第ＶＩＩ因子遺伝子発現阻害のための組成物及び方法
本発明は二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、またそのようなｄｓＲＮＡを使用して細胞又は哺乳類内第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害するための組成物及び方法を提供する。本発明はウイルス性出血性発熱を含む凝固障害など第ＶＩＩ因子遺伝子発現に惹起される病状及び疾患を治療する組成物及び方法も提供する。本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは長さ３０ヌクレオチド未満、通常、長さ１９〜２４ヌクレオチドの領域を有するＲＮＡ（アンチセンス鎖）を含み、第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡ転写の対応領域に実質的に相補的又は完全に相補的である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１２月１０日に出願された米国仮出願第６１／０１２，６７０号、及び２００７年１２月１９日に出願された米国仮出願第６１／０１４，８７９号の利益を主張する。これら両方の先行出願がその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、及び第ＶＩＩ因子発現を阻害するためのＲＮＡ干渉媒介におけるその使用、及び第ＶＩＩ因子介在性障害、例えば、ウイルス性出血性発熱の治療又は予防のためのｄｓＲＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は凝固に関与する。血管損傷時、血管外に位置する組織因子（ＴＦ）は血液及び循環第ＶＩＩ因子に曝露される。ＦＶＩＩはいったんＴＦと結合すると、トロンビン（第ＩＩａ因子）、活性化Ｘ因子及びＦＶＩＩａ‐ＴＦ複合体自体が含まれる様々なプロテアーゼによってＦＶＩＩａに活性化される。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は凝固開始の役割に加えて、凝固活性化とは独立した直接的な炎症促進効果を有することが報告されている。
【０００４】
多くのウイルスがヒト及び他のいくつかの霊長類において致死的出血性疾患を惹起することが報告されている。これらのウイルスはフィロウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、及びフラビリダが含まれる多くのウイルスファミリー由来である。出血性発熱患者は典型的には重度の消費性の播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を発現する。ＤＩＣは、過剰なトロンビン生成をもたらす広範囲の凝固カスケードの系統的活性化を特徴とする。加えて、凝固因子の消費を伴う線溶系活性化は凝固因子減少及び血小板膜糖蛋白質分解をもたらす。
【０００５】
ある感染体は感染後に凝固系を活性化することも知られている。細菌性細胞生成物、ウイルス感染及びサイトカインを含む様々な炎症刺激が内皮細胞及び単球表面上のＴＦ発現を誘発し、それによって凝固経路を活性化することが報告されている。
【０００６】
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている高度に保存された調節機構において遺伝子発現をブロックすることが示されている。特許文献１（Ｆｉｒｅら）では、シー・エレガンスのｕｎｃ‐２２遺伝子発現を阻害するための、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのｄｓＲＮＡの使用が開示されている。ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、特許文献２、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．；及び特許文献３、Ｈｅｉｆｅｔｚ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）、ショウジョウバエ（例えば、非特許文献１を参照のこと）、及び哺乳類（特許文献４、Ｌｉｍｍｅｒ；及びＤＥ １０１ ００ ５８６．５， Ｋｒｅｕｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）を含む他の生物内で標的ＲＮＡを分解することも示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９９／３２６１９号
【特許文献２】国際公開第９９／５３０５０号
【特許文献３】国際公開第９９／６１６３１号
【特許文献４】国際公開第００／４４８９５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｙａｎｇ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． （２０００）１０：１１９１−１２００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、またそのようなｄｓＲＮＡを使用して細胞又は哺乳類内第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害するための組成物及び方法を提供する。本発明はウイルス性出血性発熱を含む凝固障害など第ＶＩＩ因子遺伝子発現に惹起される病状及び疾患を治療する組成物及び方法も提供する。本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは長さ３０ヌクレオチド未満、通常、長さ１９〜２４ヌクレオチドの領域を有するＲＮＡ（アンチセンス鎖）を含み、第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡ転写の対応領域に実質的に相補的又は完全に相補的である。
【００１０】
一実施形態では、本発明は第ＶＩＩ因子遺伝子発現阻害のための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。ｄｓＲＮＡには、互いに相補的な、例えば、実質的に相補的な、完全に相補的な、又は生理的条件下でハイブリダイズするために十分に相補的な少なくとも２つの配列が含まれる。ｄｓＲＮＡには第一配列を含むセンス鎖及び第二配列を含むアンチセンス鎖が含まれる。アンチセンス鎖は第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの対応領域に実質的又は完全に相補的なヌクレオチド配列を含み、該相補性領域は長さ３０ヌクレオチド未満、通常１９〜２４ヌクレオチド、例えば、１９〜２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡの長さは約１０〜約１５ヌクレオチドであり、他の実施形態ではｄｓＲＮＡの長さは約２５〜約３０ヌクレオチドである。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子発現細胞と接触すると、第ＶＩＩ因子遺伝子発現を少なくとも２５％、例えば、少なくとも３５％、又は少なくとも４０％阻害する。一実施形態では、第ＶＩＩ因子ｄｓＲＮＡは安定した核酸粒子（ＳＮＡＬＰ）内で形成される。
【００１１】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは例えば、本明細書に記載される検定による測定においてｍＲＮＡレベルを少なくとも４０％、６０％、８０％、又は９０％低減し得る。例えば、ｄｓＲＮＡはラットの肝第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベルを、第ＶＩＩ因子標的ｓｉＲＮＡを製剤化した９８Ｎ１２‐５の単回投与などによって少なくとも４０％、６０％、８０％、又は９０％低減し得る。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えば、本明細書に記載された検定による測定において蛋白質レベルの類似した減少を引き起こす。さらに別の実施形態では、第ＶＩＩ因子標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）を製剤化した９８Ｎ１２‐５の単回注入は、例えば、本明細書に記載される検定による測定において１、２、３又は４週間以上サイレンシングを媒介し得る。ＦＶＩＩｍＲＮＡ及び蛋白質レベルを測定する検定は当分野で知られている標準方法によっても実施し得る。例えば、ＦＶＩＩｍＲＮＡはＲＴ‐ＰＣＲ又はノーザンブロット解析によって測定し得る。ＦＶＩＩ蛋白質レベルは酵素検定によって、又は抗体に基づく方法、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、若しくは免疫組織化学によって測定し得る。
【００１２】
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡ分子は、表１、２、及び３のセンス配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第一配列、並びに表１、２、及び３のアンチセンス配列からなる群から選択される第二配列を含み得る。本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡ分子は天然で存在するヌクレオチドを含み得、又は２’‐Ｏ‐メチル修飾ヌクレオチド、５’‐ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合する末端ヌクレオチドなど少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み得る。あるいは、修飾ヌクレオチドは、２’‐デオキシ‐２’‐フルオロ修飾ヌクレオチド、２’‐デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド、脱塩基性ヌクレオチド、２’‐アミノ修飾ヌクレオチド、２’‐アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、及びヌクレオチド含有非天然塩基の群から選択してもよい。一般的に、前記ｄｓＲＮＡの第一配列は表１、２、及び３のセンス配列からなる群から選択され、第二配列は表１、２、及び３のアンチセンス配列からなる群から選択される。
【００１３】
別の実施形態では、本発明はＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡが含まれる細胞を提供する。該細胞は通常、ヒト細胞などの哺乳類細胞である。
【００１４】
別の実施形態では、本発明はＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡの１つ以上、及び製薬上許容可能な担体が含まれる生物における第ＶＩＩ因子遺伝子発現阻害のための医薬組成物を提供する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、細胞内第ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害方法を提供し、該方法には下記の工程が含まれる。
（ａ）二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、互いに相補的、例えば、実質的に又は完全に、互いに相補的な少なくとも２つの配列が含まれるｄｓＲＮＡの細胞内導入工程、及び
（ｂ）工程（ａ）において産生した細胞を第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡ転写物を分解させるのに十分な時間維持し、それによって細胞内第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害する工程。
【００１６】
ｄｓＲＮＡには第一配列を含むセンス鎖及び第二配列を含むアンチセンス鎖が含まれる。該アンチセンス鎖は第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの対応領域に実質的に又は完全に相補的な相補性領域を含み、該相補性領域は長さ３０ヌクレオチド未満、通常、長さ１９〜２４ヌクレオチドであり、該ｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子発現細胞と接触すると、第ＶＩＩ因子遺伝子発現を少なくとも４０％阻害する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは例えば、本明細書に記載される検定による測定においてｍＲＮＡを少なくとも４０％、６０％、８０％、又は９０％低減し得る。例えば、第ＶＩＩ因子標的ｓｉＲＮＡ製剤９８Ｎ１２‐５の単回投与後に、ｄｓＲＮＡはラット肝第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベルを少なくとも４０％、６０％、８０％、又は９０％低減し得る。一実施形態ではｄｓＲＮＡは、例えば、本明細書に記載される検定による測定において蛋白質レベルの類似した減少をもたらす。別の実施形態では、第ＶＩＩ因子標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）を製剤化した９８Ｎｌ２‐５の単回注入は、例えば、本明細書に記載される検定による測定において１、２、３又は４週間以上サイレンシングを媒介し得る。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子介在性障害の治療、予防又は管理方法を、そのような治療、予防又は管理を必要とする患者への本発明で特徴とされる１つ又は複数のｄｓＲＮＡの治療的又は予防的有効量の投与によって提供する。
【００１８】
一実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡはウイルス性出血性発熱などの出血性発熱の治療に使用し得る。そのような発熱はフィロウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、又はフラビリダ科のウイルスなどのウイルスによって惹起され得る。例えば、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡはフィロウイルス科のウイルス、例えば、エボラ又はマールブルグウイルス、又はアレナウイルス科のウイルス、例えば、ラッサウイルスによって惹起される出血性発熱の治療に使用し得る。
【００１９】
別の実施形態では、本明細書で特徴とされるＦＶＩＩｄｓＲＮＡは出血性発熱に惹起される可能性のあるもののような、凝固因子異常又は炎症反応の治療に使用される。
【００２０】
別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡは血栓性障害、例えば、動脈硬化性プラークの破裂によって生じる可能性のある局所血栓などの治療に使用し得る。別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡ投与は急性心筋梗塞又は不安定狭心症の治療又は予防に使用される。ＦＶＩＩｄｓＲＮＡは閉塞性冠動脈内血栓治療にも使用し得る。別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡは深部静脈血栓症の治療又は予防のために投与される。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡは、例えば、癌患者における静脈血栓塞栓症の治療又は予防のために投与される。
【００２１】
別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡを患者に投与し、１、２、３、又は４週間後、患者は、例えば、血液中若しくは尿中、又は肝臓など特定組織内のＦＶＩＩｍＲＮＡレベルを測定するために試験される。ＦＶＩＩｍＲＮＡレベルが予め設定したレベルを超えると測定された場合、患者にＦＶＩＩｄｓＲＮＡをもう一度投与する。ＦＶＩＩｍＲＮＡレベルが予め設定したレベル未満と測定された場合は、患者にＦＶＩＩｄｓＲＮＡをもう一度投与することはない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡは増殖性障害、例えば、卵巣癌、乳癌、頭頚部癌、前立腺癌、結腸直腸癌又は肺癌などの癌の治療のために投与される。
【００２２】
単回投与が長期間のサイレンシングを提供し得ることが発見されている。したがって、別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡの１回用量が患者に投与され、該用量は第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ又は蛋白質が、少なくとも治療後５、１０、又は１５日間、治療前レベル（又は未治療時に見られるであろうレベル）の２０％以下、少なくとも治療後５、１０、又は１５日間、治療前レベル（又は未治療時に見られるであろうレベル）の４０％以下、少なくとも治療後５、１０、１５、又は２０日間、治療前レベル（又は未治療時に見られるレベル）の６０％以下、少なくとも治療後５、１０、１５、２０、又は２５日間、治療前レベル（又は未治療時に見られるであろうレベル）の８０％以下となるのに十分な用量である。
【００２３】
一実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡを１回用量投与し、初回投与又はコース投与終了後少なくとも５、１０、１５、２０、又は２５日間はＦＶＩＩｄｓＲＮＡの追加用量を投与しない。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡの１つの少なくとも一本鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される調節配列を含む、細胞内第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害するベクターを提供する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は細胞内第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害するベクターを含む細胞を提供する。該ベクターとしては本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡの１つの少なくとも一本鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される調節配列が挙げられる。
【００２６】
【表１】
【００２７】
「ｓ」はホスホロチオエート連結を示す。２’‐Ｏ‐Ｍｅ修飾ヌクレオチドは小文字で示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
Ｎは任意のヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｔ）を指す。
【００３１】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を本明細書で下に説明する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は本明細書及び図面から、並びに請求項から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＦＶＩＩｓｉＲＮＡ投与後の肝ＦＶＩＩｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。
【図２】ＦＶＩＩｓｉＲＮＡ投与後の血清ＦＶＩＩ蛋白質レベルを示す棒グラフである。
【図３】ＦＶＩＩｓｉＲＮＡ投与後のプロトロンビン時間を示す棒グラフである。
【図４】リポソーム的に製剤化したＦＶＩＩｄｓＲＮＡによる処理後のマウス肝細胞内ＦＶＩＩ蛋白質レベルを示す棒グラフである。リポソーム的に製剤化したルシフェラーゼｄｓＲＮＡを陰性対照として使用した。
【図５】エボラに感染し、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡで処理したマウスの生存レベルを示すグラフである。陰性対照は未処理マウス及びルシフェラーゼｄｓＲＮＡで処理したマウスを含んだ。
【図６】０時点でＬＮＰ０ｌ‐ｓｉＦＶＩＩを５ｍｇ／ｋｇ単回ボーラス静脈注射で処理したＣ５７ＢＬ／６系マウスにおける第ＶＩＩ因子蛋白質レベルの経時変化を示すグラフである。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０００１３１．３（３１４１ｂｐ）（２００７年１１月１８日付のＧｅｎＢａｎｋ記録）のヒトＦＶＩＩ転写変異体のｍＲＮＡ配列を示す。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０１９６１６．２（３１４１ｂｐ）（２００７年１１月１８日付のＧｅｎＢａｎｋ記録）のヒトＦＶＩＩ転写変異体のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１０８０１３６．１（２４２４ｂｐ）（２００７年１月１３日付のＧｅｎＢａｎｋ記録）のアカゲザルＦＶＩＩ転写変異体のｍＲＮＡ配列を示す。
【図１０】ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｄ２１２１２．１（４７８ｂｐ）（２００６年１２月２７日付のＧｅｎＢａｎｋ記録）のアカゲザルＦＶＩＩの部分的ｃｄｓ配列を示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＥＮＳＥＭＢＬＥ寄託番号ＥＭＳＭＭＵＴ０００００００１４７７（１３８９ｂｐ）のアカゲザルＦＶＩＩ配列を示す。
【図１２】ＥＮＳＥＭＢＬＥ寄託番号ＥＭＳＭＭＵＴ００００００４２９９７（１３２６ｂｐ）のアカゲザルＦＶＩＩ配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、並びにｄｓＲＮＡを使用して細胞又は哺乳類内第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害するための組成物及び方法を提供する。本発明は、ｄｓＲＮＡを使用して第ＶＩＩ因子遺伝子発現により惹起された哺乳類の病状及び疾患の治療のための組成物並びに方法も提供する。ｄｓＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られたプロセスを通してｍＲＮＡの配列特異的分解を指令する。該プロセスは哺乳類及び他の脊椎動物を含む多種多様の生物において生じる。
【００３４】
本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは、長さ３０ヌクレオチド未満、通常、長さ１９〜２４ヌクレオチドの領域を有するＲＮＡ（アンチセンス鎖）を含み、第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に実質的に又は完全に相補的である。これらｄｓＲＮＡの使用は、哺乳類の血栓症に関係しているとみなされる遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。細胞ベース及び動物の検定を使用して、本発明者らは、これらｄｓＲＮＡは超低用量でＲＮＡｉを特異的且つ効果的に媒介し得て、第ＶＩＩ因子遺伝子発現を有意に阻害することを示してきている。したがって、本発明で特徴とされる方法及び組成物には血栓性障害治療に有用なｄｓＲＮＡが含まれる。
【００３５】
下記の詳細な説明は標的第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害するｄｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡを含む組成物の作製及び使用方法、並びに血栓性障害などの第ＶＩＩ因子発現に惹起される疾患及び障害を治療する組成物及び方法を開示する。本発明で特徴とされる医薬組成物は、製薬上許容可能な担体と共に、長さ３０ヌクレオチド未満、通常、長さ１９〜２４ヌクレオチドで、第ＶＩＩ因子遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を有するアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを含む。
【００３６】
したがって、本発明のある態様では、製薬上許容可能な担体と共にＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡを含む医薬組成物、第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害する組成物の使用方法、及び第ＶＩＩ因子遺伝子発現に惹起される疾患を治療する医薬組成物の使用方法を提供する。
【００３７】
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の請求項で使用されるある用語及び語句の意味を下に提供する。本明細書の他の箇所における用語の使用法と本項で提供するその定義との間に明らかな矛盾があった場合、本項の定義が優先されるものとする。
【００３８】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｕ」は通常、塩基として各々グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という用語は、下に詳述する通り、修飾ヌクレオチド、又は代用置換部分も示し得ることが理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えずに他の部分と置換してよいことをよく理解している。例えば、イノシンをその塩基として含むヌクレオチドは、制限なく、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対となってよい。したがって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明で特徴とされるヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換してよい。別の例では、標的ｍＲＮＡと塩基対合するＧ‐Ｕゆらぎを形成するためにオリゴヌクレオチドの任意の箇所のアデニン及びシトシンを各々グアニン及びウラシルと置換し得る。そのような置換部分を含む配列は本発明で特徴とされる実施形態である。
【００３９】
本明細書で使用される「第ＶＩＩ因子」とは、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、又はポリペプチドを意味する。「第ＶＩＩ因子」という用語は、当分野でＡＩ１３２６２０、Ｃｆ７、凝固第ＶＩＩ因子前駆体、凝固第ＶＩＩ因子、ＦＶＩＩ、血清プロトロンビン転化促進剤、ＦＶＩＩ凝固蛋白質、及びエプタコグアルファとしても知られている。
【００４０】
本明細書においては、「標的配列」とは、一次転写産物のＲＮＡプロセシング産物であるｍＲＮＡを含む、第ＶＩＩ因子遺伝子の転写中に形成されたｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の隣接部を意味する。
【００４１】
本明細書においては、「配列が含まれる鎖」という用語は、標準的ヌクレオチド命名法を使用して示した配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを示す。
【００４２】
本明細書においては、別に示されない限り、「相補的な」という用語は、ヌクレオチド対に関して使用される場合、伝統的なワトソン‐クリック対、すなわち、ＧＣ、ＡＴ、又はＡＵを意味する。それはまたヌクレオチドの一方又は両方が本明細書に記載されるように、例えば、リボース修飾又はリン酸骨格修飾により修飾されている伝統的なワトソン‐クリック対合にまで及ぶ。それは実質的に塩基対合特性を変えないイノシン又は他の構成要素との対合も含み得る。
【００４３】
当業者に理解されるように、本明細書においては、別に示されない限り、「相補的な」という用語は、第二ヌクレオチド配列との関連で第一ヌクレオチド配列について記載するために使用するとき、第二ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと、ある条件下において、第一ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドがハイブリダイズし二重鎖構造を形成する能力を示す。相補性とは、生理的条件下、例えば、生物内に発生する可能性のある生理的に関連した条件下のハイブリダイゼーションを可能とする完全相補性、実質的相補性、及び十分な相補性を含み得る。完全な相補性とは、上記に定義した個々の対について、第一及び第二配列の対全てにおける相補性を指す。本明細書の第二配列に関して配列が「実質的に相補的な」とき、２つの配列は完全に相補的となり得るか、又はそれらはそれらの最終適用に最も関連する条件下においてハイブリダイズ能力を保持しつつ、ハイブリダイゼーション時に１つ以上の、しかし通常は４、３又は２つ以下のミスマッチ塩基対を形成してよい。実質的な相補性は緊縮条件下のハイブリダイゼーションとしても定義し得、緊縮条件とは：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間、そしてそれに続く洗浄を含み得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終適用にしたがって２つの配列の相補性を試験する上で最も適切な条件設定を決定することができる。
【００４４】
しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション時に１つ又は複数の単鎖突出部を形成するように設計されている場合、そのような突出部は相補性の決定に関してミスマッチとみなされない。例えば、長さ２１ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド及び長さ２３ヌクレオチドの別のオリゴヌクレオチドを含み、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡも、本明細書の目的のために「完全に相補的」と呼び得る。
【００４５】
「相補的」配列は、本明細書において使用するときは、ハイブリダイズ能力に関する上記の要件を満たす限り、非ワトソン‐クリック塩基対並びに／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含んでもよく、又はそれから全体が形成されてもよい。そのような非ワトソン‐クリック塩基対は、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対又はＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対合を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
「相補的な」、「完全に相補的な」、「実質的に相補的な」、及び生理的条件下、例えば、生物内に発生する可能性がある生理的関連条件下においてハイブリダイゼーションを可能とするのに十分な相補性という用語は、それらの使用において理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間でマッチする塩基に関して本明細書で使用してよい。
【００４７】
本明細書において使用するとき、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に「相補的、例えば、実質的に少なくとも一部相補的な」ポリヌクレオチドとは、対象のｍＲＮＡ隣接部（例えば、コード第ＶＩＩ因子）に対して相補的な、例えば、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、該配列が第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの途切れのない部分に実質的に相補的な場合、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。
【００４８】
「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」という用語は、本明細書において使用される場合、上に定義される２つの逆平行及び実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子、又はリボ核酸分子複合体を示す。二重鎖構造を形成する二本の鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分でよく、又は別々のＲＮＡ分子でもよい。二本の鎖が１つのより大きな分子の一部であり、したがって片方の鎖の３’末端と二重鎖構造を形成する他方の鎖の５’末端との間が一続きのヌクレオチド鎖によって連結している場合、連結したＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。二本の鎖が、片方の鎖の３’末端と二重鎖構造を形成する他方の鎖の５’末端との間の一続きのヌクレオチド鎖ではない方法によって共有連結している場合、該連結構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は同数又は異なる数のヌクレオチドを有してよい。塩基対の最大数はｄｓＲＮＡの短い方の鎖におけるヌクレオチド数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは１つ又は複数のヌクレオチド突出部を含んでよい。本明細書で使用されるｄｓＲＮＡは「低分子阻害性ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「ｉＲＮＡ剤」又は「ＲＮＡｉ剤」とも称される。
【００４９】
本明細書において使用するとき、「ヌクレオチド突出部」とはｄｓＲＮＡの片方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を超えて伸びる、又はその逆のときにｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突き出す１つ又は複数の不対ヌクレオチドのことを指す。「平滑」又は「平滑末端」とは該ｄｓＲＮＡ末端に不対ヌクレオチドを有さないこと、すなわち、ヌクレオチドの突出部を有さないことを意味する。「平滑末端」ｄｓＲＮＡとはその長さ全体において二本鎖である、すなわち、該分子のいずれの末端にもヌクレオチドの突出部を有さないｄｓＲＮＡのことである。
【００５０】
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖を指す。本明細書において使用するとき、「相補性領域」という用語は、ある配列、例えば本明細書で定義されるような標的配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列に対し完全に相補的ではない場合、ミスマッチは末端領域内が最も忍容され、存在すれぱ通常、末端領域又は、例えば、５’及び／若しくは３’末端の６、５、４、３、若しくは２ヌクレオチド以内の領域内である。
【００５１】
本明細書で使用される「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖を指す。
【００５２】
「同一性」という用語は、２ポリヌクレオチド以上の配列同士を比較して決定される、該配列間の関係性である。同一性とはそのような配列ストリング間の適合性によって決定されるポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定する多くの方法が存在するが、該用語は当業者に周知である（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８７）、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ．， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）を参照のこと）。本明細書で使用される「実質的に同一」とは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖と標的遺伝子の対応部分との間の相同度が非常に高いこと（例えば、１００％の配列同一性）を意味する。しかしながら、９０％より高い、又は９５％より高い配列同一性を有するｄｓＲＮＡを本発明に使用してよく、したがって遺伝子変異、菌株多型性、又は進化の多様性による予測可能な配列変異は忍容し得る。ｄｓＲＮＡは典型的には標的ＲＮＡに対して１００％相補的であるが、いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡはＲＮＡと標的遺伝子との間に単数又は複数の塩基対のランダムなミスマッチを含んでよい。
【００５３】
本明細書において使用される「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定的な核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰとは、ｉＲＮＡ剤又はｉＲＮＡ剤が転写されるプラスミドなどの核酸を含む還元された水性内部をコーティングする脂質小胞を表す。ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開第２００６０２４００９３号、第２００７０１３５３７２号、及び２００８年４月１５日に出願された米国特許出願第６１／０４５，２２８号に記載されている。これらの出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５４】
「細胞内導入」とは、ｄｓＲＮＡを指す場合、当業者に理解される、細胞内への取り込み又は吸収の促進を意味する。ｄｓＲＮＡの吸収又は取り込みは自発的拡散性又は能動的細胞プロセスを通して、又は助剤若しくはデバイスによって生じ得る。本用語の意味はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞に限定されない。ｄｓＲＮＡは細胞が生命体の一部であるとき「細胞内導入」してもよい。そのような場合、細胞内導入は生物への送達が含まれる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ送達において、ｄｓＲＮＡは組織部位内へ注入、又は全身投与し得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞内導入には、電気穿孔法及びリポフェクチン法など当分野で知られている方法が含まれる。
【００５５】
「サイレンス」及び「発現阻害」という用語は、それらが第ＶＩＩ因子遺伝子を指す限り、本明細書では、第一細胞又は細胞群と実質的に同一だがそのように処理されていない（対照細胞）第二細胞又は細胞群と比較したときの、第ＶＩＩ因子遺伝子が転写され、第ＶＩＩ遺伝子発現が阻害されるように処理されている第一細胞又は細胞群から単離され得るｍＲＮＡ量の低減によって示される、第ＶＩＩ因子遺伝子発現の少なくとも部分的な抑制を示す。阻害度は通常、
［（対照細胞内のｍＲＮＡ）−（処理した細胞内のｍＲＮＡ）］／（対照細胞内のｍＲＮＡ）×１００％
と表される。
【００５６】
あるいは、阻害度は、第ＶＩＩ因子遺伝子転写に機能的に関連づけられるパラメーター、例えば細胞から分泌される第ＶＩＩ因子遺伝子にコードされる蛋白質量、又はある表現型、例えばアポトーシスを示す細胞の数の減少を単位として与えられ得る。原則上、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングは、構成的に又はゲノム工学のいずれかによって標的を発現している任意の細胞において、及び任意の適切な検定によって決定してよい。しかしながら、所与のｓｉＲＮＡが第ＶＩＩ因子遺伝子発現をある程度阻害し、したがって本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要な場合、下記の実施例にて提供する検定はそのような参照の役割を果たすものとする。
【００５７】
例えば、ある例では、本発明で特徴とされる二本鎖オリゴヌクレオチド投与によって第ＶＩＩ因子遺伝子発現は少なくとも約２０％、２５％、３５％、４０％又は５０％抑制される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって第ＶＩＩ因子遺伝子は少なくとも約６０％、７０％、又は８０％抑制される。他の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって第ＶＩＩ因子遺伝子は少なくとも約８５％、９０％、又は９５％抑制される。
【００５８】
「治療（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、ウイルス性出血性発熱などの疾患又は障害の緩和（ｒｅｌｉｅｆ）又は軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）を指す。本発明において、本明細書の下記に記載される任意の他の状態（例えば、血栓性障害以外の第ＶＩＩ因子介在性状態）に関連する範囲で、「治療（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、そのような状態に関連した少なくとも１つの症状を緩和（ｒｅｌｉｅｖｅ）又は軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）すること、又はそのような状態の進行を減退若しくは逆行させることを意味する。
【００５９】
本明細書においては、「第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患」という用語並びに関連用語及び語句は、不適切、例えば、正常より高い、第ＶＩＩ因子活性を特徴とする状態又は障害を指す。不適切な第ＶＩＩ因子機能活性は正常時に第ＶＩＩ因子を発現しない細胞内での第ＶＩＩ因子発現、又は第ＶＩＩ因子発現増加（例えば、ウイルス性出血性発熱、又は血栓の症状に至る）の結果として生じる可能性がある。第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患には不適切な第ＶＩＩ因子の機能活性が完全に又は部分的に介在する可能性がある。しかしながら、第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患は、第ＶＩＩ因子調整が基礎疾患又は障害に対するいくらかの効果をもたらすものである（例えば、第ＶＩＩ因子阻害剤は少なくともいくらかの患者において患者の健康のいくらかの改善をもたらす）。
【００６０】
「出血性発熱」としてはウイルス感染に惹起される疾患（ｉｌｌｎｅｓｓ）の組み合わせが挙げられる。発熱及び胃腸症状は典型的には毛細管出血を続発する。
【００６１】
「凝固因子異常」とは対象の血液凝固機序における任意の欠陥である。
【００６２】
本明細書においては、「血栓性障害」とは好ましからぬ血液凝固を特徴とする任意の障害である。
【００６３】
本明細書においては、「治療的有効量」及び「予防的有効量」という語句はウイルス性出血性発熱、又はそのような障害、例えば、出血、発熱、衰弱、筋肉痛、頭痛、炎症、若しくは循環性ショックの明白な症状の治療、予防、又は管理における治療的利益を提供する量を指す。具体的な治療的有効量は一般の医師が容易に決定し得て、当分野で知られている要因、例えば血栓性障害タイプ、患者の既往歴及び年齢、疾患段階、並びに他剤投与などによって変わる可能性がある。
【００６４】
本明細書において使用するとき、「医薬組成物」には薬理学的有効量のｄｓＲＮＡ及び製薬上許容可能な担体が含まれる。本明細書において使用するとき、「薬理学的有効量」、「治療的有効量」又は単に「有効量」とは意図した薬理学的、治療的又は予防的結果を得る上で有効なＲＮＡ量を指す。例えば、疾患又は障害に関連した測定可能なパラメーターが少なくとも２５％減少したときに、与えられた臨床治療が有効とみなされる場合、該疾患又は障害の治療のための薬物の治療的有効量は、該パラメーターの少なくとも２５％の減少をもたらすために要される量である。
【００６５】
「製薬上許容可能な担体」という用語は、治療剤投与のための担体を指す。そのような担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。該用語は細胞培養用培地を明確に除外する。薬物経口投与用の製薬上許容可能な担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑剤、甘味剤、香味料、着色剤及び保存料などの製薬上許容可能な賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。トウモロコシ澱粉及びアルギン酸が適切な崩壊剤である一方、適切な不活性希釈剤としては炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム、並びにラクトースが挙げられる。滑剤は、存在する場合、通常マグネシウムステアレート、ステアリン酸又はタルクである一方、結合剤は澱粉及びゼラチンを含んでよい。所望の場合、錠剤は胃腸管内吸収を遅延化するためにグリセリンモノステアレート又はグリセリルジステアレートなどの材料でコーティングしてよい。
【００６６】
本明細書において使用するとき、「形質転換細胞」とはｄｓＲＮＡ分子が発現する可能性があるベクターを導入した細胞である。
【００６７】
ＩＩ． 二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
一実施形態では、本発明は細胞内又は哺乳類内において第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。該ｄｓＲＮＡには、第ＶＩＩ因子遺伝子発現で形成されたｍＲＮＡの対応領域に相補的であり、長さ３０ヌクレオチド未満であり、通常、長さ１９〜２４ヌクレオチドである相補性領域を含むアンチセンス鎖が含まれる。一実施形態ではｄｓＲＮＡは、前記ＶＩＩ因子遺伝子発現細胞との接触時、前記ＶＩＩ因子遺伝子発現を、例えば、細胞ベースの検定において、少なくとも２５％、例えば、少なくとも４０％阻害する。ｄｓＲＮＡには二重鎖構造を形成するハイブリダイズに十分相補的な２本のＲＮＡ鎖が含まれる。センス鎖には、適切な条件下で結合した場合、二本鎖がハイブリダイズして二重鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的な領域が含まれる。一般的に、二重鎖構造は１５〜３０、より通常では１８〜２５、さらにより通常では１９〜２４、及び最も通常では２１〜２３塩基対の長さである。同様に、標的配列への相補性領域は１５〜３０、より通常では１８〜２５、さらにより通常では１９〜２４、及び最も通常では２１〜２３ヌクレオチドの長さである。ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡはさらに１つ又は複数の単鎖ヌクレオチド突出部を含んでよい。ｄｓＲＮＡは当分野で知られている標準方法によって、以下で詳細に考察するように、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．から市販されている自動ＤＮＡ合成装置の使用などによって合成し得る。一実施形態では、第ＶＩＩ因子遺伝子はヒト第ＶＩＩ因子遺伝子である。特定の実施形態では、第一配列は表１、２、及び３のセンス配列からなる群から選択され、第二配列は表１、２、及び３のアンチセンス配列からなる群から選択される。一実施形態では、切断は表１、２、及び３のｄｓＲＮＡの切断部位の６、５、４、３、２又は１ヌクレオチド以内である。
【００６８】
さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡには表１、２、及び３に提示される配列の群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列が含まれる。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡには、本群から選択される少なくとも２つの配列であり、少なくとも２つの配列の片方は少なくとも２つの配列の他方に相補的であって、少なくとも２つの配列の片方は第ＶＩＩ因子遺伝子発現で発生するｍＲＮＡ配列に実質的に相補的であるｄｓＲＮＡが含まれる。一般的に、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含み、第一のオリゴヌクレオチドは表１、２、又は３に記載されるセンス鎖であり、第二のオリゴヌクレオチドは表１、２、又は３に記載されるアンチセンス鎖である。
【００６９】
当業者は、２０〜２３、厳密には２１塩基対の二重鎖構造を含むｄｓＲＮＡがＲＮＡ干渉の誘発に特に有効であることが確認されてきていることをよく理解している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ ２００１， ２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、他の者はより短い又はより長いｄｓＲＮＡも同様に有効であり得ることを見出している。上記の実施形態では、表１、２、及び３に提示したオリゴヌクレオチド配列の性質の故に、本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは最小２１ｎｔの長さの少なくとも一本の鎖を含み得る。一方又は両方の末端上のほんの数ヌクレオチドを差し引いた、表１、２又は３の配列の１つを含むより短いｄｓＲＮＡは、上記のｄｓＲＮＡと比較して同様に有効な可能性があることを合理的に期待し得る。したがって、表１、２、又は３の配列の１つの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれより多い隣接ヌクレオチドの部分配列を含み、第ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害能力が、本明細書で下で記載されるＦＡＣＳ検定において、完全配列を含むｄｓＲＮＡから５、１０、１５、２０、２５、又は３０％より多く阻害能力が異なることはない、ｄｓＲＮＡが本発明によって企図される。
【００７０】
加えて、表１、２、及び３に提示したｄｓＲＮＡはＲＮＡｉベース切断感受性の第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡにおける選択部位を特定する。したがって、本発明は、本発明の製剤の１つによって標的とされる配列内を標的とするｄｓＲＮＡをさらに含む。本明細書において使用するとき、第二ｄｓＲＮＡが第一ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡ内の任意の箇所のメッセージを切断する場合、第二ｄｓＲＮＡは第一ｄｓＲＮＡ配列内を標的とすると言われる。そのような第二剤は通常、表１、２、又は３に示し、第ＶＩＩ因子遺伝子において選択された配列の隣接領域から取られた追加のヌクレオチド配列に連結した配列の１つの少なくとも１５隣接ヌクレオチドからなる。
【００７１】
本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは標的配列に対する１つ又は複数のミスマッチを含み得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは３より多くのミスマッチを含まない。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチ部分は典型的には相補性領域中心に位置しない。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチは典型的にはいずれかの末端から５ヌクレオチド、例えば相補性領域の５’又は３’末端のいずれかから５、４、３、２、又は１ヌクレオチドに制限される。例えば、第ＶＩＩ因子遺伝子領域に相補的な２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖では、ｄｓＲＮＡは通常、中心部１３ヌクレオチド内にミスマッチを全く含まない。本明細書に記載する方法は、標的配列に対するミスマッチを含むｄｓＲＮＡが、第ＶＩＩ因子遺伝子発現阻害において有効であるかどうか決定するために使用し得る。ミスマッチを伴うｄｓＲＮＡの第ＶＩＩ因子遺伝子発現阻害における有効性の考察は、特に第ＶＩＩ因子遺伝子内の特定の相補性領域が集団内に多形性配列変異を有することが知られている場合に重要である。
