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第6染色体短腕22領域または第9染色体長腕21領域の一塩基多型に基づく肥満の検査方法
説明

第6染色体短腕22領域または第9染色体長腕21領域の一塩基多型に基づく肥満の検査方法

【課題】肥満を検査する方法を提供する。
【解決手段】第6染色体短腕22領域または第9染色体長腕21領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満の発症リスクおよび/または発症の有無を検査する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は肥満の発症リスクや発症の有無を判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、肥満は世界的に流行し、医療上および経済上の深刻な問題となっている(非特許文献1)。肥満は糖尿病等、多くの生活習慣病の主要なリスク因子であり、肥満の発症を予測し予防することは重要な課題である。肥満は遺伝的素因に強く影響を受ける疾患であり、その症状の個人差の約40〜70%は遺伝的素因に起因することが知られている(非特許文献2)。
【0003】
近年、ゲノムワイド関連解析(GWAS)により、肥満の尺度として最も一般的に用いられるボディマス指数(Body Mass Index;BMI)と関連する多くの遺伝子座が見出された(非特許文献3〜12)。しかしながら、それらの研究のほとんどはヨーロッパ人を被検者として行われており、世界人口の2/3を占めるアジア人についてはほとんど解析されていない。ここで、アジア人では、ヨーロッパ人と比較して、同じBMIでも肥満の程度や、肥満により悪化する疾病リスクが高いことが知られている。よって、アジア人を被検者とする研究により、肥満に関連する新規な遺伝子座を同定し、肥満の遺伝的バックグラウンドに関するさらなる知見が得られるものと期待される。
【0004】
CDKAL1遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ5制御サブユニット関連タンパク質1ライク1(cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) regulatory subunit-associated protein 1-like 1)をコードする遺伝子である。CDKAL1遺伝子座は2型糖尿病のリスク遺伝子座であることが知られている(非特許文献13〜15)。
【0005】
CDKAL1遺伝子座は、ドイツ人集団を用いた研究で8歳児のBMIと関連することが報告されている(非特許文献13)。また、CDKAL1遺伝子座は、デンマーク人集団を用いた研究で出生時体重と関連することが報告されている(非特許文献14)。しかしながら、アジア人集団におけるCDKAL1遺伝子座とBMIとの関連は報告されておらず、また、成人におけるCDKAL1遺伝子座とBMIとの関連も報告されていない。
【0006】
KLF9遺伝子は、ジンクフィンガー転写因子の1つをコードする遺伝子であり、種々の生理反応に関与する。Klf9タンパク質は、peroxisome proliferator-activated receptor(PPAR)γのトランス活性化を介した脂肪生成促進性(pro-adipogenic)の転写因子であることが示唆されている(非特許文献16)。しかしながら、KLF9遺伝子座とBMIとの関連は報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Kopelman PG. Nature 404, 635-643 (2000).
【非特許文献2】Maes HH et al. Behav Genet 27, 325-351 (1997).
【非特許文献3】Frayling TM et al. Science 316, 889-894 (2007).
【非特許文献4】Liu YJ et al. Hum Mol Genet 17, 1803-1813 (2008).
【非特許文献5】Chambers JC et al. Nat Genet 40, 716-718 (2008).
【非特許文献6】Loos RJ et al. Nat Genet 40, 768-775 (2008).
【非特許文献7】Thorleifsson G et al. Nat Genet 41, 18-24 (2009).
【非特許文献8】Willer CJ et al. Nat Genet 41, 25-34 (2009).
【非特許文献9】Meyre D et al. Nat Genet 41, 157-159 (2009).
【非特許文献10】Liu XG et al. Am J Hum Genet 84, 418-423 (2009).
【非特許文献11】Cho YS et al. Nat Genet 41, 527-534 (2009).
【非特許文献12】Speliotes EK et al. Nat Genet 42, 937-948 (2010).
【非特許文献13】Winkler C et al. Diabetes 59, 2063-2067 (2010).
【非特許文献14】Andersson EA et al. Diabetologia 53, 1908-1916 (2010).
【非特許文献15】Yamauchi T et al. Nat Genet 42, 864-868 (2010).
