穀物または穀物副生産物由来のオリゴ糖の酵素的産生
本発明は、穀物ふすまの可溶性画分を含む組成物を調製するための穀物ふすまの可溶化および食品、例えば、パンの製造のための可溶化された穀物ふすまを含むこれらの組成物の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、穀物ふすまの可溶性画分を含む組成物を調製するための穀物ふすまの可溶化および食品、例えば、パンの製造のための可溶化された穀物ふすまを含むこれらの組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
穀物は、アラビノキシランを５−１０％含み、デンプン、セルロースおよびβ−グルカンと共に、最も豊富な穀物炭水化物を構成する。アラビノキシランは、Ｏ−２および／もしくはＯ−３ α−Ｌ−アラビノ−フラノシル単位または４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基が連結しているβ−１，４−連結Ｄ−キシロピラノシル単位の主鎖を含み、該キシロピラノシル単位は酢酸でエステル化され得る。さらに、Ｌ−アラビノフラノシル側鎖残基は、フェルラ酸およびｐ−クマル酸でエステル化され得る。典型的なアラビノキシランにおいて、置換されていない、一置換されている、および二置換されているキシロース残基が生じる。
【０００３】
穀物におけるアラビノキシランは、水で抽出可能または水で抽出不可能のいずれかである。水で抽出不可能なアラビノキシランは、アルカリ性条件下で、または酵素、例えば、エンドキシラナーゼを使用することにより、部分的に可溶化され得る。
【０００４】
アラビノキシラン−オリゴ糖（ＡＸＯＳ）は、アラビノキシラン由来のオリゴ糖であり、前生物的特性を発揮することが示されている。前生物学的物質は、上部消化管の酵素により消化することができない化合物、通常、非グルコシドオリゴ糖であるが、大腸におけるいくつかの型の腸内細菌により選択的に発酵される。食事における前生物学的物質の存在は、一般的に乳酸菌およびビフィズス菌種の相対的な増加により特徴付けられる、腸内細菌集団の組成のシフトを引き起こす。腸の微生物叢のこのシフトは、健康全般の改善、消化管の感染症の減少、腸の短鎖脂肪酸のレベルの増大、ミネラルのより良い吸収、および大腸癌発症の抑制と関連する。
【０００５】
Katapodis Pら, European journal of Nutrition, 2003 Jan; 42(1):55-60は、小麦粉のアラビノキシラン由来の抗酸化活性を有するフェルロイル化オリゴ糖の酵素生産に関する。
【０００６】
Yuanら, Food Chemistry, Vol 95, Issue 3, 2006, Pages 484-492は、枯草菌(Bacillus subtilis)由来のキシラナーゼによる、小麦ふすまの不溶性食物繊維由来のフェルロイルオリゴ糖の生産に関する。
【０００７】
最近、ニワトリにおいて、可溶化されたふすまが不溶性ふすまよりもより良い栄養学的効果を有することが、例えば、Courtinら Journal of the science of food and agriculture. 88. p 2517-2522 (2008)およびCloetensら, Journal of the American College of Nutrition, Vol. 27, No. 4, 512-518 (2008)により示されている。
【０００８】
Swennenら. Journal of the science of food and agriculture, 2006, vol. 86, 1722-1731は、小麦ふすまのアラビノキシロオリゴ糖の大規模生産および特性化に関する。
【０００９】
ＷＯ２００８００００５０は、全粒の穀物の発酵の副産物として可溶性アラビノキシランを製造するための方法に関する。
【００１０】
ＷＯ２００８０８７１６７は、ベークド産物(baked product)中でそのままで(in situ)水溶性アラビノキシランオリゴ糖のレベルを増加させるための方法に関する。
【００１１】
Rouau, X and Surget, A., Carbohydrate polymers 24: 123 - 132 (1994)は、小麦粉中の全ての、および水で抽出可能なペントサンの測定のための迅速な半自動方法を記載している。
【００１２】
当該分野において、家畜飼料のような低価格の用途(application)に回される穀物が少なくなるような、穀物のより良い利用が求められている。さらに、製品の外観／構造、色および味において有意な影響を及ぼすことなく、穀物由来のふすま画分を既存の穀物製品に利用すること、および既存の製品の健康学的および栄養学的効果を増加させることが、長年にわたり切実に求められている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的
本発明の目的は、家畜飼料などの低価格の用途に回される穀物が少なくなる、穀物のより良い利用方法を提供するために、穀物ふすまの可溶化の増加のための方法を提供することである。さらに本発明の目的は、製品の外観／構造、色および味において有意な影響を及ぼすことなく、穀物由来のふすま画分を既存の穀物製品に利用すること、および既存の製品の健康学的および栄養学的効果を増加させることである。
【００１４】
発明の概要
本発明者らは、穀物ふすま中に相当量のデンプンを維持していることにより、細胞壁修飾酵素およびデンプン修飾酵素で処理すると、有意に高い収率のアラビノキシランオリゴ糖ならびに全可溶性物質が穀物デンプンの可溶化のプロセスにおいて得ることができることを見出した。
【００１５】
広い局面において、本発明は、可溶化されている穀物ふすまの少なくとも一部を含む組成物を生産するための穀物ふすまの可溶化に関する。本発明の方法により得られる組成物の別の一部が、ふすまの完全または部分的不溶性画分であり得ると理解すべきである。
【００１６】
よって、第１の局面において、本発明は、デンプンを含む穀物ふすまの可溶化のための方法であって、
ａ）相当量のデンプンを含む粒子穀物ふすまの液体懸濁液を調製し、
ｂ）液体懸濁液中に相当量のデンプンを含む該粒子穀物ふすまを、いずれの成分も除去することなく、任意の順番で連続して、または同時に、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素、１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素で処理する
工程を含む方法に関する。
【００１７】
第２の局面において、本発明は、本発明の方法により生産される可溶化された穀物ふすまに関する。
さらなる局面において、本発明は、食品の生産のための本発明の方法により生産される可溶化された穀物ふすまの使用に関する。
【００１８】
さらに他の局面において、本発明は、食品の生産における本発明の方法により生産される可溶化された穀物ふすまの使用により得られる食品に関する。
またさらなる局面において、本発明は、
ａ）１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素；１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素を含む酵素の組合せ、
ｂ）本発明の方法における使用のための指示書、および
ｃ）所望により食品のための他の成分
を含むパーツを含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ふすま処理に対する抽出バッファーの回収率。縦列は、表３の試験番号１−６に対する回収された抽出体積を示す。
【図２】ふすま処理に対する得られた可溶性画分中の乾物。縦列は、表３の試験番号１−６に対する％における乾物含有量を示す。
【図３】ふすま処理に対するふすまの可溶化度。縦列は、表３の試験番号１−６に対するふすまの可溶化度を示す。
【図４】ふすま処理に対する補正された（抽出体積回収率に対して）ふすまの可溶化度。縦列は、表３の試験番号１−６に対する％における（抽出体積回収率に対して補正された）ふすまの可溶化度を示す。
【図５】ベーキング試験結果。パン 対 ブランクの相対体積（％）。縦列は、表９のベーキング試験１−４に対する％におけるパン体積を示す。試験１（ブランクを１００％とする）。
【図６】（左から）対照穀粉、２，５％の可溶性繊維、５％の可溶性繊維および５％の不溶性繊維でのベーキングから得られるパン。
【図７】（左から）対照穀粉、２，５％の可溶性繊維、５％の可溶性繊維および５％の不溶性繊維でのベーキングから得られるパン。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、穀物の用途において利用され得る産物を生じる穀物の二次生産物(sidestream)（ふすま）の可溶化のプロセス（および得られる産物）に関する。本発明は、得られる産物の官能(sensoric)およびテクスチャー特性に悪影響を与えることなく穀物用途において穀物の二次生産物の利用を可能にし、原料（穀物）の利用性を増加させる。本発明のプロセスにおいて、前生物学的オリゴ糖、例えば、ベータ−グルカン、およびＡＸＯＳ、トコフェノール、およびトコトリエノール(tocotriol)（後ろの２つは抗酸化作用を有する）が産生するであろう。さらに、モノ−およびジ−グリセリド、ｌｙｓｏ−ＰＣおよびモノ／ジ−ガラクトシル−モノ−グリセリドが産生すると考えられ、これら全てが乳化剤効果を有し、最終穀物製品の外観、構造および安定性に対してさらなるプラス効果を有するであろう。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明のプロセスにより得られる可溶化された産物は、前生物学的物質、抗酸化剤および乳化剤から選択される化合物を含む。
いくつかの態様において、本発明のプロセスにより得られる可溶化された産物は、アラビノキシランオリゴ糖（ＡＸＯＳ）を含む。
【００２２】
いくつかの態様において、本発明のプロセスにより得られる可溶化された産物は、イソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ）を含む。
いくつかの態様において、本発明の方法において使用される穀物ふすまは、穀物副生産物(bi-stream)由来、例えば、従来の製粉由来の小麦ふすまである。
【００２３】
従来の小麦製粉は、６５−８５％の抽出程度（穀粒(Kernel)重量に基づく穀粉収率％）まで行われ、細胞壁多糖類、例えば、アラビノキシラン、ベータ−グルカン、セルロースからなる小麦ふすまが得られ、さらに、タンパク質、脂質、リグニンおよびデンプンが該ふすま中に存在する。ａ）例えば、キシラナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、セルラーゼ由来の、１つまたはそれ以上の細胞壁加水分解活性、およびｂ）１つまたはそれ以上のデンプン加水分解酵素、例えば、アルファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、ベータ−アミラーゼおよびトランスグリコシル化酵素、例えば、トランス−グリコシダーゼの組合せでの穀物ふすまの処理は、他の細胞壁のオリゴ糖／多糖類と共にＡＸＯＳを産生し、いくつかの態様において、ＩＭＯも産生する。該技術は、前生物学的および低炭水化物食物繊維産物を生じる製粉の二次生産物に適用され得、ベーキング、朝食用のシリアル、ケーキ、パスタなどのような穀物の用途に適用され得る。
【００２４】
本発明の１つの重要な特徴は、最終製品のより許容可能な官能性外観および健康への影響であり得る。穀物利用品における本発明のふすま画分の使用は、４つの異なるパラメーター：１）製品の構造／外観、２）製品の色、３）製品の味、および／または４）健康面に主に影響する。
【００２５】
１）穀物製品へのふすま画分の添加は、最終製品の構造に影響する。製品が酵母で発酵させるパンであるとき、ふすま画分は、グルテン強度に対して不利益な作用を有し、より小さい体積でより緻密な製品を与える。一般的に、製品へのふすま添加は、製品の構造および外観に影響を及ぼす。これは、ふすま画分または繊維画分が固体形態の代わりに可溶性形態において製品に加えられたとき、排除されるか、または減少され得る。可溶化されたふすまは、例えば、酵母で発酵させるパンにおけるグルテン発達および強度に対し同じ作用を有さない。
【００２６】
２）穀物製品におけるふすまの使用は、製品の色に対して有意な影響を及ぼし、製品をより暗くする。この理由は、ふすま画分における色成分（主に細胞壁におけるフェノール性化合物）であり、製品全体の色に影響を及ぼす。ほとんどの場合、内胚乳（穀粉）のみから生産されるより白色の製品と比較して、不利益な、あまり魅力的でない製品としての特徴が見られる。本発明の可溶化されたふすまを使用すると、色は減少されるか、またはさらに排除され得る。この理由は、多くのフェノール性化合物がしばしば、酵素的に接触が非常に困難である細胞壁の領域に位置することであり、したがって、それらが可溶化され、可溶化されたふすま画分を使用して生産される最終製品の暗い色に寄与しなくなる。
【００２７】
本発明の方法は、色に寄与する化合物を完全に除去するために、これらの産物の特異的な酵素加水分解を使用して、または分離および／もしくは精製技術の適用により、最適化され得る。
【００２８】
３）ふすま画分を適用するとき、より暗い製品に寄与する同じ成分は、最終製品の官能特性も変化させるであろう。内胚乳から生産される製品と比較して、これらの化合物に関する特徴はより苦い味である。この味は、ライ麦パンが伝統的に、消費されているスカンジナビアおよびヨーロッパ北部においてよく知られており、好まれる。しかしながら、世界の他の多くにおいて、該味は好まれず、製品の欠点として見られる。
【００２９】
４）多くのヒバマタ属は、食事を介して消化管の健康に対する影響に向けられてきた。食事、とりわけ食物繊維（可溶性および不溶性）の消費が、腸管内菌叢の組成、それによる個体の健康全般に非常に大きな影響を有することが良く認識されている。可溶性ふすま、またはより正確には、可溶性低分子アラビノキシランオリゴ糖（ＡＸＯＳ）の適用は、腸管内菌叢を劇的に変化させることが示されている。ＡＸＯＳおよびＩＭＯの産生を組み合わせることにより、繊維画分の使用は、製品により多くのデンプンを加えることなく、代謝エネルギーを高めるが、残留デンプンおよびグルコースを別の前生物学的繊維、ＩＭＯに変換する。
【００３０】
産生される画分は、朝食用のシリアルにおいて利用でき、穀物（小麦）の利用率を増加させ、使用される増量剤（糖）を減少させ、カロリー負荷を減少させ、前生物学的物質を食事に導入することができる。
【００３１】
要約すると、本発明の方法は、飼料、例えば、家畜飼料のような低価格の利用品に回される穀物が少なくなるような穀物のより良い利用を与える。さらに、本明細書に記載されている方法は、製品の外観／構造、色および味に対し有意な影響を及ぼすことなく、穀物由来のふすま画分を既存の穀物製品に利用可能にする。最後に、本明細書に記載されている方法は、既存の製品の健康学的および栄養学的効果を増加させることを可能にする。
【００３２】
定義
本明細書において使用される「穀物」なる用語は、イネ科(Poaceae)の植物由来の実を示し、果皮、種皮(seed coat)（あるいは種皮(testa)とも称される）および／または胚芽のさらなる存在を有するか、または有さない、例えば、アリューロンを含む少なくともふすまおよびデンプン内胚乳を含む種子を示す。該用語は、小麦、大麦、オート麦、スペルト小麦、ライ麦、モロコシ、メイズおよびイネのような種を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書において使用される「ふすま」なる用語は、対応する完全な種子と比較して、アリューロン、果皮および種皮から選択される組織のいずれかまたは全てにおいて豊富である穀物由来の製粉画分を示す。
【００３４】
本明細書において使用される「可溶化」なる用語は、本発明の方法における穀物ふすまの可溶化を示し、あらゆる程度の可溶化を含むことを意図する。したがって、「可溶化」は、１００％の可溶性物質を達成するようにであってよく、また、１００％未満、例えば、７０％未満、例えば、４０％−６０％の範囲、または、例えば、２０％−４０％の範囲の可溶化度を達成するようにであってよい。いくつかの態様において、可溶化度は、乾物 対 乾物ふすまで決定される。
【００３５】
本明細書において使用される「製粉画分」なる用語は、例えば、限定はしないが、ふるい(sieving)、スクリーニング、ふるい分け(sifting)、吹き込み(blowing)、吸引、遠心式のふるい分け(centrifugal sifting)、風によるふるい分け(windsifting)、静電分離または電界分離による分別を含むか、または含まない、例えば、限定はしないが、切断、圧延、粉砕、破損(breakage)または製粉による粒子サイズの機械的減少によって生じる画分の全てまたは一部を示す。
【００３６】
本発明の文脈において「相当量のデンプン」は、穀物の従来の機械加工後、例えば、穀物の商業的な製粉後に通常存在する残留デンプンの量をほぼ含む穀物ふすまを示す。いくつかの態様において、穀物に通常存在するデンプンの少なくとも約１％、例えば、少なくとも約３％、例えば、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、例えば、少なくとも約５０％が、まだ、本発明で使用される穀物ふすま画分にある。好ましくは、穀物ふすまは、デンプン加水分解酵素で前処理されていないか、または他の方法においてふすまからデンプンを除去するために酵素的に処理されていない。
【００３７】
本発明の方法は、残留デンプンを含む粒子穀物ふすまの実質的に単離された液体懸濁液の調製、および該穀物ふすまの酵素処理に関すると理解すべきである。したがって、該酵素は残留デンプンを有する穀物ふすまに対して酵素作用を有するはずであると理解すべきである。本発明は、添加的な追加された穀粉調製物での組成物の酵素処理、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕでの酵素的パン製造適用を包含することを意図しない。
【００３８】
いくつかの態様において、粒子穀物ふすまの液体懸濁液の約５０％未満、例えば、約４０％未満、例えば、約３０％未満、例えば、約２０％未満、例えば、約１０％未満、例えば、約６％未満、例えば、約３％未満、例えば、約１％未満（ｗ／ｗ）は、デンプンまたはデンプンを含む成分、例えば、穀粉である。
【００３９】
本発明の文脈において「細胞壁修飾酵素」は、植物細胞壁の複合マトリクス多糖類を加水分解または修飾することができるあらゆる酵素、例えば、本明細書における「細胞壁可溶化アッセイ」において活性を有するあらゆる酵素を示す。「細胞壁修飾酵素」の定義に包含されるものは、セルラーゼ、例えば、セロビオヒドロラーゼＩおよびセロビオヒドロラーゼＩＩ、エンド−グルカナーゼおよびベータ−グルコシダーゼ、ならびにヘミセルロース分解酵素、例えば、キシラナーゼである。
【００４０】
本明細書において使用される「セルラーゼ」または「セルロース分解酵素」なる用語は、セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、例えば、セロビオヒドロラーゼＩおよびセロビオヒドロラーゼＩＩ、ならびにエンド−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）およびベータ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）を含むと理解される。
【００４１】
セルラーゼの定義に包含されるものは、ランダムにセルロース鎖を切断するエンド−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、セルロース鎖末端からセロビオシル単位を開裂するセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）およびセロビオースおよび可溶性セロデキストリンをグルコースに変換するベータ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）である。セルロースの生物分解に関与する酵素のこれら３つのカテゴリー中、セロビオヒドロラーゼは、天然結晶セルロースの分解のための重要な酵素である。「セロビオヒドロラーゼＩ」なる用語は、鎖の非還元末端からのセロビオースの遊離により、セルロースおよびセロテトラオースにおける１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素クラスＥＣ３．２．１．９１において定義される、セルロース１，４−ベータ−セロビオシダーゼ（エキソグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼまたは１，４−ベータ−セロビオヒドロラーゼとしも称される）活性として本明細書において定義される。「セロビオヒドロラーゼＩｌ活性」なる用語の定義は、セロビオヒドロラーゼＩｌが鎖の還元末端から攻撃することを除いて、同一である。
【００４２】
セルラーゼは、酵素のセルロース含有繊維への結合を増強し、酵素の触媒活性部分の効力を増加させる炭水化物−結合モジュール（ＣＢＭ）を含み得る。ＣＢＭは、炭水化物−結合活性を有する目立たない折り畳みを有する炭水化物−活性酵素内の隣接するアミノ酸配列として定義される。ＣＢＭのさらなる情報のために、ＣＡＺｙインターネット・サーバー（上記）またはTommeら.(1995) in Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Saddler and Penner, eds.), Cellulose- binding domains: classification and properties, pp. 142-163, American Chemical Society, Washington参照。好ましい態様において、セルラーゼまたはセルロース分解酵素は、米国出願第６０／９４１，２５１号（出典明示により本明細書に包含させる）に定義されているセルロース分解調製物であり得る。好ましい態様において、セルロース分解調製物は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１Ａ）、好ましくはＷＯ２００５／０７４６５６に記載されているものを含む。細胞壁修飾酵素は、さらに、ベータ−グルコシダーゼ、例えば、トリコデルマ、アスペルギルスまたはペニシリウム属の株由来のベータ−グルコシダーゼ、例えば、米国出願第６０／８３２，５１１号（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）に記載されているベータ−グルコシダーゼ活性を有する融合タンパク質であり得る。いくつかの態様において、細胞壁修飾酵素は、ＣＢＨ ＩＩ、例えば、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)セロビオヒドロラーゼＩｌ（ＣＥＬ６Ａ）である。いくつかの態様において、細胞壁修飾酵素は、セルラーゼ酵素、例えば、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)由来のものである。
