粒子状アジュバントと免疫増強物質との組合せを含むインフルエンザワクチン
【課題】粒子状アジュバントと免疫増強物質との組合せを含むインフルエンザワクチンの提供。
【解決手段】不溶性粒子状アジュバントを含むインフルエンザワクチンは、主にＴＨ２応答（ＩｇＧ１）であるＩｇＧ応答を誘発することが見出されている。この応答は、組成物中に免疫増強物質を含むことによってＴＨ１応答（ＩｇＧ２ａ）へと移行され得る。したがって、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを含む免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【解決手段】不溶性粒子状アジュバントを含むインフルエンザワクチンは、主にＴＨ２応答（ＩｇＧ１）であるＩｇＧ応答を誘発することが見出されている。この応答は、組成物中に免疫増強物質を含むことによってＴＨ１応答（ＩｇＧ２ａ）へと移行され得る。したがって、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを含む免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルス感染を防御するためのアジュバントワクチン（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
ＭＦ５９水中油型エマルションアジュバント［非特許文献１］を使用するＦＬＵＡＤＴＭ製品（Ｃｈｉｒｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）を除いて、インフルエンザワクチンは、現在、一般的使用においてアジュバントを含まない。これらのワクチンは、参考文献２の第１７章および第１８章においてさらに詳細に記載される。それらのワクチンは、生ウイルス（ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ）または不活化ウイルスに基づき、そして不活化ワクチンは、全ウイルス（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）、「スプリット」ウイルス（「ｓｐｌｉｔ」ｖｉｒｕｓ）または精製された表面抗原（赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む）に基づき得る。赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、ＨＡレベルへの参照によって標準化され、そのワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含む。
【０００４】
流行性のインフルエンザ感染において、多数の用量のインフルエンザワクチンが必要とされるが、多大な要求を満たすためにワクチンの供給を増大させることは、困難である。したがって、より多くのワクチン抗原を産生するよりも、１株あたりより低い量の抗原を使用すること、および減少した抗原用量を補うためにアジュバントを使用することが、提案されている。大流行間期に同じアプローチを使用すること（例えば、製造レベルを増大させることなく集団をより広く網羅することを可能にすること）がまた、提案されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｒｅｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００３年、第２１号、ｐ．４２３４−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
不溶性粒子状アジュバント［３］（例えば、アルミニウム塩［４〜７］または微粒子［８］）は、インフルエンザワクチンを改良するために提案されている。これらのアジュバントワクチンは、有用であるが、改良の余地が、存在し続ける。したがって、さらなるアジュバントインフルエンザワクチンおよび改良されたアジュバントインフルエンザワクチン（流行中における使用および大流行の間の使用の両方のため）、ならびにそれらの調製のための方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
不溶性粒子状アジュバントを含むインフルエンザワクチンは、主にＴＨ２応答（ＩｇＧ１）であるＩｇＧ応答を誘発することが見出されている。この応答は、組成物中に免疫増強物質を含むことによってＴＨ１応答（ＩｇＧ２ａ）へと移行され得る。ＴＨ１型応答は、インフルエンザウイルスに対する異種サブタイプ免疫（ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を改良することが報告されている［９］。有利にも、上記免疫増強物質はまた、赤血球凝集力価および抗赤血球凝集素ＥＬＩＳＡ力価の上昇が見出されている。
【０００８】
したがって、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを含む免疫原性組成物を提供する。
【０００９】
本発明はまた、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【００１０】
本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む第１のキット成分；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバントを含む第２のキット成分；とを備えるキットを提供し、（ａ）上記第１の成分または上記第２の成分は、免疫増強物質を含むか、あるいは（ｂ）上記キットは、免疫増強物質を含む第３のキット成分を含むかのいずれかである。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを含む、免疫原性組成物。
（項目２）
前記インフルエンザウイルス抗原は、不活化ウイルスである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記インフルエンザウイルス抗原は、全ウイルス、スプリットウイルス、または精製された表面抗原を含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記インフルエンザウイルス抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ由来である、項目１〜３のいずれかに記載の組成物。
（項目５）
前記インフルエンザウイルス抗原は、細胞培養物において増殖されたインフルエンザウイルスから調製される、項目１〜４のいずれかに記載の組成物。
（項目６）
前記インフルエンザウイルス抗原は、卵において増殖されたインフルエンザウイルスから調製される、項目１〜５のいずれかに記載の組成物。
（項目７）
前記組成物は、オボアルブミン、オボムコイドおよびニワトリＤＮＡを含まない、項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目８）
前記組成物は、前記細胞培養物の宿主由来の１０ｎｇ未満の細胞ＤＮＡを含む、項目５または項目７に記載の組成物。
（項目９）
前記組成物は、１００ヌクレオチド以上である１０ｎｇ未満のＤＮＡを含む、項目５または項目７に記載の組成物。
（項目１０）
前記組成物は、１ウイルス株あたり０．１μｇと２０μｇとの間の赤血球凝集素を含む、項目１〜９のいずれかに記載の組成物。
（項目１１）
前記不溶性粒子状アジュバントは、アルミニウム塩；カルシウム塩；および微粒子；からなる群より選択される、項目１〜１０のいずれかに記載の組成物。
（項目１２）
前記不溶性粒子状アジュバントは、水酸化アルミニウムを含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記不溶性粒子状アジュバントは、リン酸アルミニウムを含む、項目１１または項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記不溶性粒子状アジュバントは、リン酸カルシウムを含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１５）
前記不溶性粒子状アジュバントは、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）から作製された微粒子を含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１６）
前記免疫増強物質は、ヒトＴＬＲ１、ヒトＴＬＲ２、ヒトＴＬＲ３、ヒトＴＬＲ４、ヒトＴＬＲ７、ヒトＴＬＲ８、および／またはヒトＴＬＲ９のうちの１つ以上のアゴニストである、項目１〜１５のいずれかに記載の組成物。
（項目１７）
前記免疫増強物質は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、項目１〜１６のいずれかに記載の組成物。
（項目１８）
不溶性粒子状アジュバント；および（ｉｉｉ）免疫増強物質。
（項目１９）
（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法。
（項目２０）
（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む第１のキット成分；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバントを含む第２のキット成分；とを備えるキットであって、（ａ）該第１の成分または該第２の成分は、免疫増強物質を含むか、あるいは（ｂ）該キットは、免疫増強物質を含む第３のキット成分を含むかのいずれかである、キット。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、異なる組成物によって免疫感作されたマウスについてのＬｏｇ１０血清抗体力価（ＥＬＩＳＡ）を示す。図１は、Ｈ１Ｎ１を示す。
【図２】図２は、異なる組成物によって免疫感作されたマウスについてのＬｏｇ１０血清抗体力価（ＥＬＩＳＡ）を示す。図２は、Ｈ３Ｎ２を示す。
【図３】図３は、異なる組成物によって免疫感作されたマウスについてのＬｏｇ１０血清抗体力価（ＥＬＩＳＡ）を示す。図３は、インフルエンザＢ型を示す。
【図４】図４は、ＨＩ力価を示す。前景のバーは、群１〜３であり、そして後景のバーは、群４〜６である。
【図５】図５は、ＩｇＧについてのＧＭＴ（ＡＵ／ｍｌ）を示す。各対の左のバーは、ＩｇＧ１を示す；右のバーは、ＩｇＧ２ａを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（インフルエンザウイルス抗原）
本発明の組成物は、インフルエンザウイルス抗原を含む。上記抗原は、代表的に、インフルエンザビリオンから調製されるが、その代わりとして、赤血球凝集素などの抗原が、組換え宿主（例えば、バキュロウイルスベクターを使用した昆虫細胞株）において発現され、そして精製された形態で使用され得る［１０、１１］。しかし、一般に、抗原は、ビリオン由来である。
【００１３】
上記抗原は、生ウイルスの形態、またはより好ましくは、不活化ウイルスの形態をとり得る。ウイルスを不活化するための化学的手段としては、以下の因子の１種以上の有効量による処理が挙げられる：洗浄剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β−プロピオラクトン、またはＵＶ光。不活化のためのさらなる化学的手段としては、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）または任意のその組合せによる処理が挙げられる。ウイルス不活化の他の方法は、当該分野において公知である（例えば、第二級エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはγ線照射など）。ＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ製品は、全ビリオン不活化ワクチンである。
【００１４】
不活化ウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ウイルス、スプリットウイルス、または精製された表面抗原（赤血球凝集素を含み、そして通常は、ノイラミニダーゼをまた含む）を含み得る。
【００１５】
ビリオンは、種々の方法によってウイルス含有流体から回収され得る。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む直線ショ糖勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、必要に応じた希釈後に、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって精製され得る。
【００１６】
スプリットビリオン（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）は、ビリオンを洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）により処理（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）プロセスを含む）してサブビリオン調製物を産生することによって得られる。インフルエンザウイルスを分解する方法は、当該分野において周知である（例えば、参考文献１２〜１７などを参照のこと）。ウイルスの分解は、代表的に、破壊する濃度の分解剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）によって全ウイルスを破壊または断片化する（感染性であっても非感染性であってもよい）ことによって行われる。上記破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化をもたらし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分解剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖（ａｃｙｌ ｓｕｇａｒ）、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド（Ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分解手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの継続的な効果を使用し、そして分解は、（例えば、ショ糖密度勾配溶液における）最初のビリオン精製の間に行われ得る。したがって、分解プロセスは、ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するため）、回収されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着方法を使用する）、非ビリオン材料からの全ビリオン分離、密度勾配遠心分離工程（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分解剤を含むショ糖勾配を使用する）において分解剤を使用したビリオンの分解、および所望されない物質を除去するためのその後の濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。スプリットビリオンは、通常、リン酸ナトリウムによって緩衝化された等張塩化ナトリウム溶液に再懸濁され得る。ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ製品、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ製品、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭ製品およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品は、スプリットワクチン（ｓｐｌｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）である。
【００１７】
精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原の赤血球凝集素、および代表的には、ノイラミニダーゼをまた含む。精製された形態でこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ製品、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭ製品およびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品は、サブユニットワクチンである。
【００１８】
インフルエンザ抗原はまた、ビロソームの形態で提供され得る［１８］。
【００１９】
上記インフルエンザウイルスは、弱毒化され得る。上記インフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。上記インフルエンザウイルスは、低温適応性であり得る。これらの３つの可能性は、特に、生ウイルスに適合する。
【００２０】
ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節により変化する。最近の大流行間期において、ワクチンは、代表的に、２種のインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１種のインフルエンザＢ型株を含み、そして三価ワクチンが、代表的である。本発明はまた、（特に、インフルエンザＡ型ウイルスの）Ｈ２サブタイプ株、Ｈ５サブタイプ株、Ｈ７サブタイプ株またはＨ９サブタイプ株などの流行株（すなわちワクチンのレシピエントおよび一般的なヒト集団が免疫学的にナイーブである株）に由来するウイルスを使用し得、そして流行株に対するインフルエンザワクチンは、一価であっても、流行株によって補充された通常の三価ワクチンに基づいてもよい。しかし、季節および上記ワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、赤血球凝集素サブタイプであるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１種以上を防御し得る。本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＡサブタイプであるＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９の１種以上を防御し得る。
【００２１】
上記組成物に通常含まれ得る他の株は、抗ウイルス療法に対して抵抗性（例えば、オセルタミビル［１９］および／またはザナミビルに対して抵抗性）の株であり得、その株は、抵抗性の流行株を含む［２０］。
【００２２】
本発明のアジュバント添加組成物は、流行株に対して免疫感作するために特に有用である。流行の発生を引き起こす可能性をインフルエンザ株に与えるインフルエンザ株の特性は、以下である：（ａ）そのインフルエンザ株が、最近広まっているヒト株における赤血球凝集素と比較して新規の赤血球凝集素（すなわち、１０年以上にわたってヒト集団において顕性でない赤血球凝集素（例えばＨ２））を含むか、またはヒト集団において以前に全く見出されていない（例えば、一般には鳥類集団においてのみ見出されているＨ５、Ｈ６またはＨ９）ことにより、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであること；（ｂ）そのインフルエンザ株が、ヒト集団において水平伝播し得ること；および（ｃ）そのインフルエンザ株が、ヒトに対して病原性であること。Ｈ５型赤血球凝集素を有するウイルスは、流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対する免疫感作のために好ましい。他の可能性のある株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、および任意の他の顕在する潜在的な流行株が挙げられる。Ｈ５サブタイプにおいて、ウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３に分類され得［２１］、クレード１およびクレード３は、特に、関連性がある。
【００２３】
本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含む１種以上（例えば１種、２種、３種、４種またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る。ワクチンが、１種より多い株のインフルエンザを含む場合、それらの異なる株は、代表的に、別個に増殖され、かつそれらのウイルスが回収された後に混合され、そして抗原が、調製される。したがって、本発明のプロセスは、１種より多いインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含み得る。
【００２４】
上記インフルエンザウイルスは、リアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）株であり得、そして逆方向遺伝学技術によって得ることができた。逆方向遺伝学技術［例えば、２２〜２６］は、プラスミドを使用してインビトロで調製される所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを可能にする。代表的に、それは、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターにより、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を発現すること、および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターにより、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現することを含むことで、細胞における両方の型のＤＮＡの発現が、完全なインタクト感染性ビリオンの構築を生じる。上記ＤＮＡは、好ましくは、全ての上記ウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の全てを提供するが、そのＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを使用することもまた、可能である。各ウイルスＲＮＡを産生するために別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が、好ましく［２７〜２９］、そしてこれらの方法はまた、上記ウイルスタンパク質の全てまたはいくつか（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質およびＮＰタンパク質だけ）を発現するためのプラスミドの使用を包含し、１２種のプラスミドが、いくつかの方法において使用される。
【００２５】
必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［３０］は、（ウイルスＲＮＡ合成のための）同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を合わせる。参考文献３０の方法の好ましい局面は、以下を含む：（ａ）単一プラスミド上のＰＢ１ ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２ ｍＲＮＡコード領域およびＰＡ ｍＲＮＡコード領域；および（ｂ）単一プラスミド上の全８種のｖＲＮＡコードセグメント。１つのプラスミド上にＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを含み、そして別のプラスミド上に６種の他のセグメントを含むこともまた、問題を容易にし得る。
【００２６】
上記ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを使用する代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することが、可能である［３１］。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターが、慣用的に使用され得る。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性に起因して、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えばＭＤＣＫ）に関してより慣用的であり得るが、細胞はまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってトランスフェクトされる必要がある。
【００２７】
他の技術において、単一の鋳型に由来して上記ウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために二重のｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用することが、可能である［３２、３３］。
【００２８】
したがって、インフルエンザＡ型ウイルスは、特に、そのウイルスが卵において増殖される場合、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント（代表的に、６セグメントは、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来し、上記ＨＡセグメントおよびＮセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２リアソータント）を含み得る。それはまた、ワクチン調製物のためのリアソータントウイルスを産生するために、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント、または有用な任意の他のウイルス株の１種以上のＲＮＡセグメントを含み得る。代表的に、上記株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１種のＲＮＡセグメントを含むので、本発明は、ヒト同士の伝染が可能である株から防御する。それは、鳥インフルエンザウイルスに由来するＮＳセグメントを含み得る。
【００２９】
上記抗原の供給源として使用されるウイルスは、卵（通常は、ＳＰＦ卵）または細胞培養物のいずれかにおいて増殖され得る。インフルエンザウイルス増殖についての現在の標準的な方法は、有胚の鶏卵を使用し、そのウイルスは、その卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。しかし、さらに最近、ウイルスは、動物細胞培養物において増殖され、そして速さおよび患者のアレルギーの理由に起因して、この増殖方法が、好ましい。卵ベースのウイルス増殖が使用される場合、１種以上のアミノ酸がウイルスと一緒に卵の尿膜の流体中に導入され得る［１５］。
【００３０】
細胞基質は、代表的に、哺乳動物細胞株である。適切な哺乳動物細胞の起源としては、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類細胞（ヒト細胞およびサル細胞を含む）およびイヌ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などのような種々の細胞型が、使用され得る。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣの名前を有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎細胞）である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞株のような腎細胞である。したがって、適切な細胞株としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８；などが挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるために好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる：Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［３４〜３７］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ
ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［３８〜４０］；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［４１］。これらの細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［４２］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［４３］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広範に入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７の種々の異なるＶｅｒｏ細胞を提供し、そしてＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−３４のＭＤＣＫ細胞を提供する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０においてＥＣＡＣＣから入手可能である。あまり好ましくない哺乳動物細胞株の代替物として、ウイルスは、アヒル（例えば、アヒル網膜）または雌鶏（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ））などに由来する細胞株を含む鳥類細胞株［例えば、参考文献４４〜４６］において増殖され得る。例としては、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４に由来するＥＢｘ細胞株［４８］を含む鳥類胚性幹細胞［４４、４７］が挙げられる。
