筋肉遅筋化促進剤
【課題】 持久力の増強や疲労の回復などに有効な天然由来の新規な成分を提供すること。
【解決手段】 本発明によれば、持久力の増強や疲労の回復などに有効な天然由来の筋肉遅筋化促進剤を提供することができる。本発明の筋肉遅筋化促進剤は、ウーロン茶や紅茶などの発酵茶から抽出された高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするものである。
【解決手段】 本発明によれば、持久力の増強や疲労の回復などに有効な天然由来の筋肉遅筋化促進剤を提供することができる。本発明の筋肉遅筋化促進剤は、ウーロン茶や紅茶などの発酵茶から抽出された高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持久力の増強や疲労の回復などに有効な筋肉遅筋化促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
持久力の増強や疲労の回復などに有効な成分は、アスリートの能力向上のみならず一般人の健康保持などにも寄与し、当該成分が天然由来であれば安全性が高いことから、サプリメントなどとしての用途が期待される。しかしながら、天然由来のそのような成分に関する報告は、例えば非特許文献１と非特許文献２において、カテキンを主成分とする緑茶抽出物が脂質代謝を改善することによって持久力を増強することが報告されている程度に過ぎない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Murase T et al. Green tea extract improves endurance capacity and increases muscle lipid oxidation in mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005; 288: R708-715
【非特許文献２】Murase T et al. Green tea extract improves running endurance in mice by stimulating lipid utilization during exercise. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2006; 290: R1550-1556
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、持久力の増強や疲労の回復などに有効な天然由来の新規な成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールが、ＡＭＰキナーゼの活性化などに基づくＰＧＣ−１αの発現促進などにより、筋肉の遅筋化を促進する作用を有することで、持久力の増強や疲労の回復などに有効であることを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の筋肉遅筋化促進剤は、請求項１記載の通り、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする。
また、請求項２記載の筋肉遅筋化促進剤は、請求項１記載の筋肉遅筋化促進剤において、高分子ポリフェノールが、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であることを特徴とする。
また、請求項３記載の筋肉遅筋化促進剤は、請求項１または２記載の筋肉遅筋化促進剤において、高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする。
また、請求項４記載の筋肉遅筋化促進剤は、請求項１または２記載の筋肉遅筋化促進剤において、高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする。
また、請求項５記載の筋肉遅筋化促進剤は、請求項１記載の筋肉遅筋化促進剤において、発酵茶がウーロン茶または紅茶であることを特徴とする。
また、本発明の持久力増強および／または疲労回復剤は、請求項６記載の通り、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明のＰＧＣ−１α発現促進剤は、請求項７記載の通り、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明のＡＭＰキナーゼ活性化剤は、請求項８記載の通り、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、持久力の増強や疲労の回復などに有効な天然由来の筋肉遅筋化促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１におけるウーロン茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を示すグラフである。
【図２】同、画分（１５）の高分子ポリフェノールの筋肉の遅筋化の促進作用を示すグラフである。
【図３】同、画分（１５）の高分子ポリフェノールの持久力の増強作用を示すグラフである。
【図４】同、画分（１５）の高分子ポリフェノールのＰＧＣ−１αの発現促進作用を示すグラフである。
【図５】同、画分（１５）の高分子ポリフェノールのＡＭＰキナーゼの活性化作用を示すグラフである。
【図６】実施例２におけるウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を示すグラフである。
【図７】実施例３における紅茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１６個の画分を示すグラフである。
【図８】実施例４における紅茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１１個の画分を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の筋肉遅筋化促進剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするものである。本発明において、発酵茶とは、茶葉の発酵を進行させてなる茶を意味し、その具体例としては、半発酵茶であるウーロン茶や発酵茶である紅茶などが挙げられる。また、本発明において、高分子ポリフェノールとは、分子内にフェノール性水酸基を複数個有する化合物、例えば、フラボノイド系ポリフェノールであるカテキン類が高度に重合したもの（例えば数平均分子量が５０００〜３００００）を意味する。カテキン類は、Ｃ６−Ｃ３−Ｃ６骨格にフェノール系水酸基を複数個有するフラバン−３−オール骨格を持つ化合物群であり、特に、茶の葉に多く含まれることは当業者によく知られた事実である。カテキンの化学構造は下記に示す通りである。カテキンには様々な誘導体が存在する（例えばカテキンの５’位の水素が水酸基に置換されたものがガロカテキンであり、さらに３位の水酸基が没食子酸とエステル結合したものがガロカテキンガレートである）。本発明において、カテキン類とは、カテキンおよびその誘導体を意味し、その具体例としては、カテキン、カテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレートなどが挙げられる。
【００１０】
【化１】
【００１１】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、発酵茶の製造過程（発酵、熟成や乾燥など）でカテキン類が高度に重合することで生成すると考えられるものであり、その取得方法としては、例えば、発酵茶葉中の水溶出成分（水、沸騰水、熱水、水蒸気などで抽出することで溶出する成分）を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製する方法や、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製する方法などが挙げられる。なお、溶媒に含水アセトンを用いた分画精製は、例えば東ソー株式会社のトヨパールＨＷ−４０Ｆを用いたクロマトグラフィーにより行うことができる。
また、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、水や、メタノールやエタノールやアセトンなどの有機溶媒を用いた抽出操作によって得られる発酵茶葉抽出物を合成吸着剤（例えば芳香族系合成吸着剤である三菱化学株式会社のダイヤイオンＨＰ２０など）に吸着させ、吸着剤を３０％メタノール溶液などで洗浄した後、７０％メタノール溶液などで吸着成分を溶出し、溶出成分から酢酸エチル溶出成分を除去した後、酢酸エチル非溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いてクロマトグラフィーにより分画精製する方法などによっても取得することができる。