【００７２】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端に、１〜４、通常１又は２ヌクレオチドの単鎖ヌクレオチド突出部がある。少なくとも１つのヌクレオチド突出部を有するｄｓＲＮＡは平滑末端対応物よりも優れた阻害特性を期せずして有する。さらに、本発明者らは、１ヌクレオチド突出部のみの存在がｄｓＲＮＡの干渉作用を、その全体の安定性に影響を与えずに強化することを見出した。１つの突出部のみを有するｄｓＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏ、並びに様々な細胞、細胞培養用培地、血液、及び血清で特に安定且つ有効であることが証明された。一般的に、単鎖突出部はアンチセンス鎖の３’末端、あるいは、センス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは通常、アンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端を有していてもよい。そのようなｄｓＲＮＡは改善された安定性及び阻害作用を有し、したがって低用量、すなわち、５ｍｇ／レシピエントの体重１ｋｇ／日未満での投与が可能である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖はセンス鎖の各３’末端及び５’末端に１〜１０ヌクレオチド突出部を有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖はアンチセンス鎖の各３’末端及び５’末端に１〜１０ヌクレオチド突出部を有する。別の実施形態では、突出部内の１ヌクレオチド以上がヌクレオシドチオホスフェートと置換される。
【００７３】
さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは安定性を高めるため化学的に修飾されている。例えば、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡの核酸は、参照することにより本明細書に組み込まれる“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｒｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ＵＳＡに記載されるような当分野にてよく確立された方法によって合成及び／又は修飾してよい。ｄｓＲＮＡ化合物の具体例としては、修飾骨格を含む又は天然ヌクレオシド間結合を含まないｄｓＲＮＡが挙げられる。本明細書に定義される通り、修飾した骨格を有するｄｓＲＮＡには、骨格内にリン原子を有し続けるｄｓＲＮＡも骨格内にリン原子を有さないｄｓＲＮＡも含まれる。本明細書の目的のため、及び当分野においてときどき参照されるように、それらのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾ｄｓＲＮＡはオリゴヌクレオシドともみなし得る。
【００７４】
代表的な修飾ｄｓＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート並びに３’‐アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、並びに正常な３’‐５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’‐５’結合アナログ、並びにヌクレオシド単位の隣接対が３’‐５’から５’‐３’へ又は２’‐５’から５’‐２’へ結合した逆極性を持つものが挙げられる。種々の塩、混合塩、及び遊離酸の形態も含まれる。
【００７５】
上記のリン含有連結調製を説明している代表的な米国特許は、各々が、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、及び第５，６２５，０５０号が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
リン原子を含まない、代表的な修飾ｄｓＲＮＡの骨格は、短鎖アルキル若しくは短鎖シクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、並びにＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成成分が混合された部分を有する他の骨格が含まれる。
【００７７】
上記のオリゴヌクレオシド調製を説明している代表的な米国特許は、各々が、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、及び第５，６７７，４３９号を含むが、これらに限定されない。
【００７８】
他の代表的なｄｓＲＮＡ模倣物では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合、すなわち骨格の両方が新規な基と置換される。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーション用に維持されている。そのようなオリゴマー化合物の１つであり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されてきているｄｓＲＮＡ模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ｄｓＲＮＡの糖骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接に又は間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を説明している代表的な米国特許は、各々が、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；及び第５，７１９，２６２号を含むが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物に関するさらなる説明はＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５４， １４９７−１５００に見出され得る。
【００７９】
代表的な実施形態では、ｄｓＲＮＡはヘテロ原子骨格、特に上記に参照した米国特許第５，４８９，６７７号の‐ＣＨ２‐ＮＨ‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２‐Ｎ（ＣＨ３）‐Ｏ‐ＣＨ２‐［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている］、‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｎ（ＣＨ３）‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２‐Ｎ（ＣＨ３）‐Ｎ（ＣＨ３）‐ＣＨ２‐及び‐Ｎ（ＣＨ３）‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐［天然ホスホジエステル骨格は‐Ｏ‐Ｐ‐Ｏ‐ＣＨ２‐として表される］、並びに上記に参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を伴うホスホロチオエート骨格及びオリゴヌクレオシドを有する。他の実施形態では、本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは上記に参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
【００８０】
修飾ｄｓＲＮＡは１つ又は複数の置換した糖部分を含んでもよい。代表的なｄｓＲＮＡは２’位に下記の１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ‐、Ｓ‐、若しくはＮ‐アルキル；Ｏ‐、Ｓ‐、若しくはＮ‐アルケニル；Ｏ‐、Ｓ‐又はＮ‐アルキニル；又はＯ‐アルキル‐Ｏ‐アルキルであって、アルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。代表的な修飾としてはＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中ｎ及びｍは１〜約１０である）が挙げられる。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは２’位に下記の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ‐アルカリル又はＯ‐アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポータ基、インターカレータ、ｄｓＲＮＡの薬物動態学的特性を改善するための基、又はｄｓＲＮＡの薬力学的特性を改善するための基、並びに類似した特性を有する他の置換基。一実施形態では、修飾としては２’‐メトキシエトキシ（２’‐Ｏ‐ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’‐Ｏ‐（２‐メトキシエチル）又は２’‐ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＨｅＩｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６−５０４）、すなわち、アルコキシ‐アルコキシ基が挙げられる。他の実施形態では、修飾には下記の実施例に記載されるように２’‐ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’‐ＤＭＡＯＥとしても知られる、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、、及び２’‐ジメチルアミノエトキシエトキシ（当分野で２’‐Ｏ‐ジメチルアミノエトキシエチル又は２’‐ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、下記の実施例にも記載される２’‐Ｏ‐ＣＨ２‐Ｏ‐ＣＨ２‐Ｎ（ＣＨ２）２が含まれる。
【００８１】
他の修飾には２’‐メトキシ（２’‐ＯＣＨ３）、２’‐アミノプロポキシ（２’‐ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’‐フルオロ（２’‐Ｆ）が含まれる。類似した修飾はｄｓＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の３’位又は２’‐５’位の連結したｄｓＲＮＡ及び５’末端ヌクレオチドの５’位においても行ってよい。ｄｓＲＮＡは、フラノース型五炭糖の代わりにシクロブチル部分などの糖質模倣物も有してよい。そのような修飾糖構造の調製を説明している代表的な米国特許には、本出願と共に共同保有され、且つ各々がその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号；及び第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
ｄｓＲＮＡはまた、核酸塩基（当分野において単に「塩基」と称されることが多い）に対する修飾又は置換を含んでいてもよい。本明細書において使用するとき、「修飾されていない」又は「天然の」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基には、他の合成及び天然の核酸塩基、例えば５‐メチルシトシン（５‐ｍｅ‐Ｃ）、５‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２‐アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６‐メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２‐プロピル及び他のアルキル誘導体、２‐チオウラシル、２‐チオチミン及び２‐チオシトシン、５‐ハロウラシル及びシトシン、５‐プロピニルウラシル及びシトシン、６‐アゾウラシル、シトシン及びチミン、５‐ウラシル（擬ウラシル）、４‐チオウラシル、８‐ハロ、８‐アミノ、８‐チオール、８‐チオアルキル、８‐ヒドロキシル及び他の８‐置換アデニン並びにグアニン、５‐ハロ、特に５‐ブロモ、５‐トリフルオロメチル及び他の５‐置換ウラシル並びにシトシン、７‐メチルグアニン及び７‐メチルアデニン、８‐アザグアニン及び８‐アザアデニン、７‐デアザグアニン及び７‐デアザアデニン、並びに３‐デアザグアニン及び３‐デアザアデニンが含まれる。さらに、核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８−８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｌ， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３に開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ Ｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ２８９−３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， Ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３に開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のいくつかは、オリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、５‐置換ピリミジン、６‐アザピリミジン、並びに２‐アミノプロピルアデニン、５‐プロピニルウラシル及び５‐プロピニルシトシンを含むＮ‐２、Ｎ‐６及びＯ‐６置換プリンが含まれる。５‐メチルシトシンの置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃高めることが示されてきており（Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ． Ｓ．， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， Ｅｄｓ．， ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３， ｐｐ． ２７６−２７８）、特に２’‐Ｏ‐メトキシエチル糖修飾と組み合わされたとき、典型的な塩基置換基を表す。
上記のいくつかの修飾した核酸塩基並びに 他の修飾した核酸塩基の調製を説明している代表的な米国特許は、参照することにより各々が本明細書に組み込まれる米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、及び第５，６８１，９４１号と同様に上記の米国特許第３，６８７，８０８号を含むが、これらに限定されず、米国特許第５，７５０，６９２号も含まれ、それも参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８３】
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡの別の修飾としては、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを高める１つ以上の部分又は複合体へのｄｓＲＮＡの化学的連結が挙げられる。そのような部分は、限定するものではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９， ８６， ６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９４ ４ １０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル‐Ｓ‐トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０， ３０６−３０９； Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３， ２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０， ５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， １９９１， １０， １１１１−１１１８； Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９， ３２７−３３０； Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５， ４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロール又はトリエチル‐アンモニウム１，２‐ジ‐Ｏ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロ‐３‐Ｈ‐ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１−３６５４； Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８， ３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４， ９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１−３６５４）、パルミトイル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４， ２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ‐カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７， ９２３−９３７）である。
【００８４】
そのようなｄｓＲＮＡ複合体の調製を説明している代表的な米国特許は、参照することにより各々が本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号及び第５，６８８，９４１号を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
所与の化合物は全位置均一に修飾される必要はなく、実際には１つより多くの上記の修飾のが単一化合物又はｄｓＲＮＡ内の単一ヌクレオシドすらにも取り込まれてよい。本発明はキメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も含む。「キメラ」ｄｓＲＮＡ化合物又は「キメラ」とは、本発明において、化学的に異なる領域を２つ以上含むｄｓＲＮＡ化合物、特にｄｓＲＮＡであり、各々が少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドで構成されている。これらのｄｓＲＮＡは典型的には、該ｄｓＲＮＡはｄｓＲＮＡに増大したヌクレアーゼ分解耐性、増大した細胞取り込み、及び／又は増大した標的核酸結合親和力を付与するように修飾されている少なくとも１つの領域を含む。ｄｓＲＮＡの付加的領域はＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断可能な酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮａｓｅ ＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、したがって、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによってｄｓＲＮＡによる遺伝子発現阻害の有効性を大いに高める。その結果、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと同様の結果が、キメラｄｓＲＮＡ使用時により短いｄｓＲＮＡにおいてしばしば得られる。ＲＮＡ標的の切断はゲル電気泳動及び、必要に応じて、当分野で知られている関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により日常的に検出し得る。
【００８６】
ある例では、ｄｓＲＮＡを非リガンド基によって修飾してよい。多くの非リガンド分子はｄｓＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを高めるためにｄｓＲＮＡに複合化されており、そのような複合化の実施手順は科学的文献において入手可能である。そのような非リガンド部分には、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １９９４， ４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル‐Ｓ‐トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０：３０６、 Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９１， １０：１１１、 Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９：３２７；、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２‐ジ‐Ｏ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロ‐３‐Ｈ‐ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１、 Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１）、パルミトイル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ‐カルボニル‐オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７：９２３）などの脂質成分が含まれている。そのようなｄｓＲＮＡ複合体の調製を説明している代表的な米国特許は上に挙げた。代表的な複合体化プロトコルは、該配列の１つ又は複数の位置にアミノリンカーを有するｄｓＲＮＡ合成を含む。アミノ基は次いで適切なカップリング又は活性化試薬を使用して複合化される分子と反応する。該複合体化反応は、ｄｓＲＮＡが固体支持体に結合したまま又は溶液相内のｄｓＲＮＡ切断後のいずれかで実施してよい。ＨＰＬＣによるｄｓＲＮＡ複合体精製により典型的には純粋な複合体が得られる。コレステロール複合体の使用は、例えば、第ＶＩＩ因子発現部位である膣上皮細胞標的を高め得る。
【００８７】
ベクターによりコードされるＲＮＡｉ剤
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏで細胞内にて組換えウイルスベクターからも発現し得る。例えば、組換えウイルスベクターは、ｄｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡ配列発現のための任意の適切なプロモーターをコードする配列を含み得る。適切なプロモーターとしては、例えば、Ｕ６又はＨｌ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は当分野における技術範囲である。組換えウイルスベクターは特定の組織内又は特定の細胞内環境におけるｄｓＲＮＡ発現を誘導可能な又は調節可能なプロモーターも含み得る。ｄｓＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏ細胞内に送達するための組換えウイルスベクターの使用についての詳細は、以下で考察する。
【００８８】
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡは２つの分離した相補的なＲＮＡ分子、又は２つの相補性領域を伴う単一ＲＮＡ分子のいずれかとして組換えウイルスベクターから発現し得る。
【００８９】
発現させるべきｄｓＲＮＡ分子のためのコーディング配列を受け入れ可能な任意のウイルスベクター、例えばアデノウイルス（ＡＶ）、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルスなどに由来するベクターを使用し得る。ウイルスベクターの向性は外被蛋白質又は他のウイルス由来の他の表面抗原を有するベクターをシュードタイプ化することによって、又は必要に応じて異なるウイルスカプシド蛋白質を置換することによって修飾し得る。
【００９０】
例えば、レンチウイルスベクターは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなど由来の表面蛋白質でシュードタイプ化し得る。ＡＡＶベクターは、ベクターを操作して、異なるカプシド蛋白質血清型を発現させることによって異なる細胞を標的とするようにし得る。例えば、血清２型ゲノム上の血清２型カプシド発現ＡＡＶベクターはＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター内のこの血清２型カプシド遺伝子はＡＡＶ２／５ベクターを得るために血清５型カプシド遺伝子と置換し得る。異なるカプシド蛋白質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築する技術は当分野の技術範囲である。例えば、全体の開示が参照により本明細書に組み込まれるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ． （２００２）， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照のこと。
【００９１】
本発明における使用に適切な組換えウイルスベクターの選択、ベクター内へのｄｓＲＮＡ発現のための核酸配列挿入方法、及び関心のある細胞へのウイルスベクター送達方法は当分野の技術範囲である。例えば、全体の開示が参照により本明細書に組み込まれるＤｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ （１９９５）， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ． ２： ３０１−３１０、 Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ （１９８８）， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６： ６０８−６１４、 Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ （１９９０）， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ． １： ５−１４、 Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ （１９９８）， Ｎａｔｕｒｅ ３９２： ２５−３０、 ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ３３： ４０１−４０６を参照のこと。
【００９２】
代表的なウイルスベクターはＡＶ及びＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡは例えば、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡプロモーター、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを含む組換えＡＡＶベクター由来の２つの別々の、相補的な単鎖ＲＮＡ分子として発現される。
【００９３】
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法、及び標的細胞内へのベクター送達方法はＸｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ． （２００２）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２０： １００６−１０１０にて記載されている。
【００９４】
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡを発現するための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法、及び標的細胞内へのベクター送達方法は、全体の開示が参照することにより本明細書に組み込まれるＳａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７）， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１： ３０９６−３１０１、 Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９６）， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ７０： ５２０−５３２、 Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９）， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３： ３８２２−３８２６、米国特許第５，２５２，４７９号、米国特許第５，１３９，９４１号、国際公開特許第９４／１３７８８号、及び国際公開特許第９３／２４６４１号にて記載されている。
【００９５】
ＩＩＩ． ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物
一実施形態では、本発明は本明細書に記載のｄｓＲＮＡ、及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は第ＶＩＩ因子発現が介在した病的プロセスなど、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現又は活性に関連した疾患又は障害の治療に有用である。そのような医薬組成物は送達様式に基づき製剤化される。一例は非経口送達を介した全身投与用に製剤化した組成物である。
【００９６】
本発明で特徴とされる医薬組成物は第ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害に十分な量を投与する。本発明者らは、それらの改善された有効性のため、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を驚異的な低用量で投与し得ることを見出した。最大投与量でレシピエントの体重１ｋｇ、一日あたり５ｍｇ ｄｓＲＮＡ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ）が、第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害又は完全に抑制するのに十分である。
【００９７】
一般に、ｄｓＲＮＡの適切用量は、レシピエントの体重１ｋｇ、一日あたり０．０１〜５．０ｍｇの範囲、通常、体重１ｋｇ、一日あたり１μｇ〜１ｍｇの範囲となる。医薬組成物は１日１回投与してよく、又はｄｓＲＮＡは２、３、若しくはそれより多いサブ用量を１日を通して適切な間隔で、又は制御した放出性製剤を通した持続注入若しくは送達を使用しても投与してよい。その場合、各サブ用量に含まれるｄｓＲＮＡは総１日投与量に到達するため相応に、より少量でなければならない。用量単位は、例えば、数日間持続してｄｓＲＮＡ放出を提供する従来の持続した放出性製剤を使用して数日間に渡って送達するように調合し得る。持続放出性製剤は当分野で周知であり、例えば本発明の製剤と使用し得る製剤の膣内送達に特に有用である。本実施形態では、用量単位には対応する複数日の用量が含まれる。
【００９８】
疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の全般的な健康状態及び／又は年齢、並びに他の疾患症状が含まれるがこれらに限定されない、いくつかの因子が対象を有効に治療するために要求される投与量及びタイミングに影響を与える可能性があることは、当業者に理解される。さらに、組成物の治療的有効量を用いた対象の治療は単回治療又は一連の治療を含み得る。本発明に含まれる個々のｄｓＲＮＡのための有効な投与量及びｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、従来の方法を使用して、又は本明細書の他の箇所に記載の適切な動物モデルを使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて推定し得る。
【００９９】
マウス遺伝学の進歩は、第ＶＩＩ因子発現の介在する病的プロセスなど様々なヒト疾患研究のための多くのマウスモデルを生み出した。そのようなモデルは、ｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ試験、及び治療的有効量の決定のために使用される。
【０１００】
本発明はＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡ化合物を含む医薬組成物及び製剤も含む。医薬組成物は多くの方法で投与してよく、該方法は局所又は全身治療のいずれが望ましいかによって、且つ治療部位によって決まる。投与は局所、肺、例えば、吸入又は噴霧器などによる粉剤若しくはエアロゾル吹送によって；気管内、鼻内、表皮及び経皮、経口又は非経口によって行ってよい。投与は、例えば関節内への直接的な関節内注入、胃腸管への直接的な送達のための直腸投与、子宮内及び膣内への送達のための膣内投与、眼内送達のための硝子体内投与による局所送達を介して特定の組織へ優先的に局在するようにも設計してよい。非経口投与としては静脈内、動脈内、関節内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又は注入；又は頭蓋内、例えば、髄腔内又は脳室内の投与が挙げられる。
【０１０１】
局所投与用の医薬組成物及び医薬製剤には、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤及び粉剤を含んでよい。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性の基材、増粘剤などが必要又は望ましい場合がある。コーティングを施したコンドーム、グローブなども有用な場合がある。局所製剤としては、ｄｓＲＮＡが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤及び界面活性剤のような局所送達剤と混合されているものが挙げられる。代表的な脂質及びリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））及びカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が挙げられる。ｄｓＲＮＡはリポソーム中に封入されてもよいし、又はリポソームとの、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成してもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質との複合体としてもよい。代表的な脂肪酸及びエステルとしては、限定するものではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１‐モノカプレート、１‐ドデシルアザシクロヘプタン‐２‐オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１‐１０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリステート（ＩＰＭ））、モノグリセリド、ジグリセリド、又は製薬上許容可能なこれらの塩が挙げられる。局所製剤については、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる１９９９年５月２０日出願の米国特許出願第０９／３１５，２９８号明細書に詳細に記載されている。
【０１０２】
一実施形態では、本発明で特徴とされるＦＶＩＩｄｓＲＮＡは、（例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、又は他の核酸‐脂質粒子を形成するため）脂質製剤内に完全に封入されている。本明細書において使用するとき、「ＳＮＡＬＰ」という用語はＳＰＬＰを含む安定した核酸‐脂質粒子を指す。本明細書において使用するとき、「ＳＰＬＰ」という用語は脂質小胞内に封入したプラスミドＤＮＡを含む核酸‐脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは典型的には、粒子の集合（例えば、ＰＥＧ‐脂質複合体）を予防するカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び脂質を含む。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に延長された循環期間を示し、遠位部（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身適用にとって極めて有用である。国際公開第００／０３６８３号にて説明されているように、ＳＰＬＰは「ｐＳＰＬＰ」を含み、封入された縮合剤‐核酸複合体を含む。本発明の粒子の平均直径は典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０〜約９０ｎｍであり、実質的に無毒性である。加えて、核酸は、本発明の核酸‐脂質粒子内に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解耐性を示す。核酸‐脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；第５，９８１，５０１号；第６，５３４，４８４号；第６，５８６，４１０号；第６，８１５，４３２号；及び国際公開第９６／４０９６４号にて開示されている。
【０１０３】
一実施形態では、脂質の薬物に対する比（質量／質量比）（例えば、脂質のｄｓＲＮＡに対する比）は約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、又は約６：１〜約９：１の範囲となる。
【０１０４】
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ‐ジオレイル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ‐ジステアリル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ‐（Ｉ‐（２，３‐ジオレオイルオキシ）プロピル）‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ‐（Ｉ‐（２，３‐ジオレイルオキシ）プロピル）‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２‐ジリノレニルオキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２‐ジリノレイルカルバモイルオキシ‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ‐Ｃ‐ＤＡＰ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐３‐（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ‐ＤＡＣ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐３‐モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ‐ＭＡ）、１，２‐ジリノレオイル‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２‐ジリノレイルチオ‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ‐Ｓ‐ＤＭＡ）、１‐リノレオイル‐２‐リノレイルオキシ‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ‐２‐ＤＭＡＰ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐３‐トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ‐ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２‐ジリノレオイル‐３‐トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ‐ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐３‐（Ｎ‐メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ‐ＭＰＺ）、又は３‐（Ｎ，Ｎ‐ジリノレイルアミノ）‐１，２‐プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３‐（Ｎ，Ｎ‐ジオレイルアミノ）‐１，２‐プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２‐ジリノレイルオキソ‐３‐（２‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ‐ＥＧ‐ＤＭＡ）、２，２‐ジリノレイル‐４‐ジメチルアミノメチル‐［１，３］‐ジオキソラン（ＤＬｉｎ‐Ｋ‐ＤＭＡ）、又はその混合物であってよい。カチオン性脂質は粒子内に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％又は約４０ｍｏｌ％を含んでよい。
【０１０５】
非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）‐シクロヘキサン‐ｌ‐カルボキシレート（ＤＯＰＥ‐ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル‐ホスファチジル‐エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６‐Ｏ‐モノメチルＰＥ、１６‐Ｏ‐ジメチルＰＥ、１８‐１‐トランスＰＥ、１‐ステアロイル‐２‐オレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、又はその混合物を含むが、これらに限定されないアニオン性脂質又は中性脂質でよい。非カチオン性脂質は粒子内に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、又はコレステロールが含まれる場合約５８ｍｏｌ％であってよい。
【０１０６】
粒子の集合を阻害する複合脂質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）‐脂質であってもよく、該ＰＥＧ‐脂質はＰＥＧ‐ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ‐ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ‐リン脂質、ＰＥＧ‐セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。ＰＥＧ‐ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ‐ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ‐ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ‐ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、又はＰＥＧ‐ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）でよい。粒子の集合を予防する複合脂質は粒子内に存在する総脂質の０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％又は約２ｍｏｌ％でよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、核酸‐脂質粒子は、例えば、粒子内に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％又は約４８ｍｏｌ％のコレステロールをさらに含む。
【０１０８】
一実施形態では、脂質‐ｓｉＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製するために脂質様物質ＮＤ９８ ４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（式１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＰＥＧ‐セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用し得る。エタノール中の各ストック溶液は、ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍＬ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ‐セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍＬのように調製し得る。ＮＤ９８、コレステロール、及びＰＥＧ‐セラミドＣ１６ストック溶液は次いで、例えば、４２：４８：１０モル比で併合し得る。併合脂質溶液はエタノール最終濃度が約３５〜４５％及び酢酸ナトリウム最終濃度が約１００〜３００ｍＭとなるように、水性ｓｉＲＮＡ（例えば、ｐＨ５の酢酸ナトリウム溶液）と混合し得る。脂質‐ｓｉＲＮＡナノ粒子は混合時、典型的には自発的に形成される。所望の粒子サイズ分布によって、生成したナノ粒子混合物は例えばＬｉｐｅｘ押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ， Ｉｎｃ）などのｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ押出機を使用してポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出し得る。いくつかの場合では、押出工程を省き得る。エタノール除去及び同時緩衝液交換は例えば、透析又は接線流濾過によって達成し得る。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、又は約ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換し得る。
【０１０９】
【化１】
【０１１０】
ＬＮＰ０１製剤については、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／０４２９７３号に記載されている。
【０１１１】
標準又は押し出さない方法のいずれかによって調製される製剤は、類似した手法で特徴づけし得る。例えば、製剤は典型的には視覚検査で特徴づけられる。それらは集合又は沈降物のない白色半透明溶液であるべきである。脂質‐ナノ粒子の粒子サイズ及び粒子サイズ分布は光散乱、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ， ＵＳＡ）を使用して測定し得る。粒子サイズは約２０〜３００ｎｍ、例えば４０〜１００ｎｍなどであるべきである。粒子サイズ分布は単峰型であるべきである。該製剤における総ｓｉＲＮＡ濃度は、並びに内包画分は、色素排除法を使用して推定される。製剤化したｓｉＲＮＡの試料は製剤崩壊界面活性剤、例えば、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の有無下でＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合性色素とともにインキュベートし得る。該製剤内の総ｓｉＲＮＡは標準曲線に対する、界面活性剤を含む試料からのシグナルによって決定し得る。内包画分は総ｓｉＲＮＡ含量から（界面活性剤の非存在下におけるシグナルによって測定した）「遊離」ｓｉＲＮＡ含量を差し引いて決定する。内包ｓｉＲＮＡの百分率は典型的には＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤において、粒子サイズは少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、及び少なくとも１２０ｎｍである。適切な範囲は典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、又は少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。
【０１１２】
