粘液または痰の液化のための生成物および処理
過度または異常に粘性または粘着性が高い粘液または痰の粘性および／または粘着性を低下させるか、および／またはそれらの液化を促進させる組成物および方法を開示する。該組成物は、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを含み、選択的には、さらに還元系を含む。本態様の一局面において、患者は、嚢胞性線維症など、粘液または痰が異常または過度に粘性または粘着性になることが病気の症状または原因となる肺病を患っている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、一般的に、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを、粘液または痰の液化を誘導、促進および／または増加させるために使用することに関係する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、塩素イオンチャネルタンパク質であるＣＦ膜コンダクタンス制御因子をコードする遺伝子の変異によって起きる、珍しくない致死性の遺伝性疾患である。この欠陥の結果、体内の上皮が、塩素イオン輸送に対して不透過になる（Ｂｏｕｃｈｅｒ ら，Ｌｕｎｇ １６１：１−１７，１９８３；Ｗｅｌｓｈ，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．６７：１１４４３−１１８４，１９８７）。すい臓、腸および男性生殖管など、いくつかの器官が冒されるが、肺内における合併症が、罹病率および死亡率の９５％を占める（Ｄｏｄｇｅ ＪＡ，Ｂｒｏｃｋ ＤＪＨ，ａｎｄ Ｗｉｄｄｉｃｏｍｂｅ ＪＨ．Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ編 Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ Ｖｏｌｕｍｅ １より、 Ｍｅａｎｓ，Ｍ．Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ５０ ｙｅａｒｓ、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９２，ｐ．２１７−２５０）。本病によって損なわれた肺では、気道管腔内への塩素輸送によって、Ｎａ＋および液体の過剰吸収が起きて、気道表面にある液体の量が減少する（Ｊｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：４２４−４２７，１９９３）。気道表面にある液体が枯渇すると、粘液のゲル形成成分であるムチン高分子の濃縮が起こる（Ｍａｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ ９５：１００５−１０１５，１９９８）。正常な粘液の粘弾性は、ムチン重合体の濃度、分子量およびもつれ具合によって決まる（Ｖｅｒｄｕｇｏら、Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ ２０：２２３−２３０，１９８３）。死につつある炎症細胞から放出されるＤＮＡ（Ｐｏｔｔｅｒら、Ａｍ Ｊ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ １００：４９３−４９５，１９６０；Ｌｅｔｈｅｍら、Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ １００：４９３−４９５，１９９０；Ｌｅｔｈｅｍら、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ３：１９−２３，１９９０）およびｆ−アクチン重合体（Ｓｈｅｉｌｓら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈ １４８：９１９−９２７，１９９６；Ｂａｕｍ ＧＬ，Ｐｒｉｅｌ Ｚ，Ｒｏｔｈ Ｙ，Ｌｉｒｏｎ ＮおよびＯｓｔｆｅｌｄ ＥＪ編、Ｃｉｌｉａ，ｍｕｃｕｓ ａｎｄ ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓより、Ｔｏｍｋｉｅｗｉｃｚら、ＤＮＡ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｐｕｔｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，１９９８）とムチンとのさらなる相互作用が、ＣＦ痰に密集性と粘性をもたらす。このような粘液を咳や粘膜毛様体クリアランスによって排出することができないため、日和見性の病原体が肺に定住しやすくなる。
【０００３】
ＣＦ肺疾患の病因は、痰の流動性が変化することにあるといえるが、肺機能に障害があることは、誕生時にはほとんど明らかではない。それどころか、気管支拡張と気道閉塞は患者の年齢とともに進行する。この慢性的な肺損傷は、細菌感染と炎症反応との終わりのない循環によって起こる。気道損傷は、肺に補充された好中球が、エラスターゼなどのマトリックス分解酵素、および有害な活性酸素種を放出したときに起こる（ＫｏｎｓｔａｎとＢｅｒｇｅｒ，Ｐｅｄｉａｔｒ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ ２４：１３７−１４２，１９９７において概説されている）。
【０００４】
期待が持てそうな進歩がいくらかあるにもかかわらず、遺伝子治療によるＣＦの矯正は、未だ達成可能ではない。現在でも、膿状の気道分泌物の排出を促す薬物と併用される抗生物質療法が、相変わらず、進行性の気道疾患の主要な治療法となっている。ＣＦ患者の気道に存在する細胞外ＤＮＡを分解する精製ｒｈＤＮａｓｅ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，米国）吸入が、呼吸器の鬱血除去剤として広く使用されている。このような治療は、痰の粘性を低下させ、強制呼気量（ＦＥＶ）を安定化させるために臨床上有効である（Ｆｕｃｈｓら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３１：６３７−６４２，１９９４）。他の研究的な治療法で、Ｎ−アセチルシステイン、ナシステリン（ｎａｃｙｓｔｅｌｙｎ：Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの誘導体）、およびゲルソリンのような、ムチンまたはアクチンのポリマーを分解するための方法も、実験的には痰の粘性を低下させることができたが、まだ、具体的には、ＣＦを治療するための臨床上の認可を米国内で得るには至っていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、当技術分野においては嚢胞性線維症、および、異常または過度に粘性または粘着性の粘液または痰を伴う他の疾患を治療するために改善された治療法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の一つの態様は、過度に粘性または粘着性の粘液または痰の出る患者の体内において粘液または痰の液状化を増進させる方法に関係する。本方法は、患者の粘液または痰を、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを含む組成物であって、接触前と比較して粘液または痰の液状化を増進させるのに有効な組成物に接触させるステップを含む。本態様の一局面において、患者は、嚢胞性線維症など、粘液または痰が異常または過度に粘性または粘着性になることが病気の症状または原因となる肺病を患っている。
【０００７】
一つの局面において、患者の粘液または痰を組成物と接触させるステップは、経鼻、気管内、気管支、肺内への直接設置、および吸入からなる群より選択された経路によって、組成物を患者に導入して実施される。一つの局面において、接触させる粘液または痰は、患者の呼吸管、胃腸管、または生殖管に存在する。別の局面において、組成物は、薬学的に許容される担体に入れて患者に投与される。好ましくは、患者からの粘液または痰の試料の全量の液相が、組成物を投与すると統計的に有意な増加を示す。
【０００８】
本態様の一局面において、蛋白質またはペプチドは、患者の体重１ｋｇ当り約１．５ミリモル（ｍｍｏｌｅｓ）から約１５０ミリモルの量で患者に投与される。別の局面において、該蛋白質は、患者の体内で約５分から約２４時間という半減期を有する。一つの局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃというアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にあり、Ｘ残基はいずれのアミノ酸残基でもよい。別の局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘというアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にあり、Ｘ残基はいずれのアミノ酸残基でもよい。別の局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）というアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にあり、Ｘ残基はいずれのアミノ酸残基でもよい。さらに別の局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｗ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｋ（配列番号：３）というアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にある。さらに別の局面において、蛋白質は原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物のチオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンからなる群より選択されるチオレドキシンを含む。好適な局面において、蛋白質はヒトチオレドキシンを含む。
【０００９】
本発明の一局面において、組成物は、さらに、蛋白質のチオレドキシン活性部位を還元するためにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（ＮＡＤＰＨ）を含む。さらなる局面において、組成物はチオレドキシンレダクターゼを含む。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、粘液または痰の液状化に使用するための組成物であって、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含み、さらに、過剰に粘性または粘着性のある粘液または痰を治療するための薬剤を少なくとも一つ含む組成物に関する。一つの局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘというアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にあり、Ｘ残基はいずれのアミノ酸残基でもよい。別の局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）というアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にあり、Ｘ残基はいずれのアミノ酸残基でもよい。さらに別の局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｗ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｋ（配列番号：３）というアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にある。さらに別の局面において、蛋白質は原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物のチオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンからなる群より選択されるチオレドキシンを含む。好適な局面において、蛋白質はヒトチオレドキシンを含む。
【００１１】
さらなる局面において、組成物はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（ＮＡＤＰＨ）を含むことができる。さらなる局面において、組成物は、さらにチオレドキシンレダクターゼを含む。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰が出る患者の体内で粘液または痰の液状化を増進させる方法に関係する。この方法は、患者の気道内にある粘液または痰を、Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘというアミノ酸配列であって、Ｃ残基が還元状態にある配列を含む蛋白質を含む組成物と接触させるステップであって、組成物を接触させることによって、患者からの粘液または痰の試料中の液相が、該組成物と接触させる前に比較して増加するステップを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般的には、粘液または痰の液状化を誘導、促進および／または増加させるために、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドの使用に関連する。より具体的には、本発明者らは、チオレドキシンが、痰または粘液の粘性および／または粘着性を低下させることができるため、痰または粘液を液状化させるための有効な因子であることを発見した。その結果、天然のチオレドキシン、還元状態にあるチオレドキシンの活性部位を含む蛋白質もしくはペプチド、またはそれらの蛋白質をコードする核酸分子を、単独または組成物にして、望ましくない粘液や粘着力があり粘性の痰を伴う症状または疾患を治療するために使用できるようになった。例えば、嚢胞性線維症などの呼吸器疾患が、特に、本発明に係る産物および方法を用いる治療法を行いやすい。従って、本発明は、還元状態にあるチオレドキシンの活性部位を含む蛋白質を、粘液または痰、特に、異常または過度に粘性および／または粘着性の粘液または痰の液状化を増進するために使用することに関する。この蛋白質は、このような異常または過度の粘液または痰に苦しんでいる、もしくは影響を受けている患者に、粘液または痰の液状化を増進させるような、好ましくは、患者に治療上の効果をもたらすような方法および用量で投与される。
