等温核酸増幅のための材料および方法
標的核酸配列の等温増幅のための方法が開示される。標的核酸は、ヘリカーゼ活性を有する酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する抗体により増幅される。HPV核酸を含む標的核酸配列の等温増幅のためのキットも開示される。キットは、ヘリカーゼ活性を有する第1の抗体ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、その全体について参照により本明細書に組み入れられる、2010年1月8日に出願した米国特許仮出願第61/293,372号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
核酸の増幅は、研究、法医学、医学および農業で広く用いられている。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、インビトロDNA増幅のための最も広く用いられている方法である。典型的にはPCR反応は、標的配列の5'境界および3'境界にハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドプライマー、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）を重合し二本鎖産物を生成することによりアニーリングさせたプライマーを伸長するDNA依存性DNAポリメラーゼを利用する。反応混合物の温度を上昇および低下させること（サーモサイクリングとして公知）により、DNA産物の二本鎖が分離し、アニーリングおよび伸長の次のラウンドの鋳型として機能することができ、工程が繰り返される。
【０００３】
ここ数年、サーモサイクリングに依拠しない他の核酸増幅方法が開発されている。これらの方法は、実行するのに温度変化の繰り返しに依拠しないため、「等温標的増幅」として大別される。
【０００４】
その1つの例が、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）である。インビボではポリメラーゼは、様々なアクセサリータンパク質の助けを借りて核酸を増幅する。そのようなアクセサリータンパク質の分類の1つは、「ヘリカーゼ」と名付けられ、核酸の二重鎖を増幅の間にポリメラーゼが利用できる一本鎖に分離するという共通の特徴を共有する。HDAは、ヘリカーゼを利用してプライマーハイブリダイゼーションおよびその後のポリメラーゼによるプライマー伸長のための一本鎖鋳型を生成することにより、インビトロでこの一般的なスキームを模倣する。ヘリカーゼを反応混合物に加えることにより、プライマーの鋳型との融解および再アニーリングを繰り返す必要なく、増幅の繰り返しが進められる。したがって、高価なサーモサイクリング装置または退屈な手動のサーモサイクリングを避けることができる。さらに、HDAは、単純な反応スキームを有しかつプロセス全体にわたって同一の温度で行うことができる真の等温反応であることにより、他の等温DNA増幅方法に比べて複数の利点を提供する。
【０００５】
逆転写PCR（RT-PCR）と名付けられたPCRのバリエーションの1つは、特に遺伝子発現を測定するために、試料中のRNAを解析するために、および修飾された相補的cDNAプローブを合成するために頻繁に用いられる。典型的なスキームでは、逆転写酵素活性を有する酵素が、RNA鋳型を用いて相補DNA鎖（cDNA）を生成し、次いでPCRを介して増幅される。HDAはまた、cDNAを増幅するために用いられてもよく、その場合、工程は、逆転写HDA（RT-HDA）と名付けられる。どちらの場合にも、各活性に対して典型的には別々の酵素が用いられる：cDNAの作製に対して逆転写酵素；cDNAの増幅に対してDNA依存性DNAポリメラーゼ；およびHDAの場合、一本鎖鋳型の作製に対してヘリカーゼ。
【０００６】
残念なことに、逆転写酵素は、典型的には校正能力を有していないため、高い頻度で誤りが生じうる。さらに、反応混合物に添加された各酵素は、異なる至適温度、反応条件、試薬などの潜在的必要性を増大させる。よって多くの場合、忠実度の高いDNAを大量に産生する酵素一式と条件一式を見いだすことは難しい作業である。この作業を単純化する1つの方法は、関係する酵素の数を減らすことである。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本明細書において、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を用いる標的核酸の等温増幅を行うための材料および方法を開示する。
【０００８】
1つの局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を用いる、標的核酸の等温増幅のための方法に関する。
【０００９】
別の局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を用いる、標的RNAの等温増幅のための方法に関する。
【００１０】
別の局面は、ニック誘導活性（nick-inducing activity）を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を用いる、標的RNAの等温増幅の方法に関する。
【００１１】
別の局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を用いる、RT-HDAの方法に関する。
【００１２】
別の局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を用いることによりHPVの核酸配列を検出する工程を含む、試料中のヒトパピローマウイルス（HPV）の存在を同定する方法に関する。
【００１３】
さらに別の局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を含む、標的核酸の等温増幅のためのキットに関する。
【００１４】
別の局面において、ヘリカーゼ活性を有する酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を含む、標的RNAの等温増幅のためのキットが提供され、これはDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有するいかなる他の酵素も含まない。
【００１５】
別の局面は、逆転写酵素活性を有する酵素もしくはポリメラーゼ活性を有する酵素、または両方が、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素に置き換えられている、RT-HDAのためのキットに関する。
【００１６】
別の局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を含む、試料中の少なくとも1つのヒトパピローマウイルス（HPV）の存在および／または存在量を決定するためのキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】PYROPHAGE 3173がBstポリメラーゼの存在下でワンステップRH-HDAにおいて他の逆転写酵素と同じくらい効果があることを示す。増幅は、Bstポリメラーゼ（2U）およびuvrDヘリカーゼ（1U）を利用して、25 μlで75分間行われた。CtRNAを標的として用いた。10および100 RNAコピーに対するサーモスクリプト（Thermoscript）、Thermo-X、トランスクリプター（Transcriptor）およびPYROPHAGEのアッセイシグナル（Luminex MFI）を示す。
【図２】PYROPHAGE 3173酵素がワンステップ等温RH-HDAにおいて逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼの両方として機能しうることを示す。増幅は、25 μLで75分間行われた。反応混合物は、Bstあり（Bst+とラベル表示されたバー）またはBstポリメラーゼの添加なし（Bst-とラベル表示されたバー）のいずれかでPYROPHAGE 3173（2.5 U）を含んだ。Ct RNA（25または100コピー）を標的として用いた。検出はLuminexで行われ、結果をシグナル／ノイズとして提示する。
【図３】Bstポリメラーゼ非存在下でTHERMO-X、サーモスクリプト、トランスクリプター、およびPYROPHAGE 3173を用いるRT-HDA反応を示す。反応条件は図2で記載したものと同じである。
【図４】PYROPHAGE 3173酵素がBstの非存在下でDNAを増幅しうることを示す。増幅は、50 μLで90分間行われた。反応物はPYROPHAGE 3173（5U）またはBstポリメラーゼ（20U）のいずれかを含んだ。HPV16 DNAをアルカリ変性による標準的なtHDAアッセイの標的として用いた。検出はLuminexで行われ、結果をシグナル／ノイズとして提示する。
【図５】2つのHPV 16 RNA標的を増幅するRT-HDA反応のノイズに対するシグナル（S／N）を示す。各バーは種々のプライマー濃度による増幅後の2つの標的それぞれのS／N（y軸）を表示する。プライマー濃度および増幅標的をx軸に表示する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
1つの局面において、標的核酸の増幅は、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素により達成される。二重活性を有するこの酵素は、DNA依存性DNAポリメラーゼおよび／または逆転写酵素を用いる代わりに、またはそれに追加して用いられる。
【００１９】
本明細書で用いられる「核酸」は、二本鎖（ds）または一本鎖（ss）のDNA分子、RNA分子またはDNA-RNAハイブリッドを指す。二本鎖核酸分子は、ニックが入ってもよく、またはインタクトであってもよい。二本鎖または一本鎖の核酸分子は、線状または環状であってもよい。二重鎖は、平滑断片にされてもよく、または一本鎖の末端部を有してもよい。一本鎖分子は、ヘアピンまたはループおよびステムの形態の二次構造を有してもよい。核酸は、環境、食物、農業、発酵、血液、ミルク、脳脊髄液、痰、唾液、便、肺吸引液、粘膜組織のぬぐい液もしくは組織試料などの生体液、または細胞を含む、様々な供給源から単離されてもよい。核酸試料は、細胞、細菌またはウイルスから得られてもよく、以下のいずれかを含んでもよい：染色体DNA、プラスミドDNAを含む染色体外DNA、組換えDNA、DNA断片、メッセンジャーRNA、転移RNA、リボソームRNA、二本鎖RNAまたは細胞、細菌もしくはウイルスで生じる他のRNA。核酸は、化学合成の手段によりインビトロで単離、クローン化または合成されてもよい。任意の上記核酸は、核酸内の個別の核酸を（例えばメチル化により）化学的に変化させる修飾に供してもよい。修飾は、自然にまたはインビトロでの合成により生じてもよい。用語「二重鎖（duplex）」は、全体的にまたは部分的に二本鎖である核酸分子を指す。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「標的核酸」は、増幅させることを意図する任意の核酸配列を指す。増幅させるべき標的核酸分子の大きさは、例えば、100を上回り5000 bpまでの範囲を含む約50 bpから約100 kbの範囲であってもよい。標的核酸は、より長い二本鎖または一本鎖の核酸内に含まれてもよい。あるいは、標的核酸は、二本鎖または一本鎖の核酸全体であってもよい。
【００２１】
1つの態様において、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素はPYROPHAGE 3173である。PYROPHAGE 3173は、その内容が全体として組み入れられる、U.S. Patent Application Publication No. 2008/0268498として公開されたU.S. Patent Application No. 12/089,221に記載されている。PYROPHAGE 3173は、LUCIGEN Corporationから入手可能であり、忠実度が高い増幅をもたらす、固有の3'→5'エキソヌクレアーゼ（校正）活性を有する耐熱性バクテリオファージ酵素である。この活性のため、ホスホロチオエートプライマーを使用し、増幅前に標的核酸鋳型およびプライマーへの曝露を最小とすることが好ましい可能性がある。あるいは、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性が不活性化されている（PYROPHAGE 3173 Exo-変異体）変異体バージョンが用いられてもよい。PYROPHAGE 3173はまた、二本鎖DNAによるDNA合成を可能にする鎖置換活性も有する。それはニックでも効率的に開始され、したがってDNA合成はプライマーによりまたは部位特異的ニッキング酵素により導入されるニックで開始されうる。PYROPHAGE 3173はまた、逆転写活性も有し、よってRNA鋳型に対して単一チューブ、単一酵素逆転写PCRを行うことができる。この二重活性のために、PYROPHAGE 3173は、RT-HDAで逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼの代わりとして用いられてもよい。さらに、PYROPHAGE 3173酵素の高い熱安定性は、より高いRNA増幅率を可能にする可能性がある。
【００２２】
1つの態様において、標的核酸は等温増幅を用いて増幅される。「等温増幅」は、単一の温度で行われる増幅を指す。これは、増幅手法と同じ温度またはより高い温度で実行される可能性がある、増幅の開始時の1回の短い時間（15分未満）を含まない。
【００２３】
1つの態様において、等温増幅法はRT-HDAである。典型的には、RT-HDAでは3種類の酵素が用いられる：逆転写酵素、ヘリカーゼ、およびDNA依存性DNAポリメラーゼ。逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼとしても公知である）は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）を重合することにより一本鎖RNA（ssRNA）を相補的一本鎖DNA（cDNA）へと転写するDNAポリメラーゼ活性を有する酵素である。同様のpyrophage酵素もまたds-DNAを形成するcDNAの「第2の鎖」を重合する可能性がある。これは、ss-RNAからds-DNAを合成する従来工程における2種類の酵素（逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ）の使用を否定する。ヘリカーゼは、ds-DNAの上鎖（top strand）および下鎖（bottom strand）のプライマー依存性DNA重合の繰り返し（増幅）のためにds-DNAを巻き戻す酵素活性を有する。次いで、DNA依存性DNAポリメラーゼは、dNTPを重合することによりcDNAを相補的一本鎖DNAに転写する。この工程は、指数関数的増幅がサーモサイクリングの必要無しに単一の温度で達成できるように繰り返される。1つの態様において、RT-HDAは、単一の酵素を用いて行われ、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方が提供される。
