米乳酸発酵飲食品及びその製造方法
【課題】米を原料に乳酸菌の持つ機能性を付与した飲食物を得ることを目的に、米発酵に適し、米を発酵させたときの特性（乳酸菌株の生残性、風味、嗜好性）が高い乳酸菌株を選定し、該乳酸菌株を用いた安価で日常的摂取が可能な米の飲食品を提供する。
【解決手段】胃酸耐性が高く低ｐＨでの生育が良好で、胆汁耐性も高く、かつ米もしくは米糖化物での生育が良好で、発酵後の風味、嗜好性が優れるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１（ＮＩＴＥ ＡＰ−６９１）に属する乳酸菌で発酵させることによる米の飲食物。
【解決手段】胃酸耐性が高く低ｐＨでの生育が良好で、胆汁耐性も高く、かつ米もしくは米糖化物での生育が良好で、発酵後の風味、嗜好性が優れるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１（ＮＩＴＥ ＡＰ−６９１）に属する乳酸菌で発酵させることによる米の飲食物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米の発酵に適し、経口投与後も生残性が高いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に属する乳酸菌、ならびに、該乳酸菌を含有する米の飲食品およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、発酵乳や、漬物、味噌、醤油などの伝統的な発酵食品の製造に深く関わっているとともに、腸管を介した宿主への生理機能（プロバイオティクスと呼ばれる）が注目を集めており、腸内細菌のバランスを回復し下痢、便秘などの症状を改善するだけでなく、免疫機能を高めたり、過剰な血中コレステロール値を低下させるなどの効能も知られている。このような乳酸菌の機能を活用したヨーグルトや発酵乳の開発が行われているが、米などの植物質の原料に発酵乳由来の乳酸菌を接種させても、生育が遅く発酵が進まないことが多い。これは本来乳酸菌は栄養要求性が高く、植物原料のみでは乳酸菌の生育に必要な栄養素を満たすことができないことによる。しかし漬物や味噌、醤油などの伝統的な発酵食品には乳酸菌が生息し、これらの乳酸菌の中には植物原料のみで生育する乳酸菌も存在する。
【０００３】
豆乳に関しては、（特許文献１）で、豆乳に適した乳酸菌が示されており、米に関しては、例えば（特許文献２）、（特許文献３）、には玄米や米糠を糖化させて乳酸発酵させる試みがなされているが、玄米や米糠は精白米よりも栄養分が豊富で、乳酸発酵に適する反面、糠臭が強く、食感も悪く嗜好性が劣る。精白米では開示さている乳酸菌を用いても発酵せず、精白米の米発酵に適した乳酸菌の選抜は行われていない。（特許文献４）には、蒸米を原料とし、麹カビを用いて一般の製麹法により酒麹を製造して、高糖分含有の麹糖化液に調製し、大豆蛋白の添加によりタンパク質の含有量を増加させた後、滅菌、乳酸菌を接種し発酵させる方法が記載されているが、これも乳酸菌の生育に必要なタンパク質を大豆タンパクの添加で解決しており、通常の発酵乳の製造に使用する乳酸菌が選ばれており、米の発酵に適しているとは言い難い。
【０００４】
（特許文献５）ではデンプン分解性を備えた乳酸菌による米の糖化と乳酸発酵を同時に行う方法が記載されているが、発酵にはスキムミルク、酵母エキスなどの米以外の栄養分の添加が必要である。そのほかの事例でも米の発酵には乳酸菌の生育に必要な米以外の成分が添加されており、既存の乳酸菌では、目的とする米飲食物を調製するには未だ改良の余地が多く残されているのが現状である。
【特許文献１】特開２００５−２２４２２４号公報
【特許文献２】特開平８−２８９３４１号公報
【特許文献３】特開昭６０−９４０５７号公報
【特許文献４】特開２００３−１１６５０２号公報
【特許文献５】特開平７−２５５４３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、米を原料に乳酸菌の持つ機能性を付与した飲食物を得ることを目的に、米発酵に適し、米を発酵させたときの特性（乳酸菌株の生残性、風味、嗜好性）が高い乳酸菌株を選定し、該乳酸菌株を用いた安価で日常的摂取が可能な米の飮食品を新たに提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記した課題を解決するためになされたものであって、本発明者らは、目的とする乳酸菌をスクリーニングするに際し、次のような基準を新たに設定し、選定作業を行った。
すなわち、本発明者らは、食経験が長く安全性の高い乳酸菌として、伝統的な発酵食由来の乳酸菌のうち▲１▼胃酸耐性が高い、▲２▼低ｐＨでの生育が良好である、▲３▼胆汁耐性が高い▲４▼米もしくは米糖化物での生育が良好で、発酵後の風味、嗜好性が優れる菌株の選定につき研究を重ねた結果、これらの条件に合致する菌株としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１（本菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターＮＩＴＥ ＡＰ−６９１として寄託された。）をラッキョウ漬物中から見出した。本菌株の菌学的性質は、以下のとおりである。
【０００７】
Ａ．形態的性状
細胞形態：桿菌