【００１４】
チオレドキシン、およびチオレドキシン活性部位を含む蛋白質には、他の還元剤に比べ、嚢胞性線維症などの症状の治療に用いる上での利点がある。例えば、他の還元剤（例えばＮ−アセチルシステイン、ナシステリン（ＮＡＬ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ））とは異なり、チオレドキシンは、その有効（還元）型に繰り返し再還元することができる。また、チオレドキシンの自動酸化（例えばスーパーオキシド、過酸化水素ヒドロキシルラジカル、およびその他の有害酸素代謝物を産生する）は、ＮＡＣ、ＮＡＬおよびＤＴＴなど他の還元剤に比べ低量で起きる。さらに、チオレドキシンは、細胞外空間に普通に存在する天然の化合物であるから、気道内にチオレドキシンを導入しても、免疫応答を誘導したり、炎症を起こさせたりすることはない。また、チオレドキシンはグリコシル化されていないので、天然型または組換型の蛋白質を投与しても、自然免疫応答を誘導することはない。おそらくさらに一層顕著なのは、チオレドキシンは、他の還元剤とは対照的に、処理した粘液または痰を液体の状態に維持する点である。例えば、ＮＡＣおよびＤＴＴは、時間がたつうちに「消耗され」、すなわち酸化されて、その段階で、液状化された痰または粘液は元に戻り、さらに粘性の強い「ゲル」状になる。これに対し、チオレドキシンによって作り出された液状化は、たぶん、その還元系によって繰り返し再還元されるため、何時間も持続する。最後に、チオレドキシンは、他の還元剤よりも強力であるため、他の薬剤よりもかなり低用量で使用しても有益な効果を得ることができる。
【００１５】
上記の利点に加え、チオレドキシンには、病気の症状において、その有益性をさらに高める他の利点がある。例えば、チオレドキシンは、病気の痰（例えば嚢胞性線維症の痰）の中にある一定の細菌毒素（例えば、グラム陰性菌の細菌細胞壁から出るエンドトキシン、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏａｓ ａｅｒｕｇｕｎｏｓａ）のピオシアニン、その他）の毒性を低下させると推定されているＭｎＳＯＤ（例えば、その全体が本明細書において参考文献に組み入れられる、Ｗｈｉｔｅらに付与された米国特許第５，９８５，２６１号を参照）を誘導する。さらに、チオレドキシンは呼吸器の症状の全体的な治療を促進することができる抗炎性を有する。
【００１６】
チオレドキシン（Ｔｒｘ）は、数多くのチオール依存的な細胞の還元プロセスを触媒する、蛋白質のジスルフィドレダクターゼである。チオレドキシン（Ｔｒｘ）は、種横断的に高度に保存されている２個の酸化還元活性型システインを含む。それらは、酸化型になると、蛋白質の三次元構造から突き出したジスルフィド架橋を形成する（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：２３７−２７１，１９８５）。ＮＡＤＰＨ依存型チオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）によってこの活性中心が還元されると、Ｔｒｘが、ジチオール／ジスルフィド交換能力をもつ電子運搬体として作用することが可能になる（Ｏｂｌｏｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：７２７１−７２７７，１９９３）。蛋白質のジスルフィドは、Ｔｒｘ介在型還元作用にとって好適な基質である。嚢胞性線維症では気道分泌物が難分解性で粘性であるため、気道閉塞、日和見感染症、および肺機能の低下が生じる。呼吸器のムチンが、重合に必須の機能を果たすと考えられているシステインドメインをいくつか含んでいることを認めた（Ｂｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５７：２０３−２０９，２００１；Ａｓｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３３３：３８１−３８７，１９９８）上で、本発明者は、ムチンのジスルフィドを還元することによって、Ｔｒｘが効果的な粘液溶解剤として役立つか否かを判定しようとした。
【００１７】
本明細書で検討する実験において、本発明者らは、インビトロにおけるＣＦ痰の物理的性質および流動学的性質に対するＴｒｘ還元系（チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、およびＮＡＤＰＨ）の効果を調べた。ＣＦ患者から得られた痰をＴＲＸ、およびその還元系［０．１μＭチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）＋２ｍＭ ＮＡＤＰＨ］で処理し、液相対ゲル相の割合（液相の割合）をコンパクションアッセイ法によって測定した。低濃度（１μＭ）のＴｒｘに曝露したところ、痰の液相の割合が有意に上昇した。液相の割合が最も上昇したのは、３０μＭのときであった。さらなる測定によって、Ｔｒｘ還元系による痰の液状化は、ＮＡＤＰＨ濃度に依存することが明らかになった。また、Ｔｒｘ還元系の相対的な有効性についても、他のジスルフィド還元剤と比較した。Ｔｒｘとは対照的に、グルタチオンおよびＮ−アセチルシステインは、１ｍＭよりも低い濃度で使用すると、痰を液状化する上で効果がなかった。マイクロレオメーターで測定したところ、３，１０または３０μＭのＴｒｘで２０分間処理した後に痰の粘弾性が有意に低下した。同様に、この粘弾性の低下もＮＡＤＰＨ濃度に依存していた。さらなる実験によって、Ｔｒｘ処理によって高分子量糖蛋白質の可溶性が増加し、痰の液相内への細胞外ＤＮＡの再分布がもたらされることが示された。本明細書に記載した実験は、触媒量Ｔｒｘとその還元系によるインビトロでの処理によって、膿状のＣＦ痰を液状化し、粘弾性を低下させ得ることを示している。Ｔｒｘ処理した痰の中に存在する高分子量の糖蛋白質の可溶性が高まることは、ムチン高分子が、ムコ多糖分解プロセスにおいてＴｒｘによって還元される基質である可能性を示している。
【００１８】
粘液による気道閉塞は、ＣＦ患者における重大な病状や死亡の原因となりうる。本発明者は、気道内においてこれらの分泌物が持続するのを助長する粘弾性が、Ｔｒｘによって顕著に低下することを実証した。この結果は、２つの実験的証拠によって裏付けられている。第一は、コンパクションアッセイの結果、Ｔｒｘとインキュベートすると、ＣＦ痰のゲル基質から大量の液体が放出されることが示されたことである。この放出と同時に固体の体積の減少が起こったことは、痰のゲル構成成分が可溶化したことを示すものである。ＣＦ痰のこのような液状化は、ＣＦ痰試料をインキュベートしている間に、しばしば、おおまかながら観察することができた。したがって、これは、による破壊といったアーティファクトではない。Ｔｒｘによる液体の遊離は、気道表面における水容量が回復すると、ＣＦ上皮の粘膜繊毛の輸送能力が回復される可能性があるため、重要な治療上の意味を持つと思われる（Ｊｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：４２４−４２７，１９９３）。第二は、磁気マイクロレオメーター測定値は、痰の粘弾性が、Ｔｒｘにより痰成分が還元される結果次第に低下するという直接の証拠を示している。
【００１９】
ＣＦ痰は、液体と固体の両方の特徴を示す非ニュートン性の流体である。重合体は、低濃度で液体中に存在するときには自由に回転することができる。重合体が、その回転を妨げられる程度まで濃縮または架橋されると、液体は、浸透閾値（ｐｅｒｃｏｌａｔｉｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる遷移相に到達する（Ｆｏｒｇａｃｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １０８：２１３１−２１４３，１９９５）。浸透閾値で、液体は固体の性質を獲得するようになり、架橋重合体間の相互作用（ｃｒｏｓｓ−ｐｏｌｙｍｅｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）が加わるにつれて、試料中の各繊維が基質の中に取り込まれるまで弾性率は増加しつづける。生化学的分析によって、呼吸管の内壁細胞によって分泌されるムチンであるＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂが、気道粘液の主要なゲル形成重合体成分であることが明らかにされた（Ｈｏｖｅｎｂｅｒｇら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ １３：８３９−８４７，１９９６；Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３１６：９６７−９７５，１９９６；Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：９５６１−９５６６，１９９７）。これらムチンに存在するシステインドメインが、ジスルフィド結合形成によって、重合体形成、および、おそらく、隣接するムチン鎖との相互作用に寄与する（Ｂｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５７：２０３−２０９，２００１；Ａｓｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３３３：３８１−３８７，１９９８）。蛋白質上のジスルフィド結合は、Ｔｒｘの酵素活性にとって好適な基質であるため、本発明者は、Ｔｒｘによる痰の液状化の過程において、ムチン重合体が還元の標的であるとの仮説を立てた。この仮説は、Ｔｒｘで処理した痰における高分子量のグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）の可溶性の変化を明らかにしたＰＡＳ染色によって裏付けられた。Ｔｒｘに曝露した痰の液相中の糖蛋白質の濃度が高くなっていることが検出されると、さらに、黄色がより濃くなって示され、希釈剤で処理した試料から得た液相に比べて一層不透明になった。Ｔｒｘに曝露した痰におけるＰＡＳで検出可能な糖蛋白質の電気泳動での移動度が促進されることも、これらの高分子が、酵素による還元過程でサイズが減少しうることを示唆している。この電気泳動による解析からの知見は、液相内への糖蛋白質の遊離と、Ｔｒｘに曝露している間のゲル基質量の減少とが同時に起こることを明らかにしたことによって、コンパクションアッセイの測定結果と一致している。
【００２０】
病気のＣＦ肺の気道内において好中球の溶解が起こる結果、気道分泌物の中に細胞外ＤＮＡが沈積する（Ｌｅｔｈｅｍら、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ３：１９−２３，１９９０）。非共有結合的相互作用によって、このＤＮＡは、ムチン糖蛋白質の中でもつれ合うようになり、ムチンのゲル粘弾性を高める（Ｓａｃｈｄｅｖら、Ｃｈｅｓｔ８１：４１Ｓ−４３Ｓ，１９８２）。本明細書に記載する実験において、本発明者は、痰の中にあるＤＮＡが、Ｔｒｘ処理の後次第に可溶性になることを発見した。論理的な説明は、Ｔｒｘ活性によって、ＤＮＡと処理の影響を受けた高分子とがもつれ合う関係を解消させるのに十分な構造変化がゲル基質の中で起きるというものである。ＣＦ痰をＴｒｘに曝露したときに観察される粘弾性の変化に対し、このＤＮＡ可溶性上昇が、どのような相対的寄与をしているのかは明確ではない。それにもかかわらず、臨床的な見地からは、痰の不溶性のゲル相からＤＮＡを除去することは、ＣＦにおけるこのような治療の間、ＤＮａｓｅ活性に対してＤＮＡをより感受性にすることができるようにする。従って、本発明に係る方法は、ＣＦに対する他の既存の「最新技術」による療法と相乗効果を発揮する可能性が高い。
【００２１】
他のチオール還元剤の痰液状化能力と比較した研究において、Ｔｒｘは、グルタチオン（ＧＳＨ；還元型グルタチオン）還元系よりも高い有効性を示した。ＧＳＨが、たった１個のシステイン残基（モノチオール）しか持たないのに対し、Ｔｒｘは２個の酸化還元活性型システイン残基（ジチオール）を有するため、ＣＦ痰のゲル形成成分の中のジスルフィド結合を還元するのにより有効である可能性がある。非再生型粘液溶解薬（ｎｏｎ−ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｍｕｃｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇｓ）については、等モル濃度で比べるとＤＴＴの方がＮＡＣ（またはＭｕｃｏｍｙｓｔ（著作権））溶液よりも有効であった（図２および３；データは示されていない）。これらの化合物の効力も、また、酸化還元活性型システイン残基の数によって決まり、ＤＴＴには２個あるが、ＮＡＣには１個しかない。これらのコンパクションアッセイ測定値に基づいて、二重に酸化還元活性型システインをもつ蛋白質、ペプチド、または別の化合物を用いた酵素によるジスルフィド結合の還元が、強力な粘液溶解法となることが期待されている。
【００２２】