経口投与用の組成物及び製剤には、粉剤若しくは顆粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、水中若しくは非水性媒体中の懸濁液若しくは溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤又は小型錠剤が含まれる。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましい場合がある。代表的な経口製剤は、ｄｓＲＮＡが１つ又は複数の浸透促進剤、界面活性剤及びキレート剤と共に投与されるものである。代表的な界面活性剤には、脂肪酸及び／又はそのエステル若しくは塩、胆汁酸及び／又はその塩が含まれる。代表的な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ‐２４，２５‐ジヒドロ‐フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。代表的な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１‐モノカプレート、１‐ドデシルアザシクロヘプタン‐２‐オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はモノグリセリド、ジグリセリド又は製薬上許容可能なこれらの塩（例えばナトリウム塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、製剤は、浸透促進剤の組み合わせ、例えば脂肪酸／塩を胆汁酸／塩と組み合わせたものを含む。一実施形態では、組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン‐２０‐セチルエーテルが挙げられる。ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥した粒子などの顆粒形態、又はマイクロ粒子若しくはナノ粒子を形成するように複合体化された形態で、経口送達してよい。ｄｓＲＮＡの複合体化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化したゼラチン、アルブミン、澱粉、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び澱粉；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥで誘導体化されたポリイミン、ポルラン、セルロース及び澱粉が挙げられる。代表的な複合体化剤としては、キトサン、Ｎ‐トリメチルキトサン、ポリ‐Ｌ‐リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ‐アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥメタクリレート、ＤＥＡＥヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥアクリルアミド、ＤＥＡＥアルブミン及びＤＥＡＥデキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ、Ｌ‐乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、アルギネート、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤及びその調製については、各々がその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許出願番号第０８／８８６，８２９号（１９９７年７月１日出願）、同第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日出願）、同第０９／２５６，５１５号（１９９９年２月２３日出願）、同第０９／０８２，６２４号（１９９８年５月２１日出願）及び同第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日出願）に詳細に述べられている。
【０１１３】
非経口、髄腔内又は脳室内投与用の組成物及び製剤は、無菌の水溶液を含んでよく、該水溶液は、緩衝液、希釈剤及びその他の適切な添加剤、例えば、限定するものではないが、浸透促進剤、担体化合物、及びその他の製薬上許容可能な担体又は賦形剤も含んでよい。
【０１１４】
本発明の医薬組成物としては、限定するものではないが、液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤が挙げられる。これらの組成物は、限定するものではないが、予め形成された液剤、自己乳化型の固体及び自己乳化型の半固体が含まれる様々な構成成分から作製してよい。
【０１１５】
本発明の医薬製剤は、便利なように単位投与形態で提供してよく、医薬品産業において周知の従来の技術にしたがって調製してよい。そのような技術は、有効成分を製薬用の担体又は賦形剤と共に会合させる工程を含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体若しくは微粉固体担体若しくは両方と共に均一かつ念入りに会合させ、次いで必要な場合は生成物を成形することにより調製される。
【０１１６】
本発明の組成物は、多くの可能な投与形態のうち任意のもの、例えば、限定するものではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟ゲル剤、坐剤、及び浣腸剤などに製剤化してよい。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混成媒体中の懸濁液としても製剤化してよい。水性懸濁液は、該懸濁液の粘性を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランなどをさらに含んでよい。懸濁液は安定剤も含んでよい。
【０１１７】
本発明の一実施形態では、医薬組成物はフォーム剤として製剤化及び使用してよい。医薬フォーム剤には、限定するものではないが、乳剤、マイクロエマルジョン、クリーム剤、ゼリー剤及びリポソームなどの製剤が挙げられる。これらの製剤の性質は基本的に類似しているが、構成成分及び最終生成物の粘稠度においては異なっている。そのような組成物及び製剤の調製は、一般的に製薬及び製剤分野の当業者に知られており、本発明の組成物の製剤化に適用してよい。
【０１１８】
乳剤
本発明の組成物は乳剤として調製及び製剤化されてよい。乳剤は典型的には一方の液体が他方の中に通常は直径０．１μｍを超える小滴形態で分散している不均質な系である（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９、 Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２４５、 Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐ．３３５、 Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８５， ｐ．３０１）。乳剤は、互いによく混合かつ分散された非混和性の２つの液相を含む二相系であることが多い。一般に、乳剤は、油中水（ｗ／ｏ）型又は水中油（ｏ／ｗ）型のどちらであってもよい。水相が大量の油相中で微細に分割され細かい小滴として分散される場合、生成組成物は油中水（ｗ／ｏ）型乳剤と呼ばれる。あるいは、油相が大量の水相中で微細に分割され細かい小滴として分散される場合、生成組成物は水中油（ｏ／ｗ）型乳剤と呼ばれる。乳剤は、分散相と、さらに水相、油相中又はそれ自体が分離した相の溶液として存在する可能性のある活性薬物とに加えて追加の構成成分を含んでよい。乳化剤、安定剤、染料及び酸化防止剤のような医薬賦形剤が、必要に応じて乳剤中に存在していてもよい。医薬乳剤は３つ以上の相で構成される多相乳剤、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）型乳剤及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型乳剤の事例のようなものであってもよい。そのような複雑な製剤は、単純な二成分の乳剤にはないある種の利点を備えていることが多い。ｏ／ｗ型乳剤の個々の油の小滴がより小さな水滴を囲む多相乳剤は、ｗ／ｏ／ｗ型乳剤を構成する。同様に、油性連続相中で安定化した水の小球に囲まれた油の小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ型乳剤を提供する。
【０１１９】
乳剤は、熱力学的安定性がほとんど又は全くないことを特徴とする。多くの場合、乳剤の分散相すなわち不連続相は、外相すなわち連続相中に十分に分散し、乳化剤又は製剤の粘性によってこの形態に維持される。乳剤型の軟膏基剤及びクリーム剤の場合のように、乳剤相のうちいずれかが半固体又は固体であってよい。乳剤を安定させる他の手段は、乳剤のいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、大きく分けて４つの分類、すなわち合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸水性基剤、及び微細分散固体に分類してよい（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９）。
【０１２０】
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、乳剤の製剤化に広い適用可能性が見出されてきており、文献中に総説もある（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２８５、 Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９）。界面活性剤は典型的には両親媒性であり、親水性部分及び疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性性質との比率は親水／親油バランス（ＨＬＢ）と名付けられており、製剤の調製において界面活性剤を分類及び選択する際に有益な手段である。界面活性剤は、親水基の性質に基づいて異なる種類、すなわち非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類することができる（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２８５）。
【０１２１】
乳剤製剤に使用される天然の乳化剤には、ラノリン、みつろう、ホスファチド、レシチン及びアカシアが挙げられる。吸水性基剤は、脱水ラノリン及び親水ワセリンのように、水分を吸収してｗ／ｏ型乳剤を形成しつつも半固体の粘稠度を維持し得るように、親水性の特性を有している。微粉固体も、特に界面活性剤と組み合わされて、及び粘性の調製物において、良質の乳化剤として使用されている。それには、極性の無機固体、例えば重金属の水酸化物、非膨潤性の粘土、例えばベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状のケイ酸アルミニウム及びコロイド状のケイ酸アルミニウムマグネシウム、色素並びに無極性の固体、例えば炭素又はトリステアリン酸グリセリルが含まれる。
【０１２２】
乳化作用を持たない種々様々な材料も乳剤製剤に含まれており、乳剤の特性の一要素となっている。それには、脂肪、油、ろう、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水コロイド、保存剤及び酸化防止剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．３３５、 Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９）。
【０１２３】
親水コロイドすなわちハイドロコロイドとしては、天然に存在するゴム及び合成ポリマー、例えば多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアーガム、カラヤゴム及びトラガント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル及びカルボキシビニルポリマー）などが挙げられる。これらは水中で分散又は膨張し、分散相の小滴の周囲に丈夫な界面膜を形成し、かつ外相の粘性を高めることにより、乳剤を安定させるコロイド溶液を形成する。
【０１２４】
乳剤は、微生物の増殖を引き起こしやすい可能性のある、炭水化物、蛋白質、ステロール及びホスファチドのような多くの成分を含むことが多いので、これら製剤には保存剤が組み込まれることが多い。乳剤製剤に含めるのに一般に使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、ベンザルコニウムクロライド、ｐ‐ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が挙げられる。酸化防止剤も一般に、乳剤製剤の変質を防ぐため該製剤に添加される。使用される酸化防止剤は、フリーラジカル捕捉剤、例えばトコフェロール、アルキルガラート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなど、又は還元剤、例えばアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなど、並びに酸化防止剤相乗剤、例えばクエン酸、酒石酸及びレシチンなどでよい。
【０１２５】
経皮的、経口及び非経口経路を介した乳剤製剤の適用並びに乳剤製剤の製造方法については、文献に総説がある（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９）。経口送達用の乳剤製剤は、製剤化が容易であり、さらに吸収及びバイオアベイラビリティの見地から有効であるため、非常に広く使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２４５、 Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９）。鉱油の緩下剤、脂溶性ビタミン及び高脂肪の栄養剤は、ｏ／ｗ型乳剤として一般に経口投与されてきている材料に含まれる。
【０１２６】
本発明の一実施形態では、ｄｓＲＮＡ及び核酸の組成物はマイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、光学的に等方性かつ熱力学的に安定な単一の溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義することができる（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２４５）。典型的には、マイクロエマルジョンは、最初に油を水性の界面活性剤溶液中に分散させて、次に十分な量の第四成分、一般には中鎖長アルコールを加えて透明な系を形成することにより、調製される系である。したがって、マイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面膜によって安定している２つの非混和性液体の、熱力学的に安定し、等方的に透明な分散物としても説明されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ， ｉｎ： Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ： Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒｏｓｏｆｆ， Ｍ．， Ｅｄ．， １９８９， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルジョンは一般に、油、水、界面活性剤、界面活性助剤及び電解質を含む３〜５つの構成成分の組み合わせによって調製される。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）型であるか水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油及び界面活性剤の特性、並びに界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素の尾部の構造及び幾何学的密集状態に依存する（Ｓｃｈｏｔｔ， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８５， ｐ．２７１）。
【０１２７】
状態図を利用する現象学的アプローチが広く研究されてきており、マイクロエマルジョンを製剤化する方法に関する包括的な知識が当業者にもたらされている（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２４５、 Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．３３５）。従来の乳剤に比べて、マイクロエマルジョンには、自然に形成される熱力学的に安定した小滴の製剤中で水不溶性の薬物を可溶化するという長所がある。
【０１２８】
マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤には、限定するものではないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレアート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられ、単独又は界面活性助剤との組み合わせられる。界面活性助剤は、通常はエタノール、１‐プロパノール及び１‐ブタノールのような短鎖アルコールであり、界面活性剤の界面膜に浸透し、その結果として、界面活性剤分子間に生じた空所に不規則な界面膜を作り出すことによって、界面の流動性を増大させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンは界面活性助剤を使用せずに調製してよく、アルコールを含まない自己乳化型マイクロエマルジョンの系が当分野で知られている。水相は、典型的には、限定するものではないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコール誘導体でよい。油相は、限定するものではないが、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ及びトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油などのような材料を含んでよい。
【０１２９】
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化及び薬物吸収増大の見地から特に興味深い。ペプチドなどの薬物の経口バイオアベイラビリティを増大させるために、脂質を用いるマイクロエマルジョン（ｏ／ｗ型及びｗ／ｏ型の両方）が提案されてきている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５−１３９０； Ｒｉｔｓｃｈｅｌ， Ｍｅｔｈ． Ｆｉｎｄ． Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， １９９３， １３， ２０５）。マイクロエマルジョンがもたらす長所は、薬物の可溶化の改善、酵素加水分解からの薬物の防護、界面活性剤により誘発された膜の流動性及び透過性の変化に起因する薬物吸収増大の可能性、調製の容易さ、固体剤形の場合の経口投与の容易さ、臨床上の効能の改善、並びに毒性の減少である（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５； Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９９６， ８５， １３８−１４３）。多くの場合、マイクロエマルジョンは、その構成成分を一緒にすると周囲温度で自然に形成され得る。このことは、熱に不安定な薬物、ペプチド又はｄｓＲＮＡを製剤化する場合に特に有利であり得る。マイクロエマルジョンはまた、化粧用途及び製薬用途の両方における有効成分の経皮送達にも有効となっている。本発明のマイクロエマルジョン組成物及び製剤は、胃腸管からのｄｓＲＮＡ及び核酸の全身吸収増大を促進し、同時に胃腸管、膣、口腔及び他の投与領域内におけるｄｓＲＮＡ及び核酸の局所的な細胞内取り込みを改善するであろうと期待される。
【０１３０】
本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、本発明のｄｓＲＮＡ及び核酸の吸収を増大させるために、追加の構成成分及び添加剤、例えばソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、及び浸透促進剤なども含んでよい。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、大きく分けて５つの部類、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、及び非キレート性の非界面活性剤、のうちの１つに属するように分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）。これらの部類の各々については上で考察した。
【０１３１】
リポソーム
マイクロエマルジョンの他に、研究され、薬物の製剤化に使用されている、多くの組織化された界面活性剤構造物がある。これらには単層、ミセル、二層及び小胞が挙げられる。リポソームのような小胞は、その特異性及び作用持続時間ゆえに、薬物送達の見地から大きな関心が持たれている。本発明において使用されるとき、「リポソーム」という用語は、球状の１つ又は複数の二層をなすように配置された両親媒性脂質で構成されている小胞を意味する。
【０１３２】
リポソームは、親油性の物質から形成された膜と水性内部とを有する単層又は多層の小胞である。水性の部分は、送達すべき組成物を含んでいる。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという長所を有する。非カチオン性リポソームは、効率的に細胞壁と融合することはできないが、ｉｎ ｖｉｖｏでマクロファージによって取り込まれる。
【０１３３】
無傷の哺乳類の皮膚を越えるためには、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、各直径が５０ｎｍ未満の一連の微小な細孔を通り抜けなければならない。したがって、変形能力が高く且つそのような微小な細孔を通り抜けることのできるリポソームを使用することが望ましい。
【０１３４】
リポソームのさらなる長所を挙げると、天然リン脂質から得られたリポソームは生体適合性及び生物分解性を有すること、リポソームは多種多様な水溶性及び脂溶性の薬物を組み込み得ること、リポソームは、その内部区画内に封入された薬物を代謝及び分解から保護し得ること、である（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な事柄は、脂質表面電荷、小胞サイズ及びリポソームの水容量である。
【０１３５】
リポソームは、作用部位への有効成分の移送及び送達に有用である。リポソーム膜は生体膜に構造上似ているので、リポソームが組織に対して適用されると、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞との融合が進行するにつれて、リポソームの内容物は、活性物質が作用することのできる細胞内に移される。
【０１３６】
リポソーム製剤は、多くの薬物の送達様式として広範囲な研究の中心となっている。局所投与については、リポソームが他の製剤に勝る長所をいくつか示すという証拠が増えつつある。そのような長所には、投与された薬物の高度の全身吸収に関連した副作用の低減、所望の標的における投与された薬物の蓄積増大、並びに親水性及び疎水性の両方の種々様々な薬物を皮膚内に投与する能力が含まれる。
【０１３７】
いくつかの報告書では、リポソームが高分子量のＤＮＡなどの物質を皮膚内に送達する能力について詳述されている。鎮痛剤、抗体、ホルモン及び高分子量ＤＮＡなどの化合物が皮膚に投与されている。適用の大部分は表皮上層を標的とする結果となった。
【０１３８】
リポソームは大きく２つに分類される。カチオン性リポソームは正に荷電したリポソームであり、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内に内部移行する。エンドソーム内の酸性ｐＨによりリポソームは破裂し、その内容物を細胞の細胞質中に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９８７， １４７， ９８０−９８５）。
【０１３９】
ｐＨ感受性であるか又は負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成する代わりにＤＮＡを封入する。ＤＮＡと脂質の両方が同様に荷電しているので、複合体形成ではなく斥力が生じる。それでもなお、一部のＤＮＡはこれらのリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ感受性のリポソームは、培養中の細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するために使用されている。該外来遺伝子の発現は標的細胞内で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， １９９２， １９， ２６９−２７４）。
【０１４０】
主要なタイプの１つのリポソーム組成物は、天然ホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性のリポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成し得る。アニオン性のリポソーム組成物は一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性の融合性リポソームは主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば大豆のＰＣ及び卵のＰＣなどから形成される。別のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
【０１４１】
いくつかの研究により、薬物のリポソーム製剤の皮膚への局所送達について評価がなされている。モルモット皮膚へのインターフェロン含有リポソーム塗布は、ヘルペスによる皮膚のただれを低減したが、他の手段（例えば液剤又は乳剤）によるインターフェロン送達では効果がなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， １９９２， ２， ４０５−４１０）。さらに、補足研究により、水性の系を使用したインターフェロン投与に対してリポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性が試験され、そのリポソーム製剤が水性投与より優れているとの結論が下された（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９２， １８， ２５９−２６５）。
【０１４２】
非イオン性のリポソーム系も、皮膚への薬物送達におけるその有用性を決定するために、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系について検討されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン‐１０‐ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン‐１０‐ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウス皮膚の真皮内にシクロスポリンＡを送達するために使用された。結果から、そのような非イオン性のリポソーム系が、皮膚の様々な層内にシクロスポリンＡが沈着するのを促進するのに有効であることが示された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ． Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ． Ｓｃｉ．， １９９４， ４， ６， ４６６）。
【０１４３】
リポソームはまた、「立体的に安定した」リポソームも含み、該用語は、本明細書において使用するとき、１つ又は複数の特殊な脂質を含むリポソームを指し、該脂質は、リポソームに組み込まれると、そのような特殊な脂質を欠くリポソームと比較して長い循環寿命をもたらす。立体的に安定したリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１のような糖脂質を１つ又は複数含む、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような１つ又は複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧで誘導体化された脂質を含有している立体的に安定したリポソームについては少なくとも、これらの立体的に安定したリポソームの循環半減期の延長は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内取り込みの減少に由来すると当分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８７， ２２３， ４２； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９３， ５３， ３７６５）。
【０１４４】
１つ又は複数の糖脂質が含まれる様々なリポソームが当分野で知られている。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９８７， ５０７， ６４）には、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸及びホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を改善する能力について報告されている。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８８， ８５， ６９４９）によって説明されている。いずれもＡｌｌｅｎらの米国特許第４，８３７，０２８号及び国際公開第８８／０４９２４号は、（１）スフィンゴミエリン、及び（２）ガングリオシドＧＭ１又はガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２‐ｓｎ‐ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示されている。
【０１４５】
１つ又は複数の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム及びその調製法が、当分野で知られている。Ｓｕｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ．， １９８０， ５３， ２７７８）は、ＰＥＧ部分を含む非イオン系洗剤２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームについて記載している。Ｉｌｉｕｍ ｅｔ ａｌ． （ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９８４， １６７， ７９）は、ポリマー状のグリコールを用いたポリスチレン粒子の親水コーティングにより血中半減期が有意に延長されることを記載している。ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボキシル基を取り付けることによって修飾された合成リン脂質については、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号及び同第４，５３４，８９９号）によって記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２６８， ２３５）は、ＰＥＧ又はＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、有意に延長された血液循環半減期を有することを実証する実験について記載している。Ｂｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ． （Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １９９０， １０２９， ９１）は、そのような観察を他のＰＥＧ誘導体化リン脂質に、例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）及びＰＥＧの組み合わせから形成されるＤＳＰＥ‐ＰＥＧに拡大適用した。外表面上にＰＥＧ部分が共有結合しているリポソームは、欧州特許第０ ４４５ １３１ Ｂ１号及びＦｉｓｈｅｒの国際公開第９０／０４３８４号に記載されている。ＰＥＧで誘導体化されたＰＥを１〜２０モル％含有するリポソーム組成物及びその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号及び同第５，３５６，６３３号）、及びＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号及び欧州特許第０ ４９６ ８１３ Ｂ１号）によって記載されている。多くの他の脂質‐ポリマー複合体を含むリポソームが、国際公開第９１／０５５４５号及び米国特許第５，２２５，２１２号（いずれもＭａｒｔｉｎら）並びに国際公開第９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾されたセラミド脂質を含むリポソームは、国際公開第９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）及び米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）には、表面上の官能基部分を用いてさらに誘導体化し得るＰＥＧ含有リポソームについて記載されている。
【０１４６】
核酸を含むリポソームは当分野で限られた数が知られている。Ｔｈｉｅｒｒｙらの国際公開第９６／４００６２号には、リポソーム中への高分子量核酸の封入方法が開示されている。Ｔａｇａｗａらの米国特許第５，２６４，２２１号は、蛋白質が結合したリポソームを開示し、そのようなリポソームの内容物はｄｓＲＮＡを含み得ると主張している。Ｒａｈｍａｎらの米国特許第５，６６５，７１０号には、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドを封入するある方法について記載されている。Ｌｏｖｅらの国際公開第９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。
【０１４７】
Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅはさらに別のタイプのリポソームであり、薬物送達用ビヒクルの好ましい候補である変形能力の高い脂質凝集物である。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅは、非常に変形能力が高い脂質小滴であるため該小滴よりも小さい細孔を容易に通り抜けることができるものとして説明してよい。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅは使用される環境に適応可能であり、例えば、自己最適化し（皮膚の細孔の形状に適応）、自己修復し、分断されることなく標的に到達することが多く、また多くの場合自己装荷型である。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを作製するために、標準的なリポソーム組成物に、表面の境界面の活性化物質、通常は界面活性剤を加えることが可能である。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅは皮膚に血清アルブミンを送達するために使用されている。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを介した血清アルブミンの送達は、血清アルブミンが含まれる溶液の皮下注射と同程度に有効であることが示されている。
【０１４８】
界面活性剤は、乳剤（マイクロエマルジョンが含まれる）及びリポソームのような製剤に広い用途が見出されている。天然及び合成の両方の多くの様々なタイプの界面活性剤の特性を分類及び格付けする最も一般的な方法は、親水／親油バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水基（「頭部」としても知られる）の性質は、製剤に使用される様々な界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｐ．２８５）。
【０１４９】
界面活性剤分子がイオン化されない場合、該分子は非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品及び化粧品に広い用途が見出されており、広範囲のｐＨ値に対して使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値範囲はその構造に依存して２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグルセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル、及びエトキシ化エステルのような非イオン性のエステルが含まれる。非イオン性のアルカノールアミド及びエーテル、例えば脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシ化アルコールなどであり、エトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなども、この分類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤部類のうち最も一般的な成員である。
【０１５０】
界面活性剤分子が水に溶解又は分散されたとき、該分子が負電荷を保有する場合、その界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミドなどのカルボキシレート、硫酸アルキル及びエトキシ化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネート、並びにホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤部類の中で最も重要なメンバーは硫酸アルキル及び石鹸である。
【０１５１】
界面活性剤分子が水に溶解又は分散されたとき、該分子が正電荷を保有する場合、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩及びエトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩はこの分類において最もよく使用されるものである。
【０１５２】
界面活性剤分子が正電荷又は負電荷のいずれかをも保有する能力を有する場合、その界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ‐アルキルベタイン及びホスファチドが挙げられる。
【０１５３】
薬品、製剤、及び乳剤における界面活性剤の使用については総説がある（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｐ．２８５）。
【０１５４】
浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、動物の皮膚への核酸、特にｄｓＲＮＡの効率的な送達を達成するために様々な浸透促進剤を使用する。ほとんどの薬物は、イオン化及び非イオン化の両方の状態で溶液中に存在する。しかしながら、通常は脂溶性又は親油性の薬物だけが容易に細胞膜を横断する。横断しようとする細胞膜が浸透促進剤で処理されると、親油性ではない薬物ですら細胞膜を横断する可能性が見出されてきている。浸透促進剤は、親油性ではない薬物が細胞膜を横切って拡散するのを支援することに加えて、親油性の薬物の透過性も高める。
【０１５５】
浸透促進剤は、５つの大きな分類、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、及び非キレート性の非界面活性剤のうちの１つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）。上述の浸透促進剤の分類各々について、下でより詳細に述べる。
【０１５６】
界面活性剤：本発明に関して、界面活性剤（又は「表面活性剤」）は、水溶液中に溶解されると、該溶液の表面張力又は該水溶液と別の液体との間の界面張力を低減し、その結果として粘膜を介したｄｓＲＮＡ吸収を増強させる化学成分である。胆汁酸塩及び脂肪酸に加えて、これら浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン‐２０‐セチルエーテル（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）；並びにペルフルオロ化合物の乳剤、例えばＦＣ‐４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， １９８８， ４０， ２５２）などが含まれる。
【０１５７】
脂肪酸：浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸及びその誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ‐デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１‐モノオレオイル‐ｒａｃ‐グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１‐モノカプレート、１‐ドデシルアザシクロヘプタン‐２‐オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜Ｃ１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル及びｔ‐ブチル）、並びにそれらのモノグリセリド及びジグリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｙｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２、 Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３、 Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９２， ４４， ６５１−６５４）。
【０１５８】
胆汁酸塩：胆汁の生理的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収を促進することが含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ： Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９６， ｐｐ． ９３４−９３５）。様々な天然胆汁酸塩及びその合成誘導体は浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁酸塩」という用語には、天然に存在する胆汁成分のうち任意のもの、並びにその合成誘導体のうち任意のものが含まれる。胆汁酸塩としては、例えば、コール酸（又はその製薬上許容可能なナトリウム塩であるコール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ‐２４，２５‐ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２、 Ｓｗｉｎｙａｒｄ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９９０， ｐａｇｅｓ ７８２−７８３、 Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３、 Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９２， ２６３， ２５、 Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９９０， ７９， ５７９−５８３）。
【０１５９】
キレート剤：キレート剤は、本発明に関して使用されるとき、金属イオンと複合体を形成することにより溶液中から金属イオンを取り除き、その結果として粘膜を介したｄｓＲＮＡ吸収を増強させる化合物として定義することができる。キレート剤を本発明において浸透促進剤として使用することについては、特性解析されているほとんどのＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用に二価金属イオンを必要とし、したがってキレート剤によって阻害を受けるので、キレート剤はＤＮａｓｅ阻害剤としての役割も果たすというさらなる長所を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， １９９３， ６１８， ３１５−３３９）。キレート剤としては、限定するものではないが、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えばナトリウムサリチレート、５‐メトキシサリチレート及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ‐アシル誘導体、β‐ジケトンのラウレス‐９及びＮ‐アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２、 Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３、 Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｉ．， １９９０， １４， ４３−５１）。
【０１６０】
非キレート性の非界面活性剤：本明細書中で使用されるとき、非キレート性の非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤又は界面活性剤として示す活性は有意ではないが、それにもかかわらず消化器粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収を高める化合物として定義し得る（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３）。この部類の浸透促進剤としては、例えば、不飽和の環式尿素、１‐アルキル‐及び１‐アルケニルアザシクロ‐アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２）、並びに非ステロイド性抗炎症薬、例えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９８７， ３９， ６２１−６２６）が挙げられる。
【０１６１】
細胞レベルでのｄｓＲＮＡの取り込みを高める薬剤を本発明の医薬組成物及びその他の組成物にも添加してよい。例えば、カチオン性脂質、例えばリポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性のグリセロール誘導体、並びにポリカチオン型分子、例えばポリリシン（Ｌｏｌｌｏら、国際公開第９７／３０７３１号）なども、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。
【０１６２】
他の薬剤、例えばエチレングリコール及びプロピレングリコールのようなグリコール、２‐ピロールのようなピロール、アゾン、並びにリモネン及びメントンのようなテルペンなどは、投与された核酸の浸透を高めるために利用してよい。
【０１６３】
担体
本発明のある種の組成物は、製剤中に担体化合物も組み入れる。本明細書において使用するとき、「担体化合物」又は「担体」とは、核酸又はそのアナログであって、不活性である（すなわち、それ自身は生物学的活性を有していない）が、例えば生物学的活性を有する核酸の分解又は循環血中からの除去促進により生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低減するｉｎ ｖｉｖｏプロセスにより核酸として認識されるものを指し得る。核酸及び担体化合物を、典型的には担体化合物を過剰量として併用投与すると、おそらくは共通の受容体に関する担体化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓又は他の循環血流外の蓄積部位で回収される核酸の量を大幅に低減し得る。例えば、部分的にホスホロチオエートを有するｄｓＲＮＡをポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジル酸又は４‐アセトアミド‐４’イソチオシアノ‐スチルベン‐２，２’‐ジスルホン酸と共に併用投与すると、該ｄｓＲＮＡの肝臓組織での回収は低減し得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ， ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．， １９９５， ５， １１５−１２１、 Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， １９９６， ６， １７７−１８３）。
【０１６４】
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」すなわち「賦形剤」は、製薬上許容可能な溶媒、懸濁化剤、又は動物に１つ又は複数の核酸を送達するための他の任意の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体でも固体でもよく、想定された投与方法によって、所与の医薬組成物の核酸及び他の成分と組み合わせたときに所望の体積、粘稠度などを提供するように選択される。代表的な医薬担体には、限定するものではないが、結合剤（例えば、予めゼラチン化したトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、増量剤（例えば、ラクトース及びその他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸の金属塩、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど）、並びに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
【０１６５】
核酸との間で有害反応を起こさない、製薬上許容可能な有機又は無機の経口投与に適した賦形剤も、本発明の組成物を製剤化するために使用し得る。適切な製薬上許容可能な担体としては、限定するものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１６６】
核酸の局所投与用製剤は、滅菌及び非滅菌の水溶液、アルコールのような一般的な溶媒中の非水性溶液、又は液体若しくは固体の油性基剤中の核酸溶液を含んでよい。該溶液はまた、緩衝液、希釈剤及びその他の適切な添加剤も含んでよい。核酸との間で有害反応を起こさない、製薬上許容可能な有機又は無機の経口投与に適した賦形剤を使用し得る。
【０１６７】
製薬上許容可能な適切な賦形剤としては、限定するものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１６８】
その他の構成成分
本発明の組成物は、通常、医薬組成物中に見出される他の補助成分を、該成分の分野で確立された使用量レベルで、付加的に含んでよい。したがって、例えば、組成物は、追加の、混合可能な、薬学的活性物質、例えば止痒剤、収斂剤、局所麻酔薬又は抗炎症薬などを含んでもよく、又は本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化するのに役立つ追加の物質、例えば色素、香料剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などを含んでもよい。しかしながら、そのような物質を加える場合は、該物質は本発明の組成物成分の生物学的活性を過度に妨げてはならない。製剤は滅菌し得て、望ましい場合は、該製剤の核酸との間で有害な相互反応を生じない補助的薬剤、例えば滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を操作するための塩類、緩衝液、着色剤、香味料及び／又は芳香剤などと混合し得る。
【０１６９】
水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランなど該懸濁液の粘性を増大させる物質を含んでよい。該懸濁液は安定剤も含んでよい。
【０１７０】
本発明で特徴とされるある実施形態は、（ａ）１つ又は複数のｄｓＲＮＡ分子、及び（ｂ）１つ又は複数の他の治療剤であってｄｓＲＮＡ介在性ではない機構によって機能するもの、を含有する医薬組成物を提供する。例えば、１つ又は複数の他の治療剤は抗凝固剤を含む。模範的な抗凝固剤は、例えば、ワルファリン（ＣＯＵＭＡＤＩＮ（商標））；ＬＭＷＨ（低分子量ヘパリン）；第Ｘａ因子インヒビター、例えば、ビスアミジン化合物、並びにフェニル及びナフチルスルホンアミド；未分画ヘパリン；アスピリン；並びに血小板糖蛋白質Ｉｌｂ／ＩＩＩａブロッカーを含む。
【０１７１】
