空のピコルナウイルスキャプシドを生成するための構築物
本発明は、宿主細胞において発現される場合、空のウイルスキャプシドを生成し得る構築物を提供し、上記構築物は、（ｉ）キャプシド前駆タンパク質をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）上記キャプシド前駆タンパク質を切断し得るプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列；および（ｉｉｉ）上記プロテアーゼの発現を制御する制御エレメントを含み、その結果、上記構築物が上記宿主細胞において存在する場合、上記制御エレメントは、上記プロテアーゼが上記キャプシド前駆タンパク質を切断するのに十分なレベルで発現させるが、上記宿主細胞において顕著な毒性を誘導するには十分でない。本発明はまた、このような構築物を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに空のウイルスキャプシドを生成するためのそれらの使用を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、宿主細胞において発現される場合、空のウイルスキャプシド、特に、空の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）キャプシドを生成し得る構築物に関する。本発明はまた、このような構築物を含むベクターおよび宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
口蹄疫（ＦＭＤ）
ＦＭＤは、非常に感染性で、経済的に甚大な被害をもたらす、偶蹄類の動物（偶蹄目）の疾患である。この疾患は、家畜化された反芻動物、ブタおよび多数の野生生物種に罹患する。
【０００３】
ＦＭＤは、世界中に広く分布している。先進領域（例えば、北米および中米、ならびに南極大陸の国々）およびオーストラリアおよびニュージーランドのような国々は、疾患から免れている一方で、ＦＭＤは、多くの発展途上国（例えば、サハラ砂漠以南のアフリカ、中東、南アジア、東南アジアおよび南米における国々）においては固有である。通常は疾患から免れている世界のいくつかの領域（例えば、ＦＭＤが１９８９年に根絶され、ワクチン接種が１９９１年以来中止された欧州）もまた存在する。しかし、ＰａｎＡｓｉａｎ Ｏ株に起因する疾患の特別な襲来（ｏｃｃａｓｉｏｎａｌ ｉｎｃｕｒｓｉｏｎ）（例えば、２００１年のＵＫ／ＥＩＲＥ／フランス／オランダの流行（非特許文献１）および２００７年の血清型Ｏ１ ＢＦＳ／１９６７のＵＫでの大発生もあった。
【０００４】
ＦＭＤの原因因子は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（ピコルナウイルス科のプラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルス）である。ＦＭＤＶは、７個の抗原性が異なる血清型、すなわち、Ａ、Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａ １、ならびにＳｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ Ｔｅｒｒｉｔｏｒｉｅｓ（ＳＡＴ） １、２および３として存在し、各血清型内に多くのサブタイプがある。
【０００５】
上記一本鎖ＲＮＡの翻訳は、ウイルスがコードするプロテアーゼによってその後プロセシングされて、ウイルスアセンブリおよび複製に必要とされる構造タンパク質および非構造タンパク質を生成するポリプロテインを生じる。リーダー（Ｌ）プロテアーゼは、シスもしくはトランスで、そのＣ末端において上記Ｐ１−２Ａキャプシド前駆体からそれ自体を切断する。上記２Ａプロテアーゼは、そのＣ末端においてそれ自体を切断して、Ｐ１−２ＡをＰ２から放出する。上記Ｐ１−２Ａのプロセシングは、上記３Ｃプロテアーゼによって実施されて、上記キャプシドタンパク質１ＡＢ（ＶＰ０としても公知）、１Ｃ（ＶＰ３）および１Ｄ（ＶＰ１）を生成する。ビリオンにおいて、１ＡＢの切断は、１Ａ（ＶＰ４）および１Ｂ（ＶＰ２）を生成するために起こる。
【０００６】
（ＦＭＤＶワクチン）
ＦＭＤに対する従来のワクチンは、化学的に不活性化された（通常は、アジリジン（例えば、バイナリーエチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）（ＢＥＩ）の使用によって）完全ウイルスビリオンからなる。
【０００７】
不活性化された完全ウイルスワクチンは、ＦＭＤを制御しかつ根絶するための作戦において重要な役割を果たす。しかし、ウイルス組織培養物から生成されたワクチンは、ワクチン製造の間にウイルス放出のリスクと関連する。ワクチン関連のＦＭＤ大発生をもたらす可能性を有する、上記ウイルスの不適切な不活性化のリスクもまた存在する。
【０００８】
これらリスクを低下させるために、ＦＭＤＶの空のキャプシド様粒子を使用する可能性が、考えられてきた。このような粒子は、上記ＦＭＤＶの構造タンパク質を含むが、非複製的かつ非感染性である。なぜなら、上記粒子は、ＲＮＡゲノムを有さないからである。上記空のキャプシドの外部構造は、野生型ウイルスと同じであるはずであるので、空のキャプシドは、同様に抗原性であり、免疫原性であるはずである。
【０００９】
空のＦＭＤキャプシド粒子を生成するためのいくつかの試みが行われてきたが、上記生成物の収率および安定性と関連した繰り返し発生する問題があった。
【００１０】
ワクチンウイルス発現系は、Ｐ１−２Ａ−３Ｃカセットを発現するために使用されてきた（非特許文献２）。上記カセットの構成的発現は、不成功に終わったが、ｖｖ／ＦＭＤＶ組換え体は、上記カセットがバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下で配置されたときに単離され得ることが見いだされた。しかし、このようなシステムは、空のキャプシドの長期間の発現のために使用できなかった。なぜなら、その後、上記Ｐ１−２Ａ−３Ｃカセットの毒性が、勝っているからである。一定のＴ７ Ｐｏｌ発現が、上記Ｐ１−２Ａ−３Ｃの生成を駆動するために必要とされるという論点もまたある。組織培養において小規模でこれを達成することは可能であるが、これを製造スケールに外挿することは不可能である。さらに、ワクシニア系において生成される生成物は、医療適用もしくは獣医学的適用には市販されていない。
【００１１】
非特許文献３は、カイコ−バキュロウイルス発現系におけるＦＭＤＶウイルスキャプシドタンパク質の発現を報告する。Ｐ１−２Ａおよび３Ｃのインタクトなコード領域の組換えウイルス発現を、カイコに接種するために使用し、その後、血リンパを、死につつあるカイコから集めた。これら「発現された抗原」の調製は、ウシにおいて抗ＦＭＤＶ抗体応答を引き起こすことを示した。しかし、上記「発現された抗原」の性質は、完全に不明であり、上記著者らは、空のキャプシドとは対照的に、それが「サブユニットワクチン」であると仮定するようである。
【００１２】
非特許文献４は、ＦＭＤＶの上記Ｐ１２Ａタンパク質および３Ｃタンパク質の遺伝子を個々のプロモーターから同時に発現する組換えバキュロウイルス系を記載する。上記キャプシドタンパク質が、３Ｃプロテアーゼによってある程度プロセシングされ、空のキャプシド粒子が、免疫電子顕微鏡によって観察され得ることを、ウェスタンブロッティングによって示した。空のキャプシドの粗製抽出物での免疫は、免疫応答を生じなかったが、ＦＭＤＶ特異的抗体および中和抗体のレベルは、従来の不活性化ワクチンより低かった。これは、空のキャプシド粒子のレベルを低下させることに起因すると推定される。さらなる研究から、タンパク質発現の量および昆虫細胞における空のキャプシドアセンブリを改善するために必要とされることが結論づけられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｎｏｗｌｅｓら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ．（２００１）１４８．２５８〜２５９
【非特許文献２】Ａｂｒａｈａｍｓら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）７６：３０８９〜３０９８
【非特許文献３】Ｌｉら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２００８）２８：３（５）ｅ２２７３
【非特許文献４】Ｃａｏら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）１３７：１０〜１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、免疫原性の安定な生成物を合理的な収量で生成する、空のウイルスキャプシドを生成するための改善された方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の局面の要旨）
本発明者らは、驚くべきことに、ＦＭＤＶの空のキャプシド生成と歴史的に関連してきた低収量の理由は、上記３Ｃプロテアーゼのレベルが上記宿主細胞において高すぎる（これは毒性を引き起こす）ことであるということを見いだした。空のキャプシド粒子を高収量で生成するために、上記キャプシドタンパク質前駆体を切断するには十分発現され／活性であるが、上記宿主細胞において毒性を誘導するレベルでは発現されず／活性でないように、上記３Ｃプロテアーゼの発現および／もしくは活性のバランスをとることは必要である。
【００１６】
従って、第１の局面において、本発明は、宿主細胞において発現される場合に、空のウイルスキャプシドを生成し得る構築物を提供し、上記構築物は、
（ｉ）キャプシド前駆タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記キャプシド前駆タンパク質を切断し得るプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）上記プロテアーゼの発現を制御する制御エレメント
を含み、
その結果、上記構築物が上記宿主細胞に存在する場合、上記制御エレメントは、上記プロテアーゼが、上記キャプシド前駆タンパク質を切断するのに十分であるが、上記宿主細胞において顕著な毒性を誘導するには十分でないレベルで発現させる。
【００１７】
上記制御エレメントは、レトロウイルスに由来し得る。特に、上記制御エレメントは、レトロウイルスフレームシフト部位（例えば、ＨＩＶ−１ フレームシフト部位）であり得る。上記ＨＩＶ−１ フレームシフト部位は、翻訳されるｍＲＮＡのうちの約５％においてフレームシフトを引き起こす。
【００１８】
上記フレームシフト部位は、上記キャプシド前駆タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、上記プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列との間に位置し得、その結果、上記構築物が翻訳されるとき、
（１）リボソームがフレームシフトを受けない場合、上記構築物は、（上記キャプシド前駆タンパク質を含むが上記プロテアーゼを含まない）短縮型生成物を生成する；しかし
（２）リボソームがフレームシフトを受ける場合、上記キャプシド前駆タンパク質および上記プロテアーゼの両方が翻訳される。
【００１９】
本発明の第１の局面の構築物において、上記プロテアーゼの活性はまた、低下させられ得る。例えば、上記プロテアーゼは、そのキャプシド前駆タンパク質切断活性を低下させる少なくとも１個の変異を含み得る。
【００２０】
上記プロテアーゼ（例えば、変異プロテアーゼ）は、野生型プロテアーゼより約３分の１のキャプシド前駆タンパク質切断活性を有し得る。
【００２１】
発明の第１の局面に従う構築物を含む宿主細胞によって生成される空のキャプシドは、ピコルナウイルスキャプシド（例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）キャプシド）であり得る。
【００２２】
空のＦＭＤＶキャプシドを生成するために、上記前駆タンパク質は、Ｐ１であり得、上記プロテアーゼは、３Ｃであり得る。上記３Ｃプロテアーゼの活性を低下させるために、上記３Ｃプロテアーゼは、例えば、Ｃｙｓ１４２において変異を含み得る。
【００２３】
第２の局面において、本発明は、本発明の第１の局面に従う構築物を含むベクターを提供する。上記ベクターは、例えば、バキュロウイルス移入ベクター（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ）；ＤＮＡベクター、プラスミドもしくはウイルスベクターであり得る。
【００２４】
第３の局面において、本発明は、本発明の第１の局面に従う構築物を含む宿主細胞を提供する。第１の実施形態において、上記宿主細胞は、本発明の第２の局面に従うベクターを生成し得る。第２の実施形態において、上記宿主細胞は、空のウイルスキャプシドを生成し得る。
【００２５】
上記宿主細胞は、例えば、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞であり得る。
【００２６】
本発明のさらなる局面は、
（ｉ）本発明の第１の局面に従う構築物を宿主細胞において発現することによって、空のウイルスキャプシドを生成し、上記宿主細胞によって生成された空のウイルスキャプシドを採取するための方法；
（ｉｉ）このような方法によって空のウイルスキャプシドを生成し、ワクチンに上記空のウイルスキャプシドを組み込むことによって、ワクチンを生成するための方法；
（ｉｉｉ）空のキャプシドがインビボで生成されるように、本発明の第１の局面に従う構築物を上記被験体において発現することによる、被験体における疾患を処置および／もしくは予防するための方法；
（ｉｖ）疾患の予防および／もしくは処置において使用するための、本発明の第１の局面に従う構築物もしくは本発明の第２の局面に従うベクター；
（ｖ）疾患の予防および／もしくは処置のための医薬の製造における、本発明の第１の局面に従う構築物、もしくは本発明の第２の局面に従うベクターの使用；
（ｖｉ）ピコルナウイルスタンパク質の発現を制御するためのレトロウイルス制御エレメントの使用；ならびに
（ｖｉｉ）レトロウイルス制御エレメントの制御下で、ピコルナウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む構築物
に関する。
【００２７】
