神経成長因子コンジュゲート及びその使用
本発明は、医学、公衆衛生学、免疫学、分子生物学及びウイルス学の分野である。本発明は、少なくとも一つの抗原に連結されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物であって、前記抗原がＮＧＦ抗原である組成物を提供する。また、本発明は組成物を産生する方法を提供する。本発明の組成物は、特に疼痛の治療のためのワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は、有効な免疫応答、特に抗体反応を誘導する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、公衆衛生学、免疫学、分子生物学及びウイルス学の分野である。本発明は、少なくとも一つの抗原に連結されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物であって、前記抗原はＮＧＦ抗原である、組成物を提供する。また、本発明は、組成物を製造する方法を提供する。本発明の組成物は、特に、慢性疼痛の治療のためのワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は、特に抗体反応における効率的な免疫応答を誘発する。
【技術背景】
【０００２】
神経成長因子（ＮＧＦ）（ＮＧＦβとしても知られている）は神経栄養因子であり、ＮＧＦの他に脳由来ニューロトロフィック因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３及びニューロトロフィン４／５から成るニューロトロフィンのファミリーの創立メンバーである(Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006))。全てのニューロトロフィンと同様に、ＮＧＦは約２７ｋＤａの前駆タンパク質として発現され、約１４ｋＤａの成熟形態に切断される(Edwards et al., J Biol Chem. 263(14): 6810-5(1988); Seidah et al., Biochem J. 314: 951-60 (1996))。この成熟形態は、２つの受容体、一般的な受容体ｐ７５NTR（低親和性により全てのニューロトロフィンと結合する）及び高親和性トロポミオシン受容体キナーゼＡ（ｔｒｋＡ）受容体に結合することによって、その生物学的機能を発揮する。ＴｒｋＡは、リガンド結合性に応じて二量体になる受容体チロシンキナーゼであり、異なるシグナル伝達経路を活性化する(Patapontian and Reichardt, Curr Opin Neurobiol. 11(3): 272-80 2001))。初期発生の間、ＮＧＦ−ｔｒｋＡ相互作用によって活性化されるこれらのシグナル伝達経路がアポトーシスを遮断し、侵害受容システムの感覚性ニューロンの生存及び神経伸長を促進する(Patel et al., Neuron 25(2): 345-57(2000))。出生後、これらのニューロンは生存のためのＮＧＦに対するその依存を緩めるが、ＮＧＦは出生後期の間も、侵害受容体上に重大な生物学的影響を発揮し続ける。それは神経伝達物質、受容体及び電位型イオンチャネルの発現を調整し、それにより侵害受容体の反応性を制御する。ＮＧＦの別の機能的に重要な作用は、一過性受容体電位・バニロイド１（ＴＲＰＶ１）の改良された反応性につながる翻訳後制御を通して、侵害受容体反応性を敏感にすることである(Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006))。
【０００３】
ＮＧＦは、成人の侵害受容体反応の調節におけるその役割に対して、動物とヒトの痛み感受の仲介に関与している。ＮＧＦのわずかな皮下注入又は筋肉内注入は、何日も続く痛みと圧痛を引き起こす(Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006))。ヒトにおいて、ＮＧＦ濃度と痛み強度との間の相関は、慢性前立腺炎(Miller et al., Urology, 2002. 59(4): 603-8 (2002))、間質性膀胱炎(Lowe et al., Br J Urol. 79(4): 572-7 (1997))及びその他のような痛みを伴う病状の多くにおいて、評価できるであろう。基本的に、２種類の痛みが識別されうる：侵害受容性疼痛と神経障害疼痛。侵害受容性疼痛が、例えば損傷または外科的な切開後に、炎症の経過で組織損害によって生じる侵害受容体の刺激から起こる一方で、神経障害疼痛は、例えば、神経圧縮または外傷の後、または感染症または感覚性ニューロンに影響を与える自己免疫病の後で神経系自体の病状から生じる。
【０００４】
炎症の間、ＮＧＦは、発痛性の炎症性メディエータとして働く。それは、ケラチノサイト、上皮細胞、平滑筋細胞及びシュワン細胞のような末梢において、多数の異なる細胞型によって、特にマストセル及びマクロファージによる炎症の間、産生される。ＮＧＦ濃度は、動物とヒトにおいて、炎症及び慢性疼痛のある状態の間、かなり上昇する。ＮＧＦの遮断は、齧歯動物の侵害受容性疼痛モデルの多数において、痛覚感受性をかなり減少させることが示された。例えば、それはＣＦＡの皮膚注入後、熱的及び機械的痛覚過敏を減少させ(Woolf et al., Br. J. Pharmacol. 121(3): 417-24 (1997)、とりわけ関節炎に関連する疼痛(Shelton et al., Pain 116(1-2): 8-16 (2005))及び骨肉腫性疼痛(Sevcik et al., Pain 115(1-2): 128-41(2005))を抑制した。神経障害疼痛におけるＮＧＦの役割は炎症性疼痛におけるものよりも確立されておらず、いくつかのグループは、また、齧歯動物の神経障害疼痛のモデルの抗−ＮＧＦ治療の成功を示した(Ramer et al., Neurosci. Lett. 251(1): 53-6 (1998), Ramer et al., Eur. J. Neurosci. 11(3): 837-46 (1999))。米国特許第５１４７２９４号は、痛みを治療するためのＮＧＦアンタゴニスト（その中ではＮＧＦモノクローム抗体）の使用を請求する。その後、慢性疼痛の治療のための、ＮＧＦに対するモノクローナル抗体の使用をクレームする数多くの特許が出願された。慢性疼痛は、ヨーロッパ及び米国の人口のほぼ２０％に影響を及ぼしている深刻な健康問題である。現在使われている治療により十分な救助を得られるのは、慢性疼痛で苦しんでいる患者の３０％未満である(Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006)。更には、慢性疼痛の治療に使用される既存の薬物（大部分はオピオイドと非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ））は、長期間摂取した場合、重大な副作用を伴う。
【発明の開示】
【０００５】
本願明細書において開示される新規な治療的ストラテジーは、ＮＧＦβに対する能動免疫に基づく。患者の免疫系によってＮＧＦ−中和抗体の産生を誘発する組成物が、開示される。能動免疫は、ＮＧＦβの永続的な中和に結果としてなりうるものであり、したがって１日の薬物摂取の要求を減らすことができる。我々は、現在、驚くべきことに、それぞれ少なくとも一つのＮＧＦ抗原を含む本発明の組成物とワクチンが、特定の抗体反応においてＮＧＦに対して高い抗体価を誘導する免疫応答を誘発することができることを見いだした。さらに驚くべきことに、それぞれ少なくとも一つのＮＧＦ抗原を含む本発明の組成物及びワクチンは、慢性疼痛のための動物モデルの痛みを減らすことができることを見いだした。従って、これは、免疫応答、特に本発明の組成物及びワクチンによってそれぞれ生成される抗体が、インビボでＮＧＦに特異的に結合し、その機能を中和して阻害することができることを示す。
【０００６】
そのため、本発明の一態様は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）；及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原を含む組成物であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原であり；（ａ）及び（ｂ）は、前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結される、組成物である。ＮＧＦβは、動物に投与された場合、望まれていない副作用に結果としてなる可能性がある生物学的活性を含む受容体リガンドである。従って、本発明は、前記ＮＧＦタンパク質がＮＧＦ突然変異タンパク質であり、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は減少した生物学的活性を含むか又は生物学的活性を含まないが、それでもＮＧＦβ中和抗体を誘発する能力を保持する組成物を提供する。したがって、本発明の好ましい実施形態において、前記ＮＧＦ抗原は、ＮＧＦ突然変異タンパク質である。
【０００７】
通常、非常に望ましくない副作用は、抗ＮＧＦβワクチンによるＴ細胞応答の誘導に関連する場合がある。しかしながら、本発明の組成物は、不必要なＴ細胞応答を除去するか又は低減すると共に、特定の状況において、ＮＧＦ抗原に対して強い抗体反応を誘発するために効率的に役立つ。好ましい実施態様において、本発明の組成物は、従って、少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子を更に含み、前記ポリアニオン性巨大分子は前記ＶＬＰにパッケージ化され、好ましくは前記ポリアニオン性巨大分子はポリアニオン性ポリペプチドであり、好ましくは前記ポリアニオン性ポリペプチドはポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり、最も好ましくはポリグルタミン酸である。
【０００８】
本発明の更なる態様は、本発明の組成物の治療上有効量を含むワクチンの組成物である。
【０００９】
本発明の更なる態様は、（ａ）本発明の組成物；及び（ｂ）薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。
【００１０】
本発明の更なる態様は、好ましくはＮＧＦβに対する免疫化の方法であり、前記方法は、動物に、好ましくはヒトに、本発明の組成物、本発明のワクチン組成物または本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【００１１】
本発明の更なる態様は、医薬としての使用するための、本発明の組成物、本発明のワクチン組成物または本発明の医薬組成物である。
【００１２】
本発明の更なる態様は、痛みの、好ましくは慢性疼痛の治療のための医薬の製造のための、本発明の組成物の使用または本発明のワクチン組成物の使用である。
【００１３】
本発明の更なる態様は、痛みの、好ましくは慢性疼痛の治療に用いられる、本発明の組成物または本発明のワクチン組成物または本発明の医薬組成物である。
【００１４】
本発明の更なる態様は、本発明の組成物を産生する方法であって、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＶＬＰを提供すること；（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つのＮＧＦ抗原を提供すること；及び（ｃ）前記組成物を産生するために前記ＶＬＰと前記ＮＧＦ抗原を結合することを含んで成り、前記ＮＧＦ抗原と前記ＶＬＰは、前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結される、方法である。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
他に定められない限り、本願明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が帰属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１６】
抗原：本明細書で用いる「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子により提示された場合、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により結合されることができる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で用いる場合、Ｔ細胞エピトープも含む。抗原はさらに、免疫系により認識されることができ、及び／又は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、これは、少なくとも特定の場合に、抗原がＴＨ細胞エピトープを含むか、又は結合していて、アジュバントと投与される必要がある場合がある。抗原は、１つ又は複数のエピトープ（ＢおよびＴエピトープ）を有することができる。上に記載した特異的反応は、抗原が、好ましくは、一般的に高度に選択的にその対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原により誘起される他の多数の抗体又はＴＣＲと反応しないことを示すことを意味する。抗原は、本明細書で用いる数種の抗原の混合物であってもよい。非常に好ましい実施態様において、抗原はＮＧＦ抗原である。
【００１７】
エピトープ：ここで使用される場合、「エピトープ」なる用語は、エピトープはＭＨＣ分子のＴ細胞レセプターにより又は抗体により免疫特異的に結合されうる、ポリペプチドの連続的又は非連続的部分を指す。免疫特異性結合性は、非特異的結合性を除外するが、交差反応性を必ずしも除外するというわけではない。エピトープは、典型的には、エピトープに特有である空間コンフォメーションに５−１０のアミノ酸を含む。
【００１８】
会合した：「会合した」（またはその名詞：会合）なる用語は、本願明細書において使用する場合、２分子が連結される全てのありうる方法、好ましくは化学相互作用をさす。化学相互作用は、共有結合及び非共有結合の相互作用を含む。非共有結合的相互作用の典型的な例は、イオン相互作用、疎水性相互作用または水素結合であり、共有結合的相互作用は、例えば、共有結合（例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素−リン結合、炭素−硫黄結合（例えばチオエーテル）またはイミド結合）に基づく。
【００１９】
付着部位、第１：本明細書で用いる「第１の付着部位」という句は、ＶＬＰに、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰに天然に存在する要素、又はＶＬＰに、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰに人工的に付加された要素であって、第２の付着部位に結合されうる要素をさす。第１付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジニル基のような化学反応基あるいはその組合せであってもよい。第１の付着部位である化学反応基の好ましい実施態様は、リジンのようなアミノ酸のアミノ基である。好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、リジン残基のアミノ基であって、好ましくは前記リジン残基は、前記ＶＬＰに、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの前記ＶＬＰに、天然に存在するリジン残基である。
【００２０】
第１の付着部位は、典型的には、ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰの表面上に、好ましくは外面上に位置する。多数の第１の付着部位は、ウイルス様粒子の、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰの表面上に、好ましくは外面上に典型的には存在し、好ましくは反復性の配置で存在する。好ましい実施態様において、第１の付着部位は、ＶＬＰに、少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合により会合する。更なる好ましい実施態様において、第１の付着部位は、ＶＬＰに天然に存在する。あるいは、他の好ましい実施形態において、第１の付着部位は、ＶＬＰに人工的に付加される。好ましい実施態様において、第１の付着部位は、前記ＶＬＰは、少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも一つのペプチド結合により会合し、前記ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰである。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、リジン残基のアミノ基であって、前記リジン残基は、コートタンパク質の、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質の、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質のリジン残基のアミノ基であって、好ましくは前記コートタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はそれから好ましくは成る。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、リジン残基であって、好ましくは前記リジン残基は、コートタンパク質の、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質の、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基である。
【００２１】
付着部位、第２：本明細書で用いる「第２の付着部位」という句は、ＮＧＦ抗原に天然に存在するか又は人工的に付加される要素であって、第１の付着部位が連結される要素をさす。ＮＧＦ抗原の第２の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）または化学反応基（例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジニル基またはその組合せ）であってもよい。第２の付着部位である化学反応基の好ましい実施態様は、スルフヒドリル基である。更なる好ましい実施態様において前記第２の付着部位がスルフヒドリル基であって、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基である。本願明細書において使用する場合、「少なくとも一つの第２の付着部位を有する抗原」なる用語及び交換可能に使用される用語の「少なくとも一つの第２の付着部位を有するＮＧＦ抗原」は、ＮＧＦ抗原と少なくとも一つの第２の付着部位含んで成るコンストラクトをさす。好ましい一実施形態において、第２の付着部位は、ＮＧＦ抗原に天然に存在する。他の好ましい実施形態において、第２の付着部位は、ＮＧＦ抗原に人工的に付加される。好ましい一実施形態において、第２の付着部位は、少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも一つのペプチド結合により、ＮＧＦ抗原に会合する。好ましい一実施形態において、少なくとも一つの第２の付着部位を有するＮＧＦ抗原は、リンカーを更に含んでなり、好ましくは前記リンカーは、少なくとも一つの第２の付着部位を含み、更に好ましくは前記リンカーは、ペプチド結合によってＮＧＦ抗原に融合する。
【００２２】
コートタンパク質：本明細書中で用いる「コートタンパク質」なる用語はウイルスキャプシド又はＶＬＰに組み込まれることができる、ウイルスタンパク質、好ましくはウイルスの、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの天然のキャプシド集合体を指す。コートタンパク質なる用語は、キャプシドタンパク質としても知られている。
【００２３】
連結した：「連結した」（またはその名詞：連結）は、本願明細書において使われる場合、少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位が連結される全てのありうる方法、好ましくは化学相互作用を指す。化学相互作用は、共有結合及び非共有結合の相互作用を含む。非共有結合的相互作用の典型的な例は、イオン相互作用、疎水性相互作用または水素結合であり、共有結合的相互作用は、例えば、共有結合（例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素−リン結合、炭素−硫黄結合（例えばチオエーテル）またはイミド結合）に基づく。特定の好ましい実施形態において、第１の付着部位と第２の付着部位は、少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも一つの非ペプチド結合により、より好ましくは非ペプチド結合により連結される。しかしながら、本願明細書において使用される「連結される」なる用語は、少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位の直接的な連結を含むだけでなく、代わりに及び好ましくは、中間体分子を介した少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位との間接的な連結であって、典型的には及び好ましくは、少なくとも１つの、好ましくは１つのヘテロ二官能性架橋剤による連結をも含む。したがって、好ましい実施態様において、前記少なくとも１つの第１の付着部位と前記少なくとも１つの第２の付着部位は、少なくとも１つの、好ましくは正確に１つのヘテロ二官能性架橋剤を経て連結される共有結合であって、好ましくは前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であって、更に好ましくは前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基である。
【００２４】
リンカー：本願明細書において使われる場合、「リンカー」は第２の付着部位をＮＧＦ抗原に会合させるか、又は第２の付着部位を含むか、本質的にそれから成るか、又はそれから成る。好ましくは、本願明細書において使われる場合、「リンカー」は第２の付着部位を、基本的には及び好ましくは、しかし必然的にではなく、１つのアミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として含む。好ましい実施態様において、前記リンカーは、アミノ酸リンカーである。非常に好ましい実施態様において、前記リンカーは、正確に１つのシステイン残基から成る。更に好ましい実施態様において、前記リンカーは正確に１つのシステイン残基を含むかまたはそれから成り、前記第２の付着部位は前記正確に１つのシステイン残基のスルフヒドリル基である。本発明に有用な更なるリンカーは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シクロアルキル（例えばシクロペンチルまたはシクロヘキシル）、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロアリール部分含んで成る分子である。更に、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル、シクロアルキル−（Ｃ５、Ｃ６）、アリール又はヘテロアリール−部分を含むリンカー及び本発明のリンカーとしても使用できる付加的なアミノ酸は、本発明の範囲内で含まれる。ＮＧＦ抗原へのリンカーの会合は、好ましくは少なくとも一つの共有結合を、より好ましくは少なくとも一つのペプチド結合を経由する。ＮＧＦ抗原に天然に存在する第２の付着部位の場合には、リンカーは、少なくとも一つの第２の付着部位（例えばシステイン）に、好ましくは少なくとも一つの共有結合を経由して、より好ましくは、少なくとも一つのペプチド結合を経由して、会合する。
【００２５】
アミノ酸リンカー：「アミノ酸リンカー」なる用語は、少なくとも一つのアミノ酸残基を含むリンカーに指す。通常、「アミノ酸リンカー」なる用語は、前記アミノ酸リンカーがアミノ酸残基だけから成ることを意味しない。しかしながら、好ましい実施態様において、前記アミノ酸リンカーは、アミノ酸残基だけから成る。リンカーのアミノ酸残基は、好ましくは天然に存在するアミノ酸、又は既知の非天然アミノ酸のａｌｌ−Ｌまたはａｌｌ−Ｄ、またはそれらの混合物、最も好ましくはａｌｌ−Ｌから成る。本発明に係るリンカーの更なる好ましい実施態様において、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む分子及びこのような分子類は、従って、本発明に含まれる。
【００２６】
ＮＧＦ抗原：本願明細書において使われる「ＮＧＦ抗原」なる用語は、ＮＧＦタンパク質、ＮＧＦ断片またはＮＧＦ突然変異タンパク質を指す。非常に好ましくは、前記ＮＧＦ抗原は、ＮＧＦ突然変異タンパク質である。本願明細書において使われる「ＮＧＦ抗原」なる用語は、上記とおり、ＮＧＦ抗原のグリコシル化、アセチル化、リン酸エステル化を非限定的に含む翻訳後修飾を含む。典型的に及び好ましくは、しかし必然的ではなく、前記ＮＧＦ抗原は、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗ＮＧＦβ抗体に特異的に結合される。
【００２７】
ＮＧＦタンパク質：本願明細書において使われる「ＮＧＦタンパク質」は、配列番号２２のヒトＮＧＦ、配列番号２４のマウスＮＧＦ又は任意の他の動物由来の対応するオルソログを含むか又は好ましくはそれから成るポリペプチドを含む。さまざまな動物種由来の非常に好適なＮＧＦオルソログは、配列番号３２から３９のポリペプチドである。ＮＧＦタンパク質は、典型的には、しかし必然的にではなく、好ましくは細胞増殖アッセイにおける生物学的活性を含む。更には、本願明細書で使用する「ＮＧＦタンパク質」なる用語は、配列番号２２のヒトＮＧＦ、配列番号２４のマウスＮＧＦ又は任意の他の動物由来の対応するオルソログと、７０％を超える、好ましくは８０％を超える、より好ましくは８５％を超える、更により好ましくは９０％を超える、再度より好ましくは９５％を超える、最も好ましくは９７％を超えるアミノ酸配列同一性を有する任意の天然又は遺伝的に改変された変異体から成るか、代替的に又は好ましくはそれらから成るポリペプチドを含む。
本願明細書において使われる「ＮＧＦタンパク質」なる用語は、上記とおり、ＮＧＦタンパク質のグリコシル化、アセチル化、リン酸エステル化を非限定的に含む翻訳後修飾を含む。好ましくは、本明細書で定義されるＮＧＦタンパク質は、長くても２００アミノ酸長、より好ましくは長くても１５０アミノ酸長、更に好ましくは長くても１３０アミノ酸長から成る。典型的に及び好ましくは、前記ＮＧＦタンパク質は、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗ＮＧＦβ抗体に特異的に結合する。さらにまた、本発明の目的にとって有用なＮＧＦタンパク質は、典型的に及び好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導することが出来る。最も好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導出来るＮＧＦタンパク質であって、前記抗ＮＧＦ抗体は、好ましくは本願明細書（参照：実施例９〜１２と１５）に記載されているように、インビトロ及び／又はインビボアッセイでＮＧＦタンパク質の生物学的活性を中和することができる。典型的に及び好ましくは、特定種のＮＧＦタンパク質含む本発明の組成物によって誘導される抗体は、前記種のＮＧＦ抗体に特異的に結合でき、及び／又は中和できるであろうことは当業者にとって自明である。
【００２８】
ＮＧＦ断片：本願明細書において使われる「ＮＧＦ断片」なる用語は、ＮＧＦタンパク質の少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも２０、更により好ましくは少なくとも３０の連続アミノ酸を含むか、それから本質的に成るか、又は代替的に又は好ましくはそれからなるペプチド、及び本願明細書に規定のＮＧＦタンパク質の連続するアミノ酸の多くとも６０、好ましくは多くとも５０、更により好ましくは多くとも４５、更により好ましくは多くとも４０アミノ酸を含むか、それから本質的に成るか、代替的に又は好ましくはそれからなる同ポリペプチド、加えてそれに対して７０％を超える、より好ましくは８０％を超える、更に好ましくは９０％を超える、更により好ましくは９５％を超えるアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含む。好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ断片は、（ａ）本明細書で定義するＮＧＦタンパク質、好ましくは配列番号２２のうちの８から６０、好ましくは１２から６０、より好ましくは２０から６０、更により好ましくは３０から６０から成るポリペプチド、及び（ｂ）（ａ）のポリペプチドに対して７０％を超える、好ましくは８０％を超える、より好ましくは９０％を超える、更により好ましくは９５％を超えるアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドから選択されるポリペプチドを含むか、それから本質的にそれから成るか、又はそれから成る。好ましくは、本願明細書において使用する「ＮＧＦ断片」なる用語は、配列番号２２のＮＧＦタンパク質の少なくとの１２の連続するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、代替的に又は好ましくはそれからなる任意のペプチド、及び配列番号２２のＮＧＦタンパク質の多くとも４５の、更により好ましくは多くとも４０の連続するアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、代替的に又は好ましくはそれからなる同ペプチドを含む。本願明細書において使われる「ＮＧＦ断片」なる用語は、上記とおり、ＮＧＦ断片のグリコシル化、アセチル化、リン酸エステル化を非限定的に含む翻訳後修飾を含む。ＮＧＦ断片は、典型的には、しかし必然的にではなく、好ましくは細胞増殖アッセイにおける生物学的活性を含む。典型的に及び好ましくは、しかし必然的ではなく、前記ＮＧＦ断片は、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗ＮＧＦβ抗体に特異的に結合される。さらにまた、本発明の目的にとって有用なＮＧＦ断片は、典型的に及び好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導することが出来る。最も好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導出来るＮＧＦ断片であって、前記抗ＮＧＦ抗体は、好ましくは本願明細書（参照：実施例９〜１２と１５）に記載されているように、インビトロ及び／又はインビボアッセイでＮＧＦタンパク質の生物学的活性を中和することができる。典型的に及び好ましくは、特定種のＮＧＦ断片を含む本発明の組成物によって誘導される抗体は、前記種のＮＧＦ抗体に特異的に結合でき、及び／又は中和できるであろうことは当業者にとって自明である。
【００２９】
ＮＧＦ突然変異タンパク質：本願明細書において使用する「ＮＧＦ突然変異タンパク質」なる用語は、突然変異したアミノ酸配列を含むか、代替的に又は好ましくはそれから成る任意のポリペプチドを含み、突然変異するアミノ酸配列は、ＮＧＦタンパク質、好ましくはヒトＮＧＦタンパク質、最も好ましくは配列番号２２であり、突然変異する前記アミノ酸配列は、少なくとも一つ及び多くとも２０の位置で、好ましくは少なくとも一つ及び多くても１０の位置で、より好ましくは少なくとも一つ及び多くても１０の位置で変化し、前記位置においてアミノ酸残基は、置換によって、欠失によって、挿入によって、またはそれらの任意の組合せによって変化する。非常に好ましい実施形態において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は突然変異したアミノ酸配列であり、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸配列は、少なくとも１つ及び多くとも４つの位置において、置換によって、欠失によって、それらの組合せによって変化し、好ましくは前記位置のアミノ酸残基は置換によって変化する。典型的には、しかし必然的ではなく、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、モノクローナル及び／又はポリクローナル抗ＮＧＦβ抗体によって特異的に結合する。突然変異タンパク質は、突然変異される前記アミノ酸配列と比較して、減じた生物学的活性を含む。最も好ましくは、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、検出可能な生物学的活性を含まない。さらにまた、本発明の目的にとって有用なＮＧＦ突然変異タンパク質は、典型的に及び好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導することが出来る。最も好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導出来るＮＧＦ突然変異タンパク質であって、前記抗ＮＧＦ抗体は、好ましくは本願明細書（参照：実施例９〜１２と１５）に記載されているように、インビトロ及び／又はインビボアッセイでＮＧＦタンパク質の生物学的活性を中和することができる。
典型的に及び好ましくは、ＮＧＦ突然変異タンパク質を含む本発明の組成物であって、突然変異させられるアミノ酸配列は特定種であるものによって誘導される抗体は、前記種のＮＧＦタンパク質に特異的に結合でき、及び／又は中和できるであろうことは当業者にとって自明である。
【００３０】
本出願の範囲内で、抗原に対する抗体、好ましくはモノクローナルまたはポリクローナル抗体の特異的な結合性は、１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１以上の親和性（Ｋａ）によって特徴づけられる結合性を指す。抗体の親和性は、当該分野の通常の技術によって（例えば、スキャッチャード解析、Ｂｉａｃｏｒｅ−またはＥＬＩＳＡベースの方法によって）、容易に決定することができる。最も好ましくは、ＮＧＦ抗原に対するモノクローナルのおよび／またはポリクローナル抗ＮＧＦ抗体の特異的な結合は、ＥＬＩＳＡによって、最も好ましくは本願明細書の実施例５に記載した基本的条件下でアッセイされる。
【００３１】
生物学的活性：本願明細書において使用する「生物学的活性」なる用語は、細胞増殖アッセイにおける抗原、好ましくはＮＧＦ抗原、最も好ましくはＮＧＦタンパク質、ＮＧＦ断片および／またはＮＧＦ突然変異タンパク質の活性をさし、好ましくは前記細胞増殖アッセイは、ＮＧＦ依存性ヒト赤白血病のＴＦ−１細胞株に基づくものであり、なお更に好ましくは、前記細胞増殖アッセイは本願明細書の実施例６に記載されているように基本的条件下で実施される。ＮＧＦ抗原は、それが細胞増殖の検出可能なレベルを誘導することができる場合、生物学的に活性があると見なされる。典型的に及び好ましくは、適切な標準によって得られる最大増殖の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、まだ更に好ましくは少なくとも８０％である細胞増殖を誘発することができる場合、ＮＧＦ抗原は生物学的に活性である。ＮＧＦ抗原、好ましくはＮＧＦ突然変異タンパク質は、それが細胞増殖の検出可能なレベルを誘導しない場合、生物学的に活性ではない。典型的に及び好ましくは、適切な標準によって得られる最大増殖の多くとも２０％、好ましくは多くとも１５％、まだ更に好ましくは多くとも１０％、また更に好ましくは多くとも５％である細胞増殖を誘発することができる場合、ＮＧＦ抗原は生物学的に活性でない。ＮＧＦ突然変異タンパク質は、それが前記突然変異されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較して、１００％未満、好ましくは８０％未満、またより好ましくは６０％未満、またより好ましくは４０％未満、またより好ましくは２０％未満である細胞増殖を誘発する場合に、減じた生物学的活性を含むと見なされる。本発明において、ＮＧＦ抗原、特にＮＧＦタンパク質、ＮＧＦ断片及びＮＧＦ突然変異タンパク質は、試験動物に免疫原コンジュゲートの形態で投与された場合に抗体応答を誘導した場合であって、前記抗体応答の抗体は前記ＮＧＦ抗原に特異的に結合するものである場合に、「抗体を誘導できる」と見なされる。典型的には及び好ましくは、前記ＮＧＦタンパク質は、ウイルス様粒子とのコンジュゲートの形態で、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス粒子とのコンジュゲートの形態で、前記試験動物に投与される。最も好ましくは、前記ＮＧＦ抗原は、本願明細書において開示される組成物、ワクチの組成物または医薬組成物の形態の前記試験動物に投与される。非常に好ましくは、抗体を誘導するＮＧＦ抗原の能力は、基本的に、実施例８において説明したような条件下でアッセイされる。本発明において、ＮＧＦ抗原、特にＮＧＦタンパク質、ＮＧＦ断片及びＮＧＦ突然変異タンパク質は、試験動物に免疫原コンジュゲートの形態で投与された場合に抗体応答を誘導したならば、前記抗体応答において産生される抗体は前記ＮＧＦタンパク質を中和でき、「抗体の中和を誘導できる」と見なされる。ＮＧＦタンパク質を中和する抗体能力は、細胞増殖アッセイを使用するインビトロ・アッセイで分析され、好ましくは前記細胞増殖アッセイは、ＮＧＦ依存性ヒト赤白血病のＴＦ−１細胞株に基づくものであり、なお更に好ましくは、前記細胞増殖アッセイは、基本的に本願明細書の実施例６及び９に記載されている条件下で実施される。抗体は、それが前記細胞増殖アッセイにおいて前記ＮＧＦタンパク質の生物学的活性を減らすかまたは除去することができる場合、ＮＧＦタンパク質を中和できると見なされる。あるいは、ＮＧＦタンパク質を中和する抗体能力は、インビボアッセイにおいて、好ましくは疼痛のための動物モデルにおいて分析され、ＮＧＦタンパク質を中和する前記抗体の能力は、前記動物モデルの疼痛の改善として、最終的に検出される。疼痛のための好適な動物モデルは、マウスのコラーゲンによって誘導された関節炎、マウスのザイモサンＡによって誘導された炎症性疼痛、タキソールによって誘発された神経障害疼痛であって、好ましくは、前記アッセイは、基本的には、実施例１０、１１または１５にて開示する条件下で実施される。
【００３２】
規則正しい反復性抗原アレイ：本願明細書で使用する「規則正しい反復性抗原アレイ」なる用語は、通常抗原の反復パターンを指すか、または典型的には及び好ましくは、ウイルス様粒子に関して抗原の空間配置の均一性の高い規則性によって特徴づけられる。本発明の一実施形態において、反復パターンは幾何学模様であってもよい。本発明の特定の実施態様は、例えばＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰは、１から３０ナノメーター、好ましくは２から１５ナノメーター、より好ましくは２から１０ナノメーター、さらにより好ましくは２から８ナノメーター、さらにより好ましくは１．６から７ナノメーターの間隔を有する抗原の準結晶性の厳密に反復性の規則性を持つ、適切に規則正しい反復性抗原アレイの典型的及び好適な例である。
【００３３】
ポリペプチド：本願明細書中で用いられる「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合（ペプチド結合ともいう）によって、直線的に連結されるモノマー（アミノ酸）から成る分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、産物の特定の長さを指すわけではない。ゆえに、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ポリペプチドの翻訳後修飾も包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列同一性は、公知のコンピュータプログラム（例えばＢｅｓｔｆｉｔプログラム）を使用して、従来通り決定されうる。対照標準アミノ酸配列に対して、例えば９５％同一性を有するかを決定するために、他の任意の配列配列プログラムも使用する場合、好ましくはＢｅｓｔｆｉｔを使用する場合、同一性のパーセンテージは対照標準アミノ酸配列の完全長に対して算出され、対照標準配列におけるアミノ酸残基の総数の多くとも５％の相同性におけるギャップが許可されるように、パラメータは設定される。ポリペプチド間の同一性のパーセンテージを決定における上述の方法は、本発明において開示される全てのタンパク質、ポリペプチドまたはそれらの断片に適用できる。当業者に理解されるように、保存的アミノ酸置換には等配性の置換、すなわちアミノ酸の荷電、極性、芳香族、脂肪族又は疎水性性質が維持される置換が含まれる。代表的な保存的アミノ酸置換は、以下のグループのうちの１グループ内のアミノ酸間の置換である：（ａ）Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、及びＬｅｕ；（ｂ）Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ；Ｌｙｓ、及びＡｒｇ；及び（ｃ）Ｐｈｅ及びＴｙｒ。
【００３４】
ウイルス粒子：本明細書中で用いられる「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態学的形状を指す。いくつかのウイルス型には、タンパク質キャプシドに囲まれるゲノムを含む；他のものは付加的な構造（例えばエンベロープ、テイルなど）を有する。
【００３５】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で用いられる「ウイルス様粒子」なる用語は、非反復可能性又は非感染性、好ましくは非反復可能性又は非感染性のウイルス粒子、又は非反復可能性又は非感染性、好ましくは非反復可能性又は非感染性のウイルス粒子に類似した構造、好ましくはウイルスのキャプシドを指す。本願明細書において使われる「非反復可能性」なる用語は、ＶＬＰによって含まれるゲノムを繰り返すことができないことを指す。本願明細書において使われる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に入ることができないことを指す。好ましくは、本発明に係るウイルス様粒子は、遺伝子操作のために又は物理的、化学的失活のために、ウイルスゲノムまたはゲノム機能の全部または一部を欠いているので、非反復可能性でおよび／または非感染性である。典型的には及び好ましくは、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの反復可能性及び感染性構成部分の全部または一部を欠いている。本発明に係るウイルス様粒子は、ウイルスゲノムとは別の核酸を含むことができる。本発明のウイルス様粒子の典型的及び好適な実施態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのウイルスカプシドのようなウイルスカプシドである。「ウイルスカプシド」または「カプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質サブユニットから成る巨大分子アセンブリをさす。通常は、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウィルスタンパク質サブユニットがある。典型的には及び好ましくは、これらのサブユニットの相互作用は、本来の反復性の構成を有するウイルスカプシド又はウイルスカプシド様の構造の形成につながり、前記構造は、典型的には球状又は管状である。
【００３６】
組換えＶＬＰ：本願明細書において使われる「組換えＶＬＰ」なる用語は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも一つの工程を含む方法によって得られるＶＬＰを指す。
【００３７】
パッケージ化：本願明細書において使用する「パッケージ化」なる用語は、ＶＬＰに関するポリアニオン性巨大分子の状態を指す。本願明細書において使用する「パッケージ化」なる用語は、例えば化学的結合による共有結合、または例えばイオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合等による非共有結合であってもよい結合を含む。好ましい実施形態において、「パッケージ化」なる用語は、ＶＬＰによるポリアニオン性巨大分子の封入または部分的な封入を指す。したがって、ポリアニオン性巨大分子は、実際の結合の存在なしに、特に共有結合の存在なしにＶＬＰによって封入されることができる。好ましい実施形態において、少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子は、前記ＶＬＰに、最も好ましくは非共有の方法で、パッケージ化される。ＶＬＰに、特にＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰに、ポリグルタミン酸のようなポリアニオン性巨大分子をパッケージ化する方法は、ＷＯ２００６／０３７７８７に開示される。ＷＯ２００６／０３７７８７の実施例４を特に引用する。