【００２４】
本明細書で用いられる「HDA」は、二本鎖核酸を巻き戻すためにヘリカーゼ調製物を用いて増幅用の鋳型を生成することにより核酸を増幅するためのインビトロでの方法である、ヘリカーゼ依存性増幅（Helicase Dependent Amplification）を指す。
【００２５】
本明細書で用いられる「ヘリカーゼ」または「ヘリカーゼ活性を伴うまたは有する酵素」は、二本鎖核酸を巻き戻すことができる任意の酵素を指す。例えば、ヘリカーゼは、全ての生物体、および複製、組換え、修復、転写、翻訳およびRNAスプライシングなどの核酸に関係する全てのプロセスで見いだされる酵素である。DNAまたはRNAに沿って5'→3'方向または逆の3'→5'方向に移動する任意のヘリカーゼが用いられてもよい。これは、原核生物、ウイルス、古細菌、および真核生物から得られたヘリカーゼ、または天然に存在する酵素の組換え型、ならびに特定の活性を有する類似体または誘導体を含む。天然に存在するDNAヘリカーゼの例は、大腸菌（E. coli）ヘリカーゼI、II、III、およびIV、Rep、DnaB、PriA、PcrA、T4 Gp41ヘリカーゼ、T4 Ddaヘリカーゼ、T7 Gp4ヘリカーゼ、SV40ラージT抗原、酵母RADを含む。有用である可能性があるさらなるヘリカーゼは、RecQヘリカーゼ、T. テングコンジェンシス（T. tengcongensis）およびT. サーモフィルス（T. thermophilus）由来の耐熱性UvrDヘリカーゼ、T. アクアチクス（T. aquaticus）由来の耐熱性DnaBヘリカーゼ、および古細菌および真核生物由来のMCMヘリカーゼを含む。
【００２６】
別の態様において、ヘリカーゼは、耐熱性のヘリカーゼである。核酸二重鎖の変性は、例えば45℃から75℃の範囲の高温を含むインキュベーション条件下で耐熱性ヘリカーゼ調製物を用いることにより促進することができる。耐熱性ヘリカーゼ調製物および耐熱性ポリメラーゼを用いて高温でHDAを行うことは、増幅の特異性を改善することができる、プライマー結合の特異性を増加させる可能性がある。
【００２７】
さらなる態様において、複数の異なるヘリカーゼ酵素が増幅反応に用いられる。複数のヘリカーゼの使用は、異なるヘリカーゼが種々の機能を連携して働かせ二重鎖核酸の巻き戻しの効率を高める特定の条件下で、HDAにおける標的増幅の収率および長さを向上させる可能性がある。例えば、処理能力は低いが平滑末端DNAを融解できるヘリカーゼは、優れた処理能力を有しているが巻き戻しの開始のために二重鎖領域の境界で一本鎖末端部を認識する第2のヘリカーゼと併用されてもよい。この例では、第1のヘリカーゼが最初に、長い核酸二重鎖の平滑末端を分離し5'および3'一本鎖末端部を生じさせ、次いでその限定された処理能力のためにその基質から解離する。続いて、この部分的に巻き戻された基質は、第2のヘリカーゼにより認識され、次いでその第2のヘリカーゼは非常に優れた処理能力によって巻き戻しプロセスを続ける。このようにして、核酸二重鎖中の長い標的は、複数のヘリカーゼを含むヘリカーゼ調製物の使用により巻き戻され、続いてHDA反応で増幅されてもよい。
【００２８】
さらなる態様において、アクセサリータンパク質が反応混合物に含まれる。「アクセサリータンパク質」は、ヘリカーゼ活性を刺激する能力を有する任意のタンパク質を指す。例えば、大腸菌MutLタンパク質は、UvrDヘリカーゼ活性を高めるためのアクセサリータンパク質である。アクセサリータンパク質は、選択されるヘリカーゼによって有用である。しかしながら、核酸の巻き戻しは、アクセサリータンパク質の非存在下でヘリカーゼにより達成されてもよい。
【００２９】
別の態様において、少なくとも1つの一本鎖結合タンパク質（SSB）反応混合物に含まれる。中温性のヘリカーゼは、SSBの存在下で活性の改善を示す。このような状況では、BBSの選択は概して、特定のタンパク質に限定されない。一本鎖結合タンパク質の例は、T4遺伝子32タンパク質、大腸菌SSB、T7 gp2.5 SSB、ファージphi29 SSBおよびこれらのタンパク質の切断型である。よって、ある態様において、1つまたは複数のSSBが増幅反応に加えられてもよい。
【００３０】
さらに別の態様において、少なくとも1つのコファクターが提供される。「コファクター」は、ヘリカーゼ巻き戻し活性に必要とされる低分子作用物質を指す。ヘリカーゼコファクターは、ヌクレオシド三リン酸（NTP）およびデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）およびマグネシウム（または他の二価カチオン）を含む。例えば、ATP（アデノシン三リン酸）は、0.1から100 mMの範囲、好ましくは1から10 mMの範囲（例えば3 mM）の濃度で、UvrDヘリカーゼのコファクターとして用いられてもよい。同様に、dTTP（デオキシチミジン三リン酸）は、1から10 mMの範囲（例えば3 mM）でT7 Gp4Bヘリカーゼのコファクターとして用いられてもよい。
【００３１】
さらなる態様において、DNA依存性DNAポリメラーゼは、配列依存性増幅においてcDNAを転写する。「配列依存性合成」または「配列依存性増幅」は、標的特異的プライマーの使用による試料中に存在する非標的配列に対する標的配列の増幅を指す。本明細書で用いられる「標的特異的プライマー」は、標的核酸上で予め決定された一本鎖領域に結合し、選択的に増幅すべき標的核酸のポリメラーゼ依存性複製を促進することができる一本鎖核酸を指す。
【００３２】
1つの態様において、一方が標的配列の5'隣接部にハイブリダイズしかつ他方が標的の3'隣接部にハイブリダイズする1対の標的特異的プライマーが、標的配列の指数関数的な増幅を達成するために用いられる。
【００３３】
別の態様において、複数対の標的特異的プライマーが、多重反応における異なる検出タグを同時に用いて複数の標的を増幅するための単一反応において利用されうる。多重化は通常、一塩基多型（SNP）解析および病原体の検出で用いられる。
【００３４】
概して、適当な標的特異的プライマー対は、短い合成オリゴヌクレオチドであり、例えば10ヌクレオチド以上かつ50ヌクレオチド未満の長さを有する。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマー設計は、ストリング（string）に基づくアライメントスコア、融解温度、プライマーの長さおよびGC含量などの種々のパラメータに関係する。標的特異的プライマーを設計するとき、重要な因子の1つは、増幅させるべき核酸分子に特異的な標的断片内で配列を選択することである。別の重要な因子は、反応用の標的特異的プライマーの融解温度を計算することである。標的特異的プライマーの融解温度は、そのオリゴヌクレオチドの長さおよびGC含量により決定される。好ましくは、プライマーの融解温度は、プライマーハイブリダイゼーションおよび標的増幅が行われる温度より約10から30℃高い。
【００３５】
「プライマーハイブリダイゼーション」は、プライマーが1つの鋳型鎖上でその相補配列にのみ特異的に結合する条件下での一本鎖核酸鋳型の領域へのオリゴヌクレオチドプライマーの結合を指し、鋳型中の他の領域への結合は指さない。ハイブリダイゼーションの特異性は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さ、ハイブリダイゼーション反応が行われる温度、イオン強度および反応混合物のpHによって影響される可能性がある。
【００３６】
各標的特異的プライマーは、標的核酸の各末端にハイブリダイズし、鋳型として標的ヌクレオチド配列を用いるポリメラーゼにより3'→5'方向に伸長されてもよい。特異的増幅を達成するために、相同なまたは完全に一致する標的特異的プライマーが好ましい。しかしながら、標的特異的プライマーは、5'末端に標的ヌクレオチド配列に相補的ではない配列を含んでもよい。あるいは、標的特異的プライマーは、その全体わたって標的核酸に正確に相補的ではないヌクレオチドまたは配列を含んでもよい。
【００３７】
標的特異的プライマーは、任意のデオキシリボヌクレオチド塩基A、T、GもしくはC、および／または1つまたは複数のリボヌクレオチド塩基A、C、U、G、および／または1つまたは複数の修飾ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド）を含んでもよく、修飾は、プライマーの核酸へのハイブリダイゼーションまたは標的特異的プライマーの伸長または二本鎖分子の変性を妨げない。標的特異的プライマーは、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸などの化学基または非ヌクレオチドリンカーで修飾され、その能力を向上させるかまたは増幅産物の特徴付けを容易にしてもよい。
【００３８】
概して、標的特異的プライマーの鋳型認識およびその後のアニーリングの特異性を可能にするのに適した変性の温度は、例えば20℃から75℃の温度範囲にわたって生じてもよい。好ましい変性温度は、どのヘリカーゼが融解工程のために選択されるかによって選択されてもよい。選択されたヘリカーゼの存在下での核酸の増幅のための至適温度を決定するための試験は、反応混合物の温度を変えてゲル電気泳動を用いて増幅産物を比較することにより日常的な実験により決定されうる。
【００３９】
標的特異的プライマーは、蛍光または化学発光標識、およびビオチン化などの修飾（例えば、カルボキシフルオレセインのアミン反応性フルオレセインエステルなどの蛍光タグ）に供されてもよい。他の標識方法は、放射性同位元素、発色団、およびビオチンまたはハプテンなどのリガンドを含み、それらは、直接的に検出できないが、その特異的結合パートナー、例えばアビジンおよび抗体の標識形態それぞれとの反応により容易に検出することができる。そのような修飾は、増幅産物を検出するために用いることができる。
【００４０】
「融解」、「巻き戻し」、または「変性」は、核酸二重鎖の2本の相補鎖の全体または一部を分離することを指す。
【００４１】
さらなる態様において、DNA依存性DNAポリメラーゼは、配列非依存性増幅においてcDNAを転写する。本明細書において用いられる「配列非依存性増幅」は、特定の配列を増幅しないDNA依存性DNAポリメラーゼにより行われる任意の増幅を指す。限定はしないが、例えば、ランダムプライマー混合物またはニック誘導剤は、配列非依存性増幅を開始するために用いられる可能性がある。
【００４２】
本明細書で用いられる「ランダムプライマー混合物」は、短く無作為に作製されたオリゴヌクレオチド配列の混合物を指す。
【００４３】
本明細書で用いられる「ニック開始性（nick-initiated）ポリメラーゼ活性」は、外部からのプライマーの非存在下でのポリメラーゼ活性を指し、それは鋳型中の一本鎖切断により開始される。合成は、外因性合成プライマーの末端ではなくDNA中の一本鎖切断で開始される。ニック開始性合成により、プライマーの除去は不必要であり、コスト、取り扱い時間および産物の損失または分解の可能性を低減させる。さらに、ニック開始性合成は、プライマーの自己伸長により引き起こされる偽の増幅シグナルを減少させる。ニックは、認識配列でニックを導入する酵素を用いることにより定義された位置に導入されてもよく、または標的ポリヌクレオチドに無作為に導入されてもよい。本明細書で用いられる「ニック誘導剤」は、二本鎖核酸の一方の鎖の2つの隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合に切れ目を導入する任意の酵素的もしくは化学的試薬または物理的処理を指す。ニック誘導酵素の例は、Bpu10 I、BstNB I、Alw I、BbvC I、BbvC I、Bsm I、BsrD、および大腸菌エンドヌクレアーゼIを含む。1つの態様において、少なくとも1つのニック誘導酵素が、反応混合物においてヘリカーゼの代わりとして含まれる。別の態様において、少なくとも1つのニック誘導酵素は、少なくとも1つのヘリカーゼに加えて反応混合物に加えられる。
【００４４】
他の増幅反応構成要素は、バッファー、バイオ分子、塩類、尿素、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリエチレングリコール（PEG）、マグネシウム、トポイソメラーゼ、アクセサリータンパク質、変性剤、コファクターまたはそれらの組み合わせを適切な状況において含んでもよい。プライマー開始増幅が望まれているとき、プライマーが増幅反応構成要素に加えられる。
【００４５】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸dNTP（すわなち、dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）は加えられ、DNAの新しい鎖を構築するために用いられる。ATPまたはTTPはエネルギー源として加えられる。ATPまたはTTPは、高い処理能力を有するヘリカーゼの一般的に好ましいエネルギー源である。平均して、1個のATP分子は、DNAヘリカーゼにより消費され1から4塩基対を巻き戻す。より長い標的を増幅するために、より短い標的と比べて、より多くのATPが消費される可能性がある。このような状況では、ヘリカーゼとともに使用するためのピルビン酸キナーゼに基づくATP再生システムを含むことが望ましい可能性がある。よって、特定の態様において、ATPもしくはTTPまたは組み合わせまたはピルビン酸キナーゼに基づくATP再生システムが、増幅反応構成要素に加えられる可能性がある。
【００４６】
トポイソメラーゼは、長いHDA反応で用いられ、HDAの長い標的単位複製配列を増幅する能力を向上させることができる。非常に長い直鎖DNA二重鎖がヘリカーゼにより分離されると、トポイソメラーゼの旋回（swivel）（緩和）機能がねじれを取り除き、巻きすぎを妨げる。例えば、大腸菌トポイソメラーゼIは、一方のDNA鎖にニックを導入することにより負の超らせんDNAを緩和するために用いられうる。DNAジャイレース（トポイソメラーゼII）は、DNA内に一過性の二本鎖切断を導入し、DNA鎖が相互に通り抜けることを可能にする。よって、特定の態様において、トポイソメラーゼもしくはジャイレース、または両方は、増幅反応に加えられる可能性がある。
