立体構造予測方法，立体構造予測プログラム及び質量分析装置
【課題】
質量分析装置を用いて、タンパク質やペプチドの立体構造の形成に重要な所定結合部位を予測し、立体構造情報の取得を実現する。
【解決手段】
質量分析の前処理法として、タンパク質またはペプチド試料に対して、立体構造の形成に重要な所定結合を切断する切断剤を添加して前処理を行い測定試料とする場合と、切断剤を添加せずに前処理を行い測定試料とする場合の２通りを行い、この２通りで処理した測定試料を質量分析装置で測定し、得られた測定データを比較解析することで、所定結合の部位を予測する。
質量分析装置を用いて、タンパク質やペプチドの立体構造の形成に重要な所定結合部位を予測し、立体構造情報の取得を実現する。
【解決手段】
質量分析の前処理法として、タンパク質またはペプチド試料に対して、立体構造の形成に重要な所定結合を切断する切断剤を添加して前処理を行い測定試料とする場合と、切断剤を添加せずに前処理を行い測定試料とする場合の２通りを行い、この２通りで処理した測定試料を質量分析装置で測定し、得られた測定データを比較解析することで、所定結合の部位を予測する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、立体構造予測方法，立体構造予測プログラム及び質量分析装置に関し、特にタンパク質またはペプチドの立体構造解析と翻訳後修飾部位の解析に好適な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析のための一般的な前処理方法では、タンパク質やペプチドに含まれるシステイン残基間のジスルフィド結合を還元化する還元剤や水素結合を切断する変性剤などを添加することによって、タンパク質の立体構造を形成するために重要な結合を切断し、タンパク質分解酵素などによるタンパク質のペプチド断片化が効率良く進むよう処理する。そのため、得られる質量分析データにはタンパク質の立体構造情報は含まれていない。これに対し、非特許文献１では対象試料のジスルフィド結合を切断せずに質量分析し、対象試料のアミノ酸配列を基に構築したＭＳ／ＭＳスペクトルデータベースに対して、データベース検索してジスルフィド結合を予測する。
【０００３】
【非特許文献１】Jiaxi Wang, Bin Ma, Weiwu Chen“Disulfide bonded Dipeptide Analysis with PEAKS and Q-TOF Mass Spectrometry”ＡＳＭＳ２００７，June ３−７、Ｐ.６−Ｐ.７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
タンパク質は、固有の立体構造をとることによって、生体中でそれぞれの機能を発揮することができる。そのため、生体中でタンパク質がどのような機能を果たすかを解明するためには、立体構造の解析が重要となる。
【０００５】
タンパク質の立体構造形成には、アミノ酸配列上で離れた位置に存在するシステイン残基間のジスルフィド結合や水素結合などが大きく影響する。また、機能発現のためには糖鎖やリン酸基などの翻訳後修飾が重要となっている。
【０００６】
現在の質量分析装置では、前処理段階でタンパク質やペプチドの構造形成に重要な結合を決断するという処置を行うため、このような結合部位についての情報が失われ、立体構造を推測することができないという課題がある。さらに、前述の非特許文献１では、ジスルフィド結合に関する質量分析について述べているが、ＭＳ／ＭＳスペクトルデータベースを構築する際に、構造予測する対象試料のアミノ酸配列が不明である場合を配慮されていない、またジスルフィド結合以外のタンパク質立体構造を形成するために重要な結合や翻訳後修飾部位の予測に対応していない、という課題がある。
【０００７】
本発明の１つの目的は、立体構造形成に重要な結合を保ったままの試料を質量分析し、得られたデータから結合部位や翻訳後修飾部位を予測し、立体構造情報の取得を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの特徴は、立体構造形成に重要な結合または翻訳後修飾部位の結合を切断する切断剤を添加する第１の方法を用いて質量分析して得られた第１のデータファイルと、前述の切断剤を添加しない第２の方法を用いて質量分析して得られた第２のデータファイルを比較解析する方法にある。これにより、タンパク質またはペプチドの立体構造形成に重要な結合の部位や、翻訳後修飾の部位を質量分析装置で予測する方法を実現するものである。
【０００９】
本発明の他の特徴は、（１）立体構造解析方法において、前記第１の方法と前記第２の方法で前処理し、それぞれの試料を質量分析装置で測定することにより、タンパク質やペプチドの立体構造情報を得るものである。
【００１０】
本発明のその他の特徴は、（２）立体構造解析プログラムにおいて、前記第１の方法で前処理した試料の質量分析データをデータベース検索して、アミノ酸配列を同定する。同定されたアミノ酸配列から、立体構造形成に重要な結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドが結合を形成するとしたときの質量、または翻訳後修飾されるアミノ酸残基を含むペプチドが翻訳後修飾されるとしたときの質量を求める。この質量を、第２の方法で前処理した試料の質量分析データと比較し、一致する質量を探索することで、立体構造に重要な結合を形成する部位、または翻訳後修飾される部位を予測するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の１つの態様によれば、質量分析データから、タンパク質またはペプチドの立体構造形成に重要な結合の部位や、翻訳後修飾部位を予測することが可能となる。
【００１２】
また、本発明の他の態様によれば、複雑な処理や条件検討をせずに簡便にタンパク質の構造を解析することが可能となり、今まで困難であったタンパク質の構造や機能の解明に貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の実施形態の一例を、図１から図８を用いて説明する。
【００１４】
図１は、本発明の実施形態の処理の流れを示した図である。
【００１５】
