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第10染色体長腕24領域の一塩基多型に基づく骨・関節疾患の検査方法
説明

第10染色体長腕24領域の一塩基多型に基づく骨・関節疾患の検査方法

【課題】側弯症等の骨・関節疾患を検査する方法を提供する。
【解決手段】第10染色体長腕24領域(10q24領域)に存在する一塩基多型を分析し、
該分析結果に基づいて骨・関節疾患の発症リスクおよび/または発症の有無を検査する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は側弯症等の骨・関節疾患の発症リスクや発症の有無を判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
側弯症は、脊椎が左右方向に弯曲した病態をいう。側弯症の内、その病因が明らかでないものを特発性側弯症と呼び、側弯症の80〜90%を占める。
【0003】
側弯症は、通学年代の児童に多く発症し、特に、女子に多く発症する。10歳から骨格が成熟するまでの児童において、側弯の指標であるコブ角(cobb angle)で少なくとも10°の弯曲を示し、且つ、その病因が明らかでないものを思春期特発性側弯症(Adolescent idiopathic scoliosis;AIS)と定義する。AISの発症頻度は、通学年代の児童
の内、日本で2%、世界では2〜3%であり、日本では毎年1万人程度が発症している。
【0004】
側弯症の診断は主にX線検査により行われるが、X線検査は発症前や発症初期における側弯症の診断には有効でない。また、特発性側弯症の治療は、対症療法により行われるのみで、病因が明らかでない以上、原因療法は行われていない。よって、側弯症の発症前診断(リスク診断)や早期診断を可能にし、また、原因治療を可能にするため、側弯症と関連する遺伝子や一塩基多型(SNPs)の同定が望まれている。
【0005】
ゲノムワイド連鎖解析(genome-wide linkage analysis)によりAISの病因となる多くの遺伝子座が見出されており、AISは複雑な遺伝的素因に基づくと考えられている(非特許文献1、2)。また、候補遺伝子解析によりAIS感受性遺伝子が報告されているが(非特許文献3〜9)、いずれの遺伝子についても別の人種を被検者とした場合にAISとの関連の再現性が得られていない(非特許文献10、11)。
【0006】
さらに、近年、伝達不平衡解析(Transmission Disequilibrium Test;TDT)法に基づくゲノムワイド関連解析(Genome-wide association study;GWAS)によって、A
ISと関連する遺伝子の候補が報告された(非特許文献12)。しかしながら、それらは、多重検定補正後のケース−コントロール関連解析においてはAISとの関連の再現性が得られていない。
【0007】
以上の通り、側弯症感受性遺伝子に関する知見は存在するものの、ゲノムワイド水準で側弯症との関連が認められた遺伝子や一塩基多型(SNPs)は報告されていない。
【0008】
第10染色体長腕24領域(10q24)に存在するLBX1遺伝子は、ホメオボックス遺伝子
としてクローニングされており、脊髄後索、後脳、心臓神経堤の一部、筋原細胞等での発現が報告されている。しかしながら、LBX1遺伝子と側弯症との関連は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Wise, C.A. et al. Curr. Genomics 9, 51-59 (2008).
【非特許文献2】Raggio, C. L. et al. J. Orthop. Res. 27, 1366-1372 (2009).
【非特許文献3】Wu, J. et al. Spine 31, 1131-1136 (2006).
【非特許文献4】Zhang, H.Q. et al. Spine 34, 760-764 (2009).
【非特許文献5】Chen, Z. et al. Eur. J. Hum. Genet. 17, 525-532 (2009).
【非特許文献6】Qiu, X. S. et al. Spine 32, 1748-1753 (2007).
【非特許文献7】Wang, H. et al. Spine 33, 2199-2203 (2008).
【非特許文献8】Inoue, M. et al. Stud. Health Technol. Inform. 91, 90-96 (2002).
【非特許文献9】Yeung, H.Y. et al. Stud. Health Technol. Inform. 123, 18-24 (2006).
【非特許文献10】Takahashi, Y. et al. J. Orthop. Res. 29, 834-837(2011).
【非特許文献11】Takahashi, Y. et al. J. Orthop. Res. (2011).
