粒子保存溶液および粒子の保存方法
【課題】 本発明の目的は、一定量の粒子を効率良く、かつ精度良く分取することが可能な粒子保存溶液に関する。また、本発明の別の目的は、一定量の粒子を効率良く、かつ精度良く分取することが可能な粒子の保存方法に関する。
【解決手段】 本発明の粒子保存溶液は、生物由来物質を固定化するための粒子と、前記粒子を保存する保存液とを含む粒子保存溶液であって、前記粒子の比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が、０．４以下であることを特徴とする。また、本発明の粒子の保存方法は、上述に記載の粒子保存溶液を用いることを特徴とする。
【解決手段】 本発明の粒子保存溶液は、生物由来物質を固定化するための粒子と、前記粒子を保存する保存液とを含む粒子保存溶液であって、前記粒子の比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が、０．４以下であることを特徴とする。また、本発明の粒子の保存方法は、上述に記載の粒子保存溶液を用いることを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、 粒子保存溶液および粒子の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体ビーズ、レクチンビーズ、アビジンビーズ、ビオチンビーズ、ヒドラジドビーズなど表面を活性化させた微粒子が多数市販されている。しかし、それらの大半は水溶液あるいは有機溶媒の分散液として保存し、使用時に必要量を分取するという使用方法である（例えば、特許文献１参照）。しかし、微粒子のような固体を液体中に均一に分散させるのは困難であり、使用毎に分取量が変化してしまう。そのため、自動で分取することが難しく、処理する検体数が多い場合は特に、分散液を反応容器に移すのに手間がかかるという欠点がある。
【０００３】
この様な背景から、一定量の微粒子があらかじめ反応容器に封入された状態での提供または、一定量の微粒子を簡便に分取する手法の提供が求められる。カラムにあらかじめ一定量の微粒子が封入された状態で販売されている例もあるが、分散液での保存、乾燥状態での保存ともに容器の表面等に付着してしまうことで一部の微粒子を失ってしまう。特に、少量の微粒子を反応に用いるような系の場合、そのことが原因で結果にばらつきが生じやすくなってしまう。また、微粒子分散液から一定量の微粒子を分取する方法として、攪拌子を使用して微粒子分散液を攪拌させ、そこから一定量の分散液を分取する方法もあるが、攪拌速度を最適化するなどの工夫が必要で微粒子の偏りが生じやすいため、一定量の微粒子を得るのは難しい。そこで、一定量の微粒子を容易に分取可能な新しい手法が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５３６８２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、一定量の粒子を効率良く、かつ精度良く分取することが可能な粒子保存溶液に関する。
また、本発明の別の目的は、一定量の粒子を効率良く、かつ精度良く分取することが可能な粒子の保存方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的は、下記（１）〜（１１）に記載の本発明により達成される。
（１） 生物由来物質を固定化するための粒子と、前記粒子を保存する保存液とを含む粒子保存溶液であって、
前記粒子の平均比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が、０．４以下であることを特徴とする粒子保存溶液。
（２）前記保存液の比重（Ｓ２）が、０．５〜５である（１）に記載の粒子保存溶液。
（３）前記粒子の平均粒子径（ｒ）は、０．１〜５００μｍである（１）または（２）に記載の粒子保存溶液。
（４）前記粒子の平均比重をＳ１とし、粒子の比重の標準偏差をσとし、保存液の比重をＳ２としたとき、
Ｓ１−３σ＜Ｓ２＜Ｓ１＋３σ を満足する（１）ないし（３）のいずれかに記載の粒子保存溶液。
（５）前記保存液は、２種類以上の溶液を混合してなる混合溶液である（１）ないし（４）のいずれかに記載の粒子保存溶液。
（６）前記保存液は、無機塩の水溶液である（１）ないし（４）のいずれかに記載の粒子保存溶液。
（７）前記無機塩は、セシウム塩、バリウム塩、ルビジウム塩、ストロンチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩、ベリリウム塩から選ばれる少なくとも一つである（６）に記載の粒子保存溶液。
（８）前記無機塩の含有量は、前記水溶液中の０．１〜５０重量／体積％である（６）または（７）に記載の粒子保存溶液。
（９）前記保存液の沸点が、５０℃以上である（１）ないし（８）のいずれかに記載の粒子保存溶液。
（１０）前記粒子は、樹脂粒子である（１）ないし（９）のいずれかに記載の粒子保存溶液。
（１１）（１）ないし（１０）のいずれかに記載の粒子保存溶液を用いることを特徴とする粒子の保存方法。
（１２）（１）ないし（１０）のいずれかに記載の粒子保存溶液で、該溶液中の粒子の分散を測定する方法であり、該溶液の可視光線の透過率を測定する粒子保存溶液の測定方法。
（１３）（１２）に記載の可視光線の透過率の測定において、透過率の時間変化を測定する保存溶液の測定方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、一定量の粒子を効率良く、かつ精度良く分取することが可能な粒子保存溶液を得ることができる。
また、本発明によれば、一定量の粒子を効率良く、かつ精度良く分取することが可能な粒子の保存方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】微粒子の分散状態を説明するためのグラフである。
【図２】実施例の保存容器内に保存をしたビーズを用いて作製した、２−ＡＢ標識ウ シ由来ＩｇＧ糖鎖を高速液体クロマトグラフィにより測定した結果を示すチャート図 である。
【図３】実施例１で用いたヒドラジドビーズを、上述した粒子保存容器内で保存する ことなく、直ぐに２−ＡＢ標識ウシ由来ＩｇＧ糖鎖を高速液体クロマトグラフィによ り測定した結果を示すチャート図である。
【図４】実施例１で用いたヒドラジドビーズを含む粒子保存液の光透過度を測定した結果を示すチャート図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の粒子保存溶液および粒子の保存方法について詳細に説明する。
本発明の粒子保存溶液は、生物由来物質を固定化するための粒子と、前記粒子を保存する保存液とを含む粒子保存溶液であって、前記粒子の比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が、０．４以下であることを特徴とする。
また、本発明の粒子の保存方法は、上述に記載の粒子保存溶液を用いることを特徴とする。
【００１０】
（粒子保存溶液）
まず、粒子保存溶液について説明する。
本発明の粒子保存溶液は、生物由来物質を固定化するための粒子を保存するために用いるものである。このような粒子は、上述したように水溶液等の分散液として保存されることが多い。そして、使用される際には必要量を分取するという使用方法であるが、このような粒子を分散液中に均一に分散させるのは困難であり、使用毎に分取量が変化してしまうことがあった。本発明は、生物由来物質を固定化するための粒子に要求される課題を解決するためのものである。
