第１染色体長腕２４領域、ＮＥＵＲＬ遺伝子、またはＣＵＸ２遺伝子の一塩基多型に基づく不整脈の検査方法
【課題】心房細動等の不整脈を検査する方法を提供する。
【解決手段】第１染色体長腕２４領域、ＮＥＵＲＬ遺伝子、またはＣＵＸ２遺伝子に存在する一塩基多型を分析。該一塩基多型が、特定の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型であり、その相補配列を有する不整脈検査用プローブ、及び塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる不整脈検査用プライマーを提供。該分析結果に基づいて不整脈の発症リスクおよび／または発症の有無を検査する。
【解決手段】第１染色体長腕２４領域、ＮＥＵＲＬ遺伝子、またはＣＵＸ２遺伝子に存在する一塩基多型を分析。該一塩基多型が、特定の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型であり、その相補配列を有する不整脈検査用プローブ、及び塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる不整脈検査用プライマーを提供。該分析結果に基づいて不整脈の発症リスクおよび／または発症の有無を検査する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は心房細動等の不整脈の発症および／または罹患リスクを判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
不整脈（Arrhythmia）とは、心拍数や心拍リズムが一定でない症状をいう。不整脈は心拍数等に基づき様々な種類に分類されるが、中でも心房細動（Atrial fibrillation（ＡＦ））は、日本を含む多くの国において最も頻繁に見られる不整脈の一種である。心房細動とは、心房の脈数が不規則で、かつ高頻度になる症状をいい、罹患率・死亡率（morbidity and mortality）の増大を伴う。心房細動の危険因子としては、性別、年齢、高血圧、肥満、および他の心疾患が知られており、よってこれら危険因子に関連する遺伝要因は、心房細動のリスクを予測するための判断材料になる。また、心房細動の家系には固有の遺伝要因が存在すると考えられ、よって心房細動の家族歴が陽性であることは上記危険因子とは別個に心房細動のリスクを予測するための判断材料になる。
【０００３】
心房細動の家系研究により、イオンチャンネルをコードするいくつかの遺伝子における変異が心房細動に関連して見出されたが、それらの変異は心房細動の全症例に当てはまるわけではなかった。
【０００４】
近年、ゲノムワイド相関解析（ＧＷＡＳ）によって心房細動の発症に関連する遺伝子や一塩基多型（ＳＮＰｓ）を同定する試みがなされている。欧米人被検者を用いたＧＷＡＳにより、これまでに、心房細動感受性をもたらす遺伝変異が染色体上のいくつかの箇所に存在することが示唆されている（非特許文献１〜５）。心房細動に関連するさらなる遺伝変異の同定や、心房細動に関連する複雑な遺伝要因を理解するためには、日本人等のアジア人やそれ以外の人種についてもＧＷＡＳを行う必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gudbjartsson DF. et. al., Nature. 2007 Jul 19;448(7151):353-357
【非特許文献２】Gudbjartsson DF. et. al., Nat Genet. 2009 Aug;41(8):876-878
【非特許文献３】Benjamin EJ. et. al., Nat Genet. 2009 Aug;41(8):879-881
【非特許文献４】Holm H. et. al., Nat Genet. 2010 Feb;42(2):117-122
【非特許文献５】Ellinor PT. et. al., Nat Genet. 2010 Mar;42(3):240-244
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、心房細動等の不整脈の発症リスクや発症を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第１染色体長腕２４領域、ＮＥＵＲＬ遺伝子、またはＣＵＸ２遺伝子に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）が心房細動と相関することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより心房細動等の不整脈の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]
以下の（１）〜（３）のいずれかの領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて不整脈を検査することを特徴とする、不整脈の発症および／または罹患リスクの判定方法。
（１）第１染色体長腕２４領域
（２）ＮＥＵＲＬ遺伝子
（３）ＣＵＸ２遺伝子
[２]
前記一塩基多型が、配列番号１、２、または３の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、[１]に記載の方法。
[３]
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号４〜２０から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基である、[２]に記載の方法。
[４]
前記不整脈が心房細動である、[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。
[５]
配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する不整脈検査用プローブ。
[６]
配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる不整脈検査用プライマー。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、これまで予測が困難であった不整脈の発症リスク（罹患リスク）を正確かつ簡便に予測することができる。また、不整脈の発症を正確かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は不整脈の予防や早期治療に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒト第１染色体長腕２４領域（１ｑ２４領域）の連鎖不平衡（ＬＤ）マップおよび遺伝子を示す図。下向きの矢印は、rs639652の位置を示す。上段はＨａｐＭａｐプロジェクトの日本人のデータベース（ＪＰＴ）に基づくＬＤマップ、下段はヨーロッパ人のデータベース（ＣＥＵ）に基づくＬＤマップ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第１染色体長腕２４領域、ＮＥＵＲＬ遺伝子、またはＣＵＸ２遺伝子に存在するＳＮＰを分析し、該分析結果に基づいて不整脈を検査することを特徴とする、不整脈の発症および／または罹患リスクの判定方法である。なお、本発明において、「検査」とは不整脈の発症リスクの検査及び不整脈の発症の有無の検査を含む。本発明の方法においては、ＳＮＰの分析結果を、不整脈の発症リスクおよび／または発症の有無と関連付ける。
