神経細胞死抑制剤
プロサイモシンα１又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤を提供し、これによって神経細胞死を伴う疾患の治療手段を確立する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、プロサイモシンα１（以下、「ＰＴＡ１」という）を有効成分として含有する神経細胞死抑制剤及び神経細胞死を伴う疾患の治療剤に関する。
【背景技術】
ヒト脳では数百億個もの神経細胞が複雑なネットワークを構成しているが、数少ない神経幹細胞からの神経新生機構を考慮に入れないならば、基本的にはその細胞数は生後においては、ただ減少するばかりである。百数十年といわれる長い寿命の期間、様々な外来性、内因性のストレスに対して脳は様々な保護機構を駆使し、生存を維持している。脳自身のもつ保護機構には神経−グリアや神経−神経間に存在するコミュニティーが相互に影響しあってその高度な役割を維持すべく働いている。最もよく知られた神経保護メカニズムは神経栄養因子やサイトカインなどの分子によって機能されているものである。こうした神経栄養因子は様々なストレス条件下に見られるプログラム神経細胞死（アポトーシス）を抑制する働きを有するものとして知られている。もう一つのメカニズムは神経新生であり最近の報告では脳虚血ストレス下に神経新生が亢進するとの報告はなされているが大量に細胞死に陥る神経を補うには十分ではないことが予想される。
脳虚血時には虚血中心部コアの部分で破壊的な細胞死であるネクローシスが観察されるが、この細胞死は細胞内容物を外部に放散するため、本来ならば細胞傷害作用は更に周囲に拡散するはずである。ところが数日の後には周囲のペナンブラと呼ばれる領域では、細胞の断片化や凝縮、ミクログリアなどによる貪食といったアポトーシスに特有の現象が観察される。このようなペナンブラにみられるアポトーシスは、傷害部位を限局させることにより脳全体の傷害を防止する一種の保護機構として機能するものであると考えられる（非特許文献１参照）。
上述した脳虚血時にみられるネクローシスからアポトーシスへの細胞死形態の変換は、ある特定の物質によって引き起こさせるものと推定されているが（非特許文献１参照）、現在までのところ、その物質は明らかになっていない。
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、ネクローシスからアポトーシスへ細胞死形態を変換することのできる物質を特定することを目的とする。
〔非特許文献１〕 植田弘師，濱邉和歌子 日薬理誌１１９，７９−８８（２００２）
【発明の開示】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、サイモシンの前駆体であると考えられていたＰＴＡ１が（Ａ）神経細胞に作用し、ネクローシスを抑制する機能（ネクローシス抑制機能）、（Ｂ）神経細胞に作用し、アポトーシスを促進する機能（アポトーシス促進機能）、及び（Ｃ）マイクログリアに作用し、アポトーシスを抑制する物質（神経栄養因子）の分泌を促進し、間接的にアポトーシスを抑制する機能（間接的アポトーシス抑制機能）を有することを見出した。
以上の機能から、神経細胞に対してのみ作用する場合（培養神経細胞にＰＴＡ１を添加するような場合）には、ＰＴＡ１は神経細胞の細胞死形態をネクローシスからアポトーシスに変換し、神経細胞とマイクログリアに作用する場合（ｉｎ ｖｉｖｏでＰＴＡ１を投与するような場合）には、ＰＴＡ１は神経細胞のネクローシス及びアポトーシスの両者を抑制することになる。
本発明は、以上の知見から完成されたものである。
即ち、本発明は、ＰＴＡ１又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤である。
また、本発明は、ＰＴＡ１又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを有効成分として含有する神経細胞死を伴う疾患の治療剤である。
更に、本発明は、配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチド又はこれらのペプチドと実質的に同一のペプチドである。
以下、本発明を詳細に説明する。
ＰＴＡ１は、既知のタンパク質であるが、上述したネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能を有することは、本発明者によって初めて見出されたものである。
これらの３つの機能は、以下のような機序で発現するものと推定される（図１）。
（Ａ）ネクローシス抑制機能
１）神経細胞におけるＰＴＡ１の受容体との結合
２）グルコーストランスポーターの細胞表面への移動
３）細胞内のグルコース量増大
４）ミトコンドリアからのＡＴＰ産生量の増大
５）ネクローシスの抑制
（Ｂ）アポトーシス促進機能
１）神経細胞におけるＰＴＡ１の受容体との結合
２）神経細胞におけるＢａｘおよびＢｉｍタンパク質の発現増大とＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬタンパク質の発現減少
３）ミトコンドリアからのチトクロームｃの放出
４）カスパーゼの活性化
５）ＣＡＤの活性化
６）アポトーシスの促進
（Ｃ）間接的アポトーシス抑制
１）グリア細胞におけるＰＴＡ１の受容体との結合
２）グリア細胞における神経栄養因子およびサイトカイン遺伝子の発現増大
３）神経細胞における神経栄養因子受容体（Ｔｒｋ）およびサイトカイン受容体の活性化
４）アポトーシスの抑制
以上の知見から、ＰＴＡ１は、神経細胞死抑制剤として利用することができる。
神経細胞抑制剤に使用するＰＴＡ１は特に限定されず、ヒト由来のＰＴＡ１、ラット由来のＰＴＡ１、マウス由来のＰＴＡ１などを使用することができる。これらの生物から実際に得られたＰＴＡ１のアミノ酸配列を図２に示す。また、これらのＰＴＡ１の中から特に３種類のＰＴＡ１のアミノ酸配列を配列番号１（ヒト由来）、配列番号２（ラット由来）、配列番号３（マウス由来）に示し、更に、各配列を整列させた図を図３に示す。ヒト、ラット、マウス以外の生物由来のＰＴＡ１としては、ウシ由来のＰＴＡ１、カエル由来のＰＴＡ１なども使用することができる。これらのＰＴＡ１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等にそれぞれＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＴＮＢＯＡ１、ＣＡＣ３９３９７として登録されている。
ＰＴＡ１の代わりにＰＴＡ１と同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを使用することもできる。ここで「ＰＴＡ１と同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチド」とは、ＰＴＡ１の持つネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能のすべて又は一部を持つタンパク質若しくはペプチドを意味する。このようなタンパク質若しくはペプチドとしては、例えば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列で表されるタンパク質が含まれる。ここで、欠失等するアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常は、２０個以内であり、好ましくは１０個以内であり、特に好ましくは５個以内である。また、「ＰＴＡ１と同等の機能を有するペプチド」には、ＰＴＡ１から得られ、上述したネクローシス抑制機能等を有するペプチドフラグメントも含まれる。このようなフラグメントとしては、配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチドやこれらのペプチドと実質的に同一のペプチドを例示することができる。ここで「実質的に同一のペプチド」とは、配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列で表され、ＰＴＡ１の持つネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能のすべて又は一部を持つペプチドをいう。欠失等するアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常５個以内であり、好ましくは３個以内であり、特に好ましくは１個である。なお、図２中の配列番号４に対応するアミノ酸配列（図２において、ラット活性本体のアミノ酸配列と同じ列に位置するアミノ酸配列）で表されるペプチドは、この「実質的に同一のペプチド」に含まれる。
ＰＴＡ１は、マイクログリアが存在する条件では間接的にアポトーシスを抑制するが、マイクログリアが存在しない条件ではアポトーシスを抑制しない（逆にアポトーシスを促進する）。従って、本発明の神経細胞死抑制剤は、使用の態様により、ネクローシスのみを抑制する場合とネクローシスとアポトーシスの両者を抑制する場合とがある。
本発明の神経細胞死抑制剤の適用対象とする神経細胞は特に限定されず、大脳皮質、線条体、中脳、海馬、小脳、脊髄、視覚器由来の神経細胞などの細胞死の抑制に適用できる。
ＰＴＡ１は、神経細胞死抑制剤としてだけでなく、神経細胞死を伴う疾患の治療剤としても利用することができる。ここで「神経細胞死を伴う疾患」とは、アポトーシス、ネクローシス、又はその両者を伴う疾患をいう。このような疾患には、脳卒中、外傷性脳傷害、緑内障、糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性傷害などの虚血が原因となっている疾患が含まれるほか、虚血以外の原因による疾患や原因がよくわからない疾患、例えば、アルツハイマー、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症なども含まれる。なお、ここでいう「治療」には、疾患を完治させる場合のみならず、病状を軽減させる場合や病状の悪化を阻止する場合なども含まれる。
本発明の神経細胞死を伴う疾患の治療剤は、ＰＴＡ１を公知の方法に従い薬学的に許容される担体あるいは希釈剤と混合することにより製剤化される。適当な担体および希釈剤、並びにタンパク質を含む製剤については、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等に記載されている。
ＰＴＡ１に関して、投与に適した剤型は特に限定はされないが、既に医薬として使用されている多くのタンパク質を含む薬学的組成物と同様に注射剤として調製されることが好ましい。より具体的に言えば、ＰＴＡ１を、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤とする。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護材として添加して調製可能である。また、リボソーム等の封入体にポリペプチドを包埋させて投与することも可能である。
ＰＴＡ１を上述した疾患の治療に用いるとき、その用量は、対象の年齢、体重、病状、および投与経路、その他の要素により異なるが、投薬する医師が容易に適宜決定することができる。例えば、緑内障治療のため硝子体内投与する場合には、１回量約０．００１２ｍｇ〜０．０１２ｍｇの投与であり、脳卒中治療のため脳室内投与する場合には、１日量約０．０１２ｍｇ〜１．２ｍｇの投与である。
ＰＴＡ１の投与方法は特に限定されず、脳内投与する場合も現在実際に行われている様々な投与方法を採用することができる。このような投与方法の一例として、大槽内投与を挙げることができる。大槽内投与は、脳実質を傷つけないという点で有利である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、神経細胞及びマイクログリアに対するＰＴＡ１の作用を模式的に表した図である。
第２図は、ヒト、ラット、マウスなどの生物から実際に得られたＰＴＡ１のアミノ酸配列を示す図である（図２ａのアミノ酸配列の右端と図２ｂのアミノ酸配列の左端がつながり、図２ｂのアミノ酸配列の右端と図２ｃのアミノ酸配列の左端がつながる。）。
第３図は、ヒト、ラット、及びマウス由来のＰＴＡ１のアミノ酸配列を示す図である。
第４図は、培養神経細胞に対して生存活性を持つタンパク質の精製工程を示す図である。
第５図は、生存活性を持つタンパク質のリジルエンドペプチターゼ消化物の逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。
第６図は、神経細胞の生存活性と、ラットｒＰＴＡ１のコーティング量との関係を示す図である。
第７図は、大脳皮質、線条体、中脳、又は海馬由来の神経細胞の生存活性と、ラットｒＰＴＡ１のコーティング量との関係を示す図である。
第８図は、神経細胞の生存活性と、神経細胞培養時に添加したラットｒＰＴＡ１の欠損部位との関係を示す図である。
第９図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞の蛍光顕微鏡写真である。
第１０図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞の透過型電子顕微鏡写真である。
第１１図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞の細胞内ＡＴＰ含量の経時的変化を示す図である。
第１２図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞の細胞内ＡＴＰ含量変化に対するＣａｌ Ｃ又はＵ−７３１２２の添加の効果を示す図である。
第１３図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞の２−ＤＧ取り込み作用に対するＣａｌ Ｃ又はＵ−７３１２２の添加の効果を示す図である。
第１４図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞におけるＧＬＵＴ１又はＧＬＵＴ４の細胞中の位置を示す蛍光顕微鏡写真である。
第１５図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞におけるチトクロームｃの位置を示す蛍光顕微鏡写真である。
第１６図は、ラットｒＰＴＡ１によるアポトーシスメカニズム誘発機構としてのＢｃｌ−２ファミリータンパク質発現調節を示す図である。
第１７図は、ラットｒＰＴＡ１による神経細胞の生存活性に対する神経栄養因子の添加効果を示す図である。
第１８図は、ラットｒＰＴＡ１による神経細胞におけるチトクロームｃの位置変化とＢＤＮＦ共存による変化を示す蛍光顕微鏡写真である。