【００４７】
さらなる態様において、増幅核酸産物は、エチジウムブロマイド染色および限定されないが放射標識、蛍光標識および酵素などの標識手段による増幅配列の検出を含む種々の方法により検出される可能性がある。例えば、HDA増幅産物は、ヘパリン構造の3'末端の近くにフルオロフォアを備えて設計されたオリゴヌクレオチドである、蛍光標識されたLUXプライマー（Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.）を用いて実時間で検出することができる。この立体構造は、別の消光成分なしに蛍光消光能を内因的に与える。プライマーが二本鎖増幅産物に導入されると、フルオロフォアは、脱消光され（dequenched）、蛍光シグナルの有意な増加をもたらす。
【００４８】
本開示はまた、ヘリカーゼ活性を有する酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を含むキットも包含する。キットは、1つまたは複数のdNTP、ATP、TTP、プライマー、マグネシウム、トポイソメラーゼ、SSBタンパク質、アクセサリータンパク質、変性剤、ポリエチレングリコール、コファクター、またはそれらの混合物から選択されるがこれらに限定されない、増幅反応構成成分をさらに含んでもよい。
【００４９】
さらなる態様は、等温増幅の標的である核酸を含む混合物に関する。核酸標的は、ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、RNA-DNAハイブリッド、または上記の任意の混合物であってもよい。標的核酸を含む混合物はまた、ヘリカーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素、ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する少なくとも1つの酵素も含む。標的核酸および酵素を含む混合物はまた、前記の増幅反応構成成分の1つまたは複数も含むことができる。
【００５０】
別の局面は、記載の増幅方法により得られた増幅核酸である。増幅核酸は、DNAまたはRNAであってもよい。
【００５１】
別の局面において、等温性逆転写酵素／増幅反応を用いてHPV RNAを検出するためのキットが提供され、キットは、逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する少なくとも1つの酵素を含む。1つの態様において、キットは、ヘリカーゼ活性およびニック誘導活性からなる群より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素をさらに含む。別の態様において、キットは、ヘリカーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素およびニック誘導活性を有する少なくとも1つの酵素をさらに含む。キットは、以下を含むがこれに限定されない、所望の増幅を実行するのに必要な他の試薬をさらに含んでもよい：バッファー；バイオ分子；塩類；尿素；ジメチルスルホキシド（DMSO）；ポリエチレングリコール（PEG）；マグネシウム；トポイソメラーゼ；ジャイレース；アクセサリータンパク質；変性剤；コファクター；dNTP；ATP；TTP；未標識プライマーならびにビオチン化プライマーおよびLUXプライマーなどの標識プライマーを含むがこれに限定されない、配列特異的プライマーのセット；ならびにランダムプライマー。
【００５２】
用いられる用語「含む（comprising）」は、「本質的にからなる（consisting essentially of）」および「からなる（consisting of）」を包含する。
【実施例】
【００５３】
実施例1：RT-HDAにおけるRT酵素の代わりとしてのPYROPHAGE 3173の使用
PYROPHAGE 3173 DNAポリメラーゼは、トランスクリプター（Transcriptor）およびサーモスクリプト（Thermoscript）逆転写酵素と比べて複数の利点を有する。例えば、サーモスクリプトおよびトランスクリプターは、HDAバッファーにおいて65℃で活性が限定されることが公知である。PYROPHAGE 3173 DNAポリメラーゼがワンステップ等温RT-HDA増幅においてこれらの逆転写酵素の代わりとなりうるか否かを決定するために、PYROPHAGE 3173 DNAポリメラーゼを試験した。
【００５４】
簡単に言うと、以下を含む25 μL反応混合物を作製した：（1）クラジミア・トラコマチス潜在プラスミドRNA（ct-RNA）を含む、0、10、または100コピーのインビトロで転写した合成RNA（GenBankアクセッション番号X06707）(SEQ ID NO: 1)；（2）フォワードプライマー5'- ATC GCA TGC AAG ATA TCG AGT ATG CGT-3' (SEQ ID NO: 2)およびリバースプライマー5'- CTC ATA ATT AGC AAG CTG CCT CAG AAT-3'（「ct-orfプライマー」）(SEQ ID NO: 3)；（3）2.5 Uのサーモスクリプト、Thermo-X、トランスクリプター、またはPyrophage 3173；（4）2 UのBstポリメラーゼ；および（5）1 UのuvrDヘリカーゼ。増幅は65℃で75分間行われた。反応混合物は、表1に記載の最終濃度の試薬を含んだ。図1からわかるように、PYROPHAGE 3173は、他のRT酵素の増幅と同じように機能する。
【００５５】
【表１】
【００５６】
実施例2：RTおよびDNA依存性DNAポリメラーゼ両方の代わりとしてのPYROPHAGE 3173の使用
PYROPHAGE 3173がワンステップ等温RT-HDA増幅において逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ両方の代わりとなりうるか否かを決定するために、PYROPHAGE 3173 DNAポリメラーゼを試験した。簡単に言うと、以下を含む25 μL反応混合物を作製した：（1）0、25、または100コピーのct-RNA；（2）ct-orfプライマー；（3）2.5 UのPyrophage 3173；（4）0 Uまたは2 UいずれかのBstポリメラーゼ；および（5）1 UのuvrDヘリカーゼ。反応混合物は、表1に記載された最終濃度の試薬を含んだ。増幅は、62℃または65℃で75分間行われた。結果を図2に示す。わかるように、PYROPHAGE 3173は、ワンステップ等温RT-HDAにおいて逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ両方の代わりとなる能力を有する。
【００５７】
PYROPHAGE 3173 DNAポリメラーゼを、別のDNA依存性DNAポリメラーゼの非存在下でRT-HDAを行う能力についても、逆転写酵素活性を有する他の酵素と比較した。簡単に言うと、以下を含む25 μLの反応混合物を作製した：（1）0、25、または100コピーのct-RNA；（2）ct-orfプライマー；（3）2.5 Uのサーモスクリプト、Thermo-X、トランスクリプター、またはPyrophage 3173；および（4）1 UのuvrDヘリカーゼ。増幅は、65℃で75分間行われた。実施例1のようなLuminexによる検出。結果を図3に示す。PYROPHAGE 3173とは対照的に、他の逆転写酵素は、RT-HDAのBstポリメラーゼの有効な代わりではなかった。Bstポリメラーゼが除外されると、Thermo-X、サーモスクリプトまたはトランスクリプターを利用するRT-HDA反応では、ほとんどあるいは全くアッセイシグナルが観察されなかった。PYROPHAGE 3173だけが、Bstポリメラーゼを有さない反応においてシグナルを生じることができた。
【００５８】
実施例3：DNA増幅でのPYROPHAGE 3173の使用
標的増幅
HPV16 DNAをHDAアッセイにおける標的DNAとして用いた。二本鎖DNA標的を5 μlの0.1 M NaOHで65℃で10分間変性させた。次いで、等量の0.2 Mヘペスを加え、変性した標的を中和した。15 μlのプレミックスおよび25 μlの増幅ミックスを標的に加え、65℃で1.5時間インキュベートした。プレミックスおよび増幅ミックスの成分を表2に記載する。
【００５９】
単位複製配列検出
HDA産物（5 μL）をU底ハイブリダイゼーションプレートに移し、次いで、5 μlの1×変性試薬（Digene HC2 DNR, Qiagen Gaithersburg, Inc., Gaithersburg, MD）で希釈した。次いで、プレートを密封し、30秒間1100 rpmでDigene振とう機で振とうし、室温で15分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション希釈剤（5μlの1×hc2プローブ希釈剤、Qiagen Gaithersburg, Inc., Gaithersburg, MD）を加え、プレートを再密封し、30秒間1100 rpmでDigene振とう機で振とうした。単位複製配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを有するLuminexビーズカクテル（10 μlの1×TE）を各ウェルに加え（3000ビーズ／ウェル）、プレートを再び密封し、暗所で振とうしながら50℃で30分間インキュベートした。ストレプトアビジン-フィコエリトリン（Moss Corp.）（10 μl、PBSで12.5 ng/μlに希釈）を加え、プレートを再び密封し、光を遮ったDigene振とう機で5分間1100 rpmで振とうした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（150 μl）を加え、プレートを再密封し、800 rpmで1分間振とうした。Luminex 100およびLuminex 1.7ソフトウエアを用いて、平均蛍光強度（MFI）を決定した。結果を図4に示す。バックグラウンドレベルを上回るMFIは、DNA標的の存在と相関する。
【００６０】
実施例4：ワンステップRT-HDAを用いる2つHPV16 mRNA配列の検出
HPV16 E6-7遺伝子およびHPV16 L1遺伝子に相当する、インビトロで転写した合成RNAを標的として用いた。各標的核酸を25または250コピーいずれかで各反応中に含んだ。Ct-orfプライマーの代わりに表3に記載のプライマーを用いる、ワンステップ等温RT-HDA反応を実施例2のように実行した。リバースプライマーは75 mMの最終濃度で用いられ、一方フォワードプライマー濃度は35 mM、40 mM、45 mM、50 mM、または55 mMであった。結果を図5に示す。25コピーの2つのHPV16 RNAそれぞれの検出は、RT-HDA反応に対して頑健性を有していた。この実験での至適プライマー濃度は、75 mMの各ビオチン化リバースプライマー、および40または45 mMの各フォワードプライマーであった。S/Nの変動係数（n＝3）は、これらの反応では低かった（12から22％）。
【００６１】
【表２】
【００６２】
【表３】
【００６３】
実施例5：ハイブリッドキャプチャーにおけるPYROPHAGE 3173の使用
A. ハイブリッドキャプチャー技術
ハイブリッドキャプチャー技術は、試料中の特定の標的核酸を精製および検出する種々の方法において、RNA:DNAハイブリッドに結合する能力を有する特定の抗体を利用する。ハイブリッドキャプチャー法の様々な反復法（iteration）は、とりわけ、U.S. Patent No. 5,994,079、6,027,897、6,277,579、6,686,151、および7,439,016; US Patent Publication No. 2006/0051809 A1、2009/0162851 A1、および2009-0298187 A1;ならびにPCT Publication No. WO 01/96608に記載され、そのそれぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる。基本のハイブリッドキャプチャープロトコルは以下を含む：（1）核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、DNA:RNAハイブリッドを生成する工程；（2）DNA:RNAハイブリッドを固相に結合し、標的核酸の単離を容易にする工程；および（3）DNA:RNAハイブリッドを検出する工程。様々な反復法では、抗DNA:RNAハイブリッド抗体が、段階（2）または段階（3）のいずれかで用いられうる。限定はしないが例えば、抗DNA:RNAハイブリッド抗体は、固相に結合され（共有結合的にまたは他の方法で）、それによってDNA:RNAハイブリッドの固相への「捕捉」を媒介してもよい。あるいは、固相に結合した（共有結合的にまたは他の方法で）核酸プローブが、固相にDNA:RNAハイブリッドを捕捉してもよく、次いで検出可能に標識された抗DNA:RNAハイブリッド抗体により検出されてもよい。
【００６４】
B. ハイブリッドキャプチャーにより単離された標識の検出
前述の通り、ハイブリッドキャプチャーはDNA:RNAハイブリッドを利用する。したがって、所望の標的のアイデンティティは重要である。標的核酸分子がDNAであるとき、プローブは好ましくはRNAであり、標的核酸がRNAであるとき、プローブは好ましくはDNAである。
【００６５】
標的核酸を含む試料をチューブ内に集め、アルカリ溶液などの変性試薬で処理し、標的核酸分子をハイブリダイゼーションで利用しやすい状態にする。さらに、タンパク質のアルカリ処理は、被検物を効果的にホモジナイズし、与えられた試料の解析結果の再現性を確かなものにする。キネティクスを向上させること、試料をホモジナイズすること、および試料中の任意の内因性の一本鎖RNA核酸、DNA:RNAハイブリッドまたはRNA-RNAハイブリッドを破壊することによりバックグラウンドを低減させることも、試料の粘度を低下させることができる。それはまた、試料中に存在する可能性があるRNaseおよびDNaseなどの酵素を不活性化するのを助ける。（DNAとは対照的に）RNAが標的核酸である場合、フェノール抽出およびTCA／アセトン沈殿、ならびにグアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出を含むがこれに限定されない、異なる試薬が好ましい可能性があることを当業者なら理解するであろう。