要約すると、Ｔｒｘは、液体画分を増加させて、ＣＦ痰の粘弾性を低下させる。Ｔｒｘによって痰を処理する過程で、糖蛋白質の可溶性の上昇が起こるが、このことが、これらの流動性を変化させるメカニズムであるかもしれない。液体の遊離を促進し、気道分泌液の粘性を低下させる粘液還元系を開発すれば、ＣＦに対する治療法となり、また、他の呼吸器症状（例えば、慢性または急性の気管支炎、気管支拡張症、急性気管炎、急性または慢性の副鼻腔炎、粘膜による気道の急性または慢性の堰塞によって起こる肺拡張不全、細気管支炎）を伴うか、または、過剰または異常な粘液の粘性および／または粘着性を伴うか、もしくはそれによって悪化する、さまざまな胃腸または生殖器官の疾患（例えば、粘液の濃縮による急性、亜急性、または慢性の腸閉塞、重要な生殖器構造の閉塞による不妊）を伴う、過剰または異常な粘液の粘性および／または粘着性の治療に対する治療法となる可能性が期待される。Ｔｒｘは、グリコシル化および翻訳後修飾を受けない天然の蛋白質であり、通常は、細胞外の間隙に低濃度で存在するため、それを長期にわたって投与すると免疫系によって寛容されうる。
【００２３】
したがって、本発明の一つの態様は、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を有する患者の体内で粘液または痰の液状化を上昇させる方法に関する。この方法は、患者の粘液または痰を、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを含む組成物に接触させるステップを含む。この蛋白質は、接触ステップの前に比べて、粘液または痰の液状化を増進するのに効果的である。
【００２４】
本発明によれば、「粘液」という用語は、通常、呼吸管、胃腸管および生殖器官など、さまざまな身体の組織にある粘膜によって分泌される、大抵は透明で粘質の液体を意味する。粘液は、それを分泌する組織を湿らせ、滑らかにし、保護する。粘液は、ムチン高分子を含むが、これは粘液のゲル形成成分である。正常なムチンの粘弾性は、ムチン重合体の濃度、分子量、および縺れ具合によって決まる。「痰」という用語は、通常、唾液と、粘液などの気道からの排出物との混合物を意味する。一般的には、痰は、唾液と粘液の吐出物（および、呼吸組織からの他の排出物）である。従って、粘液は、痰の主要な成分であり、そのため、過剰に粘性の粘液が痰に存在すると、それ自体が過剰に粘性の痰になってしまう。「液状化」という用語は、液体になる作用を意味する。したがって、粘液または痰の液状化が増進するとは、粘液または痰の液相または液体状態が、より固いか、または粘性の相に比べて増加することを意味する。
【００２５】
体内における粘液および痰の通常の機能は、粘液（および、したがって痰の粘液成分）が粘弾性を有することを必要とする。正常な粘液および痰を有する個体（すなわち、健常な個体、より具体的には、粘液または痰の粘性または粘着性によって生じるか悪化する病徴または症状を患っていない個体）では、粘弾性はムチン重合体の濃度、分子量、および縺れ具合によって決まる（Ｖｅｒｄｕｇｏら、Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ ２０；２２３−２３０，１９８３）。粘液中のムチンが、死にかけている炎症細胞から放出されるＤＮＡ（Ｐｏｔｔｅｒら、Ａｍ Ｊ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ １００：４９３−４９５，１９６０；Ｌｅｔｈｅｍら、Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ １００：４９３−４９５，１９９０；Ｌｅｔｈｅｍら、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ３：１９−２３，１９９０）およびｆ−アクチン重合体（ｆ−ａｃｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒ）（Ｓｈｅｉｌら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈ １４８：９１９−９２７，１９９６；Ｔｏｍｋｉｅｗｉｃｚら、ＤＮＡ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｐｕｔｕｍ，Ｃｉｌｉａ，ｍｕｃｕｓ，ａｎｄ ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓより、Ｂａｕｍ ＧＬ，Ｐｒｉｅｌ Ｚ，Ｒｏｔｈ Ｙ，Ｌｉｒｏｎ ＮおよびＯｓｔｆｅｌｄ ＥＪ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，１９９８）と相互作用すると、粘液（および、したがって痰）は、ＣＦ痰と同じように濃密で粘性になる。このような粘液は、咳や粘膜毛様体クリアランスによって排出することができないため、日和見性の病原体が肺に定住しやすくなる。したがって、異常または過剰に粘性および／または粘着性の粘液は、正常または健康な患者（好適には、年齢および性別が一致した患者）からの粘液よりも、測定可能または検出可能な程度に粘性または粘着性が強い粘液という特徴、および／または、その粘性および／または粘着性のせいで、患者に不快感や痛みをもたらすか、または、病状または病気を起こさせるか、悪化させる、一つ以上の症状を患者に生じさせるか、それを助長するという特徴を有する。すなわち、異常または過剰に粘性および／または粘着性の痰は、正常な粘液または痰から逸脱したものであって、患者には、その症状の軽減または他の治療上の利益を提供することが望ましい。
【００２６】
本発明に係る方法および組成物を用いて、粘液または痰の液状化を増進することが望ましい患者を治療することができる。特に、肺、洞（ｓｉｎｕｓ）、胃腸、または生殖器の病気または症状を有する患者が、本発明に係る方法および組成物を用いた治療による恩恵を受けることができる。本発明は、粘液または痰の異常または過剰な粘性および／または粘着性によって生じるか、悪化する病気または病状の一つ以上の症状を改善または軽減するのに最も役立つが、それには、当然ながら、肺関連疾患である嚢胞性線維症も含まれる。その他の病気も、少なくとも時には、粘液または痰の異常または過剰な粘性および／または粘着性を伴うことがあり、そのような症状が起きたときには、本発明に係る方法を用いて、粘液または痰の液状化を増進させることができ、患者に多少の緩和または治療上の恩恵をもたらすことができる。このような病気の例には、嚢胞性線維症、慢性または急性の気管支炎、気管支拡張症（非ＣＦ型およびＣＦ型の気管支拡張症）、急性気管炎（細菌性、ウイルス性、マイコプラズマ性、または別の生物が原因となる）、急性または慢性の副鼻腔炎、急性または慢性の粘膜性気道堰塞（時に、ぜんそくなど、さまざまな疾患で見られる）によって起こる肺拡張不全（肺または肺葉の虚脱）、細気管支炎（ウイルス性など）、ＣＦまたは同様の疾患における胎便性イレウス、またはその同等物など、粘膜の濃縮によって起こる急性、亜急性、または慢性の腸閉塞、頸管、精管、またはその他の重要な生殖構造（など）の閉塞が原因となる不妊などがある。また、本発明に係る組成物および方法は、ウイルス性および細菌性の感染症など、さまざまな呼吸器官の感染症に罹った患者において、粘液または痰の過剰な粘性および／または粘着性を伴う症状を軽減させるのに役立つ可能性がある。
【００２７】
したがって、治療上の恩恵とは、必ずしも、特定の病気または病状を治すことではなく、むしろ、好適には、最も典型的には、病気または病状の緩和、病気または病状の除去、病気または病状に関連した症状の軽減または除去、一次的な病気または病状の発生によって起こる二次的な病気または病状（例えば、気道にある過剰に粘性の粘液を利用する日和見病原生物によって引き起こされる感染症）の予防または緩和、および／または、病気または病状の予防、もしくは、その病気または病状を伴う症状の予防などの結果を含む。ここで、「病気から守る」という語句は、病気の症状を軽減させること、緩和療法（治癒をもたらさずに病気の症状を軽減または緩和すること）、病気の発生を低下させること、および／または、病気の重篤度を軽減することを意味する。患者を守るとは、本発明に係る組成物を患者に投与すると、病気の発生が防止され、および／または、その病気または病状の一つ以上の症状、徴候、または原因が治癒または緩和されることを意味することもある。したがって、患者を病気から守るとは、病気の発生を予防すること（予防的治療）、および病気に罹った患者を治療すること（治療的措置）とが含まれる。具体的には、患者を病気から守ることは、有益な効果が得られるように粘液または痰と、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドとを接触させることで、患者の粘液または痰の液状化を増進することによって実行される。有益な効果は、当業者、および／または、患者を治療している熟練した医師によって簡単に評価することができる。「病気」という用語は、患者の正常な健康状態からの逸脱を意味し、症状が存在するときの状態、および逸脱（例えば、感染、遺伝子変異、遺伝的欠陥など）は起きたが、まだ症状が現れていない病状を含む。
【００２８】
患者の粘液および／または痰を、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチド（または、そのような蛋白質を含む組成物）に接触させるのは、その組成物と接触させる前に比べて、粘液または痰の液状化を増進させる結果を意図してのことである。本発明によれば、粘液または痰の液状化の増進が、以前の液状化の程度と比較して、粘液または痰の液状化の程度が測定可能または検出可能な増加であることもあり、好適には、統計学的に有意な増加である（すなわち、患者試料と基準対照との間における液状化の測定レベルの違いが、信頼度ｐ＜０．０５以上で統計的に有意である）。一般的には、「基準対照」とは、治療を行う前の患者の試料である。なぜなら、正常で健康な個体は、通常、対照として用いるのに十分な量の痰を産生することができないからであるが、正常で健康な個体からの痰を基準対照から除外するわけではない。粘液または痰の液状化は、実施例の項で説明されているようなコンパクションアッセイ法など、当技術分野において公知の適当な技術を用いて測定することができる。このようなアッセイ法では、固相（ゲル）対水相（液体）における粘液または痰の量を測定する。本発明の別の局面において、粘液または痰の相対的な粘性または粘着性は、（例えば、磁気マイクロレオメーターによって測定された）粘弾性、糖蛋白質の含有量、またはＤＮＡ含有量など、別のパラメーターまたは指標を用いて測定することができる。本発明の一つの局面において、液状化の程度は、水（液）相にある所定の粘液または痰の量として、粘液または痰の試料の全量の百分率として記載される。嚢胞性線維症患者においては、例えば、粘液または痰の液状化程度は、全量の１０％よりも低く、さらには、５％よりも低い。好適には、本発明に係る蛋白質または組成物を粘液または痰に接触させると、粘液または痰の液状化に変化が生じ、全量の約１５％以上が液相になり、より好適には全量の約２０％以上が液相になり、より好適には全量の約２５％以上が液相になり、より好適には全量の約３０％以上が液相になり、より好適には全量の約３５％以上が液相になり、より好適には全量の約４０％以上が液相になり、より好適には、全量の約４５％以上が液相になり、より好適には全量の約５０％以上が液相になり、または、粘液によって生じた機能の遮断または阻害が解消されるに至る（例えば、液状物を吐き出し始めるのに十分なほど、患者の気道がきれいになる）。通常、痰または粘液の液状化は、気道、またはそれ以外の遮断された通路（例えば、胃腸管または生殖管）がきれいになるまで、痰を過剰に液状化することなく、小幅で段階的な増分で増進させるのが好適である。粘液または痰を過剰に液状化することは、患者に有害な場合もあるため（例えば、液状化した痰が逆流して、患者が痰を吐き出す前に、感染している濃度の低い液体で小さな気道を溢れさせる可能性があるため）望ましくない。好適には、本発明に係るタンパク質、ペプチド、または組成物を粘液または痰に接触させると、治療前に比べ、粘液または痰の液状化を容量にして約１％以上増加させ、より好適には、約２％以上というように、１％の増し分で、患者の気道やその他の詰まった通路がきれいになるまで続けてゆく。
【００２９】
一つの局面において、本治療は、患者の罹患組織（気道、胃腸管、生殖管など）から薄層化した物質を除去する方法とともに行われる。例えば、呼吸器系の場合には、本発明に係る方法を、体位ドレナージ、強制呼気（ｈｕｆｆ ｃｏｕｇｈｉｎｇ）、およびその他の呼吸運動、または、これら以外で、液状化した粘液または痰を吐き出すために適した方法とともに用いることができる。
【００３０】
本発明によれば、治療すべき患者の粘液または痰を、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質（または該蛋白質を含む組成物）に接触させる。この蛋白質は、粘液または痰の粘性および粘着性を低下させ、および／または、接触前の段階に比べ、痰または粘液の液状化を増進させるのに効果的である。前述したように、チオレドキシンは、ほとんどの生物に存在するジスルフィド還元酵素で、多くのチオール依存型細胞内還元作用に関与する蛋白質である。ヒトにおいて、チオレドキシンは、成人Ｔ細胞白血病由来因子（ＡＤＦ）とも呼ばれる。細胞内においては、この遍在性の低分子量（１１，７００）蛋白質のほとんどは還元されている。還元型または酸化型のチオレドキシンは、無傷の細胞に進入し、または細胞膜に吸着することができ、そこで、少量が、時間をかけて次第に内部移行してゆく。これは、活性部位に２個の近接するシステイン残基を有し、酸化型蛋白質では、この蛋白質の三次元構造からジスルフィド架橋が突き出している。フラビン蛋白質チオレドキシンレダクターゼは、このジスルフィドのＮＡＤＰＨ依存型還元を触媒する。チオレドキシンが僅かに増加すると、蛋白質におけるスルフヒドリル−ジスルフィド酸化還元状態に大きな変化をもたらすことがある。
