粒状金属酸化物を用いるプリオン排除
ヒュームド金属酸化物および／または粒状二酸化珪素を生物学的物質に加えてヒュームド金属酸化物および／または粒状二酸化珪素並びに生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、そしてヒュームド金属酸化物および／または粒状二酸化珪素を混合物から分離して生ずる溶液を形成せしめることにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法であって、生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を生ずる溶液中で実質的に減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的物質からの病原性プリオン蛋白質の分離または排除に関する。生物学的物質を例えばヒュームド（ｆｕｍｅｄ）シリカの如きヒュームド金属酸化物を包含する金属酸化物および／または粒状二酸化珪素に曝すことにより、病原性プリオンが生物学的物質から分離される。
【背景技術】
【０００２】
病原性プリオン蛋白質（病原性プリオン）は、ヒト並びに他の哺乳動物種、特に羊、山羊、牛、ミンク、エルク、および鹿における致死的な神経変性疾病である伝搬性海綿形態脳障害（ＴＳＥ）に関連する。疾病のヒト形態は、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−ストラウスラー−シェインカー（ＧＳＳ）症候群、致死的な家族性不眠症（ＦＦＩ）、およびクールーを包含する。これらの疾病の症状は、ミオクロヌス、運動失調、および進行性認知症を包含する。これらの疾病の病理学は、脳内のアミロイドプラークの生成を包含する。
【０００３】
プリオン疾病の発生は感染性伝播並びに遺伝的および散在的原因に関連していた。例えば、ニューギニアのフォア（Ｆｏｒｅ）族を苦しめたクールーは儀式的人肉嗜食中の他の部族員の感染された脳組織の摂取により引き起こされた。非特許文献１。より最近では、英国における変種ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）の発生が病原性プリオンが感染した牛からの牛肉の消費の結果であることが前提にされている。非特許文献２、非特許文献３。同様に、医原性ＣＪＤは死体の下垂体から由来するヒト成長ホルモンの注射により引き起こされた。非特許文献４。上記のようなプリオンの感染作用の症例は、プリオン感染性が生物学的物質を通して伝播されうることを示唆している。
【０００４】
プリオンは、核酸の同時伝播なしに、プリオン蛋白質である蛋白質の伝播により人間および他の哺乳動物に感染することが、信じられている。この感染因子は天然産出性の細胞プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）の疾病を引き起こす変種であると仮定されており、その生理学的機能は知られていない。この理論では、プリオン蛋白質の変種形態（ＰｒＰＳｃ）がプリオン蛋白質の正常形態（ＰｒＰＣ）において構造変化を誘発し、それによりそれを病原性プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の疾病を引き起こす形態に転化させる。試料をプロテイナーゼＫ処理にかけそして試料をプロテイナーゼ耐性ポリペプチド（ＰｒＰＲＥＳ）の存在に関して分析することにより、ＰｒＰＳｃを検出することができる。バイエル・コーポレーション（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に譲渡されたＬｅｅ，ｅｔ ａｌ．の特許文献１および非特許文献５を参照のこと。
【０００５】
治療組成物はしばしば生物学的物質から誘導される。例えば、因子ＶＩＩＩ、免疫グロブリン類、α−１プロテイナーゼ阻害剤、プラスミノーゲン／プラスミン、およびアルブミンの如き治療的に価値ある蛋白質がヒト血漿から単離される。例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）の如き他の感染因子が、生成物処理流から因子を効果的に除去する不活性化方法または工程を受けなかった血液または血液生成物の治療使用により伝播されることが知られている。他の生物学的物質を通るＴＳＥの伝播の証明が、血液および血液由来生成物、組み換え生成物、並びに生物起源の他の生成物を通るＴＳＥの可能な伝播より重要性を強める。
【０００６】
しかしながら、血液発生性病原体、例えばＨＩＶおよびＨＣＶ、からの感染の危険性を減少させる既知の方法は不活性化プリオンでは有効でない。さらに、強塩基を用いる処理および／またはオートクレーブ処理を包含するプリオンからの感染の危険性を減少させる
方法は、治療またはその他の有用な蛋白質の製造工程が蛋白質を変性させるため、そのような工程と共に使用するためには適していない。
【特許文献１】米国特許第６，４３７，１０２号明細書
【非特許文献１】Ａｌｐｅｒｓ，“Ｓｌｏｗ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｖｏｌ．１，Ｓ．Ｂ．Ｐｒｕｉｓｎｅｒ ａｎｄ Ｗ．Ｊ．Ｈａｄｌｏｗ，ｅｄｓ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．６６−９００（１９７９）
【非特許文献２】Ｇ．Ｃｈａｚｏｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３４７：１１８１（１９９６）
【非特許文献３】Ｒ．Ｇ．Ｗｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３４７：９２１−２５（１９９６）
【非特許文献４】Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３４０：２４−２７（１９９２）
【非特許文献５】Ｌｅｅ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８４（１）：７７−８９（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、例えば血液血漿画分および組み換え製造された蛋白質の水溶液の如き生物学的物質からプリオンを分離する方法が要望されている。本発明は治療的に価値ある蛋白質を変性させずにそのような生物学的物質からプリオンを分離する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は生物学的物質からのプリオンの分離または排除方法を提供する。そのような方法は生物学的物質から発生する生成物が元の物質から由来する病原性プリオン蛋白質で感染され始めたかもしれないヒトまたは動物によるその後の使用にとって確実に安全にするために有用であることは認識されよう。
【０００９】
従って、本発明の一面は、金属酸化物を生物学的物質に加えて金属酸化物および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、そして金属酸化物を混合物から分離して生ずる溶液を形成することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を、生ずる溶液中で実質的に減少させる。ある態様では、この方法は、病原性プリオン蛋白質の存在または量に関する生ずる溶液の評価を含んでなる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、約１５０ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられるヒュームドシリカを生物学的物質に加えてヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、混合物を少なくともヒュームドシリカの粒子の実質的部分を保持するフィルターを含んでなる濾過システムを通過させることによりヒュームドシリカを混合物から分離して生ずる溶液を形成し、そして生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して免疫検定を用いて評価することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を、生ずる溶液中で実質的に減少させる。
【００１１】
別の面では、本発明は、二酸化珪素粒子を生物学的物質に加えて二酸化珪素粒子および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、二酸化珪素粒子を混合物から分離して生ず
る溶液を形成し、そして生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して評価することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を、生ずる溶液中で実質的に減少させる。
【００１２】
本発明は、また、試料を流動性液体状態で金属酸化物を含んでなる固体基質と接触させ、試料中のプリオンが基質と結合するような時間にわたり試料を基質と接触させたままにし、そして試料を基質から分離することによりプリオンを試料から分離する方法に関する。
【００１３】
本発明は、さらに、試料を粒状金属酸化物と接触させ、粒状金属酸化物を試料から分離し、そして粒状金属酸化物と会合したプリオン蛋白質をさらなる分析にかけることによりプリオン蛋白質を試料から分離しそしてそれらをさらなる分析のために濃縮する方法に関する。
図面の簡単な説明
図１は、パネルに隣接して示された濃度におけるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（ヒュームドシリカ）を用いる濾過後の病原性プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の特異的検出を示すウェスタンブロットを示す。使用された物質および方法は実施例１に示された通りである。
【００１４】
図２は、種々の量の加えられたＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを用いるＰｒＰＳｃの排除または除去のグラフ表示である。グラフを作成するために使用されたデータは図１に示されたようにウェスタンブロット実験で示されている。
【００１５】
図３は、プラスミノーゲンの精製中のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。物質および方法に関する詳細に関しては実施例２を参照のこと。
【００１６】
図４は、図３に示された結果を生ずる際にプラスミノーゲンの種々の精製工程の変動におけるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。物質および方法に関する詳細に関しては実施例２を参照のこと。
【００１７】
図５は、Ａｌ（ＯＨ）３の添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。レーンは、以下の通りにして加えられたＡｌ（ＯＨ）３（アンヒドロゲル（ＡＮＨＹＤＲＯＧＥＬ）の％ｖ／ｖ）を有する試料の分析を表す：ａ、０；ｂ、１；ｃ、２；ｄ、５；ｅ、１０；およびｆ、１８。物質および方法に関する詳細に関しては実施例３を参照のこと。
詳細な記述
本発明は、可能性として溶液を汚染する病原性プリオン蛋白質を出発溶液に比べて実質的に減少させる溶液の製造方法に関する。本発明は、また、汚染された溶液からのプリオン蛋白質の回収を基にしたさらなる分析のためのそれらの製造も提供する。
【００１８】
従って、一面では、本発明は、金属酸化物を生物学的物質に加えて金属酸化物および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、そして金属酸化物を混合物から分離して生ずる溶液を形成することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。ある態様では、この方法は、病原性プリオン蛋白質の存在または量に関する生ずる溶液の評価を含んでなる。
【００１９】
特定の態様では、生物学的物質は血液−由来生成物、組織−由来生成物、および組み換え製造された生成物でありうる。ある態様では、生物学的物質は血液−由来生成物である。血液−由来生成物はヒト起源でありうる。血液−由来生成物は免疫グロブリン類、血液凝固因子、プラスミン、プラスミノーゲン、α−１プロテイナーゼ阻害剤、およびアルブ
ミンでありうる。
【００２０】
特定の態様では、金属酸化物はヒュームドシリカまたはヒュームドアルミナでありうる。ヒュームド金属酸化物はヒュームドシリカでありうる。ヒュームドシリカは約１３０ｍ２／ｇ〜約３８０ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられうる。特定の態様では、ヒュームドシリカは約１５０ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられうる。ヒュームドシリカは２００ｍ２／ｇの比表面積によっても特徴づけられうる。
【００２１】
ある態様では、金属酸化物は混合物から濾過により分離される。濾過は、約０．１ｍｍより大きいものから約５ｍｍまでの粒子を保持する濾過システム中の混合物の通過を包含しうる。濾過はまた、約０．８μｍより大きい粒子を保持する濾過システム中の混合物の通過も包含しうる。
【００２２】
病原性プリオン蛋白質の存在または量に関する生ずる溶液の評価は、病原性プリオン蛋白質に関する動物生物学的検定または免疫検定を用いる感染性に関する試料の評価を包含しうる。免疫検定はウェスタンブロットまたはエリザ（ＥＬＩＳＡ）検定でありうる。
【００２３】
ある態様では、金属酸化物は水酸化アルミニウムでありうる。水酸化アルミニウムは、約２重量％のＡｌ２Ｏ３を含んでなるゲル状として、約１〜約１０容量％の、約１〜約５容量％の、または約３容量％の濃度で存在しうる。
【００２４】