【００３８】
ポリアニオン性巨大分子：本願明細書において使われる「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、負の電荷の反復性の基を含む高い相対分子質量の分子であって、その構造は基本的に、実際にまたは概念的に低い相対分子質量の分子に由来する単位の多重反復を含む分子を指す。本願明細書において使用する「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、ｔｏｌｌ様受容体を活性化することができない分子を指す。したがって、「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、Ｔｏｌｌ様受容体リガンドを除外するものであり、Ｔｏｌｌ様受容体リガンドのような免疫応答を誘発および／または改良することができる物質、免疫応答を誘導および／または改良することができる核酸及びリポ多糖体（ＬＰＳ）を除外する。より好ましくは、本願明細書において使われる「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、サイトカイン産生を誘導することができない分子を指す。好ましくは、ポリアニオン性巨大分子は、ポリアニオン性ポリペプチドまたはアニオン性デキストランである。好ましい実施態様において、前記ポリアニオン性巨大分子は、ポリアニオン性ポリペプチドであって、好ましくは前記ポリアニオン性ポリペプチドは、以下からなるグループから選択される：（ａ）ポリグルタミン酸；（ｂ）ポリアスパラギン酸；（ｃ）ポリ（ＧｌｕＡｓｐ）及び（ｄ） （ａ）から（ｃ）の任意の化学修飾。化学修飾の例は、グリコシル化、アセチル化及びリン酸化を含むが、これに限定されるものではない。更なる好ましい実施態様において、前記ポリアニオン性巨大分子は、以下からなるグループから選択されるアニオン性デキストランである：（ａ）デキストラン硫酸；（ｂ）カルボキシルメチルデキストラン；（ｃ）スルホプロピルデキストラン；（ｄ）メチルスルホナートデキストラン；及び（ｅ）デキストランホスフェート。
【００３９】
ポリアスパラギン酸：本願明細書において使われる「ポリアスパラギン酸」なる用語は、前記ポリペプチドによって含まれるアミノ酸残基の総数から少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％のアスパラギン酸残基を含むポリペプチドを指す。前記ポリペプチドのアスパラギン酸残基は、ａｌｌ−Ｌ、ａｌｌ−Ｄのどちらか又はＬ−とＤ−アスパラギン酸の混合物である。最も好ましくは前記ポリペプチドは、Ｌ−アスパラギン酸残基のみを含む。
【００４０】
ポリグルタミン酸：本願明細書において使われる「ポリグルタミン酸」なる用語は、前記ポリペプチドによって含まれるアミノ酸残基の総数から少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％のグルタミン酸残基を含むポリペプチドを指す。前記ポリペプチドのグルタミン酸残基は、ａｌｌ−Ｌ、ａｌｌ−Ｄのどちらか又はＬ−とＤ−グルタミン酸の混合物である。最も好ましくは、前記ポリペプチドは、Ｌ−グルタミン酸残基のみを含む。
【００４１】
ポリ（ＧｌｕＡｓｐ）：本願明細書において使われる「ポリ（ＧｌｕＡｓｐ）」なる用語は、前記ポリペプチドによって含まれるアミノ酸残基の総数から少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％のグルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基を含むポリペプチドを指す。グルタミン酸分子とアスパラギン酸分子は、ａｌｌ−Ｌ又はａｌｌ−Ｄのどちらか、又はそれらの混合物である。最も好ましくは、前記ポリペプチドは、Ｌ−グルタミン酸残基及びＬ−アスパラギン酸残基を含む。
【００４２】
疼痛：疼痛受容体（侵害受容性疼痛）の刺激から、例えば損傷によって起こる疼痛、又は神経系の機能不全によって生じる疼痛は、明らかな物理的原因（神経障害疼痛）なしに、それは脳に送られる疼痛シグナルを導く。疼痛は、例えば、骨関節炎疼痛、リウマチ様関節炎疼痛、癌性疼痛、内臓痛、慢性的な腰痛症及び慢性的な頭痛、線維症、糖尿病性ニューロパシ、幻想肢痛及び帯状疱疹後神経痛を含む。
【００４３】
侵害受容性疼痛：本願明細書において使われる「侵害受容性疼痛」なる用語は、組織、例えば関節炎と癌に影響を及ぼす損傷、手術または疾患のために、疼痛受容体の刺激から起こっている疼痛を指す。また、侵害受容性疼痛は、慢性疼痛を含む。侵害受容性疼痛の好適な種類は、骨関節炎疼痛、リウマチ様関節炎疼痛、癌性疼痛、内臓痛、慢性的腰痛症及び慢性的頭痛である。
【００４４】
神経障害性疼痛：本願明細書において使われる「神経障害性疼痛」なる用語は、明らかな物理的原因無しに、脳に送られる疼痛シグナルを導く神経系の機能不全によって生じる疼痛を指す。例えば糖尿病性ニューロパシ、幻想肢痛及び帯状疱疹後神経痛である。ウイルス粒子とウイルス様粒子の１つの共通の特徴は、それらのサブユニットの高度に規則正しい反復性の配置である。
【００４５】
ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子：本願明細書において使われる「ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質、突然変異体又はその断片を含むか、又は好ましくはそれから本質的になるか、又はそれから成る。加えて、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの構造に似ている。さらにまた、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子は、非反復可能性で非感染性である。典型的に及び好ましくは、「ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子」は、ＲＮＡ−バクテリオファージ複製装置をコードする遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは全てを欠如し、典型的に及び更に好ましくは、宿主へのウイルス付着又は侵入の役割を果たしているタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは全てを欠如するＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子を指す。しかしながら、この定義は、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子を含み、上述の遺伝子は、依然として存在するが不活性であり、従って、ＲＮＡ−バクテリオファージの非反復可能性で非感染性のウイルス様粒子を導く。従って、最も広い定義では、「ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子」は、そのゲノムは物理的又は化学的又は遺伝子の方法によって不活性化され、そのためウイルス粒子が非反復可能性および／または非感染性であるＲＮＡ−バクテリオファージのウィルス粒子を含む。ＲＮＡ−バクテリオファージの好適なＶＬＰは、正二十面体対称を呈する１８０のサブユニットから成る。
【００４６】
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも１つ」、又は「１つ又は複数」を意味する。
【００４７】
本発明は、動物またはヒトのＮＧＦに対する免疫応答を改良するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）；及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原を含み、少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原であり、（ａ）と（ｂ）は少なくとも１つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結される。好ましくは、ＮＧＦ抗原はＶＬＰに連結され、それにより規則正しい反復性抗原−ＶＬＰアレイを形成する。本発明の好ましい実施形態において、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも６０において、さらにより好ましくは少なくとも１２０、最も好ましくは少なくとも１８０のＮＧＦ抗原がＶＬＰに連結される。規則正しい反復性構造を有する公知技術の任意のウイルスは、本発明のＶＬＰとして選択されることができる。
【００４８】
図示するＤＮＡ又はＲＮＡウイルス、そのコートタンパク質は、ＷＯ２００４／００９１２４の２５頁１０から２１行目、２６頁１１から２８行目、２８頁の４行目から３１頁の４行目に開示されたＶＬＰの調整に使用することができる。これらの開示は、参照により本願明細書において組み込まれる。
【００４９】
ウイルスまたはウイルス様粒子は、ウイルス感染した細胞培養から産生し精製されることができる。ワクチン接種の目的において、結果として生じるウイルスまたはウイルス様粒子は、毒性が欠けていることを必要とする。遺伝子工学の他に、物理的又は化学的方法が、ウイルスゲノム機能を機能させないために使用することができる。例えばＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理。
【００５０】
好ましい一実施形態において、ＶＬＰは組換えＶＬＰである。ほとんどすべての一般に知られているウイルスは、配列決定されており、公的に容易に入手できる。コートタンパク質をコードしている遺伝子は、当業者によって容易に同定することができる。宿主でコートタンパク質を組換えにより発現するＶＬＰの調製は、当業者の常識の範囲内である。好ましい一実施形態において、ウイルス様粒子は、以下のから成るグループから選択されるウイルスの組換えタンパク質、その突然変異体又は断片を含むか、又はそれから成る：（ａ）ＲＮＡ−バクテリオファージ；（ｂ）バクテリオファージ；（ｃ）Ｂ型肝炎ウィルス、好ましくはそのコートタンパク質 (Ulrich, et al., Virus Res. 50: 141-182 (1998))又は表面タンパク質（ＷＯ９２／１１２９１）；（ｄ）はしかウィルス(Warnes, et al., Gene 160:173-178 (1995))；（ｅ）シンドビスウィルス；（ｆ）ロタウィルス（ＵＳ５０７１６５１及びＵＳ５３７４４２６）；（ｇ）口蹄疫ウィルス(Twomey, et al., Vaccine 13:1603 1610, (1995))；（ｈ）ノーウォーク・ウイルス(Jiang, X., et al., Science 250:1580 1583 (1990); Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991))；（ｉ）アルファウイルス；ｊ）レトロウィルス、好ましくはそのＧＡＧタンパク質（ＷＯ９６／３０５２３）；（ｋ）レトロトランスポゾンＴｙ、好ましくはタンパク質ｐ１；（ｌ）ヒトパピローマウィルス（ＷＯ９８／１５６３１）；（ｍ）ポリオーマウィルス；（ｎ）タバコモザイクウィルス；及び（ｏ）フロックハウス・ウイルス。
【００５１】
好ましい一実施形態において、ＶＬＰは、組換えタンパク質、その突然変異体又はその断片のうちの１より多いアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、ＶＬＰは、少なくとも１つの第１のポリペプチド及び少なくとも１つの第２のポリペプチドから成り、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは、コートタンパク質、その変異体または断片のアミノ酸配列を含み、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドのアミノ酸配列は同一でない。別の好ましい実施形態では、前記第１のポリペプチドは、第１のコートタンパク質の、その変異体の又は断片のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドは第２のコートタンパク質の、その変異体の又は断片のアミノ酸配列を含み、前記第１のコートタンパク質と前記第２のコートタンパク質は同じウイルスのコートタンパク質であって、好ましくは前記ウイルスはＲＮＡ−バクテリオファージである。１より多いポリペプチド種を含むか、又はそれから成るＶＬＰはモザイクＶＬＰと呼ばれる。
【００５２】
本願明細書において使われる「組換えタンパク質の断片」または「コートタンパク質の断片」は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質の長さの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％のポリペプチドで、好ましくはＶＬＰを形成する能力を保持しているものと定義される。好ましくは、断片は少なくとも１つの内部欠失、少なくとも一つの切り詰めまたはそれらの少なくとも一つの組合せである。更に好ましくは、断片は、多くても５、４、３、２つの内部欠失によって、多くても２つの切り詰めによって又は正確にそれらの１つの組合せによって得られる。
【００５３】
「組換えタンパク質の断片」または「コートタンパク質の断片」なる用語は、それぞれ上に定義した「組換えタンパク質の断片」または「コートタンパク質の断片」に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％のアミノ酸同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子に組み立てられることができるものである。本発明において交換可能に使用される「突然変異体リコンビナントタンパク質」なる用語または「組換えタンパク質の突然変異体」なる用語、本発明において交換可能に使用される「突然変異体コートタンパク質」なる用語または「コートタンパク質の突然変異体」なる用語は、それぞれ、野生型組換えタンパク質またはコートタンパク質に由来するアミノ酸配列を有するポリペプチド指すものであり、アミノ酸配列は野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有し、好ましくは前記ポリペプチドはＶＬＰに組み立てられる能力を保持する。
【００５４】
好ましい一実施形態において、本発明のウイルス様粒子は、Ｂ型肝炎ウィルスのものである。Ｂ型肝炎ウィルス様粒子の調製は、ＷＯ００／３２２２７、ＷＯ０１／８５２０８及びＷＯ０１／０５６９０５において開示される。全３つの文献は、対照標準を経由して本願明細書に明示的に組み込まれる。本発明の実行ために適切なＨＢｃＡｇの他の変異体は、ＷＯ０１／０５６９０５において、特にその３４から３９頁に開示される。
【００５５】
更なる本発明の好ましい実施形態において、リジン残基は、ＨＢｃＡｇのＶＬＰに対するＮＧＦ抗原の連結を介在するために、ＨＢｃＡｇポリペプチドに導入される。好ましい実施態様において、本発明のＶＬＰ及び組成物は、修飾されアミノ酸の位置７９及び８０がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ酸配列を有するペプチドに置き換えられた配列番号２０のアミノ酸１−１４４又は１−１４９、１−１８５を含むか又はそれから成るＨＢｃＡｇを使用して調製される。この修飾は、配列番号２０から配列番号２１への変化である。更なる好ましい実施態様において、配列番号２１（またはそれに対応する断片、好ましくは１−１４４または１−１４９）の位置４８と１１０のシステイン残基は、セリンに変異する。本発明は、上記の対応するアミノ酸変異を有するＢ型肝炎コアタンパク質変異体を含む組成物を更に含む。本発明は、配列番号２１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るＨＢｃＡｇポリペプチドをそれぞれ含む組成物及びワクチンを含む。
【００５６】
本発明の一実施例において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子であって、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージは、（ａ）バクテリオファージＱβ；（ｂ）バクテリオファージＲ１７；（ｃ）バクテリオファージｆｒ；（ｄ）バクテリオファージＧＡ；（ｅ）バクテリオファージＳＰ；（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；（ｇ）バクテリオファージＭ１１；（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；（ｋ）バクテリオファージｆ２；（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及び（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。非常に好適な実施態様において、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子である。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質、その突然変異体又はその断片を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成り、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージは、（ａ）バクテリオファージＱβ；（ｂ）バクテリオファージＲ１７；（ｃ）バクテリオファージｆｒ；（ｄ）バクテリオファージＧＡ；（ｅ）バクテリオファージＳＰ；（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；（ｇ）バクテリオファージＭ１１；（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；（ｋ）バクテリオファージｆ２；（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及び（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５から成るグループから選択される。更に好ましい実施態様において、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質、突然変異体又はその断片を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成り、前記ＲＮＡバクテリオファージは、Ｑβ、ｆｒ、ＡＰ２０５またはＧＡから選択される。非常に好適な実施態様において、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質、突然変異体又はその断片を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る。
【００５８】
本発明の一実施形態において、組成物は、コートタンパク質、その突然変異体又はその断片を含み、好ましくは前記コートタンパク質は、以下から成るグループから選択されるアミノ酸配列を含むか又は好ましくはそれから成る：（ａ）配列番号１；Ｑβ ＣＰを指す；（ｂ）配列番号１と配列番号２の混合物（Ｑβ Ａ１タンパク質を指す）；（ｃ）配列番号３；（ｄ）配列番号４；（ｅ）配列番号５；（ｆ）配列番号６，（ｇ）配列番号６と配列番号７との混合物；（ｈ）配列番号８；（ｉ）配列番号９；（ｊ）配列番号１０；（ｋ）配列番号１１；（ｌ）配列番号１２；（ｍ）配列番号１３；（ｎ）配列番号１４；（ｏ）配列番号４０；（ｐ）配列番号４１；及び（ｑ）配列番号４２。
【００５９】
別の好ましい実施形態では、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質、突然変異体又はその断片を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る。別の好ましい実施形態では、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質、突然変異体又はその断片を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成り、前記コートタンパク質は、以下から成るグループから選択されるアミノ酸配列を含むか又は好ましくはそれから成る：（ａ）配列番号１； Ｑβ ＣＰを指す；（ｂ）配列番号１と配列番号２の混合物（Ｑβ Ａ１タンパク質を指す）；（ｃ）配列番号３；（ｄ）配列番号４；（ｅ）配列番号５；（ｆ）配列番号６，（ｇ）配列番号６と配列番号７との混合物；（ｈ）配列番号８；（ｉ）配列番号９；（ｊ）配列番号１０；（ｋ）配列番号１１；（ｌ）配列番号１２；（ｍ）配列番号１３；及び（ｎ）配列番号１４；（ｏ）配列番号４０；（ｐ）配列番号４１；及び（ｑ）配列番号４２。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、前記ウイルス様粒子は、組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれから成るか、又はそれから成り、前記組換えコートタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成る。本発明の一実施形態において、ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体またはその断片の１より多いアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成るモザイクＶＬＰである。ある非常に好適な実施態様において、ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージの２つの異なるコートタンパク質を含むか、あるいはそれから成り、前記２つの異なるコートタンパク質は、配列番号１及び配列番号２、又は配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列をそれぞれ含むか、あるいは好ましくはそれから成る。好ましい一実施形態において、前記ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰである。
【００６１】
Ｑβのカプシドまたはウイルス様粒子は、直径２５ｎｍ及びＴ＝３見かけ対称性を有する正二十面体のファージ様カプシド構造を示す。カプシドは１８０コピーのコートタンパク質を含み、それはジスルフィド架橋(Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-5554 (1996))によって共有結合性五量体と六量体に連結され、Ｑβカプシドの顕著な安定性を導く。しかしながら、組換えＱβコートタンパク質から作成されるカプシドまたはＶＬＰは、カプシド中の他のサブユニットにジスルフィド結合を経て連結されないサブユニットか、または不完全に連結したサブユニットを含むことができる。ＱβのカプシドまたはＶＬＰは、有機溶媒及び変性剤に通常でない耐性を示す。驚くべきことに、３０％と同じ高さのＤＭＳＯ及びアセトニトリル濃度、１Ｍと同じ高さのグアニジニウム濃度はカプシドの安定性に影響を及ぼさないことが観察された。Ｑβのカプシド及びＶＬＰの高い安定性は、特に、本発明に係る哺乳類及びヒトの免疫化及びワクチン接種におけるその使用に有利な特徴である。
【００６２】
本発明に係るＲＮＡ−バクテリオファージ、特にＲＮＡ−バクテリオファージＱβとＲＮＡ−バクテリオファージｆｒの更なる好適なウイルス様粒子はＷＯ０２／０５６９０５において開示され、その開示は参照により完全に本願明細書に援用される。特に、ＷＯ０２／０５６９０５の実施例１８は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰの調製の詳細な説明を提供する。
【００６３】
他の好ましい例として、前記ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージＡＰ２０５のＶＬＰである。アミノ酸５のプロリンがスレオニンに置換されたＡＰ２０５コートタンパク質又はアミノ酸１４のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されたＡＰ２０５コートタンパク質を含むＡＰ２０５ ＶＬＰの組み立て可能な変異体の形態は、本発明の実行に使用されてもよく、本発明の好ましい他の実施形態につながる。ＷＯ２００４／００７５３８は、特に実施例１と実施例２において、ＡＰ２０５コートタンパク質を含むＶＬＰをどのように得るかについて、及び特にその発現と精製を記載する。ＷＯ２００４／００７５３８は、参照により本願明細書に援用される。ＡＰ２０５ ＶＬＰは高度に免疫原性であり、典型的には及び好ましくは、配向性及び反復性の様式で抗原を提示するワクチン・コンストラクトを生成するために、抗原に連結されることができる。高い抗体価はが提示された抗原に対して引き出され、連結された抗原は免疫系の細胞、典型的には及び好ましくはＢ細胞と相互作用することが可能であり、従って、免疫原性である。
【００６４】
好ましい一実施形態において、前記ＶＬＰは、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの、ウイルスの変異体コートタンパク質を含むかまたはそれから成り、変異体コートタンパク質は、置換の方法でおよび／または欠失の方法で、少なくとも一つのリジン残基が除去されることによって修飾されている。他の好ましい実施形態において、本発明のＶＬＰは、ウイルスの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの変異体コートタンパク質を含むか、又はそれから成り、変異体コートタンパク質は、置換の方法でおよび／または欠失の方法で、少なくとも一つのリジン残基が付加されることによって修飾されている。少なくとも一つのリジン残基の欠失、置換または付加は、カップリングの程度を変化させてることを可能にし、すなわち、ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰのサブユニットにつき結合している抗原量を変化させることを可能にする。したがって、特異的ワクチンの設計の必要条件を、満たすことができる。
【００６５】
好ましい一実施形態において、本発明の組成物とワクチンは、０．５から４．０の抗原密度を有する。本願明細書において使われる「抗原密度」なる用語は、ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰのサブユニット、好ましくはコートタンパク質につき連結される抗原分子の、平均数を指す。したがって、この値は、本発明の組成物またはワクチンにおいて、前記ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの前記ＶＬＰの、全てのサブユニットにおける平均として算出される。Ｑβコートタンパク質のＶＬＰまたはカプシドは、定まった数のリジン残基をそれらの表面に提示し、３つのリジン残基がカプシドの内部を向いておりＲＮＡと相互作用し、４つの別のリジン残基がカプシドの外側に曝らされる定まったトポロジーを有する。好ましくは、少なくとも一つの第１の付着部位は、ＶＬＰの外側を向いているか又はそこに存在するリジン残基である。より好ましくは、少なくとも一つの第１の付着部位は、ＶＬＰの外側を向いているか又はそこに存在するリジン残基のアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基のアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、配列番号１のリジン残基のアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、配列番号１の位置２、１３、１６、４６、６０、６３及び６７のリジン残基のうちの任意の一つのアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、カプシドの外側に向かうリジン残基の任意の一つのアミノ基である。
【００６６】
露出したリジン残基がアルギニンと交換されたＱβ変異体が、本発明のために使われてもよい。したがって、別の本発明の好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、変異体Ｑβのコートタンパク質を含むか、基本的にそれから成るか、またはそれから成る。好ましくは、これらの変異体コートタンパク質は、（ａ）Ｑβ−２４０（配列番号１５、配列番号１のＬｙｓ１３−Ａｒｇ）；（ｂ）Ｑβ−２４３（配列番号１６、配列番号１のＡｓｎ１０−Ｌｙｓ）；（ｃ）Ｑβ−２５０（配列番号１７、配列番号１のＬｙｓ２−Ａｒｇ）；（ｄ）Ｑβ−２５１（配列番号１８、配列番号１のＬｙｓ１６−Ａｒｇ）；及び（ｅ）Ｑβ−２５９（配列番号１９、配列番号１のＬｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ）からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成る。上記のＱβ変異体コートタンパク質、変異体Ｑβコートタンパク質ＶＬＰ及びカプシドのコンストラクト、発現及び精製は、それぞれＷＯ０２／０５６９０５に記載されている。特に、ＷＯ０２／０５６９０５の実施例１８はここに援用される。
【００６７】
別の本発明の好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、変異体コートタンパク質Ｑβまたは変異体または断片及び対応するＡ１タンパク質を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。更なる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、変異体コートタンパク質からを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、前記変異体コートタンパク質は、配列番号１５、１６、１７、１８及び１９及び対応するＡ１タンパク質の任意の一つから選択される。
【００６８】
更なるＲＮＡ−バクテリオファージ・コートタンパク質はバクテリア宿主の発現において自己集合することが示されている(Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170:238-242 (1989), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特に、ＧＡ(Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996), Tars, K et al., J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))及びｆｒ(Pushko P. et al., Prot. Eng. 6: 883-891 (1993), Liljas, L et al. J Mol. Biol. 244:279-290,(1994))の生物学的及び生化学的特性が開示されている。いくつかのＲＮＡ−バクテリオファージの結晶構造が決定されている(Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996))。このような情報を用いて、表面露出した残基は同定されることができ、したがって、一つ以上の反応性のアミノ酸残基が挿入または置換により挿入されることができるように、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質は修飾されることができる。ＲＮＡ−バクテリオファージに由来するＶＬＰの別の有利な点は、手頃なコストで大量の物質の産生を可能にするバクテリアにおける、高い発現生産量である。
【００６９】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦ抗原はＮＧＦタンパク質である。好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質は、以下からなるグループから選択される：（ａ）ヒトＮＧＦタンパク質；（ｂ）イヌＮＧＦタンパク質；（ｃ）ネコＮＧＦタンパク質；（ｄ）マウスＮＧＦタンパク質、及び（ｅ）ウマＮＧＦタンパク質。更なる好ましい実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、ヒトのまたは他動物の、好ましくは哺乳類のＮＧＦであって、更に好ましくは前記ＮＧＦタンパク質は、配列番号２２から２５及び３２から３９の任意の一つから選択される。好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質はヒトＮＧＦである。
【００７０】
更なる好ましい実施態様において、ヒトＮＧＦは、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれから成る。別の好ましい実施態様では、ＮＧＦタンパク質は、配列番号２２と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなる。好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むか又は好ましくはそれから成り、配列番号２２は、置換及び／又は欠失及び／又は挿入又はそれらの組み合わせによって、少なくとも１つの及び多くとも２０の、好ましくは少なくとも１つの及び多くとも１０の、より好ましくは少なくとも１つの及び多くとも５のアミノ酸が変化する。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、ＮＧＦタンパク質は、変異したアミノ酸配列を含むか又は好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸配列は、置換及び／又は欠失及び／又は挿入又はそれらの組み合わせによって、少なくとも１つの及び多くとも２０の、好ましくは少なくとも１つの及び多くとも１０の、より好ましくは少なくとも１つの及び多くとも５のアミノ酸が変化される。
【００７２】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、配列番号２２は、少なくとも１つの及び多くとも２０の、好ましくは少なくとも１つの及び多くとも１０の、より好ましくは少なくとも１つの及び多くとも５のアミノ酸が欠失により変化される。
【００７３】
更なる好ましい実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、配列番号２２は、１、２、又は３つのアミノ酸の欠失によって変えられる。別の好ましい実施態様では、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は、配列番号２２であり、多くとも１０、９、８、７、６、５又は４アミノ酸残基が前記突然変異されるアミノ酸配列から欠失される。非常に好適な実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は、配列番号２２であり、３、２又は好ましくは１つのアミノ酸残基が前記突然変異されるアミノ酸配列から欠失する。好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、配列番号２２は、少なくとも１つの及び多くとも２０の、好ましくは少なくとも１つの及び多くとも１０の、より好ましくは少なくとも１つの及び多くとも５のアミノ酸が挿入により変化する。
【００７４】
更なる好ましい実施態様において、ＮＧＦタンパク質はアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、配列番号２２は、１、２、又は３つのアミノ酸挿入によって変えられる。別の好ましい実施形態では、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は、配列番号２２であり、多くとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５又は４アミノ酸残基が前記突然変異されるアミノ酸配列に挿入される。非常に好適な実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、３、２又は好ましくは１つのアミノ酸残基は、前記突然変異されるアミノ酸配列に挿入される。
【００７５】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれからなり、配列番号２２は、少なくとも１つの及び多くとも２０の、好ましくは少なくとも１つの及び多くとも１０の、より好ましくは少なくとも１つの及び多くとも５のアミノ酸が置換により、好ましくは保存的置換により、変化する。更なる好ましい実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り 配列番号２２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸置換によって、好ましくは保存的置換によって変化する。
【００７６】
更なる好ましい実施態様において、ＮＧＦタンパク質はアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、配列番号２２は、１、２、又は３つのアミノ酸置換によって、好ましくは保存的置換によって変化する。別の好ましい実施例では、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸配列の多くとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、 ７、６、５、又は４つのアミノ酸残基がアミノ酸置換により交換され、好ましくは前記アミノ酸置換は、保守的アミノ酸置換である。非常に好適な実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は、配列番号２２であり、突然変異される前記アミノ酸配列の３、２、好ましくは１つのアミノ酸残基は、アミノ酸置換によって交換され、好ましくは前記アミノ酸置換は、保守的なアミノ酸置換である。
【００７７】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質はヒトＮＧＦ前駆体である。更なる好ましい実施態様において、ヒトＮＧＦ前駆体は、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成る。他の好ましい実施形態において、ＮＧＦタンパク質はアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、それは配列番号２３と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。
【００７８】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦ抗原はＮＧＦ断片であり、前記ＮＧＦ断片は少なくとも一つのエピトープを含むか、あるいはそれから成る。タンパク質のエピトープを決定する方法は、当業者に知られている。ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９８０は２６頁の第１段落から２７頁の第４段落に、これらの方法のいくつかを詳細に記載しており、これらの具体的開示は本願明細書に援用したものとする。これらの方法が他のポリペプチド抗原に通常適用できる点に留意される必要があり、ゆえに、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９８０に開示のＩＬ−２３ ｐ１９に制限されない。
【００７９】
本発明の好ましい実施態様において、ＮＧＦ抗原はＮＧＦ断片である。更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ断片は、配列番号２２のヒトＮＧＦの少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも２０、なお好ましくは少なくとも３０の連続するアミノ酸を含むか、あるいは好ましくはそれから成る。更なる好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ断片は、配列番号２２の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０の連続するアミノ酸から成り、好ましくは前記ＮＧＦ断片は配列番号１０の連続するアミノ酸を含み、更に好ましくは前記ＮＧＦ断片は配列番号２２の１０のＮ末端基アミノ酸を含む。したがって、非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ断片は、配列番号４４のアミノ酸配列から成る。
【００８０】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦ抗原は、ＮＧＦ突然変異タンパク質であって、好ましくは前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、減少した生物学的活性を含み、更なる好ましくは前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、免疫原性コンジュゲートの形態で動物に投与された場合、抗体中和を誘発することができる。非常に好適な実施態様において、ＮＧＦ突然変異タンパク質は生物学的活性を含まず、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、免疫原性コンジュゲートの形態で動物に投与された場合、抗体中和を誘発することができる。
【００８１】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は、配列番号２２であり、前記変異される前記アミノ酸配列は少なくとも１及び多くとも９、好ましくは少なくとも１及び多くても３、より好ましくは、少なくとも１及び多くとも２、最も好ましくは正確に１つの位置において変えられ、前記位置のアミノ酸残基は、置換によってまたは欠失によって、最も好ましくは置換によって変えられる。更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異したアミノ酸配列から成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記アミノ酸配列は、少なくとも１及び多くとも９の位置で変えられ、前記位置のアミノ酸残基は配列番号２２から欠失され、好ましくは前記欠失するアミノ酸残基は配列番号２２のアミノ酸残基１から９から選択され、更に好ましくは前記欠失するアミノ酸残基は、配列番号２２のアミノ酸残基４Ｈ、５Ｐ、７Ｆ又は８Ｈの何らかの一つから選択される(Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Woo, S.B. and K.E. Neet J Biol Chem, 1996. 271(40): p. 24433-41; and Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は配列番号４５から成る。
【００８２】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、変異される前記アミノ酸配列は少なくとも１及び多くとも３、好ましくは少なくとも１及び多くても２、最も好ましくは正確に１つの位置において変化し、前記位置のアミノ酸残基は置換によって変化する。
【００８３】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異される前記アミノ酸配列は少なくとも１及び多くとも３、好ましくは少なくとも１及び多くても２、最も好ましくは正確に１つの位置において変化し、前記位置のアミノ酸残基は置換によって変えられ、置換するアミノ酸残基は配列番号２２のアミノ酸残基４Ｈ、５Ｐ、７Ｆ又は８Ｈのいずれかの１つから選択される(Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Woo, S.B. and K.E. Neet J Biol Chem, 1996. 271(40): p. 24433-41; and Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、配列番号４６から５２の何れか一つから成る。
【００８４】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異するアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸配列は少なくとも１及び多くとも３の、好ましくは少なくとも１及び多くても２の、最も好ましくは正確に１つの位置において変えられ、前記位置のアミノ酸残基は置換によって変えられ、置換されたアミノ酸残基は、配列番号２２のアミノ酸残基４３から４５、４８及び４９の何れかの一つから選択される(Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8, and Xie, Y., et al. J Biol Chem, 2000. 275(38): p. 29868-74.)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、配列番号５３から６０の何れかの一つから成る。