【００６６】
核酸を含む試料を変性させた後、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが試料中の標的核酸にハイブリダイズし二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分な条件下で、それを1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブに接触させる。プローブは、全長DNA、切断型DNA、合成DNA、全長RNA、切断型RNAまたは合成RNAでありうる。標的核酸がDNAである場合、プローブはRNAであってよく、標的核酸がRNAである場合、プローブはDNAであってよい。好ましくは、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブは、（塩基性の変性試薬を中和するための）中和ハイブリダイゼーションバッファーとしても機能しうるプローブ希釈剤で希釈される。DNAプローブまたはRNAプローブに対して用いられるプローブ希釈剤は、RNAとDNAの安定のために必要とされる要件が異なっているため相違する。例えば、プローブがRNAである場合、NaOHがRNAを破壊しうるため、最初に試料を中和し、次いでプローブを添加するか、あるいはRNAプローブおよび中和剤（プローブ希釈剤）を試料に同時に添加することが好ましい。プローブ希釈剤は、プローブを溶解および希釈するために用いることができ、さらに試料を中性近くのpH、例えば約pH 6から約pH 9に回復させハイブリダイゼーションにより都合のよい環境を提供するのも助けることができる。十分な量、好ましくは試料の1/2量のプローブ希釈剤が、塩基処理された試料を中和するために用いられてもよい。
【００６７】
プローブを標的核酸分子へハイブリダイズさせかつ二本鎖核酸ハイブリッドを形成させた後、ハイブリッドは、常磁性ビーズの上に固定化した抗ハイブリッド抗体により捕捉される。ハイブリッドは、抗ハイブリッド抗体と共に約67℃から約70℃で約30分間インキュベートされる。次いで、磁場をチューブに適用し、ビーズから上清を取り除く。次いで、例えば40 mMトリス、pH 8.2、100 mM NaCl、0.5％Triton-X 100および0．05％アジ化ナトリウムを含む、適当な洗浄バッファーでビーズを洗浄してもよい。
【００６８】
次いで、捕獲された核酸は、本明細書に記載の任意の増幅スキームを用いて検出されてもよい。
【００６９】
C. ハイブリッドキャプチャーアッセイの感度の増加
いくつかの反復法において、増幅は、特に標的核酸が低コピー数で存在することが予測されるときに、ハイブリッドキャプチャーアッセイの感度を増すために用いることができる。しかしながら、標準的な増幅技術は、ハイブリッドキャプチャーが用いられる可能性がある条件に常に適合するわけではない。例えば、ハイブリッドキャプチャー技術の1つの特定の利用は、高価なサーモサイクラーおよび経験のある技術者が多くの場合いない農村社会におけるスクリーニングアッセイを目的とする。そのような状況では、関係する複雑な試薬の数を低減し、工程を単純化することが有益であり、多くの場合標準的なPCRプロトコルの使用を不可能にする。そのような状況では、PYROPHAGE 3173などの耐熱性ポリメラーゼが有用である。
【００７０】
一例をあげると、本明細書に記載の増幅は、例えばU.S. Patent No. 5,994,079、6,027,897、6,277,579、6,686,151、および7,439,016；US Patent Publication No. 2006/0051809 A1、2009/0162851 A1、および2009-0298187 A1；ならびにPCT Publication No. WO 01/96608に記載のハイブリッドキャプチャーアッセイにより精製および検出された結果として得られる単位複製配列を伴う試料に対して行われてもよい。
【００７１】
あるいは、標的核酸は、実施例5Bに記載の通り精製され、次いで本明細書に記載の通り増幅されてもよい。分離後、標的は、変性され、ビーズから分離され、例えばU.S. Patent No. 5,994,079、6,027,897、6,277,579、6,686,151、および7,439,016；US Patent Publication No. 2006/0051809 A1、2009/0162851 A1、および2009-0298187 A1；ならびにPCT Publication No. WO 01/96608に記載のようなハイブリッドキャプチャーアッセイにより検出されてもよい。
【００７２】
D. 利用可能な試薬による使用への不適合な標的の適応
上記の通り、ハイブリッドキャプチャーは好ましくはDNA:RNAハイブリッドと組み合わせて用いられる。しかしながら、標的核酸およびハイブリッドキャプチャープローブが両方ともRNAである事例が存在する可能性がある。そのような場合、ハイブリッドキャプチャーを行う前に標的RNAをDNAに変換することが望ましい。PYROPHAGE 3173の逆転写酵素活性は、そのような態様において有用でありうる。
【００７３】
mRNAが所望の標的であるときなど、特に所望の標的が試料中に存在する可能性が高いDNA相当物である場合、RNAは任意で、逆転写反応を行う前に試料から抽出されてもよい。全RNAおよびそのサブセットを単離する多くの方法が当技術分野において周知であり、例えば、酸グアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出およびRNeasy（登録商標）製品系列のキット（Qiagen GmbH, Hilden, DE）などの市販のキットを含む。逆転写反応およびそれを行う的確な方法を行う前にRNAを単離するか否かは、具体的な標的および適用に大部分依存し、当業者により決定されうる。
【００７４】
ひとたび試料を所望のように調製したら、逆転写反応は本質的に本明細書に記載のとおり行うことができる。感度の増加が必要または望まれる場合、ワンステップRT-HDA反応がさらに行われてもよい。次いで、標的単離は、実施例5Bに記載のハイブリッドキャプチャーにより行われてもよく、および／または標的検出は、例えばU.S. Patent No. 5,994,079、6,027,897、6,277,579、6,686,151、および7,439,016；US Patent Publication No. 2006/0051809 A1、2009/0162851 A1、および2009-0298187 A1；ならびにPCT Publication No. WO 01/96608に記載のとおりに行われてもよい。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、その全体について参照により本明細書に組み入れられる、2010年1月8日に出願した米国特許仮出願第61/293,372号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
核酸の増幅は、研究、法医学、医学および農業で広く用いられている。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、インビトロDNA増幅のための最も広く用いられている方法である。典型的にはPCR反応は、標的配列の5'境界および3'境界にハイブリダイズする2つのオリゴヌクレオチドプライマー、およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）を重合し二本鎖産物を生成することによりアニーリングさせたプライマーを伸長するDNA依存性DNAポリメラーゼを利用する。反応混合物の温度を上昇および低下させること（サーモサイクリングとして公知）により、DNA産物の二本鎖が分離し、アニーリングおよび伸長の次のラウンドの鋳型として機能することができ、工程が繰り返される。
【０００３】
ここ数年、サーモサイクリングに依拠しない他の核酸増幅方法が開発されている。これらの方法は、実行するのに温度変化の繰り返しに依拠しないため、「等温標的増幅」として大別される。
【０００４】
その1つの例が、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）である。インビボではポリメラーゼは、様々なアクセサリータンパク質の助けを借りて核酸を増幅する。そのようなアクセサリータンパク質の分類の1つは、「ヘリカーゼ」と名付けられ、核酸の二重鎖を増幅の間にポリメラーゼが利用できる一本鎖に分離するという共通の特徴を共有する。HDAは、ヘリカーゼを利用してプライマーハイブリダイゼーションおよびその後のポリメラーゼによるプライマー伸長のための一本鎖鋳型を生成することにより、インビトロでこの一般的なスキームを模倣する。ヘリカーゼを反応混合物に加えることにより、プライマーの鋳型との融解および再アニーリングを繰り返す必要なく、増幅の繰り返しが進められる。したがって、高価なサーモサイクリング装置または退屈な手動のサーモサイクリングを避けることができる。さらに、HDAは、単純な反応スキームを有しかつプロセス全体にわたって同一の温度で行うことができる真の等温反応であることにより、他の等温DNA増幅方法に比べて複数の利点を提供する。
【０００５】
逆転写PCR（RT-PCR）と名付けられたPCRのバリエーションの1つは、特に遺伝子発現を測定するために、試料中のRNAを解析するために、および修飾された相補的cDNAプローブを合成するために頻繁に用いられる。典型的なスキームでは、逆転写酵素活性を有する酵素が、RNA鋳型を用いて相補DNA鎖（cDNA）を生成し、次いでPCRを介して増幅される。HDAはまた、cDNAを増幅するために用いられてもよく、その場合、工程は、逆転写HDA（RT-HDA）と名付けられる。どちらの場合にも、各活性に対して典型的には別々の酵素が用いられる：cDNAの作製に対して逆転写酵素；cDNAの増幅に対してDNA依存性DNAポリメラーゼ；およびHDAの場合、一本鎖鋳型の作製に対してヘリカーゼ。
【０００６】
残念なことに、逆転写酵素は、典型的には校正能力を有していないため、高い頻度で誤りが生じうる。さらに、反応混合物に添加された各酵素は、異なる至適温度、反応条件、試薬などの潜在的必要性を増大させる。よって多くの場合、忠実度の高いDNAを大量に産生する酵素一式と条件一式を見いだすことは難しい作業である。この作業を単純化する1つの方法は、関係する酵素の数を減らすことである。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本明細書において、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を用いる標的核酸の等温増幅を行うための材料および方法を開示する。
【０００８】
1つの局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を用いる、標的核酸の等温増幅のための方法に関する。
【０００９】
別の局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を用いる、標的RNAの等温増幅のための方法に関する。
【００１０】
別の局面は、ニック誘導活性（nick-inducing activity）を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を用いる、標的RNAの等温増幅の方法に関する。
【００１１】
別の局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を用いる、RT-HDAの方法に関する。
【００１２】
別の局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を用いることによりHPVの核酸配列を検出する工程を含む、試料中のヒトパピローマウイルス（HPV）の存在を同定する方法に関する。
【００１３】
さらに別の局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を含む、標的核酸の等温増幅のためのキットに関する。
【００１４】
別の局面において、ヘリカーゼ活性を有する酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を含む、標的RNAの等温増幅のためのキットが提供され、これはDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有するいかなる他の酵素も含まない。
【００１５】
別の局面は、逆転写酵素活性を有する酵素もしくはポリメラーゼ活性を有する酵素、または両方が、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素に置き換えられている、RT-HDAのためのキットに関する。
【００１６】
別の局面は、ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する第2の酵素を含む、試料中の少なくとも1つのヒトパピローマウイルス（HPV）の存在および／または存在量を決定するためのキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】PYROPHAGE 3173がBstポリメラーゼの存在下でワンステップRH-HDAにおいて他の逆転写酵素と同じくらい効果があることを示す。増幅は、Bstポリメラーゼ（2U）およびuvrDヘリカーゼ（1U）を利用して、25 μlで75分間行われた。CtRNAを標的として用いた。10および100 RNAコピーに対するサーモスクリプト（Thermoscript）、Thermo-X、トランスクリプター（Transcriptor）およびPYROPHAGEのアッセイシグナル（Luminex MFI）を示す。
【図２】PYROPHAGE 3173酵素がワンステップ等温RH-HDAにおいて逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼの両方として機能しうることを示す。増幅は、25 μLで75分間行われた。反応混合物は、Bstあり（Bst+とラベル表示されたバー）またはBstポリメラーゼの添加なし（Bst-とラベル表示されたバー）のいずれかでPYROPHAGE 3173（2.5 U）を含んだ。Ct RNA（25または100コピー）を標的として用いた。検出はLuminexで行われ、結果をシグナル／ノイズとして提示する。