運動性：なし
胞子の有無：なし
グラム染色性：陽性
【０００８】
Ｂ．生理学的性状（陽性：＋、陰性：−、弱陽性：ｗ）
カタラーゼ −
ガス産生 −
１５℃での生育 ＋
４５℃での生育 −
発酵形式 ホモ発酵
乳酸旋光性 ＤＬ
ペプチドグリカンタイプ ＤＡＰ
好塩性・耐塩性 ０〜８％での生育 ＋
９％での生育 −
【０００９】
Ｃ．炭水化物発酵性（陽性：＋、陰性：−、弱陽性：ｗ）
アラビノース ＋
リボース ＋
キシロース −
グルコン酸 −
グルコース ＋
フルクトース ＋
ガラクトース ＋
マンノース ＋
ラムノース −
セロビオース ＋
ラクトース ＋
マルトース ＋
メリビオース ＋
スクロース ＋
ラフィノース ＋
サリシン ＋
トレハロース ＋
メリチトース −
マンニトール ＋
ソルビトール ＋
スターチ −
イヌリン −
グリセロール ＋
【００１０】
Ｄ．遺伝学的特性
ＭｉｃｒｏＳｅｑ ５００ １６ＳｒＤＮＡ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いた１６ＳｒＤＮＡの５００ｂｐ塩基配列はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ および Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ の１６ＳｒＤＮＡに対し、相同率９９％以上の高い相同性を示した。この塩基配列を用いて相同性検索を行い、相同率の高い上位１０株と近隣結合法による分子系統樹を作成したところ、図１を示し、分子系統樹上でも本菌株の１６ＳｒＤＮＡはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ および Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ の１６ＳｒＤＮＡとクラスターを形成し近縁であることが示された。
【００１１】
Ｅ．胃酸耐性
胃酸耐性試験は以下の通りに実施した。人工胃液（１００ｍＭ ＨＣｌ／ＫＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ２．０ ｗｉｔｈ ０．０４％ Ｐｅｐｓｉｎ）４．５ｍｌに乳酸菌培養液（ＧＹＰブロス ３０℃ ２４ｈｒ）０．５ｍｌを加え、３７℃で２時間放置し、初発菌数および人工胃液に接触後の菌数をＭＲＳ ａｇａｒを用いて計測し、生残率を算出した。本法により、食品由来乳酸菌（１２０株）の中で本菌株は高い生存率を示し、接種後の生菌数を経時的にみたところ、図２に示すようにほとんど低下しなかった。
【００１２】
Ｆ．胆汁耐性
胆汁耐性試験は以下の通りに実施した。ＧＹＰブロスにて２４時間前培養を行った菌株を０、０．１、０．２、０．３、０．４％胆汁末含有ＧＹＰブロスに接種、３７℃で２４時間培養、マイクロプレートリーダーで６３０ｎｍＯＤ値を測定した。胆汁濃度が高くなると、菌の生育は悪くなるが、図３に示すように本菌株は胆汁濃度０．４％下でも生育を示した。
【００１３】
Ｇ．米の発酵性
前述の胃酸耐性、胆汁耐性試験から、胃酸耐性、胆汁耐性を示した上位１０株を用いて米の発酵性を検討した。試験は以下の通りに実施した。うるち米粉（上新粉）０．２ｇ、グルコース０．２ｇ、脱イオン水２０ｍｌを５０ｍｌメジュウム瓶に入れ、滅菌後、ＧＹＰ ブロスにて２４時間前培養を行った乳酸菌培養液を２０μｌ添加し、３０℃で２日間発酵させ、ｐＨ測定、福井県食品加工研究所所員３名による官能評価（臭い、食味）を実施した。その結果は表１に示すように本菌株を含む５株が総合評価が優れていた。なお、風味の評価基準は以下の通りである。
【００１４】
◎；非常に良い、○；良い、△；あまりよくない、×；悪い
【００１５】
【表１】
上記の結果で評価の高かった本菌株を含む５株について、さらに米糖化液を用いて再度発酵性を検討した。米糖化液による発酵製試験は以下の通りに実施した。精白米１５０ｇに水３７０ｍｌを加え炊飯後、約６０℃の温湯６００ｍｌを加え、さらに市販麹１５０ｇを加え、よく混ぜ、インキュベーターにて５５℃、１４時間保温し、甘酒（米糖化液）を調製した。これをミキサーでピューレ状にし８０．０ｇずつ滅菌済みポリ容器にいれ、ＧＹＰ液体培地にて２４時間前培養を行った乳酸菌培養液を５０μｌ添加し、３０℃で２日間発酵させ、ｐＨ、酸度、乳酸菌生菌数、福井県食品加工研究所所員３名による官能評価（臭い、食味）を実施した。乳酸菌数は炭酸カルシウム加ＭＲＳ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を用い、混釈平板培養により計数測定した。３０℃４８時間培養した後、コロニー数をカウントした。表２に示すように添加した乳酸菌は米糖化液中で速やかに増加し、２４時間後には１０９個／ｇに達し、表３に示すように乳酸生成、ｐＨ低下が観察され、本菌株を含む選択株に優位性が認められた。官能評価の結果は表４に示すように、２４時間後、４８時間後とも、本菌株が食味評価が高く、嗜好性が優れていた。なお、風味の評価基準は以下の通りである。
【００１６】
◎；非常に良い、○；良い、△；あまりよくない、×；悪い
【表２】
【表３】
【表４】