【００３１】
細胞の蛋白質の還元をもたらすことができる以外に、チオレドキシンは、（例えば、活性酸素種をスカベンジすることによって、酸化されうる基質の酸化を防止することにより）抗酸化因子として直接的に作用することができるが、チオレドキシンは、他のチオール類とは異なり、一般的には、自己酸化によって（例えば、自己酸化によりスーパーオキシド・ラジカルを発生させて）細胞内の酸化ストレスに寄与することはない。前掲、Ｗｈｉｔｅらに付与された米国特許第５，９８５，２６１号は、チオレドキシンが、ＭｎＳＯＤの産生を直接誘導すること、および、この誘導が、還元状態にあるチオレドキシンによってもたらされることを明らかにした。
【００３２】
本発明に係る「チオレドキシン活性部位」は、Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃというアミノ酸配列を含む。ここで、「Ｃ」と表記されるアミノ酸残基はシステイン残基であり、「Ｘ」と表記されるアミノ酸残基は、どのアミノ酸残基でもよいが、具体的には、標準的な２０アミノ酸残基のいずれかである。このような本発明に係るチオレドキシン活性部位は、好適には、アミノ酸配列Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ（配列番号：１）を含む。さらに、チオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘを含むことがある。好適には、本発明に係るチオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）を含むが、ここで、「Ｇ」と表記されるアミノ酸残基はグリシン残基であり、「Ｐ」と表記されるアミノ酸残基はプロリン残基である。より好適には、本発明に係るチオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｗ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｋ（配列番号：３）を含むが、ここで、「Ｗ」と表記されるアミノ酸残基はトリプトファン残基であり、「Ｋ」と表記されるアミノ酸残基はリシン残基である。
【００３３】
本発明の一局面において、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質は、全長のチオレドキシン蛋白質、またはその断片で、構造的および機能的に上記に記載したとおりのチオレドキシン活性部位を含むものである。好適なチオレドキシン蛋白質は、原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物チオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンなどであるが、特にヒトチオレドキシンが好適である。多様な生物に由来するチオレドキシンの核酸配列およびアミノ酸配列が当技術分野において周知されており、本発明に包含される対象となる。例えば、配列番号：４〜１５は、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）（配列番号：４）、ポリフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（配列番号：５）、リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（配列番号：６）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（配列番号：７）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）（配列番号：８）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（配列番号：９）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（配列番号：１０）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）（配列番号：１１）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（配列番号：１２）、シロイズナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（配列番号：１３）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（配列番号：１４）、およびイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（配列番号：１５）に由来するチオレドキシンのアミノ酸配列を示している。これらの配列の各々について、Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）というモチーフ（配列番号：１のＣＧＰＣモチーフを含む）は以下のように存在する。配列番号：４（３３〜３８番目）、配列番号：５（２８〜３３番目）、配列番号：６（２７〜３２番目）、配列番号：７（２９〜３４番目）、配列番号：８（３１〜３６番目）、配列番号：９（３１〜３６番目）、配列番号：１０（３１〜３６番目）、配列番号：１１（３１〜３６番目）、配列番号：１２（３１〜３６番目）、配列番号：１３（５９〜６４番目）、配列番号：１４（８８〜９３番目）、および配列番号：１５（９４〜９９番目）。さらに、ヒトおよび細菌のチオレドキシンなど、いくつかのチオレドキシン蛋白質の三次元構造が解明されている。したがって、多数の生物に由来するチオレドキシンの構造および活性部位が、当技術分野において周知されており、当業者は、本発明において使用することができる、全長チオレドキシンの断片またはホモログを容易に同定および製作することができる。
【００３４】
「還元状態にある」という語句は、本発明に係る蛋白質またはペプチドの活性部位にあるシステイン残基の状態を具体的に述べている。還元状態にあると、これらシステイン残基はジチオール（すなわち、２個の遊離したスルフヒドリル基、−ＳＨ）を形成する。これに対し、酸化型では、これらのシステイン残基は、細胞内でジスルフィド架橋を形成し、このような分子はシスチンと呼ばれる。還元状態では、チオレドキシン活性部位が、その活性部位であるジチオールをジスルフィドに可逆的に酸化することによって酸化還元反応に関与することができ、ジチオール−ジスルフィド交換反応を触媒する。
【００３５】
ここで、チオレドキシン活性部位を含む、本発明に係る蛋白質は、チオレドキシン活性部位そのものであっても、グリコシド結合によって別のアミノ酸に結合しているチオレドキシンであってもよい。このように、本発明に係る蛋白質またはペプチドの最小サイズは、約４個から約６個のアミノ酸長であり、好適なサイズは、その蛋白質の全長体、融合体、多価体、または単なる機能的部位のいずれが所望なのかによって異なる。好適には、本発明に係る蛋白質またはペプチドの長さは、約４個から約１００個以上のアミノ酸残基まで延び、具体的には、整数（すなわち、４、５、６、７…９９、１００、１０１…）である中間的な長さのペプチドが想定されている。さらなる好適な態様において、本発明に係る蛋白質は、全長の蛋白質、またはこの蛋白質のホモログである。ここで、「ホモログ」という用語は、天然の蛋白質またはペプチド（すなわち、「プロトタイプ」または「野生型」の蛋白質）を改変したことによって、天然の蛋白質またはペプチドとは異なるが、天然型の基本的な蛋白質および側鎖の構造を維持しており、および／または、天然の蛋白質の少なくとも生物活性部位（すなわち、チオレドキシン活性部位）の基本的な三次元構造を維持している蛋白質またはペプチドを意味する。このような改変には、１個または数個のアミノ酸側鎖の変化、欠失（例えば、蛋白質またはペプチド（断片）の切断型）、挿入、および／または置換などの１個または数個のアミノ酸の変化、１個または数個の原子の立体配位の変化、および／または、メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化（ｐａｌｍｉｔａｔｉｏｎ）、アミド化、および／または、グリコシルホスファチジルイノシトールの付加など、軽微な誘導体化などがある。本発明によれば、天然のチオレドキシンタンパク質のホモログを含む、本発明において有用な蛋白質またはペプチドは、還元状態で、蛋白質またはペプチドがチオレドキシン活性部位を有するため、その活性部位であるジチオールをジスルフィドに可逆的に酸化することによって、酸化還元反応に関与することができ、ジチオール−ジスルフィド交換反応を触媒することができ、および／または、粘液または痰の粘性または粘着性を低下させるか、粘液または痰の液状化を増進することができる。ここで、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドは、チオレドキシンと同じ特徴をもつことができ、また、好適には、原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物のチオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンからなる群より選択されるチオレドキシンである。特に好適な態様において、この蛋白質はヒトチオレドキシンである。
【００３６】
ホモログは、自然対立遺伝子変異または自然突然変異によるものであってもよい。蛋白質をコードする核酸の自然対立遺伝子変異体とは、ゲノムにおいて、このタンパク質をコードする遺伝子と本質的には同じ遺伝子座（または複数の遺伝子座）に存在するが、例えば、突然変異または組換えによって生じた自然変異のために、似てはいるが同一ではない配列を有する遺伝子である。対立遺伝子変異体は、一般的には、比較の対象となる遺伝子によってコードされているタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードしている。対立遺伝子変異体の一つの種類は、同一の蛋白質をコードすることができるが、遺伝子コードの縮退によって、異なった核酸配列を有する。また、対立遺伝子変異体は、遺伝子の５’側または３’側の非翻訳領域（例えば、調節制御領域）に変異を含む。対立遺伝子変異体は、当業者によく知られている。
【００３７】
単離された天然の蛋白質の直接改変、蛋白質の直接合成、または、例えば、ランダムもしくは標的された変異作出を行うための古典的ＤＮＡ技術もしくは組換えＤＮＡ技術を用いて、蛋白質をコードする核酸配列を改変するなど、当技術分野において蛋白質を作製するために既知の技術を用いて、ホモログを作製することができる。
【００３８】
野生型蛋白質と比較したときのホモログの改変部は、天然の蛋白質と比較したときにホモログの基本的な生物活性に作用または拮抗するか、または実質的な変化を与えないのいずれかである。通常、蛋白質の生物活性または生物作用とは、インビボ（すなわち、蛋白質の自然な生理学的環境において）またはインビトロ（すなわち、実験条件下において）測定または観察したときに、天然型の蛋白質だとされる蛋白質によって示され、行われる機能を意味する。ホモログまたはミメティクス（ｍｉｍｅｔｉｃ）（後述）などへの蛋白質の改変は、天然型の蛋白質と同じ生物活性をもつ蛋白質、または、天然型の蛋白質と比べて低下または上昇した活性を有する蛋白質をもたらす。蛋白質発現の低下、または蛋白質の活性の低下をもたらす改変は、（完全または部分的な）不活性化、下方制御または低下された作用と呼ぶことができる。同様に、蛋白質発現の上昇、または蛋白質の活性の上昇をもたらす改変は、蛋白質の増幅、過剰生産、活性化、促進、上方制御、または増進された作用と呼ぶことができる。
【００３９】
一つの態様において、チオレドキシンのペプチドおよび非ペプチドのホモログを含む、チオレドキシン蛋白質のホモログは、薬剤設計または選択の産物であってもよく、当技術分野において既知のさまざまな方法を用いて作製することができる。このようなホモログをミメティクスと呼ぶこともできる。ミメティクスは、天然のペプチドの基本構造を模倣する基本構造を持ち、および／または、天然のペプチドの主要な生物学的性質を有することから、ミメティクスとは、天然のペプチドの生物作用を模倣することができるペプチドまたは非ペプチドの化合物を意味する。ミメティクスには、天然のペプチドと側鎖類似性のないものなど、プロトタイプからの実質的な改変を有するペプチド（このような改変は、例えば、分解に対する感受性を低下させる可能性がある）、抗イディオタイプおよび／または触媒性の抗体、もしくはその断片、単離された蛋白質の非蛋白質部位（例えば、糖質構造）、または、例えば、コンビナトリアル化学法によって同定される核酸および薬剤などの合成または天然の有機分子などを含みうる。このようなミメティクスは、当技術分野において既知のさまざまな方法を用いて、設計、選択、および／または、さもなければ同定することができる。本発明において有用なミメティクス、またはそれ以外の治療化合物を設計または選択するのに役立つ、さまざまな薬剤設計法が、Ｍａｕｌｉｋら、１９９７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．に開示されており、ここに、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられる。
【００４０】
ミメティクスは、例えば、分子多様性作出法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｓｔｒａｔｅｇｙ）（大規模で、化学的に多様な分子ライブラリーを迅速に構築可能にする関連法を組み合わせたもの）から、特に、化学物質またはコンビナトリアルのライブラリー（すなわち、配列または大きさが異なるが、同じような構成単位を有する化合物のライブラリー）、または、合理的、特異的またはランダム薬剤設計によって、得ることができる。例えば、Ｍａｕｌｉｋら、前掲参照。