そのような化合物の毒性及び治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％が死亡する用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手法によって決定し得る。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療指数であり、治療指数はＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。適切な化合物は典型的には高い治療指数を指す。
【０１７２】
細胞培養検定及び動物実験から得られたデータを、ヒトで使用するための用量範囲の策定において使用し得る。本発明で特徴とされる組成物の用量は、通常、毒性をほとんど又は全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。用量は、この範囲内で、使用される剤形及び利用される投与経路に依存して変動してよい。本明細書で特徴とされる方法で使用される任意の化合物について、治療上有効な用量を、細胞培養検定から最初に推定し得る。用量は、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）が含まれる、該化合物の循環血漿中濃度範囲、又は適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の循環血漿中濃度範囲（例えば、該ポリペプチドの濃度減少を達成する）を達成するように、動物モデルにおいて策定してよい。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用し得る。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してよい。
【０１７３】
上記で考察したように、ｄｓＲＮＡを独立に又は複数として投与することに加えて、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子発現介在性病的プロセスの治療に有効な他の既知の製剤と組み合わせて投与し得る。どの場合も、投与する医師は、当分野で既知又は本明細書に記載の標準的な有効性尺度を使用して観察された結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量及びタイミングを調節し得る。
【０１７４】
第ＶＩＩ因子遺伝子発現に惹起される疾患の治療方法
一実施形態では、本発明は、ウイルス性出血性発熱などの第ＶＩＩ因子遺伝子発現介在性病状を有する対象の治療方法を提供する。本実施形態では、ｄｓＲＮＡは第ＶＩＩ因子発現蛋白質制御のための治療剤として作用する。該方法には第ＶＩＩ因子遺伝子発現が抑制されるように、ウイルス感染患者などの患者（例えば、ヒト）への医薬組成物投与が含まれる。それらの高い特異性により、本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは特異的に第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡを標的とする。
【０１７５】
本明細書においては、「第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患」という用語並びに関連用語及び語句は、好ましからぬ又は不適切な、例えば、異常な第ＶＩＩ因子活性を特徴とする状態又は障害を指す。不適切な第ＶＩＩ因子機能活性は正常時に第ＶＩＩ因子を発現しない細胞内での第ＶＩＩ因子発現、又は第ＶＩＩ因子発現及び／若しくは活性の増加の結果として生じる可能性がある（例えば、ウイルス性出血性発熱症状、又は血栓性障害に至る）。第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患は第ＶＩＩ因子の不適切な活性化のために生じる可能性がある不適切な第ＶＩＩ因子機能活性によって完全に又は部分的に介在される可能性がある。それらに関係なく、第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患は、ＲＮＡ干渉を介した第ＶＩＩ因子の調節が基礎疾患又は障害に対するいくらかの効果をもたらすものである（例えば、第ＶＩＩ因子インヒビターは少なくともいくらかの患者における患者の健康のいくらかの改善をもたらす）。
【０１７６】
本発明の抗第ＶＩＩ因子ｄｓＲＮＡは対象におけるウイルス性出血性発熱の治療又は診断に使用してよい。治療方法は、本明細書に記載された抗第ＶＩＩ因子ｄｓＲＮＡを出血性発熱治療に有効な量を対象へ投与することを含む。
【０１７７】
病的プロセスとは有害な作用をもたらす生物学的プロセスの分類を指す。例えば、調整されていない第ＶＩＩ因子発現はウイルス性出血性発熱、血栓性障害及び癌に関連する。本発明で特徴とされる化合物は、典型的には該化合物がプロセスの程度又は重症度を低減するとき、病的プロセスを調節し得る。例えば、第ＶＩＩ因子の発現又は少なくとも１つの活性を低減する、そうでなければ調節するｄｓＲＮＡ投与によって、出血性発熱を予防し得、又は関連した病的プロセスを調節し得る。
【０１７８】
したがって、本明細書で特徴とされるｄｓＲＮＡ分子もウイルス性出血性発熱の治療又は予防に使用してよい。ｄｓＲＮＡは凝固障害若しくは炎症反応を寛解及び／又は予防することによって出血性発熱を治療又は予防し得る。
【０１７９】
本明細書で特徴とされるｄｓＲＮＡ分子は血栓性障害治療にも使用してよい。第ＶＩＩ因子を標的とするｄｓＲＮＡにより治療し得る血栓性障害は、局所血栓、急性心筋梗塞、不安定狭心症、冠動脈内血栓性閉塞、又は深部静脈血栓症を含むが、これらに限定されない。
【０１８０】
本発明に含まれる医薬組成物は、静脈内、筋肉内、関節内、腹腔内、皮下、硝子体内、経皮、気道（エアロゾル）、鼻内、直腸内、膣内及び局所（口腔内及び舌下を含む）投与、並びに硬膜外投与を含む経口又は非経口経路を含むが、これらに限定されない当分野で知られている任意の手段によって投与してよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は静脈注射又は注入によって投与する。
【０１８１】
第ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害方法
さらに別の態様では、本発明は哺乳類内の第ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害方法を提供する。該方法は標的ＶＩＩ因子遺伝子発現が抑制されるような、本発明で特徴とされる組成物の哺乳類への投与を含む。それらの高い特異性のために、本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは特異的に標的ＶＩＩ因子遺伝子のＲＮＡ（一次又はプロセシング後）を標的とする。ｄｓＲＮＡを使用した第ＶＩＩ因子遺伝子発現阻害の組成物及び方法は、本明細書の他の箇所に記載されているように実施し得る。
【０１８２】
一実施形態では、該方法はｄｓＲＮＡを含む組成物投与を含み、該ｄｓＲＮＡは治療対象の哺乳類の第ＶＩＩ因子遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。治療対象の生物がヒトなどの哺乳類であるとき、該組成物は、静脈内、筋肉内、関節内、頭蓋内、皮下、硝子体内、経皮、気道（エアロゾル）、鼻内、直腸内、膣内及び局所（口腔内及び舌下を含む）投与を含むが、これらに限定されない経口又は非経口経路を含む、当分野で知られている任意の手段によって投与してよい。ある実施形態では、組成物は静脈注射又は注入によって投与する。
【０１８３】
ｄｓＲＮＡ発現ベクター
別の態様では、ＦＶＩＩ遺伝子発現活性を調節するＦＶＩＩ特異的ｄｓＲＮＡ分子はＤＮＡ又はＲＮＡベクター内に挿入した転写単位によって発現する（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ， Ａ， ｅｔ ａｌ．， ＴＩＧ． （１９９６）， １２：５−１０； Ｓｋｉｌｌｅｒｎ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， 国際公開第００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄ、国際公開第００／２２１１４号、及びＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号を参照のこと）。これらのトランス遺伝子は直鎖状コンストラクト、環状プラスミド、又はウイルスベクターとして挿入し得、これらは宿主ゲノム内へ統合されたトランス遺伝子として取り込まれ且つ遺伝し得る。トランス遺伝子はまた染色体外プラスミドとして遺伝されるのを可能にするよう構築され得る（Ｇａｓｓｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ （１９９５） ９２：１２９２）。
【０１８４】
ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、２つの別々の発現ベクター上のプロモーターによって転写され且つ標的細胞内に同時に形質転換し得る。あるいはｄｓＲＮＡの個々の各鎖を同一発現プラスミド上に位置する両プロモーターによって転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列により接合された逆方向反復として発現する。
【０１８５】
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは通常ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡ発現ウイルスベクターは、アデノ関連性ウイルス（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９２） １５８：９７−１２９）を参照のこと）、アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （１９９８） ６：６１６）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４）、及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９２）， Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５）を参照のこと）、又はアルファウイルス、並びに当分野で知られている他のものが挙げられるが、これらに限定されないものに基づいて構築し得る。レトロウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで上皮細胞を含む多くの異なるタイプの細胞内への様々な遺伝子導入に使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８５） ２３０：１３９５−１３９８、 Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９８） ８５：６４６０−６４６４、 Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８、 Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６１４１６１４５、 Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３、 Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１、 Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５、 ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｄ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７６４０−１９ 、 Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７、 Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５、 Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４１０４−４１１５、米国特許第４，８６８，１１６号、米国特許第４，９８０，２８６号、国際公開第８９／０７１３６号、国際公開第８９／０２４６８号、国際公開第８９／０５３４５号、及び国際公開第９２／０７５７３号を参照のこと）。細胞ゲノム内に挿入した遺伝子を形質導入及び発現できる組換えレトロウイルスベクターは適切なパッケージング細胞株内へのＰＡ３１７及びＰｓｉ‐ＣＲＩＰなどの組換えレトロウイルスゲノムのトランスフェクトによって産生し得る（Ｃｏｍｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５−１０、 Ｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６３４９）。組換えアデノウイルスベクターは感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、及びチンパンジー）内の多種多様の細胞及び組織への感染に使用し得（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， １６６：７６９）、感染のために有糸分裂的活性細胞を要さないという長所も有する。
【０１８６】
ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターのいずれかにおいてｄｓＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、発現プラスミドがＴ７プロモーターからの転写に必要とするＴ７ ＲＮＡポリメラーゼもコードするという条件で、真核ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えばリボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えばＣＭＶ早期プロモーター又はアクチンプロモーター又はＵｌ ｓｎＲＮＡプロモーター）若しくは通常ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６ ｓｎＲＮＡ又は７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）又は原核生物プロモーター、例えばＴ７プロモーターでよい。プロモーターは膵臓へのトランス遺伝子発現も指令し得る（例えば膵臓のインスリン調節配列（Ｂｕｃｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：２５１１−２５１５）を参照のこと）。
【０１８７】
加えて、トランス遺伝子発現は、例えば、ある生理的レギュレータ、例えば、循環グルコースレベル、又はホルモンに感受性の調整配列などの誘導型調整配列及び発現系を使用することによって正確に調整し得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ， １９９４， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ８：２０−２４）。細胞内又は哺乳類内トランス遺伝子発現の制御に適切な、そのような誘導型発現系としては、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学的誘導物質、及びイソプロピル‐ベータ‐Ｄ１‐チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調整が挙げられる。当業者はｄｓＲＮＡトランス遺伝子の意図した使用に基づき適切な調整／プロモーター配列を選択することができるだろう。
【０１８８】
一般的に、ｄｓＲＮＡ分子を発現可能な組換えベクターは下記の通り送達され、標的細胞内に残存する。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用し得る。そのようなベクターは必要に応じて反復投与し得る。ｄｓＲＮＡはいったん発現すると、標的ＲＮＡと結合し、その機能又は発現を調節する。ｄｓＲＮＡ発現ベクターは、静脈内若しくは筋肉内投与、患者から体外移植された標的細胞へ投与後の患者への再導入、又は所望の標的細胞内への導入を可能とする他の任意の手段などによって全身に送達し得る。
【０１８９】
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは典型的には、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクトアミン）又は非カチオン性脂質担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞内にトランスフェクトされる。１週間以上の単独第ＶＩＩ因子遺伝子又は複数第ＶＩＩ因子遺伝子の異なる領域を標的とするｄｓＲＮＡ介在性ノックダウンのための複数脂質トランスフェクションも本発明によって企図される。ベクターの宿主細胞内への成功的導入は既知の様々な方法を使用して監視し得る。例えば、一過性トランスフェクションは緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のような蛍光標識などのレポータを用いてシグナル化し得る。ｅｘ ｖｉｖｏ細胞の安定したトランスフェクションは、ハイグロマイシンＢ耐性のような特異性環境因子（例えば、抗生物質及び薬物）耐性を有するトランスフェクトした細胞を提供する標識を使用して確実にし得る。
【０１９０】
第ＶＩＩ因子特異性ｄｓＲＮＡ分子はまたベクター内に挿入し、ヒト患者に対する遺伝子治療ベクターとして使用もし得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与によって（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）又は定位注入によって（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）、対象に送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は許容可能な希釈剤内の遺伝子治療ベクターを含み得、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放マトリックスを含み得る。あるいは、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから完全な遺伝子送達ベクターを無傷で産生し得る場合、医薬調製物は遺伝子送達系を産生する細胞を１つ又は複数含み得る。
【０１９１】
別段の指定がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明の実施又は試験には、本明細書に記載のものと類似した又は同等の方法及び材料を使用し得るが、適切な方法及び材料を下に記載する。全ての刊行物、特許出願、特許、及び本明細書に記載した他の参考文献がその全体を参照することにより組み込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は例証することのみを意図し、限定する意図はない。
【実施例】
【０１９２】
（実施例１）
ＦＶＩＩ標的ｓｉＲＮＡの設計。凝固第ＶＩＩ因子（ＡＩ１３２６２０、Ｃｆ７、凝固第ＶＩＩ因子前駆体、凝固第ＶＩＩ因子、ＦＶＩＩ、血清プロトロンビン転化促進因子、ＦＶＩＩ凝固蛋白質、及びエプタコグアルファとしても知られる）を標的とするｓｉＲＮＡを同定するためにｓｉＲＮＡ設計を実施した。
【０１９３】
２種のＦＶＩＩ転写変異体に対するヒトｍＲＮＡ配列、ＲｅｆＳｅｑ番号：ＮＭ＿０００１３１．３（３１４１ｂｐ）（例えば、図７Ａ及び７Ｂを参照のこと）及びＮＭ＿０１９６１６．２（３０７５ｂｐ）（２００７年１１月１８日付のＧｅｎＢａｎｋ記録）（例えば、図８Ａ及び８Ｂを参照のこと）を使用した。アカゲザル配列はＮＣＢＩ及びＥＮＳＥＭＢＬデータベース源から収集した（下記参照）。
【０１９４】
予測したヒトＦＶＩＩ特異性を有するヒト及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔｏ）ＦＶＩＩへに対して交差反応性であるｓｉＲＮＡ二重鎖を設計した。スクリーニングのために２４種の二重鎖を合成した。これらを表１に示す。
【０１９５】
ヒト‐アカゲザル交差反応。ヒト‐アカゲザル交差反応をｓｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ選択における必要条件として定義した。この目的のため、ＦＶＩＩのための２つのキュレーションされたヒト変異体及び入手可能なアカゲザル配列が１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ標的部位を含むことを確認した。
【０１９６】
２種のＦＶＩＩ転写変異体に対するヒトｍＲＮＡ配列をＮＣＢＩヌクレオチドデータベースからダウンロードした；これらの１つであるＮＭ＿０００１３１．３をさらに参照配列として使用した。
【０１９７】
ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース（ＮＭ＿００１０８０１３６．１‐２４２４ｂｐ及びＤ２１２１２．１‐４７８ｂｐ、部分的ｃｄｓ）、及びＥＮＳＥＭＢＬデータベース（ＥＮＳＭＭＵＴ０００００００１４７７‐１３８９ｂｐ及びＥＮＳＭＭＵＴ００００００４２９９７‐１３２６ｂｐ）からダウンロードしたアカゲザルＦＶＩＩｍＲＮＡ配列を、全長２４２４ｂｐのアカゲザルＦＶＩＩの共通配列を構築するために配列比較した。
【０１９８】
全ての可能性のある１９ｍｅｒｓをヒトｍＲＮＡ参照配列から抽出し、ＮＭ＿０００１３１．３の３１２２（センス鎖）配列、反応性ＦＶＩＩｓｉＲＮＡに対応する標的部位候補のプールが得られた。
【０１９９】
キュレーションされたヒト変異体及びアカゲザル共通配列の両方に対して反応するｓｉＲＮＡを決定するため、ｓｉＲＮＡ標的部位の各候補をヒトＲｅｆＳｅｑ配列ＮＭ＿０１９６１６．２及び部分的なアカゲザル配列内で探索した。得られたｓｉＲＮＡをヒト‐アカゲザル交差反応性ｓｉＲＮＡと定義した。
【０２００】
特異性予測。予測したｓｉＲＮＡ特異性を最終選択基準として使用し、ヒトＦＶＩＩｍＲＮＡであるが、他のヒトｍＲＮＡではない配列を標的とすることによって示された。
【０２０１】
非ＦＶＩＩヒト転写産物（潜在的な「オフターゲット」遺伝子）を標的しないヒトＦＶＩＩ特異的ｓｉＲＮＡを同定するため、ヒト‐アカゲザル交差反応性ｓｉＲＮＡを、包括的ヒトトランスクリプトームを表すとみなされるヒトＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡデータベースにおいて相同性検索に供した。
【０２０２】
この目的のため、ヒトＲｅｆＳｅｑデータベース（ｒｅｌｅａｓｅ２４）の各配列に対して最も相同性がヒットする領域のアンチセンス及びセンス鎖を決定するためにｆａｓｔＡアルゴリズムを使用した。
【０２０３】
得られた、全ＲｅｆＳｅｑエントリーの配列比較をｐｅｒｌスクリプトによってさらに分析してミスマッチの数及び位置を抽出し、これに基づき特異性スコアを算出した。
【０２０４】
算出した特異性スコアすなわち、高度に特異的であるスコア＞３、特異的であるスコア＝３、及び中等度に特異的であるスコア＝２．２〜２．８、に基づきｓｉＲＮＡ鎖を特異性分類に分類した。
【０２０５】
ｓｉＲＮＡ配列選択。ｓｉＲＮＡの選択において、アンチセンス鎖に対して特異性スコア２．８以上、及びセンス鎖に対してスコア２以上をｓｉＲＮＡ選択の必要条件として選択し、一方４個以上連続したＧ（ポリＧ配列）を含む配列は全て除外した。
【０２０６】
上記の全てのヒト及びアカゲザルＦＶＩＩｍＲＮＡに対し交差反応を示し、特異性基準を満たした２４種のｓｉＲＮＡ配列を選択した（表１参照）。得られた２４種のセットは２個の高度に特異的、１６個の特異的、及び６個の中等度に特異的なｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖の特異性のみ考慮）からなった。
【０２０７】
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｖｏのＦＶＩＩサイレンシング。ラット（ｎ＝４）に脂質様製剤９８Ｎ１２‐５で製剤化したｓｉＦＶＩＩを１．２５、２．５、３、３．５、４、５、及び１０ｍｇ／ｋｇ単回静脈注射した。
【０２０８】
動物を投与後４８時間に出血させ及び屠殺した。肝第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベルの有意な用量依存的低下が観察され、１．２５、２．５、及び５ｍｇ／ｋｇ投与時に各々４０％、８０％、及び９０％超抑制された（図１）。策定した対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔ）を使用時に抑制は観察されず、抑制の特異性が示された。肝第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベル低下は同時に血清第ＶＩＩ因子蛋白質レベルの用量依存的低下を引き起こし、最高用量投与時にはほぼ完全に抑制した（図２）。
【０２０９】
予期した通り、有意に低下した血清第ＶＩＩ因子レベルは処理した動物において表現型効果を生み出した。第ＶＩＩ因子は外因性凝固経路の一部であるため、処理した動物は、プロトロンビン時間（ＰＴ）延長での測定によると、この経路を通じた凝固の異常を有していた（図３）。策定した対照群はＰＴ摂動を示さなかったため、表現型効果は特異的であり送達ビヒクルに起因しないことが見出された。得られた遺伝子の発現抑制は高度に持続性であった。第Ｖｌｌ因子を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）を製剤化した９８Ｎｌ２‐５の単回注入で、ほぼ４週間持続する発現抑制の媒介が可能であった。
【０２１０】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列は下記の通りである。
【０２１１】
【数１】
【０２１２】
２’‐Ｏ‐Ｍｅ修飾ヌクレオチドは小文字で、２’‐フルオロ修飾ヌクレオチドは太字の小文字で、及びホスホロチオエート連結はアスタリスクで表す。ｓｉＲＮＡは等モル量の相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖をアニールすることによって作製した。
【０２１３】
使用した全ての動物手順は動物倫理審議委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認され、適用可能な地方、州、及び連邦規制に準拠した。Ｃ５７ＢＬ／６系マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ， ＭＡ）及びＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙ系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ， ＭＡ）に生理食塩水又は脂質様製剤内ｓｉＲＮＡのいずれかを尾静脈から０．０１ｍＬ／ｇ注入した。後眼窩からの採血によって採取した試料においける第ＶＩＩ因子蛋白質の血清レベルを、色原体アッセイ（Ｃｏａｓｅｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ， ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ， ＯＨ 又はＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ， Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＯＨ）を使用して測定した。第ＶＩＩ因子の肝ｍＲＮＡレベルは分岐ＤＮＡ法（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ， Ｐａｎｏｍｉｃｓ， ＣＡ）を使用して測定した。
【０２１４】
脂質様ベースのｓｉＲＮＡ製剤には、脂質様物質、コレステロール、ポリ（エチレングリコール）‐脂質（ＰＥＧ‐脂質）、及びｓｉＲＮＡが含まれた。製剤はＳｅｍｐｌｅ及び同僚（Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ８０：２３１０−２３２６， ２００１； Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５１０：１５２−１６６， ２００１）により記載されたものに類似したプロトコルを使用して調製した。９８Ｎ１２‐５（１）・４ＨＣｌ ＭＷ １４８９、ｍＰＥＧ２０００‐セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）ＭＷ ２６３４又はｍＰＥＧ２０００‐ＤＭＧ ＭＷ ２６６０、及びコレステロールＭＷ ３８７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ストック溶液をエタノール中で調製し、混合してモル比４２：１０：４８を得た。混合脂質を１２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．２に添加して３５％エタノールを含む溶液を得、空の脂質様ナノ粒子が自然に形成された。得られたナノ粒子を０．０８μ膜を通して押し出した（２パス）。３５％エタノール及び５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．２内ｓｉＲＮＡを１：７．５（重量：重量）のｓｉＲＮＡ：総脂質でナノ粒子に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ含有脂質様ナノ粒子のエタノール除去及び緩衝液交換は１００，０００ＭＷＣＯ膜を使用した、リン酸緩衝食塩水に対する接線流濾過によって達成した。最終的に、０．２μ無菌性フィルターを通して製剤を濾過した。粒子サイズはＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳ （Ｍａｌｖｅｒｎ， ＵＫ）を使用して測定した。ｓｉＲＮＡ含量は２６０ｎｍのＵＶ吸収によって測定し、ｓｉＲＮＡ取り込み効率をＲｉｂｏｇｒｅｅｎ法３２によって測定した。得られた粒子の平均直径は約５０ｎｍ、ピーク幅２０ｎｍ、及びｓｉＲＮＡ取り込み効率＞９５％であった。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号も参照のこと。
【０２１５】
【表４】
【０２１６】
（実施例３）
ウイルス性出血性発熱治療標的としての第ＶＩＩ因子。マウス肝細胞内ＶＩＩ因子の頑強なｉｎ ｖｉｖｏ発現抑制が脂質で製剤化したＦＶＩＩｄｓＲＮＡ（ＬＮＰ‐０１ ＦＶＩＩ）投与後に観察された（図４）。マウスにｄｓＲＮＡを静脈内投与し、２４時間後ＦＶＩＩ蛋白質について血清を分析した。ＦＶＩＩ蛋白質レベルの用量依存的な低下が生じた。ＬＮＰ‐０１で製剤化したルシフェラーゼｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。
【０２１７】
第ＶＩＩ因子に対する非最適化リポソーム的に製剤化したｄｓＲＮＡを使用した予備的データはエボラウイルス感染マウスにおいて有益な生存効果を示した（図５）。マウスはＬＮＰ‐０１で製剤化したｓｉＲＮＡで、エボラ−ザイールの３０，０００ＬＤ５０感染後０日目（５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）及び３日目（３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）に処理した。マウス１０匹／治療群の生存を監視した。陰性対照は、未処理群マウス及びＬＮＰ‐０１で製剤化したルシフェラーゼｓｉＲＮＡ処理群マウスを含んだ。観察結果は組換え抗凝固剤ＮａｐＣ２で見られた利益と一致し（Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｌａｎｃｅｔ， ３６２：１９５３−１９５８）、特に、エボラ感染非ヒト霊長類及びヒトに見られる凝固因子異常と比較して、マウスモデルにおいては凝固因子異常における役割が低いことを考慮すると、有望であった。
【０２１８】
（実施例４）
ｓｉＦＶＩＩによる治療は長期の効果を示した。
【０２１９】
Ｃ５７ＢＬ／６系マウスをＬＮＰ０ｌ‐ｓｉＦＶＩＩの５ｍｇ／ｋｇ単回ボーラス静脈注射によって処理した。図６は本投与がＦＶＩＩレベル低下を惹起し、３週間より長く持続させたことを示す。
【０２２０】
（実施例５）
ｄｓＲＮＡの合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書中で特に記載されない場合、そのような試薬は、分子生物学において適用するための品質／純度標準の分子生物学用試薬を供給する任意の業者から入手することができる。
【０２２１】
ｓｉＲＮＡの合成
単鎖ＲＮＡをＥｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び固体支持体として制御細孔ガラス（ＣＰＧ， ５００Å， Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）使用して、固体相合成によって１μＭ規模で産生した。ＲＮＡ及び２’‐Ｏ‐メチルヌクレオチド含有ＲＮＡを各々対応するホスホラミダイト及び２’‐Ｏ‐メチルホスホラミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、固体相合成によって作製した。これら構成要素は、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｒｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ＵＳＡに記載されているような標準ヌクレオシドホスホラミダイトを使用してオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に組み込んだ。ホスホロチオエート連結はヨウ素酸化剤溶液をＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ， Ｇｌａｓｇｏｗ， ＵＫ）のアセトニトリル溶液（１％）と置換して導入した。さらに補助試薬をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ （Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。
【０２２２】
定型手順に従い陰イオン交換ＨＰＬＣによって粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護及び精製を実行した。収率及び濃度は分光光度計（ＤＵ ６４０Ｂ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ， ＵｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉＢｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、波長２６０ｎｍの各ＲＮＡ溶液のＵＶ吸収によって測定した。アニーリング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）内で、相補鎖の等モル溶液を混合することによって二本鎖ＲＮＡを作製し、８５〜９０℃の水浴で３分間温め、３〜４時間室温に冷却する。アニーリングしたＲＮＡ溶液を使用時まで−２０℃で保存した。
【０２２３】
３’‐コレステロール複合化ｓｉＲＮＡ（以下、‐Ｃｈｏｌ‐３’と称す）の合成のため、適切に修飾した固体支持体をＲＮＡ合成のために使用する。修飾した固体支持体は下記の通り調製する。
【０２２４】
ジエチル‐２‐アザブタン‐１，４‐ジカルボキシレート ＡＡ
【０２２５】
【化２】
【０２２６】
氷冷したエチルグリシナート塩酸（３２．１９ｇ、０．２３モル）の水溶液（５０ｍＬ）内に４．７Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を撹拌しながら添加する。次いで、エチルアクリラート（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、ＴＬＣによって反応終了を確認するまで混合物を室温で撹拌する。１９時間後、溶液をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）により分離する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して蒸発させる。残渣を蒸留してＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得る。
【０２２７】
３‐｛エトキシカルボニルメチル‐［６‐（９Ｈ‐フルオレン‐９‐イルメトキシカルボニル‐アミノ）‐ヘキサノイル］‐アミノ｝‐プロピオン酸エチルエステル ＡＢ
【０２２８】
【化３】
【０２２９】
Ｆｍｏｃ‐６‐アミノ‐ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解して氷冷する。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に添加する。次いでジエチル‐アザブタン‐１，４‐ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加する。溶液を室温にし、さらに６時間撹拌する。反応終了はＴＬＣによって確認する。反応混合物を減圧濃縮し、エチルアセテートを添加して、ジイソプロピル尿素を沈殿させる。懸濁液を濾過する。濾過液を５％塩酸水溶液、５％重炭酸ナトリウム及び水で洗浄する。併合有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して粗生成物を得、カラムクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）により精製して、ＡＢ １１．８７ｇ（８８％）を得る。
【０２３０】
３‐［（６‐アミノ‐ヘキサノイル）‐エトキシカルボニルメチル‐アミノ］‐プロピオン酸エチルエステル ＡＣ
【０２３１】
【化４】
【０２３２】
３‐｛エトキシカルボニルメチル‐［６‐（９Ｈ‐フルオレン‐９‐イルメトキシカルボニルアミノ）‐ヘキサノイル］‐アミノ｝‐プロピオン酸エチルエステル ＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を０℃で２０％ピペリジンのジメチルホルムアミド溶液に溶解する。該溶液を１時間撹拌し続ける。反応混合物を減圧濃縮し、残渣に水を添加し、生成物をエチルアセテートで抽出する。粗生成物をその塩酸塩へ転換することにより精製する。
【０２３３】
３‐（｛６‐［１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イルオキシカルボニルアミノ］‐ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル‐アミノ）‐プロピオン酸エチルエステル ＡＤ
【０２３４】
【化５】
【０２３５】
３‐［（６‐アミノ‐ヘキサノイル）‐エトキシカルボニルメチル‐アミノ］‐プロピオン酸エチルエステル ＡＣの塩酸塩（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン内に取り込む。懸濁液を氷上で０℃に冷却する。懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加する。生成溶液にコレステリルクロロホルメート（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を一晩撹拌する。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄する。生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製する（１０．３ｇ、９２％）。
【０２３６】
１‐｛６‐［１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イルオキシカルボニルアミノ］‐ヘキサノイル｝‐４‐オキソ‐ピロリジン‐３‐カルボン酸エチルエステル ＡＥ
【０２３７】
【化６】
【０２３８】
カリウムｔ‐ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン３０ｍＬ内でスラリー状にする。混合物を氷上で０℃に冷却し、ジエステルＡＤ ５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を２０分以内撹拌しながら緩徐に添加する。添加中、温度を５℃未満に保つ。撹拌を０℃で３０分継続し、氷酢酸１ｍＬを添加し、直後にＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ４ｇの水溶液４０ｍＬを添加する。生成混合物を２回、各ジクロロメタン１００ｍＬで抽出し、併合有機抽出物を２回各１０ｍＬリン酸緩衝液で洗浄し、乾燥し、蒸発乾固させる。残渣を６０ｍＬトルエンに溶解し、０℃に冷却し、冷却したｐＨ９．５炭酸塩緩衝液５０ｍＬで３回抽出する。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に調節し、併合クロロホルム４０ｍＬで５回抽出し、乾燥させ、蒸発乾固させる。残渣を２５％エチルアセテート／ヘキサンを使用したカラムクロマトグラフィーにより精製し、ｂ‐ケトエステル１．９ｇ（３９％）を得る。
【０２３９】
［６‐（３‐ヒドロキシ‐４‐ヒドロキシメチル‐ピロリジン‐１‐イル）‐６‐オキソ‐ヘキシル］‐カルバミン酸１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イル エステル ＡＦ
【０２４０】
【化７】
【０２４１】
ｂ‐ケトエステル ＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）及び水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）の還流混合物にメタノール（２ｍＬ）を１時間かけて滴下する。撹拌を還流温度で１時間継続する。室温に冷却後、１Ｎ ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、混合物をエチルアセテート（３×４０ｍＬ）で抽出する。併合エチルアセテート層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧濃縮して生成物を得て、カラムクロマトグラフィーにより精製する（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）（８９％）。
【０２４２】
（６‐｛３‐［ビス‐（４‐メトキシ‐フェニル）‐フェニル‐メトキシメチル］‐４‐ヒドロキシ‐ピロリジン‐１‐イル｝‐６‐オキソ‐ヘキシル）‐カルバミン酸１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イル エステル ＡＧ
【０２４３】
【化８】
【０２４４】
ジオール ＡＦ（１．２５ｇ、１．９９４ｍｍｏｌ）をピリジン（２×５ｍＬ）と減圧蒸発させて乾燥させる。無水ピリジン（１０ｍＬ）及び４，４’‐ジメトキシトリチルクロライド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加する。反応を室温で一晩実行する。反応をメタノールの添加によって停止させる。反応混合物を減圧濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加する。有機層を１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して、濃縮する。残渣のピリジンをトルエンにより蒸発させて除去する。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、Ｒｆ＝０．５の５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３溶液）により精製する（１．７５ｇ、９５％）。
【０２４５】
コハク酸モノ‐（４‐［ビス‐（４‐メトキシ‐フェニル）‐フェニル‐メトキシメチル］‐１‐｛６‐［１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イルオキシカルボニルアミノ］‐ヘキサノイル｝‐ピロリジン‐３‐イル）エステル ＡＨ
【０２４６】
【化９】
【０２４７】
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、一晩４０℃で減圧乾燥させる。混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を添加して溶液をアルゴン雰囲気下、室温で１６時間撹拌する。次いでそれをジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）及び水（２×２０ｍＬ）で洗浄する。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固させる。次工程のため残渣をそのように使用する。
【０２４８】
コレステロール誘導体化ＣＰＧ ＡＩ
【０２４９】
【化１０】
【０２５０】
サクシネート ＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル混合物（３：２、３ｍＬ）に溶解する。そのＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．２５ｍＬ）に２，２’‐ジチオ‐ビス（５‐ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／ジクロロエタン溶液（３：１、１．２５ｍＬ）を逐次添加する。生成溶液にトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．６ｍＬ）を添加する。反応混合物は明橙色に変色する。溶液はリストアクションシェイカーを短時間（５分）使用して十分に撹拌する。長鎖アルキルアミン‐ＣＰＧ（ＬＣＡＡ‐ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加する。懸濁液を２時間撹拌する。ＣＰＧは焼結漏斗を介して濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン及びエーテルによって逐次洗浄する。未反応アミノ基は無水酢酸／ピリジンを使用してマスクする。ＣＰＧの達成負荷はＵＶ測定（３７ｍＭ／ｇ）によって測定する。
【０２５１】
５’‐１２‐ドデカン酸ビスデシルアミド基（以下「５’‐Ｃ３２‐」と称す）又は５’‐コレステリル誘導体基（以下「５’‐Ｃｈｏｌ‐」と称す）を有するｓｉＲＮＡの合成は、コレステリル誘導体のために、酸化工程をホスホロチオエート連結を核酸オリゴマーの５’末端に導入するためにＢｅａｕｃａｇｅ試薬を使用して実施することを除き、国際公開第２００４／０６５６０１号に記載されているように実施する。
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１２月１０日に出願された米国仮出願第６１／０１２，６７０号、及び２００７年１２月１９日に出願された米国仮出願第６１／０１４，８７９号の利益を主張する。これら両方の先行出願がその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、及び第ＶＩＩ因子発現を阻害するためのＲＮＡ干渉媒介におけるその使用、及び第ＶＩＩ因子介在性障害、例えば、ウイルス性出血性発熱の治療又は予防のためのｄｓＲＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は凝固に関与する。血管損傷時、血管外に位置する組織因子（ＴＦ）は血液及び循環第ＶＩＩ因子に曝露される。ＦＶＩＩはいったんＴＦと結合すると、トロンビン（第ＩＩａ因子）、活性化Ｘ因子及びＦＶＩＩａ‐ＴＦ複合体自体が含まれる様々なプロテアーゼによってＦＶＩＩａに活性化される。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は凝固開始の役割に加えて、凝固活性化とは独立した直接的な炎症促進効果を有することが報告されている。
【０００４】
多くのウイルスがヒト及び他のいくつかの霊長類において致死的出血性疾患を惹起することが報告されている。これらのウイルスはフィロウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、及びフラビリダが含まれる多くのウイルスファミリー由来である。出血性発熱患者は典型的には重度の消費性の播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を発現する。ＤＩＣは、過剰なトロンビン生成をもたらす広範囲の凝固カスケードの系統的活性化を特徴とする。加えて、凝固因子の消費を伴う線溶系活性化は凝固因子減少及び血小板膜糖蛋白質分解をもたらす。
【０００５】
ある感染体は感染後に凝固系を活性化することも知られている。細菌性細胞生成物、ウイルス感染及びサイトカインを含む様々な炎症刺激が内皮細胞及び単球表面上のＴＦ発現を誘発し、それによって凝固経路を活性化することが報告されている。
【０００６】
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている高度に保存された調節機構において遺伝子発現をブロックすることが示されている。特許文献１（Ｆｉｒｅら）では、シー・エレガンスのｕｎｃ‐２２遺伝子発現を阻害するための、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのｄｓＲＮＡの使用が開示されている。ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、特許文献２、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．；及び特許文献３、Ｈｅｉｆｅｔｚ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）、ショウジョウバエ（例えば、非特許文献１を参照のこと）、及び哺乳類（特許文献４、Ｌｉｍｍｅｒ；及びＤＥ １０１ ００ ５８６．５， Ｋｒｅｕｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）を含む他の生物内で標的ＲＮＡを分解することも示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９９／３２６１９号
【特許文献２】国際公開第９９／５３０５０号
【特許文献３】国際公開第９９／６１６３１号
【特許文献４】国際公開第００／４４８９５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｙａｎｇ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． （２０００）１０：１１９１−１２００
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、またそのようなｄｓＲＮＡを使用して細胞又は哺乳類内第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害するための組成物及び方法を提供する。本発明はウイルス性出血性発熱を含む凝固障害など第ＶＩＩ因子遺伝子発現に惹起される病状及び疾患を治療する組成物及び方法も提供する。本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは長さ３０ヌクレオチド未満、通常、長さ１９〜２４ヌクレオチドの領域を有するＲＮＡ（アンチセンス鎖）を含み、第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡ転写の対応領域に実質的に相補的又は完全に相補的である。