【００１７】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１は、米もしくは米糖化物での生育が良好で、発酵後の風味、嗜好性が優れ、胃酸耐性、胆汁耐性を有し摂取後の生残性も期待でき、該菌株の生菌または米の発酵物を食品（液状、凝固、ペースト状、凍結、乾燥品）として提供することが可能な菌株として選択したものである。そこで、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１株を用いた米発酵飲食物の製造特性を例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
すなわち、本発明は 米に麹、水を加え糖化した甘酒、もしくは米に乳酸菌が利用できる糖類、水を加え、米発酵に適したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に属する乳酸菌、該乳酸菌含有物、その処理物の少なくともひとつを含有してなること、を特徴とする飲食品に関するものである。乳酸菌含有物としては、乳酸菌懸濁液、乳酸菌培養物、乳酸菌培養物から固形分を除去した乳酸菌培養液、米の発酵飲料、ヨーグルト状食品などが挙げられる。
【００１９】
処理物としては、凝固物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状物、希釈物、凍結物等が挙げられる。乳酸菌としては生菌体、湿潤菌体、乾燥菌体などが適宜使用可能である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、米に麹を加えて糖化させた甘酒や、米粉に最小限の糖類を添加しただけの原材料で乳酸発酵を行うことができ、効率的に米の乳酸発酵飲食品の製造を行うことができる。なお、米の糖化は麹以外にもアミラーゼなどの酵素剤を使用することも可能で、この場合も、米のみの原料で乳酸発酵を行うことができる。
【００２１】
また、乳酸菌を添加し発酵させることで、原料米に由来の耐熱性胞子形成バチルス属細菌などの変敗微生物の成育が抑制されるため、製品の保存性を高めることができる。
【００２２】
そして、胃酸耐性、胆汁耐性を有し摂取後の生残性も期待できる乳酸菌を用いることで保健機能を併せ持つ米の健康志向飲食品の製造が可能となり、低迷する米の消費拡大にも寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
原料の米は、粳米、糯米、有色素米など使用することができ、玄米のまま利用することもできるが、通常は精白米を炊飯して利用することができる。また上新粉や餅粉など粉末状の米粉に加水し、加熱して利用することもできる。乳酸菌は生育にグルコースなどの糖を必要とするが、これは米に麹や糖化酵素を作用させ、米デンプンを一部糖化し、マルトースやグルコースを生成させることで利用できる。もちろん米にグルコースなどの糖類を添加することも可能である。米の糖化は従来より、麹を利用する甘酒が広く行われており、甘酒に本乳酸菌株を作用させ方法は、再現良く乳酸発酵を行うことができ、もっとも適した方法である。
【００２４】
飲食物製造のための乳酸菌株の前培養は、遠心分離などで培養菌体だけを集菌し、培地成分を除去して使用することのほか、食品として利用できる食品添加物としての酵母エキス、グルコースのみからなる液体培地でも十分生育させることができる。また、米の乳酸発酵物をそのままスターターとして添加することも可能である。添加量は原料の１／１００００から１／１０の範囲で使用することができる。
【００２５】
本乳酸菌の生育温度は１５℃〜４０℃、至適温度３０℃で、この温度条件下で乳酸発酵を行うことができる。培養時間は３０℃で１６時間〜４８時間で、発酵終了後は冷蔵（５℃）保存により、約１ヶ月後も乳酸菌数を維持することができる。乳酸発酵中に酵母汚染が懸念されるため、乳酸菌の添加前に原材料の加熱殺菌を行うことが望ましい。乳酸生菌を製品中に維持するには、発酵終了後は冷蔵、凍結、凍結乾燥などが有効であるが、死菌としてもよい場合には、乳酸発酵終了後に加熱殺菌を行ってもよい。
【００２６】
飲料として提供する場合は、加水量を調節することで、製品の粘性を調節できる。乳酸菌添加時に寒天等のゲル化剤を添加することで、ヨーグルト状の凝固とて提供することもできる。また凍結させることでフローズンタイプのデザートとして提供することも可能であり、凍結乾燥などにより、粉末化し、サプリメントなどに利用することも可能である。
【試験例１】
【００２７】
精白米（うるち米）３００ｇ（２合）を洗米し、水７４０ｍＬに浸漬、電気炊飯器にて炊飯後、水約６００ｍＬ、市販麹２２０ｇ（２合）を加え、撹拌後、さらに水を加え総量２Ｌとした。上部をラップで覆い、５５℃に保温したインキュベーターで２４時間糖化し、甘酒を調製した。これを家庭用ミキサーでホモゲナイズし、ペースト状とし、温浴上で加熱殺菌（中心温度８５℃３０分間）を行い、水で約３０℃に冷却後、本菌株の前培養液（ＧＹＰブロス３０℃２４時間培養）を２ｍＬ（１／１０００容）添加し、滅菌済みサンプルチューブに３０ｍＬずつ分注し、２０℃、３０℃、４０℃に保温したインキュベーター内に静置して、ｐＨ、酸度、乳酸菌数を計測した。酸度は試料２ｍＬを０．１Ｎ水酸化ナトリウムで適定し、乳酸相当量に換算して表した。乳酸菌数は炭酸カルシウム加ＧＹＰ寒天培地を用い、混釈平板培養により計数測定した。３０℃４８時間培養した後、コロニー数をカウントした。図４、図５、図６に示すように、本菌株の至適温度３０℃で最も、菌数増加、ｐＨ低下、酸度上昇が認められたが、２０℃、４０℃でも、２４時間後には菌数は１０８ＣＦＵ／ｇ以上に達した。