【００４３】
いくつかの態様において、セルロース分解活性は、真菌供給源、例えば、トリコデルマ属の株、例えば、トリコデルマ・リーゼイの株、またはフミコーラ属の株、例えば、フミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)の株由来であり得る。
【００４４】
いくつかの態様において、細胞壁修飾酵素は、ＷＯ２００５／０７４６５６に記載されているセルロース分解増強活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１Ａ）、セロビオヒドロラーゼ、例えば、チエラビア・テレストリス セロビオヒドロラーゼＩｌ（ＣＥＬ６Ａ）、ベータ−グルコシダーゼ（例えば、米国出願第６０／８３２，５１１号に記載されている融合タンパク質）および、例えば、トリコデルマ・リーゼイ由来のセルロース分解酵素である。
【００４５】
いくつかの態様において、細胞壁修飾酵素は、ＷＯ２００５／０７４６５６に記載されているセルロース分解増強活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１Ａ）、ベータ−グルコシダーゼ（例えば、米国出願第６０／８３２，５１１号に記載されている融合タンパク質）および、例えば、トリコデルマ・リーゼイ由来のセルロース分解酵素である。いくつかの態様において、細胞壁修飾酵素は、市販されている産物、例えば、Genencor, A Danisco Division, USから利用できるＧＣ２２０またはNovozymes A/S, Denmarkから利用できるＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（登録商標） １．５ＬもしくはＣＥＬＬＵＺＹＭＥTMである。
【００４６】
エンド−グルカナーゼ（ＥＣＮｏ．３．２．１．４）は、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース）、リケニンにおける１，４−ベータ−Ｄ−グリコシド結合、複合ベータ−１，３グルカン、例えば、穀物ベータ−Ｄ−グルカンまたはキシログルカンおよびセルロース部分を含む他の植物原料におけるベータ−１，４結合の内部加水分解(endo hydrolysis)を触媒する。公認名は、エンド１，４−ベータ−Ｄ−グルカン ４−グルカノヒドロラーゼであるが、略語エンド−グルカナーゼが本明細書において使用される。エンド−グルカナーゼ活性は、Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268の方法にしたがってカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）加水分解を使用して測定され得る。
【００４７】
いくつかの態様において、エンド−グルカナーゼは、トリコデルマ属の株、例えば、トリコデルマ・リーゼイの株、フミコーラ属の株、例えば、フミコーラ・インソレンスの株、またはクリソスポリウム(Chrysosporium)の株、好ましくはクリソスポリウム・ラクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)の株由来であり得る。
【００４８】
「セロビオヒドロラーゼ」なる用語は、セルロース、セロオリゴ糖、またはあらゆるベータ−１，４−連結グルコース含有ポリマーにおける１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒し、鎖の還元または非還元末端からセロビオースを遊離する１，４−ベータ−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）を意味する。
【００４９】
セロビオヒドロラーゼ(cellobiohydrolose)の例は、上記のもの、例えば、トリコデルマ・リーゼイ、フミコーラ・インソレンス由来のＣＢＨＩおよびＣＢＨＩｌならびにチエラビア・テレストリス(Thielavia teπrestris)セロビオヒドロラーゼ由来のＣＢＨＩｌ（ＣＥＬＬ６Ａ）である。
【００５０】
セロビオヒドロラーゼ活性は、Leverら., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279およびvan Tilbeurghら., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288により記載されている方法にしたがって測定され得る。Leverらの方法は、トウモロコシ茎葉におけるセルロースの加水分解を評価するために適当であり、van Tilbeurghらの方法は、蛍光二糖類誘導体におけるセロビオヒドロラーゼ活性を測定するために適当である。
【００５１】
「ベータ−グルコシダーゼ」なる用語は、ベータ−Ｄ−グルコースの遊離を伴う末端の非還元ベータ−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒するベータ−Ｄ−グルコシド グルコヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）を意味する。本発明の目的のために、ベータ−グルコシダーゼ活性は、異なる条件が本明細書に記載されているとおりに使用されることを除いて、Venturiら., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66により記載されている基本的方法にしたがって測定される。ベータ−グルコシダーゼ活性の１ユニットは、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中で基質として４ｍＭのｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドから５００Ｃで、ｐＨ５で１分あたり生産される１．０μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールとして定義される。
【００５２】
いくつかの態様において、ベータ−グルコシダーゼは、真菌起源、例えば、トリコデルマ、アスペルギルスまたはペニシリウム属の株のものである。いくつかの態様において、ベータ−グルコシダーゼは、トリコデルマ・リーゼイ由来であり、例えば、ｂｇｌ１遺伝子によってコードされるベータ−グルコシダーゼである（ＥＰ５６２００３参照）。他の態様において、ベータ−グルコシダーゼは、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)（ＷＯ０２／０９５０１４にしたがってアスペルギルス・オリザエにおいて組換え的に生産される）、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)（ＷＯ０２／０９５０１４の実施例２２にしたがってアスペルギルス・オリザエにおいて組換え的に生産される）または黒色アスペルギルス（1981, J. Appl. 3: 157-163）由来である。
【００５３】
本明細書において使用される「ヘミセルロース分解酵素(hemicellulolvtic enzyme)」または「ヘミセルラーゼ」なる用語は、ヘミセルロースを分解し得る酵素を示す。
【００５４】
好ましくはアラビノキシランオリゴ糖への、ヘミセルロースの加水分解における使用のために適当なあらゆるヘミセルラーゼが使用され得る。好ましいヘミセルラーゼは、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクタナーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、マンナーゼ、エンドもしくはエキソアラビナーゼ、エキソ−ガラクタナーゼ、ペクチナーゼ、キシログルカナーゼ、または２つ以上のそれらの混合物を含む。本発明における使用のために適当なヘミセルラーゼの例は、Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ ９３０（Danisco A/S, Denmarkから利用できる）またはＶＩＳＣＯＺＹＭ ＥTM（Novozymes A/S, Denmarkから利用できる）を含む。１つの態様において、ヘミセルラーゼはキシラナーゼである。１つの態様において、キシラナーゼは、微生物起源、例えば、真菌起源（例えば、トリコデルマ、メリピルス(Meripilus)、フミコーラ、アスペルギルス、フザリウム）または細菌（例えば、バチルス）由来である。いくつかの態様において、キシラナーゼは、糸状菌由来、好ましくはアスペルギルスの株、例えば、アスペルギルス・アクレアータス(Aspergillus aculeatus)、またはフミコーラの株、好ましくはフミコーラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)由来である。キシラナーゼは、好ましくはエンド１，４−ベータ−キシラナーゼ、さらに好ましくはＧＨ１０またはＧＨ１１のエンド１，４−ベータ−キシラナーゼであり得る。市販のキシラナーゼの例は、Danisco A/S, DenmarkからのＧｒｉｎｄａｍｙｌ Ｈ１２１もしくはＧｒｉｎｄａｍｙｌ Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ ９３０またはNovozymes A/S, DenmarkからのＳＨＥＡＲＺＹＭＥTMおよびＢＩＯＦＥＥＤ ＷＨＥＡＴTMを含む。
【００５５】
アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）は、アルファ−Ｌ−アラビノシドにおける末端の非還元アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド残基の加水分解を触媒する。アラビノガラクタン エンド−１，４−ベータ−ガラクトシダーゼであるガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）は、アラビノガラクタンにおける１，４−Ｄ−ガラクトシド結合の内部加水分解を触媒する。
【００５６】
ペクチナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５）は、ペクチン酸塩における１，４−アルファ−Ｄ−ガラクトシドウロン(galactosiduronic)結合および他のガラクツロナンの加水分解を触媒する。
キシログルカナーゼは、キシログルカンの加水分解を触媒する。
【００５７】
本明細書において使用される「キシラナーゼ」なる用語は、キシランまたはアラビノキシランの非末端ベータ−Ｄ−キシロピラノシル−１，４−ベータ−Ｄ−キシロピラノシル単位におけるベータ−１，４グリコシル結合を加水分解することができる酵素を示す。他の名前は、１，４−ベータ−Ｄ−キシラン キシラノヒドロラーゼ、１，４−ベータ−キシラン キシラノヒドロラーゼ、ベータ−１，４−キシラン キシラノヒドロラーゼ、（１−４）−ベータ−キシラン ４−キシラノヒドロラーゼ、エンド−１，４−ベータ−キシラナーゼ、エンド−（１−４）−ベータ−キシラナーゼ、エンド−ベータ−１，４−キシラナーゼ、エンド−１，４−ベータ−Ｄ−キシラナーゼ、エンド−１，４−キシラナーゼ、キシラナーゼ、ベータ−１，４−キシラナーゼ、ベータ−キシラナーゼ、ベータ−Ｄ−キシラナーゼを含む。キシラナーゼは、種々の生物、例えば、植物、真菌（例えば、アスペルギルス、ペニシリウム、ディスポロトリカム(Disporotrichum)、アカパンカビ、フザリウム、フミコーラ、トリコデルマの種）または細菌種（例えば、バチルス、アエロモナス、ストレプトマイセス、ノカルジオプシス、サーモミセス(Thermomyces)の種）（例えば、ＷＯ９２／１７５７３、ＷＯ９２／０１７９３、ＷＯ９１／１９７８２、ＷＯ９４／２１７８５参照）由来であり得る。
【００５８】
本発明の１つの局面において、本発明の方法において使用されるキシラナーゼは、ＥＣ３．２．１．８として分類される酵素である。正式名称はエンド−１，４−ベータ−キシラナーゼである。組織名は１，４−ベータ−Ｄ−キシラン キシラノヒドロラーゼである。他の名前は、例えば、エンド−（１−４）−ベータ−キシラナーゼ、（１−４）−ベータ−キシラン ４−キシラノヒドロラーゼ、エンド−１，４−キシラナーゼ、キシラナーゼ、ベータ−１，４−キシラナーゼ、エンド−１，４−キシラナーゼ、エンド−ベータ−１，４−キシラナーゼ、エンド−１，４−ベータ−Ｄ−キシラナーゼ、１，４−ベータ−キシラン キシラノヒドロラーゼ、ベータ−キシラナーゼ、ベータ−１，４−キシラン キシラノヒドロラーゼ、エンド−１，４−ベータ−キシラナーゼ、ベータ−Ｄ−キシラナーゼで使用され得る。触媒される反応は、キシランにおける１，４−ベータ−Ｄ−キシロシド結合の内部加水分解である。
【００５９】
本発明の１つの局面において、本発明のキシラナーゼは、グリコシドヒドロラーゼ(hydrolyase)（ＧＨ）ファミリー１１のキシラナーゼである。「グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１１」なる用語は、問題になっているキシラナーゼがＧＨファミリー１１に分類されるか、または分類され得ることを意味する。
【００６０】
本発明の１つの局面において、本発明において使用されるキシラナーゼは、本明細書に記載されている「キシラナーゼアッセイ」において測定されるとき、キシラナーゼ活性を有するキシラナーゼである。
【００６１】
Ｃａｚｙ（ＭｏｄＯ）サイトにしたがって、ファミリー１１グリコシドヒドロラーゼは以下のとおりに特徴付けることができる：
既知の活性：キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）
メカニズム：維持
触媒求核原子／塩基：Ｇｌｕ（実験的）
触媒プロトン供与体：Ｇｌｕ（実験的）
３Ｄ構造状態：折り畳み：β−ゼリーロール
クラン：ＧＨ−Ｃ
【００６２】
本明細書において使用される「クランＣ」は、共通の三次元折り畳みおよび同一の触媒機構を共有するファミリーのグループを示す（例えば、Henrissat, B. and Bairoch, A., (1996) Biochem. J.,316, 695-696参照）。
【００６３】
本明細書において使用される「ファミリー１１」は、Henrissat and Bairoch (1993) Biochem J.,293,781-788（Henrissat and Davies (1997) Current Opinion in Structural Biol. 1997, &:637-644も参照）により確立されている酵素のファミリーを示す。ファミリー１１メンバーの一般的な特性は、高い遺伝的相同性、約２０ｋＤａのサイズおよび二重置換触媒メカニズムを含む（Tenkanenら., 1992; Wakarchukら., 1994参照）。ファミリー１１キシラナーゼの構造は、β−鎖から作られる２つの大型のβ−シートおよびα−ヘリックスを含む。
【００６４】
ファミリー１１キシラナーゼは、黒色アスペルギルス(Aspergillus niger)ＸｙｎＡ、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)ＸｙｎＣ、アスペルギルス・ツビゲンシス(Aspergillus tubigensis)ＸｙｎＡ、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)ＸｙｎＡ、バチルスプンジルス(Bacilluspunzilus)ＸｙｎＡ、枯草菌ＸｙｎＡ、ネオカリマスチクスフロンタリス(Neocalliniastix patriciarum)ＸｙｎＡ、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)ＸｙｎＢ、ストレプトミセス・リビダンスＸｙｎＣ、ストレプトミセス・ゼリノビオラセウス(Streptomyces therinoviolaceus)ＸｙｎＩＩ、好熱性放線菌ＸｙｎＡ、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)Ｘｙｎ、トリコデルマ・リーゼイＸｙｎＩ、トリコデルマ・リーゼイＸｙｎＩＩ、トリコデルマビリデ(Trichoderma viride)Ｘｙｎを含む。
【００６５】
本発明の文脈において、「デンプン修飾酵素」は、グルコシドにおけるα−１，３および／またはα−１，６グルコシド結合の加水分解を触媒するあらゆる酵素を示す。この用語に包含されるものは、一般的に作用する基質にちなんで命名されるグリコシドヒドロラーゼである。本発明のいくつかの態様において、「デンプン修飾酵素」は、ラクターゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、キチナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼおよびリゾチームから選択される。
【００６６】
いくつかの態様において、デンプン修飾酵素はデンプン脱分枝酵素である。
本発明の１つの局面において、本発明において使用されるデンプン修飾酵素は、本明細書に記載されている「デンプン脱分枝活性アッセイ」において測定されるとき、デンプン脱分枝活性を有する酵素である。
【００６７】
デンプン脱分枝酵素は、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）およびイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）を含む。それらは、アミロペクチン、β−リミットデキストリンおよびプルランにおけるα−ｌ，６−Ｄ−グルコシド分岐結合を加水分解する。イソアミラーゼは、プルランを攻撃するイソアミラーゼの無能力により、およびα−リミットデキストリンにおける限界作用により、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）と区別することができる。
【００６８】
「アミラーゼ」は、あらゆるアミラーゼ、例えば、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびバチルス属、例えば、バチルス・リケニホルミス(B. licheniformis)および枯草菌の野生型α−アミラーゼを含むことを意図する。「アミラーゼ」は、特に、デンプンの分解を触媒することができる酵素を意味する。アミラーゼは、デンプンにおけるα−Ｄ−（ｌ→４）Ｏ−グリコシド結合を開裂するヒドロラーゼである。一般的に、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１；（Ｘ−Ｄ−（１→４）−グルカン グルカノヒドロラーゼ）は、ランダム様式においてデンプン分子内のα−Ｄ−（ｌ→４）Ｏ−グリコシド結合を開裂するエンド−作用性酵素として定義される。対照的に、エキソ−作用性デンプン分解酵素、例えば、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２；α−Ｄ−（ｌ→４）−グルカン マルトヒドロラーゼ）およびいくつかの産物特異的アミラーゼ様マルトース生成型(maltogenic)α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）は、基質の非還元末端からデンプン分子を開裂し、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０；α−Ｄ−グルコシド グルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３；α−Ｄ−（ｌ→４）−グルカン グルコヒドロラーゼ）および産物特異的アミラーゼは、デンプンからグルコースを生産することができる。
【００６９】
「α−アミラーゼ変異体」、「α−アミラーゼ変異体ポリペプチド」および「変異体酵素」は、成熟体α−アミラーゼタンパク質のアミノ末端でアミノ酸残基を置き換えることにより修飾されているα−アミラーゼタンパク質を意味する。本明細書において使用される「親酵素」、「親配列」、「親ポリペプチド」、「野生型α−アミラーゼタンパク質」および「親ポリペプチド」は、α−アミラーゼ変異体ポリペプチドが由来する酵素およびポリペプチドを意味する。親酵素は、以前に組換え的に操作されている野生型酵素またはα−アミラーゼであり得る。α−アミラーゼ変異体は、α−アミラーゼ親ポリペプチドのシグナル配列において、またはα−アミラーゼ親ポリペプチドの他の場所において変異をさらに含むことができる。したがって、α−アミラーゼポリペプチドは、組換え的に操作された酵素であり得る。
【００７０】
本発明の１つの局面において、本発明において使用されるα−アミラーゼは、本明細書に記載されている「α−アミラーゼアッセイ」において測定されるとき、α−アミラーゼ活性を有するα−アミラーゼである。
【００７１】
本発明の１つの局面において、本発明において使用されるベータ−アミラーゼは、本明細書に記載されている「ベータ−アミラーゼアッセイ」において測定されるとき、ベータ−アミラーゼ活性を有するベータ−アミラーゼである。
【００７２】