【００１１】
ここで、生物由来物質としては、例えばは糖鎖、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質等を挙げることができる。
【００１２】
本発明の粒子保存溶液は、前記粒子の平均比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が０．４以下であることを特徴とする。これにより、粒子保存液中に分散している粒子が沈降したり、浮遊したりしてくるのを抑制することができる。
前記比重差は、特に好ましくは０．２以下であり、より好ましくは０．１以下である。比重差が前記範囲内であると、分散している粒子が沈降または浮遊するまでの時間を長くすることができ、それによって試料を分取するさいのバラツキを低減することができる。
【００１３】
このように、粒子の平均比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差を、０．４以下とすることにより、粒子の分散性を向上することができる。具体的には、比重差を０．１〜０．４とした場合には、分散した粒子が沈降等するまでの時間を０．１〜０．５時間とすることができ、比重差を０．０１〜０．１とした場合には、分散した粒子が沈降等するまでの時間を０．５〜１時間とすることができる。
【００１４】
また、前記粒子保存溶液は、前記粒子の平均比重をＳ１とし、粒子の比重の標準偏差をσとし、保存液の比重をＳ２としたとき、Ｓ１−３σ＜Ｓ２＜Ｓ１＋３σを満足するものであることが好ましい。これにより、粒子の比重にばらつきのあった場合でも粒子の分散性を向上することができる。
粒子の平均比重（Ｓ１）は、例えば比重瓶で測定し、標準偏差(σ)は密度勾配法により算出できる。
【００１５】
このような粒子保存溶液に用いる（微）粒子としては、例えばシリカ粒子、金属粒子等の無機粒子、セファロース粒子、アガロース粒子、セルロース粒子、樹脂粒子等の有機粒子が挙げられる。これらの中でも有機粒子（特に、樹脂粒子）が好ましい。これにより、保存液との比重の調製を容易にすることができる。
具体的には、シリカ（微）粒子、高分子（微）粒子、金（微）粒子、セファロース（微）粒子、アガロース（微）粒子、セルロース（微）粒子等が挙げられる。これらの（微）粒子の中でも、表面に活性基としてアビジン、ビオチン、抗体、レクチン、カルボニル基、アミノ基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、エステル基、マレイミド基およびチオール基のいずれか１種以上の活性基を有するものが好ましい。
【００１６】
このような粒子の平均比重（Ｓ１）としては、特に限定されないが、０．６〜５．０であることが好ましく、より好ましくは０．６７〜４．０であり、さらに好ましくは０．７〜３．０である。粒子の平均比重（Ｓ１）が前記範囲内であると、保存液との比重の調整を容易にすることができる。
このような平均比重は、例えば比重瓶を用いて評価することができる。
【００１７】
また、前記粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、０．１〜５００μｍであることが好ましく、特に１０〜１５０μｍであることが好ましい。平均粒子径が前記範囲内であると、（微）粒子の分散性に優れ、取り扱いが容易となる。
前記平均粒子径は、例えば粒度分布測定装置を用いて測定することができる。
【００１８】
前記粒子保存溶液に用いる保存液としては、例えば水溶液、有機溶媒等が挙げられる。具体的には、水と無機塩の水溶液、水と有機溶媒の混合液、有機溶媒同士の混合液等が挙げられる。これらの中でも水と無機塩との水溶液が好ましい。これにより、溶液の蒸発による比重の変化を低減することができる。また、有機溶媒を用いることと比較すると環境への影響、人体への影響を低減することもできる。
【００１９】
前記無機塩の水溶液としては、例えばセシウム塩、バリウム塩、ルビジウム塩、ストロンチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩、ベリリウム塩から選ばれる少なくとも一つを溶解させたものが好ましい。これにより、溶液の粘度を上昇させること無く使用することができる。
【００２０】
前記無機塩の含有量は、目的とする比重に応じて決定され、特に限定されないが、水溶液中の質量パーセント濃度０．１〜９０％が好ましく、特に質量パーセント濃度１０〜６０％が好ましい。含有量が前記範囲内であると、特に溶液の粘度を上昇させること無く使用することができ、扱いが容易ある。
【００２１】
また、前記保存液は、２種以上の溶液を混合してなる混合溶液であっても良い。これにより、比重の調整する際の溶液選択の自由度を向上することができる。
２種以上の溶液の組み合わせとしては、例えば水とメタノール、水とエタノール、メタノールとクロロホルムが挙げられる。
【００２２】
このような保存液を構成する溶液は、目的とする比重により適宜決定される。例えば、比重が１より大きい粒子を分散させるための保存液としては、水と無機塩の水溶液が好ましい。
一方、比重が１より小さい粒子を分散させるための保存液としては、水と有機溶媒の混合液、有機溶媒同士の混合液が好ましい。
【００２３】
また、保存液を構成する溶液は、有機溶媒でも水溶液でも良いが、溶液の蒸発により比重が変化してしまう可能性を回避するために、沸点の高い有機溶媒あるいは水溶液であることが好ましい。具体的には、保存液の沸点が５０℃以上であるものが好ましく、特に６０℃以上であるものが好ましい。保存液の沸点が前記範囲内であれば、粒子を保存する過程での保存液の蒸発等により保存液の比重が変化するのを防止することができ、それによって粒子の分散状態を良好に維持できる。
【００２４】
具体的に保存液の比重（Ｓ２）は、特に限定されないが、０．５〜５．０が好ましく、特に０．７〜３．０が好ましい。これにより、保存液の作製を容易にすることができる。
【００２５】
上述したような前記粒子、前記保存液を用いて、前記粒子の平均比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が０．４以下であると、粒子が短時間で底に沈んでしまうこと防ぎ、長時間分散した状態を保つことにより、一定量の粒子を容器内に効率よく分取することが可能となる。
【００２６】
（粒子の保存方法）
本発明の粒子の保存方法は、上述したような粒子保存液を用いることを特徴とする。これにより、粒子保存液中で粒子の沈降、浮遊するのを抑制することができる。すなわち、一度攪拌等により粒子を保存液中で分散させると、その分散状態を長く維持することができ、それによって粒子の正確な分取を可能とすることができるものである。
例えば、高分子（微）粒子を無機塩の水溶液に分散させて保存する保存方法等がある。
【００２７】
このような粒子保存溶液を用いることにより、粒子が分散している状態を長く維持できるようになるので、不均一だった粒子の分散液の均一化を容易にできる。それによって、一定量の粒子を反応容器に分取することが容易になる。この際、従来から問題となっていた粒子の減少を最小限に抑えることが可能である。また、同時に複数個分の分取も可能である上、自動化にも向いているため作業の大幅な効率化も図ることもできる。
【００２８】
（粒子分散状態の測定方法）
