第６染色体短腕２２領域または第９染色体長腕２１領域の一塩基多型に基づく肥満の検査方法
【課題】肥満を検査する方法を提供する。
【解決手段】第６染色体短腕２２領域または第９染色体長腕２１領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満の発症リスクおよび／または発症の有無を検査する。
【解決手段】第６染色体短腕２２領域または第９染色体長腕２１領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満の発症リスクおよび／または発症の有無を検査する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肥満の発症リスクや発症の有無を判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肥満は世界的に流行し、医療上および経済上の深刻な問題となっている（非特許文献１）。肥満は糖尿病等、多くの生活習慣病の主要なリスク因子であり、肥満の発症を予測し予防することは重要な課題である。肥満は遺伝的素因に強く影響を受ける疾患であり、その症状の個人差の約４０〜７０％は遺伝的素因に起因することが知られている（非特許文献２）。
【０００３】
近年、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、肥満の尺度として最も一般的に用いられるボディマス指数（Body Mass Index；ＢＭＩ）と関連する多くの遺伝子座が見出された（非特許文献３〜１２）。しかしながら、それらの研究のほとんどはヨーロッパ人を被検者として行われており、世界人口の２／３を占めるアジア人についてはほとんど解析されていない。ここで、アジア人では、ヨーロッパ人と比較して、同じＢＭＩでも肥満の程度や、肥満により悪化する疾病リスクが高いことが知られている。よって、アジア人を被検者とする研究により、肥満に関連する新規な遺伝子座を同定し、肥満の遺伝的バックグラウンドに関するさらなる知見が得られるものと期待される。
【０００４】
ＣＤＫＡＬ１遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ５制御サブユニット関連タンパク質１ライク１（cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) regulatory subunit-associated protein 1-like 1）をコードする遺伝子である。ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は２型糖尿病のリスク遺伝子座であることが知られている（非特許文献１３〜１５）。
【０００５】
ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は、ドイツ人集団を用いた研究で８歳児のＢＭＩと関連することが報告されている（非特許文献１３）。また、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は、デンマーク人集団を用いた研究で出生時体重と関連することが報告されている（非特許文献１４）。しかしながら、アジア人集団におけるＣＤＫＡＬ１遺伝子座とＢＭＩとの関連は報告されておらず、また、成人におけるＣＤＫＡＬ１遺伝子座とＢＭＩとの関連も報告されていない。
【０００６】
ＫＬＦ９遺伝子は、ジンクフィンガー転写因子の１つをコードする遺伝子であり、種々の生理反応に関与する。Ｋｌｆ９タンパク質は、peroxisome proliferator-activated receptor（ＰＰＡＲ）γのトランス活性化を介した脂肪生成促進性（pro-adipogenic）の転写因子であることが示唆されている（非特許文献１６）。しかしながら、ＫＬＦ９遺伝子座とＢＭＩとの関連は報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kopelman PG. Nature 404, 635-643 (2000).
【非特許文献２】Maes HH et al. Behav Genet 27, 325-351 (1997).
【非特許文献３】Frayling TM et al. Science 316, 889-894 (2007).
【非特許文献４】Liu YJ et al. Hum Mol Genet 17, 1803-1813 (2008).
【非特許文献５】Chambers JC et al. Nat Genet 40, 716-718 (2008).
【非特許文献６】Loos RJ et al. Nat Genet 40, 768-775 (2008).
【非特許文献７】Thorleifsson G et al. Nat Genet 41, 18-24 (2009).
【非特許文献８】Willer CJ et al. Nat Genet 41, 25-34 (2009).
【非特許文献９】Meyre D et al. Nat Genet 41, 157-159 (2009).
【非特許文献１０】Liu XG et al. Am J Hum Genet 84, 418-423 (2009).
【非特許文献１１】Cho YS et al. Nat Genet 41, 527-534 (2009).
【非特許文献１２】Speliotes EK et al. Nat Genet 42, 937-948 (2010).
【非特許文献１３】Winkler C et al. Diabetes 59, 2063-2067 (2010).
【非特許文献１４】Andersson EA et al. Diabetologia 53, 1908-1916 (2010).
【非特許文献１５】Yamauchi T et al. Nat Genet 42, 864-868 (2010).
【非特許文献１６】Pei H et al. Cell Death Differ. 18, 315-327 (2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、肥満の発症リスクや発症の有無を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第６染色体短腕２２領域または第９染色体長腕２１領域に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）が肥満の指標であるＢＭＩと関連することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより肥満の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]
第６染色体短腕２２領域または第９染色体長腕２１領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査することを特徴とする、肥満の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法。
[２]
前記一塩基多型が、配列番号１または２の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、[１]に記載の方法。
[３]
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号３〜７２から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基である、[２]に記載の方法。
[４]
配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する肥満検査用プローブ。
[５]
配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる肥満検査用プライマー。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、これまで予測が困難であった肥満の発症リスク（罹患リスク）を正確かつ簡便に予測することができる。また、肥満の発症を正確かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は肥満の予防や早期治療に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（ａ）ＧＷＡＳの結果のマンハッタンプロットを示す図。（ｂ）ヒト第６染色体短腕２２領域におけるＳＮＰｓのプロットおよび遺伝子構造を示す図。（ｃ）ヒト第９染色体長腕２１領域におけるＳＮＰｓのプロットおよび遺伝子構造を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第６染色体短腕２２領域または第９染色体長腕２１領域に存在するＳＮＰを分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査することを特徴とする、肥満の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法である。すなわち、本発明において、「検査」とは肥満の発症リスクの検査及び肥満の発症の有無の検査を含む。本発明の方法においては、ＳＮＰの分析結果を、肥満の発症リスクおよび／または発症の有無と関連付ける。
【００１４】