「プルラナーゼ」なる用語は、プルランを分解するデンプン分解内酵素である特定の種類のグルカナーゼを示す。それは、例えば、クレブシエラ属のグラム陰性菌により細胞外の細胞表面に固定されたリポタンパク質として生産される。しかしながら、グラム陽性菌は、分泌タンパク質としてプルラナーゼを生産する。Ｉ型プルラナーゼは、α−１，６結合を特異的に攻撃するが、ＩＩ型プルラナーゼは、α−１，４結合も加水分解することができる。それは、また、いくつかの他の細菌および古細菌により生産される。プルラナーゼは、バイオテクノロジーにおいてデタージェントとして使用される。プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）は、プルラン−６−グルカノヒドロラーゼ（脱分枝酵素）としても知られている。プルランは、α−１，６−グルコシド結合により連結したマルトトリオース単位の鎖と考えられている。プルラナーゼは、プルラン（α−グルカン多糖類）を加水分解的に開裂する。
【００７３】
「トランスグリコシル化酵素」は、トランスグルコシダーゼ活性を有するあらゆる酵素、例えば、トランスグルコシダーゼを示す。「トランスグルコシダーゼ」なる用語は、１，４−α−Ｄ−グルカンにおけるα−Ｄ−グルコシル残基を、遊離しているか、または１，４−α−Ｄ−グルカンと結合しているグルコースの第一ヒドロキシ基に移す酵素を示す。本明細書に記載されているトランスグルコシダーゼは、ＩＵＢＭＢ酵素命名にしたがってＥＣ２．４．１．２４と記載されている活性を有する。本明細書に記載されているトランスグルコシダーゼの組織名は、１，４−α−Ｄ−グルカン、すなわち１，４−α−Ｄ−グルカン（Ｄ−グルコース）６−α−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼである。この酵素は、ある文献においてα−グルコシダーゼとして称されている。
【００７４】
上記のとおり、トランスグルコシダーゼ酵素は、一般的に、ＩＵＢＭＢ酵素命名にしたがってＥＣ２．４．１．２４として定義される、あるグルカンにおけるグルコシル残基をグルコースの第一ヒドロキシ基に移す活性を有する。いくつかの態様において、該酵素は、また、糖側鎖を切るか、または内部結合を開裂し、多糖類骨格を破壊することにより、天然ゴム多糖類（例えば、キサンタン、およびガラクトマンナン含有多糖類、例えば、グアーガムまたはライ豆ゴム）を分解する活性を有し得る。あらゆる適当なトランスグルコシダーゼ酵素が本発明における使用に認められる（例えば、Pazurら, Carbohydr. Res. 1986 149:137-47;およびNakamuraら, J. Biotechnol., 53:75-84, 1997参照）。いくつかの態様において、本発明における使用に認められるトランスグルコシダーゼ酵素は、市販されているものである（例えば、Megazyme, Wicklow, Ireland；またはDanisco US Inc., Genencor Division, Palo Alto, CAから得られる酵素を含むが、これらに限定されない）。いくつかの態様において、酵素は、トリコデルマ・リーゼイ細胞において生産される黒色アスペルギルス トランスグルコシダーゼである。いくつかのさらなる態様において、トランスグルコシダーゼは、野生型真菌トランスグルコシダーゼ（例えば、アクセス番号：Ｄ４５３５６（ＧＩＤ：２６４５１５９；黒色アスペルギルス）、ＢＡＤ０６００６．１（ＧＩＤ：４０３１３２８；アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)）、ＢＡＡ０８１２５．１｛ＧｌＯ：＼０５４５６５；アスペルギルス・オリザエ）、ＸＰＪ）Ｏｌ ２１０８０９．１（ＧＩＤ： １ １５４９２３６３；アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)）、ＸＰ＿００１２７１８９１．１（ＧＩＤ：１２１７０７６２０；アスペルギルス・クラバタス(Aspergillus clavatus)、ＸＰＪ）０１２６６９９９．１（ＧＩＤ：１ １９５００４８４；ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)）、ＸＰ ７５１８１ １．１（ＧＩＤ：７０９９３９２８；アスペルギルス・フミガーツス）、ＸＰ＿６５９６２１．１（ＧＩＤ：６７５２３１２１；アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)）、ＸＰ＿００１２１６８９９．１（ＧＩＤ：１１５４３３５２４；アスペルギルス・テレウス）およびＸＰＪ）０１２５８５８５．１（ＧＩＤ：１１９４７３３７１；ネオサルトリア・フィシェリ）として、ＮＣＢＩのＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースにおいて寄託されているアミノ酸配列を有する真菌トランスグルコシダーゼを含むが、これらに限定されない）、または、野生型真菌トランスグルコシダーゼと少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一または少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を有するそれらの変異体である。
【００７５】
本発明の１つの局面において、本発明において使用されるトランスグルコシダーゼは、本明細書に記載されている「トランスグルコシダーゼアッセイ」において測定されるとき、トランスグルコシダーゼ活性を有するトランスグルコシダーゼである。
【００７６】
本発明の酵素活性アッセイ
細胞壁可溶化アッセイ
好ましくは、ふすま溶解度は、以下のアッセイを使用して測定される。
【００７７】
（０．１Ｍ）−リン酸水素二ナトリウム（０．２Ｍ）バッファー、ｐＨ５．０中の小麦ふすまの懸濁液を、１，３３％のふすまの濃度（ｗ／ｗ）に調製する。この懸濁液から、７５０μｌのアリコートを撹拌下でエッペンドルフチューブに移す。それぞれの基質チューブを４０℃で５分間予め加熱する。そこに、２５０μｌの酵素溶液を加え、基質１％の最終濃度を作る。各測定時間（０、３０、６０および２４０分）に対し、酵素濃度を増加させて（０，３３；１，０および３，０μｇの酵素／グラムふすま）、本発明の各酵素組成物から３つの希釈物（デュプリケート）を作る。ブランクとして、酵素組成物の熱変性した溶液を使用する。反応は、９５℃でチューブをインキュベーターセットに移すことにより、所定の時間に終了する。全酵素反応が終了するまで、熱変性したサンプルを４℃で維持する。全酵素反応が終了したとき、エッペンドルフチューブを遠心し、透明な上清を得る。ふすまを可溶性にする酵素能力は、ＰＡＨＢＡＨを使用して測定される末端基の還元の増加として示される（Ｌｅｖｅｒ、１９７２）。
【００７８】
使用されるふすまが残留デンプンを含むとき、副活性、例えば、アミラーゼ活性が上記アッセイを妨げ得るため、ふすま可溶化アッセイは、精製された細胞壁修飾酵素（アミラーゼ活性を有さない）でのみ実施されるべきである。
【００７９】
あるいは、可溶化度は、以下の方法にしたがって測定され得る。
植物原料、例えば、穀物ふすまの可溶化度は、不溶性植物原料を、酵素を有するか、または有さない抽出バッファー（一般的に、バッファー中１０−２５％のふすま（ｗ／ｗ））に懸濁し、懸濁液を撹拌下で摂氏４０℃で制御時間（例えば、３０から１４４０分）でインキュベートすることにより測定することができる。可溶化後、可溶化された原料を遠心分離（２０分、２５０００×ｇ、室温）により不溶性原料から分離する。上清中の乾物含有量を、サンプルの一部を凍結乾燥することにより、または含水量分析により（Moidture analyser, AND ML-50, Buch & Holm, Denmark）測定する。すべての抽出バッファーを、このプロトコールを使用して回収することはできないが、しかしながら、可溶性物質の濃度は、回収されなかった抽出バッファー中と回収された抽出バッファー中で同じであると考え、補正を使用された全抽出バッファーに対して行う。可溶性画分中の乾物含有量を測定しておき、試験に取り入れた植物原料の量および抽出バッファーの量を知っていると、可溶化度は以下の方程式を使用して決定することができる。
可溶化度＝（（（乾物のグラム／回収された上清のｍｌ）×（使用された抽出バッファーのｍｌ））×１００％）／試験に取り入れた植物原料のグラム
【００８０】
キシラナーゼアッセイ（エンド−β−１，４−キシラナーゼ活性）
このアッセイにおいてＯＤ５９０＝約０．７を得るように、サンプルをクエン酸（０．１Ｍ）−リン酸水素二ナトリウム（０．２Ｍ）バッファー、ｐＨ５．０に希釈した。サンプルの３つの異なる希釈物を５分４０℃でプレインキュベートした。時間＝５分で、１つのＸｙｌａｚｙｍｅ錠剤（架橋され、染色されたキシラン基質、Megazyme, Bray, Ireland）を、１ｍｌの反応容量の酵素溶液に加えた。時間＝１５分で、１０ｍｌの２％のＴＲＩＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ１２を加えることにより反応を終了した。ブランクは、酵素溶液の代わりに１０００μｌのバッファーを使用して調製した。反応混合物を遠心し（１５００×ｇ、１０分、２０℃）、上清のＯＤを５９０ｎｍで測定した。１つのキシラナーゼユニット（ＸＵ）は、１分あたりＯＤ５９０が０．０２５増加するキシラナーゼ活性として定義される。
【００８１】
α−アミラーゼ活性：
α−アミラーゼは、α−Ｄ−１，４−グルコシド結合を加水分解し、その活性は、アルファ１，４−Ｄ−結合の加水分解によるデンプン−ヨウ素溶液の色の変化率として検出することができる。
【００８２】
ベータ−アミラーゼ活性：
ベータ−アミラーゼ活性は、デンプン溶液の非還元末端からのマルトースの遊離として測定することができる。
【００８３】
トランスグルコシダーゼ活性：
トランスグルコシダーゼは、α−Ｄ−グルコオリゴ糖とのインキュベーションにおける加水分解および移動反応の両方を触媒する。トランスグルコシダーゼ活性は、マルトースまたはマルトデキストリンとのインキュベーション時のイソマルトオリゴ糖、例えば、イソマルトース、パノース(pansose)およびイソマルトトリオースの生成として測定することができる。
【００８４】
デンプン脱分枝活性アッセイ：
現在、デンプンにおけるα−Ｄ−１，６グルコシド結合に対して特異的な酵素は、イソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）およびプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）を含む。デンプンのα−Ｄ−１，６グルコシド結合に作用する酵素は、また、プルランに対するそれらの活性により分類され、それらの活性は、デンプンおよびプルランのα−Ｄ−１，６グルコシド結合の特異的加水分解として測定される。
【００８５】
本発明の特定の態様：
上記のとおり、本発明は、デンプンを含む穀物ふすまの可溶化のための方法であって、
ａ）相当量のデンプンを含む粒子穀物ふすまの液体懸濁液を調製し、
ｂ）液体懸濁液中に相当量のデンプンを含む該粒子穀物ふすまを、いずれの成分も除去することなく、任意の順番で連続して、または同時に、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素、１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素で処理する
工程を含む方法に関する。
【００８６】
本発明のいくつかの態様において、粒子穀物ふすまを、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素、および１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素を含む酵素の組合せで同時に処理する。
【００８７】
本発明のいくつかの態様において、１つのさらなる酵素は、１つまたはそれ以上のトランスグリコシル化酵素である。
本発明のいくつかの態様において、１つのさらなる酵素は、リパーゼ、例えば、ホスホリパーゼまたはガラクトリパーゼである。
本発明のいくつかの態様において、１つのさらなる酵素は、プロテアーゼである。
【００８８】
本発明のいくつかの態様において、工程ｂ）から得られる可溶性画分を回収する工程をさらに含む。
【００８９】
本発明のいくつかの態様において、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素は、キシラナーゼおよびセルラーゼ、例えば、セロビオヒドロラーゼ、エンド−グルカナーゼおよびベータ−グルカナーゼからなる群から選択される。
【００９０】
本発明のいくつかの態様において、セルラーゼは、エンド−セルラーゼ、エキソ−セルラーゼ、セロビアーゼ、酸化セルラーゼ、セルロースホスホリラーゼから選択される。
【００９１】
本発明のいくつかの態様において、１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素は、アルファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼおよびベータ−アミラーゼからなる群から選択される。
【００９２】
本発明のいくつかの態様において、１つまたはそれ以上のトランスグリコシル化酵素は、酵素クラスＥＣ２．４．１．２４の酵素からなる群から選択される。
【００９３】
本発明のいくつかの態様において、該粒子ふすまの平均粒径は、３０００μｍ未満、例えば、１０００μｍ未満、例えば、５００μｍ未満である。
【００９４】
本発明のいくつかの態様において、穀物ふすまを産業的製粉工程から得、平均粒径５００μｍ未満、例えば、４００μｍ未満、例えば、２００μｍ未満を得るためにさらに製粉する。
【００９５】
本発明のいくつかの態様において、さらなる酵素活性を不活性化するために、可溶化された穀物ふすまをさらに処理する。
【００９６】
本発明のいくつかの態様において、乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、可溶化度は、２０％以上、例えば、２５％以上、例えば、３０％以上、例えば、３５％以上、例えば、４０％以上、例えば、５０％以上、例えば、４０％−６０％の範囲、例えば、５０％−６０％の範囲である。
【００９７】
本発明のいくつかの態様において、乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、工程ｂ）から得られる可溶性画分中のアラビノキシランオリゴ糖（ＡＸＯＳ）の含有量は、２０％を越える、例えば、２５％を越える、例えば、３０％を越える、例えば、３５％を越える、例えば、４０％を越える、例えば、４５％を越える、例えば、５０％を越える。
【００９８】
本発明のいくつかの態様において、穀物ふすま中の１％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の２％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の３％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の４％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の５％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の１０％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の１５−５０％以上のデンプンは、工程ｂ）から得られる可溶性画分中でイソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ）に変換される。
【００９９】
本発明のいくつかの態様において、乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、工程ｂ）から得られる可溶性画分中の修飾された脂質の含有量は、少なくとも約０．０５％、例えば、少なくとも約１．０％、例えば、０．０５−５％の範囲である。
【０１００】
本発明のいくつかの態様において、穀物ふすま由来の修飾された脂質の全量の少なくとも約２％、例えば、少なくとも約１０％、例えば、２−８０％の範囲が、工程ｂ）から得られる可溶性画分に存在する。
【０１０１】
本発明のいくつかの態様において、工程ａ）の前に、ｉ）穀物を分画して、内胚乳、ふすま、および胚芽を得、ｉｉ）内胚乳、ふすま、および胚芽を分離および分配して、それらを処理可能にし、ｉｉｉ）ふすまを製粉する工程をさらに含む。
【０１０２】
本発明のいくつかの態様において、穀物ふすまは、小麦、大麦、オート麦、ライ麦およびライコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される。
【０１０３】
本発明のいくつかの態様において、該方法は、得られた可溶化された穀物ふすまの乾燥の工程をさらに含む。
【０１０４】
本発明のいくつかの態様において、該方法は、得られた可溶化された穀物ふすまの噴霧乾燥の工程をさらに含む。
【０１０５】
本発明のいくつかの態様において、該方法は、得られた可溶化された穀物ふすまの凍結乾燥の工程をさらに含む。
【０１０６】
本発明は、さらに、本発明の得られた可溶化された穀物ふすまの使用に関する。
【０１０７】
本発明のいくつかの態様において、本発明の方法において得られる可溶化された穀物ふすまを、食品の生産における可溶性および不溶性穀物ふすま原料の混合物として直接加える。
【０１０８】
本発明の方法は、例えば、可溶性画分が可溶性および不溶性穀物ふすま原料の混合物から回収されるとき、可溶性穀物ふすま原料のみを有する単離された可溶化された画分を生産し得ると理解すべきである。
【０１０９】
いくつかの態様において、このような回収された可溶性穀物ふすま原料は、食品の生産において使用される。
【０１１０】
他の態様において、可溶性および不溶性原料の両方を含む可溶化された穀物ふすまは、さらなる分離または回収なしに、食品の生産において直接使用され得る。
【０１１１】
本発明のいくつかの態様において、食品は、パン、朝食用のシリアル、パスタ、ビスケット、クッキー、スナックおよびビールからなる群から選択される。
【０１１２】
本発明の可溶化された穀物ふすまは、食品として、またはそれらの製造において使用され得る。ここで、「食品」なる用語は、広い意味において使用され、ヒトのための食物ならびに動物のための食物（すなわち、えさ）を含む。いくつかの局面において、食物はヒト消費のためである。
【０１１３】
食物は、使用および／または適用様式および／または投与経路に依存して、溶液形態において、または固体としてであり得る。
【０１１４】
したがって、本発明の他の態様において、回収された可溶性穀物ふすま原料および／または可溶性および不溶性原料の両方を含む可溶化された穀物ふすまは、動物飼料において使用され得る。
【０１１５】
本発明の可溶化された穀物ふすまは、食物成分としても使用され得る。
【０１１６】
本明細書において使用される「食物成分」なる用語は、栄養補助食品および／または食物繊維補助食品として機能性食品または食料品に加えられるか、または加えることができる製剤を含む。本明細書において使用される食物成分なる用語は、また、粘度を加えることなく、ゲル化、キメ出し、安定化、懸濁、皮膜形成および構造化、みずみずしさの保持ならびに食感の改善を必要とする多種多様の産物において低レベルで使用することができる製剤を示す。
【０１１７】
食物成分は、使用および／または適用様式および／または投与経路に依存して、溶液形態において、または固体としてであり得る。
【０１１８】
本発明の可溶化された穀物ふすまは、食物補助食品であってもよく、またはそれに加えられてもよい。
本発明の可溶化された穀物ふすまは、機能性食品であってもよく、またはそれに加えられてもよい。
【０１１９】
本明細書において使用される「機能性食品」なる用語は、栄養効果および／または味の満足感を提供することができるだけでなく、消費者にさらなる有益な効果を送達することも可能である食物を意味する。
【０１２０】
したがって、機能性食品は、純粋な栄養効果以外の特定の機能、例えば、医薬的または生理学的利点を食物に与える、食物に包含されている要素または成分（例えば、本明細書に記載されているもの）を有する普通の食物である。
【０１２１】
機能性食品の法的な定義はないが、分野における多数の関係者が、特定の健康への影響を有するとして市販されている食物と一致する。
【０１２２】
いくつかの機能性食品は栄養補助食品である。本明細書において「栄養補助食品」なる用語は、栄養効果および／または味の満足感を提供することができるだけでなく、消費者に治療（または他の有益な）効果を送達することも可能である食物を意味する。栄養補助食品は、食物と医薬の従来の境界線を交差する。
【０１２３】
調査により、消費者が心臓疾患に関する機能性食品に最も重点を置いていることが示唆されている。癌の予防は、栄養摂取の別の局面であり、多くの消費者に関心をもたせているが、興味深いことに、わずかにコントロールできると消費者が感じている領域である。事実、世界保健機関によると、少なくとも３５％の癌の原因は食事関連である。骨粗鬆症、消化管の健康および肥満効果に関連するさらなる要求は、また、機能性食品購入を刺激し、市場開発を動かす可能性のある重要な因子である。
【０１２４】
本発明の組成物は、食品の製造物、例えば、１つ以上のジャム、マーマレード、ゼリー、乳製品（例えば、ミルクまたはチーズ）、肉製品、鳥肉製品、魚製品およびベーカリー産物において使用することができる。
【０１２５】
例として、本発明の組成物は、清涼飲料、乳漿タンパク質を含む果汁または飲料、ヘルスティー(health tea)、ココア飲料、ミルク飲料および乳酸菌飲料、ヨーグルトおよび飲料ヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、水氷およびデザート、菓子、ビスケットケーキおよびケーキ粉末食品、スナック食品、朝食用のシリアル、即席めんおよびカップめん、即席スープおよびカップスープ、バランスのとれた食物および飲料、甘味剤、質感が改善されたスナック食品の棒状物、繊維棒状物、焼きに安定なフルーツ充填物、保護グレーズ(care glaze)、チョコレートベーカリー充填物、チーズケーキ香味付け充填物、フルーツ香味付けケーキ充填物、ケーキおよびドーナツの砂糖衣、熱安定なベーカリー充填物、即席ベーカリー充填物クリーム、クッキー用の充填物、すぐに食べられるベーカリー充填物、低カロリー充填物、成人用栄養飲料、酸性大豆／汁飲料、無菌／レトルトチョコレート飲料、棒状物の粉末食品、飲料粉末、カルシウム強化大豆／プレーン(plaim)およびチョコレートミルク、カルシウム強化コーヒー飲料に対する成分として使用することができる。