【００８５】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異するアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異するアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸配列は少なくとも１及び多くとも３の、好ましくは少なくとも１及び多くても２の、最も好ましくは正確に１つの位置において変えられ、前記位置のアミノ酸残基は置換によって変えられ、置換されるアミノ酸残基は、配列番号２２のアミノ酸残基９４Ｇ、９５Ｋ及び９６Ｑの何れか一つから選択される（Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8, and Xie, Y., et al. J Biol Chem, 2000. 275(38): p. 29868-74.)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、配列番号６１から６６の何れか一つから成る。
【００８６】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異するアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異するアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸置換によって正確に１つの位置において変えられ、置換されたアミノ酸残基はアミノ酸残基７５Ｈ、８４Ｈ、１００Ｒ、１１１Ｖ、１１２ｌ、１１４Ｒ、１１５Ｋ、１１３Ｓの何れか一つのアミノ酸から選択される(Kullander, K. et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Larsson, E. et al. Neurobiol Dis, 2008, Kruttgen, A., et al. J Biol Chem, 1997. 272(46): p. 29222-8)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は配列番号６７から７４の何れか一つから成る。
【００８７】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異するアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸は正確に２つの位置において変えられ、前記位置のアミノ酸残基は置換によって変えられ、置換されたアミノ酸残基は７５Ｈ及び８４Ｈである(Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は配列番号７５から成る。
【００８８】
好ましい実施態様では、組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子；及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原を含むか、本質的にそれから成るか又はそれから成り、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原であり；（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結し、前記結合は少なくとも一つのペプチド結合、好ましくはペプチド結合だけを経るものである。
【００８９】
更なる好ましい実施態様において、少なくとも一つの第１の付着部位を有する前記ウイルス様粒子と前記少なくとも一つの抗原は、遺伝子融合の手段により連結される。ＮＧＦ抗原をコードする遺伝子は、内部に、または好ましくはＶＬＰのコートタンパク質をコードする遺伝子のＮ−またはＣ−末端にインフレームでライげーションされる。また、融合は、ＮＧＦ抗原の配列を、コートタンパク質配列の部分が欠失したコートタンパク質の変異体であって、トランケーション変異体と呼ばれるものに挿入することによって遂行されることができる。トランケーション変異体は、コートタンパク質の配列の一部のＮ−またはＣ末端欠失、又は内部欠失を有することができる。融合タンパク質は、好ましくは発現に応じてＶＬＰに組み立てられる能力を保持し、それは電子顕微鏡によって調べられることができる。
【００９０】
隣接するアミノ酸残基は、コートタンパク質とＮＧＦ抗原との間の距離を増大させるために、ＮＧＦ抗原に加えられることができる。グリシンとセリン残基は、隣接配列において使用される特に好ましいアミノ酸残基である。このような隣接配列は、融合コンスストラクトに追加的な柔軟性を与える。これは、ＶＬＰサブユニットの配列に融合した外来配列を不安定にする効果の可能性を減少し、従ってＶＬＰアセンブリによる外来配列の干渉を減少させる。他の実施態様において、ＮＧＦ抗原は他のウイルスコートタンパク質の多くに、例えばＱβのＡ１タンパク質の切断型のＣ末端に融合することができる(Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39:9-15 (1996))。あるいは、ＮＧＦ抗原は、ＣＰ伸長の位置７２と７３の間に挿入されることができる。例えば、Kozlovska et al.,(Intervirology, 39: 9-15 (1996))はエピトープが、位置１９で切断されたＱＣＰ伸長のＣ末端に融合したＱＡ１タンパク質融合を記載する。別の例として、ＮＧＦ抗原は、ｆｒ ＣＰのアミノ酸２と３との間に挿入されることができる(Pushko P. et al., Prot. Eng. 6: 883-891 (1993))。さらにまた、ＮＧＦ抗原は、ＲＮＡ−バクテリオファージＭＳ−２（ＷＯ９２／１３０８１）のコートタンパク質のＮ末端基突出したヘアピンに融合することができる。あるいは、ＮＧＦ抗原は、パピローマウイルスのコートタンパク質に、ウシパピローマウイルス・タイプ１のコートタンパク質の主要コートタンパク質Ｌ１（ＢＰＶ−１）に融合させることができる(Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999), WO00/23955)。また、ＮＧＦ抗原を有するＢＰＶ−１ Ｌ１のアミノ酸１３０−１３６の置換も、本発明の実施態様である。ウイルスのコートタンパク質に、または変異体又はその断片に、ＮＧＦ抗原を融合する更なる実施形態は、ＷＯ２００４／００９１２４の６２頁２０行目から６８頁１７行目に開示されており、引用により本願明細書に組み込まれる。
【００９１】
他の好ましい実施形態において、ＮＧＦ抗原は、ＲＮＡ−バクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質、変異体又はその断片のＮ末端又はＣ末端のどちらかに融合し、好ましくは前記コートタンパク質、変異体又はその断片は配列番号１４、４０から４２の何れか一つのアミノ酸配列、好ましくは配列番号４１のアミノ酸配列を含むか又は好ましくはそれから成る。
【００９２】
更に好ましい実施態様において、融合タンパク質は、スペーサを更に含み、前記スペーサーはＲＮＡ−バクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質、その変異体又はその断片と前記ＮＧＦ抗原との間に入る。好ましくは、前記スペーサーは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５未満アミノ酸から成る。非常に好ましくは、前記スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸から成る。
【００９３】
好ましい実施形態では、組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子；及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原を含むか、本質的にそれから成るか、又はそれから成り、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原であって；（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記連結は少なくとも一つの非ペプチド共有結合であり、好ましくは前記第１の付着部位はスルフヒドリル基を含まないか又はそれでなく、より好ましくは、前記第１の付着部位はシステインのシステインのスルフヒドリル基を含まないか又はそれではない。
【００９４】
好ましい実施形態において、第１の付着部位はアミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれから成る。更に好ましい実施形態において、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれから成り、前記リジン残基は、前記ＶＬＰに含まれる組換えコートタンパク質のリジン残基である。更に好ましい実施形態において、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれであり、前記リジン残基は、前記ＶＬＰに含まれるＲＮＡバクテリオファージの組換えコートタンパク質のリジン残基である。
【００９５】
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第１の付着部位を有する前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子であり、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基を含むか又は好ましくはそれであり、好ましくは前記リジン残基は、組換えコートタンパク質、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質ののリジン残基であって、前記組換えコートタンパク質は、ＲＮＡ−バクテリオファージの前記ウイルス様粒子に含まれる。
【００９６】
更に好ましい実施態様において、少なくとも一つの第１の付着部位を有する前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質、その変異体又はその断片を含むか、本質的にそれから成り、あるいはそれから成り、前記第１の付着部位は、リジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれであり、好ましくは前記リジン残基は、前記ＲＮＡ−バクテリオファージの、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージＱβの前記組換えコートタンパク質、その変異体またはその断片に含まれるリジン残基である。
【００９７】
更に好ましい実施態様において、少なくとも一つの第１の付着部位を有する前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれから成るか、またはそれから成り、前記組換えコートタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り；好ましくは前記第１の付着部位は配列番号１のリジン残基のアミノ基を含むか、又はそれである。
【００９８】
別の本発明の好ましい実施形態において、第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそれから成る。本発明の非常に好適な実施態様において、少なくとも一つの第１の付着部位はアミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基であり、少なくとも一つの第２の付着部位はスルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基である。
【００９９】
本発明の好適な一実施形態において、典型的には及び好ましくはＮＧＦ抗原は、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて、化学的架橋結合を経由してＶＬＰに連結される。好ましい実施態様において、ヘテロ二官能性架橋剤は、好適な第１の付着部位、好ましくはアミノ基、より好ましくはＶＬＰのリジン残基のアミノ基と反応できる官能基と、好適な第２の付着部位、すなわちスルフヒドリル基、好ましくはＮＧＦ抗原に本来からあるか又は人工的に付加されたシステイン残基のスルフヒドリル基と反応することができ、場合により還元による反応に利用される更なる官能基を含む。複数のヘテロ二官能性架橋剤は、従来技術で周知である。これらは好適な架橋剤であるＳＭＰＨ（ピアス）、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＥＭＣ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ及び例えばピアス化学会社から入手できる他の架橋剤、及びアミノ基に対して反応できる１つの官能基とスルフヒドリル基に対して反応できる１つの官能基とを有するものを含む。上述の全ての架橋剤は、アミノ基との反応後アミド結合の形成に、スルフヒドリル基との反応後チオエーテル結合の形成につながる。本発明の実施において適切な架橋剤の別のクラスは、結合の際にＮＧＦ抗原とＶＬＰとの間のジスルフィド結合の導入によって特徴づけられる。このクラスに属している好適な架橋剤は、例えばＳＰＤＰとスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（ピアス）を含む。
【０１００】
好ましい実施形態において、本発明の組成物はリンカーを更に含む。ＮＧＦ抗原への第２の付着部位のエンジニアリングはリンカーの会合によって達成され、好ましくは本発明の開示に従って第２の付着部位として適切な少なくとも一つのアミノ酸を含む。従って、本発明の好ましい実施態様において、リンカーは少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも１つの、典型的には１つのペプチド結合をにより、ＮＧＦ抗原に会合する。好ましくは、リンカーは第２の付着部位を含むか、又はそれから成る。別の好ましい実施形態では、リンカーは、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む。他の好ましい実施形態として、アミノ酸リンカーは、システイン残基である。別の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーは、ＣＧＧ−またはＧＣＧ−リンカー、好ましくはＣＧＧ−リンカーである。本発明のために適切であるリンカーはＷＯ２００５／１０８４２５Ａ１（３２−３３頁）に開示され、それは引用により本願明細書において組み込まれる。
【０１０１】
上述の好適な方法によるヘテロ二官能性架橋剤を使用したＶＬＰへのＮＧＦ抗原の連結は、配向性の様式でＶＬＰへＮＧＦ抗原を結合することを可能にする。ＮＧＦ抗原をＶＬＰに連結する他の方法は、ＮＧＦ抗原が、カルボジイミドＥＤＣ及びＮＨＳを使用して、ＶＬＰに架橋結合する方法を含む。また、ＮＧＦ抗原は、最初に、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰまたはイミノチオランとの反応によってチオール化されてもよい。次に、ＮＧＦ抗原は、必要であれば脱保護の後で、以下の通りにＶＬＰに結合することができる。過剰なチオール化試薬の分離後、ＮＧＦ抗原はＶＬＰ（システイン反応の部分を含むヘテロ二官能性架橋剤によって前もって活性化されたもの）と反応させ、その結果、システイン残基に反応性である少なくとも１つ又は複数の官能基であって、そこに上述のようにチオール化されたＮＧＦ抗原が反応することができる官能基を提示する。場合により、低量の還元剤は、反応混合物に含まれる。更なる方法において、ＮＧＦ抗原は、グルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（ピアス）のようなホモ二官能性架橋剤又はＶＬＰのアミノ基又はカルボキシル基に反応性である官能基を有するホモ二官能性架橋剤を使用してＶＬＰに取り付けられる。
【０１０２】
本発明の他の実施態様において、組成物は、化学的相互作用を経て、ＮＧＦ抗原に連結されたウイルス様粒子を含むかまたは本質的にそれから成り、これらの相互作用のうちの少なくとも１つは共有結合でない。このような相互作用は、抗原−抗体相互作用、受容体−リガンド相互作用を含むが、これに限定されるものではない。ＮＧＦ抗原へのＶＬＰの結合は、以下によって遂行されることができる：ＶＬＰをビオチン化すること、及びストレプトアビジン−融合タンパク質としてＮＧＦ抗原を発現すること。
【０１０３】
立体配置的に許容可能であるならば、１または複数の抗原分子（すなわちＮＧＦ抗原）は、ＶＬＰの１つのサブユニット、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質に、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰのコートタンパク質の露出したリジン残基を介して、取り付けられることができる。ＲＮＡ−バクテリオファージ、特にＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰの特殊な特徴は、したがって、サブユニットにつき複数の抗原を結合させるという可能性である。これは、密度の高い抗原アレイの生成を可能にする。
【０１０４】
本発明の非常に好適な実施態様において、ＮＧＦ抗原は、ＮＧＦ抗原のＮ末端基かＣ末端に付加されたシステイン残基を介してまたはＮＧＦ抗原の天然システイン残基を介して、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質の、特にＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のＶＬＰのリジン残基に連結される。上記の通り、４つのリジン残基は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰの表面に露出する。典型的に及び好ましくは、これらの残基は、架橋剤分子との反応により誘導体化される。露出したリジン残基の全てが抗原に接続することができるというわけでない例として、架橋剤と反応したリジン残基は、誘導体化工程の後、ε−アミノ基に取り付けられた架橋剤分子をあとに残す。これは１または複数の正の電荷の消失につながり、それはＶＬＰの溶解性と安定性に有害である可能性がある。開示されたＱβコートタンパク質変異体の場合のように、いくつかのリジン残基をアルギニンと交換することによって、アルギニン残基が好適な架橋剤と反応しないことにより、正電荷の過剰な消失を妨げる。さらに、より少ない部位が抗原と反応可能である場合に、アルギニン残基によるリジン残基の置換は、より多くの形成された抗原アレイを導くことができる。
【０１０５】
したがって、露出したリジン残基は、以下のＱβコートタンパク質変異体のアルギニンと交換された：Ｑβ−２４０（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号１５）、Ｑβ−２５０（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号１７）、Ｑβ−２５９（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ，Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号１９）及びＱβ−２５１；（Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ、配列番号１８）。さらなる実施態様において、１つの追加的なリジン残基Ｑβ−２４３を有するＲＮＡ−バクテリオファージＱβの変異体コートタンパク質を開示する（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号１６）それは、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβの野生型コートタンパク質によって、より高い密度の抗原アレイさえ得ることに適している（配列番号１）。
【０１０６】
本発明の一実施態様において、前記ウイルス様粒子は宿主によって組換えにより産生され、前記ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡから本質的に離れており、好ましくは前記ウイルス様粒子は宿主核酸を本質的に含まず、好ましくは前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子である。更なる好ましい実施形態では、組成物は、ＶＬＰに結合したか、好ましくはＶＬＰにパッケージ化されているか又は封入されている少なくとも１つのポリアニオン性巨大分子を更に含む。
【０１０７】
好ましい実施形態において、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子のウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子は組換えによって宿主により産生され、前記ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子は宿主ＲＮＡを本質的に含まず、前記組成物は少なくとも１つのポリアニオン性巨大分子を含み、前記少なくとも１つのポリアニオン性巨大分子は、前記ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子に、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子にパッケージ化されている。更に非常に好ましい実施態様において、前記ポリアニオン性巨大分子は、ポリグルタミン酸および／またはポリアスパラギン酸であって、好ましくはポリグルタミン酸である。
【０１０８】
この記載において、本願明細書で使用される「本質的に宿主ＲＮＡを含まない」なる用語は、ＶＬＰにより含まれる宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸の量を指し、典型的に及び好ましくはＶＬＰの１ｍｇにつき、３０ｍｇ未満、好ましくは２０ｍｇ未満、より好ましくは１０ｍｇ未満、更により好ましくは８ｍｇ未満であり、更により好ましくは６ｍｇ、更に好ましくは４ｍｇ未満であり、最も好ましくは２ｍｇ未満である。最も好ましくは、前記ＶＬＰおよび／または本発明の前記組成物に含まれる宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸は、検出限界の下にある。前述の記載において使われているように、宿主はＶＬＰが組換えにより産生される宿主を指し、前記宿主は、典型的に及び好ましくは、大腸菌である。ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を決定する従来法は、当業者に知られている。本発明に係る、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を決定する典型的及び好適な方法は、ＷＯ２００６／０３７７８７Ａ２の実施例１７に記載されている。同一、類似または相似の条件が、典型的に及び好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰを含む本発明の組成物のために、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量の測定のために使われる。最終的に必要とされる条件の変更は、当業者の知識の範囲内である。決定される量の数値は、典型的に及び好ましくは、示された値の±１０％の偏差、好ましくは±５％の偏差を有する値を含むものとして理解されるべきである。
【０１０９】
宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸：「宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸」なる用語は、もともと宿主によって合成されたＲＮＡまたは好ましくは核酸を指す。しかしながら、ＲＮＡ、好ましくは核酸は、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を減らすか又は除去する手順において、化学的および／または物理的変化を被る可能性があり、典型的に及び好ましくは本発明の方法により、例えば、ＲＮＡ、好ましくは核酸のサイズが短く成る可能性やその二次構造が変えられる可能性がある。宿主ＲＮＡまたは核酸なる用語はこれらの分解生成物を含む。
【０１１０】
宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸の量の減少させること又は除去することは、不必要なＴ細胞応答（例えば炎症性Ｔ細胞応答及び細胞障害性Ｔ細胞応答）と他の不必要な副作用を（例えば発熱）を最小限に抑えるかまたは減らし、その一方で抗原に対して強い抗体反応を維持する。
【０１１１】
一態様では、本発明は、本発明の組成物を産生する方法に関し、前記方法は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＶＬＰを提供すること；（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有するＮＧＦ抗原を提供すること、及び（ｃ）組成物を産生するために前記ＶＬＰと前記ＮＧＦ抗原を結合する工程を含み、前記ＮＧＦ抗原と前記ＶＬＰは、第１の付着部位および第２の付着部位で連結される。別の好ましい実施形態では、少なくとも一つの第１の付着部位を有する前記ＶＬＰを提供する工程は、更に（ａ）前記ウイルス様粒子、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの前記ウイルス様粒子を、前記コートタンパク質、その変異体またはその断片に分解すること、（ｂ）前記コートタンパク質、その変異体またはその断片を精製すること；（ｃ）前記精製されたコートタンパク質、その変異体またはその断片をウイルス様粒子に再組立てする工程を含み、好ましくは前記ウイルス様粒子は、宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まない。なお更に好ましい実施態様において、前記精製されたコートタンパク質を再組立てすることは、少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子の存在下で遂行される。少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子の存在下で、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質を再組立てする方法は、例えば、ＷＯ２００６／０３７７８７Ａ２において開示される。
【０１１２】
ある態様では、本発明は、本発明の組成物を含むワクチンの組成物を提供する。
【０１１３】
更なる態様において、本発明はワクチンの組成物を提供し、前記ワクチンの組成物は、本発明の組成物の何れか一つの治療的有効量を含むかまたはそれから成る。
【０１１４】
更に好ましい実施例では前記ワクチンの組成物は、少なくとも一つのアジュバントを含む。少なくとも１つのアジュバントの投与は、本発明の組成物の投与の前、同時にまたは後に生じる。本願明細書において使用する「アジュバント」なる用語は、宿主のデポーの生成を可能にする免疫応答または免疫物質の非特異的刺激因子を指し、本発明のワクチン組成物及び医薬組成物とそれぞれ組合わせた場合、より増強された免疫応答を提供することができる。少なくとも一つのアジュバントの実施態様は、完全及び不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、アルミニウム塩類及び修飾されたムラミルジペプチドを含むか、好ましくはそれから成る。更なるアジュバントは、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、例えばリゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール及びＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコルネバクテリウム・パルバムのような役立つ可能性があるヒトアジュバントである。このようなアジュバントも、また公知技術である。本発明の組成物と共に投与されることができる更なるアジュバントは、一リン酸化脂質免疫修飾物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩類（ミョウバン）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４とＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術を含むが、これに限定されるものではない。なお更なるアジュバントは免疫賦活性核酸、好ましくは、主鎖に１又は複数の修飾、好ましくはホスホロチオネート修飾を含む免疫賦活性核酸を含む。修飾は分解に対して核酸を安定させるためである。
【０１１５】
他の好ましい実施形態において、ワクチンの組成物はアジュバントを欠く。アジュバントの非存在下でさえ、本発明の有利な特徴は、組成物の高い免疫原性である。したがって、患者へのワクチンの組成物の投与は、好ましくはワクチンの組成物の投与の前、同時又は後に、同じ患者に少なくとも一つのアジュバントを投与せずに起こる。ＶＬＰは一般にアジュバントとして記載されていた。しかしながら、本出願の記載で使われる場合は「アジュバント」なる用語は、ＶＬＰではなく、むしろ前記ＶＬＰに付け加えて本発明のために使用するアジュバントを指す。
【０１１６】
本発明のワクチン組成物は、その投与が受容個体によって許容されることができる場合、「薬学的に許容可能である」と言われている。更に、本発明のワクチン組成物は、「治療上の有効量」、すなわち所望の生理作用を産生する量において投与される。本発明において、所望の生理作用は、典型的に及び好ましくは、疼痛の抑制または縮小である。
【０１１７】
ある態様では、本発明は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体と共に本発明の組成物またはワクチン組成物を含む。好ましい実施態様において、前記医薬組成物は、本発明の組成物の治療上の有効量を含む。組成物またはワクチンの組成物が個体に投与される場合、それは塩類、バッファー、アジュバントまたはコンジュゲートの効果を改良するために所望の他の物質を含む形態であってもよい。医薬組成物の調製ために使用する適切な物質の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990))を含む数多くの出典に提供されている。医薬組成物の更なる成分は、無菌水性（例えば、生理食塩水）か非水溶媒及び懸濁液とを含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。担体または密封包帯は、皮膚透過性を増大してと抗原吸収を改良するために用いることができる。
【０１１８】
本発明は、好ましくはＮＧＦ抗原に対する免疫化の方法を更に開示し、前記方法は、動物に、好ましくはヒトに、組成物、ワクチンの組成物または医薬組成物を投与することを含む。動物は、好ましくは哺乳類、例えばマウス、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマと特にヒトである。組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、前記動物に、好ましくはヒトに、従来技術の様々な方法によって、投与されることができる。典型的に及び好ましくは、組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、注射、注入、吸入または経口投与によって、前記動物に、好ましくは前記ヒトに投与される。更に好ましくは、組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、筋肉内に、静脈内に、経粘膜的に、経皮的に、鼻腔内に、腹膜内にまたは皮下に投与される。
【０１１９】
一態様では、本発明は、疼痛を予防するか、又は特に治療するための方法を提供し、前記方法は、前記組成物、前記ワクチン組成物または前記医薬組成物を、動物に、好ましくはヒトに投与することを含み、典型的に及び好ましくは、前記動物、好ましくは前記ヒトは、疼痛に苦しんでいる。好ましい一実施形態において、前記疼痛は、侵害受容性疼痛である。非常に好適な実施態様において、前記疼痛は、慢性的な炎症性疼痛である。更に好ましい実施態様において、疼痛は、骨関節炎疼痛、リウマチ様関節炎疼痛、癌性疼痛、内臓痛、慢性的な腰痛症及び慢性的な頭痛、または慢性的な頭痛、膵臓炎痛、膀胱炎痛または前立腺炎痛を含む。非常に好適な実施態様において、前記疼痛は、骨癌性疼痛である。好ましい一実施形態において、疼痛は、損傷によって生じる。
【０１２０】
好ましい一実施形態において、前記疼痛は、例えば、損傷による神経圧縮／神経外傷によって、帯状疱疹後神経痛のような神経細胞の感染によって生じることがある、脳卒中または変性神経疾患または幻想肢痛のような神経細胞の損害につながっている状態の神経障害疼痛である。
【０１２１】
本発明の更なる態様は前記組成物の、前記ワクチン組成物のまたは前記医薬品組成物の医薬としての使用である。
【０１２２】
別の態様において、本発明は、動物、好ましくはヒトの疼痛の治療のための医薬の製造のための、前記組成物のまたは前記ワクチン組成物の使用を提供し、好ましくは前記疼痛は、侵害受容性疼痛または神経障害疼痛である。非常に好適な実施態様において、前記疼痛は、慢性的な炎症性疼痛である。更なる好ましい実施態様において、前記疼痛は、骨関節炎疼痛、リウマチ様関節炎疼痛、癌性疼痛、内臓痛、慢性的な腰痛症及び慢性的な頭痛、または慢性的な頭痛、膵臓炎痛、膀胱炎痛または前立腺炎痛を含む。非常に好適な実施態様において、前記疼痛は、骨癌性疼痛である。好ましい一実施形態において、疼痛は、損傷によって生じる。
【０１２３】
別の態様において、本発明は、動物の、好ましくはヒトの疼痛の治療のための本願明細書において記載の組成物、ワクチン組成物または医薬組成物を提供し、更に好ましくは前記組成物、前記ワクチン組成物または前記医薬組成物は、前記動物に、好ましくは前記ヒトに投与されることになっており、なお更に好ましくは前記疼痛は侵害受容性疼痛または神経障害疼痛である。
【０１２４】
ある実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＶＬＰがＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰであり、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦタンパク質とリンカーを含み、好ましくは前記ＮＧＦタンパク質は、配列番号２２から成り、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記第１の付着部位はバクテリオファージＱβの前記ＶＬＰのリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位は前記リンカーを含み、前記リンカーはペプチド結合によって前記ＮＧＦタンパク質に融合し、前記第２の付着部位はシステインのスルフヒドリル基であり；好ましくは前記第１の付着部位と前記第２の付着部位は、ヘテロ二官能性架橋剤で、好ましくはＳＭＰＨによって連結されるものを含むか、本質的にそれから成るか、又は好ましくはそれから成る。
【０１２５】
ある実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）、前記ＶＬＰはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰであり、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ断片とリンカーを含み、好ましくは前記ＮＧＦ断片は配列番号４４から成り、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記第１の付着部位はバクテリオファージＱβの前記ＶＬＰのリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位は前記リンカーを含み、前記リンカーはペプチド結合によって前記ＮＧＦタンパク質に融合し、前記第２の付着部位はシステインのスルフヒドリル基であり；好ましくは前記第１の付着部位と前記第２の付着部位は、ヘテロ二官能性架橋剤で、好ましくはＳＭＰＨによって連結されるものを含むか、本質的にそれから成るか、又は好ましくはそれから成る。
【０１２６】
ある実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＶＬＰはＲＮＡ−バクテリオファージＱβであり、及び（ｂ） 少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ突然変異タンパク質とリンカーを含み、好ましくは前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、配列番号４５から７５の何れか一つから成り；（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記第１の付着部位はバクテリオファージＱβの前記ＶＬＰのリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位は前記リンカーを含み、前記リンカーはペプチド結合によって前記ＮＧＦタンパク質に融合し、前記第２の付着部位はシステインのスルフヒドリル基であり；好ましくは前記第１の付着部位と前記第２の付着部位は、ヘテロ二官能性架橋剤で、好ましくはＳＭＰＨによって連結されるものを含むか、本質的にそれから成るか、又は好ましくはそれから成る。
【０１２７】
ある実施形態において、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＶＬＰは、配列番号１を含むかまたは好ましくはそれから成り、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原とリンカーとを含み、前記ＮＧＦ抗原は、（ｉ）ＮＧＦタンパク質、好ましくは配列番号２２；（ｉｉ）ＮＧＦ断片、好ましくは配列番号４４；及び（ｉｉｉ）ＮＧＦ突然変異タンパク質、好ましくは配列番号４５から７５の何れか一つ；から成るグループから選択され、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記第１の付着部位は配列番号１の前記ＶＬＰのリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位は前記リンカーを含み、前記リンカーはペプチド結合によって前記ＮＧＦタンパク質に融合し、前記第２の付着部位はシステインのスルフヒドリル基であり；好ましくは前記第１の付着部位と前記第２の付着部位は、ヘテロ二官能性架橋剤で、好ましくはＳＭＰＨによって連結されるものを含むか、本質的にそれから成るか、又は好ましくはそれから成る。
【０１２８】
ある実施態様において、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＶＬＰはＲＮＡ−バクテリオファージＱβであり、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原とリンカーとを含み、前記ＮＧＦ抗原は、（ｉ）ＮＧＦタンパク質、好ましくは配列番号２２；（ｉｉ）ＮＧＦ断片、好ましくは配列番号４４；及び（ｉｉｉ）ＮＧＦ突然変異タンパク質、好ましくは配列番号４５から７５何れか一つ；から成るグループから選択され；（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記第１の付着部位はバクテリオファージＱβの前記ＶＬＰのリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位は前記リンカーを含み、前記リンカーはペプチド結合によって前記ＮＧＦタンパク質に融合し、前記第２の付着部位はシステインのスルフヒドリル基であり；好ましくは前記第１の付着部位と前記第２の付着部位は、ヘテロ二官能性架橋剤で、好ましくはＳＭＰＨによって連結され、更に前記組成物は、少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子を含み、前記ポリアニオン性巨大分子は前記ＶＬＰにパッケージ化され、好ましくは前記ポリアニオン性巨大分子はポリグルタミン酸であるものを含むか、本質的にそれから成るか、又は好ましくはそれから成る。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】免疫マウスの精製されたトータルＩｇＧによるｍＮＧＦのインビトロ中和。ｍＮＧＦβに応答するＴＦ−１細胞の増殖は、ＢｒｄＵ取込みを介して測定された。Ｑβ免疫化動物の１０μｇ／ｍｌのトータルＩｇＧの存在下において、１０ｎｇの／ｍｌのｍＮＧＦβに応答する増殖は１００％とセットされ、他の全ての状態に応答するＴＦ−１増殖は、その値に関して算出した。円は、Ｑβ免疫化動物のＩｇＧ２と共にプレインキュベーションした後に由来する値を表わし、正方形はＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ−免疫化動物からのＩｇＧと共にプレインキュベーションした後に由来する値を表わす。三組の平均＋／−ＳＤを示す。
【図２】臨床スコアの発現とＣＩＡマウスの平均体重。マウスは日０、１０及び２０において免疫化され、ＣＩＡは日２７及び４８において誘導された。Ａ）Ｑβ（黒四角）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの臨床関節炎スコア。値は、マウスにつき全ての四肢のスコアの平均及びグループ（ｎ＝８）＋／−ＳＥＭとして示す。Ｂ）Ｑβ（黒四角）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの平均体重。値は平均体重（ｎ＝８）＋／−ＳＥＭとして示す。
【図３】ザイモサンＡで誘発された炎症性疼痛における熱過敏性及び機械的異痛症。マウスは日０、１０及び２０において免疫化され、炎症性疼痛は日３１に左後足へのザイモサンＡの注射によって誘導された。Ａ）足撤回時間として測定された、Ｑβ（黒四角）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの熱過敏性。値は平均（ｎ＝４）＋／−ＳＥＭとして与えられる。Ｂ）足撤回を引き起こす加圧力として測定された、Ｑβ（黒四角）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの機械的異痛症。値は平均（ｎ＝４）＋／−ＳＥＭとして与えられる。
【図４】Ｑβ−（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ免疫化マウスにおいて、ザイモサンＡで誘発された炎症性疼痛における熱過敏性及び機械的異痛症。マウスは日０、１４、２８及び４２で免疫化され、炎症性疼痛はザイモサンＡの左後足への注入によって日６２に誘発された。Ａ）足撤回時間として測定された、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）（黒四角）、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（黒三角）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの機械的異痛症。値は平均（ｎ＝４）＋／−ＳＥＭとして与えられる。Ｂ）足撤回を引き起こす加圧力として測定された、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）（黒四角）、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（灰色丸）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの機械的異痛症。値は平均（ｎ＝４）＋／−ＳＥＭとして与えられる。
【実施例】
【０１３０】
実施例１
ｍｐｒｏＮＧＦβｃＤＮＡの原核生物の発現ベクターへのクローニング
マウスｐｒｏＮＧＦβは、マウスの胎児性脳組織のｃＤＮＡライブラリから以下のプライマーを使用してＰＣＲによって増幅された：Ｎｄｅ−ｐｒｏＮＧＦ−Ｆ（配列番号２６）及びｐｒｏＮＧＦ−Ｘｈｏ−Ｒ（配列番号２７）。ＰＣＲ産物は、ＮｄｅＩとＸｈｏＩによって消化されて、ｐＭ−Ｈｉｓ−ＧＧＣベクターにライげーションされた。結果として生じるプラスミドはｐＭ−ｐｒｏＮＧＦ−ＨｉｓＧＧＣという名前をつけられ、それはマウスＮＧＦβ、Ｈｉｓ６タグおよびＣ末端に２つのグリシン続いてシステインを含むリンカーを含む融合タンパク質をコードする。
【０１３１】
実施例２
ｐＣＢ２８＿ｐｒｏＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ真核生物の発現ベクターの構築