試料（タンパク質またはペプチド）１０１を２通りの方法で前処理１０２を行う。１つは、切断剤を添加して所定結合を切断する第１の方法である。もう１つは、切断剤を添加せずに所定結合を切断しない第２の方法である。この２通りで前処理を行い、ペプチド断片化する。この２通りで処理した試料を質量分析１０３し、それぞれの測定データとして、第１のデータファイルと第２のデータファイルを得る。この第１のデータファイルと第２のデータファイルを比較解析処理１０４することで、予測された所定結合部位１０５の情報を得る。以下、各段階について詳細に説明する。
【００１６】
１．前処理
図２は、本発明の実施形態の前処理の一例を示す概略図である。
【００１７】
図２左側の左フローは、第１の方法を表しており、クロマトグラフ質量分析装置の通常の前処理方法と同じである。タンパク質またはペプチドである試料２０１に、切断剤を添加する切断剤の添加処理２０２を行い、所定結合を切断後、タンパク質試料の場合は酵素消化処理２０３を行うことにより、ペプチド断片化し、測定試料２０４とする。
【００１８】
図２右側の右フローは、第２の方法を表しており、所定結合を切断しない前処理方法である。タンパク質またはペプチドである試料２０１に、タンパク質試料の場合は酵素消化処理２０３して、測定試料２０４とする。
【００１９】
２．質量分析
図３は、本発明の実施形態のクロマトグラフ質量分析装置の構成例を示す概略図である。
【００２０】
前処理後の測定試料３０１を、液体クロマトグラフ部３０２の分離カラム３０３を用い、吸着・分配などの相互作用によって、ペプチド成分が保持時間に従って分離される。そして、質量分析装置本体３０４のイオン源３０５でイオン化後、質量分離装置３０６で質量分離されて検出器３０７で質量数とその信号強度が検出される。この検出データを、コンピュータを有するデータ処理装置３０８に取り込み、各ペプチドフラグメントの保持時間，質量対電荷比ｍ／ｚ（ｍはイオン質量、ｚはイオンの荷数），信号強度の情報を含む測定データが得られる。質量分離装置３０６は、図で示したイオントラップ方式の他、磁場型・四重極型・飛行時間型などの質量分離を行う装置であってもよい。
【００２１】
３．データ解析
図４は、本発明の実施形態における測定データの比較解析の説明図である。
【００２２】
第１の方法で前処理した試料の測定データである第１のデータファイル４０１について、既存のデータベース検索ソフトウェアを用いてデータベース検索４０２し、ペプチドのアミノ酸配列の同定４０３を行う。そして、同定されたペプチドのアミノ酸配列から所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドの抽出４０４を行う。この抽出したペプチドが所定結合を形成すると仮定したときの質量対電荷比を算出し、第１の質量対電荷比リストの作成４０５を行う。
【００２３】
一方、第２の方法で前処理した試料の測定データである第２のデータファイル４０６から、第２の質量対電荷比リストの作成４０７を行う。この第２の質量対電荷比リストと、第１の質量対電荷比リストの作成４０５で作成した第１の質量対電荷比リストの質量対電荷比を比較する質量対電荷比の比較処理４０８を行う。そして、一致する質量対電荷比の抽出４０９を行う。これにより、所定結合を形成するアミノ酸残基の予測４１０を行う。このようにして、所定結合を形成するアミノ酸残基を同定することによって、タンパク質またはペプチドの立体構造を予測することが可能となる。図４の符号４０４，４０５，４０８，４０９，４１０の各段階について、図５，図６で更に詳細に説明する。
【００２４】
図５は、図４に示す比較解析の詳細を表す図である。第１のデータファイル５０１をデータベース検索してペプチドのアミノ酸配列を同定して得られた結果であるデータベース検索によるペプチドのアミノ酸配列の同定結果５０２から、所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドＰiとペプチドＰjが、所定結合を形成すると仮定したときの質量Ｍ（Ｐi,j）５０３を求める。この質量Ｍ（Ｐi,j）５０３について、電荷ｚ＝２，３，４，５のときの質量対電荷比を算出して質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚ（ｚ＝２，３，４，５）５０４とする。この質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚ（ｚ＝２，３，４，５）５０４と、第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚn５０５とを比較する比較処理５０６を実行する。比較処理５０６では、ｍ／ｚnに対して、±１.０以内で一致するＭ（Ｐi,j）／ｚがある場合（図中ＹＥＳ）、このＰiとＰjの所定結合に関わるアミノ酸残基の間で所定結合が形成されるとの予測結果５０７を得る。
【００２５】
図６は、図５に示す比較解析の詳細を記号で記載した図である。符号６０１は、所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドＰiとＰjが所定結合を形成すると仮定したときの質量Ｍ（Ｐi,j）を示し、ペプチドの総当りの組合せで質量を求める。符号６０２は、電荷ｚ＝２，３，４，５のときの質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚであり、符号６０３は、第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚnである。そして、電荷ｚ＝２，３，４，５のときの質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚ６０２と第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚn６０３とを比較することとなる。
【実施例１】
【００２６】
以下に本発明の実施例１について図面を用いて説明する。
【００２７】
実施例１として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の立体構造形成に重要な役割を果たすジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合部位の同定する場合を挙げる。図７において、アミノ酸配列７０１は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のアミノ酸配列であり、３５個のシステイン残基を含んでいる。ウシ血清アルブミンのジスルフィド結合部位を示す符号７０２では、３４個のシステイン残基によって１７ヶ所のＳ−Ｓ結合が形成されていることを示している。