【試験例２】
【００２８】
試験例１と同様に調製した甘酒を家庭用ミキサーでホモゲナイズし、ペースト状とし、温浴上で加熱殺菌（中心温度８５℃３０分間）を行い、水で約３０℃に冷却後、２００ｍＬずつメジウム瓶３本に入れ、本菌株の前培養液４０ｍＬ（ＧＹＰブロス３０℃２４時間培養：２．５×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）を２０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ 遠心分離し、培地成分を取り除き、滅菌生理食塩水で２回洗浄後滅菌生理食塩水４０ｍｌに懸濁させた菌体溶液をそれぞれ０．２ｍＬ（０．０１％）、２ｍＬ（０．１％）、２０ｍＬ（１％）添加し、３０℃に保温したインキュベーター内に静置して、乳酸菌数を計測した。乳酸菌数は炭酸カルシウム加ＧＹＰ寒天培地を用い、混釈平板培養により計数測定した。３０℃４８時間培養した後、コロニー数をカウントした。図７に示すように、初期の乳酸菌の添加量が異なっても、２４時間には１０９ＣＦＵ／ｇ近くに達し、良好な発酵性を示した。また試験例２では食品の製造を考慮して、培地成分を遠心分離により取り除いて菌体のみを添加しているが、十分な生育を示しており、産業上利用可能な菌株であると判断した。
【実施例１】
【００２９】
精白米（うるち米）７５０ｇ（５合）を洗米し、水１．８５Ｌに浸漬、電気炊飯器にて炊飯後、水約１．５Ｌ、市販麹５５０ｇ（５合）を加え、撹拌後、さらに水を加え総量５Ｌとした。上部をラップで覆い、５５℃に保温したインキュベーターで２４時間糖化し、甘酒を調製した。これを家庭用ミキサーでホモゲナイズし、ペースト状とし、温浴上で加熱殺菌（中心温度８５℃３０分間）を行い、水で約３０℃に冷却後、本菌株の前培養液（ＧＹＰブロス３０℃２４時間培養）を５ｍＬ（１／１０００容）添加し、３０℃で２４時間乳酸発酵して米乳酸発酵液状物を得た。
【実施例２】
【００３０】
実施例１と同様に調製した甘酒を家庭用ミキサーでホモゲナイズし、ペースト状とし、温浴上で加熱殺菌（中心温度８５℃３０分間）を行い、水で約３０℃に冷却後、本菌株の前培養液（ＧＹＰブロス３０℃２４時間培養）を５ｍＬ（１／１０００容）添加し、寒天２０ｇを水５００ｍＬにあらかじめ加熱溶解させたものを添加し素早くまぜ、均質化し、５０ｍｌずつ紙カップ容器に分注し、ふたをして３０℃で２４時間乳酸発酵して米乳酸発酵凝固物を得た。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本菌株の遺伝学的特性に関して１６ＳｒＤＮＡの５００ｂｐ塩基配列による本菌株と近縁菌との近隣結合法による分子系統樹を示す図である。
【図２】本菌株の胃酸耐性に関して、人工胃液による生存性を示すグラフである。
【図３】本菌株の胆汁耐性に関して、胆汁濃度と、菌の増殖の関係を示すグラフである。
【図４】本菌株を米糖化液に添加して所定の温度に置いたときの乳酸菌数の変化を示すグラフである。
【図５】本菌株を米糖化液に添加して所定の温度に置いたときのｐＨの変化を示すグラフである。
【図６】本菌株を米糖化液に添加して所定の温度に置いたときの酸度（乳酸換算値）の変化を示すグラフである。
【図７】本菌株の接種量を変えて米糖化液に添加して３０℃に置いたときの乳酸菌数の変化を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米の発酵に適し、経口投与後も生残性が高いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に属する乳酸菌、ならびに、該乳酸菌を含有する米の飲食品およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、発酵乳や、漬物、味噌、醤油などの伝統的な発酵食品の製造に深く関わっているとともに、腸管を介した宿主への生理機能（プロバイオティクスと呼ばれる）が注目を集めており、腸内細菌のバランスを回復し下痢、便秘などの症状を改善するだけでなく、免疫機能を高めたり、過剰な血中コレステロール値を低下させるなどの効能も知られている。このような乳酸菌の機能を活用したヨーグルトや発酵乳の開発が行われているが、米などの植物質の原料に発酵乳由来の乳酸菌を接種させても、生育が遅く発酵が進まないことが多い。これは本来乳酸菌は栄養要求性が高く、植物原料のみでは乳酸菌の生育に必要な栄養素を満たすことができないことによる。しかし漬物や味噌、醤油などの伝統的な発酵食品には乳酸菌が生息し、これらの乳酸菌の中には植物原料のみで生育する乳酸菌も存在する。
【０００３】
豆乳に関しては、（特許文献１）で、豆乳に適した乳酸菌が示されており、米に関しては、例えば（特許文献２）、（特許文献３）、には玄米や米糠を糖化させて乳酸発酵させる試みがなされているが、玄米や米糠は精白米よりも栄養分が豊富で、乳酸発酵に適する反面、糠臭が強く、食感も悪く嗜好性が劣る。精白米では開示さている乳酸菌を用いても発酵せず、精白米の米発酵に適した乳酸菌の選抜は行われていない。（特許文献４）には、蒸米を原料とし、麹カビを用いて一般の製麹法により酒麹を製造して、高糖分含有の麹糖化液に調製し、大豆蛋白の添加によりタンパク質の含有量を増加させた後、滅菌、乳酸菌を接種し発酵させる方法が記載されているが、これも乳酸菌の生育に必要なタンパク質を大豆タンパクの添加で解決しており、通常の発酵乳の製造に使用する乳酸菌が選ばれており、米の発酵に適しているとは言い難い。