【００１２】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールの具体例としては、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であるものが挙げられる。プロシアニジン構造とは、カテキン類のＣ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造である。発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造の他に、カテキン類のＢ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造などを含んでいてもよい。発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールが有する部分構造の具体例としては以下に示すものが挙げられる。なお、以下に示す部分構造はあくまで例示に過ぎず、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、ベンゾトロポロン、ベンゾキノン、ナフトキノンなどを含む部分構造をはじめとする多種多様の部分構造を有するものと考えられる。
【００１３】
【化２】
【００１４】
本発明の筋肉遅筋化促進剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを自体公知の方法によって顆粒剤や錠剤やカプセル剤などの経口製剤に製剤化したり、注射剤などの非経口製剤に製剤化したりしてヒトを含む哺乳動物に投与することで、筋肉（例えば骨格筋）の遅筋化を促進し、持久力の増強や疲労の回復などに効果的に作用する。その投与量は、適用対象の年齢、性別、体重、体調、症状の程度などによって適宜決定することができる。また、本発明の筋肉遅筋化促進剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを種々の形態の食品（サプリメントを含む）に持久力の増強や疲労の回復などの効果をもたらすに足る有効量を添加することで、機能性食品として食してもよい。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００１６】
実施例１：ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノール（その１）の筋肉の遅筋化の促進作用
（Ａ）ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノールの調製
沸騰水１０００ｍＬにウーロン茶葉３０ｇを加え、約１分間沸騰後、１０分間静置した。その後、ウーロン茶葉をろ過して除去し、ろ液を得た。以上の操作を合計４回行い、ウーロン茶葉１２０ｇから水溶出成分を含む水溶液を得た。
次に、水溶出成分から低分子ポリフェノールを除去するために酢酸エチル抽出した。具体的には、水溶液５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和酢酸エチルを加え、攪拌し、静置した後、酢酸エチル相を分取する操作を１０回繰り返し、酢酸エチル非溶出成分を含む水相を得た。
次に、酢酸エチル非溶出成分を含む水相をブタノール抽出した。具体的には、水相を減圧濃縮することで残存する酢酸エチルを除去した後、５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和ｎ−ブタノールを加え、攪拌し、静置した後、ブタノール相を分取する操作を１０回繰り返した。分取したブタノール相を集めることでブタノール溶出成分を含む抽出液を得、これを減圧濃縮することで残存するブタノールを除去し、ブタノール溶出成分を含む水溶液を得た。この水溶液を凍結乾燥し、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分をウーロン茶葉１２０ｇあたり４．５ｇの収量で得た。
【００１７】
次に、以上の方法で得られたウーロン茶ブタノール抽出中性画分を、クロマトグラフィーを行ってさらに細かく分画した。固定相にはトヨパールＨＷ−４０Ｆ（東ソー株式会社製）を用い、移動相には含水アセトンを用いた。
まず、直径２．４ｃｍ×長さ３５ｃｍのカラムにトヨパールＨＷ−４０Ｆを充填した。また、移動相として２０％アセトン溶液と５０％アセトン溶液をそれぞれ６００ｍＬ準備した。
次に、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分０．３ｇを２０％アセトン溶液３ｍＬに溶解し、得られた溶液をカラムにアプライした。２０％アセトン溶液と５０％アセトン溶液を用いて固定相に吸着した成分を２０〜５０％の直線的濃度勾配をかけて０．３ｇ／分の速度で順次溶出させ、フラクションコレクターを用いて溶出液を５ｇずつ試験管に分取した。
次に、各試験管に分取した溶出液の３５０ｎｍにおける吸光度を測定し、溶出曲線を作成した。作成した溶出曲線に基づいてウーロン茶ブタノール抽出中性画分をさらに細かく分画し、同じ画分に属する溶出液を集めた後、減圧濃縮することでアセトンを除去し、凍結乾燥し、１５個の画分サンプルを得た。
図１にウーロン茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を図１にあわせて示す。
【００１８】
（Ｂ）画分（１５）の平均分子量の測定
サイズ排除クロマトグラフィー法（ＳＥＣ：ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって画分（１５）の平均分子量の測定を行った。高速クロマトグラフ装置としてＬＣ−１０Ａシステム（株式会社島津製作所製）を用い、カラムにはＴＳＫ−ＧＥＬα−３０００（カラム寸法：直径７．８ｍｍ×長さ３０ｃｍ，東ソー株式会社製）を用いた。カラム温度は４０℃とした。展開溶媒には塩化リチウム１０ｍＭを含有したジメチルホルムアミドを用いた。流速は０．６ｍＬ／分に設定した。検出器にはＬＣ−１０Ａシステムに含まれるＵＶ検出器を用いた。検出波長は２７５ｎｍに設定した。
まず、カラムに分子量標準化合物としてＴＳＫ標準ポリスチレン（東ソー株式会社製）をアプライし、溶出時間を横軸に、ＵＶ検出値を縦軸にしてプロットし、溶出曲線を作成し、これに基づいて較正曲線を作成した。
次に、カラムにジメチルホルムアミドに溶解した画分（１５）をアプライし、溶出時間を横軸に、ＵＶ検出値を縦軸にしてプロットし、較正曲線に基づいて平均分子量を算出したところ、数平均分子量は１．５２×１０４、重量平均分子量は２．１０×１０４であった。
【００１９】
（Ｃ）画分（１５）の構造解析
熱分解−ガスクロマトグラフ−マススペクトル（Ｐｙ−ＧＣ−ＭＳ）分析装置を用いて画分（１５）の構造解析を行った。Ｐｙ−ＧＣ−ＭＳ分析装置によれば、サンプルを熱分解装置（Ｐｙ）で熱分解した後、得られた熱分解生成物をガスクロマトグラフ装置（ＧＣ）に導入して分別し、さらに分別した物質をマススペクトル装置（ＭＳ）で解析することにより、サンプルの熱的性質や化学構造に関する知見を得ることができる。
最初に、熱分解装置（Ｐｙ）としてキューリーポイント熱分解装置ＪＨＰ−５（日本分析工業株式会社製）を用いて画分（１５）の熱分解を行った。まず、炉内とガスクロマトグラフ導入部の温度を２５０℃にした。次に、フェロマグネティック−パイロホイル（厚さ５０μｍ）で０．１〜０．２ｍｇの画分（１５）を包み、１０％テトラメチルアンモニウムヒドロキサイドのメタノール溶液５μＬを加え、炉内に入れて３１５℃で４秒間処理することで熱分解を行った後、熱分解生成物をガスクロマトグラフ装置に導いた。なお、１０％テトラメチルアンモニウムヒドロキサイドのメタノール溶液は、画分（１５）に含まれる化学構造をメチル化することにより質量分析の段階で揮発性や熱安定性が得られるようにする目的で用いた。
ガスクロマトグラフ−マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）にはガスクロマトグラフ質量分析装置ＪＭＳ−６００Ｍ（日本電子株式会社製）を用いた。また、データ処理装置としてＴＳＳ−２０００（日本分析工業株式会社製）を用いた。ガスクロマトグラフ用カラムにはキャピラリーカラムＨＰ−１ＭＳ（カラム寸法：直径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ，コーティングした液層の厚さ：０．２５μｍ，アジレント・テクノロジー製）を用いた。画分（１５）の熱分解生成物とキャリアガスをカラム内に導入し、熱分解生成物中に存在する物質を分離するとともに、保持時間に関するデータを取得した。また、分離した各物質について質量分析を行い、化学構造などに関する知見を得た。なお、カラム内の温度は最初５０℃で１分間保持し、次に５℃／分で３００℃まで直線的に昇温させ、その後３００℃で１４分間保持した。キャリアガスにはヘリウムを用いた。流速は１ｍＬ／分に設定した。質量分析はイオン源温度２５０℃，イオン化電圧７０ｅＶの条件で行った。
ガスクロマトグラフ−マススペクトルにより得られたデータと、合成標準物質について同様の実験を行うことで得られたデータを比較した結果、画分（１５）の熱分解生成物から以下に化学式を示す１０種類の化合物が検出された。