【０１２６】
本発明の可溶化された穀物ふすまは、さらに、食品、例えば、アメリカンチーズソース、粉＆細切りチーズのための凝固阻止剤、チップディップ、クリームチーズ、乾燥混合ホイップティップ(whip topping)脂肪非含有サワークリーム、凍結／解凍された乳製品ホイッピング・クリーム、凍結／解凍された安定なホイップティップ(whipped tipping)、低脂肪＆低カロリーのナテュラルチェダー・チーズ、低脂肪スイススタイル(Swiss style)ヨーグルト、気泡含有(aerated)凍結デザート、およびノベルティーバー(novelty bars)、ハードパックアイスクリーム、ラベルフレンドリー(label friendly)、経済的に改善された＆インダルジェンス(indulgence)のハードパックアイスクリーム、低脂肪アイスクリーム：ソフトクリーム、バーベキューソース、チーズディップソース、カッテージ・チーズドレッシング、乾燥混合物アルフレド(Alfredo)ソース、ミックスチーズソース、乾燥混合物トマトソースおよび他のものの中の成分として使用することができる。
【０１２７】
ある局面において、食料品は飲料である。
ある局面において、食料品はベーカリー産物、例えば、パン、デニッシュ・ペストリー、ビスケットまたはクッキーである。
【０１２８】
いくつかの態様において、ふすまの可溶化度は、実施例１に記載されている「可溶性画分アッセイにおける乾物含有量（％）」として、使用されるふすまに対する可溶性画分中の乾物含有量（％）として測定される。
【０１２９】
いくつかの態様において、「可溶性画分アッセイにおける乾物含有量（％）」として測定されるとき、ふすまの可溶化度は、２０％以上、例えば、２５％以上、例えば、３０％以上、例えば、３５％以上、例えば、３５％以上、例えば、４０％以上、例えば、５０％以上、例えば、４０％−６０％の範囲、例えば、５０％−６０％の範囲である。
【実施例】
【０１３０】
実施例
実施例１
市販の小麦ふすまの実験室規模の可溶化：
ふすま：
商業的製粉から得られる小麦ふすま画分を使用した。該画分は、細粒ふすま画分および粗粒ふすま画分からなった。使用の前に、粗粒ふすま画分を製粉して、より小さい粒径を得、ふすまの比表面積を増加させ、最終的にふすまの酵素的可溶化の効率を増加させた。製粉をＲｅｔｃｈ製粉機で行い、５００μｍの平均粒径を得た。しかしながら、可溶化度に関して、より小さい粒径が好ましいであろうことに注意すべきである。
【０１３１】
酵素：
表１．小麦ふすま可溶化のために使用される酵素
【表１】
【０１３２】
プロトコール：
表２．ふすま可溶化のために使用されるプロトコール
【表２】
【０１３３】
分析：
可溶性ふすま画分（上清）を以下に関して分析する：
可溶性画分アッセイにおける乾物含有量（％）：
得られる可溶性ふすまの定量的サンプルを凍結乾燥させる。凍結乾燥後、該サンプルサイズを再び定量し、乾物の量を計算する。ブランクとして、該バッファーは、この分析に含まれる。
【０１３４】
試験：
表３．小麦ふすまの異なる処理をもたらすように行われた試験
【表３】
【０１３５】
結果：
ふすま可溶化度：
ふすま画分中の細胞壁成分のよく知られている保水最大容量によって、抽出バッファーの有効な回収率はこれらの実験において得られなかった。しかしながら、適当な処理が展開されたとき得られた。図１において、抽出バッファーの実際の回収率を示す。抽出回収率は、２５から５５％で変化する。
【０１３６】
可溶化の効率を、得られた可溶性画分中の乾物含有量に基づいて測定した。図２から分かるように、湿式プロセスのみが有意な量のふすまを可溶化する。しかしながら、キシラナーゼ、セルラーゼ／グルカナーゼおよびデンプン分解複合体の組み合わせた効果は、有意に可溶化を増加させる。実際にこの実験において、非デンプン加水分解酵素（キシラナーゼ、セルラーゼおよびグルカナーゼ）とデンプン加水分解酵素（アミラーゼ、プルラナーゼ、ベータ−アミラーゼおよびトランスグルコシダーゼ）との組合せの相加的効果があることに注意すべきである。該相加的効果は、単一の酵素複合体がその基質に接触するには立体障害があるという事実によって得られるのかもしれない。この立体障害または基質への接触は、非デンプンおよびデンプン修飾酵素の両方の組合せを使用するとき、最適化される。
【０１３７】
得られた種々の可溶性画分中の乾物含有量および回収された抽出バッファーの量に基づいて、可溶化度を決定することが可能である。ふすま画分の可溶化度は、１０から２５％の可溶化で変化する。該データは図３において説明される。
【０１３８】
しかしながら、図３における可溶化度は、正確な可溶化度ではない。正確な可溶化度は、有意にさらに高い。これは、ふすま処理に応じた抽出バッファーの偏りおよび低い回収率のためである。しかしながら、実際の抽出度は、得られた抽出バッファーを実際に使用された抽出バッファー容量で補正することにより容易に得ることができる。この補正が許容される。回収された可溶性物質の濃度は、回収されなかった可溶性物質の濃度と同じであると考えられるためである。さらに、ここで得られる可溶性物質の回収率は、このプロトコールにおいて使用されるプロセスにより与えられる。異なる分離プロセスを使用して、または残留ふすまの繰り返し抽出を使用して、より高い回収率が容易に得ることができた。ふすま可溶化に関するデータを補正したとき、図４における結果が得られる。
【０１３９】
実施例２
市販の小麦ふすまの実験室規模の可溶化：
ふすま：
より大規模な実験を、５００ｇの小麦ふすま、３３００ｍｌの５０ｍＭのＮａＰｉ ｐＨ５．０および表４に記載されている酵素を適用することにより準備した。反応は、表２に記載されているプロトコールにしたがって実施した。
【０１４０】
酵素：
表４：大規模可溶化実験に適用された酵素
【表４】
【０１４１】
分析：
ＡＸ含有量：
可溶性物質のサンプル（上清）を可溶化されたＡＸについて分析した。分析はRouau and Surget (1994)にしたがって行った。
ＡＸ ｍｗ／ＡＸＯＳ分析：
ＡＸの分子量は、ＬＣ＿ＭＳにより測定した。
デンプン含有量：
ふすまおよび可溶化ふすま中のデンプン含有量を、熱安定なアルファ−アミラーゼを摂氏９５℃で９０分で用い、次にプラナーゼ(pullanase)およびグルコアミラーゼを摂氏５０℃で４５時間で加えるデンプンの全加水分解後に、グルコース測定により分析した。
ＩＭＯ含有量：
得られた可溶性画分中のＩＭＯ濃度をＨＰＬＣ−陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して測定した。
【０１４２】
結果：
ふすま可溶化度：
この実験において使用された抽出バッファーの正確な容量を補正したとき、以前の実験において得られた可溶化度に匹敵する５４％の可溶化度が得られた。
ＡＸ含有量：
ふすま画分中のＡＸの量は、１９ｍｇ／ｍｌ上清と決定された。抽出体積を考慮すると、可溶化されたふすま中の可溶性ＡＸの全量は６２，７ｇである。小麦ふすま中のＡＸ含有量の文献データにしたがって、全ＡＸの約５３％の可溶化を得ている。データは表５に要約されている。
表５． 試験に適用されたふすま、ｇ。使用された抽出バッファーおよび容量、ｍｌ。可溶化されたふすま中のＡＸ濃度、ｍｇ／ｍｌ。抽出体積に対して補正されたときの全ＡＸ、ｇ。ふすまに対する抽出されたＡＸ、％。小麦ふすま中のＡＸ含有量に関する文献データ、および最後に、ふすまの抽出度、％。
【表５】
【０１４３】
デンプン含有量：
ふすま出発物質中のデンプンの量は、全グルコース含有量の酵素分析にしたがって、１６．３％と測定された。可溶化された原料において回収され見出されるふすま由来のデンプンの量は、可溶化された原料の全グルコース測定により分析されたとき、７６％と決定された。
【０１４４】
ＩＭＯ含有量：
上清を高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してイソマルトオリゴ糖（イソマルトース、イソマルトトリオースおよびパノース）の含有量について分析した（表５）。可溶化プロセスにおいて得られたＩＭＯの濃度は、ふすま原料のデンプン含有量に大きく依存する。ふすま出発物質中のデンプンのＩＭＯへの変換度を、ＩＭＯ生産の尺度として使用する。この実施例において、ＩＭＯ（イソマルトース、イソマルトトリオースおよびパノース）の全濃度は、可溶化された原料において２６９０ｐｐｍと測定される（表６）。バッファー容量を考慮したとき、産生されたＩＭＯの量は９．０ｇである。したがって、ＩＭＯへの全変換は、ふすま中のデンプンの最初の量の１１．０％であった。
表６：イソマルトオリゴ糖の濃度
【表６】
ＭＳによるＡＸＯＳ分析：
ＡＸＯＳ分析からの結果は、ＤＰ６のピーク濃度でＤＰ３からＤＰ１１の範囲におけるＡＸＯＳのＤＰ分布を示した。
【０１４５】
実施例３
可溶化されたふすまを使用するベーキング実験
穀粉：
市販の非最適化デニッシュ改良穀粉(Danish reform flour)（２００７−００１１３）をベーキング実験のために使用する。可溶化されたふすまに対する対照として、再構成された穀粉を可溶化実験（実施例１および２参照）のために使用した穀粉およびふすまから作製する。可溶化されたふすま画分中の乾物および穀粉に加えられた水／可溶性ふすまの量に基づいて、穀粉で置き換えられたふすまの量を計算することができる（表８参照）。
可溶化されたふすま：
実施例２において得られた可溶化されたふすまを、ベーキング試験のために使用した。
【０１４６】
ベーキングレシピ：
穀粉、可溶化されたふすまを加えられた穀粉および可溶化されていないふすまを加えられた再構成された穀粉のベーキング性能を、以下のレシピ（表７）を使用して小規模ベーキング試験（５０グラムの混合物(mixer)および１０グラムのローフ(Loaves)）において評価した。
表７．穀粉、可溶化されたふすまを加えられた穀粉および可溶化されていないふすまを加えられた再構成された穀粉のベーキング性能を評価するために使用されるレシピ。塩／糖は、塩および糖の１：１（ｗ／ｗ）混合物である。水は、Ｆａｒｉｎｏｇｒａｐｈ分析により測定される水分吸収である。
【表７】
【０１４７】
ドー(Dough)作りおよびベーキング
穀粉（または穀粉およびふすまの混合物）および乾燥成分を１分間混合し、その後、水を加え、混合をさらに５分間続けた。
【０１４８】
混合後、それぞれ１０グラムの穀粉を含む４つのドーの塊を計量した。手動成形機を使用して、これらをパンに成形した。ローフ(Loaves)を焼き型に入れ、密閉した容器（ふたを有する）中に置き、テーブルに１０分間放置した。その後、パンを３４℃で８５％のＲＨで４５分間発酵させ、最後にＢａｇｏオーブン（Bago-line, Faaborg, Denmark）で２３０℃で５分間焼く。ドーの測定(scaling)の間に、粘り気を１（非常に粘り気）から５（乾燥）の尺度において主観的に評価した。
パンを、評価（重量、体積測定、ならびに身、皮および官能評価）の前に２０分間冷やした。
【０１４９】
ベーキング試験
以下のベーキング試験を行った（表８）。
表８．ベーキング試験実験構成。ＩＤは、可溶化されたふすまを加えられたか、または不溶性ふすまで再構成された穀粉組成を示す。穀粉（ｇ）は、パンにおける穀粉の量である。ふすま（ｇ）は、再構成のために使用されたふすまの量である。可溶化されたふすま（ｍｌ）は、水の代わりに穀粉に加えられた可溶化されたふすまの量である。水（ｍｌ）は、穀粉に加えられた水の量である。「ふすま」（％）は、穀粉重量に基づく可溶化されたふすま、または不溶性ふすまのいずれかの量である。
【表８】
【０１５０】
官能評価：
パンの冷却２０分後の官能評価をした。とりわけ、従来のふすま画分由来の苦味を評価した。
劣化評価：
硬度は、研究室テーブル上にパンローフを２４時間放置した後に主観的に評価した。
【０１５１】
結果：
表９および図５において分かるように、可溶性繊維の添加は、パンの比体積に影響を及ぼさない。
表９．ベーキング試験結果。ＩＤは、可溶化されたふすまを加えられたか、または不溶性ふすまで再構成された穀粉組成を示す。穀粉（ｇ）は、パンにおける穀粉の量である。ふすま（ｇ）は、再構成のために使用されたふすまの量である。比体積（ｍｇ／ｍｌ）は、パンの真比体積である。相対体積 対 ブランク（％）は、パン 対 パン１（ブランク）の相対体積である。
【表９】
【０１５２】
しかしながら、さらに驚くべきことに、繊維の添加されたものと比較して、可溶性繊維のパンへの添加は、得られるパンの色に影響を及ぼさない。図６参照。
色に関する結果は、パンの身を評価するとき、さらに明白である（図７参照）。
【０１５３】
官能評価：
試験パネルがパンを評価した（ｎ＝３）。以下の評価は、官能特性における有意な違いが、対照パンと可溶性ふすま画分を加えられたパンの間で測定されなかったことを示した。一方、ふすまを加えられたパンは、ふすま由来の独特の苦味を有した。
【０１５４】
表１０．パンの官能評価。ＩＤは、可溶化されたふすまを加えられたか、または不溶性ふすまで再構成された穀粉組成を示す。苦味を、参照として穀粉および不溶性ふすまを加えられたパンで評価する。対照との違いは、パン１と比較した全体的な外観を示す。皮の色および身の色を主観的に評価する（図６および７参照）。
【表１０】
【０１５５】
表１１．パンの硬度評価。ＩＤは、可溶化されたふすまを加えられたか、または不溶性ふすまで再構成された穀粉組成を示す。硬度は、研究室のベンチ上に２４時間放置された切断されたパンで評価する。尺度：１＝柔らかい；５＝堅い。
【表１１】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、穀物ふすまの可溶性画分を含む組成物を調製するための穀物ふすまの可溶化および食品、例えば、パンの製造のための可溶化された穀物ふすまを含むこれらの組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
穀物は、アラビノキシランを５−１０％含み、デンプン、セルロースおよびβ−グルカンと共に、最も豊富な穀物炭水化物を構成する。アラビノキシランは、Ｏ−２および／もしくはＯ−３ α−Ｌ−アラビノ−フラノシル単位または４−Ｏ−メチルグルクロン酸残基が連結しているβ−１，４−連結Ｄ−キシロピラノシル単位の主鎖を含み、該キシロピラノシル単位は酢酸でエステル化され得る。さらに、Ｌ−アラビノフラノシル側鎖残基は、フェルラ酸およびｐ−クマル酸でエステル化され得る。典型的なアラビノキシランにおいて、置換されていない、一置換されている、および二置換されているキシロース残基が生じる。
【０００３】
穀物におけるアラビノキシランは、水で抽出可能または水で抽出不可能のいずれかである。水で抽出不可能なアラビノキシランは、アルカリ性条件下で、または酵素、例えば、エンドキシラナーゼを使用することにより、部分的に可溶化され得る。
【０００４】
アラビノキシラン−オリゴ糖（ＡＸＯＳ）は、アラビノキシラン由来のオリゴ糖であり、前生物的特性を発揮することが示されている。前生物学的物質は、上部消化管の酵素により消化することができない化合物、通常、非グルコシドオリゴ糖であるが、大腸におけるいくつかの型の腸内細菌により選択的に発酵される。食事における前生物学的物質の存在は、一般的に乳酸菌およびビフィズス菌種の相対的な増加により特徴付けられる、腸内細菌集団の組成のシフトを引き起こす。腸の微生物叢のこのシフトは、健康全般の改善、消化管の感染症の減少、腸の短鎖脂肪酸のレベルの増大、ミネラルのより良い吸収、および大腸癌発症の抑制と関連する。
【０００５】
Katapodis Pら, European journal of Nutrition, 2003 Jan; 42(1):55-60は、小麦粉のアラビノキシラン由来の抗酸化活性を有するフェルロイル化オリゴ糖の酵素生産に関する。
【０００６】
Yuanら, Food Chemistry, Vol 95, Issue 3, 2006, Pages 484-492は、枯草菌(Bacillus subtilis)由来のキシラナーゼによる、小麦ふすまの不溶性食物繊維由来のフェルロイルオリゴ糖の生産に関する。
【０００７】
最近、ニワトリにおいて、可溶化されたふすまが不溶性ふすまよりもより良い栄養学的効果を有することが、例えば、Courtinら Journal of the science of food and agriculture. 88. p 2517-2522 (2008)およびCloetensら, Journal of the American College of Nutrition, Vol. 27, No. 4, 512-518 (2008)により示されている。
【０００８】
Swennenら. Journal of the science of food and agriculture, 2006, vol. 86, 1722-1731は、小麦ふすまのアラビノキシロオリゴ糖の大規模生産および特性化に関する。
【０００９】
ＷＯ２００８００００５０は、全粒の穀物の発酵の副産物として可溶性アラビノキシランを製造するための方法に関する。
【００１０】
ＷＯ２００８０８７１６７は、ベークド産物(baked product)中でそのままで(in situ)水溶性アラビノキシランオリゴ糖のレベルを増加させるための方法に関する。
【００１１】
Rouau, X and Surget, A., Carbohydrate polymers 24: 123 - 132 (1994)は、小麦粉中の全ての、および水で抽出可能なペントサンの測定のための迅速な半自動方法を記載している。
【００１２】
当該分野において、家畜飼料のような低価格の用途(application)に回される穀物が少なくなるような、穀物のより良い利用が求められている。さらに、製品の外観／構造、色および味において有意な影響を及ぼすことなく、穀物由来のふすま画分を既存の穀物製品に利用すること、および既存の製品の健康学的および栄養学的効果を増加させることが、長年にわたり切実に求められている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的
本発明の目的は、家畜飼料などの低価格の用途に回される穀物が少なくなる、穀物のより良い利用方法を提供するために、穀物ふすまの可溶化の増加のための方法を提供することである。さらに本発明の目的は、製品の外観／構造、色および味において有意な影響を及ぼすことなく、穀物由来のふすま画分を既存の穀物製品に利用すること、および既存の製品の健康学的および栄養学的効果を増加させることである。
【００１４】
発明の概要
本発明者らは、穀物ふすま中に相当量のデンプンを維持していることにより、細胞壁修飾酵素およびデンプン修飾酵素で処理すると、有意に高い収率のアラビノキシランオリゴ糖ならびに全可溶性物質が穀物デンプンの可溶化のプロセスにおいて得ることができることを見出した。
【００１５】
広い局面において、本発明は、可溶化されている穀物ふすまの少なくとも一部を含む組成物を生産するための穀物ふすまの可溶化に関する。本発明の方法により得られる組成物の別の一部が、ふすまの完全または部分的不溶性画分であり得ると理解すべきである。
【００１６】
よって、第１の局面において、本発明は、デンプンを含む穀物ふすまの可溶化のための方法であって、
ａ）相当量のデンプンを含む粒子穀物ふすまの液体懸濁液を調製し、
ｂ）液体懸濁液中に相当量のデンプンを含む該粒子穀物ふすまを、いずれの成分も除去することなく、任意の順番で連続して、または同時に、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素、１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素で処理する
工程を含む方法に関する。
【００１７】
第２の局面において、本発明は、本発明の方法により生産される可溶化された穀物ふすまに関する。
さらなる局面において、本発明は、食品の生産のための本発明の方法により生産される可溶化された穀物ふすまの使用に関する。
【００１８】
さらに他の局面において、本発明は、食品の生産における本発明の方法により生産される可溶化された穀物ふすまの使用により得られる食品に関する。
またさらなる局面において、本発明は、
ａ）１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素；１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素を含む酵素の組合せ、
ｂ）本発明の方法における使用のための指示書、および
ｃ）所望により食品のための他の成分
を含むパーツを含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ふすま処理に対する抽出バッファーの回収率。縦列は、表３の試験番号１−６に対する回収された抽出体積を示す。
【図２】ふすま処理に対する得られた可溶性画分中の乾物。縦列は、表３の試験番号１−６に対する％における乾物含有量を示す。
【図３】ふすま処理に対するふすまの可溶化度。縦列は、表３の試験番号１−６に対するふすまの可溶化度を示す。
【図４】ふすま処理に対する補正された（抽出体積回収率に対して）ふすまの可溶化度。縦列は、表３の試験番号１−６に対する％における（抽出体積回収率に対して補正された）ふすまの可溶化度を示す。
【図５】ベーキング試験結果。パン 対 ブランクの相対体積（％）。縦列は、表９のベーキング試験１−４に対する％におけるパン体積を示す。試験１（ブランクを１００％とする）。
【図６】（左から）対照穀粉、２，５％の可溶性繊維、５％の可溶性繊維および５％の不溶性繊維でのベーキングから得られるパン。