【図３】Bstポリメラーゼ非存在下でTHERMO-X、サーモスクリプト、トランスクリプター、およびPYROPHAGE 3173を用いるRT-HDA反応を示す。反応条件は図2で記載したものと同じである。
【図４】PYROPHAGE 3173酵素がBstの非存在下でDNAを増幅しうることを示す。増幅は、50 μLで90分間行われた。反応物はPYROPHAGE 3173（5U）またはBstポリメラーゼ（20U）のいずれかを含んだ。HPV16 DNAをアルカリ変性による標準的なtHDAアッセイの標的として用いた。検出はLuminexで行われ、結果をシグナル／ノイズとして提示する。
【図５】2つのHPV 16 RNA標的を増幅するRT-HDA反応のノイズに対するシグナル（S／N）を示す。各バーは種々のプライマー濃度による増幅後の2つの標的それぞれのS／N（y軸）を表示する。プライマー濃度および増幅標的をx軸に表示する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
1つの局面において、標的核酸の増幅は、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素により達成される。二重活性を有するこの酵素は、DNA依存性DNAポリメラーゼおよび／または逆転写酵素を用いる代わりに、またはそれに追加して用いられる。
【００１９】
本明細書で用いられる「核酸」は、二本鎖（ds）または一本鎖（ss）のDNA分子、RNA分子またはDNA-RNAハイブリッドを指す。二本鎖核酸分子は、ニックが入ってもよく、またはインタクトであってもよい。二本鎖または一本鎖の核酸分子は、線状または環状であってもよい。二重鎖は、平滑断片にされてもよく、または一本鎖の末端部を有してもよい。一本鎖分子は、ヘアピンまたはループおよびステムの形態の二次構造を有してもよい。核酸は、環境、食物、農業、発酵、血液、ミルク、脳脊髄液、痰、唾液、便、肺吸引液、粘膜組織のぬぐい液もしくは組織試料などの生体液、または細胞を含む、様々な供給源から単離されてもよい。核酸試料は、細胞、細菌またはウイルスから得られてもよく、以下のいずれかを含んでもよい：染色体DNA、プラスミドDNAを含む染色体外DNA、組換えDNA、DNA断片、メッセンジャーRNA、転移RNA、リボソームRNA、二本鎖RNAまたは細胞、細菌もしくはウイルスで生じる他のRNA。核酸は、化学合成の手段によりインビトロで単離、クローン化または合成されてもよい。任意の上記核酸は、核酸内の個別の核酸を（例えばメチル化により）化学的に変化させる修飾に供してもよい。修飾は、自然にまたはインビトロでの合成により生じてもよい。用語「二重鎖（duplex）」は、全体的にまたは部分的に二本鎖である核酸分子を指す。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「標的核酸」は、増幅させることを意図する任意の核酸配列を指す。増幅させるべき標的核酸分子の大きさは、例えば、100を上回り5000 bpまでの範囲を含む約50 bpから約100 kbの範囲であってもよい。標的核酸は、より長い二本鎖または一本鎖の核酸内に含まれてもよい。あるいは、標的核酸は、二本鎖または一本鎖の核酸全体であってもよい。
【００２１】
1つの態様において、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素はPYROPHAGE 3173である。PYROPHAGE 3173は、その内容が全体として組み入れられる、U.S. Patent Application Publication No. 2008/0268498として公開されたU.S. Patent Application No. 12/089,221に記載されている。PYROPHAGE 3173は、LUCIGEN Corporationから入手可能であり、忠実度が高い増幅をもたらす、固有の3'→5'エキソヌクレアーゼ（校正）活性を有する耐熱性バクテリオファージ酵素である。この活性のため、ホスホロチオエートプライマーを使用し、増幅前に標的核酸鋳型およびプライマーへの曝露を最小とすることが好ましい可能性がある。あるいは、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性が不活性化されている（PYROPHAGE 3173 Exo-変異体）変異体バージョンが用いられてもよい。PYROPHAGE 3173はまた、二本鎖DNAによるDNA合成を可能にする鎖置換活性も有する。それはニックでも効率的に開始され、したがってDNA合成はプライマーによりまたは部位特異的ニッキング酵素により導入されるニックで開始されうる。PYROPHAGE 3173はまた、逆転写活性も有し、よってRNA鋳型に対して単一チューブ、単一酵素逆転写PCRを行うことができる。この二重活性のために、PYROPHAGE 3173は、RT-HDAで逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼの代わりとして用いられてもよい。さらに、PYROPHAGE 3173酵素の高い熱安定性は、より高いRNA増幅率を可能にする可能性がある。
【００２２】
1つの態様において、標的核酸は等温増幅を用いて増幅される。「等温増幅」は、単一の温度で行われる増幅を指す。これは、増幅手法と同じ温度またはより高い温度で実行される可能性がある、増幅の開始時の1回の短い時間（15分未満）を含まない。
【００２３】
1つの態様において、等温増幅法はRT-HDAである。典型的には、RT-HDAでは3種類の酵素が用いられる：逆転写酵素、ヘリカーゼ、およびDNA依存性DNAポリメラーゼ。逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼとしても公知である）は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）を重合することにより一本鎖RNA（ssRNA）を相補的一本鎖DNA（cDNA）へと転写するDNAポリメラーゼ活性を有する酵素である。同様のpyrophage酵素もまたds-DNAを形成するcDNAの「第2の鎖」を重合する可能性がある。これは、ss-RNAからds-DNAを合成する従来工程における2種類の酵素（逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ）の使用を否定する。ヘリカーゼは、ds-DNAの上鎖（top strand）および下鎖（bottom strand）のプライマー依存性DNA重合の繰り返し（増幅）のためにds-DNAを巻き戻す酵素活性を有する。次いで、DNA依存性DNAポリメラーゼは、dNTPを重合することによりcDNAを相補的一本鎖DNAに転写する。この工程は、指数関数的増幅がサーモサイクリングの必要無しに単一の温度で達成できるように繰り返される。1つの態様において、RT-HDAは、単一の酵素を用いて行われ、逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方が提供される。
【００２４】
本明細書で用いられる「HDA」は、二本鎖核酸を巻き戻すためにヘリカーゼ調製物を用いて増幅用の鋳型を生成することにより核酸を増幅するためのインビトロでの方法である、ヘリカーゼ依存性増幅（Helicase Dependent Amplification）を指す。
【００２５】
本明細書で用いられる「ヘリカーゼ」または「ヘリカーゼ活性を伴うまたは有する酵素」は、二本鎖核酸を巻き戻すことができる任意の酵素を指す。例えば、ヘリカーゼは、全ての生物体、および複製、組換え、修復、転写、翻訳およびRNAスプライシングなどの核酸に関係する全てのプロセスで見いだされる酵素である。DNAまたはRNAに沿って5'→3'方向または逆の3'→5'方向に移動する任意のヘリカーゼが用いられてもよい。これは、原核生物、ウイルス、古細菌、および真核生物から得られたヘリカーゼ、または天然に存在する酵素の組換え型、ならびに特定の活性を有する類似体または誘導体を含む。天然に存在するDNAヘリカーゼの例は、大腸菌（E. coli）ヘリカーゼI、II、III、およびIV、Rep、DnaB、PriA、PcrA、T4 Gp41ヘリカーゼ、T4 Ddaヘリカーゼ、T7 Gp4ヘリカーゼ、SV40ラージT抗原、酵母RADを含む。有用である可能性があるさらなるヘリカーゼは、RecQヘリカーゼ、T. テングコンジェンシス（T. tengcongensis）およびT. サーモフィルス（T. thermophilus）由来の耐熱性UvrDヘリカーゼ、T. アクアチクス（T. aquaticus）由来の耐熱性DnaBヘリカーゼ、および古細菌および真核生物由来のMCMヘリカーゼを含む。
【００２６】
別の態様において、ヘリカーゼは、耐熱性のヘリカーゼである。核酸二重鎖の変性は、例えば45℃から75℃の範囲の高温を含むインキュベーション条件下で耐熱性ヘリカーゼ調製物を用いることにより促進することができる。耐熱性ヘリカーゼ調製物および耐熱性ポリメラーゼを用いて高温でHDAを行うことは、増幅の特異性を改善することができる、プライマー結合の特異性を増加させる可能性がある。
【００２７】
さらなる態様において、複数の異なるヘリカーゼ酵素が増幅反応に用いられる。複数のヘリカーゼの使用は、異なるヘリカーゼが種々の機能を連携して働かせ二重鎖核酸の巻き戻しの効率を高める特定の条件下で、HDAにおける標的増幅の収率および長さを向上させる可能性がある。例えば、処理能力は低いが平滑末端DNAを融解できるヘリカーゼは、優れた処理能力を有しているが巻き戻しの開始のために二重鎖領域の境界で一本鎖末端部を認識する第2のヘリカーゼと併用されてもよい。この例では、第1のヘリカーゼが最初に、長い核酸二重鎖の平滑末端を分離し5'および3'一本鎖末端部を生じさせ、次いでその限定された処理能力のためにその基質から解離する。続いて、この部分的に巻き戻された基質は、第2のヘリカーゼにより認識され、次いでその第2のヘリカーゼは非常に優れた処理能力によって巻き戻しプロセスを続ける。このようにして、核酸二重鎖中の長い標的は、複数のヘリカーゼを含むヘリカーゼ調製物の使用により巻き戻され、続いてHDA反応で増幅されてもよい。
【００２８】
さらなる態様において、アクセサリータンパク質が反応混合物に含まれる。「アクセサリータンパク質」は、ヘリカーゼ活性を刺激する能力を有する任意のタンパク質を指す。例えば、大腸菌MutLタンパク質は、UvrDヘリカーゼ活性を高めるためのアクセサリータンパク質である。アクセサリータンパク質は、選択されるヘリカーゼによって有用である。しかしながら、核酸の巻き戻しは、アクセサリータンパク質の非存在下でヘリカーゼにより達成されてもよい。
【００２９】
別の態様において、少なくとも1つの一本鎖結合タンパク質（SSB）反応混合物に含まれる。中温性のヘリカーゼは、SSBの存在下で活性の改善を示す。このような状況では、BBSの選択は概して、特定のタンパク質に限定されない。一本鎖結合タンパク質の例は、T4遺伝子32タンパク質、大腸菌SSB、T7 gp2.5 SSB、ファージphi29 SSBおよびこれらのタンパク質の切断型である。よって、ある態様において、1つまたは複数のSSBが増幅反応に加えられてもよい。
【００３０】
さらに別の態様において、少なくとも1つのコファクターが提供される。「コファクター」は、ヘリカーゼ巻き戻し活性に必要とされる低分子作用物質を指す。ヘリカーゼコファクターは、ヌクレオシド三リン酸（NTP）およびデオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）およびマグネシウム（または他の二価カチオン）を含む。例えば、ATP（アデノシン三リン酸）は、0.1から100 mMの範囲、好ましくは1から10 mMの範囲（例えば3 mM）の濃度で、UvrDヘリカーゼのコファクターとして用いられてもよい。同様に、dTTP（デオキシチミジン三リン酸）は、1から10 mMの範囲（例えば3 mM）でT7 Gp4Bヘリカーゼのコファクターとして用いられてもよい。
【００３１】
さらなる態様において、DNA依存性DNAポリメラーゼは、配列依存性増幅においてcDNAを転写する。「配列依存性合成」または「配列依存性増幅」は、標的特異的プライマーの使用による試料中に存在する非標的配列に対する標的配列の増幅を指す。本明細書で用いられる「標的特異的プライマー」は、標的核酸上で予め決定された一本鎖領域に結合し、選択的に増幅すべき標的核酸のポリメラーゼ依存性複製を促進することができる一本鎖核酸を指す。
【００３２】
1つの態様において、一方が標的配列の5'隣接部にハイブリダイズしかつ他方が標的の3'隣接部にハイブリダイズする1対の標的特異的プライマーが、標的配列の指数関数的な増幅を達成するために用いられる。
【００３３】
別の態様において、複数対の標的特異的プライマーが、多重反応における異なる検出タグを同時に用いて複数の標的を増幅するための単一反応において利用されうる。多重化は通常、一塩基多型（SNP）解析および病原体の検出で用いられる。
【００３４】
概して、適当な標的特異的プライマー対は、短い合成オリゴヌクレオチドであり、例えば10ヌクレオチド以上かつ50ヌクレオチド未満の長さを有する。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマー設計は、ストリング（string）に基づくアライメントスコア、融解温度、プライマーの長さおよびGC含量などの種々のパラメータに関係する。標的特異的プライマーを設計するとき、重要な因子の1つは、増幅させるべき核酸分子に特異的な標的断片内で配列を選択することである。別の重要な因子は、反応用の標的特異的プライマーの融解温度を計算することである。標的特異的プライマーの融解温度は、そのオリゴヌクレオチドの長さおよびGC含量により決定される。好ましくは、プライマーの融解温度は、プライマーハイブリダイゼーションおよび標的増幅が行われる温度より約10から30℃高い。
【００３５】
「プライマーハイブリダイゼーション」は、プライマーが1つの鋳型鎖上でその相補配列にのみ特異的に結合する条件下での一本鎖核酸鋳型の領域へのオリゴヌクレオチドプライマーの結合を指し、鋳型中の他の領域への結合は指さない。ハイブリダイゼーションの特異性は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さ、ハイブリダイゼーション反応が行われる温度、イオン強度および反応混合物のpHによって影響される可能性がある。
【００３６】