【００２８】
まず、実施例１における前処理について説明する。前処理における第１の方法では、Ｓ−Ｓ結合を切断する切断剤として、還元剤であるジチオスレイトール添加する。還元化されチオール基となったシステイン残基のを、ヨードアセトアミドによってアルキル化する。そして、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を用いて、ＢＳＡをペプチド断片化する。これを調製して測定試料とする。第２の方法では、切断剤を添加せずにタンパク質分解酵素でペプチド断片化した後に、これを調製して測定試料とする。
【００２９】
この２種の試料を、nanoＬＣ／ＩＴ−ＴＯＦ（ナノ液体クロマトグラフ／イオントラップ−飛行時間型）質量分析装置（NanoFrontierL（日立ハイテク））によって質量分析し、測定データとして、第１のデータファイルと第２のデータファイルを得る。
【００３０】
次にデータ解析について説明する。第１のデータファイルをデータベース検索ソフトウェアMascotで検索する。この結果、システイン残基３２個を含む２３のペプチド断片のアミノ酸配列が同定される。確認として、第２のデータファイルをMascot検索したところ、システイン残基を含むペプチド断片は同定されず、Ｓ−Ｓ結合が切断されていないことが検証される。
【００３１】
データベース検索の結果得られた２３のペプチド断片について、総当りの組合せでＳ−Ｓ結合を形成したときの質量Ｍ（Ｐi,j）を算出する。このＭ（Ｐi,j）から、ｚ＝２，３，４，５のときの質量対電荷比Ｍ（Ｐi,j）／ｚを算出する。
【００３２】
この第１のデータファイルから算出したＭ（Ｐi,j）／ｚと、第２のデータファイルのうち信号強度が５００以上になるｍ／ｚnとを比較して、この差が±１.０以内にあるものを抽出する。そして、抽出されたＭ（Ｐi,j）／ｚの値をもつペプチドＰiとＰjのシステイン間で、Ｓ−Ｓ結合を形成していると予測される。
【００３３】
図８に、ＢＳＡのジスルフィド結合部位を予測するときのデータの一例を示す。ウシ血清アルブミンの第１のデータファイルから算出される質量対電荷比Ｍ（Ｐi,j）／ｚの一例８０１として、ウシ血清アルブミンの第１のデータファイルから同定された質量１０３３.５のペプチドＰiと質量１４９３.６のペプチドＰjが、ジスルフィド結合を形成すると仮定するとその質量は２３５７.０と算出され、この質量対電荷比Ｍ（Ｐi,j）／ｚはｚ＝５のとき４７２.４となることを示す。
【００３４】
ウシ血清アルブミンの第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚnの一例８０２に示すように、ウシ血清アルブミンの第２のデータファイルにｍ／ｚn４７３.３３４５があるため、このペプチドＰiとＰjはＳ−Ｓ結合を形成すると予測される。
【００３５】
ウシ血清アルブミンの１１４番目のシステイン残基と１２５番目のシステイン残基はジスルフィド結合を形成していることを示すチャート８０３に示すように、ペプチドＰiの１２５番目のシステイン残基と、ペプチドＰjの１１４番目のシステイン残基は、実際にＳ−Ｓ結合を形成しており、本発明が有効であることが示される。
【００３６】
以上より、本発明によって、タンパク質またはペプチドの立体構造を簡便に予測できるようになり、質量分析装置でタンパク質やペプチドの質量や一次構造だけでなく、二次構造や三次構造まで解析できるようになるという効果が得られる。
【００３７】
本明細書の開示の一例を以下列挙すると、
１．タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程と、前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程とを有する前処理工程と、前記第１の工程で得られた測定試料と前記第２の工程で得られた測定試料に関する質量分析データを比較することで所定結合の部位を予測する工程と、を有することにより立体構造を予測する立体構造予測方法。
【００３８】
２．上記１．において、前記所定結合は、タンパク質またはペプチドが立体構造を形成するための重要な結合、または翻訳後修飾部位における結合であり、前記切断剤は、前記所定結合を解離させる物質であることを特徴とする立体構造予測方法。
【００３９】
３．上記２．において、前記タンパク質またはペプチドが立体構造を形成するための重要な結合とは、ジスルフィド結合，水素結合，イオン結合，疎水性相互作用であり、翻訳後修飾部位における結合とは、リン酸化部位や糖鎖修飾部位などであり、前記所定結合を解離させる物質とは、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質や水素結合を切断する変性剤などであることを特徴とする立体構造予測方法。
【００４０】
４．タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程を用いて得られる測定試料の質量分析データから同定された、前記所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドの質量を基に、２つ以上のペプチドの前記所定結合に関わるアミノ酸残基間でジスルフィド結合を形成しているときに観測される予測質量を算出する手順と、前記予測質量と前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程を用いて得られる測定試料の質量分析データを比較して一致する質量があるかを探索する手順を、コンピュータに実行させる立体構造予測プログラム。
【００４１】
５．上記４．において、前記プログラムとは、前記所定結合の部位を予測することにより立体構造を予測することを特徴とする立体構造予測プログラム。
【００４２】