【非特許文献16】Pei H et al. Cell Death Differ. 18, 315-327 (2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、肥満の発症リスクや発症の有無を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第6染色体短腕22領域または第9染色体長腕21領域に存在する一塩基多型(SNP)が肥満の指標であるBMIと関連することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより肥満の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0010】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[1]
第6染色体短腕22領域または第9染色体長腕21領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査することを特徴とする、肥満の発症リスクおよび/または発症の有無の判定方法。
[2]
前記一塩基多型が、配列番号1または2の塩基配列の塩基番号61番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、[1]に記載の方法。
[3]
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号3〜72から選ばれる塩基配列の塩基番号61番目の塩基に相当する塩基である、[2]に記載の方法。
[4]
配列番号1〜72から選ばれる塩基配列において、塩基番号61番目の塩基を含む10塩基以上の配列、又はその相補配列を有する肥満検査用プローブ。
[5]
配列番号1〜72から選ばれる塩基配列において、塩基番号61番目の塩基を含む領域を増幅することのできる肥満検査用プライマー。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、これまで予測が困難であった肥満の発症リスク(罹患リスク)を正確かつ簡便に予測することができる。また、肥満の発症を正確かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は肥満の予防や早期治療に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】(a)GWASの結果のマンハッタンプロットを示す図。(b)ヒト第6染色体短腕22領域におけるSNPsのプロットおよび遺伝子構造を示す図。(c)ヒト第9染色体長腕21領域におけるSNPsのプロットおよび遺伝子構造を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0013】
<1>本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第6染色体短腕22領域または第9染色体長腕21領域に存在するSNPを分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査することを特徴とする、肥満の発症リスクおよび/または発症の有無の判定方法である。すなわち、本発明において、「検査」とは肥満の発症リスクの検査及び肥満の発症の有無の検査を含む。本発明の方法においては、SNPの分析結果を、肥満の発症リスクおよび/または発症の有無と関連付ける。
【0014】
ヒト第6染色体短腕22領域(6p22領域)に存在する具体的なSNPとしては、ヒトrs2206734を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology Information(NCBI)のdbSNPデータベース(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)の登録番号を示す。rs2206734はGenBank Accession No. NT_007592.14の11553135番目の塩基におけるシトシン(C)/チミン(T)の多型を意味し、この塩基がCである場合は肥満の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、CC>CT>TTの順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【0015】
rs2206734は、CDKAL1遺伝子座に存在し、CDKAL1遺伝子座は肥満のリスク遺伝子座であると考えられる。よって、特に、CDKAL1遺伝子座に存在するSNPを解析することによって肥満を検査することができる。CDKAL1遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000006.11の20534688〜21232635の領域が挙げられる。
【0016】
ヒト第9染色体長腕21領域(9q21領域)に存在する具体的なSNPとしては、ヒトrs11142387を挙げることができる。rs11142387はGenBank Accession No. NT_023935.17の2162864番目の塩基におけるアデニン(A)/シトシン(C)の多型を意味し、この塩基がCである場合は肥満の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、CC>CA>AAの順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【0017】
rs11142387は、KLF9遺伝子のプロモーター領域に存在し、KLF9遺伝子座は肥満のリスク遺伝子座であると考えられる。よって、特に、KLF9遺伝子座に存在するSNPを解析することによって肥満を検査することができる。KLF9遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000009.11の72999513〜73029573の領域の相補配列が挙げられる。
【0018】
なお、rs2206734およびrs11142387について、SNP塩基及びその前後60bpの領域を含む合計121bpの長さの配列を、それぞれ配列番号1および2に示した。61番目の塩基が多型を有する。
【0019】
本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がSNP以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。
【0020】