【図７】（左から）対照穀粉、２，５％の可溶性繊維、５％の可溶性繊維および５％の不溶性繊維でのベーキングから得られるパン。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、穀物の用途において利用され得る産物を生じる穀物の二次生産物(sidestream)（ふすま）の可溶化のプロセス（および得られる産物）に関する。本発明は、得られる産物の官能(sensoric)およびテクスチャー特性に悪影響を与えることなく穀物用途において穀物の二次生産物の利用を可能にし、原料（穀物）の利用性を増加させる。本発明のプロセスにおいて、前生物学的オリゴ糖、例えば、ベータ−グルカン、およびＡＸＯＳ、トコフェノール、およびトコトリエノール(tocotriol)（後ろの２つは抗酸化作用を有する）が産生するであろう。さらに、モノ−およびジ−グリセリド、ｌｙｓｏ−ＰＣおよびモノ／ジ−ガラクトシル−モノ−グリセリドが産生すると考えられ、これら全てが乳化剤効果を有し、最終穀物製品の外観、構造および安定性に対してさらなるプラス効果を有するであろう。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明のプロセスにより得られる可溶化された産物は、前生物学的物質、抗酸化剤および乳化剤から選択される化合物を含む。
いくつかの態様において、本発明のプロセスにより得られる可溶化された産物は、アラビノキシランオリゴ糖（ＡＸＯＳ）を含む。
【００２２】
いくつかの態様において、本発明のプロセスにより得られる可溶化された産物は、イソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ）を含む。
いくつかの態様において、本発明の方法において使用される穀物ふすまは、穀物副生産物(bi-stream)由来、例えば、従来の製粉由来の小麦ふすまである。
【００２３】
従来の小麦製粉は、６５−８５％の抽出程度（穀粒(Kernel)重量に基づく穀粉収率％）まで行われ、細胞壁多糖類、例えば、アラビノキシラン、ベータ−グルカン、セルロースからなる小麦ふすまが得られ、さらに、タンパク質、脂質、リグニンおよびデンプンが該ふすま中に存在する。ａ）例えば、キシラナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、セルラーゼ由来の、１つまたはそれ以上の細胞壁加水分解活性、およびｂ）１つまたはそれ以上のデンプン加水分解酵素、例えば、アルファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、ベータ−アミラーゼおよびトランスグリコシル化酵素、例えば、トランス−グリコシダーゼの組合せでの穀物ふすまの処理は、他の細胞壁のオリゴ糖／多糖類と共にＡＸＯＳを産生し、いくつかの態様において、ＩＭＯも産生する。該技術は、前生物学的および低炭水化物食物繊維産物を生じる製粉の二次生産物に適用され得、ベーキング、朝食用のシリアル、ケーキ、パスタなどのような穀物の用途に適用され得る。
【００２４】
本発明の１つの重要な特徴は、最終製品のより許容可能な官能性外観および健康への影響であり得る。穀物利用品における本発明のふすま画分の使用は、４つの異なるパラメーター：１）製品の構造／外観、２）製品の色、３）製品の味、および／または４）健康面に主に影響する。
【００２５】
１）穀物製品へのふすま画分の添加は、最終製品の構造に影響する。製品が酵母で発酵させるパンであるとき、ふすま画分は、グルテン強度に対して不利益な作用を有し、より小さい体積でより緻密な製品を与える。一般的に、製品へのふすま添加は、製品の構造および外観に影響を及ぼす。これは、ふすま画分または繊維画分が固体形態の代わりに可溶性形態において製品に加えられたとき、排除されるか、または減少され得る。可溶化されたふすまは、例えば、酵母で発酵させるパンにおけるグルテン発達および強度に対し同じ作用を有さない。
【００２６】
２）穀物製品におけるふすまの使用は、製品の色に対して有意な影響を及ぼし、製品をより暗くする。この理由は、ふすま画分における色成分（主に細胞壁におけるフェノール性化合物）であり、製品全体の色に影響を及ぼす。ほとんどの場合、内胚乳（穀粉）のみから生産されるより白色の製品と比較して、不利益な、あまり魅力的でない製品としての特徴が見られる。本発明の可溶化されたふすまを使用すると、色は減少されるか、またはさらに排除され得る。この理由は、多くのフェノール性化合物がしばしば、酵素的に接触が非常に困難である細胞壁の領域に位置することであり、したがって、それらが可溶化され、可溶化されたふすま画分を使用して生産される最終製品の暗い色に寄与しなくなる。
【００２７】
本発明の方法は、色に寄与する化合物を完全に除去するために、これらの産物の特異的な酵素加水分解を使用して、または分離および／もしくは精製技術の適用により、最適化され得る。
【００２８】
３）ふすま画分を適用するとき、より暗い製品に寄与する同じ成分は、最終製品の官能特性も変化させるであろう。内胚乳から生産される製品と比較して、これらの化合物に関する特徴はより苦い味である。この味は、ライ麦パンが伝統的に、消費されているスカンジナビアおよびヨーロッパ北部においてよく知られており、好まれる。しかしながら、世界の他の多くにおいて、該味は好まれず、製品の欠点として見られる。
【００２９】
４）多くのヒバマタ属は、食事を介して消化管の健康に対する影響に向けられてきた。食事、とりわけ食物繊維（可溶性および不溶性）の消費が、腸管内菌叢の組成、それによる個体の健康全般に非常に大きな影響を有することが良く認識されている。可溶性ふすま、またはより正確には、可溶性低分子アラビノキシランオリゴ糖（ＡＸＯＳ）の適用は、腸管内菌叢を劇的に変化させることが示されている。ＡＸＯＳおよびＩＭＯの産生を組み合わせることにより、繊維画分の使用は、製品により多くのデンプンを加えることなく、代謝エネルギーを高めるが、残留デンプンおよびグルコースを別の前生物学的繊維、ＩＭＯに変換する。
【００３０】
産生される画分は、朝食用のシリアルにおいて利用でき、穀物（小麦）の利用率を増加させ、使用される増量剤（糖）を減少させ、カロリー負荷を減少させ、前生物学的物質を食事に導入することができる。
【００３１】
要約すると、本発明の方法は、飼料、例えば、家畜飼料のような低価格の利用品に回される穀物が少なくなるような穀物のより良い利用を与える。さらに、本明細書に記載されている方法は、製品の外観／構造、色および味に対し有意な影響を及ぼすことなく、穀物由来のふすま画分を既存の穀物製品に利用可能にする。最後に、本明細書に記載されている方法は、既存の製品の健康学的および栄養学的効果を増加させることを可能にする。
【００３２】
定義
本明細書において使用される「穀物」なる用語は、イネ科(Poaceae)の植物由来の実を示し、果皮、種皮(seed coat)（あるいは種皮(testa)とも称される）および／または胚芽のさらなる存在を有するか、または有さない、例えば、アリューロンを含む少なくともふすまおよびデンプン内胚乳を含む種子を示す。該用語は、小麦、大麦、オート麦、スペルト小麦、ライ麦、モロコシ、メイズおよびイネのような種を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書において使用される「ふすま」なる用語は、対応する完全な種子と比較して、アリューロン、果皮および種皮から選択される組織のいずれかまたは全てにおいて豊富である穀物由来の製粉画分を示す。
【００３４】
本明細書において使用される「可溶化」なる用語は、本発明の方法における穀物ふすまの可溶化を示し、あらゆる程度の可溶化を含むことを意図する。したがって、「可溶化」は、１００％の可溶性物質を達成するようにであってよく、また、１００％未満、例えば、７０％未満、例えば、４０％−６０％の範囲、または、例えば、２０％−４０％の範囲の可溶化度を達成するようにであってよい。いくつかの態様において、可溶化度は、乾物 対 乾物ふすまで決定される。
【００３５】
本明細書において使用される「製粉画分」なる用語は、例えば、限定はしないが、ふるい(sieving)、スクリーニング、ふるい分け(sifting)、吹き込み(blowing)、吸引、遠心式のふるい分け(centrifugal sifting)、風によるふるい分け(windsifting)、静電分離または電界分離による分別を含むか、または含まない、例えば、限定はしないが、切断、圧延、粉砕、破損(breakage)または製粉による粒子サイズの機械的減少によって生じる画分の全てまたは一部を示す。
【００３６】
本発明の文脈において「相当量のデンプン」は、穀物の従来の機械加工後、例えば、穀物の商業的な製粉後に通常存在する残留デンプンの量をほぼ含む穀物ふすまを示す。いくつかの態様において、穀物に通常存在するデンプンの少なくとも約１％、例えば、少なくとも約３％、例えば、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約４０％、例えば、少なくとも約５０％が、まだ、本発明で使用される穀物ふすま画分にある。好ましくは、穀物ふすまは、デンプン加水分解酵素で前処理されていないか、または他の方法においてふすまからデンプンを除去するために酵素的に処理されていない。
【００３７】
本発明の方法は、残留デンプンを含む粒子穀物ふすまの実質的に単離された液体懸濁液の調製、および該穀物ふすまの酵素処理に関すると理解すべきである。したがって、該酵素は残留デンプンを有する穀物ふすまに対して酵素作用を有するはずであると理解すべきである。本発明は、添加的な追加された穀粉調製物での組成物の酵素処理、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕでの酵素的パン製造適用を包含することを意図しない。
【００３８】
いくつかの態様において、粒子穀物ふすまの液体懸濁液の約５０％未満、例えば、約４０％未満、例えば、約３０％未満、例えば、約２０％未満、例えば、約１０％未満、例えば、約６％未満、例えば、約３％未満、例えば、約１％未満（ｗ／ｗ）は、デンプンまたはデンプンを含む成分、例えば、穀粉である。
【００３９】
本発明の文脈において「細胞壁修飾酵素」は、植物細胞壁の複合マトリクス多糖類を加水分解または修飾することができるあらゆる酵素、例えば、本明細書における「細胞壁可溶化アッセイ」において活性を有するあらゆる酵素を示す。「細胞壁修飾酵素」の定義に包含されるものは、セルラーゼ、例えば、セロビオヒドロラーゼＩおよびセロビオヒドロラーゼＩＩ、エンド−グルカナーゼおよびベータ−グルコシダーゼ、ならびにヘミセルロース分解酵素、例えば、キシラナーゼである。
【００４０】
本明細書において使用される「セルラーゼ」または「セルロース分解酵素」なる用語は、セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、例えば、セロビオヒドロラーゼＩおよびセロビオヒドロラーゼＩＩ、ならびにエンド−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）およびベータ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）を含むと理解される。
【００４１】
セルラーゼの定義に包含されるものは、ランダムにセルロース鎖を切断するエンド−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、セルロース鎖末端からセロビオシル単位を開裂するセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）およびセロビオースおよび可溶性セロデキストリンをグルコースに変換するベータ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）である。セルロースの生物分解に関与する酵素のこれら３つのカテゴリー中、セロビオヒドロラーゼは、天然結晶セルロースの分解のための重要な酵素である。「セロビオヒドロラーゼＩ」なる用語は、鎖の非還元末端からのセロビオースの遊離により、セルロースおよびセロテトラオースにおける１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素クラスＥＣ３．２．１．９１において定義される、セルロース１，４−ベータ−セロビオシダーゼ（エキソグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼまたは１，４−ベータ−セロビオヒドロラーゼとしも称される）活性として本明細書において定義される。「セロビオヒドロラーゼＩｌ活性」なる用語の定義は、セロビオヒドロラーゼＩｌが鎖の還元末端から攻撃することを除いて、同一である。
【００４２】
セルラーゼは、酵素のセルロース含有繊維への結合を増強し、酵素の触媒活性部分の効力を増加させる炭水化物−結合モジュール（ＣＢＭ）を含み得る。ＣＢＭは、炭水化物−結合活性を有する目立たない折り畳みを有する炭水化物−活性酵素内の隣接するアミノ酸配列として定義される。ＣＢＭのさらなる情報のために、ＣＡＺｙインターネット・サーバー（上記）またはTommeら.(1995) in Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Saddler and Penner, eds.), Cellulose- binding domains: classification and properties, pp. 142-163, American Chemical Society, Washington参照。好ましい態様において、セルラーゼまたはセルロース分解酵素は、米国出願第６０／９４１，２５１号（出典明示により本明細書に包含させる）に定義されているセルロース分解調製物であり得る。好ましい態様において、セルロース分解調製物は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１Ａ）、好ましくはＷＯ２００５／０７４６５６に記載されているものを含む。細胞壁修飾酵素は、さらに、ベータ−グルコシダーゼ、例えば、トリコデルマ、アスペルギルスまたはペニシリウム属の株由来のベータ−グルコシダーゼ、例えば、米国出願第６０／８３２，５１１号（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）に記載されているベータ−グルコシダーゼ活性を有する融合タンパク質であり得る。いくつかの態様において、細胞壁修飾酵素は、ＣＢＨ ＩＩ、例えば、チエラビア・テレストリス(Thielavia terrestris)セロビオヒドロラーゼＩｌ（ＣＥＬ６Ａ）である。いくつかの態様において、細胞壁修飾酵素は、セルラーゼ酵素、例えば、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)由来のものである。
【００４３】
いくつかの態様において、セルロース分解活性は、真菌供給源、例えば、トリコデルマ属の株、例えば、トリコデルマ・リーゼイの株、またはフミコーラ属の株、例えば、フミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)の株由来であり得る。
【００４４】
いくつかの態様において、細胞壁修飾酵素は、ＷＯ２００５／０７４６５６に記載されているセルロース分解増強活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１Ａ）、セロビオヒドロラーゼ、例えば、チエラビア・テレストリス セロビオヒドロラーゼＩｌ（ＣＥＬ６Ａ）、ベータ−グルコシダーゼ（例えば、米国出願第６０／８３２，５１１号に記載されている融合タンパク質）および、例えば、トリコデルマ・リーゼイ由来のセルロース分解酵素である。
【００４５】
いくつかの態様において、細胞壁修飾酵素は、ＷＯ２００５／０７４６５６に記載されているセルロース分解増強活性を有するポリペプチド（ＧＨ６１Ａ）、ベータ−グルコシダーゼ（例えば、米国出願第６０／８３２，５１１号に記載されている融合タンパク質）および、例えば、トリコデルマ・リーゼイ由来のセルロース分解酵素である。いくつかの態様において、細胞壁修飾酵素は、市販されている産物、例えば、Genencor, A Danisco Division, USから利用できるＧＣ２２０またはNovozymes A/S, Denmarkから利用できるＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（登録商標） １．５ＬもしくはＣＥＬＬＵＺＹＭＥTMである。
【００４６】
エンド−グルカナーゼ（ＥＣＮｏ．３．２．１．４）は、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース）、リケニンにおける１，４−ベータ−Ｄ−グリコシド結合、複合ベータ−１，３グルカン、例えば、穀物ベータ−Ｄ−グルカンまたはキシログルカンおよびセルロース部分を含む他の植物原料におけるベータ−１，４結合の内部加水分解(endo hydrolysis)を触媒する。公認名は、エンド１，４−ベータ−Ｄ−グルカン ４−グルカノヒドロラーゼであるが、略語エンド−グルカナーゼが本明細書において使用される。エンド−グルカナーゼ活性は、Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268の方法にしたがってカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）加水分解を使用して測定され得る。
【００４７】
いくつかの態様において、エンド−グルカナーゼは、トリコデルマ属の株、例えば、トリコデルマ・リーゼイの株、フミコーラ属の株、例えば、フミコーラ・インソレンスの株、またはクリソスポリウム(Chrysosporium)の株、好ましくはクリソスポリウム・ラクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)の株由来であり得る。
【００４８】
「セロビオヒドロラーゼ」なる用語は、セルロース、セロオリゴ糖、またはあらゆるベータ−１，４−連結グルコース含有ポリマーにおける１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド結合の加水分解を触媒し、鎖の還元または非還元末端からセロビオースを遊離する１，４−ベータ−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）を意味する。
【００４９】
セロビオヒドロラーゼ(cellobiohydrolose)の例は、上記のもの、例えば、トリコデルマ・リーゼイ、フミコーラ・インソレンス由来のＣＢＨＩおよびＣＢＨＩｌならびにチエラビア・テレストリス(Thielavia teπrestris)セロビオヒドロラーゼ由来のＣＢＨＩｌ（ＣＥＬＬ６Ａ）である。
【００５０】
セロビオヒドロラーゼ活性は、Leverら., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279およびvan Tilbeurghら., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288により記載されている方法にしたがって測定され得る。Leverらの方法は、トウモロコシ茎葉におけるセルロースの加水分解を評価するために適当であり、van Tilbeurghらの方法は、蛍光二糖類誘導体におけるセロビオヒドロラーゼ活性を測定するために適当である。
【００５１】
「ベータ−グルコシダーゼ」なる用語は、ベータ−Ｄ−グルコースの遊離を伴う末端の非還元ベータ−Ｄ−グルコース残基の加水分解を触媒するベータ−Ｄ−グルコシド グルコヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）を意味する。本発明の目的のために、ベータ−グルコシダーゼ活性は、異なる条件が本明細書に記載されているとおりに使用されることを除いて、Venturiら., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66により記載されている基本的方法にしたがって測定される。ベータ−グルコシダーゼ活性の１ユニットは、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０中で基質として４ｍＭのｐ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドから５００Ｃで、ｐＨ５で１分あたり生産される１．０μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールとして定義される。
【００５２】
いくつかの態様において、ベータ−グルコシダーゼは、真菌起源、例えば、トリコデルマ、アスペルギルスまたはペニシリウム属の株のものである。いくつかの態様において、ベータ−グルコシダーゼは、トリコデルマ・リーゼイ由来であり、例えば、ｂｇｌ１遺伝子によってコードされるベータ−グルコシダーゼである（ＥＰ５６２００３参照）。他の態様において、ベータ−グルコシダーゼは、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)（ＷＯ０２／０９５０１４にしたがってアスペルギルス・オリザエにおいて組換え的に生産される）、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)（ＷＯ０２／０９５０１４の実施例２２にしたがってアスペルギルス・オリザエにおいて組換え的に生産される）または黒色アスペルギルス（1981, J. Appl. 3: 157-163）由来である。
【００５３】
本明細書において使用される「ヘミセルロース分解酵素(hemicellulolvtic enzyme)」または「ヘミセルラーゼ」なる用語は、ヘミセルロースを分解し得る酵素を示す。
【００５４】