別の態様では、金属酸化物はヒュームドアルミナでありうる。ヒュームドアルミナは約０．１〜約１．０重量％の量で存在しうる。ヒュームドアルミナは約０．２５〜約０．７５重量％の量でも存在しうる。ヒュームドアルミナは約０．５重量％の量でも存在しうる。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、約１５０ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられるヒュームドシリカを生物学的物質に加えてヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、混合物をヒュームドシリカの粒子の少なくとも実質的部分を保持するフィルターを含んでなる濾過システム中に通過させることによりヒュームドシリカを混合物から分離して生ずる溶液を形成し、そして生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して免疫検定を用いて評価することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。
【００２６】
ある態様では、ヒュームドシリカは、約２００ｍ２／ｇの比表面積、約５０ｇ／ｌのタップ密度（ｔａｐ ｄｅｎｓｉｔｙ）、および約０．２μｍ〜約０．３μｍの平均集合体粒子長さにより特徴づけられる。ヒュームドシリカはヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の約０．１％〜約１．０％（重量／重量）の量で加えられる。ヒュームドシリカはヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の約０．２％〜約０．８％（重量／重量）の量で加えることができる。ヒュームドシリカはヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の少なくとも約０．２５％（重量／重量）の量で加えることができる。特別な態様では、ヒュームドシリカはヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の少なくとも約０．５％（重量／重量）の量で加えることができる。
【００２７】
別の面では、本発明は、二酸化珪素粒子を生物学的物質に加えて二酸化珪素粒子および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、二酸化珪素粒子を混合物から分離して生ずる溶液を形成し、そして生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して評価することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。事によると生物学的物質を汚染する病原性プリオン蛋白質を、生ずる溶液中で実質的に減少させる。
【００２８】
ある態様では、混合物からの二酸化珪素粒子の分離は遠心または濾過により行われる。
【００２９】
別の面では、本発明は、試料を流動性液体状態で金属酸化物を含んでなる固体基質と接触させ、試料中のプリオンが基質と結合するような時間にわたり試料を基質と接触させたままにし、そして試料を基質から分離することによりプリオンを試料から分離する方法に関する。金属酸化物は二酸化珪素または水酸化アルミニウムでありうる。金属酸化物はヒュームドシリカでありうる。
【００３０】
別の面では、本発明は、試料を粒状金属酸化物と接触させ、粒状金属酸化物を試料から分離し、粒状金属酸化物と会合したプリオン蛋白質をさらなる分析にかけることによりプリオン蛋白質を試料から分離しそしてそれらをさらなる分析のために濃縮する方法に関する。プリオン蛋白質のさらなる分析は、免疫検定、動物生物学的検定、分光分析、またはクロマトグラフィー分析を包含しうる。
【００３１】
本発明は、生物学的物質からのプリオンの分離または排除方法を提供する。生物学的物質は、生物学的に由来する流体、例えば血液血漿画分、生物学的物質、例えば組織の試料、および組み換え製造された生成物、例えば組み換え蛋白質の水溶液を包含する。一般的に、この方法は、粒状二酸化珪素または金属酸化物を生物学的物質に加えて粒状二酸化珪素または金属酸化物および生物学的物質の混合物を得ることによる生物学的物質からのプリオンの分離を提供する。粒状二酸化珪素または金属酸化物を次に混合物から、例えば濾過または遠心により分離して、元の生物学的物質を汚染したかもしれない病原性プリオン蛋白質における実質的な減少により特徴づけられる精製された生物学的物質を得る。
【００３２】
そのような方法は、生物学的物質から発生する生成物が元の物質から生ずる病原性プリオン蛋白質で感染し始めたかもしれないヒトまたは動物によるその後の使用にとって安全を確保するために有用であることは認識されよう。従って、本発明の実施法は、病原性プリオン蛋白質を実際に含んでなっていてもまたは含んでなっていなくてもよい生物学的物質に関して開示された方法を、生物学的物質を可能性として汚染させる処理用の品質確保方法として包含する。
【００３３】
ここで使用される際には、下記の用語は断らない限り指示された意味を有する。
【００３４】
「動物生物学的検定」は、病原性プリオン蛋白質により引き起こされるかまたは関連する疾病に敏感な生存有機体中への物質の試験試料の導入に関連する物質中の病原性プリオンの検定と、その後の関連疾病症状の進行証拠に関する有機体の監視を意味する。動物生物学的検定は、Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，”Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，３８（９）：８１０−６（１９９８）に記載されている齧歯動物感染性検定を包含するが、それに限定されるものではない。
【００３５】
「血液−由来生成物」は、全血または分画血液起源、一般的には哺乳動物から製造されるいずれかの生成物を意味する。
【００３６】
「生物学的物質」は、溶液状で処理できる生存有機体から発生するいずれかの物質を意味する。本発明の方法にかけることができる生物学的物質はいずれの生物学的物質も包含しうるが、一般的にはその起源、処理履歴または他の露呈の理由のために可能性として病原性プリオン蛋白質で汚染される物質であろう。
【００３７】
「金属酸化物」は、重量と比べて大きい表面積を有する小粒子形態の金属酸化物を意味する。水素および酸素または空気の火炎中への金属塩化物の注入により一般的に製造されるヒュームド金属酸化物（「ヒュームド」または発熱性（ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ）金属酸化物）が包含される。一般的に、そのような物質は非晶質であるが、種々の結晶性相の混合物を含んでなりうる。粒状二酸化珪素および水酸化アルミニウムが包含される。そのような粒子は主要粒子の三次元集合体を形成しうる。ヒュームド金属酸化物はヒュームドシリカおよびヒュームドアルミナを包含する。
【００３８】
「ヒュームドシリカ」は、発熱性の非晶質コロイド状二酸化珪素を意味する。
【００３９】
「免疫検定」は、抗体およびプリオン蛋白質の間の特定なそして検出可能な相互作用に基づく検定を意味する。免疫検定自体がプリオン蛋白質の非病原性および病原性イソ形態（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）に関して非特異的である場合には、その使用を例えば非病原性イソ形態の蛋白分解消化によりイソ形態間を実質的に区別する工程と組み合わせることができる。有用な免疫検定の例は、ウェスタンブロット、エリザ、およびドットブロット検定を包含する。
【００４０】
「病原性プリオン」または「ＰｒＰＳｃ」は、ヒトの伝搬性海綿形態脳炎（例えば、変種クロイツフェルト−ヤコブ病（ｖＣＪＤ）、クールー、ゲルストマン−ストラウスラー−シェインカー病（ＧＳＳ）、および致死的な家族性不眠症（ＦＦＩ）、牛の海綿形態脳炎（「狂牛」病）の最近同定された形態、スクレーピー（羊および山羊を苦しめる）、慢性消耗病（鹿）、並びにプリオン蛋白質の病原性形態（スクレーピーイソ形態−ＰｒＰＳｃ）への露呈により広がる他の部分的に同定されたおよびまだ同定されていない疾病を包含するヒトまたは他の哺乳動物を苦しめる種々の伝搬性神経変性疾病のいずれかに関連するいずれかの蛋白質感染因子を意味する（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｓ．Ｂ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１５１５−１５２２（１９９１）参照）。
【００４１】
「組み換え製造された生成物」は、人造核酸構成体（例えば天然有機体において通常は製造されないかまたは特定量で製造されない蛋白質生成物を製造するために変更されたトランスジェニック有機体を発生するために使用される構成体）を用いて製造されるいずれかの生成物を意味する。そのような生成物は、組み換え製造方法でまたはその他の方法で使用される動物に対するいずれかの露呈によって可能性として病原性プリオン蛋白質で汚染されうる。「組み換え体」は元来は組み換え方法による製造を意味すること、並びに組み換え生成物のその後の製造をそれ自体でまたは自然に技術的には非組み換え体（例えば、組み換え技術により元来製造されそしてその後に組み換え生成物の製造のために伝播されるトランスジェニック動物）である方法で実施しうることは認識されよう。
【００４２】
「二酸化珪素」は、微細粒子寸法の高表面積の二酸化珪素粒子または粒子の集合体を意味する。
【００４３】
「比表面積」は、例えばＢ．Ｅ．Ｔ．（ブルナウアー、エメット、およびテラー）方法により測定されるような粒状固体の単位重量当たりの表面積を意味する。
【００４４】
「組織−由来生成物」は、生存有機体の組織から製造されるいずれかの生成物を意味し、治療的または栄養的使用のために製造される生成物を包含し、その処理は、少なくとも一面では、製造段階または処理段階である金属酸化物または粒状二酸化珪素または水酸化アルミニウムとの混合物を形成可能な溶液の製造を伴う。
【００４５】
本発明の方法における使用のためのヒュームド金属酸化物はヒュームドシリカまたはヒュームドアルミナでありうる。本発明の方法の少なくとも一部の態様に従い使用できる粒状二酸化珪素は非常に微細な主要粒子寸法により特徴づけられる。平均集合体粒子寸法は明確に且ついつも測定することはさらに困難でありうる。本発明のある態様では、使用される二酸化珪素はコロイド状二酸化珪素である。コロイド状二酸化珪素は、珪素化合物、例えば四塩化珪素、の蒸気相加水分解（例えば、１１１０℃における）により製造されるミクロンより小さいヒュームドシリカである。そのような生成物は、カボット・コーポレーション（Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ツスコラ、イリノイ州（商品名ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ）およびデグッサ・インク（Ｄｅｇｕｓｓａ，Ｉｎｃ．）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州（商品名ＡＥＲＯＳＩＬ）を包含する多くの製造元から市販されている。
【００４６】
コロイド状二酸化珪素は、とりわけ、コロイド状シリカ、ヒュームドシリカ、弱無水珪酸、無水珪酸、およびヒュームド二酸化珪素としても知られている。製造方法を変えることにより、種々の商業用等級のコロイド状二酸化珪素が製造される。そのような改変は典型的には、シリカ含有量、比重、屈折率、色または非晶質形態に影響を与えない。しかしながら、これらの改変はコロイド状二酸化珪素生成物の粒子寸法、表面積およびかさ密度を変化させうる。
【００４７】
本発明の方法の特定態様で使用される二酸化珪素の１種の表面積は約５０ｍ２／ｇ〜約５００ｍ２／ｇの範囲内である。本発明で使用される二酸化珪素の好ましい種類の平均主要粒子直径は約５ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲内である。しかしながら、商業用コロイド状二酸化珪素生成物では、これらの粒子は種々の程度まで集塊化または集合されている。平均集合体粒子寸法（長さ）は約１００ｎｍ（０．１μｍ）〜約５００ｎｍ（０．５μｍ）でありうる。本発明で使用される二酸化珪素の１種のタップ密度は約２０ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌの範囲内である。
【００４８】
市販のコロイド状二酸化珪素生成物は、例えば、約５０ｍ２／ｇ〜約４００ｍ２／ｇの範囲内のＢＥＴ表面積を有することができる。市販の粒子寸法は約７ｎｍの名目粒子直径〜約４０ｎｍの平均主要粒子寸法の範囲内でありうる。これらの市販生成物は二酸化珪素の有用な種類の許容可能な性質の例示目的のためだけに記載されており、そしてこの記述は本発明の範囲を何らかの方法で限定しようとするものではない。
【００４９】
本発明の方法は、プリオンを血液血漿画分から分離するために使用できる。プリオンを血液血漿画分から分離するために使用する場合には、本発明の方法は、血液血漿画分からのプリオンの少なくとも約２〜少なくとも約３ｌｏｇの排除をもたらしうる。
【００５０】
本発明の方法は、プリオンを組み換え製造された生成物の水溶液から分離するために使用できる。組み換え製造された生成物は組み換え製造された蛋白質でありうる。
【００５１】
本発明の方法の特定態様では、粒状二酸化珪素を血液血漿画分に加えて混合物を生成することにより、可能性として血液血漿画分を汚染する病原性プリオン蛋白質を実質的に減少させることができる。特定の態様では、粒状二酸化珪素は混合物の約０．５％（重量／重量）まで加えられる。粒状二酸化珪素を次にこの混合物から除去し、そして生ずる溶液は出発物質と比べて実質的に減少したプリオン汚染を有する。ある態様では、二酸化珪素を濾過により除去することができる。
【００５２】
本発明の１つの態様に従い得られる結果は、清澄化されたスクレーピー脳ホモジェネート（ＳＢＨ）でスパイクされた牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ
Ｍ−５Ｐの添加によるＰｒＰＳｃの分配を測定するためのウェスタンブロット検定を使
用することにより、評価することができる。本発明によると、０．５％のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを添加し、引き続き０．８μｍ濾過を用いるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの除去により、検出限度である約４．５ｌｏｇまでの排除が得られうる（約０．５ｌｏｇより多くない排除は０．８μｍ濾過自体に起因する）。実施例１並びに図１および２を参照のこと。
【００５３】
さらに、プラスミノーゲンの精製工程中のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬヒュームドシリカ（約０．２５重量／重量％）の添加が病原性プリオン蛋白質の少なくともさらに約２−３ｌｏｇの排除をもたらす。実施例２はこの関係においてプリオン排除を評価するために行われた実験を記載する一方で、図３はこの結果のウェスタンブロット分析を示す。データは、ヒュームドシリカを添加せずに処理された試料と比べて３ｌｏｇの改良された排除を示す。
【００５４】
本発明の方法に従うプリオン排除を受けた試料を金属酸化物に対して液体試料中の懸濁液として曝すことができること、或いは液体の流動性試料を金属酸化物に固体基質の形態で曝すことができることは認識されよう。排除された試料は、種々の濾過プロトコールを用いる濾液状、遠心を用いる上澄み液状、または固体基質からの溶離液状を包含する種々の手段により回収することができる。
【００５５】
以下の実施例は本発明の特定態様を説明するものであるが、ここで請求された本発明の範囲の限定であるとみなすべきでない。
【実施例】
【００５６】
実施例１ 種々の濃度のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ Ｍ−５Ｐを用いるＰｒＰＳｃ排除
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解させて１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡの溶液を作成した。ＢＳＡ溶液をスクレーピー脳ホモジェネート（ＳＢＨ、２６３Ｋハムスター−に適応させた因子を感染させたハムスター脳を用いて製造された）で「スパイク」し、使用前に１０，０００ｇにおける１０分間にわたる遠心により高度に清澄化して約１％の最終濃度にした。ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ Ｍ−５Ｐシリカ（ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ）を種々の濃度で加え、引き続き攪拌しそして０．８μｍフィルターを用いて濾過した（濾過だけはＰｒＰＳｃにおける約０．５ｌｏｇ減少を引き起こすと推定された）。ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬはフィルターにより実質的に保持された。
【００５７】
投入試料、０％、０．１％、０．２５％および０．５％ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ濾液のウェスタンブロット分析が図１に示されている。図２はＰｒＰＳｃ排除に対するＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの濃度増加の影響のグラフ表示を示す。（物質および方法の詳細に関しては、バイエル・コーポレーション（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に譲渡されたＬｅｅ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，４３７，１０２号明細書、およびプリオン蛋白質の検出に関する敏感性ウェスタンブロット分析に関する詳細事項を与えるＬｅｅ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，” Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８４（１）：７７−８９（２０００）、並びに人間のプリオンの分配がハムスターのスクレーピーモデルで観察されたものと同様であることを示すＳｔｅｎｌａｎｄ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｓｈｅｅｐ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ，” Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４２（１１）：１４９７−５００（Ｎｏｖ ２００２）、および開示された方法により検出されたプリオンが動物感染度に関連することを示すＬｅｅ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，” Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４１（４）：４４９−５５（２００１）を参照すべきであり、これらの開示は引用することにより全てが本発明の内容となる）。
【００５８】
高度に精製された膜と会合していないスクレーピー脳スパイク（“Ｂｏｌｔｏｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，”Ｂｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，２５８：５７９−９０（１９８７）参照）が約０．５％の最終濃度で使用されたこと以外は、上記の実験を繰り返し、図１に示された結果を得た。投入試料、０％ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ、０．１％、０．２５％および０．５％のウェスタン分析は実質的に同じ結果を与え、０．５％のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの使用から生じた検出限度までの排除があった。しかしながら、清澄化されたスクレーピー脳ホモジェネートの０．８μｍ濾過による（得られた合計５ｌｏｇの中の）０．５ｌｏｇ排除とは対照的に、ボルトン調合物の２．５ｌｏｇ排除は濾過だけによるものであったことが注目された。
実施例２ プラスミノーゲン精製方法におけるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを用いるＰｒＰＳｃ排除
本発明の譲渡人に所有権のあるプラスミン／プラスミノーゲン精製方法の詳細は「可逆的に不活性酸性化されたプラスミン組成物の製造方法」の名称の現在出願継続中の米国特許出願（引用することにより本発明の内容となるＤａｄｄ，ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開番号ＵＳ２００２０１９２７９４Ａ１）に開示されている。ヒュームドシリカの使用を含む工程段階用の出発物質は、ここでカプリレート・ケーキ（Ｃａｐｒｙｌａｔｅ Ｃａｋｅ）Ｉ（ＣＣＩ）と称するカプリレート沈殿であるコーン（Ｃｏｈｎ）画分ＩＩおよびＩＩＩからの免疫グロブリンの精製中に生成するペーストである。
【００５９】
ＣＣＩを３時間にわたり２００ｍＭのＬ−リシンおよび０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液で抽出した。２％のヒフロ・スーパーセル（ＨＹＦＬＯ ＳＵＰＥＲＣＥＬ）（フィルター助剤−セライト・コーポレーション（Ｃｅｌｉｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ロンポク、カリフォルニア州）を加え、そして懸濁液をフィルター布を通して濾過して消費されたフィルター助剤を除去した。布濾過後に且つ３％のポリエチレングリコール３３５０（ＰＥＧ）の添加前に、スクレーピー脳ホモジェネートスパイクを加えた。生じたスパイクされた濾液を３つのアリコートに分割した。一つの部分はＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを受容せず、第二のものは０．２５％を受容し、そして第三のアリコートは０．５％（ｗ／ｗ）のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを受容した。さらに３時間の混合後に、２％（ｗ／ｗ）のフィルター助剤を加え、そして物質をクノ（ＣＵＮＯ）ＳＰ−９０フィルターパッドを通して濾過した。生じた濾液をＰｒＰ含有量に関してウェスタンブロットにより分析した。
【００６０】
結果は図３に示されている。結果は０．２５％および０．５％ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ濾液中に存在する０．５〜１．０ｌｏｇの信号を示すようである。対照試験を用いるその後の検討で、信号は二次抗体との非特異的ＩｇＧ反応でありそしてＰｒＰ関連性がないことが示された。ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬはＰｒＰをＣＣＩ抽出物質から除去したが、プラスミノーゲン濃度を包含する匹敵する蛋白質水準が３種全てのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ添加水準に関して観察された。それ故、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬは所望する蛋白質成分に対する最少の影響だけでＰｒＰを除去した。
【００６１】
他の実験では、２００ｍＭのＬ−リシン、４％のＰＥＧ、および０．２５％のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを含有する５０ｍＭの二塩基性燐酸ナトリウムを用いて、ＣＣＩを抽出した。１０％の粗製脳ホモジェネートを抽出開始時に加えそして４時間にわたり混合した。フィルターを加えそして溶液をクノＳＰ９０を通して濾過した。
【００６２】
信号が濾液およびすすぎ液中で出現する（図４）。上記のように、対照試験がこれらの信号がＰｒＰ特異的でないことを証明した。ＰｒＰはフィルター助剤中およびフィルターパッド上に保持された。
実施例３ プリオン排除用のＡｌ（ＯＨ）３
実施例１の通りにして、０．１％のＢＳＡ／ＴＢＳをＳＢＨでスパイクして１％または０．１％の最終濃度にした。水酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３、ゲルまたはスラリー状の１．９−２．２％（ｗ／ｗ）−ここでＡｌ（ＯＨ）３または水酸化アルミニウムとしても表示される）（アルヒドロゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）、スーパーフォス・バイオセクター（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）Ａ／Ｓ、デンマーク）をプリオン排除に有用な因子として評価するために、これらの試料を使用した。以下の容量／容量百分率は加えられたアルヒドロゲル生成物の割合をさす。
【００６３】
種々の量のＡｌ（ＯＨ）３（表１に示されているような０〜１８％（ｖ／ｖ）の最終濃度）をＳＢＨを含有する試料に加え、そして試料を実施例１のようにして混合した。試料を次に５１００ｇにおいて５分間にわたり遠心しそして上澄み液およびペレットをＰｒＰＳｃに関して検定した。図５において、レーンは表１の通りにして加えられたＡｌ（ＯＨ）３（％ｖ／ｖ）を有する試料の分析を表す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
１％ＳＢＨに関すると、４．５％（ｖ／ｖ）より多い量で処置された場合には水酸化アルミニウムに関して排除は４ｌｏｇより大きかった。０．１％ＳＢＨに関すると、１％（ｖ／ｖ）より多い水酸化アルミニウムに関して排除は３ｌｏｇより大きかった。
実施例４ プラスミノーゲン抽出方法の評価
本発明の特定の態様に従うＰｒＰＳｃ排除を評価するためのモデルシステムを確認するために、カプリレート・ケーキＩ（ＣＣＩ）抽出（プラスミノーゲン精製工程に関して以上で論じられている）用の規模縮小モデルがＰＥＧ沈殿／深度濾過段階（Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ／Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔｅｐｓ）の排除効果に関して同定された。この試験の目的は、標準条件下でのプラスミノーゲン方法におけるＣＣＩ抽出およびＰＥＧ沈殿／深度濾過段階のベンチ−スケールモデルを設定することであった。設定されたら、工程段階を越えるＰｒＰＳｃ排除を評価するためにこのモデルシステムを使用した。
【００６６】
簡単に述べると、ＣＣＩを０．１Ｍのトリズマ（ＴＲＩＺＭＡ）ベース抽出緩衝液（ｐＨ１０．５）の中に４℃において２−３時間にわたり混合しながら再懸濁させた。抽出後に、溶液のｐＨを７．５に調節し、そして抽出の温度が２０℃に上昇した。７．５のｐＨを保ちながら、Ｌ−リシンを抽出物に１００ｍＭの最終濃度まで加えた。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加え、引き続きヒフロ・スーパーセ
ル・フィルター助剤を４％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加えた。抽出物を次にクノＳＰ−３０フィルターパッドを通して濾過しそして濾液を集めた。試料が最初のＣＣＩ抽出物、濾液、および抽出物から集められた。合計蛋白質をＡ２８０により測定しそしてプラスミノーゲン回収率を免疫比濁法により測定した。回収率分析は、この段階を越えての非常に少量の蛋白質損失を示した。
【００６７】