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とr2>0.5、好ましくはr2>0.8、さらに好ましくはr2>0.9の関係を満たす塩基をいう。r2は連鎖不平衡係数である。また上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。もしくは、複数人(通常は20−40人程度)から採取
したDNAをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にあるSNPを探索することにより同定することもできる。
【0021】
rs2206734とr2>0.5で連鎖不平衡にある塩基としては、rs9368219、rs7766070、rs9356744、rs9368222、rs9350271、rs10440833、rs6456364、rs2328545、rs742642、rs9295475、rs9348440、rs9358355、rs9368216、rs7752906、rs10946398、rs4710940、rs4712522、rs4712525、rs4712526、rs6456368、rs6456369、rs6906327、rs7748382、rs7752780、rs7754840、rs7774594、rs9460544、rs9460545、rs9460546、rs6456367、rs7772603、rs9358356、rs4712523、rs9295474、rs9465850、rs2328528、rs6940200、rs7751957、rs7768642、rs9465846、rs9465847、rs9356747、rs9356746、rs4515379、rs9465837、rs9465841、rs2328548、rs1040558、rs10946403、rs11753081、rs6935599、rs7747752、rs7767391、rs9295478、rs9356748、rs9358357、rs9358358、rs9368224、rs12111351、rs9460550、rs9368226、rs9465871、rs2328529、rs7756992、rs1569699、rs2328549、rs9350270、およびrs9356743が挙げられる。これらSNP塩基及びその前後60bpの領域を含む合計121bpの長さの配列を、それぞれ配列番号3〜70に示した。61番目の塩基が多型を有する。これらSNPは、リスクアレルのホモ接合体 > リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体 > 非リスクアレルのホモ接合体の順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【0022】
rs11142387とr2>0.5で連鎖不平衡にある塩基としては、rs10780928およびrs4745008が挙げられる。これらSNP塩基及びその前後60bpの領域を含む合計121bpの長さの配列を、それぞれ配列番号71および72に示した。61番目の塩基が多型を有する。これらSNPは、リスクアレルのホモ接合体 > リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体 > 非リスクアレルのホモ接合体の順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【0023】
rs2206734またはrs11142387とr2>0.5で連鎖不平衡にあるこれら各塩基について、rs2206734またはrs11142387に対する連鎖不平衡係数(r2)、アレルの組み合わせ、およびリスクアレルを表1、2に示す。表1、2に示した連鎖不平衡係数(r2)は、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)上で公開されている、日本人および中国人90人のジェノタイプデータ(Phase II、release 24)に基づき推定されたものである。リスクアレルの表記はNCBIが公開している参照配列(Build 36)におけるforward strandに対応している。
【0024】
【表1】

【0025】
【表2】

【0026】
上記SNPの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて肥満と関
連付けることにより、肥満を検査することができる。上記SNPは単独で解析されてもよいし、上記SNPの少なくとも1つを含む複数のSNPsをまとめて解析(ハプロタイプ解析)してもよい。例えば、上記SNPの複数をまとめて解析してもよいし、上記SNPの少なくとも1つと、肥満と関連する既知のSNPs(非特許文献3〜12)や当該既知のSNPsと連鎖不平衡にあるSNPsとを組み合わせて解析してもよい。肥満と関連する複数のSNPsをまとめて解析すれば、肥満の検査の精度が向上する。なお、いずれのSNPも、二本鎖DNAのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、CDKAL1遺伝子またはKLF9遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
【0027】
SNPの解析に用いる試料としては、染色体DNAを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。SNPの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体DNAを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【0028】
SNPの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、PCR、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0029】
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の5’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめSNP部位を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。
【0030】