好ましくはアラビノキシランオリゴ糖への、ヘミセルロースの加水分解における使用のために適当なあらゆるヘミセルラーゼが使用され得る。好ましいヘミセルラーゼは、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクタナーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、マンナーゼ、エンドもしくはエキソアラビナーゼ、エキソ−ガラクタナーゼ、ペクチナーゼ、キシログルカナーゼ、または２つ以上のそれらの混合物を含む。本発明における使用のために適当なヘミセルラーゼの例は、Ｇｒｉｎｄａｍｙｌ Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ ９３０（Danisco A/S, Denmarkから利用できる）またはＶＩＳＣＯＺＹＭ ＥTM（Novozymes A/S, Denmarkから利用できる）を含む。１つの態様において、ヘミセルラーゼはキシラナーゼである。１つの態様において、キシラナーゼは、微生物起源、例えば、真菌起源（例えば、トリコデルマ、メリピルス(Meripilus)、フミコーラ、アスペルギルス、フザリウム）または細菌（例えば、バチルス）由来である。いくつかの態様において、キシラナーゼは、糸状菌由来、好ましくはアスペルギルスの株、例えば、アスペルギルス・アクレアータス(Aspergillus aculeatus)、またはフミコーラの株、好ましくはフミコーラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)由来である。キシラナーゼは、好ましくはエンド１，４−ベータ−キシラナーゼ、さらに好ましくはＧＨ１０またはＧＨ１１のエンド１，４−ベータ−キシラナーゼであり得る。市販のキシラナーゼの例は、Danisco A/S, DenmarkからのＧｒｉｎｄａｍｙｌ Ｈ１２１もしくはＧｒｉｎｄａｍｙｌ Ｐｏｗｅｒｂａｋｅ ９３０またはNovozymes A/S, DenmarkからのＳＨＥＡＲＺＹＭＥTMおよびＢＩＯＦＥＥＤ ＷＨＥＡＴTMを含む。
【００５５】
アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）は、アルファ−Ｌ−アラビノシドにおける末端の非還元アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド残基の加水分解を触媒する。アラビノガラクタン エンド−１，４−ベータ−ガラクトシダーゼであるガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．８９）は、アラビノガラクタンにおける１，４−Ｄ−ガラクトシド結合の内部加水分解を触媒する。
【００５６】
ペクチナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５）は、ペクチン酸塩における１，４−アルファ−Ｄ−ガラクトシドウロン(galactosiduronic)結合および他のガラクツロナンの加水分解を触媒する。
キシログルカナーゼは、キシログルカンの加水分解を触媒する。
【００５７】
本明細書において使用される「キシラナーゼ」なる用語は、キシランまたはアラビノキシランの非末端ベータ−Ｄ−キシロピラノシル−１，４−ベータ−Ｄ−キシロピラノシル単位におけるベータ−１，４グリコシル結合を加水分解することができる酵素を示す。他の名前は、１，４−ベータ−Ｄ−キシラン キシラノヒドロラーゼ、１，４−ベータ−キシラン キシラノヒドロラーゼ、ベータ−１，４−キシラン キシラノヒドロラーゼ、（１−４）−ベータ−キシラン ４−キシラノヒドロラーゼ、エンド−１，４−ベータ−キシラナーゼ、エンド−（１−４）−ベータ−キシラナーゼ、エンド−ベータ−１，４−キシラナーゼ、エンド−１，４−ベータ−Ｄ−キシラナーゼ、エンド−１，４−キシラナーゼ、キシラナーゼ、ベータ−１，４−キシラナーゼ、ベータ−キシラナーゼ、ベータ−Ｄ−キシラナーゼを含む。キシラナーゼは、種々の生物、例えば、植物、真菌（例えば、アスペルギルス、ペニシリウム、ディスポロトリカム(Disporotrichum)、アカパンカビ、フザリウム、フミコーラ、トリコデルマの種）または細菌種（例えば、バチルス、アエロモナス、ストレプトマイセス、ノカルジオプシス、サーモミセス(Thermomyces)の種）（例えば、ＷＯ９２／１７５７３、ＷＯ９２／０１７９３、ＷＯ９１／１９７８２、ＷＯ９４／２１７８５参照）由来であり得る。
【００５８】
本発明の１つの局面において、本発明の方法において使用されるキシラナーゼは、ＥＣ３．２．１．８として分類される酵素である。正式名称はエンド−１，４−ベータ−キシラナーゼである。組織名は１，４−ベータ−Ｄ−キシラン キシラノヒドロラーゼである。他の名前は、例えば、エンド−（１−４）−ベータ−キシラナーゼ、（１−４）−ベータ−キシラン ４−キシラノヒドロラーゼ、エンド−１，４−キシラナーゼ、キシラナーゼ、ベータ−１，４−キシラナーゼ、エンド−１，４−キシラナーゼ、エンド−ベータ−１，４−キシラナーゼ、エンド−１，４−ベータ−Ｄ−キシラナーゼ、１，４−ベータ−キシラン キシラノヒドロラーゼ、ベータ−キシラナーゼ、ベータ−１，４−キシラン キシラノヒドロラーゼ、エンド−１，４−ベータ−キシラナーゼ、ベータ−Ｄ−キシラナーゼで使用され得る。触媒される反応は、キシランにおける１，４−ベータ−Ｄ−キシロシド結合の内部加水分解である。
【００５９】
本発明の１つの局面において、本発明のキシラナーゼは、グリコシドヒドロラーゼ(hydrolyase)（ＧＨ）ファミリー１１のキシラナーゼである。「グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー１１」なる用語は、問題になっているキシラナーゼがＧＨファミリー１１に分類されるか、または分類され得ることを意味する。
【００６０】
本発明の１つの局面において、本発明において使用されるキシラナーゼは、本明細書に記載されている「キシラナーゼアッセイ」において測定されるとき、キシラナーゼ活性を有するキシラナーゼである。
【００６１】
Ｃａｚｙ（ＭｏｄＯ）サイトにしたがって、ファミリー１１グリコシドヒドロラーゼは以下のとおりに特徴付けることができる：
既知の活性：キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）
メカニズム：維持
触媒求核原子／塩基：Ｇｌｕ（実験的）
触媒プロトン供与体：Ｇｌｕ（実験的）
３Ｄ構造状態：折り畳み：β−ゼリーロール
クラン：ＧＨ−Ｃ
【００６２】
本明細書において使用される「クランＣ」は、共通の三次元折り畳みおよび同一の触媒機構を共有するファミリーのグループを示す（例えば、Henrissat, B. and Bairoch, A., (1996) Biochem. J.,316, 695-696参照）。
【００６３】
本明細書において使用される「ファミリー１１」は、Henrissat and Bairoch (1993) Biochem J.,293,781-788（Henrissat and Davies (1997) Current Opinion in Structural Biol. 1997, &:637-644も参照）により確立されている酵素のファミリーを示す。ファミリー１１メンバーの一般的な特性は、高い遺伝的相同性、約２０ｋＤａのサイズおよび二重置換触媒メカニズムを含む（Tenkanenら., 1992; Wakarchukら., 1994参照）。ファミリー１１キシラナーゼの構造は、β−鎖から作られる２つの大型のβ−シートおよびα−ヘリックスを含む。
【００６４】
ファミリー１１キシラナーゼは、黒色アスペルギルス(Aspergillus niger)ＸｙｎＡ、アスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)ＸｙｎＣ、アスペルギルス・ツビゲンシス(Aspergillus tubigensis)ＸｙｎＡ、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)ＸｙｎＡ、バチルスプンジルス(Bacilluspunzilus)ＸｙｎＡ、枯草菌ＸｙｎＡ、ネオカリマスチクスフロンタリス(Neocalliniastix patriciarum)ＸｙｎＡ、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)ＸｙｎＢ、ストレプトミセス・リビダンスＸｙｎＣ、ストレプトミセス・ゼリノビオラセウス(Streptomyces therinoviolaceus)ＸｙｎＩＩ、好熱性放線菌ＸｙｎＡ、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)Ｘｙｎ、トリコデルマ・リーゼイＸｙｎＩ、トリコデルマ・リーゼイＸｙｎＩＩ、トリコデルマビリデ(Trichoderma viride)Ｘｙｎを含む。
【００６５】
本発明の文脈において、「デンプン修飾酵素」は、グルコシドにおけるα−１，３および／またはα−１，６グルコシド結合の加水分解を触媒するあらゆる酵素を示す。この用語に包含されるものは、一般的に作用する基質にちなんで命名されるグリコシドヒドロラーゼである。本発明のいくつかの態様において、「デンプン修飾酵素」は、ラクターゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、キチナーゼ、スクラーゼ、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼおよびリゾチームから選択される。
【００６６】
いくつかの態様において、デンプン修飾酵素はデンプン脱分枝酵素である。
本発明の１つの局面において、本発明において使用されるデンプン修飾酵素は、本明細書に記載されている「デンプン脱分枝活性アッセイ」において測定されるとき、デンプン脱分枝活性を有する酵素である。
【００６７】
デンプン脱分枝酵素は、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）およびイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）を含む。それらは、アミロペクチン、β−リミットデキストリンおよびプルランにおけるα−ｌ，６−Ｄ−グルコシド分岐結合を加水分解する。イソアミラーゼは、プルランを攻撃するイソアミラーゼの無能力により、およびα−リミットデキストリンにおける限界作用により、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）と区別することができる。
【００６８】
「アミラーゼ」は、あらゆるアミラーゼ、例えば、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびバチルス属、例えば、バチルス・リケニホルミス(B. licheniformis)および枯草菌の野生型α−アミラーゼを含むことを意図する。「アミラーゼ」は、特に、デンプンの分解を触媒することができる酵素を意味する。アミラーゼは、デンプンにおけるα−Ｄ−（ｌ→４）Ｏ−グリコシド結合を開裂するヒドロラーゼである。一般的に、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１；（Ｘ−Ｄ−（１→４）−グルカン グルカノヒドロラーゼ）は、ランダム様式においてデンプン分子内のα−Ｄ−（ｌ→４）Ｏ−グリコシド結合を開裂するエンド−作用性酵素として定義される。対照的に、エキソ−作用性デンプン分解酵素、例えば、β−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．２；α−Ｄ−（ｌ→４）−グルカン マルトヒドロラーゼ）およびいくつかの産物特異的アミラーゼ様マルトース生成型(maltogenic)α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）は、基質の非還元末端からデンプン分子を開裂し、β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２０；α−Ｄ−グルコシド グルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３；α−Ｄ−（ｌ→４）−グルカン グルコヒドロラーゼ）および産物特異的アミラーゼは、デンプンからグルコースを生産することができる。
【００６９】
「α−アミラーゼ変異体」、「α−アミラーゼ変異体ポリペプチド」および「変異体酵素」は、成熟体α−アミラーゼタンパク質のアミノ末端でアミノ酸残基を置き換えることにより修飾されているα−アミラーゼタンパク質を意味する。本明細書において使用される「親酵素」、「親配列」、「親ポリペプチド」、「野生型α−アミラーゼタンパク質」および「親ポリペプチド」は、α−アミラーゼ変異体ポリペプチドが由来する酵素およびポリペプチドを意味する。親酵素は、以前に組換え的に操作されている野生型酵素またはα−アミラーゼであり得る。α−アミラーゼ変異体は、α−アミラーゼ親ポリペプチドのシグナル配列において、またはα−アミラーゼ親ポリペプチドの他の場所において変異をさらに含むことができる。したがって、α−アミラーゼポリペプチドは、組換え的に操作された酵素であり得る。
【００７０】
本発明の１つの局面において、本発明において使用されるα−アミラーゼは、本明細書に記載されている「α−アミラーゼアッセイ」において測定されるとき、α−アミラーゼ活性を有するα−アミラーゼである。
【００７１】
本発明の１つの局面において、本発明において使用されるベータ−アミラーゼは、本明細書に記載されている「ベータ−アミラーゼアッセイ」において測定されるとき、ベータ−アミラーゼ活性を有するベータ−アミラーゼである。
【００７２】
「プルラナーゼ」なる用語は、プルランを分解するデンプン分解内酵素である特定の種類のグルカナーゼを示す。それは、例えば、クレブシエラ属のグラム陰性菌により細胞外の細胞表面に固定されたリポタンパク質として生産される。しかしながら、グラム陽性菌は、分泌タンパク質としてプルラナーゼを生産する。Ｉ型プルラナーゼは、α−１，６結合を特異的に攻撃するが、ＩＩ型プルラナーゼは、α−１，４結合も加水分解することができる。それは、また、いくつかの他の細菌および古細菌により生産される。プルラナーゼは、バイオテクノロジーにおいてデタージェントとして使用される。プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）は、プルラン−６−グルカノヒドロラーゼ（脱分枝酵素）としても知られている。プルランは、α−１，６−グルコシド結合により連結したマルトトリオース単位の鎖と考えられている。プルラナーゼは、プルラン（α−グルカン多糖類）を加水分解的に開裂する。
【００７３】
「トランスグリコシル化酵素」は、トランスグルコシダーゼ活性を有するあらゆる酵素、例えば、トランスグルコシダーゼを示す。「トランスグルコシダーゼ」なる用語は、１，４−α−Ｄ−グルカンにおけるα−Ｄ−グルコシル残基を、遊離しているか、または１，４−α−Ｄ−グルカンと結合しているグルコースの第一ヒドロキシ基に移す酵素を示す。本明細書に記載されているトランスグルコシダーゼは、ＩＵＢＭＢ酵素命名にしたがってＥＣ２．４．１．２４と記載されている活性を有する。本明細書に記載されているトランスグルコシダーゼの組織名は、１，４−α−Ｄ−グルカン、すなわち１，４−α−Ｄ−グルカン（Ｄ−グルコース）６−α−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼである。この酵素は、ある文献においてα−グルコシダーゼとして称されている。
【００７４】
上記のとおり、トランスグルコシダーゼ酵素は、一般的に、ＩＵＢＭＢ酵素命名にしたがってＥＣ２．４．１．２４として定義される、あるグルカンにおけるグルコシル残基をグルコースの第一ヒドロキシ基に移す活性を有する。いくつかの態様において、該酵素は、また、糖側鎖を切るか、または内部結合を開裂し、多糖類骨格を破壊することにより、天然ゴム多糖類（例えば、キサンタン、およびガラクトマンナン含有多糖類、例えば、グアーガムまたはライ豆ゴム）を分解する活性を有し得る。あらゆる適当なトランスグルコシダーゼ酵素が本発明における使用に認められる（例えば、Pazurら, Carbohydr. Res. 1986 149:137-47;およびNakamuraら, J. Biotechnol., 53:75-84, 1997参照）。いくつかの態様において、本発明における使用に認められるトランスグルコシダーゼ酵素は、市販されているものである（例えば、Megazyme, Wicklow, Ireland；またはDanisco US Inc., Genencor Division, Palo Alto, CAから得られる酵素を含むが、これらに限定されない）。いくつかの態様において、酵素は、トリコデルマ・リーゼイ細胞において生産される黒色アスペルギルス トランスグルコシダーゼである。いくつかのさらなる態様において、トランスグルコシダーゼは、野生型真菌トランスグルコシダーゼ（例えば、アクセス番号：Ｄ４５３５６（ＧＩＤ：２６４５１５９；黒色アスペルギルス）、ＢＡＤ０６００６．１（ＧＩＤ：４０３１３２８；アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)）、ＢＡＡ０８１２５．１｛ＧｌＯ：＼０５４５６５；アスペルギルス・オリザエ）、ＸＰＪ）Ｏｌ ２１０８０９．１（ＧＩＤ： １ １５４９２３６３；アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)）、ＸＰ＿００１２７１８９１．１（ＧＩＤ：１２１７０７６２０；アスペルギルス・クラバタス(Aspergillus clavatus)、ＸＰＪ）０１２６６９９９．１（ＧＩＤ：１ １９５００４８４；ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)）、ＸＰ ７５１８１ １．１（ＧＩＤ：７０９９３９２８；アスペルギルス・フミガーツス）、ＸＰ＿６５９６２１．１（ＧＩＤ：６７５２３１２１；アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)）、ＸＰ＿００１２１６８９９．１（ＧＩＤ：１１５４３３５２４；アスペルギルス・テレウス）およびＸＰＪ）０１２５８５８５．１（ＧＩＤ：１１９４７３３７１；ネオサルトリア・フィシェリ）として、ＮＣＢＩのＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベースにおいて寄託されているアミノ酸配列を有する真菌トランスグルコシダーゼを含むが、これらに限定されない）、または、野生型真菌トランスグルコシダーゼと少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一または少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を有するそれらの変異体である。
【００７５】
本発明の１つの局面において、本発明において使用されるトランスグルコシダーゼは、本明細書に記載されている「トランスグルコシダーゼアッセイ」において測定されるとき、トランスグルコシダーゼ活性を有するトランスグルコシダーゼである。
【００７６】
本発明の酵素活性アッセイ
細胞壁可溶化アッセイ
好ましくは、ふすま溶解度は、以下のアッセイを使用して測定される。
【００７７】
（０．１Ｍ）−リン酸水素二ナトリウム（０．２Ｍ）バッファー、ｐＨ５．０中の小麦ふすまの懸濁液を、１，３３％のふすまの濃度（ｗ／ｗ）に調製する。この懸濁液から、７５０μｌのアリコートを撹拌下でエッペンドルフチューブに移す。それぞれの基質チューブを４０℃で５分間予め加熱する。そこに、２５０μｌの酵素溶液を加え、基質１％の最終濃度を作る。各測定時間（０、３０、６０および２４０分）に対し、酵素濃度を増加させて（０，３３；１，０および３，０μｇの酵素／グラムふすま）、本発明の各酵素組成物から３つの希釈物（デュプリケート）を作る。ブランクとして、酵素組成物の熱変性した溶液を使用する。反応は、９５℃でチューブをインキュベーターセットに移すことにより、所定の時間に終了する。全酵素反応が終了するまで、熱変性したサンプルを４℃で維持する。全酵素反応が終了したとき、エッペンドルフチューブを遠心し、透明な上清を得る。ふすまを可溶性にする酵素能力は、ＰＡＨＢＡＨを使用して測定される末端基の還元の増加として示される（Ｌｅｖｅｒ、１９７２）。
【００７８】
使用されるふすまが残留デンプンを含むとき、副活性、例えば、アミラーゼ活性が上記アッセイを妨げ得るため、ふすま可溶化アッセイは、精製された細胞壁修飾酵素（アミラーゼ活性を有さない）でのみ実施されるべきである。
【００７９】
あるいは、可溶化度は、以下の方法にしたがって測定され得る。
植物原料、例えば、穀物ふすまの可溶化度は、不溶性植物原料を、酵素を有するか、または有さない抽出バッファー（一般的に、バッファー中１０−２５％のふすま（ｗ／ｗ））に懸濁し、懸濁液を撹拌下で摂氏４０℃で制御時間（例えば、３０から１４４０分）でインキュベートすることにより測定することができる。可溶化後、可溶化された原料を遠心分離（２０分、２５０００×ｇ、室温）により不溶性原料から分離する。上清中の乾物含有量を、サンプルの一部を凍結乾燥することにより、または含水量分析により（Moidture analyser, AND ML-50, Buch & Holm, Denmark）測定する。すべての抽出バッファーを、このプロトコールを使用して回収することはできないが、しかしながら、可溶性物質の濃度は、回収されなかった抽出バッファー中と回収された抽出バッファー中で同じであると考え、補正を使用された全抽出バッファーに対して行う。可溶性画分中の乾物含有量を測定しておき、試験に取り入れた植物原料の量および抽出バッファーの量を知っていると、可溶化度は以下の方程式を使用して決定することができる。
可溶化度＝（（（乾物のグラム／回収された上清のｍｌ）×（使用された抽出バッファーのｍｌ））×１００％）／試験に取り入れた植物原料のグラム
【００８０】
キシラナーゼアッセイ（エンド−β−１，４−キシラナーゼ活性）
このアッセイにおいてＯＤ５９０＝約０．７を得るように、サンプルをクエン酸（０．１Ｍ）−リン酸水素二ナトリウム（０．２Ｍ）バッファー、ｐＨ５．０に希釈した。サンプルの３つの異なる希釈物を５分４０℃でプレインキュベートした。時間＝５分で、１つのＸｙｌａｚｙｍｅ錠剤（架橋され、染色されたキシラン基質、Megazyme, Bray, Ireland）を、１ｍｌの反応容量の酵素溶液に加えた。時間＝１５分で、１０ｍｌの２％のＴＲＩＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ１２を加えることにより反応を終了した。ブランクは、酵素溶液の代わりに１０００μｌのバッファーを使用して調製した。反応混合物を遠心し（１５００×ｇ、１０分、２０℃）、上清のＯＤを５９０ｎｍで測定した。１つのキシラナーゼユニット（ＸＵ）は、１分あたりＯＤ５９０が０．０２５増加するキシラナーゼ活性として定義される。
【００８１】
α−アミラーゼ活性：
