビメンチン、ルイスＸ抗原、ムサシ−１、またはプロミニン
の少なくとも１つの発現に対して陽性であることで特徴付けられている、請求項８に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１０】
前記集団中の神経幹細胞がさらに、それらが
Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇ
の少なくとも１つの発現に対して陰性であることで特徴付けられている、請求項８または９に記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１１】
前記集団中の神経幹細胞が、Ｓｏｘ−２の発現に対して陽性であり、そしてＳｏｘ−１の発現に対して陰性である、請求項８から１０のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１２】
前記集団中の神経幹細胞が、オンコジーンをコードする外因性核酸を含まないか、または前記神経幹細胞が、不死化幹細胞ではない、請求項８から１１のいずれかに記載の神経幹細胞の集団。
【請求項１３】
細胞が、ＥＧＦファミリーのレセプターのアゴニスト、およびＦＧＦレセプターのアゴニストの存在下で維持され、該細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、細胞株。
【請求項１４】
前記細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項１３に記載の細胞株。
【請求項１５】
前記細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項１３に記載の細胞株。
【請求項１６】
神経幹細胞を含む組成物であって、該神経幹細胞が接着培養中にあり、該組成物中の該細胞の少なくとも８０％が、対称的に分裂している神経幹細胞であり、そして該細胞の１％以下が、成熟した星状細胞、ニューロン、および乏突起膠細胞に対するマーカーの発現に対して陽性である、組成物。
【請求項１７】
前記細胞の少なくとも９０％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
神経幹細胞を含む組成物であって、該組成物中の該細胞の少なくとも９５％が、対称的に分裂している神経幹細胞である、組成物。
【請求項２０】
前記神経幹細胞がヒト神経幹細胞である、請求項１６から１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記神経幹細胞がラット神経幹細胞である、請求項１６から１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記神経幹細胞がマウス神経幹細胞である、請求項１６から１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
神経変性疾患および脳損傷の治療用調製物の製造のための、請求項１から１２に記載の集団、請求項１３から１５に記載の細胞株、または請求項１６から２２に記載の組成物中に存在する神経幹細胞の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｇ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【公開番号】特開２０１２−３４７０６（Ｐ２０１２−３４７０６Ａ）
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４７９８６（Ｐ２０１１−２４７９８６）
【出願日】平成２３年１１月１１日（２０１１．１１．１１）
【分割の表示】特願２００７−５２６５４８（Ｐ２００７−５２６５４８）の分割
【原出願日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【出願人】（５００２１９６１８）ザ・ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ (21)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｕｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１１日（２０１１．１１．１１）
【分割の表示】特願２００７−５２６５４８（Ｐ２００７−５２６５４８）の分割
【原出願日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【出願人】（５００２１９６１８）ザ・ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ (21)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｕｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ
【Ｆターム（参考）】
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