ｍｐｒｏＮＧＦβ配列は、ｐＭ−ｐｒｏＮＧＦ−ＨｉｓＧＧＣベクターから、以下の２つのプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された：ｍｐｒｏＮＧＦｅｕｋ＿ｖａｒ１＿ｆ（配列番号２８）及びｍｐｒｏＮＧＦｅｕｋ＿ｖａｒ１＿ｒ（配列番号２９）。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン）にライゲーションされた。ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターはＰａｃＩとＸｈｏＩによって消化され、結果として生じるｍｐｒｏＮＧＦβ−ＨｉｓＧＧＣ断片はｐＣＢ２８ベクターにライげーションされる。結果として生じるプラスミドは、ｐＣＢ２８＿ｍｐｒｏＮＧＦ＿Ｈｉｓ＿Ｃという名前をつけられ、ｍｐｒｏＮＧＦβ配列、Ｈｉｓ６タグ及びＣ末端に２つのグリシン続いてシステインを含むリンカーが続くｐＳＥＣＴａｇ２／ＨｙｇｒｏＡ，Ｂ，Ｃベクター（インビトロゲン）に由来したγイムノグロブリンのカッパ軽鎖に由来するシグナル配列をコードする。
【０１３２】
実施例３
２９３Ｔ ＨＥＫ細胞のｐＣＢ２８−ｐｒｏＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの発現
ピューロマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＢ２８＿ｐｒｏＮＧＦ＿Ｈｉｓ＿Ｃ発現ベクターの１μｇは、２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロゲン）と７．５μｌのリポフェクタミン２０００（インビトロゲン）と混合されて、１．５＊１０６のＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションさせた。４時間後に、細胞に、１０％のＦＣＳと１％の非必須アミノ酸（インビトロゲン）を含むＤ−ＭＥＭ培地を再供給した。２４時間後、１ｍｇ／ｌのピューロマイシン（インビトロゲン）は、ピューロマイシン耐性の選択を可能にするために、培地に加えられた。ピューロマイシン耐性細胞は、１０ｍｇ／ｌの還元型グルタチオン（Ｆｌｕｋａ）、１６１ｍｇ／ｌのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｆｌｕｋａ）１％の非必須アミノ酸、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロゲン）及び１ｍｇ／ｌのピューロマイシンを含むＦＣＳ−なしのＤ−ＭＥＭ培地のポリ‐Ｌ‐リジン被覆ローラーボトルにおいて増殖させた。
【０１３３】
ピューロマイシン耐性細胞の上清は収集されて、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター装置（ミリポア）によって濃縮されて、還元条件下で１２％のＮＵＰＡＧＥビス／トリス・ゲル（インビトロゲン）上で泳動した。ＮＧＦの発現は、抗ペンタ・ヒスチジン−特異的抗体（キアゲン）を使用するイムノブロット分析によって視覚化された。発現は、Ｈｉｓタグとリンカー（配列番号３０）を含む、期待サイズ１４．７ｋＤａの成熟ｍＮＧＦβに対応する約１５ｋＤａのバンドの視覚化によって証明された。ｍｐｒｏＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から上清中に放出された成熟ｍＮＧＦβ−ＨｉｓＧＧＣの正しい処理は、エドマン分解によって確認され、ＳＳＴＨＰを成熟ｍＮＧＦβの５つのＮ末端基アミノ酸として明らかにした。これは、成熟したｍＮＧＦβの５つの期待されるアミノ酸に対応し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞によるｍｐｒｏＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣへの処理と正しい発現を確認した。
【０１３４】
実施例４
ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの精製
ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣは、Ｎｉ２＋−親和性精製によりＨＥＫ２９３Ｔの上清から精製された。簡潔に、上清は１／１０量のニッケル−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）結合バッファー（５００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのイミダゾール、１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８）を添加され、それからカラムに詰められた平衡化Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズ（キアゲン）にペリスタル型ポンプを使用して４℃で１６時間カラムに注入された。結合後、カラムはＡＥＫＴＡ清浄器ＦＰＬＣシステムに接続され、Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズは非特異的に結合した不純物の量を減らすために洗浄バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８）の４カラム体積によって洗われた。続いて、ｍＮＧＦβは、２カラム体積の洗浄から溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８）の勾配によって溶出させられた。溶出したタンパク質は、精製の品質を点検するために、還元条件下、１２％のＮＵＰＡＧＥビス／トリス・ゲル上で泳動した。非常に純粋なｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣが、このような方法で引き出される場合があり、実施例７にて説明したようにＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの更なる発現のために使われた。
【０１３５】
実施例５
モノクローナル抗体によるｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの認識
天然タグと比較してｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣとマウスの顎下腺から精製されるリンカーなしのｍＮＧＦβの結合性は、捕獲のためのモノクローナル抗ＮＧＦβ抗体（ケミコン・インターナショナル）及び検出のためのポリクローナル・ヒツジ抗ｍＮＧＦβ抗体（ケミコン・インターナショナル）を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定された。簡潔には、モノクローナル抗ｍＮＧＦβ抗体は、カーボネイト・バッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）に０．８５μｇ／ｍｌに希釈し、マイクロタイタウェル上に４℃でオーバーナイトで被覆した。次に、プレートはＰＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄され、その後３７℃で２時間、２％のＢＳＡのＰＢＳ−Ｔ溶液によってブロックされた。次に、プレートは０．２から２００ｎｇ／ｍｌのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの濃度増加と共に室温で２時間暖められ、顎下腺から分離されたｍＮＧＦβは１％ＢＳＡのＰＢＳ−Ｔ溶液に希釈した。次に、プレートは、ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄されて、室温で１時間１０ｍｇ／ｍｌのヒツジ抗ｍＮＧＦβ抗体と共にインキュベートされた。ＰＢＳ−Ｔによる６回の洗浄後、プレートは、６０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ抱合型ウサギ抗ヒツジ抗体（ケミコン・インターナショナル）と共に室温で３０分間暖められた。ＰＢＳ−Ｔによる６回の最終的な洗浄工程の後、酵素反応は、１０ｍｇのＯＰＤ基質（Ｆｌｕｋａ）及び８μｌのＨ２Ｏ２（３０％）の２５ｍｌのクエン酸バッファー（６６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭのクエン酸、ｐＨ５）溶液からなる１００ｍｌの溶液を全てのウェルに加えることによって開始した。呈色反応は５％のＨ２ＳＯ４で停止され、吸光度はＥＬＩＳＡ読取り器（バイオラド）を使用して４５０ｎｍで測定された。ＥＬＩＳＡは、両方ともに組換えにより発現されたｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣとｍＮＧＦβの等しい認識を明らかにし、これはｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣは正しく発現され、正しい三次元構造に折り畳まれたことを示す。
【０１３６】
実施例６
ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの生理活性
ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの生理活性は、他（Ｒ＆Ｄ ＮＧＦβ産物シート）に記載されているように、ｍＮＧＦβ反応性因子依存性ヒト赤白血病ＴＦ−１細胞株（ＡＴＣＣ）を、読出し装置として使用して、インビトロ細胞増殖アッセイにおいて試験した。簡潔には、１０４のＴＦ−１細胞は、９６ウェルの平底プレートのウェルにつき、１００μｌのＤＭＥＭ培地（１０％のＦＣＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のＧｌｕｔａｍａｘで補充された）にまかれた。０．８から１００ｎｇ／ｍｌに増大する濃度のマウスの顎下腺から精製されたｍＮＧＦβ−ＨｉｓＧＧＣまたはｍＮＧＦβは、細胞に加えられた。４８時間後、細胞はＢｒｄＵ標識試薬（ロシュ・ダイアグノスティク）により、増殖細胞に組み込まれるために、標識された。２４時間後に、細胞は固定され、続いてペルオキシダーゼ抱合型抗−ＢｒｄＵモノクローナル抗体（ロシュ・ダイアグノスティク）と共にインキュベートされた。十分な洗浄後、１００μｌのテトラベンジル−ベンジジン基質溶液を各ウェルに与えた。呈色反応は５％のＨ２ＳＯ４で停止され、吸光度はＥＬＩＳＡ読取り器（バイオラド）を使用して４５０ｎｍで測定された。顎下腺からのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣとｍＮＧＦβは同じように増殖を刺激し、これはｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣが生物学的に活性であることを示した。
【０１３７】
実施例７
Ｑβ−ＶＬＰへのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの結合
Ｑβ−ＶＬＰ（２ｍｇ／ｍｌ）は、５倍のモル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノネート（ＳＭＰＨ，Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、室温で３０分間、反応させた。ＳＭＰＨは、ジメチルスルホキシド中に溶解された５０ｍＭストックから取り出された。反応生成物は、１０ｋＤａの分子量カットオフ（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ， Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、結合バッファー（２０ｍＭのＭＥ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン、ｐＨ６）に対して２回透析された。透析は、室温で行われた。このような方法で誘導体化されるＱβ−ＶＬＰが、次に標的タンパク質に結合させるために使われた。
【０１３８】
結合前に、実施例４に記載の通りに得られた精製されたｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣは、結合バッファー中に透析され、５モル過剰量のＴＣＥＰと共に室温（ＲＴ）で１時間、還元された。還元されたｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）は、４℃で４時間１００μｌの総容積で誘導体化されたＱβ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）と共に暖められた。反応の完了後、反応チューブは、ありうる沈殿を取り除くために遠心分離機にかけられた。結合反応は還元条件下で１２％のＮｕＰＡＧＥビス／トリス・ゲル上で結合産物を泳動することによって分析され、抗−ペンタＨｉｓ抗体によりイムノブロット分析し、Ｑβ−ＶＬＰへのｍＮＧＦβの有効な結合を明らかにした。タンパク質濃度はブラッドフォードで測定された。
【０１３９】
実施例８
Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの免疫原性
雄のＤＢＡ／１マウスは、アジュバントの非存在下で日０、日１０と日２０において、実施例７から得られるｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣに結合する５０μｇのＱβ ＶＬＰによって、皮下に免疫化された。ネガティブコントロールのマウスはＱβ−ＶＬＰだけによって免疫化された。日１０、２０と３０に血液は採取された。血清は、血清管（Ｍｉｒｏｔａｉｎｅｒ、ＢＤバイオサイエンス）の血液サンプルを１０分間、１０．０００ｇで遠心させることによって調製された。血清試料のｍＮＧＦβ−特異的抗体の検出は、コーティングに、マウスの顎下腺から精製される、タグ及びリンカー無しのｍＮＧＦβを使用してＥＬＩＳＡによって行われた。簡潔には、ｍＮＧＦβはカーボネイト・バッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）に２．５μｇ／ｍｌの濃度で希釈し、マイクロタイター・ウェル上に４℃で終夜、被覆した。次に、プレートはＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄され、その後３７℃で２時間、２％ＢＳＡのＰＢＳ−Ｔ溶液によってブロックされた。次に、プレートは、１：２００の開始希釈物から始めて３倍の希釈工程を使用して、ＰＢＳ−Ｔ ＋２％ＢＳＡに希釈した血清試料と共に室温で２時間インキュベートされた。次に、プレートは、ＰＢＳ−Ｔにより６回洗浄され、ペルオキシダーゼ抱合型ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories)の１：１０００希釈によって１時間室温でインキュベートされた。６回洗浄後、酵素反応は、全てのウェルに、１０ｍｇＯＰＤ基質及び８μｌのＨ２Ｏ２（３０％）の２５ｍｌのクエン酸バッファー（６６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭのクエン酸、ｐＨ５）溶液を加えることによって始まった。呈色反応は５％のＨ２ＳＯ４で停止され、吸光度はＥＬＩＳＡ読取り器（バイオラド）を使用して４５０ｎｍで測定された。ＥＬＩＳＡは、ｍＮＧＦβに対する強い自己抗体応答が上記の免疫化プロトコルを使用してＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって誘発される可能性があることを明らかにした。
【０１４０】
実施例９
Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって上昇する抗体の中和活性
Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによる免疫化によって上昇するインビトロでの抗体の中和活性は、実施例６に記載のように、インビトロ細胞増殖アッセイにおいて試験された。簡潔には、マウスは、実施例８に記載のように、Ｑβ又はＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって免疫化された。免疫化された動物の血清は収集されて、トータルＩｇＧ分画はタンパク質Ｇ精製によって血清から分離された。次に、ＱβまたはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ免疫マウスからの精製されたトータルＩｇＧの、ｍＮＧＦβの生理活性を中和するための能力は、ＴＦ−１細胞増殖アッセイで試験された。簡潔には、１０４のＴＦ−１細胞は、９６ウェルの平底プレートのウェルにつき、１００ｍｌのＤＭＥＭ培地（１０％のＦＣＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のＧｌｕｔａｍａｘで補充された）にまかれた。０．２から１００ｎｇ／ｍｌに増大する濃度の顎下腺から精製されたｍＮＧＦβは、室温で３０分間Ｑβ又はＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣと共に免疫化されたマウスの血清から精製されたトータルＩｇＧと共にプレインキュベートされ、次に細胞に加えられた。４８時間後、細胞はＢｒｄＵ標識試薬（ロシュ・ダイアグノスティク）により、増殖細胞に組み込まれるために、標識された。２４時間後に、細胞は固定され、続いてペルオキシダーゼ抱合型抗−ＢｒｄＵモノクローナル抗体（ロシュ・ダイアグノスティク）と共にインキュベートされた。十分な洗浄後、１００μｌのテトラベンジル−ベンジジン基質溶液を各ウェルに与えた。呈色反応は５％のＨ２ＳＯ４で停止され、吸光度はＥＬＩＳＡ読取り器（バイオラド）を使用して４５０ｎｍで測定された。Ｑβ免疫マウスから１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌのトータルＩｇＧと共にプレインキュベートされたｍＮＧＦβの増加濃度により刺激された細胞は、増殖の抑制を示さなかった。Ｑβ免疫マウスから１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌのトータルＩｇＧと共にプレインキュベートされたｍＮＧＦβの増加濃度により刺激された細胞は、一方でかなり減少した増殖速度を示し、Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（図１）による免疫化によって上昇した抗体のＮＧＦ中和活性を立証した。
【０１４１】
実施例１０
コラーゲンによって誘導された関節炎の悪液質の抑制におけるＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣワクチン接種の有効性
自己免疫関節炎の悪液質を減少するＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣワクチンの能力は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、いわゆるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）のマウスモデルにおいて評価された。このモデルにおいて、ＲＡは、完全フロイント・アジュバント（ＣＦＡ）のコラーゲン２型（MD Biosciences）の皮内注射によって、続いて２１日後に、不完全フロイント・アジュバント（ＩＦＡ）のコラーゲンＩＩ型の皮内注射によって、誘発された。炎症は絶え間なく進行して、減量を伴う強直と永続性の関節破壊に達する。雄のＤＢＡ／１マウス（ｎ＝８）は日−３５、日−２１及び日−７で５０μｇのＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって免疫化され、同様にネガティブコントロールのマウスはＱβだけで免疫化された。３回の免疫処置後、ＲＡは日０で誘発された。炎症進行は７−９週にわたって監視され、臨床スコアは以下の定義に従って各四肢に割り当てられた：０ 正常、１ 軽度の紅斑および／または趾／足の腫張、２ 完全な足／関節全体にひろがる紅斑と膨張、３ 強直を伴う足／関節の強い膨張、変形。図２Ａは、ＱβとＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ免疫動物の両方における関節炎の進行を示す。関節炎は、両群において非常に同じように進行した。同期間に、マウスの体重は、毎日測定され（図２Ｂ）、特にＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ免疫マウスの悪液質に関連する自己免疫の抑制を示す疾患の発症の後、両群間の平均体重に相当なずれを示した。
【０１４２】
実施例１１
マウスのザイモサンＡ誘導炎症性疼痛モデルの炎症性疼痛の抑制におけるＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣワクチン接種の有効性
雄のＢＬ／６マウスの後足の足底側へのイースト抽出物ザイモサンＡ（シグマ）の注入によって生じる熱的及び機械的刺激に応答して、Ｑβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣワクチンの炎症性過敏症を減じる能力を以下のようにして評価した：雄のＢＬ／６マウス（ｎ＝４）は、５０μｇのＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ単独により、日０、１０及び２０に免疫化された。各時点で、両後足の足底部の熱過敏症は、熱的及び機械的刺激に応じて決定された。熱感受性の測定のために、所定の強度の熱源（赤外線ビーム）による刺激後の足撤回の待ち時間が測定された。待ち時間は、電子制御計測器（Plantartest、Ugo Basile)で測定された。無処置の動物で待ち時間がほぼ１６秒となるように、熱源の強度は調整された。各後足ごとに、６回の測定値が取られ、平均値を算出した。機械的感受性を測定するために、いわゆるフォン・フレイ・フィラメントによる刺激への反応が測定された。フォン・フレイ・フィラメントは、増大する圧力をマウス足の足底部に適用できる調整されたプラスチック・フィラメントである。電子制御計測器（IITC, Woodland Hills, USA)により、足撤回にを導いた加圧力が測定された。６回の測定は足ごとに行われ、平均値を計算された。日３１において、炎症性疼痛は、左後足の足底部に、ザイモサンＡの３ｍｇ／ｍｌ溶液を２０μｌ注入によって誘発された。ザイモサンＡ誘導の炎症が開始した直後に生じる熱的及び機械的刺激に応答する過敏症は、炎症性疼痛の誘導の２時間、４時間、６時間、８時間、１日、２日、３日、４日、及び７日後に、上記のように足撤回により測定された。図３に証明されたように、Ｑβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって免疫化された動物は、Ｑβだけによって免疫化される動物と比較して、熱的（図３Ａ）及び機械的刺激（図３Ｂ）の後でかなり減少した過敏症を示した。
【０１４３】
実施例１２
慢性的な収縮性損傷により誘導されたマウスの神経障害疼痛モデルにおける神経障害疼痛の抑制におけるＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの有効性
雄のＢＬ／６マウス（ｎ＝６）は、５０μｇのＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ単独により日０、１４及び２８に免疫化される。実施例１１に記載のように、各時点で、両後足の足底部の熱過敏症は、熱的及び機械的刺激への応答で測定された。日４２に、慢性的収縮損傷（ＣＣＩ）は、座骨神経を結さつするか又はそれを影響を受けないままにすることによって誘発される（見かけ作動した対照群）。座骨神経の結さつ術によって、各四肢の過敏症が生じ、それは１４日以内に発現し、消えるまで別に２−３週間持続する。ＣＣＩは、神経障害疼痛の確立された齧歯類モデルである。ＣＣＩ手術後、熱的及び機械的刺激に応答する感受性は、実施例１１にて説明したように、一日おきに測定される。
【０１４４】
実施例１３
ヒトＮＧＦβのクローニング、発現、精製及びＱβ−ＶＬＰに対する結合
ヒトｐｒｏＮＧＦβはＰＣＲによってヒト胎児性脳組織ｃＤＮＡライブラリーから増幅され、ＰＣＲ産物はｐＣＢ２８発現ベクターにライゲーションされる。結果として生じるプラスミドは、ｐＣＢ２８＿ｈｕｐｒｏＮＧＦ＿Ｈｉｓ＿Ｃという名前をつけられ、ガンマイムノグロブリンのカッパ軽鎖に由来するシグナル配列、続いてｈｕｐｒｏＮＧＦβ配列、Ｈｉｓ６タグ及びＣ末端で２つのグリシンに続いてシステインを含むリンカーをコードする。真核生物発現ベクターｐＣＢ２８＿ｈｕｐｒｏＮＧＦ＿Ｈｉｓ＿Ｃは実施例３に記載のように、基本的にＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、実施例４に記載のように、成熟ｈｕＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣを含む上清は基本的にＮｉ−ＮＴＡによって精製のために収集される。精製されたタンパク質は、配列番号３１に記載の配列を有する。精製されたｈｕＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣは、実施例７に記載のプロトコルに従って、ＳＭＰＨ誘導体化されたＱβ−ＶＬＰに結合する。
【０１４５】
実施例１４
ポリアニオン性巨大分子ポリグルタミン酸を含むＱβ粒子に結合するｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによるワクチン接種の有効性
ポリアニオン性巨大分子ポリグルタミン酸を含むＱβ粒子（以後Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）と呼ぶ）は、ＷＯ０６／０３７７８７の実施例４に説明の通りに生成された。実施例７に先に記載したように、ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣはＱβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）に結合された。Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの免疫原性は、以下のようにして決定された：雌のＢＬ６マウス（グループにつきｎ＝４）は、アジュバントとして０．３３％のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌと混合されたＱβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣのいずれか５０ｕｇにより日０、１４、２８および４２に皮下に免疫化された。日０、１４、２８、４２及び５６に、採血された。血清は調製され、ｍＮＧＦβ−特異的抗体が実施例８に記載のようにＥＬＩＳＡによって決定された。Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによる免疫化によって誘導される抗ｍＮＧＦβ−特異的抗体のタイターは、Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって誘導されるものより有意に低く、減少したＩｇＧ２ａであるが高いＩｇＧ１抗体価により示されるようにＴｈ２ ＩｇＧアイソタイプ・パターンを示した。
表１：Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによる免疫化後のｍＮＧＦ−特異的抗体の誘導。マウスは、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣにより日０、１４、２８及び４２で免疫化された。血液は日０、１４、２８、４２及び５６に採血され、血清は生成された、血清試料のｍＮＧＦ特異的トータルＩｇＧ、ＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ２ａアイソタイプのタイターはＥＬＩＳＡによって分析された。
【０１４６】
Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣにより免疫化によって誘発される抗−ｍＮＧＦβ特異的自己抗体の、ザイモサンＡ誘導化炎症性疼痛モデルにおいて侵害受容性疼痛を抑制する能力は、以下のようにして評価した：雌のＢＬ６マウス（グループにつきｎ＝４）は、アジュバントとして０．３３％のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌと混合されたＱβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣのいずれか５０μｇにより日０、１４、２８および４２に皮下に免疫化された。日６２に、炎症性疼痛は、左後足の足底側に、ザイモサンＡの３ｍｇ／ｍｌ溶液を２０ｍｌ注入することによって誘導された。過敏症を減らすワクチンの能力は、実施例１１に説明したように、熱的及び機械的刺激に応じて評価された。図４に示したように、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによりワクチン接種によって誘導される抗−ｍＮＧＦβ自己抗体レベルは、熱的及び機械的刺激後に過敏症を減らすのに十分だった。減少は、Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによる免疫化後に観察されたものと類似していた。
【０１４７】
実施例１５
Ｑβ−ｍＮＧＦｂ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによる神経障害疼痛の抑制；ラットのタキソール誘発性神経障害疼痛モデルの有効性
成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、５００μｇのＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ単独により日０、１４及び２８に免疫化される。日３５に、神経障害疼痛は、一日おきに（３５、３７、３９、４１）２ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルの４回の腹こう内投与によって誘発される。ｐａｌｉｔａｘｅｌの最後の注射３日後に開始し、４週間連続で続けて、、変化した痛覚感受性の試験は、実施例１１でマウスについて記載されているように基本的に後足の足底の表面上に、熱的痛覚過敏と機械的異痛症を測定することによって一日おきに行われる。
【０１４８】
実施例１６
Ｑβ−ＶＬＰに結合する抗原候補としてのＮＧＦ突然変異タンパク質の評価
上記の配列修飾を有するＮＧＦ突然変異タンパク質（配列番号４５から７５）は組換えにより発現されて、実施例１−４にて説明したように精製される。実施例４に記載されているように、産生された突然変異タンパク質の生理活性は基本的にインビトロ生理活性アッセイにおいて試験される。実施例７に記載されているように、インビトロ・アッセイにおいて低い生理活性を有する突然変異タンパク質から生理活性を有さない突然変異タンパク質は選択され、本質的にＱβ ＶＬＰと結合させた。実施例８及び９に記載されているように、Ｑβ−ＶＬＰに結合する突然変異タンパク質の免疫原性及び誘導された抗体の中和活性を測定する。Ｑβ−ＶＬＰに結合する場合、低い生理活性を有するか生理活性を有さないが、それでも中和抗体を誘導する突然変異タンパク質が、選択される。疼痛と悪液質を抑制する誘導された抗体のインビボ有効性は、実施例１０−１５にて説明したように、インビボモデルにおいて試験される。
【０１４９】
実施例１７
ＡＰ２０５ ＶＬＰに対するｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ及びＦｌａｇペプチド抗原の結合、及びＡＰ２０５ ＶＬＰに結合したｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによるマウスの免疫処置
Ａ．組換えＡＰ２０５ ＶＬＰへのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣペプチド及びＦｌａｇ ペプチドの結合
ペプチドｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（配列番号３１）及びＦｌａｇ（配列番号４３）は公知技術の方法に従って化学的に合成される。ＡＰ２０５ ＶＬＰ（配列番号１４）は発現して、ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００７５７２（７５−７９頁）の実施例１及び２に説明したように精製され、２０ｍＭのＨｅｐｅｓと１５０ｍＭのＮａＣｌのバッファー（ｐＨ７．４）（ＨＢＳバッファー）に再溶解した。再溶解されたＡＰ２０５ＶＬＰは、２ｍｇ／ｍｌブラッドフォード・アッセイで測定）の濃度で、２．８５ｍＭのＳＭＰＨ（ピアス）と、３０分間室温（ＲＴ）で反応させる。次に、反応混合物は、ＨＢＳバッファーに対して透析されて、５０ｍＭのＤＭＳＯストックから反応混合物に希釈した０．７１４ｍＭのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＦＬＡＧと反応させる。結合反応は、１５℃で２時間進行させたままにし、反応混合物は２×２時間、１０倍体積のＨＢＳに対して透析し、保存用アリコートは液体窒素で急速冷凍され、更なる使用までの−８０℃で保存する。アリコートは解凍され、ＡＰ２０５サブユニットに結合された抗原は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価され、タンパク質濃度は、ブラッドフォード・アッセイで測定される。架橋結合剤によるＡＰ２０５ ＶＬＰの誘導体化に応じて、架橋性によって産生される二量体、三量体、四量体、五量体及び六量体は、サブユニットの一量体形態に加えて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて検出される。
Ｂ．組換えＡＰ２０５ ＶＬＰに結合するｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣペプチドによるマウスの免疫化 免疫応答の解析及びＩｇＧサブタイプの決定
ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣペプチドに結合したＡＰ２０５ ＶＬＰは、日０と１４にマウス（各３匹）の皮下に注入される。各マウスはＰＢＳで２００μｌにまで希釈された１０μｇワクチンによって免疫化される。マウスは日２０に後眼窩から採血され、ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣペプチドに特異的な抗体のタイターは、ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣペプチドに対してＥＬＩＳＡで測定された。ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣは、化学架橋剤スルホ−ＳＰＤＰを使用してウシＲＮＡｓｅ Ａに結合する。ＥＬＩＳＡプレートは、１０μｇ／ｍｌの濃度で、結合したＲＮＡｓｅ調製物によりコートされる。プレートはブロックされて、次に連続的に希釈されたマウス血清によって暖められる。結合抗体は、それぞれのサブタイプごとに酵素により標識された抗マウスＩｇＧ抗体によって検出される。対照として、同じマウスの免疫化前の血清も試験される。
【０１５０】
実施例１８
ＡＰ２０５ＶＬＰに対するｍＮＧＦβ断片の融合及びＡＰ２０５ＶＬＰに融合したｍＮＧＦβ断片によるマウスの免疫処置
ｍＮＧＦβ１−１０ペプチドのＮ−またはＣ末端部に融合されたＡＰ２０５を含むコンストラクトは、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５４７２１の実施例１において開示される方法によって得られた。発現された融合タンパク質の精製の方法は、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５４７２１の実施例２にて開示したものと実質的に同じである。ＰＡＰ４０５及びｐＡＰ２８３のコンストラクトと配列は、それぞれＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５４７２１及びＷＯ２００４／００７５３８Ａ２に記載されている。成熟雌、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（グループに付き５匹）はｍＮＧＦβ １−１０ペプチドにＣ末端に融合されたＡＰ２０５によってワクチン接種された（配列番号４４）。５０μｇの透析されたワクチンは、２００μｌの量にＰＢＳに希釈されて、日０、１４、２８及び４２に皮下に注入された（腹側２箇所に１００μｌ）。ワクチンはアジュバントなしで投与された。対照として、マウスの１グループは、ＰＢＳと共に又はＡＰ２０５ ＶＬＰ単独で注入された。マウスは日０、１４、２８、４２、５６及び７０に、後眼窩から採血され、それらの血清はＥＬＩＳＡによって分析された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、公衆衛生学、免疫学、分子生物学及びウイルス学の分野である。本発明は、少なくとも一つの抗原に連結されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物であって、前記抗原はＮＧＦ抗原である、組成物を提供する。また、本発明は、組成物を製造する方法を提供する。本発明の組成物は、特に、慢性疼痛の治療のためのワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は、特に抗体反応における効率的な免疫応答を誘発する。
【技術背景】
【０００２】
神経成長因子（ＮＧＦ）（ＮＧＦβとしても知られている）は神経栄養因子であり、ＮＧＦの他に脳由来ニューロトロフィック因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３及びニューロトロフィン４／５から成るニューロトロフィンのファミリーの創立メンバーである(Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006))。全てのニューロトロフィンと同様に、ＮＧＦは約２７ｋＤａの前駆タンパク質として発現され、約１４ｋＤａの成熟形態に切断される(Edwards et al., J Biol Chem. 263(14): 6810-5(1988); Seidah et al., Biochem J. 314: 951-60 (1996))。この成熟形態は、２つの受容体、一般的な受容体ｐ７５NTR（低親和性により全てのニューロトロフィンと結合する）及び高親和性トロポミオシン受容体キナーゼＡ（ｔｒｋＡ）受容体に結合することによって、その生物学的機能を発揮する。ＴｒｋＡは、リガンド結合性に応じて二量体になる受容体チロシンキナーゼであり、異なるシグナル伝達経路を活性化する(Patapontian and Reichardt, Curr Opin Neurobiol. 11(3): 272-80 2001))。初期発生の間、ＮＧＦ−ｔｒｋＡ相互作用によって活性化されるこれらのシグナル伝達経路がアポトーシスを遮断し、侵害受容システムの感覚性ニューロンの生存及び神経伸長を促進する(Patel et al., Neuron 25(2): 345-57(2000))。出生後、これらのニューロンは生存のためのＮＧＦに対するその依存を緩めるが、ＮＧＦは出生後期の間も、侵害受容体上に重大な生物学的影響を発揮し続ける。それは神経伝達物質、受容体及び電位型イオンチャネルの発現を調整し、それにより侵害受容体の反応性を制御する。ＮＧＦの別の機能的に重要な作用は、一過性受容体電位・バニロイド１（ＴＲＰＶ１）の改良された反応性につながる翻訳後制御を通して、侵害受容体反応性を敏感にすることである(Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006))。
【０００３】
ＮＧＦは、成人の侵害受容体反応の調節におけるその役割に対して、動物とヒトの痛み感受の仲介に関与している。ＮＧＦのわずかな皮下注入又は筋肉内注入は、何日も続く痛みと圧痛を引き起こす(Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006))。ヒトにおいて、ＮＧＦ濃度と痛み強度との間の相関は、慢性前立腺炎(Miller et al., Urology, 2002. 59(4): 603-8 (2002))、間質性膀胱炎(Lowe et al., Br J Urol. 79(4): 572-7 (1997))及びその他のような痛みを伴う病状の多くにおいて、評価できるであろう。基本的に、２種類の痛みが識別されうる：侵害受容性疼痛と神経障害疼痛。侵害受容性疼痛が、例えば損傷または外科的な切開後に、炎症の経過で組織損害によって生じる侵害受容体の刺激から起こる一方で、神経障害疼痛は、例えば、神経圧縮または外傷の後、または感染症または感覚性ニューロンに影響を与える自己免疫病の後で神経系自体の病状から生じる。
【０００４】
炎症の間、ＮＧＦは、発痛性の炎症性メディエータとして働く。それは、ケラチノサイト、上皮細胞、平滑筋細胞及びシュワン細胞のような末梢において、多数の異なる細胞型によって、特にマストセル及びマクロファージによる炎症の間、産生される。ＮＧＦ濃度は、動物とヒトにおいて、炎症及び慢性疼痛のある状態の間、かなり上昇する。ＮＧＦの遮断は、齧歯動物の侵害受容性疼痛モデルの多数において、痛覚感受性をかなり減少させることが示された。例えば、それはＣＦＡの皮膚注入後、熱的及び機械的痛覚過敏を減少させ(Woolf et al., Br. J. Pharmacol. 121(3): 417-24 (1997)、とりわけ関節炎に関連する疼痛(Shelton et al., Pain 116(1-2): 8-16 (2005))及び骨肉腫性疼痛(Sevcik et al., Pain 115(1-2): 128-41(2005))を抑制した。神経障害疼痛におけるＮＧＦの役割は炎症性疼痛におけるものよりも確立されておらず、いくつかのグループは、また、齧歯動物の神経障害疼痛のモデルの抗−ＮＧＦ治療の成功を示した(Ramer et al., Neurosci. Lett. 251(1): 53-6 (1998), Ramer et al., Eur. J. Neurosci. 11(3): 837-46 (1999))。米国特許第５１４７２９４号は、痛みを治療するためのＮＧＦアンタゴニスト（その中ではＮＧＦモノクローム抗体）の使用を請求する。その後、慢性疼痛の治療のための、ＮＧＦに対するモノクローナル抗体の使用をクレームする数多くの特許が出願された。慢性疼痛は、ヨーロッパ及び米国の人口のほぼ２０％に影響を及ぼしている深刻な健康問題である。現在使われている治療により十分な救助を得られるのは、慢性疼痛で苦しんでいる患者の３０％未満である(Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006)。更には、慢性疼痛の治療に使用される既存の薬物（大部分はオピオイドと非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ））は、長期間摂取した場合、重大な副作用を伴う。
【発明の開示】
【０００５】
本願明細書において開示される新規な治療的ストラテジーは、ＮＧＦβに対する能動免疫に基づく。患者の免疫系によってＮＧＦ−中和抗体の産生を誘発する組成物が、開示される。能動免疫は、ＮＧＦβの永続的な中和に結果としてなりうるものであり、したがって１日の薬物摂取の要求を減らすことができる。我々は、現在、驚くべきことに、それぞれ少なくとも一つのＮＧＦ抗原を含む本発明の組成物とワクチンが、特定の抗体反応においてＮＧＦに対して高い抗体価を誘導する免疫応答を誘発することができることを見いだした。さらに驚くべきことに、それぞれ少なくとも一つのＮＧＦ抗原を含む本発明の組成物及びワクチンは、慢性疼痛のための動物モデルの痛みを減らすことができることを見いだした。従って、これは、免疫応答、特に本発明の組成物及びワクチンによってそれぞれ生成される抗体が、インビボでＮＧＦに特異的に結合し、その機能を中和して阻害することができることを示す。
【０００６】
そのため、本発明の一態様は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）；及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原を含む組成物であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原であり；（ａ）及び（ｂ）は、前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結される、組成物である。ＮＧＦβは、動物に投与された場合、望まれていない副作用に結果としてなる可能性がある生物学的活性を含む受容体リガンドである。従って、本発明は、前記ＮＧＦタンパク質がＮＧＦ突然変異タンパク質であり、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は減少した生物学的活性を含むか又は生物学的活性を含まないが、それでもＮＧＦβ中和抗体を誘発する能力を保持する組成物を提供する。したがって、本発明の好ましい実施形態において、前記ＮＧＦ抗原は、ＮＧＦ突然変異タンパク質である。