６．試料を成分に分離し、その分離された成分をイオン化して質量を分析する質量分析部と、前記質量分析部からの分析データを処理するデータ処理部を有する質量分析装置において、タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程を用いて得られる測定試料を質量分析した結果を第１のデータファイルとする処理と、前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程を用いて得られる測定試料を質量分析した結果を第２のデータファイルとする処理と、を実行することを特徴とする質量分析装置。
【００４３】
本発明は、上記実施例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲内で、種々変形可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の実施形態の処理の流れを示した図である。
【図２】本発明の実施形態の一例である前処理の概略図である。
【図３】本発明の実施形態のクロマトグラフ質量分析装置の構成例を示す概略図である。
【図４】本発明の実施形態における測定データの比較解析の説明図である。
【図５】図４に示す比較解析の詳細を表す図である。
【図６】図５に示す比較解析の詳細を記号で記載した図である。
【図７】ウシ血清アルブミンのアミノ酸配列とジスルフィド結合部位である。
【図８】ＢＳＡのジスルフィド結合部位予測の一例である。
【符号の説明】
【００４５】
１０１ 試料（タンパク質またはペプチド）
１０２ 前処理
１０３ 質量分析
１０４ 比較解析処理
１０５ 予測された所定結合部位
２０１ 試料
２０２ 切断剤の添加処理
２０３ 酵素消化処理
２０４ 測定試料
３０１ 前処理後の測定試料
３０２ 液体クロマトグラフ部
３０３ 分離カラム
３０４ 質量分析装置本体
３０５ イオン源
３０６ 質量分離装置
３０７ 検出器
３０８ データ処理装置
４０１ 第１の方法で前処理した試料の測定データである第１のデータファイル
４０２ データベース検索
４０３ ペプチドのアミノ酸配列の同定
４０４ 所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドの抽出
４０５ 第１の質量対電荷比リストの作成
４０６ 第２の方法で前処理した試料の測定データである第２のデータファイル
４０７ 第２の質量対電荷比リストの作成
４０８ 質量対電荷比の比較処理
４０９ 一致する質量対電荷比の抽出
４１０ 所定結合を形成するアミノ酸残基の予測
５０１ 第１のデータファイル
５０２ データベース検索によるペプチドのアミノ酸配列の同定結果
５０３ 質量Ｍ（Ｐi,j）
５０４ 質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚ（ｚ＝２，３，４，５）
５０５ 第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚn
５０６ 比較処理
５０７ 予測結果
６０１ 所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドＰiとＰjが所定結合を形成すると仮定したときの質量Ｍ（Ｐi,j）
６０２ 電荷ｚ＝２，３，４，５のときの質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚ
６０３ 第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚn
７０１ アミノ酸配列
７０２ ウシ血清アルブミンのジスルフィド結合部位
８０１ ウシ血清アルブミンの第１のデータファイルから算出される質量対電荷比Ｍ（Ｐi,j）／ｚの一例
８０２ ウシ血清アルブミンの第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚnの一例
８０３ ウシ血清アルブミンの１１４番目のシステイン残基と１２５番目のシステイン残
基はジスルフィド結合を形成していることを示すチャート
【技術分野】
【０００１】
本発明は、立体構造予測方法，立体構造予測プログラム及び質量分析装置に関し、特にタンパク質またはペプチドの立体構造解析と翻訳後修飾部位の解析に好適な技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析のための一般的な前処理方法では、タンパク質やペプチドに含まれるシステイン残基間のジスルフィド結合を還元化する還元剤や水素結合を切断する変性剤などを添加することによって、タンパク質の立体構造を形成するために重要な結合を切断し、タンパク質分解酵素などによるタンパク質のペプチド断片化が効率良く進むよう処理する。そのため、得られる質量分析データにはタンパク質の立体構造情報は含まれていない。これに対し、非特許文献１では対象試料のジスルフィド結合を切断せずに質量分析し、対象試料のアミノ酸配列を基に構築したＭＳ／ＭＳスペクトルデータベースに対して、データベース検索してジスルフィド結合を予測する。
【０００３】
【非特許文献１】Jiaxi Wang, Bin Ma, Weiwu Chen“Disulfide bonded Dipeptide Analysis with PEAKS and Q-TOF Mass Spectrometry”ＡＳＭＳ２００７，June ３−７、Ｐ.６−Ｐ.７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
タンパク質は、固有の立体構造をとることによって、生体中でそれぞれの機能を発揮することができる。そのため、生体中でタンパク質がどのような機能を果たすかを解明するためには、立体構造の解析が重要となる。
【０００５】
タンパク質の立体構造形成には、アミノ酸配列上で離れた位置に存在するシステイン残基間のジスルフィド結合や水素結合などが大きく影響する。また、機能発現のためには糖鎖やリン酸基などの翻訳後修飾が重要となっている。
【０００６】
現在の質量分析装置では、前処理段階でタンパク質やペプチドの構造形成に重要な結合を決断するという処置を行うため、このような結合部位についての情報が失われ、立体構造を推測することができないという課題がある。さらに、前述の非特許文献１では、ジスルフィド結合に関する質量分析について述べているが、ＭＳ／ＭＳスペクトルデータベースを構築する際に、構造予測する対象試料のアミノ酸配列が不明である場合を配慮されていない、またジスルフィド結合以外のタンパク質立体構造を形成するために重要な結合や翻訳後修飾部位の予測に対応していない、という課題がある。