ヒト第６染色体短腕２２領域（６ｐ２２領域）に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs2206734を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。rs2206734はGenBank Accession No. NT_007592.14の11553135番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基がＣである場合は肥満の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【００１５】
rs2206734は、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座に存在し、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は肥満のリスク遺伝子座であると考えられる。よって、特に、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座に存在するＳＮＰを解析することによって肥満を検査することができる。ＣＤＫＡＬ１遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000006.11の20534688〜21232635の領域が挙げられる。
【００１６】
ヒト第９染色体長腕２１領域（９ｑ２１領域）に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs11142387を挙げることができる。rs11142387はGenBank Accession No. NT_023935.17の2162864番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＣである場合は肥満の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＡ＞ＡＡの順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【００１７】
rs11142387は、ＫＬＦ９遺伝子のプロモーター領域に存在し、ＫＬＦ９遺伝子座は肥満のリスク遺伝子座であると考えられる。よって、特に、ＫＬＦ９遺伝子座に存在するＳＮＰを解析することによって肥満を検査することができる。ＫＬＦ９遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000009.11の72999513〜73029573の領域の相補配列が挙げられる。
【００１８】
なお、rs2206734およびrs11142387について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１および２に示した。６１番目の塩基が多型を有する。
【００１９】
本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。
【００２０】
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たす塩基をいう。ｒ2は連鎖不平衡係数である。また上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。もしくは、複数人（通常は２０−４０人程度）から採取
したＤＮＡをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にあるＳＮＰを探索することにより同定することもできる。
【００２１】
rs2206734とｒ2＞０．５で連鎖不平衡にある塩基としては、rs9368219、rs7766070、rs9356744、rs9368222、rs9350271、rs10440833、rs6456364、rs2328545、rs742642、rs9295475、rs9348440、rs9358355、rs9368216、rs7752906、rs10946398、rs4710940、rs4712522、rs4712525、rs4712526、rs6456368、rs6456369、rs6906327、rs7748382、rs7752780、rs7754840、rs7774594、rs9460544、rs9460545、rs9460546、rs6456367、rs7772603、rs9358356、rs4712523、rs9295474、rs9465850、rs2328528、rs6940200、rs7751957、rs7768642、rs9465846、rs9465847、rs9356747、rs9356746、rs4515379、rs9465837、rs9465841、rs2328548、rs1040558、rs10946403、rs11753081、rs6935599、rs7747752、rs7767391、rs9295478、rs9356748、rs9358357、rs9358358、rs9368224、rs12111351、rs9460550、rs9368226、rs9465871、rs2328529、rs7756992、rs1569699、rs2328549、rs9350270、およびrs9356743が挙げられる。これらＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号３〜７０に示した。６１番目の塩基が多型を有する。これらＳＮＰは、リスクアレルのホモ接合体 ＞ リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体 ＞ 非リスクアレルのホモ接合体の順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【００２２】
rs11142387とｒ2＞０．５で連鎖不平衡にある塩基としては、rs10780928およびrs4745008が挙げられる。これらＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号７１および７２に示した。６１番目の塩基が多型を有する。これらＳＮＰは、リスクアレルのホモ接合体 ＞ リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体 ＞ 非リスクアレルのホモ接合体の順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【００２３】
rs2206734またはrs11142387とｒ2＞０．５で連鎖不平衡にあるこれら各塩基について、rs2206734またはrs11142387に対する連鎖不平衡係数（ｒ2）、アレルの組み合わせ、およびリスクアレルを表１、２に示す。表１、２に示した連鎖不平衡係数（ｒ2）は、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)上で公開されている、日本人および中国人90人のジェノタイプデータ（Phase II、release ２４）に基づき推定されたものである。リスクアレルの表記はＮＣＢＩが公開している参照配列（Build 36）におけるforward strandに対応している。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて肥満と関
連付けることにより、肥満を検査することができる。上記ＳＮＰは単独で解析されてもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つを含む複数のＳＮＰｓをまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。例えば、上記ＳＮＰの複数をまとめて解析してもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つと、肥満と関連する既知のＳＮＰｓ（非特許文献３〜１２）や当該既知のＳＮＰｓと連鎖不平衡にあるＳＮＰｓとを組み合わせて解析してもよい。肥満と関連する複数のＳＮＰｓをまとめて解析すれば、肥満の検査の精度が向上する。なお、いずれのＳＮＰも、二本鎖ＤＮＡのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、ＣＤＫＡＬ１遺伝子またはＫＬＦ９遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
【００２７】
ＳＮＰの解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。ＳＮＰの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００２８】
ＳＮＰの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめＳＮＰ部位を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００３０】
また、ＳＮＰの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【００３１】
また、ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３２】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３３】
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰがいずれの塩基であるかを調べることもで
きる。
【００３４】
このようにしてＳＮＰがいずれの塩基であるかを決定することで、肥満を検査するためのデータを得ることができる。