本発明の粒子の保存方法において、溶媒中の粒子が分散している状態を観察するには、簡便には、目視で観察し、沈殿物、すなわち、沈降した粒子の存在の有無により確認できる。
より詳細に、粒子の分散状態を確認する方法としては、粒子保存溶液に可視光線を照射し、その光透過率で粒子の分散状態を数値化することが可能である。これは、粒子が溶媒中に分散している状態においては、分散状態の粒子が障害物となり、照射した可視光線が透過せず、その分散粒子の濃度により光透過率が変わることを利用したもので、可視光線の分散状態に応じた可視光線の光透過率を示すことができる。
【００２９】
さらに、この光透過率の経時変化を追跡することで、分散状態の変化を測定することが出来る。すなわち、光透過率が変化していくことは、粒子の分散状態が変わっていることを示し、例えば、分散している粒子が沈降すれば、保存容器上側の溶液において可視光線通過の障害物がなくなるので、光透過率が上昇していく結果となる。逆に容器下側の底面部に近い箇所では、粒子の沈降により、可視光線の障害物が増し、光透過度が下がる結果となる。
【００３０】
具体的には、紫外可視分光光度計を用いて、セル中に粒子保存溶液の一部を移し、対照溶液として粒子を含まない保存溶液を用いて光透過率を測定することで分散状態を求めることが出来る。
【００３１】
更に、一定量の粒子を反応容器に分取する場合に、粒子の分散状態が変化していないかを測定することも出来る。例えば、反応容器に分取後、各容器中の粒子分散液の光透過率を測定することで粒子の分取のバラツキを確認することができる。
また、分取の自動化の場合は、送液ライン中に透過光率測定のための窓を設け、それを使用して光透過率測定をすれば、分取時の粒子の分散状態を追跡することが可能で、より精度の高い分取が可能となる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３３】
（実施例１）
１．保存液の調製
塩化セシウム（比重３．９９、和光純薬、０３５−０１９５２）２．４３ｇを、水７．５７ｍＬに溶解させて、質量パーセント濃度２４．３％の塩化セシウム水溶液（比重１．２２３）を得た。
【００３４】
２．粒子保存溶液の調製
微粒子としてヒドラジドビーズ（ポリマー粒子、球状、５０ｍｇ、ヒドラジド基保有、住友ベークライト社製、ＢＳ−４５６０３、平均比重１．２９１）を、１．５ｍＬチューブに量り取り、そして上述の保存液を５００μＬ分注し、ボルテックスミキサーで攪拌して、粒子保存溶液を得た。この微粒子と、保存液との比重差は、０．０６８であった。
【００３５】
（実施例２）
保存液として、以下のものを用いた以外は、実施例１と同様にした。
塩化セシウム（比重３．９９、和光純薬、０３５−０１９５２）３．６３ｇを、水６．３７ｍＬに溶解させて、質量パーセント濃度３６．３％の塩化セシウム水溶液（比重１．３７４）を得た。この微粒子と、保存液との比重差は、０．０８３であった。
【００３６】
（実施例３）
保存液として、以下のものを用いた以外は、実施例１と同様にした。
塩化セシウム（比重３．９９、和光純薬、０３５−０１９５２）２．１ｇを、水７．９ｍＬに溶解させて、質量パーセント濃度２１％の塩化セシウム水溶液（比重１．１８７）を得た。この微粒子と、保存液との比重差は、０．１０４であった。
【００３７】
（比較例１）
保存液としてメタノール（比重０．７９１）のものを用いた以外は、実施例１と同様にした。この微粒子と保存液との比重差は０．５であった。
【００３８】
（比較例２）
保存液として、以下のものを用いた以外は、実施例１と同様にした。
塩化セシウム（比重３．９９、和光純薬、０３５−０１９５２）５．７１ｇを、水４．２９ｍＬに溶解させて、質量パーセント濃度５７．１％の塩化セシウム水溶液（比重１．７４８）を得た。この微粒子と、保存液との比重差は、０．４５７であった。
【００３９】
各実施例および比較例で得られた粒子保存溶液について、以下の評価を行った。評価項目を内容と共に示す。得られた結果を、表１に示す。
【００４０】
１．微粒子の分散状態（１）
ボルテックスミキサーで攪拌後における粒子保存溶液の微粒子の分散状態を、目視で評価した。各符号は、以下の通りである。
◎：０．５時間経過後も微粒子の沈殿、浮遊が無かった。
○：０．２時間以上、０．５時間未満で微粒子の沈殿、浮遊が無かった。
△：０．１時間以上、０．２時間未満で微粒子の沈殿、浮遊が無かった。
×：０．１時間未満に、微粒子の沈殿、浮遊が有った。
【００４１】
２．微粒子の分散状態（２）
実施例１で得られた粒子保存溶液および比較例１で得られた粒子保存溶液を、それぞれボルテックスミキサーにて攪拌した。この攪拌直後から、１分後、３分後、５分後、１０分後、１５分後、２０分後、３０分後、６０分後にそれぞれ１００μＬの粒子保存液を、重量があらかじめ測定してある１．５ｍＬチューブに分注した。その後、凍結乾燥により１．５ｍＬチューブ内の水を完全に除去し１．５ｍＬチューブの重量を再測定した。１．５ｍＬチューブ本体の重量との差から１．５ｍＬチューブ内に分注された粒子および塩化セシウム量を算出し、それぞれ比較した。得られた結果を、図１に示す。
【００４２】
図１に示すように、比較例１で得られた粒子保存溶液を用いた場合では数分後には収量が大きく変動しているのに対して、実施例１で得られた粒子保存溶液を用いた場合では、６０分経過後も大きな変動が見られなかった。これより、本発明の粒子保存溶液を用いて粒子を保存することにより粒子の分散性が、より向上することが分かった。
【００４３】
２．微粒子の分散状態（３）
実施例１で得られた粒子保存溶液および超純水に粒子を分散させたものの光透過率の継時変化を測定した。
具体的には、実施例１で得られた粒子保存液を保存液で１０倍希釈したものを準備、また比較例１同様に粒子をメタノールで濃度が同じになるように希釈した溶液を準備した。各々の溶液を装置専用の測定用ガラスセルに移した。
測定は、多目的紫外可視分光光度計ＤＵ７３０(BECKMAN COULTER, Life Scienve UV/Vis Spectorometer)で測定した。測定時間は、粒子保存液は、０，５，１０，１５，３０，４０，５０，６０分、メタノール分散は、０, ０．２５, ０．５，１，１．５，２，２．５，３，３．５，４，４．５，５分に測定した。対照は、それぞれの粒子を含まない溶液を用いた。得られた結果を図４に示す。
【００４４】
図４に示すように、実施例１では、６０分後においても光透過率は、ほとんど変化が見られない。一方、比較例１では、測定開始時から急激に光透過度が上昇し、５分で光透過度が９０％を越える結果となった。実際に測定用ガラスセルを目視で確認すると、実施例１の溶液は、変化が見られないのに対し、比較例１ではセルの底面に明らかに粒子が沈降していることが確認された。本方法により、粒子保存液の粒子分散状態を確認することが可能であることが示された。
【００４５】
３．粒子の性能確認
（Ａ）微粒子の回収
次に、粒子保存溶液中の微粒子の反応に使用する新たな反応容器（フィルターカラム、住友ベークライト社製、ＢＳ−４５６０３）を準備した。粒子保存溶液５０μＬを反応容器に添加した。卓上遠心機を用いて保存液を遠心除去した。さらに、微粒子の入った反応容器の内部に純水２００μＬを加え、卓上遠心機を用いて純粋を遠心除去した。これをさらに２回繰り返し粒子に付着した塩化セシウム塩を除去した。
【００４６】
（Ｂ）試料の作製