【００４１】
分子多様性作出法では、大きな化合物ライブラリーが、生物学的、酵素的、および／または科学的方法を用いて、例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、および／または有機分子から合成される。分子多様性作出法を開発する上で重要なパラメーターは、サブユニットの多様性、分子の大きさ、およびライブラリーの多様性である。このようなライブラリーをスクリーニングする通常の目標は、コンビナトリアル選択の連続的な適用を利用して、所望の標的に対する高親和性のリガンドを得た後、ランダムまたは特異的な設計法のいずれかによってリード分子を最適化することである。分子多様性作出法は、Ｍａｕｌｉｋら、前記の箇所に詳細に記載されている。
【００４２】
Ｍａｕｌｉｋらは、例えば、適当に選択された断片の断片ライブラリーから新規の分子を作出するプロセスを使用者が指示する指定設計法、使用者が、遺伝子アルゴリズムまたはその他のアルゴリズムを用いて、断片とそれらの組み合わせをランダムに変異させつつ、同時に、候補リガンドの適合性を評価するための選択基準を適用するランダム設計法、および、使用者が、三次元レセプター構造と小断片プローブとの間の相互作用エネルギーを計算した後、好ましいプローブ部位を一緒に連結するグリッド基準法（ｇｒｉｄ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ）も開示している。
【００４３】
本発明の一つの態様において、本発明で使用するのに適した蛋白質は、チオレドキシン蛋白質の全長配列、またはその断片であって、本明細書に記載されているとおりのチオレドキシン活性部位を有する断片を含むか、本質的にそれからなるか、または、それからなるアミノ酸配列を有する。例えば、配列番号：４〜１２のいずれか一つ、またはその断片もしくそのホモログであって、本明細書に記載されているとおりのチオレドキシン活性部位を有するものが、本発明に包含される。このようなホモログは、全長チオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列に約１０％以上一致するアミノ酸配列を有する、または約２０％以上、または約３０％以上、または約４０％以上、または約５０％以上、または約６０％以上、または約７０％以上、または約８０％以上、または約９０％以上、または約９５％以上全長チオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有する蛋白質を含むことができるが、このパーセントは、１０％から１００％の間のすべて整数であれば何パーセントでもよい（１０％、１１％、１２％、…９８％、９９％、１００％）。
【００４４】
ここで、特段の記載がない限り、一致率（％）とは、以下を用いて行われた相同性評価を意味する。（１）アミノ酸検索にはｂｌａｓｔｐ、核酸検索にはｂｌａｓｔｎを用いた、標準的なデフォルトのパラメーターによるＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴ相同性検索であって、クエリー配列を、デフォルト値による低複雑度領域（ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎ）についてフィルターをかけた検索（Ａｅｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｓｃｈａａｆｆｅｒ，ＡＡ．Ａ．，Ｚｈａｎｇ．，Ｊ．Ｚｈａｎｇ，Ｚ，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に説明がある。本文献は、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられる）、（２）ＢＬＡＳＴ ２アラインメント（後述のパラメーターを使用）、（３）および／または、標準的なデフォルトのパラメーターによるＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ。（位置特異的）。ＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ ２には標準的なパラメーターに幾分かの違いがあるため、２つの具体的な配列が、ＢＬＡＳＴ ２プログラムを用いたときには有意な相同性ありと識別されても、どちらか一方の配列をクエリー配列としてＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴで検索を行うと、もう一方の配列が最も一致すると同定されないことがあることが知られている。さらに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、「プロファイル」検索の自動簡易版を提供しており、配列相同性を求めるための感度のよい方法である。プログラムは、まず、ギャップを許す（ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴデータベース検索を実行する。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、返ってくる有意なアラインメントからの情報を利用して位置特異的スコアマトリックスを構築し、次回のデータベース検索のクエリー配列を置換する。したがって、当然ながら、これらのプログラムのいずれか一つを用いることによって、一致率を決定することができる。
【００４５】
２つの具体的な配列は、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられるＴａｔｕｓｏｖａとＭａｄｄｅｎ，（１９９９），“Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ - ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）に記載されているとおりに、ＢＬＡＳＴ ２配列を用いて互いにアラインメントすることができる。ＢＬＡＳＴ ２配列アラインメントは、ｂｌａｓｔｐまたはｂｌａｓｔｎで、ＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムを用いて、得られるアラインメントにギャップ（欠失および挿入）を導入することができる、２配列間におけるギャップ許容ＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴ ２．０）を実行して行われる。ここで明確にするために、以下のようにして、標準的なデフォルトのパラメーターを用いてＢＬＡＳＴ ２配列アラインメントが行われる。
【００４６】
ｂｌａｓｔｎの場合、０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを用いて、
一致したときの報酬スコア＝１
不一致のときのペナルティスコア＝−２
ギャップ間隔（５）および延長ギャップ（２）ペナルティ
ギャップＸ＿ドロップオフ（５０）、期待値（１０）単語数（１１）フィルター（ｏｎ）
ｂｌａｓｔｐの場合、０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを用いて、
ギャップ間隔（１１）および延長ギャップ（１）ペナルティ
ギャップＸ＿ドロップオフ（５０）、期待値（１０）単語数（３）フィルター（ｏｎ）
本発明において有用なタンパク質は、全長チオレドキシン蛋白質の１０個以上の連続したアミノ酸残基（例えば、配列番号：４〜１２）（すなわち、参照配列の１０個連続したアミノ酸に１００％一致する１０個連続したアミノ酸残基）を含むアミノ酸配列を有する蛋白質も含みうる。別の態様において、チオレドキシン蛋白質のホモログは、天然のチオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列の１５個以上、または２０個以上、または２５個以上、または３０個以上、または３５個以上、または４０個以上、または４５個以上、または５０個以上、または５５個以上、または６０個以上、または６５個以上、または７０個以上、または７５個以上、または８０個以上などの連続したアミノ酸残基を、すべて整数となる（１０、１１、１２、…）介在長も含んで、全長の蛋白質となるまで含む。
【００４７】
本発明によれば、本明細書に記載されている配列に関して「連続的な」または「連続した」という用語は、切れ目のない配列として結合していることを意味する。例えば、ある配列が、別の配列の３０個連続した（または連続的な）アミノ酸を含むとは、その第一の配列が、第二の配列中の切れ目のない３０個のアミノ酸残基の配列に１００％一致する、切れ目のない３０個のアミノ酸残基の配列を含んでいることを意味する。同様に、ある配列が別の配列に「１００％一致する」とは、その第一の配列が、ヌクレオチドやアミノ酸にギャップ０で、第二の配列に正確に一致することを意味する。
【００４８】
別の態様において、本発明において有用なタンパク質は、天然のチオレドキシンのアミノ酸配列に十分に類似するアミノ酸配列をもち、ホモログをコードする核酸配列が、中度、高度、または非常に高度なストリンジェンシー条件（後述）下で、天然のチオレドキシン蛋白質をコードする核酸分子（すなわち、天然のチオレドキシンのアミノ酸配列をコードする核酸の相補配列）に（すなわち、に対して）ハイブリダイズすることができる蛋白質を含む。このようなハイブリダイゼーション条件の詳細については後述する。
【００４９】
本発明に係るチオレドキシン蛋白質をコードする核酸配列の相補核酸配列とは、チオレドキシンをコードするストランドに相補的な核酸鎖の核酸配列を意味する。所定のアミノ酸配列をコードする二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡと、その一本鎖ＤＮＡに相補的な配列を有する相補鎖を含む。そのため、本発明に係る核酸分子は、二本鎖でも一本鎖でもよく、ストリンカージェントなハイブリダイゼーション条件下で、チオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列をコードする核酸配列、および／または、そのようなアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補鎖と安定したハイブリッドを形成する核酸分子を含む。相補鎖を推定する方法は、当業者にとって既知である。
【００５０】
ここで、ハイブリダイゼーション条件と言うときは、類似した核酸分子を同定するために核酸分子が用いられる標準的なハイブリダイゼーション条件を意味する。そのような標準的条件は、例えば、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に開示されている（特に、９．３１〜９．６２頁参照）。さらに、さまざまな程度のヌクレオチドのミスマッチを許容したハイブリダイゼーションを行うのに適したハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を計算するための式が、例えば、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられるＭｅｉｎｋｏｔｈら、１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４；Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、同書に開示されている。
【００５１】
より具体的には、ここで、中度にストリンジェントなハイブリダイゼーションと洗浄の条件とは、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして用いられる核酸分子に対し約７０％以上の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件（すなわち、約３０％以下のヌクレオチドミスマッチを許容する条件）を意味する。ここで、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションと洗浄の条件とは、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして用いられる核酸分子に対し約８０％以上の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件（すなわち、約２０％以下のヌクレオチドミスマッチを許容する条件）を意味する。ここで、非常に高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションと洗浄の条件とは、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして用いられる核酸分子に対し約９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件（すなわち、約１０％以下のヌクレオチドミスマッチを許容する条件）を意味する。上で検討したように、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、同書の式を用いて、これら特定の程度のヌクレオチドミスマッチを達成するのに適したハイブリダイゼーションと洗浄の条件を計算することができる。このような条件はさまざまなであり、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのどちらが形成されるかによって異なる。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのための計算融解温度は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのそれよりも１０℃低い。