【００３５】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、肥満を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記ＳＮＰ部位を含み、ハイブリダイズの有無によってＳＮＰ部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。
【００３６】
また、プライマーとしては、上記ＳＮＰ部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記ＳＮＰ部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
【００３７】
上記ＳＮＰ部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
【００３８】
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００４０】
（１）肥満と関連するＳＮＰｓの同定
肥満感受性を決定する遺伝的変異を同定するために、日本人被検者を用いてゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行った。ＧＷＡＳとは、疾患等の表現型に関わる遺伝的変異を探索する遺伝統計学的手法である。例えば、ヒトゲノム全体を網羅するような数十万〜１００万ヶ所のＳＮＰｓを用いて、ある形質の平均値の分布において、多型の組み合わせ（ジェノタイプ）による差があるかどうかを統計的に検定することで、疾患と関連する遺伝的変異を見出すことができる。本実施例において、肥満の指標としては、ボディマス指数（Body Mass Index；ＢＭＩ）を用いた。
【００４１】
＜被検者＞
ＧＷＡＳに用いた２６６２０名の被検者、再現試験（replication study）１に用いた３７６３名の被検者、および再現試験２に用いた４１４７名の被検者は、東京大学医科学研究所のBioBank Japan (BBJ) (Nakamura, Y. The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol 5, 696-7 (2007))に登録された種々の疾患の日本人患者から採用した。これら被検者のうち、ＢＭＩ≧２７．５の被検者を、肥満の被検者（ケース（case））として用いた。それ以外の被検者を、対照被検者（コントロール（control））として用いた。
ＧＷＡＳ、再現試験１、および再現試験２に用いた被検者における肥満の被検者の比率は、それぞれ９．３％、７．２％、７．３％であった。
【００４２】
再現試験３には、２７７１５名の東アジア人種の８集団からなる被検者を用いた。
【００４３】
ＧＷＡＳ、および再現試験１〜３に用いた被検者集団は、互いに独立である。
【００４４】
本実施例に用いた被検者の特徴を表３に示す。
【００４５】
【表３】
ａ：ＢＭＩ≧２７．５の被検者を、肥満（obesity）とした。
ｂ：BioBank Japan (BBJ) に登録された種々の疾患の患者からなる被検者。
ｃ：東アジア人種の８集団（KARE, Shanghai, SiMES, SDCS, SP2, IMCJ, Taiwan, CRC）からなる被検者。
【００４６】
本研究は東京大学医科学研究所および理化学研究所横浜研究所の倫理委員会によって承認され、全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。
【００４７】
＜ＧＷＡＳ＞
被検者２６６２０名の遺伝子型を、Illumina Human610-Quad Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））を用いて解析した。なお、クオリティコントロールとして、コール率（call rate）が０．９８未満の被検者、コール率（call rate）が０．９９未満のＳＮＰｓ、あいまいなコール（ambiguous call）のＳＮＰｓ、identify-by-state（ＩＢＳ）＞１．７の近縁ペアの内の低コール率の被検者、および主成分分析（ＰＣＡ）により外れ値（outlier）であると判定された被検者を除外した。クオリティコントロールを通過したマイナーアレル頻度（ＭＡＦｓ）≧０．０１を満たす常染色体上の４８０，１０３個のＳＮＰｓについて、遺伝子型のデータを取得した。各ＳＮＰｓについて、線形回帰モデル（linear regression model）を用いてＢＭＩとの関連を評価した。
【００４８】
ＧＷＡＳの結果、ゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値として設定されたＰ＜５．０×１０-8を満たしてＢＭＩと有意に関連する３ヶ所のＳＮＰｓ（9q21領域のrs11142387、11p14領域のrs2030323、および19q13領域のrs11671664）が見出された（図１（ａ）、表４）。
【００４９】
【表４】
ａ：ＧＷＡＳおよび全３回の再現試験の複合解析でＰ＜５．０×１０-5を満たしたＳＮＰｓを示す。
ｂ：ＢＭＩを増大させるアレルをＡ１（アレル１）として、NCBI Build 36のforward strandに基づいて示した。
ｃ：アレル１の頻度。
ｄ：標準化したＢＭＩ（平均値＝０、標準偏差＝１）におけるアレル１の効果量。
ｅ：独立した３度の再現試験の総合結果。
ｆ：非特許文献１２の結果に基づく。
【００５０】
＜再現試験＞
ＧＷＡＳで見出された関連性を検証するため、独立した３度の再現試験（replication study）を行った。
【００５１】
再現試験１では、ＧＷＡＳにおいてＰ＜５．０×１０-5を満たした３６個のＳＮＰｓについて、ＢＭＩとの関連を検証した。被検者３７６３名の遺伝子型をIllumina HumanHap550v3 Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））を用いて解析し、ＧＷＡＳと同様のクオリティコントロールの下でＢＭＩとの関連を検証した。
【００５２】
ＧＷＡＳと再現試験１の複合解析（combined analysis）の結果、Ｐ＜５．０×１０-5を満たした１１個のＳＮＰｓを再現試験２および３に供した。
【００５３】
再現試験２では、被検者４１４７名の遺伝子型を、Illumina HumanOmniExpress Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））を用いて解析し、ＧＷＡＳと同様のクオリティコントロールの下でＢＭＩとの関連を検証した。再現試験３では、被検者２７７１５名の遺伝子型をAffymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0（Affymetrix社（USA））、Affymetrix Genome-Wide Human SNP array 5.0（Affymetrix社（USA））、Illumina 1Mduo Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））、Illumina HumanHap610Quad Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））、およびIllumina HumanHap550 Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））を用いて解析した。
【００５４】
ＧＷＡＳと全３回の再現試験の複合解析（combined analysis）の結果、Ｐ＜５．０×１０-5を満たした９個のＳＮＰｓを表４に示す。これらの内、７か所のＳＮＰｓが、ゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値として設定されたＰ＜５．０×１０-8を満たし、ＢＭＩと有意に関連することが確認された。なお、これら７個のＳＮＰｓには、ＧＷＡＳにおいて有意性を満たした３個のＳＮＰｓも含まれている。
【００５５】
これら７個のＳＮＰｓが位置する遺伝子座の内、1q25領域のSEC16B遺伝子座、11p14領域のBDNF遺伝子座、16q12領域のFTO遺伝子座、18p21領域のMC4R遺伝子座、および19q13領域のGIPR遺伝子座の５つについては、すでにヨーロッパ人においてＢＭＩとの関連が見出されている。
【００５６】
一方、残りのrs2206734およびrs11142387が位置する領域（6p22および9q21）については、主にヨーロッパ人被検者（特に成人被検者）を用いたこれまでの研究ではＢＭＩとの関連が報告されていなかった。
【００５７】
rs2206734の位置する領域におけるＳＮＰｓのプロットおよび遺伝子構造を図１（ｂ）に示す。また、rs11142387の位置する領域におけるＳＮＰｓのプロットおよび遺伝子構造を図１（ｃ）に示す。
【００５８】
rs2206734は、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座のコード領域に位置している。ＣＤＫＡＬ１遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ５制御サブユニット関連タンパク質１ライク１（cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) regulatory subunit-associated protein 1-like 1）をコードする遺伝子である。
【００５９】
ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は、ドイツ人集団を用いた研究で８歳児のＢＭＩと関連することが報告されている（非特許文献１３）。また、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は、デンマーク人集団を用いた研究で出生時体重と関連することが報告されている（非特許文献１４）。しかしながら、アジア人集団におけるＣＤＫＡＬ１遺伝子座とＢＭＩとの関連は報告されておらず、また、成人におけるＣＤＫＡＬ１遺伝子座とＢＭＩとの関連も報告されていなかった。よって、特に、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座のＳＮＰｓを解析することでアジア人種の肥満や成人の肥満を検査できることは、本発明者により初めて見出された知見である。
【００６０】
また、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は２型糖尿病のリスク遺伝子座であることが知られている（非特許文献１３〜１５）。そこで、rs2206734およびrs11142387について、共変数を含むロジスティック回帰モデル（logistic regression model）を用いて肥満および２型糖尿病との関連を評価した。結果、rs2206734（ＣＤＫＡＬ１遺伝子座）のＴアレルは、ＢＭＩを低下させるのに対し、２型糖尿病のリスクを増大させることが明らかとなった（表５）。通常、ＢＭＩが増大すれば２型糖尿病のリスクも増大すると考えられる。よって、rs2206734のＢＭＩに対する効果は２型糖尿病に対する効果から想定されるものと反対であり、rs2206734のＣアレルがＢＭＩのリスクアレルとして見出されたのは驚くべき結果であった。
【００６１】
【表５】
ａ：ＢＭＩを増大させるアレルをＡ１（アレル１）として、NCBI Build 36のforward strandに基づいて示した。
ｂ：ＧＷＡＳと全３回の再現試験の被検者が含まれる。
ｃ：肥満および２型糖尿病におけるアレル１の効果量。
【００６２】
rs11142387は、ＫＬＦ９遺伝子のプロモーター領域に位置している。rs11142387を含む連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックは複数の遺伝子を含むが、タグＳＮＰであるrs11142387がＫＬＦ９遺伝子座に位置していることから、ＫＬＦ９遺伝子が原因遺伝子の候補である。
【００６３】
ＫＬＦ９遺伝子は、ジンクフィンガー転写因子の１つをコードする遺伝子であり、種々の生理反応に関与する。ここで、脂肪細胞分化の重要な要素としてperoxisome proliferator-activated receptor（ＰＰＡＲ）γが知られており、ＰＰＡＲγは肥満を含む多くの代謝特性の病態と関連している（Pei H et al. Cell Death Differ. 18, 315-327 (2010)）。最近の研究では、ＫＬＦ９遺伝子がコードするタンパク質は、ＰＰＡＲγのトランス活性化を介した脂肪生成促進性（pro-adipogenic）の転写因子であることが示唆されている（非特許文献１６）。また、ＫＬＦとしては、ＫＬＦ７遺伝子座が肥満と関連すること、およびＫＬＦ５遺伝子がコードするタンパク質が脂肪細胞分化を制御していることが知られている。しかしながら、ＫＬＦ９遺伝子座とＢＭＩとの関連は報告されていなかった。
【００６４】
なお、rs2206734（ＣＤＫＡＬ１遺伝子座）と異なり、rs11142387（ＫＬＦ９遺伝子座）は２型糖尿病との関連は認められなかった（表５）。
【００６５】
＜民族間での比較＞
さらに、民族間での肥満の遺伝学的差異を評価するため、ＧＷＡＳと全３回の再現試験の複合解析（combined analysis）でＰ＜５．０×１０-5を満たした９個のＳＮＰｓについて、ＧＩＡＮＴコンソーシアムの１２３，８６５名のヨーロッパ人被検者のメタ解析の結果（非特許文献１２）を利用してＢＭＩとの関連を評価した（表４）。
【００６６】
９個のＳＮＰｓの内、rs2206734（ＣＤＫＡＬ１遺伝子座）を含む５つが、ヨーロッパ人集団においてもＢＭＩと有意（Ｐ＜０．０２８、false discovery rate＜０．０５）に関連した。一方、rs11142387（ＫＬＦ９遺伝子座）については、ヨーロッパ人集団においてはＢＭＩとの関連が認められなかった。よって、特にrs11142387（ＫＬＦ９遺伝子座）および当該塩基と連鎖不平衡の関係にあるＳＮＰｓは、アジア人集団における肥満の検査に好適に用いることができる。
【００６７】
次に、主にヨーロッパ人集団においてＢＭＩとの関連が報告されている既知のＳＮＰｓ（非特許文献１３〜１５、Zobel DP et al. Eur J Endocrinol 160, 603-609 (2009)）について、本実施例のＧＷＡＳで得られたデータを用いて日本人集団におけるＢＭＩとの関連を評価した（表６）。
【００６８】
【表６】
ａ：ＢＭＩとの関連が報告されている既知のＳＮＰｓ。
ｂ：ＢＭＩを増大させるアレルをＡ１（アレル１）として、NCBI Build 36のforward strandに基づいて示した。
ｃ：ＧＷＡＳ被検者におけるアレル１の頻度。
ｄ：標準化したＢＭＩ（平均値＝０、標準偏差＝１）におけるアレル１の効果量。
ｅ：Ｐ＜０．０２（多型遺伝子座の数に基づくfalse discovery rate＜０．０５）を有意とした。
ｆ：統計的検出力（statistical power）は、アレル頻度とＧＷＡＳのサンプルサイズに基づいて算出し、効果量を０．０３５と仮定した条件での有意性の閾値を０．０２とした。
【００６９】
ＢＭＩとの関連が報告されている既知のＳＮＰｓの内、本実施例で既にＢＭＩとの関連が再確認された５つの遺伝子座に加え、さらに１０ヶ所の遺伝子座が日本人被検者においても同様にＢＭＩに影響することが明らかとなったＰ＜０．０２（false discovery rate＜０．０５）。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
以上の通り、ＢＭＩと関連する２個のＳＮＰｓが新規に見出された。これらのＳＮＰｓは肥満の検査に有用であり、肥満の予防および／または治療に貢献するものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は肥満の発症リスクや発症の有無を判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肥満は世界的に流行し、医療上および経済上の深刻な問題となっている（非特許文献１）。肥満は糖尿病等、多くの生活習慣病の主要なリスク因子であり、肥満の発症を予測し予防することは重要な課題である。肥満は遺伝的素因に強く影響を受ける疾患であり、その症状の個人差の約４０〜７０％は遺伝的素因に起因することが知られている（非特許文献２）。
【０００３】
近年、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、肥満の尺度として最も一般的に用いられるボディマス指数（Body Mass Index；ＢＭＩ）と関連する多くの遺伝子座が見出された（非特許文献３〜１２）。しかしながら、それらの研究のほとんどはヨーロッパ人を被検者として行われており、世界人口の２／３を占めるアジア人についてはほとんど解析されていない。ここで、アジア人では、ヨーロッパ人と比較して、同じＢＭＩでも肥満の程度や、肥満により悪化する疾病リスクが高いことが知られている。よって、アジア人を被検者とする研究により、肥満に関連する新規な遺伝子座を同定し、肥満の遺伝的バックグラウンドに関するさらなる知見が得られるものと期待される。
【０００４】
ＣＤＫＡＬ１遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ５制御サブユニット関連タンパク質１ライク１（cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) regulatory subunit-associated protein 1-like 1）をコードする遺伝子である。ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は２型糖尿病のリスク遺伝子座であることが知られている（非特許文献１３〜１５）。
【０００５】
ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は、ドイツ人集団を用いた研究で８歳児のＢＭＩと関連することが報告されている（非特許文献１３）。また、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は、デンマーク人集団を用いた研究で出生時体重と関連することが報告されている（非特許文献１４）。しかしながら、アジア人集団におけるＣＤＫＡＬ１遺伝子座とＢＭＩとの関連は報告されておらず、また、成人におけるＣＤＫＡＬ１遺伝子座とＢＭＩとの関連も報告されていない。
【０００６】
ＫＬＦ９遺伝子は、ジンクフィンガー転写因子の１つをコードする遺伝子であり、種々の生理反応に関与する。Ｋｌｆ９タンパク質は、peroxisome proliferator-activated receptor（ＰＰＡＲ）γのトランス活性化を介した脂肪生成促進性（pro-adipogenic）の転写因子であることが示唆されている（非特許文献１６）。しかしながら、ＫＬＦ９遺伝子座とＢＭＩとの関連は報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kopelman PG. Nature 404, 635-643 (2000).