第１９図は、細胞及び培養上清中のＰＴＡ１量の経時的変化を示す図である。
第２０図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養されたマイクログリア及び神経細胞におけるＩＬ−６ｍＲＮＡ発現量の経時的変化を示す図である。
第２１図は、マウスＰＴＡ１のＡＳ−ＯＤＮを硝子体投与した後、虚血処置を施したマウスから調製した網膜細胞層の光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡写真である。
第２２図は、マウスｒＰＴＡ１の硝子体投与を虚血前あるいは後に施したマウスから調製した網膜細胞層の光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡写真である。
第２３図は、マウスｒＰＴＡ１の脳室内投与後に頸動脈虚血処置を施したマウスから調製した前額断片切片の顕微鏡写真である。
第２４図は、頸動脈虚血処置を施したマウスにおける、Ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ潜時に対するマウスｒＰＴＡ１の脳室内投与の効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
最初に本実施例において使用した実験材料及び方法について説明する。
初代培養
胎生１７日胚ラットの大脳皮質の初代培養は、Ｓａｓａｋｉ Ｙ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｎ．Ｙｏｓｈｉｄａ Ａ．ａｎｄ Ｕｅｄａ Ｈ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）１８，４８７−４９６．に記載した方法に従って行った。分散した細胞はあらかじめポリＤＬ−オルニチン（シグマ製）によりコーティングした９６ウェル培養ディッシュ、８ウェルのＬａｂ−ＴｅｋＴＭチャンバー、３．５と９ｃｍの培養ディッシュにまき、３７℃、５％の二酸化炭素中で培養した。培養上清は５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度（高密度）で３日間培養した上清をＭｉｌｅｘフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、使用まで−２０℃で保存した。上清は低密度（１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）培養に添加する場合と、培養直前に培養プレートに加え２５℃、２時間インキュベートし、後にＰＢＳで２回洗浄する方法でコーティングする場合とによった。
乳酸脱水素酵素遊離実験
細胞傷害は、傷害を受けた細胞から培養上清中に遊離した細胞質乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製（ドイツ、マンハイム）の細胞毒性検出キットを用い、同社のプロトコールに従い測定することにより定量した。具体的には以下の通りである。
９６ウェル培養プレートに３．２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ウェルの１７日胚大脳皮質細胞をまき、培養開始から一定の時間後、１００μｌ培養上清を取り、これに１００μｌの２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え総量２００μｌとした。その１００μｌを取り分け９６ウェルプレートに移し、キット反応液１００μｌをさらに加え、９０分間室温暗所でインキュベートし、４５０ｎｍの波長での吸光度測定を行い、最大ＬＤＨ遊離量とした。一方、培養上清に遊離したＬＤＨ量は培養上清（５０μｌ）を９６ウェルプレートに移し、５０μｌの２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、さらにキット反応液１００μｌを加えたのち吸光度測定することにより求め、最大ＬＤＨ遊離量に対するパーセント相対ＬＤＨ遊離量として評価した。
ＷＳＴ−８アッセイ
細胞の生存活性には２−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＷＳＴ−８）還元活性キット（同人研究所、東京）を用い、添付のプロトコールに従って実験を行った。ＷＳＴ−８は比色測定の３時間前加え、３７℃でインキュベートした。生存活性は培養開始直後の活性に対する割合（パーセント）として求めた。
トリパンブルー色素排除試験
神経細胞死は、トリパンブルーの細胞からの排除機能低下により評価した。
培養細胞にメディウムと同容量の０．４％トリパンブルー液を添加し、５分間放置した後、氷冷ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳに溶解した４％パラホルムアルデヒドにより室温、３０分間固定した。細胞死の割合は全細胞に対する割合（％）で評価した。
細胞内ＡＴＰ量の測定
測定にはルシフェリン−ルシフェラーゼ法をＡＴＰ定量キット（モレキュラープローブ社、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて行った。２ｘ１０６の全細胞を用い、氷冷したＰＢＳで２回洗浄後、細胞希釈溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７５，４ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。０．５ｍＭルシフェリン、１．２５μｇ／ｍｌのルシフェラーゼと１ｍＭ ＤＴＴを２０μｌの細胞懸濁液に混合した。ルシフェリンールシフェラーゼバイオルミネッセンス測定は、ＥＧ＆Ｇ ｂｅｒｔｈｏｌｄ社（Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＬＵＭＡＴ ＬＢ ９５０７を用いて行った。
アネキシンＶ結合およびＰＩ染色実験
アポトーシスとネクローシスはそれぞれロッシュ・モレキュラーバイオケミカルズ社のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＬＵＯＳ染色Ｋｉｔとシグマ社のプロピディウム・イオダイド（ＰＩ）を用いて評価した。大脳皮質細胞を８ウェルのＬａｂ−ＴｅｋＴＭチャンバーで培養し、一定時間後にアネキシンＶフルオセインと１０μｇ／ｍｌ ＰＩを添加し、室温１５分間暗所でインキュベートした。その後細胞は氷冷ＰＢＳで洗浄し、室温３０分間４％ＰＦＡを用いて固定した。蛍光はカールツァイス社のＬＳＭ４１０蛍光顕微鏡を用いて測定した。
ＴＵＮＥＬ解析
アポトーシスを示す細胞におけるＤＮＡ断片化はｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）法を用いて組織化学的に測定した。８ウェルのＬａｂ−ＴｅｋＴＭチャンバーで培養した細胞を１０μｇ／ｍｌ ＰＩと３７℃、３０分間インキュベートし、２回の氷冷ＰＢＳ洗浄と４％ＰＦＡ固定の後、５０％と続き１００％の５分間メタノール処置により透過型にした。その後、ロッシュ・モレキュラーバイオケミカルズ社のＴＵＮＥＬ液で３７℃、１時間処置し、２回のＰＢＳ洗浄、室温１時間のブロック液（ＰＢＳに溶解した１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）とのインキュベート後、さらにｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）（１：１００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と室温１．５時間インキュベートし、蛍光顕微鏡測定を行った。
活性型カスパーゼ３の免疫細胞化学
８ウェルのＬａｂ−ＴｅｋＴＭチャンバーで培養した細胞をＰＦＡで固定した後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過型にした。室温で１時間ブロック液（２％ｌｏｗ−ｆａｔ ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ，２％ウシ血清アルブミン，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０をｐＨ７．４ＰＢＳに溶解したもの）とインキュベートし、活性型カスパーゼ３抗体（１：５０；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と室温２時間インキュベート、洗浄の後、ＦＩＴＣ結合型抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２００；Ｃａｐｐｅｌ，Ａｕｒｏｒａ）と室温４時間インキュベートし、蛍光顕微鏡観察を行った。
透過型電子顕微鏡観察
培養大脳皮質細胞を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２．５％グルタルアルデヒドと室温１時間インキュベートすることにより固定化し、後に１％四酸化オスミウムを用いて室温１時間の後固定を行った。続いて、アルコール脱水の後、Ｅｐｏｎ８１２包埋を行い、Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｓ（Ｌｅｉｃａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて８０ｎｍの超薄切片作製を行った。切片は酢酸ウランとクエン酸鉛を用いてそれぞれ３０と５分間の染色を行い、電子顕微鏡（ＪＥＭ−１２１０；ＪＥＯＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）観察を行った。
イムノブロット解析
１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動した試料は一次抗体として抗カスパーゼ８及び９抗体（１：５００；ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ｃａｎａｄａ）と抗活性型カスパーゼ３抗体（１：５００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、抗Ｂａｘ、抗Ｂｉｍ、抗Ｂｃｌ−２、抗Ｂｃｌ−ｘＬ抗体（１：１０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いてイムノブロット解析を行った。免疫活性バンドの検出にはＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の増強化学発光基質（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を用いてｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ測定を行った。
２−デオキシ−Ｄ−［３Ｈ］グルコース取り込み実験
実験は、Ｋｏｉｖｉｓｔｏの方法を改良した方法に従い、以下の通り行った。
大脳皮質細胞を、１７．５ｍＭグルコースを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２メディウムを入れた６ウェルプレート中で培養した。プレートは、リコンビナントＰＴＡ１をコーティングしたものと、コーティングしないものとを用いた。培養開始から一定時間後に［３Ｈ］−２−ＤＧ（１μＣｉ／ｗｅｌｌ，１０ｎＭ）を添加し、３７℃、２時間さらにインキュベートした後、上清の除去と２回の氷冷ＰＢＳによる洗浄を行った。細胞は１００μｌの０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液で溶解し、０．５Ｍ塩酸で中和した後、放射活性を液体シンチレーションカウンターにより測定した。
ＰＫＣキナーゼ活性測定
培養細胞は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．３％ β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ，５０μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ，１０ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅを含む緩衝液で懸濁した後、同容量のグリセロールと混合し、氷上でホモジェナイズした。ＰＫＣ活性はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のプロテインキナーゼＣ酵素活性測定システムを用い、添付プロトコールの手法に従った。培養試料［Ｓ］をＰＫＣでリン酸化される基質（０．３ｍｇ／ｍｌ Ｌａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｓｅｒｉｎ）と混合し５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ並びに［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとマグネシウム−ＡＴＰ ｂｕｆｆｅｒと３７℃、１５分間インキュベートした。最大Ｍａｘｉｍｕｍ ＰＫＣ活性化量［Ｍａｘ］は上記組成に２４ｍｇ／ｍｌ ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ及び１２ｍＭ酢酸カルシウムを添加して測定した。バックグラウンド値［Ｂ］は基質を除いて測定した。停止液を加えて反応を停止し、ペプチド結合紙に吸着させた。この結合紙を５％酢酸で２回洗浄し取り込まれた３２Ｐ放射性活性を液体シンチレーションカウンターにより測定した。ＰＫＣ活性は以下の数式により求めた。ＰＫＣ活性化（％）＝（［Ｓ］−［Ｂ］）／（［Ｍａｘ］−［Ｂ］）ｘ１００
統計解析
多次元分散分析（ＡＮＯＶＡ）解析を行ったのちにＳｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を用いて統計的解析を行った。有意差は危険率０．０５％を基準とし、全ての結果は平均＋標準誤差として表現した。
〔実施例１〕 タンパク質の構造決定とリコンビナントタンパク質の調製
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞培養上清から陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより生存活性を有するタンパク質の精製を行い、これにより分子量約２０ｋＤａと約２２ｋＤａの２種類のタンパク質（ＮＤＩ２０及びＮＤＩ２２）が得られた（図４ａ及びｂ）。なお、生存活性の評価にはＷＳＴ−８アッセイにより行った。