具体的な態様において、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにとってストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ＋）というイオン強度、約２０℃から約３５℃という温度（より低いストリンジェンシー）、より好適には、約２８℃から約４０℃という温度（よりストリンジェント）、さらにより好適には、約３５℃から約４５℃という温度（さらに一層ストリンジェント）で、適当な洗浄条件によるハイブリダイゼーションを含む。具体的な態様において、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドにとってストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ＋）というイオン強度、約３０℃から約４５℃という温度、より好適には、約３８℃から約５０℃という温度、さらにより好適には、約４５℃から約５５℃という温度で、同様にストリンジェントな洗浄条件によるハイブリダイゼーションを含む。これらの値は、約１００ヌクレオチドよりも大きく、ホルムアミド０％、そしてＧ＋Ｃ含有率が約４０％の分子についての融解温度の計算に基づいている。あるいは、Ｔｍは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、９．３１〜９．６２頁に示されているような実験によって計算することもできる。通常、洗浄条件は、できるだけストリンジェントであるべきであり、そして、選択したハイブリダイゼーション条件に適合しているべきである。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、塩条件と、具体的なハイブリッドの計算上のＴｍよりもおよそ２０〜２５℃低い温度条件とを組み合わせることを含むことがあり、洗浄条件は、一般的に、ハイブリッドの計算上のＴｍよりも約１２〜２０℃低い温度条件とを組み合わせることを含む。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドで使用するのに適したハイブリダイゼーション条件の一例には、６×ＳＳＣ（５０％ホルムアミド）中、約４２℃で２〜２４時間ハイブリダイズした後、約２×ＳＳＣにおいて室温で一回以上洗浄することを含む洗浄工程を行った後、より高い温度とより低いイオン強度でさらに洗浄すること（例えば、約０．１×〜０．５×ＳＳＣ中約３７℃で一回以上洗浄した後、約０．１×〜０．５×ＳＳＣ中約６８℃で一回以上洗浄すること）を含む。
【００５２】
本発明に係る蛋白質は、チオレドキシン活性部位と、さまざまな作用をもつ融合セグメントとを含むセグメントを含む融合蛋白質でもよい。例えば、このような融合セグメントは、得られた融合蛋白質の精製を、アフィニティークロマトグラフィーを用いて可能にするなど、本発明に係る蛋白質の精製を簡単にするためのツールとして機能することができる。適当な融合セグメントは、所望の機能を有する、あらゆるサイズのドメインでもよい（例えば、蛋白質の安定性を強化する、タンパク質の免疫原性を強化する、および／または、蛋白質の精製を簡単にする）。一つ以上の融合セグメントを使用することは、本発明の範囲内にある。融合セグメントを、チオレドキシン活性部位を含むセグメントのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に結合させることができる。融合セグメントと、融合蛋白質のチオレドキシン活性部位含有ドメインとの間の結合は、この蛋白質のチオレドキシン活性部位含有ドメインを直接回復できるようにするため、切断されやすくなっていることもある。好適には、融合蛋白質は、チオレドキシン活性部位含有ドメインのカルボキシ末端および／またはアミノ末端に結合した融合セグメントを含む蛋白質をコードする融合核酸分子で形質転換した組換え細胞を培養して産生される。
【００５３】
一つの態様において、本発明に係る方法とともに使用するのに適した、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドは、該蛋白質が投与される動物種と実質的に類似する動物種に由来するチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを含む。別の態様において、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドは、微生物および植物など多様な由来原からのものを含み、所定の患者に用いることができる。
【００５４】
本発明の一つの態様において、天然のチオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列など、本明細書に記載されたアミノ酸配列はいずれも、特定されたアミノ酸配列のＣ−および／またはＮ−末端のそれぞれに隣接する、１個以上で約２０個までの異種性の付加的アミノ酸とともに産生することができる。その結果得られる蛋白質またはポリペプチドは、特定されたアミノ酸配列から「本質的になる」と呼ぶことができる。本発明によれば、異種性のアミノ酸とは、自然には、特定されたアミノ酸配列に隣接して存在しない（すなわち、自然、すなわちインビボでは見られない）アミノ酸の配列であるか、または、特定されたアミノ酸配列の機能とは関連しないアミノ酸配列であるか、または、そのアミノ酸配列が由来する生物にとって標準的なコドン使用頻度を用いて翻訳されたならば、遺伝子内に存在するときには、特定されたアミノ酸配列をコードする天然の核酸配列に隣接しているヌクレオチドによってはコードされていないアミノ酸の配列である。同様に、「本質的になる」という語句は、本明細書において核酸配列に関して使用するとき、特定されたアミノ酸配列をコードする核酸配列の５’および／または３’末端のそれぞれに付加された、１個以上で、約６０個までの異種性のヌクレオチドが隣接していることがある、特定されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を意味する。異種性のヌクレオチドは、特定されたアミノ酸配列をコードする核酸配列が天然の遺伝子中に存在するときには、それに隣接しているのが自然には見られない（すなわち、自然界、インビボでは見られない）か、または、該蛋白質に付加的機能を付与するか、特定されたアミノ酸配列を有するタンパク質の機能を変化させる蛋白質をコードしていない。
【００５５】
別の態様において、本発明に係る方法とともに使用するのに適した、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドは、単離され、または生物学的に純粋な、その天然の環境から取り出してきた蛋白質を含む。したがって、「単離された」および「生物学的に純粋な」は、必ずしも、その蛋白質が精製されている限度を反映しているわけではない。本発明に係る単離蛋白質は、例えば、天然の由来原から得ることができ、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法、クロニーング）を用いて製造することができ、または、化学的に合成することができる。
【００５６】
好適には、本発明に係る方法で使用される、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質は、患者の体内で粘液または痰の液状化を測定可能または検出可能な程度増進させる（または、粘性または粘着性を低下させる）のに十分な、および／または、患者の粘液または痰を伴う患者に測定可能、検出可能または感知される治療上の恩恵をもたらすのに十分な半減期をインビボで有する。この半減期は、このような蛋白質の送達方法によってもたらされうる。本発明に係る蛋白質は、好適には、動物において約５分よりも長い半減期を有し、より好適には、動物において約４時間よりも長く、さらにより好適には、動物において約１６時間よりも長い。好適な態様において、本発明に係る蛋白質は、動物において約５分から約２４時間までの半減期を有し、好適には、動物において約２時間から約１６時間までであり、より好適には、動物において約４時間から約１２時間までである。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドをコードする核酸分子を含む。そのような核酸分子を用いて、本発明に係る方法においてインビトロまたはインビボで有用な蛋白質を製造することができる。本発明に係る核酸分子は、本明細書で既に説明した蛋白質のいずれかをコードする核酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる核酸分子を含む。本発明によれば、単離された核酸分子とは、その天然の環境から取り出された（すなわち、人間による操作を受けた）核酸分子（ポリヌクレオチド）であって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ｃＤＮＡなど、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体を含みうる。したがって、「単離された」とは、核酸分子がどの程度精製されているかを反映するものではない。「核酸分子」という語句は、一次的には、物理的な核酸分子意味し、「核酸配列」という語句は、一次的には、核酸分子上のヌクレオチドの配列を意味するが、この二つの語句は、特に、蛋白質をコードすることができる核酸分子、または核酸配列について互換的に使用することができる。本発明に係る単離された核酸分子は、その天然の由来原から単離し、または、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法、クロニーング）もしくは化学合成法を用いて製造することができる。単離された核酸分子は、例えば、遺伝子、自然対立遺伝子変異体、そのコード領域もしくは一部、および、改変によって、本発明に係る所望の蛋白質をコードするか、もしくは天然の遺伝子を単離したものとストリンジェントな条件下で安定したハイブリッドを形成する核酸分子の能力を実質的に阻害することがないようにヌクレオチド挿入、欠失、置換および、または逆位により改変されたコード領域および／または調節領域を含みうる。単離された核酸分子は縮退を含みうる。ここで、ヌクレオチドの縮退とは、一つのアミノ酸が、異なったヌクレオチドコドンによってコードされうるという現象を意味する。したがって、本発明において有用な所定の蛋白質をコードする核酸分子の核酸配列は、縮退によって変化しうる。
【００５８】
本発明によれば、遺伝子というとき、該遺伝子によってコードされる蛋白質の産生を調節する制御領域（転写、翻訳、または翻訳後の調節領域）、およびコード領域そのものなど、天然（すなわち野生型）の遺伝子に関係するすべての核酸配列を含む。別の態様において、遺伝子は、所定の蛋白質をコードする核酸配列に類似するが同一ではない配列を含む、天然の対立遺伝子変異体でもよい。対立遺伝子変異体は、既に上記で説明されている。「核酸分子」および「遺伝子」という語句は、核酸分子が、上記のような遺伝子を含むときには、互換的に使用することができる。
【００５９】
好適には、本発明に係る単離された核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法、クロニーング）を用いて製造することができ、または、化学的に合成することができる。単離された核酸分子は、天然の核酸分子、ならびに、そのホモログであって、天然の対立遺伝子変異体、および改変によって、蛋白質の生物活性に対し所望の効果が提供されるよう、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、および／または逆位されている改変核酸分子などを含むホモログを含む。対立遺伝子変異体および蛋白質ホモログ（例えば、核酸ホモログによってコードされる蛋白質）については、詳細に上述されている。
【００６０】
核酸分子ホモログは、当業者に既知のいくつかの方法を用いて作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら参照）。例えば、古典的な変異誘発法および組換えＤＮＡ技術（例えば、部位特異的変異誘発法、化学的処理、制限酵素切断法、核酸分子断片のライゲーション、および／またはＰＣＲ増幅法）による技術、または、オリゴヌクレオチド混合物の合成、混合物グループをライゲーションして、核酸分子の混合物、およびそれらを組み合わせたものを「構築」する技術など、さまざまな技術を用いて核酸分子を改変することができる。所定の蛋白質をコードする組換え核酸分子を改変するための別法は遺伝子シャッフリング法（すなわち分子育種（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ）である（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒに付与された米国特許第５，６０５，７９３号；ＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：２８４−２９０；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１参照。これらの文献は、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられる）。この技術を用いて、蛋白質に複数の変化を同時に効果的に導入することができる。所定の遺伝子とのハイブリダイゼーションによって、または、核酸分子によってコードされる蛋白質の機能（すなわち生物活性）をスクリーニングすることによって、核酸分子のホモログを選択することができる。
【００６１】