【００３１】
ウイルスが哺乳動物細胞株において増殖された場合、上記組成物は、有益に、卵タンパク質（例えばオボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それによってアレルゲン性を減少させる。
【００３２】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞株の派生物もまた、使用され得る。例えば、参考文献３４は、懸濁培養物における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」）を開示する。同様に、参考文献４９は、無血清培養の懸濁物において増殖するＭＤＣＫ由来細胞株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示する。参考文献５０は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ
ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む）を開示する。参考文献５１は、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む）を開示する。任意のこれらのＭＤＣＫ細胞株が、使用され得る。
【００３３】
ウイルスが細胞株において増殖された場合、増殖のための培養物、およびまた、培養を開始するために使用されるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない［５２］（すなわち、それらの培養物および接種物は、これらのウイルスについて試験され、そしてこれらのウイルスによる汚染についてネガティブな結果を得る）。単純ヘルペスウイルスが無いことは、特に好ましい。
【００３４】
ウイルスが細胞株において増殖された場合、上記組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、およびより好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが、存在し得る。一般に、上記宿主細胞ＤＮＡ（それは、本発明の組成物から取り除くことが望ましい）は、１００ｂｐよりも長いＤＮＡである。
【００３５】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、現在、生物製剤についての慣用的な管理要件（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）であり、そして当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために使用されるアッセイは、代表的に、確認されたアッセイである［５３、５４］。確認されたアッセイの性能の特徴は、数学的項目および定量可能な項目において記載され得、そしてその考えられる誤差の供給源は、同定されている。上記アッセイは、一般に、正確度、精度、特異性などの特徴について試験された。一旦アッセイが、（例えば、宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量に対して）較正され、そして試験された場合、定量的ＤＮＡ測定は、慣用的に行われ得る。ＤＮＡ定量についての以下の３つの主要な技術が、使用され得る：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション法［５５］；ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭ Ｓｙｓｔｅｍなどのイムノアッセイ法［５６］；および定量的ＰＣＲ［５７］。これらの方法は全て、当業者によく知られているが、各方法の正確な特徴は、目的とする宿主細胞に依存し得る（例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択など）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡについての定量的アッセイであり、そして生物製剤中の混入したＤＮＡのレベルをモニタリングするために使用されている［５６］。代表的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間における反応複合体の配列非特異的形成を包含する。全てのアッセイ成分は、上記製造業者から入手可能である完全なＴｏｔａｌ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに含まれる。種々の商業的な製造業者は、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供する（例えば、ＡｐｐＴｅｃＴＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅＴＭ、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡの混入を測定することについての化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡ ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムとの比較は、参考文献５８に見出され得る。
【００３６】
混入したＤＮＡは、標準的な精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用して、ワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによるヌクレアーゼ処理によって増強され得る。宿主細胞ＤＮＡの混入を減少させるために好都合な方法は、参考文献５９および６０に開示され、その方法は、最初に、ウイルス増殖の間に使用され得るＤＮａｓｅ（例えば、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））を使用し、次いで、ビリオンの破壊の間に使用され得るカチオン性洗浄剤（例えばＣＴＡＢ）を使用する、２工程の処理を含む。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）による処理がまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、そしてまた、有益に、ビリオンを不活化するために使用され得る［６１］。
【００３７】
０．２５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、１５μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、好ましい。０．５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、５０μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、より好ましい。
【００３８】
任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることが、好ましい。
【００３９】
細胞株（例えば、ＭＤＣＫ細胞）における増殖について、ウイルスは、懸濁物における細胞［３４、６２、６３］または付着培養（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）中の細胞において増殖され得る。懸濁培養のための１つの適切なＭＤＣＫ細胞株は、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された）である。代替物として、マイクロキャリア培養（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）が、使用され得る。
【００４０】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、無血清培地および／またはタンパク質を含まない培地において増殖される。培地は、ヒト起源または動物起源の血清に由来する添加物が存在しない本発明の文脈において、無血清培地と称される。タンパク質を含まないことは、上記細胞の増殖がタンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除して生じる培養を意味すると理解されるが、ウイルス増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を必要に応じて含み得る。そのような培養物において増殖する細胞は、細胞自体のタンパク質をもちろん含む。
【００４１】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、例えば、ウイルス複製の間に、３７℃未満（例えば、３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）で増殖される［６４］。
【００４２】
培養された細胞においてウイルスを増殖させるための方法は、一般に、その培養された細胞に培養されるべき株を接種する工程、ウイルス増殖（例えば、ウイルス力価または抗原発現によって決定される）のために所望の期間（例えば、接種の２４時間後と１６８時間後との間）にわたって、感染された細胞を培養する工程、および増殖されたウイルスを回収する工程を包含する。上記培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５、より好ましくは、１：５０〜１：１０の細胞比まで、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定される）を接種される。上記ウイルスは、上記細胞の懸濁物に添加されるか、または上記細胞の単一層に適用され、そしてそのウイルスは、２５℃〜４０℃（好ましくは、２８℃〜３７℃）にて、少なくとも６０分間（しかし通常は、３００分未満（好ましくは、９０分間と２４０分間との間））にわたってその細胞上に吸着される。上記感染された細胞の培養物（例えば、単一層）は、回収される培養上清のウイルス含量を増大させるために、凍結解凍または酵素作用のいずれかによって除去され得る。次いで、上記回収された流体は、凍結されて不活化または保存のいずれかが行われる。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは、０．００２〜５、より好ましくは、０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）にて感染され得る。よりさらに好ましくは、上記細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉにて感染される。感染された細胞は、感染後３０時間〜６０時間で回収され得る。好ましくは、上記細胞は、感染後３４時間〜４８時間で回収される。よりさらに好ましくは、上記細胞は、感染後３８時間〜４０時間で回収される。プロテアーゼ（代表的に、トリプシン）は、一般に、ウイルスの放出を可能にするために細胞培養の間に添加され、そしてそのプロテアーゼは、その培養の間の任意の適切な段階において添加され得る。
【００４３】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチン中の主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、代表的に、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定されるようなＨＡレベルを参照することによって標準化される。ワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量がまた、例えば、小児のためかまたは流行性の状況において使用される。１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８のような分割量が、より高い用量（例えば、３×用量または９×用量［６５、６６］）を有する場合に使用されている［６、７］。したがって、ワクチンは、１つのインフルエンザ株あたり０．１μｇと１５０μｇとの間のＨＡ、好ましくは、０．１μｇと５０μｇとの間（例えば、０．１μｇ〜２０μｇ、０．１μｇ〜１５μｇ、０．１μｇ〜１０μｇ、０．１μｇ〜７．５μｇ、０．５μｇ〜５μｇなど）のＨＡを含み得る。特定の用量は、例えば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。これらのより低い用量は、本発明のようにアジュバントがワクチン中に存在する場合、最も有用である。
【００４４】
生ワクチンについて、投薬量は、ＨＡ含量よりもむしろ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、そして１株あたり１０６と１０８との間（好ましくは、１０６．５〜１０７．５の間）のＴＣＩＤ５０が、代表的である。
【００４５】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルスにおいて見出されるような天然のＨＡであっても、改変されていてもよい。例えば、ウイルスを鳥類種において非常に病原性にする決定因子（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との切断部位周辺の超塩基性領域（ｈｙｐｅｒ−ｂａｓｉｃ ｒｅｇｉｏｎ））を除去するためにＨＡを改変することが、公知である。なぜならば、これらの決定因子は、そうでなければウイルスが卵において増殖されることを妨げ得るからである。
【００４６】
本発明のキットの抗原成分は、特に、スプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンのために、洗浄剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として公知である）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム）を含み得る。上記洗浄剤は、微量でのみ存在し得る。したがって、上記ワクチンは、各々１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール−１０、α−コハク酸水素トコフェロールおよびポリソルベート８０を含み得る。残りの他の微量成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００４７】
不活化されている非全細胞ワクチン（例えば、ウイルス成分ワクチンまたは精製された表面抗原ワクチン）は、この抗原内に位置するさらなるＴ細胞エピトープからの利益を受けるために、マトリックスタンパク質を含み得る。したがって、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む非全細胞ワクチン（特に、スプリットワクチン）は、Ｍ１および／またはＭ２マトリックスタンパク質をさらに含み得る。マトリックスタンパク質が存在する場合、検出可能なレベルのＭ２マトリックスタンパク質を含むことが、好ましい。核タンパク質もまた、存在し得る。
【００４８】
（不溶性粒子状アジュバント）
本発明の組成物およびキットは、不溶性粒子状アジュバントを含む。本発明に有用な適切な不溶性粒子状アジュバントの例としては、アルミニウム塩、カルシウム塩、および微粒子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
上記不溶性粒子状アジュバントは、代表的に、吸着剤として機能して、抗原およびアジュバントが使用される場合に、その抗原（例えば、赤血球凝集素）が、そのアジュバントに吸着される。しかし、微粒子について、その粒子表面上に上記抗原を吸着する代わりとして（または上記抗原を吸着することに加えて）、その抗原をその粒子の内部に封入することが、可能である。
【００５０】
（アルミニウム塩）
適切なアルミニウム塩としては、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知であるアジュバントが挙げられる。これらの名前は、慣習的であるが、便宜上のみに使用され、いずれも存在している実際の化合物の正確な説明でもない［例えば、参考文献６７の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される任意の「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントを使用し得る。
【００５１】
「水酸化アルミニウム」として公知であるアジュバントは、代表的に、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、それは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光学によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸収帯および３０９０〜３１００ｃｍ−１における強力なショルダーの存在によって水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物と区別され得る［参考文献６７の第９章］）。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度の程度は、回折バンドの半価幅（ＷＨＨ）に反映され、結晶性の低い粒子は、より小さい結晶サイズに起因して、より大きい線幅拡大を示す。ＷＨＨが増大する場合、表面積は、増大し、そしてより高いＷＨＨ値を有するアジュバントは、抗原吸着についてのより大きい能力を有することが見出されている。繊維状の形態学（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに関して代表的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、代表的に、約１１である（すなわち、そのアジュバント自体は、生理学的ｐＨにて正の表面電荷を有する）。ｐＨ７．４において１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり１．８ｍｇ〜２．６ｍｇの間の吸着力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００５２】
「リン酸アルミニウム」として公知であるアジュバントは、代表的に、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、それはまた、しばしば少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウムサルフェート）を含む。それらのアジュバントは、沈殿によって得られ得、そして沈殿の間の反応条件および濃度は、上記塩におけるヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に影響を及ぼす。ヒドロキシリン酸塩は、一般に、０．３と１．２との間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、厳密なＡｌＰＯ４からヒドロキシル基の存在によって区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃まで加熱される場合）は、構造的なヒドロキシルの存在を示す［参考文献６７の第９章］。
【００５３】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に、０．３と１．２との間、好ましくは、０．８と１．２との間、そしてより好ましくは、０．９５±０．１である。上記リン酸アルミニウムは、一般に、特にヒドロキシリン酸塩については特に非晶質である。代表的なアジュバントは、０．８４と０．９２との間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムであり、１ｍｌあたり０．６ｍｇのＡｌ３＋で含む。上記リン酸アルミニウムは、一般に、粒子状（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような板状の形態学）である。その粒子の代表的な直径は、任意の抗原吸着の後において０．５μｍ〜２０μｍ（例えば、約５μｍ〜１０μｍ）の範囲である。ｐＨ７．４において１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり０．７ｍｇ〜１．５ｍｇの間のタンパク質を吸着する能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００５４】
リン酸アルミニウムの荷電ゼロ点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に逆に相関し、そしてこの置換の程度は、沈殿によって上記塩を調製するために使用される反応条件および濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度（より多いリン酸塩＝より酸性のＰＺＣ）を変化させること、またはヒスチジン緩衝剤（ＰＺＣをより塩基性にする）などの緩衝剤を添加することによって変えられる。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０と７．０との間、より好ましくは５．０と６．５との間（例えば、約５．７）のＰＺＣを有する。
【００５５】
本発明で使用されるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤またはヒスチジン緩衝剤またはＴｒｉｓ緩衝剤）を含み得るが、これは、常に必要であるとは限らない。上記懸濁物は、好ましくは、無菌であり、かつ発熱物質を含まない。懸濁物は、例えば、１．０ｍＭと２０ｍＭとの間、好ましくは５ｍＭと１５ｍＭとの間、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する、遊離型の水性リン酸イオンを含み得る。上記懸濁物はまた、塩化ナトリウムを含み得る。
【００５６】
本発明の１つの実施形態において、上記アジュバントは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を含む［６］。この場合において、水酸化アルミニウムよりも多いリン酸アルミニウム（例えば、少なくとも２：１（例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１など）の重量比）が、存在し得る。
【００５７】
患者に対する投与のための組成物におけるＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなど）である。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌとの間である。０．８５ｍｇ／用量未満の最大量が、好ましい。
【００５８】
（カルシウム塩）
種々のカルシウム塩のうち、一般に、リン酸カルシウムのみが、アジュバントとして使用される。リン酸カルシウムの種々のアジュバント形態が、報告されており、そして任意のこれらの形態が、本発明によって使用され得る：
水和リン酸カルシウムゲルアジュバントは、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ（Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能である。
【００５９】
参考文献６７の第８章は、１９９５年にリン酸カルシウムアジュバントを概説した。抗原は、その抗原の存在下における塩のその場での沈殿（ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）または予め形成された塩への吸着のいずれかによって、リン酸カルシウムに吸着され得る。予め形成されたリン酸カルシウムゲルの商業的供給源は、言及される。詳細は、吸着力を含む上記アジュバントの物理化学的特徴に対する沈殿条件の効果について与えられる。
【００６０】
参考文献６８は、種々のリン酸カルシウムアジュバントの構造特性および吸着特性について報告する。厳密なＣａ３（ＰＯ４）２であるよりもむしろ、上記アジュバントは、式Ｃａ１０−ｘ（ＨＰＯ４）ｘ（ＰＯ４）６−ｘ（ＯＨ）２−ｘの非化学量論的なヒドロキシアパタイト、および５．５の荷電ゼロ点（ＰＺＣ）を有するｐＨ依存性の表面荷電であることが報告された。上記アジュバントは、約１０ｎｍ×１５０ｎｍの寸法を有する針様粒子、および約２０〜３０ｎｍの直径を有する不規則に成形された板（ｐｌａｔｅ）を形成し得る。
【００６１】
参考文献６９は、空の反応部位を含む反応性の非晶質リン酸カルシウムを開示し、その反応部位は、非晶質炭酸・リン酸カルシウムの炭酸プレ成分（ｐｒｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を、そのプレ成分の気体または蒸気の副産物への熱分解によって除去することによって得られた。
【００６２】
参考文献７０および７１は、粒子状リン酸カルシウムアジュバント（「ＣＡＰ」）を開示し、その粒子は、３００〜４０００ｎｍの範囲の直径（ナノ粒子）を有し、そして球形状および平滑面を有する。参考文献７２は、これらの粒子が粘膜免疫感作のために使用され得ることを開示する。
【００６３】
粘膜免疫感作はまた、参考文献７３に開示され、ＩｇＡ抗体応答をもたらすために哺乳動物にワクチン接種するための方法は、上皮を横切る輸送に適したサイズの粒子状炭酸・リン酸カルシウムを使用する。
【００６４】
参考文献７４は、インビボで可溶性である複合粒子を開示し、そしてその複合粒子は、その表面上にコーティングされた約１．０〜２．０のＣａ／Ｐ比を有するリン酸カルシウム化合物を有するポリマー物質の粒子を含む。
【００６５】
参考文献７５は、ワクチンを吸着するためのリン酸カルシウムの注射可能な水性ゲルを開示し、Ｃａ／Ｐの重量比が１．６２〜１．８５であり、かつ１リットルあたり０．０７個のＣａ原子を含む場合にそのゲルの沈殿時間が１０分間で２０℃にて１〜２０ｍｍの間であるような割合で、カルシウムイオンおよびリン酸イオンが、合わせられる。
【００６６】
リン酸カルシウムアジュバントのＣａ対Ｐのモル比は、例えば、１．３５と１．８３との間で変動し得る［参考文献６７の第８章を参照のこと］。上記アジュバントの吸着特性は、沈殿の間に使用される条件に依存して変動することが見出されている（例えば、緩徐な混合は、迅速な混合によって形成されたアジュバントよりも低い吸着力を有するアジュバントを与えた）。
【００６７】
Ｃａ＋＋として測定される本発明のワクチン中のリン酸カルシウムの量は、０．１ｍｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌとの間（例えば、０．５〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．７５〜３ｍｇ／ｍｌ、０．９〜１．５ｍｇ／ｍｌまたは約１ｍｇ／ｍｌ）であり得る。
【００６８】
上記リン酸カルシウムアジュバントは、抗原を吸着する能力を有する。所与の抗原について、その抗原の総量の少なくとも８０重量％（例えば、８５重量％以上、９０重量％以上、９２．５重量％以上、９５重量％以上、９７．５重量％以上、９７．５重量％以上、９８重量％以上、９９重量％以上、９９．５重量％以上など）が、吸着される。リン酸カルシウムアジュバントが不溶性である場合、吸着の程度は、従来通り、遠心分離を含む方法、およびその後の、固体物質または可溶性物質の一方（または両方）である抗原の量の決定によって測定され得る。吸着されていない抗原は、遠心分離後に溶液のままである。例えば、リン酸カルシウムアジュバントの吸着力は、参考文献７６において、この方法によって測定された。１ｍｇのＣａ＋＋に対するジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドの吸着は、（ａ）ジフテリアトキソイドレベルが１００Ｌｆを上回って上昇した場合、および（ｂ）破傷風トキソイドレベルが２５Ｌｆを上回って上昇した場合に、不完全であった。
【００６９】
吸着についてリン酸カルシウムアジュバントは、好ましくは、インフルエンザ抗原が添加される水性懸濁物の形態で使用される。上記カルシウム塩は、上記抗原を添加する前に、必要とされる濃度まで希釈され得る。
【００７０】
（微粒子）
微粒子は、アジュバントとして使用するために所望されている（例えば、参考文献７７および７８を参照のこと）。
【００７１】
好ましい微粒子は、生分解性でありかつ非毒性のポリマーから作製される。例えば、それらは、以下からなる群より選択されるポリマーから作製され得る：ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレート。これらのポリマーのコポリマー（例えば、すなわち、Ｄ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマー）もまた、使用され得る。
【００７２】
好ましいポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、より好ましくはポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）からなる群より選択されるものである。最も好ましいポリマーは、「ＰＬＧ」と称されるポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーである。好ましいポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーは、２５：７５〜７５：２５の範囲、より好ましくは、４０：６０〜６０：４０（例えば、約５０：５０）の範囲のラクチド／グリコリドモル比を有するものである。５０％のＤ，Ｌ−ラクチドおよび５０％のグリコリドを含む５０：５０のＰＬＧポリマーは、迅速に再吸収するコポリマーを提供するが、７５：２５のＰＬＧは、よりゆっくりと分解し、そして８５：１５および９０：１０は、増大したラクチド成分に起因して、よりさらにゆっくりと分解する。