また、SNPの解析は、PCRによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、3’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してPCRを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、LAMP法(特許第3313358号明細書)、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification;特許2843586号明細書)、ICAN法(特開2002−233379号公報)などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【0031】
また、SNP部位を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR−SSCP(single-strand conformation polymorphism)法(Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.)が挙げられる。具体的には、まず、目的のSNPを含むDNAを増幅し、増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【0032】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる(RFLP法)。この場合、まず、DNA試料を制限酵素により切断する。次いで、DNA断片を分離し、検出されたDNA断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【0033】
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもで
きる。
【0034】
このようにしてSNPがいずれの塩基であるかを決定することで、肥満を検査するためのデータを得ることができる。
【0035】
<2>本発明の検査用試薬
本発明はまた、肥満を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記SNP部位を含み、ハイブリダイズの有無によってSNP部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号1〜72から選ばれる塩基配列の61番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する10塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、15〜35塩基であり、より好ましくは20〜35塩基である。
【0036】
また、プライマーとしては、上記SNP部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、又は上記SNP部位を配列解析(シークエンシング)するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号1〜72から選ばれる塩基配列の61番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは10〜50塩基が好ましく、15〜35塩基がより好ましく、20〜35塩基がさらに好ましい。
【0037】
上記SNP部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の5’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の3’側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を3’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を3’側に含むプライマーなどが例示される。
【0038】
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【0039】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【0040】
(1)肥満と関連するSNPsの同定
肥満感受性を決定する遺伝的変異を同定するために、日本人被検者を用いてゲノムワイド関連解析(GWAS)を行った。GWASとは、疾患等の表現型に関わる遺伝的変異を探索する遺伝統計学的手法である。例えば、ヒトゲノム全体を網羅するような数十万〜100万ヶ所のSNPsを用いて、ある形質の平均値の分布において、多型の組み合わせ(ジェノタイプ)による差があるかどうかを統計的に検定することで、疾患と関連する遺伝的変異を見出すことができる。本実施例において、肥満の指標としては、ボディマス指数(Body Mass Index;BMI)を用いた。
【0041】
<被検者>
GWASに用いた26620名の被検者、再現試験(replication study)1に用いた3763名の被検者、および再現試験2に用いた4147名の被検者は、東京大学医科学研究所のBioBank Japan (BBJ) (Nakamura, Y. The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol 5, 696-7 (2007))に登録された種々の疾患の日本人患者から採用した。これら被検者のうち、BMI≧27.5の被検者を、肥満の被検者(ケース(case))として用いた。それ以外の被検者を、対照被検者(コントロール(control))として用いた。
GWAS、再現試験1、および再現試験2に用いた被検者における肥満の被検者の比率は、それぞれ9.3%、7.2%、7.3%であった。
【0042】
再現試験3には、27715名の東アジア人種の8集団からなる被検者を用いた。
【0043】
GWAS、および再現試験1〜3に用いた被検者集団は、互いに独立である。
【0044】
本実施例に用いた被検者の特徴を表3に示す。
【0045】
【表3】

a:BMI≧27.5の被検者を、肥満(obesity)とした。
b:BioBank Japan (BBJ) に登録された種々の疾患の患者からなる被検者。
c:東アジア人種の8集団(KARE, Shanghai, SiMES, SDCS, SP2, IMCJ, Taiwan, CRC)からなる被検者。
【0046】
本研究は東京大学医科学研究所および理化学研究所横浜研究所の倫理委員会によって承認され、全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。
【0047】
<GWAS>