得られた２種類のタンパク質をリジルエンドペプチダーゼ消化したところ、共にＫＥＶＶＥＥＡＥの配列を持つ部分ペプチドが得られた（図５）。また、抽出の条件を変化させてもＮＤＩ２０は安定して検出できたが、ＮＤＩ２２は検出できない場合があった。このことからＮＤＩ２２は、ＮＤＩ２０に別の小分子が吸着したものと予想され、ＮＤＩ２０を活性本体とみなした。このＮＤＩ２０は、データベースからＰＴＡ１であることが推定できたので、ＲＴ−ＰＣＲによりラット及びマウス型のｃＤＮＡクローンを単離、大腸菌に発現させ、酸性フェノール抽出およびバイオフォレシス（アトー株式会社；ＡＥＰ−８２０型）によりリコンビナントＰＴＡ１（以下「ｒＰＴＡ１」という）を調製した。このようにして調製されたｒＰＴＡ１は、もとのＮＤＩ２０と同様の電気泳動上の移動度を示し、マススペクトル（ＶＯＹＡＧＥＲ；（ＭＡＬＤＩ）ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）での分子量も一致した。
〔実施例２〕 ラットｒＰＴＡ１による神経細胞死保護効果
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養し、培養開始から１２時間後の生存活性及び細胞傷害度を評価した。培養は低密度培養（１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）及び高密度培養（５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の２通りの条件で行った（以下、特に断りがない場合は、低密度及び高密度培養は前述した密度で培養するものとする。）。ラットｒＰＴＡ１存在下での培養は、ラットｒＰＴＡ１を３〜５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２の用量で９６ウェルの培養ディッシュに予めコーティングしておき、その上に神経細胞をまいて行った。生存活性はＷＳＴ−８アッセイにより評価し、細胞傷害度はＬＤＨ遊離量により評価した。また、２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２のｒＰＴＡ１存在下で培養した場合の生存活性及び細胞傷害度の経時的変化を調べた。以上の結果を図６Ａ〜Ｄに示す。
図６Ａに示すように、ラットｒＰＴＡ１非存在下で培養した場合は（図中のＶ）、生存活性が培養開始時の４０％程度にまでに低下していたが、ラットｒＰＴＡ１存在下で培養することにより、生存活性は用量依存的に向上した。また、細胞傷害度についても、ラットｒＰＴＡ１による用量依存的な軽減がみられた（図６Ｃ）。
ラット１７日胚の大脳皮質、線条体、中脳、及び海馬から調製した神経細胞を、無血清条件下、０〜５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２のラットｒＰＴＡ１存在下で低密度培養し、１２時間後の生存活性（ＷＳＴ−８アッセイによる）を評価した。また、後根神経節（ＤＲＧ）細胞と大脳皮質神経細胞を、無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１存在下で低密度培養し、１２時間後の細胞死率をトリパンブルー色素排除試験を用いて調べた。以上の結果を図７に示す。
図７Ａに示すように、ラットｒＰＴＡ１による生存活性の向上は、大脳皮質だけでなく線条体、中脳、及び海馬由来の神経細胞においても観察された。大脳皮質や海馬の神経変性はアルツハイマーや老人性痴呆に関連する脳領域であり、線条体の神経変性はハンチントン病に関連し、中脳変性ではパーキンソン病に関連することが知られている。従って、ラットｒＰＴＡ１は、こうした幅広い神経変性疾患に有効である可能性がある。
図７Ｂに示すように、大脳皮質神経細胞では、ラットｒＰＴＡ１存在下で培養することにより用量依存的に細胞死率が低下したが、ＤＲＧ細胞では、細胞死率の低下はみられなかった。
〔実施例３〕 ｒＰＴＡ１欠失変異体による神経細胞死保護効果
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とラットｒＰＴＡ１欠失変異体融合タンパク質発現クローン作製のため、欠失変異体それぞれの領域に対応するプライマーを用いて、すでにクローニング済みのラットｒＰＴＡ１全長のクローンを鋳型にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＸ−５Ｘ−１ベクターにクローニングした。欠失変異体のＧＳＴ融合タンパク質は常法により発現させ、菌体抽出液よりグルタチオン−セファロースカラムを用いて精製した。
このようにして作製したｒＰＴＡ１欠失変異体を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動によって分画し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって可視化したところ、予想されるサイズにバンドが観察されたので（図８Ａ）、これらを用いてラット１７日胚の大脳皮質神経細胞の生存活性を評価した。２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２のｒＰＴＡ１欠失変異体の添加による生存活性は、無血清低密度培養条件下、培養開始１２時間後に測定した。この結果を図８Ｂに示す。
図８Ｂで示すように、ｒＰＴＡ１のＮ末端より４８番目のアミノ酸までを欠失させた変異体および７９番目から１１２番目までのアミノ酸を欠失させた変異体は、ｒＰＴＡ１の完全長と同程度の生存活性の向上が見られたが、Ｎ末端より６８および８６番目のアミノ酸までを欠失させた変異体と３０番目から１１２番目、５８番目から１１２番目までのアミノ酸を欠失させた変異体の生存活性の向上は著明に減弱した。
これらの事実から、ラットｒＰＴＡ１の活性本体が４９番目から７８番目のアミノ酸領域であることが予想される。なお、この４９−７８のフラグメントのアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、ヒトＰＴＡ１において、このフラグメントに対応するフラグメントのアミノ酸配列を配列番号５に示す。
〔実施例４〕 ラットｒＰＴＡ１による神経細胞死モードスイッチ
８ウェルのＬａｂ−ＴｅｋＴＭチャンバーにラット１７日胚大脳皮質神経細胞をまき、無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で低密度及び高密度培養し、３〜２４時間後の細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。細胞は、（１）ＰＩ染色とＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色、（２）ＰＩ染色と活性型カスパーゼ３免疫蛍光染色、（３）ＰＩ染色とＴＵＮＥＬ染色の３通りの方法で染色した。この結果を図９ａ〜ｃ、ｅ〜ｇ、ｉ〜ｋに示す。また、各染色方法によって染色された細胞の数を図９ｄ、ｈ、ｉに示す。
これらの図に示すように、ラットｒＰＴＡ１非存在下で低密度培養した場合には、ネクローシスの指標となるＰＩ染色による赤色蛍光が観察されたが、アポトーシスの指標となるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖによる緑色蛍光は観察されなかった。逆に、高密度培養及びラットｒＰＴＡ１存在下での低密度培養では、ネクローシスの指標となる赤色蛍光は観察されず、アポトーシスの指標となる緑色蛍光が観察された。同様な結果がＰＩ染色と活性型カスパーゼ３免疫蛍光染色、ＰＩ染色とＴＵＮＥＬ染色によっても確認された。これらの事実から、ラットｒＰＴＡ１は神経細胞のネクローシスをアポトーシスに変換させる作用があることが明らかになった。
〔実施例５〕 透過型電子顕微鏡観察によるラットｒＰＴＡ１の神経細胞死モードスイッチ作用
ラット１７日胚大脳皮質神経細胞を、無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で低密度及び高密度培養し、培養開始から１２時間後の細胞の状態を透過型電子顕微鏡で観察した。この結果を図１０に示す。
図１０に示すように、ラットｒＰＴＡ１非存在下で低密度培養した細胞では、細胞膜の傷害、細胞質部分における電子密度の顕著な低下、ミトコンドリアの膨潤化などが観察された。一方、ラットｒＰＴＡ１存在下で低密度培養をした場合では、細胞膜傷害やミトコンドリア膨潤化は観察されなかったが、核の断片化や核クロマチンの凝縮といったアポトーシスに見られる現象が観察された。こうした現象は、高密度培養でも観察された。
〔実施例６〕 ネクローシス機構としてのＡＴＰ含量低下に対するラットｒＰＴＡ１の抑制効果
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を実施例５と同様の条件で培養し、細胞内のＡＴＰ含量の経時的変化を調べた。この結果を図１１に示す。
図１１に示すように、ラットｒＰＴＡ１非存在下で低密度培養を行った場合には、細胞内ＡＴＰ含量は急速に低下し、１８時間後にはほぼ０レベルになった。しかし、高密度培養及びラットｒＰＴＡ１存在下での低密度培養では、細胞内ＡＴＰ含量の低下は有意に抑制された。
〔実施例７〕 ラットｒＰＴＡ１によるネクロース抑制効果のホスホリパーゼＣとプロテインキナーゼＣを介するメカニズム
ラット１７日胚大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度及び高密度培養し、培養開始から６時間後の細胞内ＡＴＰ含量を調べた。培養は、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、培養開始直後にカルフォスチンＣ（Ｃａｌ Ｃ）又はＵ−７３１２２（Ｕ２２）を１μＭになるように添加した。この結果を図１２Ａに示す。なお、カルフォスチンＣはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤であり、Ｕ−７３１２２はホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）阻害剤である。図１２Ａに示すように、ラットｒＰＴＡ１存在下で培養することにより、ＡＴＰ含量の低下は抑制されたが、この効果はＣａｌ Ｃ及びＵ−７３１２２の添加により消失した。
さらにラットｒＰＴＡ１による細胞内ＡＴＰ含量の低下の抑制のメカニズムを調べた。図１２Ｂに示すように、ラットｒＰＴＡ１存在下で培養することにより、ＡＴＰ含量の低下は抑制されたが、この効果はグルコースの取り込み阻害剤である２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）、解糖系の阻害剤であるヨウ化酢酸（ＩＡ）及びミトコンドリアでのＡＴＰ産生の阻害剤であるオリゴマイシン（Ｏｌｉｇｏ）の添加により消失した。したがってラットｒＰＴＡ１による細胞内ＡＴＰ含量低下の抑制は細胞によるグルコース取り込みの後に生じるＡＴＰ産生系上昇を示唆している。
〔実施例８〕 ラットｒＰＴＡ１によるグルコース取り込み低下抑制効果
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、血清存在又は無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で低密度及び高密度培養し、培養開始から２時間後における２−デオキシ−Ｄ−［３Ｈ］グルコース取り込み作用を評価した。この結果を図１３に示す。
図１３に示すように、無血清条件下での培養では、血清存在下での培養と比較し、２−デオキシ−Ｄ−［３Ｈ］グルコース取り込み作用が１０％以下に低下した。ラットｒＰＴＡ１存在下で培養することにより、２−デオキシ−Ｄ−［３Ｈ］グルコース取り込み作用は、血清存在下での培養時の６５％程度にまで回復した。しかし、この低下抑制効果もＣａｌ Ｃ又はＵ−７３１２２を添加することにより消失した。ＡＴＰ含量の急速な低下は、グルコース取り込み作用の低下と関連することが明らかとなり、ラットｒＰＴＡ１のＡＴＰ含量低下抑制効果における第一次反応は、グルコース取り込み作用の低下抑制によるものであることが示唆された。
〔実施例９〕 ラットｒＰＴＡ１によるグルコーストランスポーターの細胞膜表在化効果
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を低密度培養し、培養開始から２時間後の細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。培養は、血清（１０％ＦＢＳ）存在又は無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、培養開始直後にＣａｌ Ｃを１μＭになるように添加した。また、細胞は、ＧＬＵＴ１又はＧＬＵＴ４（これらはグルコーストランスポーターである）を認識する一次抗体と一次抗体を認識する蛍光標識した二次抗体で染色した。この結果を図１４に示す。
図１４に示すように、ＧＬＵＴ１とＧＬＵＴ４の細胞膜表在化は、血清存在下で培養した細胞では観察されたが、無血清条件下で培養した細胞では観察されなかった。ラットｒＰＴＡ１存在下で培養した細胞では、血清が存在しなくても、ＧＬＵＴ１とＧＬＵＴ４の細胞膜表在化が観察されたが、Ｃａｌ Ｃを添加した場合には、このような表在化は消失した。実施例６−９の結果からラットｒＰＴＡ１は細胞膜に存在することが期待される受容体を介し、続いてＰＬＣとＰＫＣの活性化、ＧＬＵＴ１とＧＬＵＴ４の細胞膜表在化、グルコース取り込みの促進、ＡＴＰ産生増加といったメカニズムを駆動することが証明された。
〔実施例１０〕 ラットｒＰＴＡ１によるアポトーシスメカニズム誘発機構としてのミトコンドリアからのチトクロームＣ（Ｃｙｔｏ Ｃ）遊離作用
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度及び高密度培養し、培養開始から１２時間後の細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。培養は、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、培養開始直後にＣａｌ Ｃを１μＭになるように添加した。また、細胞はＣＭＲＸｏｓ（赤色蛍光、ミトコンドリアと結合）と抗Ｃｙｔｏ Ｃ抗体（緑色蛍光、Ｃｙｔｏ Ｃと結合）で二重染色した。抗Ｃｙｔｏ Ｃ抗体は蛍光標識した二次抗体によって認識した。この結果を図１５に示す。
図１５に示すように、ラットｒＰＴＡ１非存在下で低密度培養を行った場合には、ミトコンドリアの位置に緑色蛍光が観察され、Ｃｙｔｏ Ｃは遊離せず、ミトコンドリア内に局在していた。一方、高密度培養やラットｒＰＴＡ１存在下での低密度培養では、緑色蛍光が観察されず、Ｃｙｔｏ Ｃがミトコンドリアから遊離していた。また、このようなＣｙｔｏ Ｃの遊離は、Ｃａｌ Ｃにより抑制された。