【００７３】
これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能であり、そして所与の抗原に関して適切な分子量は、当業者によって容易に決定される。ポリラクチドについて、例えば、適切な分子量は、約２０００〜５０００のオーダーである。ＰＬＧについて、適切な分子量は、一般に、約１０，０００〜約２００，０００の範囲、好ましくは、約１５，０００〜約１５０，０００の範囲、そして最も好ましくは、約５０，０００〜約１００，０００の範囲である。有用な範囲は、３０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトンである。
【００７４】
微粒子は、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの範囲の直径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの範囲の直径、そして最も好ましくは約５００ｎｍ〜約１０μｍの範囲の直径を有し得る。それらの微粒子は、代表的に、実質的に球状である。
【００７５】
微粒子は、種々の方法で作製され得る。例えば、二重エマルション／溶媒蒸発（ｄｏｕｂｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ／ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）技術が、公知であり、その技術は、ポリマー溶液の小滴からなる一次エマルションの形成を包含し、その一次エマルションは、次いで粒子安定剤／界面活性剤を含む連続した水相と混合される。より具体的には、水中油中水型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒蒸発系が、参考文献７９に記載されるように、上記微粒子を形成するために使用され得る。この技術において、特定のポリマーは、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、ジメチルクロリド（塩化メチレンおよびジクロロメタンとも称される）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなど）と合わせられる。上記ポリマーは、有機溶媒中の約２〜１５％溶液、より好ましくは、約４〜１０％溶液、そして最も好ましくは、６％溶液で提供される。上記ポリマー溶液は、例えば、ホモジナイザーを使用して乳化される。次いで、上記エマルションは、エマルション安定剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはポリビニルピロリドン）のより大きい容量の水溶液と合わせられる。上記エマルション安定剤は、代表的に、約２〜１５％溶液、より代表的に、約４〜１０％溶液で提供される。次いで、その混合物は、安定なｗ／ｏ／ｗ二重エマルションを産生するためにホモジナイズされる。次いで、有機溶媒は、蒸発される。処方パラメータは、小さい（＜５μｍ）微粒子および大きい（＞３０μｍ）微粒子の調製を可能にするために操作され得る。例えば、撹拌の減少は、内相の容量の増加をもたらすような、より大きい微粒子を生じる。粒径は、慣用的な方法によって決定され得る。
【００７６】
二重エマルション技術を使用することと同様に、一重エマルション（ｓｉｎｇｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）技術もまた、使用され得る。微粒子はまた、噴霧乾燥およびコアセルベーションを使用して形成されても、気中懸濁被覆技術（例えば、パンコーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティング）によって形成されてもよい。イオンゲル化（ｉｏｎｉｃ ｇｅｌａｔｉｏｎ）もまた、使用され得る。
【００７７】
調製の後、微粒子は、それらが、すなわち、さらなる使用のために凍結乾燥され得るように、保存され得る。
【００７８】
調製された微粒子上に抗原を吸着させるための１つの方法は、以下の通りである。微粒子は、再度水和され、そして透析可能な洗浄剤を使用して微粒子の本質的に単一の懸濁物へと分散される。有用な洗浄剤としては、任意の種々のＮ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡとして公知である）（例えば、ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−７）、オクタノイル−Ｎメチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、およびデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０））；コール酸；コール酸ナトリウム；デオキシコール酸；デオキシコール酸ナトリウム；タウロコール酸；タウロコール酸ナトリウム；タウロデオキシコール酸；タウロデオキシコール酸ナトリウム；３［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−サルフェート（ＣＨＡＰＳ）；３−［（３ コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン−サルフェート（ＣＨＡＰＳＯ）；Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオール（ａｍｍｏｎｉｏｌ）−プロパン−サルフェート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ ３−１２）；Ｎ，Ｎ−ビス−（３−Ｄグルコンアミドプロピル（Ｄｇｌｕｃｏｎｅａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））−デオキシコールアミド（ＤＥＯＸＹ−ＢＩＧＣＨＡＰ）；Ｎオクチルグルコシド（Ｎｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）；モノラウリル酸スクロース；グリココール酸／グリココール酸ナトリウム；ラウロサルコシン（ナトリウム塩）；グリコデオキシコール酸／グリコデオキシコール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、洗浄剤 対 微粒子の約０．０１５６：１の比（ｗ：ｗ）、が使用され、より好ましくは、約０．６２５：１の比、よりさらに好ましくは、約０．２５：１の比、そして最も好ましくは、約１：１〜２：１の比（洗浄剤 対 微粒子（ｗ：ｗ））が使用される。
【００７９】
次いで、上記微粒子／洗浄剤混合物は、例えば、セラミック製の乳鉢および乳棒を使用して、滑らかなスラリーが形成されるまで、物理的にすり砕かれる。次いで、適切な水性緩衝剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）が、添加され、そして得られた混合物は、上記微粒子が十分に懸濁されるまで、超音波処理またはホモジナイズされる。次いで、目的の抗原が、上記微粒子懸濁物に添加され、そしてその系は、洗浄剤を除去するために透析される。上記ポリマー微粒子および洗浄剤系は、好ましくは、目的の抗原がその抗原の活性を依然として維持しつつその微粒子の表面に吸着するように選択される。表面に吸着した抗原を含む得られた微粒子は、結合していない抗原を含まないように洗浄され得、そして以下でさらに記載されるように、適切な緩衝剤処方物中の懸濁物として保存されても、適切な賦形剤と一緒に凍結乾燥されてもよい。
【００８０】
微粒子は、必要に応じて、負に荷電した表面（例えば、ＳＤＳを用いる）または正に荷電した表面（例えば、カチオン性洗浄剤（例えば、ＣＴＡＢ）を用いる）を有するように処理され得る。表面特徴の変化は、吸着される抗原に従う吸着特徴を変化させ得る。
【００８１】
（免疫増強物質）
本発明の組成物は、免疫増強物質を含み、そして免疫増強物質と不溶性粒子状アジュバントとの組合せは驚くほど有効な免疫原性組成物を与えることが、見出されている。
【００８２】
好ましい免疫増強物質は、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のアゴニストである。例えば、それらは、ヒトＴＬＲ１タンパク質、ヒトＴＬＲ２タンパク質、ヒトＴＬＲ３タンパク質、ヒトＴＬＲ４タンパク質、ヒトＴＬＲ７タンパク質、ヒトＴＬＲ８タンパク質、および／またはヒトＴＬＲ９タンパク質のうちの１つ以上のアゴニストであり得る。好ましい薬剤は、ＴＬＲ７のアゴニスト（例えば、イミダゾキノリン（ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｉｌｏｎｅ））および／またはより好ましくは、ＴＬＲ９のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）である。これらの免疫増強物質は、先天免疫経路を活性化するために有用である。
【００８３】
代表的な免疫増強物質は、有機化合物であり、そしてそれらは、通常、ポリマーではない。それらは、２ｋＤａ未満（例えば、１８００Ｄａ未満、１６００Ｄａ未満、１４００Ｄａ未満、１２００Ｄａ未満、１０００Ｄａ未満、８００Ｄａ未満、６００Ｄａ未満、５００Ｄａ未満、４００Ｄａ未満、３００Ｄａ未満、または２００Ｄａ未満）の分子量を有し得る。
【００８４】
適切な免疫増強物質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
−免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに結合された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）または二本鎖ＲＮＡを含むもの、あるいはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチド）。
−３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「ＭＰＬＴＭ」としても公知である「３ｄＭＰＬ」）［８０〜８３］。
−イミダゾキノリン化合物（例えば、イミキモッド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ８３７」）［８４、８５］、レシキモッド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）［８６］、およびそれらのアナログ；ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献８７〜９１に見出され得る。
−チオセミカルバゾン化合物（例えば、参考文献９２に開示されるもの）。活性化合物についての処方、製造、およびスクリーニングの方法はまた、参考文献９２に記載される。−トリプタントリン化合物（例えば、参考文献９３に開示されるもの）。活性化合物についての処方、製造、およびスクリーニングの方法はまた、参考文献９３に記載される。
−（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【００８５】
【化１】
などのヌクレオシドアナログ、およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献９４〜９６に開示される化合物；（ｆ）式：
【００８６】
【化２】
を有する化合物（ここで、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ３は、存在しないか、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキルであるか、または一緒に結合されてＲ４−５：
【００８７】
【化３】
のような５員環を形成し、この結合は、
【００８８】
【化４】
によって示される結合において達成され、Ｘ１およびＸ２は、各々独立して、Ｎ、Ｃ、Ｏ、またはＳであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルまたはＲ９ａであり、Ｒ９ａは、
【００８９】
【化５】
であり、この結合は、
【００９０】
【化６】
によって示される結合において達成され；
Ｒ１０およびＲ１１は、各々独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、または−ＯＨであり；
各々のＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールであり；
各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルであり；
各Ｒｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１−６アルキル）２、Ｃ６−Ｉ０アリール、またはヘテロシクリルであり；
各Ｒｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
各Ｒｆは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートであり；
各ｎは、独立して、０、１、２、または３であり；
各ｐは、独立して、０、１、または２である）；あるいは（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に受容可能な塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体、またはその互変異性体の薬学的に受容可能な塩。
−ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）［９７］。
−ポリオキシドニウム（ｐｏｌｙｏｘｉｄｏｎｉｕｍ）ポリマー［９８、９９］または他のＮ−酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
−参考文献１００に開示される化合物。
−参考文献１０１に規定されるような、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ：
【００９１】
【化７】
の化合物、あるいはその塩、例えば、「ＥＲ ８０３０５８」、「ＥＲ ８０３７３２」、「ＥＲ ８０４０５３」、「ＥＲ ８０４０５８」、「ＥＲ ８０４０５９」、「ＥＲ
８０４４４２」、「ＥＲ ８０４６８０」、「ＥＲ ８０４７６４」、「ＥＲ ８０４０５７」（以下に示される構造）：
【００９２】
【化８】
またはＥＲ−８０３０２２（以下に示される構造）：
【００９３】
【化９】
−アミノアルキルグルコサミニドグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９［１０２、１０３］）。
−例えば、参考文献１０４および１０５に記載されるようなポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ））ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）などのホスファゼン。
−ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１０６、１０７］：
【００９４】
【化１０】
などの、ホスフェート含有非環式骨格に結合された脂質を含む化合物。
−ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ）プロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、または「ＴｈｅｒａｍｉｄｅＴＭ」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）。
−参考文献１０８に開示される化合物（アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンゾイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１０９、１１０］、ヒドラフタラミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１１１］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン（Ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物、およびベンザゾール（Ｂｅｎｚａｚｏｌｅ）化合物［１１２］を含む）。
−メチルイノシン５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」）［１１３］。
−式：
【００９５】
【化１１】
を有するもの（Ｒは、水素、直鎖または分枝鎖であり、非置換または置換であり、不飽和または飽和である、アシル基、アルキル基（例えば、シクロアルキル基）、アルケニル基、アルキニル基およびアリール基、あるいはそれらの薬学的に受容可能な塩または誘導体からなる群より選択される）などのポリヒドロキシル化ピロリジン化合物［１１４］。例としては、カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２５４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール；
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチルアセテート；
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン；
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール；
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール；
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
などの低分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）。
【００９６】
上記免疫増強物質は、上記組成物に、その産生の間の種々の段階において添加され得る。例えば、上記免疫増強物質は、抗原組成物内にあり得、次いで、この混合物は、不溶性粒子状アジュバントに添加され得る。その代わりとして、上記免疫増強物質は、不溶性粒子状アジュバントと混合され得、次いで、この混合物は、上記抗原と混合され得る。
【００９７】
上記免疫増強物質は、抗原などの別個の因子に結合体化され得る（例えば、ＣＲＭ１９７）。低分子に対する結合体化技術の総説は、参考文献１１５に提供される。その代わりとして、上記免疫増強物質は、疎水性相互作用またはイオン性相互作用などによってさらなる因子と非共有結合され得る。
【００９８】
２つの好ましい免疫増強物質は、（ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および（ｂ）３ｄＭＰＬである。
【００９９】
（免疫刺激性オリゴヌクレオチド）
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド改変／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変）を含み得、そして二本鎖であっても（ｄｓＲＮＡを除いて）一本鎖であってもよい。参考文献１１６、１１７および１１８は、可能なアナログ置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによるグアノシンの置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１１９〜１２４においてさらに考察される。上記ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に関し得る（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）［１２５］。上記ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導について特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド））か、またはその配列は、Ｂ細胞応答の誘導について、より特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１２６〜１２８において考察される。好ましくは、上記ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、上記ＣｐＧ オリゴヌクレオチドは、その５’末端がレセプター認識を達成可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成するようにそれらの３’末端において結合され得る。例えば、参考文献１２５および参考文献１２９〜１３１を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントは、ＰｒｏＭｕｎｅＴＭ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知であるＣｐＧ７９０９である。
【０１００】
ＣｐＧ配列を使用する代わりか、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列が、使用され得る［１３２］。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【０１０１】
上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンが豊富であり得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献１３２に開示されるようなＴＴＴＴ）を含み得るか、そして／または免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のチミジンを含むヌクレオチド組成を有し得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したシトシンヌクレオチド（例えば、参考文献１３２に開示されるようなＣＣＣＣ）を含み得るか、そして／またはその免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のシトシンを含むヌクレオチド組成を有し得る。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【０１０２】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、代表的に、少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。それらは、１００個よりも少ないヌクレオチドを含み得る。
【０１０３】
（３ｄＭＰＬ）
３ｄＭＰＬ（３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしても公知である）は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されるアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）変異体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そして数種のサイトカインの放出を刺激する。３ｄＭＰＬの調製は、最初に、参考文献１３３に記載された。
【０１０４】
３ｄＭＰＬとアルミニウム塩との組合せは、既に公知である（例えば、リン酸アルミニウムとの組合せ［１３４］、または水酸化アルミニウムとの組合せ［１３５］）。
【０１０５】
３ｄＭＰＬは、それらのアシル化によって変動する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５または６のアシル鎖を有する）関連分子の混合物の形態をとり得る。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知の）単糖は、それらの２位の炭素（すなわち、２位および２’位）でＮ−アシル化され、そしてまた３’位でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は以下：
【０１０６】
【化１２】
である。
【０１０７】
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは、８〜１６の間であり、より好ましくは、９〜１２の間であり、そして最も好ましくは、１０である。
【０１０８】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、各々独立して、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４；であり得、ここでＲ４は−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ここでｍの値は、好ましくは、８〜１６の間であり、そしてより好ましくは、１０、１２または１４である。２位では、ｍは、好ましくは、１４である。２’位では、ｍは、好ましくは、１０である。３’位では、ｍは、好ましくは、１２である。したがって、基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。
【０１０９】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは３つのアシル鎖のみを有する（２位、２’位および３’位の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち２つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち１つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれもが−Ｈではない場合、上記３ｄＭＰＬは、６つのアシル鎖を有し得る。本発明に従って用いられる３ｄＭＰＬアジュバントは、３〜６つのアシル鎖を備えたこれらの形態の混合物であり得るが、この混合物中に６つのアシル鎖をもつ３ｄＭＰＬを含むことが好ましく、そして特に６つのアシル鎖形態が総３ｄＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、２０重量％以上、３０重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上またはさらに多くを占めることが好ましい。６つのアシル鎖を備えた３ｄＭＰＬは、最もアジュバント活性な形態であることが見出された。
【０１１０】
従って、本発明の組成物に含めるために３ｄＭＰＬの最も好ましい形態は、
【０１１１】
【化１３】
である。
【０１１２】
３ｄＭＰＬが混合物の形態で使用される場合、本発明の組成物中の３ｄＭＰＬの量または濃度に関する言及は、混合物中の合わせた３ｄＭＰＬ種をいう。
【０１１３】
水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズを備えた（例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを備えた）ミセル凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方は、本発明とともに使用され得、そしてより良好な粒子が通常のアッセイによって選択され得る。より小さな粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁物を与えるに十分小さい）が、より優れた活性［１３６］に起因して、本発明に従う使用に好ましい。好ましい粒子は、２２０ｎｍより小さいか、より好ましくは２００ｎｍより小さいか、１５０ｎｍより小さいか、あるいは１２０ｎｍより小さい平均直径を有し、１００ｎｍより小さい平均直径を有しさえし得る。しかしながら、大部分の場合において、この平均直径は、５０ｎｍより小さくはない。これらの粒子は、濾過滅菌に適するほどに十分小さい。粒子直径は、通常の動的光散乱法の技法によって評価され得、平均粒子直径が明らかとなる。粒子がｘｎｍの直径を有するといわれる場合、一般的にはおおよそこの平均の粒子の分布が存在するが、粒子の数で少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれより多く）がｘ±２５％の範囲内の直径を有する。
【０１１４】
実質的に全ての３ｄＭＰＬは、好ましくは、上記エマルションの水相に位置する。
【０１１５】
ワクチン中の３ｄＭＰＬの代表的な量は、１０〜１００μｇ／用量（例えば、約２５μｇまたは約５０μｇ）である。
【０１１６】
（薬学的組成物）
本発明の組成物は、薬学的に受容可能である。それらの組成物は、抗原、アジュバントおよび免疫増強物質に加えて、成分を含み得る（例えば、それらの組成物は、代表的に、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含有する）。そのような成分の徹底的な考察は、参考文献１３７において入手可能である。
【０１１７】
上記組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは実質的に水銀物質を含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）（例えば、チオメルサールを含まない）べき［１４、１３８］であることが、好ましい。水銀を含まないワクチンが、より好ましい。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