ウシ免疫グロブリンＧ（ウシＩｇＧ）１ｍｇを１００ｍＭ（ミリモーラー）の重炭酸アンモニウム５０μＬに溶解させた後、１２０ｍＭ（ミリモーラー）のＤＴＴ（ジチオスレイトール）を５μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、１２３ｍＭ（ミリモーラー）のＩＡＡ（ヨードアセトアミド）１０μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４００Ｕのトリプシンによってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。反応溶液を９０℃で５分処理した後、５ＵのグリコシダーゼＦによる処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、予備処理済の生体試料を得た。
【００４７】
（Ｃ）微粒子と生体試料の反応
微粒子が入ったフィルターカラムに、予備処理済の生体試料の懸濁物２０μＬおよび１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させ微粒子上のヒドラジド基に糖を固定させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し微粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。続いて、グアニジン溶液、水、メタノール、トリエチルアミン溶液にて微粒子を洗浄後、１０％無水酢酸／メタノールを添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、塩酸水溶液、水にて微粒子を洗浄した。微粒子の入ったフィルターカラムに、超純水２０μＬおよび２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、７０℃で１時間反応させ微粒子上の糖鎖を切り出した。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し微粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。
【００４８】
（Ｄ）標識化工程
微粒子および切り出した糖鎖の入ったフィルターカラムに、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．３５Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解させて調整した溶液５０μＬを添加し、６０℃で２時間反応させて、切り出した糖鎖を２−ＡＢで標識化した。
【００４９】
（Ｅ）余剰試薬除去工程
上述の溶液５０μＬを回収し、アセトニトリルで１０倍に希釈した後、標識化した糖鎖を付属のクリーンアップカラムに吸着させた。アセトニトリル、アセトニトリル／水混合溶液（９５：５）にてカラムを洗浄後、超純水５０μＬにて標識化した糖鎖を回収した。
【００５０】
（Ｆ）標識化した糖鎖の検出
得られた標識化した糖鎖をＨＰＬＣにて測定した。アミドカラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０ ４．６＊２５０）を用いて励起波長３３０ ｎｍ、蛍光波長４２０ ｎｍにて測定した。溶媒Ａは５０ｍＭギ酸、２５％アンモニア水にてｐＨ４．４に調整したものを使用し、溶媒Ｂとしてアセトニトリルを使用し、溶媒Ａ液２０％（０ｍｉｎ）→Ａ液５８％（１５８ｍｉｎ）で送液した。カラム温度は３０℃で流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。図２に示すように、ウシＩｇＧ糖鎖由来ピークが観察された。
これより、本発明の粒子保存容器を用いることにより、微粒子が損失せずに容器内に保存可能であることが示された。
【００５１】
（参考例）
実施例１で用いたヒドラジドビーズを、上述した粒子保存容器内で保存することなく、直ぐに標識化糖鎖の検出を行った。得られた結果を、図３に示す。実線は、ウシＩｇＧ糖鎖由来ピークであった。
【００５２】
参考例の結果で得られたウシＩｇＧ糖鎖由来ピークと、実施例１で得られたウシＩｇＧ糖鎖由来ピークに大きな相違は無かった。
これより、本発明の粒子保存溶液を用いて粒子を保存しても粒子表面の活性基は失活しないことが分かった。
【００５３】
これらの結果により、本発明の微粒子保存溶液を用いることにより、不均一だった微粒子分散液を均一化させることができ、一定量の微粒子を反応容器に容易に分取することが可能となる。この際、従来問題となっていた微粒子の減少を最小限に抑えることが可能である。また、同時に複数個分の分取も可能である上、自動化にも向いているため作業の大幅な効率化も図れる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の粒子保存溶液および粒子の保存方法は、抗体ビーズ、レクチンビーズ、アビジンビーズ、ビオチンビーズ、ヒドラジドビーズ等の（微）粒子を一定量任意の容器に分取するのに使用できる。また、本発明の粒子保存溶液は(微)粒子の分散性に優れているため、こまめに（微）粒子を攪拌する必要も無い。単純な操作で一定量の(微)粒子を分取可能なため、ロボットによる自動処理にも容易に対応が可能である。さらに、一連の操作により粒子の有する活性基等を破壊することもない。使用毎の(微)粒子量のばらつきや、活性基等の失活を心配することなく粒子を分取するのに適している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、 粒子保存溶液および粒子の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体ビーズ、レクチンビーズ、アビジンビーズ、ビオチンビーズ、ヒドラジドビーズなど表面を活性化させた微粒子が多数市販されている。しかし、それらの大半は水溶液あるいは有機溶媒の分散液として保存し、使用時に必要量を分取するという使用方法である（例えば、特許文献１参照）。しかし、微粒子のような固体を液体中に均一に分散させるのは困難であり、使用毎に分取量が変化してしまう。そのため、自動で分取することが難しく、処理する検体数が多い場合は特に、分散液を反応容器に移すのに手間がかかるという欠点がある。
【０００３】
この様な背景から、一定量の微粒子があらかじめ反応容器に封入された状態での提供または、一定量の微粒子を簡便に分取する手法の提供が求められる。カラムにあらかじめ一定量の微粒子が封入された状態で販売されている例もあるが、分散液での保存、乾燥状態での保存ともに容器の表面等に付着してしまうことで一部の微粒子を失ってしまう。特に、少量の微粒子を反応に用いるような系の場合、そのことが原因で結果にばらつきが生じやすくなってしまう。また、微粒子分散液から一定量の微粒子を分取する方法として、攪拌子を使用して微粒子分散液を攪拌させ、そこから一定量の分散液を分取する方法もあるが、攪拌速度を最適化するなどの工夫が必要で微粒子の偏りが生じやすいため、一定量の微粒子を得るのは難しい。そこで、一定量の微粒子を容易に分取可能な新しい手法が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５３６８２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、一定量の粒子を効率良く、かつ精度良く分取することが可能な粒子保存溶液に関する。