α−アミラーゼは、α−Ｄ−１，４−グルコシド結合を加水分解し、その活性は、アルファ１，４−Ｄ−結合の加水分解によるデンプン−ヨウ素溶液の色の変化率として検出することができる。
【００８２】
ベータ−アミラーゼ活性：
ベータ−アミラーゼ活性は、デンプン溶液の非還元末端からのマルトースの遊離として測定することができる。
【００８３】
トランスグルコシダーゼ活性：
トランスグルコシダーゼは、α−Ｄ−グルコオリゴ糖とのインキュベーションにおける加水分解および移動反応の両方を触媒する。トランスグルコシダーゼ活性は、マルトースまたはマルトデキストリンとのインキュベーション時のイソマルトオリゴ糖、例えば、イソマルトース、パノース(pansose)およびイソマルトトリオースの生成として測定することができる。
【００８４】
デンプン脱分枝活性アッセイ：
現在、デンプンにおけるα−Ｄ−１，６グルコシド結合に対して特異的な酵素は、イソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）およびプルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）を含む。デンプンのα−Ｄ−１，６グルコシド結合に作用する酵素は、また、プルランに対するそれらの活性により分類され、それらの活性は、デンプンおよびプルランのα−Ｄ−１，６グルコシド結合の特異的加水分解として測定される。
【００８５】
本発明の特定の態様：
上記のとおり、本発明は、デンプンを含む穀物ふすまの可溶化のための方法であって、
ａ）相当量のデンプンを含む粒子穀物ふすまの液体懸濁液を調製し、
ｂ）液体懸濁液中に相当量のデンプンを含む該粒子穀物ふすまを、いずれの成分も除去することなく、任意の順番で連続して、または同時に、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素、１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素で処理する
工程を含む方法に関する。
【００８６】
本発明のいくつかの態様において、粒子穀物ふすまを、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素、および１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素を含む酵素の組合せで同時に処理する。
【００８７】
本発明のいくつかの態様において、１つのさらなる酵素は、１つまたはそれ以上のトランスグリコシル化酵素である。
本発明のいくつかの態様において、１つのさらなる酵素は、リパーゼ、例えば、ホスホリパーゼまたはガラクトリパーゼである。
本発明のいくつかの態様において、１つのさらなる酵素は、プロテアーゼである。
【００８８】
本発明のいくつかの態様において、工程ｂ）から得られる可溶性画分を回収する工程をさらに含む。
【００８９】
本発明のいくつかの態様において、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素は、キシラナーゼおよびセルラーゼ、例えば、セロビオヒドロラーゼ、エンド−グルカナーゼおよびベータ−グルカナーゼからなる群から選択される。
【００９０】
本発明のいくつかの態様において、セルラーゼは、エンド−セルラーゼ、エキソ−セルラーゼ、セロビアーゼ、酸化セルラーゼ、セルロースホスホリラーゼから選択される。
【００９１】
本発明のいくつかの態様において、１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素は、アルファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼおよびベータ−アミラーゼからなる群から選択される。
【００９２】
本発明のいくつかの態様において、１つまたはそれ以上のトランスグリコシル化酵素は、酵素クラスＥＣ２．４．１．２４の酵素からなる群から選択される。
【００９３】
本発明のいくつかの態様において、該粒子ふすまの平均粒径は、３０００μｍ未満、例えば、１０００μｍ未満、例えば、５００μｍ未満である。
【００９４】
本発明のいくつかの態様において、穀物ふすまを産業的製粉工程から得、平均粒径５００μｍ未満、例えば、４００μｍ未満、例えば、２００μｍ未満を得るためにさらに製粉する。
【００９５】
本発明のいくつかの態様において、さらなる酵素活性を不活性化するために、可溶化された穀物ふすまをさらに処理する。
【００９６】
本発明のいくつかの態様において、乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、可溶化度は、２０％以上、例えば、２５％以上、例えば、３０％以上、例えば、３５％以上、例えば、４０％以上、例えば、５０％以上、例えば、４０％−６０％の範囲、例えば、５０％−６０％の範囲である。
【００９７】
本発明のいくつかの態様において、乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、工程ｂ）から得られる可溶性画分中のアラビノキシランオリゴ糖（ＡＸＯＳ）の含有量は、２０％を越える、例えば、２５％を越える、例えば、３０％を越える、例えば、３５％を越える、例えば、４０％を越える、例えば、４５％を越える、例えば、５０％を越える。
【００９８】
本発明のいくつかの態様において、穀物ふすま中の１％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の２％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の３％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の４％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の５％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の１０％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の１５−５０％以上のデンプンは、工程ｂ）から得られる可溶性画分中でイソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ）に変換される。
【００９９】
本発明のいくつかの態様において、乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、工程ｂ）から得られる可溶性画分中の修飾された脂質の含有量は、少なくとも約０．０５％、例えば、少なくとも約１．０％、例えば、０．０５−５％の範囲である。
【０１００】
本発明のいくつかの態様において、穀物ふすま由来の修飾された脂質の全量の少なくとも約２％、例えば、少なくとも約１０％、例えば、２−８０％の範囲が、工程ｂ）から得られる可溶性画分に存在する。
【０１０１】
本発明のいくつかの態様において、工程ａ）の前に、ｉ）穀物を分画して、内胚乳、ふすま、および胚芽を得、ｉｉ）内胚乳、ふすま、および胚芽を分離および分配して、それらを処理可能にし、ｉｉｉ）ふすまを製粉する工程をさらに含む。
【０１０２】
本発明のいくつかの態様において、穀物ふすまは、小麦、大麦、オート麦、ライ麦およびライコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される。
【０１０３】
本発明のいくつかの態様において、該方法は、得られた可溶化された穀物ふすまの乾燥の工程をさらに含む。
【０１０４】
本発明のいくつかの態様において、該方法は、得られた可溶化された穀物ふすまの噴霧乾燥の工程をさらに含む。
【０１０５】
本発明のいくつかの態様において、該方法は、得られた可溶化された穀物ふすまの凍結乾燥の工程をさらに含む。
【０１０６】
本発明は、さらに、本発明の得られた可溶化された穀物ふすまの使用に関する。
【０１０７】
本発明のいくつかの態様において、本発明の方法において得られる可溶化された穀物ふすまを、食品の生産における可溶性および不溶性穀物ふすま原料の混合物として直接加える。
【０１０８】
本発明の方法は、例えば、可溶性画分が可溶性および不溶性穀物ふすま原料の混合物から回収されるとき、可溶性穀物ふすま原料のみを有する単離された可溶化された画分を生産し得ると理解すべきである。
【０１０９】
いくつかの態様において、このような回収された可溶性穀物ふすま原料は、食品の生産において使用される。
【０１１０】
他の態様において、可溶性および不溶性原料の両方を含む可溶化された穀物ふすまは、さらなる分離または回収なしに、食品の生産において直接使用され得る。
【０１１１】
本発明のいくつかの態様において、食品は、パン、朝食用のシリアル、パスタ、ビスケット、クッキー、スナックおよびビールからなる群から選択される。
【０１１２】
本発明の可溶化された穀物ふすまは、食品として、またはそれらの製造において使用され得る。ここで、「食品」なる用語は、広い意味において使用され、ヒトのための食物ならびに動物のための食物（すなわち、えさ）を含む。いくつかの局面において、食物はヒト消費のためである。
【０１１３】
食物は、使用および／または適用様式および／または投与経路に依存して、溶液形態において、または固体としてであり得る。
【０１１４】
したがって、本発明の他の態様において、回収された可溶性穀物ふすま原料および／または可溶性および不溶性原料の両方を含む可溶化された穀物ふすまは、動物飼料において使用され得る。
【０１１５】
本発明の可溶化された穀物ふすまは、食物成分としても使用され得る。
【０１１６】
本明細書において使用される「食物成分」なる用語は、栄養補助食品および／または食物繊維補助食品として機能性食品または食料品に加えられるか、または加えることができる製剤を含む。本明細書において使用される食物成分なる用語は、また、粘度を加えることなく、ゲル化、キメ出し、安定化、懸濁、皮膜形成および構造化、みずみずしさの保持ならびに食感の改善を必要とする多種多様の産物において低レベルで使用することができる製剤を示す。
【０１１７】
食物成分は、使用および／または適用様式および／または投与経路に依存して、溶液形態において、または固体としてであり得る。
【０１１８】
本発明の可溶化された穀物ふすまは、食物補助食品であってもよく、またはそれに加えられてもよい。
本発明の可溶化された穀物ふすまは、機能性食品であってもよく、またはそれに加えられてもよい。
【０１１９】
本明細書において使用される「機能性食品」なる用語は、栄養効果および／または味の満足感を提供することができるだけでなく、消費者にさらなる有益な効果を送達することも可能である食物を意味する。
【０１２０】
したがって、機能性食品は、純粋な栄養効果以外の特定の機能、例えば、医薬的または生理学的利点を食物に与える、食物に包含されている要素または成分（例えば、本明細書に記載されているもの）を有する普通の食物である。
【０１２１】
機能性食品の法的な定義はないが、分野における多数の関係者が、特定の健康への影響を有するとして市販されている食物と一致する。
【０１２２】
いくつかの機能性食品は栄養補助食品である。本明細書において「栄養補助食品」なる用語は、栄養効果および／または味の満足感を提供することができるだけでなく、消費者に治療（または他の有益な）効果を送達することも可能である食物を意味する。栄養補助食品は、食物と医薬の従来の境界線を交差する。
【０１２３】
調査により、消費者が心臓疾患に関する機能性食品に最も重点を置いていることが示唆されている。癌の予防は、栄養摂取の別の局面であり、多くの消費者に関心をもたせているが、興味深いことに、わずかにコントロールできると消費者が感じている領域である。事実、世界保健機関によると、少なくとも３５％の癌の原因は食事関連である。骨粗鬆症、消化管の健康および肥満効果に関連するさらなる要求は、また、機能性食品購入を刺激し、市場開発を動かす可能性のある重要な因子である。
【０１２４】
本発明の組成物は、食品の製造物、例えば、１つ以上のジャム、マーマレード、ゼリー、乳製品（例えば、ミルクまたはチーズ）、肉製品、鳥肉製品、魚製品およびベーカリー産物において使用することができる。
【０１２５】
例として、本発明の組成物は、清涼飲料、乳漿タンパク質を含む果汁または飲料、ヘルスティー(health tea)、ココア飲料、ミルク飲料および乳酸菌飲料、ヨーグルトおよび飲料ヨーグルト、チーズ、アイスクリーム、水氷およびデザート、菓子、ビスケットケーキおよびケーキ粉末食品、スナック食品、朝食用のシリアル、即席めんおよびカップめん、即席スープおよびカップスープ、バランスのとれた食物および飲料、甘味剤、質感が改善されたスナック食品の棒状物、繊維棒状物、焼きに安定なフルーツ充填物、保護グレーズ(care glaze)、チョコレートベーカリー充填物、チーズケーキ香味付け充填物、フルーツ香味付けケーキ充填物、ケーキおよびドーナツの砂糖衣、熱安定なベーカリー充填物、即席ベーカリー充填物クリーム、クッキー用の充填物、すぐに食べられるベーカリー充填物、低カロリー充填物、成人用栄養飲料、酸性大豆／汁飲料、無菌／レトルトチョコレート飲料、棒状物の粉末食品、飲料粉末、カルシウム強化大豆／プレーン(plaim)およびチョコレートミルク、カルシウム強化コーヒー飲料に対する成分として使用することができる。
【０１２６】
本発明の可溶化された穀物ふすまは、さらに、食品、例えば、アメリカンチーズソース、粉＆細切りチーズのための凝固阻止剤、チップディップ、クリームチーズ、乾燥混合ホイップティップ(whip topping)脂肪非含有サワークリーム、凍結／解凍された乳製品ホイッピング・クリーム、凍結／解凍された安定なホイップティップ(whipped tipping)、低脂肪＆低カロリーのナテュラルチェダー・チーズ、低脂肪スイススタイル(Swiss style)ヨーグルト、気泡含有(aerated)凍結デザート、およびノベルティーバー(novelty bars)、ハードパックアイスクリーム、ラベルフレンドリー(label friendly)、経済的に改善された＆インダルジェンス(indulgence)のハードパックアイスクリーム、低脂肪アイスクリーム：ソフトクリーム、バーベキューソース、チーズディップソース、カッテージ・チーズドレッシング、乾燥混合物アルフレド(Alfredo)ソース、ミックスチーズソース、乾燥混合物トマトソースおよび他のものの中の成分として使用することができる。
【０１２７】
ある局面において、食料品は飲料である。
ある局面において、食料品はベーカリー産物、例えば、パン、デニッシュ・ペストリー、ビスケットまたはクッキーである。
【０１２８】
いくつかの態様において、ふすまの可溶化度は、実施例１に記載されている「可溶性画分アッセイにおける乾物含有量（％）」として、使用されるふすまに対する可溶性画分中の乾物含有量（％）として測定される。
【０１２９】
いくつかの態様において、「可溶性画分アッセイにおける乾物含有量（％）」として測定されるとき、ふすまの可溶化度は、２０％以上、例えば、２５％以上、例えば、３０％以上、例えば、３５％以上、例えば、３５％以上、例えば、４０％以上、例えば、５０％以上、例えば、４０％−６０％の範囲、例えば、５０％−６０％の範囲である。
【実施例】
【０１３０】
実施例
実施例１
市販の小麦ふすまの実験室規模の可溶化：
ふすま：
商業的製粉から得られる小麦ふすま画分を使用した。該画分は、細粒ふすま画分および粗粒ふすま画分からなった。使用の前に、粗粒ふすま画分を製粉して、より小さい粒径を得、ふすまの比表面積を増加させ、最終的にふすまの酵素的可溶化の効率を増加させた。製粉をＲｅｔｃｈ製粉機で行い、５００μｍの平均粒径を得た。しかしながら、可溶化度に関して、より小さい粒径が好ましいであろうことに注意すべきである。
【０１３１】
酵素：
表１．小麦ふすま可溶化のために使用される酵素
【表１】
【０１３２】
プロトコール：
表２．ふすま可溶化のために使用されるプロトコール
【表２】
【０１３３】
分析：
可溶性ふすま画分（上清）を以下に関して分析する：
可溶性画分アッセイにおける乾物含有量（％）：
得られる可溶性ふすまの定量的サンプルを凍結乾燥させる。凍結乾燥後、該サンプルサイズを再び定量し、乾物の量を計算する。ブランクとして、該バッファーは、この分析に含まれる。
【０１３４】
試験：
表３．小麦ふすまの異なる処理をもたらすように行われた試験
【表３】
【０１３５】
結果：
ふすま可溶化度：
ふすま画分中の細胞壁成分のよく知られている保水最大容量によって、抽出バッファーの有効な回収率はこれらの実験において得られなかった。しかしながら、適当な処理が展開されたとき得られた。図１において、抽出バッファーの実際の回収率を示す。抽出回収率は、２５から５５％で変化する。
【０１３６】
可溶化の効率を、得られた可溶性画分中の乾物含有量に基づいて測定した。図２から分かるように、湿式プロセスのみが有意な量のふすまを可溶化する。しかしながら、キシラナーゼ、セルラーゼ／グルカナーゼおよびデンプン分解複合体の組み合わせた効果は、有意に可溶化を増加させる。実際にこの実験において、非デンプン加水分解酵素（キシラナーゼ、セルラーゼおよびグルカナーゼ）とデンプン加水分解酵素（アミラーゼ、プルラナーゼ、ベータ−アミラーゼおよびトランスグルコシダーゼ）との組合せの相加的効果があることに注意すべきである。該相加的効果は、単一の酵素複合体がその基質に接触するには立体障害があるという事実によって得られるのかもしれない。この立体障害または基質への接触は、非デンプンおよびデンプン修飾酵素の両方の組合せを使用するとき、最適化される。
【０１３７】
得られた種々の可溶性画分中の乾物含有量および回収された抽出バッファーの量に基づいて、可溶化度を決定することが可能である。ふすま画分の可溶化度は、１０から２５％の可溶化で変化する。該データは図３において説明される。
【０１３８】
しかしながら、図３における可溶化度は、正確な可溶化度ではない。正確な可溶化度は、有意にさらに高い。これは、ふすま処理に応じた抽出バッファーの偏りおよび低い回収率のためである。しかしながら、実際の抽出度は、得られた抽出バッファーを実際に使用された抽出バッファー容量で補正することにより容易に得ることができる。この補正が許容される。回収された可溶性物質の濃度は、回収されなかった可溶性物質の濃度と同じであると考えられるためである。さらに、ここで得られる可溶性物質の回収率は、このプロトコールにおいて使用されるプロセスにより与えられる。異なる分離プロセスを使用して、または残留ふすまの繰り返し抽出を使用して、より高い回収率が容易に得ることができた。ふすま可溶化に関するデータを補正したとき、図４における結果が得られる。
【０１３９】
実施例２
市販の小麦ふすまの実験室規模の可溶化：
ふすま：
より大規模な実験を、５００ｇの小麦ふすま、３３００ｍｌの５０ｍＭのＮａＰｉ ｐＨ５．０および表４に記載されている酵素を適用することにより準備した。反応は、表２に記載されているプロトコールにしたがって実施した。
【０１４０】
酵素：
表４：大規模可溶化実験に適用された酵素
【表４】
【０１４１】
分析：
ＡＸ含有量：
可溶性物質のサンプル（上清）を可溶化されたＡＸについて分析した。分析はRouau and Surget (1994)にしたがって行った。
ＡＸ ｍｗ／ＡＸＯＳ分析：
ＡＸの分子量は、ＬＣ＿ＭＳにより測定した。
デンプン含有量：
ふすまおよび可溶化ふすま中のデンプン含有量を、熱安定なアルファ−アミラーゼを摂氏９５℃で９０分で用い、次にプラナーゼ(pullanase)およびグルコアミラーゼを摂氏５０℃で４５時間で加えるデンプンの全加水分解後に、グルコース測定により分析した。
ＩＭＯ含有量：
得られた可溶性画分中のＩＭＯ濃度をＨＰＬＣ−陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して測定した。
【０１４２】
結果：
ふすま可溶化度：
この実験において使用された抽出バッファーの正確な容量を補正したとき、以前の実験において得られた可溶化度に匹敵する５４％の可溶化度が得られた。
ＡＸ含有量：
ふすま画分中のＡＸの量は、１９ｍｇ／ｍｌ上清と決定された。抽出体積を考慮すると、可溶化されたふすま中の可溶性ＡＸの全量は６２，７ｇである。小麦ふすま中のＡＸ含有量の文献データにしたがって、全ＡＸの約５３％の可溶化を得ている。データは表５に要約されている。
表５． 試験に適用されたふすま、ｇ。使用された抽出バッファーおよび容量、ｍｌ。可溶化されたふすま中のＡＸ濃度、ｍｇ／ｍｌ。抽出体積に対して補正されたときの全ＡＸ、ｇ。ふすまに対する抽出されたＡＸ、％。小麦ふすま中のＡＸ含有量に関する文献データ、および最後に、ふすまの抽出度、％。
【表５】
【０１４３】
デンプン含有量：
ふすま出発物質中のデンプンの量は、全グルコース含有量の酵素分析にしたがって、１６．３％と測定された。可溶化された原料において回収され見出されるふすま由来のデンプンの量は、可溶化された原料の全グルコース測定により分析されたとき、７６％と決定された。
【０１４４】
ＩＭＯ含有量：
上清を高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してイソマルトオリゴ糖（イソマルトース、イソマルトトリオースおよびパノース）の含有量について分析した（表５）。可溶化プロセスにおいて得られたＩＭＯの濃度は、ふすま原料のデンプン含有量に大きく依存する。ふすま出発物質中のデンプンのＩＭＯへの変換度を、ＩＭＯ生産の尺度として使用する。この実施例において、ＩＭＯ（イソマルトース、イソマルトトリオースおよびパノース）の全濃度は、可溶化された原料において２６９０ｐｐｍと測定される（表６）。バッファー容量を考慮したとき、産生されたＩＭＯの量は９．０ｇである。したがって、ＩＭＯへの全変換は、ふすま中のデンプンの最初の量の１１．０％であった。
表６：イソマルトオリゴ糖の濃度
【表６】
ＭＳによるＡＸＯＳ分析：
ＡＸＯＳ分析からの結果は、ＤＰ６のピーク濃度でＤＰ３からＤＰ１１の範囲におけるＡＸＯＳのＤＰ分布を示した。
【０１４５】
実施例３
可溶化されたふすまを使用するベーキング実験
穀粉：
市販の非最適化デニッシュ改良穀粉(Danish reform flour)（２００７−００１１３）をベーキング実験のために使用する。可溶化されたふすまに対する対照として、再構成された穀粉を可溶化実験（実施例１および２参照）のために使用した穀粉およびふすまから作製する。可溶化されたふすま画分中の乾物および穀粉に加えられた水／可溶性ふすまの量に基づいて、穀粉で置き換えられたふすまの量を計算することができる（表８参照）。