【０００４】
（特許文献５）ではデンプン分解性を備えた乳酸菌による米の糖化と乳酸発酵を同時に行う方法が記載されているが、発酵にはスキムミルク、酵母エキスなどの米以外の栄養分の添加が必要である。そのほかの事例でも米の発酵には乳酸菌の生育に必要な米以外の成分が添加されており、既存の乳酸菌では、目的とする米飲食物を調製するには未だ改良の余地が多く残されているのが現状である。
【特許文献１】特開２００５−２２４２２４号公報
【特許文献２】特開平８−２８９３４１号公報
【特許文献３】特開昭６０−９４０５７号公報
【特許文献４】特開２００３−１１６５０２号公報
【特許文献５】特開平７−２５５４３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、米を原料に乳酸菌の持つ機能性を付与した飲食物を得ることを目的に、米発酵に適し、米を発酵させたときの特性（乳酸菌株の生残性、風味、嗜好性）が高い乳酸菌株を選定し、該乳酸菌株を用いた安価で日常的摂取が可能な米の飮食品を新たに提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記した課題を解決するためになされたものであって、本発明者らは、目的とする乳酸菌をスクリーニングするに際し、次のような基準を新たに設定し、選定作業を行った。
すなわち、本発明者らは、食経験が長く安全性の高い乳酸菌として、伝統的な発酵食由来の乳酸菌のうち▲１▼胃酸耐性が高い、▲２▼低ｐＨでの生育が良好である、▲３▼胆汁耐性が高い▲４▼米もしくは米糖化物での生育が良好で、発酵後の風味、嗜好性が優れる菌株の選定につき研究を重ねた結果、これらの条件に合致する菌株としてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１（本菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターＮＩＴＥ ＡＰ−６９１として寄託された。）をラッキョウ漬物中から見出した。本菌株の菌学的性質は、以下のとおりである。
【０００７】
Ａ．形態的性状
細胞形態：桿菌
運動性：なし
胞子の有無：なし
グラム染色性：陽性
【０００８】
Ｂ．生理学的性状（陽性：＋、陰性：−、弱陽性：ｗ）
カタラーゼ −
ガス産生 −
１５℃での生育 ＋
４５℃での生育 −
発酵形式 ホモ発酵
乳酸旋光性 ＤＬ
ペプチドグリカンタイプ ＤＡＰ
好塩性・耐塩性 ０〜８％での生育 ＋
９％での生育 −
【０００９】
Ｃ．炭水化物発酵性（陽性：＋、陰性：−、弱陽性：ｗ）
アラビノース ＋
リボース ＋
キシロース −
グルコン酸 −
グルコース ＋
フルクトース ＋
ガラクトース ＋
マンノース ＋
ラムノース −
セロビオース ＋
ラクトース ＋
マルトース ＋
メリビオース ＋
スクロース ＋
ラフィノース ＋
サリシン ＋
トレハロース ＋
メリチトース −
マンニトール ＋
ソルビトール ＋
スターチ −
イヌリン −
グリセロール ＋
【００１０】
Ｄ．遺伝学的特性
ＭｉｃｒｏＳｅｑ ５００ １６ＳｒＤＮＡ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いた１６ＳｒＤＮＡの５００ｂｐ塩基配列はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ および Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ の１６ＳｒＤＮＡに対し、相同率９９％以上の高い相同性を示した。この塩基配列を用いて相同性検索を行い、相同率の高い上位１０株と近隣結合法による分子系統樹を作成したところ、図１を示し、分子系統樹上でも本菌株の１６ＳｒＤＮＡはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ および Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ の１６ＳｒＤＮＡとクラスターを形成し近縁であることが示された。
【００１１】
Ｅ．胃酸耐性
胃酸耐性試験は以下の通りに実施した。人工胃液（１００ｍＭ ＨＣｌ／ＫＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ２．０ ｗｉｔｈ ０．０４％ Ｐｅｐｓｉｎ）４．５ｍｌに乳酸菌培養液（ＧＹＰブロス ３０℃ ２４ｈｒ）０．５ｍｌを加え、３７℃で２時間放置し、初発菌数および人工胃液に接触後の菌数をＭＲＳ ａｇａｒを用いて計測し、生残率を算出した。本法により、食品由来乳酸菌（１２０株）の中で本菌株は高い生存率を示し、接種後の生菌数を経時的にみたところ、図２に示すようにほとんど低下しなかった。
【００１２】
Ｆ．胆汁耐性
胆汁耐性試験は以下の通りに実施した。ＧＹＰブロスにて２４時間前培養を行った菌株を０、０．１、０．２、０．３、０．４％胆汁末含有ＧＹＰブロスに接種、３７℃で２４時間培養、マイクロプレートリーダーで６３０ｎｍＯＤ値を測定した。胆汁濃度が高くなると、菌の生育は悪くなるが、図３に示すように本菌株は胆汁濃度０．４％下でも生育を示した。