また、本発明の別の目的は、一定量の粒子を効率良く、かつ精度良く分取することが可能な粒子の保存方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような目的は、下記（１）〜（１１）に記載の本発明により達成される。
（１） 生物由来物質を固定化するための粒子と、前記粒子を保存する保存液とを含む粒子保存溶液であって、
前記粒子の平均比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が、０．４以下であることを特徴とする粒子保存溶液。
（２）前記保存液の比重（Ｓ２）が、０．５〜５である（１）に記載の粒子保存溶液。
（３）前記粒子の平均粒子径（ｒ）は、０．１〜５００μｍである（１）または（２）に記載の粒子保存溶液。
（４）前記粒子の平均比重をＳ１とし、粒子の比重の標準偏差をσとし、保存液の比重をＳ２としたとき、
Ｓ１−３σ＜Ｓ２＜Ｓ１＋３σ を満足する（１）ないし（３）のいずれかに記載の粒子保存溶液。
（５）前記保存液は、２種類以上の溶液を混合してなる混合溶液である（１）ないし（４）のいずれかに記載の粒子保存溶液。
（６）前記保存液は、無機塩の水溶液である（１）ないし（４）のいずれかに記載の粒子保存溶液。
（７）前記無機塩は、セシウム塩、バリウム塩、ルビジウム塩、ストロンチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩、ベリリウム塩から選ばれる少なくとも一つである（６）に記載の粒子保存溶液。
（８）前記無機塩の含有量は、前記水溶液中の０．１〜５０重量／体積％である（６）または（７）に記載の粒子保存溶液。
（９）前記保存液の沸点が、５０℃以上である（１）ないし（８）のいずれかに記載の粒子保存溶液。
（１０）前記粒子は、樹脂粒子である（１）ないし（９）のいずれかに記載の粒子保存溶液。
（１１）（１）ないし（１０）のいずれかに記載の粒子保存溶液を用いることを特徴とする粒子の保存方法。
（１２）（１）ないし（１０）のいずれかに記載の粒子保存溶液で、該溶液中の粒子の分散を測定する方法であり、該溶液の可視光線の透過率を測定する粒子保存溶液の測定方法。
（１３）（１２）に記載の可視光線の透過率の測定において、透過率の時間変化を測定する保存溶液の測定方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、一定量の粒子を効率良く、かつ精度良く分取することが可能な粒子保存溶液を得ることができる。
また、本発明によれば、一定量の粒子を効率良く、かつ精度良く分取することが可能な粒子の保存方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】微粒子の分散状態を説明するためのグラフである。
【図２】実施例の保存容器内に保存をしたビーズを用いて作製した、２−ＡＢ標識ウ シ由来ＩｇＧ糖鎖を高速液体クロマトグラフィにより測定した結果を示すチャート図 である。
【図３】実施例１で用いたヒドラジドビーズを、上述した粒子保存容器内で保存する ことなく、直ぐに２−ＡＢ標識ウシ由来ＩｇＧ糖鎖を高速液体クロマトグラフィによ り測定した結果を示すチャート図である。
【図４】実施例１で用いたヒドラジドビーズを含む粒子保存液の光透過度を測定した結果を示すチャート図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の粒子保存溶液および粒子の保存方法について詳細に説明する。
本発明の粒子保存溶液は、生物由来物質を固定化するための粒子と、前記粒子を保存する保存液とを含む粒子保存溶液であって、前記粒子の比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が、０．４以下であることを特徴とする。
また、本発明の粒子の保存方法は、上述に記載の粒子保存溶液を用いることを特徴とする。
【００１０】
（粒子保存溶液）
まず、粒子保存溶液について説明する。
本発明の粒子保存溶液は、生物由来物質を固定化するための粒子を保存するために用いるものである。このような粒子は、上述したように水溶液等の分散液として保存されることが多い。そして、使用される際には必要量を分取するという使用方法であるが、このような粒子を分散液中に均一に分散させるのは困難であり、使用毎に分取量が変化してしまうことがあった。本発明は、生物由来物質を固定化するための粒子に要求される課題を解決するためのものである。
【００１１】
ここで、生物由来物質としては、例えばは糖鎖、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質等を挙げることができる。
【００１２】
本発明の粒子保存溶液は、前記粒子の平均比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が０．４以下であることを特徴とする。これにより、粒子保存液中に分散している粒子が沈降したり、浮遊したりしてくるのを抑制することができる。
前記比重差は、特に好ましくは０．２以下であり、より好ましくは０．１以下である。比重差が前記範囲内であると、分散している粒子が沈降または浮遊するまでの時間を長くすることができ、それによって試料を分取するさいのバラツキを低減することができる。
【００１３】
このように、粒子の平均比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差を、０．４以下とすることにより、粒子の分散性を向上することができる。具体的には、比重差を０．１〜０．４とした場合には、分散した粒子が沈降等するまでの時間を０．１〜０．５時間とすることができ、比重差を０．０１〜０．１とした場合には、分散した粒子が沈降等するまでの時間を０．５〜１時間とすることができる。
【００１４】
また、前記粒子保存溶液は、前記粒子の平均比重をＳ１とし、粒子の比重の標準偏差をσとし、保存液の比重をＳ２としたとき、Ｓ１−３σ＜Ｓ２＜Ｓ１＋３σを満足するものであることが好ましい。これにより、粒子の比重にばらつきのあった場合でも粒子の分散性を向上することができる。
粒子の平均比重（Ｓ１）は、例えば比重瓶で測定し、標準偏差(σ)は密度勾配法により算出できる。
【００１５】
このような粒子保存溶液に用いる（微）粒子としては、例えばシリカ粒子、金属粒子等の無機粒子、セファロース粒子、アガロース粒子、セルロース粒子、樹脂粒子等の有機粒子が挙げられる。これらの中でも有機粒子（特に、樹脂粒子）が好ましい。これにより、保存液との比重の調製を容易にすることができる。
具体的には、シリカ（微）粒子、高分子（微）粒子、金（微）粒子、セファロース（微）粒子、アガロース（微）粒子、セルロース（微）粒子等が挙げられる。これらの（微）粒子の中でも、表面に活性基としてアビジン、ビオチン、抗体、レクチン、カルボニル基、アミノ基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、エステル基、マレイミド基およびチオール基のいずれか１種以上の活性基を有するものが好ましい。
【００１６】
このような粒子の平均比重（Ｓ１）としては、特に限定されないが、０．６〜５．０であることが好ましく、より好ましくは０．６７〜４．０であり、さらに好ましくは０．７〜３．０である。粒子の平均比重（Ｓ１）が前記範囲内であると、保存液との比重の調整を容易にすることができる。
このような平均比重は、例えば比重瓶を用いて評価することができる。
【００１７】