次に、ＣＣＩおよびＰＥＧ沈殿／深層濾過段階中のＰｒＰＳｃ排除を評価した。この実験の目的は、ＣＣＩの抽出およびＰＥＧ沈殿／深層濾過段階中に除去されたＰｒＰＳｃの量を測定することであった。
【００６８】
ＣＣＩの抽出中に１ｍｌの１０％粗製ＳＢＨを１００ｍｌの抽出物に加えて０．１％の最終ＳＢＨ濃度を生じたこと以外は、プロトコールは上記と同じであった。クノＳＰ−３０フィルターにより保持されたペーストをＴＢＳ中に元の量となるまで再懸濁させた。プローブ（Ｐｒｏｖｅ）（濾過前のスパイクされた抽出物）、濾液およびペースト再懸濁液からの試料をウェスタン分析によりプラスミノーゲンおよびＰｒＰＳｃの両者に関して分析した。
【００６９】
上記の段階（水酸化アルミニウムまたはＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬなし）は１ｌｏｇのＰｒＰＳｃ排除を生じた。
実施例５ プラスミノーゲン回収率およびＰｒＰＳｃ排除に対するＡｌ（ＯＨ）３の影響
ＰＥＧ沈殿／深度濾過中のプラスミノーゲン回収率およびＰｒＰＳｃ排除に対する１０％（ｖ／ｖ）のＡｌ（ＯＨ）３（アルヒドロゲル、スーパーフォス・バイオセクターＡ／Ｓ、デンマーク）の影響を測定した。３％のＰＥＧの添加後に１０％のＡｌ（ＯＨ）３（ｖ／ｖ）を加えたこと以外は、プロトコールは実施例４において以上で記載された通りであった。クノＳＰ−３０フィルターにより保持されたペーストをＴＢＳ中に再懸濁させて元の容量とした。プローブ（濾過前のスパイクされた抽出物）、濾液およびペースト再懸濁液からの試料をウェスタン分析によりプラスミノーゲンおよびＰｒＰＳｃの両者に関して分析した。
【００７０】
以上で示された濃度でのＡｌ（ＯＨ）３の添加が２ｌｏｇのＰｒＰＳｃ排除における増加（ありの場合の約３ｌｏｇ対なしの場合の１ｌｏｇ）を生じた。
実施例６ プラスミノーゲン精製工程におけるＡｌ（ＯＨ）３を用いるＰｒＰＳｃ排除
カプリレート・ケーキＩ（ＣＣＩ）の処理中のＰｒＰＳｃ排除に対する３％のＡｌ（ＯＨ）３の影響を測定した。
【００７１】
上記の通りにしてＣＣＩを抽出しそして処理した。１つの実験では、布（多孔性ポリプロピレン）濾過前にＳＢＨスパイクおよび３％のＡｌ（ＯＨ）３（ｖ／ｖ）の両者を加えた。試料を投入試料（プローブ）および布濾液から除去した。ＰｒＰＳｃの存在を各試料においてウェスタン分析により測定した。
【００７２】
３％のＡｌ（ＯＨ）３（ｖ／ｖ）の含有が２ｌｏｇのＰｒＰＳｃの排除を生じた。Ａｌ（ＯＨ）３なしでは、排除は０ｌｏｇであった。
実施例７ ヒュームドシリカおよびヒュームドアルミナの比較
前の実験で使用されたＡｌ（ＯＨ）３スラリーとは対照的に、ヒュームドアルミナ（スペクトラル（ＳＰＥＣＴＲＡＬ）、カボット・コーポレーション（Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ツスコラ、イリノイ州）もヒュームドシリカ（ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ）に対するその影響を比較する実験において使用した。
【００７３】
５０ミリリットルのＴＢＳ中０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．５ｍｌの清澄化されたハムスターのスクレーピー脳ホモジェネートまたは高度に精製された（ボルトン
）スパイクを用いてスパイクした。スパイク後に、最初の１０ｍｌ試料（プローブ）を物質の最初の力価を測定するための分析用に取り出した。次に、約０．０５ｇのヒュームドアルミナまたはヒュームドシリカのいずれかを１５ｍｌ円錐管に加えた。これらの管の各々に、１０ｍｌのスパイクされた物質を加え、そして管を１５−２０回にわたり逆転させた。
【００７４】
プランジャーを３個の１０ｍｌ注射器から除去しそしてそれらを０．８μｍの注射器フィルターに装着することにより濾過装置を製造した。スパイキングタイプの各々に関して３回の濾過を行った。第一回の濾過は存在する金属酸化物を有しておらず、第二回の濾過はヒュームドアルミナを有しており、そして第三回の濾過はヒュームドシリカを有していた。プローブおよび生じた濾液をウェスタンブロットにより分析しそして下記の信号を見出した。
【００７５】
【表２】
【００７６】
両方のスパイキング条件下で両方の金属酸化物に関して検出限度までの排除が観察された。
【００７７】
本発明の主題をこれにより開示してきたが、本発明の多くの改変、置換、および変更がそれに照らして可能であることは明らかであるはずである。本発明を具体的な記載以外に実施しうることを理解すべきである。そのような改変、置換、および変更は本出願の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１はパネルに隣接して示された濃度におけるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（ヒュームドシリカ）を用いる濾過後の病原性プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の特異的検出を示すウェスタンブロットを示す。
【図２】図２は種々の量の加えられたＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを用いるＰｒＰＳｃの排除または除去のグラフ表示である。
【図３】図３はプラスミノーゲンの精製中のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。
【図４】図４は図３に示された結果を生ずる際にプラスミノーゲンの種々の精製工程の変動におけるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。
【図５】図５はＡｌ（ＯＨ）３の添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的物質からの病原性プリオン蛋白質の分離または排除に関する。生物学的物質を例えばヒュームド（ｆｕｍｅｄ）シリカの如きヒュームド金属酸化物を包含する金属酸化物および／または粒状二酸化珪素に曝すことにより、病原性プリオンが生物学的物質から分離される。
【背景技術】
【０００２】
病原性プリオン蛋白質（病原性プリオン）は、ヒト並びに他の哺乳動物種、特に羊、山羊、牛、ミンク、エルク、および鹿における致死的な神経変性疾病である伝搬性海綿形態脳障害（ＴＳＥ）に関連する。疾病のヒト形態は、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン−ストラウスラー−シェインカー（ＧＳＳ）症候群、致死的な家族性不眠症（ＦＦＩ）、およびクールーを包含する。これらの疾病の症状は、ミオクロヌス、運動失調、および進行性認知症を包含する。これらの疾病の病理学は、脳内のアミロイドプラークの生成を包含する。
【０００３】
プリオン疾病の発生は感染性伝播並びに遺伝的および散在的原因に関連していた。例えば、ニューギニアのフォア（Ｆｏｒｅ）族を苦しめたクールーは儀式的人肉嗜食中の他の部族員の感染された脳組織の摂取により引き起こされた。非特許文献１。より最近では、英国における変種ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）の発生が病原性プリオンが感染した牛からの牛肉の消費の結果であることが前提にされている。非特許文献２、非特許文献３。同様に、医原性ＣＪＤは死体の下垂体から由来するヒト成長ホルモンの注射により引き起こされた。非特許文献４。上記のようなプリオンの感染作用の症例は、プリオン感染性が生物学的物質を通して伝播されうることを示唆している。
【０００４】
プリオンは、核酸の同時伝播なしに、プリオン蛋白質である蛋白質の伝播により人間および他の哺乳動物に感染することが、信じられている。この感染因子は天然産出性の細胞プリオン蛋白質（ＰｒＰＣ）の疾病を引き起こす変種であると仮定されており、その生理学的機能は知られていない。この理論では、プリオン蛋白質の変種形態（ＰｒＰＳｃ）がプリオン蛋白質の正常形態（ＰｒＰＣ）において構造変化を誘発し、それによりそれを病原性プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の疾病を引き起こす形態に転化させる。試料をプロテイナーゼＫ処理にかけそして試料をプロテイナーゼ耐性ポリペプチド（ＰｒＰＲＥＳ）の存在に関して分析することにより、ＰｒＰＳｃを検出することができる。バイエル・コーポレーション（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に譲渡されたＬｅｅ，ｅｔ ａｌ．の特許文献１および非特許文献５を参照のこと。
【０００５】
治療組成物はしばしば生物学的物質から誘導される。例えば、因子ＶＩＩＩ、免疫グロブリン類、α−１プロテイナーゼ阻害剤、プラスミノーゲン／プラスミン、およびアルブミンの如き治療的に価値ある蛋白質がヒト血漿から単離される。例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および肝炎Ｃウイルス（ＨＣＶ）の如き他の感染因子が、生成物処理流から因子を効果的に除去する不活性化方法または工程を受けなかった血液または血液生成物の治療使用により伝播されることが知られている。他の生物学的物質を通るＴＳＥの伝播の証明が、血液および血液由来生成物、組み換え生成物、並びに生物起源の他の生成物を通るＴＳＥの可能な伝播より重要性を強める。
【０００６】
しかしながら、血液発生性病原体、例えばＨＩＶおよびＨＣＶ、からの感染の危険性を減少させる既知の方法は不活性化プリオンでは有効でない。さらに、強塩基を用いる処理および／またはオートクレーブ処理を包含するプリオンからの感染の危険性を減少させる
方法は、治療またはその他の有用な蛋白質の製造工程が蛋白質を変性させるため、そのような工程と共に使用するためには適していない。
【特許文献１】米国特許第６，４３７，１０２号明細書
【非特許文献１】Ａｌｐｅｒｓ，“Ｓｌｏｗ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｖｏｌ．１，Ｓ．Ｂ．Ｐｒｕｉｓｎｅｒ ａｎｄ Ｗ．Ｊ．Ｈａｄｌｏｗ，ｅｄｓ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），ｐｐ．６６−９００（１９７９）
【非特許文献２】Ｇ．Ｃｈａｚｏｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３４７：１１８１（１９９６）
【非特許文献３】Ｒ．Ｇ．Ｗｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３４７：９２１−２５（１９９６）
【非特許文献４】Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３４０：２４−２７（１９９２）
【非特許文献５】Ｌｅｅ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，”Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８４（１）：７７−８９（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、例えば血液血漿画分および組み換え製造された蛋白質の水溶液の如き生物学的物質からプリオンを分離する方法が要望されている。本発明は治療的に価値ある蛋白質を変性させずにそのような生物学的物質からプリオンを分離する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要旨
本発明は生物学的物質からのプリオンの分離または排除方法を提供する。そのような方法は生物学的物質から発生する生成物が元の物質から由来する病原性プリオン蛋白質で感染され始めたかもしれないヒトまたは動物によるその後の使用にとって確実に安全にするために有用であることは認識されよう。
【０００９】
従って、本発明の一面は、金属酸化物を生物学的物質に加えて金属酸化物および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、そして金属酸化物を混合物から分離して生ずる溶液を形成することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を、生ずる溶液中で実質的に減少させる。ある態様では、この方法は、病原性プリオン蛋白質の存在または量に関する生ずる溶液の評価を含んでなる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、約１５０ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられるヒュームドシリカを生物学的物質に加えてヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、混合物を少なくともヒュームドシリカの粒子の実質的部分を保持するフィルターを含んでなる濾過システムを通過させることによりヒュームドシリカを混合物から分離して生ずる溶液を形成し、そして生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して免疫検定を用いて評価することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を、生ずる溶液中で実質的に減少させる。
【００１１】
別の面では、本発明は、二酸化珪素粒子を生物学的物質に加えて二酸化珪素粒子および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、二酸化珪素粒子を混合物から分離して生ず
る溶液を形成し、そして生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して評価することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を、生ずる溶液中で実質的に減少させる。
【００１２】