【非特許文献12】Sharma, S. et al. Hum Mol Genet. 20, 1456-1466 (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、側弯症等の骨・関節疾患の発症リスクや発症の有無を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第10染色体長腕24領域(10q24領域)に存在する一塩基多型(SNP)が思春期特発性側弯症(AIS)と関連す
ることを同定した。そして、これらの多型を調べることにより側弯症等の骨・関節疾患の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0012】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[1]
第10染色体長腕24領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて骨・関節疾患を検査することを特徴とする、骨・関節疾患の発症リスクおよび/または発症の有無の判定方法。
[2]
前記骨・関節疾患が、側弯症である、[1]に記載の方法。
[3]
前記一塩基多型が、配列番号1〜3から選ばれる塩基配列の塩基番号61番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、[1]または[2]に記載の方法。
[4]
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号4〜11から選ばれる塩基配列の塩基番号61番目の塩基に相当する塩基である、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]
配列番号1〜11から選ばれる塩基配列において、塩基番号61番目の塩基を含む10塩基以上の配列、又はその相補配列を有する骨・関節疾患検査用プローブ。
[6]
配列番号1〜11から選ばれる塩基配列において、塩基番号61番目の塩基を含む領域を増幅することのできる骨・関節疾患検査用プライマー。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、これまで予測が困難であった側弯症等の骨・関節疾患の発症リスク(罹患リスク)を正確かつ簡便に予測することができる。また、側弯症等の骨・関節疾患の発症を正確かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は側弯症等の骨・関節疾患の予防や早期治療に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】10q24領域の連鎖不平衡マップ(上パネル)およびAISとの関連解析の結果(下パネル)を示す図。連鎖不平衡マップは、Phase II HapMap (release24) JPTに基づいて作成し、GWASで遺伝子型を解析したSNPsをボックスで囲んだ。関連解析の結果は、コクラン・アーミテージ傾向検定のP値の-log10として示す。関連解析の結果において、黒い菱形はGWASの結果を、白い四角は補完(imputation)の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
<1>本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第10染色体長腕24領域(10q24領域)に存在するSNPを
分析し、該分析結果に基づいて骨・関節疾患を検査することを特徴とする、骨・関節疾患の発症リスクおよび/または発症の有無の判定方法である。すなわち、本発明において、「検査」とは骨・関節疾患の発症リスクの検査及び骨・関節疾患の発症の有無の検査を含む。本発明の方法においては、SNPの分析結果を、骨・関節疾患の発症リスクおよび/または発症の有無と関連付ける。
【0016】
骨・関節疾患としては、特に限定されないが、例えば、脊椎の疾患、具体的には、側弯症が挙げられる。本発明の方法は、特に、従来病因が特定されていない特発性側弯症の検査に好適に用いられる。側弯症は、先天性、若年性、思春期性、成人性等、いずれの時期に発症するものであってもよいが、思春期性側弯症であるのが好ましく、思春期特発性側弯症(AIS)であるのがより好ましい。
【0017】
本発明の方法は、いずれの人種の被検者に対しても用いることができるが、特に、日本人等のアジア人の被検者に好適に用いることができる。また、本発明の方法は、いずれの性別の被検者に対しても用いることができる。
【0018】
10q24領域に存在する具体的なSNPとしては、ヒトrs11190870、rs625039、およびrs11598564を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)の登録
番号を示す。これら3つのSNPsは、10q24.31〜q24.32領域のLBX1遺伝子および仮想遺伝子FLJ41350が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置する。よって、特に、当該連鎖不平衡ブロックに存在するSNPを解析することによって骨・関節疾患を検査することができる。LBX1遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000010.10の102986733
〜102988717の領域の相補配列が挙げられる。仮想遺伝子FLJ41350としては、具体的には
、GenBank Accession No. NC_000010.10の102989351〜102998616の領域が挙げられる。
【0019】
rs11190870はGenBank Accession No. NT_030059.12の21727733番目の塩基におけるチミン(T)/シトシン(C)の多型を意味し、この塩基がTである場合は骨・関節疾患の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、TT>TC>CCの順で骨・関節疾患の可能性または発症リスクが高い。
【0020】