【０００７】
通常、非常に望ましくない副作用は、抗ＮＧＦβワクチンによるＴ細胞応答の誘導に関連する場合がある。しかしながら、本発明の組成物は、不必要なＴ細胞応答を除去するか又は低減すると共に、特定の状況において、ＮＧＦ抗原に対して強い抗体反応を誘発するために効率的に役立つ。好ましい実施態様において、本発明の組成物は、従って、少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子を更に含み、前記ポリアニオン性巨大分子は前記ＶＬＰにパッケージ化され、好ましくは前記ポリアニオン性巨大分子はポリアニオン性ポリペプチドであり、好ましくは前記ポリアニオン性ポリペプチドはポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸であり、最も好ましくはポリグルタミン酸である。
【０００８】
本発明の更なる態様は、本発明の組成物の治療上有効量を含むワクチンの組成物である。
【０００９】
本発明の更なる態様は、（ａ）本発明の組成物；及び（ｂ）薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。
【００１０】
本発明の更なる態様は、好ましくはＮＧＦβに対する免疫化の方法であり、前記方法は、動物に、好ましくはヒトに、本発明の組成物、本発明のワクチン組成物または本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【００１１】
本発明の更なる態様は、医薬としての使用するための、本発明の組成物、本発明のワクチン組成物または本発明の医薬組成物である。
【００１２】
本発明の更なる態様は、痛みの、好ましくは慢性疼痛の治療のための医薬の製造のための、本発明の組成物の使用または本発明のワクチン組成物の使用である。
【００１３】
本発明の更なる態様は、痛みの、好ましくは慢性疼痛の治療に用いられる、本発明の組成物または本発明のワクチン組成物または本発明の医薬組成物である。
【００１４】
本発明の更なる態様は、本発明の組成物を産生する方法であって、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＶＬＰを提供すること；（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つのＮＧＦ抗原を提供すること；及び（ｃ）前記組成物を産生するために前記ＶＬＰと前記ＮＧＦ抗原を結合することを含んで成り、前記ＮＧＦ抗原と前記ＶＬＰは、前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結される、方法である。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
他に定められない限り、本願明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が帰属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１６】
抗原：本明細書で用いる「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子により提示された場合、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により結合されることができる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で用いる場合、Ｔ細胞エピトープも含む。抗原はさらに、免疫系により認識されることができ、及び／又は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、これは、少なくとも特定の場合に、抗原がＴＨ細胞エピトープを含むか、又は結合していて、アジュバントと投与される必要がある場合がある。抗原は、１つ又は複数のエピトープ（ＢおよびＴエピトープ）を有することができる。上に記載した特異的反応は、抗原が、好ましくは、一般的に高度に選択的にその対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原により誘起される他の多数の抗体又はＴＣＲと反応しないことを示すことを意味する。抗原は、本明細書で用いる数種の抗原の混合物であってもよい。非常に好ましい実施態様において、抗原はＮＧＦ抗原である。
【００１７】
エピトープ：ここで使用される場合、「エピトープ」なる用語は、エピトープはＭＨＣ分子のＴ細胞レセプターにより又は抗体により免疫特異的に結合されうる、ポリペプチドの連続的又は非連続的部分を指す。免疫特異性結合性は、非特異的結合性を除外するが、交差反応性を必ずしも除外するというわけではない。エピトープは、典型的には、エピトープに特有である空間コンフォメーションに５−１０のアミノ酸を含む。
【００１８】
会合した：「会合した」（またはその名詞：会合）なる用語は、本願明細書において使用する場合、２分子が連結される全てのありうる方法、好ましくは化学相互作用をさす。化学相互作用は、共有結合及び非共有結合の相互作用を含む。非共有結合的相互作用の典型的な例は、イオン相互作用、疎水性相互作用または水素結合であり、共有結合的相互作用は、例えば、共有結合（例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素−リン結合、炭素−硫黄結合（例えばチオエーテル）またはイミド結合）に基づく。
【００１９】
付着部位、第１：本明細書で用いる「第１の付着部位」という句は、ＶＬＰに、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰに天然に存在する要素、又はＶＬＰに、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰに人工的に付加された要素であって、第２の付着部位に結合されうる要素をさす。第１付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジニル基のような化学反応基あるいはその組合せであってもよい。第１の付着部位である化学反応基の好ましい実施態様は、リジンのようなアミノ酸のアミノ基である。好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、リジン残基のアミノ基であって、好ましくは前記リジン残基は、前記ＶＬＰに、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの前記ＶＬＰに、天然に存在するリジン残基である。
【００２０】
第１の付着部位は、典型的には、ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰの表面上に、好ましくは外面上に位置する。多数の第１の付着部位は、ウイルス様粒子の、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰの表面上に、好ましくは外面上に典型的には存在し、好ましくは反復性の配置で存在する。好ましい実施態様において、第１の付着部位は、ＶＬＰに、少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合により会合する。更なる好ましい実施態様において、第１の付着部位は、ＶＬＰに天然に存在する。あるいは、他の好ましい実施形態において、第１の付着部位は、ＶＬＰに人工的に付加される。好ましい実施態様において、第１の付着部位は、前記ＶＬＰは、少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも一つのペプチド結合により会合し、前記ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰである。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、リジン残基のアミノ基であって、前記リジン残基は、コートタンパク質の、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質の、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質のリジン残基のアミノ基であって、好ましくは前記コートタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はそれから好ましくは成る。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、リジン残基であって、好ましくは前記リジン残基は、コートタンパク質の、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質の、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基である。
【００２１】
付着部位、第２：本明細書で用いる「第２の付着部位」という句は、ＮＧＦ抗原に天然に存在するか又は人工的に付加される要素であって、第１の付着部位が連結される要素をさす。ＮＧＦ抗原の第２の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）または化学反応基（例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジニル基またはその組合せ）であってもよい。第２の付着部位である化学反応基の好ましい実施態様は、スルフヒドリル基である。更なる好ましい実施態様において前記第２の付着部位がスルフヒドリル基であって、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基である。本願明細書において使用する場合、「少なくとも一つの第２の付着部位を有する抗原」なる用語及び交換可能に使用される用語の「少なくとも一つの第２の付着部位を有するＮＧＦ抗原」は、ＮＧＦ抗原と少なくとも一つの第２の付着部位含んで成るコンストラクトをさす。好ましい一実施形態において、第２の付着部位は、ＮＧＦ抗原に天然に存在する。他の好ましい実施形態において、第２の付着部位は、ＮＧＦ抗原に人工的に付加される。好ましい一実施形態において、第２の付着部位は、少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも一つのペプチド結合により、ＮＧＦ抗原に会合する。好ましい一実施形態において、少なくとも一つの第２の付着部位を有するＮＧＦ抗原は、リンカーを更に含んでなり、好ましくは前記リンカーは、少なくとも一つの第２の付着部位を含み、更に好ましくは前記リンカーは、ペプチド結合によってＮＧＦ抗原に融合する。
【００２２】
コートタンパク質：本明細書中で用いる「コートタンパク質」なる用語はウイルスキャプシド又はＶＬＰに組み込まれることができる、ウイルスタンパク質、好ましくはウイルスの、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの天然のキャプシド集合体を指す。コートタンパク質なる用語は、キャプシドタンパク質としても知られている。
【００２３】
連結した：「連結した」（またはその名詞：連結）は、本願明細書において使われる場合、少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位が連結される全てのありうる方法、好ましくは化学相互作用を指す。化学相互作用は、共有結合及び非共有結合の相互作用を含む。非共有結合的相互作用の典型的な例は、イオン相互作用、疎水性相互作用または水素結合であり、共有結合的相互作用は、例えば、共有結合（例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素−リン結合、炭素−硫黄結合（例えばチオエーテル）またはイミド結合）に基づく。特定の好ましい実施形態において、第１の付着部位と第２の付着部位は、少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも一つの非ペプチド結合により、より好ましくは非ペプチド結合により連結される。しかしながら、本願明細書において使用される「連結される」なる用語は、少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位の直接的な連結を含むだけでなく、代わりに及び好ましくは、中間体分子を介した少なくとも一つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位との間接的な連結であって、典型的には及び好ましくは、少なくとも１つの、好ましくは１つのヘテロ二官能性架橋剤による連結をも含む。したがって、好ましい実施態様において、前記少なくとも１つの第１の付着部位と前記少なくとも１つの第２の付着部位は、少なくとも１つの、好ましくは正確に１つのヘテロ二官能性架橋剤を経て連結される共有結合であって、好ましくは前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基であって、更に好ましくは前記第２の付着部位はシステイン残基のスルフヒドリル基である。
【００２４】
リンカー：本願明細書において使われる場合、「リンカー」は第２の付着部位をＮＧＦ抗原に会合させるか、又は第２の付着部位を含むか、本質的にそれから成るか、又はそれから成る。好ましくは、本願明細書において使われる場合、「リンカー」は第２の付着部位を、基本的には及び好ましくは、しかし必然的にではなく、１つのアミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として含む。好ましい実施態様において、前記リンカーは、アミノ酸リンカーである。非常に好ましい実施態様において、前記リンカーは、正確に１つのシステイン残基から成る。更に好ましい実施態様において、前記リンカーは正確に１つのシステイン残基を含むかまたはそれから成り、前記第２の付着部位は前記正確に１つのシステイン残基のスルフヒドリル基である。本発明に有用な更なるリンカーは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シクロアルキル（例えばシクロペンチルまたはシクロヘキシル）、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロアリール部分含んで成る分子である。更に、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル、シクロアルキル−（Ｃ５、Ｃ６）、アリール又はヘテロアリール−部分を含むリンカー及び本発明のリンカーとしても使用できる付加的なアミノ酸は、本発明の範囲内で含まれる。ＮＧＦ抗原へのリンカーの会合は、好ましくは少なくとも一つの共有結合を、より好ましくは少なくとも一つのペプチド結合を経由する。ＮＧＦ抗原に天然に存在する第２の付着部位の場合には、リンカーは、少なくとも一つの第２の付着部位（例えばシステイン）に、好ましくは少なくとも一つの共有結合を経由して、より好ましくは、少なくとも一つのペプチド結合を経由して、会合する。
【００２５】
アミノ酸リンカー：「アミノ酸リンカー」なる用語は、少なくとも一つのアミノ酸残基を含むリンカーに指す。通常、「アミノ酸リンカー」なる用語は、前記アミノ酸リンカーがアミノ酸残基だけから成ることを意味しない。しかしながら、好ましい実施態様において、前記アミノ酸リンカーは、アミノ酸残基だけから成る。リンカーのアミノ酸残基は、好ましくは天然に存在するアミノ酸、又は既知の非天然アミノ酸のａｌｌ−Ｌまたはａｌｌ−Ｄ、またはそれらの混合物、最も好ましくはａｌｌ−Ｌから成る。本発明に係るリンカーの更なる好ましい実施態様において、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む分子及びこのような分子類は、従って、本発明に含まれる。
【００２６】
ＮＧＦ抗原：本願明細書において使われる「ＮＧＦ抗原」なる用語は、ＮＧＦタンパク質、ＮＧＦ断片またはＮＧＦ突然変異タンパク質を指す。非常に好ましくは、前記ＮＧＦ抗原は、ＮＧＦ突然変異タンパク質である。本願明細書において使われる「ＮＧＦ抗原」なる用語は、上記とおり、ＮＧＦ抗原のグリコシル化、アセチル化、リン酸エステル化を非限定的に含む翻訳後修飾を含む。典型的に及び好ましくは、しかし必然的ではなく、前記ＮＧＦ抗原は、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗ＮＧＦβ抗体に特異的に結合される。
【００２７】
ＮＧＦタンパク質：本願明細書において使われる「ＮＧＦタンパク質」は、配列番号２２のヒトＮＧＦ、配列番号２４のマウスＮＧＦ又は任意の他の動物由来の対応するオルソログを含むか又は好ましくはそれから成るポリペプチドを含む。さまざまな動物種由来の非常に好適なＮＧＦオルソログは、配列番号３２から３９のポリペプチドである。ＮＧＦタンパク質は、典型的には、しかし必然的にではなく、好ましくは細胞増殖アッセイにおける生物学的活性を含む。更には、本願明細書で使用する「ＮＧＦタンパク質」なる用語は、配列番号２２のヒトＮＧＦ、配列番号２４のマウスＮＧＦ又は任意の他の動物由来の対応するオルソログと、７０％を超える、好ましくは８０％を超える、より好ましくは８５％を超える、更により好ましくは９０％を超える、再度より好ましくは９５％を超える、最も好ましくは９７％を超えるアミノ酸配列同一性を有する任意の天然又は遺伝的に改変された変異体から成るか、代替的に又は好ましくはそれらから成るポリペプチドを含む。
本願明細書において使われる「ＮＧＦタンパク質」なる用語は、上記とおり、ＮＧＦタンパク質のグリコシル化、アセチル化、リン酸エステル化を非限定的に含む翻訳後修飾を含む。好ましくは、本明細書で定義されるＮＧＦタンパク質は、長くても２００アミノ酸長、より好ましくは長くても１５０アミノ酸長、更に好ましくは長くても１３０アミノ酸長から成る。典型的に及び好ましくは、前記ＮＧＦタンパク質は、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗ＮＧＦβ抗体に特異的に結合する。さらにまた、本発明の目的にとって有用なＮＧＦタンパク質は、典型的に及び好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導することが出来る。最も好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導出来るＮＧＦタンパク質であって、前記抗ＮＧＦ抗体は、好ましくは本願明細書（参照：実施例９〜１２と１５）に記載されているように、インビトロ及び／又はインビボアッセイでＮＧＦタンパク質の生物学的活性を中和することができる。典型的に及び好ましくは、特定種のＮＧＦタンパク質含む本発明の組成物によって誘導される抗体は、前記種のＮＧＦ抗体に特異的に結合でき、及び／又は中和できるであろうことは当業者にとって自明である。
【００２８】
ＮＧＦ断片：本願明細書において使われる「ＮＧＦ断片」なる用語は、ＮＧＦタンパク質の少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも２０、更により好ましくは少なくとも３０の連続アミノ酸を含むか、それから本質的に成るか、又は代替的に又は好ましくはそれからなるペプチド、及び本願明細書に規定のＮＧＦタンパク質の連続するアミノ酸の多くとも６０、好ましくは多くとも５０、更により好ましくは多くとも４５、更により好ましくは多くとも４０アミノ酸を含むか、それから本質的に成るか、代替的に又は好ましくはそれからなる同ポリペプチド、加えてそれに対して７０％を超える、より好ましくは８０％を超える、更に好ましくは９０％を超える、更により好ましくは９５％を超えるアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含む。好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ断片は、（ａ）本明細書で定義するＮＧＦタンパク質、好ましくは配列番号２２のうちの８から６０、好ましくは１２から６０、より好ましくは２０から６０、更により好ましくは３０から６０から成るポリペプチド、及び（ｂ）（ａ）のポリペプチドに対して７０％を超える、好ましくは８０％を超える、より好ましくは９０％を超える、更により好ましくは９５％を超えるアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドから選択されるポリペプチドを含むか、それから本質的にそれから成るか、又はそれから成る。好ましくは、本願明細書において使用する「ＮＧＦ断片」なる用語は、配列番号２２のＮＧＦタンパク質の少なくとの１２の連続するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、代替的に又は好ましくはそれからなる任意のペプチド、及び配列番号２２のＮＧＦタンパク質の多くとも４５の、更により好ましくは多くとも４０の連続するアミノ酸を含むか、それから本質的になるか、代替的に又は好ましくはそれからなる同ペプチドを含む。本願明細書において使われる「ＮＧＦ断片」なる用語は、上記とおり、ＮＧＦ断片のグリコシル化、アセチル化、リン酸エステル化を非限定的に含む翻訳後修飾を含む。ＮＧＦ断片は、典型的には、しかし必然的にではなく、好ましくは細胞増殖アッセイにおける生物学的活性を含む。典型的に及び好ましくは、しかし必然的ではなく、前記ＮＧＦ断片は、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗ＮＧＦβ抗体に特異的に結合される。さらにまた、本発明の目的にとって有用なＮＧＦ断片は、典型的に及び好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導することが出来る。最も好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導出来るＮＧＦ断片であって、前記抗ＮＧＦ抗体は、好ましくは本願明細書（参照：実施例９〜１２と１５）に記載されているように、インビトロ及び／又はインビボアッセイでＮＧＦタンパク質の生物学的活性を中和することができる。典型的に及び好ましくは、特定種のＮＧＦ断片を含む本発明の組成物によって誘導される抗体は、前記種のＮＧＦ抗体に特異的に結合でき、及び／又は中和できるであろうことは当業者にとって自明である。
【００２９】
ＮＧＦ突然変異タンパク質：本願明細書において使用する「ＮＧＦ突然変異タンパク質」なる用語は、突然変異したアミノ酸配列を含むか、代替的に又は好ましくはそれから成る任意のポリペプチドを含み、突然変異するアミノ酸配列は、ＮＧＦタンパク質、好ましくはヒトＮＧＦタンパク質、最も好ましくは配列番号２２であり、突然変異する前記アミノ酸配列は、少なくとも一つ及び多くとも２０の位置で、好ましくは少なくとも一つ及び多くても１０の位置で、より好ましくは少なくとも一つ及び多くても１０の位置で変化し、前記位置においてアミノ酸残基は、置換によって、欠失によって、挿入によって、またはそれらの任意の組合せによって変化する。非常に好ましい実施形態において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は突然変異したアミノ酸配列であり、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸配列は、少なくとも１つ及び多くとも４つの位置において、置換によって、欠失によって、それらの組合せによって変化し、好ましくは前記位置のアミノ酸残基は置換によって変化する。典型的には、しかし必然的ではなく、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、モノクローナル及び／又はポリクローナル抗ＮＧＦβ抗体によって特異的に結合する。突然変異タンパク質は、突然変異される前記アミノ酸配列と比較して、減じた生物学的活性を含む。最も好ましくは、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、検出可能な生物学的活性を含まない。さらにまた、本発明の目的にとって有用なＮＧＦ突然変異タンパク質は、典型的に及び好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導することが出来る。最も好ましくは、動物に免疫原コンジュゲートの形態で、好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰとのコンジュゲートの形態で投与された場合に、前記動物において抗ＮＧＦ抗体の形成を誘導出来るＮＧＦ突然変異タンパク質であって、前記抗ＮＧＦ抗体は、好ましくは本願明細書（参照：実施例９〜１２と１５）に記載されているように、インビトロ及び／又はインビボアッセイでＮＧＦタンパク質の生物学的活性を中和することができる。
典型的に及び好ましくは、ＮＧＦ突然変異タンパク質を含む本発明の組成物であって、突然変異させられるアミノ酸配列は特定種であるものによって誘導される抗体は、前記種のＮＧＦタンパク質に特異的に結合でき、及び／又は中和できるであろうことは当業者にとって自明である。
【００３０】
本出願の範囲内で、抗原に対する抗体、好ましくはモノクローナルまたはポリクローナル抗体の特異的な結合性は、１０６Ｍ−１以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１以上の親和性（Ｋａ）によって特徴づけられる結合性を指す。抗体の親和性は、当該分野の通常の技術によって（例えば、スキャッチャード解析、Ｂｉａｃｏｒｅ−またはＥＬＩＳＡベースの方法によって）、容易に決定することができる。最も好ましくは、ＮＧＦ抗原に対するモノクローナルのおよび／またはポリクローナル抗ＮＧＦ抗体の特異的な結合は、ＥＬＩＳＡによって、最も好ましくは本願明細書の実施例５に記載した基本的条件下でアッセイされる。
【００３１】
生物学的活性：本願明細書において使用する「生物学的活性」なる用語は、細胞増殖アッセイにおける抗原、好ましくはＮＧＦ抗原、最も好ましくはＮＧＦタンパク質、ＮＧＦ断片および／またはＮＧＦ突然変異タンパク質の活性をさし、好ましくは前記細胞増殖アッセイは、ＮＧＦ依存性ヒト赤白血病のＴＦ−１細胞株に基づくものであり、なお更に好ましくは、前記細胞増殖アッセイは本願明細書の実施例６に記載されているように基本的条件下で実施される。ＮＧＦ抗原は、それが細胞増殖の検出可能なレベルを誘導することができる場合、生物学的に活性があると見なされる。典型的に及び好ましくは、適切な標準によって得られる最大増殖の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、まだ更に好ましくは少なくとも８０％である細胞増殖を誘発することができる場合、ＮＧＦ抗原は生物学的に活性である。ＮＧＦ抗原、好ましくはＮＧＦ突然変異タンパク質は、それが細胞増殖の検出可能なレベルを誘導しない場合、生物学的に活性ではない。典型的に及び好ましくは、適切な標準によって得られる最大増殖の多くとも２０％、好ましくは多くとも１５％、まだ更に好ましくは多くとも１０％、また更に好ましくは多くとも５％である細胞増殖を誘発することができる場合、ＮＧＦ抗原は生物学的に活性でない。ＮＧＦ突然変異タンパク質は、それが前記突然変異されたアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較して、１００％未満、好ましくは８０％未満、またより好ましくは６０％未満、またより好ましくは４０％未満、またより好ましくは２０％未満である細胞増殖を誘発する場合に、減じた生物学的活性を含むと見なされる。本発明において、ＮＧＦ抗原、特にＮＧＦタンパク質、ＮＧＦ断片及びＮＧＦ突然変異タンパク質は、試験動物に免疫原コンジュゲートの形態で投与された場合に抗体応答を誘導した場合であって、前記抗体応答の抗体は前記ＮＧＦ抗原に特異的に結合するものである場合に、「抗体を誘導できる」と見なされる。典型的には及び好ましくは、前記ＮＧＦタンパク質は、ウイルス様粒子とのコンジュゲートの形態で、最も好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス粒子とのコンジュゲートの形態で、前記試験動物に投与される。最も好ましくは、前記ＮＧＦ抗原は、本願明細書において開示される組成物、ワクチの組成物または医薬組成物の形態の前記試験動物に投与される。非常に好ましくは、抗体を誘導するＮＧＦ抗原の能力は、基本的に、実施例８において説明したような条件下でアッセイされる。本発明において、ＮＧＦ抗原、特にＮＧＦタンパク質、ＮＧＦ断片及びＮＧＦ突然変異タンパク質は、試験動物に免疫原コンジュゲートの形態で投与された場合に抗体応答を誘導したならば、前記抗体応答において産生される抗体は前記ＮＧＦタンパク質を中和でき、「抗体の中和を誘導できる」と見なされる。ＮＧＦタンパク質を中和する抗体能力は、細胞増殖アッセイを使用するインビトロ・アッセイで分析され、好ましくは前記細胞増殖アッセイは、ＮＧＦ依存性ヒト赤白血病のＴＦ−１細胞株に基づくものであり、なお更に好ましくは、前記細胞増殖アッセイは、基本的に本願明細書の実施例６及び９に記載されている条件下で実施される。抗体は、それが前記細胞増殖アッセイにおいて前記ＮＧＦタンパク質の生物学的活性を減らすかまたは除去することができる場合、ＮＧＦタンパク質を中和できると見なされる。あるいは、ＮＧＦタンパク質を中和する抗体能力は、インビボアッセイにおいて、好ましくは疼痛のための動物モデルにおいて分析され、ＮＧＦタンパク質を中和する前記抗体の能力は、前記動物モデルの疼痛の改善として、最終的に検出される。疼痛のための好適な動物モデルは、マウスのコラーゲンによって誘導された関節炎、マウスのザイモサンＡによって誘導された炎症性疼痛、タキソールによって誘発された神経障害疼痛であって、好ましくは、前記アッセイは、基本的には、実施例１０、１１または１５にて開示する条件下で実施される。
【００３２】
規則正しい反復性抗原アレイ：本願明細書で使用する「規則正しい反復性抗原アレイ」なる用語は、通常抗原の反復パターンを指すか、または典型的には及び好ましくは、ウイルス様粒子に関して抗原の空間配置の均一性の高い規則性によって特徴づけられる。本発明の一実施形態において、反復パターンは幾何学模様であってもよい。本発明の特定の実施態様は、例えばＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰは、１から３０ナノメーター、好ましくは２から１５ナノメーター、より好ましくは２から１０ナノメーター、さらにより好ましくは２から８ナノメーター、さらにより好ましくは１．６から７ナノメーターの間隔を有する抗原の準結晶性の厳密に反復性の規則性を持つ、適切に規則正しい反復性抗原アレイの典型的及び好適な例である。
【００３３】
ポリペプチド：本願明細書中で用いられる「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合（ペプチド結合ともいう）によって、直線的に連結されるモノマー（アミノ酸）から成る分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、産物の特定の長さを指すわけではない。ゆえに、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ポリペプチドの翻訳後修飾も包含する。ポリペプチドのアミノ酸配列同一性は、公知のコンピュータプログラム（例えばＢｅｓｔｆｉｔプログラム）を使用して、従来通り決定されうる。対照標準アミノ酸配列に対して、例えば９５％同一性を有するかを決定するために、他の任意の配列配列プログラムも使用する場合、好ましくはＢｅｓｔｆｉｔを使用する場合、同一性のパーセンテージは対照標準アミノ酸配列の完全長に対して算出され、対照標準配列におけるアミノ酸残基の総数の多くとも５％の相同性におけるギャップが許可されるように、パラメータは設定される。ポリペプチド間の同一性のパーセンテージを決定における上述の方法は、本発明において開示される全てのタンパク質、ポリペプチドまたはそれらの断片に適用できる。当業者に理解されるように、保存的アミノ酸置換には等配性の置換、すなわちアミノ酸の荷電、極性、芳香族、脂肪族又は疎水性性質が維持される置換が含まれる。代表的な保存的アミノ酸置換は、以下のグループのうちの１グループ内のアミノ酸間の置換である：（ａ）Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、及びＬｅｕ；（ｂ）Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ；Ｌｙｓ、及びＡｒｇ；及び（ｃ）Ｐｈｅ及びＴｙｒ。
【００３４】
ウイルス粒子：本明細書中で用いられる「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態学的形状を指す。いくつかのウイルス型には、タンパク質キャプシドに囲まれるゲノムを含む；他のものは付加的な構造（例えばエンベロープ、テイルなど）を有する。
【００３５】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で用いられる「ウイルス様粒子」なる用語は、非反復可能性又は非感染性、好ましくは非反復可能性又は非感染性のウイルス粒子、又は非反復可能性又は非感染性、好ましくは非反復可能性又は非感染性のウイルス粒子に類似した構造、好ましくはウイルスのキャプシドを指す。本願明細書において使われる「非反復可能性」なる用語は、ＶＬＰによって含まれるゲノムを繰り返すことができないことを指す。本願明細書において使われる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に入ることができないことを指す。好ましくは、本発明に係るウイルス様粒子は、遺伝子操作のために又は物理的、化学的失活のために、ウイルスゲノムまたはゲノム機能の全部または一部を欠いているので、非反復可能性でおよび／または非感染性である。典型的には及び好ましくは、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの反復可能性及び感染性構成部分の全部または一部を欠いている。本発明に係るウイルス様粒子は、ウイルスゲノムとは別の核酸を含むことができる。本発明のウイルス様粒子の典型的及び好適な実施態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのウイルスカプシドのようなウイルスカプシドである。「ウイルスカプシド」または「カプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質サブユニットから成る巨大分子アセンブリをさす。通常は、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウィルスタンパク質サブユニットがある。典型的には及び好ましくは、これらのサブユニットの相互作用は、本来の反復性の構成を有するウイルスカプシド又はウイルスカプシド様の構造の形成につながり、前記構造は、典型的には球状又は管状である。
【００３６】
組換えＶＬＰ：本願明細書において使われる「組換えＶＬＰ」なる用語は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも一つの工程を含む方法によって得られるＶＬＰを指す。
【００３７】
パッケージ化：本願明細書において使用する「パッケージ化」なる用語は、ＶＬＰに関するポリアニオン性巨大分子の状態を指す。本願明細書において使用する「パッケージ化」なる用語は、例えば化学的結合による共有結合、または例えばイオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合等による非共有結合であってもよい結合を含む。好ましい実施形態において、「パッケージ化」なる用語は、ＶＬＰによるポリアニオン性巨大分子の封入または部分的な封入を指す。したがって、ポリアニオン性巨大分子は、実際の結合の存在なしに、特に共有結合の存在なしにＶＬＰによって封入されることができる。好ましい実施形態において、少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子は、前記ＶＬＰに、最も好ましくは非共有の方法で、パッケージ化される。ＶＬＰに、特にＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰに、ポリグルタミン酸のようなポリアニオン性巨大分子をパッケージ化する方法は、ＷＯ２００６／０３７７８７に開示される。ＷＯ２００６／０３７７８７の実施例４を特に引用する。
【００３８】
ポリアニオン性巨大分子：本願明細書において使われる「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、負の電荷の反復性の基を含む高い相対分子質量の分子であって、その構造は基本的に、実際にまたは概念的に低い相対分子質量の分子に由来する単位の多重反復を含む分子を指す。本願明細書において使用する「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、ｔｏｌｌ様受容体を活性化することができない分子を指す。したがって、「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、Ｔｏｌｌ様受容体リガンドを除外するものであり、Ｔｏｌｌ様受容体リガンドのような免疫応答を誘発および／または改良することができる物質、免疫応答を誘導および／または改良することができる核酸及びリポ多糖体（ＬＰＳ）を除外する。より好ましくは、本願明細書において使われる「ポリアニオン性巨大分子」なる用語は、サイトカイン産生を誘導することができない分子を指す。好ましくは、ポリアニオン性巨大分子は、ポリアニオン性ポリペプチドまたはアニオン性デキストランである。好ましい実施態様において、前記ポリアニオン性巨大分子は、ポリアニオン性ポリペプチドであって、好ましくは前記ポリアニオン性ポリペプチドは、以下からなるグループから選択される：（ａ）ポリグルタミン酸；（ｂ）ポリアスパラギン酸；（ｃ）ポリ（ＧｌｕＡｓｐ）及び（ｄ） （ａ）から（ｃ）の任意の化学修飾。化学修飾の例は、グリコシル化、アセチル化及びリン酸化を含むが、これに限定されるものではない。更なる好ましい実施態様において、前記ポリアニオン性巨大分子は、以下からなるグループから選択されるアニオン性デキストランである：（ａ）デキストラン硫酸；（ｂ）カルボキシルメチルデキストラン；（ｃ）スルホプロピルデキストラン；（ｄ）メチルスルホナートデキストラン；及び（ｅ）デキストランホスフェート。
【００３９】
ポリアスパラギン酸：本願明細書において使われる「ポリアスパラギン酸」なる用語は、前記ポリペプチドによって含まれるアミノ酸残基の総数から少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％のアスパラギン酸残基を含むポリペプチドを指す。前記ポリペプチドのアスパラギン酸残基は、ａｌｌ−Ｌ、ａｌｌ−Ｄのどちらか又はＬ−とＤ−アスパラギン酸の混合物である。最も好ましくは前記ポリペプチドは、Ｌ−アスパラギン酸残基のみを含む。
【００４０】
ポリグルタミン酸：本願明細書において使われる「ポリグルタミン酸」なる用語は、前記ポリペプチドによって含まれるアミノ酸残基の総数から少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％のグルタミン酸残基を含むポリペプチドを指す。前記ポリペプチドのグルタミン酸残基は、ａｌｌ−Ｌ、ａｌｌ−Ｄのどちらか又はＬ−とＤ−グルタミン酸の混合物である。最も好ましくは、前記ポリペプチドは、Ｌ−グルタミン酸残基のみを含む。
【００４１】
ポリ（ＧｌｕＡｓｐ）：本願明細書において使われる「ポリ（ＧｌｕＡｓｐ）」なる用語は、前記ポリペプチドによって含まれるアミノ酸残基の総数から少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは１００％のグルタミン酸残基及びアスパラギン酸残基を含むポリペプチドを指す。グルタミン酸分子とアスパラギン酸分子は、ａｌｌ−Ｌ又はａｌｌ−Ｄのどちらか、又はそれらの混合物である。最も好ましくは、前記ポリペプチドは、Ｌ−グルタミン酸残基及びＬ−アスパラギン酸残基を含む。
【００４２】
疼痛：疼痛受容体（侵害受容性疼痛）の刺激から、例えば損傷によって起こる疼痛、又は神経系の機能不全によって生じる疼痛は、明らかな物理的原因（神経障害疼痛）なしに、それは脳に送られる疼痛シグナルを導く。疼痛は、例えば、骨関節炎疼痛、リウマチ様関節炎疼痛、癌性疼痛、内臓痛、慢性的な腰痛症及び慢性的な頭痛、線維症、糖尿病性ニューロパシ、幻想肢痛及び帯状疱疹後神経痛を含む。
【００４３】
侵害受容性疼痛：本願明細書において使われる「侵害受容性疼痛」なる用語は、組織、例えば関節炎と癌に影響を及ぼす損傷、手術または疾患のために、疼痛受容体の刺激から起こっている疼痛を指す。また、侵害受容性疼痛は、慢性疼痛を含む。侵害受容性疼痛の好適な種類は、骨関節炎疼痛、リウマチ様関節炎疼痛、癌性疼痛、内臓痛、慢性的腰痛症及び慢性的頭痛である。
【００４４】
神経障害性疼痛：本願明細書において使われる「神経障害性疼痛」なる用語は、明らかな物理的原因無しに、脳に送られる疼痛シグナルを導く神経系の機能不全によって生じる疼痛を指す。例えば糖尿病性ニューロパシ、幻想肢痛及び帯状疱疹後神経痛である。ウイルス粒子とウイルス様粒子の１つの共通の特徴は、それらのサブユニットの高度に規則正しい反復性の配置である。
【００４５】
ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子：本願明細書において使われる「ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質、突然変異体又はその断片を含むか、又は好ましくはそれから本質的になるか、又はそれから成る。加えて、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの構造に似ている。さらにまた、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子は、非反復可能性で非感染性である。典型的に及び好ましくは、「ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子」は、ＲＮＡ−バクテリオファージ複製装置をコードする遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは全てを欠如し、典型的に及び更に好ましくは、宿主へのウイルス付着又は侵入の役割を果たしているタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは全てを欠如するＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子を指す。しかしながら、この定義は、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子を含み、上述の遺伝子は、依然として存在するが不活性であり、従って、ＲＮＡ−バクテリオファージの非反復可能性で非感染性のウイルス様粒子を導く。従って、最も広い定義では、「ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子」は、そのゲノムは物理的又は化学的又は遺伝子の方法によって不活性化され、そのためウイルス粒子が非反復可能性および／または非感染性であるＲＮＡ−バクテリオファージのウィルス粒子を含む。ＲＮＡ−バクテリオファージの好適なＶＬＰは、正二十面体対称を呈する１８０のサブユニットから成る。
【００４６】
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも１つ」、又は「１つ又は複数」を意味する。
【００４７】
本発明は、動物またはヒトのＮＧＦに対する免疫応答を改良するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）；及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原を含み、少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原であり、（ａ）と（ｂ）は少なくとも１つの第１の付着部位と少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結される。好ましくは、ＮＧＦ抗原はＶＬＰに連結され、それにより規則正しい反復性抗原−ＶＬＰアレイを形成する。本発明の好ましい実施形態において、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも６０において、さらにより好ましくは少なくとも１２０、最も好ましくは少なくとも１８０のＮＧＦ抗原がＶＬＰに連結される。規則正しい反復性構造を有する公知技術の任意のウイルスは、本発明のＶＬＰとして選択されることができる。
【００４８】
図示するＤＮＡ又はＲＮＡウイルス、そのコートタンパク質は、ＷＯ２００４／００９１２４の２５頁１０から２１行目、２６頁１１から２８行目、２８頁の４行目から３１頁の４行目に開示されたＶＬＰの調整に使用することができる。これらの開示は、参照により本願明細書において組み込まれる。
【００４９】