【００１３】
Ｇ．米の発酵性
前述の胃酸耐性、胆汁耐性試験から、胃酸耐性、胆汁耐性を示した上位１０株を用いて米の発酵性を検討した。試験は以下の通りに実施した。うるち米粉（上新粉）０．２ｇ、グルコース０．２ｇ、脱イオン水２０ｍｌを５０ｍｌメジュウム瓶に入れ、滅菌後、ＧＹＰ ブロスにて２４時間前培養を行った乳酸菌培養液を２０μｌ添加し、３０℃で２日間発酵させ、ｐＨ測定、福井県食品加工研究所所員３名による官能評価（臭い、食味）を実施した。その結果は表１に示すように本菌株を含む５株が総合評価が優れていた。なお、風味の評価基準は以下の通りである。
【００１４】
◎；非常に良い、○；良い、△；あまりよくない、×；悪い
【００１５】
【表１】
上記の結果で評価の高かった本菌株を含む５株について、さらに米糖化液を用いて再度発酵性を検討した。米糖化液による発酵製試験は以下の通りに実施した。精白米１５０ｇに水３７０ｍｌを加え炊飯後、約６０℃の温湯６００ｍｌを加え、さらに市販麹１５０ｇを加え、よく混ぜ、インキュベーターにて５５℃、１４時間保温し、甘酒（米糖化液）を調製した。これをミキサーでピューレ状にし８０．０ｇずつ滅菌済みポリ容器にいれ、ＧＹＰ液体培地にて２４時間前培養を行った乳酸菌培養液を５０μｌ添加し、３０℃で２日間発酵させ、ｐＨ、酸度、乳酸菌生菌数、福井県食品加工研究所所員３名による官能評価（臭い、食味）を実施した。乳酸菌数は炭酸カルシウム加ＭＲＳ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を用い、混釈平板培養により計数測定した。３０℃４８時間培養した後、コロニー数をカウントした。表２に示すように添加した乳酸菌は米糖化液中で速やかに増加し、２４時間後には１０９個／ｇに達し、表３に示すように乳酸生成、ｐＨ低下が観察され、本菌株を含む選択株に優位性が認められた。官能評価の結果は表４に示すように、２４時間後、４８時間後とも、本菌株が食味評価が高く、嗜好性が優れていた。なお、風味の評価基準は以下の通りである。
【００１６】
◎；非常に良い、○；良い、△；あまりよくない、×；悪い
【表２】
【表３】
【表４】
【００１７】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１は、米もしくは米糖化物での生育が良好で、発酵後の風味、嗜好性が優れ、胃酸耐性、胆汁耐性を有し摂取後の生残性も期待でき、該菌株の生菌または米の発酵物を食品（液状、凝固、ペースト状、凍結、乾燥品）として提供することが可能な菌株として選択したものである。そこで、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１株を用いた米発酵飲食物の製造特性を例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
すなわち、本発明は 米に麹、水を加え糖化した甘酒、もしくは米に乳酸菌が利用できる糖類、水を加え、米発酵に適したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に属する乳酸菌、該乳酸菌含有物、その処理物の少なくともひとつを含有してなること、を特徴とする飲食品に関するものである。乳酸菌含有物としては、乳酸菌懸濁液、乳酸菌培養物、乳酸菌培養物から固形分を除去した乳酸菌培養液、米の発酵飲料、ヨーグルト状食品などが挙げられる。
【００１９】
処理物としては、凝固物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状物、希釈物、凍結物等が挙げられる。乳酸菌としては生菌体、湿潤菌体、乾燥菌体などが適宜使用可能である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、米に麹を加えて糖化させた甘酒や、米粉に最小限の糖類を添加しただけの原材料で乳酸発酵を行うことができ、効率的に米の乳酸発酵飲食品の製造を行うことができる。なお、米の糖化は麹以外にもアミラーゼなどの酵素剤を使用することも可能で、この場合も、米のみの原料で乳酸発酵を行うことができる。
【００２１】
また、乳酸菌を添加し発酵させることで、原料米に由来の耐熱性胞子形成バチルス属細菌などの変敗微生物の成育が抑制されるため、製品の保存性を高めることができる。
【００２２】
そして、胃酸耐性、胆汁耐性を有し摂取後の生残性も期待できる乳酸菌を用いることで保健機能を併せ持つ米の健康志向飲食品の製造が可能となり、低迷する米の消費拡大にも寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
原料の米は、粳米、糯米、有色素米など使用することができ、玄米のまま利用することもできるが、通常は精白米を炊飯して利用することができる。また上新粉や餅粉など粉末状の米粉に加水し、加熱して利用することもできる。乳酸菌は生育にグルコースなどの糖を必要とするが、これは米に麹や糖化酵素を作用させ、米デンプンを一部糖化し、マルトースやグルコースを生成させることで利用できる。もちろん米にグルコースなどの糖類を添加することも可能である。米の糖化は従来より、麹を利用する甘酒が広く行われており、甘酒に本乳酸菌株を作用させ方法は、再現良く乳酸発酵を行うことができ、もっとも適した方法である。