【００１２】
不整脈としては、頻脈性不整脈、徐脈性不整脈、期外収縮が挙げられる。頻脈性不整脈としては、洞性頻脈、心室性頻拍、心房細動、心房粗動、多源性心房頻拍、心室細動、心室粗動、上室性頻拍が挙げられる。徐脈性不整脈としては、洞房ブロック、房室ブロック、接合部性調律、洞不全症候群、呼吸性不整脈、脚ブロックが挙げられる。期外収縮としては、心房性期外収縮、心室性期外収縮が挙げられる。これらの中では、心房細動を検査するのが好ましい。
【００１３】
ヒト第１染色体長腕２４領域（１ｑ２４領域）に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs639652を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。rs639652はGenBank Accession No. NT_004487.18の21103228番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味する。リスクアレルはＣであるが、このＳＮＰと不整脈との関連は劣性モデルであるため、ホモ接合であるＣＣの場合のみ不整脈の可能性または発症リスクが高くなる。
【００１４】
また、染色体１ｑ２４領域においてrs639652の近傍にはＰＲＲＸ１遺伝子が存在する。ＰＲＲＸ１遺伝子は、ペア型ファミリーに属するホメオボックスタンパク質をコードし、各種遺伝子の発現や筋肉の発生に関与する。rs639652は、ＰＲＲＸ１遺伝子のプロモーター領域に位置し、よって、ＰＲＲＸ１遺伝子の発現に関わると考えられる。したがって、ＰＲＲＸ１遺伝子に存在するＳＮＰを解析することによっても不整脈を検査することができる。ＰＲＲＸ１遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000001.10の170633313〜170708541の領域が挙げられる。
【００１５】
ＮＥＵＲＬ遺伝子は、ヒト第１０染色体長腕２５．１領域（１０ｑ２５．１領域）に存在する。ＮＥＵＲＬ遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000010.10の105253735〜105352309の領域が挙げられる。
【００１６】
ＮＥＵＲＬ遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs6584555を挙げることができる。rs6584555はGenBank Accession No. NT_030059.12の24048137番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基がＣである場合は不整脈の可能性または発症リスクが高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、rs6584555がＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順で不整脈の可能性または発症リスクが高い。
【００１７】
ＣＵＸ２遺伝子は、cut-likeホメオボックス２タンパク質をコードし、ヒト第１２染色体長腕２４領域（１２ｑ２４領域）に存在する。ＣＵＸ２遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000012.11の111471828〜111788358の領域が挙げられる。
【００１８】
ＣＵＸ２遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs6490029を挙げることができる。rs6490029はGenBank Accession No. NT_009775.16の2267966番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味する。リスクアレルはＡであるが、このＳＮＰと不整脈との関連は劣性モデルであるため、ホモ接合であるＡＡの場合のみ不整脈の可能性または発症リスクが高くなる。
【００１９】
なお、rs639652、rs6584555、およびrs6490029について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１、２、および３に示した。６１番目の塩基が多型を有する。
【００２０】
本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。
【００２１】
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たす塩基をいう。また上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。もしくは、複数人（通常は２０−４０人程度）から採取したＤＮＡをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にあるＳＮＰを探索することにより同定することもできる。
【００２２】
rs639652とｒ2＞０．８で連鎖不平衡にある塩基としては、rs12760630、rs736791、rs541557、rs577676、rs763567、rs6658866、rs3903239、rs6677540、rs2022372、rs1234275、rs12755237、およびrs593560が挙げられる。これらＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号４〜１５に示した。６１番目の塩基が多型を有する。これらＳＮＰと不整脈との関連は劣性モデルであるため、リスクアレルのホモ接合である場合のみ不整脈の可能性または発症リスクが高くなる。
【００２３】
rs6584555とｒ2＞０．８で連鎖不平衡にある塩基としては、rs7904046、rs6584554、rs6584557、およびrs7069733が挙げられる。これらＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１６〜１９に示した。６１番目の塩基が多型を有する。これらＳＮＰは、リスクアレルのホモ接合体 ＞ リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体 ＞ 非リスクアレルのホモ接合体の順で不整脈の可能性または発症リスクが高い。
【００２４】
rs6490029とｒ2＞０．８で連鎖不平衡にある塩基としては、rs916682が挙げられる。このＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、配列番号２０に示した。６１番目の塩基が多型を有する。このＳＮＰと不整脈との関連は劣性モデルであるため、リスクアレルのホモ接合である場合のみ不整脈の可能性または発症リスクが高くなる。
【００２５】