【０００７】
本発明の１つの目的は、立体構造形成に重要な結合を保ったままの試料を質量分析し、得られたデータから結合部位や翻訳後修飾部位を予測し、立体構造情報の取得を実現することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの特徴は、立体構造形成に重要な結合または翻訳後修飾部位の結合を切断する切断剤を添加する第１の方法を用いて質量分析して得られた第１のデータファイルと、前述の切断剤を添加しない第２の方法を用いて質量分析して得られた第２のデータファイルを比較解析する方法にある。これにより、タンパク質またはペプチドの立体構造形成に重要な結合の部位や、翻訳後修飾の部位を質量分析装置で予測する方法を実現するものである。
【０００９】
本発明の他の特徴は、（１）立体構造解析方法において、前記第１の方法と前記第２の方法で前処理し、それぞれの試料を質量分析装置で測定することにより、タンパク質やペプチドの立体構造情報を得るものである。
【００１０】
本発明のその他の特徴は、（２）立体構造解析プログラムにおいて、前記第１の方法で前処理した試料の質量分析データをデータベース検索して、アミノ酸配列を同定する。同定されたアミノ酸配列から、立体構造形成に重要な結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドが結合を形成するとしたときの質量、または翻訳後修飾されるアミノ酸残基を含むペプチドが翻訳後修飾されるとしたときの質量を求める。この質量を、第２の方法で前処理した試料の質量分析データと比較し、一致する質量を探索することで、立体構造に重要な結合を形成する部位、または翻訳後修飾される部位を予測するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の１つの態様によれば、質量分析データから、タンパク質またはペプチドの立体構造形成に重要な結合の部位や、翻訳後修飾部位を予測することが可能となる。
【００１２】
また、本発明の他の態様によれば、複雑な処理や条件検討をせずに簡便にタンパク質の構造を解析することが可能となり、今まで困難であったタンパク質の構造や機能の解明に貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の実施形態の一例を、図１から図８を用いて説明する。
【００１４】
図１は、本発明の実施形態の処理の流れを示した図である。
【００１５】
試料（タンパク質またはペプチド）１０１を２通りの方法で前処理１０２を行う。１つは、切断剤を添加して所定結合を切断する第１の方法である。もう１つは、切断剤を添加せずに所定結合を切断しない第２の方法である。この２通りで前処理を行い、ペプチド断片化する。この２通りで処理した試料を質量分析１０３し、それぞれの測定データとして、第１のデータファイルと第２のデータファイルを得る。この第１のデータファイルと第２のデータファイルを比較解析処理１０４することで、予測された所定結合部位１０５の情報を得る。以下、各段階について詳細に説明する。
【００１６】
１．前処理
図２は、本発明の実施形態の前処理の一例を示す概略図である。
【００１７】
図２左側の左フローは、第１の方法を表しており、クロマトグラフ質量分析装置の通常の前処理方法と同じである。タンパク質またはペプチドである試料２０１に、切断剤を添加する切断剤の添加処理２０２を行い、所定結合を切断後、タンパク質試料の場合は酵素消化処理２０３を行うことにより、ペプチド断片化し、測定試料２０４とする。
【００１８】
図２右側の右フローは、第２の方法を表しており、所定結合を切断しない前処理方法である。タンパク質またはペプチドである試料２０１に、タンパク質試料の場合は酵素消化処理２０３して、測定試料２０４とする。
【００１９】
２．質量分析
図３は、本発明の実施形態のクロマトグラフ質量分析装置の構成例を示す概略図である。
【００２０】
前処理後の測定試料３０１を、液体クロマトグラフ部３０２の分離カラム３０３を用い、吸着・分配などの相互作用によって、ペプチド成分が保持時間に従って分離される。そして、質量分析装置本体３０４のイオン源３０５でイオン化後、質量分離装置３０６で質量分離されて検出器３０７で質量数とその信号強度が検出される。この検出データを、コンピュータを有するデータ処理装置３０８に取り込み、各ペプチドフラグメントの保持時間，質量対電荷比ｍ／ｚ（ｍはイオン質量、ｚはイオンの荷数），信号強度の情報を含む測定データが得られる。質量分離装置３０６は、図で示したイオントラップ方式の他、磁場型・四重極型・飛行時間型などの質量分離を行う装置であってもよい。
【００２１】
３．データ解析
図４は、本発明の実施形態における測定データの比較解析の説明図である。
【００２２】
第１の方法で前処理した試料の測定データである第１のデータファイル４０１について、既存のデータベース検索ソフトウェアを用いてデータベース検索４０２し、ペプチドのアミノ酸配列の同定４０３を行う。そして、同定されたペプチドのアミノ酸配列から所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドの抽出４０４を行う。この抽出したペプチドが所定結合を形成すると仮定したときの質量対電荷比を算出し、第１の質量対電荷比リストの作成４０５を行う。
【００２３】
一方、第２の方法で前処理した試料の測定データである第２のデータファイル４０６から、第２の質量対電荷比リストの作成４０７を行う。この第２の質量対電荷比リストと、第１の質量対電荷比リストの作成４０５で作成した第１の質量対電荷比リストの質量対電荷比を比較する質量対電荷比の比較処理４０８を行う。そして、一致する質量対電荷比の抽出４０９を行う。これにより、所定結合を形成するアミノ酸残基の予測４１０を行う。このようにして、所定結合を形成するアミノ酸残基を同定することによって、タンパク質またはペプチドの立体構造を予測することが可能となる。図４の符号４０４，４０５，４０８，４０９，４１０の各段階について、図５，図６で更に詳細に説明する。
【００２４】