rs625039はGenBank Accession No. NT_030059.12の21742175番目の塩基におけるグアニン(G)/アデニン(A)の多型を意味し、この塩基がGである場合は骨・関節疾患の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、GG>GA>AAの順で骨・関節疾患の可能性または発症リスクが高い。
【0021】
rs11598564はGenBank Accession No. NT_030059.12の21713130番目の塩基におけるアデニン(A)/グアニン(G)の多型を意味し、この塩基がGである場合は骨・関節疾患の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、GG>GA>AAの順で骨・関節疾患の可能性または発症リスクが高い。
【0022】
なお、上記3個のSNPについて、SNP塩基及びその前後60bpの領域を含む合計121bpの長さの配列を、配列番号1〜3に示した。61番目の塩基が多型を有する。
【0023】
本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がSNP以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。
【0024】
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とr2>0.5、好ましくはr2>0.8、さらに好ましくはr2>0.9
の関係を満たす塩基をいう。r2は連鎖不平衡係数である。また上記の塩基と連鎖不平衡
にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等
を用いて同定することができる。もしくは、複数人(通常は20−40人程度)から採取したDNAをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にあるSNPを探索することにより同定することもできる。上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、遺伝子型を考慮して解析した場合は、リスクアレルのホモ接合体 > リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体 > 非リスクアレルのホモ接合体の順で骨・関節疾患の可能性または発症リスクが高い。
【0025】
rs11190870とr2>0.5で連鎖不平衡にある塩基としては、上記のrs625039およびrs11598564に加え、rs12771674、rs11598177、rs1407409、rs1322331、rs594791、rs679206
、rs678741、およびrs10883597が挙げられる。これら各塩基について、rs11190870に対する連鎖不平衡係数(r2)、アレルの組み合わせ、およびリスクアレル等を表1に示す。
表中、アレルおよびリスクアレルの表記はNCBIが公開している参照配列(Build 36)におけるforward strandに対応している。また、rs12771674、rs11598177、rs1407409、rs1322331、rs594791、rs679206、rs678741、およびrs10883597について、SNP塩基及びその前後60bpの領域を含む合計121bpの長さの配列を、それぞれ配列番号4〜11に示した。61番目の塩基が多型を有する。
【0026】
【表1】

Allele 1がメジャーアレルである。
Allele 1/2は、human reference sequenceの(+) strandに基づいて示した。
【0027】
上記SNPの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて骨・関節疾患と関連付けることにより、骨・関節疾患を検査することができる。上記SNPは単独で解析されてもよいし、上記SNPの少なくとも1つを含む複数のSNPsをまとめて解析(ハプロタイプ解析)してもよい。例えば、上記SNPの複数をまとめて解析してもよいし、上記SNPの少なくとも1つと、骨・関節疾患と関連する既知のSNPs(非特許文献12等)や当該既知のSNPsと連鎖不平衡にあるSNPsとを組み合わせて解析してもよい。骨・関節疾患と関連する複数のSNPsをまとめて解析すれば、骨・関節疾患の検査の精度が向上する。なお、いずれのSNPも、二本鎖DNAのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、LBX1遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
【0028】
SNPの解析に用いる試料としては、染色体DNAを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。SNPの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体DNAを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【0029】
SNPの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、PCR、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0030】
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の5’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめSNP部位を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。
【0031】
また、SNPの解析は、PCRによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、3’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してPCRを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、LAMP法(特許第3313358号明細書)、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification;特許2843586号明細書)、ICAN法(特開2002−2