rs639652、rs6584555、またはrs6490029とｒ2＞０．８で連鎖不平衡にある各塩基について、そのアレルの組み合わせ、およびリスクアレルを表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて不整脈と関連付けることにより、不整脈を検査することができる。上記ＳＮＰは単独で解析されてもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つを含む複数のＳＮＰｓをまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。例えば、上記ＳＮＰの複数をまとめて解析してもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つと、不整脈と相関する既知のＳＮＰｓ（非特許文献１〜５）や既知のＳＮＰｓと連鎖不平衡にあるＳＮＰｓとを組み合わせて解析してもよい。不整脈と相関する複数のＳＮＰｓをまとめて解析すれば、不整脈の検査の精度が向上する。なお、いずれのＳＮＰも、二本鎖ＤＮＡのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、ＰＲＲＸ１遺伝子、ＮＥＵＲＬ遺伝子、またはＣＵＸ２遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
【００２８】
ＳＮＰの解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。ＳＮＰの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００２９】
ＳＮＰの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめＳＮＰ部位を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００３１】
また、ＳＮＰの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【００３２】
また、ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３３】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３４】
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
【００３５】
このようにしてＳＮＰがいずれの塩基であるかを決定することで、不整脈を検査するためのデータを得ることができる。
【００３６】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、不整脈を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記ＳＮＰ部位を含み、ハイブリダイズの有無によってＳＮＰ部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。
【００３７】
また、プライマーとしては、上記ＳＮＰ部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記ＳＮＰ部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
【００３８】
上記ＳＮＰ部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
【００３９】
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００４１】
（１）心房細動と相関するＳＮＰｓの同定
心房細動感受性を決定する遺伝的変異を同定するために、日本人被検者を用いてゲノムワイド相関解析（ＧＷＡＳ）を行った。ＧＷＡＳとは、疾患等の表現型に関わる遺伝的変異を探索する遺伝統計学的手法である。例えば、ヒトゲノム全体を網羅するような数十万〜１００万ヶ所のＳＮＰｓを用いて、ある疾患の患者（ケース）とその疾患にかかっていない被験者（コントロール）との間で、多型の頻度に差があるかどうかを統計的に検定することで、疾患と関連する遺伝的変異を見出すことができる。
【００４２】
＜被検者＞
ＧＷＡＳの１次試験に用いた心房細動の全被検者（ケース（Case））、および２次試験に用いた心房細動のほとんどの被検者は、東京大学医科学研究所のBioBank Japan (BBJ) (Nakamura, Y. The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol 5, 696-7 (2007))
に登録された心房細動の患者群から、臨床診断を経て採用した。２次試験に用いた心房細動の一部の被検者は、東京医科歯科大学の循環器内科から得た。なお、心房細動の被検者は全て、標準１２誘導心電図（12-lead electrocardiogram（ＥＣＧ））により心房細動であると診断された。
【００４３】
ＧＷＡＳの１次試験の対照被検者（コントロール（control））としては、BBJに登録された２４４４名の心房細動以外の疾患の患者、および大阪御堂筋ロータリークラブで募集した９０６名の健康なボランティアを用いた。２次試験の対照被検者としては、BBJに登録された１７１９０名の心房細動以外の疾患の患者を用いた。
【００４４】
被検者について集団の階層化（population stratification）が認められないことを主成分分析（ＰＣＡ）により確認した。すなわち、心房細動の被検者と対照被検者には、心房細動に相関する遺伝的要因以外には遺伝的相違が存在しないものとする。
【００４５】
本研究は東京大学医科学研究所および理化学研究所横浜研究所の倫理委員会によって承認され、全ての参加者、あるいは参加者が２０歳未満の場合はその両親からインフォームドコンセントを得た。
【００４６】
＜統計解析＞
ＧＷＡＳの１次試験および２次試験において、常染色体上の各ＳＮＰと心房細動との相関は、コクラン・アーミテージ傾向検定（Cochran-Armitage trend test）により評価した。１次試験および２次試験を組み合わせた統計解析は、マンテル・ヘンツェル（Mantel-Haenszel）法により行った。
【００４７】
＜ＧＷＡＳの１次試験＞
心房細動の被検者８４３名の遺伝型は、Human610-Quad BeadChip（Illumina社）を用いて解析した。対照被検者３３５０名の遺伝型は、HumanHap550v3 Genotyping BeadChip（Illumina社）を用いて解析した。対照被検者においてマイナーアレル頻度（ＭＡＦｓ）＞０．０１を満たす常染色体上の約４３万個のＳＮＰｓについて相関解析を行った。
【００４８】
ＧＷＡＳの結果、第４染色体長腕２５領域のＰＩＴＸ２遺伝子近傍に位置するrs1906599が、ゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値として設定されたＰ＜１．０×１０-7を満たし、心房細動と有意に相関することが確認された（表１）。rs1906599が存在する領域は、既に欧米人において心房細動との相関が報告されている。