Ｃｙｔｏ Ｃ遊離は続くカスパーゼの活性化を引き起こすのでアポトーシス誘発のメカニズムと考えられているので、本実施例はラットｒＰＴＡ１がアポトーシスを積極的に誘発していることを証明している。
〔実施例１１〕 ラットｒＰＴＡ１によるアポトーシスメカニズム誘発機構としてのＢｃｌ−２ファミリータンパク質発現調節
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度培養し、培養開始から経時的に細胞を回収し、イムノブロッティング法で解析を行った。培養は、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、培養開始直後にＣａｌ ＣおよびＵ７３１２２を１μＭになるように添加した。
低密度培養における２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２のラットｒＰＴＡ１処置はＣｙｔｏ Ｃ遊離に促進的なＢａｘ発現の時間依存性の増加を引き起こし（図１６Ａ、Ｂ）、また同様な機能を有するＢｉｍ発現を増加した（図１６Ｂ）。対照的に、Ｃｙｔｏ Ｃ遊離抑制に働くＢｃｌ−２とＢｃｌ−ｘＬの発現を低下させた（図１６Ａ、Ｂ）。ラットｒＰＴＡ１によるＢａｘ増加作用はＵ７３１２２とＣａｌ Ｃにより遮断された（図１６Ｃ）。実施例１０と１１の成績からラットｒＰＴＡ１によるアポトーシスメカニズム誘発機構はネクローシス抑制と同様ＰＬＣとＰＫＣを介し、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の発現調節を介してミトコンドリアからのＣｙｔｏ Ｃ遊離を促進させカスパーゼ系の活性化等のアポトーシスメカニズムにつながることが証明された。
〔実施例１２〕 神経栄養因子によるラットｒＰＴＡ１の細胞死抑制作用増強
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度培養し、培養開始から１２時間後の生存活性（ＷＳＴ−８アッセイによる）を評価した。培養は、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、また、培養開始直後にＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ、又はＩＬ６を１００ｎｇ／ｍｌになるように添加して行った。この結果を図１７に示す。
図１７に示すように、神経栄養因子の添加は、ラットｒＰＴＡ１の細胞死抑制作用を増強した。しかし、これら神経栄養因子単独では、細胞死を抑制する効果はなかった。
〔実施例１３〕 ＢＤＮＦによるラットｒＰＴＡ１のもつアポトーシス誘発効果の抑制
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度培養し、培養開始から１２時間後の細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。培養は、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、培養開始直後にＢＤＮＦを１００ｎｇ／ｍｌになるように添加した。また、細胞の染色は、ＣＭＲＸｏｓ（赤色蛍光、ミトコンドリアと結合）による染色、二次抗体を蛍光標識し認識させた抗Ｃｙｔｏ Ｃ抗体（緑色蛍光、Ｃｙｔｏ Ｃと結合）による染色による二重染色で行った。この結果を図１８に示す。
ラットｒＰＴＡ１のもつＣｙｔｏ Ｃ遊離作用は、ＢＤＮＦ添加により完全に抑制された。実施例１２と１３からｒＰＴＡ１は大脳皮質神経細胞のネクローシスを抑制し、神経栄養因子により保護される形のアポトーシス形態にスイッチさせることが証明された。
〔実施例１４〕 無血清ストレスによる内在性ＰＴＡ１の神経細胞からの遊離
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清又は血清存在下で高密度培養し、内在性ＰＴＡ１の遊離量とＰＴＡ１の細胞内含量を定量した。
内在性ＰＴＡ１遊離は、培養上清の酸性フェノール抽出により濃縮精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開の後、ブルーステイン法により可視化して定量した。一方、細胞内含量はそのまま抽出して同様に定量した。この結果を図１９に示す。
図１９に示すように、無血清条件下での培養では、時間に依存した内在性ＰＴＡ１遊離が観察され、逆に細胞内含量は時間依存的に低下した。また血清存在下での培養では、このような内在性ＰＴＡ１遊離は観察されなかった。このことから、この遊離は無血清あるいは飢餓ストレス誘発性の非古典的遊離であることが示唆された。
〔実施例１５〕 ラットｒＰＴＡ１によるマイクログリア神経栄養因子遺伝子発現増加
ラット１７日胚の大脳から調製したマイクログリアを培養し、一時的に血清を１％にした条件下でラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）を添加し、ＩＬ−６のｍＲＮＡ量（ＲＴ−ＰＣＲ法で定量）の時間的変化を測定した。同様の実験は、マイクログリアの代わりに低密度無血清培養したラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を用いて行った。また、ラットｒＰＴＡ１の添加量を変化させ、ラットｒＰＴＡ１添加から１時間後のＩＬ−６のｍＲＮＡ量を測定した。この際、比較のためシクロフィリンのｍＲＮＡ量も測定した。以上の結果を図２０Ａ、Ｂ及びＣに示す。
ラットｒＰＴＡ１の添加により、マイクログリアのＩＬ−６遺伝子の発現量が顕著に増大した（図２０Ａ）。このような遺伝子発現の増大は、０．１から２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２の用量範囲で観察された（図２０Ｂ）。また、神経細胞ではこのような遺伝子発現の増大は観察されなかった（図２０Ｃ）。
〔実施例１６〕 アンチセンス法による内在性ＰＴＡ１含量低下による網膜虚血ストレス誘発性神経細胞死の増悪効果
虚血処置を施したｄｄＹ系マウスから摘出した網膜をパラフィン包埋し、網膜細胞層の切片を調製した。この切片をヘマトキシリン−エオジン染色した後、光学顕微鏡を用い観察した。さらにエポキシ樹脂に包埋した切片を作成し、外顆粒層を透過型電子顕微鏡で観察した。虚血処置は、マウス前眼房に１３０ｍｍＨｇの圧力を４５分間適用による網膜虚血を行い、その後常圧に戻す再灌流モデルを採用した。また、虚血処置１２０時間前、７２時間前、２４時間前の３回マウスＰＴＡ１遺伝子のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ、ＡＣＴ ＧＣＣ ＧＣＧ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＴ）とミスセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＭＳ−ＯＤＮ、ＡＧＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＴＣＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＧＴ）を硝子体に１μｇ／１μｌ／一回の用量で投与した。虚血処置４日後の網膜細胞層切片の写真を図２１Ｂに、虚血処置２４時間後の外顆粒層切片の写真を図２１Ｆにそれぞれ示す。
また、顕微鏡の画像から視神経節細胞層、内顆粒層、及び外顆粒層の各々に含まれる細胞数を計測した。この結果を図２１Ｃ、Ｄ、Ｅに示す。
更に、ＡＳ−ＯＤＮ及びＭＳ−ＯＤＮを投与した際のＰＴＡ１のタンパク質量（酸性フェノール抽出により濃縮精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開の後、ブルーステイン法により可視化）を図２１Ａに示す。
図２１Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅに示すように、虚血処置により網膜神経細胞層の厚みが低下した。ＡＳ−ＯＤＮを投与した場合には、更に厚みが低下したが、ＭＳ−ＯＤＮを投与した場合にはそのような変化は観察されなかった。
〔実施例１７〕 マウスｒＰＴＡ１による網膜虚血神経傷害の抑制
虚血処置を施したｄｄＹ系マウスから網膜細胞層及び外顆粒層の切片を調製し、透過型電子顕微鏡で観察した。虚血処置及び切片の作製は、実施例１６と同様に行った。虚血処置３０分前又は２４時間後に０．１又は１．０ｐｍｏｌのマウスｒＰＴＡ１と１００ｐｍｏｌのＣａｌ Ｃ又はＨｅｒｂｉｍｙｃｉｎ Ａ（チロシンキナーゼ阻害剤）を硝子体に注入した。虚血処置４日後の網膜細胞層切片の写真を図２２Ａ〜Ｇに、虚血処置２４時間後の外顆粒層切片の写真を図２２Ｊ〜Ｎにそれぞれ示す。
また、顕微鏡の画像から視神経節細胞層、内顆粒層、及び外顆粒層の各々に含まれる細胞数を計測した。この結果を図２２Ｇ、Ｈ、Ｉに示す。
虚血処置により網膜神経細胞層の厚みが低下したが（図２２Ａ、Ｂ）、このような厚みの低下は、マウスｒＰＴＡ１の投与により抑制された。マウスｒＰＴＡ１の投与は、虚血処置の前後いずれでも有効であり（図２２Ｃ、Ｆ）、また、０．１ｐｍｏｌ投与、１．０ｐｍｏｌ投与のいずれの場合も有効であった（図２２Ｈ〜Ｊ）。マウスｒＰＴＡ１の投与の効果は、Ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ Ａによる影響を受けなかったが（図２２Ｅ）、Ｃａｌ Ｃの投与により消失した（図２２Ｄ）。
また、虚血処置により外顆粒層の細胞にネクローシスが観察された（図２２Ｊ、Ｋ）。マウスｒＰＴＡ１前投与した場合には、ネクローシスは抑制され、また、アポトーシスも観察されなかった（図２２Ｌ）。マウスｒＰＴＡ１をＣａｌ Ｃと共に投与した場合には、ネクローシスが観察され、ｒＰＴＡ１のネクローシス抑制効果が消失した。マウスｒＰＴＡ１をＨｅｒｂｉｍｙｃｉｎ Ａと共に投与した場合には、ネクローシスは観察されず、アポトーシスが観察された。
〔実施例１８〕 マウスｒＰＴＡ１による脳虚血神経傷害の抑制
ｄｄＹ系マウスの頸動脈を３０分間結紮した後、再灌流し、４日後に大脳線条体或いは海馬領域を含む前額断面切片（１ｍｍ）を調製し、これをＴＴＣ染色した後顕微鏡で観察した。マウスには、虚血処置３０分前又は２４時間後に１ｐｍｏｌのマウスｒＰＴＡ１の脳室内投与を行った。この結果を図２３に示す。
図２３に示すように、マウスｒＰＴＡ１を投与せずに頸動脈結紮を行った場合には、線条体や海馬領域に白く色素が抜けた部分が観察された。しかし、マウスｒＰＴＡ１を投与した場合には、虚血処置前後にかかわらず、このような色素の抜けた部分は観察されず、虚血処置による傷害が抑制されていた。
〔実施例１９〕 マウスｒＰＴＡ１による脳虚血誘発性学習障害の抑制
ｄｄＹ系マウスの頸動脈を３０分間結紮した後、再灌流し、４日後にＳｔｅｐ Ｔｈｒｏｕｇｈ型受動回避実験を行った。マウスには、実施例１８と同様に、虚血処置３０分前又は２４時間後に１０ｐｍｏｌのマウスｒＰＴＡ１の脳室内投与を行った。Ｓｔｅｐ Ｔｈｒｏｕｇｈ型受動回避実験の結果を図２４に示す。
図２４に示すように、虚血処置したマウスでは、偽処置対照と比較し暗室移動までの潜時の顕著な遅延が観察されたが、マウスｒＰＴＡ１を投与した場合には、虚血処置前後にかかわらず、この潜時の遅延が消失した。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００３−０１５７３５号の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明により、神経細胞のアポトーシスやネクローシスを抑制することができるようになる。これにより、脳卒中、緑内障などの神経細胞死を伴う疾患の治療が可能になる。
【配列表】
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【技術分野】
本発明は、プロサイモシンα１（以下、「ＰＴＡ１」という）を有効成分として含有する神経細胞死抑制剤及び神経細胞死を伴う疾患の治療剤に関する。
【背景技術】
ヒト脳では数百億個もの神経細胞が複雑なネットワークを構成しているが、数少ない神経幹細胞からの神経新生機構を考慮に入れないならば、基本的にはその細胞数は生後においては、ただ減少するばかりである。百数十年といわれる長い寿命の期間、様々な外来性、内因性のストレスに対して脳は様々な保護機構を駆使し、生存を維持している。脳自身のもつ保護機構には神経−グリアや神経−神経間に存在するコミュニティーが相互に影響しあってその高度な役割を維持すべく働いている。最もよく知られた神経保護メカニズムは神経栄養因子やサイトカインなどの分子によって機能されているものである。こうした神経栄養因子は様々なストレス条件下に見られるプログラム神経細胞死（アポトーシス）を抑制する働きを有するものとして知られている。もう一つのメカニズムは神経新生であり最近の報告では脳虚血ストレス下に神経新生が亢進するとの報告はなされているが大量に細胞死に陥る神経を補うには十分ではないことが予想される。
脳虚血時には虚血中心部コアの部分で破壊的な細胞死であるネクローシスが観察されるが、この細胞死は細胞内容物を外部に放散するため、本来ならば細胞傷害作用は更に周囲に拡散するはずである。ところが数日の後には周囲のペナンブラと呼ばれる領域では、細胞の断片化や凝縮、ミクログリアなどによる貪食といったアポトーシスに特有の現象が観察される。このようなペナンブラにみられるアポトーシスは、傷害部位を限局させることにより脳全体の傷害を防止する一種の保護機構として機能するものであると考えられる（非特許文献１参照）。
上述した脳虚血時にみられるネクローシスからアポトーシスへの細胞死形態の変換は、ある特定の物質によって引き起こさせるものと推定されているが（非特許文献１参照）、現在までのところ、その物質は明らかになっていない。
本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、ネクローシスからアポトーシスへ細胞死形態を変換することのできる物質を特定することを目的とする。
〔非特許文献１〕 植田弘師，濱邉和歌子 日薬理誌１１９，７９−８８（２００２）
【発明の開示】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、サイモシンの前駆体であると考えられていたＰＴＡ１が（Ａ）神経細胞に作用し、ネクローシスを抑制する機能（ネクローシス抑制機能）、（Ｂ）神経細胞に作用し、アポトーシスを促進する機能（アポトーシス促進機能）、及び（Ｃ）マイクログリアに作用し、アポトーシスを抑制する物質（神経栄養因子）の分泌を促進し、間接的にアポトーシスを抑制する機能（間接的アポトーシス抑制機能）を有することを見出した。