「空のキャプシド」ベースのワクチンは、伝統的な不活性化完全病原体ワクチン（例えば、ＦＭＤに関する）より有利である。なぜなら、それは、製造のために高い安全性の封じ込め施設を必要とせず、従って、ウイルスが「漏れ出る」いかなるリスクをも軽減するからである。上記ワクチンはまた、非感染性であり、取り扱いやすく、（本発明に鑑みれば）調製するのに容易かつ安価である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、発現ベクターｐＯＰＩＮＥ５９４９−ＦＳである。上記ベクターは、市販のベクターｐＴｒｉＥｘ１．１（ＥＭＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の誘導体であるが、シームレスクローニングのために改善された。上記ベクターの顕著な特徴および診断的制限部位の部位は、示されている。ＦＭＤＶの空のキャプシドの成功裏の発現に必要な重要な工程は、上記特有のＮｏｔＩ制限部位とＢｓｕ３６Ｉ制限部位との間の上記３Ｃコード領域の前に上記ＨＩＶ−１ フレームシフト部位をコードする配列を導入することである。結果として、上記ｐ１０もしくはＣＭＶプロモーターに由来するすべてのｍＲＮＡは、上記Ｐ１前駆タンパク質を翻訳するが、上記３Ｃプロテアーゼを一部翻訳するのみである。組換えバキュロウイルスを形成するように使用される場合、ＯＲＦ６０３とＯＲＦ１６２９へと時計回りの間の配列は、上記ウイルスゲノムと組換わる。次いで、上記Ｐ１０プロモーターは、感染した細胞において組換え生成物を生成する上記バキュロウイルス感染サイクルの一部として活性化される。
【図２】図２は、Ｐ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ（右側トラック）もしくはＰ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ１６３Ｓ（左側トラック）をコードする組換えバキュロウイルスの間の発現レベルの比較を示す。３Ｃ活性の不活性化は、Ｐ１の豊富な合成を奪回する。
【図３】図３は、上記Ｐ１−３Ｃ接合点においてフレームシフトを引き起こすために使用される配列を示す。その重要な特徴は、ずれが起こり、続いて、上記リボソームを小休止させるので、上記ずれを促進する偽ノットが起こる一連のウラシル（下線を付した）である。
【図４】図４は、上記ＦＭＤＶ配列への上記ＨＩＶ−１フレームシフト配列の導入を示す。上記Ｐ１リーディングフレームは、２つのうちの上側であり、挿入は、赤で印がつけられた終止コドンにおいて上記翻訳された生成物の短縮を生じる。その挿入された配列（オレンジ色のボックス）の始まりにおけるＡ−１フレームシフトは、３Ｃ翻訳（下側のフレーム）を含むように上記リーディングフレームの修正を生じる。
【図５】図５は、残基１４２において変異した３Ｃプロテアーゼのインビトロ活性測定を示す。１４２Ｔおよび１４２Ｓはともに、その親配列と比較した場合に低下した活性を有することに注意する。
【図６】図６は、ピコルナウイルス系統発生を示す。密接に関連したファミリーは、共通のコードストラテジーおよび複製サイクルを共有する；十分に研究されたウイルス（例えば、ポリオウイルス（ＰＶ）および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ））に関して観察されてきたものは、他のメンバーに対しても適用されてきた。完全な系統発生および考察は、以下において見いだされ得る：Ｈｕｇｈｅｓ ＡＬ．（２００４）Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｇｅｎｅｔ Ｅｖｏｌ．４：１４３−５２。
【図７】図７は、図１における発現カセットの直線上のマップおよびその考えられる翻訳生成物を示す。上記Ｐ１生成物およびＰ１−２Ａ−３Ｂ−ＦＳ−３Ｃ生成物の翻訳の示唆される相対レベルは、文献から理解され、経験的に決定されなかった。
【図８】図８は、上記３Ｃプロテアーゼの毒性を示す。昆虫細胞に、３Ｃに連結された上記ＦＭＤＶ Ｐ１を発現する組換えバキュロウイルスを感染させた。Ａにおいて、トラック１は、残基１６３の活性部位Ｃｙｓにおける変異体であり、Ｐ１へ自発的に分解する上記Ｐ１−３Ｃ融合タンパク質の豊富な合成は明らかである。トラック２は、野生型プロテアーゼであり；上記成熟キャプシドタンパク質ＶＰ１のＰ１の合成がほとんどないことは明らかである。Ｂにおいて、Ｐ１を発現する組換えウイルス（トラック１）および弱毒化された３Ｃに連結されたＰ１を発現する組換えウイルス（トラック２）が比較される。ここでは、高レベルの合成が維持され、上記Ｐ１前駆体は、上記成熟キャプシドタンパク質ＶＰ１に化学量論的に変換される。細胞溶解物を、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そのウェスタンブロットを、多価ＦＭＤＶ抗血清でプローブした。ここで大部分の反応性は、ＶＰ１に対するものである。ＶＰ０およびＶＰ３のモル量も示されるが、この血清によっては明らかにされない。
【図９】図９は、空のＦＭＤＶキャプシドのアセンブリを示す。上記３Ｃプロテアーゼ活性の改変が達成された、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞に由来する上記発現生成物のスクロース勾配分析。いくつかのプロセシングされていないＰ１前駆体（おそらく、集合した）は、上記勾配のそこに存在するのに対して、上記ＶＰ１切断生成物は、３５〜４５％ スクロース画分において強くて幅広いピークを形成する。
【００２９】
上記勾配における位置は、アセンブリされた粒子が予測され、可溶性抗原ではない。
【図１０】図１０は、バキュロウイルス発現によって生成される空のＦＭＤＶ Ａ血清型 キャプシドの視覚化を示す。スクロース勾配からのピーク画分をプールして濃縮し、その後、炭素コーティングしたｆｏｒｍｖａｒ ｇｒｉｄに吸着させ、酢酸ウラニルでネガティブ染色した。直径２５ｎｍを有する多くの粒子が見られた（２個の矢印をつけた）。粒子内部の染色は、これらが空であることを示すことに注意する。二十面体構造と一致した特に良好な角度の定義を示す粒子は、赤の矢印をつけている。
【図１１】図１１は、バキュロウイルス発現によって生成される空のＦＭＤＶ Ｏ血清型のキャプシドの視覚化を示す。
【図１２】図１２は、合成キャプシドでの免疫に応答したモルモットの特異的抗体の誘導を示すグラフである。その抗体力価を、（Ａ）ウイルス中和試験、および（Ｂ）液相ブロッキングＥＬＩＳＡを使用して測定した。上記合成Ａ血清型 キャプシドでのモルモットの免疫は、以前の研究において防御的であることが示されたレベルと一致した抗体力価の誘導を生じる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（詳細な説明）
（構築物）
本発明の第１の局面において、本発明は、
（ｉ）キャプシド前駆タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記キャプシド前駆タンパク質を切断し得るプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）上記プロテアーゼの発現を制御する制御エレメント
を含む構築物を提供する。
【００３１】
用語「ヌクレオチド配列」とは、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列を含む。それは、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。それは、例えば、ゲノム配列であってもよいし、組換え配列であってもよいし、ｍＲＮＡ配列であってもよいし、ｃＤＮＡ配列であってもよい。
【００３２】
上記構築物は、ヌクレオチド配列である（ｉ）および（ｉｉ）を（おそらく、連続的な様式で）含むヌクレオチド配列であり得る。ヌクレオチド配列（ｉ）とヌクレオチド配列（ｉｉ）との間には配列の部分があり得る。上記制御エレメントは、その配列の部分に存在し得、その結果、それは、上記プロテアーゼの発現を制御するが、上記キャプシド前駆タンパク質の発現を制御せず、その発現に影響も与えない。
【００３３】
上記構築物は、プラスミド、移入ベクター、もしくは宿主細胞ゲノムの一部として存在し得る（以下を参照のこと）。
【００３４】
（制御エレメント）
本発明の第１の局面の構築物は、上記プロテアーゼの発現を制御する制御エレメントを含む。上記制御エレメントは、例えば、上記プロテアーゼの転写および／もしくは翻訳を少なくとも部分的に制御し得る。
【００３５】
具体的には、上記制御エレメントは、上記プロテアーゼが上記キャプシド前駆タンパク質を切断するのに十分であるが、上記宿主細胞において顕著な毒性を誘導するには十分でないレベルで発現させる。
【００３６】
上記キャプシド前駆タンパク質の切断は、当該分野で公知の技術を使用して分析され得る。例えば、宿主細胞からの組換えタンパク質抽出物は、ゲル電気泳動によって分離され得、その分離されたタンパク質は、ウェスタンブロッティングのためにニトロセルロース膜に転写される。抗ウイルス抗体でのウェスタンブロッティングは、プロテアーゼ媒介性切断の程度（ｄｅｇｒｅｅ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｔ）を明らかにするはずである。
【００３７】
例えば、ＦＭＤＶに関しては、上記プロセシングされていないキャプシド前駆タンパク質（Ｐ１−Ｐ２Ａ）は、８１ｋＤａのバンドとして現れ、切断は、ＶＰ３１（４７ｋＤａ）、ＶＰ３（２４ｋＤａ）および／もしくはＶＰ１（２４ｋＤａ）を生成し得る。
【００３８】
上記キャプシド前駆タンパク質の切断はまた、空のキャプシドの生成によって推論され得る（以下を参照のこと）。
【００３９】
上記プロテアーゼによって誘導される上記宿主細胞における細胞傷害性の程度はまた、当該分野で公知の技術を使用して分析され得る。例えば、トリパンブルー排除は、例えば、０．４％ トリパンブルーと細胞とを等量混合し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動化細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって測定される場合に、生存性のレベルを定義することによって使用され得る。
【００４０】
上記毒性のレベルは、上記宿主細胞のうちの１０％未満、５％未満もしくは２％未満が、上記プロテアーゼによって非生存性にされる場合には、「顕著」であるとはみなされない。上記毒性のレベルは、上記宿主細胞が、上記３Ｃタンパク質の同時発現の非存在下（上記プロテアーゼによる上記キャプシド前駆タンパク質の切断の効果を無視する）で達成されるレベルの８０％、９０％もしくは９５％で上記キャプシド前駆タンパク質を発現し得る場合、「顕著」であるとみなされない。
【００４１】
上記制御エレメントは、上記制御エレメントが存在しない場合に生じる発現のレベルと比較して、上記３Ｃプロテアーゼの発現を低下させ得る。
【００４２】
上記制御エレメントは、ｍＲＮＡを読む場合のパーセンテージにおいて、少なくとも１個の塩基で上記翻訳中のリボソームにスキップ（もしくは反復）させるフレームシフト部位であり得る。フレームシフトする間に、翻訳中のリボソームは、転写物中の異なる点において前もしくは後ろへと１ヌクレオチドスライドするように誘導され得、次いで、タンパク質合成は、それぞれ、その＋１もしくは−１のリーディングフレームにおいて続き得る。
【００４３】
プログラムされた−１リボソームフレームシフトシグナルは、十分に特徴付けられており、いくつかの細菌の−１フレームシフト事象もまた、報告された。多くのウイルス感染真核生物細胞が、プログラムされた−１リボソームフレームシフトを利用する。このことは、上記フレームシフトプロセスに関与するシスエレメントが、真核生物において機能することを示す。ウイルス系において、フレームシフトの効率は、上記ウイルスの効率的拡大のために堅調に維持されなければならない合成されたウイルスタンパク質生成物の化学量論の本質的な決定因子である。
【００４４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１は、ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌポリプロテインの必要とされる割合を生成するためにリボソームフレームシフトを使用する。上記フレームシフトシグナルのステム−ループ構造は、上記リボソームを妨げると考えられ、その５’方向においてずれを引き起こし、これは、上記−１フレームシフトを引き起こし、次いで、翻訳は、新たなフレームにおいて続く（図３を参照のこと）。
【００４５】
上記制御エレメントは、上記翻訳されるｍＲＮＡのうちの１〜２０％の間、１〜１０％の間、３〜７％の間もしくは約５％でフレームシフトを引き起こし得る。
【００４６】
上記フレームシフト配列は、一連の約６個のウラシルを含み得、ここでずれが起こり、続いて、上記リボソームが小休止し、上記ずれを促進するようにする偽ノットを形成し得る配列が生じる。
【００４７】
上記制御エレメントは、上記プロテアーゼコードヌクレオチド配列の上流かつ上記キャプシド前駆タンパク質コード配列の下流に存在し得る。
【００４８】
（空のキャプシド）
「空のキャプシド」は、ウイルスの上記タンパク質殻を含むが、上記ＲＮＡゲノムもしくはＤＮＡゲノムを欠いている実体である。空のキャプシドは、野生型ワクチンと同じ様式において抗原性でありかつ免疫原性であるはずである。なぜなら、上記空のキャプシドは、同じ構造エピトープを保持するが、上記ゲノムの欠如に起因して、感染を生じないはずだからである。
【００４９】
上記空のキャプシドの生成は、当該分野で公知の技術（例えば、スクロース密度遠心分離もしくは電子顕微鏡（上記のようにＡｂｒａｈａｍｓら（１９９５））を使用して調査もしくは確認され得る。
【００５０】
野生型ウイルス上の立体エピトープに対して特異的であるモノクローナル抗体が、上記空のキャプシドの抗原性が保持されるか否かを調査するために、使用され得る。
【００５１】
（プロテアーゼ）
上記プロテアーゼは、キャプシドの生成およびアセンブリの工程としてキャプシド前駆タンパク質を切断する任意のウイルスプロテアーゼであり得る。
【００５２】
上記で言及されるように、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）に関して、上記前駆体Ｐ１の、ＶＰ０（ＶＰ２＋ＶＰ４）、ＶＰ３およびＶＰ１へのタンパク質分解的なプロセシングは、上記ウイルスプロテアーゼ３Ｃもしくはその前駆体３ＣＤによって起こる。
【００５３】
ＦＭＤＶタイプＡ株に由来するＦＭＤＶ野生型３Ｃプロテアーゼの配列は、以下に示される：
【００５４】
【化１】
上記３Ｃプロテアーゼの結晶構造は、解明されており、変異誘発分析は、活性部位に関する情報を提供するために行われた（Ｓｗｅｅｎｅｙら（２００７） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１１５−１２４）。
【００５５】
本発明の第１の局面の構築物は、そのキャプシド前駆タンパク質切断活性を低下させる少なくとも１個の変異を含み得る。
【００５６】