被検者26620名の遺伝子型を、Illumina Human610-Quad Genotyping BeadChip(Illumina社(USA))を用いて解析した。なお、クオリティコントロールとして、コール率(call rate)が0.98未満の被検者、コール率(call rate)が0.99未満のSNPs、あいまいなコール(ambiguous call)のSNPs、identify-by-state(IBS)>1.7の近縁ペアの内の低コール率の被検者、および主成分分析(PCA)により外れ値(outlier)であると判定された被検者を除外した。クオリティコントロールを通過したマイナーアレル頻度(MAFs)≧0.01を満たす常染色体上の480,103個のSNPsについて、遺伝子型のデータを取得した。各SNPsについて、線形回帰モデル(linear regression model)を用いてBMIとの関連を評価した。
【0048】
GWASの結果、ゲノムワイドな有意性(genome-wide significance)の閾値として設定されたP<5.0×10-8を満たしてBMIと有意に関連する3ヶ所のSNPs(9q21領域のrs11142387、11p14領域のrs2030323、および19q13領域のrs11671664)が見出された(図1(a)、表4)。
【0049】
【表4】

a:GWASおよび全3回の再現試験の複合解析でP<5.0×10-5を満たしたSNPsを示す。
b:BMIを増大させるアレルをA1(アレル1)として、NCBI Build 36のforward strandに基づいて示した。
c:アレル1の頻度。
d:標準化したBMI(平均値=0、標準偏差=1)におけるアレル1の効果量。
e:独立した3度の再現試験の総合結果。
f:非特許文献12の結果に基づく。
【0050】
<再現試験>
GWASで見出された関連性を検証するため、独立した3度の再現試験(replication study)を行った。
【0051】
再現試験1では、GWASにおいてP<5.0×10-5を満たした36個のSNPsについて、BMIとの関連を検証した。被検者3763名の遺伝子型をIllumina HumanHap550v3 Genotyping BeadChip(Illumina社(USA))を用いて解析し、GWASと同様のクオリティコントロールの下でBMIとの関連を検証した。
【0052】
GWASと再現試験1の複合解析(combined analysis)の結果、P<5.0×10-5を満たした11個のSNPsを再現試験2および3に供した。
【0053】
再現試験2では、被検者4147名の遺伝子型を、Illumina HumanOmniExpress Genotyping BeadChip(Illumina社(USA))を用いて解析し、GWASと同様のクオリティコントロールの下でBMIとの関連を検証した。再現試験3では、被検者27715名の遺伝子型をAffymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0(Affymetrix社(USA))、Affymetrix Genome-Wide Human SNP array 5.0(Affymetrix社(USA))、Illumina 1Mduo Genotyping BeadChip(Illumina社(USA))、Illumina HumanHap610Quad Genotyping BeadChip(Illumina社(USA))、およびIllumina HumanHap550 Genotyping BeadChip(Illumina社(USA))を用いて解析した。
【0054】
GWASと全3回の再現試験の複合解析(combined analysis)の結果、P<5.0×10-5を満たした9個のSNPsを表4に示す。これらの内、7か所のSNPsが、ゲノムワイドな有意性(genome-wide significance)の閾値として設定されたP<5.0×10-8を満たし、BMIと有意に関連することが確認された。なお、これら7個のSNPsには、GWASにおいて有意性を満たした3個のSNPsも含まれている。
【0055】
これら7個のSNPsが位置する遺伝子座の内、1q25領域のSEC16B遺伝子座、11p14領域のBDNF遺伝子座、16q12領域のFTO遺伝子座、18p21領域のMC4R遺伝子座、および19q13領域のGIPR遺伝子座の5つについては、すでにヨーロッパ人においてBMIとの関連が見出されている。
【0056】
一方、残りのrs2206734およびrs11142387が位置する領域(6p22および9q21)については、主にヨーロッパ人被検者(特に成人被検者)を用いたこれまでの研究ではBMIとの関連が報告されていなかった。
【0057】
rs2206734の位置する領域におけるSNPsのプロットおよび遺伝子構造を図1(b)に示す。また、rs11142387の位置する領域におけるSNPsのプロットおよび遺伝子構造を図1(c)に示す。
【0058】
rs2206734は、CDKAL1遺伝子座のコード領域に位置している。CDKAL1遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ5制御サブユニット関連タンパク質1ライク1(cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) regulatory subunit-associated protein 1-like 1)をコードする遺伝子である。
【0059】
CDKAL1遺伝子座は、ドイツ人集団を用いた研究で8歳児のBMIと関連することが報告されている(非特許文献13)。また、CDKAL1遺伝子座は、デンマーク人集団を用いた研究で出生時体重と関連することが報告されている(非特許文献14)。しかしながら、アジア人集団におけるCDKAL1遺伝子座とBMIとの関連は報告されておらず、また、成人におけるCDKAL1遺伝子座とBMIとの関連も報告されていなかった。よって、特に、CDKAL1遺伝子座のSNPsを解析することでアジア人種の肥満や成人の肥満を検査できることは、本発明者により初めて見出された知見である。
【0060】
また、CDKAL1遺伝子座は2型糖尿病のリスク遺伝子座であることが知られている(非特許文献13〜15)。そこで、rs2206734およびrs11142387について、共変数を含むロジスティック回帰モデル(logistic regression model)を用いて肥満および2型糖尿病との関連を評価した。結果、rs2206734(CDKAL1遺伝子座)のTアレルは、BMIを低下させるのに対し、2型糖尿病のリスクを増大させることが明らかとなった(表5)。通常、BMIが増大すれば2型糖尿病のリスクも増大すると考えられる。よって、rs2206734のBMIに対する効果は2型糖尿病に対する効果から想定されるものと反対であり、rs2206734のCアレルがBMIのリスクアレルとして見出されたのは驚くべき結果であった。