33379号公報)などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【0032】
また、SNP部位を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR−SSCP(single-strand conformation polymorphism)法(Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.)が挙げられる。具体的には、まず、目的のSNPを含むDNAを増幅し、増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【0033】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる(RFLP法)。この場合、まず、DNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片を分離し、検出されたDNA断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【0034】
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる。
【0035】
このようにしてSNPがいずれの塩基であるかを決定することで、骨・関節疾患を検査するためのデータを得ることができる。
【0036】
<2>本発明の検査用試薬
本発明はまた、側弯症等の骨・関節疾患を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記SNP部位を含み、ハイブリダイズの有無によってSNP部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号1〜3から選ばれる塩基配列の61番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する10塩基以上の長さのプローブや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む配列、又はその相補配列を有する10塩基以上の長さのプローブが挙げられる。なお、「当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基」及びその前後の領域の塩基配列は、例えば、National Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)から取得できる。プローブの長さは好ましくは、15〜35塩基であり、より好ましくは20〜35塩基である。
【0037】
また、プライマーとしては、上記SNP部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、又は上記SNP部位を配列解析(シークエンシング)するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号1〜3から選ばれる塩基配列の61番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは10〜50塩基が好ましく、15〜35塩基がより好ましく、20〜35塩基がさらに好ましい。
【0038】
上記SNP部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の5’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の3’側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を3’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を3’側に含むプライマーなどが例示される。
【0039】
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【0040】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【0041】
[思春期特発性側弯症(AIS)と関連するSNPsの同定]
AIS感受性を決定する遺伝的変異を同定するために、日本人被検者を用いてゲノムワイド関連解析(GWAS)を行った。GWASとは、疾患等の表現型に関わる遺伝的変異を探索する遺伝統計学的手法である。例えば、ヒトゲノム全体を網羅するような数十万〜100万ヶ所のSNPsを用いて、ある疾患の患者(ケース)とその疾患にかかっていない被験者(コントロール)との間で、多型の頻度に差があるかどうかを統計的に検定する
ことで、疾患と関連する遺伝的変異を見出すことができる。
【0042】
<被検者>
本実施例に用いた被検者の特徴を表2に示す。
【0043】
【表2】

a:ORC(大阪御堂筋ロータリークラブ)から採用した対照被検者は健康なボランティアからなる。
b:BBJから採用したGWASの対照被検者はAIS以外の13種の疾患を有する患者からなる。
c:BBJから採用した再現試験の対照被検者はAIS以外の42種の疾患を有する患者からなる。
【0044】
AISは女性に多く発症することから、被検者としてはいずれも日本人女性を採用した。GWASに用いたAIS被検者(ケース(case))1,050名は、8ヶ所の病院で募集し
た。再現試験(replication study)に用いたAIS被検者(ケース(case))326名は、8ヶ所の病院で募集した。全AIS被検者は、臨床検査および放射線検査を受け、側弯症の専門医によりAISと診断された。なお、側弯の指標であるコブ角(Cobb angle)は全例で、20°を超えていた。GWASに用いた対照被検者(コントロール(control))1,474名は、BBJに登録されたAIS以外の疾患の患者、および大阪御堂筋ロータリークラ
ブで募集した健康なボランティアからなる。再現試験に用いた対照被検者9,823名は、BBJに登録されたAIS以外の疾患の患者から採用した。
【0045】
本研究は東京大学医科学研究所および理化学研究所横浜研究所の倫理委員会によって承認され、全ての被検者および一部の被検者の両親からインフォームドコンセントを得た。