本発明は、また、試料を流動性液体状態で金属酸化物を含んでなる固体基質と接触させ、試料中のプリオンが基質と結合するような時間にわたり試料を基質と接触させたままにし、そして試料を基質から分離することによりプリオンを試料から分離する方法に関する。
【００１３】
本発明は、さらに、試料を粒状金属酸化物と接触させ、粒状金属酸化物を試料から分離し、そして粒状金属酸化物と会合したプリオン蛋白質をさらなる分析にかけることによりプリオン蛋白質を試料から分離しそしてそれらをさらなる分析のために濃縮する方法に関する。
図面の簡単な説明
図１は、パネルに隣接して示された濃度におけるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（ヒュームドシリカ）を用いる濾過後の病原性プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の特異的検出を示すウェスタンブロットを示す。使用された物質および方法は実施例１に示された通りである。
【００１４】
図２は、種々の量の加えられたＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを用いるＰｒＰＳｃの排除または除去のグラフ表示である。グラフを作成するために使用されたデータは図１に示されたようにウェスタンブロット実験で示されている。
【００１５】
図３は、プラスミノーゲンの精製中のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。物質および方法に関する詳細に関しては実施例２を参照のこと。
【００１６】
図４は、図３に示された結果を生ずる際にプラスミノーゲンの種々の精製工程の変動におけるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。物質および方法に関する詳細に関しては実施例２を参照のこと。
【００１７】
図５は、Ａｌ（ＯＨ）３の添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。レーンは、以下の通りにして加えられたＡｌ（ＯＨ）３（アンヒドロゲル（ＡＮＨＹＤＲＯＧＥＬ）の％ｖ／ｖ）を有する試料の分析を表す：ａ、０；ｂ、１；ｃ、２；ｄ、５；ｅ、１０；およびｆ、１８。物質および方法に関する詳細に関しては実施例３を参照のこと。
詳細な記述
本発明は、可能性として溶液を汚染する病原性プリオン蛋白質を出発溶液に比べて実質的に減少させる溶液の製造方法に関する。本発明は、また、汚染された溶液からのプリオン蛋白質の回収を基にしたさらなる分析のためのそれらの製造も提供する。
【００１８】
従って、一面では、本発明は、金属酸化物を生物学的物質に加えて金属酸化物および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、そして金属酸化物を混合物から分離して生ずる溶液を形成することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。ある態様では、この方法は、病原性プリオン蛋白質の存在または量に関する生ずる溶液の評価を含んでなる。
【００１９】
特定の態様では、生物学的物質は血液−由来生成物、組織−由来生成物、および組み換え製造された生成物でありうる。ある態様では、生物学的物質は血液−由来生成物である。血液−由来生成物はヒト起源でありうる。血液−由来生成物は免疫グロブリン類、血液凝固因子、プラスミン、プラスミノーゲン、α−１プロテイナーゼ阻害剤、およびアルブ
ミンでありうる。
【００２０】
特定の態様では、金属酸化物はヒュームドシリカまたはヒュームドアルミナでありうる。ヒュームド金属酸化物はヒュームドシリカでありうる。ヒュームドシリカは約１３０ｍ２／ｇ〜約３８０ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられうる。特定の態様では、ヒュームドシリカは約１５０ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられうる。ヒュームドシリカは２００ｍ２／ｇの比表面積によっても特徴づけられうる。
【００２１】
ある態様では、金属酸化物は混合物から濾過により分離される。濾過は、約０．１ｍｍより大きいものから約５ｍｍまでの粒子を保持する濾過システム中の混合物の通過を包含しうる。濾過はまた、約０．８μｍより大きい粒子を保持する濾過システム中の混合物の通過も包含しうる。
【００２２】
病原性プリオン蛋白質の存在または量に関する生ずる溶液の評価は、病原性プリオン蛋白質に関する動物生物学的検定または免疫検定を用いる感染性に関する試料の評価を包含しうる。免疫検定はウェスタンブロットまたはエリザ（ＥＬＩＳＡ）検定でありうる。
【００２３】
ある態様では、金属酸化物は水酸化アルミニウムでありうる。水酸化アルミニウムは、約２重量％のＡｌ２Ｏ３を含んでなるゲル状として、約１〜約１０容量％の、約１〜約５容量％の、または約３容量％の濃度で存在しうる。
【００２４】
別の態様では、金属酸化物はヒュームドアルミナでありうる。ヒュームドアルミナは約０．１〜約１．０重量％の量で存在しうる。ヒュームドアルミナは約０．２５〜約０．７５重量％の量でも存在しうる。ヒュームドアルミナは約０．５重量％の量でも存在しうる。
【００２５】
さらに別の態様では、本発明は、約１５０ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられるヒュームドシリカを生物学的物質に加えてヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、混合物をヒュームドシリカの粒子の少なくとも実質的部分を保持するフィルターを含んでなる濾過システム中に通過させることによりヒュームドシリカを混合物から分離して生ずる溶液を形成し、そして生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して免疫検定を用いて評価することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。
【００２６】
ある態様では、ヒュームドシリカは、約２００ｍ２／ｇの比表面積、約５０ｇ／ｌのタップ密度（ｔａｐ ｄｅｎｓｉｔｙ）、および約０．２μｍ〜約０．３μｍの平均集合体粒子長さにより特徴づけられる。ヒュームドシリカはヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の約０．１％〜約１．０％（重量／重量）の量で加えられる。ヒュームドシリカはヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の約０．２％〜約０．８％（重量／重量）の量で加えることができる。ヒュームドシリカはヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の少なくとも約０．２５％（重量／重量）の量で加えることができる。特別な態様では、ヒュームドシリカはヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の少なくとも約０．５％（重量／重量）の量で加えることができる。
【００２７】
別の面では、本発明は、二酸化珪素粒子を生物学的物質に加えて二酸化珪素粒子および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、二酸化珪素粒子を混合物から分離して生ずる溶液を形成し、そして生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して評価することにより生物学的物質を含有する溶液を製造する方法に関する。事によると生物学的物質を汚染する病原性プリオン蛋白質を、生ずる溶液中で実質的に減少させる。
【００２８】
ある態様では、混合物からの二酸化珪素粒子の分離は遠心または濾過により行われる。
【００２９】
別の面では、本発明は、試料を流動性液体状態で金属酸化物を含んでなる固体基質と接触させ、試料中のプリオンが基質と結合するような時間にわたり試料を基質と接触させたままにし、そして試料を基質から分離することによりプリオンを試料から分離する方法に関する。金属酸化物は二酸化珪素または水酸化アルミニウムでありうる。金属酸化物はヒュームドシリカでありうる。
【００３０】
別の面では、本発明は、試料を粒状金属酸化物と接触させ、粒状金属酸化物を試料から分離し、粒状金属酸化物と会合したプリオン蛋白質をさらなる分析にかけることによりプリオン蛋白質を試料から分離しそしてそれらをさらなる分析のために濃縮する方法に関する。プリオン蛋白質のさらなる分析は、免疫検定、動物生物学的検定、分光分析、またはクロマトグラフィー分析を包含しうる。
【００３１】
本発明は、生物学的物質からのプリオンの分離または排除方法を提供する。生物学的物質は、生物学的に由来する流体、例えば血液血漿画分、生物学的物質、例えば組織の試料、および組み換え製造された生成物、例えば組み換え蛋白質の水溶液を包含する。一般的に、この方法は、粒状二酸化珪素または金属酸化物を生物学的物質に加えて粒状二酸化珪素または金属酸化物および生物学的物質の混合物を得ることによる生物学的物質からのプリオンの分離を提供する。粒状二酸化珪素または金属酸化物を次に混合物から、例えば濾過または遠心により分離して、元の生物学的物質を汚染したかもしれない病原性プリオン蛋白質における実質的な減少により特徴づけられる精製された生物学的物質を得る。
【００３２】
そのような方法は、生物学的物質から発生する生成物が元の物質から生ずる病原性プリオン蛋白質で感染し始めたかもしれないヒトまたは動物によるその後の使用にとって安全を確保するために有用であることは認識されよう。従って、本発明の実施法は、病原性プリオン蛋白質を実際に含んでなっていてもまたは含んでなっていなくてもよい生物学的物質に関して開示された方法を、生物学的物質を可能性として汚染させる処理用の品質確保方法として包含する。
【００３３】
ここで使用される際には、下記の用語は断らない限り指示された意味を有する。
【００３４】
「動物生物学的検定」は、病原性プリオン蛋白質により引き起こされるかまたは関連する疾病に敏感な生存有機体中への物質の試験試料の導入に関連する物質中の病原性プリオンの検定と、その後の関連疾病症状の進行証拠に関する有機体の監視を意味する。動物生物学的検定は、Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ，”Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，３８（９）：８１０−６（１９９８）に記載されている齧歯動物感染性検定を包含するが、それに限定されるものではない。
【００３５】
「血液−由来生成物」は、全血または分画血液起源、一般的には哺乳動物から製造されるいずれかの生成物を意味する。
【００３６】
「生物学的物質」は、溶液状で処理できる生存有機体から発生するいずれかの物質を意味する。本発明の方法にかけることができる生物学的物質はいずれの生物学的物質も包含しうるが、一般的にはその起源、処理履歴または他の露呈の理由のために可能性として病原性プリオン蛋白質で汚染される物質であろう。
【００３７】
「金属酸化物」は、重量と比べて大きい表面積を有する小粒子形態の金属酸化物を意味する。水素および酸素または空気の火炎中への金属塩化物の注入により一般的に製造されるヒュームド金属酸化物（「ヒュームド」または発熱性（ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ）金属酸化物）が包含される。一般的に、そのような物質は非晶質であるが、種々の結晶性相の混合物を含んでなりうる。粒状二酸化珪素および水酸化アルミニウムが包含される。そのような粒子は主要粒子の三次元集合体を形成しうる。ヒュームド金属酸化物はヒュームドシリカおよびヒュームドアルミナを包含する。
【００３８】
「ヒュームドシリカ」は、発熱性の非晶質コロイド状二酸化珪素を意味する。
【００３９】
「免疫検定」は、抗体およびプリオン蛋白質の間の特定なそして検出可能な相互作用に基づく検定を意味する。免疫検定自体がプリオン蛋白質の非病原性および病原性イソ形態（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）に関して非特異的である場合には、その使用を例えば非病原性イソ形態の蛋白分解消化によりイソ形態間を実質的に区別する工程と組み合わせることができる。有用な免疫検定の例は、ウェスタンブロット、エリザ、およびドットブロット検定を包含する。
【００４０】
「病原性プリオン」または「ＰｒＰＳｃ」は、ヒトの伝搬性海綿形態脳炎（例えば、変種クロイツフェルト−ヤコブ病（ｖＣＪＤ）、クールー、ゲルストマン−ストラウスラー−シェインカー病（ＧＳＳ）、および致死的な家族性不眠症（ＦＦＩ）、牛の海綿形態脳炎（「狂牛」病）の最近同定された形態、スクレーピー（羊および山羊を苦しめる）、慢性消耗病（鹿）、並びにプリオン蛋白質の病原性形態（スクレーピーイソ形態−ＰｒＰＳｃ）への露呈により広がる他の部分的に同定されたおよびまだ同定されていない疾病を包含するヒトまたは他の哺乳動物を苦しめる種々の伝搬性神経変性疾病のいずれかに関連するいずれかの蛋白質感染因子を意味する（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｓ．Ｂ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１５１５−１５２２（１９９１）参照）。
【００４１】
「組み換え製造された生成物」は、人造核酸構成体（例えば天然有機体において通常は製造されないかまたは特定量で製造されない蛋白質生成物を製造するために変更されたトランスジェニック有機体を発生するために使用される構成体）を用いて製造されるいずれかの生成物を意味する。そのような生成物は、組み換え製造方法でまたはその他の方法で使用される動物に対するいずれかの露呈によって可能性として病原性プリオン蛋白質で汚染されうる。「組み換え体」は元来は組み換え方法による製造を意味すること、並びに組み換え生成物のその後の製造をそれ自体でまたは自然に技術的には非組み換え体（例えば、組み換え技術により元来製造されそしてその後に組み換え生成物の製造のために伝播されるトランスジェニック動物）である方法で実施しうることは認識されよう。