【０１１８】
張度を制御するために、生理的塩（例えば、ナトリウム塩）を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、その塩化ナトリウムは、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、二水素リン酸カリウム、無水二ナトリウムリン酸塩、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１１９】
組成物は、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となる。浸透圧モル濃度は、ワクチン接種により引き起こされる痛みに対して影響を有しないことが以前に報告されている［１３９］が、この範囲に浸透圧モル濃度を維持することが、やはり好ましい。
【０１２０】
組成物は、１つ以上の緩衝剤を含有し得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤。緩衝剤は、代表的に５〜２０ｍＭの範囲で含有される。
【０１２１】
組成物のｐＨは、一般に、５．０と８．１との間、より代表的には６．０と８．０との間、例えば、６．５と７．５との間、または７．０と７．８との間である。したがって、本発明の方法は、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。
【０１２２】
上記組成物は、好ましくは、無菌である。上記組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な測定単位）、そして好ましくは１用量あたり＜０．１ＥＵを含む）。上記組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１２３】
上記組成物は、単回免疫感作のための物質を含んでも、複数回免疫感作（すなわち、「複数回用量」キット）のための物質を含んでもよい。保存剤を含むことが、複数回用量の準備において好ましい。複数回用量組成物中に保存剤を含むことの代わりとして（またはそれに加えて）、その組成物は、物質を除去するための無菌のアダプターを有する容器中に含まれ得る。
【０１２４】
インフルエンザワクチンは、代表的に、約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。
【０１２５】
組成物中の抗原、アジュバントおよび免疫増強物質は、代表的に、混合物中にある。本発明の組成物は、代表的に、水性形態である。
【０１２６】
組成物およびキットは、好ましくは、２℃と８℃との間にて保存される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、直接的な光から免れるべきである。
【０１２７】
（本発明のキット）
上述の通り、本発明の組成物は、送達時において即座に調製され得る。したがって、本発明は、混合のために調整された種々の成分を備えるキットを提供する。上記キットは、上記アジュバントおよび上記抗原が使用時まで別々に保持されることを可能にする。上記免疫増強物質は、これら２つのキット成分の一方に含まれても、第３のキット成分の部分であってもよい。
【０１２８】
上記成分は、上記キット内で、互いから物理的に分離した形態であり、そしてこの分離は、種々の手段で達成され得る。例えば、上記成分は、分離したバイアルなどの容器中にあり得る。次いで、上記２つのバイアルの内容物は、例えば、一方のバイアルの内容物を取り出し、そしてそれらを他方のバイアルに添加すること、または両方のバイアルの内容物を別々に取り出し、そしてそれらを第３の容器中で混合することによって混合され得る。
【０１２９】
好ましい構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において、キット成分のうちの一方は、注射器中にあり、そして他方は、バイアルなどの容器中にある。注射器（例えば、針を有する）が、その成分を混合のための第２の容器中に挿入するために使用され得、次いでその混合物は、その注射器中に引かれ得る。次いで、その注射器の混合された内容物は、代表的に、新規の滅菌針を通して患者に投与され得る。注射器中に１つの成分を包装することは、患者への投与のために別個の注射器を使用する必要性を排除する。
【０１３０】
別の好ましい構成において、上記２つのキット成分は、同じ注射器（例えば、二重室注射器（ｄｕａｌ−ｃｈａｍｂｅｒ ｓｙｒｉｎｇｅ）（例えば、参考文献１４０〜１４７などに開示されるもの））において、一緒であるが分離して保持される。その注射器が、作動される場合（例えば、患者に対する投与の間）、その２つの室の内容物は、混合される。この構成は、使用時における別個の混合工程に対する必要性を回避する。
【０１３１】
種々のキット成分の内容は、一般には全て、水性形態にある。いくつかの構成において、一方の成分（代表的に、アジュバント成分よりもむしろ抗原成分）は、乾燥形態（例えば、凍結乾燥された形態）であり、他方の成分は、水性形態である。上記２つの成分は、上記乾燥成分を再活性化し、そして患者に対する投与のための水性組成物を得るために混合され得る。凍結乾燥された成分は、代表的に、注射器よりもむしろバイアル内におかれる。乾燥された成分は、安定剤（例えば、乳糖、ショ糖またはマンニトール、およびそれらの混合物（例えば、乳糖／ショ糖混合物、ショ糖／マンニトール混合物）など）を含み得る。１つの可能な構成は、予め充填された注射器中の水性アジュバント成分およびバイアル中の凍結乾燥された抗原成分を使用する。
【０１３２】
（組成物またはキット成分の包装）
本発明の組成物（またはキット成分）に適した容器としては、バイアル、注射器（例えば、使い捨て可能な注射器）、点鼻スプレーなどが挙げられる。これらの容器は、無菌であるべきである。
【０１３３】
組成物／成分が、バイアル中におかれる場合、そのバイアルは、好ましくは、ガラス材料またはプラスチック材料から作製される。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物がそのバイアルに添加される前に滅菌される。ラテックス感受性患者に関する懸案事項を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーによって密封され、そして全ての包装用物質中にラテックスが存在しないことが、好ましい。上記バイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそのバイアルは、１つよりも多い用量（例えば１０用量）を含み得る（「複数回用量」バイアル）。好ましいバイアルは、無色のガラスから作製される。
【０１３４】
バイアルは、予め充填された注射器がそのキャップ中に挿入され得るように適合したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得、その注射器の内容物は、（例えば、その中の凍結乾燥された物質を再構成するために）そのバイアル中に排出され得、そしてそのバイアルの内容物は、その注射器中に戻され得る。上記バイアルから上記注射器を取り外した後、次いで針が、接続され得、そして組成物が、患者に投与され得る。上記キャップが、好ましくは、シールまたはカバーの内側に配置されて、そのシールまたはカバーは、そのキャップが接触され得る前に取り外される必要がある。バイアルは、特に、複数回用量バイアルに関して、その内容物の無菌的な取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【０１３５】
成分が、注射器中に包装される場合、その注射器は、それに接続された針を有し得る。針が接続されない場合、別個の針が、組み立ておよび使用のために注射器とともに提供され得る。そのような針は、シースで覆う（ｓｈｅａｔｈｅ）ことができる。安全針が、好ましい。１インチ２３ゲージの針、１インチ２５ゲージの針および５／８インチ２５ゲージの針が、代表的である。注射器には、その上に内容物のロット番号、インフルエンザの時期および使用期限日がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。上記注射器中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に外れることを防ぐ。上記注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨て可能な注射器は、単回用量のワクチンを含む。上記注射器は、一般に、針の接続前に先端を密封するために先端キャップを有し、そしてその先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製される。上記注射器と針とが別個に包装される場合、その針は、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。好ましい注射器は、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭで市販されるものである。
【０１３６】
容器は、半用量の容量を示して、例えば、小児に対する送達を容易にするために、標識され得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含む注射器は、０．２５ｍｌ容量を示す標識を有し得る。
【０１３７】
ガラス容器（例えば、注射器またはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラス製の容器よりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。
【０１３８】
キットまたは組成物は、上記ワクチンの詳細（例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細など）を含む印刷物と一緒に（例えば、同じ箱中に）含まれ得る。その指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の場合、直ちに利用できるようにアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【０１３９】
（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、そして本発明は、患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
【０１４０】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明のキットまたは組成物を提供する。
【０１４１】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；および（ｉｉｉ）免疫増強物質を提供する。
【０１４２】
これらの方法および使用によって惹起された免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的な抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野において周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体力価が防御と相関することを示している（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集−抑制力価は、同種のウイルスによる感染に対する約５０％の防御を与える）［１４８］。抗体応答は、代表的に、赤血球凝集抑制、マイクロ中和、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）、および／または単純放射溶血（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は、当該分野において周知である。
【０１４３】
本発明の組成物は、種々の手段で投与され得る。最も好ましい免疫感作経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚）によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻腔内［１４９〜１５１］、経口［１５２］、皮内［１５３、１５４］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［１５５］などが挙げられる。
【０１４４】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、最近、小児および成人の免疫感作における６月齢からの使用について推奨される。したがって、上記患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受容するための好ましい患者は、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若年者（例えば５歳以下）、入院患者、医療従事者、国軍および軍人、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、そのワクチンを受容する前の７日間において抗ウイルス化合物（例えば、リン酸オセルタミビルなどのオセルタミビルまたはザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している患者、および海外渡航者である。上記ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているわけではないが、より一般的には集団において使用され得る。流行株に関して、全ての年齢群に対する投与が、好ましい。
【０１４５】
処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫感作スケジュールおよび／または追加免疫感作スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールにおいて、種々の用量は、同じかまたは異なる経路（例えば、非経口によるプライム（ｐｒｉｍｅ）および粘膜によるブースト（ｂｏｏｓｔ）、粘膜によるプライムおよび非経口によるブーストなど）によって与えられ得る。１つより多い用量（代表的に、２用量）の投与は、特に、免疫学的にナイーブな患者において有用である（例えば、以前にインフルエンザワクチンを受容したことがない者のためか、または新規のＨＡサブタイプに対してワクチン接種するため（流行の発生において））。複数回用量は、代表的に、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）の間隔を空けて投与される。
【０１４６】
本発明の好ましい組成物は、効力に関してＣＰＭＰ判定基準の１、２または３を満たす。成人（１８〜６０歳）において、これらの基準は、（１）７０％以上のセロプロテクション（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）４０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２．５倍以上のＧＭＴ増加である。高齢者（＞６０歳）において、これらの判定基準は、（１）６０％以上のセロプロテクション；（２）３０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２倍以上のＧＭＴ増加である。これらの判定基準は、少なくとも５０人の患者による非盲検研究に基づく。
【０１４７】
本発明のワクチンは、他のワクチン（麻疹ワクチン、流行耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合体ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、特に、高齢患者において有用である。
【０１４８】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時（例えば、医療専門家による同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。これらの抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（そのエステル（例えば、エチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）を含む））が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，ホスフェート（１：１）（リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知である）である。
【０１４９】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１５０】
語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１５１】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１５２】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。したがって、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。
【０１５３】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、それらを、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から取得しなければならない。総合的に、動物に由来する材料の完全な非存在下で細胞を培養することが、好ましい。
【０１５４】
化合物が、組成物の部分として投与される場合、その化合物は、代替的に、適切なプロドラッグによって置換され得る。
【０１５５】
細胞基質が、リアソータント手順または逆方向遺伝学手順のために使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ Ｅｕｒ総論（ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈａｐｔｅｒ）５．２．３にあるようなヒトワクチン生産における使用について承認されているものである。
【実施例】
【０１５６】
（本発明を実施するための様式）
インフルエンザウイルス株Ｗｙｏｍｉｎｇ Ｈ３Ｎ２（Ａ）、Ｎｅｗ−Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ｈ１Ｎ１（Ａ）およびＪｉａｎｇｓｕ（Ｂ）を、ＭＤＣＫ細胞において個別に増殖させた。三価表面糖タンパク質ワクチンを、調製し、そしてそれを使用して、１株あたり０．１μｇのＨＡにて０日目および２８日目に免疫ナイーブＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫感作（筋肉内）した。動物を、４２日目に採血し、そして種々の抗体アッセイを、その血液を用いて行った：ＨＩ力価；ＥＬＩＳＡによって測定した抗ＨＡ応答。ＩｇＧ応答を、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａとして分類した。
【０１５７】
以下の３種の不溶性粒子状アジュバントを、試験した：（ｉ）１ｍｇ／ｍｌで使用され、かつ５ｍＭヒスチジン緩衝剤を含む水酸化アルミニウム；（ｉｉ）１ｍｇ／ｍｌで使用され、かつ５ｍＭヒスチジン緩衝剤を含むリン酸カルシウム；または（ｉｉｉ）ポリ（ラクチドｃｏ−グリコリド）５０：５０コポリマー組成物から形成される微粒子（固有粘度０．４（「ＰＬＧ」））。
【０１５８】
以下の２種の免疫増強物質を、試験した：（ａ）ホスホロチオエート骨格を有する免疫刺激性ＣｐＧ ＯＤＮ（１０μｇ／用量）；または（ｂ）Ｒ−８４８。
【０１５９】
したがって、１２の動物群が存在した。
【０１６０】
【化１４】
Ａｌ−Ｈ処方物について、三価抗原を、３μｇ／ｍｌの抗原、５ｍＭのヒスチジン緩衝剤（ｐＨ６．５）および９ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムにおいて、１ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムに対して４℃にて一晩吸着させた。
【０１６１】
Ｃａ−Ｐ処方物について、リン酸カルシウム懸濁物を、粒径を減少させるために２０ｍｍプローブを使用して１５，０００ｒｐｍにて３分間にわたってホモジナイズした。次いで、上記抗原を、１ｍｇ／ｍｌのＣａ−Ｐ、３μｇ／ｍｌの抗原、５ｍＭヒスチジン緩衝剤（ｐＨ６．５）および９ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムにおいて、上記ホモジナイズした懸濁物に対して４℃にて一晩吸着させた。
【０１６２】
ＰＬＧ微粒子を、溶媒蒸発法によって調製した。簡単にいうと、微粒子を、２．５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む塩化メチレン中の１０ｍｌの６％（ｗ／ｖ）ポリマー溶液を、１０ｍｍプローブを使用してホモジナイズすることによって調製した。そうして形成された油中水型エマルションを、次いで、ＤＳＳを含む５０ｍｌの蒸留水に添加し、そしてその混合物を、２０ｍｍプローブを用いて５分間にわたって非常に速い速度にて氷浴中でホモジナイズした。この手順は、水中油中水型エマルションの形成を生じ、その水中油中水型エマルションを、１０００ｒｐｍにて１２時間にわたって室温で撹拌した。上記塩化メチレンを、放置して蒸発させた。得られた微粒子のサイズ分布を、粒径分析器によって決定した。ゼータ電位を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ分析器によって測定した。抗原を、０．０３％（ｗ／ｗ）の負荷（ｌｏａｄ）において、１００ｍｇの空ＰＬＧ微粒子を含む懸濁物を３０μｇの三価インフルエンザ抗原と一緒にインキュベートすることによって吸着させた。濃縮したヒスチジン緩衝溶液を、１０ｍｌの総容量において１０ｍＭの最終濃度（ｐＨ６．２）になるまで添加した。その懸濁物を、実験室のロッカー（ｌａｂ ｒｏｃｋｅｒ）において４℃にて一晩混合した。１ｍＬを、吸着効率の決定のために使用するときに取り出した。３．６μｇの三価抗原を含むアリコートを、小さいガラスバイアル中におき、そして再構成の際に、それぞれ、４．５％および１．５％の最終濃度を達成するマンニトールおよびショ糖と一緒に、−５０℃かつ９０×１０−３ｍＢａｒにて凍結乾燥した。
【０１６３】
上記３種のアジュバントに対するタンパク質吸着の効率を、以下の通りに決定した：ＰＬＧ／ＦＣＣ、Ａｌ−Ｈ／ＦＣＣまたはＣａ−Ｐ／ＦＣＣの１ｍｌアリコートを、一晩のインキュベーション工程の後に取り出した。遠心分離後、上清中に残存する結合していないタンパク質の量を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定した。本質的に、１００μｌの上清を、Ｗａｔｅｒｓ ２６９０／４３２機器を備えたＴＳＫ３０００ＳＷＸＬに注入した。直線の検量線を、三価抗原によって確立し、そしてその上清に存在するタンパク質の量を、算出した。次いで、結合していないタンパク質の総量を、最初に添加したタンパク質の総量から減算し、そしてその差を、実際の負荷効率を算出するために使用した。
【０１６４】
Ａｌ−Ｈ処方物およびＣａ−Ｐ処方物からの抗原抽出のために、アリコートを、１５〜２０分間にわたって５０００ｒｐｍにて遠心分離した。各サンプル由来の上清を、ペレットを乱すことなく除去した。上記抗原を置換するために、脱着緩衝剤（０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４＋０．１５ＭのＥＤＴＡ）を、各ペレットに添加し、そして穏やかに動揺させながら２〜３時間にわたって室温にてインキュベートした。抽出された抗原を、遠心分離によって送達系から分離した。
【０１６５】
ＰＬＧ微粒子からの抗原抽出のために、ＰＢＳを、０．０５％のオクチル−β−グルコシドと一緒に添加し、穏やかな動揺運動のもとで１〜２時間にわたって室温にてインキュベートした。抽出されたＦＣＣ抗原を含む上清を、遠心分離によってペレットから分離した。
【０１６６】
抗原特異的抗体を、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＨＡ特異的ＩｇＧの滴定を、最後の免疫感作の２週間後に、個々の血清に対して行った。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェル平底プレートを、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）中のＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ３またはＢによって０．２μｇ／ウェルで２７〜３０℃にて一晩コーティングした。上記コーティングしたウェルを、３００μｌの３％ ＰＶＰを用いて１時間にわたって室温にてブロックした。そのプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％ ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて洗浄し、軽打（ｔａｐ）し、そして乾燥した。血清サンプルおよび血清標準を、最初に、希釈緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）によって１：５，０００〜１：２０，０００に希釈し、次いで、コーティング−ブロックしたプレートに移し、ここで、サンプルを、同じ緩衝液を用いて３倍に連続希釈した。抗原特異的ＩｇＧを、アルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧで明らかにした。抗体力価を、免疫感作前の血清において得られた平均光学濃度（ＯＤ）の平均＋５×標準偏差（ＳＤ）よりも高いＯＤを与えるＥＬＩＳＡ力価の対数として示した。上記力価を、並行してアッセイした参照血清に関して正規化した。
【０１６７】
抗体をまた、第１の免疫感作の２週間後（ｐｏｓｔ １）および第２の免疫感作の２週間後（ｐｏｓｔ ２）に採取した個々の血清に対してＶ字形状の９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて行った、赤血球凝集抑制アッセイによって決定した。簡単にいうと、２５μＬの２倍に連続希釈したサンプルを、２５μＬの株特異的インフルエンザ抗原（４赤血球凝集単位（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｕｎｉｔ）を含む全ウイルス）と一緒に６０分間にわたって室温にてインキュベートする。成体の雄鶏から得た赤血球の０．５％（ｖ／ｖ）懸濁物を、添加し、そしてその混合物を、さらに６０分間にわたってインキュベートする。反応を、目視検査によって追跡する：赤色の点の形成は、ポジティブな反応（抑制）を示し、そして細胞の拡散した斑は、ネガティブな反応（赤血球凝集）を示す。上記力価は、最後の完全な凝集抑制が生じる血清希釈度として規定される。上記抗体濃度は、上記力価の逆数値に対応する。
【０１６８】
図１〜３は、１２個の群についての抗ＨＡ ＥＬＩＳＡ応答を示す。群１と群４との比較は、水酸化アルミニウムに対するＣｐＧの添加がＨＡ力価を上昇させることを示す。同様に、ＣｐＧは、上記リン酸カルシウムアジュバント（群２および５）および上記ＰＬＧアジュバント（群３および６）に添加した場合、ＨＡ力価を上昇させる。
【０１６９】
図４は、群１〜６についてのＨＩ力価を示す。ＣｐＧの添加は、ＨＩ力価を増強する。
【０１７０】
免疫応答がＴＨ１型のものであるかまたはＴＨ２型のものであるかを見るために、ＨＡ特異的ＩｇＧを、ＩｇＧ１（ＴＨ２）またはＩｇＧ２ａ（ＴＨ１）として細分類した。図５は、この分析の結果を示す。単独の粒子状抗原（群１、２および３）は、ＩｇＧ２ａをほとんど示さない。しかし、ＣｐＧを添加する場合、顕著なＩｇＧ２ａ応答が、見られ（群４、５および６）、ＩｇＧ２ａは、群５（ＣｐＧ＋ＣａＰ）において優勢になった。したがって、上記不溶性粒子状アジュバントに対する免疫増強物質（例えば、ＣｐＧ）の添加は、ＴＨ２型応答からＴＨ１型応答への移行をもたらす。ＴＨ１型応答は、インフルエンザウイルスに対する異種サブタイプ免疫を改良することが報告されている［９］ので、不溶性粒子状アジュバントを含む公知のインフルエンザワクチンは、免疫増強物質の添加によって改良され得る。
【０１７１】
本発明は例示のみによって記載され、そして改変は本発明の範囲および精神の中にあるままでもなされ得ることが、理解される。
【０１７２】
（参考文献（その内容は、本明細書によって参考として援用される））
【０１７３】
【化１５】
【０１７４】
【化１６】
【０１７５】
【化１７−１】
［９０］米国特許第４６８９３３８号、同第４９２９６２４号、同第５２３８９４４号、同第５２６６５７５号、同第５２６８３７６号、同第５３４６９０５号、同第５３５２７８４号、同第５３８９６４０号、同第５３９５９３７号、同第５４８２９３６号、同第５４９４９１６号、同第５５２５６１２号、同第６０８３５０５号、同第６４４０９９２号、同第６６２７６４０号、同第６６５６９３８号、同第６６６０７３５号、同第６６６０７４７号、同第６６６４２６０号、同第６６６４２６４号、同第６６６４２６５号、同第６６６７３１２号、同第６６７０３７２号、同第６６７７３４７号、同第６６７７３４８号、同第６６７７３４９号、同第６６８３０８８号、同第６７０３４０２号、同第６７４３９２０号、同第６８００６２４号、同第６８０９２０３号、同第６８８８０００号および同第６９２４２９３号．
【０１７６】
【化１７−２】
【０１７７】
【化１８】
【技術分野】
【０００１】
明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルス感染を防御するためのアジュバントワクチン（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