【００２４】
飲食物製造のための乳酸菌株の前培養は、遠心分離などで培養菌体だけを集菌し、培地成分を除去して使用することのほか、食品として利用できる食品添加物としての酵母エキス、グルコースのみからなる液体培地でも十分生育させることができる。また、米の乳酸発酵物をそのままスターターとして添加することも可能である。添加量は原料の１／１００００から１／１０の範囲で使用することができる。
【００２５】
本乳酸菌の生育温度は１５℃〜４０℃、至適温度３０℃で、この温度条件下で乳酸発酵を行うことができる。培養時間は３０℃で１６時間〜４８時間で、発酵終了後は冷蔵（５℃）保存により、約１ヶ月後も乳酸菌数を維持することができる。乳酸発酵中に酵母汚染が懸念されるため、乳酸菌の添加前に原材料の加熱殺菌を行うことが望ましい。乳酸生菌を製品中に維持するには、発酵終了後は冷蔵、凍結、凍結乾燥などが有効であるが、死菌としてもよい場合には、乳酸発酵終了後に加熱殺菌を行ってもよい。
【００２６】
飲料として提供する場合は、加水量を調節することで、製品の粘性を調節できる。乳酸菌添加時に寒天等のゲル化剤を添加することで、ヨーグルト状の凝固とて提供することもできる。また凍結させることでフローズンタイプのデザートとして提供することも可能であり、凍結乾燥などにより、粉末化し、サプリメントなどに利用することも可能である。
【試験例１】
【００２７】
精白米（うるち米）３００ｇ（２合）を洗米し、水７４０ｍＬに浸漬、電気炊飯器にて炊飯後、水約６００ｍＬ、市販麹２２０ｇ（２合）を加え、撹拌後、さらに水を加え総量２Ｌとした。上部をラップで覆い、５５℃に保温したインキュベーターで２４時間糖化し、甘酒を調製した。これを家庭用ミキサーでホモゲナイズし、ペースト状とし、温浴上で加熱殺菌（中心温度８５℃３０分間）を行い、水で約３０℃に冷却後、本菌株の前培養液（ＧＹＰブロス３０℃２４時間培養）を２ｍＬ（１／１０００容）添加し、滅菌済みサンプルチューブに３０ｍＬずつ分注し、２０℃、３０℃、４０℃に保温したインキュベーター内に静置して、ｐＨ、酸度、乳酸菌数を計測した。酸度は試料２ｍＬを０．１Ｎ水酸化ナトリウムで適定し、乳酸相当量に換算して表した。乳酸菌数は炭酸カルシウム加ＧＹＰ寒天培地を用い、混釈平板培養により計数測定した。３０℃４８時間培養した後、コロニー数をカウントした。図４、図５、図６に示すように、本菌株の至適温度３０℃で最も、菌数増加、ｐＨ低下、酸度上昇が認められたが、２０℃、４０℃でも、２４時間後には菌数は１０８ＣＦＵ／ｇ以上に達した。
【試験例２】
【００２８】
試験例１と同様に調製した甘酒を家庭用ミキサーでホモゲナイズし、ペースト状とし、温浴上で加熱殺菌（中心温度８５℃３０分間）を行い、水で約３０℃に冷却後、２００ｍＬずつメジウム瓶３本に入れ、本菌株の前培養液４０ｍＬ（ＧＹＰブロス３０℃２４時間培養：２．５×１０９ＣＦＵ／ｍｌ）を２０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ 遠心分離し、培地成分を取り除き、滅菌生理食塩水で２回洗浄後滅菌生理食塩水４０ｍｌに懸濁させた菌体溶液をそれぞれ０．２ｍＬ（０．０１％）、２ｍＬ（０．１％）、２０ｍＬ（１％）添加し、３０℃に保温したインキュベーター内に静置して、乳酸菌数を計測した。乳酸菌数は炭酸カルシウム加ＧＹＰ寒天培地を用い、混釈平板培養により計数測定した。３０℃４８時間培養した後、コロニー数をカウントした。図７に示すように、初期の乳酸菌の添加量が異なっても、２４時間には１０９ＣＦＵ／ｇ近くに達し、良好な発酵性を示した。また試験例２では食品の製造を考慮して、培地成分を遠心分離により取り除いて菌体のみを添加しているが、十分な生育を示しており、産業上利用可能な菌株であると判断した。
【実施例１】
【００２９】
精白米（うるち米）７５０ｇ（５合）を洗米し、水１．８５Ｌに浸漬、電気炊飯器にて炊飯後、水約１．５Ｌ、市販麹５５０ｇ（５合）を加え、撹拌後、さらに水を加え総量５Ｌとした。上部をラップで覆い、５５℃に保温したインキュベーターで２４時間糖化し、甘酒を調製した。これを家庭用ミキサーでホモゲナイズし、ペースト状とし、温浴上で加熱殺菌（中心温度８５℃３０分間）を行い、水で約３０℃に冷却後、本菌株の前培養液（ＧＹＰブロス３０℃２４時間培養）を５ｍＬ（１／１０００容）添加し、３０℃で２４時間乳酸発酵して米乳酸発酵液状物を得た。
【実施例２】
【００３０】
実施例１と同様に調製した甘酒を家庭用ミキサーでホモゲナイズし、ペースト状とし、温浴上で加熱殺菌（中心温度８５℃３０分間）を行い、水で約３０℃に冷却後、本菌株の前培養液（ＧＹＰブロス３０℃２４時間培養）を５ｍＬ（１／１０００容）添加し、寒天２０ｇを水５００ｍＬにあらかじめ加熱溶解させたものを添加し素早くまぜ、均質化し、５０ｍｌずつ紙カップ容器に分注し、ふたをして３０℃で２４時間乳酸発酵して米乳酸発酵凝固物を得た。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本菌株の遺伝学的特性に関して１６ＳｒＤＮＡの５００ｂｐ塩基配列による本菌株と近縁菌との近隣結合法による分子系統樹を示す図である。
【図２】本菌株の胃酸耐性に関して、人工胃液による生存性を示すグラフである。
【図３】本菌株の胆汁耐性に関して、胆汁濃度と、菌の増殖の関係を示すグラフである。