本発明の一つの態様は、一つ以上の転写調節配列に機能的に連結されている上記の単離された核酸分子を含む組換え核酸分子に関する。より具体的には、本発明によれば、組換え核酸分子は、本明細書に記載するような組換えベクターおよび単離核酸分子を一般的に含む。本発明によれば、組換えベクターは、選抜された核酸配列を操作し、および／または、その核酸配列を宿主細胞に導入するためのツールとして用いられる改造された（すなわち、人為的に作製された）核酸分子である。したがって、組換えベクターは、選抜された核酸配列を宿主細胞の中で発現および／または組換え細胞を形成させるために送達するなどして、選抜した核酸配列をクロニーング、シークエンシング、および／またはその他の操作を行うときに使用するのに適している。このようなベクターは、典型的には、異種性の核酸配列、すなわち、自然には、クロニーングされるか送達される核酸配列に隣接しているとは認められない核酸配列を含むが、このベクターは、自然界で、本発明に係る核酸配列に隣接していることが分かっているか、または、本発明に係る核酸分子を発現させるのに有用な調節核酸配列（例えば、プロモーター、非翻訳領域）を含むこともできる（詳細は後述）。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、原核生物または真核生物のいずれでもよいが、典型的にはプラスミドである。ベクターは、染色体外因子（例えばプラスミド）として維持するか、または、組換え宿主細胞の染色体の中に組み込むことができるが、ベクターが、ゲノムから離れたままになっていれば、本発明を適用する場面のほとんどにとって好適である。ベクターの全体を、宿主細胞の中の適当な場所で維持するか、一定の条件下では、本発明に係る核酸分子を残して、プラスミドＤＮＡは除去することもできる。組み込まれた核酸分子は、染色体のプロモーターによる調節下、天然もしくはプラスミドのプロモーターによる調節下、またはいくつかのプロモーターを組み合わせたものの調節下に置くことができる。核酸分子の一個または複数個のコピーを染色体の中に組み込むことができる。本発明に係る組換えベクターは、少なくとも１個の選抜マーカーを含むことができる。
【００６２】
一つの態様において、本発明に係る組換え核酸分子で使用される組換えベクターは発現ベクターである。ここで、「発現ベクター」という語句は、コードされている産物（例えば、目的とする蛋白質）を産生させるのに適したベクターを意味するために使用される。この態様において、産生すべき産物（例えばチオレドキシン活性部位を含む蛋白質）をコードする核酸配列を組換えベクターに挿入して、組換え核酸分子を作製する。ベクター内で核酸配列が調節配列に機能的に連結されて、組換え宿主細胞内での核酸配列の転写および翻訳が可能になるように、産生すべき蛋白質をコードする核酸配列をベクターの中に組み込む。
【００６３】
本発明の別の態様において、組換え核酸分子はウイルスベクターを含む。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムまたはその一部の中に組み込まれた本発明に係る単離核酸分子を含むが、その中で、核酸分子は、細胞の中にＤＮＡが進入できるよう、ウイルス外被にパッケージされている。アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスなどを利用したものなど、いくつかのウイルスベクターを使用することができる。
【００６４】
一般的には、組換え核酸分子は、一個以上の発現調節配列に機能的に連結した本発明に係る核酸分子を少なくとも一個含む。ここで、「組換え分子」または「組換え核酸分子」という語句は、一次的には、発現調節配列に機能的に連結された核酸分子または核酸配列を意味するが、核酸分子が、本明細書で検討されているような組換え分子であるときは、「核酸分子」という語句と互換的に使用することもできる。本発明によれば、「機能的に連結された」という語句は、宿主細胞中にトランスフェクトされた（すなわち、形質転換、形質導入、トランスフェクト、接合、または形質伝導（ｃｏｎｄｕｃｅｄ）された）ときに分子が発現されうるように、核酸分子を発現調節配列に連結することを意味する。転写調節配列は、転写の開始、伸長、または終結を調節する発現調節配列である。特に重要な転写調節配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列、およびリプレッサー配列など、転写開始を調節する配列である。適当な転写調節配列には、組換え核酸分子が導入される宿主細胞または生物の中で機能することができる転写調節配列が含まれる。また、本発明に係る組換え核酸分子は、さらに、翻訳調節配列、複製開始点、およびその他の調節配列であって、組換え細胞に適合するものなど、付加的な調節配列を含むこともできる。一つの態様において、宿主細胞の染色体に組み込まれている分子など、本発明に係る組換え分子は、発現された蛋白質が、蛋白質を産生する細胞から分泌されるようにする分泌シグナル（すなわち、シグナルセグメント核酸配列）も含む。適当なシグナルセグメントには、発現される蛋白質と自然界で結合しているシグナルセグメント、または、本発明に係る蛋白質の分泌を指令することができる異種性シグナルセグメントなどがある。別の態様において、本発明に係る組換え分子は、発現された蛋白質を宿主細胞の膜まで輸送して挿入することができるリーダー配列を含む。適当なリーダー配列には、その蛋白質と自然界で結合しているリーダー配列、または、蛋白質を宿主細胞の膜まで輸送して挿入することを指令できる異種性リーダー配列などがある。
【００６５】
本発明によれば、「トランスフェクション」という用語は、外来性核酸分子（すなわち組換え核酸分子）を細胞内に挿入しうる方法を意味するために使用される。「形質転換」という用語は、この語が、微生物細胞または植物の中に核酸分子を導入するという意味で使用される場合には、「トランスフェクション」という用語と互換的に使用することができる。微生物系においては、「形質転換」という用語を使用して、微生物による外来核酸の獲得によって生じる遺伝的変化を表現するが、本質的に、「トランスフェクション」という用語と同義である。しかし、動物細胞では、例えば、癌化した後の培養状態における細胞の増殖性の変化（上記）を意味するという第二の意味を得ている。したがって、混乱を避けるため、動物細胞への外来性核酸の導入については、好適には、「トランスフェクション」という用語を使用し、本明細書において、外来性核酸を細胞に導入する場合に関しては、この用語が、動物細胞のトランスフェクション、および植物細胞と微生物細胞の形質転換を一般的に包含するものとして使用される。したがって、トランスフェクション技術には、形質転換、粒子衝撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、電子穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染、およびプロトプラスト融合などがある。
【００６６】
本発明に係る組換え分子を一個以上用いて、本発明に係るコードされた産物（例えば、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質）を生産することができる。一つの態様において、コードされた産物は、蛋白質を産生するのに効果的な条件下で、本明細書に記載されている核酸分子を発現させることによって生産することができる。コードされた蛋白質を生産するために好適な方法は、一個以上の組換え分子で宿主細胞をトランスフェクトして、組換え細胞を形成させる方法である。
【００６７】
好適な態様において、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを、組成物で処理すべき粘液または痰に接触させる。この組成物は、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質を含み、また、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を減少させるか、そのような粘液または痰の液状化を増進させるために使用することができる別の化合物など、一種類以上の付加的な化合物を含むこともできる。一つの態様において、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドをコードする核酸分子を、治療すべき患者の細胞（例えば、肺または気道中の上皮細胞）に送達するために組成物を使用して、細胞がトランスフェクトされて、蛋白質を発現できるようになり、また、蛋白質が、細胞の微小環境内で粘液または痰に接触できるようにさせることができる。
【００６８】
また、組成物は、例えば、蛋白質または核酸分子またはその他の調節用化合物を患者に送達するための薬学的に許容される賦形剤および／または輸送用媒体など、薬学的に許容される担体を含むこともできる。ここで、薬学的に許容される担体とは、本発明に係る方法において有用な治療用蛋白質、核酸、または、その他の化合物を、適当なインビボまたはエクスビボ部位に送達するのに適した物質を意味する。好適な薬学的に許容される担体は、蛋白質、核酸分子、または化合物が所望の部位（例えば、処理すべき粘液または痰が分泌または排出されている部位）に到達したとき、粘液または痰に接触することができる形状（蛋白質または化合物の場合）、または、細胞の中に進入して、細胞によって発現され、発現された蛋白質が粘液または痰に接触しうる形状（核酸分子の場合）に蛋白質、核酸分子、または化合物を維持することができる。本発明に係る適当な賦形剤には、治療剤（蛋白質、核酸、または化合物）を細胞、組織、または液状物（粘液または痰）に輸送するか、輸送を助けるが、特異的に標的しない賦形剤または処方薬（ここでは、非標的担体とも呼ばれる）などがある。薬学的に許容される賦形剤の例には、水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス液、その他の生理学的平衡水溶液、油類、エステル、およびグリコール類などがある。水性担体は、例えば、科学的安定性および等張性を促進することによって、レシピエントの生理学的状態に近づけるために必要とされる適当な補助物質を含むことができる。
【００６９】
適当な補助物質には、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、および重炭酸緩衝液を作製するのに使用される他の物質などがある。また、補助物質は、チメロサール、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリン、およびベンゾールアルコールなどの保存剤を含むことができる。本発明に係る組成物は、常法を用いて滅菌、および／または凍結乾燥することができる。
【００７０】
薬学的に許容される担体の一つのタイプは、本発明に係る組成物を患者の体内にゆっくりと放出することができる放出制御型処方薬を含む。ここで、放出制御型処方薬は、一種類以上の本発明に係る治療剤を放出制御用媒体の中に含む。適当な放出制御用媒体には、生体適合性ポリマー、その他のポリマー基質、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス調製剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフィア（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）、および経皮送達系などがある。核酸の適当な送達媒体には、リポソーム、ウイルスベクター、または、リボザイムなど、その他の送達媒体がある。
【００７１】
リポソーム送達媒体は、蛋白質、化合物、または核酸分子を、患者の適当な細胞および／または組織に送達することができる脂質化合物を含む。リポソーム送達媒体は、細胞の中に組成物を送達するために、細胞の原形質膜に融合することができる脂質組成物を含むことができる。リポソーム送達媒体は、好適には、患者の体内の好適な部位に組成物を送達するのに十分な時間、患者の体内で安定に維持できる。本発明で使用するのに適したリポソームは、あらゆるリポソームを含む。
【００７２】
チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを患者に投与するのに適当または有効な量とは以下のことができる量である。活性部位のジチオールをジスルフィドに可逆的に酸化することによって酸化還元反応に関与すること、ジチオール−ジスルフィド交換反応を触媒すること、ならびに、具体的には、患者の体内で粘液または痰の粘性または粘着性を低下させること、および／または粘液または痰の液状化を増進すること、ならびに、より具体的には、患者に治療による恩恵を提供できるほど、患者の体内で粘液または痰の液状化を増進すること。粘性または粘着性の低下、または粘液または痰の液状化の増進は、本明細書において既に記載されているように、または、当業者に既知の適当な方法によって測定、検出、または判定することができる。
【００７３】
一つの態様において、患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドの好適な量は、患者の体重１ｋｇあたり約０．１マイクロモルから約１５０マイクロモルまでである。別の態様において、患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドの好適な量は、患者の体重１ｋｇあたり約１．５マイクロモルから約１５０マイクロモルまでである。患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドのより好適な量は、患者の体重１ｋｇあたり約２マイクロモルから約２５マイクロモルまでである。患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドのさらにより好適な量は、患者の体重１ｋｇあたり約３マイクロモルから約１０マイクロモルまでである。
【００７４】