ＭＦ５９水中油型エマルションアジュバント［非特許文献１］を使用するＦＬＵＡＤＴＭ製品（Ｃｈｉｒｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）を除いて、インフルエンザワクチンは、現在、一般的使用においてアジュバントを含まない。これらのワクチンは、参考文献２の第１７章および第１８章においてさらに詳細に記載される。それらのワクチンは、生ウイルス（ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ）または不活化ウイルスに基づき、そして不活化ワクチンは、全ウイルス（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）、「スプリット」ウイルス（「ｓｐｌｉｔ」ｖｉｒｕｓ）または精製された表面抗原（赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む）に基づき得る。赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、ＨＡレベルへの参照によって標準化され、そのワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含む。
【０００４】
流行性のインフルエンザ感染において、多数の用量のインフルエンザワクチンが必要とされるが、多大な要求を満たすためにワクチンの供給を増大させることは、困難である。したがって、より多くのワクチン抗原を産生するよりも、１株あたりより低い量の抗原を使用すること、および減少した抗原用量を補うためにアジュバントを使用することが、提案されている。大流行間期に同じアプローチを使用すること（例えば、製造レベルを増大させることなく集団をより広く網羅することを可能にすること）がまた、提案されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｒｅｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００３年、第２１号、ｐ．４２３４−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
不溶性粒子状アジュバント［３］（例えば、アルミニウム塩［４〜７］または微粒子［８］）は、インフルエンザワクチンを改良するために提案されている。これらのアジュバントワクチンは、有用であるが、改良の余地が、存在し続ける。したがって、さらなるアジュバントインフルエンザワクチンおよび改良されたアジュバントインフルエンザワクチン（流行中における使用および大流行の間の使用の両方のため）、ならびにそれらの調製のための方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
不溶性粒子状アジュバントを含むインフルエンザワクチンは、主にＴＨ２応答（ＩｇＧ１）であるＩｇＧ応答を誘発することが見出されている。この応答は、組成物中に免疫増強物質を含むことによってＴＨ１応答（ＩｇＧ２ａ）へと移行され得る。ＴＨ１型応答は、インフルエンザウイルスに対する異種サブタイプ免疫（ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を改良することが報告されている［９］。有利にも、上記免疫増強物質はまた、赤血球凝集力価および抗赤血球凝集素ＥＬＩＳＡ力価の上昇が見出されている。
【０００８】
したがって、本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを含む免疫原性組成物を提供する。
【０００９】
本発明はまた、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法を提供する。
【００１０】
本発明は、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む第１のキット成分；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバントを含む第２のキット成分；とを備えるキットを提供し、（ａ）上記第１の成分または上記第２の成分は、免疫増強物質を含むか、あるいは（ｂ）上記キットは、免疫増強物質を含む第３のキット成分を含むかのいずれかである。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを含む、免疫原性組成物。
（項目２）
前記インフルエンザウイルス抗原は、不活化ウイルスである、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記インフルエンザウイルス抗原は、全ウイルス、スプリットウイルス、または精製された表面抗原を含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記インフルエンザウイルス抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ由来である、項目１〜３のいずれかに記載の組成物。
（項目５）
前記インフルエンザウイルス抗原は、細胞培養物において増殖されたインフルエンザウイルスから調製される、項目１〜４のいずれかに記載の組成物。
（項目６）
前記インフルエンザウイルス抗原は、卵において増殖されたインフルエンザウイルスから調製される、項目１〜５のいずれかに記載の組成物。
（項目７）
前記組成物は、オボアルブミン、オボムコイドおよびニワトリＤＮＡを含まない、項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目８）
前記組成物は、前記細胞培養物の宿主由来の１０ｎｇ未満の細胞ＤＮＡを含む、項目５または項目７に記載の組成物。
（項目９）
前記組成物は、１００ヌクレオチド以上である１０ｎｇ未満のＤＮＡを含む、項目５または項目７に記載の組成物。
（項目１０）
前記組成物は、１ウイルス株あたり０．１μｇと２０μｇとの間の赤血球凝集素を含む、項目１〜９のいずれかに記載の組成物。
（項目１１）
前記不溶性粒子状アジュバントは、アルミニウム塩；カルシウム塩；および微粒子；からなる群より選択される、項目１〜１０のいずれかに記載の組成物。
（項目１２）
前記不溶性粒子状アジュバントは、水酸化アルミニウムを含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記不溶性粒子状アジュバントは、リン酸アルミニウムを含む、項目１１または項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
前記不溶性粒子状アジュバントは、リン酸カルシウムを含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１５）
前記不溶性粒子状アジュバントは、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）から作製された微粒子を含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１６）
前記免疫増強物質は、ヒトＴＬＲ１、ヒトＴＬＲ２、ヒトＴＬＲ３、ヒトＴＬＲ４、ヒトＴＬＲ７、ヒトＴＬＲ８、および／またはヒトＴＬＲ９のうちの１つ以上のアゴニストである、項目１〜１５のいずれかに記載の組成物。
（項目１７）
前記免疫増強物質は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドである、項目１〜１６のいずれかに記載の組成物。
（項目１８）
不溶性粒子状アジュバント；および（ｉｉｉ）免疫増強物質。
（項目１９）
（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；と（ｉｉｉ）免疫増強物質；とを合わせる工程を包含する、免疫原性組成物を調製するための方法。
（項目２０）
（ｉ）インフルエンザウイルス抗原を含む第１のキット成分；と（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバントを含む第２のキット成分；とを備えるキットであって、（ａ）該第１の成分または該第２の成分は、免疫増強物質を含むか、あるいは（ｂ）該キットは、免疫増強物質を含む第３のキット成分を含むかのいずれかである、キット。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、異なる組成物によって免疫感作されたマウスについてのＬｏｇ１０血清抗体力価（ＥＬＩＳＡ）を示す。図１は、Ｈ１Ｎ１を示す。
【図２】図２は、異なる組成物によって免疫感作されたマウスについてのＬｏｇ１０血清抗体力価（ＥＬＩＳＡ）を示す。図２は、Ｈ３Ｎ２を示す。
【図３】図３は、異なる組成物によって免疫感作されたマウスについてのＬｏｇ１０血清抗体力価（ＥＬＩＳＡ）を示す。図３は、インフルエンザＢ型を示す。
【図４】図４は、ＨＩ力価を示す。前景のバーは、群１〜３であり、そして後景のバーは、群４〜６である。
【図５】図５は、ＩｇＧについてのＧＭＴ（ＡＵ／ｍｌ）を示す。各対の左のバーは、ＩｇＧ１を示す；右のバーは、ＩｇＧ２ａを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（インフルエンザウイルス抗原）
本発明の組成物は、インフルエンザウイルス抗原を含む。上記抗原は、代表的に、インフルエンザビリオンから調製されるが、その代わりとして、赤血球凝集素などの抗原が、組換え宿主（例えば、バキュロウイルスベクターを使用した昆虫細胞株）において発現され、そして精製された形態で使用され得る［１０、１１］。しかし、一般に、抗原は、ビリオン由来である。
【００１３】
上記抗原は、生ウイルスの形態、またはより好ましくは、不活化ウイルスの形態をとり得る。ウイルスを不活化するための化学的手段としては、以下の因子の１種以上の有効量による処理が挙げられる：洗浄剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β−プロピオラクトン、またはＵＶ光。不活化のためのさらなる化学的手段としては、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）または任意のその組合せによる処理が挙げられる。ウイルス不活化の他の方法は、当該分野において公知である（例えば、第二級エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはγ線照射など）。ＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ製品は、全ビリオン不活化ワクチンである。
【００１４】
不活化ウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ウイルス、スプリットウイルス、または精製された表面抗原（赤血球凝集素を含み、そして通常は、ノイラミニダーゼをまた含む）を含み得る。
【００１５】
ビリオンは、種々の方法によってウイルス含有流体から回収され得る。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む直線ショ糖勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、必要に応じた希釈後に、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって精製され得る。
【００１６】
スプリットビリオン（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）は、ビリオンを洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）により処理（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）プロセスを含む）してサブビリオン調製物を産生することによって得られる。インフルエンザウイルスを分解する方法は、当該分野において周知である（例えば、参考文献１２〜１７などを参照のこと）。ウイルスの分解は、代表的に、破壊する濃度の分解剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）によって全ウイルスを破壊または断片化する（感染性であっても非感染性であってもよい）ことによって行われる。上記破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化をもたらし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分解剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖（ａｃｙｌ ｓｕｇａｒ）、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド（Ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分解手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの継続的な効果を使用し、そして分解は、（例えば、ショ糖密度勾配溶液における）最初のビリオン精製の間に行われ得る。したがって、分解プロセスは、ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するため）、回収されたビリオンの濃縮（例えば、ＣａＨＰＯ４吸着などの吸着方法を使用する）、非ビリオン材料からの全ビリオン分離、密度勾配遠心分離工程（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどの分解剤を含むショ糖勾配を使用する）において分解剤を使用したビリオンの分解、および所望されない物質を除去するためのその後の濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。スプリットビリオンは、通常、リン酸ナトリウムによって緩衝化された等張塩化ナトリウム溶液に再懸濁され得る。ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ製品、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ製品、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭ製品およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品は、スプリットワクチン（ｓｐｌｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）である。
【００１７】
精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原の赤血球凝集素、および代表的には、ノイラミニダーゼをまた含む。精製された形態でこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ製品、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭ製品およびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品は、サブユニットワクチンである。
【００１８】
インフルエンザ抗原はまた、ビロソームの形態で提供され得る［１８］。
【００１９】
上記インフルエンザウイルスは、弱毒化され得る。上記インフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。上記インフルエンザウイルスは、低温適応性であり得る。これらの３つの可能性は、特に、生ウイルスに適合する。
【００２０】
ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節により変化する。最近の大流行間期において、ワクチンは、代表的に、２種のインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１種のインフルエンザＢ型株を含み、そして三価ワクチンが、代表的である。本発明はまた、（特に、インフルエンザＡ型ウイルスの）Ｈ２サブタイプ株、Ｈ５サブタイプ株、Ｈ７サブタイプ株またはＨ９サブタイプ株などの流行株（すなわちワクチンのレシピエントおよび一般的なヒト集団が免疫学的にナイーブである株）に由来するウイルスを使用し得、そして流行株に対するインフルエンザワクチンは、一価であっても、流行株によって補充された通常の三価ワクチンに基づいてもよい。しかし、季節および上記ワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、赤血球凝集素サブタイプであるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１種以上を防御し得る。本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＡサブタイプであるＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９の１種以上を防御し得る。
【００２１】
上記組成物に通常含まれ得る他の株は、抗ウイルス療法に対して抵抗性（例えば、オセルタミビル［１９］および／またはザナミビルに対して抵抗性）の株であり得、その株は、抵抗性の流行株を含む［２０］。
【００２２】
本発明のアジュバント添加組成物は、流行株に対して免疫感作するために特に有用である。流行の発生を引き起こす可能性をインフルエンザ株に与えるインフルエンザ株の特性は、以下である：（ａ）そのインフルエンザ株が、最近広まっているヒト株における赤血球凝集素と比較して新規の赤血球凝集素（すなわち、１０年以上にわたってヒト集団において顕性でない赤血球凝集素（例えばＨ２））を含むか、またはヒト集団において以前に全く見出されていない（例えば、一般には鳥類集団においてのみ見出されているＨ５、Ｈ６またはＨ９）ことにより、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであること；（ｂ）そのインフルエンザ株が、ヒト集団において水平伝播し得ること；および（ｃ）そのインフルエンザ株が、ヒトに対して病原性であること。Ｈ５型赤血球凝集素を有するウイルスは、流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対する免疫感作のために好ましい。他の可能性のある株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、および任意の他の顕在する潜在的な流行株が挙げられる。Ｈ５サブタイプにおいて、ウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３に分類され得［２１］、クレード１およびクレード３は、特に、関連性がある。
【００２３】
本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含む１種以上（例えば１種、２種、３種、４種またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る。ワクチンが、１種より多い株のインフルエンザを含む場合、それらの異なる株は、代表的に、別個に増殖され、かつそれらのウイルスが回収された後に混合され、そして抗原が、調製される。したがって、本発明のプロセスは、１種より多いインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含み得る。
【００２４】
上記インフルエンザウイルスは、リアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）株であり得、そして逆方向遺伝学技術によって得ることができた。逆方向遺伝学技術［例えば、２２〜２６］は、プラスミドを使用してインビトロで調製される所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを可能にする。代表的に、それは、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターにより、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を発現すること、および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターにより、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現することを含むことで、細胞における両方の型のＤＮＡの発現が、完全なインタクト感染性ビリオンの構築を生じる。上記ＤＮＡは、好ましくは、全ての上記ウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の全てを提供するが、そのＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを使用することもまた、可能である。各ウイルスＲＮＡを産生するために別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が、好ましく［２７〜２９］、そしてこれらの方法はまた、上記ウイルスタンパク質の全てまたはいくつか（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質およびＮＰタンパク質だけ）を発現するためのプラスミドの使用を包含し、１２種のプラスミドが、いくつかの方法において使用される。
【００２５】
必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［３０］は、（ウイルスＲＮＡ合成のための）同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を合わせる。参考文献３０の方法の好ましい局面は、以下を含む：（ａ）単一プラスミド上のＰＢ１ ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２ ｍＲＮＡコード領域およびＰＡ ｍＲＮＡコード領域；および（ｂ）単一プラスミド上の全８種のｖＲＮＡコードセグメント。１つのプラスミド上にＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを含み、そして別のプラスミド上に６種の他のセグメントを含むこともまた、問題を容易にし得る。
【００２６】
上記ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを使用する代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することが、可能である［３１］。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターが、慣用的に使用され得る。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性に起因して、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えばＭＤＣＫ）に関してより慣用的であり得るが、細胞はまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってトランスフェクトされる必要がある。
【００２７】
他の技術において、単一の鋳型に由来して上記ウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために二重のｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用することが、可能である［３２、３３］。
【００２８】
したがって、インフルエンザＡ型ウイルスは、特に、そのウイルスが卵において増殖される場合、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント（代表的に、６セグメントは、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来し、上記ＨＡセグメントおよびＮセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２リアソータント）を含み得る。それはまた、ワクチン調製物のためのリアソータントウイルスを産生するために、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント、または有用な任意の他のウイルス株の１種以上のＲＮＡセグメントを含み得る。代表的に、上記株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１種のＲＮＡセグメントを含むので、本発明は、ヒト同士の伝染が可能である株から防御する。それは、鳥インフルエンザウイルスに由来するＮＳセグメントを含み得る。
【００２９】
上記抗原の供給源として使用されるウイルスは、卵（通常は、ＳＰＦ卵）または細胞培養物のいずれかにおいて増殖され得る。インフルエンザウイルス増殖についての現在の標準的な方法は、有胚の鶏卵を使用し、そのウイルスは、その卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。しかし、さらに最近、ウイルスは、動物細胞培養物において増殖され、そして速さおよび患者のアレルギーの理由に起因して、この増殖方法が、好ましい。卵ベースのウイルス増殖が使用される場合、１種以上のアミノ酸がウイルスと一緒に卵の尿膜の流体中に導入され得る［１５］。
【００３０】
細胞基質は、代表的に、哺乳動物細胞株である。適切な哺乳動物細胞の起源としては、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類細胞（ヒト細胞およびサル細胞を含む）およびイヌ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などのような種々の細胞型が、使用され得る。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣの名前を有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎細胞）である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞株のような腎細胞である。したがって、適切な細胞株としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８；などが挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるために好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる：Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［３４〜３７］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ
ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［３８〜４０］；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［４１］。これらの細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［４２］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［４３］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広範に入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７の種々の異なるＶｅｒｏ細胞を提供し、そしてＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−３４のＭＤＣＫ細胞を提供する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０においてＥＣＡＣＣから入手可能である。あまり好ましくない哺乳動物細胞株の代替物として、ウイルスは、アヒル（例えば、アヒル網膜）または雌鶏（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ））などに由来する細胞株を含む鳥類細胞株［例えば、参考文献４４〜４６］において増殖され得る。例としては、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４に由来するＥＢｘ細胞株［４８］を含む鳥類胚性幹細胞［４４、４７］が挙げられる。
【００３１】
ウイルスが哺乳動物細胞株において増殖された場合、上記組成物は、有益に、卵タンパク質（例えばオボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それによってアレルゲン性を減少させる。
【００３２】
インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞株の派生物もまた、使用され得る。例えば、参考文献３４は、懸濁培養物における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」）を開示する。同様に、参考文献４９は、無血清培養の懸濁物において増殖するＭＤＣＫ由来細胞株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示する。参考文献５０は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ
ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む）を開示する。参考文献５１は、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む）を開示する。任意のこれらのＭＤＣＫ細胞株が、使用され得る。
【００３３】
ウイルスが細胞株において増殖された場合、増殖のための培養物、およびまた、培養を開始するために使用されるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない［５２］（すなわち、それらの培養物および接種物は、これらのウイルスについて試験され、そしてこれらのウイルスによる汚染についてネガティブな結果を得る）。単純ヘルペスウイルスが無いことは、特に好ましい。
【００３４】
ウイルスが細胞株において増殖された場合、上記組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、およびより好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが、存在し得る。一般に、上記宿主細胞ＤＮＡ（それは、本発明の組成物から取り除くことが望ましい）は、１００ｂｐよりも長いＤＮＡである。
【００３５】
残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、現在、生物製剤についての慣用的な管理要件（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）であり、そして当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために使用されるアッセイは、代表的に、確認されたアッセイである［５３、５４］。確認されたアッセイの性能の特徴は、数学的項目および定量可能な項目において記載され得、そしてその考えられる誤差の供給源は、同定されている。上記アッセイは、一般に、正確度、精度、特異性などの特徴について試験された。一旦アッセイが、（例えば、宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量に対して）較正され、そして試験された場合、定量的ＤＮＡ測定は、慣用的に行われ得る。ＤＮＡ定量についての以下の３つの主要な技術が、使用され得る：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション法［５５］；ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭ Ｓｙｓｔｅｍなどのイムノアッセイ法［５６］；および定量的ＰＣＲ［５７］。これらの方法は全て、当業者によく知られているが、各方法の正確な特徴は、目的とする宿主細胞に依存し得る（例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択など）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡについての定量的アッセイであり、そして生物製剤中の混入したＤＮＡのレベルをモニタリングするために使用されている［５６］。代表的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間における反応複合体の配列非特異的形成を包含する。全てのアッセイ成分は、上記製造業者から入手可能である完全なＴｏｔａｌ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに含まれる。種々の商業的な製造業者は、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供する（例えば、ＡｐｐＴｅｃＴＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅＴＭ、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡの混入を測定することについての化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡ ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭシステムとの比較は、参考文献５８に見出され得る。
【００３６】
混入したＤＮＡは、標準的な精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用して、ワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによるヌクレアーゼ処理によって増強され得る。宿主細胞ＤＮＡの混入を減少させるために好都合な方法は、参考文献５９および６０に開示され、その方法は、最初に、ウイルス増殖の間に使用され得るＤＮａｓｅ（例えば、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））を使用し、次いで、ビリオンの破壊の間に使用され得るカチオン性洗浄剤（例えばＣＴＡＢ）を使用する、２工程の処理を含む。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）による処理がまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、そしてまた、有益に、ビリオンを不活化するために使用され得る［６１］。
【００３７】
０．２５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、１５μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、好ましい。０．５ｍｌ容量あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、５０μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、より好ましい。
【００３８】
任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることが、好ましい。
【００３９】
細胞株（例えば、ＭＤＣＫ細胞）における増殖について、ウイルスは、懸濁物における細胞［３４、６２、６３］または付着培養（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）中の細胞において増殖され得る。懸濁培養のための１つの適切なＭＤＣＫ細胞株は、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された）である。代替物として、マイクロキャリア培養（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）が、使用され得る。
【００４０】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、無血清培地および／またはタンパク質を含まない培地において増殖される。培地は、ヒト起源または動物起源の血清に由来する添加物が存在しない本発明の文脈において、無血清培地と称される。タンパク質を含まないことは、上記細胞の増殖がタンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除して生じる培養を意味すると理解されるが、ウイルス増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を必要に応じて含み得る。そのような培養物において増殖する細胞は、細胞自体のタンパク質をもちろん含む。
【００４１】
インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、例えば、ウイルス複製の間に、３７℃未満（例えば、３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）で増殖される［６４］。
【００４２】
培養された細胞においてウイルスを増殖させるための方法は、一般に、その培養された細胞に培養されるべき株を接種する工程、ウイルス増殖（例えば、ウイルス力価または抗原発現によって決定される）のために所望の期間（例えば、接種の２４時間後と１６８時間後との間）にわたって、感染された細胞を培養する工程、および増殖されたウイルスを回収する工程を包含する。上記培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５、より好ましくは、１：５０〜１：１０の細胞比まで、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０によって測定される）を接種される。上記ウイルスは、上記細胞の懸濁物に添加されるか、または上記細胞の単一層に適用され、そしてそのウイルスは、２５℃〜４０℃（好ましくは、２８℃〜３７℃）にて、少なくとも６０分間（しかし通常は、３００分未満（好ましくは、９０分間と２４０分間との間））にわたってその細胞上に吸着される。上記感染された細胞の培養物（例えば、単一層）は、回収される培養上清のウイルス含量を増大させるために、凍結解凍または酵素作用のいずれかによって除去され得る。次いで、上記回収された流体は、凍結されて不活化または保存のいずれかが行われる。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは、０．００２〜５、より好ましくは、０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）にて感染され得る。よりさらに好ましくは、上記細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉにて感染される。感染された細胞は、感染後３０時間〜６０時間で回収され得る。好ましくは、上記細胞は、感染後３４時間〜４８時間で回収される。よりさらに好ましくは、上記細胞は、感染後３８時間〜４０時間で回収される。プロテアーゼ（代表的に、トリプシン）は、一般に、ウイルスの放出を可能にするために細胞培養の間に添加され、そしてそのプロテアーゼは、その培養の間の任意の適切な段階において添加され得る。
【００４３】
赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチン中の主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、代表的に、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定されるようなＨＡレベルを参照することによって標準化される。ワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量がまた、例えば、小児のためかまたは流行性の状況において使用される。１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８のような分割量が、より高い用量（例えば、３×用量または９×用量［６５、６６］）を有する場合に使用されている［６、７］。したがって、ワクチンは、１つのインフルエンザ株あたり０．１μｇと１５０μｇとの間のＨＡ、好ましくは、０．１μｇと５０μｇとの間（例えば、０．１μｇ〜２０μｇ、０．１μｇ〜１５μｇ、０．１μｇ〜１０μｇ、０．１μｇ〜７．５μｇ、０．５μｇ〜５μｇなど）のＨＡを含み得る。特定の用量は、例えば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。これらのより低い用量は、本発明のようにアジュバントがワクチン中に存在する場合、最も有用である。
【００４４】
生ワクチンについて、投薬量は、ＨＡ含量よりもむしろ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって測定され、そして１株あたり１０６と１０８との間（好ましくは、１０６．５〜１０７．５の間）のＴＣＩＤ５０が、代表的である。
【００４５】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルスにおいて見出されるような天然のＨＡであっても、改変されていてもよい。例えば、ウイルスを鳥類種において非常に病原性にする決定因子（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との切断部位周辺の超塩基性領域（ｈｙｐｅｒ−ｂａｓｉｃ ｒｅｇｉｏｎ））を除去するためにＨＡを改変することが、公知である。なぜならば、これらの決定因子は、そうでなければウイルスが卵において増殖されることを妨げ得るからである。
【００４６】
本発明のキットの抗原成分は、特に、スプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンのために、洗浄剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として公知である）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム）を含み得る。上記洗浄剤は、微量でのみ存在し得る。したがって、上記ワクチンは、各々１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール−１０、α−コハク酸水素トコフェロールおよびポリソルベート８０を含み得る。残りの他の微量成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００４７】
不活化されている非全細胞ワクチン（例えば、ウイルス成分ワクチンまたは精製された表面抗原ワクチン）は、この抗原内に位置するさらなるＴ細胞エピトープからの利益を受けるために、マトリックスタンパク質を含み得る。したがって、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む非全細胞ワクチン（特に、スプリットワクチン）は、Ｍ１および／またはＭ２マトリックスタンパク質をさらに含み得る。マトリックスタンパク質が存在する場合、検出可能なレベルのＭ２マトリックスタンパク質を含むことが、好ましい。核タンパク質もまた、存在し得る。
【００４８】
（不溶性粒子状アジュバント）
本発明の組成物およびキットは、不溶性粒子状アジュバントを含む。本発明に有用な適切な不溶性粒子状アジュバントの例としては、アルミニウム塩、カルシウム塩、および微粒子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
上記不溶性粒子状アジュバントは、代表的に、吸着剤として機能して、抗原およびアジュバントが使用される場合に、その抗原（例えば、赤血球凝集素）が、そのアジュバントに吸着される。しかし、微粒子について、その粒子表面上に上記抗原を吸着する代わりとして（または上記抗原を吸着することに加えて）、その抗原をその粒子の内部に封入することが、可能である。
【００５０】
（アルミニウム塩）
適切なアルミニウム塩としては、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知であるアジュバントが挙げられる。これらの名前は、慣習的であるが、便宜上のみに使用され、いずれも存在している実際の化合物の正確な説明でもない［例えば、参考文献６７の第９章を参照のこと］。本発明は、アジュバントとして一般的に使用される任意の「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントを使用し得る。
【００５１】
「水酸化アルミニウム」として公知であるアジュバントは、代表的に、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、それは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得るオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光学によって、特に、１０７０ｃｍ−１における吸収帯および３０９０〜３１００ｃｍ−１における強力なショルダーの存在によって水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３のようなその他のアルミニウム化合物と区別され得る［参考文献６７の第９章］）。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度の程度は、回折バンドの半価幅（ＷＨＨ）に反映され、結晶性の低い粒子は、より小さい結晶サイズに起因して、より大きい線幅拡大を示す。ＷＨＨが増大する場合、表面積は、増大し、そしてより高いＷＨＨ値を有するアジュバントは、抗原吸着についてのより大きい能力を有することが見出されている。繊維状の形態学（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに関して代表的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、代表的に、約１１である（すなわち、そのアジュバント自体は、生理学的ｐＨにて正の表面電荷を有する）。ｐＨ７．４において１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり１．８ｍｇ〜２．６ｍｇの間の吸着力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００５２】
「リン酸アルミニウム」として公知であるアジュバントは、代表的に、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、それはまた、しばしば少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウムサルフェート）を含む。それらのアジュバントは、沈殿によって得られ得、そして沈殿の間の反応条件および濃度は、上記塩におけるヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に影響を及ぼす。ヒドロキシリン酸塩は、一般に、０．３と１．２との間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、厳密なＡｌＰＯ４からヒドロキシル基の存在によって区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃まで加熱される場合）は、構造的なヒドロキシルの存在を示す［参考文献６７の第９章］。
【００５３】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に、０．３と１．２との間、好ましくは、０．８と１．２との間、そしてより好ましくは、０．９５±０．１である。上記リン酸アルミニウムは、一般に、特にヒドロキシリン酸塩については特に非晶質である。代表的なアジュバントは、０．８４と０．９２との間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムであり、１ｍｌあたり０．６ｍｇのＡｌ３＋で含む。上記リン酸アルミニウムは、一般に、粒子状（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られるような板状の形態学）である。その粒子の代表的な直径は、任意の抗原吸着の後において０．５μｍ〜２０μｍ（例えば、約５μｍ〜１０μｍ）の範囲である。ｐＨ７．４において１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり０．７ｍｇ〜１．５ｍｇの間のタンパク質を吸着する能力が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００５４】
リン酸アルミニウムの荷電ゼロ点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルに対するリン酸の置換の程度に逆に相関し、そしてこの置換の程度は、沈殿によって上記塩を調製するために使用される反応条件および濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度（より多いリン酸塩＝より酸性のＰＺＣ）を変化させること、またはヒスチジン緩衝剤（ＰＺＣをより塩基性にする）などの緩衝剤を添加することによって変えられる。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０と７．０との間、より好ましくは５．０と６．５との間（例えば、約５．７）のＰＺＣを有する。
【００５５】
本発明で使用されるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤またはヒスチジン緩衝剤またはＴｒｉｓ緩衝剤）を含み得るが、これは、常に必要であるとは限らない。上記懸濁物は、好ましくは、無菌であり、かつ発熱物質を含まない。懸濁物は、例えば、１．０ｍＭと２０ｍＭとの間、好ましくは５ｍＭと１５ｍＭとの間、そしてより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する、遊離型の水性リン酸イオンを含み得る。上記懸濁物はまた、塩化ナトリウムを含み得る。
【００５６】
本発明の１つの実施形態において、上記アジュバントは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を含む［６］。この場合において、水酸化アルミニウムよりも多いリン酸アルミニウム（例えば、少なくとも２：１（例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１など）の重量比）が、存在し得る。
【００５７】
患者に対する投与のための組成物におけるＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満（例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなど）である。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌとの間である。０．８５ｍｇ／用量未満の最大量が、好ましい。
【００５８】
（カルシウム塩）
種々のカルシウム塩のうち、一般に、リン酸カルシウムのみが、アジュバントとして使用される。リン酸カルシウムの種々のアジュバント形態が、報告されており、そして任意のこれらの形態が、本発明によって使用され得る：
水和リン酸カルシウムゲルアジュバントは、Ｓｕｐｅｒｆｏｓ（Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手可能である。
【００５９】
参考文献６７の第８章は、１９９５年にリン酸カルシウムアジュバントを概説した。抗原は、その抗原の存在下における塩のその場での沈殿（ｉｎ ｓｉｔｕ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）または予め形成された塩への吸着のいずれかによって、リン酸カルシウムに吸着され得る。予め形成されたリン酸カルシウムゲルの商業的供給源は、言及される。詳細は、吸着力を含む上記アジュバントの物理化学的特徴に対する沈殿条件の効果について与えられる。
【００６０】
参考文献６８は、種々のリン酸カルシウムアジュバントの構造特性および吸着特性について報告する。厳密なＣａ３（ＰＯ４）２であるよりもむしろ、上記アジュバントは、式Ｃａ１０−ｘ（ＨＰＯ４）ｘ（ＰＯ４）６−ｘ（ＯＨ）２−ｘの非化学量論的なヒドロキシアパタイト、および５．５の荷電ゼロ点（ＰＺＣ）を有するｐＨ依存性の表面荷電であることが報告された。上記アジュバントは、約１０ｎｍ×１５０ｎｍの寸法を有する針様粒子、および約２０〜３０ｎｍの直径を有する不規則に成形された板（ｐｌａｔｅ）を形成し得る。
【００６１】
参考文献６９は、空の反応部位を含む反応性の非晶質リン酸カルシウムを開示し、その反応部位は、非晶質炭酸・リン酸カルシウムの炭酸プレ成分（ｐｒｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を、そのプレ成分の気体または蒸気の副産物への熱分解によって除去することによって得られた。
【００６２】
参考文献７０および７１は、粒子状リン酸カルシウムアジュバント（「ＣＡＰ」）を開示し、その粒子は、３００〜４０００ｎｍの範囲の直径（ナノ粒子）を有し、そして球形状および平滑面を有する。参考文献７２は、これらの粒子が粘膜免疫感作のために使用され得ることを開示する。
【００６３】
粘膜免疫感作はまた、参考文献７３に開示され、ＩｇＡ抗体応答をもたらすために哺乳動物にワクチン接種するための方法は、上皮を横切る輸送に適したサイズの粒子状炭酸・リン酸カルシウムを使用する。
【００６４】
参考文献７４は、インビボで可溶性である複合粒子を開示し、そしてその複合粒子は、その表面上にコーティングされた約１．０〜２．０のＣａ／Ｐ比を有するリン酸カルシウム化合物を有するポリマー物質の粒子を含む。
【００６５】
参考文献７５は、ワクチンを吸着するためのリン酸カルシウムの注射可能な水性ゲルを開示し、Ｃａ／Ｐの重量比が１．６２〜１．８５であり、かつ１リットルあたり０．０７個のＣａ原子を含む場合にそのゲルの沈殿時間が１０分間で２０℃にて１〜２０ｍｍの間であるような割合で、カルシウムイオンおよびリン酸イオンが、合わせられる。
【００６６】
リン酸カルシウムアジュバントのＣａ対Ｐのモル比は、例えば、１．３５と１．８３との間で変動し得る［参考文献６７の第８章を参照のこと］。上記アジュバントの吸着特性は、沈殿の間に使用される条件に依存して変動することが見出されている（例えば、緩徐な混合は、迅速な混合によって形成されたアジュバントよりも低い吸着力を有するアジュバントを与えた）。
【００６７】
Ｃａ＋＋として測定される本発明のワクチン中のリン酸カルシウムの量は、０．１ｍｇ／ｍｌと１０ｍｇ／ｍｌとの間（例えば、０．５〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．７５〜３ｍｇ／ｍｌ、０．９〜１．５ｍｇ／ｍｌまたは約１ｍｇ／ｍｌ）であり得る。
【００６８】
上記リン酸カルシウムアジュバントは、抗原を吸着する能力を有する。所与の抗原について、その抗原の総量の少なくとも８０重量％（例えば、８５重量％以上、９０重量％以上、９２．５重量％以上、９５重量％以上、９７．５重量％以上、９７．５重量％以上、９８重量％以上、９９重量％以上、９９．５重量％以上など）が、吸着される。リン酸カルシウムアジュバントが不溶性である場合、吸着の程度は、従来通り、遠心分離を含む方法、およびその後の、固体物質または可溶性物質の一方（または両方）である抗原の量の決定によって測定され得る。吸着されていない抗原は、遠心分離後に溶液のままである。例えば、リン酸カルシウムアジュバントの吸着力は、参考文献７６において、この方法によって測定された。１ｍｇのＣａ＋＋に対するジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドの吸着は、（ａ）ジフテリアトキソイドレベルが１００Ｌｆを上回って上昇した場合、および（ｂ）破傷風トキソイドレベルが２５Ｌｆを上回って上昇した場合に、不完全であった。
【００６９】
吸着についてリン酸カルシウムアジュバントは、好ましくは、インフルエンザ抗原が添加される水性懸濁物の形態で使用される。上記カルシウム塩は、上記抗原を添加する前に、必要とされる濃度まで希釈され得る。
【００７０】
（微粒子）
微粒子は、アジュバントとして使用するために所望されている（例えば、参考文献７７および７８を参照のこと）。
【００７１】
好ましい微粒子は、生分解性でありかつ非毒性のポリマーから作製される。例えば、それらは、以下からなる群より選択されるポリマーから作製され得る：ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、およびポリシアノアクリレート。これらのポリマーのコポリマー（例えば、すなわち、Ｄ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマー）もまた、使用され得る。
【００７２】
好ましいポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、より好ましくはポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）からなる群より選択されるものである。最も好ましいポリマーは、「ＰＬＧ」と称されるポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーである。好ましいポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーは、２５：７５〜７５：２５の範囲、より好ましくは、４０：６０〜６０：４０（例えば、約５０：５０）の範囲のラクチド／グリコリドモル比を有するものである。５０％のＤ，Ｌ−ラクチドおよび５０％のグリコリドを含む５０：５０のＰＬＧポリマーは、迅速に再吸収するコポリマーを提供するが、７５：２５のＰＬＧは、よりゆっくりと分解し、そして８５：１５および９０：１０は、増大したラクチド成分に起因して、よりさらにゆっくりと分解する。
【００７３】
これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能であり、そして所与の抗原に関して適切な分子量は、当業者によって容易に決定される。ポリラクチドについて、例えば、適切な分子量は、約２０００〜５０００のオーダーである。ＰＬＧについて、適切な分子量は、一般に、約１０，０００〜約２００，０００の範囲、好ましくは、約１５，０００〜約１５０，０００の範囲、そして最も好ましくは、約５０，０００〜約１００，０００の範囲である。有用な範囲は、３０，０００ダルトン〜７０，０００ダルトンである。
【００７４】
微粒子は、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの範囲の直径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍの範囲の直径、そして最も好ましくは約５００ｎｍ〜約１０μｍの範囲の直径を有し得る。それらの微粒子は、代表的に、実質的に球状である。