上記変異は、例えば、上記プロテアーゼの活性部位中に存在し得る。残基１６３、残基４６および残基８４から構成される活性部位において触媒性の三つ組みが存在すると考えられている。上記変異は、これら残基のうちの１個以上の欠失もしくは置換を含み得る。上記変異は、上記キャプシド前駆タンパク質切断活性を低下させるはずであるが、完全には破壊しないはずである。
【００５７】
上記３Ｃプロテアーゼの結晶構造から、上記ペプチド結合裂け目を折りたたみ、基質認識に寄与するβ−リボンがあることが明らかにされた（Ｓｗｅｅｎｅｙら（２００７）（上記のとおり））。上記変異は、例えば、上記β−リボン（残基１３８〜１５０）中に存在し得る。上記変異は、例えば、残基１４２における置換であり得る。上記変異は、Ｃ１４２Ｖ、Ｃ１４２ＡもしくはＣ１４２Ｔ変異であり得る。上記変異は、Ｃ１４２Ｔ変異であり得る。
【００５８】
上記変異は、３倍〜２倍の間、もしくは３倍〜１．５倍の間まで上記酵素についての特異性定数を低下させ得る。例えば、上記野生型酵素の特異性定数が９９０ｋｃａｔ／Ｋｍである場合、上記変異酵素についての特異性定数は、４９５〜３３０ｋｃａｔ／Ｋｍの間、もしくは６６０〜３３０ｋｃａｔ／Ｋｍの間であり得る。
【００５９】
変異体である上記プロテアーゼは、上記野生型プロテアーゼと比較して、上記キャプシド前駆タンパク質切断活性のうちの１０〜５０％、２０〜４０％もしくは約３０％を有し得る。
【００６０】
（キャプシド前駆タンパク質）
上記キャプシド前駆タンパク質は、（ピコルナウイルスについては）Ｐ１であり得る。これは、上記３Ｃプロテアーゼによって、ＶＰ０、ＶＰ３およびＶＰ１へと切断される。
【００６１】
あるいは、上記キャプシド前駆タンパク質は、Ｐ１−２Ａであり得る。上記２Ａ プロテアーゼは、そのＣ末端においてそれ自体を切断して、Ｐ１−２ＡをＰ２から放出する。
【００６２】
上記キャプシド前駆タンパク質は、空のキャプシド（の一部）を形成するために上記プロテアーゼによって切断可能であり得る。上記前駆タンパク質は、プロテアーゼ切断によって生成され得る空のキャプシドを形成するために必要なタンパク質のタイプのすべてを含み得る。
【００６３】
（ベクター）
第２の局面において、本発明は、本発明の第１の局面に従う構築物を含むベクターを提供する。
【００６４】
上記ベクターは、例えば、プラスミド、またはバキュロウイルス移入ベクター、ＤＮＡベクターもしくはウイルスベクターであり得る。
【００６５】
上記ベクターは、上記構築物を宿主細胞に移入し得る。
【００６６】
上記ベクターは、上記構築物を植物、昆虫もしくは動物細胞に移入し得る。
【００６７】
上記バキュロウイルス発現系は、ウイルスおよびウイルス様粒子の生成に広く使用されている。
【００６８】
本発明のベクターは、例えば、上記バキュロウイルスシャトルベクターが増殖される細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用される１個以上の移入プラスミドであり得る。
【００６９】
本発明の第１の局面の構築物は、上記移入ベクターからバキュロウイルスシャトルベクター（バクミド）へのＤＮＡの部位特異的転移によって生成される組換えバキュロウイルスＤＮＡであってもよいし、これを含んでいてもよい。このＤＮＡは、昆虫細胞へとトランスフェクトされて、組換えバキュロウイルスを生成し得る。
【００７０】
本発明のベクターは、得られた組換えバキュロウイルスであり得る。
【００７１】
他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
レトロウイルスは、遺伝子治療アプローチにおいて一般に使用される。上記組換えレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、安定な様式で宿主ゲノムへと組み込む能力を有する。それらは、上記宿主ゲノムへの組み込みを可能にする逆転写酵素を含む。レトロウイルスベクターは、多くのＦＤＡが承認した臨床試験（例えば、ＳＣＩＤ−Ｘ１臨床試験）において使用されてきた。
【００７３】
レトロウイルス（例えば、モロニーレトロウイルス）の使用の主な欠点は、細胞が形質導入のために活発に分裂することが要件であることを含む。結果として、細胞（例えば、ニューロン）は、レトロウイルスによる感染および形質導入に非常に抵抗性である。
【００７４】
レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスである。それらは、近年、分裂していない細胞のゲノムに組み込むそれらの能力に起因して、遺伝子送達ビヒクル（ベクター）として適合させられてきた。ＲＮＡの形態にある上記ウイルスゲノムは、上記ウイルスが上記細胞に入って、ＤＮＡを生成する場合に逆転写され、次いで、これは、上記ウイルスインテグラーゼ酵素によってランダムな位置においてゲノムへと挿入される。上記ベクター（ここでは、プロウイルスといわれる）は、上記ゲノム中に維持され、細胞が分裂する場合に、上記細胞の子孫へと伝えられる。
【００７５】
安全性の理由から、レンチウイルスベクターは、それらの複製に必要とされる遺伝子を決して保持しない。レンチウイルスを生成するために、いくつかのプラスミドが、いわゆるパッケージング細胞株（一般には、ＨＥＫ ２９３）へとトランスフェクトされる。１個以上のプラスミド（一般には、パッケージングプラスミドといわれる）は、ビリオンタンパク質（例えば、上記キャプシドおよび上記逆転写酵素）をコードする。別のプラスミドは、上記ベクターによって送達されるべき遺伝物質を含む。このプラスミドは、一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムを生成するために転写され、ψ（ｐｓｉ）配列の存在によって示される。この配列は、上記ビリオンへと上記ゲノムをパッケージするために使用される。
【００７６】
レンチウイルスとは対照的に、アデノウイルスＤＮＡは、上記ゲノムへと組み込まれず、細胞分裂の間に複製されない。それらの主な適用は、遺伝子治療およびワクチン接種にある。人は、一般に、アデノウイルス（これは、呼吸器感染胃腸感染および眼の感染を引き起こす）と接触した状態にあるので、上記アデノウイルスは、潜在的には危険な結果を伴う急激な急速な免疫応答を誘発する。この問題を克服するために、科学者らは、ヒトが免疫を有さないアデノウイルスを現在調査している最中である。
【００７７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよびいくつかの他の霊長類の種に感染する小さなウイルスである。ＡＡＶは、疾患を引き起こすとは現在のところ知られておらず、それゆえ、上記ウイルスは、非常に軽度の免疫応答を引き起こす。ＡＡＶは、分裂している細胞にも分裂していない細胞にも感染し得、そのゲノムを上記宿主細胞のゲノムへと組み込み得る。これら特徴は、ＡＡＶを、遺伝子治療用のウイルスベクターを作り出すための非常に魅力的な候補にしている。
【００７８】
（宿主細胞）
本発明はまた、本発明の第１の局面の構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００７９】
上記宿主細胞は、本発明の第２の局面に従うベクター（例えば、ウイルスベクター）を生成し得る能力がある。
【００８０】
上記宿主細胞は、ウイルスベクターを生成し得る、パッケージング細胞もしくはプロデューサー細胞であり得る。
【００８１】
上記宿主細胞は、本発明の第２の局面に従う組換えバキュロウイルスを生成し得るＳｆ９昆虫細胞であり得る。
【００８２】
上記宿主細胞は、空のウイルスキャプシドを生成し得る。
【００８３】
上記宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞もしくは動物細胞であり得る。
【００８４】
（生成方法）
本発明は、空のウイルスキャプシドを生成するための方法を提供し、上記方法は、以下の工程：
（ｉ）本発明の第１の局面に従う構築物を宿主細胞において発現させる工程；および
（ｉｉ）上記宿主細胞によって生成される空のウイルスキャプシドを採取する工程
を含む。
【００８５】
本発明の構築物は、例えば、本発明の第２の局面のベクターでのトランスフェクションもしくは形質導入によって、上記宿主細胞 へと導入され得る。
【００８６】
上記空のウイルスキャプシドが、上記宿主細胞の外側で発現される場合、それらは、上清から採取され得る。
【００８７】
上記空のウイルスキャプシドが、上記宿主細胞の内部で発現される場合、それらは、例えば、
（ｉ）上記宿主細胞の溶解（例えば、凍結融解による）；ならびに、必要に応じて、
（ｉｉ）濃縮（例えば、ＰＥＧ沈殿による）、および／または
（ｉｉｉ）精製
によって採取され得る。
【００８８】
本発明はまた、このような方法によって空のウイルスキャプシドを生成する工程および上記空のウイルスキャプシドをワクチンに組み込む工程を含む、ワクチンを生成するための方法を提供する。
【００８９】
上記ワクチンはまた、薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバントもしくは賦形剤を含み得る。
【００９０】
（ウイルス）
本発明は、特定のウイルスの空のキャプシドの生成に関する。
【００９１】
上記ウイルスは、例えば、ピコルナウイルスであり得る。
【００９２】
ピコルナウイルス属、種および血清型の例は、表１に示される：
【００９３】
【表１−１】
【００９４】
【表１−２】
コモウイルス科（コモウイルス属、ファバウイルス属、およびネポウイルス属）、セキウイルス科（セキウイルス属およびワイカウイルス属）および多くのまだ割り当てられていない属（ケラウイルス（Ｃｈｅｒａｖｉｒｕｓ）、サドワウイルスおよびトラドウイルス（Ｔｏｒｒａｄｏｖｉｒｕｓ）（タイプ種 トマトトラドウイルス））を含むセコウイルス上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｓｅｃｏｖｉｒｉｄａｅ）へと分類されてきた植物ピコルナウイルスもまた存在する。
【００９５】
上記ウイルスは、蜂ウイルス（例えば、イスラエル急性麻痺ウイルス；カシミア蜂ウイルス；カクゴウイルス；ミツバチヘギイダニウイルス；サックブルードウイルス；奇形羽ウイルス）であり得る。すべてのこのようなウイルスは、蜂コロニーの喪失と関連してきたので、上記コロニー喪失の原因を決定するために診断試験が必要である。
【００９６】
上記ウイルスは、動物の病原体（例えば、ＦＭＤＶもしくはブタ水疱病ウイルス）であり得る。上記ウイルスは、ヒト病原体（例えば、エンテロウイルス７１（これは、下痢の大発生を引き起こす）；コクサッキーウイルスＢウイルス（糖尿病および心筋炎を引き起こす）、もしくはポリオウイルスであり得る。
【００９７】
（天然の状態において）ヒトもしくは動物の病原体として作用するウイルスの空のキャプシド生成は、ワクチンおよび治療用組成物の生成に重要である。
【００９８】
（ワクチン）
用語「ワクチン」とは、本明細書で使用される場合、被験体に投与される場合に、防御免疫応答を誘導もしくは刺激する調製物をいう。ワクチンは、生物に特定の疾患に対して免疫をつけ得る。
【００９９】
上記ワクチンは、治療的に使用されて、現存の感染を処置し得る；もしくは予防的に使用されて、感染の可能性をブロックもしくは低下させ得るか、そして／または上記疾患にかかる可能性を予防もしくは低下させ得る。
【０１００】
ワクチンは、１種以上のワクチン接種する実体、ならびに必要に応じて、１種以上のアジュバント、賦形剤、キャリアおよび希釈剤を含む。
【０１０１】
上記ワクチンはまた、別の活性因子（例えば、上記ワクチン接種する実体が誘導した適応免疫応答の前に初期の防御を刺激し得るもの）を含んでいてもよいし、上記別の活性因子を発現してもよい。上記因子は、抗ウイルス剤（例えば、タイプＩインターフェロン）であり得る。代わりに、もしくは加えて、上記因子は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり得る。
【０１０２】
上記ワクチン接種する実体は、例えば、本発明の第１の局面の構築物、本発明の第２の局面のベクター、もしくは本発明の第３の局面の宿主細胞によって生成される空のキャプシドによってであり得る。
【０１０３】
ＤＮＡワクチン接種は、タンパク質ベースのワクチンを超えるいくつかの利点を有する。例えば、ＤＮＡワクチンは、インビボで上記抗原の内因性発現を生じ、抗原性ペプチドがＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ経路の両方を介して免疫系に提示されることを可能にし、それによって、ＣＤ４＋ Ｔ細胞のみならず、ＣＤ８＋ Ｔ細胞もまた刺激する。従って、ＤＮＡワクチンは、液性免疫応答および強力な細胞性免疫応答の両方を誘導し得る。ワクチンとしてのプラスミドＤＮＡの使用はまた、細菌プラスミド骨格およびＴｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）における非メチル化ＣｐＧモチーフを介して、上記宿主の先天的免疫系を誘発し得る。
【０１０４】
上記ワクチンは、ＭＨＣおよびサイトカイン分泌をダウンレギュレートすることによって、細胞性免疫応答を妨害し得る非構造タンパク質コード遺伝子２Ｂおよび２Ｃを欠いていてもよい（Ｍｏｆｆａｔら，（２００５） Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７９．４３８２−９５およびＭｏｆｆａｔら，（２００７） Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８１．１１２９−３９）。
【０１０５】
多くの市販のＦＭＤワクチンは、異なるＦＭＤ血清型に対する網羅を提供するように多価である。その上、本発明のワクチンは、複数のワクチン接種する実体（各々は、異なる血清型および／もしくは所定の血清型内の異なるサブタイプに指向される）を含み得る。
【０１０６】
（疾患の処置／予防）
本発明はまた、有効量のそのようなワクチンの投与によって、被験体における疾患を処置および／もしくは予防するための方法を提供する。
【０１０７】
用語「予防する」とは、上記疾患への罹患を防ぐか、遅らせるか、妨げるかもしくは邪魔をすることに言及することが意図される。上記ワクチンは、例えば、感染性ウイルスが細胞に入る可能性を妨げ得るかもしくは低下させ得る。
【０１０８】
「処置する」とは、本明細書で使用される場合、上記疾患を改善するか、治療するか、もしくは上記疾患の症状を軽減するために、または上記疾患の進行を衰えさせるかもしくは停止させるために、罹患した被験体に関するケアに言及する。それはまた、上記ウイルスが感染した被験体を他の被験体に対して非感染性にする処置にも言及する。
【０１０９】
上記被験体は、上記疾患にかかりやすい任意の動物もしくは植物であり得る。上記被験体は、ヒト、昆虫（例えば、蜂）、植物、哺乳動物もしくは他の動物であり得る。
【０１１０】