【0046】
<GWAS>
AIS被検者1,050名の遺伝子型を、Illumina Human610 Genotyping BeadChip(Illumina社(USA))を用いて解析した。対照被検者326名の遺伝子型を、Illumina HumanHap550v3 Genotyping BeadChip(Illumina社(USA))を用いて解析した。クオリティコントロ
ールとして、コール率(call rate)が0.99未満のSNPs、Hardy-Weinberg平衡検
定でのP値がカットオフ値以下(P≦10-6)のSNPs、常染色体上にないSNPs(non-autosomal SNPs)、単型のSNPs(monomorphic SNPs)、AIS被検者と対照被検者とで共有されていないSNPs、あいまいなコール(ambiguous call)のSNPs、identify-by-state(IBS)≧1.7の近縁ペアの内の低コール率の被検者(AIS被検
者16名、対照被検者1名)、および主成分分析(PCA)により外れ値(outlier)で
あると判定された被検者(AIS被検者1名)を除外した。クオリティコントロールを通過したAIS被検者1,033名および対照被検者1,473名の455,121個のSNPsについて、
コクラン・アーミテージ傾向検定(Cochran-Armitage trend test)によりAISとの関
連を評価した。なお、genomic inflation factorは1.09であり、集団の偏りによる偽陽性の関連が得られる可能性は低いと考えられた。
【0047】
GWASの結果、10q24に存在する3個のSNPs(rs11190870、rs625039、およびrs11598564)が、ゲノムワイドな有意性(genome-wide significance)の閾値として設定さ
れたP<1.10×10-7(=0.05/455,121)を満たし、AISとの有意な関連を示した(表3の「GWAS」欄)。当該閾値は、455,121回のテストに基づくボンフェローニ補正後のP<0.05に相当する。
【0048】
【表3】

Allele 1がメジャーアレルである。
Allele 1/2は、human reference sequenceの(+) strandに基づいて示した。
Risk;リスクアレル(Risk Allele)
RAF;リスクアレル頻度(Risk Allele Frequency)
CI;信頼区間(Confidence Interval)
a:コクラン・アーミテージ傾向検定のP値。
b:95%CIでのアレルのオッズ比(Odds Ratio)。
c:Breslow−Day検定のP値。
d:統合解析(combined analysis)の結果は、Mantel-Haenszel法により算出した。
【0049】
<再現試験>
これら3個のSNPsとAISの関連を確認するため、GWASで解析した被検者とは独立の被検者を用いて再現試験(replication study)を行った。AIS被検者326名の遺伝子型は、multiplex-PCR invader assay(Third Wave Technologies)により解析した。対照被検者9,823名の遺伝子型は、Illumina HumanHap550v3 Genotyping BeadChip(Illumina社(USA))を用いて解析した。
【0050】
再現試験の結果、3個のSNPs全てが、ボンフェローニ補正後の有意性の閾値であるP<1.67×10-2(=0.05/3)を満たし、AISとの有意な関連を示した(表3の「Replication」欄)。また、Breslow−Day検定のP値はいずれも0.0
5以下であり(表3の「Phet」欄)、GWASの被検者と再現試験の被検者とでは有意な
不均一性(significant heterogeneity)は認められなかった。
【0051】
GWASおよび再現試験のいずれにおいても、AISとの最も強い関連が認められたSNPsはrs11190870であった。Mantel-Haenszel法を用いてGWASと再現試験の統合解
析(combined analysis)を行った結果、rs11190870はP=1.24×10-19(オッズ比=1.56)でAISと関連した(表3の「Combined」欄)。
【0052】
10q24領域の連鎖不平衡マップおよび関連解析の結果を図1に示す。rs11190870、rs625039、およびrs11598564はいずれも、10q24.31〜q24.32領域のLBX1遺伝子および仮想遺伝
子FLJ41350が含まれる約80kbの連鎖不平衡ブロックに位置しており、より具体的には、rs11190870はLBX1遺伝子の3’フランキング領域に位置していた(図1)。なお、これら3個のSNPsによるハプロタイプ解析を行ったところ、rs11190870より強くAISと関連するハプロタイプは見出されなかった。
【0053】
これまでにゲノムワイド連鎖解析によりAISの病因となる遺伝子座が見出されているが、10q24領域は報告されていなかった(非特許文献1、2)。また、TDT法に基づく
GWASにおいては、上記3個のSNPs(rs11190870、rs625039、およびrs11598564)の内、rs11598564がAISとの関連の上位100位に含まれていたが、TDT法におけるP=8.19×10-5(全人種)またはP=1.03×10-3(非ヒスパニック)であり有意な関連は認められなかった(非特許文献12)。いずれの知見においてもゲノムワイド水準でAISとの関連が認められた遺伝子や一塩基多型(SNPs)は報告されておらず、すなわち本願は、ゲノムワイド水準で有意にAISと関連するSNPsを初めて見出したものである。
【0054】
LBX1遺伝子は、ホメオボックス遺伝子としてクローニングされ、脊椎動物においては、脊髄後索、後脳、心臓神経堤の一部、筋原細胞等での発現が報告されている。本発明者も脊髄および骨格筋におけるLBX1遺伝子の発現を確認した。マウスにおいて、Lbx1タンパク質は、脊髄後索ニューロンや、後脳における体性感覚ニューロンのidentityの決定因子として機能することが知られている。脊髄後索は体性感覚情報の伝達に関与し、AIS等の側弯症患者ではしばしば体性感覚機能の異常が認められる(Guo, X. et al. Spine 31, E437-E440 (2006))。また、痙攣性両側麻痺(Spastic Diplegia)の患者においては、後