以上の機能から、神経細胞に対してのみ作用する場合（培養神経細胞にＰＴＡ１を添加するような場合）には、ＰＴＡ１は神経細胞の細胞死形態をネクローシスからアポトーシスに変換し、神経細胞とマイクログリアに作用する場合（ｉｎ ｖｉｖｏでＰＴＡ１を投与するような場合）には、ＰＴＡ１は神経細胞のネクローシス及びアポトーシスの両者を抑制することになる。
本発明は、以上の知見から完成されたものである。
即ち、本発明は、ＰＴＡ１又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤である。
また、本発明は、ＰＴＡ１又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを有効成分として含有する神経細胞死を伴う疾患の治療剤である。
更に、本発明は、配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチド又はこれらのペプチドと実質的に同一のペプチドである。
以下、本発明を詳細に説明する。
ＰＴＡ１は、既知のタンパク質であるが、上述したネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能を有することは、本発明者によって初めて見出されたものである。
これらの３つの機能は、以下のような機序で発現するものと推定される（図１）。
（Ａ）ネクローシス抑制機能
１）神経細胞におけるＰＴＡ１の受容体との結合
２）グルコーストランスポーターの細胞表面への移動
３）細胞内のグルコース量増大
４）ミトコンドリアからのＡＴＰ産生量の増大
５）ネクローシスの抑制
（Ｂ）アポトーシス促進機能
１）神経細胞におけるＰＴＡ１の受容体との結合
２）神経細胞におけるＢａｘおよびＢｉｍタンパク質の発現増大とＢｃｌ−２およびＢｃｌ−ＸＬタンパク質の発現減少
３）ミトコンドリアからのチトクロームｃの放出
４）カスパーゼの活性化
５）ＣＡＤの活性化
６）アポトーシスの促進
（Ｃ）間接的アポトーシス抑制
１）グリア細胞におけるＰＴＡ１の受容体との結合
２）グリア細胞における神経栄養因子およびサイトカイン遺伝子の発現増大
３）神経細胞における神経栄養因子受容体（Ｔｒｋ）およびサイトカイン受容体の活性化
４）アポトーシスの抑制
以上の知見から、ＰＴＡ１は、神経細胞死抑制剤として利用することができる。
神経細胞抑制剤に使用するＰＴＡ１は特に限定されず、ヒト由来のＰＴＡ１、ラット由来のＰＴＡ１、マウス由来のＰＴＡ１などを使用することができる。これらの生物から実際に得られたＰＴＡ１のアミノ酸配列を図２に示す。また、これらのＰＴＡ１の中から特に３種類のＰＴＡ１のアミノ酸配列を配列番号１（ヒト由来）、配列番号２（ラット由来）、配列番号３（マウス由来）に示し、更に、各配列を整列させた図を図３に示す。ヒト、ラット、マウス以外の生物由来のＰＴＡ１としては、ウシ由来のＰＴＡ１、カエル由来のＰＴＡ１なども使用することができる。これらのＰＴＡ１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等にそれぞれＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＴＮＢＯＡ１、ＣＡＣ３９３９７として登録されている。
ＰＴＡ１の代わりにＰＴＡ１と同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを使用することもできる。ここで「ＰＴＡ１と同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチド」とは、ＰＴＡ１の持つネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能のすべて又は一部を持つタンパク質若しくはペプチドを意味する。このようなタンパク質若しくはペプチドとしては、例えば、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列で表されるタンパク質が含まれる。ここで、欠失等するアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常は、２０個以内であり、好ましくは１０個以内であり、特に好ましくは５個以内である。また、「ＰＴＡ１と同等の機能を有するペプチド」には、ＰＴＡ１から得られ、上述したネクローシス抑制機能等を有するペプチドフラグメントも含まれる。このようなフラグメントとしては、配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチドやこれらのペプチドと実質的に同一のペプチドを例示することができる。ここで「実質的に同一のペプチド」とは、配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列で表され、ＰＴＡ１の持つネクローシス抑制機能、アポトーシス促進機能、間接的アポトーシス抑制機能のすべて又は一部を持つペプチドをいう。欠失等するアミノ酸の個数は特に限定されないが、通常５個以内であり、好ましくは３個以内であり、特に好ましくは１個である。なお、図２中の配列番号４に対応するアミノ酸配列（図２において、ラット活性本体のアミノ酸配列と同じ列に位置するアミノ酸配列）で表されるペプチドは、この「実質的に同一のペプチド」に含まれる。
ＰＴＡ１は、マイクログリアが存在する条件では間接的にアポトーシスを抑制するが、マイクログリアが存在しない条件ではアポトーシスを抑制しない（逆にアポトーシスを促進する）。従って、本発明の神経細胞死抑制剤は、使用の態様により、ネクローシスのみを抑制する場合とネクローシスとアポトーシスの両者を抑制する場合とがある。
本発明の神経細胞死抑制剤の適用対象とする神経細胞は特に限定されず、大脳皮質、線条体、中脳、海馬、小脳、脊髄、視覚器由来の神経細胞などの細胞死の抑制に適用できる。
ＰＴＡ１は、神経細胞死抑制剤としてだけでなく、神経細胞死を伴う疾患の治療剤としても利用することができる。ここで「神経細胞死を伴う疾患」とは、アポトーシス、ネクローシス、又はその両者を伴う疾患をいう。このような疾患には、脳卒中、外傷性脳傷害、緑内障、糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性傷害などの虚血が原因となっている疾患が含まれるほか、虚血以外の原因による疾患や原因がよくわからない疾患、例えば、アルツハイマー、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症なども含まれる。なお、ここでいう「治療」には、疾患を完治させる場合のみならず、病状を軽減させる場合や病状の悪化を阻止する場合なども含まれる。
本発明の神経細胞死を伴う疾患の治療剤は、ＰＴＡ１を公知の方法に従い薬学的に許容される担体あるいは希釈剤と混合することにより製剤化される。適当な担体および希釈剤、並びにタンパク質を含む製剤については、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ等に記載されている。
ＰＴＡ１に関して、投与に適した剤型は特に限定はされないが、既に医薬として使用されている多くのタンパク質を含む薬学的組成物と同様に注射剤として調製されることが好ましい。より具体的に言えば、ＰＴＡ１を、水、生理食塩水、等張化した緩衝液等の適当な溶媒に溶解することで注射剤とする。その際、ポリエチレングリコール、グルコース、各種アミノ酸、コラーゲン、アルブミン等を保護材として添加して調製可能である。また、リボソーム等の封入体にポリペプチドを包埋させて投与することも可能である。
ＰＴＡ１を上述した疾患の治療に用いるとき、その用量は、対象の年齢、体重、病状、および投与経路、その他の要素により異なるが、投薬する医師が容易に適宜決定することができる。例えば、緑内障治療のため硝子体内投与する場合には、１回量約０．００１２ｍｇ〜０．０１２ｍｇの投与であり、脳卒中治療のため脳室内投与する場合には、１日量約０．０１２ｍｇ〜１．２ｍｇの投与である。
ＰＴＡ１の投与方法は特に限定されず、脳内投与する場合も現在実際に行われている様々な投与方法を採用することができる。このような投与方法の一例として、大槽内投与を挙げることができる。大槽内投与は、脳実質を傷つけないという点で有利である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、神経細胞及びマイクログリアに対するＰＴＡ１の作用を模式的に表した図である。
第２図は、ヒト、ラット、マウスなどの生物から実際に得られたＰＴＡ１のアミノ酸配列を示す図である（図２ａのアミノ酸配列の右端と図２ｂのアミノ酸配列の左端がつながり、図２ｂのアミノ酸配列の右端と図２ｃのアミノ酸配列の左端がつながる。）。
第３図は、ヒト、ラット、及びマウス由来のＰＴＡ１のアミノ酸配列を示す図である。
第４図は、培養神経細胞に対して生存活性を持つタンパク質の精製工程を示す図である。
第５図は、生存活性を持つタンパク質のリジルエンドペプチターゼ消化物の逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。
第６図は、神経細胞の生存活性と、ラットｒＰＴＡ１のコーティング量との関係を示す図である。
第７図は、大脳皮質、線条体、中脳、又は海馬由来の神経細胞の生存活性と、ラットｒＰＴＡ１のコーティング量との関係を示す図である。
第８図は、神経細胞の生存活性と、神経細胞培養時に添加したラットｒＰＴＡ１の欠損部位との関係を示す図である。
第９図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞の蛍光顕微鏡写真である。
第１０図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞の透過型電子顕微鏡写真である。
第１１図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞の細胞内ＡＴＰ含量の経時的変化を示す図である。
第１２図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞の細胞内ＡＴＰ含量変化に対するＣａｌ Ｃ又はＵ−７３１２２の添加の効果を示す図である。
第１３図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞の２−ＤＧ取り込み作用に対するＣａｌ Ｃ又はＵ−７３１２２の添加の効果を示す図である。
第１４図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞におけるＧＬＵＴ１又はＧＬＵＴ４の細胞中の位置を示す蛍光顕微鏡写真である。
第１５図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養された神経細胞におけるチトクロームｃの位置を示す蛍光顕微鏡写真である。
第１６図は、ラットｒＰＴＡ１によるアポトーシスメカニズム誘発機構としてのＢｃｌ−２ファミリータンパク質発現調節を示す図である。
第１７図は、ラットｒＰＴＡ１による神経細胞の生存活性に対する神経栄養因子の添加効果を示す図である。
第１８図は、ラットｒＰＴＡ１による神経細胞におけるチトクロームｃの位置変化とＢＤＮＦ共存による変化を示す蛍光顕微鏡写真である。
第１９図は、細胞及び培養上清中のＰＴＡ１量の経時的変化を示す図である。
第２０図は、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養されたマイクログリア及び神経細胞におけるＩＬ−６ｍＲＮＡ発現量の経時的変化を示す図である。
第２１図は、マウスＰＴＡ１のＡＳ−ＯＤＮを硝子体投与した後、虚血処置を施したマウスから調製した網膜細胞層の光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡写真である。
第２２図は、マウスｒＰＴＡ１の硝子体投与を虚血前あるいは後に施したマウスから調製した網膜細胞層の光学顕微鏡及び透過型電子顕微鏡写真である。
第２３図は、マウスｒＰＴＡ１の脳室内投与後に頸動脈虚血処置を施したマウスから調製した前額断片切片の顕微鏡写真である。
第２４図は、頸動脈虚血処置を施したマウスにおける、Ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ潜時に対するマウスｒＰＴＡ１の脳室内投与の効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
最初に本実施例において使用した実験材料及び方法について説明する。
初代培養
胎生１７日胚ラットの大脳皮質の初代培養は、Ｓａｓａｋｉ Ｙ．Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ Ｎ．Ｙｏｓｈｉｄａ Ａ．ａｎｄ Ｕｅｄａ Ｈ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）１８，４８７−４９６．に記載した方法に従って行った。分散した細胞はあらかじめポリＤＬ−オルニチン（シグマ製）によりコーティングした９６ウェル培養ディッシュ、８ウェルのＬａｂ−ＴｅｋＴＭチャンバー、３．５と９ｃｍの培養ディッシュにまき、３７℃、５％の二酸化炭素中で培養した。培養上清は５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度（高密度）で３日間培養した上清をＭｉｌｅｘフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、使用まで−２０℃で保存した。上清は低密度（１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）培養に添加する場合と、培養直前に培養プレートに加え２５℃、２時間インキュベートし、後にＰＢＳで２回洗浄する方法でコーティングする場合とによった。
乳酸脱水素酵素遊離実験
細胞傷害は、傷害を受けた細胞から培養上清中に遊離した細胞質乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製（ドイツ、マンハイム）の細胞毒性検出キットを用い、同社のプロトコールに従い測定することにより定量した。具体的には以下の通りである。