【非特許文献２】Maes HH et al. Behav Genet 27, 325-351 (1997).
【非特許文献３】Frayling TM et al. Science 316, 889-894 (2007).
【非特許文献４】Liu YJ et al. Hum Mol Genet 17, 1803-1813 (2008).
【非特許文献５】Chambers JC et al. Nat Genet 40, 716-718 (2008).
【非特許文献６】Loos RJ et al. Nat Genet 40, 768-775 (2008).
【非特許文献７】Thorleifsson G et al. Nat Genet 41, 18-24 (2009).
【非特許文献８】Willer CJ et al. Nat Genet 41, 25-34 (2009).
【非特許文献９】Meyre D et al. Nat Genet 41, 157-159 (2009).
【非特許文献１０】Liu XG et al. Am J Hum Genet 84, 418-423 (2009).
【非特許文献１１】Cho YS et al. Nat Genet 41, 527-534 (2009).
【非特許文献１２】Speliotes EK et al. Nat Genet 42, 937-948 (2010).
【非特許文献１３】Winkler C et al. Diabetes 59, 2063-2067 (2010).
【非特許文献１４】Andersson EA et al. Diabetologia 53, 1908-1916 (2010).
【非特許文献１５】Yamauchi T et al. Nat Genet 42, 864-868 (2010).
【非特許文献１６】Pei H et al. Cell Death Differ. 18, 315-327 (2010).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、肥満の発症リスクや発症の有無を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第６染色体短腕２２領域または第９染色体長腕２１領域に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）が肥満の指標であるＢＭＩと関連することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより肥満の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１]
第６染色体短腕２２領域または第９染色体長腕２１領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査することを特徴とする、肥満の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法。
[２]
前記一塩基多型が、配列番号１または２の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、[１]に記載の方法。
[３]
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号３〜７２から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基である、[２]に記載の方法。
[４]
配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する肥満検査用プローブ。
[５]
配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる肥満検査用プライマー。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、これまで予測が困難であった肥満の発症リスク（罹患リスク）を正確かつ簡便に予測することができる。また、肥満の発症を正確かつ簡便に判定することができる。したがって、本発明は肥満の予防や早期治療に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（ａ）ＧＷＡＳの結果のマンハッタンプロットを示す図。（ｂ）ヒト第６染色体短腕２２領域におけるＳＮＰｓのプロットおよび遺伝子構造を示す図。（ｃ）ヒト第９染色体長腕２１領域におけるＳＮＰｓのプロットおよび遺伝子構造を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第６染色体短腕２２領域または第９染色体長腕２１領域に存在するＳＮＰを分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査することを特徴とする、肥満の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法である。すなわち、本発明において、「検査」とは肥満の発症リスクの検査及び肥満の発症の有無の検査を含む。本発明の方法においては、ＳＮＰの分析結果を、肥満の発症リスクおよび／または発症の有無と関連付ける。
【００１４】
ヒト第６染色体短腕２２領域（６ｐ２２領域）に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs2206734を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。rs2206734はGenBank Accession No. NT_007592.14の11553135番目の塩基におけるシトシン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基がＣである場合は肥満の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【００１５】
rs2206734は、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座に存在し、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は肥満のリスク遺伝子座であると考えられる。よって、特に、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座に存在するＳＮＰを解析することによって肥満を検査することができる。ＣＤＫＡＬ１遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000006.11の20534688〜21232635の領域が挙げられる。
【００１６】
ヒト第９染色体長腕２１領域（９ｑ２１領域）に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs11142387を挙げることができる。rs11142387はGenBank Accession No. NT_023935.17の2162864番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基がＣである場合は肥満の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＡ＞ＡＡの順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【００１７】
rs11142387は、ＫＬＦ９遺伝子のプロモーター領域に存在し、ＫＬＦ９遺伝子座は肥満のリスク遺伝子座であると考えられる。よって、特に、ＫＬＦ９遺伝子座に存在するＳＮＰを解析することによって肥満を検査することができる。ＫＬＦ９遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000009.11の72999513〜73029573の領域の相補配列が挙げられる。
【００１８】
なお、rs2206734およびrs11142387について、ＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号１および２に示した。６１番目の塩基が多型を有する。
【００１９】
本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。
【００２０】
また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ2＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たす塩基をいう。ｒ2は連鎖不平衡係数である。また上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。もしくは、複数人（通常は２０−４０人程度）から採取
したＤＮＡをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にあるＳＮＰを探索することにより同定することもできる。
【００２１】
rs2206734とｒ2＞０．５で連鎖不平衡にある塩基としては、rs9368219、rs7766070、rs9356744、rs9368222、rs9350271、rs10440833、rs6456364、rs2328545、rs742642、rs9295475、rs9348440、rs9358355、rs9368216、rs7752906、rs10946398、rs4710940、rs4712522、rs4712525、rs4712526、rs6456368、rs6456369、rs6906327、rs7748382、rs7752780、rs7754840、rs7774594、rs9460544、rs9460545、rs9460546、rs6456367、rs7772603、rs9358356、rs4712523、rs9295474、rs9465850、rs2328528、rs6940200、rs7751957、rs7768642、rs9465846、rs9465847、rs9356747、rs9356746、rs4515379、rs9465837、rs9465841、rs2328548、rs1040558、rs10946403、rs11753081、rs6935599、rs7747752、rs7767391、rs9295478、rs9356748、rs9358357、rs9358358、rs9368224、rs12111351、rs9460550、rs9368226、rs9465871、rs2328529、rs7756992、rs1569699、rs2328549、rs9350270、およびrs9356743が挙げられる。これらＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号３〜７０に示した。６１番目の塩基が多型を有する。これらＳＮＰは、リスクアレルのホモ接合体 ＞ リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体 ＞ 非リスクアレルのホモ接合体の順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【００２２】
rs11142387とｒ2＞０．５で連鎖不平衡にある塩基としては、rs10780928およびrs4745008が挙げられる。これらＳＮＰ塩基及びその前後６０ｂｐの領域を含む合計１２１ｂｐの長さの配列を、それぞれ配列番号７１および７２に示した。６１番目の塩基が多型を有する。これらＳＮＰは、リスクアレルのホモ接合体 ＞ リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体 ＞ 非リスクアレルのホモ接合体の順で肥満の可能性または発症リスクが高い。
【００２３】
rs2206734またはrs11142387とｒ2＞０．５で連鎖不平衡にあるこれら各塩基について、rs2206734またはrs11142387に対する連鎖不平衡係数（ｒ2）、アレルの組み合わせ、およびリスクアレルを表１、２に示す。表１、２に示した連鎖不平衡係数（ｒ2）は、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)上で公開されている、日本人および中国人90人のジェノタイプデータ（Phase II、release ２４）に基づき推定されたものである。リスクアレルの表記はＮＣＢＩが公開している参照配列（Build 36）におけるforward strandに対応している。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
上記ＳＮＰの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて肥満と関
連付けることにより、肥満を検査することができる。上記ＳＮＰは単独で解析されてもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つを含む複数のＳＮＰｓをまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。例えば、上記ＳＮＰの複数をまとめて解析してもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つと、肥満と関連する既知のＳＮＰｓ（非特許文献３〜１２）や当該既知のＳＮＰｓと連鎖不平衡にあるＳＮＰｓとを組み合わせて解析してもよい。肥満と関連する複数のＳＮＰｓをまとめて解析すれば、肥満の検査の精度が向上する。なお、いずれのＳＮＰも、二本鎖ＤＮＡのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、ＣＤＫＡＬ１遺伝子またはＫＬＦ９遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。
【００２７】
ＳＮＰの解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。ＳＮＰの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００２８】
ＳＮＰの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめＳＮＰ部位を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。
【００３０】
また、ＳＮＰの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。
【００３１】
また、ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３２】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
【００３３】
また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰがいずれの塩基であるかを調べることもで
きる。
【００３４】
このようにしてＳＮＰがいずれの塩基であるかを決定することで、肥満を検査するためのデータを得ることができる。
【００３５】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、肥満を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記ＳＮＰ部位を含み、ハイブリダイズの有無によってＳＮＰ部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列の６１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは、１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。
【００３６】
また、プライマーとしては、上記ＳＮＰ部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記ＳＮＰ部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列の６１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。
【００３７】
上記ＳＮＰ部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
【００３８】
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００４０】
（１）肥満と関連するＳＮＰｓの同定
肥満感受性を決定する遺伝的変異を同定するために、日本人被検者を用いてゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）を行った。ＧＷＡＳとは、疾患等の表現型に関わる遺伝的変異を探索する遺伝統計学的手法である。例えば、ヒトゲノム全体を網羅するような数十万〜１００万ヶ所のＳＮＰｓを用いて、ある形質の平均値の分布において、多型の組み合わせ（ジェノタイプ）による差があるかどうかを統計的に検定することで、疾患と関連する遺伝的変異を見出すことができる。本実施例において、肥満の指標としては、ボディマス指数（Body Mass Index；ＢＭＩ）を用いた。
【００４１】
＜被検者＞