【００７５】
微粒子は、種々の方法で作製され得る。例えば、二重エマルション／溶媒蒸発（ｄｏｕｂｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ／ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）技術が、公知であり、その技術は、ポリマー溶液の小滴からなる一次エマルションの形成を包含し、その一次エマルションは、次いで粒子安定剤／界面活性剤を含む連続した水相と混合される。より具体的には、水中油中水型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒蒸発系が、参考文献７９に記載されるように、上記微粒子を形成するために使用され得る。この技術において、特定のポリマーは、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、ジメチルクロリド（塩化メチレンおよびジクロロメタンとも称される）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなど）と合わせられる。上記ポリマーは、有機溶媒中の約２〜１５％溶液、より好ましくは、約４〜１０％溶液、そして最も好ましくは、６％溶液で提供される。上記ポリマー溶液は、例えば、ホモジナイザーを使用して乳化される。次いで、上記エマルションは、エマルション安定剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはポリビニルピロリドン）のより大きい容量の水溶液と合わせられる。上記エマルション安定剤は、代表的に、約２〜１５％溶液、より代表的に、約４〜１０％溶液で提供される。次いで、その混合物は、安定なｗ／ｏ／ｗ二重エマルションを産生するためにホモジナイズされる。次いで、有機溶媒は、蒸発される。処方パラメータは、小さい（＜５μｍ）微粒子および大きい（＞３０μｍ）微粒子の調製を可能にするために操作され得る。例えば、撹拌の減少は、内相の容量の増加をもたらすような、より大きい微粒子を生じる。粒径は、慣用的な方法によって決定され得る。
【００７６】
二重エマルション技術を使用することと同様に、一重エマルション（ｓｉｎｇｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）技術もまた、使用され得る。微粒子はまた、噴霧乾燥およびコアセルベーションを使用して形成されても、気中懸濁被覆技術（例えば、パンコーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティング）によって形成されてもよい。イオンゲル化（ｉｏｎｉｃ ｇｅｌａｔｉｏｎ）もまた、使用され得る。
【００７７】
調製の後、微粒子は、それらが、すなわち、さらなる使用のために凍結乾燥され得るように、保存され得る。
【００７８】
調製された微粒子上に抗原を吸着させるための１つの方法は、以下の通りである。微粒子は、再度水和され、そして透析可能な洗浄剤を使用して微粒子の本質的に単一の懸濁物へと分散される。有用な洗浄剤としては、任意の種々のＮ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡとして公知である）（例えば、ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−７）、オクタノイル−Ｎメチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、およびデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０））；コール酸；コール酸ナトリウム；デオキシコール酸；デオキシコール酸ナトリウム；タウロコール酸；タウロコール酸ナトリウム；タウロデオキシコール酸；タウロデオキシコール酸ナトリウム；３［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−サルフェート（ＣＨＡＰＳ）；３−［（３ コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン−サルフェート（ＣＨＡＰＳＯ）；Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオール（ａｍｍｏｎｉｏｌ）−プロパン−サルフェート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ ３−１２）；Ｎ，Ｎ−ビス−（３−Ｄグルコンアミドプロピル（Ｄｇｌｕｃｏｎｅａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））−デオキシコールアミド（ＤＥＯＸＹ−ＢＩＧＣＨＡＰ）；Ｎオクチルグルコシド（Ｎｏｃｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）；モノラウリル酸スクロース；グリココール酸／グリココール酸ナトリウム；ラウロサルコシン（ナトリウム塩）；グリコデオキシコール酸／グリコデオキシコール酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、洗浄剤 対 微粒子の約０．０１５６：１の比（ｗ：ｗ）、が使用され、より好ましくは、約０．６２５：１の比、よりさらに好ましくは、約０．２５：１の比、そして最も好ましくは、約１：１〜２：１の比（洗浄剤 対 微粒子（ｗ：ｗ））が使用される。
【００７９】
次いで、上記微粒子／洗浄剤混合物は、例えば、セラミック製の乳鉢および乳棒を使用して、滑らかなスラリーが形成されるまで、物理的にすり砕かれる。次いで、適切な水性緩衝剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）が、添加され、そして得られた混合物は、上記微粒子が十分に懸濁されるまで、超音波処理またはホモジナイズされる。次いで、目的の抗原が、上記微粒子懸濁物に添加され、そしてその系は、洗浄剤を除去するために透析される。上記ポリマー微粒子および洗浄剤系は、好ましくは、目的の抗原がその抗原の活性を依然として維持しつつその微粒子の表面に吸着するように選択される。表面に吸着した抗原を含む得られた微粒子は、結合していない抗原を含まないように洗浄され得、そして以下でさらに記載されるように、適切な緩衝剤処方物中の懸濁物として保存されても、適切な賦形剤と一緒に凍結乾燥されてもよい。
【００８０】
微粒子は、必要に応じて、負に荷電した表面（例えば、ＳＤＳを用いる）または正に荷電した表面（例えば、カチオン性洗浄剤（例えば、ＣＴＡＢ）を用いる）を有するように処理され得る。表面特徴の変化は、吸着される抗原に従う吸着特徴を変化させ得る。
【００８１】
（免疫増強物質）
本発明の組成物は、免疫増強物質を含み、そして免疫増強物質と不溶性粒子状アジュバントとの組合せは驚くほど有効な免疫原性組成物を与えることが、見出されている。
【００８２】
好ましい免疫増強物質は、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のアゴニストである。例えば、それらは、ヒトＴＬＲ１タンパク質、ヒトＴＬＲ２タンパク質、ヒトＴＬＲ３タンパク質、ヒトＴＬＲ４タンパク質、ヒトＴＬＲ７タンパク質、ヒトＴＬＲ８タンパク質、および／またはヒトＴＬＲ９タンパク質のうちの１つ以上のアゴニストであり得る。好ましい薬剤は、ＴＬＲ７のアゴニスト（例えば、イミダゾキノリン（ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｉｌｏｎｅ））および／またはより好ましくは、ＴＬＲ９のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）である。これらの免疫増強物質は、先天免疫経路を活性化するために有用である。
【００８３】
代表的な免疫増強物質は、有機化合物であり、そしてそれらは、通常、ポリマーではない。それらは、２ｋＤａ未満（例えば、１８００Ｄａ未満、１６００Ｄａ未満、１４００Ｄａ未満、１２００Ｄａ未満、１０００Ｄａ未満、８００Ｄａ未満、６００Ｄａ未満、５００Ｄａ未満、４００Ｄａ未満、３００Ｄａ未満、または２００Ｄａ未満）の分子量を有し得る。
【００８４】
適切な免疫増強物質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
−免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに結合された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）または二本鎖ＲＮＡを含むもの、あるいはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチド）。
−３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「ＭＰＬＴＭ」としても公知である「３ｄＭＰＬ」）［８０〜８３］。
−イミダゾキノリン化合物（例えば、イミキモッド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ８３７」）［８４、８５］、レシキモッド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）［８６］、およびそれらのアナログ；ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献８７〜９１に見出され得る。
−チオセミカルバゾン化合物（例えば、参考文献９２に開示されるもの）。活性化合物についての処方、製造、およびスクリーニングの方法はまた、参考文献９２に記載される。−トリプタントリン化合物（例えば、参考文献９３に開示されるもの）。活性化合物についての処方、製造、およびスクリーニングの方法はまた、参考文献９３に記載される。
−（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【００８５】
【化１】
などのヌクレオシドアナログ、およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献９４〜９６に開示される化合物；（ｆ）式：
【００８６】
【化２】
を有する化合物（ここで、
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルであり；
Ｒ３は、存在しないか、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキルであるか、または一緒に結合されてＲ４−５：
【００８７】
【化３】
のような５員環を形成し、この結合は、
【００８８】
【化４】
によって示される結合において達成され、Ｘ１およびＸ２は、各々独立して、Ｎ、Ｃ、Ｏ、またはＳであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルまたはＲ９ａであり、Ｒ９ａは、
【００８９】
【化５】
であり、この結合は、
【００９０】
【化６】
によって示される結合において達成され；
Ｒ１０およびＲ１１は、各々独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、または−ＯＨであり；
各々のＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールであり；
各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１−６アルキル、または置換Ｃ１−６アルキルであり；
各Ｒｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換Ｃ１−６アルキル）２、Ｃ６−Ｉ０アリール、またはヘテロシクリルであり；
各Ｒｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換Ｃ６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
各Ｒｆは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートであり；
各ｎは、独立して、０、１、２、または３であり；
各ｐは、独立して、０、１、または２である）；あるいは（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に受容可能な塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体、またはその互変異性体の薬学的に受容可能な塩。
−ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）［９７］。
−ポリオキシドニウム（ｐｏｌｙｏｘｉｄｏｎｉｕｍ）ポリマー［９８、９９］または他のＮ−酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
−参考文献１００に開示される化合物。
−参考文献１０１に規定されるような、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ：
【００９１】
【化７】
の化合物、あるいはその塩、例えば、「ＥＲ ８０３０５８」、「ＥＲ ８０３７３２」、「ＥＲ ８０４０５３」、「ＥＲ ８０４０５８」、「ＥＲ ８０４０５９」、「ＥＲ
８０４４４２」、「ＥＲ ８０４６８０」、「ＥＲ ８０４７６４」、「ＥＲ ８０４０５７」（以下に示される構造）：
【００９２】
【化８】
またはＥＲ−８０３０２２（以下に示される構造）：
【００９３】
【化９】
−アミノアルキルグルコサミニドグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９［１０２、１０３］）。
−例えば、参考文献１０４および１０５に記載されるようなポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ））ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）などのホスファゼン。
−ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１０６、１０７］：
【００９４】
【化１０】
などの、ホスフェート含有非環式骨格に結合された脂質を含む化合物。
−ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ）プロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、または「ＴｈｅｒａｍｉｄｅＴＭ」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）。
−参考文献１０８に開示される化合物（アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンゾイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１０９、１１０］、ヒドラフタラミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１１１］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン（Ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物、およびベンザゾール（Ｂｅｎｚａｚｏｌｅ）化合物［１１２］を含む）。
−メチルイノシン５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」）［１１３］。
−式：
【００９５】
【化１１】
を有するもの（Ｒは、水素、直鎖または分枝鎖であり、非置換または置換であり、不飽和または飽和である、アシル基、アルキル基（例えば、シクロアルキル基）、アルケニル基、アルキニル基およびアリール基、あるいはそれらの薬学的に受容可能な塩または誘導体からなる群より選択される）などのポリヒドロキシル化ピロリジン化合物［１１４］。例としては、カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２５４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール；
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチルアセテート；
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン；
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール；
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール；
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
などの低分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）。
【００９６】
上記免疫増強物質は、上記組成物に、その産生の間の種々の段階において添加され得る。例えば、上記免疫増強物質は、抗原組成物内にあり得、次いで、この混合物は、不溶性粒子状アジュバントに添加され得る。その代わりとして、上記免疫増強物質は、不溶性粒子状アジュバントと混合され得、次いで、この混合物は、上記抗原と混合され得る。
【００９７】
上記免疫増強物質は、抗原などの別個の因子に結合体化され得る（例えば、ＣＲＭ１９７）。低分子に対する結合体化技術の総説は、参考文献１１５に提供される。その代わりとして、上記免疫増強物質は、疎水性相互作用またはイオン性相互作用などによってさらなる因子と非共有結合され得る。
【００９８】
２つの好ましい免疫増強物質は、（ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド、および（ｂ）３ｄＭＰＬである。
【００９９】
（免疫刺激性オリゴヌクレオチド）
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド改変／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変）を含み得、そして二本鎖であっても（ｄｓＲＮＡを除いて）一本鎖であってもよい。参考文献１１６、１１７および１１８は、可能なアナログ置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによるグアノシンの置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１１９〜１２４においてさらに考察される。上記ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に関し得る（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）［１２５］。上記ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導について特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド））か、またはその配列は、Ｂ細胞応答の誘導について、より特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１２６〜１２８において考察される。好ましくは、上記ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、上記ＣｐＧ オリゴヌクレオチドは、その５’末端がレセプター認識を達成可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成するようにそれらの３’末端において結合され得る。例えば、参考文献１２５および参考文献１２９〜１３１を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントは、ＰｒｏＭｕｎｅＴＭ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知であるＣｐＧ７９０９である。
【０１００】
ＣｐＧ配列を使用する代わりか、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列が、使用され得る［１３２］。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【０１０１】
上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンが豊富であり得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献１３２に開示されるようなＴＴＴＴ）を含み得るか、そして／または免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のチミジンを含むヌクレオチド組成を有し得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したシトシンヌクレオチド（例えば、参考文献１３２に開示されるようなＣＣＣＣ）を含み得るか、そして／またはその免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のシトシンを含むヌクレオチド組成を有し得る。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【０１０２】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、代表的に、少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。それらは、１００個よりも少ないヌクレオチドを含み得る。
【０１０３】
（３ｄＭＰＬ）
３ｄＭＰＬ（３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしても公知である）は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されるアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）変異体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そして数種のサイトカインの放出を刺激する。３ｄＭＰＬの調製は、最初に、参考文献１３３に記載された。
【０１０４】
３ｄＭＰＬとアルミニウム塩との組合せは、既に公知である（例えば、リン酸アルミニウムとの組合せ［１３４］、または水酸化アルミニウムとの組合せ［１３５］）。
【０１０５】
３ｄＭＰＬは、それらのアシル化によって変動する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５または６のアシル鎖を有する）関連分子の混合物の形態をとり得る。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知の）単糖は、それらの２位の炭素（すなわち、２位および２’位）でＮ−アシル化され、そしてまた３’位でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は以下：
【０１０６】
【化１２】
である。
【０１０７】
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは、８〜１６の間であり、より好ましくは、９〜１２の間であり、そして最も好ましくは、１０である。
【０１０８】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、各々独立して、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４；であり得、ここでＲ４は−Ｈまたは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずれかであり、ここでｍの値は、好ましくは、８〜１６の間であり、そしてより好ましくは、１０、１２または１４である。２位では、ｍは、好ましくは、１４である。２’位では、ｍは、好ましくは、１０である。３’位では、ｍは、好ましくは、１２である。したがって、基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。
【０１０９】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のすべてが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは３つのアシル鎖のみを有する（２位、２’位および３’位の各々に１つ）。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち２つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうち１つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のいずれもが−Ｈではない場合、上記３ｄＭＰＬは、６つのアシル鎖を有し得る。本発明に従って用いられる３ｄＭＰＬアジュバントは、３〜６つのアシル鎖を備えたこれらの形態の混合物であり得るが、この混合物中に６つのアシル鎖をもつ３ｄＭＰＬを含むことが好ましく、そして特に６つのアシル鎖形態が総３ｄＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、２０重量％以上、３０重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上またはさらに多くを占めることが好ましい。６つのアシル鎖を備えた３ｄＭＰＬは、最もアジュバント活性な形態であることが見出された。
【０１１０】
従って、本発明の組成物に含めるために３ｄＭＰＬの最も好ましい形態は、
【０１１１】
【化１３】
である。
【０１１２】
３ｄＭＰＬが混合物の形態で使用される場合、本発明の組成物中の３ｄＭＰＬの量または濃度に関する言及は、混合物中の合わせた３ｄＭＰＬ種をいう。
【０１１３】
水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズを備えた（例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを備えた）ミセル凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方は、本発明とともに使用され得、そしてより良好な粒子が通常のアッセイによって選択され得る。より小さな粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁物を与えるに十分小さい）が、より優れた活性［１３６］に起因して、本発明に従う使用に好ましい。好ましい粒子は、２２０ｎｍより小さいか、より好ましくは２００ｎｍより小さいか、１５０ｎｍより小さいか、あるいは１２０ｎｍより小さい平均直径を有し、１００ｎｍより小さい平均直径を有しさえし得る。しかしながら、大部分の場合において、この平均直径は、５０ｎｍより小さくはない。これらの粒子は、濾過滅菌に適するほどに十分小さい。粒子直径は、通常の動的光散乱法の技法によって評価され得、平均粒子直径が明らかとなる。粒子がｘｎｍの直径を有するといわれる場合、一般的にはおおよそこの平均の粒子の分布が存在するが、粒子の数で少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれより多く）がｘ±２５％の範囲内の直径を有する。
【０１１４】
実質的に全ての３ｄＭＰＬは、好ましくは、上記エマルションの水相に位置する。
【０１１５】
ワクチン中の３ｄＭＰＬの代表的な量は、１０〜１００μｇ／用量（例えば、約２５μｇまたは約５０μｇ）である。
【０１１６】
（薬学的組成物）
本発明の組成物は、薬学的に受容可能である。それらの組成物は、抗原、アジュバントおよび免疫増強物質に加えて、成分を含み得る（例えば、それらの組成物は、代表的に、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含有する）。そのような成分の徹底的な考察は、参考文献１３７において入手可能である。
【０１１７】
上記組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは実質的に水銀物質を含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）（例えば、チオメルサールを含まない）べき［１４、１３８］であることが、好ましい。水銀を含まないワクチンが、より好ましい。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
【０１１８】
張度を制御するために、生理的塩（例えば、ナトリウム塩）を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、その塩化ナトリウムは、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、二水素リン酸カリウム、無水二ナトリウムリン酸塩、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１１９】
組成物は、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となる。浸透圧モル濃度は、ワクチン接種により引き起こされる痛みに対して影響を有しないことが以前に報告されている［１３９］が、この範囲に浸透圧モル濃度を維持することが、やはり好ましい。