【００４２】
「二酸化珪素」は、微細粒子寸法の高表面積の二酸化珪素粒子または粒子の集合体を意味する。
【００４３】
「比表面積」は、例えばＢ．Ｅ．Ｔ．（ブルナウアー、エメット、およびテラー）方法により測定されるような粒状固体の単位重量当たりの表面積を意味する。
【００４４】
「組織−由来生成物」は、生存有機体の組織から製造されるいずれかの生成物を意味し、治療的または栄養的使用のために製造される生成物を包含し、その処理は、少なくとも一面では、製造段階または処理段階である金属酸化物または粒状二酸化珪素または水酸化アルミニウムとの混合物を形成可能な溶液の製造を伴う。
【００４５】
本発明の方法における使用のためのヒュームド金属酸化物はヒュームドシリカまたはヒュームドアルミナでありうる。本発明の方法の少なくとも一部の態様に従い使用できる粒状二酸化珪素は非常に微細な主要粒子寸法により特徴づけられる。平均集合体粒子寸法は明確に且ついつも測定することはさらに困難でありうる。本発明のある態様では、使用される二酸化珪素はコロイド状二酸化珪素である。コロイド状二酸化珪素は、珪素化合物、例えば四塩化珪素、の蒸気相加水分解（例えば、１１１０℃における）により製造されるミクロンより小さいヒュームドシリカである。そのような生成物は、カボット・コーポレーション（Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ツスコラ、イリノイ州（商品名ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ）およびデグッサ・インク（Ｄｅｇｕｓｓａ，Ｉｎｃ．）、ピスカタウェイ、ニュージャージー州（商品名ＡＥＲＯＳＩＬ）を包含する多くの製造元から市販されている。
【００４６】
コロイド状二酸化珪素は、とりわけ、コロイド状シリカ、ヒュームドシリカ、弱無水珪酸、無水珪酸、およびヒュームド二酸化珪素としても知られている。製造方法を変えることにより、種々の商業用等級のコロイド状二酸化珪素が製造される。そのような改変は典型的には、シリカ含有量、比重、屈折率、色または非晶質形態に影響を与えない。しかしながら、これらの改変はコロイド状二酸化珪素生成物の粒子寸法、表面積およびかさ密度を変化させうる。
【００４７】
本発明の方法の特定態様で使用される二酸化珪素の１種の表面積は約５０ｍ２／ｇ〜約５００ｍ２／ｇの範囲内である。本発明で使用される二酸化珪素の好ましい種類の平均主要粒子直径は約５ｎｍ〜約５０ｎｍの範囲内である。しかしながら、商業用コロイド状二酸化珪素生成物では、これらの粒子は種々の程度まで集塊化または集合されている。平均集合体粒子寸法（長さ）は約１００ｎｍ（０．１μｍ）〜約５００ｎｍ（０．５μｍ）でありうる。本発明で使用される二酸化珪素の１種のタップ密度は約２０ｇ／ｌ〜約１００ｇ／ｌの範囲内である。
【００４８】
市販のコロイド状二酸化珪素生成物は、例えば、約５０ｍ２／ｇ〜約４００ｍ２／ｇの範囲内のＢＥＴ表面積を有することができる。市販の粒子寸法は約７ｎｍの名目粒子直径〜約４０ｎｍの平均主要粒子寸法の範囲内でありうる。これらの市販生成物は二酸化珪素の有用な種類の許容可能な性質の例示目的のためだけに記載されており、そしてこの記述は本発明の範囲を何らかの方法で限定しようとするものではない。
【００４９】
本発明の方法は、プリオンを血液血漿画分から分離するために使用できる。プリオンを血液血漿画分から分離するために使用する場合には、本発明の方法は、血液血漿画分からのプリオンの少なくとも約２〜少なくとも約３ｌｏｇの排除をもたらしうる。
【００５０】
本発明の方法は、プリオンを組み換え製造された生成物の水溶液から分離するために使用できる。組み換え製造された生成物は組み換え製造された蛋白質でありうる。
【００５１】
本発明の方法の特定態様では、粒状二酸化珪素を血液血漿画分に加えて混合物を生成することにより、可能性として血液血漿画分を汚染する病原性プリオン蛋白質を実質的に減少させることができる。特定の態様では、粒状二酸化珪素は混合物の約０．５％（重量／重量）まで加えられる。粒状二酸化珪素を次にこの混合物から除去し、そして生ずる溶液は出発物質と比べて実質的に減少したプリオン汚染を有する。ある態様では、二酸化珪素を濾過により除去することができる。
【００５２】
本発明の１つの態様に従い得られる結果は、清澄化されたスクレーピー脳ホモジェネート（ＳＢＨ）でスパイクされた牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ
Ｍ−５Ｐの添加によるＰｒＰＳｃの分配を測定するためのウェスタンブロット検定を使
用することにより、評価することができる。本発明によると、０．５％のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを添加し、引き続き０．８μｍ濾過を用いるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの除去により、検出限度である約４．５ｌｏｇまでの排除が得られうる（約０．５ｌｏｇより多くない排除は０．８μｍ濾過自体に起因する）。実施例１並びに図１および２を参照のこと。
【００５３】
さらに、プラスミノーゲンの精製工程中のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬヒュームドシリカ（約０．２５重量／重量％）の添加が病原性プリオン蛋白質の少なくともさらに約２−３ｌｏｇの排除をもたらす。実施例２はこの関係においてプリオン排除を評価するために行われた実験を記載する一方で、図３はこの結果のウェスタンブロット分析を示す。データは、ヒュームドシリカを添加せずに処理された試料と比べて３ｌｏｇの改良された排除を示す。
【００５４】
本発明の方法に従うプリオン排除を受けた試料を金属酸化物に対して液体試料中の懸濁液として曝すことができること、或いは液体の流動性試料を金属酸化物に固体基質の形態で曝すことができることは認識されよう。排除された試料は、種々の濾過プロトコールを用いる濾液状、遠心を用いる上澄み液状、または固体基質からの溶離液状を包含する種々の手段により回収することができる。
【００５５】
以下の実施例は本発明の特定態様を説明するものであるが、ここで請求された本発明の範囲の限定であるとみなすべきでない。
【実施例】
【００５６】
実施例１ 種々の濃度のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ Ｍ−５Ｐを用いるＰｒＰＳｃ排除
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解させて１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡの溶液を作成した。ＢＳＡ溶液をスクレーピー脳ホモジェネート（ＳＢＨ、２６３Ｋハムスター−に適応させた因子を感染させたハムスター脳を用いて製造された）で「スパイク」し、使用前に１０，０００ｇにおける１０分間にわたる遠心により高度に清澄化して約１％の最終濃度にした。ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ Ｍ−５Ｐシリカ（ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ）を種々の濃度で加え、引き続き攪拌しそして０．８μｍフィルターを用いて濾過した（濾過だけはＰｒＰＳｃにおける約０．５ｌｏｇ減少を引き起こすと推定された）。ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬはフィルターにより実質的に保持された。
【００５７】
投入試料、０％、０．１％、０．２５％および０．５％ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ濾液のウェスタンブロット分析が図１に示されている。図２はＰｒＰＳｃ排除に対するＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの濃度増加の影響のグラフ表示を示す。（物質および方法の詳細に関しては、バイエル・コーポレーション（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に譲渡されたＬｅｅ，ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第６，４３７，１０２号明細書、およびプリオン蛋白質の検出に関する敏感性ウェスタンブロット分析に関する詳細事項を与えるＬｅｅ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｓｔｅｐｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，” Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８４（１）：７７−８９（２０００）、並びに人間のプリオンの分配がハムスターのスクレーピーモデルで観察されたものと同様であることを示すＳｔｅｎｌａｎｄ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｓｈｅｅｐ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ，” Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４２（１１）：１４９７−５００（Ｎｏｖ ２００２）、および開示された方法により検出されたプリオンが動物感染度に関連することを示すＬｅｅ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，” Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，４１（４）：４４９−５５（２００１）を参照すべきであり、これらの開示は引用することにより全てが本発明の内容となる）。
【００５８】
高度に精製された膜と会合していないスクレーピー脳スパイク（“Ｂｏｌｔｏｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，”Ｂｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，２５８：５７９−９０（１９８７）参照）が約０．５％の最終濃度で使用されたこと以外は、上記の実験を繰り返し、図１に示された結果を得た。投入試料、０％ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ、０．１％、０．２５％および０．５％のウェスタン分析は実質的に同じ結果を与え、０．５％のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの使用から生じた検出限度までの排除があった。しかしながら、清澄化されたスクレーピー脳ホモジェネートの０．８μｍ濾過による（得られた合計５ｌｏｇの中の）０．５ｌｏｇ排除とは対照的に、ボルトン調合物の２．５ｌｏｇ排除は濾過だけによるものであったことが注目された。
実施例２ プラスミノーゲン精製方法におけるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを用いるＰｒＰＳｃ排除
本発明の譲渡人に所有権のあるプラスミン／プラスミノーゲン精製方法の詳細は「可逆的に不活性酸性化されたプラスミン組成物の製造方法」の名称の現在出願継続中の米国特許出願（引用することにより本発明の内容となるＤａｄｄ，ｅｔ ａｌ．の米国特許出願公開番号ＵＳ２００２０１９２７９４Ａ１）に開示されている。ヒュームドシリカの使用を含む工程段階用の出発物質は、ここでカプリレート・ケーキ（Ｃａｐｒｙｌａｔｅ Ｃａｋｅ）Ｉ（ＣＣＩ）と称するカプリレート沈殿であるコーン（Ｃｏｈｎ）画分ＩＩおよびＩＩＩからの免疫グロブリンの精製中に生成するペーストである。
【００５９】
ＣＣＩを３時間にわたり２００ｍＭのＬ−リシンおよび０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液で抽出した。２％のヒフロ・スーパーセル（ＨＹＦＬＯ ＳＵＰＥＲＣＥＬ）（フィルター助剤−セライト・コーポレーション（Ｃｅｌｉｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ロンポク、カリフォルニア州）を加え、そして懸濁液をフィルター布を通して濾過して消費されたフィルター助剤を除去した。布濾過後に且つ３％のポリエチレングリコール３３５０（ＰＥＧ）の添加前に、スクレーピー脳ホモジェネートスパイクを加えた。生じたスパイクされた濾液を３つのアリコートに分割した。一つの部分はＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを受容せず、第二のものは０．２５％を受容し、そして第三のアリコートは０．５％（ｗ／ｗ）のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを受容した。さらに３時間の混合後に、２％（ｗ／ｗ）のフィルター助剤を加え、そして物質をクノ（ＣＵＮＯ）ＳＰ−９０フィルターパッドを通して濾過した。生じた濾液をＰｒＰ含有量に関してウェスタンブロットにより分析した。
【００６０】
結果は図３に示されている。結果は０．２５％および０．５％ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ濾液中に存在する０．５〜１．０ｌｏｇの信号を示すようである。対照試験を用いるその後の検討で、信号は二次抗体との非特異的ＩｇＧ反応でありそしてＰｒＰ関連性がないことが示された。ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬはＰｒＰをＣＣＩ抽出物質から除去したが、プラスミノーゲン濃度を包含する匹敵する蛋白質水準が３種全てのＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ添加水準に関して観察された。それ故、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬは所望する蛋白質成分に対する最少の影響だけでＰｒＰを除去した。