図５は、図４に示す比較解析の詳細を表す図である。第１のデータファイル５０１をデータベース検索してペプチドのアミノ酸配列を同定して得られた結果であるデータベース検索によるペプチドのアミノ酸配列の同定結果５０２から、所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドＰiとペプチドＰjが、所定結合を形成すると仮定したときの質量Ｍ（Ｐi,j）５０３を求める。この質量Ｍ（Ｐi,j）５０３について、電荷ｚ＝２，３，４，５のときの質量対電荷比を算出して質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚ（ｚ＝２，３，４，５）５０４とする。この質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚ（ｚ＝２，３，４，５）５０４と、第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚn５０５とを比較する比較処理５０６を実行する。比較処理５０６では、ｍ／ｚnに対して、±１.０以内で一致するＭ（Ｐi,j）／ｚがある場合（図中ＹＥＳ）、このＰiとＰjの所定結合に関わるアミノ酸残基の間で所定結合が形成されるとの予測結果５０７を得る。
【００２５】
図６は、図５に示す比較解析の詳細を記号で記載した図である。符号６０１は、所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドＰiとＰjが所定結合を形成すると仮定したときの質量Ｍ（Ｐi,j）を示し、ペプチドの総当りの組合せで質量を求める。符号６０２は、電荷ｚ＝２，３，４，５のときの質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚであり、符号６０３は、第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚnである。そして、電荷ｚ＝２，３，４，５のときの質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚ６０２と第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚn６０３とを比較することとなる。
【実施例１】
【００２６】
以下に本発明の実施例１について図面を用いて説明する。
【００２７】
実施例１として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の立体構造形成に重要な役割を果たすジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合部位の同定する場合を挙げる。図７において、アミノ酸配列７０１は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のアミノ酸配列であり、３５個のシステイン残基を含んでいる。ウシ血清アルブミンのジスルフィド結合部位を示す符号７０２では、３４個のシステイン残基によって１７ヶ所のＳ−Ｓ結合が形成されていることを示している。
【００２８】
まず、実施例１における前処理について説明する。前処理における第１の方法では、Ｓ−Ｓ結合を切断する切断剤として、還元剤であるジチオスレイトール添加する。還元化されチオール基となったシステイン残基のを、ヨードアセトアミドによってアルキル化する。そして、トリプシンなどのタンパク質分解酵素を用いて、ＢＳＡをペプチド断片化する。これを調製して測定試料とする。第２の方法では、切断剤を添加せずにタンパク質分解酵素でペプチド断片化した後に、これを調製して測定試料とする。
【００２９】
この２種の試料を、nanoＬＣ／ＩＴ−ＴＯＦ（ナノ液体クロマトグラフ／イオントラップ−飛行時間型）質量分析装置（NanoFrontierL（日立ハイテク））によって質量分析し、測定データとして、第１のデータファイルと第２のデータファイルを得る。
【００３０】
次にデータ解析について説明する。第１のデータファイルをデータベース検索ソフトウェアMascotで検索する。この結果、システイン残基３２個を含む２３のペプチド断片のアミノ酸配列が同定される。確認として、第２のデータファイルをMascot検索したところ、システイン残基を含むペプチド断片は同定されず、Ｓ−Ｓ結合が切断されていないことが検証される。
【００３１】
データベース検索の結果得られた２３のペプチド断片について、総当りの組合せでＳ−Ｓ結合を形成したときの質量Ｍ（Ｐi,j）を算出する。このＭ（Ｐi,j）から、ｚ＝２，３，４，５のときの質量対電荷比Ｍ（Ｐi,j）／ｚを算出する。
【００３２】
この第１のデータファイルから算出したＭ（Ｐi,j）／ｚと、第２のデータファイルのうち信号強度が５００以上になるｍ／ｚnとを比較して、この差が±１.０以内にあるものを抽出する。そして、抽出されたＭ（Ｐi,j）／ｚの値をもつペプチドＰiとＰjのシステイン間で、Ｓ−Ｓ結合を形成していると予測される。
【００３３】
図８に、ＢＳＡのジスルフィド結合部位を予測するときのデータの一例を示す。ウシ血清アルブミンの第１のデータファイルから算出される質量対電荷比Ｍ（Ｐi,j）／ｚの一例８０１として、ウシ血清アルブミンの第１のデータファイルから同定された質量１０３３.５のペプチドＰiと質量１４９３.６のペプチドＰjが、ジスルフィド結合を形成すると仮定するとその質量は２３５７.０と算出され、この質量対電荷比Ｍ（Ｐi,j）／ｚはｚ＝５のとき４７２.４となることを示す。
【００３４】
ウシ血清アルブミンの第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚnの一例８０２に示すように、ウシ血清アルブミンの第２のデータファイルにｍ／ｚn４７３.３３４５があるため、このペプチドＰiとＰjはＳ−Ｓ結合を形成すると予測される。
【００３５】
ウシ血清アルブミンの１１４番目のシステイン残基と１２５番目のシステイン残基はジスルフィド結合を形成していることを示すチャート８０３に示すように、ペプチドＰiの１２５番目のシステイン残基と、ペプチドＰjの１１４番目のシステイン残基は、実際にＳ−Ｓ結合を形成しており、本発明が有効であることが示される。
【００３６】
以上より、本発明によって、タンパク質またはペプチドの立体構造を簡便に予測できるようになり、質量分析装置でタンパク質やペプチドの質量や一次構造だけでなく、二次構造や三次構造まで解析できるようになるという効果が得られる。
【００３７】
本明細書の開示の一例を以下列挙すると、