【００４９】
【表２】
「ＡＦ」は心房細動被検者、「ＣＯ」は対照被検者を示す。
「１」はメジャーアレル、「２」はマイナーアレルを示す。すなわち、「１１」はメジャーアレルのホモ、「１２」はヘテロ、「２２」はマイナーアレルのホモを示す。
「ＯＲ」は、信頼区間（Confidence Interval；CI）９５％でのアレルのオッズ比（Odds Ratio；OR）を示す。
【００５０】
＜ＧＷＡＳの２次試験＞
１次試験の結果を検証するため、心房細動の被検者１６００名と対照被検者１７１９０名を用いて２次試験を行った。前立腺癌の被検者の遺伝型は、multiplex-PCR invader assay（Third Wave Technologies）（Ohnishi, Y. et al. J Hum Genet 46, 471-7 (2001)）により解析した。対照被検者の遺伝型は、Human610-Quad BeadChip（Illumina社）を用いて解析した。なお、被検者はいずれもＧＷＡＳに用いた被検者とは独立である。
【００５１】
２次試験に用いるＳＮＰｓとして、ＧＷＡＳの１次試験においてＰ値の低い上位５００個のＳＮＰｓを選択した。これら５００個のＳＮＰｓ間での連鎖不平衡係数（linkage disequilibium（LD）coefficient）（ｒ2）を算出し、他のＳＮＰとｒ2＞０．８で高度に連鎖する１５０個のＳＮＰｓを除外した３５０個のＳＮＰｓを２次試験に供した。
【００５２】
１次試験および２次試験のメタ解析の結果、さらに５ヶ所のＳＮＰｓが、ゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値として設定されたＰ＜１．０×１０-7を満たし、心房細動と有意に相関することが見出された（表１）。当該５ヶ所のＳＮＰｓは、第１染色体長腕２４領域（１ｑ２４領域）のrs639652、第１０染色体長腕２５．１領域（１０ｑ２５．１領域）のrs6584555、第１２染色体長腕２４領域（１２ｑ２４領域）のrs6490029、第７染色体長腕３１領域（７ｑ３１領域）のrs6466579、および第１６染色体長腕２２領域（１６ｑ２２領域）のrs12932445である。
【００５３】
これらの内、rs6466579が位置するＣＡＶ１／ＣＡＶ２遺伝子、およびrs12932445が位置するＺＦＨＸ３遺伝子は、既に欧米人において心房細動との相関が報告されている。
【００５４】
rs639652（Ｐ＝１．１×１０-9）は、染色体の１ｑ２４領域に位置し、具体的には、ＰＲＲＸ１遺伝子のプロモーター領域に位置していた。したがって、当該ＳＮＰはＰＲＲＸ１遺伝子の発現に関連すると考えられる。rs639652の近傍領域約２００ｋｂの連鎖不平衡（ＬＤ）マップを図１に示す。ＬＤマップは、ＨａｐＭａｐプロジェクトの日本人のデータベース（ＪＰＴ）およびヨーロッパ人のデータベース（ＣＥＵ）それぞれに基づき、Haploview Software（Barrett, J. et al. Bioinformatics 21, 263.265 (2005)）を用いて作製した。
【００５５】
ＰＲＲＸ１遺伝子は、ペア型ファミリーに属するホメオボックスタンパク質をコードする。Ｐｒｒｘ１タンパク質は共活性化因子（co-activator）であり、血清応答因子（serum response factor）のＤＮＡ結合能を向上させる（Grueneberg DA. et. al., Science. 1992 Aug 21; 257(5073): 1089-95）。血清応答因子は、成長因子（growth factor）や分化因子（differentiation factor）による各種遺伝子の発現誘導に要求される因子である。よって、ＰＲＲＸ１遺伝子は各種遺伝子の発現誘導に関与している。また、Ｐｒｒｘ１タンパク質は、筋肉のクレアチンキナーゼを制御することから、中胚葉における種々のタイプの筋肉の発生に寄与していると考えられる（Cserjesi P. et. al., J Biol Chem. 1994 Jun 17; 269(24): 16740-5）。
【００５６】
既に欧米人において心房細動との相関が報告されているＰＩＴＸ２遺伝子はRIEG/PITXホメオボックスファミリーに属する転写因子をコードし、ＺＦＨ３遺伝子はジンクフィンガードメインとホメオドメインを有する転写因子をコードする（非特許文献１〜３）。肺静脈と左心房の吻合部位では、心筋が袖状に肺静脈の周囲を取り巻きながら進展しており、この部位の心筋が心房細動を引き起こすことが知られているが、近年、Ｐｉｔｘ２欠損マウスでは初期の肺静脈心筋細胞の形成が起こらず、肺静脈心筋が肺静脈に進展しないことが示唆されている（Mommersteeg MT. et. al., Circ Res. 2007 Oct 26; 101(9): 902-9）。また、ＺＦＨ３遺伝子はＰＯＵ１Ｆ１遺伝子の転写活性化に必要であり、ＰＯＵ１Ｆ１遺伝子がコードする転写因子はＰｉｔｘ２タンパク質と相互作用してＰｉｔｘ２タンパク質のＤＮＡ結合能と転写活性を促進する（Amendt BA. et. al., J Biol Chem. 1998 Aug 7; 273(32): 20066-72）。
【００５７】
Ｐｒｒｘ１タンパク質とＰｉｔｘ２タンパク質やＺｆｈ３タンパク質とは転写因子として類似しており、ＰＲＲＸ１遺伝子は、ＰＩＴＸ２遺伝子やＺＦＨ３遺伝子と同様に心房細動に関与すると考えられる。
【００５８】
rs6584555（Ｐ＝５．３×１０-12）は、染色体の１０ｑ２５．１領域に位置し、具体的には、ＮＥＵＲＬ遺伝子に位置していた。
【００５９】
rs6490029（Ｐ＝２．６×１０-8）は、染色体の１２ｑ２４領域に位置し、具体的には、ＣＵＸ２遺伝子に位置していた。ＣＵＸ２遺伝子は、cut-likeホメオボックス２タンパク質をコードする。Ｃｕｘ２タンパク質は、ホメオボックス転写因子として機能すると考えられる。
【００６０】
また、これらＳＮＰｓが位置するいずれの遺伝子間にも、有意な遺伝子間相互作用は認められなかった。
【００６１】
以上の通り、心房細動と相関する３個のＳＮＰｓが新規に見出された。これらのＳＮＰｓは、心房細動等の不整脈の検査に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は心房細動等の不整脈の発症および／または罹患リスクを判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
不整脈（Arrhythmia）とは、心拍数や心拍リズムが一定でない症状をいう。不整脈は心拍数等に基づき様々な種類に分類されるが、中でも心房細動（Atrial fibrillation（ＡＦ））は、日本を含む多くの国において最も頻繁に見られる不整脈の一種である。心房細動とは、心房の脈数が不規則で、かつ高頻度になる症状をいい、罹患率・死亡率（morbidity and mortality）の増大を伴う。心房細動の危険因子としては、性別、年齢、高血圧、肥満、および他の心疾患が知られており、よってこれら危険因子に関連する遺伝要因は、心房細動のリスクを予測するための判断材料になる。また、心房細動の家系には固有の遺伝要因が存在すると考えられ、よって心房細動の家族歴が陽性であることは上記危険因子とは別個に心房細動のリスクを予測するための判断材料になる。