また、前記粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、０．１〜５００μｍであることが好ましく、特に１０〜１５０μｍであることが好ましい。平均粒子径が前記範囲内であると、（微）粒子の分散性に優れ、取り扱いが容易となる。
前記平均粒子径は、例えば粒度分布測定装置を用いて測定することができる。
【００１８】
前記粒子保存溶液に用いる保存液としては、例えば水溶液、有機溶媒等が挙げられる。具体的には、水と無機塩の水溶液、水と有機溶媒の混合液、有機溶媒同士の混合液等が挙げられる。これらの中でも水と無機塩との水溶液が好ましい。これにより、溶液の蒸発による比重の変化を低減することができる。また、有機溶媒を用いることと比較すると環境への影響、人体への影響を低減することもできる。
【００１９】
前記無機塩の水溶液としては、例えばセシウム塩、バリウム塩、ルビジウム塩、ストロンチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩、ベリリウム塩から選ばれる少なくとも一つを溶解させたものが好ましい。これにより、溶液の粘度を上昇させること無く使用することができる。
【００２０】
前記無機塩の含有量は、目的とする比重に応じて決定され、特に限定されないが、水溶液中の質量パーセント濃度０．１〜９０％が好ましく、特に質量パーセント濃度１０〜６０％が好ましい。含有量が前記範囲内であると、特に溶液の粘度を上昇させること無く使用することができ、扱いが容易ある。
【００２１】
また、前記保存液は、２種以上の溶液を混合してなる混合溶液であっても良い。これにより、比重の調整する際の溶液選択の自由度を向上することができる。
２種以上の溶液の組み合わせとしては、例えば水とメタノール、水とエタノール、メタノールとクロロホルムが挙げられる。
【００２２】
このような保存液を構成する溶液は、目的とする比重により適宜決定される。例えば、比重が１より大きい粒子を分散させるための保存液としては、水と無機塩の水溶液が好ましい。
一方、比重が１より小さい粒子を分散させるための保存液としては、水と有機溶媒の混合液、有機溶媒同士の混合液が好ましい。
【００２３】
また、保存液を構成する溶液は、有機溶媒でも水溶液でも良いが、溶液の蒸発により比重が変化してしまう可能性を回避するために、沸点の高い有機溶媒あるいは水溶液であることが好ましい。具体的には、保存液の沸点が５０℃以上であるものが好ましく、特に６０℃以上であるものが好ましい。保存液の沸点が前記範囲内であれば、粒子を保存する過程での保存液の蒸発等により保存液の比重が変化するのを防止することができ、それによって粒子の分散状態を良好に維持できる。
【００２４】
具体的に保存液の比重（Ｓ２）は、特に限定されないが、０．５〜５．０が好ましく、特に０．７〜３．０が好ましい。これにより、保存液の作製を容易にすることができる。
【００２５】
上述したような前記粒子、前記保存液を用いて、前記粒子の平均比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が０．４以下であると、粒子が短時間で底に沈んでしまうこと防ぎ、長時間分散した状態を保つことにより、一定量の粒子を容器内に効率よく分取することが可能となる。
【００２６】
（粒子の保存方法）
本発明の粒子の保存方法は、上述したような粒子保存液を用いることを特徴とする。これにより、粒子保存液中で粒子の沈降、浮遊するのを抑制することができる。すなわち、一度攪拌等により粒子を保存液中で分散させると、その分散状態を長く維持することができ、それによって粒子の正確な分取を可能とすることができるものである。
例えば、高分子（微）粒子を無機塩の水溶液に分散させて保存する保存方法等がある。
【００２７】
このような粒子保存溶液を用いることにより、粒子が分散している状態を長く維持できるようになるので、不均一だった粒子の分散液の均一化を容易にできる。それによって、一定量の粒子を反応容器に分取することが容易になる。この際、従来から問題となっていた粒子の減少を最小限に抑えることが可能である。また、同時に複数個分の分取も可能である上、自動化にも向いているため作業の大幅な効率化も図ることもできる。
【００２８】
（粒子分散状態の測定方法）
本発明の粒子の保存方法において、溶媒中の粒子が分散している状態を観察するには、簡便には、目視で観察し、沈殿物、すなわち、沈降した粒子の存在の有無により確認できる。
より詳細に、粒子の分散状態を確認する方法としては、粒子保存溶液に可視光線を照射し、その光透過率で粒子の分散状態を数値化することが可能である。これは、粒子が溶媒中に分散している状態においては、分散状態の粒子が障害物となり、照射した可視光線が透過せず、その分散粒子の濃度により光透過率が変わることを利用したもので、可視光線の分散状態に応じた可視光線の光透過率を示すことができる。
【００２９】
さらに、この光透過率の経時変化を追跡することで、分散状態の変化を測定することが出来る。すなわち、光透過率が変化していくことは、粒子の分散状態が変わっていることを示し、例えば、分散している粒子が沈降すれば、保存容器上側の溶液において可視光線通過の障害物がなくなるので、光透過率が上昇していく結果となる。逆に容器下側の底面部に近い箇所では、粒子の沈降により、可視光線の障害物が増し、光透過度が下がる結果となる。
【００３０】
具体的には、紫外可視分光光度計を用いて、セル中に粒子保存溶液の一部を移し、対照溶液として粒子を含まない保存溶液を用いて光透過率を測定することで分散状態を求めることが出来る。
【００３１】
更に、一定量の粒子を反応容器に分取する場合に、粒子の分散状態が変化していないかを測定することも出来る。例えば、反応容器に分取後、各容器中の粒子分散液の光透過率を測定することで粒子の分取のバラツキを確認することができる。
また、分取の自動化の場合は、送液ライン中に透過光率測定のための窓を設け、それを使用して光透過率測定をすれば、分取時の粒子の分散状態を追跡することが可能で、より精度の高い分取が可能となる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３３】
（実施例１）
１．保存液の調製
塩化セシウム（比重３．９９、和光純薬、０３５−０１９５２）２．４３ｇを、水７．５７ｍＬに溶解させて、質量パーセント濃度２４．３％の塩化セシウム水溶液（比重１．２２３）を得た。
【００３４】
２．粒子保存溶液の調製
微粒子としてヒドラジドビーズ（ポリマー粒子、球状、５０ｍｇ、ヒドラジド基保有、住友ベークライト社製、ＢＳ−４５６０３、平均比重１．２９１）を、１．５ｍＬチューブに量り取り、そして上述の保存液を５００μＬ分注し、ボルテックスミキサーで攪拌して、粒子保存溶液を得た。この微粒子と、保存液との比重差は、０．０６８であった。
【００３５】
（実施例２）
保存液として、以下のものを用いた以外は、実施例１と同様にした。
塩化セシウム（比重３．９９、和光純薬、０３５−０１９５２）３．６３ｇを、水６．３７ｍＬに溶解させて、質量パーセント濃度３６．３％の塩化セシウム水溶液（比重１．３７４）を得た。この微粒子と、保存液との比重差は、０．０８３であった。
【００３６】
（実施例３）
保存液として、以下のものを用いた以外は、実施例１と同様にした。
塩化セシウム（比重３．９９、和光純薬、０３５−０１９５２）２．１ｇを、水７．９ｍＬに溶解させて、質量パーセント濃度２１％の塩化セシウム水溶液（比重１．１８７）を得た。この微粒子と、保存液との比重差は、０．１０４であった。