【００１０】
一実施形態では、本発明は第ＶＩＩ因子遺伝子発現阻害のための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。ｄｓＲＮＡには、互いに相補的な、例えば、実質的に相補的な、完全に相補的な、又は生理的条件下でハイブリダイズするために十分に相補的な少なくとも２つの配列が含まれる。ｄｓＲＮＡには第一配列を含むセンス鎖及び第二配列を含むアンチセンス鎖が含まれる。アンチセンス鎖は第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの対応領域に実質的又は完全に相補的なヌクレオチド配列を含み、該相補性領域は長さ３０ヌクレオチド未満、通常１９〜２４ヌクレオチド、例えば、１９〜２１ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡの長さは約１０〜約１５ヌクレオチドであり、他の実施形態ではｄｓＲＮＡの長さは約２５〜約３０ヌクレオチドである。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子発現細胞と接触すると、第ＶＩＩ因子遺伝子発現を少なくとも２５％、例えば、少なくとも３５％、又は少なくとも４０％阻害する。一実施形態では、第ＶＩＩ因子ｄｓＲＮＡは安定した核酸粒子（ＳＮＡＬＰ）内で形成される。
【００１１】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは例えば、本明細書に記載される検定による測定においてｍＲＮＡレベルを少なくとも４０％、６０％、８０％、又は９０％低減し得る。例えば、ｄｓＲＮＡはラットの肝第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベルを、第ＶＩＩ因子標的ｓｉＲＮＡを製剤化した９８Ｎ１２‐５の単回投与などによって少なくとも４０％、６０％、８０％、又は９０％低減し得る。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えば、本明細書に記載された検定による測定において蛋白質レベルの類似した減少を引き起こす。さらに別の実施形態では、第ＶＩＩ因子標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）を製剤化した９８Ｎ１２‐５の単回注入は、例えば、本明細書に記載される検定による測定において１、２、３又は４週間以上サイレンシングを媒介し得る。ＦＶＩＩｍＲＮＡ及び蛋白質レベルを測定する検定は当分野で知られている標準方法によっても実施し得る。例えば、ＦＶＩＩｍＲＮＡはＲＴ‐ＰＣＲ又はノーザンブロット解析によって測定し得る。ＦＶＩＩ蛋白質レベルは酵素検定によって、又は抗体に基づく方法、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、若しくは免疫組織化学によって測定し得る。
【００１２】
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡ分子は、表１、２、及び３のセンス配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第一配列、並びに表１、２、及び３のアンチセンス配列からなる群から選択される第二配列を含み得る。本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡ分子は天然で存在するヌクレオチドを含み得、又は２’‐Ｏ‐メチル修飾ヌクレオチド、５’‐ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合する末端ヌクレオチドなど少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み得る。あるいは、修飾ヌクレオチドは、２’‐デオキシ‐２’‐フルオロ修飾ヌクレオチド、２’‐デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド、脱塩基性ヌクレオチド、２’‐アミノ修飾ヌクレオチド、２’‐アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、及びヌクレオチド含有非天然塩基の群から選択してもよい。一般的に、前記ｄｓＲＮＡの第一配列は表１、２、及び３のセンス配列からなる群から選択され、第二配列は表１、２、及び３のアンチセンス配列からなる群から選択される。
【００１３】
別の実施形態では、本発明はＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡが含まれる細胞を提供する。該細胞は通常、ヒト細胞などの哺乳類細胞である。
【００１４】
別の実施形態では、本発明はＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡの１つ以上、及び製薬上許容可能な担体が含まれる生物における第ＶＩＩ因子遺伝子発現阻害のための医薬組成物を提供する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、細胞内第ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害方法を提供し、該方法には下記の工程が含まれる。
（ａ）二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、互いに相補的、例えば、実質的に又は完全に、互いに相補的な少なくとも２つの配列が含まれるｄｓＲＮＡの細胞内導入工程、及び
（ｂ）工程（ａ）において産生した細胞を第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡ転写物を分解させるのに十分な時間維持し、それによって細胞内第ＶＩＩ因子遺伝子の発現を阻害する工程。
【００１６】
ｄｓＲＮＡには第一配列を含むセンス鎖及び第二配列を含むアンチセンス鎖が含まれる。該アンチセンス鎖は第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの対応領域に実質的に又は完全に相補的な相補性領域を含み、該相補性領域は長さ３０ヌクレオチド未満、通常、長さ１９〜２４ヌクレオチドであり、該ｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子発現細胞と接触すると、第ＶＩＩ因子遺伝子発現を少なくとも４０％阻害する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは例えば、本明細書に記載される検定による測定においてｍＲＮＡを少なくとも４０％、６０％、８０％、又は９０％低減し得る。例えば、第ＶＩＩ因子標的ｓｉＲＮＡ製剤９８Ｎ１２‐５の単回投与後に、ｄｓＲＮＡはラット肝第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベルを少なくとも４０％、６０％、８０％、又は９０％低減し得る。一実施形態ではｄｓＲＮＡは、例えば、本明細書に記載される検定による測定において蛋白質レベルの類似した減少をもたらす。別の実施形態では、第ＶＩＩ因子標的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）を製剤化した９８Ｎｌ２‐５の単回注入は、例えば、本明細書に記載される検定による測定において１、２、３又は４週間以上サイレンシングを媒介し得る。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩ因子介在性障害の治療、予防又は管理方法を、そのような治療、予防又は管理を必要とする患者への本発明で特徴とされる１つ又は複数のｄｓＲＮＡの治療的又は予防的有効量の投与によって提供する。
【００１８】
一実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡはウイルス性出血性発熱などの出血性発熱の治療に使用し得る。そのような発熱はフィロウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、又はフラビリダ科のウイルスなどのウイルスによって惹起され得る。例えば、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡはフィロウイルス科のウイルス、例えば、エボラ又はマールブルグウイルス、又はアレナウイルス科のウイルス、例えば、ラッサウイルスによって惹起される出血性発熱の治療に使用し得る。
【００１９】
別の実施形態では、本明細書で特徴とされるＦＶＩＩｄｓＲＮＡは出血性発熱に惹起される可能性のあるもののような、凝固因子異常又は炎症反応の治療に使用される。
【００２０】
別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡは血栓性障害、例えば、動脈硬化性プラークの破裂によって生じる可能性のある局所血栓などの治療に使用し得る。別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡ投与は急性心筋梗塞又は不安定狭心症の治療又は予防に使用される。ＦＶＩＩｄｓＲＮＡは閉塞性冠動脈内血栓治療にも使用し得る。別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡは深部静脈血栓症の治療又は予防のために投与される。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡは、例えば、癌患者における静脈血栓塞栓症の治療又は予防のために投与される。
【００２１】
別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡを患者に投与し、１、２、３、又は４週間後、患者は、例えば、血液中若しくは尿中、又は肝臓など特定組織内のＦＶＩＩｍＲＮＡレベルを測定するために試験される。ＦＶＩＩｍＲＮＡレベルが予め設定したレベルを超えると測定された場合、患者にＦＶＩＩｄｓＲＮＡをもう一度投与する。ＦＶＩＩｍＲＮＡレベルが予め設定したレベル未満と測定された場合は、患者にＦＶＩＩｄｓＲＮＡをもう一度投与することはない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡは増殖性障害、例えば、卵巣癌、乳癌、頭頚部癌、前立腺癌、結腸直腸癌又は肺癌などの癌の治療のために投与される。
【００２２】
単回投与が長期間のサイレンシングを提供し得ることが発見されている。したがって、別の実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡの１回用量が患者に投与され、該用量は第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ又は蛋白質が、少なくとも治療後５、１０、又は１５日間、治療前レベル（又は未治療時に見られるであろうレベル）の２０％以下、少なくとも治療後５、１０、又は１５日間、治療前レベル（又は未治療時に見られるであろうレベル）の４０％以下、少なくとも治療後５、１０、１５、又は２０日間、治療前レベル（又は未治療時に見られるレベル）の６０％以下、少なくとも治療後５、１０、１５、２０、又は２５日間、治療前レベル（又は未治療時に見られるであろうレベル）の８０％以下となるのに十分な用量である。
【００２３】
一実施形態では、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡを１回用量投与し、初回投与又はコース投与終了後少なくとも５、１０、１５、２０、又は２５日間はＦＶＩＩｄｓＲＮＡの追加用量を投与しない。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡの１つの少なくとも一本鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される調節配列を含む、細胞内第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害するベクターを提供する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は細胞内第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害するベクターを含む細胞を提供する。該ベクターとしては本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡの１つの少なくとも一本鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結される調節配列が挙げられる。
【００２６】
【表１】
【００２７】
「ｓ」はホスホロチオエート連結を示す。２’‐Ｏ‐Ｍｅ修飾ヌクレオチドは小文字で示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
Ｎは任意のヌクレオチド（Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｔ）を指す。
【００３１】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を本明細書で下に説明する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は本明細書及び図面から、並びに請求項から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＦＶＩＩｓｉＲＮＡ投与後の肝ＦＶＩＩｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。
【図２】ＦＶＩＩｓｉＲＮＡ投与後の血清ＦＶＩＩ蛋白質レベルを示す棒グラフである。
【図３】ＦＶＩＩｓｉＲＮＡ投与後のプロトロンビン時間を示す棒グラフである。
【図４】リポソーム的に製剤化したＦＶＩＩｄｓＲＮＡによる処理後のマウス肝細胞内ＦＶＩＩ蛋白質レベルを示す棒グラフである。リポソーム的に製剤化したルシフェラーゼｄｓＲＮＡを陰性対照として使用した。
【図５】エボラに感染し、ＦＶＩＩｄｓＲＮＡで処理したマウスの生存レベルを示すグラフである。陰性対照は未処理マウス及びルシフェラーゼｄｓＲＮＡで処理したマウスを含んだ。
【図６】０時点でＬＮＰ０ｌ‐ｓｉＦＶＩＩを５ｍｇ／ｋｇ単回ボーラス静脈注射で処理したＣ５７ＢＬ／６系マウスにおける第ＶＩＩ因子蛋白質レベルの経時変化を示すグラフである。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０００１３１．３（３１４１ｂｐ）（２００７年１１月１８日付のＧｅｎＢａｎｋ記録）のヒトＦＶＩＩ転写変異体のｍＲＮＡ配列を示す。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿０１９６１６．２（３１４１ｂｐ）（２００７年１１月１８日付のＧｅｎＢａｎｋ記録）のヒトＦＶＩＩ転写変異体のｍＲＮＡ配列を示す。
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１０８０１３６．１（２４２４ｂｐ）（２００７年１月１３日付のＧｅｎＢａｎｋ記録）のアカゲザルＦＶＩＩ転写変異体のｍＲＮＡ配列を示す。
【図１０】ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｄ２１２１２．１（４７８ｂｐ）（２００６年１２月２７日付のＧｅｎＢａｎｋ記録）のアカゲザルＦＶＩＩの部分的ｃｄｓ配列を示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＥＮＳＥＭＢＬＥ寄託番号ＥＭＳＭＭＵＴ０００００００１４７７（１３８９ｂｐ）のアカゲザルＦＶＩＩ配列を示す。
【図１２】ＥＮＳＥＭＢＬＥ寄託番号ＥＭＳＭＭＵＴ００００００４２９９７（１３２６ｂｐ）のアカゲザルＦＶＩＩ配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、並びにｄｓＲＮＡを使用して細胞又は哺乳類内第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害するための組成物及び方法を提供する。本発明は、ｄｓＲＮＡを使用して第ＶＩＩ因子遺伝子発現により惹起された哺乳類の病状及び疾患の治療のための組成物並びに方法も提供する。ｄｓＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られたプロセスを通してｍＲＮＡの配列特異的分解を指令する。該プロセスは哺乳類及び他の脊椎動物を含む多種多様の生物において生じる。
【００３４】
本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは、長さ３０ヌクレオチド未満、通常、長さ１９〜２４ヌクレオチドの領域を有するＲＮＡ（アンチセンス鎖）を含み、第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に実質的に又は完全に相補的である。これらｄｓＲＮＡの使用は、哺乳類の血栓症に関係しているとみなされる遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。細胞ベース及び動物の検定を使用して、本発明者らは、これらｄｓＲＮＡは超低用量でＲＮＡｉを特異的且つ効果的に媒介し得て、第ＶＩＩ因子遺伝子発現を有意に阻害することを示してきている。したがって、本発明で特徴とされる方法及び組成物には血栓性障害治療に有用なｄｓＲＮＡが含まれる。
【００３５】
下記の詳細な説明は標的第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害するｄｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡを含む組成物の作製及び使用方法、並びに血栓性障害などの第ＶＩＩ因子発現に惹起される疾患及び障害を治療する組成物及び方法を開示する。本発明で特徴とされる医薬組成物は、製薬上許容可能な担体と共に、長さ３０ヌクレオチド未満、通常、長さ１９〜２４ヌクレオチドで、第ＶＩＩ因子遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に実質的に相補的な相補性領域を有するアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを含む。
【００３６】
したがって、本発明のある態様では、製薬上許容可能な担体と共にＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡを含む医薬組成物、第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害する組成物の使用方法、及び第ＶＩＩ因子遺伝子発現に惹起される疾患を治療する医薬組成物の使用方法を提供する。
【００３７】
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の請求項で使用されるある用語及び語句の意味を下に提供する。本明細書の他の箇所における用語の使用法と本項で提供するその定義との間に明らかな矛盾があった場合、本項の定義が優先されるものとする。
【００３８】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｕ」は通常、塩基として各々グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という用語は、下に詳述する通り、修飾ヌクレオチド、又は代用置換部分も示し得ることが理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えずに他の部分と置換してよいことをよく理解している。例えば、イノシンをその塩基として含むヌクレオチドは、制限なく、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対となってよい。したがって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明で特徴とされるヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換してよい。別の例では、標的ｍＲＮＡと塩基対合するＧ‐Ｕゆらぎを形成するためにオリゴヌクレオチドの任意の箇所のアデニン及びシトシンを各々グアニン及びウラシルと置換し得る。そのような置換部分を含む配列は本発明で特徴とされる実施形態である。
【００３９】
本明細書で使用される「第ＶＩＩ因子」とは、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、又はポリペプチドを意味する。「第ＶＩＩ因子」という用語は、当分野でＡＩ１３２６２０、Ｃｆ７、凝固第ＶＩＩ因子前駆体、凝固第ＶＩＩ因子、ＦＶＩＩ、血清プロトロンビン転化促進剤、ＦＶＩＩ凝固蛋白質、及びエプタコグアルファとしても知られている。
【００４０】
本明細書においては、「標的配列」とは、一次転写産物のＲＮＡプロセシング産物であるｍＲＮＡを含む、第ＶＩＩ因子遺伝子の転写中に形成されたｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の隣接部を意味する。
【００４１】
本明細書においては、「配列が含まれる鎖」という用語は、標準的ヌクレオチド命名法を使用して示した配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを示す。
【００４２】
本明細書においては、別に示されない限り、「相補的な」という用語は、ヌクレオチド対に関して使用される場合、伝統的なワトソン‐クリック対、すなわち、ＧＣ、ＡＴ、又はＡＵを意味する。それはまたヌクレオチドの一方又は両方が本明細書に記載されるように、例えば、リボース修飾又はリン酸骨格修飾により修飾されている伝統的なワトソン‐クリック対合にまで及ぶ。それは実質的に塩基対合特性を変えないイノシン又は他の構成要素との対合も含み得る。
【００４３】
当業者に理解されるように、本明細書においては、別に示されない限り、「相補的な」という用語は、第二ヌクレオチド配列との関連で第一ヌクレオチド配列について記載するために使用するとき、第二ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと、ある条件下において、第一ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドがハイブリダイズし二重鎖構造を形成する能力を示す。相補性とは、生理的条件下、例えば、生物内に発生する可能性のある生理的に関連した条件下のハイブリダイゼーションを可能とする完全相補性、実質的相補性、及び十分な相補性を含み得る。完全な相補性とは、上記に定義した個々の対について、第一及び第二配列の対全てにおける相補性を指す。本明細書の第二配列に関して配列が「実質的に相補的な」とき、２つの配列は完全に相補的となり得るか、又はそれらはそれらの最終適用に最も関連する条件下においてハイブリダイズ能力を保持しつつ、ハイブリダイゼーション時に１つ以上の、しかし通常は４、３又は２つ以下のミスマッチ塩基対を形成してよい。実質的な相補性は緊縮条件下のハイブリダイゼーションとしても定義し得、緊縮条件とは：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間、そしてそれに続く洗浄を含み得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終適用にしたがって２つの配列の相補性を試験する上で最も適切な条件設定を決定することができる。
【００４４】
しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション時に１つ又は複数の単鎖突出部を形成するように設計されている場合、そのような突出部は相補性の決定に関してミスマッチとみなされない。例えば、長さ２１ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド及び長さ２３ヌクレオチドの別のオリゴヌクレオチドを含み、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡも、本明細書の目的のために「完全に相補的」と呼び得る。
【００４５】
「相補的」配列は、本明細書において使用するときは、ハイブリダイズ能力に関する上記の要件を満たす限り、非ワトソン‐クリック塩基対並びに／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含んでもよく、又はそれから全体が形成されてもよい。そのような非ワトソン‐クリック塩基対は、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対又はＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対合を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
「相補的な」、「完全に相補的な」、「実質的に相補的な」、及び生理的条件下、例えば、生物内に発生する可能性がある生理的関連条件下においてハイブリダイゼーションを可能とするのに十分な相補性という用語は、それらの使用において理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の間、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列の間でマッチする塩基に関して本明細書で使用してよい。
【００４７】
本明細書において使用するとき、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に「相補的、例えば、実質的に少なくとも一部相補的な」ポリヌクレオチドとは、対象のｍＲＮＡ隣接部（例えば、コード第ＶＩＩ因子）に対して相補的な、例えば、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、該配列が第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの途切れのない部分に実質的に相補的な場合、第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。
【００４８】
「二本鎖ＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ」という用語は、本明細書において使用される場合、上に定義される２つの逆平行及び実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子、又はリボ核酸分子複合体を示す。二重鎖構造を形成する二本の鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分でよく、又は別々のＲＮＡ分子でもよい。二本の鎖が１つのより大きな分子の一部であり、したがって片方の鎖の３’末端と二重鎖構造を形成する他方の鎖の５’末端との間が一続きのヌクレオチド鎖によって連結している場合、連結したＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。二本の鎖が、片方の鎖の３’末端と二重鎖構造を形成する他方の鎖の５’末端との間の一続きのヌクレオチド鎖ではない方法によって共有連結している場合、該連結構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は同数又は異なる数のヌクレオチドを有してよい。塩基対の最大数はｄｓＲＮＡの短い方の鎖におけるヌクレオチド数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは１つ又は複数のヌクレオチド突出部を含んでよい。本明細書で使用されるｄｓＲＮＡは「低分子阻害性ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「ｉＲＮＡ剤」又は「ＲＮＡｉ剤」とも称される。
【００４９】
本明細書において使用するとき、「ヌクレオチド突出部」とはｄｓＲＮＡの片方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を超えて伸びる、又はその逆のときにｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突き出す１つ又は複数の不対ヌクレオチドのことを指す。「平滑」又は「平滑末端」とは該ｄｓＲＮＡ末端に不対ヌクレオチドを有さないこと、すなわち、ヌクレオチドの突出部を有さないことを意味する。「平滑末端」ｄｓＲＮＡとはその長さ全体において二本鎖である、すなわち、該分子のいずれの末端にもヌクレオチドの突出部を有さないｄｓＲＮＡのことである。
【００５０】
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖を指す。本明細書において使用するとき、「相補性領域」という用語は、ある配列、例えば本明細書で定義されるような標的配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列に対し完全に相補的ではない場合、ミスマッチは末端領域内が最も忍容され、存在すれぱ通常、末端領域又は、例えば、５’及び／若しくは３’末端の６、５、４、３、若しくは２ヌクレオチド以内の領域内である。
【００５１】
本明細書で使用される「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡ鎖を指す。
【００５２】
「同一性」という用語は、２ポリヌクレオチド以上の配列同士を比較して決定される、該配列間の関係性である。同一性とはそのような配列ストリング間の適合性によって決定されるポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定する多くの方法が存在するが、該用語は当業者に周知である（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８７）、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ．， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）を参照のこと）。本明細書で使用される「実質的に同一」とは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖と標的遺伝子の対応部分との間の相同度が非常に高いこと（例えば、１００％の配列同一性）を意味する。しかしながら、９０％より高い、又は９５％より高い配列同一性を有するｄｓＲＮＡを本発明に使用してよく、したがって遺伝子変異、菌株多型性、又は進化の多様性による予測可能な配列変異は忍容し得る。ｄｓＲＮＡは典型的には標的ＲＮＡに対して１００％相補的であるが、いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡはＲＮＡと標的遺伝子との間に単数又は複数の塩基対のランダムなミスマッチを含んでよい。
【００５３】
本明細書において使用される「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定的な核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰとは、ｉＲＮＡ剤又はｉＲＮＡ剤が転写されるプラスミドなどの核酸を含む還元された水性内部をコーティングする脂質小胞を表す。ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開第２００６０２４００９３号、第２００７０１３５３７２号、及び２００８年４月１５日に出願された米国特許出願第６１／０４５，２２８号に記載されている。これらの出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５４】
「細胞内導入」とは、ｄｓＲＮＡを指す場合、当業者に理解される、細胞内への取り込み又は吸収の促進を意味する。ｄｓＲＮＡの吸収又は取り込みは自発的拡散性又は能動的細胞プロセスを通して、又は助剤若しくはデバイスによって生じ得る。本用語の意味はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞に限定されない。ｄｓＲＮＡは細胞が生命体の一部であるとき「細胞内導入」してもよい。そのような場合、細胞内導入は生物への送達が含まれる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ送達において、ｄｓＲＮＡは組織部位内へ注入、又は全身投与し得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞内導入には、電気穿孔法及びリポフェクチン法など当分野で知られている方法が含まれる。
【００５５】
「サイレンス」及び「発現阻害」という用語は、それらが第ＶＩＩ因子遺伝子を指す限り、本明細書では、第一細胞又は細胞群と実質的に同一だがそのように処理されていない（対照細胞）第二細胞又は細胞群と比較したときの、第ＶＩＩ因子遺伝子が転写され、第ＶＩＩ遺伝子発現が阻害されるように処理されている第一細胞又は細胞群から単離され得るｍＲＮＡ量の低減によって示される、第ＶＩＩ因子遺伝子発現の少なくとも部分的な抑制を示す。阻害度は通常、
［（対照細胞内のｍＲＮＡ）−（処理した細胞内のｍＲＮＡ）］／（対照細胞内のｍＲＮＡ）×１００％
と表される。
【００５６】
あるいは、阻害度は、第ＶＩＩ因子遺伝子転写に機能的に関連づけられるパラメーター、例えば細胞から分泌される第ＶＩＩ因子遺伝子にコードされる蛋白質量、又はある表現型、例えばアポトーシスを示す細胞の数の減少を単位として与えられ得る。原則上、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングは、構成的に又はゲノム工学のいずれかによって標的を発現している任意の細胞において、及び任意の適切な検定によって決定してよい。しかしながら、所与のｓｉＲＮＡが第ＶＩＩ因子遺伝子発現をある程度阻害し、したがって本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要な場合、下記の実施例にて提供する検定はそのような参照の役割を果たすものとする。
【００５７】
例えば、ある例では、本発明で特徴とされる二本鎖オリゴヌクレオチド投与によって第ＶＩＩ因子遺伝子発現は少なくとも約２０％、２５％、３５％、４０％又は５０％抑制される。いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって第ＶＩＩ因子遺伝子は少なくとも約６０％、７０％、又は８０％抑制される。他の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって第ＶＩＩ因子遺伝子は少なくとも約８５％、９０％、又は９５％抑制される。
【００５８】
「治療（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、ウイルス性出血性発熱などの疾患又は障害の緩和（ｒｅｌｉｅｆ）又は軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）を指す。本発明において、本明細書の下記に記載される任意の他の状態（例えば、血栓性障害以外の第ＶＩＩ因子介在性状態）に関連する範囲で、「治療（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、そのような状態に関連した少なくとも１つの症状を緩和（ｒｅｌｉｅｖｅ）又は軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）すること、又はそのような状態の進行を減退若しくは逆行させることを意味する。
【００５９】
本明細書においては、「第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患」という用語並びに関連用語及び語句は、不適切、例えば、正常より高い、第ＶＩＩ因子活性を特徴とする状態又は障害を指す。不適切な第ＶＩＩ因子機能活性は正常時に第ＶＩＩ因子を発現しない細胞内での第ＶＩＩ因子発現、又は第ＶＩＩ因子発現増加（例えば、ウイルス性出血性発熱、又は血栓の症状に至る）の結果として生じる可能性がある。第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患には不適切な第ＶＩＩ因子の機能活性が完全に又は部分的に介在する可能性がある。しかしながら、第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患は、第ＶＩＩ因子調整が基礎疾患又は障害に対するいくらかの効果をもたらすものである（例えば、第ＶＩＩ因子阻害剤は少なくともいくらかの患者において患者の健康のいくらかの改善をもたらす）。
【００６０】
「出血性発熱」としてはウイルス感染に惹起される疾患（ｉｌｌｎｅｓｓ）の組み合わせが挙げられる。発熱及び胃腸症状は典型的には毛細管出血を続発する。
【００６１】
「凝固因子異常」とは対象の血液凝固機序における任意の欠陥である。
【００６２】
本明細書においては、「血栓性障害」とは好ましからぬ血液凝固を特徴とする任意の障害である。
【００６３】
本明細書においては、「治療的有効量」及び「予防的有効量」という語句はウイルス性出血性発熱、又はそのような障害、例えば、出血、発熱、衰弱、筋肉痛、頭痛、炎症、若しくは循環性ショックの明白な症状の治療、予防、又は管理における治療的利益を提供する量を指す。具体的な治療的有効量は一般の医師が容易に決定し得て、当分野で知られている要因、例えば血栓性障害タイプ、患者の既往歴及び年齢、疾患段階、並びに他剤投与などによって変わる可能性がある。
【００６４】
本明細書において使用するとき、「医薬組成物」には薬理学的有効量のｄｓＲＮＡ及び製薬上許容可能な担体が含まれる。本明細書において使用するとき、「薬理学的有効量」、「治療的有効量」又は単に「有効量」とは意図した薬理学的、治療的又は予防的結果を得る上で有効なＲＮＡ量を指す。例えば、疾患又は障害に関連した測定可能なパラメーターが少なくとも２５％減少したときに、与えられた臨床治療が有効とみなされる場合、該疾患又は障害の治療のための薬物の治療的有効量は、該パラメーターの少なくとも２５％の減少をもたらすために要される量である。
【００６５】
「製薬上許容可能な担体」という用語は、治療剤投与のための担体を指す。そのような担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。該用語は細胞培養用培地を明確に除外する。薬物経口投与用の製薬上許容可能な担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑剤、甘味剤、香味料、着色剤及び保存料などの製薬上許容可能な賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。トウモロコシ澱粉及びアルギン酸が適切な崩壊剤である一方、適切な不活性希釈剤としては炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム、並びにラクトースが挙げられる。滑剤は、存在する場合、通常マグネシウムステアレート、ステアリン酸又はタルクである一方、結合剤は澱粉及びゼラチンを含んでよい。所望の場合、錠剤は胃腸管内吸収を遅延化するためにグリセリンモノステアレート又はグリセリルジステアレートなどの材料でコーティングしてよい。
【００６６】
本明細書において使用するとき、「形質転換細胞」とはｄｓＲＮＡ分子が発現する可能性があるベクターを導入した細胞である。
【００６７】
ＩＩ． 二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
一実施形態では、本発明は細胞内又は哺乳類内において第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。該ｄｓＲＮＡには、第ＶＩＩ因子遺伝子発現で形成されたｍＲＮＡの対応領域に相補的であり、長さ３０ヌクレオチド未満であり、通常、長さ１９〜２４ヌクレオチドである相補性領域を含むアンチセンス鎖が含まれる。一実施形態ではｄｓＲＮＡは、前記ＶＩＩ因子遺伝子発現細胞との接触時、前記ＶＩＩ因子遺伝子発現を、例えば、細胞ベースの検定において、少なくとも２５％、例えば、少なくとも４０％阻害する。ｄｓＲＮＡには二重鎖構造を形成するハイブリダイズに十分相補的な２本のＲＮＡ鎖が含まれる。センス鎖には、適切な条件下で結合した場合、二本鎖がハイブリダイズして二重鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的な領域が含まれる。一般的に、二重鎖構造は１５〜３０、より通常では１８〜２５、さらにより通常では１９〜２４、及び最も通常では２１〜２３塩基対の長さである。同様に、標的配列への相補性領域は１５〜３０、より通常では１８〜２５、さらにより通常では１９〜２４、及び最も通常では２１〜２３ヌクレオチドの長さである。ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡはさらに１つ又は複数の単鎖ヌクレオチド突出部を含んでよい。ｄｓＲＮＡは当分野で知られている標準方法によって、以下で詳細に考察するように、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．から市販されている自動ＤＮＡ合成装置の使用などによって合成し得る。一実施形態では、第ＶＩＩ因子遺伝子はヒト第ＶＩＩ因子遺伝子である。特定の実施形態では、第一配列は表１、２、及び３のセンス配列からなる群から選択され、第二配列は表１、２、及び３のアンチセンス配列からなる群から選択される。一実施形態では、切断は表１、２、及び３のｄｓＲＮＡの切断部位の６、５、４、３、２又は１ヌクレオチド以内である。
【００６８】
さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡには表１、２、及び３に提示される配列の群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列が含まれる。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡには、本群から選択される少なくとも２つの配列であり、少なくとも２つの配列の片方は少なくとも２つの配列の他方に相補的であって、少なくとも２つの配列の片方は第ＶＩＩ因子遺伝子発現で発生するｍＲＮＡ配列に実質的に相補的であるｄｓＲＮＡが含まれる。一般的に、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含み、第一のオリゴヌクレオチドは表１、２、又は３に記載されるセンス鎖であり、第二のオリゴヌクレオチドは表１、２、又は３に記載されるアンチセンス鎖である。
【００６９】
当業者は、２０〜２３、厳密には２１塩基対の二重鎖構造を含むｄｓＲＮＡがＲＮＡ干渉の誘発に特に有効であることが確認されてきていることをよく理解している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ ２００１， ２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、他の者はより短い又はより長いｄｓＲＮＡも同様に有効であり得ることを見出している。上記の実施形態では、表１、２、及び３に提示したオリゴヌクレオチド配列の性質の故に、本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは最小２１ｎｔの長さの少なくとも一本の鎖を含み得る。一方又は両方の末端上のほんの数ヌクレオチドを差し引いた、表１、２又は３の配列の１つを含むより短いｄｓＲＮＡは、上記のｄｓＲＮＡと比較して同様に有効な可能性があることを合理的に期待し得る。したがって、表１、２、又は３の配列の１つの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれより多い隣接ヌクレオチドの部分配列を含み、第ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害能力が、本明細書で下で記載されるＦＡＣＳ検定において、完全配列を含むｄｓＲＮＡから５、１０、１５、２０、２５、又は３０％より多く阻害能力が異なることはない、ｄｓＲＮＡが本発明によって企図される。
【００７０】
加えて、表１、２、及び３に提示したｄｓＲＮＡはＲＮＡｉベース切断感受性の第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡにおける選択部位を特定する。したがって、本発明は、本発明の製剤の１つによって標的とされる配列内を標的とするｄｓＲＮＡをさらに含む。本明細書において使用するとき、第二ｄｓＲＮＡが第一ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡ内の任意の箇所のメッセージを切断する場合、第二ｄｓＲＮＡは第一ｄｓＲＮＡ配列内を標的とすると言われる。そのような第二剤は通常、表１、２、又は３に示し、第ＶＩＩ因子遺伝子において選択された配列の隣接領域から取られた追加のヌクレオチド配列に連結した配列の１つの少なくとも１５隣接ヌクレオチドからなる。
【００７１】
本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは標的配列に対する１つ又は複数のミスマッチを含み得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは３より多くのミスマッチを含まない。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチ部分は典型的には相補性領域中心に位置しない。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチは典型的にはいずれかの末端から５ヌクレオチド、例えば相補性領域の５’又は３’末端のいずれかから５、４、３、２、又は１ヌクレオチドに制限される。例えば、第ＶＩＩ因子遺伝子領域に相補的な２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖では、ｄｓＲＮＡは通常、中心部１３ヌクレオチド内にミスマッチを全く含まない。本明細書に記載する方法は、標的配列に対するミスマッチを含むｄｓＲＮＡが、第ＶＩＩ因子遺伝子発現阻害において有効であるかどうか決定するために使用し得る。ミスマッチを伴うｄｓＲＮＡの第ＶＩＩ因子遺伝子発現阻害における有効性の考察は、特に第ＶＩＩ因子遺伝子内の特定の相補性領域が集団内に多形性配列変異を有することが知られている場合に重要である。
【００７２】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端に、１〜４、通常１又は２ヌクレオチドの単鎖ヌクレオチド突出部がある。少なくとも１つのヌクレオチド突出部を有するｄｓＲＮＡは平滑末端対応物よりも優れた阻害特性を期せずして有する。さらに、本発明者らは、１ヌクレオチド突出部のみの存在がｄｓＲＮＡの干渉作用を、その全体の安定性に影響を与えずに強化することを見出した。１つの突出部のみを有するｄｓＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏ、並びに様々な細胞、細胞培養用培地、血液、及び血清で特に安定且つ有効であることが証明された。一般的に、単鎖突出部はアンチセンス鎖の３’末端、あるいは、センス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡは通常、アンチセンス鎖の５’末端に位置する平滑末端を有していてもよい。そのようなｄｓＲＮＡは改善された安定性及び阻害作用を有し、したがって低用量、すなわち、５ｍｇ／レシピエントの体重１ｋｇ／日未満での投与が可能である。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖はセンス鎖の各３’末端及び５’末端に１〜１０ヌクレオチド突出部を有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖はアンチセンス鎖の各３’末端及び５’末端に１〜１０ヌクレオチド突出部を有する。別の実施形態では、突出部内の１ヌクレオチド以上がヌクレオシドチオホスフェートと置換される。
【００７３】
さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは安定性を高めるため化学的に修飾されている。例えば、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡの核酸は、参照することにより本明細書に組み込まれる“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”， Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｒｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ＵＳＡに記載されるような当分野にてよく確立された方法によって合成及び／又は修飾してよい。ｄｓＲＮＡ化合物の具体例としては、修飾骨格を含む又は天然ヌクレオシド間結合を含まないｄｓＲＮＡが挙げられる。本明細書に定義される通り、修飾した骨格を有するｄｓＲＮＡには、骨格内にリン原子を有し続けるｄｓＲＮＡも骨格内にリン原子を有さないｄｓＲＮＡも含まれる。本明細書の目的のため、及び当分野においてときどき参照されるように、それらのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾ｄｓＲＮＡはオリゴヌクレオシドともみなし得る。
【００７４】
代表的な修飾ｄｓＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート並びに３’‐アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、並びに正常な３’‐５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’‐５’結合アナログ、並びにヌクレオシド単位の隣接対が３’‐５’から５’‐３’へ又は２’‐５’から５’‐２’へ結合した逆極性を持つものが挙げられる。種々の塩、混合塩、及び遊離酸の形態も含まれる。
【００７５】
上記のリン含有連結調製を説明している代表的な米国特許は、各々が、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、及び第５，６２５，０５０号が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
リン原子を含まない、代表的な修飾ｄｓＲＮＡの骨格は、短鎖アルキル若しくは短鎖シクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、並びにＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成成分が混合された部分を有する他の骨格が含まれる。
【００７７】
上記のオリゴヌクレオシド調製を説明している代表的な米国特許は、各々が、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、及び第５，６７７，４３９号を含むが、これらに限定されない。
【００７８】