【0061】
【表5】

a:BMIを増大させるアレルをA1(アレル1)として、NCBI Build 36のforward strandに基づいて示した。
b:GWASと全3回の再現試験の被検者が含まれる。
c:肥満および2型糖尿病におけるアレル1の効果量。
【0062】
rs11142387は、KLF9遺伝子のプロモーター領域に位置している。rs11142387を含む連鎖不平衡(LD)ブロックは複数の遺伝子を含むが、タグSNPであるrs11142387がKLF9遺伝子座に位置していることから、KLF9遺伝子が原因遺伝子の候補である。
【0063】
KLF9遺伝子は、ジンクフィンガー転写因子の1つをコードする遺伝子であり、種々の生理反応に関与する。ここで、脂肪細胞分化の重要な要素としてperoxisome proliferator-activated receptor(PPAR)γが知られており、PPARγは肥満を含む多くの代謝特性の病態と関連している(Pei H et al. Cell Death Differ. 18, 315-327 (2010))。最近の研究では、KLF9遺伝子がコードするタンパク質は、PPARγのトランス活性化を介した脂肪生成促進性(pro-adipogenic)の転写因子であることが示唆されている(非特許文献16)。また、KLFとしては、KLF7遺伝子座が肥満と関連すること、およびKLF5遺伝子がコードするタンパク質が脂肪細胞分化を制御していることが知られている。しかしながら、KLF9遺伝子座とBMIとの関連は報告されていなかった。
【0064】
なお、rs2206734(CDKAL1遺伝子座)と異なり、rs11142387(KLF9遺伝子座)は2型糖尿病との関連は認められなかった(表5)。
【0065】
<民族間での比較>
さらに、民族間での肥満の遺伝学的差異を評価するため、GWASと全3回の再現試験の複合解析(combined analysis)でP<5.0×10-5を満たした9個のSNPsについて、GIANTコンソーシアムの123,865名のヨーロッパ人被検者のメタ解析の結果(非特許文献12)を利用してBMIとの関連を評価した(表4)。
【0066】
9個のSNPsの内、rs2206734(CDKAL1遺伝子座)を含む5つが、ヨーロッパ人集団においてもBMIと有意(P<0.028、false discovery rate<0.05)に関連した。一方、rs11142387(KLF9遺伝子座)については、ヨーロッパ人集団においてはBMIとの関連が認められなかった。よって、特にrs11142387(KLF9遺伝子座)および当該塩基と連鎖不平衡の関係にあるSNPsは、アジア人集団における肥満の検査に好適に用いることができる。
【0067】
次に、主にヨーロッパ人集団においてBMIとの関連が報告されている既知のSNPs(非特許文献13〜15、Zobel DP et al. Eur J Endocrinol 160, 603-609 (2009))について、本実施例のGWASで得られたデータを用いて日本人集団におけるBMIとの関連を評価した(表6)。
【0068】
【表6】

a:BMIとの関連が報告されている既知のSNPs。
b:BMIを増大させるアレルをA1(アレル1)として、NCBI Build 36のforward strandに基づいて示した。
c:GWAS被検者におけるアレル1の頻度。
d:標準化したBMI(平均値=0、標準偏差=1)におけるアレル1の効果量。
e:P<0.02(多型遺伝子座の数に基づくfalse discovery rate<0.05)を有意とした。
f:統計的検出力(statistical power)は、アレル頻度とGWASのサンプルサイズに基づいて算出し、効果量を0.035と仮定した条件での有意性の閾値を0.02とした。
【0069】
BMIとの関連が報告されている既知のSNPsの内、本実施例で既にBMIとの関連が再確認された5つの遺伝子座に加え、さらに10ヶ所の遺伝子座が日本人被検者においても同様にBMIに影響することが明らかとなったP<0.02(false discovery rate<0.05)。
【産業上の利用可能性】
【0070】
以上の通り、BMIと関連する2個のSNPsが新規に見出された。これらのSNPsは肥満の検査に有用であり、肥満の予防および/または治療に貢献するものである。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
第6染色体短腕22領域または第9染色体長腕21領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査することを特徴とする、肥満の発症リスクおよび/または発症の有無の判定方法。
【請求項2】
前記一塩基多型が、配列番号1または2の塩基配列の塩基番号61番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号3〜72から選ばれる塩基配列の塩基番号61番目の塩基に相当する塩基である、請求項2に記載の方法。
【請求項4】
配列番号1〜72から選ばれる塩基配列において、塩基番号61番目の塩基を含む10塩基以上の配列、又はその相補配列を有する肥満検査用プローブ。
【請求項5】
配列番号1〜72から選ばれる塩基配列において、塩基番号61番目の塩基を含む領域を増幅することのできる肥満検査用プライマー。

【図1】
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【公開番号】特開2013−21994(P2013−21994A)
【公開日】平成25年2月4日(2013.2.4)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−162177(P2011−162177)
【出願日】平成23年7月25日(2011.7.25)
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】(出願人による申告)平成22年度 文部科学省、科学技術試験研究委託事業「疾患関連遺伝子等の探索を効率化するための遺伝子多型情報の高度化」、産業技術力強化法第19条の適用を受ける特許出願
【出願人】(503359821)独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】(508067851)一般社団法人徳洲会 (12)
【出願人】(899000057)学校法人日本大学 (650)
【出願人】(803000034)学校法人日本医科大学 (37)
【出願人】(507148456)学校法人 岩手医科大学 (19)
【Fターム(参考)】