ＧＷＡＳに用いた２６６２０名の被検者、再現試験（replication study）１に用いた３７６３名の被検者、および再現試験２に用いた４１４７名の被検者は、東京大学医科学研究所のBioBank Japan (BBJ) (Nakamura, Y. The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol 5, 696-7 (2007))に登録された種々の疾患の日本人患者から採用した。これら被検者のうち、ＢＭＩ≧２７．５の被検者を、肥満の被検者（ケース（case））として用いた。それ以外の被検者を、対照被検者（コントロール（control））として用いた。
ＧＷＡＳ、再現試験１、および再現試験２に用いた被検者における肥満の被検者の比率は、それぞれ９．３％、７．２％、７．３％であった。
【００４２】
再現試験３には、２７７１５名の東アジア人種の８集団からなる被検者を用いた。
【００４３】
ＧＷＡＳ、および再現試験１〜３に用いた被検者集団は、互いに独立である。
【００４４】
本実施例に用いた被検者の特徴を表３に示す。
【００４５】
【表３】
ａ：ＢＭＩ≧２７．５の被検者を、肥満（obesity）とした。
ｂ：BioBank Japan (BBJ) に登録された種々の疾患の患者からなる被検者。
ｃ：東アジア人種の８集団（KARE, Shanghai, SiMES, SDCS, SP2, IMCJ, Taiwan, CRC）からなる被検者。
【００４６】
本研究は東京大学医科学研究所および理化学研究所横浜研究所の倫理委員会によって承認され、全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。
【００４７】
＜ＧＷＡＳ＞
被検者２６６２０名の遺伝子型を、Illumina Human610-Quad Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））を用いて解析した。なお、クオリティコントロールとして、コール率（call rate）が０．９８未満の被検者、コール率（call rate）が０．９９未満のＳＮＰｓ、あいまいなコール（ambiguous call）のＳＮＰｓ、identify-by-state（ＩＢＳ）＞１．７の近縁ペアの内の低コール率の被検者、および主成分分析（ＰＣＡ）により外れ値（outlier）であると判定された被検者を除外した。クオリティコントロールを通過したマイナーアレル頻度（ＭＡＦｓ）≧０．０１を満たす常染色体上の４８０，１０３個のＳＮＰｓについて、遺伝子型のデータを取得した。各ＳＮＰｓについて、線形回帰モデル（linear regression model）を用いてＢＭＩとの関連を評価した。
【００４８】
ＧＷＡＳの結果、ゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値として設定されたＰ＜５．０×１０-8を満たしてＢＭＩと有意に関連する３ヶ所のＳＮＰｓ（9q21領域のrs11142387、11p14領域のrs2030323、および19q13領域のrs11671664）が見出された（図１（ａ）、表４）。
【００４９】
【表４】
ａ：ＧＷＡＳおよび全３回の再現試験の複合解析でＰ＜５．０×１０-5を満たしたＳＮＰｓを示す。
ｂ：ＢＭＩを増大させるアレルをＡ１（アレル１）として、NCBI Build 36のforward strandに基づいて示した。
ｃ：アレル１の頻度。
ｄ：標準化したＢＭＩ（平均値＝０、標準偏差＝１）におけるアレル１の効果量。
ｅ：独立した３度の再現試験の総合結果。
ｆ：非特許文献１２の結果に基づく。
【００５０】
＜再現試験＞
ＧＷＡＳで見出された関連性を検証するため、独立した３度の再現試験（replication study）を行った。
【００５１】
再現試験１では、ＧＷＡＳにおいてＰ＜５．０×１０-5を満たした３６個のＳＮＰｓについて、ＢＭＩとの関連を検証した。被検者３７６３名の遺伝子型をIllumina HumanHap550v3 Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））を用いて解析し、ＧＷＡＳと同様のクオリティコントロールの下でＢＭＩとの関連を検証した。
【００５２】
ＧＷＡＳと再現試験１の複合解析（combined analysis）の結果、Ｐ＜５．０×１０-5を満たした１１個のＳＮＰｓを再現試験２および３に供した。
【００５３】
再現試験２では、被検者４１４７名の遺伝子型を、Illumina HumanOmniExpress Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））を用いて解析し、ＧＷＡＳと同様のクオリティコントロールの下でＢＭＩとの関連を検証した。再現試験３では、被検者２７７１５名の遺伝子型をAffymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0（Affymetrix社（USA））、Affymetrix Genome-Wide Human SNP array 5.0（Affymetrix社（USA））、Illumina 1Mduo Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））、Illumina HumanHap610Quad Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））、およびIllumina HumanHap550 Genotyping BeadChip（Illumina社（USA））を用いて解析した。
【００５４】
ＧＷＡＳと全３回の再現試験の複合解析（combined analysis）の結果、Ｐ＜５．０×１０-5を満たした９個のＳＮＰｓを表４に示す。これらの内、７か所のＳＮＰｓが、ゲノムワイドな有意性（genome-wide significance）の閾値として設定されたＰ＜５．０×１０-8を満たし、ＢＭＩと有意に関連することが確認された。なお、これら７個のＳＮＰｓには、ＧＷＡＳにおいて有意性を満たした３個のＳＮＰｓも含まれている。
【００５５】
これら７個のＳＮＰｓが位置する遺伝子座の内、1q25領域のSEC16B遺伝子座、11p14領域のBDNF遺伝子座、16q12領域のFTO遺伝子座、18p21領域のMC4R遺伝子座、および19q13領域のGIPR遺伝子座の５つについては、すでにヨーロッパ人においてＢＭＩとの関連が見出されている。
【００５６】
一方、残りのrs2206734およびrs11142387が位置する領域（6p22および9q21）については、主にヨーロッパ人被検者（特に成人被検者）を用いたこれまでの研究ではＢＭＩとの関連が報告されていなかった。
【００５７】
rs2206734の位置する領域におけるＳＮＰｓのプロットおよび遺伝子構造を図１（ｂ）に示す。また、rs11142387の位置する領域におけるＳＮＰｓのプロットおよび遺伝子構造を図１（ｃ）に示す。
【００５８】
rs2206734は、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座のコード領域に位置している。ＣＤＫＡＬ１遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ５制御サブユニット関連タンパク質１ライク１（cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) regulatory subunit-associated protein 1-like 1）をコードする遺伝子である。
【００５９】
ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は、ドイツ人集団を用いた研究で８歳児のＢＭＩと関連することが報告されている（非特許文献１３）。また、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は、デンマーク人集団を用いた研究で出生時体重と関連することが報告されている（非特許文献１４）。しかしながら、アジア人集団におけるＣＤＫＡＬ１遺伝子座とＢＭＩとの関連は報告されておらず、また、成人におけるＣＤＫＡＬ１遺伝子座とＢＭＩとの関連も報告されていなかった。よって、特に、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座のＳＮＰｓを解析することでアジア人種の肥満や成人の肥満を検査できることは、本発明者により初めて見出された知見である。
【００６０】