１．タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程と、前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程とを有する前処理工程と、前記第１の工程で得られた測定試料と前記第２の工程で得られた測定試料に関する質量分析データを比較することで所定結合の部位を予測する工程と、を有することにより立体構造を予測する立体構造予測方法。
【００３８】
２．上記１．において、前記所定結合は、タンパク質またはペプチドが立体構造を形成するための重要な結合、または翻訳後修飾部位における結合であり、前記切断剤は、前記所定結合を解離させる物質であることを特徴とする立体構造予測方法。
【００３９】
３．上記２．において、前記タンパク質またはペプチドが立体構造を形成するための重要な結合とは、ジスルフィド結合，水素結合，イオン結合，疎水性相互作用であり、翻訳後修飾部位における結合とは、リン酸化部位や糖鎖修飾部位などであり、前記所定結合を解離させる物質とは、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質や水素結合を切断する変性剤などであることを特徴とする立体構造予測方法。
【００４０】
４．タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程を用いて得られる測定試料の質量分析データから同定された、前記所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドの質量を基に、２つ以上のペプチドの前記所定結合に関わるアミノ酸残基間でジスルフィド結合を形成しているときに観測される予測質量を算出する手順と、前記予測質量と前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程を用いて得られる測定試料の質量分析データを比較して一致する質量があるかを探索する手順を、コンピュータに実行させる立体構造予測プログラム。
【００４１】
５．上記４．において、前記プログラムとは、前記所定結合の部位を予測することにより立体構造を予測することを特徴とする立体構造予測プログラム。
【００４２】
６．試料を成分に分離し、その分離された成分をイオン化して質量を分析する質量分析部と、前記質量分析部からの分析データを処理するデータ処理部を有する質量分析装置において、タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程を用いて得られる測定試料を質量分析した結果を第１のデータファイルとする処理と、前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程を用いて得られる測定試料を質量分析した結果を第２のデータファイルとする処理と、を実行することを特徴とする質量分析装置。
【００４３】
本発明は、上記実施例に限定されるものではなく、その技術思想の範囲内で、種々変形可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の実施形態の処理の流れを示した図である。
【図２】本発明の実施形態の一例である前処理の概略図である。
【図３】本発明の実施形態のクロマトグラフ質量分析装置の構成例を示す概略図である。
【図４】本発明の実施形態における測定データの比較解析の説明図である。
【図５】図４に示す比較解析の詳細を表す図である。
【図６】図５に示す比較解析の詳細を記号で記載した図である。
【図７】ウシ血清アルブミンのアミノ酸配列とジスルフィド結合部位である。
【図８】ＢＳＡのジスルフィド結合部位予測の一例である。
【符号の説明】
【００４５】
１０１ 試料（タンパク質またはペプチド）
１０２ 前処理
１０３ 質量分析
１０４ 比較解析処理
１０５ 予測された所定結合部位
２０１ 試料
２０２ 切断剤の添加処理
２０３ 酵素消化処理
２０４ 測定試料
３０１ 前処理後の測定試料
３０２ 液体クロマトグラフ部
３０３ 分離カラム
３０４ 質量分析装置本体
３０５ イオン源
３０６ 質量分離装置
３０７ 検出器
３０８ データ処理装置
４０１ 第１の方法で前処理した試料の測定データである第１のデータファイル
４０２ データベース検索
４０３ ペプチドのアミノ酸配列の同定
４０４ 所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドの抽出
４０５ 第１の質量対電荷比リストの作成
４０６ 第２の方法で前処理した試料の測定データである第２のデータファイル
４０７ 第２の質量対電荷比リストの作成
４０８ 質量対電荷比の比較処理
４０９ 一致する質量対電荷比の抽出
４１０ 所定結合を形成するアミノ酸残基の予測
５０１ 第１のデータファイル
５０２ データベース検索によるペプチドのアミノ酸配列の同定結果
５０３ 質量Ｍ（Ｐi,j）
５０４ 質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚ（ｚ＝２，３，４，５）
５０５ 第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚn
５０６ 比較処理
５０７ 予測結果
６０１ 所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドＰiとＰjが所定結合を形成すると仮定したときの質量Ｍ（Ｐi,j）
６０２ 電荷ｚ＝２，３，４，５のときの質量対電荷比の計算値Ｍ（Ｐi,j）／ｚ
６０３ 第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚn
７０１ アミノ酸配列
７０２ ウシ血清アルブミンのジスルフィド結合部位
８０１ ウシ血清アルブミンの第１のデータファイルから算出される質量対電荷比Ｍ（Ｐi,j）／ｚの一例
８０２ ウシ血清アルブミンの第２のデータファイルから得られる質量対電荷比ｍ／ｚnの一例
８０３ ウシ血清アルブミンの１１４番目のシステイン残基と１２５番目のシステイン残
基はジスルフィド結合を形成していることを示すチャート
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程と、前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程とを有する前処理工程と、