【００６１】
他の実験では、２００ｍＭのＬ−リシン、４％のＰＥＧ、および０．２５％のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを含有する５０ｍＭの二塩基性燐酸ナトリウムを用いて、ＣＣＩを抽出した。１０％の粗製脳ホモジェネートを抽出開始時に加えそして４時間にわたり混合した。フィルターを加えそして溶液をクノＳＰ９０を通して濾過した。
【００６２】
信号が濾液およびすすぎ液中で出現する（図４）。上記のように、対照試験がこれらの信号がＰｒＰ特異的でないことを証明した。ＰｒＰはフィルター助剤中およびフィルターパッド上に保持された。
実施例３ プリオン排除用のＡｌ（ＯＨ）３
実施例１の通りにして、０．１％のＢＳＡ／ＴＢＳをＳＢＨでスパイクして１％または０．１％の最終濃度にした。水酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３、ゲルまたはスラリー状の１．９−２．２％（ｗ／ｗ）−ここでＡｌ（ＯＨ）３または水酸化アルミニウムとしても表示される）（アルヒドロゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）、スーパーフォス・バイオセクター（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）Ａ／Ｓ、デンマーク）をプリオン排除に有用な因子として評価するために、これらの試料を使用した。以下の容量／容量百分率は加えられたアルヒドロゲル生成物の割合をさす。
【００６３】
種々の量のＡｌ（ＯＨ）３（表１に示されているような０〜１８％（ｖ／ｖ）の最終濃度）をＳＢＨを含有する試料に加え、そして試料を実施例１のようにして混合した。試料を次に５１００ｇにおいて５分間にわたり遠心しそして上澄み液およびペレットをＰｒＰＳｃに関して検定した。図５において、レーンは表１の通りにして加えられたＡｌ（ＯＨ）３（％ｖ／ｖ）を有する試料の分析を表す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
１％ＳＢＨに関すると、４．５％（ｖ／ｖ）より多い量で処置された場合には水酸化アルミニウムに関して排除は４ｌｏｇより大きかった。０．１％ＳＢＨに関すると、１％（ｖ／ｖ）より多い水酸化アルミニウムに関して排除は３ｌｏｇより大きかった。
実施例４ プラスミノーゲン抽出方法の評価
本発明の特定の態様に従うＰｒＰＳｃ排除を評価するためのモデルシステムを確認するために、カプリレート・ケーキＩ（ＣＣＩ）抽出（プラスミノーゲン精製工程に関して以上で論じられている）用の規模縮小モデルがＰＥＧ沈殿／深度濾過段階（Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ／Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔｅｐｓ）の排除効果に関して同定された。この試験の目的は、標準条件下でのプラスミノーゲン方法におけるＣＣＩ抽出およびＰＥＧ沈殿／深度濾過段階のベンチ−スケールモデルを設定することであった。設定されたら、工程段階を越えるＰｒＰＳｃ排除を評価するためにこのモデルシステムを使用した。
【００６６】
簡単に述べると、ＣＣＩを０．１Ｍのトリズマ（ＴＲＩＺＭＡ）ベース抽出緩衝液（ｐＨ１０．５）の中に４℃において２−３時間にわたり混合しながら再懸濁させた。抽出後に、溶液のｐＨを７．５に調節し、そして抽出の温度が２０℃に上昇した。７．５のｐＨを保ちながら、Ｌ−リシンを抽出物に１００ｍＭの最終濃度まで加えた。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を３％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加え、引き続きヒフロ・スーパーセ
ル・フィルター助剤を４％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで加えた。抽出物を次にクノＳＰ−３０フィルターパッドを通して濾過しそして濾液を集めた。試料が最初のＣＣＩ抽出物、濾液、および抽出物から集められた。合計蛋白質をＡ２８０により測定しそしてプラスミノーゲン回収率を免疫比濁法により測定した。回収率分析は、この段階を越えての非常に少量の蛋白質損失を示した。
【００６７】
次に、ＣＣＩおよびＰＥＧ沈殿／深層濾過段階中のＰｒＰＳｃ排除を評価した。この実験の目的は、ＣＣＩの抽出およびＰＥＧ沈殿／深層濾過段階中に除去されたＰｒＰＳｃの量を測定することであった。
【００６８】
ＣＣＩの抽出中に１ｍｌの１０％粗製ＳＢＨを１００ｍｌの抽出物に加えて０．１％の最終ＳＢＨ濃度を生じたこと以外は、プロトコールは上記と同じであった。クノＳＰ−３０フィルターにより保持されたペーストをＴＢＳ中に元の量となるまで再懸濁させた。プローブ（Ｐｒｏｖｅ）（濾過前のスパイクされた抽出物）、濾液およびペースト再懸濁液からの試料をウェスタン分析によりプラスミノーゲンおよびＰｒＰＳｃの両者に関して分析した。
【００６９】
上記の段階（水酸化アルミニウムまたはＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬなし）は１ｌｏｇのＰｒＰＳｃ排除を生じた。
実施例５ プラスミノーゲン回収率およびＰｒＰＳｃ排除に対するＡｌ（ＯＨ）３の影響
ＰＥＧ沈殿／深度濾過中のプラスミノーゲン回収率およびＰｒＰＳｃ排除に対する１０％（ｖ／ｖ）のＡｌ（ＯＨ）３（アルヒドロゲル、スーパーフォス・バイオセクターＡ／Ｓ、デンマーク）の影響を測定した。３％のＰＥＧの添加後に１０％のＡｌ（ＯＨ）３（ｖ／ｖ）を加えたこと以外は、プロトコールは実施例４において以上で記載された通りであった。クノＳＰ−３０フィルターにより保持されたペーストをＴＢＳ中に再懸濁させて元の容量とした。プローブ（濾過前のスパイクされた抽出物）、濾液およびペースト再懸濁液からの試料をウェスタン分析によりプラスミノーゲンおよびＰｒＰＳｃの両者に関して分析した。
【００７０】
以上で示された濃度でのＡｌ（ＯＨ）３の添加が２ｌｏｇのＰｒＰＳｃ排除における増加（ありの場合の約３ｌｏｇ対なしの場合の１ｌｏｇ）を生じた。
実施例６ プラスミノーゲン精製工程におけるＡｌ（ＯＨ）３を用いるＰｒＰＳｃ排除
カプリレート・ケーキＩ（ＣＣＩ）の処理中のＰｒＰＳｃ排除に対する３％のＡｌ（ＯＨ）３の影響を測定した。
【００７１】
上記の通りにしてＣＣＩを抽出しそして処理した。１つの実験では、布（多孔性ポリプロピレン）濾過前にＳＢＨスパイクおよび３％のＡｌ（ＯＨ）３（ｖ／ｖ）の両者を加えた。試料を投入試料（プローブ）および布濾液から除去した。ＰｒＰＳｃの存在を各試料においてウェスタン分析により測定した。
【００７２】
３％のＡｌ（ＯＨ）３（ｖ／ｖ）の含有が２ｌｏｇのＰｒＰＳｃの排除を生じた。Ａｌ（ＯＨ）３なしでは、排除は０ｌｏｇであった。
実施例７ ヒュームドシリカおよびヒュームドアルミナの比較
前の実験で使用されたＡｌ（ＯＨ）３スラリーとは対照的に、ヒュームドアルミナ（スペクトラル（ＳＰＥＣＴＲＡＬ）、カボット・コーポレーション（Ｃａｂｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ツスコラ、イリノイ州）もヒュームドシリカ（ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ）に対するその影響を比較する実験において使用した。
【００７３】
５０ミリリットルのＴＢＳ中０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を０．５ｍｌの清澄化されたハムスターのスクレーピー脳ホモジェネートまたは高度に精製された（ボルトン
）スパイクを用いてスパイクした。スパイク後に、最初の１０ｍｌ試料（プローブ）を物質の最初の力価を測定するための分析用に取り出した。次に、約０．０５ｇのヒュームドアルミナまたはヒュームドシリカのいずれかを１５ｍｌ円錐管に加えた。これらの管の各々に、１０ｍｌのスパイクされた物質を加え、そして管を１５−２０回にわたり逆転させた。
【００７４】
プランジャーを３個の１０ｍｌ注射器から除去しそしてそれらを０．８μｍの注射器フィルターに装着することにより濾過装置を製造した。スパイキングタイプの各々に関して３回の濾過を行った。第一回の濾過は存在する金属酸化物を有しておらず、第二回の濾過はヒュームドアルミナを有しており、そして第三回の濾過はヒュームドシリカを有していた。プローブおよび生じた濾液をウェスタンブロットにより分析しそして下記の信号を見出した。
【００７５】
【表２】
【００７６】
両方のスパイキング条件下で両方の金属酸化物に関して検出限度までの排除が観察された。
【００７７】
本発明の主題をこれにより開示してきたが、本発明の多くの改変、置換、および変更がそれに照らして可能であることは明らかであるはずである。本発明を具体的な記載以外に実施しうることを理解すべきである。そのような改変、置換、および変更は本出願の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１はパネルに隣接して示された濃度におけるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（ヒュームドシリカ）を用いる濾過後の病原性プリオン蛋白質（ＰｒＰＳｃ）の特異的検出を示すウェスタンブロットを示す。
【図２】図２は種々の量の加えられたＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬを用いるＰｒＰＳｃの排除または除去のグラフ表示である。
【図３】図３はプラスミノーゲンの精製中のＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。
【図４】図４は図３に示された結果を生ずる際にプラスミノーゲンの種々の精製工程の変動におけるＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬの添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。
【図５】図５はＡｌ（ＯＨ）３の添加により得られたＰｒＰＳｃ排除を示すウェスタンブロットを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）金属酸化物を生物学的物質に加えて金属酸化物および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、そして
ｂ）金属酸化物を混合物から分離して生ずる溶液を形成せしめる
ことを含んでなる生物学的物質を含有する溶液を製造する方法であって、生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を生ずる溶液中で実質的に減少させる方法。
【請求項２】
ａ）金属酸化物を生物学的物質に加えて金属酸化物および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、
ｂ）金属酸化物を混合物から分離して生ずる溶液を形成せしめ、そして
ｃ）生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して評価する
ことを含んでなる生物学的物質を含有する溶液を製造する方法であって、生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を生ずる溶液中で実質的に減少させる方法。
【請求項３】
生物学的物質が血液−由来生成物、組織−由来生成物、および組み換え的に製造された生成物よりなる群から選択される請求項２の方法。
【請求項４】
生物学的物質が血液−由来生成物である請求項２の方法。
【請求項５】
血液−由来生成物がヒト起源のものである請求項４の方法。
【請求項６】
血液−由来生成物が免疫グロブリン類、血液凝固因子、プラスミン、プラスミノーゲン、α−１プロテイナーゼ阻害剤、およびアルブミンよりなる群から選択される請求項４の方法。
【請求項７】
金属酸化物がヒュームド（ｆｕｍｅｄ）シリカおよびヒュームドアルミナよりなる群から選択される、請求項２の方法。
【請求項８】
金属酸化物がヒュームドシリカである請求項２の方法。
【請求項９】
ヒュームドシリカが約１３０ｍ２／ｇ〜約３８０ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられる請求項８の方法。
【請求項１０】
ヒュームドシリカが約１５０ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられる請求項８の方法。
【請求項１１】
ヒュームドシリカが約２００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられる請求項８の方法。
【請求項１２】
混合物からの金属酸化物の分離が濾過を含んでなる請求項２の方法。
【請求項１３】
濾過が約０．１μｍより大きいものから約５μｍまでの粒子を保持する濾過システムの混合物の通過を含んでなる請求項１２の方法。
【請求項１４】
濾過が約０．８μｍより大きい粒子を保持する濾過システムの混合物の通過を含んでなる請求項１２の方法。
【請求項１５】
病原性プリオン蛋白質の存在または量に関する生ずる溶液の評価が病原性プリオン蛋白質に関する動物生物学的検定または免疫検定よりなる群から選択される検定を用いる感染
性に関する試料の評価を含んでなる請求項２の方法。
【請求項１６】
病原性プリオン蛋白質の存在または量に関する生ずる溶液の評価が免疫検定を用いる病原性プリオン蛋白質の存在に関する試料の評価を含んでなる請求項２の方法。