【０００３】
心房細動の家系研究により、イオンチャンネルをコードするいくつかの遺伝子における変異が心房細動に関連して見出されたが、それらの変異は心房細動の全症例に当てはまるわけではなかった。
【０００４】
近年、ゲノムワイド相関解析（ＧＷＡＳ）によって心房細動の発症に関連する遺伝子や一塩基多型（ＳＮＰｓ）を同定する試みがなされている。欧米人被検者を用いたＧＷＡＳにより、これまでに、心房細動感受性をもたらす遺伝変異が染色体上のいくつかの箇所に存在することが示唆されている（非特許文献１〜５）。心房細動に関連するさらなる遺伝変異の同定や、心房細動に関連する複雑な遺伝要因を理解するためには、日本人等のアジア人やそれ以外の人種についてもＧＷＡＳを行う必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gudbjartsson DF. et. al., Nature. 2007 Jul 19;448(7151):353-357
【非特許文献２】Gudbjartsson DF. et. al., Nat Genet. 2009 Aug;41(8):876-878
【非特許文献３】Benjamin EJ. et. al., Nat Genet. 2009 Aug;41(8):879-881
【非特許文献４】Holm H. et. al., Nat Genet. 2010 Feb;42(2):117-122
【非特許文献５】Ellinor PT. et. al., Nat Genet. 2010 Mar;42(3):240-244
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、心房細動等の不整脈の発症リスクや発症を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第１染色体長腕２４領域、ＮＥＵＲＬ遺伝子、またはＣＵＸ２遺伝子に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）が心房細動と相関することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより心房細動等の不整脈の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]
以下の（１）〜（３）のいずれかの領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて不整脈を検査することを特徴とする、不整脈の発症および／または罹患リスクの判定方法。
（１）第１染色体長腕２４領域
（２）ＮＥＵＲＬ遺伝子
（３）ＣＵＸ２遺伝子
[２]
前記一塩基多型が、配列番号１、２、または３の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、[１]に記載の方法。
[３]
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号４〜２０から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基である、[２]に記載の方法。
[４]
前記不整脈が心房細動である、[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。
[５]
配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する不整脈検査用プローブ。
[６]
配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる不整脈検査用プライマー。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、これまで予測が困難であった不整脈の発症リスク（罹患リスク）を正確かつ簡便に予測することができる。また、不整脈の発症を正確かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は不整脈の予防や早期治療に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒト第１染色体長腕２４領域（１ｑ２４領域）の連鎖不平衡（ＬＤ）マップおよび遺伝子を示す図。下向きの矢印は、rs639652の位置を示す。上段はＨａｐＭａｐプロジェクトの日本人のデータベース（ＪＰＴ）に基づくＬＤマップ、下段はヨーロッパ人のデータベース（ＣＥＵ）に基づくＬＤマップ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第１染色体長腕２４領域、ＮＥＵＲＬ遺伝子、またはＣＵＸ２遺伝子に存在するＳＮＰを分析し、該分析結果に基づいて不整脈を検査することを特徴とする、不整脈の発症および／または罹患リスクの判定方法である。なお、本発明において、「検査」とは不整脈の発症リスクの検査及び不整脈の発症の有無の検査を含む。本発明の方法においては、ＳＮＰの分析結果を、不整脈の発症リスクおよび／または発症の有無と関連付ける。
【００１２】
不整脈としては、頻脈性不整脈、徐脈性不整脈、期外収縮が挙げられる。頻脈性不整脈としては、洞性頻脈、心室性頻拍、心房細動、心房粗動、多源性心房頻拍、心室細動、心室粗動、上室性頻拍が挙げられる。徐脈性不整脈としては、洞房ブロック、房室ブロック、接合部性調律、洞不全症候群、呼吸性不整脈、脚ブロックが挙げられる。期外収縮としては、心房性期外収縮、心室性期外収縮が挙げられる。これらの中では、心房細動を検査するのが好ましい。
【００１３】
ヒト第１染色体長腕２４領域（１ｑ２４領域）に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs639652を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。rs639652はGenBank Accession No. NT_004487.18の21103228番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味する。リスクアレルはＣであるが、このＳＮＰと不整脈との関連は劣性モデルであるため、ホモ接合であるＣＣの場合のみ不整脈の可能性または発症リスクが高くなる。
【００１４】
また、染色体１ｑ２４領域においてrs639652の近傍にはＰＲＲＸ１遺伝子が存在する。ＰＲＲＸ１遺伝子は、ペア型ファミリーに属するホメオボックスタンパク質をコードし、各種遺伝子の発現や筋肉の発生に関与する。rs639652は、ＰＲＲＸ１遺伝子のプロモーター領域に位置し、よって、ＰＲＲＸ１遺伝子の発現に関わると考えられる。したがって、ＰＲＲＸ１遺伝子に存在するＳＮＰを解析することによっても不整脈を検査することができる。ＰＲＲＸ１遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000001.10の170633313〜170708541の領域が挙げられる。
【００１５】