９６ウェル培養プレートに３．２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ウェルの１７日胚大脳皮質細胞をまき、培養開始から一定の時間後、１００μｌ培養上清を取り、これに１００μｌの２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え総量２００μｌとした。その１００μｌを取り分け９６ウェルプレートに移し、キット反応液１００μｌをさらに加え、９０分間室温暗所でインキュベートし、４５０ｎｍの波長での吸光度測定を行い、最大ＬＤＨ遊離量とした。一方、培養上清に遊離したＬＤＨ量は培養上清（５０μｌ）を９６ウェルプレートに移し、５０μｌの２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、さらにキット反応液１００μｌを加えたのち吸光度測定することにより求め、最大ＬＤＨ遊離量に対するパーセント相対ＬＤＨ遊離量として評価した。
ＷＳＴ−８アッセイ
細胞の生存活性には２−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＷＳＴ−８）還元活性キット（同人研究所、東京）を用い、添付のプロトコールに従って実験を行った。ＷＳＴ−８は比色測定の３時間前加え、３７℃でインキュベートした。生存活性は培養開始直後の活性に対する割合（パーセント）として求めた。
トリパンブルー色素排除試験
神経細胞死は、トリパンブルーの細胞からの排除機能低下により評価した。
培養細胞にメディウムと同容量の０．４％トリパンブルー液を添加し、５分間放置した後、氷冷ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳに溶解した４％パラホルムアルデヒドにより室温、３０分間固定した。細胞死の割合は全細胞に対する割合（％）で評価した。
細胞内ＡＴＰ量の測定
測定にはルシフェリン−ルシフェラーゼ法をＡＴＰ定量キット（モレキュラープローブ社、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて行った。２ｘ１０６の全細胞を用い、氷冷したＰＢＳで２回洗浄後、細胞希釈溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７５，４ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。０．５ｍＭルシフェリン、１．２５μｇ／ｍｌのルシフェラーゼと１ｍＭ ＤＴＴを２０μｌの細胞懸濁液に混合した。ルシフェリンールシフェラーゼバイオルミネッセンス測定は、ＥＧ＆Ｇ ｂｅｒｔｈｏｌｄ社（Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＬＵＭＡＴ ＬＢ ９５０７を用いて行った。
アネキシンＶ結合およびＰＩ染色実験
アポトーシスとネクローシスはそれぞれロッシュ・モレキュラーバイオケミカルズ社のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＬＵＯＳ染色Ｋｉｔとシグマ社のプロピディウム・イオダイド（ＰＩ）を用いて評価した。大脳皮質細胞を８ウェルのＬａｂ−ＴｅｋＴＭチャンバーで培養し、一定時間後にアネキシンＶフルオセインと１０μｇ／ｍｌ ＰＩを添加し、室温１５分間暗所でインキュベートした。その後細胞は氷冷ＰＢＳで洗浄し、室温３０分間４％ＰＦＡを用いて固定した。蛍光はカールツァイス社のＬＳＭ４１０蛍光顕微鏡を用いて測定した。
ＴＵＮＥＬ解析
アポトーシスを示す細胞におけるＤＮＡ断片化はｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｂｉｏｔｉｎ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）法を用いて組織化学的に測定した。８ウェルのＬａｂ−ＴｅｋＴＭチャンバーで培養した細胞を１０μｇ／ｍｌ ＰＩと３７℃、３０分間インキュベートし、２回の氷冷ＰＢＳ洗浄と４％ＰＦＡ固定の後、５０％と続き１００％の５分間メタノール処置により透過型にした。その後、ロッシュ・モレキュラーバイオケミカルズ社のＴＵＮＥＬ液で３７℃、１時間処置し、２回のＰＢＳ洗浄、室温１時間のブロック液（ＰＢＳに溶解した１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）とのインキュベート後、さらにｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）（１：１００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と室温１．５時間インキュベートし、蛍光顕微鏡測定を行った。
活性型カスパーゼ３の免疫細胞化学
８ウェルのＬａｂ−ＴｅｋＴＭチャンバーで培養した細胞をＰＦＡで固定した後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過型にした。室温で１時間ブロック液（２％ｌｏｗ−ｆａｔ ｍｉｌｋ ｐｏｗｄｅｒ，２％ウシ血清アルブミン，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０をｐＨ７．４ＰＢＳに溶解したもの）とインキュベートし、活性型カスパーゼ３抗体（１：５０；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と室温２時間インキュベート、洗浄の後、ＦＩＴＣ結合型抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２００；Ｃａｐｐｅｌ，Ａｕｒｏｒａ）と室温４時間インキュベートし、蛍光顕微鏡観察を行った。
透過型電子顕微鏡観察
培養大脳皮質細胞を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２．５％グルタルアルデヒドと室温１時間インキュベートすることにより固定化し、後に１％四酸化オスミウムを用いて室温１時間の後固定を行った。続いて、アルコール脱水の後、Ｅｐｏｎ８１２包埋を行い、Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｓ（Ｌｅｉｃａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて８０ｎｍの超薄切片作製を行った。切片は酢酸ウランとクエン酸鉛を用いてそれぞれ３０と５分間の染色を行い、電子顕微鏡（ＪＥＭ−１２１０；ＪＥＯＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）観察を行った。
イムノブロット解析
１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動した試料は一次抗体として抗カスパーゼ８及び９抗体（１：５００；ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ｃａｎａｄａ）と抗活性型カスパーゼ３抗体（１：５００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、抗Ｂａｘ、抗Ｂｉｍ、抗Ｂｃｌ−２、抗Ｂｃｌ−ｘＬ抗体（１：１０００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いてイムノブロット解析を行った。免疫活性バンドの検出にはＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の増強化学発光基質（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を用いてｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄｅｓ測定を行った。
２−デオキシ−Ｄ−［３Ｈ］グルコース取り込み実験
実験は、Ｋｏｉｖｉｓｔｏの方法を改良した方法に従い、以下の通り行った。
大脳皮質細胞を、１７．５ｍＭグルコースを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２メディウムを入れた６ウェルプレート中で培養した。プレートは、リコンビナントＰＴＡ１をコーティングしたものと、コーティングしないものとを用いた。培養開始から一定時間後に［３Ｈ］−２−ＤＧ（１μＣｉ／ｗｅｌｌ，１０ｎＭ）を添加し、３７℃、２時間さらにインキュベートした後、上清の除去と２回の氷冷ＰＢＳによる洗浄を行った。細胞は１００μｌの０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液で溶解し、０．５Ｍ塩酸で中和した後、放射活性を液体シンチレーションカウンターにより測定した。
ＰＫＣキナーゼ活性測定
培養細胞は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．３％ β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ，５０μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ，１０ｍＭ ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅを含む緩衝液で懸濁した後、同容量のグリセロールと混合し、氷上でホモジェナイズした。ＰＫＣ活性はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のプロテインキナーゼＣ酵素活性測定システムを用い、添付プロトコールの手法に従った。培養試料［Ｓ］をＰＫＣでリン酸化される基質（０．３ｍｇ／ｍｌ Ｌａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｓｅｒｉｎ）と混合し５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ並びに［γ−３２Ｐ］ＡＴＰとマグネシウム−ＡＴＰ ｂｕｆｆｅｒと３７℃、１５分間インキュベートした。最大Ｍａｘｉｍｕｍ ＰＫＣ活性化量［Ｍａｘ］は上記組成に２４ｍｇ／ｍｌ ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ及び１２ｍＭ酢酸カルシウムを添加して測定した。バックグラウンド値［Ｂ］は基質を除いて測定した。停止液を加えて反応を停止し、ペプチド結合紙に吸着させた。この結合紙を５％酢酸で２回洗浄し取り込まれた３２Ｐ放射性活性を液体シンチレーションカウンターにより測定した。ＰＫＣ活性は以下の数式により求めた。ＰＫＣ活性化（％）＝（［Ｓ］−［Ｂ］）／（［Ｍａｘ］−［Ｂ］）ｘ１００
統計解析
多次元分散分析（ＡＮＯＶＡ）解析を行ったのちにＳｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を用いて統計的解析を行った。有意差は危険率０．０５％を基準とし、全ての結果は平均＋標準誤差として表現した。
〔実施例１〕 タンパク質の構造決定とリコンビナントタンパク質の調製
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞培養上清から陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより生存活性を有するタンパク質の精製を行い、これにより分子量約２０ｋＤａと約２２ｋＤａの２種類のタンパク質（ＮＤＩ２０及びＮＤＩ２２）が得られた（図４ａ及びｂ）。なお、生存活性の評価にはＷＳＴ−８アッセイにより行った。
得られた２種類のタンパク質をリジルエンドペプチダーゼ消化したところ、共にＫＥＶＶＥＥＡＥの配列を持つ部分ペプチドが得られた（図５）。また、抽出の条件を変化させてもＮＤＩ２０は安定して検出できたが、ＮＤＩ２２は検出できない場合があった。このことからＮＤＩ２２は、ＮＤＩ２０に別の小分子が吸着したものと予想され、ＮＤＩ２０を活性本体とみなした。このＮＤＩ２０は、データベースからＰＴＡ１であることが推定できたので、ＲＴ−ＰＣＲによりラット及びマウス型のｃＤＮＡクローンを単離、大腸菌に発現させ、酸性フェノール抽出およびバイオフォレシス（アトー株式会社；ＡＥＰ−８２０型）によりリコンビナントＰＴＡ１（以下「ｒＰＴＡ１」という）を調製した。このようにして調製されたｒＰＴＡ１は、もとのＮＤＩ２０と同様の電気泳動上の移動度を示し、マススペクトル（ＶＯＹＡＧＥＲ；（ＭＡＬＤＩ）ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）での分子量も一致した。
〔実施例２〕 ラットｒＰＴＡ１による神経細胞死保護効果
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１存在又は非存在下で培養し、培養開始から１２時間後の生存活性及び細胞傷害度を評価した。培養は低密度培養（１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）及び高密度培養（５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）の２通りの条件で行った（以下、特に断りがない場合は、低密度及び高密度培養は前述した密度で培養するものとする。）。ラットｒＰＴＡ１存在下での培養は、ラットｒＰＴＡ１を３〜５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２の用量で９６ウェルの培養ディッシュに予めコーティングしておき、その上に神経細胞をまいて行った。生存活性はＷＳＴ−８アッセイにより評価し、細胞傷害度はＬＤＨ遊離量により評価した。また、２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２のｒＰＴＡ１存在下で培養した場合の生存活性及び細胞傷害度の経時的変化を調べた。以上の結果を図６Ａ〜Ｄに示す。
図６Ａに示すように、ラットｒＰＴＡ１非存在下で培養した場合は（図中のＶ）、生存活性が培養開始時の４０％程度にまでに低下していたが、ラットｒＰＴＡ１存在下で培養することにより、生存活性は用量依存的に向上した。また、細胞傷害度についても、ラットｒＰＴＡ１による用量依存的な軽減がみられた（図６Ｃ）。
ラット１７日胚の大脳皮質、線条体、中脳、及び海馬から調製した神経細胞を、無血清条件下、０〜５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２のラットｒＰＴＡ１存在下で低密度培養し、１２時間後の生存活性（ＷＳＴ−８アッセイによる）を評価した。また、後根神経節（ＤＲＧ）細胞と大脳皮質神経細胞を、無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１存在下で低密度培養し、１２時間後の細胞死率をトリパンブルー色素排除試験を用いて調べた。以上の結果を図７に示す。