他の代表的なｄｓＲＮＡ模倣物では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合、すなわち骨格の両方が新規な基と置換される。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーション用に維持されている。そのようなオリゴマー化合物の１つであり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されてきているｄｓＲＮＡ模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ｄｓＲＮＡの糖骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接に又は間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を説明している代表的な米国特許は、各々が、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；及び第５，７１９，２６２号を含むが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物に関するさらなる説明はＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５４， １４９７−１５００に見出され得る。
【００７９】
代表的な実施形態では、ｄｓＲＮＡはヘテロ原子骨格、特に上記に参照した米国特許第５，４８９，６７７号の‐ＣＨ２‐ＮＨ‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２‐Ｎ（ＣＨ３）‐Ｏ‐ＣＨ２‐［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている］、‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｎ（ＣＨ３）‐ＣＨ２‐、‐ＣＨ２‐Ｎ（ＣＨ３）‐Ｎ（ＣＨ３）‐ＣＨ２‐及び‐Ｎ（ＣＨ３）‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐［天然ホスホジエステル骨格は‐Ｏ‐Ｐ‐Ｏ‐ＣＨ２‐として表される］、並びに上記に参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を伴うホスホロチオエート骨格及びオリゴヌクレオシドを有する。他の実施形態では、本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは上記に参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
【００８０】
修飾ｄｓＲＮＡは１つ又は複数の置換した糖部分を含んでもよい。代表的なｄｓＲＮＡは２’位に下記の１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ‐、Ｓ‐、若しくはＮ‐アルキル；Ｏ‐、Ｓ‐、若しくはＮ‐アルケニル；Ｏ‐、Ｓ‐又はＮ‐アルキニル；又はＯ‐アルキル‐Ｏ‐アルキルであって、アルキル、アルケニル及びアルキニルは置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。代表的な修飾としてはＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中ｎ及びｍは１〜約１０である）が挙げられる。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは２’位に下記の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ‐アルカリル又はＯ‐アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポータ基、インターカレータ、ｄｓＲＮＡの薬物動態学的特性を改善するための基、又はｄｓＲＮＡの薬力学的特性を改善するための基、並びに類似した特性を有する他の置換基。一実施形態では、修飾としては２’‐メトキシエトキシ（２’‐Ｏ‐ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’‐Ｏ‐（２‐メトキシエチル）又は２’‐ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＨｅＩｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６−５０４）、すなわち、アルコキシ‐アルコキシ基が挙げられる。他の実施形態では、修飾には下記の実施例に記載されるように２’‐ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’‐ＤＭＡＯＥとしても知られる、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、、及び２’‐ジメチルアミノエトキシエトキシ（当分野で２’‐Ｏ‐ジメチルアミノエトキシエチル又は２’‐ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、下記の実施例にも記載される２’‐Ｏ‐ＣＨ２‐Ｏ‐ＣＨ２‐Ｎ（ＣＨ２）２が含まれる。
【００８１】
他の修飾には２’‐メトキシ（２’‐ＯＣＨ３）、２’‐アミノプロポキシ（２’‐ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’‐フルオロ（２’‐Ｆ）が含まれる。類似した修飾はｄｓＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の３’位又は２’‐５’位の連結したｄｓＲＮＡ及び５’末端ヌクレオチドの５’位においても行ってよい。ｄｓＲＮＡは、フラノース型五炭糖の代わりにシクロブチル部分などの糖質模倣物も有してよい。そのような修飾糖構造の調製を説明している代表的な米国特許には、本出願と共に共同保有され、且つ各々がその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号；及び第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
ｄｓＲＮＡはまた、核酸塩基（当分野において単に「塩基」と称されることが多い）に対する修飾又は置換を含んでいてもよい。本明細書において使用するとき、「修飾されていない」又は「天然の」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基には、他の合成及び天然の核酸塩基、例えば５‐メチルシトシン（５‐ｍｅ‐Ｃ）、５‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２‐アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６‐メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２‐プロピル及び他のアルキル誘導体、２‐チオウラシル、２‐チオチミン及び２‐チオシトシン、５‐ハロウラシル及びシトシン、５‐プロピニルウラシル及びシトシン、６‐アゾウラシル、シトシン及びチミン、５‐ウラシル（擬ウラシル）、４‐チオウラシル、８‐ハロ、８‐アミノ、８‐チオール、８‐チオアルキル、８‐ヒドロキシル及び他の８‐置換アデニン並びにグアニン、５‐ハロ、特に５‐ブロモ、５‐トリフルオロメチル及び他の５‐置換ウラシル並びにシトシン、７‐メチルグアニン及び７‐メチルアデニン、８‐アザグアニン及び８‐アザアデニン、７‐デアザグアニン及び７‐デアザアデニン、並びに３‐デアザグアニン及び３‐デアザアデニンが含まれる。さらに、核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８−８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｌ， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３に開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ Ｓ．， Ｃｈａｐｔｅｒ １５， ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐａｇｅｓ ２８９−３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， Ｅｄ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３に開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のいくつかは、オリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらには、５‐置換ピリミジン、６‐アザピリミジン、並びに２‐アミノプロピルアデニン、５‐プロピニルウラシル及び５‐プロピニルシトシンを含むＮ‐２、Ｎ‐６及びＯ‐６置換プリンが含まれる。５‐メチルシトシンの置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃高めることが示されてきており（Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ． Ｓ．， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ， Ｂ．， Ｅｄｓ．， ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３， ｐｐ． ２７６−２７８）、特に２’‐Ｏ‐メトキシエチル糖修飾と組み合わされたとき、典型的な塩基置換基を表す。
上記のいくつかの修飾した核酸塩基並びに 他の修飾した核酸塩基の調製を説明している代表的な米国特許は、参照することにより各々が本明細書に組み込まれる米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、及び第５，６８１，９４１号と同様に上記の米国特許第３，６８７，８０８号を含むが、これらに限定されず、米国特許第５，７５０，６９２号も含まれ、それも参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００８３】
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡの別の修飾としては、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを高める１つ以上の部分又は複合体へのｄｓＲＮＡの化学的連結が挙げられる。そのような部分は、限定するものではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｉｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９， ８６， ６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９４ ４ １０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル‐Ｓ‐トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０， ３０６−３０９； Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３， ２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０， ５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， １９９１， １０， １１１１−１１１８； Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９， ３２７−３３０； Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５， ４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロール又はトリエチル‐アンモニウム１，２‐ジ‐Ｏ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロ‐３‐Ｈ‐ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１−３６５４； Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８， ３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４， ９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１−３６５４）、パルミトイル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４， ２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ‐カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７， ９２３−９３７）である。
【００８４】
そのようなｄｓＲＮＡ複合体の調製を説明している代表的な米国特許は、参照することにより各々が本明細書に組み込まれる米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号及び第５，６８８，９４１号を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
所与の化合物は全位置均一に修飾される必要はなく、実際には１つより多くの上記の修飾のが単一化合物又はｄｓＲＮＡ内の単一ヌクレオシドすらにも取り込まれてよい。本発明はキメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も含む。「キメラ」ｄｓＲＮＡ化合物又は「キメラ」とは、本発明において、化学的に異なる領域を２つ以上含むｄｓＲＮＡ化合物、特にｄｓＲＮＡであり、各々が少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドで構成されている。これらのｄｓＲＮＡは典型的には、該ｄｓＲＮＡはｄｓＲＮＡに増大したヌクレアーゼ分解耐性、増大した細胞取り込み、及び／又は増大した標的核酸結合親和力を付与するように修飾されている少なくとも１つの領域を含む。ｄｓＲＮＡの付加的領域はＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断可能な酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、ＲＮａｓｅ ＨはＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、したがって、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによってｄｓＲＮＡによる遺伝子発現阻害の有効性を大いに高める。その結果、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと同様の結果が、キメラｄｓＲＮＡ使用時により短いｄｓＲＮＡにおいてしばしば得られる。ＲＮＡ標的の切断はゲル電気泳動及び、必要に応じて、当分野で知られている関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により日常的に検出し得る。
【００８６】
ある例では、ｄｓＲＮＡを非リガンド基によって修飾してよい。多くの非リガンド分子はｄｓＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを高めるためにｄｓＲＮＡに複合化されており、そのような複合化の実施手順は科学的文献において入手可能である。そのような非リガンド部分には、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １９９４， ４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル‐Ｓ‐トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０：３０６、 Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９１， １０：１１１、 Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９：３２７；、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２‐ジ‐Ｏ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロ‐３‐Ｈ‐ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１、 Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６：３６５１）、パルミトイル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ‐カルボニル‐オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７：９２３）などの脂質成分が含まれている。そのようなｄｓＲＮＡ複合体の調製を説明している代表的な米国特許は上に挙げた。代表的な複合体化プロトコルは、該配列の１つ又は複数の位置にアミノリンカーを有するｄｓＲＮＡ合成を含む。アミノ基は次いで適切なカップリング又は活性化試薬を使用して複合化される分子と反応する。該複合体化反応は、ｄｓＲＮＡが固体支持体に結合したまま又は溶液相内のｄｓＲＮＡ切断後のいずれかで実施してよい。ＨＰＬＣによるｄｓＲＮＡ複合体精製により典型的には純粋な複合体が得られる。コレステロール複合体の使用は、例えば、第ＶＩＩ因子発現部位である膣上皮細胞標的を高め得る。
【００８７】
ベクターによりコードされるＲＮＡｉ剤
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡはｉｎ ｖｉｖｏで細胞内にて組換えウイルスベクターからも発現し得る。例えば、組換えウイルスベクターは、ｄｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡ配列発現のための任意の適切なプロモーターをコードする配列を含み得る。適切なプロモーターとしては、例えば、Ｕ６又はＨｌ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は当分野における技術範囲である。組換えウイルスベクターは特定の組織内又は特定の細胞内環境におけるｄｓＲＮＡ発現を誘導可能な又は調節可能なプロモーターも含み得る。ｄｓＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏ細胞内に送達するための組換えウイルスベクターの使用についての詳細は、以下で考察する。
【００８８】
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡは２つの分離した相補的なＲＮＡ分子、又は２つの相補性領域を伴う単一ＲＮＡ分子のいずれかとして組換えウイルスベクターから発現し得る。
【００８９】
発現させるべきｄｓＲＮＡ分子のためのコーディング配列を受け入れ可能な任意のウイルスベクター、例えばアデノウイルス（ＡＶ）、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルスなどに由来するベクターを使用し得る。ウイルスベクターの向性は外被蛋白質又は他のウイルス由来の他の表面抗原を有するベクターをシュードタイプ化することによって、又は必要に応じて異なるウイルスカプシド蛋白質を置換することによって修飾し得る。
【００９０】
例えば、レンチウイルスベクターは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなど由来の表面蛋白質でシュードタイプ化し得る。ＡＡＶベクターは、ベクターを操作して、異なるカプシド蛋白質血清型を発現させることによって異なる細胞を標的とするようにし得る。例えば、血清２型ゲノム上の血清２型カプシド発現ＡＡＶベクターはＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター内のこの血清２型カプシド遺伝子はＡＡＶ２／５ベクターを得るために血清５型カプシド遺伝子と置換し得る。異なるカプシド蛋白質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築する技術は当分野の技術範囲である。例えば、全体の開示が参照により本明細書に組み込まれるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ． （２００２）， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照のこと。
【００９１】
本発明における使用に適切な組換えウイルスベクターの選択、ベクター内へのｄｓＲＮＡ発現のための核酸配列挿入方法、及び関心のある細胞へのウイルスベクター送達方法は当分野の技術範囲である。例えば、全体の開示が参照により本明細書に組み込まれるＤｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ （１９９５）， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ． ２： ３０１−３１０、 Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ （１９８８）， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６： ６０８−６１４、 Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ （１９９０）， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ． １： ５−１４、 Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ （１９９８）， Ｎａｔｕｒｅ ３９２： ２５−３０、 ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ３３： ４０１−４０６を参照のこと。
【００９２】
代表的なウイルスベクターはＡＶ及びＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡは例えば、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡプロモーター、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを含む組換えＡＡＶベクター由来の２つの別々の、相補的な単鎖ＲＮＡ分子として発現される。
【００９３】
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法、及び標的細胞内へのベクター送達方法はＸｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ． （２００２）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２０： １００６−１０１０にて記載されている。
【００９４】
ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡを発現するための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法、及び標的細胞内へのベクター送達方法は、全体の開示が参照することにより本明細書に組み込まれるＳａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７）， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１： ３０９６−３１０１、 Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９９６）， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ７０： ５２０−５３２、 Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９）， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３： ３８２２−３８２６、米国特許第５，２５２，４７９号、米国特許第５，１３９，９４１号、国際公開特許第９４／１３７８８号、及び国際公開特許第９３／２４６４１号にて記載されている。
【００９５】
ＩＩＩ． ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物
一実施形態では、本発明は本明細書に記載のｄｓＲＮＡ、及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は第ＶＩＩ因子発現が介在した病的プロセスなど、第ＶＩＩ因子遺伝子の発現又は活性に関連した疾患又は障害の治療に有用である。そのような医薬組成物は送達様式に基づき製剤化される。一例は非経口送達を介した全身投与用に製剤化した組成物である。
【００９６】
本発明で特徴とされる医薬組成物は第ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害に十分な量を投与する。本発明者らは、それらの改善された有効性のため、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を驚異的な低用量で投与し得ることを見出した。最大投与量でレシピエントの体重１ｋｇ、一日あたり５ｍｇ ｄｓＲＮＡ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ）が、第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害又は完全に抑制するのに十分である。
【００９７】
一般に、ｄｓＲＮＡの適切用量は、レシピエントの体重１ｋｇ、一日あたり０．０１〜５．０ｍｇの範囲、通常、体重１ｋｇ、一日あたり１μｇ〜１ｍｇの範囲となる。医薬組成物は１日１回投与してよく、又はｄｓＲＮＡは２、３、若しくはそれより多いサブ用量を１日を通して適切な間隔で、又は制御した放出性製剤を通した持続注入若しくは送達を使用しても投与してよい。その場合、各サブ用量に含まれるｄｓＲＮＡは総１日投与量に到達するため相応に、より少量でなければならない。用量単位は、例えば、数日間持続してｄｓＲＮＡ放出を提供する従来の持続した放出性製剤を使用して数日間に渡って送達するように調合し得る。持続放出性製剤は当分野で周知であり、例えば本発明の製剤と使用し得る製剤の膣内送達に特に有用である。本実施形態では、用量単位には対応する複数日の用量が含まれる。
【００９８】
疾患又は障害の重症度、以前の治療、対象の全般的な健康状態及び／又は年齢、並びに他の疾患症状が含まれるがこれらに限定されない、いくつかの因子が対象を有効に治療するために要求される投与量及びタイミングに影響を与える可能性があることは、当業者に理解される。さらに、組成物の治療的有効量を用いた対象の治療は単回治療又は一連の治療を含み得る。本発明に含まれる個々のｄｓＲＮＡのための有効な投与量及びｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、従来の方法を使用して、又は本明細書の他の箇所に記載の適切な動物モデルを使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて推定し得る。
【００９９】
マウス遺伝学の進歩は、第ＶＩＩ因子発現の介在する病的プロセスなど様々なヒト疾患研究のための多くのマウスモデルを生み出した。そのようなモデルは、ｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ試験、及び治療的有効量の決定のために使用される。
【０１００】
本発明はＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡ化合物を含む医薬組成物及び製剤も含む。医薬組成物は多くの方法で投与してよく、該方法は局所又は全身治療のいずれが望ましいかによって、且つ治療部位によって決まる。投与は局所、肺、例えば、吸入又は噴霧器などによる粉剤若しくはエアロゾル吹送によって；気管内、鼻内、表皮及び経皮、経口又は非経口によって行ってよい。投与は、例えば関節内への直接的な関節内注入、胃腸管への直接的な送達のための直腸投与、子宮内及び膣内への送達のための膣内投与、眼内送達のための硝子体内投与による局所送達を介して特定の組織へ優先的に局在するようにも設計してよい。非経口投与としては静脈内、動脈内、関節内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又は注入；又は頭蓋内、例えば、髄腔内又は脳室内の投与が挙げられる。
【０１０１】
局所投与用の医薬組成物及び医薬製剤には、経皮パッチ剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤及び粉剤を含んでよい。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性の基材、増粘剤などが必要又は望ましい場合がある。コーティングを施したコンドーム、グローブなども有用な場合がある。局所製剤としては、ｄｓＲＮＡが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤及び界面活性剤のような局所送達剤と混合されているものが挙げられる。代表的な脂質及びリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））及びカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が挙げられる。ｄｓＲＮＡはリポソーム中に封入されてもよいし、又はリポソームとの、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成してもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質との複合体としてもよい。代表的な脂肪酸及びエステルとしては、限定するものではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１‐モノカプレート、１‐ドデシルアザシクロヘプタン‐２‐オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１‐１０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリステート（ＩＰＭ））、モノグリセリド、ジグリセリド、又は製薬上許容可能なこれらの塩が挙げられる。局所製剤については、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる１９９９年５月２０日出願の米国特許出願第０９／３１５，２９８号明細書に詳細に記載されている。
【０１０２】
一実施形態では、本発明で特徴とされるＦＶＩＩｄｓＲＮＡは、（例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、又は他の核酸‐脂質粒子を形成するため）脂質製剤内に完全に封入されている。本明細書において使用するとき、「ＳＮＡＬＰ」という用語はＳＰＬＰを含む安定した核酸‐脂質粒子を指す。本明細書において使用するとき、「ＳＰＬＰ」という用語は脂質小胞内に封入したプラスミドＤＮＡを含む核酸‐脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは典型的には、粒子の集合（例えば、ＰＥＧ‐脂質複合体）を予防するカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び脂質を含む。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に延長された循環期間を示し、遠位部（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身適用にとって極めて有用である。国際公開第００／０３６８３号にて説明されているように、ＳＰＬＰは「ｐＳＰＬＰ」を含み、封入された縮合剤‐核酸複合体を含む。本発明の粒子の平均直径は典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０〜約９０ｎｍであり、実質的に無毒性である。加えて、核酸は、本発明の核酸‐脂質粒子内に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解耐性を示す。核酸‐脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；第５，９８１，５０１号；第６，５３４，４８４号；第６，５８６，４１０号；第６，８１５，４３２号；及び国際公開第９６／４０９６４号にて開示されている。
【０１０３】
一実施形態では、脂質の薬物に対する比（質量／質量比）（例えば、脂質のｄｓＲＮＡに対する比）は約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、又は約６：１〜約９：１の範囲となる。
【０１０４】
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ‐ジオレイル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ‐ジステアリル‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ‐（Ｉ‐（２，３‐ジオレオイルオキシ）プロピル）‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ‐（Ｉ‐（２，３‐ジオレイルオキシ）プロピル）‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ‐ジメチル‐２，３‐ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２‐ジリノレニルオキシ‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２‐ジリノレイルカルバモイルオキシ‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ‐Ｃ‐ＤＡＰ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐３‐（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ‐ＤＡＣ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐３‐モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ‐ＭＡ）、１，２‐ジリノレオイル‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２‐ジリノレイルチオ‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ‐Ｓ‐ＤＭＡ）、１‐リノレオイル‐２‐リノレイルオキシ‐３‐ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ‐２‐ＤＭＡＰ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐３‐トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ‐ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２‐ジリノレオイル‐３‐トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ‐ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２‐ジリノレイルオキシ‐３‐（Ｎ‐メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ‐ＭＰＺ）、又は３‐（Ｎ，Ｎ‐ジリノレイルアミノ）‐１，２‐プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３‐（Ｎ，Ｎ‐ジオレイルアミノ）‐１，２‐プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２‐ジリノレイルオキソ‐３‐（２‐Ｎ，Ｎ‐ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ‐ＥＧ‐ＤＭＡ）、２，２‐ジリノレイル‐４‐ジメチルアミノメチル‐［１，３］‐ジオキソラン（ＤＬｉｎ‐Ｋ‐ＤＭＡ）、又はその混合物であってよい。カチオン性脂質は粒子内に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％又は約４０ｍｏｌ％を含んでよい。
【０１０５】
非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルフォスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）‐シクロヘキサン‐ｌ‐カルボキシレート（ＤＯＰＥ‐ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル‐ホスファチジル‐エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６‐Ｏ‐モノメチルＰＥ、１６‐Ｏ‐ジメチルＰＥ、１８‐１‐トランスＰＥ、１‐ステアロイル‐２‐オレオイル‐ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、又はその混合物を含むが、これらに限定されないアニオン性脂質又は中性脂質でよい。非カチオン性脂質は粒子内に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、又はコレステロールが含まれる場合約５８ｍｏｌ％であってよい。
【０１０６】
粒子の集合を阻害する複合脂質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）‐脂質であってもよく、該ＰＥＧ‐脂質はＰＥＧ‐ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ‐ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ‐リン脂質、ＰＥＧ‐セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。ＰＥＧ‐ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ‐ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ‐ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ‐ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、又はＰＥＧ‐ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）でよい。粒子の集合を予防する複合脂質は粒子内に存在する総脂質の０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％又は約２ｍｏｌ％でよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、核酸‐脂質粒子は、例えば、粒子内に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％又は約４８ｍｏｌ％のコレステロールをさらに含む。
【０１０８】
一実施形態では、脂質‐ｓｉＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製するために脂質様物質ＮＤ９８ ４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（式１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＰＥＧ‐セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用し得る。エタノール中の各ストック溶液は、ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍＬ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ‐セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍＬのように調製し得る。ＮＤ９８、コレステロール、及びＰＥＧ‐セラミドＣ１６ストック溶液は次いで、例えば、４２：４８：１０モル比で併合し得る。併合脂質溶液はエタノール最終濃度が約３５〜４５％及び酢酸ナトリウム最終濃度が約１００〜３００ｍＭとなるように、水性ｓｉＲＮＡ（例えば、ｐＨ５の酢酸ナトリウム溶液）と混合し得る。脂質‐ｓｉＲＮＡナノ粒子は混合時、典型的には自発的に形成される。所望の粒子サイズ分布によって、生成したナノ粒子混合物は例えばＬｉｐｅｘ押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ， Ｉｎｃ）などのｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ押出機を使用してポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出し得る。いくつかの場合では、押出工程を省き得る。エタノール除去及び同時緩衝液交換は例えば、透析又は接線流濾過によって達成し得る。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、又は約ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換し得る。
【０１０９】
【化１】
【０１１０】
ＬＮＰ０１製剤については、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／０４２９７３号に記載されている。
【０１１１】
標準又は押し出さない方法のいずれかによって調製される製剤は、類似した手法で特徴づけし得る。例えば、製剤は典型的には視覚検査で特徴づけられる。それらは集合又は沈降物のない白色半透明溶液であるべきである。脂質‐ナノ粒子の粒子サイズ及び粒子サイズ分布は光散乱、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ， ＵＳＡ）を使用して測定し得る。粒子サイズは約２０〜３００ｎｍ、例えば４０〜１００ｎｍなどであるべきである。粒子サイズ分布は単峰型であるべきである。該製剤における総ｓｉＲＮＡ濃度は、並びに内包画分は、色素排除法を使用して推定される。製剤化したｓｉＲＮＡの試料は製剤崩壊界面活性剤、例えば、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の有無下でＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合性色素とともにインキュベートし得る。該製剤内の総ｓｉＲＮＡは標準曲線に対する、界面活性剤を含む試料からのシグナルによって決定し得る。内包画分は総ｓｉＲＮＡ含量から（界面活性剤の非存在下におけるシグナルによって測定した）「遊離」ｓｉＲＮＡ含量を差し引いて決定する。内包ｓｉＲＮＡの百分率は典型的には＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤において、粒子サイズは少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、及び少なくとも１２０ｎｍである。適切な範囲は典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、又は少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。
【０１１２】
経口投与用の組成物及び製剤には、粉剤若しくは顆粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、水中若しくは非水性媒体中の懸濁液若しくは溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤又は小型錠剤が含まれる。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤が望ましい場合がある。代表的な経口製剤は、ｄｓＲＮＡが１つ又は複数の浸透促進剤、界面活性剤及びキレート剤と共に投与されるものである。代表的な界面活性剤には、脂肪酸及び／又はそのエステル若しくは塩、胆汁酸及び／又はその塩が含まれる。代表的な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ‐２４，２５‐ジヒドロ‐フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。代表的な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１‐モノカプレート、１‐ドデシルアザシクロヘプタン‐２‐オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はモノグリセリド、ジグリセリド又は製薬上許容可能なこれらの塩（例えばナトリウム塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、製剤は、浸透促進剤の組み合わせ、例えば脂肪酸／塩を胆汁酸／塩と組み合わせたものを含む。一実施形態では、組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン‐２０‐セチルエーテルが挙げられる。ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥した粒子などの顆粒形態、又はマイクロ粒子若しくはナノ粒子を形成するように複合体化された形態で、経口送達してよい。ｄｓＲＮＡの複合体化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化したゼラチン、アルブミン、澱粉、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び澱粉；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥで誘導体化されたポリイミン、ポルラン、セルロース及び澱粉が挙げられる。代表的な複合体化剤としては、キトサン、Ｎ‐トリメチルキトサン、ポリ‐Ｌ‐リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ‐アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥメタクリレート、ＤＥＡＥヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥアクリルアミド、ＤＥＡＥアルブミン及びＤＥＡＥデキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ、Ｌ‐乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、アルギネート、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤及びその調製については、各々がその全体を参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許出願番号第０８／８８６，８２９号（１９９７年７月１日出願）、同第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日出願）、同第０９／２５６，５１５号（１９９９年２月２３日出願）、同第０９／０８２，６２４号（１９９８年５月２１日出願）及び同第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日出願）に詳細に述べられている。
【０１１３】
非経口、髄腔内又は脳室内投与用の組成物及び製剤は、無菌の水溶液を含んでよく、該水溶液は、緩衝液、希釈剤及びその他の適切な添加剤、例えば、限定するものではないが、浸透促進剤、担体化合物、及びその他の製薬上許容可能な担体又は賦形剤も含んでよい。
【０１１４】
本発明の医薬組成物としては、限定するものではないが、液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤が挙げられる。これらの組成物は、限定するものではないが、予め形成された液剤、自己乳化型の固体及び自己乳化型の半固体が含まれる様々な構成成分から作製してよい。
【０１１５】
本発明の医薬製剤は、便利なように単位投与形態で提供してよく、医薬品産業において周知の従来の技術にしたがって調製してよい。そのような技術は、有効成分を製薬用の担体又は賦形剤と共に会合させる工程を含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体若しくは微粉固体担体若しくは両方と共に均一かつ念入りに会合させ、次いで必要な場合は生成物を成形することにより調製される。
【０１１６】
本発明の組成物は、多くの可能な投与形態のうち任意のもの、例えば、限定するものではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟ゲル剤、坐剤、及び浣腸剤などに製剤化してよい。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混成媒体中の懸濁液としても製剤化してよい。水性懸濁液は、該懸濁液の粘性を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランなどをさらに含んでよい。懸濁液は安定剤も含んでよい。
【０１１７】
本発明の一実施形態では、医薬組成物はフォーム剤として製剤化及び使用してよい。医薬フォーム剤には、限定するものではないが、乳剤、マイクロエマルジョン、クリーム剤、ゼリー剤及びリポソームなどの製剤が挙げられる。これらの製剤の性質は基本的に類似しているが、構成成分及び最終生成物の粘稠度においては異なっている。そのような組成物及び製剤の調製は、一般的に製薬及び製剤分野の当業者に知られており、本発明の組成物の製剤化に適用してよい。
【０１１８】
乳剤