また、ＣＤＫＡＬ１遺伝子座は２型糖尿病のリスク遺伝子座であることが知られている（非特許文献１３〜１５）。そこで、rs2206734およびrs11142387について、共変数を含むロジスティック回帰モデル（logistic regression model）を用いて肥満および２型糖尿病との関連を評価した。結果、rs2206734（ＣＤＫＡＬ１遺伝子座）のＴアレルは、ＢＭＩを低下させるのに対し、２型糖尿病のリスクを増大させることが明らかとなった（表５）。通常、ＢＭＩが増大すれば２型糖尿病のリスクも増大すると考えられる。よって、rs2206734のＢＭＩに対する効果は２型糖尿病に対する効果から想定されるものと反対であり、rs2206734のＣアレルがＢＭＩのリスクアレルとして見出されたのは驚くべき結果であった。
【００６１】
【表５】
ａ：ＢＭＩを増大させるアレルをＡ１（アレル１）として、NCBI Build 36のforward strandに基づいて示した。
ｂ：ＧＷＡＳと全３回の再現試験の被検者が含まれる。
ｃ：肥満および２型糖尿病におけるアレル１の効果量。
【００６２】
rs11142387は、ＫＬＦ９遺伝子のプロモーター領域に位置している。rs11142387を含む連鎖不平衡（ＬＤ）ブロックは複数の遺伝子を含むが、タグＳＮＰであるrs11142387がＫＬＦ９遺伝子座に位置していることから、ＫＬＦ９遺伝子が原因遺伝子の候補である。
【００６３】
ＫＬＦ９遺伝子は、ジンクフィンガー転写因子の１つをコードする遺伝子であり、種々の生理反応に関与する。ここで、脂肪細胞分化の重要な要素としてperoxisome proliferator-activated receptor（ＰＰＡＲ）γが知られており、ＰＰＡＲγは肥満を含む多くの代謝特性の病態と関連している（Pei H et al. Cell Death Differ. 18, 315-327 (2010)）。最近の研究では、ＫＬＦ９遺伝子がコードするタンパク質は、ＰＰＡＲγのトランス活性化を介した脂肪生成促進性（pro-adipogenic）の転写因子であることが示唆されている（非特許文献１６）。また、ＫＬＦとしては、ＫＬＦ７遺伝子座が肥満と関連すること、およびＫＬＦ５遺伝子がコードするタンパク質が脂肪細胞分化を制御していることが知られている。しかしながら、ＫＬＦ９遺伝子座とＢＭＩとの関連は報告されていなかった。
【００６４】
なお、rs2206734（ＣＤＫＡＬ１遺伝子座）と異なり、rs11142387（ＫＬＦ９遺伝子座）は２型糖尿病との関連は認められなかった（表５）。
【００６５】
＜民族間での比較＞
さらに、民族間での肥満の遺伝学的差異を評価するため、ＧＷＡＳと全３回の再現試験の複合解析（combined analysis）でＰ＜５．０×１０-5を満たした９個のＳＮＰｓについて、ＧＩＡＮＴコンソーシアムの１２３，８６５名のヨーロッパ人被検者のメタ解析の結果（非特許文献１２）を利用してＢＭＩとの関連を評価した（表４）。
【００６６】
９個のＳＮＰｓの内、rs2206734（ＣＤＫＡＬ１遺伝子座）を含む５つが、ヨーロッパ人集団においてもＢＭＩと有意（Ｐ＜０．０２８、false discovery rate＜０．０５）に関連した。一方、rs11142387（ＫＬＦ９遺伝子座）については、ヨーロッパ人集団においてはＢＭＩとの関連が認められなかった。よって、特にrs11142387（ＫＬＦ９遺伝子座）および当該塩基と連鎖不平衡の関係にあるＳＮＰｓは、アジア人集団における肥満の検査に好適に用いることができる。
【００６７】
次に、主にヨーロッパ人集団においてＢＭＩとの関連が報告されている既知のＳＮＰｓ（非特許文献１３〜１５、Zobel DP et al. Eur J Endocrinol 160, 603-609 (2009)）について、本実施例のＧＷＡＳで得られたデータを用いて日本人集団におけるＢＭＩとの関連を評価した（表６）。
【００６８】
【表６】
ａ：ＢＭＩとの関連が報告されている既知のＳＮＰｓ。
ｂ：ＢＭＩを増大させるアレルをＡ１（アレル１）として、NCBI Build 36のforward strandに基づいて示した。
ｃ：ＧＷＡＳ被検者におけるアレル１の頻度。
ｄ：標準化したＢＭＩ（平均値＝０、標準偏差＝１）におけるアレル１の効果量。
ｅ：Ｐ＜０．０２（多型遺伝子座の数に基づくfalse discovery rate＜０．０５）を有意とした。
ｆ：統計的検出力（statistical power）は、アレル頻度とＧＷＡＳのサンプルサイズに基づいて算出し、効果量を０．０３５と仮定した条件での有意性の閾値を０．０２とした。
【００６９】
ＢＭＩとの関連が報告されている既知のＳＮＰｓの内、本実施例で既にＢＭＩとの関連が再確認された５つの遺伝子座に加え、さらに１０ヶ所の遺伝子座が日本人被検者においても同様にＢＭＩに影響することが明らかとなったＰ＜０．０２（false discovery rate＜０．０５）。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
以上の通り、ＢＭＩと関連する２個のＳＮＰｓが新規に見出された。これらのＳＮＰｓは肥満の検査に有用であり、肥満の予防および／または治療に貢献するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第６染色体短腕２２領域または第９染色体長腕２１領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査することを特徴とする、肥満の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法。
【請求項２】
前記一塩基多型が、配列番号１または２の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号３〜７２から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する肥満検査用プローブ。
【請求項５】
配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる肥満検査用プライマー。
【請求項１】
第６染色体短腕２２領域または第９染色体長腕２１領域に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて肥満を検査することを特徴とする、肥満の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法。
【請求項２】
前記一塩基多型が、配列番号１または２の塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記連鎖不平衡の関係にある塩基が、配列番号３〜７２から選ばれる塩基配列の塩基番号６１番目の塩基に相当する塩基である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する肥満検査用プローブ。
【請求項５】
配列番号１〜７２から選ばれる塩基配列において、塩基番号６１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる肥満検査用プライマー。
【図１】
【公開番号】特開２０１３−２１９９４（Ｐ２０１３−２１９９４Ａ）
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６２１７７（Ｐ２０１１−１６２１７７）
【出願日】平成２３年７月２５日（２０１１．７．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度 文部科学省、科学技術試験研究委託事業「疾患関連遺伝子等の探索を効率化するための遺伝子多型情報の高度化」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０８０６７８５１）一般社団法人徳洲会 (12)
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【出願人】（５０７１４８４５６）学校法人 岩手医科大学 (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２５日（２０１１．７．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度 文部科学省、科学技術試験研究委託事業「疾患関連遺伝子等の探索を効率化するための遺伝子多型情報の高度化」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０８０６７８５１）一般社団法人徳洲会 (12)
【出願人】（８９９００００５７）学校法人日本大学 (650)
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【出願人】（５０７１４８４５６）学校法人 岩手医科大学 (19)
【Ｆターム（参考）】
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