可溶化されたふすま：
実施例２において得られた可溶化されたふすまを、ベーキング試験のために使用した。
【０１４６】
ベーキングレシピ：
穀粉、可溶化されたふすまを加えられた穀粉および可溶化されていないふすまを加えられた再構成された穀粉のベーキング性能を、以下のレシピ（表７）を使用して小規模ベーキング試験（５０グラムの混合物(mixer)および１０グラムのローフ(Loaves)）において評価した。
表７．穀粉、可溶化されたふすまを加えられた穀粉および可溶化されていないふすまを加えられた再構成された穀粉のベーキング性能を評価するために使用されるレシピ。塩／糖は、塩および糖の１：１（ｗ／ｗ）混合物である。水は、Ｆａｒｉｎｏｇｒａｐｈ分析により測定される水分吸収である。
【表７】
【０１４７】
ドー(Dough)作りおよびベーキング
穀粉（または穀粉およびふすまの混合物）および乾燥成分を１分間混合し、その後、水を加え、混合をさらに５分間続けた。
【０１４８】
混合後、それぞれ１０グラムの穀粉を含む４つのドーの塊を計量した。手動成形機を使用して、これらをパンに成形した。ローフ(Loaves)を焼き型に入れ、密閉した容器（ふたを有する）中に置き、テーブルに１０分間放置した。その後、パンを３４℃で８５％のＲＨで４５分間発酵させ、最後にＢａｇｏオーブン（Bago-line, Faaborg, Denmark）で２３０℃で５分間焼く。ドーの測定(scaling)の間に、粘り気を１（非常に粘り気）から５（乾燥）の尺度において主観的に評価した。
パンを、評価（重量、体積測定、ならびに身、皮および官能評価）の前に２０分間冷やした。
【０１４９】
ベーキング試験
以下のベーキング試験を行った（表８）。
表８．ベーキング試験実験構成。ＩＤは、可溶化されたふすまを加えられたか、または不溶性ふすまで再構成された穀粉組成を示す。穀粉（ｇ）は、パンにおける穀粉の量である。ふすま（ｇ）は、再構成のために使用されたふすまの量である。可溶化されたふすま（ｍｌ）は、水の代わりに穀粉に加えられた可溶化されたふすまの量である。水（ｍｌ）は、穀粉に加えられた水の量である。「ふすま」（％）は、穀粉重量に基づく可溶化されたふすま、または不溶性ふすまのいずれかの量である。
【表８】
【０１５０】
官能評価：
パンの冷却２０分後の官能評価をした。とりわけ、従来のふすま画分由来の苦味を評価した。
劣化評価：
硬度は、研究室テーブル上にパンローフを２４時間放置した後に主観的に評価した。
【０１５１】
結果：
表９および図５において分かるように、可溶性繊維の添加は、パンの比体積に影響を及ぼさない。
表９．ベーキング試験結果。ＩＤは、可溶化されたふすまを加えられたか、または不溶性ふすまで再構成された穀粉組成を示す。穀粉（ｇ）は、パンにおける穀粉の量である。ふすま（ｇ）は、再構成のために使用されたふすまの量である。比体積（ｍｇ／ｍｌ）は、パンの真比体積である。相対体積 対 ブランク（％）は、パン 対 パン１（ブランク）の相対体積である。
【表９】
【０１５２】
しかしながら、さらに驚くべきことに、繊維の添加されたものと比較して、可溶性繊維のパンへの添加は、得られるパンの色に影響を及ぼさない。図６参照。
色に関する結果は、パンの身を評価するとき、さらに明白である（図７参照）。
【０１５３】
官能評価：
試験パネルがパンを評価した（ｎ＝３）。以下の評価は、官能特性における有意な違いが、対照パンと可溶性ふすま画分を加えられたパンの間で測定されなかったことを示した。一方、ふすまを加えられたパンは、ふすま由来の独特の苦味を有した。
【０１５４】
表１０．パンの官能評価。ＩＤは、可溶化されたふすまを加えられたか、または不溶性ふすまで再構成された穀粉組成を示す。苦味を、参照として穀粉および不溶性ふすまを加えられたパンで評価する。対照との違いは、パン１と比較した全体的な外観を示す。皮の色および身の色を主観的に評価する（図６および７参照）。
【表１０】
【０１５５】
表１１．パンの硬度評価。ＩＤは、可溶化されたふすまを加えられたか、または不溶性ふすまで再構成された穀粉組成を示す。硬度は、研究室のベンチ上に２４時間放置された切断されたパンで評価する。尺度：１＝柔らかい；５＝堅い。
【表１１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンプンを含む穀物ふすまの可溶化のための方法であって、
ａ）相当量のデンプンを含む粒子穀物ふすまの液体懸濁液を調製し、
ｂ）液体懸濁液中に相当量のデンプンを含む該粒子穀物ふすまを、いずれの成分も除去することなく、任意の順番で連続して、または同時に、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素、１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素で処理する
工程を含む方法。
【請求項２】
粒子穀物ふすまを、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素、および１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素を含む酵素の組合せで同時に処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該１つのさらなる酵素が１つまたはそれ以上のトランスグリコシル化酵素である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
該１つのさらなる酵素がリパーゼ、例えば、ホスホリパーゼまたはガラクトリパーゼである、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該１つのさらなる酵素がプロテアーゼである、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）から得られる可溶性画分を回収する工程をさらに含む、請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素がキシラナーゼおよびセルラーゼ、例えば、セロビオヒドロラーゼ、エンド−グルカナーゼおよびベータ−グルカナーゼからなる群から選択される、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該セルラーゼがエンド−セルラーゼ、エキソ−セルラーゼ、セロビアーゼ、酸化セルラーゼ、セルロースホスホリラーゼから選択される、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素がアルファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼおよびベータ−アミラーゼからなる群から選択される、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該１つまたはそれ以上のトランスグリコシル化酵素が酵素クラスＥＣ３．２．１．２０の酵素からなる群から選択される、請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該粒子ふすまの平均粒径が３０００μｍ未満、例えば、１０００μｍ未満、例えば、５００μｍ未満である、請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該穀物ふすまを産業的製粉工程から得、５００μｍ未満、例えば、４００μｍ未満、例えば、２００μｍ未満の平均粒径を得るためにさらに製粉する、請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
さらなる酵素活性を不活性化するために、可溶化された穀物ふすまをさらに処理する、請求項１−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、可溶化度が２０％以上、例えば、２５％以上、例えば、３０％以上、例えば、３５％以上、例えば、４０％以上、例えば、５０％以上、例えば、４０％−６０％の範囲、例えば、５０％−６０％の範囲である、請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、工程ｂ）から得られる可溶性画分中のアラビノキシランオリゴ糖（ＡＸＯＳ）の含有量が、２０％を越える、例えば、３０％を越える、例えば、４０％を越える、例えば、４５％を越える、例えば、５０％を越える、請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
穀物ふすま中の１％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の２％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の３％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の４％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の５％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の１０％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の１５−５０％以上のデンプンが、工程ｂ）から得られる可溶性画分中でイソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ）に変換される、請求項１−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、工程ｂ）から得られる可溶性画分中の修飾された脂質の含有量が、少なくとも約０．０５％、例えば、少なくとも約１．０％、例えば、０．０５−５％の範囲である、請求項１−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
工程ａ）の前に、ｉ）穀物を分画して、内胚乳、ふすま、および胚芽を得、ｉｉ）内胚乳、ふすま、および胚芽を分離および分配して、それらを処理可能にし、ｉｉｉ）ふすまを製粉する工程をさらに含む、請求項１−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
穀物ふすまが小麦、大麦、オート麦、ライ麦およびライコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される、請求項１−１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
得られた可溶化された穀物ふすまの乾燥の工程をさらに含む、請求項１−１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
得られた可溶化された穀物ふすまの噴霧乾燥の工程をさらに含む、請求項１−２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
得られた可溶化された穀物ふすまの凍結乾燥の工程をさらに含む、請求項１−２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項１−２２のいずれかに記載の方法により生産される可溶化された穀物ふすま。
【請求項２４】
食品の生産のための請求項２３に記載の可溶化された穀物ふすまの使用。
【請求項２５】
請求項１−５、７−２２のいずれかに記載の方法において得られる可溶化された穀物ふすまを、食品の生産における可溶性および不溶性穀物ふすま原料の混合物として直接加える、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
食品がパン、朝食用のシリアル、パスタ、ビスケット、クッキー、スナックおよびビールからなる群から選択される、請求項２４または２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
請求項２４−２６のいずれかに記載の使用により得られる食品。
【請求項２８】
ａ）１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素；１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素を含む酵素の組合せ、
ｂ）請求項１−２２のいずれかに記載の方法における使用のための指示書；および
ｃ）所望により食品のための他の成分
を含むパーツを含むキット。
【請求項１】
デンプンを含む穀物ふすまの可溶化のための方法であって、
ａ）相当量のデンプンを含む粒子穀物ふすまの液体懸濁液を調製し、
ｂ）液体懸濁液中に相当量のデンプンを含む該粒子穀物ふすまを、いずれの成分も除去することなく、任意の順番で連続して、または同時に、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素、１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素で処理する
工程を含む方法。
【請求項２】
粒子穀物ふすまを、１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素、および１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素を含む酵素の組合せで同時に処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該１つのさらなる酵素が１つまたはそれ以上のトランスグリコシル化酵素である、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
該１つのさらなる酵素がリパーゼ、例えば、ホスホリパーゼまたはガラクトリパーゼである、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
該１つのさらなる酵素がプロテアーゼである、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）から得られる可溶性画分を回収する工程をさらに含む、請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素がキシラナーゼおよびセルラーゼ、例えば、セロビオヒドロラーゼ、エンド−グルカナーゼおよびベータ−グルカナーゼからなる群から選択される、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該セルラーゼがエンド−セルラーゼ、エキソ−セルラーゼ、セロビアーゼ、酸化セルラーゼ、セルロースホスホリラーゼから選択される、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素がアルファ−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼおよびベータ−アミラーゼからなる群から選択される、請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該１つまたはそれ以上のトランスグリコシル化酵素が酵素クラスＥＣ３．２．１．２０の酵素からなる群から選択される、請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該粒子ふすまの平均粒径が３０００μｍ未満、例えば、１０００μｍ未満、例えば、５００μｍ未満である、請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該穀物ふすまを産業的製粉工程から得、５００μｍ未満、例えば、４００μｍ未満、例えば、２００μｍ未満の平均粒径を得るためにさらに製粉する、請求項１−１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
さらなる酵素活性を不活性化するために、可溶化された穀物ふすまをさらに処理する、請求項１−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、可溶化度が２０％以上、例えば、２５％以上、例えば、３０％以上、例えば、３５％以上、例えば、４０％以上、例えば、５０％以上、例えば、４０％−６０％の範囲、例えば、５０％−６０％の範囲である、請求項１−１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、工程ｂ）から得られる可溶性画分中のアラビノキシランオリゴ糖（ＡＸＯＳ）の含有量が、２０％を越える、例えば、３０％を越える、例えば、４０％を越える、例えば、４５％を越える、例えば、５０％を越える、請求項１−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
穀物ふすま中の１％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の２％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の３％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の４％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の５％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の１０％以上のデンプン、例えば、穀物ふすま中の１５−５０％以上のデンプンが、工程ｂ）から得られる可溶性画分中でイソマルトオリゴ糖（ＩＭＯ）に変換される、請求項１−１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
乾物 対 乾物ふすまで決定されるとき、工程ｂ）から得られる可溶性画分中の修飾された脂質の含有量が、少なくとも約０．０５％、例えば、少なくとも約１．０％、例えば、０．０５−５％の範囲である、請求項１−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
工程ａ）の前に、ｉ）穀物を分画して、内胚乳、ふすま、および胚芽を得、ｉｉ）内胚乳、ふすま、および胚芽を分離および分配して、それらを処理可能にし、ｉｉｉ）ふすまを製粉する工程をさらに含む、請求項１−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
穀物ふすまが小麦、大麦、オート麦、ライ麦およびライコムギ、イネおよびトウモロコシから選択される、請求項１−１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
得られた可溶化された穀物ふすまの乾燥の工程をさらに含む、請求項１−１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
得られた可溶化された穀物ふすまの噴霧乾燥の工程をさらに含む、請求項１−２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
得られた可溶化された穀物ふすまの凍結乾燥の工程をさらに含む、請求項１−２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項１−２２のいずれかに記載の方法により生産される可溶化された穀物ふすま。
【請求項２４】
食品の生産のための請求項２３に記載の可溶化された穀物ふすまの使用。
【請求項２５】
請求項１−５、７−２２のいずれかに記載の方法において得られる可溶化された穀物ふすまを、食品の生産における可溶性および不溶性穀物ふすま原料の混合物として直接加える、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
食品がパン、朝食用のシリアル、パスタ、ビスケット、クッキー、スナックおよびビールからなる群から選択される、請求項２４または２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
請求項２４−２６のいずれかに記載の使用により得られる食品。
【請求項２８】
ａ）１つまたはそれ以上の細胞壁修飾酵素；１つまたはそれ以上のデンプン修飾酵素、および所望により１つまたはそれ以上のさらなる酵素を含む酵素の組合せ、
ｂ）請求項１−２２のいずれかに記載の方法における使用のための指示書；および
ｃ）所望により食品のための他の成分
を含むパーツを含むキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５１４９８９（Ｐ２０１２−５１４９８９Ａ）
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４５７４０（Ｐ２０１１−５４５７４０）
【出願日】平成２２年１月１５日（２０１０．１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５０４４６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８１８７０
【国際公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【出願人】（５０８１２２２７５）ダニスコ・アクティーゼルスカブ (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１５日（２０１０．１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５０４４６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８１８７０
【国際公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【出願人】（５０８１２２２７５）ダニスコ・アクティーゼルスカブ (8)
【氏名又は名称原語表記】Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】
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