【図４】本菌株を米糖化液に添加して所定の温度に置いたときの乳酸菌数の変化を示すグラフである。
【図５】本菌株を米糖化液に添加して所定の温度に置いたときのｐＨの変化を示すグラフである。
【図６】本菌株を米糖化液に添加して所定の温度に置いたときの酸度（乳酸換算値）の変化を示すグラフである。
【図７】本菌株の接種量を変えて米糖化液に添加して３０℃に置いたときの乳酸菌数の変化を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
米に麹、水を加え糖化した甘酒、もしくは米に乳酸菌が利用できる糖類、水を加え、米発酵に適したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に属する乳酸菌、該乳酸菌含有物、その処理物の少なくともひとつを含有してなること、を特徴とする飲食品。
【請求項２】
米に麹、水を加え糖化した甘酒、もしくは米に乳酸菌が利用できる糖類、水を加え、米発酵に適したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に属する乳酸菌、該乳酸菌含有物、その処理物の少なくともひとつを含有してなること、を特徴とする飲食品の製造方法。
【請求項３】
胃酸耐性、胆汁耐性を有し、経口投与組成物とした際に生残性が高いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に属する乳酸菌、該乳酸菌含有物、その処理物の少なくともひとつを含有してなること、を特徴とする米の飲食品。
【請求項４】
乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１であること、を特徴とする請求項１又は２に記載の飲食品。
【請求項５】
乳酸菌含有物が、乳酸菌懸濁液、乳酸菌培養物、乳酸菌培養液から選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の飲食品。
【請求項６】
処理物が、凝固物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状物、希釈物、凍結物から選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の飲食品。
【請求項７】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１（ＮＩＴＥ ＡＰ−６９１）。
【請求項１】
米に麹、水を加え糖化した甘酒、もしくは米に乳酸菌が利用できる糖類、水を加え、米発酵に適したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に属する乳酸菌、該乳酸菌含有物、その処理物の少なくともひとつを含有してなること、を特徴とする飲食品。
【請求項２】
米に麹、水を加え糖化した甘酒、もしくは米に乳酸菌が利用できる糖類、水を加え、米発酵に適したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に属する乳酸菌、該乳酸菌含有物、その処理物の少なくともひとつを含有してなること、を特徴とする飲食品の製造方法。
【請求項３】
胃酸耐性、胆汁耐性を有し、経口投与組成物とした際に生残性が高いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．に属する乳酸菌、該乳酸菌含有物、その処理物の少なくともひとつを含有してなること、を特徴とする米の飲食品。
【請求項４】
乳酸菌がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１であること、を特徴とする請求項１又は２に記載の飲食品。
【請求項５】
乳酸菌含有物が、乳酸菌懸濁液、乳酸菌培養物、乳酸菌培養液から選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の飲食品。
【請求項６】
処理物が、凝固物、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状物、希釈物、凍結物から選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の飲食品。
【請求項７】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＦＰＬ１（ＮＩＴＥ ＡＰ−６９１）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−１４２２１４（Ｐ２０１０−１４２２１４Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３６１６６（Ｐ２００８−３３６１６６）
【出願日】平成２０年１２月２２日（２００８．１２．２２）
【出願人】（５９２０２９２５６）福井県 (122)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２２日（２００８．１２．２２）
【出願人】（５９２０２９２５６）福井県 (122)
【Ｆターム（参考）】
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