【００３７】
（比較例１）
保存液としてメタノール（比重０．７９１）のものを用いた以外は、実施例１と同様にした。この微粒子と保存液との比重差は０．５であった。
【００３８】
（比較例２）
保存液として、以下のものを用いた以外は、実施例１と同様にした。
塩化セシウム（比重３．９９、和光純薬、０３５−０１９５２）５．７１ｇを、水４．２９ｍＬに溶解させて、質量パーセント濃度５７．１％の塩化セシウム水溶液（比重１．７４８）を得た。この微粒子と、保存液との比重差は、０．４５７であった。
【００３９】
各実施例および比較例で得られた粒子保存溶液について、以下の評価を行った。評価項目を内容と共に示す。得られた結果を、表１に示す。
【００４０】
１．微粒子の分散状態（１）
ボルテックスミキサーで攪拌後における粒子保存溶液の微粒子の分散状態を、目視で評価した。各符号は、以下の通りである。
◎：０．５時間経過後も微粒子の沈殿、浮遊が無かった。
○：０．２時間以上、０．５時間未満で微粒子の沈殿、浮遊が無かった。
△：０．１時間以上、０．２時間未満で微粒子の沈殿、浮遊が無かった。
×：０．１時間未満に、微粒子の沈殿、浮遊が有った。
【００４１】
２．微粒子の分散状態（２）
実施例１で得られた粒子保存溶液および比較例１で得られた粒子保存溶液を、それぞれボルテックスミキサーにて攪拌した。この攪拌直後から、１分後、３分後、５分後、１０分後、１５分後、２０分後、３０分後、６０分後にそれぞれ１００μＬの粒子保存液を、重量があらかじめ測定してある１．５ｍＬチューブに分注した。その後、凍結乾燥により１．５ｍＬチューブ内の水を完全に除去し１．５ｍＬチューブの重量を再測定した。１．５ｍＬチューブ本体の重量との差から１．５ｍＬチューブ内に分注された粒子および塩化セシウム量を算出し、それぞれ比較した。得られた結果を、図１に示す。
【００４２】
図１に示すように、比較例１で得られた粒子保存溶液を用いた場合では数分後には収量が大きく変動しているのに対して、実施例１で得られた粒子保存溶液を用いた場合では、６０分経過後も大きな変動が見られなかった。これより、本発明の粒子保存溶液を用いて粒子を保存することにより粒子の分散性が、より向上することが分かった。
【００４３】
２．微粒子の分散状態（３）
実施例１で得られた粒子保存溶液および超純水に粒子を分散させたものの光透過率の継時変化を測定した。
具体的には、実施例１で得られた粒子保存液を保存液で１０倍希釈したものを準備、また比較例１同様に粒子をメタノールで濃度が同じになるように希釈した溶液を準備した。各々の溶液を装置専用の測定用ガラスセルに移した。
測定は、多目的紫外可視分光光度計ＤＵ７３０(BECKMAN COULTER, Life Scienve UV/Vis Spectorometer)で測定した。測定時間は、粒子保存液は、０，５，１０，１５，３０，４０，５０，６０分、メタノール分散は、０, ０．２５, ０．５，１，１．５，２，２．５，３，３．５，４，４．５，５分に測定した。対照は、それぞれの粒子を含まない溶液を用いた。得られた結果を図４に示す。
【００４４】
図４に示すように、実施例１では、６０分後においても光透過率は、ほとんど変化が見られない。一方、比較例１では、測定開始時から急激に光透過度が上昇し、５分で光透過度が９０％を越える結果となった。実際に測定用ガラスセルを目視で確認すると、実施例１の溶液は、変化が見られないのに対し、比較例１ではセルの底面に明らかに粒子が沈降していることが確認された。本方法により、粒子保存液の粒子分散状態を確認することが可能であることが示された。
【００４５】
３．粒子の性能確認
（Ａ）微粒子の回収
次に、粒子保存溶液中の微粒子の反応に使用する新たな反応容器（フィルターカラム、住友ベークライト社製、ＢＳ−４５６０３）を準備した。粒子保存溶液５０μＬを反応容器に添加した。卓上遠心機を用いて保存液を遠心除去した。さらに、微粒子の入った反応容器の内部に純水２００μＬを加え、卓上遠心機を用いて純粋を遠心除去した。これをさらに２回繰り返し粒子に付着した塩化セシウム塩を除去した。
【００４６】
（Ｂ）試料の作製
ウシ免疫グロブリンＧ（ウシＩｇＧ）１ｍｇを１００ｍＭ（ミリモーラー）の重炭酸アンモニウム５０μＬに溶解させた後、１２０ｍＭ（ミリモーラー）のＤＴＴ（ジチオスレイトール）を５μＬ加え、６０℃で３０分間反応させた。反応終了後、１２３ｍＭ（ミリモーラー）のＩＡＡ（ヨードアセトアミド）１０μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて４００Ｕのトリプシンによってプロテアーゼ処理をし、タンパク質部分をペプチド断片化した。反応溶液を９０℃で５分処理した後、５ＵのグリコシダーゼＦによる処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、予備処理済の生体試料を得た。
【００４７】
（Ｃ）微粒子と生体試料の反応
微粒子が入ったフィルターカラムに、予備処理済の生体試料の懸濁物２０μＬおよび１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させ微粒子上のヒドラジド基に糖を固定させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し微粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。続いて、グアニジン溶液、水、メタノール、トリエチルアミン溶液にて微粒子を洗浄後、１０％無水酢酸／メタノールを添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、メタノール、塩酸水溶液、水にて微粒子を洗浄した。微粒子の入ったフィルターカラムに、超純水２０μＬおよび２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、７０℃で１時間反応させ微粒子上の糖鎖を切り出した。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し微粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。
【００４８】
（Ｄ）標識化工程
微粒子および切り出した糖鎖の入ったフィルターカラムに、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムの終濃度がそれぞれ０．３５Ｍ、１Ｍになるように３０％酢酸／ＤＭＳＯ混合溶媒に溶解させて調整した溶液５０μＬを添加し、６０℃で２時間反応させて、切り出した糖鎖を２−ＡＢで標識化した。
【００４９】
（Ｅ）余剰試薬除去工程
上述の溶液５０μＬを回収し、アセトニトリルで１０倍に希釈した後、標識化した糖鎖を付属のクリーンアップカラムに吸着させた。アセトニトリル、アセトニトリル／水混合溶液（９５：５）にてカラムを洗浄後、超純水５０μＬにて標識化した糖鎖を回収した。
【００５０】
（Ｆ）標識化した糖鎖の検出
得られた標識化した糖鎖をＨＰＬＣにて測定した。アミドカラム（ＴＳＫ−ＧＥＬ Ａｍｉｄｅ−８０ ４．６＊２５０）を用いて励起波長３３０ ｎｍ、蛍光波長４２０ ｎｍにて測定した。溶媒Ａは５０ｍＭギ酸、２５％アンモニア水にてｐＨ４．４に調整したものを使用し、溶媒Ｂとしてアセトニトリルを使用し、溶媒Ａ液２０％（０ｍｉｎ）→Ａ液５８％（１５８ｍｉｎ）で送液した。カラム温度は３０℃で流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。図２に示すように、ウシＩｇＧ糖鎖由来ピークが観察された。