図７Ａに示すように、ラットｒＰＴＡ１による生存活性の向上は、大脳皮質だけでなく線条体、中脳、及び海馬由来の神経細胞においても観察された。大脳皮質や海馬の神経変性はアルツハイマーや老人性痴呆に関連する脳領域であり、線条体の神経変性はハンチントン病に関連し、中脳変性ではパーキンソン病に関連することが知られている。従って、ラットｒＰＴＡ１は、こうした幅広い神経変性疾患に有効である可能性がある。
図７Ｂに示すように、大脳皮質神経細胞では、ラットｒＰＴＡ１存在下で培養することにより用量依存的に細胞死率が低下したが、ＤＲＧ細胞では、細胞死率の低下はみられなかった。
〔実施例３〕 ｒＰＴＡ１欠失変異体による神経細胞死保護効果
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とラットｒＰＴＡ１欠失変異体融合タンパク質発現クローン作製のため、欠失変異体それぞれの領域に対応するプライマーを用いて、すでにクローニング済みのラットｒＰＴＡ１全長のクローンを鋳型にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物はｐＧＥＸ−５Ｘ−１ベクターにクローニングした。欠失変異体のＧＳＴ融合タンパク質は常法により発現させ、菌体抽出液よりグルタチオン−セファロースカラムを用いて精製した。
このようにして作製したｒＰＴＡ１欠失変異体を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動によって分画し、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によって可視化したところ、予想されるサイズにバンドが観察されたので（図８Ａ）、これらを用いてラット１７日胚の大脳皮質神経細胞の生存活性を評価した。２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２のｒＰＴＡ１欠失変異体の添加による生存活性は、無血清低密度培養条件下、培養開始１２時間後に測定した。この結果を図８Ｂに示す。
図８Ｂで示すように、ｒＰＴＡ１のＮ末端より４８番目のアミノ酸までを欠失させた変異体および７９番目から１１２番目までのアミノ酸を欠失させた変異体は、ｒＰＴＡ１の完全長と同程度の生存活性の向上が見られたが、Ｎ末端より６８および８６番目のアミノ酸までを欠失させた変異体と３０番目から１１２番目、５８番目から１１２番目までのアミノ酸を欠失させた変異体の生存活性の向上は著明に減弱した。
これらの事実から、ラットｒＰＴＡ１の活性本体が４９番目から７８番目のアミノ酸領域であることが予想される。なお、この４９−７８のフラグメントのアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、ヒトＰＴＡ１において、このフラグメントに対応するフラグメントのアミノ酸配列を配列番号５に示す。
〔実施例４〕 ラットｒＰＴＡ１による神経細胞死モードスイッチ
８ウェルのＬａｂ−ＴｅｋＴＭチャンバーにラット１７日胚大脳皮質神経細胞をまき、無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で低密度及び高密度培養し、３〜２４時間後の細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。細胞は、（１）ＰＩ染色とＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色、（２）ＰＩ染色と活性型カスパーゼ３免疫蛍光染色、（３）ＰＩ染色とＴＵＮＥＬ染色の３通りの方法で染色した。この結果を図９ａ〜ｃ、ｅ〜ｇ、ｉ〜ｋに示す。また、各染色方法によって染色された細胞の数を図９ｄ、ｈ、ｉに示す。
これらの図に示すように、ラットｒＰＴＡ１非存在下で低密度培養した場合には、ネクローシスの指標となるＰＩ染色による赤色蛍光が観察されたが、アポトーシスの指標となるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖによる緑色蛍光は観察されなかった。逆に、高密度培養及びラットｒＰＴＡ１存在下での低密度培養では、ネクローシスの指標となる赤色蛍光は観察されず、アポトーシスの指標となる緑色蛍光が観察された。同様な結果がＰＩ染色と活性型カスパーゼ３免疫蛍光染色、ＰＩ染色とＴＵＮＥＬ染色によっても確認された。これらの事実から、ラットｒＰＴＡ１は神経細胞のネクローシスをアポトーシスに変換させる作用があることが明らかになった。
〔実施例５〕 透過型電子顕微鏡観察によるラットｒＰＴＡ１の神経細胞死モードスイッチ作用
ラット１７日胚大脳皮質神経細胞を、無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で低密度及び高密度培養し、培養開始から１２時間後の細胞の状態を透過型電子顕微鏡で観察した。この結果を図１０に示す。
図１０に示すように、ラットｒＰＴＡ１非存在下で低密度培養した細胞では、細胞膜の傷害、細胞質部分における電子密度の顕著な低下、ミトコンドリアの膨潤化などが観察された。一方、ラットｒＰＴＡ１存在下で低密度培養をした場合では、細胞膜傷害やミトコンドリア膨潤化は観察されなかったが、核の断片化や核クロマチンの凝縮といったアポトーシスに見られる現象が観察された。こうした現象は、高密度培養でも観察された。
〔実施例６〕 ネクローシス機構としてのＡＴＰ含量低下に対するラットｒＰＴＡ１の抑制効果
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を実施例５と同様の条件で培養し、細胞内のＡＴＰ含量の経時的変化を調べた。この結果を図１１に示す。
図１１に示すように、ラットｒＰＴＡ１非存在下で低密度培養を行った場合には、細胞内ＡＴＰ含量は急速に低下し、１８時間後にはほぼ０レベルになった。しかし、高密度培養及びラットｒＰＴＡ１存在下での低密度培養では、細胞内ＡＴＰ含量の低下は有意に抑制された。
〔実施例７〕 ラットｒＰＴＡ１によるネクロース抑制効果のホスホリパーゼＣとプロテインキナーゼＣを介するメカニズム
ラット１７日胚大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度及び高密度培養し、培養開始から６時間後の細胞内ＡＴＰ含量を調べた。培養は、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、培養開始直後にカルフォスチンＣ（Ｃａｌ Ｃ）又はＵ−７３１２２（Ｕ２２）を１μＭになるように添加した。この結果を図１２Ａに示す。なお、カルフォスチンＣはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤であり、Ｕ−７３１２２はホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）阻害剤である。図１２Ａに示すように、ラットｒＰＴＡ１存在下で培養することにより、ＡＴＰ含量の低下は抑制されたが、この効果はＣａｌ Ｃ及びＵ−７３１２２の添加により消失した。
さらにラットｒＰＴＡ１による細胞内ＡＴＰ含量の低下の抑制のメカニズムを調べた。図１２Ｂに示すように、ラットｒＰＴＡ１存在下で培養することにより、ＡＴＰ含量の低下は抑制されたが、この効果はグルコースの取り込み阻害剤である２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）、解糖系の阻害剤であるヨウ化酢酸（ＩＡ）及びミトコンドリアでのＡＴＰ産生の阻害剤であるオリゴマイシン（Ｏｌｉｇｏ）の添加により消失した。したがってラットｒＰＴＡ１による細胞内ＡＴＰ含量低下の抑制は細胞によるグルコース取り込みの後に生じるＡＴＰ産生系上昇を示唆している。
〔実施例８〕 ラットｒＰＴＡ１によるグルコース取り込み低下抑制効果
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、血清存在又は無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で低密度及び高密度培養し、培養開始から２時間後における２−デオキシ−Ｄ−［３Ｈ］グルコース取り込み作用を評価した。この結果を図１３に示す。
図１３に示すように、無血清条件下での培養では、血清存在下での培養と比較し、２−デオキシ−Ｄ−［３Ｈ］グルコース取り込み作用が１０％以下に低下した。ラットｒＰＴＡ１存在下で培養することにより、２−デオキシ−Ｄ−［３Ｈ］グルコース取り込み作用は、血清存在下での培養時の６５％程度にまで回復した。しかし、この低下抑制効果もＣａｌ Ｃ又はＵ−７３１２２を添加することにより消失した。ＡＴＰ含量の急速な低下は、グルコース取り込み作用の低下と関連することが明らかとなり、ラットｒＰＴＡ１のＡＴＰ含量低下抑制効果における第一次反応は、グルコース取り込み作用の低下抑制によるものであることが示唆された。
〔実施例９〕 ラットｒＰＴＡ１によるグルコーストランスポーターの細胞膜表在化効果
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を低密度培養し、培養開始から２時間後の細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。培養は、血清（１０％ＦＢＳ）存在又は無血清条件下、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、培養開始直後にＣａｌ Ｃを１μＭになるように添加した。また、細胞は、ＧＬＵＴ１又はＧＬＵＴ４（これらはグルコーストランスポーターである）を認識する一次抗体と一次抗体を認識する蛍光標識した二次抗体で染色した。この結果を図１４に示す。
図１４に示すように、ＧＬＵＴ１とＧＬＵＴ４の細胞膜表在化は、血清存在下で培養した細胞では観察されたが、無血清条件下で培養した細胞では観察されなかった。ラットｒＰＴＡ１存在下で培養した細胞では、血清が存在しなくても、ＧＬＵＴ１とＧＬＵＴ４の細胞膜表在化が観察されたが、Ｃａｌ Ｃを添加した場合には、このような表在化は消失した。実施例６−９の結果からラットｒＰＴＡ１は細胞膜に存在することが期待される受容体を介し、続いてＰＬＣとＰＫＣの活性化、ＧＬＵＴ１とＧＬＵＴ４の細胞膜表在化、グルコース取り込みの促進、ＡＴＰ産生増加といったメカニズムを駆動することが証明された。
〔実施例１０〕 ラットｒＰＴＡ１によるアポトーシスメカニズム誘発機構としてのミトコンドリアからのチトクロームＣ（Ｃｙｔｏ Ｃ）遊離作用
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度及び高密度培養し、培養開始から１２時間後の細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。培養は、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、培養開始直後にＣａｌ Ｃを１μＭになるように添加した。また、細胞はＣＭＲＸｏｓ（赤色蛍光、ミトコンドリアと結合）と抗Ｃｙｔｏ Ｃ抗体（緑色蛍光、Ｃｙｔｏ Ｃと結合）で二重染色した。抗Ｃｙｔｏ Ｃ抗体は蛍光標識した二次抗体によって認識した。この結果を図１５に示す。
図１５に示すように、ラットｒＰＴＡ１非存在下で低密度培養を行った場合には、ミトコンドリアの位置に緑色蛍光が観察され、Ｃｙｔｏ Ｃは遊離せず、ミトコンドリア内に局在していた。一方、高密度培養やラットｒＰＴＡ１存在下での低密度培養では、緑色蛍光が観察されず、Ｃｙｔｏ Ｃがミトコンドリアから遊離していた。また、このようなＣｙｔｏ Ｃの遊離は、Ｃａｌ Ｃにより抑制された。
Ｃｙｔｏ Ｃ遊離は続くカスパーゼの活性化を引き起こすのでアポトーシス誘発のメカニズムと考えられているので、本実施例はラットｒＰＴＡ１がアポトーシスを積極的に誘発していることを証明している。
〔実施例１１〕 ラットｒＰＴＡ１によるアポトーシスメカニズム誘発機構としてのＢｃｌ−２ファミリータンパク質発現調節
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度培養し、培養開始から経時的に細胞を回収し、イムノブロッティング法で解析を行った。培養は、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、培養開始直後にＣａｌ ＣおよびＵ７３１２２を１μＭになるように添加した。
低密度培養における２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２のラットｒＰＴＡ１処置はＣｙｔｏ Ｃ遊離に促進的なＢａｘ発現の時間依存性の増加を引き起こし（図１６Ａ、Ｂ）、また同様な機能を有するＢｉｍ発現を増加した（図１６Ｂ）。対照的に、Ｃｙｔｏ Ｃ遊離抑制に働くＢｃｌ−２とＢｃｌ−ｘＬの発現を低下させた（図１６Ａ、Ｂ）。ラットｒＰＴＡ１によるＢａｘ増加作用はＵ７３１２２とＣａｌ Ｃにより遮断された（図１６Ｃ）。実施例１０と１１の成績からラットｒＰＴＡ１によるアポトーシスメカニズム誘発機構はネクローシス抑制と同様ＰＬＣとＰＫＣを介し、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質の発現調節を介してミトコンドリアからのＣｙｔｏ Ｃ遊離を促進させカスパーゼ系の活性化等のアポトーシスメカニズムにつながることが証明された。
〔実施例１２〕 神経栄養因子によるラットｒＰＴＡ１の細胞死抑制作用増強
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度培養し、培養開始から１２時間後の生存活性（ＷＳＴ−８アッセイによる）を評価した。培養は、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、また、培養開始直後にＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ、又はＩＬ６を１００ｎｇ／ｍｌになるように添加して行った。この結果を図１７に示す。
図１７に示すように、神経栄養因子の添加は、ラットｒＰＴＡ１の細胞死抑制作用を増強した。しかし、これら神経栄養因子単独では、細胞死を抑制する効果はなかった。
〔実施例１３〕 ＢＤＮＦによるラットｒＰＴＡ１のもつアポトーシス誘発効果の抑制
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清条件下で低密度培養し、培養開始から１２時間後の細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察した。培養は、ラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）存在又は非存在下で行い、培養開始直後にＢＤＮＦを１００ｎｇ／ｍｌになるように添加した。また、細胞の染色は、ＣＭＲＸｏｓ（赤色蛍光、ミトコンドリアと結合）による染色、二次抗体を蛍光標識し認識させた抗Ｃｙｔｏ Ｃ抗体（緑色蛍光、Ｃｙｔｏ Ｃと結合）による染色による二重染色で行った。この結果を図１８に示す。