各標的特異的プライマーは、標的核酸の各末端にハイブリダイズし、鋳型として標的ヌクレオチド配列を用いるポリメラーゼにより3'→5'方向に伸長されてもよい。特異的増幅を達成するために、相同なまたは完全に一致する標的特異的プライマーが好ましい。しかしながら、標的特異的プライマーは、5'末端に標的ヌクレオチド配列に相補的ではない配列を含んでもよい。あるいは、標的特異的プライマーは、その全体わたって標的核酸に正確に相補的ではないヌクレオチドまたは配列を含んでもよい。
【００３７】
標的特異的プライマーは、任意のデオキシリボヌクレオチド塩基A、T、GもしくはC、および／または1つまたは複数のリボヌクレオチド塩基A、C、U、G、および／または1つまたは複数の修飾ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド）を含んでもよく、修飾は、プライマーの核酸へのハイブリダイゼーションまたは標的特異的プライマーの伸長または二本鎖分子の変性を妨げない。標的特異的プライマーは、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸などの化学基または非ヌクレオチドリンカーで修飾され、その能力を向上させるかまたは増幅産物の特徴付けを容易にしてもよい。
【００３８】
概して、標的特異的プライマーの鋳型認識およびその後のアニーリングの特異性を可能にするのに適した変性の温度は、例えば20℃から75℃の温度範囲にわたって生じてもよい。好ましい変性温度は、どのヘリカーゼが融解工程のために選択されるかによって選択されてもよい。選択されたヘリカーゼの存在下での核酸の増幅のための至適温度を決定するための試験は、反応混合物の温度を変えてゲル電気泳動を用いて増幅産物を比較することにより日常的な実験により決定されうる。
【００３９】
標的特異的プライマーは、蛍光または化学発光標識、およびビオチン化などの修飾（例えば、カルボキシフルオレセインのアミン反応性フルオレセインエステルなどの蛍光タグ）に供されてもよい。他の標識方法は、放射性同位元素、発色団、およびビオチンまたはハプテンなどのリガンドを含み、それらは、直接的に検出できないが、その特異的結合パートナー、例えばアビジンおよび抗体の標識形態それぞれとの反応により容易に検出することができる。そのような修飾は、増幅産物を検出するために用いることができる。
【００４０】
「融解」、「巻き戻し」、または「変性」は、核酸二重鎖の2本の相補鎖の全体または一部を分離することを指す。
【００４１】
さらなる態様において、DNA依存性DNAポリメラーゼは、配列非依存性増幅においてcDNAを転写する。本明細書において用いられる「配列非依存性増幅」は、特定の配列を増幅しないDNA依存性DNAポリメラーゼにより行われる任意の増幅を指す。限定はしないが、例えば、ランダムプライマー混合物またはニック誘導剤は、配列非依存性増幅を開始するために用いられる可能性がある。
【００４２】
本明細書で用いられる「ランダムプライマー混合物」は、短く無作為に作製されたオリゴヌクレオチド配列の混合物を指す。
【００４３】
本明細書で用いられる「ニック開始性（nick-initiated）ポリメラーゼ活性」は、外部からのプライマーの非存在下でのポリメラーゼ活性を指し、それは鋳型中の一本鎖切断により開始される。合成は、外因性合成プライマーの末端ではなくDNA中の一本鎖切断で開始される。ニック開始性合成により、プライマーの除去は不必要であり、コスト、取り扱い時間および産物の損失または分解の可能性を低減させる。さらに、ニック開始性合成は、プライマーの自己伸長により引き起こされる偽の増幅シグナルを減少させる。ニックは、認識配列でニックを導入する酵素を用いることにより定義された位置に導入されてもよく、または標的ポリヌクレオチドに無作為に導入されてもよい。本明細書で用いられる「ニック誘導剤」は、二本鎖核酸の一方の鎖の2つの隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合に切れ目を導入する任意の酵素的もしくは化学的試薬または物理的処理を指す。ニック誘導酵素の例は、Bpu10 I、BstNB I、Alw I、BbvC I、BbvC I、Bsm I、BsrD、および大腸菌エンドヌクレアーゼIを含む。1つの態様において、少なくとも1つのニック誘導酵素が、反応混合物においてヘリカーゼの代わりとして含まれる。別の態様において、少なくとも1つのニック誘導酵素は、少なくとも1つのヘリカーゼに加えて反応混合物に加えられる。
【００４４】
他の増幅反応構成要素は、バッファー、バイオ分子、塩類、尿素、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリエチレングリコール（PEG）、マグネシウム、トポイソメラーゼ、アクセサリータンパク質、変性剤、コファクターまたはそれらの組み合わせを適切な状況において含んでもよい。プライマー開始増幅が望まれているとき、プライマーが増幅反応構成要素に加えられる。
【００４５】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸dNTP（すわなち、dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）は加えられ、DNAの新しい鎖を構築するために用いられる。ATPまたはTTPはエネルギー源として加えられる。ATPまたはTTPは、高い処理能力を有するヘリカーゼの一般的に好ましいエネルギー源である。平均して、1個のATP分子は、DNAヘリカーゼにより消費され1から4塩基対を巻き戻す。より長い標的を増幅するために、より短い標的と比べて、より多くのATPが消費される可能性がある。このような状況では、ヘリカーゼとともに使用するためのピルビン酸キナーゼに基づくATP再生システムを含むことが望ましい可能性がある。よって、特定の態様において、ATPもしくはTTPまたは組み合わせまたはピルビン酸キナーゼに基づくATP再生システムが、増幅反応構成要素に加えられる可能性がある。
【００４６】
トポイソメラーゼは、長いHDA反応で用いられ、HDAの長い標的単位複製配列を増幅する能力を向上させることができる。非常に長い直鎖DNA二重鎖がヘリカーゼにより分離されると、トポイソメラーゼの旋回（swivel）（緩和）機能がねじれを取り除き、巻きすぎを妨げる。例えば、大腸菌トポイソメラーゼIは、一方のDNA鎖にニックを導入することにより負の超らせんDNAを緩和するために用いられうる。DNAジャイレース（トポイソメラーゼII）は、DNA内に一過性の二本鎖切断を導入し、DNA鎖が相互に通り抜けることを可能にする。よって、特定の態様において、トポイソメラーゼもしくはジャイレース、または両方は、増幅反応に加えられる可能性がある。
【００４７】
さらなる態様において、増幅核酸産物は、エチジウムブロマイド染色および限定されないが放射標識、蛍光標識および酵素などの標識手段による増幅配列の検出を含む種々の方法により検出される可能性がある。例えば、HDA増幅産物は、ヘパリン構造の3'末端の近くにフルオロフォアを備えて設計されたオリゴヌクレオチドである、蛍光標識されたLUXプライマー（Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.）を用いて実時間で検出することができる。この立体構造は、別の消光成分なしに蛍光消光能を内因的に与える。プライマーが二本鎖増幅産物に導入されると、フルオロフォアは、脱消光され（dequenched）、蛍光シグナルの有意な増加をもたらす。
【００４８】
本開示はまた、ヘリカーゼ活性を有する酵素ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を含むキットも包含する。キットは、1つまたは複数のdNTP、ATP、TTP、プライマー、マグネシウム、トポイソメラーゼ、SSBタンパク質、アクセサリータンパク質、変性剤、ポリエチレングリコール、コファクター、またはそれらの混合物から選択されるがこれらに限定されない、増幅反応構成成分をさらに含んでもよい。
【００４９】
さらなる態様は、等温増幅の標的である核酸を含む混合物に関する。核酸標的は、ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、RNA-DNAハイブリッド、または上記の任意の混合物であってもよい。標的核酸を含む混合物はまた、ヘリカーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素、ならびに逆転写酵素活性およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する少なくとも1つの酵素も含む。標的核酸および酵素を含む混合物はまた、前記の増幅反応構成成分の1つまたは複数も含むことができる。
【００５０】
別の局面は、記載の増幅方法により得られた増幅核酸である。増幅核酸は、DNAまたはRNAであってもよい。
【００５１】
別の局面において、等温性逆転写酵素／増幅反応を用いてHPV RNAを検出するためのキットが提供され、キットは、逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ活性の両方を有する少なくとも1つの酵素を含む。1つの態様において、キットは、ヘリカーゼ活性およびニック誘導活性からなる群より選択される活性を有する少なくとも1つの酵素をさらに含む。別の態様において、キットは、ヘリカーゼ活性を有する少なくとも1つの酵素およびニック誘導活性を有する少なくとも1つの酵素をさらに含む。キットは、以下を含むがこれに限定されない、所望の増幅を実行するのに必要な他の試薬をさらに含んでもよい：バッファー；バイオ分子；塩類；尿素；ジメチルスルホキシド（DMSO）；ポリエチレングリコール（PEG）；マグネシウム；トポイソメラーゼ；ジャイレース；アクセサリータンパク質；変性剤；コファクター；dNTP；ATP；TTP；未標識プライマーならびにビオチン化プライマーおよびLUXプライマーなどの標識プライマーを含むがこれに限定されない、配列特異的プライマーのセット；ならびにランダムプライマー。
【００５２】
用いられる用語「含む（comprising）」は、「本質的にからなる（consisting essentially of）」および「からなる（consisting of）」を包含する。
【実施例】
【００５３】
実施例1：RT-HDAにおけるRT酵素の代わりとしてのPYROPHAGE 3173の使用
PYROPHAGE 3173 DNAポリメラーゼは、トランスクリプター（Transcriptor）およびサーモスクリプト（Thermoscript）逆転写酵素と比べて複数の利点を有する。例えば、サーモスクリプトおよびトランスクリプターは、HDAバッファーにおいて65℃で活性が限定されることが公知である。PYROPHAGE 3173 DNAポリメラーゼがワンステップ等温RT-HDA増幅においてこれらの逆転写酵素の代わりとなりうるか否かを決定するために、PYROPHAGE 3173 DNAポリメラーゼを試験した。
【００５４】
簡単に言うと、以下を含む25 μL反応混合物を作製した：（1）クラジミア・トラコマチス潜在プラスミドRNA（ct-RNA）を含む、0、10、または100コピーのインビトロで転写した合成RNA（GenBankアクセッション番号X06707）(SEQ ID NO: 1)；（2）フォワードプライマー5'- ATC GCA TGC AAG ATA TCG AGT ATG CGT-3' (SEQ ID NO: 2)およびリバースプライマー5'- CTC ATA ATT AGC AAG CTG CCT CAG AAT-3'（「ct-orfプライマー」）(SEQ ID NO: 3)；（3）2.5 Uのサーモスクリプト、Thermo-X、トランスクリプター、またはPyrophage 3173；（4）2 UのBstポリメラーゼ；および（5）1 UのuvrDヘリカーゼ。増幅は65℃で75分間行われた。反応混合物は、表1に記載の最終濃度の試薬を含んだ。図1からわかるように、PYROPHAGE 3173は、他のRT酵素の増幅と同じように機能する。
【００５５】
【表１】
【００５６】
実施例2：RTおよびDNA依存性DNAポリメラーゼ両方の代わりとしてのPYROPHAGE 3173の使用
PYROPHAGE 3173がワンステップ等温RT-HDA増幅において逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ両方の代わりとなりうるか否かを決定するために、PYROPHAGE 3173 DNAポリメラーゼを試験した。簡単に言うと、以下を含む25 μL反応混合物を作製した：（1）0、25、または100コピーのct-RNA；（2）ct-orfプライマー；（3）2.5 UのPyrophage 3173；（4）0 Uまたは2 UいずれかのBstポリメラーゼ；および（5）1 UのuvrDヘリカーゼ。反応混合物は、表1に記載された最終濃度の試薬を含んだ。増幅は、62℃または65℃で75分間行われた。結果を図2に示す。わかるように、PYROPHAGE 3173は、ワンステップ等温RT-HDAにおいて逆転写酵素およびDNA依存性DNAポリメラーゼ両方の代わりとなる能力を有する。
【００５７】
PYROPHAGE 3173 DNAポリメラーゼを、別のDNA依存性DNAポリメラーゼの非存在下でRT-HDAを行う能力についても、逆転写酵素活性を有する他の酵素と比較した。簡単に言うと、以下を含む25 μLの反応混合物を作製した：（1）0、25、または100コピーのct-RNA；（2）ct-orfプライマー；（3）2.5 Uのサーモスクリプト、Thermo-X、トランスクリプター、またはPyrophage 3173；および（4）1 UのuvrDヘリカーゼ。増幅は、65℃で75分間行われた。実施例1のようなLuminexによる検出。結果を図3に示す。PYROPHAGE 3173とは対照的に、他の逆転写酵素は、RT-HDAのBstポリメラーゼの有効な代わりではなかった。Bstポリメラーゼが除外されると、Thermo-X、サーモスクリプトまたはトランスクリプターを利用するRT-HDA反応では、ほとんどあるいは全くアッセイシグナルが観察されなかった。PYROPHAGE 3173だけが、Bstポリメラーゼを有さない反応においてシグナルを生じることができた。
【００５８】
実施例3：DNA増幅でのPYROPHAGE 3173の使用
標的増幅