これより、本発明の粒子保存容器を用いることにより、微粒子が損失せずに容器内に保存可能であることが示された。
【００５１】
（参考例）
実施例１で用いたヒドラジドビーズを、上述した粒子保存容器内で保存することなく、直ぐに標識化糖鎖の検出を行った。得られた結果を、図３に示す。実線は、ウシＩｇＧ糖鎖由来ピークであった。
【００５２】
参考例の結果で得られたウシＩｇＧ糖鎖由来ピークと、実施例１で得られたウシＩｇＧ糖鎖由来ピークに大きな相違は無かった。
これより、本発明の粒子保存溶液を用いて粒子を保存しても粒子表面の活性基は失活しないことが分かった。
【００５３】
これらの結果により、本発明の微粒子保存溶液を用いることにより、不均一だった微粒子分散液を均一化させることができ、一定量の微粒子を反応容器に容易に分取することが可能となる。この際、従来問題となっていた微粒子の減少を最小限に抑えることが可能である。また、同時に複数個分の分取も可能である上、自動化にも向いているため作業の大幅な効率化も図れる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の粒子保存溶液および粒子の保存方法は、抗体ビーズ、レクチンビーズ、アビジンビーズ、ビオチンビーズ、ヒドラジドビーズ等の（微）粒子を一定量任意の容器に分取するのに使用できる。また、本発明の粒子保存溶液は(微)粒子の分散性に優れているため、こまめに（微）粒子を攪拌する必要も無い。単純な操作で一定量の(微)粒子を分取可能なため、ロボットによる自動処理にも容易に対応が可能である。さらに、一連の操作により粒子の有する活性基等を破壊することもない。使用毎の(微)粒子量のばらつきや、活性基等の失活を心配することなく粒子を分取するのに適している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来物質を固定化するための粒子と、前記粒子を保存する保存液とを含む粒子保存溶液であって、
前記粒子の平均比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が、０．４以下であることを特徴とする粒子保存溶液。
【請求項２】
前記保存液の比重（Ｓ２）が、０．５〜５である請求項１に記載の粒子保存溶液。
【請求項３】
前記粒子の平均粒子径（ｒ）は、０．１〜５００μｍである請求項１または２に記載の粒子保存溶液。
【請求項４】
前記粒子の平均比重をＳ１とし、粒子の比重の標準偏差をσとし、保存液の比重をＳ２としたとき、
Ｓ１−３σ＜Ｓ２＜Ｓ１＋３σ を満足する請求項１ないし３のいずれかに記載の粒子保存溶液。
【請求項５】
前記保存液は、２種類以上の溶液を混合してなる混合溶液である請求項１ないし４のいずれかに記載の粒子保存溶液。
【請求項６】
前記保存液は、無機塩の水溶液である請求項１ないし４のいずれかに記載の粒子保存溶液。
【請求項７】
前記無機塩は、セシウム塩、バリウム塩、ルビジウム塩、ストロンチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩、ベリリウム塩から選ばれる少なくとも一つである請求項６に記載の粒子保存溶液。
【請求項８】
前記無機塩の含有量は、前記水溶液中の０．１〜５０重量／体積％である請求項６または７に記載の粒子保存溶液。
【請求項９】
前記保存液の沸点が、５０℃以上である請求項１ないし８のいずれかに記載の粒子保存溶液。
【請求項１０】
前記粒子は、樹脂粒子である請求項１ないし９のいずれかに記載の粒子保存溶液。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載の粒子保存溶液を用いることを特徴とする粒子の保存方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１０のいずれかに記載の粒子保存溶液で、該溶液中の粒子の分散を測定する方法であり、該溶液の可視光線の透過率を測定する粒子保存溶液の測定方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の可視光線の透過率の測定において、透過率の時間変化を測定する粒子保存溶液の測定方法。
【請求項１】
生物由来物質を固定化するための粒子と、前記粒子を保存する保存液とを含む粒子保存溶液であって、
前記粒子の平均比重（Ｓ１）と、前記保存液の比重（Ｓ２）との比重差が、０．４以下であることを特徴とする粒子保存溶液。
【請求項２】
前記保存液の比重（Ｓ２）が、０．５〜５である請求項１に記載の粒子保存溶液。
【請求項３】
前記粒子の平均粒子径（ｒ）は、０．１〜５００μｍである請求項１または２に記載の粒子保存溶液。
【請求項４】
前記粒子の平均比重をＳ１とし、粒子の比重の標準偏差をσとし、保存液の比重をＳ２としたとき、
Ｓ１−３σ＜Ｓ２＜Ｓ１＋３σ を満足する請求項１ないし３のいずれかに記載の粒子保存溶液。
【請求項５】
前記保存液は、２種類以上の溶液を混合してなる混合溶液である請求項１ないし４のいずれかに記載の粒子保存溶液。
【請求項６】
前記保存液は、無機塩の水溶液である請求項１ないし４のいずれかに記載の粒子保存溶液。
【請求項７】
前記無機塩は、セシウム塩、バリウム塩、ルビジウム塩、ストロンチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩、ベリリウム塩から選ばれる少なくとも一つである請求項６に記載の粒子保存溶液。
【請求項８】
前記無機塩の含有量は、前記水溶液中の０．１〜５０重量／体積％である請求項６または７に記載の粒子保存溶液。
【請求項９】
前記保存液の沸点が、５０℃以上である請求項１ないし８のいずれかに記載の粒子保存溶液。
【請求項１０】
前記粒子は、樹脂粒子である請求項１ないし９のいずれかに記載の粒子保存溶液。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載の粒子保存溶液を用いることを特徴とする粒子の保存方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１０のいずれかに記載の粒子保存溶液で、該溶液中の粒子の分散を測定する方法であり、該溶液の可視光線の透過率を測定する粒子保存溶液の測定方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の可視光線の透過率の測定において、透過率の時間変化を測定する粒子保存溶液の測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１０２７９６（Ｐ２０１１−１０２７９６Ａ）
【公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２８０５３（Ｐ２０１０−２２８０５３）
【出願日】平成２２年１０月８日（２０１０．１０．８）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月８日（２０１０．１０．８）
【出願人】（０００００２１４１）住友ベークライト株式会社 (2,927)
【Ｆターム（参考）】
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