ＦＭＤに関しては、上記被験体は、偶蹄類の動物であり得る。ＦＭＤ感受性の動物としては、家畜の中では、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびヤギ、ならびにラクダ科の動物（ラクダ、ラマ、アルパカ、グアナコおよびビクーニャ）が挙げられる。いくらかの野生動物（例えば、ハリネズミ、ヌートリア、および任意の野生の偶蹄類の動物（例えば、シカおよび動物園の動物（ゾウが挙げられる）））もまた、ＦＭＤにかかり得る。
【０１１１】
（投与）
非ウイルス性遺伝子送達の方法は、物理的アプローチ（キャリアなしの遺伝子送達）および化学的アプローチ（合成ベクターベースの遺伝子送達）を使用する工程を包含する。物理的アプローチ（針注入、エレクトロポレーション、遺伝子銃、超音波、および流体力学的送達が挙げられる）は、細胞膜に浸透し、細胞内遺伝子移入を促進する物理的力を使用する。上記化学的アプローチは、合成化合物もしくは天然に存在する化合物をキャリアとして使用して、上記ヌクレオチド配列を細胞内に送達する。
【０１１２】
最も適した送達法は、上記ヌクレオチド配列を標的細胞に送達するために使用される送達系に依存する。例えば、プラスミド投与に関しては、上記プラスミド調製物は、筋肉内に、皮内に、もしくは上記の組み合わせで投与され得る。
【０１１３】
ウイルスベクターは、当該分野で公知の方法（例えば、直接注射）によって被験体に投与され得る。
【０１１４】
（ピコルナウイルスタンパク質のレトロウイルス制御）
本発明はまた、ピコルナウイルスタンパク質の発現を制御するためのレトロウイルス制御エレメントの使用、レトロウイルス制御エレメントの制御下でピコルナウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む構築物に関する。
【０１１５】
上記レトロウイルス制御エレメントは、レトロウイルスフレームシフト部位（例えば、そのウイルスにおけるＧａｇおよびＧａｇ−ｐｏｌ発現を制御するＨＩＶ−１ フレームシフト部位に由来するフレームシフト部位）であり得る。
【０１１６】
上記ピコルナウイルスタンパク質は、非構造タンパク質（例えば、プロテアーゼ）であり得る。上記ピコルナウイルスタンパク質は、キャプシド前駆タンパク質を切断し得る。上記ピコルナウイルスタンパク質は、ピコルナウイルスに由来する上記３Ｃプロテアーゼもしくはその前駆体３ＣＤであり得る。
【０１１７】
本発明は、ここで実施例によってさらに記載される。実施例は、本発明を実施するにあたって当業者を助けるように働くことを意味され、本発明の範囲を限定するとは如何様にも意図されない。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１−発現がｐ１０プロモーターの制御下にあるベクターにおけるプロテアーゼ ３Ｃの変異分析）
バキュロウイルス移入ベクターｐＯＰＩＮＥ５９４９は、上記ＦＭＤＶキャプシド前駆タンパク質Ｐ１、続いて、強力なｐ１０バキュロウイルスプロモーターの制御下で短いスペーサー領域（２Ａ−３Ｂ３）が接続された上記ＦＭＤＶ ３Ｃプロテアーゼをコードする（図１）。上記ＦＭＤＶゲノムの残りの大部分は、失われている。組換えバキュロウイルスを生成するために使用される場合、その理論的結果は、上記成熟キャプシドタンパク質ＶＰ１−４（Ｐ１によってコードされる）を生成し、ウイルスキャプシドへとアセンブリするために自己切断するＰ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ融合タンパク質の発現である。このような組換えバキュロウイルスによる感染の実際の結果は、生成物がほとんど生成されないことである。
【０１１９】
この少量の生成物は、３Ｃ毒性の結果である。これは、ｐＯＰＩＮＥ５９４９内に、３Ｃの活性部位システイン（Ｃｙｓ １６３）の１個の点変異の包含が、上記Ｐ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ融合タンパク質の豊富な量の発現を可能にするという事実によって示される（図２）。これは、３Ｃ活性が、組換えＦＭＤＶ合成の制御特徴であることを形式的に証明する。
【０１２０】
（方法）
上記Ｃｙｓ １６３変異を、標準的な部位指向性変異誘発によって導入し、次いで、変異カセットを再度発現させた。
【０１２１】
（ウェスタンブロッティング）
タンパク質サンプルを、プレキャスト１０％ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ）で分離し、セミドライブロッターを使用して、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。フィルタを、０．１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）、５％ ｗ／ｖ ミルク粉末を使用して、室温で１時間にわたってブロックした。ＦＭＤＶ タイプＡウイルスに対する一次モルモット抗体を、ＰＢＳ−Ｔ、５％ ｗ／ｖ ミルク粉末中、１：１０００の希釈率で、室温において１時間にわたって使用した。ＴＢＳ−Ｔで数回洗浄した後、上記膜を、ＨＲＰ結合体化抗モルモット抗体とともに１時間にわたってインキュベートし、その結合した抗体を、ＢＭケミルミネッセンス（Ｒｏｃｈｅ）によって検出した。
【０１２２】
（実施例２−３Ｃプロテアーゼ活性および発現が低下する構築物の生成）
これら２つの端の間にある上記３Ｃプロテアーゼの活性を調節するために、２つのアプローチを以下のように組み合わせた：
１）合成される３Ｃの量の低下を引き起こす、Ｐ１および３Ｃをコードする配列の間の３Ｂリンカー領域におけるフレームシフトエレメントの導入；ならびに
２）上記３Ｃ残基（Ｃｙｓ１４２）の変異（従って、３Ｃの活性を低下させる）。
【０１２３】
フレームシフトエレメントは、ｍＲＮＡを読む場合に、その翻訳しているリボソームに塩基をスキップさせる（パーセント単位で）配列の一部である。十分に記載されているフレームシフトエレメントは、翻訳されるｍＲＮＡのうちの約５％において−１フレームシフトを引き起こすレトロウイルスＨＩＶ−１について記載されるものである。本発明者らは、Ｄｉｎｍａｎら（ＰＮＡＳ Ａｐｒｉｌ １６，２００２ ｖｏｌ．９９ ｎｏ．８ ５３３１−５３３６）によって記載される配列を使用した（図３）。
【０１２４】
上記ベクターｐＯＰＩＮＥ５９４９−ＦＳを、そのようにして、この位置でオープンリーディングフレームを集結させるような方法で上記３Ｂ３リンカー領域中に挿入された上記フレームシフト配列とともに構築した。上記フレームシフト配列の挿入は、上記Ｐ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ ｍＲＮＡの連続性を中断し、その結果、その翻訳される生成物は、上記３Ｂ３領域において短縮され、３Ｃは生成されない（３Ｃをコードする下流配列が上記メッセージ中に存在しているにも関わらず）。しかし、この領域における上記リボソームによるマイナス１フレームシフトは、上記リボソームによって束縛されるｍＲＮＡのサブセットによって、Ｐ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ融合タンパク質発現を生じる（図４）。上記フレームシフト事象の頻度が、昆虫細胞において、哺乳動物細胞において測定されるものと同じであれば、翻訳生成物は、９５％ Ｐ１−２Ａおよび５％ Ｐ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃである。従って、３Ｃプロテアーゼの合成は、比例して低レベルである。
【０１２５】
上記ｐＯＰＩＮＥ５９４９−ＦＳ配列を使用して構築した組換えバキュロウイルスは、低レベルの３Ｃプロテアーゼの生成と一致した切断パターンを示した（データは示さず）。しかし、全体的な合成レベルは、いくらかの細胞傷害性をなお示し、上記３Ｃの活性を、酵素活性においてある役割を有する位置Ｃｙｓ １４２における上記３Ｃ配列の部位指向性変異誘発によってさらに低下させた（Ｓｗｅｅｎｅｙら（２００７（上記のとおり））（図５）。
【０１２６】
（実施例３−切断されたＶＰ１生成物およびＦＭＤＶの空のキャプシドの生成）
組換えバキュロウイルスにおける１４２Ｔのフレームシフトおよび変異の組み合わせは、所望のレベルのＰ１および３Ｃを生成し、他の切断生成物とアセンブリして、上記空のＦＭＤＶのキャプシドを形成する、上記切断されたＶＰ１生成物の実施湯的な量を生じた。
【０１２７】
本明細書上記で言及されたすべての刊行物は、本明細書に参考として援用される。本発明の記載される方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、具体的な好ましい実施形態とともに記載されてきたが、本願発明がこのような具体的実施形態に過度に限定されるべきでないことは、理解されるべきである。実際に、ウイルス学、分子生物学もしくは関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するための記載される態様の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、宿主細胞において発現される場合、空のウイルスキャプシド、特に、空の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）キャプシドを生成し得る構築物に関する。本発明はまた、このような構築物を含むベクターおよび宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
口蹄疫（ＦＭＤ）
ＦＭＤは、非常に感染性で、経済的に甚大な被害をもたらす、偶蹄類の動物（偶蹄目）の疾患である。この疾患は、家畜化された反芻動物、ブタおよび多数の野生生物種に罹患する。
【０００３】
ＦＭＤは、世界中に広く分布している。先進領域（例えば、北米および中米、ならびに南極大陸の国々）およびオーストラリアおよびニュージーランドのような国々は、疾患から免れている一方で、ＦＭＤは、多くの発展途上国（例えば、サハラ砂漠以南のアフリカ、中東、南アジア、東南アジアおよび南米における国々）においては固有である。通常は疾患から免れている世界のいくつかの領域（例えば、ＦＭＤが１９８９年に根絶され、ワクチン接種が１９９１年以来中止された欧州）もまた存在する。しかし、ＰａｎＡｓｉａｎ Ｏ株に起因する疾患の特別な襲来（ｏｃｃａｓｉｏｎａｌ ｉｎｃｕｒｓｉｏｎ）（例えば、２００１年のＵＫ／ＥＩＲＥ／フランス／オランダの流行（非特許文献１）および２００７年の血清型Ｏ１ ＢＦＳ／１９６７のＵＫでの大発生もあった。
【０００４】
ＦＭＤの原因因子は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（ピコルナウイルス科のプラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルス）である。ＦＭＤＶは、７個の抗原性が異なる血清型、すなわち、Ａ、Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａ １、ならびにＳｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ Ｔｅｒｒｉｔｏｒｉｅｓ（ＳＡＴ） １、２および３として存在し、各血清型内に多くのサブタイプがある。
【０００５】
上記一本鎖ＲＮＡの翻訳は、ウイルスがコードするプロテアーゼによってその後プロセシングされて、ウイルスアセンブリおよび複製に必要とされる構造タンパク質および非構造タンパク質を生成するポリプロテインを生じる。リーダー（Ｌ）プロテアーゼは、シスもしくはトランスで、そのＣ末端において上記Ｐ１−２Ａキャプシド前駆体からそれ自体を切断する。上記２Ａプロテアーゼは、そのＣ末端においてそれ自体を切断して、Ｐ１−２ＡをＰ２から放出する。上記Ｐ１−２Ａのプロセシングは、上記３Ｃプロテアーゼによって実施されて、上記キャプシドタンパク質１ＡＢ（ＶＰ０としても公知）、１Ｃ（ＶＰ３）および１Ｄ（ＶＰ１）を生成する。ビリオンにおいて、１ＡＢの切断は、１Ａ（ＶＰ４）および１Ｂ（ＶＰ２）を生成するために起こる。
【０００６】
（ＦＭＤＶワクチン）
ＦＭＤに対する従来のワクチンは、化学的に不活性化された（通常は、アジリジン（例えば、バイナリーエチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）（ＢＥＩ）の使用によって）完全ウイルスビリオンからなる。
【０００７】
不活性化された完全ウイルスワクチンは、ＦＭＤを制御しかつ根絶するための作戦において重要な役割を果たす。しかし、ウイルス組織培養物から生成されたワクチンは、ワクチン製造の間にウイルス放出のリスクと関連する。ワクチン関連のＦＭＤ大発生をもたらす可能性を有する、上記ウイルスの不適切な不活性化のリスクもまた存在する。
【０００８】
これらリスクを低下させるために、ＦＭＤＶの空のキャプシド様粒子を使用する可能性が、考えられてきた。このような粒子は、上記ＦＭＤＶの構造タンパク質を含むが、非複製的かつ非感染性である。なぜなら、上記粒子は、ＲＮＡゲノムを有さないからである。上記空のキャプシドの外部構造は、野生型ウイルスと同じであるはずであるので、空のキャプシドは、同様に抗原性であり、免疫原性であるはずである。
【０００９】
空のＦＭＤキャプシド粒子を生成するためのいくつかの試みが行われてきたが、上記生成物の収率および安定性と関連した繰り返し発生する問題があった。
【００１０】
ワクチンウイルス発現系は、Ｐ１−２Ａ−３Ｃカセットを発現するために使用されてきた（非特許文献２）。上記カセットの構成的発現は、不成功に終わったが、ｖｖ／ＦＭＤＶ組換え体は、上記カセットがバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下で配置されたときに単離され得ることが見いだされた。しかし、このようなシステムは、空のキャプシドの長期間の発現のために使用できなかった。なぜなら、その後、上記Ｐ１−２Ａ−３Ｃカセットの毒性が、勝っているからである。一定のＴ７ Ｐｏｌ発現が、上記Ｐ１−２Ａ−３Ｃの生成を駆動するために必要とされるという論点もまたある。組織培養において小規模でこれを達成することは可能であるが、これを製造スケールに外挿することは不可能である。さらに、ワクシニア系において生成される生成物は、医療適用もしくは獣医学的適用には市販されていない。
【００１１】
非特許文献３は、カイコ−バキュロウイルス発現系におけるＦＭＤＶウイルスキャプシドタンパク質の発現を報告する。Ｐ１−２Ａおよび３Ｃのインタクトなコード領域の組換えウイルス発現を、カイコに接種するために使用し、その後、血リンパを、死につつあるカイコから集めた。これら「発現された抗原」の調製は、ウシにおいて抗ＦＭＤＶ抗体応答を引き起こすことを示した。しかし、上記「発現された抗原」の性質は、完全に不明であり、上記著者らは、空のキャプシドとは対照的に、それが「サブユニットワクチン」であると仮定するようである。