HPV16 DNAをHDAアッセイにおける標的DNAとして用いた。二本鎖DNA標的を5 μlの0.1 M NaOHで65℃で10分間変性させた。次いで、等量の0.2 Mヘペスを加え、変性した標的を中和した。15 μlのプレミックスおよび25 μlの増幅ミックスを標的に加え、65℃で1.5時間インキュベートした。プレミックスおよび増幅ミックスの成分を表2に記載する。
【００５９】
単位複製配列検出
HDA産物（5 μL）をU底ハイブリダイゼーションプレートに移し、次いで、5 μlの1×変性試薬（Digene HC2 DNR, Qiagen Gaithersburg, Inc., Gaithersburg, MD）で希釈した。次いで、プレートを密封し、30秒間1100 rpmでDigene振とう機で振とうし、室温で15分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション希釈剤（5μlの1×hc2プローブ希釈剤、Qiagen Gaithersburg, Inc., Gaithersburg, MD）を加え、プレートを再密封し、30秒間1100 rpmでDigene振とう機で振とうした。単位複製配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを有するLuminexビーズカクテル（10 μlの1×TE）を各ウェルに加え（3000ビーズ／ウェル）、プレートを再び密封し、暗所で振とうしながら50℃で30分間インキュベートした。ストレプトアビジン-フィコエリトリン（Moss Corp.）（10 μl、PBSで12.5 ng/μlに希釈）を加え、プレートを再び密封し、光を遮ったDigene振とう機で5分間1100 rpmで振とうした。次いで、リン酸緩衝生理食塩水（150 μl）を加え、プレートを再密封し、800 rpmで1分間振とうした。Luminex 100およびLuminex 1.7ソフトウエアを用いて、平均蛍光強度（MFI）を決定した。結果を図4に示す。バックグラウンドレベルを上回るMFIは、DNA標的の存在と相関する。
【００６０】
実施例4：ワンステップRT-HDAを用いる2つHPV16 mRNA配列の検出
HPV16 E6-7遺伝子およびHPV16 L1遺伝子に相当する、インビトロで転写した合成RNAを標的として用いた。各標的核酸を25または250コピーいずれかで各反応中に含んだ。Ct-orfプライマーの代わりに表3に記載のプライマーを用いる、ワンステップ等温RT-HDA反応を実施例2のように実行した。リバースプライマーは75 mMの最終濃度で用いられ、一方フォワードプライマー濃度は35 mM、40 mM、45 mM、50 mM、または55 mMであった。結果を図5に示す。25コピーの2つのHPV16 RNAそれぞれの検出は、RT-HDA反応に対して頑健性を有していた。この実験での至適プライマー濃度は、75 mMの各ビオチン化リバースプライマー、および40または45 mMの各フォワードプライマーであった。S/Nの変動係数（n＝3）は、これらの反応では低かった（12から22％）。
【００６１】
【表２】
【００６２】
【表３】
【００６３】
実施例5：ハイブリッドキャプチャーにおけるPYROPHAGE 3173の使用
A. ハイブリッドキャプチャー技術
ハイブリッドキャプチャー技術は、試料中の特定の標的核酸を精製および検出する種々の方法において、RNA:DNAハイブリッドに結合する能力を有する特定の抗体を利用する。ハイブリッドキャプチャー法の様々な反復法（iteration）は、とりわけ、U.S. Patent No. 5,994,079、6,027,897、6,277,579、6,686,151、および7,439,016; US Patent Publication No. 2006/0051809 A1、2009/0162851 A1、および2009-0298187 A1;ならびにPCT Publication No. WO 01/96608に記載され、そのそれぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられる。基本のハイブリッドキャプチャープロトコルは以下を含む：（1）核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、DNA:RNAハイブリッドを生成する工程；（2）DNA:RNAハイブリッドを固相に結合し、標的核酸の単離を容易にする工程；および（3）DNA:RNAハイブリッドを検出する工程。様々な反復法では、抗DNA:RNAハイブリッド抗体が、段階（2）または段階（3）のいずれかで用いられうる。限定はしないが例えば、抗DNA:RNAハイブリッド抗体は、固相に結合され（共有結合的にまたは他の方法で）、それによってDNA:RNAハイブリッドの固相への「捕捉」を媒介してもよい。あるいは、固相に結合した（共有結合的にまたは他の方法で）核酸プローブが、固相にDNA:RNAハイブリッドを捕捉してもよく、次いで検出可能に標識された抗DNA:RNAハイブリッド抗体により検出されてもよい。
【００６４】
B. ハイブリッドキャプチャーにより単離された標識の検出
前述の通り、ハイブリッドキャプチャーはDNA:RNAハイブリッドを利用する。したがって、所望の標的のアイデンティティは重要である。標的核酸分子がDNAであるとき、プローブは好ましくはRNAであり、標的核酸がRNAであるとき、プローブは好ましくはDNAである。
【００６５】
標的核酸を含む試料をチューブ内に集め、アルカリ溶液などの変性試薬で処理し、標的核酸分子をハイブリダイゼーションで利用しやすい状態にする。さらに、タンパク質のアルカリ処理は、被検物を効果的にホモジナイズし、与えられた試料の解析結果の再現性を確かなものにする。キネティクスを向上させること、試料をホモジナイズすること、および試料中の任意の内因性の一本鎖RNA核酸、DNA:RNAハイブリッドまたはRNA-RNAハイブリッドを破壊することによりバックグラウンドを低減させることも、試料の粘度を低下させることができる。それはまた、試料中に存在する可能性があるRNaseおよびDNaseなどの酵素を不活性化するのを助ける。（DNAとは対照的に）RNAが標的核酸である場合、フェノール抽出およびTCA／アセトン沈殿、ならびにグアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出を含むがこれに限定されない、異なる試薬が好ましい可能性があることを当業者なら理解するであろう。
【００６６】
核酸を含む試料を変性させた後、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブが試料中の標的核酸にハイブリダイズし二本鎖核酸ハイブリッドを形成するのに十分な条件下で、それを1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブに接触させる。プローブは、全長DNA、切断型DNA、合成DNA、全長RNA、切断型RNAまたは合成RNAでありうる。標的核酸がDNAである場合、プローブはRNAであってよく、標的核酸がRNAである場合、プローブはDNAであってよい。好ましくは、1つまたは複数のポリヌクレオチドプローブは、（塩基性の変性試薬を中和するための）中和ハイブリダイゼーションバッファーとしても機能しうるプローブ希釈剤で希釈される。DNAプローブまたはRNAプローブに対して用いられるプローブ希釈剤は、RNAとDNAの安定のために必要とされる要件が異なっているため相違する。例えば、プローブがRNAである場合、NaOHがRNAを破壊しうるため、最初に試料を中和し、次いでプローブを添加するか、あるいはRNAプローブおよび中和剤（プローブ希釈剤）を試料に同時に添加することが好ましい。プローブ希釈剤は、プローブを溶解および希釈するために用いることができ、さらに試料を中性近くのpH、例えば約pH 6から約pH 9に回復させハイブリダイゼーションにより都合のよい環境を提供するのも助けることができる。十分な量、好ましくは試料の1/2量のプローブ希釈剤が、塩基処理された試料を中和するために用いられてもよい。
【００６７】
プローブを標的核酸分子へハイブリダイズさせかつ二本鎖核酸ハイブリッドを形成させた後、ハイブリッドは、常磁性ビーズの上に固定化した抗ハイブリッド抗体により捕捉される。ハイブリッドは、抗ハイブリッド抗体と共に約67℃から約70℃で約30分間インキュベートされる。次いで、磁場をチューブに適用し、ビーズから上清を取り除く。次いで、例えば40 mMトリス、pH 8.2、100 mM NaCl、0.5％Triton-X 100および0．05％アジ化ナトリウムを含む、適当な洗浄バッファーでビーズを洗浄してもよい。
【００６８】
次いで、捕獲された核酸は、本明細書に記載の任意の増幅スキームを用いて検出されてもよい。
【００６９】
C. ハイブリッドキャプチャーアッセイの感度の増加
いくつかの反復法において、増幅は、特に標的核酸が低コピー数で存在することが予測されるときに、ハイブリッドキャプチャーアッセイの感度を増すために用いることができる。しかしながら、標準的な増幅技術は、ハイブリッドキャプチャーが用いられる可能性がある条件に常に適合するわけではない。例えば、ハイブリッドキャプチャー技術の1つの特定の利用は、高価なサーモサイクラーおよび経験のある技術者が多くの場合いない農村社会におけるスクリーニングアッセイを目的とする。そのような状況では、関係する複雑な試薬の数を低減し、工程を単純化することが有益であり、多くの場合標準的なPCRプロトコルの使用を不可能にする。そのような状況では、PYROPHAGE 3173などの耐熱性ポリメラーゼが有用である。
【００７０】
一例をあげると、本明細書に記載の増幅は、例えばU.S. Patent No. 5,994,079、6,027,897、6,277,579、6,686,151、および7,439,016；US Patent Publication No. 2006/0051809 A1、2009/0162851 A1、および2009-0298187 A1；ならびにPCT Publication No. WO 01/96608に記載のハイブリッドキャプチャーアッセイにより精製および検出された結果として得られる単位複製配列を伴う試料に対して行われてもよい。
【００７１】
あるいは、標的核酸は、実施例5Bに記載の通り精製され、次いで本明細書に記載の通り増幅されてもよい。分離後、標的は、変性され、ビーズから分離され、例えばU.S. Patent No. 5,994,079、6,027,897、6,277,579、6,686,151、および7,439,016；US Patent Publication No. 2006/0051809 A1、2009/0162851 A1、および2009-0298187 A1；ならびにPCT Publication No. WO 01/96608に記載のようなハイブリッドキャプチャーアッセイにより検出されてもよい。
【００７２】
D. 利用可能な試薬による使用への不適合な標的の適応
上記の通り、ハイブリッドキャプチャーは好ましくはDNA:RNAハイブリッドと組み合わせて用いられる。しかしながら、標的核酸およびハイブリッドキャプチャープローブが両方ともRNAである事例が存在する可能性がある。そのような場合、ハイブリッドキャプチャーを行う前に標的RNAをDNAに変換することが望ましい。PYROPHAGE 3173の逆転写酵素活性は、そのような態様において有用でありうる。
【００７３】
mRNAが所望の標的であるときなど、特に所望の標的が試料中に存在する可能性が高いDNA相当物である場合、RNAは任意で、逆転写反応を行う前に試料から抽出されてもよい。全RNAおよびそのサブセットを単離する多くの方法が当技術分野において周知であり、例えば、酸グアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出およびRNeasy（登録商標）製品系列のキット（Qiagen GmbH, Hilden, DE）などの市販のキットを含む。逆転写反応およびそれを行う的確な方法を行う前にRNAを単離するか否かは、具体的な標的および適用に大部分依存し、当業者により決定されうる。
【００７４】
ひとたび試料を所望のように調製したら、逆転写反応は本質的に本明細書に記載のとおり行うことができる。感度の増加が必要または望まれる場合、ワンステップRT-HDA反応がさらに行われてもよい。次いで、標的単離は、実施例5Bに記載のハイブリッドキャプチャーにより行われてもよく、および／または標的検出は、例えばU.S. Patent No. 5,994,079、6,027,897、6,277,579、6,686,151、および7,439,016；US Patent Publication No. 2006/0051809 A1、2009/0162851 A1、および2009-0298187 A1；ならびにPCT Publication No. WO 01/96608に記載のとおりに行われてもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を以下を含む反応混合物と反応させる工程を含む、標的核酸の等温増幅のための方法：
a）ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素；ならびに
b）以下を有する第2の酵素：
i. 逆転写酵素活性；および
ii. DNA依存性DNAポリメラーゼ活性。
【請求項２】
標的核酸が、dsDNA、dsRNA、ssDNA、またはssRNAからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
逆転写酵素活性を有する第2の酵素がPYROPHAGE 3173である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
標的核酸がHPV核酸である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
反応混合物が、標的特異的核酸プライマーをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
反応混合物がランダムプライマーを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
反応混合物がトポイソメラーゼまたはジャイレースをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
標的核酸が標的RNAであり、かつ前記第2の酵素が、逆転写反応を含む方法により標的RNAを標的DNAに変換する、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