ウイルスまたはウイルス様粒子は、ウイルス感染した細胞培養から産生し精製されることができる。ワクチン接種の目的において、結果として生じるウイルスまたはウイルス様粒子は、毒性が欠けていることを必要とする。遺伝子工学の他に、物理的又は化学的方法が、ウイルスゲノム機能を機能させないために使用することができる。例えばＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理。
【００５０】
好ましい一実施形態において、ＶＬＰは組換えＶＬＰである。ほとんどすべての一般に知られているウイルスは、配列決定されており、公的に容易に入手できる。コートタンパク質をコードしている遺伝子は、当業者によって容易に同定することができる。宿主でコートタンパク質を組換えにより発現するＶＬＰの調製は、当業者の常識の範囲内である。好ましい一実施形態において、ウイルス様粒子は、以下のから成るグループから選択されるウイルスの組換えタンパク質、その突然変異体又は断片を含むか、又はそれから成る：（ａ）ＲＮＡ−バクテリオファージ；（ｂ）バクテリオファージ；（ｃ）Ｂ型肝炎ウィルス、好ましくはそのコートタンパク質 (Ulrich, et al., Virus Res. 50: 141-182 (1998))又は表面タンパク質（ＷＯ９２／１１２９１）；（ｄ）はしかウィルス(Warnes, et al., Gene 160:173-178 (1995))；（ｅ）シンドビスウィルス；（ｆ）ロタウィルス（ＵＳ５０７１６５１及びＵＳ５３７４４２６）；（ｇ）口蹄疫ウィルス(Twomey, et al., Vaccine 13:1603 1610, (1995))；（ｈ）ノーウォーク・ウイルス(Jiang, X., et al., Science 250:1580 1583 (1990); Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991))；（ｉ）アルファウイルス；ｊ）レトロウィルス、好ましくはそのＧＡＧタンパク質（ＷＯ９６／３０５２３）；（ｋ）レトロトランスポゾンＴｙ、好ましくはタンパク質ｐ１；（ｌ）ヒトパピローマウィルス（ＷＯ９８／１５６３１）；（ｍ）ポリオーマウィルス；（ｎ）タバコモザイクウィルス；及び（ｏ）フロックハウス・ウイルス。
【００５１】
好ましい一実施形態において、ＶＬＰは、組換えタンパク質、その突然変異体又はその断片のうちの１より多いアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、ＶＬＰは、少なくとも１つの第１のポリペプチド及び少なくとも１つの第２のポリペプチドから成り、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドは、コートタンパク質、その変異体または断片のアミノ酸配列を含み、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドのアミノ酸配列は同一でない。別の好ましい実施形態では、前記第１のポリペプチドは、第１のコートタンパク質の、その変異体の又は断片のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドは第２のコートタンパク質の、その変異体の又は断片のアミノ酸配列を含み、前記第１のコートタンパク質と前記第２のコートタンパク質は同じウイルスのコートタンパク質であって、好ましくは前記ウイルスはＲＮＡ−バクテリオファージである。１より多いポリペプチド種を含むか、又はそれから成るＶＬＰはモザイクＶＬＰと呼ばれる。
【００５２】
本願明細書において使われる「組換えタンパク質の断片」または「コートタンパク質の断片」は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質の長さの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％のポリペプチドで、好ましくはＶＬＰを形成する能力を保持しているものと定義される。好ましくは、断片は少なくとも１つの内部欠失、少なくとも一つの切り詰めまたはそれらの少なくとも一つの組合せである。更に好ましくは、断片は、多くても５、４、３、２つの内部欠失によって、多くても２つの切り詰めによって又は正確にそれらの１つの組合せによって得られる。
【００５３】
「組換えタンパク質の断片」または「コートタンパク質の断片」なる用語は、それぞれ上に定義した「組換えタンパク質の断片」または「コートタンパク質の断片」に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％のアミノ酸同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子に組み立てられることができるものである。本発明において交換可能に使用される「突然変異体リコンビナントタンパク質」なる用語または「組換えタンパク質の突然変異体」なる用語、本発明において交換可能に使用される「突然変異体コートタンパク質」なる用語または「コートタンパク質の突然変異体」なる用語は、それぞれ、野生型組換えタンパク質またはコートタンパク質に由来するアミノ酸配列を有するポリペプチド指すものであり、アミノ酸配列は野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有し、好ましくは前記ポリペプチドはＶＬＰに組み立てられる能力を保持する。
【００５４】
好ましい一実施形態において、本発明のウイルス様粒子は、Ｂ型肝炎ウィルスのものである。Ｂ型肝炎ウィルス様粒子の調製は、ＷＯ００／３２２２７、ＷＯ０１／８５２０８及びＷＯ０１／０５６９０５において開示される。全３つの文献は、対照標準を経由して本願明細書に明示的に組み込まれる。本発明の実行ために適切なＨＢｃＡｇの他の変異体は、ＷＯ０１／０５６９０５において、特にその３４から３９頁に開示される。
【００５５】
更なる本発明の好ましい実施形態において、リジン残基は、ＨＢｃＡｇのＶＬＰに対するＮＧＦ抗原の連結を介在するために、ＨＢｃＡｇポリペプチドに導入される。好ましい実施態様において、本発明のＶＬＰ及び組成物は、修飾されアミノ酸の位置７９及び８０がＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ酸配列を有するペプチドに置き換えられた配列番号２０のアミノ酸１−１４４又は１−１４９、１−１８５を含むか又はそれから成るＨＢｃＡｇを使用して調製される。この修飾は、配列番号２０から配列番号２１への変化である。更なる好ましい実施態様において、配列番号２１（またはそれに対応する断片、好ましくは１−１４４または１−１４９）の位置４８と１１０のシステイン残基は、セリンに変異する。本発明は、上記の対応するアミノ酸変異を有するＢ型肝炎コアタンパク質変異体を含む組成物を更に含む。本発明は、配列番号２１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るＨＢｃＡｇポリペプチドをそれぞれ含む組成物及びワクチンを含む。
【００５６】
本発明の一実施例において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子であって、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージは、（ａ）バクテリオファージＱβ；（ｂ）バクテリオファージＲ１７；（ｃ）バクテリオファージｆｒ；（ｄ）バクテリオファージＧＡ；（ｅ）バクテリオファージＳＰ；（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；（ｇ）バクテリオファージＭ１１；（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；（ｋ）バクテリオファージｆ２；（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及び（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。非常に好適な実施態様において、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子である。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質、その突然変異体又はその断片を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成り、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージは、（ａ）バクテリオファージＱβ；（ｂ）バクテリオファージＲ１７；（ｃ）バクテリオファージｆｒ；（ｄ）バクテリオファージＧＡ；（ｅ）バクテリオファージＳＰ；（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；（ｇ）バクテリオファージＭ１１；（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；（ｋ）バクテリオファージｆ２；（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及び（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５から成るグループから選択される。更に好ましい実施態様において、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質、突然変異体又はその断片を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成り、前記ＲＮＡバクテリオファージは、Ｑβ、ｆｒ、ＡＰ２０５またはＧＡから選択される。非常に好適な実施態様において、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質、突然変異体又はその断片を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る。
【００５８】
本発明の一実施形態において、組成物は、コートタンパク質、その突然変異体又はその断片を含み、好ましくは前記コートタンパク質は、以下から成るグループから選択されるアミノ酸配列を含むか又は好ましくはそれから成る：（ａ）配列番号１；Ｑβ ＣＰを指す；（ｂ）配列番号１と配列番号２の混合物（Ｑβ Ａ１タンパク質を指す）；（ｃ）配列番号３；（ｄ）配列番号４；（ｅ）配列番号５；（ｆ）配列番号６，（ｇ）配列番号６と配列番号７との混合物；（ｈ）配列番号８；（ｉ）配列番号９；（ｊ）配列番号１０；（ｋ）配列番号１１；（ｌ）配列番号１２；（ｍ）配列番号１３；（ｎ）配列番号１４；（ｏ）配列番号４０；（ｐ）配列番号４１；及び（ｑ）配列番号４２。
【００５９】
別の好ましい実施形態では、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質、突然変異体又はその断片を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る。別の好ましい実施形態では、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質、突然変異体又はその断片を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成り、前記コートタンパク質は、以下から成るグループから選択されるアミノ酸配列を含むか又は好ましくはそれから成る：（ａ）配列番号１； Ｑβ ＣＰを指す；（ｂ）配列番号１と配列番号２の混合物（Ｑβ Ａ１タンパク質を指す）；（ｃ）配列番号３；（ｄ）配列番号４；（ｅ）配列番号５；（ｆ）配列番号６，（ｇ）配列番号６と配列番号７との混合物；（ｈ）配列番号８；（ｉ）配列番号９；（ｊ）配列番号１０；（ｋ）配列番号１１；（ｌ）配列番号１２；（ｍ）配列番号１３；及び（ｎ）配列番号１４；（ｏ）配列番号４０；（ｐ）配列番号４１；及び（ｑ）配列番号４２。
【００６０】
別の好ましい実施形態では、前記ウイルス様粒子は、組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれから成るか、又はそれから成り、前記組換えコートタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成る。本発明の一実施形態において、ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質、その変異体またはその断片の１より多いアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成るモザイクＶＬＰである。ある非常に好適な実施態様において、ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージの２つの異なるコートタンパク質を含むか、あるいはそれから成り、前記２つの異なるコートタンパク質は、配列番号１及び配列番号２、又は配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列をそれぞれ含むか、あるいは好ましくはそれから成る。好ましい一実施形態において、前記ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰである。
【００６１】
Ｑβのカプシドまたはウイルス様粒子は、直径２５ｎｍ及びＴ＝３見かけ対称性を有する正二十面体のファージ様カプシド構造を示す。カプシドは１８０コピーのコートタンパク質を含み、それはジスルフィド架橋(Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-5554 (1996))によって共有結合性五量体と六量体に連結され、Ｑβカプシドの顕著な安定性を導く。しかしながら、組換えＱβコートタンパク質から作成されるカプシドまたはＶＬＰは、カプシド中の他のサブユニットにジスルフィド結合を経て連結されないサブユニットか、または不完全に連結したサブユニットを含むことができる。ＱβのカプシドまたはＶＬＰは、有機溶媒及び変性剤に通常でない耐性を示す。驚くべきことに、３０％と同じ高さのＤＭＳＯ及びアセトニトリル濃度、１Ｍと同じ高さのグアニジニウム濃度はカプシドの安定性に影響を及ぼさないことが観察された。Ｑβのカプシド及びＶＬＰの高い安定性は、特に、本発明に係る哺乳類及びヒトの免疫化及びワクチン接種におけるその使用に有利な特徴である。
【００６２】
本発明に係るＲＮＡ−バクテリオファージ、特にＲＮＡ−バクテリオファージＱβとＲＮＡ−バクテリオファージｆｒの更なる好適なウイルス様粒子はＷＯ０２／０５６９０５において開示され、その開示は参照により完全に本願明細書に援用される。特に、ＷＯ０２／０５６９０５の実施例１８は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰの調製の詳細な説明を提供する。
【００６３】
他の好ましい例として、前記ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージＡＰ２０５のＶＬＰである。アミノ酸５のプロリンがスレオニンに置換されたＡＰ２０５コートタンパク質又はアミノ酸１４のアスパラギンがアスパラギン酸に置換されたＡＰ２０５コートタンパク質を含むＡＰ２０５ ＶＬＰの組み立て可能な変異体の形態は、本発明の実行に使用されてもよく、本発明の好ましい他の実施形態につながる。ＷＯ２００４／００７５３８は、特に実施例１と実施例２において、ＡＰ２０５コートタンパク質を含むＶＬＰをどのように得るかについて、及び特にその発現と精製を記載する。ＷＯ２００４／００７５３８は、参照により本願明細書に援用される。ＡＰ２０５ ＶＬＰは高度に免疫原性であり、典型的には及び好ましくは、配向性及び反復性の様式で抗原を提示するワクチン・コンストラクトを生成するために、抗原に連結されることができる。高い抗体価はが提示された抗原に対して引き出され、連結された抗原は免疫系の細胞、典型的には及び好ましくはＢ細胞と相互作用することが可能であり、従って、免疫原性である。
【００６４】
好ましい一実施形態において、前記ＶＬＰは、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの、ウイルスの変異体コートタンパク質を含むかまたはそれから成り、変異体コートタンパク質は、置換の方法でおよび／または欠失の方法で、少なくとも一つのリジン残基が除去されることによって修飾されている。他の好ましい実施形態において、本発明のＶＬＰは、ウイルスの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの変異体コートタンパク質を含むか、又はそれから成り、変異体コートタンパク質は、置換の方法でおよび／または欠失の方法で、少なくとも一つのリジン残基が付加されることによって修飾されている。少なくとも一つのリジン残基の欠失、置換または付加は、カップリングの程度を変化させてることを可能にし、すなわち、ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰのサブユニットにつき結合している抗原量を変化させることを可能にする。したがって、特異的ワクチンの設計の必要条件を、満たすことができる。
【００６５】
好ましい一実施形態において、本発明の組成物とワクチンは、０．５から４．０の抗原密度を有する。本願明細書において使われる「抗原密度」なる用語は、ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰのサブユニット、好ましくはコートタンパク質につき連結される抗原分子の、平均数を指す。したがって、この値は、本発明の組成物またはワクチンにおいて、前記ＶＬＰの、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの前記ＶＬＰの、全てのサブユニットにおける平均として算出される。Ｑβコートタンパク質のＶＬＰまたはカプシドは、定まった数のリジン残基をそれらの表面に提示し、３つのリジン残基がカプシドの内部を向いておりＲＮＡと相互作用し、４つの別のリジン残基がカプシドの外側に曝らされる定まったトポロジーを有する。好ましくは、少なくとも一つの第１の付着部位は、ＶＬＰの外側を向いているか又はそこに存在するリジン残基である。より好ましくは、少なくとも一つの第１の付着部位は、ＶＬＰの外側を向いているか又はそこに存在するリジン残基のアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のリジン残基のアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、配列番号１のリジン残基のアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、配列番号１の位置２、１３、１６、４６、６０、６３及び６７のリジン残基のうちの任意の一つのアミノ基である。更なる好ましい実施態様において、前記第１の付着部位は、カプシドの外側に向かうリジン残基の任意の一つのアミノ基である。
【００６６】
露出したリジン残基がアルギニンと交換されたＱβ変異体が、本発明のために使われてもよい。したがって、別の本発明の好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、変異体Ｑβのコートタンパク質を含むか、基本的にそれから成るか、またはそれから成る。好ましくは、これらの変異体コートタンパク質は、（ａ）Ｑβ−２４０（配列番号１５、配列番号１のＬｙｓ１３−Ａｒｇ）；（ｂ）Ｑβ−２４３（配列番号１６、配列番号１のＡｓｎ１０−Ｌｙｓ）；（ｃ）Ｑβ−２５０（配列番号１７、配列番号１のＬｙｓ２−Ａｒｇ）；（ｄ）Ｑβ−２５１（配列番号１８、配列番号１のＬｙｓ１６−Ａｒｇ）；及び（ｅ）Ｑβ−２５９（配列番号１９、配列番号１のＬｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ）からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそれから成る。上記のＱβ変異体コートタンパク質、変異体Ｑβコートタンパク質ＶＬＰ及びカプシドのコンストラクト、発現及び精製は、それぞれＷＯ０２／０５６９０５に記載されている。特に、ＷＯ０２／０５６９０５の実施例１８はここに援用される。
【００６７】
別の本発明の好ましい実施形態において、ウイルス様粒子は、変異体コートタンパク質Ｑβまたは変異体または断片及び対応するＡ１タンパク質を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。更なる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、変異体コートタンパク質からを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、前記変異体コートタンパク質は、配列番号１５、１６、１７、１８及び１９及び対応するＡ１タンパク質の任意の一つから選択される。
【００６８】
更なるＲＮＡ−バクテリオファージ・コートタンパク質はバクテリア宿主の発現において自己集合することが示されている(Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170:238-242 (1989), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特に、ＧＡ(Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996), Tars, K et al., J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))及びｆｒ(Pushko P. et al., Prot. Eng. 6: 883-891 (1993), Liljas, L et al. J Mol. Biol. 244:279-290,(1994))の生物学的及び生化学的特性が開示されている。いくつかのＲＮＡ−バクテリオファージの結晶構造が決定されている(Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996))。このような情報を用いて、表面露出した残基は同定されることができ、したがって、一つ以上の反応性のアミノ酸残基が挿入または置換により挿入されることができるように、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質は修飾されることができる。ＲＮＡ−バクテリオファージに由来するＶＬＰの別の有利な点は、手頃なコストで大量の物質の産生を可能にするバクテリアにおける、高い発現生産量である。
【００６９】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦ抗原はＮＧＦタンパク質である。好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質は、以下からなるグループから選択される：（ａ）ヒトＮＧＦタンパク質；（ｂ）イヌＮＧＦタンパク質；（ｃ）ネコＮＧＦタンパク質；（ｄ）マウスＮＧＦタンパク質、及び（ｅ）ウマＮＧＦタンパク質。更なる好ましい実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、ヒトのまたは他動物の、好ましくは哺乳類のＮＧＦであって、更に好ましくは前記ＮＧＦタンパク質は、配列番号２２から２５及び３２から３９の任意の一つから選択される。好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質はヒトＮＧＦである。
【００７０】
更なる好ましい実施態様において、ヒトＮＧＦは、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれから成る。別の好ましい実施態様では、ＮＧＦタンパク質は、配列番号２２と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなる。好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むか又は好ましくはそれから成り、配列番号２２は、置換及び／又は欠失及び／又は挿入又はそれらの組み合わせによって、少なくとも１つの及び多くとも２０の、好ましくは少なくとも１つの及び多くとも１０の、より好ましくは少なくとも１つの及び多くとも５のアミノ酸が変化する。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、ＮＧＦタンパク質は、変異したアミノ酸配列を含むか又は好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸配列は、置換及び／又は欠失及び／又は挿入又はそれらの組み合わせによって、少なくとも１つの及び多くとも２０の、好ましくは少なくとも１つの及び多くとも１０の、より好ましくは少なくとも１つの及び多くとも５のアミノ酸が変化される。
【００７２】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、配列番号２２は、少なくとも１つの及び多くとも２０の、好ましくは少なくとも１つの及び多くとも１０の、より好ましくは少なくとも１つの及び多くとも５のアミノ酸が欠失により変化される。
【００７３】
更なる好ましい実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、配列番号２２は、１、２、又は３つのアミノ酸の欠失によって変えられる。別の好ましい実施態様では、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は、配列番号２２であり、多くとも１０、９、８、７、６、５又は４アミノ酸残基が前記突然変異されるアミノ酸配列から欠失される。非常に好適な実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は、配列番号２２であり、３、２又は好ましくは１つのアミノ酸残基が前記突然変異されるアミノ酸配列から欠失する。好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、配列番号２２は、少なくとも１つの及び多くとも２０の、好ましくは少なくとも１つの及び多くとも１０の、より好ましくは少なくとも１つの及び多くとも５のアミノ酸が挿入により変化する。
【００７４】
更なる好ましい実施態様において、ＮＧＦタンパク質はアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、配列番号２２は、１、２、又は３つのアミノ酸挿入によって変えられる。別の好ましい実施形態では、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は、配列番号２２であり、多くとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５又は４アミノ酸残基が前記突然変異されるアミノ酸配列に挿入される。非常に好適な実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、３、２又は好ましくは１つのアミノ酸残基は、前記突然変異されるアミノ酸配列に挿入される。
【００７５】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれからなり、配列番号２２は、少なくとも１つの及び多くとも２０の、好ましくは少なくとも１つの及び多くとも１０の、より好ましくは少なくとも１つの及び多くとも５のアミノ酸が置換により、好ましくは保存的置換により、変化する。更なる好ましい実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、アミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り 配列番号２２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸置換によって、好ましくは保存的置換によって変化する。
【００７６】
更なる好ましい実施態様において、ＮＧＦタンパク質はアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、配列番号２２は、１、２、又は３つのアミノ酸置換によって、好ましくは保存的置換によって変化する。別の好ましい実施例では、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸配列の多くとも２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、 ７、６、５、又は４つのアミノ酸残基がアミノ酸置換により交換され、好ましくは前記アミノ酸置換は、保守的アミノ酸置換である。非常に好適な実施態様において、ＮＧＦタンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は、配列番号２２であり、突然変異される前記アミノ酸配列の３、２、好ましくは１つのアミノ酸残基は、アミノ酸置換によって交換され、好ましくは前記アミノ酸置換は、保守的なアミノ酸置換である。
【００７７】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦタンパク質はヒトＮＧＦ前駆体である。更なる好ましい実施態様において、ヒトＮＧＦ前駆体は、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成る。他の好ましい実施形態において、ＮＧＦタンパク質はアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、それは配列番号２３と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。
【００７８】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦ抗原はＮＧＦ断片であり、前記ＮＧＦ断片は少なくとも一つのエピトープを含むか、あるいはそれから成る。タンパク質のエピトープを決定する方法は、当業者に知られている。ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９８０は２６頁の第１段落から２７頁の第４段落に、これらの方法のいくつかを詳細に記載しており、これらの具体的開示は本願明細書に援用したものとする。これらの方法が他のポリペプチド抗原に通常適用できる点に留意される必要があり、ゆえに、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００４９８０に開示のＩＬ−２３ ｐ１９に制限されない。
【００７９】
本発明の好ましい実施態様において、ＮＧＦ抗原はＮＧＦ断片である。更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ断片は、配列番号２２のヒトＮＧＦの少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも２０、なお好ましくは少なくとも３０の連続するアミノ酸を含むか、あるいは好ましくはそれから成る。更なる好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ断片は、配列番号２２の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０の連続するアミノ酸から成り、好ましくは前記ＮＧＦ断片は配列番号１０の連続するアミノ酸を含み、更に好ましくは前記ＮＧＦ断片は配列番号２２の１０のＮ末端基アミノ酸を含む。したがって、非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ断片は、配列番号４４のアミノ酸配列から成る。
【００８０】
好ましい一実施形態において、ＮＧＦ抗原は、ＮＧＦ突然変異タンパク質であって、好ましくは前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、減少した生物学的活性を含み、更なる好ましくは前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、免疫原性コンジュゲートの形態で動物に投与された場合、抗体中和を誘発することができる。非常に好適な実施態様において、ＮＧＦ突然変異タンパク質は生物学的活性を含まず、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、免疫原性コンジュゲートの形態で動物に投与された場合、抗体中和を誘発することができる。
【００８１】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は、配列番号２２であり、前記変異される前記アミノ酸配列は少なくとも１及び多くとも９、好ましくは少なくとも１及び多くても３、より好ましくは、少なくとも１及び多くとも２、最も好ましくは正確に１つの位置において変えられ、前記位置のアミノ酸残基は、置換によってまたは欠失によって、最も好ましくは置換によって変えられる。更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異したアミノ酸配列から成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記アミノ酸配列は、少なくとも１及び多くとも９の位置で変えられ、前記位置のアミノ酸残基は配列番号２２から欠失され、好ましくは前記欠失するアミノ酸残基は配列番号２２のアミノ酸残基１から９から選択され、更に好ましくは前記欠失するアミノ酸残基は、配列番号２２のアミノ酸残基４Ｈ、５Ｐ、７Ｆ又は８Ｈの何らかの一つから選択される(Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Woo, S.B. and K.E. Neet J Biol Chem, 1996. 271(40): p. 24433-41; and Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は配列番号４５から成る。
【００８２】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、変異される前記アミノ酸配列は少なくとも１及び多くとも３、好ましくは少なくとも１及び多くても２、最も好ましくは正確に１つの位置において変化し、前記位置のアミノ酸残基は置換によって変化する。
【００８３】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異したアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異される前記アミノ酸配列は少なくとも１及び多くとも３、好ましくは少なくとも１及び多くても２、最も好ましくは正確に１つの位置において変化し、前記位置のアミノ酸残基は置換によって変えられ、置換するアミノ酸残基は配列番号２２のアミノ酸残基４Ｈ、５Ｐ、７Ｆ又は８Ｈのいずれかの１つから選択される(Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Woo, S.B. and K.E. Neet J Biol Chem, 1996. 271(40): p. 24433-41; and Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、配列番号４６から５２の何れか一つから成る。
【００８４】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異するアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸配列は少なくとも１及び多くとも３の、好ましくは少なくとも１及び多くても２の、最も好ましくは正確に１つの位置において変えられ、前記位置のアミノ酸残基は置換によって変えられ、置換されたアミノ酸残基は、配列番号２２のアミノ酸残基４３から４５、４８及び４９の何れかの一つから選択される(Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8, and Xie, Y., et al. J Biol Chem, 2000. 275(38): p. 29868-74.)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、配列番号５３から６０の何れかの一つから成る。
【００８５】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異するアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異するアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸配列は少なくとも１及び多くとも３の、好ましくは少なくとも１及び多くても２の、最も好ましくは正確に１つの位置において変えられ、前記位置のアミノ酸残基は置換によって変えられ、置換されるアミノ酸残基は、配列番号２２のアミノ酸残基９４Ｇ、９５Ｋ及び９６Ｑの何れか一つから選択される（Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8, and Xie, Y., et al. J Biol Chem, 2000. 275(38): p. 29868-74.)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、配列番号６１から６６の何れか一つから成る。
【００８６】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異するアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異するアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸置換によって正確に１つの位置において変えられ、置換されたアミノ酸残基はアミノ酸残基７５Ｈ、８４Ｈ、１００Ｒ、１１１Ｖ、１１２ｌ、１１４Ｒ、１１５Ｋ、１１３Ｓの何れか一つのアミノ酸から選択される(Kullander, K. et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Larsson, E. et al. Neurobiol Dis, 2008, Kruttgen, A., et al. J Biol Chem, 1997. 272(46): p. 29222-8)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は配列番号６７から７４の何れか一つから成る。
【００８７】
更に好ましい実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、突然変異するアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り、突然変異されるアミノ酸配列は配列番号２２であり、前記突然変異されるアミノ酸は正確に２つの位置において変えられ、前記位置のアミノ酸残基は置換によって変えられ、置換されたアミノ酸残基は７５Ｈ及び８４Ｈである(Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7)。非常に好適な実施態様において、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は配列番号７５から成る。
【００８８】
好ましい実施態様では、組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子；及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原を含むか、本質的にそれから成るか又はそれから成り、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原であり；（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を介して連結し、前記結合は少なくとも一つのペプチド結合、好ましくはペプチド結合だけを経るものである。
【００８９】
更なる好ましい実施態様において、少なくとも一つの第１の付着部位を有する前記ウイルス様粒子と前記少なくとも一つの抗原は、遺伝子融合の手段により連結される。ＮＧＦ抗原をコードする遺伝子は、内部に、または好ましくはＶＬＰのコートタンパク質をコードする遺伝子のＮ−またはＣ−末端にインフレームでライげーションされる。また、融合は、ＮＧＦ抗原の配列を、コートタンパク質配列の部分が欠失したコートタンパク質の変異体であって、トランケーション変異体と呼ばれるものに挿入することによって遂行されることができる。トランケーション変異体は、コートタンパク質の配列の一部のＮ−またはＣ末端欠失、又は内部欠失を有することができる。融合タンパク質は、好ましくは発現に応じてＶＬＰに組み立てられる能力を保持し、それは電子顕微鏡によって調べられることができる。
【００９０】
隣接するアミノ酸残基は、コートタンパク質とＮＧＦ抗原との間の距離を増大させるために、ＮＧＦ抗原に加えられることができる。グリシンとセリン残基は、隣接配列において使用される特に好ましいアミノ酸残基である。このような隣接配列は、融合コンスストラクトに追加的な柔軟性を与える。これは、ＶＬＰサブユニットの配列に融合した外来配列を不安定にする効果の可能性を減少し、従ってＶＬＰアセンブリによる外来配列の干渉を減少させる。他の実施態様において、ＮＧＦ抗原は他のウイルスコートタンパク質の多くに、例えばＱβのＡ１タンパク質の切断型のＣ末端に融合することができる(Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39:9-15 (1996))。あるいは、ＮＧＦ抗原は、ＣＰ伸長の位置７２と７３の間に挿入されることができる。例えば、Kozlovska et al.,(Intervirology, 39: 9-15 (1996))はエピトープが、位置１９で切断されたＱＣＰ伸長のＣ末端に融合したＱＡ１タンパク質融合を記載する。別の例として、ＮＧＦ抗原は、ｆｒ ＣＰのアミノ酸２と３との間に挿入されることができる(Pushko P. et al., Prot. Eng. 6: 883-891 (1993))。さらにまた、ＮＧＦ抗原は、ＲＮＡ−バクテリオファージＭＳ−２（ＷＯ９２／１３０８１）のコートタンパク質のＮ末端基突出したヘアピンに融合することができる。あるいは、ＮＧＦ抗原は、パピローマウイルスのコートタンパク質に、ウシパピローマウイルス・タイプ１のコートタンパク質の主要コートタンパク質Ｌ１（ＢＰＶ−１）に融合させることができる(Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999), WO00/23955)。また、ＮＧＦ抗原を有するＢＰＶ−１ Ｌ１のアミノ酸１３０−１３６の置換も、本発明の実施態様である。ウイルスのコートタンパク質に、または変異体又はその断片に、ＮＧＦ抗原を融合する更なる実施形態は、ＷＯ２００４／００９１２４の６２頁２０行目から６８頁１７行目に開示されており、引用により本願明細書に組み込まれる。
【００９１】
他の好ましい実施形態において、ＮＧＦ抗原は、ＲＮＡ−バクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質、変異体又はその断片のＮ末端又はＣ末端のどちらかに融合し、好ましくは前記コートタンパク質、変異体又はその断片は配列番号１４、４０から４２の何れか一つのアミノ酸配列、好ましくは配列番号４１のアミノ酸配列を含むか又は好ましくはそれから成る。
【００９２】
更に好ましい実施態様において、融合タンパク質は、スペーサを更に含み、前記スペーサーはＲＮＡ−バクテリオファージＡＰ２０５のコートタンパク質、その変異体又はその断片と前記ＮＧＦ抗原との間に入る。好ましくは、前記スペーサーは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５未満アミノ酸から成る。非常に好ましくは、前記スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸から成る。
【００９３】
好ましい実施形態では、組成物は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子；及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原を含むか、本質的にそれから成るか、又はそれから成り、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原であって；（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記連結は少なくとも一つの非ペプチド共有結合であり、好ましくは前記第１の付着部位はスルフヒドリル基を含まないか又はそれでなく、より好ましくは、前記第１の付着部位はシステインのシステインのスルフヒドリル基を含まないか又はそれではない。
【００９４】