【００１２】
非特許文献４は、ＦＭＤＶの上記Ｐ１２Ａタンパク質および３Ｃタンパク質の遺伝子を個々のプロモーターから同時に発現する組換えバキュロウイルス系を記載する。上記キャプシドタンパク質が、３Ｃプロテアーゼによってある程度プロセシングされ、空のキャプシド粒子が、免疫電子顕微鏡によって観察され得ることを、ウェスタンブロッティングによって示した。空のキャプシドの粗製抽出物での免疫は、免疫応答を生じなかったが、ＦＭＤＶ特異的抗体および中和抗体のレベルは、従来の不活性化ワクチンより低かった。これは、空のキャプシド粒子のレベルを低下させることに起因すると推定される。さらなる研究から、タンパク質発現の量および昆虫細胞における空のキャプシドアセンブリを改善するために必要とされることが結論づけられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋｎｏｗｌｅｓら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ．（２００１）１４８．２５８〜２５９
【非特許文献２】Ａｂｒａｈａｍｓら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）７６：３０８９〜３０９８
【非特許文献３】Ｌｉら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２００８）２８：３（５）ｅ２２７３
【非特許文献４】Ｃａｏら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００９）１３７：１０〜１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、免疫原性の安定な生成物を合理的な収量で生成する、空のウイルスキャプシドを生成するための改善された方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の局面の要旨）
本発明者らは、驚くべきことに、ＦＭＤＶの空のキャプシド生成と歴史的に関連してきた低収量の理由は、上記３Ｃプロテアーゼのレベルが上記宿主細胞において高すぎる（これは毒性を引き起こす）ことであるということを見いだした。空のキャプシド粒子を高収量で生成するために、上記キャプシドタンパク質前駆体を切断するには十分発現され／活性であるが、上記宿主細胞において毒性を誘導するレベルでは発現されず／活性でないように、上記３Ｃプロテアーゼの発現および／もしくは活性のバランスをとることは必要である。
【００１６】
従って、第１の局面において、本発明は、宿主細胞において発現される場合に、空のウイルスキャプシドを生成し得る構築物を提供し、上記構築物は、
（ｉ）キャプシド前駆タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記キャプシド前駆タンパク質を切断し得るプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）上記プロテアーゼの発現を制御する制御エレメント
を含み、
その結果、上記構築物が上記宿主細胞に存在する場合、上記制御エレメントは、上記プロテアーゼが、上記キャプシド前駆タンパク質を切断するのに十分であるが、上記宿主細胞において顕著な毒性を誘導するには十分でないレベルで発現させる。
【００１７】
上記制御エレメントは、レトロウイルスに由来し得る。特に、上記制御エレメントは、レトロウイルスフレームシフト部位（例えば、ＨＩＶ−１ フレームシフト部位）であり得る。上記ＨＩＶ−１ フレームシフト部位は、翻訳されるｍＲＮＡのうちの約５％においてフレームシフトを引き起こす。
【００１８】
上記フレームシフト部位は、上記キャプシド前駆タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、上記プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列との間に位置し得、その結果、上記構築物が翻訳されるとき、
（１）リボソームがフレームシフトを受けない場合、上記構築物は、（上記キャプシド前駆タンパク質を含むが上記プロテアーゼを含まない）短縮型生成物を生成する；しかし
（２）リボソームがフレームシフトを受ける場合、上記キャプシド前駆タンパク質および上記プロテアーゼの両方が翻訳される。
【００１９】
本発明の第１の局面の構築物において、上記プロテアーゼの活性はまた、低下させられ得る。例えば、上記プロテアーゼは、そのキャプシド前駆タンパク質切断活性を低下させる少なくとも１個の変異を含み得る。
【００２０】
上記プロテアーゼ（例えば、変異プロテアーゼ）は、野生型プロテアーゼより約３分の１のキャプシド前駆タンパク質切断活性を有し得る。
【００２１】
発明の第１の局面に従う構築物を含む宿主細胞によって生成される空のキャプシドは、ピコルナウイルスキャプシド（例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）キャプシド）であり得る。
【００２２】
空のＦＭＤＶキャプシドを生成するために、上記前駆タンパク質は、Ｐ１であり得、上記プロテアーゼは、３Ｃであり得る。上記３Ｃプロテアーゼの活性を低下させるために、上記３Ｃプロテアーゼは、例えば、Ｃｙｓ１４２において変異を含み得る。
【００２３】
第２の局面において、本発明は、本発明の第１の局面に従う構築物を含むベクターを提供する。上記ベクターは、例えば、バキュロウイルス移入ベクター（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ）；ＤＮＡベクター、プラスミドもしくはウイルスベクターであり得る。
【００２４】
第３の局面において、本発明は、本発明の第１の局面に従う構築物を含む宿主細胞を提供する。第１の実施形態において、上記宿主細胞は、本発明の第２の局面に従うベクターを生成し得る。第２の実施形態において、上記宿主細胞は、空のウイルスキャプシドを生成し得る。
【００２５】
上記宿主細胞は、例えば、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞であり得る。
【００２６】
本発明のさらなる局面は、
（ｉ）本発明の第１の局面に従う構築物を宿主細胞において発現することによって、空のウイルスキャプシドを生成し、上記宿主細胞によって生成された空のウイルスキャプシドを採取するための方法；
（ｉｉ）このような方法によって空のウイルスキャプシドを生成し、ワクチンに上記空のウイルスキャプシドを組み込むことによって、ワクチンを生成するための方法；
（ｉｉｉ）空のキャプシドがインビボで生成されるように、本発明の第１の局面に従う構築物を上記被験体において発現することによる、被験体における疾患を処置および／もしくは予防するための方法；
（ｉｖ）疾患の予防および／もしくは処置において使用するための、本発明の第１の局面に従う構築物もしくは本発明の第２の局面に従うベクター；
（ｖ）疾患の予防および／もしくは処置のための医薬の製造における、本発明の第１の局面に従う構築物、もしくは本発明の第２の局面に従うベクターの使用；
（ｖｉ）ピコルナウイルスタンパク質の発現を制御するためのレトロウイルス制御エレメントの使用；ならびに
（ｖｉｉ）レトロウイルス制御エレメントの制御下で、ピコルナウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む構築物
に関する。
【００２７】
「空のキャプシド」ベースのワクチンは、伝統的な不活性化完全病原体ワクチン（例えば、ＦＭＤに関する）より有利である。なぜなら、それは、製造のために高い安全性の封じ込め施設を必要とせず、従って、ウイルスが「漏れ出る」いかなるリスクをも軽減するからである。上記ワクチンはまた、非感染性であり、取り扱いやすく、（本発明に鑑みれば）調製するのに容易かつ安価である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、発現ベクターｐＯＰＩＮＥ５９４９−ＦＳである。上記ベクターは、市販のベクターｐＴｒｉＥｘ１．１（ＥＭＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の誘導体であるが、シームレスクローニングのために改善された。上記ベクターの顕著な特徴および診断的制限部位の部位は、示されている。ＦＭＤＶの空のキャプシドの成功裏の発現に必要な重要な工程は、上記特有のＮｏｔＩ制限部位とＢｓｕ３６Ｉ制限部位との間の上記３Ｃコード領域の前に上記ＨＩＶ−１ フレームシフト部位をコードする配列を導入することである。結果として、上記ｐ１０もしくはＣＭＶプロモーターに由来するすべてのｍＲＮＡは、上記Ｐ１前駆タンパク質を翻訳するが、上記３Ｃプロテアーゼを一部翻訳するのみである。組換えバキュロウイルスを形成するように使用される場合、ＯＲＦ６０３とＯＲＦ１６２９へと時計回りの間の配列は、上記ウイルスゲノムと組換わる。次いで、上記Ｐ１０プロモーターは、感染した細胞において組換え生成物を生成する上記バキュロウイルス感染サイクルの一部として活性化される。
【図２】図２は、Ｐ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ（右側トラック）もしくはＰ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ１６３Ｓ（左側トラック）をコードする組換えバキュロウイルスの間の発現レベルの比較を示す。３Ｃ活性の不活性化は、Ｐ１の豊富な合成を奪回する。
【図３】図３は、上記Ｐ１−３Ｃ接合点においてフレームシフトを引き起こすために使用される配列を示す。その重要な特徴は、ずれが起こり、続いて、上記リボソームを小休止させるので、上記ずれを促進する偽ノットが起こる一連のウラシル（下線を付した）である。
【図４】図４は、上記ＦＭＤＶ配列への上記ＨＩＶ−１フレームシフト配列の導入を示す。上記Ｐ１リーディングフレームは、２つのうちの上側であり、挿入は、赤で印がつけられた終止コドンにおいて上記翻訳された生成物の短縮を生じる。その挿入された配列（オレンジ色のボックス）の始まりにおけるＡ−１フレームシフトは、３Ｃ翻訳（下側のフレーム）を含むように上記リーディングフレームの修正を生じる。
【図５】図５は、残基１４２において変異した３Ｃプロテアーゼのインビトロ活性測定を示す。１４２Ｔおよび１４２Ｓはともに、その親配列と比較した場合に低下した活性を有することに注意する。
【図６】図６は、ピコルナウイルス系統発生を示す。密接に関連したファミリーは、共通のコードストラテジーおよび複製サイクルを共有する；十分に研究されたウイルス（例えば、ポリオウイルス（ＰＶ）および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ））に関して観察されてきたものは、他のメンバーに対しても適用されてきた。完全な系統発生および考察は、以下において見いだされ得る：Ｈｕｇｈｅｓ ＡＬ．（２００４）Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｇｅｎｅｔ Ｅｖｏｌ．４：１４３−５２。
【図７】図７は、図１における発現カセットの直線上のマップおよびその考えられる翻訳生成物を示す。上記Ｐ１生成物およびＰ１−２Ａ−３Ｂ−ＦＳ−３Ｃ生成物の翻訳の示唆される相対レベルは、文献から理解され、経験的に決定されなかった。
【図８】図８は、上記３Ｃプロテアーゼの毒性を示す。昆虫細胞に、３Ｃに連結された上記ＦＭＤＶ Ｐ１を発現する組換えバキュロウイルスを感染させた。Ａにおいて、トラック１は、残基１６３の活性部位Ｃｙｓにおける変異体であり、Ｐ１へ自発的に分解する上記Ｐ１−３Ｃ融合タンパク質の豊富な合成は明らかである。トラック２は、野生型プロテアーゼであり；上記成熟キャプシドタンパク質ＶＰ１のＰ１の合成がほとんどないことは明らかである。Ｂにおいて、Ｐ１を発現する組換えウイルス（トラック１）および弱毒化された３Ｃに連結されたＰ１を発現する組換えウイルス（トラック２）が比較される。ここでは、高レベルの合成が維持され、上記Ｐ１前駆体は、上記成熟キャプシドタンパク質ＶＰ１に化学量論的に変換される。細胞溶解物を、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そのウェスタンブロットを、多価ＦＭＤＶ抗血清でプローブした。ここで大部分の反応性は、ＶＰ１に対するものである。ＶＰ０およびＶＰ３のモル量も示されるが、この血清によっては明らかにされない。
【図９】図９は、空のＦＭＤＶキャプシドのアセンブリを示す。上記３Ｃプロテアーゼ活性の改変が達成された、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞に由来する上記発現生成物のスクロース勾配分析。いくつかのプロセシングされていないＰ１前駆体（おそらく、集合した）は、上記勾配のそこに存在するのに対して、上記ＶＰ１切断生成物は、３５〜４５％ スクロース画分において強くて幅広いピークを形成する。
【００２９】
上記勾配における位置は、アセンブリされた粒子が予測され、可溶性抗原ではない。
【図１０】図１０は、バキュロウイルス発現によって生成される空のＦＭＤＶ Ａ血清型 キャプシドの視覚化を示す。スクロース勾配からのピーク画分をプールして濃縮し、その後、炭素コーティングしたｆｏｒｍｖａｒ ｇｒｉｄに吸着させ、酢酸ウラニルでネガティブ染色した。直径２５ｎｍを有する多くの粒子が見られた（２個の矢印をつけた）。粒子内部の染色は、これらが空であることを示すことに注意する。二十面体構造と一致した特に良好な角度の定義を示す粒子は、赤の矢印をつけている。
【図１１】図１１は、バキュロウイルス発現によって生成される空のＦＭＤＶ Ｏ血清型のキャプシドの視覚化を示す。
【図１２】図１２は、合成キャプシドでの免疫に応答したモルモットの特異的抗体の誘導を示すグラフである。その抗体力価を、（Ａ）ウイルス中和試験、および（Ｂ）液相ブロッキングＥＬＩＳＡを使用して測定した。上記合成Ａ血清型 キャプシドでのモルモットの免疫は、以前の研究において防御的であることが示されたレベルと一致した抗体力価の誘導を生じる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（詳細な説明）
（構築物）
本発明の第１の局面において、本発明は、
（ｉ）キャプシド前駆タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）上記キャプシド前駆タンパク質を切断し得るプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）上記プロテアーゼの発現を制御する制御エレメント
を含む構築物を提供する。
【００３１】