ＮＥＵＲＬ遺伝子は、ヒト第１０染色体長腕２５．１領域（１０ｑ２５．１領域）に存在する。ＮＥＵＲＬ遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000010.10の105253735〜105352309の領域が挙げられる。
【００１６】
ＮＥＵＲＬ遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs6584555を挙げることができる。rs6584555はGenBank Accession No. NT_030059.12の24048137番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基がＣである場合は不整脈の可能性または発症リスクが高い。また、アレルを考慮して解析した場合は、rs6584555がＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順で不整脈の可能性または発症リスクが高い。
【００１７】
ＣＵＸ２遺伝子は、cut-likeホメオボックス２タンパク質をコードし、ヒト第１２染色体長腕２４領域（１２ｑ２４領域）に存在する。ＣＵＸ２遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000012.11の111471828〜111788358の領域が挙げられる。
【００１８】
ＣＵＸ２遺伝子に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs6490029を挙げることができる。rs6490029はGenBank Accession No. NT_009775.16の2267966番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味する。リスクアレルはＡであるが、このＳＮＰと不整脈との関連は劣性モデルであるため、ホモ接合であるＡＡの場合のみ不整脈の可能性または発症リスクが高くなる。
【００１９】
なお、rs639652、rs6584555、およびrs6490029について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１、２、および３に示した。６１番目の塩基が多型を有する。
【００２０】
本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。
【００２１】
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たす塩基をいう。また上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。もしくは、複数人（通常は２０−４０人程度）から採取したＤＮＡをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にあるＳＮＰを探索することにより同定することもできる。
【００２２】
rs639652とｒ2＞０．８で連鎖不平衡にある塩基としては、rs12760630、rs736791、rs541557、rs577676、rs763567、rs6658866、rs3903239、rs6677540、rs2022372、rs1234275、rs12755237、およびrs593560が挙げられる。これらＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号４〜１５に示した。６１番目の塩基が多型を有する。これらＳＮＰと不整脈との関連は劣性モデルであるため、リスクアレルのホモ接合である場合のみ不整脈の可能性または発症リスクが高くなる。
【００２３】
rs6584555とｒ2＞０．８で連鎖不平衡にある塩基としては、rs7904046、rs6584554、rs6584557、およびrs7069733が挙げられる。これらＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１６〜１９に示した。６１番目の塩基が多型を有する。これらＳＮＰは、リスクアレルのホモ接合体 ＞ リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体 ＞ 非リスクアレルのホモ接合体の順で不整脈の可能性または発症リスクが高い。
【００２４】
rs6490029とｒ2＞０．８で連鎖不平衡にある塩基としては、rs916682が挙げられる。このＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、配列番号２０に示した。６１番目の塩基が多型を有する。このＳＮＰと不整脈との関連は劣性モデルであるため、リスクアレルのホモ接合である場合のみ不整脈の可能性または発症リスクが高くなる。
【００２５】
rs639652、rs6584555、またはrs6490029とｒ2＞０．８で連鎖不平衡にある各塩基について、そのアレルの組み合わせ、およびリスクアレルを表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて不整脈と関連付けることにより、不整脈を検査することができる。上記ＳＮＰは単独で解析されてもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つを含む複数のＳＮＰｓをまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。例えば、上記ＳＮＰの複数をまとめて解析してもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つと、不整脈と相関する既知のＳＮＰｓ（非特許文献１〜５）や既知のＳＮＰｓと連鎖不平衡にあるＳＮＰｓとを組み合わせて解析してもよい。不整脈と相関する複数のＳＮＰｓをまとめて解析すれば、不整脈の検査の精度が向上する。なお、いずれのＳＮＰも、二本鎖ＤＮＡのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、ＰＲＲＸ１遺伝子、ＮＥＵＲＬ遺伝子、またはＣＵＸ２遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
【００２８】
ＳＮＰの解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。ＳＮＰの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００２９】
ＳＮＰの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめＳＮＰ部位を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００３１】
また、ＳＮＰの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【００３２】
また、ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３３】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３４】
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