【０１２０】
組成物は、１つ以上の緩衝剤を含有し得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤。緩衝剤は、代表的に５〜２０ｍＭの範囲で含有される。
【０１２１】
組成物のｐＨは、一般に、５．０と８．１との間、より代表的には６．０と８．０との間、例えば、６．５と７．５との間、または７．０と７．８との間である。したがって、本発明の方法は、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。
【０１２２】
上記組成物は、好ましくは、無菌である。上記組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な測定単位）、そして好ましくは１用量あたり＜０．１ＥＵを含む）。上記組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。
【０１２３】
上記組成物は、単回免疫感作のための物質を含んでも、複数回免疫感作（すなわち、「複数回用量」キット）のための物質を含んでもよい。保存剤を含むことが、複数回用量の準備において好ましい。複数回用量組成物中に保存剤を含むことの代わりとして（またはそれに加えて）、その組成物は、物質を除去するための無菌のアダプターを有する容器中に含まれ得る。
【０１２４】
インフルエンザワクチンは、代表的に、約０．５ｍｌの投薬容量で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。
【０１２５】
組成物中の抗原、アジュバントおよび免疫増強物質は、代表的に、混合物中にある。本発明の組成物は、代表的に、水性形態である。
【０１２６】
組成物およびキットは、好ましくは、２℃と８℃との間にて保存される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、直接的な光から免れるべきである。
【０１２７】
（本発明のキット）
上述の通り、本発明の組成物は、送達時において即座に調製され得る。したがって、本発明は、混合のために調整された種々の成分を備えるキットを提供する。上記キットは、上記アジュバントおよび上記抗原が使用時まで別々に保持されることを可能にする。上記免疫増強物質は、これら２つのキット成分の一方に含まれても、第３のキット成分の部分であってもよい。
【０１２８】
上記成分は、上記キット内で、互いから物理的に分離した形態であり、そしてこの分離は、種々の手段で達成され得る。例えば、上記成分は、分離したバイアルなどの容器中にあり得る。次いで、上記２つのバイアルの内容物は、例えば、一方のバイアルの内容物を取り出し、そしてそれらを他方のバイアルに添加すること、または両方のバイアルの内容物を別々に取り出し、そしてそれらを第３の容器中で混合することによって混合され得る。
【０１２９】
好ましい構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において、キット成分のうちの一方は、注射器中にあり、そして他方は、バイアルなどの容器中にある。注射器（例えば、針を有する）が、その成分を混合のための第２の容器中に挿入するために使用され得、次いでその混合物は、その注射器中に引かれ得る。次いで、その注射器の混合された内容物は、代表的に、新規の滅菌針を通して患者に投与され得る。注射器中に１つの成分を包装することは、患者への投与のために別個の注射器を使用する必要性を排除する。
【０１３０】
別の好ましい構成において、上記２つのキット成分は、同じ注射器（例えば、二重室注射器（ｄｕａｌ−ｃｈａｍｂｅｒ ｓｙｒｉｎｇｅ）（例えば、参考文献１４０〜１４７などに開示されるもの））において、一緒であるが分離して保持される。その注射器が、作動される場合（例えば、患者に対する投与の間）、その２つの室の内容物は、混合される。この構成は、使用時における別個の混合工程に対する必要性を回避する。
【０１３１】
種々のキット成分の内容は、一般には全て、水性形態にある。いくつかの構成において、一方の成分（代表的に、アジュバント成分よりもむしろ抗原成分）は、乾燥形態（例えば、凍結乾燥された形態）であり、他方の成分は、水性形態である。上記２つの成分は、上記乾燥成分を再活性化し、そして患者に対する投与のための水性組成物を得るために混合され得る。凍結乾燥された成分は、代表的に、注射器よりもむしろバイアル内におかれる。乾燥された成分は、安定剤（例えば、乳糖、ショ糖またはマンニトール、およびそれらの混合物（例えば、乳糖／ショ糖混合物、ショ糖／マンニトール混合物）など）を含み得る。１つの可能な構成は、予め充填された注射器中の水性アジュバント成分およびバイアル中の凍結乾燥された抗原成分を使用する。
【０１３２】
（組成物またはキット成分の包装）
本発明の組成物（またはキット成分）に適した容器としては、バイアル、注射器（例えば、使い捨て可能な注射器）、点鼻スプレーなどが挙げられる。これらの容器は、無菌であるべきである。
【０１３３】
組成物／成分が、バイアル中におかれる場合、そのバイアルは、好ましくは、ガラス材料またはプラスチック材料から作製される。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物がそのバイアルに添加される前に滅菌される。ラテックス感受性患者に関する懸案事項を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーによって密封され、そして全ての包装用物質中にラテックスが存在しないことが、好ましい。上記バイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそのバイアルは、１つよりも多い用量（例えば１０用量）を含み得る（「複数回用量」バイアル）。好ましいバイアルは、無色のガラスから作製される。
【０１３４】
バイアルは、予め充填された注射器がそのキャップ中に挿入され得るように適合したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得、その注射器の内容物は、（例えば、その中の凍結乾燥された物質を再構成するために）そのバイアル中に排出され得、そしてそのバイアルの内容物は、その注射器中に戻され得る。上記バイアルから上記注射器を取り外した後、次いで針が、接続され得、そして組成物が、患者に投与され得る。上記キャップが、好ましくは、シールまたはカバーの内側に配置されて、そのシールまたはカバーは、そのキャップが接触され得る前に取り外される必要がある。バイアルは、特に、複数回用量バイアルに関して、その内容物の無菌的な取り出しを可能にするキャップを有し得る。
【０１３５】
成分が、注射器中に包装される場合、その注射器は、それに接続された針を有し得る。針が接続されない場合、別個の針が、組み立ておよび使用のために注射器とともに提供され得る。そのような針は、シースで覆う（ｓｈｅａｔｈｅ）ことができる。安全針が、好ましい。１インチ２３ゲージの針、１インチ２５ゲージの針および５／８インチ２５ゲージの針が、代表的である。注射器には、その上に内容物のロット番号、インフルエンザの時期および使用期限日がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。上記注射器中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に外れることを防ぐ。上記注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨て可能な注射器は、単回用量のワクチンを含む。上記注射器は、一般に、針の接続前に先端を密封するために先端キャップを有し、そしてその先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製される。上記注射器と針とが別個に包装される場合、その針は、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。好ましい注射器は、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭで市販されるものである。
【０１３６】
容器は、半用量の容量を示して、例えば、小児に対する送達を容易にするために、標識され得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含む注射器は、０．２５ｍｌ容量を示す標識を有し得る。
【０１３７】
ガラス容器（例えば、注射器またはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラス製の容器よりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。
【０１３８】
キットまたは組成物は、上記ワクチンの詳細（例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細など）を含む印刷物と一緒に（例えば、同じ箱中に）含まれ得る。その指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の場合、直ちに利用できるようにアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。
【０１３９】
（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、そして本発明は、患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。
【０１４０】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明のキットまたは組成物を提供する。
【０１４１】
本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）インフルエンザウイルス抗原；（ｉｉ）不溶性粒子状アジュバント；および（ｉｉｉ）免疫増強物質を提供する。
【０１４２】
これらの方法および使用によって惹起された免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的な抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野において周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体力価が防御と相関することを示している（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集−抑制力価は、同種のウイルスによる感染に対する約５０％の防御を与える）［１４８］。抗体応答は、代表的に、赤血球凝集抑制、マイクロ中和、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）、および／または単純放射溶血（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は、当該分野において周知である。
【０１４３】
本発明の組成物は、種々の手段で投与され得る。最も好ましい免疫感作経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚）によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻腔内［１４９〜１５１］、経口［１５２］、皮内［１５３、１５４］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［１５５］などが挙げられる。
【０１４４】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、最近、小児および成人の免疫感作における６月齢からの使用について推奨される。したがって、上記患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受容するための好ましい患者は、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若年者（例えば５歳以下）、入院患者、医療従事者、国軍および軍人、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、そのワクチンを受容する前の７日間において抗ウイルス化合物（例えば、リン酸オセルタミビルなどのオセルタミビルまたはザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している患者、および海外渡航者である。上記ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているわけではないが、より一般的には集団において使用され得る。流行株に関して、全ての年齢群に対する投与が、好ましい。
【０１４５】
処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫感作スケジュールおよび／または追加免疫感作スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールにおいて、種々の用量は、同じかまたは異なる経路（例えば、非経口によるプライム（ｐｒｉｍｅ）および粘膜によるブースト（ｂｏｏｓｔ）、粘膜によるプライムおよび非経口によるブーストなど）によって与えられ得る。１つより多い用量（代表的に、２用量）の投与は、特に、免疫学的にナイーブな患者において有用である（例えば、以前にインフルエンザワクチンを受容したことがない者のためか、または新規のＨＡサブタイプに対してワクチン接種するため（流行の発生において））。複数回用量は、代表的に、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）の間隔を空けて投与される。
【０１４６】
本発明の好ましい組成物は、効力に関してＣＰＭＰ判定基準の１、２または３を満たす。成人（１８〜６０歳）において、これらの基準は、（１）７０％以上のセロプロテクション（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）４０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２．５倍以上のＧＭＴ増加である。高齢者（＞６０歳）において、これらの判定基準は、（１）６０％以上のセロプロテクション；（２）３０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２倍以上のＧＭＴ増加である。これらの判定基準は、少なくとも５０人の患者による非盲検研究に基づく。
【０１４７】
本発明のワクチンは、他のワクチン（麻疹ワクチン、流行耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合体ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、特に、高齢患者において有用である。
【０１４８】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時（例えば、医療専門家による同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。これらの抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（そのエステル（例えば、エチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）を含む））が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，ホスフェート（１：１）（リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知である）である。
【０１４９】
（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【０１５０】
語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１５１】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１５２】
詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。したがって、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。
【０１５３】
動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、それらを、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から取得しなければならない。総合的に、動物に由来する材料の完全な非存在下で細胞を培養することが、好ましい。
【０１５４】
化合物が、組成物の部分として投与される場合、その化合物は、代替的に、適切なプロドラッグによって置換され得る。
【０１５５】
細胞基質が、リアソータント手順または逆方向遺伝学手順のために使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ Ｅｕｒ総論（ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈａｐｔｅｒ）５．２．３にあるようなヒトワクチン生産における使用について承認されているものである。
【実施例】
【０１５６】
（本発明を実施するための様式）
インフルエンザウイルス株Ｗｙｏｍｉｎｇ Ｈ３Ｎ２（Ａ）、Ｎｅｗ−Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ｈ１Ｎ１（Ａ）およびＪｉａｎｇｓｕ（Ｂ）を、ＭＤＣＫ細胞において個別に増殖させた。三価表面糖タンパク質ワクチンを、調製し、そしてそれを使用して、１株あたり０．１μｇのＨＡにて０日目および２８日目に免疫ナイーブＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫感作（筋肉内）した。動物を、４２日目に採血し、そして種々の抗体アッセイを、その血液を用いて行った：ＨＩ力価；ＥＬＩＳＡによって測定した抗ＨＡ応答。ＩｇＧ応答を、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａとして分類した。
【０１５７】
以下の３種の不溶性粒子状アジュバントを、試験した：（ｉ）１ｍｇ／ｍｌで使用され、かつ５ｍＭヒスチジン緩衝剤を含む水酸化アルミニウム；（ｉｉ）１ｍｇ／ｍｌで使用され、かつ５ｍＭヒスチジン緩衝剤を含むリン酸カルシウム；または（ｉｉｉ）ポリ（ラクチドｃｏ−グリコリド）５０：５０コポリマー組成物から形成される微粒子（固有粘度０．４（「ＰＬＧ」））。
【０１５８】
以下の２種の免疫増強物質を、試験した：（ａ）ホスホロチオエート骨格を有する免疫刺激性ＣｐＧ ＯＤＮ（１０μｇ／用量）；または（ｂ）Ｒ−８４８。
【０１５９】
したがって、１２の動物群が存在した。
【０１６０】
【化１４】
Ａｌ−Ｈ処方物について、三価抗原を、３μｇ／ｍｌの抗原、５ｍＭのヒスチジン緩衝剤（ｐＨ６．５）および９ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムにおいて、１ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムに対して４℃にて一晩吸着させた。
【０１６１】
Ｃａ−Ｐ処方物について、リン酸カルシウム懸濁物を、粒径を減少させるために２０ｍｍプローブを使用して１５，０００ｒｐｍにて３分間にわたってホモジナイズした。次いで、上記抗原を、１ｍｇ／ｍｌのＣａ−Ｐ、３μｇ／ｍｌの抗原、５ｍＭヒスチジン緩衝剤（ｐＨ６．５）および９ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウムにおいて、上記ホモジナイズした懸濁物に対して４℃にて一晩吸着させた。
【０１６２】
ＰＬＧ微粒子を、溶媒蒸発法によって調製した。簡単にいうと、微粒子を、２．５ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む塩化メチレン中の１０ｍｌの６％（ｗ／ｖ）ポリマー溶液を、１０ｍｍプローブを使用してホモジナイズすることによって調製した。そうして形成された油中水型エマルションを、次いで、ＤＳＳを含む５０ｍｌの蒸留水に添加し、そしてその混合物を、２０ｍｍプローブを用いて５分間にわたって非常に速い速度にて氷浴中でホモジナイズした。この手順は、水中油中水型エマルションの形成を生じ、その水中油中水型エマルションを、１０００ｒｐｍにて１２時間にわたって室温で撹拌した。上記塩化メチレンを、放置して蒸発させた。得られた微粒子のサイズ分布を、粒径分析器によって決定した。ゼータ電位を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ分析器によって測定した。抗原を、０．０３％（ｗ／ｗ）の負荷（ｌｏａｄ）において、１００ｍｇの空ＰＬＧ微粒子を含む懸濁物を３０μｇの三価インフルエンザ抗原と一緒にインキュベートすることによって吸着させた。濃縮したヒスチジン緩衝溶液を、１０ｍｌの総容量において１０ｍＭの最終濃度（ｐＨ６．２）になるまで添加した。その懸濁物を、実験室のロッカー（ｌａｂ ｒｏｃｋｅｒ）において４℃にて一晩混合した。１ｍＬを、吸着効率の決定のために使用するときに取り出した。３．６μｇの三価抗原を含むアリコートを、小さいガラスバイアル中におき、そして再構成の際に、それぞれ、４．５％および１．５％の最終濃度を達成するマンニトールおよびショ糖と一緒に、−５０℃かつ９０×１０−３ｍＢａｒにて凍結乾燥した。
【０１６３】
上記３種のアジュバントに対するタンパク質吸着の効率を、以下の通りに決定した：ＰＬＧ／ＦＣＣ、Ａｌ−Ｈ／ＦＣＣまたはＣａ−Ｐ／ＦＣＣの１ｍｌアリコートを、一晩のインキュベーション工程の後に取り出した。遠心分離後、上清中に残存する結合していないタンパク質の量を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定した。本質的に、１００μｌの上清を、Ｗａｔｅｒｓ ２６９０／４３２機器を備えたＴＳＫ３０００ＳＷＸＬに注入した。直線の検量線を、三価抗原によって確立し、そしてその上清に存在するタンパク質の量を、算出した。次いで、結合していないタンパク質の総量を、最初に添加したタンパク質の総量から減算し、そしてその差を、実際の負荷効率を算出するために使用した。
【０１６４】
Ａｌ−Ｈ処方物およびＣａ−Ｐ処方物からの抗原抽出のために、アリコートを、１５〜２０分間にわたって５０００ｒｐｍにて遠心分離した。各サンプル由来の上清を、ペレットを乱すことなく除去した。上記抗原を置換するために、脱着緩衝剤（０．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４＋０．１５ＭのＥＤＴＡ）を、各ペレットに添加し、そして穏やかに動揺させながら２〜３時間にわたって室温にてインキュベートした。抽出された抗原を、遠心分離によって送達系から分離した。
【０１６５】
ＰＬＧ微粒子からの抗原抽出のために、ＰＢＳを、０．０５％のオクチル−β−グルコシドと一緒に添加し、穏やかな動揺運動のもとで１〜２時間にわたって室温にてインキュベートした。抽出されたＦＣＣ抗原を含む上清を、遠心分離によってペレットから分離した。
【０１６６】
抗原特異的抗体を、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＨＡ特異的ＩｇＧの滴定を、最後の免疫感作の２週間後に、個々の血清に対して行った。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェル平底プレートを、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）中のＨ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ３またはＢによって０．２μｇ／ウェルで２７〜３０℃にて一晩コーティングした。上記コーティングしたウェルを、３００μｌの３％ ＰＶＰを用いて１時間にわたって室温にてブロックした。そのプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％ ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて洗浄し、軽打（ｔａｐ）し、そして乾燥した。血清サンプルおよび血清標準を、最初に、希釈緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）によって１：５，０００〜１：２０，０００に希釈し、次いで、コーティング−ブロックしたプレートに移し、ここで、サンプルを、同じ緩衝液を用いて３倍に連続希釈した。抗原特異的ＩｇＧを、アルカリホスファターゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧで明らかにした。抗体力価を、免疫感作前の血清において得られた平均光学濃度（ＯＤ）の平均＋５×標準偏差（ＳＤ）よりも高いＯＤを与えるＥＬＩＳＡ力価の対数として示した。上記力価を、並行してアッセイした参照血清に関して正規化した。
【０１６７】
抗体をまた、第１の免疫感作の２週間後（ｐｏｓｔ １）および第２の免疫感作の２週間後（ｐｏｓｔ ２）に採取した個々の血清に対してＶ字形状の９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて行った、赤血球凝集抑制アッセイによって決定した。簡単にいうと、２５μＬの２倍に連続希釈したサンプルを、２５μＬの株特異的インフルエンザ抗原（４赤血球凝集単位（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｕｎｉｔ）を含む全ウイルス）と一緒に６０分間にわたって室温にてインキュベートする。成体の雄鶏から得た赤血球の０．５％（ｖ／ｖ）懸濁物を、添加し、そしてその混合物を、さらに６０分間にわたってインキュベートする。反応を、目視検査によって追跡する：赤色の点の形成は、ポジティブな反応（抑制）を示し、そして細胞の拡散した斑は、ネガティブな反応（赤血球凝集）を示す。上記力価は、最後の完全な凝集抑制が生じる血清希釈度として規定される。上記抗体濃度は、上記力価の逆数値に対応する。
【０１６８】
図１〜３は、１２個の群についての抗ＨＡ ＥＬＩＳＡ応答を示す。群１と群４との比較は、水酸化アルミニウムに対するＣｐＧの添加がＨＡ力価を上昇させることを示す。同様に、ＣｐＧは、上記リン酸カルシウムアジュバント（群２および５）および上記ＰＬＧアジュバント（群３および６）に添加した場合、ＨＡ力価を上昇させる。
【０１６９】
図４は、群１〜６についてのＨＩ力価を示す。ＣｐＧの添加は、ＨＩ力価を増強する。
【０１７０】
免疫応答がＴＨ１型のものであるかまたはＴＨ２型のものであるかを見るために、ＨＡ特異的ＩｇＧを、ＩｇＧ１（ＴＨ２）またはＩｇＧ２ａ（ＴＨ１）として細分類した。図５は、この分析の結果を示す。単独の粒子状抗原（群１、２および３）は、ＩｇＧ２ａをほとんど示さない。しかし、ＣｐＧを添加する場合、顕著なＩｇＧ２ａ応答が、見られ（群４、５および６）、ＩｇＧ２ａは、群５（ＣｐＧ＋ＣａＰ）において優勢になった。したがって、上記不溶性粒子状アジュバントに対する免疫増強物質（例えば、ＣｐＧ）の添加は、ＴＨ２型応答からＴＨ１型応答への移行をもたらす。ＴＨ１型応答は、インフルエンザウイルスに対する異種サブタイプ免疫を改良することが報告されている［９］ので、不溶性粒子状アジュバントを含む公知のインフルエンザワクチンは、免疫増強物質の添加によって改良され得る。
【０１７１】
本発明は例示のみによって記載され、そして改変は本発明の範囲および精神の中にあるままでもなされ得ることが、理解される。
【０１７２】
（参考文献（その内容は、本明細書によって参考として援用される））
【０１７３】
【化１５】
【０１７４】
【化１６】
【０１７５】
【化１７−１】
［９０］米国特許第４６８９３３８号、同第４９２９６２４号、同第５２３８９４４号、同第５２６６５７５号、同第５２６８３７６号、同第５３４６９０５号、同第５３５２７８４号、同第５３８９６４０号、同第５３９５９３７号、同第５４８２９３６号、同第５４９４９１６号、同第５５２５６１２号、同第６０８３５０５号、同第６４４０９９２号、同第６６２７６４０号、同第６６５６９３８号、同第６６６０７３５号、同第６６６０７４７号、同第６６６４２６０号、同第６６６４２６４号、同第６６６４２６５号、同第６６６７３１２号、同第６６７０３７２号、同第６６７７３４７号、同第６６７７３４８号、同第６６７７３４９号、同第６６８３０８８号、同第６７０３４０２号、同第６７４３９２０号、同第６８００６２４号、同第６８０９２０３号、同第６８８８０００号および同第６９２４２９３号．
【０１７６】
【化１７−２】
【０１７７】
【化１８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１４０４７０（Ｐ２０１２−１４０４７０Ａ）
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−９９６７３（Ｐ２０１２−９９６７３）
【出願日】平成２４年４月２５日（２０１２．４．２５）
【分割の表示】特願２００８−５３８４２０（Ｐ２００８−５３８４２０）の分割
【原出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−９９６７３（Ｐ２０１２−９９６７３）
【出願日】平成２４年４月２５日（２０１２．４．２５）
【分割の表示】特願２００８−５３８４２０（Ｐ２００８−５３８４２０）の分割
【原出願日】平成１８年１１月６日（２００６．１１．６）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
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