【００２０】
【化３】
【００２１】
【化４】
【００２２】
【化５】
【００２３】
なお、上記の化合物の保持時間（ｔＲ：ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）と分子量は次の通りである。
化合物１・・・ｔＲ：２３．０分，分子量：１６８
化合物２・・・ｔＲ：２２．１分，分子量：１６６
化合物３・・・ｔＲ：３０．３分，分子量：１９６
化合物４・・・ｔＲ：３０．５分，分子量：２２６
化合物５・・・ｔＲ：３１．１分，分子量：２５４
化合物６・・・ｔＲ：３２．４分，分子量：２５４
化合物７・・・ｔＲ：３２．９分，分子量：２５４
化合物８・・・ｔＲ：３５．２分，分子量：２８４
化合物９・・・ｔＲ：３６．９分，分子量：３１２
化合物１０・・ｔＲ：４６．５分，分子量：４５０
【００２４】
以上の結果から、画分（１５）は、上記の１０種類の熱分解生成物を与える化学構造を有する物質であることがわかった。質量分析の結果からは、この物質がカテキン類の２’位，５’位，６’位と他のカテキン類のいずれかの位置の間、例えば、カテキン類同士の８位と６’位の間，６位と６’位の間，６’位と６’位の間などに重合部位を有することが示唆された。また、別途に行った画分（１５）のタンナーゼ分解の結果からは、この物質にはエピカテキンやエピガロカテキンの３位の水酸基にエステル結合していると考えられる没食子酸残基が含まれることが示された。塩酸−ブタノール分解の結果からは、この物質は部分構造中にカテキン類同士の４位と８位の間または４位と６位の間で重合したプロシアニジン構造を含むことが推測された。以上の結果を総合的に判断すると、画分（１５）は、例えば、以下に示す、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでいる高分子ポリフェノールであることがわかった（なお、この高分子ポリフェノールに含まれる部分構造の種類は多種多様であると考えられ、以上の結果はベンゾトロポロン、ベンゾキノン、ナフトキノンなどを含む部分構造の存在を否定するものではない）。
【００２５】
【化６】
【００２６】
（Ｄ）画分（１５）の高分子ポリフェノールの筋肉の遅筋化の促進作用
（実験方法）
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を無作為にトレーニング群、非トレーニング群に分け、さらにそれぞれの群を２つに分け、１つにはＤＷ（水）で調整した画分（１５）の高分子ポリフェノール（以下「ＭＡＦ」と略称する）の水溶液（０．０４％）を、もう１つにはコントロールとしてＤＷを自由飲水で経口投与した。各群の名称は、非トレーニング＋ＤＷ群、非トレーニング＋ＭＡＦ群、トレーニング＋ＤＷ群、トレーニング＋ＭＡＦ群とした。トレーニング群には、１日あたり３０分間のトレッドミルによる強制走行運動（速度：１５ｍ／ｍｉｎ、傾斜：０％）を週５日行わせ、これを１０週間に亘り行った。１０週間後のマウスを解剖し、Talmadge RJ, Roy RR. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol 1993; 75: 2337-2340に記載の方法により骨格筋（足底筋）のミオシン重鎖タイプを解析し、各群の速筋型速筋線維（ＩＩｂ）に対する遅筋型速筋繊維（ＩＩａ）の割合（ＩＩａ／ＩＩｂ）を求めた。
【００２７】
（実験結果）
結果を図２に示す（縦軸：非トレーニング＋ＤＷ群のＩＩａ／ＩＩｂの値を１とした場合の値）。図２から明らかなように、非トレーニング群ではＭＡＦを投与してもＩＩａ／ＩＩｂの値に変化は見られなかったが、トレーニング群ではＭＡＦを投与することでＩＩａ／ＩＩｂの値が増加した。古くから、持久的トレーニングを行うと、骨格筋の筋線維タイプはＩＩｂからＩＩａに移行すること（骨格筋の遅筋化）が知られているが（例えばDemirel HA, Powers SK, Naito H, Hughes M, Coombes JS. Exercise-induced alterations in skeletal muscle myosin heavy chain phenotype: dose-response relationship. J Appl Physiol 1999; 86: 1002-1008）、この実験から、運動とＭＡＦの投与を組み合わせることにより、運動のみに比較して骨格筋の遅筋化が促進することがわかった。
【００２８】
（Ｅ）画分（１５）の高分子ポリフェノールの持久力の増強作用
（実験方法）
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を無作為にトレーニング群、非トレーニング群に分け、さらにそれぞれの群を２つに分け、１つにはＤＷ（水）で調整した画分（１５）の高分子ポリフェノール（以下「ＭＡＦ」と略称する）の水溶液（０．０４％）を、もう１つにはコントロールとしてＤＷを自由飲水で経口投与した。各群の名称は、非トレーニング＋ＤＷ群、非トレーニング＋ＭＡＦ群、トレーニング＋ＤＷ群、トレーニング＋ＭＡＦ群とした。各群について、持久力の測定として、９週間に亘り、トレッドミルを用いて漸増負荷試験を週１回行い、マウスが疲労困憊に至るまでの走行時間を測定した。漸増負荷試験は、トレッドミルの傾斜を１０％にし、速度を１０ｍ／ｍｉｎから始め、４分ごとに２ｍ／ｍｉｎずつ速め、３６ｍ／ｍｉｎに達したらその後の速度は一定とするプロトコルで行った。なお、トレーニング群については、１日あたり３０分間のトレッドミルによる強制走行運動（速度：１５ｍ／ｍｉｎ、傾斜：０％）を週５日行わせた上で測定を行った。
【００２９】
（実験結果）
結果を図３に示す。図３から明らかなように、非トレーニング群ではＭＡＦを投与しても走行時間に変化は見られなかったが、トレーニング群ではＭＡＦを投与することで走行時間が増加し、持久力の増強が認められた。このＭＡＦの持久力の増強作用は、上記（Ｄ）のＭＡＦの筋肉の遅筋化の促進作用に合致することから、ＭＡＦは運動負荷が付与された個体に対して筋肉の遅筋化を促進することでその持久力を増強するので、例えばアスリートの能力向上のためのサプリメントの有効成分などとして有用であることがわかった。また、このＭＡＦの持久力の増強作用は、ＭＡＦが筋肉の耐疲労能を向上させたこともその要因として考えられた。
【００３０】
（Ｆ）画分（１５）の高分子ポリフェノールのＰＧＣ−１αの発現促進作用
（実験方法）
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を無作為にトレーニング群、非トレーニング群に分け、さらにそれぞれの群を２つに分け、１つにはＤＷ（水）で調整した画分（１５）の高分子ポリフェノール（以下「ＭＡＦ」と略称する）の水溶液（０．０４％）を、もう１つにはコントロールとしてＤＷを自由飲水で経口投与した。各群の名称は、非トレーニング＋ＤＷ群、非トレーニング＋ＭＡＦ群、トレーニング＋ＤＷ群、トレーニング＋ＭＡＦ群とした。トレーニング群には、１日あたり３０分間のトレッドミルによる強制走行運動（速度：１５ｍ／ｍｉｎ、傾斜：０％）を週５日行わせ、これを１０週間に亘り行った。１０週間後のマウスを解剖し、Suwa M et al. Metformin increases the PGC-1α protein and oxidative enzyme activities possibly via AMPK phosphorylation in skeletal muscle in vivo. J Appl Physiol 2006; 101: 1685-1692に記載のウェスタンブロッティング法により、各群の骨格筋（足底筋）中のＰＧＣ−１α発現量を求めた。
【００３１】
（実験結果）
結果を図４に示す（縦軸：非トレーニング＋ＤＷ群のＰＧＣ−１α発現量を１とした場合の値。なお、ＰＧＣ−１α発現量は内部標準としてβ−アクチンを用いてＰＧＣ−１α／β−アクチンの数式により算出）。図４から明らかなように、非トレーニング群ではＭＡＦを投与してもＰＧＣ−１α発現量に変化は見られなかったが、トレーニング群ではＭＡＦを投与することでＰＧＣ−１α発現量が増加した。転写コアクチベーターであるＰＧＣ−１αは、筋肉の遅筋化に重要な働きを担っていることが知られていることから（例えばLin J et al. Transcriptional co-activator PGC-1alpha drives the formation of slow-twitch muscle fibers. Nature 2002; 418: 797-801やMiura S et al. Overexpression of peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α down-regulates GLUT4 mRNA in skeletal muscles. J Biol Chem 2003; 278: 31385-31390）、ＭＡＦによる筋肉の遅筋化の促進には、ＭＡＦのＰＧＣ−１αの発現促進作用が寄与していることがわかった。