本発明の組成物は乳剤として調製及び製剤化されてよい。乳剤は典型的には一方の液体が他方の中に通常は直径０．１μｍを超える小滴形態で分散している不均質な系である（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９、 Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２４５、 Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐ．３３５、 Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８５， ｐ．３０１）。乳剤は、互いによく混合かつ分散された非混和性の２つの液相を含む二相系であることが多い。一般に、乳剤は、油中水（ｗ／ｏ）型又は水中油（ｏ／ｗ）型のどちらであってもよい。水相が大量の油相中で微細に分割され細かい小滴として分散される場合、生成組成物は油中水（ｗ／ｏ）型乳剤と呼ばれる。あるいは、油相が大量の水相中で微細に分割され細かい小滴として分散される場合、生成組成物は水中油（ｏ／ｗ）型乳剤と呼ばれる。乳剤は、分散相と、さらに水相、油相中又はそれ自体が分離した相の溶液として存在する可能性のある活性薬物とに加えて追加の構成成分を含んでよい。乳化剤、安定剤、染料及び酸化防止剤のような医薬賦形剤が、必要に応じて乳剤中に存在していてもよい。医薬乳剤は３つ以上の相で構成される多相乳剤、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）型乳剤及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型乳剤の事例のようなものであってもよい。そのような複雑な製剤は、単純な二成分の乳剤にはないある種の利点を備えていることが多い。ｏ／ｗ型乳剤の個々の油の小滴がより小さな水滴を囲む多相乳剤は、ｗ／ｏ／ｗ型乳剤を構成する。同様に、油性連続相中で安定化した水の小球に囲まれた油の小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ型乳剤を提供する。
【０１１９】
乳剤は、熱力学的安定性がほとんど又は全くないことを特徴とする。多くの場合、乳剤の分散相すなわち不連続相は、外相すなわち連続相中に十分に分散し、乳化剤又は製剤の粘性によってこの形態に維持される。乳剤型の軟膏基剤及びクリーム剤の場合のように、乳剤相のうちいずれかが半固体又は固体であってよい。乳剤を安定させる他の手段は、乳剤のいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、大きく分けて４つの分類、すなわち合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸水性基剤、及び微細分散固体に分類してよい（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９）。
【０１２０】
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、乳剤の製剤化に広い適用可能性が見出されてきており、文献中に総説もある（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２８５、 Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９）。界面活性剤は典型的には両親媒性であり、親水性部分及び疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性性質との比率は親水／親油バランス（ＨＬＢ）と名付けられており、製剤の調製において界面活性剤を分類及び選択する際に有益な手段である。界面活性剤は、親水基の性質に基づいて異なる種類、すなわち非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類することができる（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２８５）。
【０１２１】
乳剤製剤に使用される天然の乳化剤には、ラノリン、みつろう、ホスファチド、レシチン及びアカシアが挙げられる。吸水性基剤は、脱水ラノリン及び親水ワセリンのように、水分を吸収してｗ／ｏ型乳剤を形成しつつも半固体の粘稠度を維持し得るように、親水性の特性を有している。微粉固体も、特に界面活性剤と組み合わされて、及び粘性の調製物において、良質の乳化剤として使用されている。それには、極性の無機固体、例えば重金属の水酸化物、非膨潤性の粘土、例えばベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状のケイ酸アルミニウム及びコロイド状のケイ酸アルミニウムマグネシウム、色素並びに無極性の固体、例えば炭素又はトリステアリン酸グリセリルが含まれる。
【０１２２】
乳化作用を持たない種々様々な材料も乳剤製剤に含まれており、乳剤の特性の一要素となっている。それには、脂肪、油、ろう、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水コロイド、保存剤及び酸化防止剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．３３５、 Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９）。
【０１２３】
親水コロイドすなわちハイドロコロイドとしては、天然に存在するゴム及び合成ポリマー、例えば多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアーガム、カラヤゴム及びトラガント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル及びカルボキシビニルポリマー）などが挙げられる。これらは水中で分散又は膨張し、分散相の小滴の周囲に丈夫な界面膜を形成し、かつ外相の粘性を高めることにより、乳剤を安定させるコロイド溶液を形成する。
【０１２４】
乳剤は、微生物の増殖を引き起こしやすい可能性のある、炭水化物、蛋白質、ステロール及びホスファチドのような多くの成分を含むことが多いので、これら製剤には保存剤が組み込まれることが多い。乳剤製剤に含めるのに一般に使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、ベンザルコニウムクロライド、ｐ‐ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が挙げられる。酸化防止剤も一般に、乳剤製剤の変質を防ぐため該製剤に添加される。使用される酸化防止剤は、フリーラジカル捕捉剤、例えばトコフェロール、アルキルガラート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなど、又は還元剤、例えばアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなど、並びに酸化防止剤相乗剤、例えばクエン酸、酒石酸及びレシチンなどでよい。
【０１２５】
経皮的、経口及び非経口経路を介した乳剤製剤の適用並びに乳剤製剤の製造方法については、文献に総説がある（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９）。経口送達用の乳剤製剤は、製剤化が容易であり、さらに吸収及びバイオアベイラビリティの見地から有効であるため、非常に広く使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２４５、 Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．１９９）。鉱油の緩下剤、脂溶性ビタミン及び高脂肪の栄養剤は、ｏ／ｗ型乳剤として一般に経口投与されてきている材料に含まれる。
【０１２６】
本発明の一実施形態では、ｄｓＲＮＡ及び核酸の組成物はマイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、光学的に等方性かつ熱力学的に安定な単一の溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義することができる（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２４５）。典型的には、マイクロエマルジョンは、最初に油を水性の界面活性剤溶液中に分散させて、次に十分な量の第四成分、一般には中鎖長アルコールを加えて透明な系を形成することにより、調製される系である。したがって、マイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面膜によって安定している２つの非混和性液体の、熱力学的に安定し、等方的に透明な分散物としても説明されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ， ｉｎ： Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ： Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒｏｓｏｆｆ， Ｍ．， Ｅｄ．， １９８９， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルジョンは一般に、油、水、界面活性剤、界面活性助剤及び電解質を含む３〜５つの構成成分の組み合わせによって調製される。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）型であるか水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油及び界面活性剤の特性、並びに界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素の尾部の構造及び幾何学的密集状態に依存する（Ｓｃｈｏｔｔ， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９８５， ｐ．２７１）。
【０１２７】
状態図を利用する現象学的アプローチが広く研究されてきており、マイクロエマルジョンを製剤化する方法に関する包括的な知識が当業者にもたらされている（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２４５、 Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．３３５）。従来の乳剤に比べて、マイクロエマルジョンには、自然に形成される熱力学的に安定した小滴の製剤中で水不溶性の薬物を可溶化するという長所がある。
【０１２８】
マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤には、限定するものではないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレアート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられ、単独又は界面活性助剤との組み合わせられる。界面活性助剤は、通常はエタノール、１‐プロパノール及び１‐ブタノールのような短鎖アルコールであり、界面活性剤の界面膜に浸透し、その結果として、界面活性剤分子間に生じた空所に不規則な界面膜を作り出すことによって、界面の流動性を増大させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンは界面活性助剤を使用せずに調製してよく、アルコールを含まない自己乳化型マイクロエマルジョンの系が当分野で知られている。水相は、典型的には、限定するものではないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコール誘導体でよい。油相は、限定するものではないが、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ及びトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油などのような材料を含んでよい。
【０１２９】
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化及び薬物吸収増大の見地から特に興味深い。ペプチドなどの薬物の経口バイオアベイラビリティを増大させるために、脂質を用いるマイクロエマルジョン（ｏ／ｗ型及びｗ／ｏ型の両方）が提案されてきている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５−１３９０； Ｒｉｔｓｃｈｅｌ， Ｍｅｔｈ． Ｆｉｎｄ． Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， １９９３， １３， ２０５）。マイクロエマルジョンがもたらす長所は、薬物の可溶化の改善、酵素加水分解からの薬物の防護、界面活性剤により誘発された膜の流動性及び透過性の変化に起因する薬物吸収増大の可能性、調製の容易さ、固体剤形の場合の経口投与の容易さ、臨床上の効能の改善、並びに毒性の減少である（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５； Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９９６， ８５， １３８−１４３）。多くの場合、マイクロエマルジョンは、その構成成分を一緒にすると周囲温度で自然に形成され得る。このことは、熱に不安定な薬物、ペプチド又はｄｓＲＮＡを製剤化する場合に特に有利であり得る。マイクロエマルジョンはまた、化粧用途及び製薬用途の両方における有効成分の経皮送達にも有効となっている。本発明のマイクロエマルジョン組成物及び製剤は、胃腸管からのｄｓＲＮＡ及び核酸の全身吸収増大を促進し、同時に胃腸管、膣、口腔及び他の投与領域内におけるｄｓＲＮＡ及び核酸の局所的な細胞内取り込みを改善するであろうと期待される。
【０１３０】
本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、本発明のｄｓＲＮＡ及び核酸の吸収を増大させるために、追加の構成成分及び添加剤、例えばソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、及び浸透促進剤なども含んでよい。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、大きく分けて５つの部類、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、及び非キレート性の非界面活性剤、のうちの１つに属するように分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）。これらの部類の各々については上で考察した。
【０１３１】
リポソーム
マイクロエマルジョンの他に、研究され、薬物の製剤化に使用されている、多くの組織化された界面活性剤構造物がある。これらには単層、ミセル、二層及び小胞が挙げられる。リポソームのような小胞は、その特異性及び作用持続時間ゆえに、薬物送達の見地から大きな関心が持たれている。本発明において使用されるとき、「リポソーム」という用語は、球状の１つ又は複数の二層をなすように配置された両親媒性脂質で構成されている小胞を意味する。
【０１３２】
リポソームは、親油性の物質から形成された膜と水性内部とを有する単層又は多層の小胞である。水性の部分は、送達すべき組成物を含んでいる。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという長所を有する。非カチオン性リポソームは、効率的に細胞壁と融合することはできないが、ｉｎ ｖｉｖｏでマクロファージによって取り込まれる。
【０１３３】
無傷の哺乳類の皮膚を越えるためには、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、各直径が５０ｎｍ未満の一連の微小な細孔を通り抜けなければならない。したがって、変形能力が高く且つそのような微小な細孔を通り抜けることのできるリポソームを使用することが望ましい。
【０１３４】
リポソームのさらなる長所を挙げると、天然リン脂質から得られたリポソームは生体適合性及び生物分解性を有すること、リポソームは多種多様な水溶性及び脂溶性の薬物を組み込み得ること、リポソームは、その内部区画内に封入された薬物を代謝及び分解から保護し得ること、である（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な事柄は、脂質表面電荷、小胞サイズ及びリポソームの水容量である。
【０１３５】
リポソームは、作用部位への有効成分の移送及び送達に有用である。リポソーム膜は生体膜に構造上似ているので、リポソームが組織に対して適用されると、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞との融合が進行するにつれて、リポソームの内容物は、活性物質が作用することのできる細胞内に移される。
【０１３６】
リポソーム製剤は、多くの薬物の送達様式として広範囲な研究の中心となっている。局所投与については、リポソームが他の製剤に勝る長所をいくつか示すという証拠が増えつつある。そのような長所には、投与された薬物の高度の全身吸収に関連した副作用の低減、所望の標的における投与された薬物の蓄積増大、並びに親水性及び疎水性の両方の種々様々な薬物を皮膚内に投与する能力が含まれる。
【０１３７】
いくつかの報告書では、リポソームが高分子量のＤＮＡなどの物質を皮膚内に送達する能力について詳述されている。鎮痛剤、抗体、ホルモン及び高分子量ＤＮＡなどの化合物が皮膚に投与されている。適用の大部分は表皮上層を標的とする結果となった。
【０１３８】
リポソームは大きく２つに分類される。カチオン性リポソームは正に荷電したリポソームであり、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内に内部移行する。エンドソーム内の酸性ｐＨによりリポソームは破裂し、その内容物を細胞の細胞質中に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９８７， １４７， ９８０−９８５）。
【０１３９】
ｐＨ感受性であるか又は負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成する代わりにＤＮＡを封入する。ＤＮＡと脂質の両方が同様に荷電しているので、複合体形成ではなく斥力が生じる。それでもなお、一部のＤＮＡはこれらのリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ感受性のリポソームは、培養中の細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するために使用されている。該外来遺伝子の発現は標的細胞内で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， １９９２， １９， ２６９−２７４）。
【０１４０】
主要なタイプの１つのリポソーム組成物は、天然ホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性のリポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成し得る。アニオン性のリポソーム組成物は一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性の融合性リポソームは主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば大豆のＰＣ及び卵のＰＣなどから形成される。別のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
【０１４１】
いくつかの研究により、薬物のリポソーム製剤の皮膚への局所送達について評価がなされている。モルモット皮膚へのインターフェロン含有リポソーム塗布は、ヘルペスによる皮膚のただれを低減したが、他の手段（例えば液剤又は乳剤）によるインターフェロン送達では効果がなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， １９９２， ２， ４０５−４１０）。さらに、補足研究により、水性の系を使用したインターフェロン投与に対してリポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの有効性が試験され、そのリポソーム製剤が水性投与より優れているとの結論が下された（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９２， １８， ２５９−２６５）。
【０１４２】
非イオン性のリポソーム系も、皮膚への薬物送達におけるその有用性を決定するために、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系について検討されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン‐１０‐ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン‐１０‐ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウス皮膚の真皮内にシクロスポリンＡを送達するために使用された。結果から、そのような非イオン性のリポソーム系が、皮膚の様々な層内にシクロスポリンＡが沈着するのを促進するのに有効であることが示された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ． Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ． Ｓｃｉ．， １９９４， ４， ６， ４６６）。
【０１４３】
リポソームはまた、「立体的に安定した」リポソームも含み、該用語は、本明細書において使用するとき、１つ又は複数の特殊な脂質を含むリポソームを指し、該脂質は、リポソームに組み込まれると、そのような特殊な脂質を欠くリポソームと比較して長い循環寿命をもたらす。立体的に安定したリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１のような糖脂質を１つ又は複数含む、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような１つ又は複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧで誘導体化された脂質を含有している立体的に安定したリポソームについては少なくとも、これらの立体的に安定したリポソームの循環半減期の延長は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内取り込みの減少に由来すると当分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８７， ２２３， ４２； Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９３， ５３， ３７６５）。
【０１４４】
１つ又は複数の糖脂質が含まれる様々なリポソームが当分野で知られている。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９８７， ５０７， ６４）には、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸及びホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を改善する能力について報告されている。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８８， ８５， ６９４９）によって説明されている。いずれもＡｌｌｅｎらの米国特許第４，８３７，０２８号及び国際公開第８８／０４９２４号は、（１）スフィンゴミエリン、及び（２）ガングリオシドＧＭ１又はガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２‐ｓｎ‐ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示されている。
【０１４５】
１つ又は複数の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム及びその調製法が、当分野で知られている。Ｓｕｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ．， １９８０， ５３， ２７７８）は、ＰＥＧ部分を含む非イオン系洗剤２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームについて記載している。Ｉｌｉｕｍ ｅｔ ａｌ． （ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９８４， １６７， ７９）は、ポリマー状のグリコールを用いたポリスチレン粒子の親水コーティングにより血中半減期が有意に延長されることを記載している。ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボキシル基を取り付けることによって修飾された合成リン脂質については、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号及び同第４，５３４，８９９号）によって記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ． （ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２６８， ２３５）は、ＰＥＧ又はＰＥＧステアレートで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、有意に延長された血液循環半減期を有することを実証する実験について記載している。Ｂｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ． （Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １９９０， １０２９， ９１）は、そのような観察を他のＰＥＧ誘導体化リン脂質に、例えばジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）及びＰＥＧの組み合わせから形成されるＤＳＰＥ‐ＰＥＧに拡大適用した。外表面上にＰＥＧ部分が共有結合しているリポソームは、欧州特許第０ ４４５ １３１ Ｂ１号及びＦｉｓｈｅｒの国際公開第９０／０４３８４号に記載されている。ＰＥＧで誘導体化されたＰＥを１〜２０モル％含有するリポソーム組成物及びその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号及び同第５，３５６，６３３号）、及びＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号及び欧州特許第０ ４９６ ８１３ Ｂ１号）によって記載されている。多くの他の脂質‐ポリマー複合体を含むリポソームが、国際公開第９１／０５５４５号及び米国特許第５，２２５，２１２号（いずれもＭａｒｔｉｎら）並びに国際公開第９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾されたセラミド脂質を含むリポソームは、国際公開第９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）及び米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）には、表面上の官能基部分を用いてさらに誘導体化し得るＰＥＧ含有リポソームについて記載されている。
【０１４６】
核酸を含むリポソームは当分野で限られた数が知られている。Ｔｈｉｅｒｒｙらの国際公開第９６／４００６２号には、リポソーム中への高分子量核酸の封入方法が開示されている。Ｔａｇａｗａらの米国特許第５，２６４，２２１号は、蛋白質が結合したリポソームを開示し、そのようなリポソームの内容物はｄｓＲＮＡを含み得ると主張している。Ｒａｈｍａｎらの米国特許第５，６６５，７１０号には、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドを封入するある方法について記載されている。Ｌｏｖｅらの国際公開第９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。
【０１４７】
Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅはさらに別のタイプのリポソームであり、薬物送達用ビヒクルの好ましい候補である変形能力の高い脂質凝集物である。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅは、非常に変形能力が高い脂質小滴であるため該小滴よりも小さい細孔を容易に通り抜けることができるものとして説明してよい。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅは使用される環境に適応可能であり、例えば、自己最適化し（皮膚の細孔の形状に適応）、自己修復し、分断されることなく標的に到達することが多く、また多くの場合自己装荷型である。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを作製するために、標準的なリポソーム組成物に、表面の境界面の活性化物質、通常は界面活性剤を加えることが可能である。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅは皮膚に血清アルブミンを送達するために使用されている。Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅを介した血清アルブミンの送達は、血清アルブミンが含まれる溶液の皮下注射と同程度に有効であることが示されている。
【０１４８】
界面活性剤は、乳剤（マイクロエマルジョンが含まれる）及びリポソームのような製剤に広い用途が見出されている。天然及び合成の両方の多くの様々なタイプの界面活性剤の特性を分類及び格付けする最も一般的な方法は、親水／親油バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水基（「頭部」としても知られる）の性質は、製剤に使用される様々な界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｐ．２８５）。
【０１４９】
界面活性剤分子がイオン化されない場合、該分子は非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品及び化粧品に広い用途が見出されており、広範囲のｐＨ値に対して使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値範囲はその構造に依存して２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグルセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル、及びエトキシ化エステルのような非イオン性のエステルが含まれる。非イオン性のアルカノールアミド及びエーテル、例えば脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシ化アルコールなどであり、エトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなども、この分類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤部類のうち最も一般的な成員である。
【０１５０】
界面活性剤分子が水に溶解又は分散されたとき、該分子が負電荷を保有する場合、その界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミドなどのカルボキシレート、硫酸アルキル及びエトキシ化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネート、並びにホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤部類の中で最も重要なメンバーは硫酸アルキル及び石鹸である。
【０１５１】
界面活性剤分子が水に溶解又は分散されたとき、該分子が正電荷を保有する場合、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩及びエトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩はこの分類において最もよく使用されるものである。
【０１５２】
界面活性剤分子が正電荷又は負電荷のいずれかをも保有する能力を有する場合、その界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ‐アルキルベタイン及びホスファチドが挙げられる。
【０１５３】
薬品、製剤、及び乳剤における界面活性剤の使用については総説がある（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｐ．２８５）。
【０１５４】
浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、動物の皮膚への核酸、特にｄｓＲＮＡの効率的な送達を達成するために様々な浸透促進剤を使用する。ほとんどの薬物は、イオン化及び非イオン化の両方の状態で溶液中に存在する。しかしながら、通常は脂溶性又は親油性の薬物だけが容易に細胞膜を横断する。横断しようとする細胞膜が浸透促進剤で処理されると、親油性ではない薬物ですら細胞膜を横断する可能性が見出されてきている。浸透促進剤は、親油性ではない薬物が細胞膜を横切って拡散するのを支援することに加えて、親油性の薬物の透過性も高める。
【０１５５】
浸透促進剤は、５つの大きな分類、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、及び非キレート性の非界面活性剤のうちの１つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）。上述の浸透促進剤の分類各々について、下でより詳細に述べる。
【０１５６】
界面活性剤：本発明に関して、界面活性剤（又は「表面活性剤」）は、水溶液中に溶解されると、該溶液の表面張力又は該水溶液と別の液体との間の界面張力を低減し、その結果として粘膜を介したｄｓＲＮＡ吸収を増強させる化学成分である。胆汁酸塩及び脂肪酸に加えて、これら浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン‐２０‐セチルエーテル（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）；並びにペルフルオロ化合物の乳剤、例えばＦＣ‐４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， １９８８， ４０， ２５２）などが含まれる。
【０１５７】
脂肪酸：浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸及びその誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ‐デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１‐モノオレオイル‐ｒａｃ‐グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１‐モノカプレート、１‐ドデシルアザシクロヘプタン‐２‐オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜Ｃ１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル及びｔ‐ブチル）、並びにそれらのモノグリセリド及びジグリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｙｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２、 Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３、 Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９２， ４４， ６５１−６５４）。
【０１５８】
胆汁酸塩：胆汁の生理的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収を促進することが含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ： Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９６， ｐｐ． ９３４−９３５）。様々な天然胆汁酸塩及びその合成誘導体は浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁酸塩」という用語には、天然に存在する胆汁成分のうち任意のもの、並びにその合成誘導体のうち任意のものが含まれる。胆汁酸塩としては、例えば、コール酸（又はその製薬上許容可能なナトリウム塩であるコール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ‐２４，２５‐ジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン‐９‐ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２、 Ｓｗｉｎｙａｒｄ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９９０， ｐａｇｅｓ ７８２−７８３、 Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３、 Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９２， ２６３， ２５、 Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９９０， ７９， ５７９−５８３）。
【０１５９】
キレート剤：キレート剤は、本発明に関して使用されるとき、金属イオンと複合体を形成することにより溶液中から金属イオンを取り除き、その結果として粘膜を介したｄｓＲＮＡ吸収を増強させる化合物として定義することができる。キレート剤を本発明において浸透促進剤として使用することについては、特性解析されているほとんどのＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用に二価金属イオンを必要とし、したがってキレート剤によって阻害を受けるので、キレート剤はＤＮａｓｅ阻害剤としての役割も果たすというさらなる長所を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， １９９３， ６１８， ３１５−３３９）。キレート剤としては、限定するものではないが、エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えばナトリウムサリチレート、５‐メトキシサリチレート及びホモバニレート）、コラーゲンのＮ‐アシル誘導体、β‐ジケトンのラウレス‐９及びＮ‐アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２、 Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３、 Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｉ．， １９９０， １４， ４３−５１）。
【０１６０】
非キレート性の非界面活性剤：本明細書中で使用されるとき、非キレート性の非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤又は界面活性剤として示す活性は有意ではないが、それにもかかわらず消化器粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収を高める化合物として定義し得る（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３）。この部類の浸透促進剤としては、例えば、不飽和の環式尿素、１‐アルキル‐及び１‐アルケニルアザシクロ‐アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２）、並びに非ステロイド性抗炎症薬、例えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９８７， ３９， ６２１−６２６）が挙げられる。
【０１６１】
細胞レベルでのｄｓＲＮＡの取り込みを高める薬剤を本発明の医薬組成物及びその他の組成物にも添加してよい。例えば、カチオン性脂質、例えばリポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性のグリセロール誘導体、並びにポリカチオン型分子、例えばポリリシン（Ｌｏｌｌｏら、国際公開第９７／３０７３１号）なども、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。
【０１６２】
他の薬剤、例えばエチレングリコール及びプロピレングリコールのようなグリコール、２‐ピロールのようなピロール、アゾン、並びにリモネン及びメントンのようなテルペンなどは、投与された核酸の浸透を高めるために利用してよい。
【０１６３】
担体
本発明のある種の組成物は、製剤中に担体化合物も組み入れる。本明細書において使用するとき、「担体化合物」又は「担体」とは、核酸又はそのアナログであって、不活性である（すなわち、それ自身は生物学的活性を有していない）が、例えば生物学的活性を有する核酸の分解又は循環血中からの除去促進により生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低減するｉｎ ｖｉｖｏプロセスにより核酸として認識されるものを指し得る。核酸及び担体化合物を、典型的には担体化合物を過剰量として併用投与すると、おそらくは共通の受容体に関する担体化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓又は他の循環血流外の蓄積部位で回収される核酸の量を大幅に低減し得る。例えば、部分的にホスホロチオエートを有するｄｓＲＮＡをポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジル酸又は４‐アセトアミド‐４’イソチオシアノ‐スチルベン‐２，２’‐ジスルホン酸と共に併用投与すると、該ｄｓＲＮＡの肝臓組織での回収は低減し得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ， ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．， １９９５， ５， １１５−１２１、 Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， １９９６， ６， １７７−１８３）。
【０１６４】
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」すなわち「賦形剤」は、製薬上許容可能な溶媒、懸濁化剤、又は動物に１つ又は複数の核酸を送達するための他の任意の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体でも固体でもよく、想定された投与方法によって、所与の医薬組成物の核酸及び他の成分と組み合わせたときに所望の体積、粘稠度などを提供するように選択される。代表的な医薬担体には、限定するものではないが、結合剤（例えば、予めゼラチン化したトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、増量剤（例えば、ラクトース及びその他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸の金属塩、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど）、並びに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
【０１６５】
核酸との間で有害反応を起こさない、製薬上許容可能な有機又は無機の経口投与に適した賦形剤も、本発明の組成物を製剤化するために使用し得る。適切な製薬上許容可能な担体としては、限定するものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１６６】
核酸の局所投与用製剤は、滅菌及び非滅菌の水溶液、アルコールのような一般的な溶媒中の非水性溶液、又は液体若しくは固体の油性基剤中の核酸溶液を含んでよい。該溶液はまた、緩衝液、希釈剤及びその他の適切な添加剤も含んでよい。核酸との間で有害反応を起こさない、製薬上許容可能な有機又は無機の経口投与に適した賦形剤を使用し得る。
【０１６７】
製薬上許容可能な適切な賦形剤としては、限定するものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１６８】
その他の構成成分
本発明の組成物は、通常、医薬組成物中に見出される他の補助成分を、該成分の分野で確立された使用量レベルで、付加的に含んでよい。したがって、例えば、組成物は、追加の、混合可能な、薬学的活性物質、例えば止痒剤、収斂剤、局所麻酔薬又は抗炎症薬などを含んでもよく、又は本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化するのに役立つ追加の物質、例えば色素、香料剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などを含んでもよい。しかしながら、そのような物質を加える場合は、該物質は本発明の組成物成分の生物学的活性を過度に妨げてはならない。製剤は滅菌し得て、望ましい場合は、該製剤の核酸との間で有害な相互反応を生じない補助的薬剤、例えば滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を操作するための塩類、緩衝液、着色剤、香味料及び／又は芳香剤などと混合し得る。
【０１６９】
水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランなど該懸濁液の粘性を増大させる物質を含んでよい。該懸濁液は安定剤も含んでよい。
【０１７０】
本発明で特徴とされるある実施形態は、（ａ）１つ又は複数のｄｓＲＮＡ分子、及び（ｂ）１つ又は複数の他の治療剤であってｄｓＲＮＡ介在性ではない機構によって機能するもの、を含有する医薬組成物を提供する。例えば、１つ又は複数の他の治療剤は抗凝固剤を含む。模範的な抗凝固剤は、例えば、ワルファリン（ＣＯＵＭＡＤＩＮ（商標））；ＬＭＷＨ（低分子量ヘパリン）；第Ｘａ因子インヒビター、例えば、ビスアミジン化合物、並びにフェニル及びナフチルスルホンアミド；未分画ヘパリン；アスピリン；並びに血小板糖蛋白質Ｉｌｂ／ＩＩＩａブロッカーを含む。
【０１７１】
そのような化合物の毒性及び治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％が死亡する用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手法によって決定し得る。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療指数であり、治療指数はＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。適切な化合物は典型的には高い治療指数を指す。
【０１７２】
細胞培養検定及び動物実験から得られたデータを、ヒトで使用するための用量範囲の策定において使用し得る。本発明で特徴とされる組成物の用量は、通常、毒性をほとんど又は全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。用量は、この範囲内で、使用される剤形及び利用される投与経路に依存して変動してよい。本明細書で特徴とされる方法で使用される任意の化合物について、治療上有効な用量を、細胞培養検定から最初に推定し得る。用量は、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）が含まれる、該化合物の循環血漿中濃度範囲、又は適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の循環血漿中濃度範囲（例えば、該ポリペプチドの濃度減少を達成する）を達成するように、動物モデルにおいて策定してよい。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用し得る。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してよい。
【０１７３】
上記で考察したように、ｄｓＲＮＡを独立に又は複数として投与することに加えて、ＦＶＩＩを標的とするｄｓＲＮＡは、第ＶＩＩ因子発現介在性病的プロセスの治療に有効な他の既知の製剤と組み合わせて投与し得る。どの場合も、投与する医師は、当分野で既知又は本明細書に記載の標準的な有効性尺度を使用して観察された結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量及びタイミングを調節し得る。
【０１７４】
第ＶＩＩ因子遺伝子発現に惹起される疾患の治療方法
一実施形態では、本発明は、ウイルス性出血性発熱などの第ＶＩＩ因子遺伝子発現介在性病状を有する対象の治療方法を提供する。本実施形態では、ｄｓＲＮＡは第ＶＩＩ因子発現蛋白質制御のための治療剤として作用する。該方法には第ＶＩＩ因子遺伝子発現が抑制されるように、ウイルス感染患者などの患者（例えば、ヒト）への医薬組成物投与が含まれる。それらの高い特異性により、本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは特異的に第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡを標的とする。
【０１７５】
本明細書においては、「第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患」という用語並びに関連用語及び語句は、好ましからぬ又は不適切な、例えば、異常な第ＶＩＩ因子活性を特徴とする状態又は障害を指す。不適切な第ＶＩＩ因子機能活性は正常時に第ＶＩＩ因子を発現しない細胞内での第ＶＩＩ因子発現、又は第ＶＩＩ因子発現及び／若しくは活性の増加の結果として生じる可能性がある（例えば、ウイルス性出血性発熱症状、又は血栓性障害に至る）。第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患は第ＶＩＩ因子の不適切な活性化のために生じる可能性がある不適切な第ＶＩＩ因子機能活性によって完全に又は部分的に介在される可能性がある。それらに関係なく、第ＶＩＩ因子介在性状態又は疾患は、ＲＮＡ干渉を介した第ＶＩＩ因子の調節が基礎疾患又は障害に対するいくらかの効果をもたらすものである（例えば、第ＶＩＩ因子インヒビターは少なくともいくらかの患者における患者の健康のいくらかの改善をもたらす）。
【０１７６】
本発明の抗第ＶＩＩ因子ｄｓＲＮＡは対象におけるウイルス性出血性発熱の治療又は診断に使用してよい。治療方法は、本明細書に記載された抗第ＶＩＩ因子ｄｓＲＮＡを出血性発熱治療に有効な量を対象へ投与することを含む。
【０１７７】
病的プロセスとは有害な作用をもたらす生物学的プロセスの分類を指す。例えば、調整されていない第ＶＩＩ因子発現はウイルス性出血性発熱、血栓性障害及び癌に関連する。本発明で特徴とされる化合物は、典型的には該化合物がプロセスの程度又は重症度を低減するとき、病的プロセスを調節し得る。例えば、第ＶＩＩ因子の発現又は少なくとも１つの活性を低減する、そうでなければ調節するｄｓＲＮＡ投与によって、出血性発熱を予防し得、又は関連した病的プロセスを調節し得る。