根神経切除(dorsal rhizotomy)後に側弯症の罹患率が増大することが知られている(Steinbok, P. et al. J. Neurosurg. 102, 363-373. (2005))。以上より、LBX1遺伝子は、体性感覚機能の異常を介して側弯症の病因となっている可能性がある。
【0055】
<補完(imputation)>
また、10q24領域とAISの関連をさらに解析するため、rs11190870が含まれる上記連
鎖不平衡ブロックに存在する他のSNPs(GWASでは解析されなかったもの)の遺伝子型をMACH(http://www.sph.umich.edu/csg/yli/mach/index.html)により解析し、AISとの関連を評価した。補完(imputation)の結果、新たに3個のSNPsが、ゲノムワイドな有意性(genome-wide significance)の閾値として設定されたP<1.10×10-7を満たし、AISと有意に関連することが見出された(図1の下パネルの白い四角)。これら3個のSNPsはLBX1遺伝子の3’フランキング領域に位置し、いずれもrs11190870に対しr2>0.7で連鎖不平衡の関係にあった。なお、これら3個のSNPsと
AISとの関連は、rs11190870とAISとの関連よりも弱いものであった。
【0056】
<男性被検者を用いた関連解析>
女性被検者でAISとの強い関連が認められた3個のSNPs(rs11190870、rs625039、およびrs11598564)について、男性被検者におけるAISとの関連を検証した。94名の男性AIS被検者、および、1849名の男性対照被検者は、女性被検者と同様の基準
で採用した。AIS被検者の遺伝子型は、multiplex-PCR invader assay(Third Wave Technologies)により解析した。対照被検者の遺伝子型は、Illumina HumanHap550v3 Genotyping BeadChip(Illumina社(USA))を用いて解析した。上記3個のSNPsについて
、コクラン・アーミテージ傾向検定(Cochran-Armitage trend test)によりAISとの
関連を評価した。その結果、3個のSNPs全てについて、AISとの関連が再現された(表4)。オッズ比でみると、rs11190870とAISとの関連は女性の集団での関連よりも強く、また、rs625039およびrs11598564とAISとの関連は女性の集団での関連と同等であった。以上より、rs11190870、rs625039、およびrs11598564は、男性においてもAIS感受性多型であり、男性におけるAISの検査にも用いることができると明らかになった。
【0057】
【表4】

RAF;リスクアレル頻度(Risk Allele Frequency)
CI;信頼区間(Confidence Interval)
a:コクラン・アーミテージ傾向検定のP値。
b:95%CIでのアレルのオッズ比(Odds Ratio)。
【産業上の利用可能性】
【0058】
以上の通り、全ゲノムレベルでのケース−コントロール(Case-Control)関連解析により、ゲノムワイド水準を満たしてAISと関連する領域が見出された。当該領域に存在するSNPsは側弯症等の骨・関節疾患の検査に有用であり、側弯症等の骨・関節疾患の予防および/または治療に貢献するものである。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
第10染色体長腕24領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて骨・関節疾患を検査することを特徴とする、骨・関節疾患の発症リスクおよび/または発症の有無の判定方法。
【請求項2】
前記骨・関節疾患が、側弯症である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記一塩基多型が、配列番号1〜3から選ばれる塩基配列の塩基番号61番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項4】
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号4〜11から選ばれる塩基配列の塩基番号61番目の塩基に相当する塩基である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項5】
配列番号1〜11から選ばれる塩基配列において、塩基番号61番目の塩基を含む10塩基以上の配列、又はその相補配列を有する骨・関節疾患検査用プローブ。
【請求項6】
配列番号1〜11から選ばれる塩基配列において、塩基番号61番目の塩基を含む領域を増幅することのできる骨・関節疾患検査用プライマー。

【図1】
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【公開番号】特開2013−42673(P2013−42673A)
【公開日】平成25年3月4日(2013.3.4)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−180578(P2011−180578)
【出願日】平成23年8月22日(2011.8.22)
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】(出願人による申告)平成22年度 文部科学省、科学技術試験研究委託事業「疾患関連遺伝子等の探索を効率化するための遺伝子多型情報の高度化」、産業技術力強化法第19条の適用を受ける特許出願
【出願人】(503359821)独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】(899000057)学校法人日本大学 (650)
【出願人】(507148456)学校法人 岩手医科大学 (19)
【出願人】(508067851)一般社団法人徳洲会 (12)
【出願人】(504177284)国立大学法人滋賀医科大学 (41)
【Fターム(参考)】