【００３２】
（Ｇ）画分（１５）の高分子ポリフェノールのＡＭＰキナーゼの活性化作用
（実験方法）
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を無作為にトレーニング群、非トレーニング群に分け、さらにそれぞれの群を２つに分け、１つにはＤＷ（水）で調整した画分（１５）の高分子ポリフェノール（以下「ＭＡＦ」と略称する）の水溶液（０．０４％）を、もう１つにはコントロールとしてＤＷを自由飲水で経口投与した。各群の名称は、非トレーニング＋ＤＷ群、非トレーニング＋ＭＡＦ群、トレーニング＋ＤＷ群、トレーニング＋ＭＡＦ群とした。トレーニング群には、１日あたり３０分間のトレッドミルによる強制走行運動（速度：１５ｍ／ｍｉｎ、傾斜：０％）を週５日行わせ、これを１０週間に亘り行った。１０週間後のマウスを解剖し、Pospisilik J et al. Targeted deletion of AIF decreases mitochondrial oxidative phosphorylation and protects from obesity and diabetes. Cell 2007; 131: 476-491に記載のウェスタンブロッティング法により、各群の骨格筋（足底筋）中のＡＭＰキナーゼの総量に対するリン酸化ＡＭＰキナーゼの量の割合（ｐ−ＡＭＰＫα／ｔｏｔａｌ−ＡＭＰＫα）を求めた。
【００３３】
（実験結果）
結果を図５に示す（縦軸：非トレーニング＋ＤＷ群のｐ−ＡＭＰＫα／ｔｏｔａｌ−ＡＭＰＫαの値を１とした場合の値）。図５から明らかなように、非トレーニング群ではＭＡＦを投与してもｐ−ＡＭＰＫα／ｔｏｔａｌ−ＡＭＰＫαの値に変化は見られなかったが、トレーニング群ではＭＡＦを投与することでｐ−ＡＭＰＫα／ｔｏｔａｌ−ＡＭＰＫαの値が増加した。ＡＭＫキナーゼもまた筋肉の遅筋化に重要な働きを担っていることが知られており（Narkar V et al. AMPK and PPARδ agonists are exercise mimetics. Cell 2008; 134: 405-415）、さらにＡＭＫキナーゼはＰＧＣ−１αの発現を誘引する作用を有することが知られていることから（Jaeger S. AMP-activated protein kinase (AMPK) action in skeletal muscle via direct phosphorylation of PGC-1α. PNAS 2007; 104: 12017-12022）、ＭＡＦは、ＡＭＰキナーゼのリン酸化による活性化により直接的に、また、ＰＧＣ−１αの発現促進を介して、筋肉の遅筋化を促進することがわかった。
【００３４】
実施例２：ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノール（その２）の筋肉の遅筋化の促進作用
実施例１の（Ａ）でブタノール溶出成分を含む抽出液を得た後に残った水相を塩酸でｐＨを約３にした後、５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和ｎ−ブタノールを加え、攪拌し、静置した後、ブタノール相を分取する操作を５回繰り返した。分取したブタノール相を集めることでブタノール溶出成分を含む抽出液を得、これを減圧濃縮することで残存するブタノールを除去し、ブタノール溶出成分を含む水溶液を得た。この水溶液を凍結乾燥し、ウーロン茶ブタノール抽出酸性画分をウーロン茶葉１２０ｇあたり３．２ｇの収量で得た。このウーロン茶ブタノール抽出酸性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１５個の画分サンプルを得た。図６にウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を図６にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１４）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は１．７３×１０４、重量平均分子量は２．４４×１０４であった。この画分（１４）の高分子ポリフェノールの筋肉の遅筋化の促進作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００３５】
実施例３：紅茶から抽出される高分子ポリフェノール（その１）の筋肉の遅筋化の促進作用
沸騰水５００ｍＬに紅茶葉２５ｇを加え、１０分間穏やかに沸騰後、直ちにブフナーロートとで紅茶葉をろ過して除去し、ろ液を得た。以上の操作を合計４回行い、紅茶葉１００ｇから水溶出成分を含む水溶液を得た。以降の操作を実施例１の（Ａ）と同様にして紅茶ブタノール抽出中性画分を紅茶葉１００ｇあたり１．５ｇの収量で得た。この紅茶ブタノール抽出中性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１６個の画分サンプルを得た。図７に紅茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１６個の画分を図７にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１５）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は１．３６×１０４、重量平均分子量は１．８９×１０４であった。この画分（１５）の高分子ポリフェノールの筋肉の遅筋化の促進作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００３６】
実施例４：紅茶から抽出される高分子ポリフェノール（その２）の筋肉の遅筋化の促進作用
実施例２と同様にして紅茶ブタノール抽出酸性画分を紅茶葉１００ｇあたり１．９ｇの収量で得た。この紅茶ブタノール抽出酸性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１１個の画分サンプルを得た。図８に紅茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１１個の画分を図８にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１１）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は９．４３×１０３、重量平均分子量は１．４８×１０４であった。この画分（１１）の高分子ポリフェノールの筋肉の遅筋化の促進作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００３７】
製剤例１：錠剤
実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールの凍結乾燥粉末５ｇ、乳糖７８ｇ、ステアリン酸マグネシウム１７ｇ、合計１００ｇを均一に混合し、常法に従って錠剤とした。
【００３８】
製剤例２：ビスケット
薄力粉３１ｇ、全卵１６ｇ、バター１６ｇ、砂糖２４ｇ、水１０ｇ、ベーキングパウダー１ｇ、実施例３の画分（１５）の高分子ポリフェノールの凍結乾燥粉末２ｇ、合計１００ｇを用い、常法に従ってビスケットとした。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、持久力の増強や疲労の回復などに有効な天然由来の筋肉遅筋化促進剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持久力の増強や疲労の回復などに有効な筋肉遅筋化促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
持久力の増強や疲労の回復などに有効な成分は、アスリートの能力向上のみならず一般人の健康保持などにも寄与し、当該成分が天然由来であれば安全性が高いことから、サプリメントなどとしての用途が期待される。しかしながら、天然由来のそのような成分に関する報告は、例えば非特許文献１と非特許文献２において、カテキンを主成分とする緑茶抽出物が脂質代謝を改善することによって持久力を増強することが報告されている程度に過ぎない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Murase T et al. Green tea extract improves endurance capacity and increases muscle lipid oxidation in mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005; 288: R708-715
【非特許文献２】Murase T et al. Green tea extract improves running endurance in mice by stimulating lipid utilization during exercise. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2006; 290: R1550-1556