【０１７８】
したがって、本明細書で特徴とされるｄｓＲＮＡ分子もウイルス性出血性発熱の治療又は予防に使用してよい。ｄｓＲＮＡは凝固障害若しくは炎症反応を寛解及び／又は予防することによって出血性発熱を治療又は予防し得る。
【０１７９】
本明細書で特徴とされるｄｓＲＮＡ分子は血栓性障害治療にも使用してよい。第ＶＩＩ因子を標的とするｄｓＲＮＡにより治療し得る血栓性障害は、局所血栓、急性心筋梗塞、不安定狭心症、冠動脈内血栓性閉塞、又は深部静脈血栓症を含むが、これらに限定されない。
【０１８０】
本発明に含まれる医薬組成物は、静脈内、筋肉内、関節内、腹腔内、皮下、硝子体内、経皮、気道（エアロゾル）、鼻内、直腸内、膣内及び局所（口腔内及び舌下を含む）投与、並びに硬膜外投与を含む経口又は非経口経路を含むが、これらに限定されない当分野で知られている任意の手段によって投与してよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は静脈注射又は注入によって投与する。
【０１８１】
第ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害方法
さらに別の態様では、本発明は哺乳類内の第ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害方法を提供する。該方法は標的ＶＩＩ因子遺伝子発現が抑制されるような、本発明で特徴とされる組成物の哺乳類への投与を含む。それらの高い特異性のために、本発明で特徴とされるｄｓＲＮＡは特異的に標的ＶＩＩ因子遺伝子のＲＮＡ（一次又はプロセシング後）を標的とする。ｄｓＲＮＡを使用した第ＶＩＩ因子遺伝子発現阻害の組成物及び方法は、本明細書の他の箇所に記載されているように実施し得る。
【０１８２】
一実施形態では、該方法はｄｓＲＮＡを含む組成物投与を含み、該ｄｓＲＮＡは治療対象の哺乳類の第ＶＩＩ因子遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。治療対象の生物がヒトなどの哺乳類であるとき、該組成物は、静脈内、筋肉内、関節内、頭蓋内、皮下、硝子体内、経皮、気道（エアロゾル）、鼻内、直腸内、膣内及び局所（口腔内及び舌下を含む）投与を含むが、これらに限定されない経口又は非経口経路を含む、当分野で知られている任意の手段によって投与してよい。ある実施形態では、組成物は静脈注射又は注入によって投与する。
【０１８３】
ｄｓＲＮＡ発現ベクター
別の態様では、ＦＶＩＩ遺伝子発現活性を調節するＦＶＩＩ特異的ｄｓＲＮＡ分子はＤＮＡ又はＲＮＡベクター内に挿入した転写単位によって発現する（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ， Ａ， ｅｔ ａｌ．， ＴＩＧ． （１９９６）， １２：５−１０； Ｓｋｉｌｌｅｒｎ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， 国際公開第００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄ、国際公開第００／２２１１４号、及びＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号を参照のこと）。これらのトランス遺伝子は直鎖状コンストラクト、環状プラスミド、又はウイルスベクターとして挿入し得、これらは宿主ゲノム内へ統合されたトランス遺伝子として取り込まれ且つ遺伝し得る。トランス遺伝子はまた染色体外プラスミドとして遺伝されるのを可能にするよう構築され得る（Ｇａｓｓｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＳｃＬ ＵＳＡ （１９９５） ９２：１２９２）。
【０１８４】
ｄｓＲＮＡの個々の鎖は、２つの別々の発現ベクター上のプロモーターによって転写され且つ標的細胞内に同時に形質転換し得る。あるいはｄｓＲＮＡの個々の各鎖を同一発現プラスミド上に位置する両プロモーターによって転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列により接合された逆方向反復として発現する。
【０１８５】
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは通常ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡ発現ウイルスベクターは、アデノ関連性ウイルス（総説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９２） １５８：９７−１２９）を参照のこと）、アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （１９９８） ６：６１６）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４）、及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （１９９２）， Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５）を参照のこと）、又はアルファウイルス、並びに当分野で知られている他のものが挙げられるが、これらに限定されないものに基づいて構築し得る。レトロウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで上皮細胞を含む多くの異なるタイプの細胞内への様々な遺伝子導入に使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８５） ２３０：１３９５−１３９８、 Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９８） ８５：６４６０−６４６４、 Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８、 Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６１４１６１４５、 Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３、 Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１、 Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５、 ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｄ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７６４０−１９ 、 Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７、 Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５、 Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４１０４−４１１５、米国特許第４，８６８，１１６号、米国特許第４，９８０，２８６号、国際公開第８９／０７１３６号、国際公開第８９／０２４６８号、国際公開第８９／０５３４５号、及び国際公開第９２／０７５７３号を参照のこと）。細胞ゲノム内に挿入した遺伝子を形質導入及び発現できる組換えレトロウイルスベクターは適切なパッケージング細胞株内へのＰＡ３１７及びＰｓｉ‐ＣＲＩＰなどの組換えレトロウイルスゲノムのトランスフェクトによって産生し得る（Ｃｏｍｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５−１０、 Ｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６３４９）。組換えアデノウイルスベクターは感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、及びチンパンジー）内の多種多様の細胞及び組織への感染に使用し得（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ， １６６：７６９）、感染のために有糸分裂的活性細胞を要さないという長所も有する。
【０１８６】
ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターのいずれかにおいてｄｓＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、発現プラスミドがＴ７プロモーターからの転写に必要とするＴ７ ＲＮＡポリメラーゼもコードするという条件で、真核ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えばリボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えばＣＭＶ早期プロモーター又はアクチンプロモーター又はＵｌ ｓｎＲＮＡプロモーター）若しくは通常ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６ ｓｎＲＮＡ又は７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）又は原核生物プロモーター、例えばＴ７プロモーターでよい。プロモーターは膵臓へのトランス遺伝子発現も指令し得る（例えば膵臓のインスリン調節配列（Ｂｕｃｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：２５１１−２５１５）を参照のこと）。
【０１８７】
加えて、トランス遺伝子発現は、例えば、ある生理的レギュレータ、例えば、循環グルコースレベル、又はホルモンに感受性の調整配列などの誘導型調整配列及び発現系を使用することによって正確に調整し得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ， １９９４， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ８：２０−２４）。細胞内又は哺乳類内トランス遺伝子発現の制御に適切な、そのような誘導型発現系としては、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学的誘導物質、及びイソプロピル‐ベータ‐Ｄ１‐チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調整が挙げられる。当業者はｄｓＲＮＡトランス遺伝子の意図した使用に基づき適切な調整／プロモーター配列を選択することができるだろう。
【０１８８】
一般的に、ｄｓＲＮＡ分子を発現可能な組換えベクターは下記の通り送達され、標的細胞内に残存する。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用し得る。そのようなベクターは必要に応じて反復投与し得る。ｄｓＲＮＡはいったん発現すると、標的ＲＮＡと結合し、その機能又は発現を調節する。ｄｓＲＮＡ発現ベクターは、静脈内若しくは筋肉内投与、患者から体外移植された標的細胞へ投与後の患者への再導入、又は所望の標的細胞内への導入を可能とする他の任意の手段などによって全身に送達し得る。
【０１８９】
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは典型的には、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクトアミン）又は非カチオン性脂質担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞内にトランスフェクトされる。１週間以上の単独第ＶＩＩ因子遺伝子又は複数第ＶＩＩ因子遺伝子の異なる領域を標的とするｄｓＲＮＡ介在性ノックダウンのための複数脂質トランスフェクションも本発明によって企図される。ベクターの宿主細胞内への成功的導入は既知の様々な方法を使用して監視し得る。例えば、一過性トランスフェクションは緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のような蛍光標識などのレポータを用いてシグナル化し得る。ｅｘ ｖｉｖｏ細胞の安定したトランスフェクションは、ハイグロマイシンＢ耐性のような特異性環境因子（例えば、抗生物質及び薬物）耐性を有するトランスフェクトした細胞を提供する標識を使用して確実にし得る。
【０１９０】
第ＶＩＩ因子特異性ｄｓＲＮＡ分子はまたベクター内に挿入し、ヒト患者に対する遺伝子治療ベクターとして使用もし得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与によって（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）又は定位注入によって（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）、対象に送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は許容可能な希釈剤内の遺伝子治療ベクターを含み得、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放マトリックスを含み得る。あるいは、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから完全な遺伝子送達ベクターを無傷で産生し得る場合、医薬調製物は遺伝子送達系を産生する細胞を１つ又は複数含み得る。
【０１９１】
別段の指定がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本発明の実施又は試験には、本明細書に記載のものと類似した又は同等の方法及び材料を使用し得るが、適切な方法及び材料を下に記載する。全ての刊行物、特許出願、特許、及び本明細書に記載した他の参考文献がその全体を参照することにより組み込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含め、本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は例証することのみを意図し、限定する意図はない。
【実施例】
【０１９２】
（実施例１）
ＦＶＩＩ標的ｓｉＲＮＡの設計。凝固第ＶＩＩ因子（ＡＩ１３２６２０、Ｃｆ７、凝固第ＶＩＩ因子前駆体、凝固第ＶＩＩ因子、ＦＶＩＩ、血清プロトロンビン転化促進因子、ＦＶＩＩ凝固蛋白質、及びエプタコグアルファとしても知られる）を標的とするｓｉＲＮＡを同定するためにｓｉＲＮＡ設計を実施した。
【０１９３】
２種のＦＶＩＩ転写変異体に対するヒトｍＲＮＡ配列、ＲｅｆＳｅｑ番号：ＮＭ＿０００１３１．３（３１４１ｂｐ）（例えば、図７Ａ及び７Ｂを参照のこと）及びＮＭ＿０１９６１６．２（３０７５ｂｐ）（２００７年１１月１８日付のＧｅｎＢａｎｋ記録）（例えば、図８Ａ及び８Ｂを参照のこと）を使用した。アカゲザル配列はＮＣＢＩ及びＥＮＳＥＭＢＬデータベース源から収集した（下記参照）。
【０１９４】
予測したヒトＦＶＩＩ特異性を有するヒト及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔｏ）ＦＶＩＩへに対して交差反応性であるｓｉＲＮＡ二重鎖を設計した。スクリーニングのために２４種の二重鎖を合成した。これらを表１に示す。
【０１９５】
ヒト‐アカゲザル交差反応。ヒト‐アカゲザル交差反応をｓｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ選択における必要条件として定義した。この目的のため、ＦＶＩＩのための２つのキュレーションされたヒト変異体及び入手可能なアカゲザル配列が１９ｍｅｒ ｓｉＲＮＡ標的部位を含むことを確認した。
【０１９６】
２種のＦＶＩＩ転写変異体に対するヒトｍＲＮＡ配列をＮＣＢＩヌクレオチドデータベースからダウンロードした；これらの１つであるＮＭ＿０００１３１．３をさらに参照配列として使用した。
【０１９７】
ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース（ＮＭ＿００１０８０１３６．１‐２４２４ｂｐ及びＤ２１２１２．１‐４７８ｂｐ、部分的ｃｄｓ）、及びＥＮＳＥＭＢＬデータベース（ＥＮＳＭＭＵＴ０００００００１４７７‐１３８９ｂｐ及びＥＮＳＭＭＵＴ００００００４２９９７‐１３２６ｂｐ）からダウンロードしたアカゲザルＦＶＩＩｍＲＮＡ配列を、全長２４２４ｂｐのアカゲザルＦＶＩＩの共通配列を構築するために配列比較した。
【０１９８】
全ての可能性のある１９ｍｅｒｓをヒトｍＲＮＡ参照配列から抽出し、ＮＭ＿０００１３１．３の３１２２（センス鎖）配列、反応性ＦＶＩＩｓｉＲＮＡに対応する標的部位候補のプールが得られた。
【０１９９】
キュレーションされたヒト変異体及びアカゲザル共通配列の両方に対して反応するｓｉＲＮＡを決定するため、ｓｉＲＮＡ標的部位の各候補をヒトＲｅｆＳｅｑ配列ＮＭ＿０１９６１６．２及び部分的なアカゲザル配列内で探索した。得られたｓｉＲＮＡをヒト‐アカゲザル交差反応性ｓｉＲＮＡと定義した。
【０２００】
特異性予測。予測したｓｉＲＮＡ特異性を最終選択基準として使用し、ヒトＦＶＩＩｍＲＮＡであるが、他のヒトｍＲＮＡではない配列を標的とすることによって示された。
【０２０１】
非ＦＶＩＩヒト転写産物（潜在的な「オフターゲット」遺伝子）を標的しないヒトＦＶＩＩ特異的ｓｉＲＮＡを同定するため、ヒト‐アカゲザル交差反応性ｓｉＲＮＡを、包括的ヒトトランスクリプトームを表すとみなされるヒトＲｅｆＳｅｑ ｍＲＮＡデータベースにおいて相同性検索に供した。
【０２０２】
この目的のため、ヒトＲｅｆＳｅｑデータベース（ｒｅｌｅａｓｅ２４）の各配列に対して最も相同性がヒットする領域のアンチセンス及びセンス鎖を決定するためにｆａｓｔＡアルゴリズムを使用した。
【０２０３】
得られた、全ＲｅｆＳｅｑエントリーの配列比較をｐｅｒｌスクリプトによってさらに分析してミスマッチの数及び位置を抽出し、これに基づき特異性スコアを算出した。
【０２０４】
算出した特異性スコアすなわち、高度に特異的であるスコア＞３、特異的であるスコア＝３、及び中等度に特異的であるスコア＝２．２〜２．８、に基づきｓｉＲＮＡ鎖を特異性分類に分類した。
【０２０５】
ｓｉＲＮＡ配列選択。ｓｉＲＮＡの選択において、アンチセンス鎖に対して特異性スコア２．８以上、及びセンス鎖に対してスコア２以上をｓｉＲＮＡ選択の必要条件として選択し、一方４個以上連続したＧ（ポリＧ配列）を含む配列は全て除外した。
【０２０６】
上記の全てのヒト及びアカゲザルＦＶＩＩｍＲＮＡに対し交差反応を示し、特異性基準を満たした２４種のｓｉＲＮＡ配列を選択した（表１参照）。得られた２４種のセットは２個の高度に特異的、１６個の特異的、及び６個の中等度に特異的なｓｉＲＮＡ（アンチセンス鎖の特異性のみ考慮）からなった。
【０２０７】
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｖｏのＦＶＩＩサイレンシング。ラット（ｎ＝４）に脂質様製剤９８Ｎ１２‐５で製剤化したｓｉＦＶＩＩを１．２５、２．５、３、３．５、４、５、及び１０ｍｇ／ｋｇ単回静脈注射した。
【０２０８】
動物を投与後４８時間に出血させ及び屠殺した。肝第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベルの有意な用量依存的低下が観察され、１．２５、２．５、及び５ｍｇ／ｋｇ投与時に各々４０％、８０％、及び９０％超抑制された（図１）。策定した対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔ）を使用時に抑制は観察されず、抑制の特異性が示された。肝第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベル低下は同時に血清第ＶＩＩ因子蛋白質レベルの用量依存的低下を引き起こし、最高用量投与時にはほぼ完全に抑制した（図２）。
【０２０９】
予期した通り、有意に低下した血清第ＶＩＩ因子レベルは処理した動物において表現型効果を生み出した。第ＶＩＩ因子は外因性凝固経路の一部であるため、処理した動物は、プロトロンビン時間（ＰＴ）延長での測定によると、この経路を通じた凝固の異常を有していた（図３）。策定した対照群はＰＴ摂動を示さなかったため、表現型効果は特異的であり送達ビヒクルに起因しないことが見出された。得られた遺伝子の発現抑制は高度に持続性であった。第Ｖｌｌ因子を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＶＩＩ）を製剤化した９８Ｎｌ２‐５の単回注入で、ほぼ４週間持続する発現抑制の媒介が可能であった。
【０２１０】
ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の配列は下記の通りである。
【０２１１】
【数１】
【０２１２】
２’‐Ｏ‐Ｍｅ修飾ヌクレオチドは小文字で、２’‐フルオロ修飾ヌクレオチドは太字の小文字で、及びホスホロチオエート連結はアスタリスクで表す。ｓｉＲＮＡは等モル量の相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖をアニールすることによって作製した。
【０２１３】
使用した全ての動物手順は動物倫理審議委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認され、適用可能な地方、州、及び連邦規制に準拠した。Ｃ５７ＢＬ／６系マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ， ＭＡ）及びＳｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙ系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ， ＭＡ）に生理食塩水又は脂質様製剤内ｓｉＲＮＡのいずれかを尾静脈から０．０１ｍＬ／ｇ注入した。後眼窩からの採血によって採取した試料においける第ＶＩＩ因子蛋白質の血清レベルを、色原体アッセイ（Ｃｏａｓｅｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ， ＤｉａＰｈａｒｍａ Ｇｒｏｕｐ， ＯＨ 又はＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ， Ａｎｉａｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， ＯＨ）を使用して測定した。第ＶＩＩ因子の肝ｍＲＮＡレベルは分岐ＤＮＡ法（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ， Ｐａｎｏｍｉｃｓ， ＣＡ）を使用して測定した。
【０２１４】
脂質様ベースのｓｉＲＮＡ製剤には、脂質様物質、コレステロール、ポリ（エチレングリコール）‐脂質（ＰＥＧ‐脂質）、及びｓｉＲＮＡが含まれた。製剤はＳｅｍｐｌｅ及び同僚（Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ８０：２３１０−２３２６， ２００１； Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５１０：１５２−１６６， ２００１）により記載されたものに類似したプロトコルを使用して調製した。９８Ｎ１２‐５（１）・４ＨＣｌ ＭＷ １４８９、ｍＰＥＧ２０００‐セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）ＭＷ ２６３４又はｍＰＥＧ２０００‐ＤＭＧ ＭＷ ２６６０、及びコレステロールＭＷ ３８７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ストック溶液をエタノール中で調製し、混合してモル比４２：１０：４８を得た。混合脂質を１２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．２に添加して３５％エタノールを含む溶液を得、空の脂質様ナノ粒子が自然に形成された。得られたナノ粒子を０．０８μ膜を通して押し出した（２パス）。３５％エタノール及び５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．２内ｓｉＲＮＡを１：７．５（重量：重量）のｓｉＲＮＡ：総脂質でナノ粒子に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ含有脂質様ナノ粒子のエタノール除去及び緩衝液交換は１００，０００ＭＷＣＯ膜を使用した、リン酸緩衝食塩水に対する接線流濾過によって達成した。最終的に、０．２μ無菌性フィルターを通して製剤を濾過した。粒子サイズはＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳ （Ｍａｌｖｅｒｎ， ＵＫ）を使用して測定した。ｓｉＲＮＡ含量は２６０ｎｍのＵＶ吸収によって測定し、ｓｉＲＮＡ取り込み効率をＲｉｂｏｇｒｅｅｎ法３２によって測定した。得られた粒子の平均直径は約５０ｎｍ、ピーク幅２０ｎｍ、及びｓｉＲＮＡ取り込み効率＞９５％であった。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号も参照のこと。
【０２１５】
【表４】
【０２１６】
（実施例３）
ウイルス性出血性発熱治療標的としての第ＶＩＩ因子。マウス肝細胞内ＶＩＩ因子の頑強なｉｎ ｖｉｖｏ発現抑制が脂質で製剤化したＦＶＩＩｄｓＲＮＡ（ＬＮＰ‐０１ ＦＶＩＩ）投与後に観察された（図４）。マウスにｄｓＲＮＡを静脈内投与し、２４時間後ＦＶＩＩ蛋白質について血清を分析した。ＦＶＩＩ蛋白質レベルの用量依存的な低下が生じた。ＬＮＰ‐０１で製剤化したルシフェラーゼｓｉＲＮＡを陰性対照として使用した。
【０２１７】
第ＶＩＩ因子に対する非最適化リポソーム的に製剤化したｄｓＲＮＡを使用した予備的データはエボラウイルス感染マウスにおいて有益な生存効果を示した（図５）。マウスはＬＮＰ‐０１で製剤化したｓｉＲＮＡで、エボラ−ザイールの３０，０００ＬＤ５０感染後０日目（５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．）及び３日目（３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）に処理した。マウス１０匹／治療群の生存を監視した。陰性対照は、未処理群マウス及びＬＮＰ‐０１で製剤化したルシフェラーゼｓｉＲＮＡ処理群マウスを含んだ。観察結果は組換え抗凝固剤ＮａｐＣ２で見られた利益と一致し（Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｌａｎｃｅｔ， ３６２：１９５３−１９５８）、特に、エボラ感染非ヒト霊長類及びヒトに見られる凝固因子異常と比較して、マウスモデルにおいては凝固因子異常における役割が低いことを考慮すると、有望であった。
【０２１８】
（実施例４）
ｓｉＦＶＩＩによる治療は長期の効果を示した。
【０２１９】
Ｃ５７ＢＬ／６系マウスをＬＮＰ０ｌ‐ｓｉＦＶＩＩの５ｍｇ／ｋｇ単回ボーラス静脈注射によって処理した。図６は本投与がＦＶＩＩレベル低下を惹起し、３週間より長く持続させたことを示す。
【０２２０】
（実施例５）
ｄｓＲＮＡの合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書中で特に記載されない場合、そのような試薬は、分子生物学において適用するための品質／純度標準の分子生物学用試薬を供給する任意の業者から入手することができる。
【０２２１】
ｓｉＲＮＡの合成
単鎖ＲＮＡをＥｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び固体支持体として制御細孔ガラス（ＣＰＧ， ５００Å， Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）使用して、固体相合成によって１μＭ規模で産生した。ＲＮＡ及び２’‐Ｏ‐メチルヌクレオチド含有ＲＮＡを各々対応するホスホラミダイト及び２’‐Ｏ‐メチルホスホラミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、固体相合成によって作製した。これら構成要素は、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （Ｅｄｒｓ．）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， ＵＳＡに記載されているような標準ヌクレオシドホスホラミダイトを使用してオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に組み込んだ。ホスホロチオエート連結はヨウ素酸化剤溶液をＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ， Ｇｌａｓｇｏｗ， ＵＫ）のアセトニトリル溶液（１％）と置換して導入した。さらに補助試薬をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ （Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。
【０２２２】
定型手順に従い陰イオン交換ＨＰＬＣによって粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護及び精製を実行した。収率及び濃度は分光光度計（ＤＵ ６４０Ｂ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ， ＵｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉＢｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、波長２６０ｎｍの各ＲＮＡ溶液のＵＶ吸収によって測定した。アニーリング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ塩化ナトリウム）内で、相補鎖の等モル溶液を混合することによって二本鎖ＲＮＡを作製し、８５〜９０℃の水浴で３分間温め、３〜４時間室温に冷却する。アニーリングしたＲＮＡ溶液を使用時まで−２０℃で保存した。
【０２２３】
３’‐コレステロール複合化ｓｉＲＮＡ（以下、‐Ｃｈｏｌ‐３’と称す）の合成のため、適切に修飾した固体支持体をＲＮＡ合成のために使用する。修飾した固体支持体は下記の通り調製する。
【０２２４】
ジエチル‐２‐アザブタン‐１，４‐ジカルボキシレート ＡＡ
【０２２５】
【化２】
【０２２６】
氷冷したエチルグリシナート塩酸（３２．１９ｇ、０．２３モル）の水溶液（５０ｍＬ）内に４．７Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を撹拌しながら添加する。次いで、エチルアクリラート（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、ＴＬＣによって反応終了を確認するまで混合物を室温で撹拌する。１９時間後、溶液をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）により分離する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過して蒸発させる。残渣を蒸留してＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得る。
【０２２７】
３‐｛エトキシカルボニルメチル‐［６‐（９Ｈ‐フルオレン‐９‐イルメトキシカルボニル‐アミノ）‐ヘキサノイル］‐アミノ｝‐プロピオン酸エチルエステル ＡＢ
【０２２８】
【化３】
【０２２９】
Ｆｍｏｃ‐６‐アミノ‐ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解して氷冷する。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を０℃で溶液に添加する。次いでジエチル‐アザブタン‐１，４‐ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加する。溶液を室温にし、さらに６時間撹拌する。反応終了はＴＬＣによって確認する。反応混合物を減圧濃縮し、エチルアセテートを添加して、ジイソプロピル尿素を沈殿させる。懸濁液を濾過する。濾過液を５％塩酸水溶液、５％重炭酸ナトリウム及び水で洗浄する。併合有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して粗生成物を得、カラムクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）により精製して、ＡＢ １１．８７ｇ（８８％）を得る。
【０２３０】
３‐［（６‐アミノ‐ヘキサノイル）‐エトキシカルボニルメチル‐アミノ］‐プロピオン酸エチルエステル ＡＣ
【０２３１】
【化４】
【０２３２】
３‐｛エトキシカルボニルメチル‐［６‐（９Ｈ‐フルオレン‐９‐イルメトキシカルボニルアミノ）‐ヘキサノイル］‐アミノ｝‐プロピオン酸エチルエステル ＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を０℃で２０％ピペリジンのジメチルホルムアミド溶液に溶解する。該溶液を１時間撹拌し続ける。反応混合物を減圧濃縮し、残渣に水を添加し、生成物をエチルアセテートで抽出する。粗生成物をその塩酸塩へ転換することにより精製する。
【０２３３】
３‐（｛６‐［１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イルオキシカルボニルアミノ］‐ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル‐アミノ）‐プロピオン酸エチルエステル ＡＤ
【０２３４】
【化５】
【０２３５】
３‐［（６‐アミノ‐ヘキサノイル）‐エトキシカルボニルメチル‐アミノ］‐プロピオン酸エチルエステル ＡＣの塩酸塩（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン内に取り込む。懸濁液を氷上で０℃に冷却する。懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加する。生成溶液にコレステリルクロロホルメート（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を一晩撹拌する。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄する。生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製する（１０．３ｇ、９２％）。
【０２３６】
１‐｛６‐［１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イルオキシカルボニルアミノ］‐ヘキサノイル｝‐４‐オキソ‐ピロリジン‐３‐カルボン酸エチルエステル ＡＥ
【０２３７】
【化６】
【０２３８】
カリウムｔ‐ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を乾燥トルエン３０ｍＬ内でスラリー状にする。混合物を氷上で０℃に冷却し、ジエステルＡＤ ５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）を２０分以内撹拌しながら緩徐に添加する。添加中、温度を５℃未満に保つ。撹拌を０℃で３０分継続し、氷酢酸１ｍＬを添加し、直後にＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ ４ｇの水溶液４０ｍＬを添加する。生成混合物を２回、各ジクロロメタン１００ｍＬで抽出し、併合有機抽出物を２回各１０ｍＬリン酸緩衝液で洗浄し、乾燥し、蒸発乾固させる。残渣を６０ｍＬトルエンに溶解し、０℃に冷却し、冷却したｐＨ９．５炭酸塩緩衝液５０ｍＬで３回抽出する。水性抽出物をリン酸でｐＨ３に調節し、併合クロロホルム４０ｍＬで５回抽出し、乾燥させ、蒸発乾固させる。残渣を２５％エチルアセテート／ヘキサンを使用したカラムクロマトグラフィーにより精製し、ｂ‐ケトエステル１．９ｇ（３９％）を得る。
【０２３９】
［６‐（３‐ヒドロキシ‐４‐ヒドロキシメチル‐ピロリジン‐１‐イル）‐６‐オキソ‐ヘキシル］‐カルバミン酸１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イル エステル ＡＦ
【０２４０】
【化７】
【０２４１】
ｂ‐ケトエステル ＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）及び水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）の還流混合物にメタノール（２ｍＬ）を１時間かけて滴下する。撹拌を還流温度で１時間継続する。室温に冷却後、１Ｎ ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、混合物をエチルアセテート（３×４０ｍＬ）で抽出する。併合エチルアセテート層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧濃縮して生成物を得て、カラムクロマトグラフィーにより精製する（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）（８９％）。
【０２４２】
（６‐｛３‐［ビス‐（４‐メトキシ‐フェニル）‐フェニル‐メトキシメチル］‐４‐ヒドロキシ‐ピロリジン‐１‐イル｝‐６‐オキソ‐ヘキシル）‐カルバミン酸１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル‐２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈ‐シクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イル エステル ＡＧ
【０２４３】
【化８】
【０２４４】
ジオール ＡＦ（１．２５ｇ、１．９９４ｍｍｏｌ）をピリジン（２×５ｍＬ）と減圧蒸発させて乾燥させる。無水ピリジン（１０ｍＬ）及び４，４’‐ジメトキシトリチルクロライド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら添加する。反応を室温で一晩実行する。反応をメタノールの添加によって停止させる。反応混合物を減圧濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加する。有機層を１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して、濃縮する。残渣のピリジンをトルエンにより蒸発させて除去する。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、Ｒｆ＝０．５の５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３溶液）により精製する（１．７５ｇ、９５％）。
【０２４５】
コハク酸モノ‐（４‐［ビス‐（４‐メトキシ‐フェニル）‐フェニル‐メトキシメチル］‐１‐｛６‐［１７‐（１，５‐ジメチル‐ヘキシル）‐１０，１３‐ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７‐テトラデカヒドロ‐１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン‐３‐イルオキシカルボニルアミノ］‐ヘキサノイル｝‐ピロリジン‐３‐イル）エステル ＡＨ
【０２４６】
【化９】
【０２４７】
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、一晩４０℃で減圧乾燥させる。混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を添加して溶液をアルゴン雰囲気下、室温で１６時間撹拌する。次いでそれをジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）及び水（２×２０ｍＬ）で洗浄する。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固させる。次工程のため残渣をそのように使用する。
【０２４８】
コレステロール誘導体化ＣＰＧ ＡＩ
【０２４９】
【化１０】
【０２５０】
サクシネート ＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン／アセトニトリル混合物（３：２、３ｍＬ）に溶解する。そのＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．２５ｍＬ）に２，２’‐ジチオ‐ビス（５‐ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／ジクロロエタン溶液（３：１、１．２５ｍＬ）を逐次添加する。生成溶液にトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．６ｍＬ）を添加する。反応混合物は明橙色に変色する。溶液はリストアクションシェイカーを短時間（５分）使用して十分に撹拌する。長鎖アルキルアミン‐ＣＰＧ（ＬＣＡＡ‐ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加する。懸濁液を２時間撹拌する。ＣＰＧは焼結漏斗を介して濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン及びエーテルによって逐次洗浄する。未反応アミノ基は無水酢酸／ピリジンを使用してマスクする。ＣＰＧの達成負荷はＵＶ測定（３７ｍＭ／ｇ）によって測定する。
【０２５１】
５’‐１２‐ドデカン酸ビスデシルアミド基（以下「５’‐Ｃ３２‐」と称す）又は５’‐コレステリル誘導体基（以下「５’‐Ｃｈｏｌ‐」と称す）を有するｓｉＲＮＡの合成は、コレステリル誘導体のために、酸化工程をホスホロチオエート連結を核酸オリゴマーの５’末端に導入するためにＢｅａｕｃａｇｅ試薬を使用して実施することを除き、国際公開第２００４／０６５６０１号に記載されているように実施する。
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが実質的に互いに相補的な少なくとも２つの配列を含み、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が第一配列を含み、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的な領域を含む第二配列を含み、前記領域が長さ３０ヌクレオチド未満であり、前記第一配列が表１、２、及び３の前記センス鎖配列からなる群から選択され、前記第二配列が表１、２、及び３の前記アンチセンス鎖配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
センス鎖配列が配列番号５の配列を含み、アンチセンス鎖配列が配列番号６の配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
９８Ｎｌ２‐５で製剤化した第ＶＩＩ因子標的ｓｉＲＮＡの単回投与によって少なくとも２５％発現抑制することにより、ｄｓＲＮＡがラット肝第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベルを低減し得る、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｄｓＲＮＡが少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドが、２’‐Ｏ‐メチル修飾ヌクレオチド、５’‐ホスホロチオエート基含有ヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記修飾ヌクレオチドが、２’‐デオキシ‐２’‐フルオロ修飾ヌクレオチド、２’‐デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド、脱塩基性ヌクレオチド、２’‐アミノ修飾ヌクレオチド、２’‐アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、及びヌクレオチド含有非天然塩基からなる群から選択される、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
ホスホロチオエート又は２’修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
相補性領域が少なくとも１５ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
相補性領域が１９〜２１ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡ及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
細胞内ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害方法であって、
（ａ）請求項１に記載の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入する工程と、
（ｂ）工程（ａ）において産生される細胞を、第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を分解するのに十分な時間維持し、それによって細胞内の第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害する工程とを含む方法。
【請求項１３】
ウイルス性出血性発熱の治療、予防又は管理を必要とする患者に対する請求項１に記載のｄｓＲＮＡの治療的又は予防的有効量の投与を含む、ウイルス性出血性発熱の治療、予防又は管理方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節配列を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１】
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが実質的に互いに相補的な少なくとも２つの配列を含み、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が第一配列を含み、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が第ＶＩＩ因子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に実質的に相補的な領域を含む第二配列を含み、前記領域が長さ３０ヌクレオチド未満であり、前記第一配列が表１、２、及び３の前記センス鎖配列からなる群から選択され、前記第二配列が表１、２、及び３の前記アンチセンス鎖配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
センス鎖配列が配列番号５の配列を含み、アンチセンス鎖配列が配列番号６の配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
９８Ｎｌ２‐５で製剤化した第ＶＩＩ因子標的ｓｉＲＮＡの単回投与によって少なくとも２５％発現抑制することにより、ｄｓＲＮＡがラット肝第ＶＩＩ因子ｍＲＮＡレベルを低減し得る、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｄｓＲＮＡが少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドが、２’‐Ｏ‐メチル修飾ヌクレオチド、５’‐ホスホロチオエート基含有ヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記修飾ヌクレオチドが、２’‐デオキシ‐２’‐フルオロ修飾ヌクレオチド、２’‐デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド、脱塩基性ヌクレオチド、２’‐アミノ修飾ヌクレオチド、２’‐アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、及びヌクレオチド含有非天然塩基からなる群から選択される、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
ホスホロチオエート又は２’修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
相補性領域が少なくとも１５ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
相補性領域が１９〜２１ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
【請求項１１】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡ及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
細胞内ＶＩＩ因子遺伝子発現の阻害方法であって、
（ａ）請求項１に記載の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞内に導入する工程と、
（ｂ）工程（ａ）において産生される細胞を、第ＶＩＩ因子遺伝子のｍＲＮＡ転写産物を分解するのに十分な時間維持し、それによって細胞内の第ＶＩＩ因子遺伝子発現を阻害する工程とを含む方法。
【請求項１３】
ウイルス性出血性発熱の治療、予防又は管理を必要とする患者に対する請求項１に記載のｄｓＲＮＡの治療的又は予防的有効量の投与を含む、ウイルス性出血性発熱の治療、予防又は管理方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のｄｓＲＮＡの少なくとも一方の鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節配列を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む細胞。
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１１−５０５８３３（Ｐ２０１１−５０５８３３Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８１０９（Ｐ２０１０−５３８１０９）
【出願日】平成２０年１２月１０日（２００８．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６１５８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７６４００
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５０８２９０９１０）アルニラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１０日（２００８．１２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８６１５８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７６４００
【国際公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【出願人】（５０８２９０９１０）アルニラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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