用語「ヌクレオチド配列」とは、ＲＮＡ配列もしくはＤＮＡ配列を含む。それは、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。それは、例えば、ゲノム配列であってもよいし、組換え配列であってもよいし、ｍＲＮＡ配列であってもよいし、ｃＤＮＡ配列であってもよい。
【００３２】
上記構築物は、ヌクレオチド配列である（ｉ）および（ｉｉ）を（おそらく、連続的な様式で）含むヌクレオチド配列であり得る。ヌクレオチド配列（ｉ）とヌクレオチド配列（ｉｉ）との間には配列の部分があり得る。上記制御エレメントは、その配列の部分に存在し得、その結果、それは、上記プロテアーゼの発現を制御するが、上記キャプシド前駆タンパク質の発現を制御せず、その発現に影響も与えない。
【００３３】
上記構築物は、プラスミド、移入ベクター、もしくは宿主細胞ゲノムの一部として存在し得る（以下を参照のこと）。
【００３４】
（制御エレメント）
本発明の第１の局面の構築物は、上記プロテアーゼの発現を制御する制御エレメントを含む。上記制御エレメントは、例えば、上記プロテアーゼの転写および／もしくは翻訳を少なくとも部分的に制御し得る。
【００３５】
具体的には、上記制御エレメントは、上記プロテアーゼが上記キャプシド前駆タンパク質を切断するのに十分であるが、上記宿主細胞において顕著な毒性を誘導するには十分でないレベルで発現させる。
【００３６】
上記キャプシド前駆タンパク質の切断は、当該分野で公知の技術を使用して分析され得る。例えば、宿主細胞からの組換えタンパク質抽出物は、ゲル電気泳動によって分離され得、その分離されたタンパク質は、ウェスタンブロッティングのためにニトロセルロース膜に転写される。抗ウイルス抗体でのウェスタンブロッティングは、プロテアーゼ媒介性切断の程度（ｄｅｇｒｅｅ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｔ）を明らかにするはずである。
【００３７】
例えば、ＦＭＤＶに関しては、上記プロセシングされていないキャプシド前駆タンパク質（Ｐ１−Ｐ２Ａ）は、８１ｋＤａのバンドとして現れ、切断は、ＶＰ３１（４７ｋＤａ）、ＶＰ３（２４ｋＤａ）および／もしくはＶＰ１（２４ｋＤａ）を生成し得る。
【００３８】
上記キャプシド前駆タンパク質の切断はまた、空のキャプシドの生成によって推論され得る（以下を参照のこと）。
【００３９】
上記プロテアーゼによって誘導される上記宿主細胞における細胞傷害性の程度はまた、当該分野で公知の技術を使用して分析され得る。例えば、トリパンブルー排除は、例えば、０．４％ トリパンブルーと細胞とを等量混合し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動化細胞カウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって測定される場合に、生存性のレベルを定義することによって使用され得る。
【００４０】
上記毒性のレベルは、上記宿主細胞のうちの１０％未満、５％未満もしくは２％未満が、上記プロテアーゼによって非生存性にされる場合には、「顕著」であるとはみなされない。上記毒性のレベルは、上記宿主細胞が、上記３Ｃタンパク質の同時発現の非存在下（上記プロテアーゼによる上記キャプシド前駆タンパク質の切断の効果を無視する）で達成されるレベルの８０％、９０％もしくは９５％で上記キャプシド前駆タンパク質を発現し得る場合、「顕著」であるとみなされない。
【００４１】
上記制御エレメントは、上記制御エレメントが存在しない場合に生じる発現のレベルと比較して、上記３Ｃプロテアーゼの発現を低下させ得る。
【００４２】
上記制御エレメントは、ｍＲＮＡを読む場合のパーセンテージにおいて、少なくとも１個の塩基で上記翻訳中のリボソームにスキップ（もしくは反復）させるフレームシフト部位であり得る。フレームシフトする間に、翻訳中のリボソームは、転写物中の異なる点において前もしくは後ろへと１ヌクレオチドスライドするように誘導され得、次いで、タンパク質合成は、それぞれ、その＋１もしくは−１のリーディングフレームにおいて続き得る。
【００４３】
プログラムされた−１リボソームフレームシフトシグナルは、十分に特徴付けられており、いくつかの細菌の−１フレームシフト事象もまた、報告された。多くのウイルス感染真核生物細胞が、プログラムされた−１リボソームフレームシフトを利用する。このことは、上記フレームシフトプロセスに関与するシスエレメントが、真核生物において機能することを示す。ウイルス系において、フレームシフトの効率は、上記ウイルスの効率的拡大のために堅調に維持されなければならない合成されたウイルスタンパク質生成物の化学量論の本質的な決定因子である。
【００４４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１は、ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌポリプロテインの必要とされる割合を生成するためにリボソームフレームシフトを使用する。上記フレームシフトシグナルのステム−ループ構造は、上記リボソームを妨げると考えられ、その５’方向においてずれを引き起こし、これは、上記−１フレームシフトを引き起こし、次いで、翻訳は、新たなフレームにおいて続く（図３を参照のこと）。
【００４５】
上記制御エレメントは、上記翻訳されるｍＲＮＡのうちの１〜２０％の間、１〜１０％の間、３〜７％の間もしくは約５％でフレームシフトを引き起こし得る。
【００４６】
上記フレームシフト配列は、一連の約６個のウラシルを含み得、ここでずれが起こり、続いて、上記リボソームが小休止し、上記ずれを促進するようにする偽ノットを形成し得る配列が生じる。
【００４７】
上記制御エレメントは、上記プロテアーゼコードヌクレオチド配列の上流かつ上記キャプシド前駆タンパク質コード配列の下流に存在し得る。
【００４８】
（空のキャプシド）
「空のキャプシド」は、ウイルスの上記タンパク質殻を含むが、上記ＲＮＡゲノムもしくはＤＮＡゲノムを欠いている実体である。空のキャプシドは、野生型ワクチンと同じ様式において抗原性でありかつ免疫原性であるはずである。なぜなら、上記空のキャプシドは、同じ構造エピトープを保持するが、上記ゲノムの欠如に起因して、感染を生じないはずだからである。
【００４９】
上記空のキャプシドの生成は、当該分野で公知の技術（例えば、スクロース密度遠心分離もしくは電子顕微鏡（上記のようにＡｂｒａｈａｍｓら（１９９５））を使用して調査もしくは確認され得る。
【００５０】
野生型ウイルス上の立体エピトープに対して特異的であるモノクローナル抗体が、上記空のキャプシドの抗原性が保持されるか否かを調査するために、使用され得る。
【００５１】
（プロテアーゼ）
上記プロテアーゼは、キャプシドの生成およびアセンブリの工程としてキャプシド前駆タンパク質を切断する任意のウイルスプロテアーゼであり得る。
【００５２】
上記で言及されるように、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）に関して、上記前駆体Ｐ１の、ＶＰ０（ＶＰ２＋ＶＰ４）、ＶＰ３およびＶＰ１へのタンパク質分解的なプロセシングは、上記ウイルスプロテアーゼ３Ｃもしくはその前駆体３ＣＤによって起こる。
【００５３】
ＦＭＤＶタイプＡ株に由来するＦＭＤＶ野生型３Ｃプロテアーゼの配列は、以下に示される：
【００５４】
【化１】
上記３Ｃプロテアーゼの結晶構造は、解明されており、変異誘発分析は、活性部位に関する情報を提供するために行われた（Ｓｗｅｅｎｅｙら（２００７） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１１５−１２４）。
【００５５】
本発明の第１の局面の構築物は、そのキャプシド前駆タンパク質切断活性を低下させる少なくとも１個の変異を含み得る。
【００５６】
上記変異は、例えば、上記プロテアーゼの活性部位中に存在し得る。残基１６３、残基４６および残基８４から構成される活性部位において触媒性の三つ組みが存在すると考えられている。上記変異は、これら残基のうちの１個以上の欠失もしくは置換を含み得る。上記変異は、上記キャプシド前駆タンパク質切断活性を低下させるはずであるが、完全には破壊しないはずである。
【００５７】
上記３Ｃプロテアーゼの結晶構造から、上記ペプチド結合裂け目を折りたたみ、基質認識に寄与するβ−リボンがあることが明らかにされた（Ｓｗｅｅｎｅｙら（２００７）（上記のとおり））。上記変異は、例えば、上記β−リボン（残基１３８〜１５０）中に存在し得る。上記変異は、例えば、残基１４２における置換であり得る。上記変異は、Ｃ１４２Ｖ、Ｃ１４２ＡもしくはＣ１４２Ｔ変異であり得る。上記変異は、Ｃ１４２Ｔ変異であり得る。
【００５８】
上記変異は、３倍〜２倍の間、もしくは３倍〜１．５倍の間まで上記酵素についての特異性定数を低下させ得る。例えば、上記野生型酵素の特異性定数が９９０ｋｃａｔ／Ｋｍである場合、上記変異酵素についての特異性定数は、４９５〜３３０ｋｃａｔ／Ｋｍの間、もしくは６６０〜３３０ｋｃａｔ／Ｋｍの間であり得る。
【００５９】
変異体である上記プロテアーゼは、上記野生型プロテアーゼと比較して、上記キャプシド前駆タンパク質切断活性のうちの１０〜５０％、２０〜４０％もしくは約３０％を有し得る。
【００６０】
（キャプシド前駆タンパク質）
上記キャプシド前駆タンパク質は、（ピコルナウイルスについては）Ｐ１であり得る。これは、上記３Ｃプロテアーゼによって、ＶＰ０、ＶＰ３およびＶＰ１へと切断される。
【００６１】
あるいは、上記キャプシド前駆タンパク質は、Ｐ１−２Ａであり得る。上記２Ａ プロテアーゼは、そのＣ末端においてそれ自体を切断して、Ｐ１−２ＡをＰ２から放出する。
【００６２】
上記キャプシド前駆タンパク質は、空のキャプシド（の一部）を形成するために上記プロテアーゼによって切断可能であり得る。上記前駆タンパク質は、プロテアーゼ切断によって生成され得る空のキャプシドを形成するために必要なタンパク質のタイプのすべてを含み得る。
【００６３】
（ベクター）
第２の局面において、本発明は、本発明の第１の局面に従う構築物を含むベクターを提供する。
【００６４】
上記ベクターは、例えば、プラスミド、またはバキュロウイルス移入ベクター、ＤＮＡベクターもしくはウイルスベクターであり得る。
【００６５】
上記ベクターは、上記構築物を宿主細胞に移入し得る。
【００６６】
上記ベクターは、上記構築物を植物、昆虫もしくは動物細胞に移入し得る。
【００６７】
上記バキュロウイルス発現系は、ウイルスおよびウイルス様粒子の生成に広く使用されている。
【００６８】
本発明のベクターは、例えば、上記バキュロウイルスシャトルベクターが増殖される細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用される１個以上の移入プラスミドであり得る。
【００６９】
本発明の第１の局面の構築物は、上記移入ベクターからバキュロウイルスシャトルベクター（バクミド）へのＤＮＡの部位特異的転移によって生成される組換えバキュロウイルスＤＮＡであってもよいし、これを含んでいてもよい。このＤＮＡは、昆虫細胞へとトランスフェクトされて、組換えバキュロウイルスを生成し得る。
【００７０】
本発明のベクターは、得られた組換えバキュロウイルスであり得る。
【００７１】
他のウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
レトロウイルスは、遺伝子治療アプローチにおいて一般に使用される。上記組換えレトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、安定な様式で宿主ゲノムへと組み込む能力を有する。それらは、上記宿主ゲノムへの組み込みを可能にする逆転写酵素を含む。レトロウイルスベクターは、多くのＦＤＡが承認した臨床試験（例えば、ＳＣＩＤ−Ｘ１臨床試験）において使用されてきた。
【００７３】
レトロウイルス（例えば、モロニーレトロウイルス）の使用の主な欠点は、細胞が形質導入のために活発に分裂することが要件であることを含む。結果として、細胞（例えば、ニューロン）は、レトロウイルスによる感染および形質導入に非常に抵抗性である。
【００７４】
レンチウイルスは、レトロウイルスのサブクラスである。それらは、近年、分裂していない細胞のゲノムに組み込むそれらの能力に起因して、遺伝子送達ビヒクル（ベクター）として適合させられてきた。ＲＮＡの形態にある上記ウイルスゲノムは、上記ウイルスが上記細胞に入って、ＤＮＡを生成する場合に逆転写され、次いで、これは、上記ウイルスインテグラーゼ酵素によってランダムな位置においてゲノムへと挿入される。上記ベクター（ここでは、プロウイルスといわれる）は、上記ゲノム中に維持され、細胞が分裂する場合に、上記細胞の子孫へと伝えられる。
【００７５】
安全性の理由から、レンチウイルスベクターは、それらの複製に必要とされる遺伝子を決して保持しない。レンチウイルスを生成するために、いくつかのプラスミドが、いわゆるパッケージング細胞株（一般には、ＨＥＫ ２９３）へとトランスフェクトされる。１個以上のプラスミド（一般には、パッケージングプラスミドといわれる）は、ビリオンタンパク質（例えば、上記キャプシドおよび上記逆転写酵素）をコードする。別のプラスミドは、上記ベクターによって送達されるべき遺伝物質を含む。このプラスミドは、一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムを生成するために転写され、ψ（ｐｓｉ）配列の存在によって示される。この配列は、上記ビリオンへと上記ゲノムをパッケージするために使用される。
【００７６】
レンチウイルスとは対照的に、アデノウイルスＤＮＡは、上記ゲノムへと組み込まれず、細胞分裂の間に複製されない。それらの主な適用は、遺伝子治療およびワクチン接種にある。人は、一般に、アデノウイルス（これは、呼吸器感染胃腸感染および眼の感染を引き起こす）と接触した状態にあるので、上記アデノウイルスは、潜在的には危険な結果を伴う急激な急速な免疫応答を誘発する。この問題を克服するために、科学者らは、ヒトが免疫を有さないアデノウイルスを現在調査している最中である。
【００７７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒトおよびいくつかの他の霊長類の種に感染する小さなウイルスである。ＡＡＶは、疾患を引き起こすとは現在のところ知られておらず、それゆえ、上記ウイルスは、非常に軽度の免疫応答を引き起こす。ＡＡＶは、分裂している細胞にも分裂していない細胞にも感染し得、そのゲノムを上記宿主細胞のゲノムへと組み込み得る。これら特徴は、ＡＡＶを、遺伝子治療用のウイルスベクターを作り出すための非常に魅力的な候補にしている。
【００７８】
（宿主細胞）
本発明はまた、本発明の第１の局面の構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００７９】