前記第１の工程で得られた測定試料と前記第２の工程で得られた測定試料に関する質量分析データを比較することで所定結合の部位を予測する工程と、
を有することにより立体構造を予測する立体構造予測方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記所定結合は、タンパク質またはペプチドが立体構造を形成するための重要な結合、または翻訳後修飾部位における結合であり、前記切断剤は、前記所定結合を解離させる物質であることを特徴とする立体構造予測方法。
【請求項３】
請求項２において、
前記タンパク質またはペプチドが立体構造を形成するための重要な結合とは、ジスルフィド結合，水素結合，イオン結合，疎水性相互作用であり、翻訳後修飾部位における結合とは、リン酸化部位や糖鎖修飾部位などであり、前記所定結合を解離させる物質とは、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質や水素結合を切断する変性剤などであることを特徴とする立体構造予測方法。
【請求項４】
タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程を用いて得られる測定試料の質量分析データから同定された、前記所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドの質量を基に、２つ以上のペプチドの前記所定結合に関わるアミノ酸残基間でジスルフィド結合を形成しているときに観測される予測質量を算出する手順と、
前記予測質量と前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程を用いて得られる測定試料の質量分析データを比較して一致する質量があるかを探索する手順を、コンピュータに実行させる立体構造予測プログラム。
【請求項５】
請求項４において、
前記プログラムとは、前記所定結合の部位を予測することにより立体構造を予測することを特徴とする立体構造予測プログラム。
【請求項６】
試料を成分に分離し、その分離された成分をイオン化して質量を分析する質量分析部と、前記質量分析部からの分析データを処理するデータ処理部を有する質量分析装置において、
タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程を用いて得られる測定試料を質量分析した結果を第１のデータファイルとする処理と、
前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程を用いて得られる測定試料を質量分析した結果を第２のデータファイルとする処理と、を
実行することを特徴とする質量分析装置。
【請求項１】
タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程と、前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程とを有する前処理工程と、
前記第１の工程で得られた測定試料と前記第２の工程で得られた測定試料に関する質量分析データを比較することで所定結合の部位を予測する工程と、
を有することにより立体構造を予測する立体構造予測方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記所定結合は、タンパク質またはペプチドが立体構造を形成するための重要な結合、または翻訳後修飾部位における結合であり、前記切断剤は、前記所定結合を解離させる物質であることを特徴とする立体構造予測方法。
【請求項３】
請求項２において、
前記タンパク質またはペプチドが立体構造を形成するための重要な結合とは、ジスルフィド結合，水素結合，イオン結合，疎水性相互作用であり、翻訳後修飾部位における結合とは、リン酸化部位や糖鎖修飾部位などであり、前記所定結合を解離させる物質とは、ジスルフィド結合に対して還元性を示す物質や水素結合を切断する変性剤などであることを特徴とする立体構造予測方法。
【請求項４】
タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程を用いて得られる測定試料の質量分析データから同定された、前記所定結合に関わるアミノ酸残基を含むペプチドの質量を基に、２つ以上のペプチドの前記所定結合に関わるアミノ酸残基間でジスルフィド結合を形成しているときに観測される予測質量を算出する手順と、
前記予測質量と前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程を用いて得られる測定試料の質量分析データを比較して一致する質量があるかを探索する手順を、コンピュータに実行させる立体構造予測プログラム。
【請求項５】
請求項４において、
前記プログラムとは、前記所定結合の部位を予測することにより立体構造を予測することを特徴とする立体構造予測プログラム。
【請求項６】
試料を成分に分離し、その分離された成分をイオン化して質量を分析する質量分析部と、前記質量分析部からの分析データを処理するデータ処理部を有する質量分析装置において、
タンパク質またはペプチドを有する試料について切断剤を添加して所定結合を切断して処理する第１の工程を用いて得られる測定試料を質量分析した結果を第１のデータファイルとする処理と、
前記試料について前記切断剤を添加しないで所定結合を残したまま処理する第２の工程を用いて得られる測定試料を質量分析した結果を第２のデータファイルとする処理と、を
実行することを特徴とする質量分析装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００９−１６８６９５（Ｐ２００９−１６８６９５Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８６１７（Ｐ２００８−８６１７）
【出願日】平成２０年１月１８日（２００８．１．１８）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１８日（２００８．１．１８）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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