ラットｒＰＴＡ１のもつＣｙｔｏ Ｃ遊離作用は、ＢＤＮＦ添加により完全に抑制された。実施例１２と１３からｒＰＴＡ１は大脳皮質神経細胞のネクローシスを抑制し、神経栄養因子により保護される形のアポトーシス形態にスイッチさせることが証明された。
〔実施例１４〕 無血清ストレスによる内在性ＰＴＡ１の神経細胞からの遊離
ラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を、無血清又は血清存在下で高密度培養し、内在性ＰＴＡ１の遊離量とＰＴＡ１の細胞内含量を定量した。
内在性ＰＴＡ１遊離は、培養上清の酸性フェノール抽出により濃縮精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開の後、ブルーステイン法により可視化して定量した。一方、細胞内含量はそのまま抽出して同様に定量した。この結果を図１９に示す。
図１９に示すように、無血清条件下での培養では、時間に依存した内在性ＰＴＡ１遊離が観察され、逆に細胞内含量は時間依存的に低下した。また血清存在下での培養では、このような内在性ＰＴＡ１遊離は観察されなかった。このことから、この遊離は無血清あるいは飢餓ストレス誘発性の非古典的遊離であることが示唆された。
〔実施例１５〕 ラットｒＰＴＡ１によるマイクログリア神経栄養因子遺伝子発現増加
ラット１７日胚の大脳から調製したマイクログリアを培養し、一時的に血清を１％にした条件下でラットｒＰＴＡ１（２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）を添加し、ＩＬ−６のｍＲＮＡ量（ＲＴ−ＰＣＲ法で定量）の時間的変化を測定した。同様の実験は、マイクログリアの代わりに低密度無血清培養したラット１７日胚の大脳皮質神経細胞を用いて行った。また、ラットｒＰＴＡ１の添加量を変化させ、ラットｒＰＴＡ１添加から１時間後のＩＬ−６のｍＲＮＡ量を測定した。この際、比較のためシクロフィリンのｍＲＮＡ量も測定した。以上の結果を図２０Ａ、Ｂ及びＣに示す。
ラットｒＰＴＡ１の添加により、マイクログリアのＩＬ−６遺伝子の発現量が顕著に増大した（図２０Ａ）。このような遺伝子発現の増大は、０．１から２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２の用量範囲で観察された（図２０Ｂ）。また、神経細胞ではこのような遺伝子発現の増大は観察されなかった（図２０Ｃ）。
〔実施例１６〕 アンチセンス法による内在性ＰＴＡ１含量低下による網膜虚血ストレス誘発性神経細胞死の増悪効果
虚血処置を施したｄｄＹ系マウスから摘出した網膜をパラフィン包埋し、網膜細胞層の切片を調製した。この切片をヘマトキシリン−エオジン染色した後、光学顕微鏡を用い観察した。さらにエポキシ樹脂に包埋した切片を作成し、外顆粒層を透過型電子顕微鏡で観察した。虚血処置は、マウス前眼房に１３０ｍｍＨｇの圧力を４５分間適用による網膜虚血を行い、その後常圧に戻す再灌流モデルを採用した。また、虚血処置１２０時間前、７２時間前、２４時間前の３回マウスＰＴＡ１遺伝子のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ、ＡＣＴ ＧＣＣ ＧＣＧ ＴＣＴ ＧＡＣ ＡＴＧ ＧＴ）とミスセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＭＳ−ＯＤＮ、ＡＧＴ ＧＣＡ ＧＣＴ ＴＣＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＧＴ）を硝子体に１μｇ／１μｌ／一回の用量で投与した。虚血処置４日後の網膜細胞層切片の写真を図２１Ｂに、虚血処置２４時間後の外顆粒層切片の写真を図２１Ｆにそれぞれ示す。
また、顕微鏡の画像から視神経節細胞層、内顆粒層、及び外顆粒層の各々に含まれる細胞数を計測した。この結果を図２１Ｃ、Ｄ、Ｅに示す。
更に、ＡＳ−ＯＤＮ及びＭＳ−ＯＤＮを投与した際のＰＴＡ１のタンパク質量（酸性フェノール抽出により濃縮精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ展開の後、ブルーステイン法により可視化）を図２１Ａに示す。
図２１Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅに示すように、虚血処置により網膜神経細胞層の厚みが低下した。ＡＳ−ＯＤＮを投与した場合には、更に厚みが低下したが、ＭＳ−ＯＤＮを投与した場合にはそのような変化は観察されなかった。
〔実施例１７〕 マウスｒＰＴＡ１による網膜虚血神経傷害の抑制
虚血処置を施したｄｄＹ系マウスから網膜細胞層及び外顆粒層の切片を調製し、透過型電子顕微鏡で観察した。虚血処置及び切片の作製は、実施例１６と同様に行った。虚血処置３０分前又は２４時間後に０．１又は１．０ｐｍｏｌのマウスｒＰＴＡ１と１００ｐｍｏｌのＣａｌ Ｃ又はＨｅｒｂｉｍｙｃｉｎ Ａ（チロシンキナーゼ阻害剤）を硝子体に注入した。虚血処置４日後の網膜細胞層切片の写真を図２２Ａ〜Ｇに、虚血処置２４時間後の外顆粒層切片の写真を図２２Ｊ〜Ｎにそれぞれ示す。
また、顕微鏡の画像から視神経節細胞層、内顆粒層、及び外顆粒層の各々に含まれる細胞数を計測した。この結果を図２２Ｇ、Ｈ、Ｉに示す。
虚血処置により網膜神経細胞層の厚みが低下したが（図２２Ａ、Ｂ）、このような厚みの低下は、マウスｒＰＴＡ１の投与により抑制された。マウスｒＰＴＡ１の投与は、虚血処置の前後いずれでも有効であり（図２２Ｃ、Ｆ）、また、０．１ｐｍｏｌ投与、１．０ｐｍｏｌ投与のいずれの場合も有効であった（図２２Ｈ〜Ｊ）。マウスｒＰＴＡ１の投与の効果は、Ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ Ａによる影響を受けなかったが（図２２Ｅ）、Ｃａｌ Ｃの投与により消失した（図２２Ｄ）。
また、虚血処置により外顆粒層の細胞にネクローシスが観察された（図２２Ｊ、Ｋ）。マウスｒＰＴＡ１前投与した場合には、ネクローシスは抑制され、また、アポトーシスも観察されなかった（図２２Ｌ）。マウスｒＰＴＡ１をＣａｌ Ｃと共に投与した場合には、ネクローシスが観察され、ｒＰＴＡ１のネクローシス抑制効果が消失した。マウスｒＰＴＡ１をＨｅｒｂｉｍｙｃｉｎ Ａと共に投与した場合には、ネクローシスは観察されず、アポトーシスが観察された。
〔実施例１８〕 マウスｒＰＴＡ１による脳虚血神経傷害の抑制
ｄｄＹ系マウスの頸動脈を３０分間結紮した後、再灌流し、４日後に大脳線条体或いは海馬領域を含む前額断面切片（１ｍｍ）を調製し、これをＴＴＣ染色した後顕微鏡で観察した。マウスには、虚血処置３０分前又は２４時間後に１ｐｍｏｌのマウスｒＰＴＡ１の脳室内投与を行った。この結果を図２３に示す。
図２３に示すように、マウスｒＰＴＡ１を投与せずに頸動脈結紮を行った場合には、線条体や海馬領域に白く色素が抜けた部分が観察された。しかし、マウスｒＰＴＡ１を投与した場合には、虚血処置前後にかかわらず、このような色素の抜けた部分は観察されず、虚血処置による傷害が抑制されていた。
〔実施例１９〕 マウスｒＰＴＡ１による脳虚血誘発性学習障害の抑制
ｄｄＹ系マウスの頸動脈を３０分間結紮した後、再灌流し、４日後にＳｔｅｐ Ｔｈｒｏｕｇｈ型受動回避実験を行った。マウスには、実施例１８と同様に、虚血処置３０分前又は２４時間後に１０ｐｍｏｌのマウスｒＰＴＡ１の脳室内投与を行った。Ｓｔｅｐ Ｔｈｒｏｕｇｈ型受動回避実験の結果を図２４に示す。
図２４に示すように、虚血処置したマウスでは、偽処置対照と比較し暗室移動までの潜時の顕著な遅延が観察されたが、マウスｒＰＴＡ１を投与した場合には、虚血処置前後にかかわらず、この潜時の遅延が消失した。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願２００３−０１５７３５号の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
本発明により、神経細胞のアポトーシスやネクローシスを抑制することができるようになる。これにより、脳卒中、緑内障などの神経細胞死を伴う疾患の治療が可能になる。
【配列表】
【図１】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロサイモシンα１又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤。
【請求項２】
プロサイモシンα１が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である請求項１記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項３】
プロサイモシンα１と同等の機能を有するペプチドが、配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである請求項１記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項４】
神経細胞死が、アポトーシス及びネクローシスである請求項１乃至３のいずれか一項記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項５】
プロサイモシンα１又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを有効成分として含有する神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
【請求項６】
プロサイモシンα１が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である請求項５記載の神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
【請求項７】
プロサイモシンα１と同等の機能を有するペプチドが、配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである請求項５記載の神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
【請求項８】
神経細胞死が、アポトーシス及びネクローシスである請求項５乃至７のいずれか一項記載の神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
【請求項９】
神経細胞死を伴う疾患が、脳卒中、外傷性脳傷害、緑内障、糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性傷害である請求項５乃至８のいずれか一項記載の神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
【請求項１０】
配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチド又はこれらのペプチドと実質的に同一のペプチド。
【請求項１】
プロサイモシンα１又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを有効成分として含有する神経細胞死抑制剤。
【請求項２】
プロサイモシンα１が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である請求項１記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項３】
プロサイモシンα１と同等の機能を有するペプチドが、配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである請求項１記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項４】
神経細胞死が、アポトーシス及びネクローシスである請求項１乃至３のいずれか一項記載の神経細胞死抑制剤。
【請求項５】
プロサイモシンα１又はこれと同等の機能を有するタンパク質若しくはペプチドを有効成分として含有する神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
【請求項６】
プロサイモシンα１が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である請求項５記載の神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
【請求項７】
プロサイモシンα１と同等の機能を有するペプチドが、配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチドである請求項５記載の神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
【請求項８】
神経細胞死が、アポトーシス及びネクローシスである請求項５乃至７のいずれか一項記載の神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
【請求項９】
神経細胞死を伴う疾患が、脳卒中、外傷性脳傷害、緑内障、糖尿病性網膜症又は網膜剥離治療時の圧迫性傷害である請求項５乃至８のいずれか一項記載の神経細胞死を伴う疾患の治療剤。
【請求項１０】
配列番号４又は配列番号５記載のアミノ酸配列で表されるペプチド又はこれらのペプチドと実質的に同一のペプチド。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６４８６１
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０８１１８（Ｐ２００５−５０８１１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０００５４８
【国際出願日】平成１６年１月２２日（２００４．１．２２）
【出願人】（０００２２８５９０）日本ケミファ株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０００５４８
【国際出願日】平成１６年１月２２日（２００４．１．２２）
【出願人】（０００２２８５９０）日本ケミファ株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
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