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、持久力の増強や疲労の回復などに有効な天然由来の新規な成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールが、ＡＭＰキナーゼの活性化などに基づくＰＧＣ−１αの発現促進などにより、筋肉の遅筋化を促進する作用を有することで、持久力の増強や疲労の回復などに有効であることを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の筋肉遅筋化促進剤は、請求項１記載の通り、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする。
また、請求項２記載の筋肉遅筋化促進剤は、請求項１記載の筋肉遅筋化促進剤において、高分子ポリフェノールが、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であることを特徴とする。
また、請求項３記載の筋肉遅筋化促進剤は、請求項１または２記載の筋肉遅筋化促進剤において、高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする。
また、請求項４記載の筋肉遅筋化促進剤は、請求項１または２記載の筋肉遅筋化促進剤において、高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする。
また、請求項５記載の筋肉遅筋化促進剤は、請求項１記載の筋肉遅筋化促進剤において、発酵茶がウーロン茶または紅茶であることを特徴とする。
また、本発明の持久力増強および／または疲労回復剤は、請求項６記載の通り、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明のＰＧＣ−１α発現促進剤は、請求項７記載の通り、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする。
また、本発明のＡＭＰキナーゼ活性化剤は、請求項８記載の通り、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、持久力の増強や疲労の回復などに有効な天然由来の筋肉遅筋化促進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１におけるウーロン茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を示すグラフである。
【図２】同、画分（１５）の高分子ポリフェノールの筋肉の遅筋化の促進作用を示すグラフである。
【図３】同、画分（１５）の高分子ポリフェノールの持久力の増強作用を示すグラフである。
【図４】同、画分（１５）の高分子ポリフェノールのＰＧＣ−１αの発現促進作用を示すグラフである。
【図５】同、画分（１５）の高分子ポリフェノールのＡＭＰキナーゼの活性化作用を示すグラフである。
【図６】実施例２におけるウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を示すグラフである。
【図７】実施例３における紅茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１６個の画分を示すグラフである。
【図８】実施例４における紅茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線と溶出曲線に基づいて細分画して得た１１個の画分を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の筋肉遅筋化促進剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするものである。本発明において、発酵茶とは、茶葉の発酵を進行させてなる茶を意味し、その具体例としては、半発酵茶であるウーロン茶や発酵茶である紅茶などが挙げられる。また、本発明において、高分子ポリフェノールとは、分子内にフェノール性水酸基を複数個有する化合物、例えば、フラボノイド系ポリフェノールであるカテキン類が高度に重合したもの（例えば数平均分子量が５０００〜３００００）を意味する。カテキン類は、Ｃ６−Ｃ３−Ｃ６骨格にフェノール系水酸基を複数個有するフラバン−３−オール骨格を持つ化合物群であり、特に、茶の葉に多く含まれることは当業者によく知られた事実である。カテキンの化学構造は下記に示す通りである。カテキンには様々な誘導体が存在する（例えばカテキンの５’位の水素が水酸基に置換されたものがガロカテキンであり、さらに３位の水酸基が没食子酸とエステル結合したものがガロカテキンガレートである）。本発明において、カテキン類とは、カテキンおよびその誘導体を意味し、その具体例としては、カテキン、カテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレートなどが挙げられる。
【００１０】
【化１】
【００１１】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、発酵茶の製造過程（発酵、熟成や乾燥など）でカテキン類が高度に重合することで生成すると考えられるものであり、その取得方法としては、例えば、発酵茶葉中の水溶出成分（水、沸騰水、熱水、水蒸気などで抽出することで溶出する成分）を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製する方法や、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製する方法などが挙げられる。なお、溶媒に含水アセトンを用いた分画精製は、例えば東ソー株式会社のトヨパールＨＷ−４０Ｆを用いたクロマトグラフィーにより行うことができる。
また、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、水や、メタノールやエタノールやアセトンなどの有機溶媒を用いた抽出操作によって得られる発酵茶葉抽出物を合成吸着剤（例えば芳香族系合成吸着剤である三菱化学株式会社のダイヤイオンＨＰ２０など）に吸着させ、吸着剤を３０％メタノール溶液などで洗浄した後、７０％メタノール溶液などで吸着成分を溶出し、溶出成分から酢酸エチル溶出成分を除去した後、酢酸エチル非溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いてクロマトグラフィーにより分画精製する方法などによっても取得することができる。
【００１２】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールの具体例としては、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であるものが挙げられる。プロシアニジン構造とは、カテキン類のＣ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造である。発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造の他に、カテキン類のＢ環と他のカテキン類のＡ環が結合した構造などを含んでいてもよい。発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールが有する部分構造の具体例としては以下に示すものが挙げられる。なお、以下に示す部分構造はあくまで例示に過ぎず、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールは、ベンゾトロポロン、ベンゾキノン、ナフトキノンなどを含む部分構造をはじめとする多種多様の部分構造を有するものと考えられる。
【００１３】
【化２】
【００１４】
本発明の筋肉遅筋化促進剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを自体公知の方法によって顆粒剤や錠剤やカプセル剤などの経口製剤に製剤化したり、注射剤などの非経口製剤に製剤化したりしてヒトを含む哺乳動物に投与することで、筋肉（例えば骨格筋）の遅筋化を促進し、持久力の増強や疲労の回復などに効果的に作用する。その投与量は、適用対象の年齢、性別、体重、体調、症状の程度などによって適宜決定することができる。また、本発明の筋肉遅筋化促進剤は、発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを種々の形態の食品（サプリメントを含む）に持久力の増強や疲労の回復などの効果をもたらすに足る有効量を添加することで、機能性食品として食してもよい。
【実施例】
【００１５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００１６】
実施例１：ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノール（その１）の筋肉の遅筋化の促進作用