【請求項１７】
免疫検定がウェスタンブロットおよびエリザ（ＥＬＩＳＡ）検定よりなる群から選択される請求項１６の方法。
【請求項１８】
免疫検定がウェスタンブロットである請求項１６の方法。
【請求項１９】
金属酸化物が水酸化アルミニウムである請求項２の方法。
【請求項２０】
水酸化アルミニウムが約２重量％のＡｌ２Ｏ３を含んでなるゲルとして約１〜約１０容量％の濃度で存在する請求項１９の方法。
【請求項２１】
水酸化アルミニウムが約２重量％のＡｌ２Ｏ３を含んでなるゲルとして約１〜約５容量％の濃度で存在する請求項１９の方法。
【請求項２２】
水酸化アルミニウムが約２重量％のＡｌ２Ｏ３を含んでなるゲルとして約３容量％の濃度で存在する請求項１９の方法。
【請求項２３】
ａ）約１５０ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられるヒュームドシリカを生物学的物質に加えてヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、
ｂ）混合物をヒュームドシリカの粒子の少なくとも実質的部分を保持するフィルターを含んでなる濾過システムを通過させることによりヒュームドシリカを混合物から分離して生ずる溶液を形成せしめ、そして
ｃ）生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して免疫検定を用いて評価する
ことを含んでなる生物学的物質を含有する溶液を製造する方法であって、生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を生ずる溶液中で実質的に減少させる方法。
【請求項２４】
ヒュームドシリカが約２００ｍ２／ｇの比表面積、約５０ｇ／ｌのタップ密度（ｔａｐ
ｄｅｎｓｉｔｙ）、および約０．２μｍ〜約０．３μｍの平均集合体粒子長さにより特徴づけられる請求項２３の方法。
【請求項２５】
ヒュームドシリカがヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の約０．１％〜約１．０％（重量／重量）の量で加えられる請求項２３の方法。
【請求項２６】
ヒュームドシリカがヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の約０．２％〜約０．８％（重量／重量）の量で加えられる請求項２３の方法。
【請求項２７】
ヒュームドシリカがヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の少なくとも約０．２５％（重量／重量）の量で加えられる請求項２３の方法。
【請求項２８】
ヒュームドシリカがヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の少なくとも約０．５％（重量／重量）の量で加えられる請求項２３の方法。
【請求項２９】
ａ）二酸化珪素粒子を生物学的物質に加えて二酸化珪素粒子および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、
ｂ）二酸化珪素粒子を混合物から分離して生ずる溶液を形成せしめ、そして
ｃ）生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して評価する
ことを含んでなる生物学的物質を含有する溶液を製造する方法であって、生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を生ずる溶液中で実質的に減少させる方法。
【請求項３０】
混合物からの二酸化珪素粒子の分離が遠心または濾過を含んでなる請求項２９の方法。
【請求項３１】
混合物からの二酸化珪素粒子の分離が遠心を含んでなる請求項２９の方法。
【請求項３２】
ａ）試料を流動性液体状態で金属酸化物を含んでなる固体基質と接触させ、
ｂ）試料中のプリオンが基質と結合するような時間にわたり試料を基質と接触させたままにし、そして
ｃ）試料を基質から分離する
ことを含んでなるプリオンを試料から分離する方法。
【請求項３３】
金属酸化物が二酸化珪素または水酸化アルミニウムである請求項３２の方法。
【請求項３４】
金属酸化物がヒュームドシリカである請求項３２の方法。
【請求項３５】
ａ）試料を粒状金属酸化物と接触させ、
ｂ）粒状金属酸化物を試料から分離し、
ｃ）粒状金属酸化物と会合したプリオン蛋白質をさらなる分析にかける
ことを含んでなる、プリオン蛋白質を試料から分離しそしてそれらをさらなる分析のために濃縮する方法。
【請求項３６】
プリオン蛋白質のさらなる分析が免疫検定、動物生物学的検定、分光分析、およびクロマトグラフィー分析よりなる群から選択される少なくとも１種の分析技術を含んでなる請求項３５の方法。
【請求項１】
ａ）金属酸化物を生物学的物質に加えて金属酸化物および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、そして
ｂ）金属酸化物を混合物から分離して生ずる溶液を形成せしめる
ことを含んでなる生物学的物質を含有する溶液を製造する方法であって、生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を生ずる溶液中で実質的に減少させる方法。
【請求項２】
ａ）金属酸化物を生物学的物質に加えて金属酸化物および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、
ｂ）金属酸化物を混合物から分離して生ずる溶液を形成せしめ、そして
ｃ）生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して評価する
ことを含んでなる生物学的物質を含有する溶液を製造する方法であって、生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を生ずる溶液中で実質的に減少させる方法。
【請求項３】
生物学的物質が血液−由来生成物、組織−由来生成物、および組み換え的に製造された生成物よりなる群から選択される請求項２の方法。
【請求項４】
生物学的物質が血液−由来生成物である請求項２の方法。
【請求項５】
血液−由来生成物がヒト起源のものである請求項４の方法。
【請求項６】
血液−由来生成物が免疫グロブリン類、血液凝固因子、プラスミン、プラスミノーゲン、α−１プロテイナーゼ阻害剤、およびアルブミンよりなる群から選択される請求項４の方法。
【請求項７】
金属酸化物がヒュームド（ｆｕｍｅｄ）シリカおよびヒュームドアルミナよりなる群から選択される、請求項２の方法。
【請求項８】
金属酸化物がヒュームドシリカである請求項２の方法。
【請求項９】
ヒュームドシリカが約１３０ｍ２／ｇ〜約３８０ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられる請求項８の方法。
【請求項１０】
ヒュームドシリカが約１５０ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられる請求項８の方法。
【請求項１１】
ヒュームドシリカが約２００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられる請求項８の方法。
【請求項１２】
混合物からの金属酸化物の分離が濾過を含んでなる請求項２の方法。
【請求項１３】
濾過が約０．１μｍより大きいものから約５μｍまでの粒子を保持する濾過システムの混合物の通過を含んでなる請求項１２の方法。
【請求項１４】
濾過が約０．８μｍより大きい粒子を保持する濾過システムの混合物の通過を含んでなる請求項１２の方法。
【請求項１５】
病原性プリオン蛋白質の存在または量に関する生ずる溶液の評価が病原性プリオン蛋白質に関する動物生物学的検定または免疫検定よりなる群から選択される検定を用いる感染
性に関する試料の評価を含んでなる請求項２の方法。
【請求項１６】
病原性プリオン蛋白質の存在または量に関する生ずる溶液の評価が免疫検定を用いる病原性プリオン蛋白質の存在に関する試料の評価を含んでなる請求項２の方法。
【請求項１７】
免疫検定がウェスタンブロットおよびエリザ（ＥＬＩＳＡ）検定よりなる群から選択される請求項１６の方法。
【請求項１８】
免疫検定がウェスタンブロットである請求項１６の方法。
【請求項１９】
金属酸化物が水酸化アルミニウムである請求項２の方法。
【請求項２０】
水酸化アルミニウムが約２重量％のＡｌ２Ｏ３を含んでなるゲルとして約１〜約１０容量％の濃度で存在する請求項１９の方法。
【請求項２１】
水酸化アルミニウムが約２重量％のＡｌ２Ｏ３を含んでなるゲルとして約１〜約５容量％の濃度で存在する請求項１９の方法。
【請求項２２】
水酸化アルミニウムが約２重量％のＡｌ２Ｏ３を含んでなるゲルとして約３容量％の濃度で存在する請求項１９の方法。
【請求項２３】
ａ）約１５０ｍ２／ｇ〜約３００ｍ２／ｇの比表面積により特徴づけられるヒュームドシリカを生物学的物質に加えてヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、
ｂ）混合物をヒュームドシリカの粒子の少なくとも実質的部分を保持するフィルターを含んでなる濾過システムを通過させることによりヒュームドシリカを混合物から分離して生ずる溶液を形成せしめ、そして
ｃ）生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して免疫検定を用いて評価する
ことを含んでなる生物学的物質を含有する溶液を製造する方法であって、生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を生ずる溶液中で実質的に減少させる方法。
【請求項２４】
ヒュームドシリカが約２００ｍ２／ｇの比表面積、約５０ｇ／ｌのタップ密度（ｔａｐ
ｄｅｎｓｉｔｙ）、および約０．２μｍ〜約０．３μｍの平均集合体粒子長さにより特徴づけられる請求項２３の方法。
【請求項２５】
ヒュームドシリカがヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の約０．１％〜約１．０％（重量／重量）の量で加えられる請求項２３の方法。
【請求項２６】
ヒュームドシリカがヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の約０．２％〜約０．８％（重量／重量）の量で加えられる請求項２３の方法。
【請求項２７】
ヒュームドシリカがヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の少なくとも約０．２５％（重量／重量）の量で加えられる請求項２３の方法。
【請求項２８】
ヒュームドシリカがヒュームドシリカおよび生物学的物質の混合物を含んでなる溶液の少なくとも約０．５％（重量／重量）の量で加えられる請求項２３の方法。
【請求項２９】
ａ）二酸化珪素粒子を生物学的物質に加えて二酸化珪素粒子および生物学的物質の混合物を含んでなる溶液を得、
ｂ）二酸化珪素粒子を混合物から分離して生ずる溶液を形成せしめ、そして
ｃ）生ずる溶液を病原性プリオン蛋白質の存在または量に関して評価する
ことを含んでなる生物学的物質を含有する溶液を製造する方法であって、生物学的物質を汚染する可能性のある病原性プリオン蛋白質を生ずる溶液中で実質的に減少させる方法。
【請求項３０】
混合物からの二酸化珪素粒子の分離が遠心または濾過を含んでなる請求項２９の方法。
【請求項３１】
混合物からの二酸化珪素粒子の分離が遠心を含んでなる請求項２９の方法。
【請求項３２】
ａ）試料を流動性液体状態で金属酸化物を含んでなる固体基質と接触させ、
ｂ）試料中のプリオンが基質と結合するような時間にわたり試料を基質と接触させたままにし、そして
ｃ）試料を基質から分離する
ことを含んでなるプリオンを試料から分離する方法。
【請求項３３】
金属酸化物が二酸化珪素または水酸化アルミニウムである請求項３２の方法。
【請求項３４】
金属酸化物がヒュームドシリカである請求項３２の方法。
【請求項３５】
ａ）試料を粒状金属酸化物と接触させ、
ｂ）粒状金属酸化物を試料から分離し、
ｃ）粒状金属酸化物と会合したプリオン蛋白質をさらなる分析にかける
ことを含んでなる、プリオン蛋白質を試料から分離しそしてそれらをさらなる分析のために濃縮する方法。
【請求項３６】
プリオン蛋白質のさらなる分析が免疫検定、動物生物学的検定、分光分析、およびクロマトグラフィー分析よりなる群から選択される少なくとも１種の分析技術を含んでなる請求項３５の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５２７４０５（Ｐ２００７−５２７４０５Ａ）
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６２２１（Ｐ２００６−５２６２２１）
【出願日】平成１６年９月７日（２００４．９．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９０２４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２６１９７
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５０３１０６１１１）バイエル・ヘルスケア・エルエルシー (154)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月７日（２００４．９．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２９０２４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２６１９７
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５０３１０６１１１）バイエル・ヘルスケア・エルエルシー (154)
【Ｆターム（参考）】
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