好ましい実施形態において、第１の付着部位はアミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれから成る。更に好ましい実施形態において、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれから成り、前記リジン残基は、前記ＶＬＰに含まれる組換えコートタンパク質のリジン残基である。更に好ましい実施形態において、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれであり、前記リジン残基は、前記ＶＬＰに含まれるＲＮＡバクテリオファージの組換えコートタンパク質のリジン残基である。
【００９５】
更に好ましい実施態様において、前記少なくとも一つの第１の付着部位を有する前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子であり、前記第１の付着部位はリジン残基のアミノ基を含むか又は好ましくはそれであり、好ましくは前記リジン残基は、組換えコートタンパク質、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質ののリジン残基であって、前記組換えコートタンパク質は、ＲＮＡ−バクテリオファージの前記ウイルス様粒子に含まれる。
【００９６】
更に好ましい実施態様において、少なくとも一つの第１の付着部位を有する前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質、その変異体又はその断片を含むか、本質的にそれから成り、あるいはそれから成り、前記第１の付着部位は、リジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれであり、好ましくは前記リジン残基は、前記ＲＮＡ−バクテリオファージの、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージＱβの前記組換えコートタンパク質、その変異体またはその断片に含まれるリジン残基である。
【００９７】
更に好ましい実施態様において、少なくとも一つの第１の付着部位を有する前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれから成るか、またはそれから成り、前記組換えコートタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むかまたは好ましくはそれから成り；好ましくは前記第１の付着部位は配列番号１のリジン残基のアミノ基を含むか、又はそれである。
【００９８】
別の本発明の好ましい実施形態において、第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそれから成る。本発明の非常に好適な実施態様において、少なくとも一つの第１の付着部位はアミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基であり、少なくとも一つの第２の付着部位はスルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基である。
【００９９】
本発明の好適な一実施形態において、典型的には及び好ましくはＮＧＦ抗原は、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて、化学的架橋結合を経由してＶＬＰに連結される。好ましい実施態様において、ヘテロ二官能性架橋剤は、好適な第１の付着部位、好ましくはアミノ基、より好ましくはＶＬＰのリジン残基のアミノ基と反応できる官能基と、好適な第２の付着部位、すなわちスルフヒドリル基、好ましくはＮＧＦ抗原に本来からあるか又は人工的に付加されたシステイン残基のスルフヒドリル基と反応することができ、場合により還元による反応に利用される更なる官能基を含む。複数のヘテロ二官能性架橋剤は、従来技術で周知である。これらは好適な架橋剤であるＳＭＰＨ（ピアス）、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＥＭＣ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ及び例えばピアス化学会社から入手できる他の架橋剤、及びアミノ基に対して反応できる１つの官能基とスルフヒドリル基に対して反応できる１つの官能基とを有するものを含む。上述の全ての架橋剤は、アミノ基との反応後アミド結合の形成に、スルフヒドリル基との反応後チオエーテル結合の形成につながる。本発明の実施において適切な架橋剤の別のクラスは、結合の際にＮＧＦ抗原とＶＬＰとの間のジスルフィド結合の導入によって特徴づけられる。このクラスに属している好適な架橋剤は、例えばＳＰＤＰとスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（ピアス）を含む。
【０１００】
好ましい実施形態において、本発明の組成物はリンカーを更に含む。ＮＧＦ抗原への第２の付着部位のエンジニアリングはリンカーの会合によって達成され、好ましくは本発明の開示に従って第２の付着部位として適切な少なくとも一つのアミノ酸を含む。従って、本発明の好ましい実施態様において、リンカーは少なくとも一つの共有結合により、好ましくは少なくとも１つの、典型的には１つのペプチド結合をにより、ＮＧＦ抗原に会合する。好ましくは、リンカーは第２の付着部位を含むか、又はそれから成る。別の好ましい実施形態では、リンカーは、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む。他の好ましい実施形態として、アミノ酸リンカーは、システイン残基である。別の好ましい実施形態では、アミノ酸リンカーは、ＣＧＧ−またはＧＣＧ−リンカー、好ましくはＣＧＧ−リンカーである。本発明のために適切であるリンカーはＷＯ２００５／１０８４２５Ａ１（３２−３３頁）に開示され、それは引用により本願明細書において組み込まれる。
【０１０１】
上述の好適な方法によるヘテロ二官能性架橋剤を使用したＶＬＰへのＮＧＦ抗原の連結は、配向性の様式でＶＬＰへＮＧＦ抗原を結合することを可能にする。ＮＧＦ抗原をＶＬＰに連結する他の方法は、ＮＧＦ抗原が、カルボジイミドＥＤＣ及びＮＨＳを使用して、ＶＬＰに架橋結合する方法を含む。また、ＮＧＦ抗原は、最初に、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰまたはイミノチオランとの反応によってチオール化されてもよい。次に、ＮＧＦ抗原は、必要であれば脱保護の後で、以下の通りにＶＬＰに結合することができる。過剰なチオール化試薬の分離後、ＮＧＦ抗原はＶＬＰ（システイン反応の部分を含むヘテロ二官能性架橋剤によって前もって活性化されたもの）と反応させ、その結果、システイン残基に反応性である少なくとも１つ又は複数の官能基であって、そこに上述のようにチオール化されたＮＧＦ抗原が反応することができる官能基を提示する。場合により、低量の還元剤は、反応混合物に含まれる。更なる方法において、ＮＧＦ抗原は、グルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（ピアス）のようなホモ二官能性架橋剤又はＶＬＰのアミノ基又はカルボキシル基に反応性である官能基を有するホモ二官能性架橋剤を使用してＶＬＰに取り付けられる。
【０１０２】
本発明の他の実施態様において、組成物は、化学的相互作用を経て、ＮＧＦ抗原に連結されたウイルス様粒子を含むかまたは本質的にそれから成り、これらの相互作用のうちの少なくとも１つは共有結合でない。このような相互作用は、抗原−抗体相互作用、受容体−リガンド相互作用を含むが、これに限定されるものではない。ＮＧＦ抗原へのＶＬＰの結合は、以下によって遂行されることができる：ＶＬＰをビオチン化すること、及びストレプトアビジン−融合タンパク質としてＮＧＦ抗原を発現すること。
【０１０３】
立体配置的に許容可能であるならば、１または複数の抗原分子（すなわちＮＧＦ抗原）は、ＶＬＰの１つのサブユニット、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質に、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰのコートタンパク質の露出したリジン残基を介して、取り付けられることができる。ＲＮＡ−バクテリオファージ、特にＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰの特殊な特徴は、したがって、サブユニットにつき複数の抗原を結合させるという可能性である。これは、密度の高い抗原アレイの生成を可能にする。
【０１０４】
本発明の非常に好適な実施態様において、ＮＧＦ抗原は、ＮＧＦ抗原のＮ末端基かＣ末端に付加されたシステイン残基を介してまたはＮＧＦ抗原の天然システイン残基を介して、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質の、特にＲＮＡ−バクテリオファージＱβのコートタンパク質のＶＬＰのリジン残基に連結される。上記の通り、４つのリジン残基は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰの表面に露出する。典型的に及び好ましくは、これらの残基は、架橋剤分子との反応により誘導体化される。露出したリジン残基の全てが抗原に接続することができるというわけでない例として、架橋剤と反応したリジン残基は、誘導体化工程の後、ε−アミノ基に取り付けられた架橋剤分子をあとに残す。これは１または複数の正の電荷の消失につながり、それはＶＬＰの溶解性と安定性に有害である可能性がある。開示されたＱβコートタンパク質変異体の場合のように、いくつかのリジン残基をアルギニンと交換することによって、アルギニン残基が好適な架橋剤と反応しないことにより、正電荷の過剰な消失を妨げる。さらに、より少ない部位が抗原と反応可能である場合に、アルギニン残基によるリジン残基の置換は、より多くの形成された抗原アレイを導くことができる。
【０１０５】
したがって、露出したリジン残基は、以下のＱβコートタンパク質変異体のアルギニンと交換された：Ｑβ−２４０（Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号１５）、Ｑβ−２５０（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３−Ａｒｇ；配列番号１７）、Ｑβ−２５９（Ｌｙｓ２−Ａｒｇ，Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ；配列番号１９）及びＱβ−２５１；（Ｌｙｓ１６−Ａｒｇ、配列番号１８）。さらなる実施態様において、１つの追加的なリジン残基Ｑβ−２４３を有するＲＮＡ−バクテリオファージＱβの変異体コートタンパク質を開示する（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号１６）それは、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβの野生型コートタンパク質によって、より高い密度の抗原アレイさえ得ることに適している（配列番号１）。
【０１０６】
本発明の一実施態様において、前記ウイルス様粒子は宿主によって組換えにより産生され、前記ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡから本質的に離れており、好ましくは前記ウイルス様粒子は宿主核酸を本質的に含まず、好ましくは前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子である。更なる好ましい実施形態では、組成物は、ＶＬＰに結合したか、好ましくはＶＬＰにパッケージ化されているか又は封入されている少なくとも１つのポリアニオン性巨大分子を更に含む。
【０１０７】
好ましい実施形態において、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子のウイルス様粒子であって、前記ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子は組換えによって宿主により産生され、前記ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子は宿主ＲＮＡを本質的に含まず、前記組成物は少なくとも１つのポリアニオン性巨大分子を含み、前記少なくとも１つのポリアニオン性巨大分子は、前記ＲＮＡ−バクテリオファージのウイルス様粒子に、好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージＱβのウイルス様粒子にパッケージ化されている。更に非常に好ましい実施態様において、前記ポリアニオン性巨大分子は、ポリグルタミン酸および／またはポリアスパラギン酸であって、好ましくはポリグルタミン酸である。
【０１０８】
この記載において、本願明細書で使用される「本質的に宿主ＲＮＡを含まない」なる用語は、ＶＬＰにより含まれる宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸の量を指し、典型的に及び好ましくはＶＬＰの１ｍｇにつき、３０ｍｇ未満、好ましくは２０ｍｇ未満、より好ましくは１０ｍｇ未満、更により好ましくは８ｍｇ未満であり、更により好ましくは６ｍｇ、更に好ましくは４ｍｇ未満であり、最も好ましくは２ｍｇ未満である。最も好ましくは、前記ＶＬＰおよび／または本発明の前記組成物に含まれる宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸は、検出限界の下にある。前述の記載において使われているように、宿主はＶＬＰが組換えにより産生される宿主を指し、前記宿主は、典型的に及び好ましくは、大腸菌である。ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を決定する従来法は、当業者に知られている。本発明に係る、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を決定する典型的及び好適な方法は、ＷＯ２００６／０３７７８７Ａ２の実施例１７に記載されている。同一、類似または相似の条件が、典型的に及び好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰを含む本発明の組成物のために、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量の測定のために使われる。最終的に必要とされる条件の変更は、当業者の知識の範囲内である。決定される量の数値は、典型的に及び好ましくは、示された値の±１０％の偏差、好ましくは±５％の偏差を有する値を含むものとして理解されるべきである。
【０１０９】
宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸：「宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸」なる用語は、もともと宿主によって合成されたＲＮＡまたは好ましくは核酸を指す。しかしながら、ＲＮＡ、好ましくは核酸は、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を減らすか又は除去する手順において、化学的および／または物理的変化を被る可能性があり、典型的に及び好ましくは本発明の方法により、例えば、ＲＮＡ、好ましくは核酸のサイズが短く成る可能性やその二次構造が変えられる可能性がある。宿主ＲＮＡまたは核酸なる用語はこれらの分解生成物を含む。
【０１１０】
宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸の量の減少させること又は除去することは、不必要なＴ細胞応答（例えば炎症性Ｔ細胞応答及び細胞障害性Ｔ細胞応答）と他の不必要な副作用を（例えば発熱）を最小限に抑えるかまたは減らし、その一方で抗原に対して強い抗体反応を維持する。
【０１１１】
一態様では、本発明は、本発明の組成物を産生する方法に関し、前記方法は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＶＬＰを提供すること；（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有するＮＧＦ抗原を提供すること、及び（ｃ）組成物を産生するために前記ＶＬＰと前記ＮＧＦ抗原を結合する工程を含み、前記ＮＧＦ抗原と前記ＶＬＰは、第１の付着部位および第２の付着部位で連結される。別の好ましい実施形態では、少なくとも一つの第１の付着部位を有する前記ＶＬＰを提供する工程は、更に（ａ）前記ウイルス様粒子、好ましくはＲＮＡ−バクテリオファージの前記ウイルス様粒子を、前記コートタンパク質、その変異体またはその断片に分解すること、（ｂ）前記コートタンパク質、その変異体またはその断片を精製すること；（ｃ）前記精製されたコートタンパク質、その変異体またはその断片をウイルス様粒子に再組立てする工程を含み、好ましくは前記ウイルス様粒子は、宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まない。なお更に好ましい実施態様において、前記精製されたコートタンパク質を再組立てすることは、少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子の存在下で遂行される。少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子の存在下で、ＲＮＡ−バクテリオファージのコートタンパク質を再組立てする方法は、例えば、ＷＯ２００６／０３７７８７Ａ２において開示される。
【０１１２】
ある態様では、本発明は、本発明の組成物を含むワクチンの組成物を提供する。
【０１１３】
更なる態様において、本発明はワクチンの組成物を提供し、前記ワクチンの組成物は、本発明の組成物の何れか一つの治療的有効量を含むかまたはそれから成る。
【０１１４】
更に好ましい実施例では前記ワクチンの組成物は、少なくとも一つのアジュバントを含む。少なくとも１つのアジュバントの投与は、本発明の組成物の投与の前、同時にまたは後に生じる。本願明細書において使用する「アジュバント」なる用語は、宿主のデポーの生成を可能にする免疫応答または免疫物質の非特異的刺激因子を指し、本発明のワクチン組成物及び医薬組成物とそれぞれ組合わせた場合、より増強された免疫応答を提供することができる。少なくとも一つのアジュバントの実施態様は、完全及び不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、アルミニウム塩類及び修飾されたムラミルジペプチドを含むか、好ましくはそれから成る。更なるアジュバントは、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、例えばリゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール及びＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコルネバクテリウム・パルバムのような役立つ可能性があるヒトアジュバントである。このようなアジュバントも、また公知技術である。本発明の組成物と共に投与されることができる更なるアジュバントは、一リン酸化脂質免疫修飾物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩類（ミョウバン）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４とＶｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術を含むが、これに限定されるものではない。なお更なるアジュバントは免疫賦活性核酸、好ましくは、主鎖に１又は複数の修飾、好ましくはホスホロチオネート修飾を含む免疫賦活性核酸を含む。修飾は分解に対して核酸を安定させるためである。
【０１１５】
他の好ましい実施形態において、ワクチンの組成物はアジュバントを欠く。アジュバントの非存在下でさえ、本発明の有利な特徴は、組成物の高い免疫原性である。したがって、患者へのワクチンの組成物の投与は、好ましくはワクチンの組成物の投与の前、同時又は後に、同じ患者に少なくとも一つのアジュバントを投与せずに起こる。ＶＬＰは一般にアジュバントとして記載されていた。しかしながら、本出願の記載で使われる場合は「アジュバント」なる用語は、ＶＬＰではなく、むしろ前記ＶＬＰに付け加えて本発明のために使用するアジュバントを指す。
【０１１６】
本発明のワクチン組成物は、その投与が受容個体によって許容されることができる場合、「薬学的に許容可能である」と言われている。更に、本発明のワクチン組成物は、「治療上の有効量」、すなわち所望の生理作用を産生する量において投与される。本発明において、所望の生理作用は、典型的に及び好ましくは、疼痛の抑制または縮小である。
【０１１７】
ある態様では、本発明は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体と共に本発明の組成物またはワクチン組成物を含む。好ましい実施態様において、前記医薬組成物は、本発明の組成物の治療上の有効量を含む。組成物またはワクチンの組成物が個体に投与される場合、それは塩類、バッファー、アジュバントまたはコンジュゲートの効果を改良するために所望の他の物質を含む形態であってもよい。医薬組成物の調製ために使用する適切な物質の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990))を含む数多くの出典に提供されている。医薬組成物の更なる成分は、無菌水性（例えば、生理食塩水）か非水溶媒及び懸濁液とを含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。担体または密封包帯は、皮膚透過性を増大してと抗原吸収を改良するために用いることができる。
【０１１８】
本発明は、好ましくはＮＧＦ抗原に対する免疫化の方法を更に開示し、前記方法は、動物に、好ましくはヒトに、組成物、ワクチンの組成物または医薬組成物を投与することを含む。動物は、好ましくは哺乳類、例えばマウス、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマと特にヒトである。組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、前記動物に、好ましくはヒトに、従来技術の様々な方法によって、投与されることができる。典型的に及び好ましくは、組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、注射、注入、吸入または経口投与によって、前記動物に、好ましくは前記ヒトに投与される。更に好ましくは、組成物、ワクチン組成物または医薬組成物は、筋肉内に、静脈内に、経粘膜的に、経皮的に、鼻腔内に、腹膜内にまたは皮下に投与される。
【０１１９】
一態様では、本発明は、疼痛を予防するか、又は特に治療するための方法を提供し、前記方法は、前記組成物、前記ワクチン組成物または前記医薬組成物を、動物に、好ましくはヒトに投与することを含み、典型的に及び好ましくは、前記動物、好ましくは前記ヒトは、疼痛に苦しんでいる。好ましい一実施形態において、前記疼痛は、侵害受容性疼痛である。非常に好適な実施態様において、前記疼痛は、慢性的な炎症性疼痛である。更に好ましい実施態様において、疼痛は、骨関節炎疼痛、リウマチ様関節炎疼痛、癌性疼痛、内臓痛、慢性的な腰痛症及び慢性的な頭痛、または慢性的な頭痛、膵臓炎痛、膀胱炎痛または前立腺炎痛を含む。非常に好適な実施態様において、前記疼痛は、骨癌性疼痛である。好ましい一実施形態において、疼痛は、損傷によって生じる。
【０１２０】
好ましい一実施形態において、前記疼痛は、例えば、損傷による神経圧縮／神経外傷によって、帯状疱疹後神経痛のような神経細胞の感染によって生じることがある、脳卒中または変性神経疾患または幻想肢痛のような神経細胞の損害につながっている状態の神経障害疼痛である。
【０１２１】
本発明の更なる態様は前記組成物の、前記ワクチン組成物のまたは前記医薬品組成物の医薬としての使用である。
【０１２２】
別の態様において、本発明は、動物、好ましくはヒトの疼痛の治療のための医薬の製造のための、前記組成物のまたは前記ワクチン組成物の使用を提供し、好ましくは前記疼痛は、侵害受容性疼痛または神経障害疼痛である。非常に好適な実施態様において、前記疼痛は、慢性的な炎症性疼痛である。更なる好ましい実施態様において、前記疼痛は、骨関節炎疼痛、リウマチ様関節炎疼痛、癌性疼痛、内臓痛、慢性的な腰痛症及び慢性的な頭痛、または慢性的な頭痛、膵臓炎痛、膀胱炎痛または前立腺炎痛を含む。非常に好適な実施態様において、前記疼痛は、骨癌性疼痛である。好ましい一実施形態において、疼痛は、損傷によって生じる。
【０１２３】
別の態様において、本発明は、動物の、好ましくはヒトの疼痛の治療のための本願明細書において記載の組成物、ワクチン組成物または医薬組成物を提供し、更に好ましくは前記組成物、前記ワクチン組成物または前記医薬組成物は、前記動物に、好ましくは前記ヒトに投与されることになっており、なお更に好ましくは前記疼痛は侵害受容性疼痛または神経障害疼痛である。
【０１２４】
ある実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＶＬＰがＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰであり、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦタンパク質とリンカーを含み、好ましくは前記ＮＧＦタンパク質は、配列番号２２から成り、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記第１の付着部位はバクテリオファージＱβの前記ＶＬＰのリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位は前記リンカーを含み、前記リンカーはペプチド結合によって前記ＮＧＦタンパク質に融合し、前記第２の付着部位はシステインのスルフヒドリル基であり；好ましくは前記第１の付着部位と前記第２の付着部位は、ヘテロ二官能性架橋剤で、好ましくはＳＭＰＨによって連結されるものを含むか、本質的にそれから成るか、又は好ましくはそれから成る。
【０１２５】
ある実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）、前記ＶＬＰはＲＮＡ−バクテリオファージＱβのＶＬＰであり、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ断片とリンカーを含み、好ましくは前記ＮＧＦ断片は配列番号４４から成り、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記第１の付着部位はバクテリオファージＱβの前記ＶＬＰのリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位は前記リンカーを含み、前記リンカーはペプチド結合によって前記ＮＧＦタンパク質に融合し、前記第２の付着部位はシステインのスルフヒドリル基であり；好ましくは前記第１の付着部位と前記第２の付着部位は、ヘテロ二官能性架橋剤で、好ましくはＳＭＰＨによって連結されるものを含むか、本質的にそれから成るか、又は好ましくはそれから成る。
【０１２６】
ある実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＶＬＰはＲＮＡ−バクテリオファージＱβであり、及び（ｂ） 少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ突然変異タンパク質とリンカーを含み、好ましくは前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は、配列番号４５から７５の何れか一つから成り；（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記第１の付着部位はバクテリオファージＱβの前記ＶＬＰのリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位は前記リンカーを含み、前記リンカーはペプチド結合によって前記ＮＧＦタンパク質に融合し、前記第２の付着部位はシステインのスルフヒドリル基であり；好ましくは前記第１の付着部位と前記第２の付着部位は、ヘテロ二官能性架橋剤で、好ましくはＳＭＰＨによって連結されるものを含むか、本質的にそれから成るか、又は好ましくはそれから成る。
【０１２７】
ある実施形態において、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＶＬＰは、配列番号１を含むかまたは好ましくはそれから成り、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原とリンカーとを含み、前記ＮＧＦ抗原は、（ｉ）ＮＧＦタンパク質、好ましくは配列番号２２；（ｉｉ）ＮＧＦ断片、好ましくは配列番号４４；及び（ｉｉｉ）ＮＧＦ突然変異タンパク質、好ましくは配列番号４５から７５の何れか一つ；から成るグループから選択され、（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記第１の付着部位は配列番号１の前記ＶＬＰのリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位は前記リンカーを含み、前記リンカーはペプチド結合によって前記ＮＧＦタンパク質に融合し、前記第２の付着部位はシステインのスルフヒドリル基であり；好ましくは前記第１の付着部位と前記第２の付着部位は、ヘテロ二官能性架橋剤で、好ましくはＳＭＰＨによって連結されるものを含むか、本質的にそれから成るか、又は好ましくはそれから成る。
【０１２８】
ある実施態様において、（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＶＬＰはＲＮＡ−バクテリオファージＱβであり、及び（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原とリンカーとを含み、前記ＮＧＦ抗原は、（ｉ）ＮＧＦタンパク質、好ましくは配列番号２２；（ｉｉ）ＮＧＦ断片、好ましくは配列番号４４；及び（ｉｉｉ）ＮＧＦ突然変異タンパク質、好ましくは配列番号４５から７５何れか一つ；から成るグループから選択され；（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結し、前記第１の付着部位はバクテリオファージＱβの前記ＶＬＰのリジン残基のアミノ基であり、前記第２の付着部位は前記リンカーを含み、前記リンカーはペプチド結合によって前記ＮＧＦタンパク質に融合し、前記第２の付着部位はシステインのスルフヒドリル基であり；好ましくは前記第１の付着部位と前記第２の付着部位は、ヘテロ二官能性架橋剤で、好ましくはＳＭＰＨによって連結され、更に前記組成物は、少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子を含み、前記ポリアニオン性巨大分子は前記ＶＬＰにパッケージ化され、好ましくは前記ポリアニオン性巨大分子はポリグルタミン酸であるものを含むか、本質的にそれから成るか、又は好ましくはそれから成る。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】免疫マウスの精製されたトータルＩｇＧによるｍＮＧＦのインビトロ中和。ｍＮＧＦβに応答するＴＦ−１細胞の増殖は、ＢｒｄＵ取込みを介して測定された。Ｑβ免疫化動物の１０μｇ／ｍｌのトータルＩｇＧの存在下において、１０ｎｇの／ｍｌのｍＮＧＦβに応答する増殖は１００％とセットされ、他の全ての状態に応答するＴＦ−１増殖は、その値に関して算出した。円は、Ｑβ免疫化動物のＩｇＧ２と共にプレインキュベーションした後に由来する値を表わし、正方形はＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ−免疫化動物からのＩｇＧと共にプレインキュベーションした後に由来する値を表わす。三組の平均＋／−ＳＤを示す。
【図２】臨床スコアの発現とＣＩＡマウスの平均体重。マウスは日０、１０及び２０において免疫化され、ＣＩＡは日２７及び４８において誘導された。Ａ）Ｑβ（黒四角）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの臨床関節炎スコア。値は、マウスにつき全ての四肢のスコアの平均及びグループ（ｎ＝８）＋／−ＳＥＭとして示す。Ｂ）Ｑβ（黒四角）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの平均体重。値は平均体重（ｎ＝８）＋／−ＳＥＭとして示す。
【図３】ザイモサンＡで誘発された炎症性疼痛における熱過敏性及び機械的異痛症。マウスは日０、１０及び２０において免疫化され、炎症性疼痛は日３１に左後足へのザイモサンＡの注射によって誘導された。Ａ）足撤回時間として測定された、Ｑβ（黒四角）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの熱過敏性。値は平均（ｎ＝４）＋／−ＳＥＭとして与えられる。Ｂ）足撤回を引き起こす加圧力として測定された、Ｑβ（黒四角）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの機械的異痛症。値は平均（ｎ＝４）＋／−ＳＥＭとして与えられる。
【図４】Ｑβ−（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ免疫化マウスにおいて、ザイモサンＡで誘発された炎症性疼痛における熱過敏性及び機械的異痛症。マウスは日０、１４、２８及び４２で免疫化され、炎症性疼痛はザイモサンＡの左後足への注入によって日６２に誘発された。Ａ）足撤回時間として測定された、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）（黒四角）、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（黒三角）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの機械的異痛症。値は平均（ｎ＝４）＋／−ＳＥＭとして与えられる。Ｂ）足撤回を引き起こす加圧力として測定された、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）（黒四角）、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（灰色丸）またはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（白丸）によって免疫化されたマウスの機械的異痛症。値は平均（ｎ＝４）＋／−ＳＥＭとして与えられる。
【実施例】
【０１３０】
実施例１
ｍｐｒｏＮＧＦβｃＤＮＡの原核生物の発現ベクターへのクローニング
マウスｐｒｏＮＧＦβは、マウスの胎児性脳組織のｃＤＮＡライブラリから以下のプライマーを使用してＰＣＲによって増幅された：Ｎｄｅ−ｐｒｏＮＧＦ−Ｆ（配列番号２６）及びｐｒｏＮＧＦ−Ｘｈｏ−Ｒ（配列番号２７）。ＰＣＲ産物は、ＮｄｅＩとＸｈｏＩによって消化されて、ｐＭ−Ｈｉｓ−ＧＧＣベクターにライげーションされた。結果として生じるプラスミドはｐＭ−ｐｒｏＮＧＦ−ＨｉｓＧＧＣという名前をつけられ、それはマウスＮＧＦβ、Ｈｉｓ６タグおよびＣ末端に２つのグリシン続いてシステインを含むリンカーを含む融合タンパク質をコードする。
【０１３１】
実施例２
ｐＣＢ２８＿ｐｒｏＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ真核生物の発現ベクターの構築
ｍｐｒｏＮＧＦβ配列は、ｐＭ−ｐｒｏＮＧＦ−ＨｉｓＧＧＣベクターから、以下の２つのプライマーを使用するＰＣＲによって増幅された：ｍｐｒｏＮＧＦｅｕｋ＿ｖａｒ１＿ｆ（配列番号２８）及びｍｐｒｏＮＧＦｅｕｋ＿ｖａｒ１＿ｒ（配列番号２９）。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン）にライゲーションされた。ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターはＰａｃＩとＸｈｏＩによって消化され、結果として生じるｍｐｒｏＮＧＦβ−ＨｉｓＧＧＣ断片はｐＣＢ２８ベクターにライげーションされる。結果として生じるプラスミドは、ｐＣＢ２８＿ｍｐｒｏＮＧＦ＿Ｈｉｓ＿Ｃという名前をつけられ、ｍｐｒｏＮＧＦβ配列、Ｈｉｓ６タグ及びＣ末端に２つのグリシン続いてシステインを含むリンカーが続くｐＳＥＣＴａｇ２／ＨｙｇｒｏＡ，Ｂ，Ｃベクター（インビトロゲン）に由来したγイムノグロブリンのカッパ軽鎖に由来するシグナル配列をコードする。
【０１３２】
実施例３
２９３Ｔ ＨＥＫ細胞のｐＣＢ２８−ｐｒｏＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの発現
ピューロマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＢ２８＿ｐｒｏＮＧＦ＿Ｈｉｓ＿Ｃ発現ベクターの１μｇは、２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロゲン）と７．５μｌのリポフェクタミン２０００（インビトロゲン）と混合されて、１．５＊１０６のＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションさせた。４時間後に、細胞に、１０％のＦＣＳと１％の非必須アミノ酸（インビトロゲン）を含むＤ−ＭＥＭ培地を再供給した。２４時間後、１ｍｇ／ｌのピューロマイシン（インビトロゲン）は、ピューロマイシン耐性の選択を可能にするために、培地に加えられた。ピューロマイシン耐性細胞は、１０ｍｇ／ｌの還元型グルタチオン（Ｆｌｕｋａ）、１６１ｍｇ／ｌのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｆｌｕｋａ）１％の非必須アミノ酸、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロゲン）及び１ｍｇ／ｌのピューロマイシンを含むＦＣＳ−なしのＤ−ＭＥＭ培地のポリ‐Ｌ‐リジン被覆ローラーボトルにおいて増殖させた。
【０１３３】
ピューロマイシン耐性細胞の上清は収集されて、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター装置（ミリポア）によって濃縮されて、還元条件下で１２％のＮＵＰＡＧＥビス／トリス・ゲル（インビトロゲン）上で泳動した。ＮＧＦの発現は、抗ペンタ・ヒスチジン−特異的抗体（キアゲン）を使用するイムノブロット分析によって視覚化された。発現は、Ｈｉｓタグとリンカー（配列番号３０）を含む、期待サイズ１４．７ｋＤａの成熟ｍＮＧＦβに対応する約１５ｋＤａのバンドの視覚化によって証明された。ｍｐｒｏＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から上清中に放出された成熟ｍＮＧＦβ−ＨｉｓＧＧＣの正しい処理は、エドマン分解によって確認され、ＳＳＴＨＰを成熟ｍＮＧＦβの５つのＮ末端基アミノ酸として明らかにした。これは、成熟したｍＮＧＦβの５つの期待されるアミノ酸に対応し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞によるｍｐｒｏＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣへの処理と正しい発現を確認した。
【０１３４】
実施例４
ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの精製
ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣは、Ｎｉ２＋−親和性精製によりＨＥＫ２９３Ｔの上清から精製された。簡潔に、上清は１／１０量のニッケル−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）結合バッファー（５００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのイミダゾール、１００ｍＭのβ−メルカプトエタノール、ｐＨ８）を添加され、それからカラムに詰められた平衡化Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズ（キアゲン）にペリスタル型ポンプを使用して４℃で１６時間カラムに注入された。結合後、カラムはＡＥＫＴＡ清浄器ＦＰＬＣシステムに接続され、Ｎｉ−ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗビーズは非特異的に結合した不純物の量を減らすために洗浄バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８）の４カラム体積によって洗われた。続いて、ｍＮＧＦβは、２カラム体積の洗浄から溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８）の勾配によって溶出させられた。溶出したタンパク質は、精製の品質を点検するために、還元条件下、１２％のＮＵＰＡＧＥビス／トリス・ゲル上で泳動した。非常に純粋なｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣが、このような方法で引き出される場合があり、実施例７にて説明したようにＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの更なる発現のために使われた。
【０１３５】
実施例５
モノクローナル抗体によるｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの認識
天然タグと比較してｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣとマウスの顎下腺から精製されるリンカーなしのｍＮＧＦβの結合性は、捕獲のためのモノクローナル抗ＮＧＦβ抗体（ケミコン・インターナショナル）及び検出のためのポリクローナル・ヒツジ抗ｍＮＧＦβ抗体（ケミコン・インターナショナル）を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定された。簡潔には、モノクローナル抗ｍＮＧＦβ抗体は、カーボネイト・バッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）に０．８５μｇ／ｍｌに希釈し、マイクロタイタウェル上に４℃でオーバーナイトで被覆した。次に、プレートはＰＢＳ−０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄され、その後３７℃で２時間、２％のＢＳＡのＰＢＳ−Ｔ溶液によってブロックされた。次に、プレートは０．２から２００ｎｇ／ｍｌのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの濃度増加と共に室温で２時間暖められ、顎下腺から分離されたｍＮＧＦβは１％ＢＳＡのＰＢＳ−Ｔ溶液に希釈した。次に、プレートは、ＰＢＳ−Ｔで６回洗浄されて、室温で１時間１０ｍｇ／ｍｌのヒツジ抗ｍＮＧＦβ抗体と共にインキュベートされた。ＰＢＳ−Ｔによる６回の洗浄後、プレートは、６０μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ抱合型ウサギ抗ヒツジ抗体（ケミコン・インターナショナル）と共に室温で３０分間暖められた。ＰＢＳ−Ｔによる６回の最終的な洗浄工程の後、酵素反応は、１０ｍｇのＯＰＤ基質（Ｆｌｕｋａ）及び８μｌのＨ２Ｏ２（３０％）の２５ｍｌのクエン酸バッファー（６６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭのクエン酸、ｐＨ５）溶液からなる１００ｍｌの溶液を全てのウェルに加えることによって開始した。呈色反応は５％のＨ２ＳＯ４で停止され、吸光度はＥＬＩＳＡ読取り器（バイオラド）を使用して４５０ｎｍで測定された。ＥＬＩＳＡは、両方ともに組換えにより発現されたｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣとｍＮＧＦβの等しい認識を明らかにし、これはｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣは正しく発現され、正しい三次元構造に折り畳まれたことを示す。
【０１３６】
実施例６
ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの生理活性
ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの生理活性は、他（Ｒ＆Ｄ ＮＧＦβ産物シート）に記載されているように、ｍＮＧＦβ反応性因子依存性ヒト赤白血病ＴＦ−１細胞株（ＡＴＣＣ）を、読出し装置として使用して、インビトロ細胞増殖アッセイにおいて試験した。簡潔には、１０４のＴＦ−１細胞は、９６ウェルの平底プレートのウェルにつき、１００μｌのＤＭＥＭ培地（１０％のＦＣＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のＧｌｕｔａｍａｘで補充された）にまかれた。０．８から１００ｎｇ／ｍｌに増大する濃度のマウスの顎下腺から精製されたｍＮＧＦβ−ＨｉｓＧＧＣまたはｍＮＧＦβは、細胞に加えられた。４８時間後、細胞はＢｒｄＵ標識試薬（ロシュ・ダイアグノスティク）により、増殖細胞に組み込まれるために、標識された。２４時間後に、細胞は固定され、続いてペルオキシダーゼ抱合型抗−ＢｒｄＵモノクローナル抗体（ロシュ・ダイアグノスティク）と共にインキュベートされた。十分な洗浄後、１００μｌのテトラベンジル−ベンジジン基質溶液を各ウェルに与えた。呈色反応は５％のＨ２ＳＯ４で停止され、吸光度はＥＬＩＳＡ読取り器（バイオラド）を使用して４５０ｎｍで測定された。顎下腺からのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣとｍＮＧＦβは同じように増殖を刺激し、これはｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣが生物学的に活性であることを示した。
【０１３７】
実施例７
Ｑβ−ＶＬＰへのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの結合
Ｑβ−ＶＬＰ（２ｍｇ／ｍｌ）は、５倍のモル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノネート（ＳＭＰＨ，Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、室温で３０分間、反応させた。ＳＭＰＨは、ジメチルスルホキシド中に溶解された５０ｍＭストックから取り出された。反応生成物は、１０ｋＤａの分子量カットオフ（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ， Ｐｉｅｒｃｅ）と共に、結合バッファー（２０ｍＭのＭＥ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン、ｐＨ６）に対して２回透析された。透析は、室温で行われた。このような方法で誘導体化されるＱβ−ＶＬＰが、次に標的タンパク質に結合させるために使われた。
【０１３８】
結合前に、実施例４に記載の通りに得られた精製されたｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣは、結合バッファー中に透析され、５モル過剰量のＴＣＥＰと共に室温（ＲＴ）で１時間、還元された。還元されたｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）は、４℃で４時間１００μｌの総容積で誘導体化されたＱβ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）と共に暖められた。反応の完了後、反応チューブは、ありうる沈殿を取り除くために遠心分離機にかけられた。結合反応は還元条件下で１２％のＮｕＰＡＧＥビス／トリス・ゲル上で結合産物を泳動することによって分析され、抗−ペンタＨｉｓ抗体によりイムノブロット分析し、Ｑβ−ＶＬＰへのｍＮＧＦβの有効な結合を明らかにした。タンパク質濃度はブラッドフォードで測定された。
【０１３９】
実施例８
Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの免疫原性
雄のＤＢＡ／１マウスは、アジュバントの非存在下で日０、日１０と日２０において、実施例７から得られるｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣに結合する５０μｇのＱβ ＶＬＰによって、皮下に免疫化された。ネガティブコントロールのマウスはＱβ−ＶＬＰだけによって免疫化された。日１０、２０と３０に血液は採取された。血清は、血清管（Ｍｉｒｏｔａｉｎｅｒ、ＢＤバイオサイエンス）の血液サンプルを１０分間、１０．０００ｇで遠心させることによって調製された。血清試料のｍＮＧＦβ−特異的抗体の検出は、コーティングに、マウスの顎下腺から精製される、タグ及びリンカー無しのｍＮＧＦβを使用してＥＬＩＳＡによって行われた。簡潔には、ｍＮＧＦβはカーボネイト・バッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）に２．５μｇ／ｍｌの濃度で希釈し、マイクロタイター・ウェル上に４℃で終夜、被覆した。次に、プレートはＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄され、その後３７℃で２時間、２％ＢＳＡのＰＢＳ−Ｔ溶液によってブロックされた。次に、プレートは、１：２００の開始希釈物から始めて３倍の希釈工程を使用して、ＰＢＳ−Ｔ ＋２％ＢＳＡに希釈した血清試料と共に室温で２時間インキュベートされた。次に、プレートは、ＰＢＳ−Ｔにより６回洗浄され、ペルオキシダーゼ抱合型ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories)の１：１０００希釈によって１時間室温でインキュベートされた。６回洗浄後、酵素反応は、全てのウェルに、１０ｍｇＯＰＤ基質及び８μｌのＨ２Ｏ２（３０％）の２５ｍｌのクエン酸バッファー（６６ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭのクエン酸、ｐＨ５）溶液を加えることによって始まった。呈色反応は５％のＨ２ＳＯ４で停止され、吸光度はＥＬＩＳＡ読取り器（バイオラド）を使用して４５０ｎｍで測定された。ＥＬＩＳＡは、ｍＮＧＦβに対する強い自己抗体応答が上記の免疫化プロトコルを使用してＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって誘発される可能性があることを明らかにした。
【０１４０】
実施例９
Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって上昇する抗体の中和活性
Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによる免疫化によって上昇するインビトロでの抗体の中和活性は、実施例６に記載のように、インビトロ細胞増殖アッセイにおいて試験された。簡潔には、マウスは、実施例８に記載のように、Ｑβ又はＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって免疫化された。免疫化された動物の血清は収集されて、トータルＩｇＧ分画はタンパク質Ｇ精製によって血清から分離された。次に、ＱβまたはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ免疫マウスからの精製されたトータルＩｇＧの、ｍＮＧＦβの生理活性を中和するための能力は、ＴＦ−１細胞増殖アッセイで試験された。簡潔には、１０４のＴＦ−１細胞は、９６ウェルの平底プレートのウェルにつき、１００ｍｌのＤＭＥＭ培地（１０％のＦＣＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のＧｌｕｔａｍａｘで補充された）にまかれた。０．２から１００ｎｇ／ｍｌに増大する濃度の顎下腺から精製されたｍＮＧＦβは、室温で３０分間Ｑβ又はＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣと共に免疫化されたマウスの血清から精製されたトータルＩｇＧと共にプレインキュベートされ、次に細胞に加えられた。４８時間後、細胞はＢｒｄＵ標識試薬（ロシュ・ダイアグノスティク）により、増殖細胞に組み込まれるために、標識された。２４時間後に、細胞は固定され、続いてペルオキシダーゼ抱合型抗−ＢｒｄＵモノクローナル抗体（ロシュ・ダイアグノスティク）と共にインキュベートされた。十分な洗浄後、１００μｌのテトラベンジル−ベンジジン基質溶液を各ウェルに与えた。呈色反応は５％のＨ２ＳＯ４で停止され、吸光度はＥＬＩＳＡ読取り器（バイオラド）を使用して４５０ｎｍで測定された。Ｑβ免疫マウスから１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌのトータルＩｇＧと共にプレインキュベートされたｍＮＧＦβの増加濃度により刺激された細胞は、増殖の抑制を示さなかった。Ｑβ免疫マウスから１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌのトータルＩｇＧと共にプレインキュベートされたｍＮＧＦβの増加濃度により刺激された細胞は、一方でかなり減少した増殖速度を示し、Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（図１）による免疫化によって上昇した抗体のＮＧＦ中和活性を立証した。
【０１４１】
実施例１０
コラーゲンによって誘導された関節炎の悪液質の抑制におけるＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣワクチン接種の有効性
自己免疫関節炎の悪液質を減少するＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣワクチンの能力は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、いわゆるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）のマウスモデルにおいて評価された。このモデルにおいて、ＲＡは、完全フロイント・アジュバント（ＣＦＡ）のコラーゲン２型（MD Biosciences）の皮内注射によって、続いて２１日後に、不完全フロイント・アジュバント（ＩＦＡ）のコラーゲンＩＩ型の皮内注射によって、誘発された。炎症は絶え間なく進行して、減量を伴う強直と永続性の関節破壊に達する。雄のＤＢＡ／１マウス（ｎ＝８）は日−３５、日−２１及び日−７で５０μｇのＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって免疫化され、同様にネガティブコントロールのマウスはＱβだけで免疫化された。３回の免疫処置後、ＲＡは日０で誘発された。炎症進行は７−９週にわたって監視され、臨床スコアは以下の定義に従って各四肢に割り当てられた：０ 正常、１ 軽度の紅斑および／または趾／足の腫張、２ 完全な足／関節全体にひろがる紅斑と膨張、３ 強直を伴う足／関節の強い膨張、変形。図２Ａは、ＱβとＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ免疫動物の両方における関節炎の進行を示す。関節炎は、両群において非常に同じように進行した。同期間に、マウスの体重は、毎日測定され（図２Ｂ）、特にＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ免疫マウスの悪液質に関連する自己免疫の抑制を示す疾患の発症の後、両群間の平均体重に相当なずれを示した。
【０１４２】
実施例１１
マウスのザイモサンＡ誘導炎症性疼痛モデルの炎症性疼痛の抑制におけるＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣワクチン接種の有効性
雄のＢＬ／６マウスの後足の足底側へのイースト抽出物ザイモサンＡ（シグマ）の注入によって生じる熱的及び機械的刺激に応答して、Ｑβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣワクチンの炎症性過敏症を減じる能力を以下のようにして評価した：雄のＢＬ／６マウス（ｎ＝４）は、５０μｇのＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ単独により、日０、１０及び２０に免疫化された。各時点で、両後足の足底部の熱過敏症は、熱的及び機械的刺激に応じて決定された。熱感受性の測定のために、所定の強度の熱源（赤外線ビーム）による刺激後の足撤回の待ち時間が測定された。待ち時間は、電子制御計測器（Plantartest、Ugo Basile)で測定された。無処置の動物で待ち時間がほぼ１６秒となるように、熱源の強度は調整された。各後足ごとに、６回の測定値が取られ、平均値を算出した。機械的感受性を測定するために、いわゆるフォン・フレイ・フィラメントによる刺激への反応が測定された。フォン・フレイ・フィラメントは、増大する圧力をマウス足の足底部に適用できる調整されたプラスチック・フィラメントである。電子制御計測器（IITC, Woodland Hills, USA)により、足撤回にを導いた加圧力が測定された。６回の測定は足ごとに行われ、平均値を計算された。日３１において、炎症性疼痛は、左後足の足底部に、ザイモサンＡの３ｍｇ／ｍｌ溶液を２０μｌ注入によって誘発された。ザイモサンＡ誘導の炎症が開始した直後に生じる熱的及び機械的刺激に応答する過敏症は、炎症性疼痛の誘導の２時間、４時間、６時間、８時間、１日、２日、３日、４日、及び７日後に、上記のように足撤回により測定された。図３に証明されたように、Ｑβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって免疫化された動物は、Ｑβだけによって免疫化される動物と比較して、熱的（図３Ａ）及び機械的刺激（図３Ｂ）の後でかなり減少した過敏症を示した。
【０１４３】
実施例１２
慢性的な収縮性損傷により誘導されたマウスの神経障害疼痛モデルにおける神経障害疼痛の抑制におけるＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの有効性
雄のＢＬ／６マウス（ｎ＝６）は、５０μｇのＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ単独により日０、１４及び２８に免疫化される。実施例１１に記載のように、各時点で、両後足の足底部の熱過敏症は、熱的及び機械的刺激への応答で測定された。日４２に、慢性的収縮損傷（ＣＣＩ）は、座骨神経を結さつするか又はそれを影響を受けないままにすることによって誘発される（見かけ作動した対照群）。座骨神経の結さつ術によって、各四肢の過敏症が生じ、それは１４日以内に発現し、消えるまで別に２−３週間持続する。ＣＣＩは、神経障害疼痛の確立された齧歯類モデルである。ＣＣＩ手術後、熱的及び機械的刺激に応答する感受性は、実施例１１にて説明したように、一日おきに測定される。
【０１４４】
実施例１３
ヒトＮＧＦβのクローニング、発現、精製及びＱβ−ＶＬＰに対する結合
ヒトｐｒｏＮＧＦβはＰＣＲによってヒト胎児性脳組織ｃＤＮＡライブラリーから増幅され、ＰＣＲ産物はｐＣＢ２８発現ベクターにライゲーションされる。結果として生じるプラスミドは、ｐＣＢ２８＿ｈｕｐｒｏＮＧＦ＿Ｈｉｓ＿Ｃという名前をつけられ、ガンマイムノグロブリンのカッパ軽鎖に由来するシグナル配列、続いてｈｕｐｒｏＮＧＦβ配列、Ｈｉｓ６タグ及びＣ末端で２つのグリシンに続いてシステインを含むリンカーをコードする。真核生物発現ベクターｐＣＢ２８＿ｈｕｐｒｏＮＧＦ＿Ｈｉｓ＿Ｃは実施例３に記載のように、基本的にＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションし、実施例４に記載のように、成熟ｈｕＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣを含む上清は基本的にＮｉ−ＮＴＡによって精製のために収集される。精製されたタンパク質は、配列番号３１に記載の配列を有する。精製されたｈｕＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣは、実施例７に記載のプロトコルに従って、ＳＭＰＨ誘導体化されたＱβ−ＶＬＰに結合する。
【０１４５】
実施例１４
ポリアニオン性巨大分子ポリグルタミン酸を含むＱβ粒子に結合するｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによるワクチン接種の有効性
ポリアニオン性巨大分子ポリグルタミン酸を含むＱβ粒子（以後Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）と呼ぶ）は、ＷＯ０６／０３７７８７の実施例４に説明の通りに生成された。実施例７に先に記載したように、ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣはＱβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）に結合された。Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣの免疫原性は、以下のようにして決定された：雌のＢＬ６マウス（グループにつきｎ＝４）は、アジュバントとして０．３３％のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌと混合されたＱβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣのいずれか５０ｕｇにより日０、１４、２８および４２に皮下に免疫化された。日０、１４、２８、４２及び５６に、採血された。血清は調製され、ｍＮＧＦβ−特異的抗体が実施例８に記載のようにＥＬＩＳＡによって決定された。Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによる免疫化によって誘導される抗ｍＮＧＦβ−特異的抗体のタイターは、Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによって誘導されるものより有意に低く、減少したＩｇＧ２ａであるが高いＩｇＧ１抗体価により示されるようにＴｈ２ ＩｇＧアイソタイプ・パターンを示した。
表１：Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによる免疫化後のｍＮＧＦ−特異的抗体の誘導。マウスは、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ−ｍＮＧＦ−Ｈｉｓ−ＧＧＣにより日０、１４、２８及び４２で免疫化された。血液は日０、１４、２８、４２及び５６に採血され、血清は生成された、血清試料のｍＮＧＦ特異的トータルＩｇＧ、ＩｇＧ１アイソタイプ及びＩｇＧ２ａアイソタイプのタイターはＥＬＩＳＡによって分析された。
【０１４６】
Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣにより免疫化によって誘発される抗−ｍＮＧＦβ特異的自己抗体の、ザイモサンＡ誘導化炎症性疼痛モデルにおいて侵害受容性疼痛を抑制する能力は、以下のようにして評価した：雌のＢＬ６マウス（グループにつきｎ＝４）は、アジュバントとして０．３３％のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌと混合されたＱβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣのいずれか５０μｇにより日０、１４、２８および４２に皮下に免疫化された。日６２に、炎症性疼痛は、左後足の足底側に、ザイモサンＡの３ｍｇ／ｍｌ溶液を２０ｍｌ注入することによって誘導された。過敏症を減らすワクチンの能力は、実施例１１に説明したように、熱的及び機械的刺激に応じて評価された。図４に示したように、Ｑβ（ＰｏｌｙＧｌｕ）−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによりワクチン接種によって誘導される抗−ｍＮＧＦβ自己抗体レベルは、熱的及び機械的刺激後に過敏症を減らすのに十分だった。減少は、Ｑβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによる免疫化後に観察されたものと類似していた。
【０１４７】
実施例１５
Ｑβ−ｍＮＧＦｂ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによる神経障害疼痛の抑制；ラットのタキソール誘発性神経障害疼痛モデルの有効性
成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、５００μｇのＱβ−ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＱβ単独により日０、１４及び２８に免疫化される。日３５に、神経障害疼痛は、一日おきに（３５、３７、３９、４１）２ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルの４回の腹こう内投与によって誘発される。ｐａｌｉｔａｘｅｌの最後の注射３日後に開始し、４週間連続で続けて、、変化した痛覚感受性の試験は、実施例１１でマウスについて記載されているように基本的に後足の足底の表面上に、熱的痛覚過敏と機械的異痛症を測定することによって一日おきに行われる。
【０１４８】
実施例１６
Ｑβ−ＶＬＰに結合する抗原候補としてのＮＧＦ突然変異タンパク質の評価
上記の配列修飾を有するＮＧＦ突然変異タンパク質（配列番号４５から７５）は組換えにより発現されて、実施例１−４にて説明したように精製される。実施例４に記載されているように、産生された突然変異タンパク質の生理活性は基本的にインビトロ生理活性アッセイにおいて試験される。実施例７に記載されているように、インビトロ・アッセイにおいて低い生理活性を有する突然変異タンパク質から生理活性を有さない突然変異タンパク質は選択され、本質的にＱβ ＶＬＰと結合させた。実施例８及び９に記載されているように、Ｑβ−ＶＬＰに結合する突然変異タンパク質の免疫原性及び誘導された抗体の中和活性を測定する。Ｑβ−ＶＬＰに結合する場合、低い生理活性を有するか生理活性を有さないが、それでも中和抗体を誘導する突然変異タンパク質が、選択される。疼痛と悪液質を抑制する誘導された抗体のインビボ有効性は、実施例１０−１５にて説明したように、インビボモデルにおいて試験される。
【０１４９】
実施例１７
ＡＰ２０５ ＶＬＰに対するｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ及びＦｌａｇペプチド抗原の結合、及びＡＰ２０５ ＶＬＰに結合したｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣによるマウスの免疫処置
Ａ．組換えＡＰ２０５ ＶＬＰへのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣペプチド及びＦｌａｇ ペプチドの結合
ペプチドｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣ（配列番号３１）及びＦｌａｇ（配列番号４３）は公知技術の方法に従って化学的に合成される。ＡＰ２０５ ＶＬＰ（配列番号１４）は発現して、ＰＣＴ／ＥＰ２００３／００７５７２（７５−７９頁）の実施例１及び２に説明したように精製され、２０ｍＭのＨｅｐｅｓと１５０ｍＭのＮａＣｌのバッファー（ｐＨ７．４）（ＨＢＳバッファー）に再溶解した。再溶解されたＡＰ２０５ＶＬＰは、２ｍｇ／ｍｌブラッドフォード・アッセイで測定）の濃度で、２．８５ｍＭのＳＭＰＨ（ピアス）と、３０分間室温（ＲＴ）で反応させる。次に、反応混合物は、ＨＢＳバッファーに対して透析されて、５０ｍＭのＤＭＳＯストックから反応混合物に希釈した０．７１４ｍＭのｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣまたはＦＬＡＧと反応させる。結合反応は、１５℃で２時間進行させたままにし、反応混合物は２×２時間、１０倍体積のＨＢＳに対して透析し、保存用アリコートは液体窒素で急速冷凍され、更なる使用までの−８０℃で保存する。アリコートは解凍され、ＡＰ２０５サブユニットに結合された抗原は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価され、タンパク質濃度は、ブラッドフォード・アッセイで測定される。架橋結合剤によるＡＰ２０５ ＶＬＰの誘導体化に応じて、架橋性によって産生される二量体、三量体、四量体、五量体及び六量体は、サブユニットの一量体形態に加えて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて検出される。
Ｂ．組換えＡＰ２０５ ＶＬＰに結合するｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣペプチドによるマウスの免疫化 免疫応答の解析及びＩｇＧサブタイプの決定
ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣペプチドに結合したＡＰ２０５ ＶＬＰは、日０と１４にマウス（各３匹）の皮下に注入される。各マウスはＰＢＳで２００μｌにまで希釈された１０μｇワクチンによって免疫化される。マウスは日２０に後眼窩から採血され、ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣペプチドに特異的な抗体のタイターは、ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣペプチドに対してＥＬＩＳＡで測定された。ｍＮＧＦβ−Ｈｉｓ−ＧＧＣは、化学架橋剤スルホ−ＳＰＤＰを使用してウシＲＮＡｓｅ Ａに結合する。ＥＬＩＳＡプレートは、１０μｇ／ｍｌの濃度で、結合したＲＮＡｓｅ調製物によりコートされる。プレートはブロックされて、次に連続的に希釈されたマウス血清によって暖められる。結合抗体は、それぞれのサブタイプごとに酵素により標識された抗マウスＩｇＧ抗体によって検出される。対照として、同じマウスの免疫化前の血清も試験される。
【０１５０】
実施例１８
ＡＰ２０５ＶＬＰに対するｍＮＧＦβ断片の融合及びＡＰ２０５ＶＬＰに融合したｍＮＧＦβ断片によるマウスの免疫処置
ｍＮＧＦβ１−１０ペプチドのＮ−またはＣ末端部に融合されたＡＰ２０５を含むコンストラクトは、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５４７２１の実施例１において開示される方法によって得られた。発現された融合タンパク質の精製の方法は、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５４７２１の実施例２にて開示したものと実質的に同じである。ＰＡＰ４０５及びｐＡＰ２８３のコンストラクトと配列は、それぞれＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５４７２１及びＷＯ２００４／００７５３８Ａ２に記載されている。成熟雌、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（グループに付き５匹）はｍＮＧＦβ １−１０ペプチドにＣ末端に融合されたＡＰ２０５によってワクチン接種された（配列番号４４）。５０μｇの透析されたワクチンは、２００μｌの量にＰＢＳに希釈されて、日０、１４、２８及び４２に皮下に注入された（腹側２箇所に１００μｌ）。ワクチンはアジュバントなしで投与された。対照として、マウスの１グループは、ＰＢＳと共に又はＡＰ２０５ ＶＬＰ単独で注入された。マウスは日０、１４、２８、４２、５６及び７０に、後眼窩から採血され、それらの血清はＥＬＩＳＡによって分析された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）；及び
（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原
を含む組成物であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原であり；
（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結される、組成物。
【請求項２】
前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦタンパク質、ＮＧＦ断片またはＮＧＦ突然変異タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦタンパク質であり、前記ＮＧＦタンパク質はアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列は配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を含み、好ましくは前記ＮＧＦタンパク質は配列番号２２のアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ断片であり、好ましくは前記ＮＧＦ断片には配列番号４４を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも一つの抗原がＮＧＦ突然変異タンパク質であり、好ましくは前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は減少した生物学的活性を含み、最も好ましくは前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は生物学的活性を含まない、請求項１から４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも一つの抗原がＮＧＦ突然変異タンパク質であり、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質が配列番号４５から７５の何れか一つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＶＬＰはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰであり、
好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージは
（ａ）バクテリオファージＱβ；
（ｂ）バクテリオファージＲ１７；
（ｃ）バクテリオファージｆｒ；
（ｄ）バクテリオファージＧＡ；
（ｅ）バクテリオファージＳＰ；
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；
（ｇ）バクテリオファージＭ１１；
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；
（ｋ）バクテリオファージｆ２；
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及び
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなるグループから選択される、請求項１から６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質、その変異体又はその断片を含み、好ましくは前記コートタンパク質は、配列番号１を含むか又は好ましくはそれから成る、請求項１から７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の付着部位は、少なくとも一つの共有結合を介して前記第２の付着部位に連結される、請求項１から８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記共有結合は非ペプチド結合である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１の付着部位が、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれである、請求項１から１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第２の付着部位が、スルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの共有結合はペプチド結合であり、好ましくは前記ＶＬＰはＲＮＡ−バクテリオファージＡＰ２０５のＶＬＰである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＶＬＰが組換えＶＬＰであり、前記組換えＶＬＰが宿主ＲＮＡを本質的に含まない、請求項１から１３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子を含み、前記ポリアニオン性巨大分子は前記ＶＬＰにパッケージ化され、好ましくは前記ポリアニオン性巨大分子はポリアニオン性ポリペプチドまたはアニオン性デキストランである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリアニオン性巨大分子は、（ａ）ポリグルタミン酸；（ｂ）ポリアスパラギン酸；（ｃ）ポリ（ＧｌｕＡｓｐ）；及び（ｄ）（ａ）から（ｃ）の任意の化学修飾からなるグループから選択されるポリアニオン性ポリペプチドであり、好ましくは前記ポリアニオン性ポリペプチドはポリグルタミン酸および／またはポリアスパラギン酸であり、より好ましくは前記ポリアニオン性ポリペプチドはポリグルタミン酸である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリアニオン性巨大分子はアニオン性デキストランであり、前記アニオン性デキストランは
（ａ）デキストラン硫酸；
（ｂ）カルボキシメチル・デキストラン；
（ｃ）スルホプロピル・デキストラン；
（ｄ）メチル・スルホナート・デキストラン；及び
（ｅ）デキストラン・ホスフェイト
から成るグループから選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物の治療上の有効量を含むをワクチン組成物であって、更に好ましくはアジュバントを含む前記ワクチンの組成物。
【請求項１９】
（ａ）請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物；及び
（ｂ）薬学的に許容可能な担体
を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物、請求項１８に記載のワクチン組成物、または請求項１９に記載の医薬組成物を動物、好ましくはヒトに投与すること含む免疫化方法。
【請求項２１】
医薬として使用するための請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物、請求項１８のワクチン組成物、または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
疼痛の、好ましくは慢性疼痛の、最も好ましくはリウマチ様関節炎疼痛を治療するための医薬の製造のための、請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物の使用、又は請求項１８のワクチン組成物の使用。
【請求項２３】
疼痛の、好ましくは慢性疼痛の、最も好ましくはリウマチ様関節炎疼痛の治療に使用するための請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物、請求項１８のワクチン組成物、または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＶＬＰを提供すること；
（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つのＮＧＦ抗原を提供すること；及び
（ｃ）前記組成物を産生するために前記ＶＬＰと前記ＮＧＦ抗原を連結し、前記ＮＧＦ抗原と前記ＶＬＰは、前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結されること
を含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物を製造する方法。
【請求項１】
（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）；及び
（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つの抗原
を含む組成物であって、前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ抗原であり；
（ａ）と（ｂ）は前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結される、組成物。
【請求項２】
前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦタンパク質、ＮＧＦ断片またはＮＧＦ突然変異タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦタンパク質であり、前記ＮＧＦタンパク質はアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列は配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を含み、好ましくは前記ＮＧＦタンパク質は配列番号２２のアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも一つの抗原はＮＧＦ断片であり、好ましくは前記ＮＧＦ断片には配列番号４４を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも一つの抗原がＮＧＦ突然変異タンパク質であり、好ましくは前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は減少した生物学的活性を含み、最も好ましくは前記ＮＧＦ突然変異タンパク質は生物学的活性を含まない、請求項１から４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも一つの抗原がＮＧＦ突然変異タンパク質であり、前記ＮＧＦ突然変異タンパク質が配列番号４５から７５の何れか一つから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＶＬＰはＲＮＡ−バクテリオファージのＶＬＰであり、
好ましくは前記ＲＮＡ−バクテリオファージは
（ａ）バクテリオファージＱβ；
（ｂ）バクテリオファージＲ１７；
（ｃ）バクテリオファージｆｒ；
（ｄ）バクテリオファージＧＡ；
（ｅ）バクテリオファージＳＰ；
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２；
（ｇ）バクテリオファージＭ１１；
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１；
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５；
（ｋ）バクテリオファージｆ２；
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及び
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
からなるグループから選択される、請求項１から６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＶＬＰは、ＲＮＡ−バクテリオファージの組換えコートタンパク質、その変異体又はその断片を含み、好ましくは前記コートタンパク質は、配列番号１を含むか又は好ましくはそれから成る、請求項１から７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１の付着部位は、少なくとも一つの共有結合を介して前記第２の付着部位に連結される、請求項１から８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記共有結合は非ペプチド結合である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１の付着部位が、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそれである、請求項１から１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第２の付着部位が、スルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも一つの共有結合はペプチド結合であり、好ましくは前記ＶＬＰはＲＮＡ−バクテリオファージＡＰ２０５のＶＬＰである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＶＬＰが組換えＶＬＰであり、前記組換えＶＬＰが宿主ＲＮＡを本質的に含まない、請求項１から１３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物は少なくとも一つのポリアニオン性巨大分子を含み、前記ポリアニオン性巨大分子は前記ＶＬＰにパッケージ化され、好ましくは前記ポリアニオン性巨大分子はポリアニオン性ポリペプチドまたはアニオン性デキストランである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリアニオン性巨大分子は、（ａ）ポリグルタミン酸；（ｂ）ポリアスパラギン酸；（ｃ）ポリ（ＧｌｕＡｓｐ）；及び（ｄ）（ａ）から（ｃ）の任意の化学修飾からなるグループから選択されるポリアニオン性ポリペプチドであり、好ましくは前記ポリアニオン性ポリペプチドはポリグルタミン酸および／またはポリアスパラギン酸であり、より好ましくは前記ポリアニオン性ポリペプチドはポリグルタミン酸である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリアニオン性巨大分子はアニオン性デキストランであり、前記アニオン性デキストランは
（ａ）デキストラン硫酸；
（ｂ）カルボキシメチル・デキストラン；
（ｃ）スルホプロピル・デキストラン；
（ｄ）メチル・スルホナート・デキストラン；及び
（ｅ）デキストラン・ホスフェイト
から成るグループから選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物の治療上の有効量を含むをワクチン組成物であって、更に好ましくはアジュバントを含む前記ワクチンの組成物。
【請求項１９】
（ａ）請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物；及び
（ｂ）薬学的に許容可能な担体
を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物、請求項１８に記載のワクチン組成物、または請求項１９に記載の医薬組成物を動物、好ましくはヒトに投与すること含む免疫化方法。
【請求項２１】
医薬として使用するための請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物、請求項１８のワクチン組成物、または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
疼痛の、好ましくは慢性疼痛の、最も好ましくはリウマチ様関節炎疼痛を治療するための医薬の製造のための、請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物の使用、又は請求項１８のワクチン組成物の使用。
【請求項２３】
疼痛の、好ましくは慢性疼痛の、最も好ましくはリウマチ様関節炎疼痛の治療に使用するための請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物、請求項１８のワクチン組成物、または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
（ａ）少なくとも一つの第１の付着部位を有するＶＬＰを提供すること；
（ｂ）少なくとも一つの第２の付着部位を有する少なくとも一つのＮＧＦ抗原を提供すること；及び
（ｃ）前記組成物を産生するために前記ＶＬＰと前記ＮＧＦ抗原を連結し、前記ＮＧＦ抗原と前記ＶＬＰは、前記少なくとも一つの第１の付着部位と前記少なくとも一つの第２の付着部位を通して連結されること
を含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物を製造する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１１−５０６５８２（Ｐ２０１１−５０６５８２Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８７９９（Ｐ２０１０−５３８７９９）
【出願日】平成２０年１２月２２日（２００８．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８２０９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０８２３
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（３０４０４２３７５）サイトス バイオテクノロジー アーゲー (26)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２２日（２００８．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８２０９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０８２３
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（３０４０４２３７５）サイトス バイオテクノロジー アーゲー (26)
【Ｆターム（参考）】
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