（Ａ）ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノールの調製
沸騰水１０００ｍＬにウーロン茶葉３０ｇを加え、約１分間沸騰後、１０分間静置した。その後、ウーロン茶葉をろ過して除去し、ろ液を得た。以上の操作を合計４回行い、ウーロン茶葉１２０ｇから水溶出成分を含む水溶液を得た。
次に、水溶出成分から低分子ポリフェノールを除去するために酢酸エチル抽出した。具体的には、水溶液５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和酢酸エチルを加え、攪拌し、静置した後、酢酸エチル相を分取する操作を１０回繰り返し、酢酸エチル非溶出成分を含む水相を得た。
次に、酢酸エチル非溶出成分を含む水相をブタノール抽出した。具体的には、水相を減圧濃縮することで残存する酢酸エチルを除去した後、５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和ｎ−ブタノールを加え、攪拌し、静置した後、ブタノール相を分取する操作を１０回繰り返した。分取したブタノール相を集めることでブタノール溶出成分を含む抽出液を得、これを減圧濃縮することで残存するブタノールを除去し、ブタノール溶出成分を含む水溶液を得た。この水溶液を凍結乾燥し、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分をウーロン茶葉１２０ｇあたり４．５ｇの収量で得た。
【００１７】
次に、以上の方法で得られたウーロン茶ブタノール抽出中性画分を、クロマトグラフィーを行ってさらに細かく分画した。固定相にはトヨパールＨＷ−４０Ｆ（東ソー株式会社製）を用い、移動相には含水アセトンを用いた。
まず、直径２．４ｃｍ×長さ３５ｃｍのカラムにトヨパールＨＷ−４０Ｆを充填した。また、移動相として２０％アセトン溶液と５０％アセトン溶液をそれぞれ６００ｍＬ準備した。
次に、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分０．３ｇを２０％アセトン溶液３ｍＬに溶解し、得られた溶液をカラムにアプライした。２０％アセトン溶液と５０％アセトン溶液を用いて固定相に吸着した成分を２０〜５０％の直線的濃度勾配をかけて０．３ｇ／分の速度で順次溶出させ、フラクションコレクターを用いて溶出液を５ｇずつ試験管に分取した。
次に、各試験管に分取した溶出液の３５０ｎｍにおける吸光度を測定し、溶出曲線を作成した。作成した溶出曲線に基づいてウーロン茶ブタノール抽出中性画分をさらに細かく分画し、同じ画分に属する溶出液を集めた後、減圧濃縮することでアセトンを除去し、凍結乾燥し、１５個の画分サンプルを得た。
図１にウーロン茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を図１にあわせて示す。
【００１８】
（Ｂ）画分（１５）の平均分子量の測定
サイズ排除クロマトグラフィー法（ＳＥＣ：ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって画分（１５）の平均分子量の測定を行った。高速クロマトグラフ装置としてＬＣ−１０Ａシステム（株式会社島津製作所製）を用い、カラムにはＴＳＫ−ＧＥＬα−３０００（カラム寸法：直径７．８ｍｍ×長さ３０ｃｍ，東ソー株式会社製）を用いた。カラム温度は４０℃とした。展開溶媒には塩化リチウム１０ｍＭを含有したジメチルホルムアミドを用いた。流速は０．６ｍＬ／分に設定した。検出器にはＬＣ−１０Ａシステムに含まれるＵＶ検出器を用いた。検出波長は２７５ｎｍに設定した。
まず、カラムに分子量標準化合物としてＴＳＫ標準ポリスチレン（東ソー株式会社製）をアプライし、溶出時間を横軸に、ＵＶ検出値を縦軸にしてプロットし、溶出曲線を作成し、これに基づいて較正曲線を作成した。
次に、カラムにジメチルホルムアミドに溶解した画分（１５）をアプライし、溶出時間を横軸に、ＵＶ検出値を縦軸にしてプロットし、較正曲線に基づいて平均分子量を算出したところ、数平均分子量は１．５２×１０４、重量平均分子量は２．１０×１０４であった。
【００１９】
（Ｃ）画分（１５）の構造解析
熱分解−ガスクロマトグラフ−マススペクトル（Ｐｙ−ＧＣ−ＭＳ）分析装置を用いて画分（１５）の構造解析を行った。Ｐｙ−ＧＣ−ＭＳ分析装置によれば、サンプルを熱分解装置（Ｐｙ）で熱分解した後、得られた熱分解生成物をガスクロマトグラフ装置（ＧＣ）に導入して分別し、さらに分別した物質をマススペクトル装置（ＭＳ）で解析することにより、サンプルの熱的性質や化学構造に関する知見を得ることができる。
最初に、熱分解装置（Ｐｙ）としてキューリーポイント熱分解装置ＪＨＰ−５（日本分析工業株式会社製）を用いて画分（１５）の熱分解を行った。まず、炉内とガスクロマトグラフ導入部の温度を２５０℃にした。次に、フェロマグネティック−パイロホイル（厚さ５０μｍ）で０．１〜０．２ｍｇの画分（１５）を包み、１０％テトラメチルアンモニウムヒドロキサイドのメタノール溶液５μＬを加え、炉内に入れて３１５℃で４秒間処理することで熱分解を行った後、熱分解生成物をガスクロマトグラフ装置に導いた。なお、１０％テトラメチルアンモニウムヒドロキサイドのメタノール溶液は、画分（１５）に含まれる化学構造をメチル化することにより質量分析の段階で揮発性や熱安定性が得られるようにする目的で用いた。
ガスクロマトグラフ−マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）にはガスクロマトグラフ質量分析装置ＪＭＳ−６００Ｍ（日本電子株式会社製）を用いた。また、データ処理装置としてＴＳＳ−２０００（日本分析工業株式会社製）を用いた。ガスクロマトグラフ用カラムにはキャピラリーカラムＨＰ−１ＭＳ（カラム寸法：直径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ，コーティングした液層の厚さ：０．２５μｍ，アジレント・テクノロジー製）を用いた。画分（１５）の熱分解生成物とキャリアガスをカラム内に導入し、熱分解生成物中に存在する物質を分離するとともに、保持時間に関するデータを取得した。また、分離した各物質について質量分析を行い、化学構造などに関する知見を得た。なお、カラム内の温度は最初５０℃で１分間保持し、次に５℃／分で３００℃まで直線的に昇温させ、その後３００℃で１４分間保持した。キャリアガスにはヘリウムを用いた。流速は１ｍＬ／分に設定した。質量分析はイオン源温度２５０℃，イオン化電圧７０ｅＶの条件で行った。
ガスクロマトグラフ−マススペクトルにより得られたデータと、合成標準物質について同様の実験を行うことで得られたデータを比較した結果、画分（１５）の熱分解生成物から以下に化学式を示す１０種類の化合物が検出された。
【００２０】
【化３】
【００２１】
【化４】
【００２２】
【化５】
【００２３】
なお、上記の化合物の保持時間（ｔＲ：ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）と分子量は次の通りである。
化合物１・・・ｔＲ：２３．０分，分子量：１６８
化合物２・・・ｔＲ：２２．１分，分子量：１６６
化合物３・・・ｔＲ：３０．３分，分子量：１９６
化合物４・・・ｔＲ：３０．５分，分子量：２２６
化合物５・・・ｔＲ：３１．１分，分子量：２５４
化合物６・・・ｔＲ：３２．４分，分子量：２５４
化合物７・・・ｔＲ：３２．９分，分子量：２５４
化合物８・・・ｔＲ：３５．２分，分子量：２８４
化合物９・・・ｔＲ：３６．９分，分子量：３１２
化合物１０・・ｔＲ：４６．５分，分子量：４５０
【００２４】
以上の結果から、画分（１５）は、上記の１０種類の熱分解生成物を与える化学構造を有する物質であることがわかった。質量分析の結果からは、この物質がカテキン類の２’位，５’位，６’位と他のカテキン類のいずれかの位置の間、例えば、カテキン類同士の８位と６’位の間，６位と６’位の間，６’位と６’位の間などに重合部位を有することが示唆された。また、別途に行った画分（１５）のタンナーゼ分解の結果からは、この物質にはエピカテキンやエピガロカテキンの３位の水酸基にエステル結合していると考えられる没食子酸残基が含まれることが示された。塩酸−ブタノール分解の結果からは、この物質は部分構造中にカテキン類同士の４位と８位の間または４位と６位の間で重合したプロシアニジン構造を含むことが推測された。以上の結果を総合的に判断すると、画分（１５）は、例えば、以下に示す、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでいる高分子ポリフェノールであることがわかった（なお、この高分子ポリフェノールに含まれる部分構造の種類は多種多様であると考えられ、以上の結果はベンゾトロポロン、ベンゾキノン、ナフトキノンなどを含む部分構造の存在を否定するものではない）。
【００２５】
【化６】
【００２６】
（Ｄ）画分（１５）の高分子ポリフェノールの筋肉の遅筋化の促進作用
（実験方法）