【００３５】
このようにしてＳＮＰがいずれの塩基であるかを決定することで、不整脈を検査するためのデータを得ることができる。
【００３６】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、不整脈を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記ＳＮＰ部位を含み、ハイブリダイズの有無によってＳＮＰ部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。
【００３７】
また、プライマーとしては、上記ＳＮＰ部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記ＳＮＰ部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
【００３８】
上記ＳＮＰ部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
【００３９】
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００４１】
（１）心房細動と相関するＳＮＰｓの同定
心房細動感受性を決定する遺伝的変異を同定するために、日本人被検者を用いてゲノムワイド相関解析（ＧＷＡＳ）を行った。ＧＷＡＳとは、疾患等の表現型に関わる遺伝的変異を探索する遺伝統計学的手法である。例えば、ヒトゲノム全体を網羅するような数十万〜１００万ヶ所のＳＮＰｓを用いて、ある疾患の患者（ケース）とその疾患にかかっていない被験者（コントロール）との間で、多型の頻度に差があるかどうかを統計的に検定することで、疾患と関連する遺伝的変異を見出すことができる。
【００４２】
＜被検者＞
ＧＷＡＳの１次試験に用いた心房細動の全被検者（ケース（Case））、および２次試験に用いた心房細動のほとんどの被検者は、東京大学医科学研究所のBioBank Japan (BBJ) (Nakamura, Y. The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol 5, 696-7 (2007))
に登録された心房細動の患者群から、臨床診断を経て採用した。２次試験に用いた心房細動の一部の被検者は、東京医科歯科大学の循環器内科から得た。なお、心房細動の被検者は全て、標準１２誘導心電図（12-lead electrocardiogram（ＥＣＧ））により心房細動であると診断された。
【００４３】
ＧＷＡＳの１次試験の対照被検者（コントロール（control））としては、BBJに登録された２４４４名の心房細動以外の疾患の患者、および大阪御堂筋ロータリークラブで募集した９０６名の健康なボランティアを用いた。２次試験の対照被検者としては、BBJに登録された１７１９０名の心房細動以外の疾患の患者を用いた。
【００４４】
被検者について集団の階層化（population stratification）が認められないことを主成分分析（ＰＣＡ）により確認した。すなわち、心房細動の被検者と対照被検者には、心房細動に相関する遺伝的要因以外には遺伝的相違が存在しないものとする。
【００４５】
本研究は東京大学医科学研究所および理化学研究所横浜研究所の倫理委員会によって承認され、全ての参加者、あるいは参加者が２０歳未満の場合はその両親からインフォームドコンセントを得た。
【００４６】
＜統計解析＞
ＧＷＡＳの１次試験および２次試験において、常染色体上の各ＳＮＰと心房細動との相関は、コクラン・アーミテージ傾向検定（Cochran-Armitage trend test）により評価した。１次試験および２次試験を組み合わせた統計解析は、マンテル・ヘンツェル（Mantel-Haenszel）法により行った。
【００４７】
＜ＧＷＡＳの１次試験＞
心房細動の被検者８４３名の遺伝型は、Human610-Quad BeadChip（Illumina社）を用いて解析した。対照被検者３３５０名の遺伝型は、HumanHap550v3 Genotyping BeadChip（Illumina社）を用いて解析した。対照被検者においてマイナーアレル頻度（ＭＡＦｓ）＞０．０１を満たす常染色体上の約４３万個のＳＮＰｓについて相関解析を行った。
【００４８】
ＧＷＡＳの結果、第４染色体長腕２５領域のＰＩＴＸ２遺伝子近傍に位置するrs1906599が、ゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値として設定されたＰ＜１．０×１０-7を満たし、心房細動と有意に相関することが確認された（表１）。rs1906599が存在する領域は、既に欧米人において心房細動との相関が報告されている。
【００４９】
【表２】
「ＡＦ」は心房細動被検者、「ＣＯ」は対照被検者を示す。
「１」はメジャーアレル、「２」はマイナーアレルを示す。すなわち、「１１」はメジャーアレルのホモ、「１２」はヘテロ、「２２」はマイナーアレルのホモを示す。
「ＯＲ」は、信頼区間（Confidence Interval；CI）９５％でのアレルのオッズ比（Odds Ratio；OR）を示す。
【００５０】
＜ＧＷＡＳの２次試験＞
１次試験の結果を検証するため、心房細動の被検者１６００名と対照被検者１７１９０名を用いて２次試験を行った。前立腺癌の被検者の遺伝型は、multiplex-PCR invader assay（Third Wave Technologies）（Ohnishi, Y. et al. J Hum Genet 46, 471-7 (2001)）により解析した。対照被検者の遺伝型は、Human610-Quad BeadChip（Illumina社）を用いて解析した。なお、被検者はいずれもＧＷＡＳに用いた被検者とは独立である。
【００５１】
２次試験に用いるＳＮＰｓとして、ＧＷＡＳの１次試験においてＰ値の低い上位５００個のＳＮＰｓを選択した。これら５００個のＳＮＰｓ間での連鎖不平衡係数（linkage disequilibium（LD）coefficient）（ｒ2）を算出し、他のＳＮＰとｒ2＞０．８で高度に連鎖する１５０個のＳＮＰｓを除外した３５０個のＳＮＰｓを２次試験に供した。
【００５２】
１次試験および２次試験のメタ解析の結果、さらに５ヶ所のＳＮＰｓが、ゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値として設定されたＰ＜１．０×１０-7を満たし、心房細動と有意に相関することが見出された（表１）。当該５ヶ所のＳＮＰｓは、第１染色体長腕２４領域（１ｑ２４領域）のrs639652、第１０染色体長腕２５．１領域（１０ｑ２５．１領域）のrs6584555、第１２染色体長腕２４領域（１２ｑ２４領域）のrs6490029、第７染色体長腕３１領域（７ｑ３１領域）のrs6466579、および第１６染色体長腕２２領域（１６ｑ２２領域）のrs12932445である。
【００５３】
これらの内、rs6466579が位置するＣＡＶ１／ＣＡＶ２遺伝子、およびrs12932445が位置するＺＦＨＸ３遺伝子は、既に欧米人において心房細動との相関が報告されている。
【００５４】