第2の酵素が標的DNAを増幅する増幅反応をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
反応混合物が以下を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法：
a. KCl；
b. トリスHCl；
c. MgSO4；
d. NaCl；
e. dNTP；
f. dATP；および
g. プライマーセット。
【請求項１１】
前記プライマーセットが、標的特異的核酸プライマーセットおよびランダムプライマーセットからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記プライマーセットが、SEQ ID NO: 2からSEQ ID NO: 7からなる群より選択されるプライマーを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
試料から標的核酸を単離する工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
標的核酸が、以下を含む方法により試料から単離される、請求項13記載の方法：
a. 標的核酸を含むDNA:RNAハイブリッドを生成する工程；
b. DNA:RNAハイブリッドを固相に結合させる工程；および
c. 固相に結合したDNA:RNAハイブリッドを試料から分離する工程。
【請求項１５】
DNA:RNAハイブリッドが抗DNA:RNA抗体に結合する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
抗DNA:RNA抗体が固相に結合するか、または固相に結合するよう適合される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
標的核酸を増幅する前に、標的核酸が試料から精製される、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
標的核酸を増幅した後に、標的核酸が試料から精製される、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
以下を含むキット：
a）ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素；ならびに
b）以下を有する第2の酵素：
i. 逆転写酵素活性；および
ii. DNA依存性DNAポリメラーゼ活性。
【請求項２０】
以下からなる群より選択される少なくとも1つの構成成分をさらに含み、各構成成分が任意で保存溶液の構成成分となる、請求項19記載のキット：
a. KCl；
b. トリスHCl；
c. MgSO4；
d. NaCl；
e. dNTP；
f. dATP；
g. ジャイレース；
h. トポイソメラーゼ；
i. プライマーセット
j. 核酸プローブ；
k. 抗DNA:RNAハイブリッド抗体；および
l. 固相。
【請求項２１】
核酸プローブ、抗DNA:RNAハイブリッド抗体、および固相を含み、以下のいずれかである、請求項19または20記載のキット：
a. 抗DNA:RNA抗体が、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される；または
b. 核酸プローブが、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される。
【請求項２２】
KClおよびトリスHClを含む保存アニーリングバッファーを含む、請求項19〜21のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３】
前記アニーリングバッファーが、10 mM KClおよび20 mMトリスHClの最終濃度に希釈可能であるように製剤化される、請求項22記載のキット。
【請求項２４】
第2の酵素がPYROPHAGE 3173である、請求項19〜23のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５】
以下を含む混合物：
a. 標的核酸；
b. ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素；ならびに
c. 以下を有する第2の酵素：
i. 逆転写酵素活性；および
ii. DNA依存性DNAポリメラーゼ活性。
【請求項２６】
以下からなる群より選択される少なくとも1つの構成成分をさらに含む、請求項25記載の混合物：
a. KCl；
b. トリスHCl；
c. MgSO4；
d. NaCl；
e. dNTP；
f. dATP；
g. ジャイレース；
h. トポイソメラーゼ；
i. プライマーセット
j. 核酸プローブ；
k. 抗DNA:RNAハイブリッド抗体；および
l. 固相。
【請求項２７】
核酸プローブ、抗DNA:RNAハイブリッド抗体、および固相を含み、以下のいずれかである、請求項25または26記載の混合物：
a. 抗DNA:RNA抗体が、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される；または
b. 核酸プローブが、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される。
【請求項２８】
水性溶液中に以下の構成成分を含む、請求項25〜27のいずれか一項記載の混合物：
a. 10 mM KCl；
b. 20 mM トリスHCl；
c. 4 mM MgSO4；
d. 40 mM NaCl；
e. 0.4 mM dNTP；
f. 3 mM dATP。
【請求項２９】
第2の酵素がPYROPHAGE 3173である、請求項25〜28のいずれか一項記載の混合物。
【請求項３０】
請求項1〜18のいずれか一項記載の方法により得られる増幅核酸。
【請求項１】
標的核酸を以下を含む反応混合物と反応させる工程を含む、標的核酸の等温増幅のための方法：
a）ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素；ならびに
b）以下を有する第2の酵素：
i. 逆転写酵素活性；および
ii. DNA依存性DNAポリメラーゼ活性。
【請求項２】
標的核酸が、dsDNA、dsRNA、ssDNA、またはssRNAからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
逆転写酵素活性を有する第2の酵素がPYROPHAGE 3173である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
標的核酸がHPV核酸である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
反応混合物が、標的特異的核酸プライマーをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
反応混合物がランダムプライマーを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
反応混合物がトポイソメラーゼまたはジャイレースをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
標的核酸が標的RNAであり、かつ前記第2の酵素が、逆転写反応を含む方法により標的RNAを標的DNAに変換する、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
第2の酵素が標的DNAを増幅する増幅反応をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
反応混合物が以下を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法：
a. KCl；
b. トリスHCl；
c. MgSO4；
d. NaCl；
e. dNTP；
f. dATP；および
g. プライマーセット。
【請求項１１】
前記プライマーセットが、標的特異的核酸プライマーセットおよびランダムプライマーセットからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記プライマーセットが、SEQ ID NO: 2からSEQ ID NO: 7からなる群より選択されるプライマーを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
試料から標的核酸を単離する工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
標的核酸が、以下を含む方法により試料から単離される、請求項13記載の方法：
a. 標的核酸を含むDNA:RNAハイブリッドを生成する工程；
b. DNA:RNAハイブリッドを固相に結合させる工程；および
c. 固相に結合したDNA:RNAハイブリッドを試料から分離する工程。
【請求項１５】
DNA:RNAハイブリッドが抗DNA:RNA抗体に結合する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
抗DNA:RNA抗体が固相に結合するか、または固相に結合するよう適合される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
標的核酸を増幅する前に、標的核酸が試料から精製される、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
標的核酸を増幅した後に、標的核酸が試料から精製される、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
以下を含むキット：
a）ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素；ならびに
b）以下を有する第2の酵素：
i. 逆転写酵素活性；および
ii. DNA依存性DNAポリメラーゼ活性。
【請求項２０】
以下からなる群より選択される少なくとも1つの構成成分をさらに含み、各構成成分が任意で保存溶液の構成成分となる、請求項19記載のキット：
a. KCl；
b. トリスHCl；
c. MgSO4；
d. NaCl；
e. dNTP；
f. dATP；
g. ジャイレース；
h. トポイソメラーゼ；
i. プライマーセット
j. 核酸プローブ；
k. 抗DNA:RNAハイブリッド抗体；および
l. 固相。
【請求項２１】
核酸プローブ、抗DNA:RNAハイブリッド抗体、および固相を含み、以下のいずれかである、請求項19または20記載のキット：
a. 抗DNA:RNA抗体が、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される；または
b. 核酸プローブが、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される。
【請求項２２】
KClおよびトリスHClを含む保存アニーリングバッファーを含む、請求項19〜21のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３】
前記アニーリングバッファーが、10 mM KClおよび20 mMトリスHClの最終濃度に希釈可能であるように製剤化される、請求項22記載のキット。
【請求項２４】
第2の酵素がPYROPHAGE 3173である、請求項19〜23のいずれか一項記載のキット。
【請求項２５】
以下を含む混合物：
a. 標的核酸；
b. ヘリカーゼ活性を有する第1の酵素；ならびに
c. 以下を有する第2の酵素：
i. 逆転写酵素活性；および
ii. DNA依存性DNAポリメラーゼ活性。
【請求項２６】
以下からなる群より選択される少なくとも1つの構成成分をさらに含む、請求項25記載の混合物：
a. KCl；
b. トリスHCl；
c. MgSO4；
d. NaCl；
e. dNTP；
f. dATP；
g. ジャイレース；
h. トポイソメラーゼ；
i. プライマーセット
j. 核酸プローブ；
k. 抗DNA:RNAハイブリッド抗体；および
l. 固相。
【請求項２７】
核酸プローブ、抗DNA:RNAハイブリッド抗体、および固相を含み、以下のいずれかである、請求項25または26記載の混合物：
a. 抗DNA:RNA抗体が、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される；または
b. 核酸プローブが、固相に結合するように適合されるか、もしくは固相に結合される。
【請求項２８】
水性溶液中に以下の構成成分を含む、請求項25〜27のいずれか一項記載の混合物：
a. 10 mM KCl；
b. 20 mM トリスHCl；
c. 4 mM MgSO4；
d. 40 mM NaCl；
e. 0.4 mM dNTP；
f. 3 mM dATP。
【請求項２９】
第2の酵素がPYROPHAGE 3173である、請求項25〜28のいずれか一項記載の混合物。
【請求項３０】
請求項1〜18のいずれか一項記載の方法により得られる増幅核酸。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５１６１９２（Ｐ２０１３−５１６１９２Ａ）
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４８１３６（Ｐ２０１２−５４８１３６）
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２０４５９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８５１６０
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５１００６９５５９）キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月７日（２０１１．１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２０４５９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８５１６０
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５１００６９５５９）キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
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