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を無作為にトレーニング群、非トレーニング群に分け、さらにそれぞれの群を２つに分け、１つにはＤＷ（水）で調整した画分（１５）の高分子ポリフェノール（以下「ＭＡＦ」と略称する）の水溶液（０．０４％）を、もう１つにはコントロールとしてＤＷを自由飲水で経口投与した。各群の名称は、非トレーニング＋ＤＷ群、非トレーニング＋ＭＡＦ群、トレーニング＋ＤＷ群、トレーニング＋ＭＡＦ群とした。トレーニング群には、１日あたり３０分間のトレッドミルによる強制走行運動（速度：１５ｍ／ｍｉｎ、傾斜：０％）を週５日行わせ、これを１０週間に亘り行った。１０週間後のマウスを解剖し、Talmadge RJ, Roy RR. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol 1993; 75: 2337-2340に記載の方法により骨格筋（足底筋）のミオシン重鎖タイプを解析し、各群の速筋型速筋線維（ＩＩｂ）に対する遅筋型速筋繊維（ＩＩａ）の割合（ＩＩａ／ＩＩｂ）を求めた。
【００２７】
（実験結果）
結果を図２に示す（縦軸：非トレーニング＋ＤＷ群のＩＩａ／ＩＩｂの値を１とした場合の値）。図２から明らかなように、非トレーニング群ではＭＡＦを投与してもＩＩａ／ＩＩｂの値に変化は見られなかったが、トレーニング群ではＭＡＦを投与することでＩＩａ／ＩＩｂの値が増加した。古くから、持久的トレーニングを行うと、骨格筋の筋線維タイプはＩＩｂからＩＩａに移行すること（骨格筋の遅筋化）が知られているが（例えばDemirel HA, Powers SK, Naito H, Hughes M, Coombes JS. Exercise-induced alterations in skeletal muscle myosin heavy chain phenotype: dose-response relationship. J Appl Physiol 1999; 86: 1002-1008）、この実験から、運動とＭＡＦの投与を組み合わせることにより、運動のみに比較して骨格筋の遅筋化が促進することがわかった。
【００２８】
（Ｅ）画分（１５）の高分子ポリフェノールの持久力の増強作用
（実験方法）
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を無作為にトレーニング群、非トレーニング群に分け、さらにそれぞれの群を２つに分け、１つにはＤＷ（水）で調整した画分（１５）の高分子ポリフェノール（以下「ＭＡＦ」と略称する）の水溶液（０．０４％）を、もう１つにはコントロールとしてＤＷを自由飲水で経口投与した。各群の名称は、非トレーニング＋ＤＷ群、非トレーニング＋ＭＡＦ群、トレーニング＋ＤＷ群、トレーニング＋ＭＡＦ群とした。各群について、持久力の測定として、９週間に亘り、トレッドミルを用いて漸増負荷試験を週１回行い、マウスが疲労困憊に至るまでの走行時間を測定した。漸増負荷試験は、トレッドミルの傾斜を１０％にし、速度を１０ｍ／ｍｉｎから始め、４分ごとに２ｍ／ｍｉｎずつ速め、３６ｍ／ｍｉｎに達したらその後の速度は一定とするプロトコルで行った。なお、トレーニング群については、１日あたり３０分間のトレッドミルによる強制走行運動（速度：１５ｍ／ｍｉｎ、傾斜：０％）を週５日行わせた上で測定を行った。
【００２９】
（実験結果）
結果を図３に示す。図３から明らかなように、非トレーニング群ではＭＡＦを投与しても走行時間に変化は見られなかったが、トレーニング群ではＭＡＦを投与することで走行時間が増加し、持久力の増強が認められた。このＭＡＦの持久力の増強作用は、上記（Ｄ）のＭＡＦの筋肉の遅筋化の促進作用に合致することから、ＭＡＦは運動負荷が付与された個体に対して筋肉の遅筋化を促進することでその持久力を増強するので、例えばアスリートの能力向上のためのサプリメントの有効成分などとして有用であることがわかった。また、このＭＡＦの持久力の増強作用は、ＭＡＦが筋肉の耐疲労能を向上させたこともその要因として考えられた。
【００３０】
（Ｆ）画分（１５）の高分子ポリフェノールのＰＧＣ−１αの発現促進作用
（実験方法）
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を無作為にトレーニング群、非トレーニング群に分け、さらにそれぞれの群を２つに分け、１つにはＤＷ（水）で調整した画分（１５）の高分子ポリフェノール（以下「ＭＡＦ」と略称する）の水溶液（０．０４％）を、もう１つにはコントロールとしてＤＷを自由飲水で経口投与した。各群の名称は、非トレーニング＋ＤＷ群、非トレーニング＋ＭＡＦ群、トレーニング＋ＤＷ群、トレーニング＋ＭＡＦ群とした。トレーニング群には、１日あたり３０分間のトレッドミルによる強制走行運動（速度：１５ｍ／ｍｉｎ、傾斜：０％）を週５日行わせ、これを１０週間に亘り行った。１０週間後のマウスを解剖し、Suwa M et al. Metformin increases the PGC-1α protein and oxidative enzyme activities possibly via AMPK phosphorylation in skeletal muscle in vivo. J Appl Physiol 2006; 101: 1685-1692に記載のウェスタンブロッティング法により、各群の骨格筋（足底筋）中のＰＧＣ−１α発現量を求めた。
【００３１】
（実験結果）
結果を図４に示す（縦軸：非トレーニング＋ＤＷ群のＰＧＣ−１α発現量を１とした場合の値。なお、ＰＧＣ−１α発現量は内部標準としてβ−アクチンを用いてＰＧＣ−１α／β−アクチンの数式により算出）。図４から明らかなように、非トレーニング群ではＭＡＦを投与してもＰＧＣ−１α発現量に変化は見られなかったが、トレーニング群ではＭＡＦを投与することでＰＧＣ−１α発現量が増加した。転写コアクチベーターであるＰＧＣ−１αは、筋肉の遅筋化に重要な働きを担っていることが知られていることから（例えばLin J et al. Transcriptional co-activator PGC-1alpha drives the formation of slow-twitch muscle fibers. Nature 2002; 418: 797-801やMiura S et al. Overexpression of peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α down-regulates GLUT4 mRNA in skeletal muscles. J Biol Chem 2003; 278: 31385-31390）、ＭＡＦによる筋肉の遅筋化の促進には、ＭＡＦのＰＧＣ−１αの発現促進作用が寄与していることがわかった。
【００３２】
（Ｇ）画分（１５）の高分子ポリフェノールのＡＭＰキナーゼの活性化作用
（実験方法）
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を無作為にトレーニング群、非トレーニング群に分け、さらにそれぞれの群を２つに分け、１つにはＤＷ（水）で調整した画分（１５）の高分子ポリフェノール（以下「ＭＡＦ」と略称する）の水溶液（０．０４％）を、もう１つにはコントロールとしてＤＷを自由飲水で経口投与した。各群の名称は、非トレーニング＋ＤＷ群、非トレーニング＋ＭＡＦ群、トレーニング＋ＤＷ群、トレーニング＋ＭＡＦ群とした。トレーニング群には、１日あたり３０分間のトレッドミルによる強制走行運動（速度：１５ｍ／ｍｉｎ、傾斜：０％）を週５日行わせ、これを１０週間に亘り行った。１０週間後のマウスを解剖し、Pospisilik J et al. Targeted deletion of AIF decreases mitochondrial oxidative phosphorylation and protects from obesity and diabetes. Cell 2007; 131: 476-491に記載のウェスタンブロッティング法により、各群の骨格筋（足底筋）中のＡＭＰキナーゼの総量に対するリン酸化ＡＭＰキナーゼの量の割合（ｐ−ＡＭＰＫα／ｔｏｔａｌ−ＡＭＰＫα）を求めた。
【００３３】
（実験結果）
結果を図５に示す（縦軸：非トレーニング＋ＤＷ群のｐ−ＡＭＰＫα／ｔｏｔａｌ−ＡＭＰＫαの値を１とした場合の値）。図５から明らかなように、非トレーニング群ではＭＡＦを投与してもｐ−ＡＭＰＫα／ｔｏｔａｌ−ＡＭＰＫαの値に変化は見られなかったが、トレーニング群ではＭＡＦを投与することでｐ−ＡＭＰＫα／ｔｏｔａｌ−ＡＭＰＫαの値が増加した。ＡＭＫキナーゼもまた筋肉の遅筋化に重要な働きを担っていることが知られており（Narkar V et al. AMPK and PPARδ agonists are exercise mimetics. Cell 2008; 134: 405-415）、さらにＡＭＫキナーゼはＰＧＣ−１αの発現を誘引する作用を有することが知られていることから（Jaeger S. AMP-activated protein kinase (AMPK) action in skeletal muscle via direct phosphorylation of PGC-1α. PNAS 2007; 104: 12017-12022）、ＭＡＦは、ＡＭＰキナーゼのリン酸化による活性化により直接的に、また、ＰＧＣ−１αの発現促進を介して、筋肉の遅筋化を促進することがわかった。