上記宿主細胞は、本発明の第２の局面に従うベクター（例えば、ウイルスベクター）を生成し得る能力がある。
【００８０】
上記宿主細胞は、ウイルスベクターを生成し得る、パッケージング細胞もしくはプロデューサー細胞であり得る。
【００８１】
上記宿主細胞は、本発明の第２の局面に従う組換えバキュロウイルスを生成し得るＳｆ９昆虫細胞であり得る。
【００８２】
上記宿主細胞は、空のウイルスキャプシドを生成し得る。
【００８３】
上記宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞もしくは動物細胞であり得る。
【００８４】
（生成方法）
本発明は、空のウイルスキャプシドを生成するための方法を提供し、上記方法は、以下の工程：
（ｉ）本発明の第１の局面に従う構築物を宿主細胞において発現させる工程；および
（ｉｉ）上記宿主細胞によって生成される空のウイルスキャプシドを採取する工程
を含む。
【００８５】
本発明の構築物は、例えば、本発明の第２の局面のベクターでのトランスフェクションもしくは形質導入によって、上記宿主細胞 へと導入され得る。
【００８６】
上記空のウイルスキャプシドが、上記宿主細胞の外側で発現される場合、それらは、上清から採取され得る。
【００８７】
上記空のウイルスキャプシドが、上記宿主細胞の内部で発現される場合、それらは、例えば、
（ｉ）上記宿主細胞の溶解（例えば、凍結融解による）；ならびに、必要に応じて、
（ｉｉ）濃縮（例えば、ＰＥＧ沈殿による）、および／または
（ｉｉｉ）精製
によって採取され得る。
【００８８】
本発明はまた、このような方法によって空のウイルスキャプシドを生成する工程および上記空のウイルスキャプシドをワクチンに組み込む工程を含む、ワクチンを生成するための方法を提供する。
【００８９】
上記ワクチンはまた、薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバントもしくは賦形剤を含み得る。
【００９０】
（ウイルス）
本発明は、特定のウイルスの空のキャプシドの生成に関する。
【００９１】
上記ウイルスは、例えば、ピコルナウイルスであり得る。
【００９２】
ピコルナウイルス属、種および血清型の例は、表１に示される：
【００９３】
【表１−１】
【００９４】
【表１−２】
コモウイルス科（コモウイルス属、ファバウイルス属、およびネポウイルス属）、セキウイルス科（セキウイルス属およびワイカウイルス属）および多くのまだ割り当てられていない属（ケラウイルス（Ｃｈｅｒａｖｉｒｕｓ）、サドワウイルスおよびトラドウイルス（Ｔｏｒｒａｄｏｖｉｒｕｓ）（タイプ種 トマトトラドウイルス））を含むセコウイルス上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｓｅｃｏｖｉｒｉｄａｅ）へと分類されてきた植物ピコルナウイルスもまた存在する。
【００９５】
上記ウイルスは、蜂ウイルス（例えば、イスラエル急性麻痺ウイルス；カシミア蜂ウイルス；カクゴウイルス；ミツバチヘギイダニウイルス；サックブルードウイルス；奇形羽ウイルス）であり得る。すべてのこのようなウイルスは、蜂コロニーの喪失と関連してきたので、上記コロニー喪失の原因を決定するために診断試験が必要である。
【００９６】
上記ウイルスは、動物の病原体（例えば、ＦＭＤＶもしくはブタ水疱病ウイルス）であり得る。上記ウイルスは、ヒト病原体（例えば、エンテロウイルス７１（これは、下痢の大発生を引き起こす）；コクサッキーウイルスＢウイルス（糖尿病および心筋炎を引き起こす）、もしくはポリオウイルスであり得る。
【００９７】
（天然の状態において）ヒトもしくは動物の病原体として作用するウイルスの空のキャプシド生成は、ワクチンおよび治療用組成物の生成に重要である。
【００９８】
（ワクチン）
用語「ワクチン」とは、本明細書で使用される場合、被験体に投与される場合に、防御免疫応答を誘導もしくは刺激する調製物をいう。ワクチンは、生物に特定の疾患に対して免疫をつけ得る。
【００９９】
上記ワクチンは、治療的に使用されて、現存の感染を処置し得る；もしくは予防的に使用されて、感染の可能性をブロックもしくは低下させ得るか、そして／または上記疾患にかかる可能性を予防もしくは低下させ得る。
【０１００】
ワクチンは、１種以上のワクチン接種する実体、ならびに必要に応じて、１種以上のアジュバント、賦形剤、キャリアおよび希釈剤を含む。
【０１０１】
上記ワクチンはまた、別の活性因子（例えば、上記ワクチン接種する実体が誘導した適応免疫応答の前に初期の防御を刺激し得るもの）を含んでいてもよいし、上記別の活性因子を発現してもよい。上記因子は、抗ウイルス剤（例えば、タイプＩインターフェロン）であり得る。代わりに、もしくは加えて、上記因子は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり得る。
【０１０２】
上記ワクチン接種する実体は、例えば、本発明の第１の局面の構築物、本発明の第２の局面のベクター、もしくは本発明の第３の局面の宿主細胞によって生成される空のキャプシドによってであり得る。
【０１０３】
ＤＮＡワクチン接種は、タンパク質ベースのワクチンを超えるいくつかの利点を有する。例えば、ＤＮＡワクチンは、インビボで上記抗原の内因性発現を生じ、抗原性ペプチドがＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ経路の両方を介して免疫系に提示されることを可能にし、それによって、ＣＤ４＋ Ｔ細胞のみならず、ＣＤ８＋ Ｔ細胞もまた刺激する。従って、ＤＮＡワクチンは、液性免疫応答および強力な細胞性免疫応答の両方を誘導し得る。ワクチンとしてのプラスミドＤＮＡの使用はまた、細菌プラスミド骨格およびＴｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）における非メチル化ＣｐＧモチーフを介して、上記宿主の先天的免疫系を誘発し得る。
【０１０４】
上記ワクチンは、ＭＨＣおよびサイトカイン分泌をダウンレギュレートすることによって、細胞性免疫応答を妨害し得る非構造タンパク質コード遺伝子２Ｂおよび２Ｃを欠いていてもよい（Ｍｏｆｆａｔら，（２００５） Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７９．４３８２−９５およびＭｏｆｆａｔら，（２００７） Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８１．１１２９−３９）。
【０１０５】
多くの市販のＦＭＤワクチンは、異なるＦＭＤ血清型に対する網羅を提供するように多価である。その上、本発明のワクチンは、複数のワクチン接種する実体（各々は、異なる血清型および／もしくは所定の血清型内の異なるサブタイプに指向される）を含み得る。
【０１０６】
（疾患の処置／予防）
本発明はまた、有効量のそのようなワクチンの投与によって、被験体における疾患を処置および／もしくは予防するための方法を提供する。
【０１０７】
用語「予防する」とは、上記疾患への罹患を防ぐか、遅らせるか、妨げるかもしくは邪魔をすることに言及することが意図される。上記ワクチンは、例えば、感染性ウイルスが細胞に入る可能性を妨げ得るかもしくは低下させ得る。
【０１０８】
「処置する」とは、本明細書で使用される場合、上記疾患を改善するか、治療するか、もしくは上記疾患の症状を軽減するために、または上記疾患の進行を衰えさせるかもしくは停止させるために、罹患した被験体に関するケアに言及する。それはまた、上記ウイルスが感染した被験体を他の被験体に対して非感染性にする処置にも言及する。
【０１０９】
上記被験体は、上記疾患にかかりやすい任意の動物もしくは植物であり得る。上記被験体は、ヒト、昆虫（例えば、蜂）、植物、哺乳動物もしくは他の動物であり得る。
【０１１０】
ＦＭＤに関しては、上記被験体は、偶蹄類の動物であり得る。ＦＭＤ感受性の動物としては、家畜の中では、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびヤギ、ならびにラクダ科の動物（ラクダ、ラマ、アルパカ、グアナコおよびビクーニャ）が挙げられる。いくらかの野生動物（例えば、ハリネズミ、ヌートリア、および任意の野生の偶蹄類の動物（例えば、シカおよび動物園の動物（ゾウが挙げられる）））もまた、ＦＭＤにかかり得る。
【０１１１】
（投与）
非ウイルス性遺伝子送達の方法は、物理的アプローチ（キャリアなしの遺伝子送達）および化学的アプローチ（合成ベクターベースの遺伝子送達）を使用する工程を包含する。物理的アプローチ（針注入、エレクトロポレーション、遺伝子銃、超音波、および流体力学的送達が挙げられる）は、細胞膜に浸透し、細胞内遺伝子移入を促進する物理的力を使用する。上記化学的アプローチは、合成化合物もしくは天然に存在する化合物をキャリアとして使用して、上記ヌクレオチド配列を細胞内に送達する。
【０１１２】
最も適した送達法は、上記ヌクレオチド配列を標的細胞に送達するために使用される送達系に依存する。例えば、プラスミド投与に関しては、上記プラスミド調製物は、筋肉内に、皮内に、もしくは上記の組み合わせで投与され得る。
【０１１３】
ウイルスベクターは、当該分野で公知の方法（例えば、直接注射）によって被験体に投与され得る。
【０１１４】
（ピコルナウイルスタンパク質のレトロウイルス制御）
本発明はまた、ピコルナウイルスタンパク質の発現を制御するためのレトロウイルス制御エレメントの使用、レトロウイルス制御エレメントの制御下でピコルナウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む構築物に関する。
【０１１５】
上記レトロウイルス制御エレメントは、レトロウイルスフレームシフト部位（例えば、そのウイルスにおけるＧａｇおよびＧａｇ−ｐｏｌ発現を制御するＨＩＶ−１ フレームシフト部位に由来するフレームシフト部位）であり得る。
【０１１６】
上記ピコルナウイルスタンパク質は、非構造タンパク質（例えば、プロテアーゼ）であり得る。上記ピコルナウイルスタンパク質は、キャプシド前駆タンパク質を切断し得る。上記ピコルナウイルスタンパク質は、ピコルナウイルスに由来する上記３Ｃプロテアーゼもしくはその前駆体３ＣＤであり得る。
【０１１７】
本発明は、ここで実施例によってさらに記載される。実施例は、本発明を実施するにあたって当業者を助けるように働くことを意味され、本発明の範囲を限定するとは如何様にも意図されない。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１−発現がｐ１０プロモーターの制御下にあるベクターにおけるプロテアーゼ ３Ｃの変異分析）
バキュロウイルス移入ベクターｐＯＰＩＮＥ５９４９は、上記ＦＭＤＶキャプシド前駆タンパク質Ｐ１、続いて、強力なｐ１０バキュロウイルスプロモーターの制御下で短いスペーサー領域（２Ａ−３Ｂ３）が接続された上記ＦＭＤＶ ３Ｃプロテアーゼをコードする（図１）。上記ＦＭＤＶゲノムの残りの大部分は、失われている。組換えバキュロウイルスを生成するために使用される場合、その理論的結果は、上記成熟キャプシドタンパク質ＶＰ１−４（Ｐ１によってコードされる）を生成し、ウイルスキャプシドへとアセンブリするために自己切断するＰ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ融合タンパク質の発現である。このような組換えバキュロウイルスによる感染の実際の結果は、生成物がほとんど生成されないことである。
【０１１９】
この少量の生成物は、３Ｃ毒性の結果である。これは、ｐＯＰＩＮＥ５９４９内に、３Ｃの活性部位システイン（Ｃｙｓ １６３）の１個の点変異の包含が、上記Ｐ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ融合タンパク質の豊富な量の発現を可能にするという事実によって示される（図２）。これは、３Ｃ活性が、組換えＦＭＤＶ合成の制御特徴であることを形式的に証明する。
【０１２０】
（方法）
上記Ｃｙｓ １６３変異を、標準的な部位指向性変異誘発によって導入し、次いで、変異カセットを再度発現させた。
【０１２１】
（ウェスタンブロッティング）
タンパク質サンプルを、プレキャスト１０％ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ）で分離し、セミドライブロッターを使用して、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。フィルタを、０．１％ ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）、５％ ｗ／ｖ ミルク粉末を使用して、室温で１時間にわたってブロックした。ＦＭＤＶ タイプＡウイルスに対する一次モルモット抗体を、ＰＢＳ−Ｔ、５％ ｗ／ｖ ミルク粉末中、１：１０００の希釈率で、室温において１時間にわたって使用した。ＴＢＳ−Ｔで数回洗浄した後、上記膜を、ＨＲＰ結合体化抗モルモット抗体とともに１時間にわたってインキュベートし、その結合した抗体を、ＢＭケミルミネッセンス（Ｒｏｃｈｅ）によって検出した。
【０１２２】
（実施例２−３Ｃプロテアーゼ活性および発現が低下する構築物の生成）
これら２つの端の間にある上記３Ｃプロテアーゼの活性を調節するために、２つのアプローチを以下のように組み合わせた：
１）合成される３Ｃの量の低下を引き起こす、Ｐ１および３Ｃをコードする配列の間の３Ｂリンカー領域におけるフレームシフトエレメントの導入；ならびに
２）上記３Ｃ残基（Ｃｙｓ１４２）の変異（従って、３Ｃの活性を低下させる）。
【０１２３】
フレームシフトエレメントは、ｍＲＮＡを読む場合に、その翻訳しているリボソームに塩基をスキップさせる（パーセント単位で）配列の一部である。十分に記載されているフレームシフトエレメントは、翻訳されるｍＲＮＡのうちの約５％において−１フレームシフトを引き起こすレトロウイルスＨＩＶ−１について記載されるものである。本発明者らは、Ｄｉｎｍａｎら（ＰＮＡＳ Ａｐｒｉｌ １６，２００２ ｖｏｌ．９９ ｎｏ．８ ５３３１−５３３６）によって記載される配列を使用した（図３）。
【０１２４】
上記ベクターｐＯＰＩＮＥ５９４９−ＦＳを、そのようにして、この位置でオープンリーディングフレームを集結させるような方法で上記３Ｂ３リンカー領域中に挿入された上記フレームシフト配列とともに構築した。上記フレームシフト配列の挿入は、上記Ｐ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ ｍＲＮＡの連続性を中断し、その結果、その翻訳される生成物は、上記３Ｂ３領域において短縮され、３Ｃは生成されない（３Ｃをコードする下流配列が上記メッセージ中に存在しているにも関わらず）。しかし、この領域における上記リボソームによるマイナス１フレームシフトは、上記リボソームによって束縛されるｍＲＮＡのサブセットによって、Ｐ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃ融合タンパク質発現を生じる（図４）。上記フレームシフト事象の頻度が、昆虫細胞において、哺乳動物細胞において測定されるものと同じであれば、翻訳生成物は、９５％ Ｐ１−２Ａおよび５％ Ｐ１−２Ａ−３Ｂ３−３Ｃである。従って、３Ｃプロテアーゼの合成は、比例して低レベルである。