rs639652（Ｐ＝１．１×１０-9）は、染色体の１ｑ２４領域に位置し、具体的には、ＰＲＲＸ１遺伝子のプロモーター領域に位置していた。したがって、当該ＳＮＰはＰＲＲＸ１遺伝子の発現に関連すると考えられる。rs639652の近傍領域約２００ｋｂの連鎖不平衡（ＬＤ）マップを図１に示す。ＬＤマップは、ＨａｐＭａｐプロジェクトの日本人のデータベース（ＪＰＴ）およびヨーロッパ人のデータベース（ＣＥＵ）それぞれに基づき、Haploview Software（Barrett, J. et al. Bioinformatics 21, 263.265 (2005)）を用いて作製した。
【００５５】
ＰＲＲＸ１遺伝子は、ペア型ファミリーに属するホメオボックスタンパク質をコードする。Ｐｒｒｘ１タンパク質は共活性化因子（co-activator）であり、血清応答因子（serum response factor）のＤＮＡ結合能を向上させる（Grueneberg DA. et. al., Science. 1992 Aug 21; 257(5073): 1089-95）。血清応答因子は、成長因子（growth factor）や分化因子（differentiation factor）による各種遺伝子の発現誘導に要求される因子である。よって、ＰＲＲＸ１遺伝子は各種遺伝子の発現誘導に関与している。また、Ｐｒｒｘ１タンパク質は、筋肉のクレアチンキナーゼを制御することから、中胚葉における種々のタイプの筋肉の発生に寄与していると考えられる（Cserjesi P. et. al., J Biol Chem. 1994 Jun 17; 269(24): 16740-5）。
【００５６】
既に欧米人において心房細動との相関が報告されているＰＩＴＸ２遺伝子はRIEG/PITXホメオボックスファミリーに属する転写因子をコードし、ＺＦＨ３遺伝子はジンクフィンガードメインとホメオドメインを有する転写因子をコードする（非特許文献１〜３）。肺静脈と左心房の吻合部位では、心筋が袖状に肺静脈の周囲を取り巻きながら進展しており、この部位の心筋が心房細動を引き起こすことが知られているが、近年、Ｐｉｔｘ２欠損マウスでは初期の肺静脈心筋細胞の形成が起こらず、肺静脈心筋が肺静脈に進展しないことが示唆されている（Mommersteeg MT. et. al., Circ Res. 2007 Oct 26; 101(9): 902-9）。また、ＺＦＨ３遺伝子はＰＯＵ１Ｆ１遺伝子の転写活性化に必要であり、ＰＯＵ１Ｆ１遺伝子がコードする転写因子はＰｉｔｘ２タンパク質と相互作用してＰｉｔｘ２タンパク質のＤＮＡ結合能と転写活性を促進する（Amendt BA. et. al., J Biol Chem. 1998 Aug 7; 273(32): 20066-72）。
【００５７】
Ｐｒｒｘ１タンパク質とＰｉｔｘ２タンパク質やＺｆｈ３タンパク質とは転写因子として類似しており、ＰＲＲＸ１遺伝子は、ＰＩＴＸ２遺伝子やＺＦＨ３遺伝子と同様に心房細動に関与すると考えられる。
【００５８】
rs6584555（Ｐ＝５．３×１０-12）は、染色体の１０ｑ２５．１領域に位置し、具体的には、ＮＥＵＲＬ遺伝子に位置していた。
【００５９】
rs6490029（Ｐ＝２．６×１０-8）は、染色体の１２ｑ２４領域に位置し、具体的には、ＣＵＸ２遺伝子に位置していた。ＣＵＸ２遺伝子は、cut-likeホメオボックス２タンパク質をコードする。Ｃｕｘ２タンパク質は、ホメオボックス転写因子として機能すると考えられる。
【００６０】
また、これらＳＮＰｓが位置するいずれの遺伝子間にも、有意な遺伝子間相互作用は認められなかった。
【００６１】
以上の通り、心房細動と相関する３個のＳＮＰｓが新規に見出された。これらのＳＮＰｓは、心房細動等の不整脈の検査に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）のいずれかの領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて不整脈を検査することを特徴とする、不整脈の発症および／または罹患リスクの判定方法。
（１）第１染色体長腕２４領域
（２）ＮＥＵＲＬ遺伝子
（３）ＣＵＸ２遺伝子
【請求項２】
前記一塩基多型が、配列番号１、２、または３の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号４〜２０から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記不整脈が心房細動である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する不整脈検査用プローブ。
【請求項６】
配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる不整脈検査用プライマー。
【請求項１】
以下の（１）〜（３）のいずれかの領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて不整脈を検査することを特徴とする、不整脈の発症および／または罹患リスクの判定方法。
（１）第１染色体長腕２４領域
（２）ＮＥＵＲＬ遺伝子
（３）ＣＵＸ２遺伝子
【請求項２】
前記一塩基多型が、配列番号１、２、または３の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号４〜２０から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記不整脈が心房細動である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する不整脈検査用プローブ。
【請求項６】
配列番号１〜２０から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる不整脈検査用プライマー。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１７９００８（Ｐ２０１２−１７９００８Ａ）
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−４４１５７（Ｐ２０１１−４４１５７）
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度 文部科学省、科学技術試験研究「個人の遺伝情報に応じた医療の実現プロジェクト」産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０８０６７８５１）一般社団法人徳洲会 (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１日（２０１１．３．１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度 文部科学省、科学技術試験研究「個人の遺伝情報に応じた医療の実現プロジェクト」産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０８０６７８５１）一般社団法人徳洲会 (12)
【Ｆターム（参考）】
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