【００３４】
実施例２：ウーロン茶から抽出される高分子ポリフェノール（その２）の筋肉の遅筋化の促進作用
実施例１の（Ａ）でブタノール溶出成分を含む抽出液を得た後に残った水相を塩酸でｐＨを約３にした後、５００ｍＬにつき２００ｍＬの水飽和ｎ−ブタノールを加え、攪拌し、静置した後、ブタノール相を分取する操作を５回繰り返した。分取したブタノール相を集めることでブタノール溶出成分を含む抽出液を得、これを減圧濃縮することで残存するブタノールを除去し、ブタノール溶出成分を含む水溶液を得た。この水溶液を凍結乾燥し、ウーロン茶ブタノール抽出酸性画分をウーロン茶葉１２０ｇあたり３．２ｇの収量で得た。このウーロン茶ブタノール抽出酸性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１５個の画分サンプルを得た。図６にウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１５個の画分を図６にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１４）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は１．７３×１０４、重量平均分子量は２．４４×１０４であった。この画分（１４）の高分子ポリフェノールの筋肉の遅筋化の促進作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００３５】
実施例３：紅茶から抽出される高分子ポリフェノール（その１）の筋肉の遅筋化の促進作用
沸騰水５００ｍＬに紅茶葉２５ｇを加え、１０分間穏やかに沸騰後、直ちにブフナーロートとで紅茶葉をろ過して除去し、ろ液を得た。以上の操作を合計４回行い、紅茶葉１００ｇから水溶出成分を含む水溶液を得た。以降の操作を実施例１の（Ａ）と同様にして紅茶ブタノール抽出中性画分を紅茶葉１００ｇあたり１．５ｇの収量で得た。この紅茶ブタノール抽出中性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１６個の画分サンプルを得た。図７に紅茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１６個の画分を図７にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１５）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は１．３６×１０４、重量平均分子量は１．８９×１０４であった。この画分（１５）の高分子ポリフェノールの筋肉の遅筋化の促進作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００３６】
実施例４：紅茶から抽出される高分子ポリフェノール（その２）の筋肉の遅筋化の促進作用
実施例２と同様にして紅茶ブタノール抽出酸性画分を紅茶葉１００ｇあたり１．９ｇの収量で得た。この紅茶ブタノール抽出酸性画分を、実施例１の（Ａ）と同様にして細かく分画し、１１個の画分サンプルを得た。図８に紅茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線（溶出パターン）を示す（横軸：溶出液を回収した試験管番号（回収順），縦軸：３５０ｎｍにおける吸光度）。また、溶出曲線に基づいて細分画して得た１１個の画分を図８にあわせて示す。実施例１の（Ｂ）と同様にしてサイズ排除クロマトグラフィー法により画分（１１）の高分子ポリフェノールの平均分子量を測定したところ、数平均分子量は９．４３×１０３、重量平均分子量は１．４８×１０４であった。この画分（１１）の高分子ポリフェノールの筋肉の遅筋化の促進作用を実施例１の（Ｄ）と同様にして評価したところ、実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールと同様の作用が認められた。
【００３７】
製剤例１：錠剤
実施例１の画分（１５）の高分子ポリフェノールの凍結乾燥粉末５ｇ、乳糖７８ｇ、ステアリン酸マグネシウム１７ｇ、合計１００ｇを均一に混合し、常法に従って錠剤とした。
【００３８】
製剤例２：ビスケット
薄力粉３１ｇ、全卵１６ｇ、バター１６ｇ、砂糖２４ｇ、水１０ｇ、ベーキングパウダー１ｇ、実施例３の画分（１５）の高分子ポリフェノールの凍結乾燥粉末２ｇ、合計１００ｇを用い、常法に従ってビスケットとした。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、持久力の増強や疲労の回復などに有効な天然由来の筋肉遅筋化促進剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする筋肉遅筋化促進剤。
【請求項２】
高分子ポリフェノールが、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であることを特徴とする請求項１記載の筋肉遅筋化促進剤。
【請求項３】
高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする請求項１または２記載の筋肉遅筋化促進剤。
【請求項４】
高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする請求項１または２記載の筋肉遅筋化促進剤。
【請求項５】
発酵茶がウーロン茶または紅茶であることを特徴とする請求項１記載の筋肉遅筋化促進剤。
【請求項６】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする持久力増強および／または疲労回復剤。
【請求項７】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするＰＧＣ−１α発現促進剤。
【請求項８】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするＡＭＰキナーゼ活性化剤。
【請求項１】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする筋肉遅筋化促進剤。
【請求項２】
高分子ポリフェノールが、プロシアニジン構造と、カテキン類のＢ環同士が結合した構造を部分構造中に少なくとも含んでおり、数平均分子量が９０００〜１８０００であることを特徴とする請求項１記載の筋肉遅筋化促進剤。
【請求項３】
高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする請求項１または２記載の筋肉遅筋化促進剤。
【請求項４】
高分子ポリフェノールが、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、抽出されなかったブタノール非溶出成分を酸性化した後に再びブタノール抽出し、抽出されたブタノール溶出成分を溶媒に含水アセトンを用いて分画精製することで得られてなることを特徴とする請求項１または２記載の筋肉遅筋化促進剤。
【請求項５】
発酵茶がウーロン茶または紅茶であることを特徴とする請求項１記載の筋肉遅筋化促進剤。
【請求項６】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とする持久力増強および／または疲労回復剤。
【請求項７】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするＰＧＣ−１α発現促進剤。
【請求項８】
発酵茶から抽出される高分子ポリフェノールを有効成分とすることを特徴とするＡＭＰキナーゼ活性化剤。
【図１】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−３７３２３（Ｐ２０１０−３７３２３Ａ）
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４２２５５（Ｐ２００９−４２２５５）
【出願日】平成２１年２月２５日（２００９．２．２５）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（３０３０４４７１２）三井農林株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２５日（２００９．２．２５）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（３０３０４４７１２）三井農林株式会社 (72)
【Ｆターム（参考）】
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