【０１２５】
上記ｐＯＰＩＮＥ５９４９−ＦＳ配列を使用して構築した組換えバキュロウイルスは、低レベルの３Ｃプロテアーゼの生成と一致した切断パターンを示した（データは示さず）。しかし、全体的な合成レベルは、いくらかの細胞傷害性をなお示し、上記３Ｃの活性を、酵素活性においてある役割を有する位置Ｃｙｓ １４２における上記３Ｃ配列の部位指向性変異誘発によってさらに低下させた（Ｓｗｅｅｎｅｙら（２００７（上記のとおり））（図５）。
【０１２６】
（実施例３−切断されたＶＰ１生成物およびＦＭＤＶの空のキャプシドの生成）
組換えバキュロウイルスにおける１４２Ｔのフレームシフトおよび変異の組み合わせは、所望のレベルのＰ１および３Ｃを生成し、他の切断生成物とアセンブリして、上記空のＦＭＤＶのキャプシドを形成する、上記切断されたＶＰ１生成物の実施湯的な量を生じた。
【０１２７】
本明細書上記で言及されたすべての刊行物は、本明細書に参考として援用される。本発明の記載される方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、具体的な好ましい実施形態とともに記載されてきたが、本願発明がこのような具体的実施形態に過度に限定されるべきでないことは、理解されるべきである。実際に、ウイルス学、分子生物学もしくは関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するための記載される態様の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞において発現される場合、空のウイルスキャプシドを生成し得る構築物であって、該構築物は、
（ｉ）キャプシド前駆タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）該キャプシド前駆タンパク質を切断し得るプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）該プロテアーゼの発現を制御する制御エレメント
を含み、ここで、該構築物が該宿主細胞において発現される場合、該制御エレメントは、該プロテアーゼを、該キャプシド前駆タンパク質を切断するのに十分であるが、該宿主細胞において顕著な毒性を誘導するには十分ではないレベルで発現させる、構築物。
【請求項２】
前記制御エレメントは、レトロウイルスに由来し得る、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記制御エレメントは、レトロウイルスフレームシフト部位である、請求項２に記載の構築物。
【請求項４】
前記制御エレメントは、前記ＨＩＶ−１フレームシフト部位である、請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
前記フレームシフト部位は、前記キャプシド前駆タンパク質をコードするヌクレオチド配列と前記プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列との間に位置し、ここで、
前記構築物が翻訳されるとき：
リボソームがフレームシフトを受けない場合、該構築物は、該キャプシド前駆タンパク質を含むが該プロテアーゼを含まない短縮型生成物を生成する；
しかしリボソームがフレームシフトを受ける場合、該キャプシド前駆タンパク質および該プロテアーゼの両方が翻訳される、
請求項３または４に記載の構築物。
【請求項６】
前記制御エレメントは、翻訳されるｍＲＮＡのうちの約５％においてフレームシフトを引き起こす、請求項３〜５のいずれかに記載の構築物。
【請求項７】
前記プロテアーゼは、該プロテアーゼのキャプシド前駆タンパク質切断活性を低下させる少なくとも１個の変異を含む、前述の請求項のいずれかに記載の構築物。
【請求項８】
変異体である前記プロテアーゼは、野生型プロテアーゼの約３分の１のキャプシド前駆タンパク質切断活性を有する、請求項７に記載の構築物。
【請求項９】
宿主細胞において発現される場合、空のピコルナウイルスキャプシドを生成し得る、前述の請求項のいずれかに記載の構築物。
【請求項１０】
宿主細胞において発現される場合、空の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）キャプシドを生成し得る、請求項９に記載の構築物。
【請求項１１】
前記キャプシド前駆タンパク質は、Ｐ１であり、前記プロテアーゼは、３Ｃである、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
Ｃｙｓ１４２において変異を有する変異体の３Ｃプロテアーゼを含む、請求項１１に記載の構築物。
【請求項１３】
前述の請求項のいずれかに記載の構築物を含むベクター。
【請求項１４】
バキュロウイルス移入ベクター；ＤＮＡベクター、プラスミドもしくはウイルスベクターである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載のベクターを生成し得る、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
空のウイルスキャプシドを生成し得る、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞である、請求項１６または１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
空のウイルスキャプシドを生成するための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）宿主細胞において請求項１〜１２のいずれかに記載の構築物を発現させる工程；および
（ｉｉ）該宿主細胞によって生成される空のウイルスキャプシドを採取する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
ワクチンを生成するための方法であって、該方法は、請求項１９に記載の方法によって空のウイルスキャプシドを生成する工程、および該空のウイルスキャプシドをワクチンに組み込む工程を包含する、方法。
【請求項２１】
被験体における疾患を処置および／もしくは予防するための方法であって、該方法は、空のキャプシドがインビボで生成されるように、請求項１〜１２のいずれかに記載の構築物を該被験体において発現させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記構築物は、ＤＮＡワクチン接種によって、もしくはウイルスベクターを使用することによって、前記被験体に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
疾患の予防および／もしくは処置において使用するための、請求項１〜１２のいずれかに記載の構築物、請求項１３または１４に記載のベクター。
【請求項２４】
疾患の予防および／もしくは処置のための医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかに記載の構築物あるいは請求項１３または１４に記載のベクターの使用。
【請求項２５】
ピコルナウイルスタンパク質の発現を制御するための、レトロウイルス制御エレメントの使用。
【請求項２６】
レトロウイルス制御エレメントの制御下でピコルナウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む構築物。
【請求項１】
宿主細胞において発現される場合、空のウイルスキャプシドを生成し得る構築物であって、該構築物は、
（ｉ）キャプシド前駆タンパク質をコードするヌクレオチド配列；
（ｉｉ）該キャプシド前駆タンパク質を切断し得るプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列；および
（ｉｉｉ）該プロテアーゼの発現を制御する制御エレメント
を含み、ここで、該構築物が該宿主細胞において発現される場合、該制御エレメントは、該プロテアーゼを、該キャプシド前駆タンパク質を切断するのに十分であるが、該宿主細胞において顕著な毒性を誘導するには十分ではないレベルで発現させる、構築物。
【請求項２】
前記制御エレメントは、レトロウイルスに由来し得る、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記制御エレメントは、レトロウイルスフレームシフト部位である、請求項２に記載の構築物。
【請求項４】
前記制御エレメントは、前記ＨＩＶ−１フレームシフト部位である、請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
前記フレームシフト部位は、前記キャプシド前駆タンパク質をコードするヌクレオチド配列と前記プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列との間に位置し、ここで、
前記構築物が翻訳されるとき：
リボソームがフレームシフトを受けない場合、該構築物は、該キャプシド前駆タンパク質を含むが該プロテアーゼを含まない短縮型生成物を生成する；
しかしリボソームがフレームシフトを受ける場合、該キャプシド前駆タンパク質および該プロテアーゼの両方が翻訳される、
請求項３または４に記載の構築物。
【請求項６】
前記制御エレメントは、翻訳されるｍＲＮＡのうちの約５％においてフレームシフトを引き起こす、請求項３〜５のいずれかに記載の構築物。
【請求項７】
前記プロテアーゼは、該プロテアーゼのキャプシド前駆タンパク質切断活性を低下させる少なくとも１個の変異を含む、前述の請求項のいずれかに記載の構築物。
【請求項８】
変異体である前記プロテアーゼは、野生型プロテアーゼの約３分の１のキャプシド前駆タンパク質切断活性を有する、請求項７に記載の構築物。
【請求項９】
宿主細胞において発現される場合、空のピコルナウイルスキャプシドを生成し得る、前述の請求項のいずれかに記載の構築物。
【請求項１０】
宿主細胞において発現される場合、空の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）キャプシドを生成し得る、請求項９に記載の構築物。
【請求項１１】
前記キャプシド前駆タンパク質は、Ｐ１であり、前記プロテアーゼは、３Ｃである、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
Ｃｙｓ１４２において変異を有する変異体の３Ｃプロテアーゼを含む、請求項１１に記載の構築物。
【請求項１３】
前述の請求項のいずれかに記載の構築物を含むベクター。
【請求項１４】
バキュロウイルス移入ベクター；ＤＮＡベクター、プラスミドもしくはウイルスベクターである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載のベクターを生成し得る、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
空のウイルスキャプシドを生成し得る、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞である、請求項１６または１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
空のウイルスキャプシドを生成するための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）宿主細胞において請求項１〜１２のいずれかに記載の構築物を発現させる工程；および
（ｉｉ）該宿主細胞によって生成される空のウイルスキャプシドを採取する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
ワクチンを生成するための方法であって、該方法は、請求項１９に記載の方法によって空のウイルスキャプシドを生成する工程、および該空のウイルスキャプシドをワクチンに組み込む工程を包含する、方法。
【請求項２１】
被験体における疾患を処置および／もしくは予防するための方法であって、該方法は、空のキャプシドがインビボで生成されるように、請求項１〜１２のいずれかに記載の構築物を該被験体において発現させる工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記構築物は、ＤＮＡワクチン接種によって、もしくはウイルスベクターを使用することによって、前記被験体に投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
疾患の予防および／もしくは処置において使用するための、請求項１〜１２のいずれかに記載の構築物、請求項１３または１４に記載のベクター。
【請求項２４】
疾患の予防および／もしくは処置のための医薬の製造における、請求項１〜１２のいずれかに記載の構築物あるいは請求項１３または１４に記載のベクターの使用。
【請求項２５】
ピコルナウイルスタンパク質の発現を制御するための、レトロウイルス制御エレメントの使用。
【請求項２６】
レトロウイルス制御エレメントの制御下でピコルナウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む構築物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１３−５０７９４８（Ｐ２０１３−５０７９４８Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３４７５９（Ｐ２０１２−５３４７５９）
【出願日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１８０７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４８３５３
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５１２１０２４０５）インスティテュート フォー アニマル ヘルス (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１８０７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４８３５３
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５１２１０２４０５）インスティテュート フォー アニマル ヘルス (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]