別の態様において、送達経路がエアロゾルまたは同様の経路である場合には、患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドの好適な量は、投薬単位（例えば、ヒトへの投薬単位は、一般的に約２〜３ｍｌ）あたり約０．２５ｍｇ以上、および投薬単位あたり約２５ｍｇを含む。好適には、患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチド量は、投薬単位あたり約０．２５ｍｇ以上、また、より好適には、投薬単位あたり約０．３ｍｇ以上、また、より好適には、投薬単位あたり約０．３５ｍｇ以上というように、０．０５ｍｇの増し分で、投薬単位あたり約２５ｍｇ以上までを含む。エアロゾル送達では、一般的に、エアロゾルの約１０％の容量しか、実際には気道に送達されない。したがって、他の投薬経路で、その部位に送達される組成物の容量がこれよりも多い場合には、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドの用量を減らしたものを使用できることが簡単に理解できよう。
【００７５】
動物に投与される本発明に係る蛋白質の最適量は、投与経路によって変化する。例えば、蛋白質を吸入経路（エアロゾル）によって投与する場合、最適投与量は、気管内注射で投与するときの最適量とは異なる。このように投与経路に応じて、量を変化させることは当業者にとって可能である。本発明に係る蛋白質の適当量とは、動物にとって有毒でなく、所望の機能を発揮する量であるということに留意することが重要である。
【００７６】
本願発明の好適な態様において、チオレドキシン反応部位を含む蛋白質を含む本発明に係る組成物は、蛋白質のチオレドキシン活性部位を還元状態に維持または還元する還元系を含む一種類以上の薬剤とともにさらに調剤される。好適には、このような薬剤には、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（ＮＡＤＰＨ）、および／またはチオレドキシンレダクターゼなどがあるが、ＮＡＤＰＨとの調剤が特に好適である。本発明者は、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドとともに還元系が存在すると、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質が、本発明に係る方法において機能する能力が高まること（例えば、粘液または痰の液状化を増進すること）を発見した。さらに、本発明者は、還元系としては、ＮＡＤＰＨを含めば十分であり、そのため、この還元系にチオレドキシンレダクターゼは必要ではないが、所望の場合には含むこともできるということを発見した。本発明において他の還元系を用いることもでき、ＮＡＤＨ−依存型チオレドキシンレダクターゼ、リポ酸、および他の生物レダクターゼなどが含まれる。一般的には、本発明者は、還元当量の由来原である、たぶんＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨが、最適な治療効果を得るための、本発明に係る組成物の重要な成分であると考える。しかし、還元当量を（ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨからのＨ＋）、チオレドキシンまたはチオレドキシン活性部位を含む分子に移行させる仲介機能に役立つ付加的成分も使用することができる。
【００７７】
ＮＡＤＰＨが本発明に係る組成物に含まれるときには、ＮＡＤＰＨの表面濃度が約０．５μＭから約２０ｍＭになるよう調剤するのが好適であり、より好適には、ＮＡＤＰＨの表面濃度が約５μＭから約２ｍＭになるよう調剤し、さらにより好適には、ＮＡＤＰＨの表面濃度が約５０μＭから約２００μＭになるよう調剤する。別の態様において、組成物は、適当量のＮＡＤＰＨ、好適には、ＮＡＤＰＨの表面濃度が約０．５μＭから約２０ｍＭになるよう、０．１μＭの増し分（すなわち、０．５μＭ、０．６μＭ、…１９．９μＭ、２０μＭ）で調剤することができる。「なった表面濃度」とは、ＮＡＤＰＨなど、具体的な化学物質の濃度であって、細胞または組織の表面、例えば、肺上皮内壁の表面において達成または存在する濃度のことである。したがって、所定の表面濃度にならせるためには、実際には、具体的な化学物質をより高い濃度で投与する必要があろう。当業者は、このような濃度を適宜決定しえる。チオレドキシンレダクターゼを本発明に係る組成物に含むとき、チオレドキシンレダクターゼの表面濃度が、約０．００１μＭから約１μＭまでになるよう調剤するのが好適であり、より好適には、チオレドキシンレダクターゼの表面濃度が約０．００１μＭから約０．１μＭまでになるよう、０．００１μＭずつの増し分で約０．０００１μＭから約１μＭまでの量を含む量に調剤する。一つの態様において、本発明に係る組成物にチオレドキシンレダクターゼを含ませることが必要である。このような量のチオレドキシンレダクターゼおよび／またはＮＡＤＰＨを、当業者が、チオレドキシン活性部位の還元状態を維持または促進するために、このチオレドキシン活性部位または送達方式を含む蛋白質またはペプチドの量が指示するように修飾することは、本発明の範囲内である。
【００７８】
上記検討したように、本発明に係る組成物は、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を減少させるか、そのような粘液または痰の液状化を増進させるために使用することができる他の化合物など、一種類以上の付加的化合物を含むことができる。このような化合物の例は、当技術分野において既知であり、精製されたｒｈＤＮａｓｅ、Ｎ−アセチルシステイン、ナシステリン（Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの誘導体）、およびゲルソリンなどがある。
【００７９】
上記検討したように、本発明に係る組成物は、該組成物、特に、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子、および／または該組成物に含まれる他の化合物を標的部位（例えば、蛋白質および化合物については、処理すべき粘液または痰、組換え核酸分子については、処理すべき粘液または痰という環境に入れられる、またはその中に存在する標的宿主細胞）に送達するのに効果的な方法で患者に投与される。適当な投薬プロトコールには、インビボまたはエクスビボでの投薬プロトコールが含まれる。
【００８０】
本発明によれば、効果的な投薬プロトコール（すなわち、本発明に係る組成物を効果的な方法で投与すること）は、組成物に含まれる、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質および／または他の化合物を、処理すべき粘液または痰に接触させるのに適当な、または、患者の所望の宿主細胞において、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質をコードする組換え核酸分子のトランスフェクションまたは発現をもたらすのに適当な投薬量パラメーターおよび投薬方式を含み、その結果、好適には、このような投与から、患者は、測定可能、観察可能または感受できる恩恵を得る。状況によっては、患者から粘液または痰をサンプリングして、本明細書で論じた、粘液または痰の粘性または液状化を評価する方法を用いて、効果的な投薬量パラメーターを決定することができる。あるいは、インビトロの試料、インビボの動物モデル、および、患者がヒトであるときは、最終的には臨床試験を用いた実験によって効果的な投薬量パラメーターを決定することができる。具体的な病気または症状に対して、当技術分野で標準的な方法を用いて投薬量パラメーターを決定することができる。このような方法は、例えば、生存率、副作用（すなわち毒性）、および病気の進行および退行を測定することが含まれる。
【００８１】
本発明によれば、本発明に係る組成物を患者に投与するのに適した方法には、組成物を、患者の体内の所望の部位に送達するのに適したインビボ投与経路が含まれる。好適な投与経路は当業者にとって明らかであるが、化合物が蛋白質、核酸、または他の化合物（例えば薬物）のいずれであるかに応じて、身体のどの部位に組成物を投与するかによって、また、患者が患っている病気や症状に応じて異なる。通常、インビボ投与法には、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内投与（例えば、頸動脈内）、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、脳室内投与、吸入（例えばエアロゾル）、脳内、経鼻、経口、肺投与、カテーテルの注入、および組織への直接注射などがある。経耳到達には、点耳薬などが含まれ、鼻腔内送達には、点鼻薬または鼻腔内注射などがあり、また、眼内送達には、点眼薬などがある。エアロゾルの（吸入）送達は、当技術分野で標準的な方法を用いて行うこともできる（例えば、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられるＳｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７−１１２８１，１９９２を参照）。経口送達は、例えば、錠剤またはカプセルとして、また、食品および飲料に処方されているものなど、口から取り込むことができる固体および液体などがある。粘膜組織にとって有用な他の投与経路には、気管支、皮内、筋肉内、鼻腔内、他の吸入経路、直腸、皮下、局所、経皮、膣、経頸管、頸管周囲（ｐｅｒｉｃｅｒｖｉｃａｌ）および尿道などの経路が含まれる。さらに、投薬プロトコールは、不妊などへの適用に使用するために、ペッサリーに入れた蛋白質、ペプチド、または組成物を（例えば、頸管への）適用するなど、前治療用装置を含むこともある。本発明の好適な態様において、本発明に係る蛋白質または組成物を、呼吸管（気道）内にある過剰または異常に粘性または粘着性の痰または粘液を処理するために投与する場合には、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチド（または組成物）、またはその他の化合物は、吸入（すなわち、例えば、界面活性剤の中の、またはそれとともにエアロゾルを吸入する）、気管支鏡、気管内チューブおよび／または人工的な換気装置による肺内への直接設置、鼻への投与（鼻腔内または経鼻）、気管支、または気管内（すなわち、気管の中に直接注射するか、気管開口）、直接的、もしくは脂質カプセル化または界面活性剤のいずれかによるなどの経路によって投与される。組成物または蛋白質を気道に導入して、そこに存在する粘液または痰に接触できるようにする方法で考えられるものが、本発明に包含される。
【００８２】
本明細書に開示されているさまざまな投与方法および送達媒体が、標的細胞に核酸分子を送達し、核酸分子が細胞をトランスフェクションして発現されるのに効果的であることが分かっている。多くの研究で、好適な細胞型において、および／または、好適な送達媒体、および本発明に係る投与方法を用いて、異種性遺伝子の送達と発現に成功している。
【００８３】
例えば、リポソーム送達法を用いて、１９９８年１月６日にＤｏｗらに発行された米国特許第５，７０５，１５１号は、カチオン性リポソーム送達媒体に入れたスーパー抗原をコードする核酸およびサイトカインをコードする核酸分子を、インビボで静脈内送達して、動物の組織の中、具体的には、肺組織において、コードされた蛋白質を発現させることに成功したことを明らかにした。さらに、Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１６７，１９９７は、遺伝子を含むコレステロール含有カチオン性リポソームの静脈内送達が、選択的に肺組織を標的として、該遺伝子のインビボで移動および発現を効果的にもたらすことを明らかにした。Ｄｚａｕとその共同研究者らによるいくつかの刊行物は、裸のＤＮＡおよびセンダイウイルス−リポソーム送達法を用いて、心膜内でのインキュベーションおよび冠動脈への注入（冠動脈内送達）の両方による投与によって、心臓の筋細胞および線維芽細胞、および血管平滑筋細胞などの心臓の細胞への遺伝子のインビボ送達と発現に成功したことを明らかにしている（例えば、Ａｏｋｉら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２９：９４９−９５９；Ｋａｎｅｄａら、１９９７，Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１１：２９９−３０８；およびｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｅｙｅｎら、１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１３７−１１４１参照）。
【００８４】
数多くの核酸配列の送達が、その核酸配列をコードするウイルスベクターを投与して行われてきた。このようなベクターを用い、エクスビボ送達（多くの実例のうち、レトロウイルスについて、Ｂｌａｅｓｅら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０；Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５参照）、鼻への投与（ＣＦＴＲ−アデノウイルス随伴ベクター）、冠動脈内投与（アデノウイルスベクターおよびセンダイウイルス、上記参照）、静脈内投与（アデノ随伴ウイルスベクター、Ｋｏｅｂｅｒｌら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１４２６−１４３１）を用いて、送達および発現に成功している。Ｍａｕｒｉｃｅらによる刊行物（１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：２１−２９）は、冠状動脈内送達によって投与されたβ２−アドレナリン作用性レセプターをコードするアデノウイルスベクターが、インビボでの複数の心室における心筋での広範な発現（ｄｉｆｆｕｓｅ ｍｕｌｔｉｃｈａｍｂｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をもたらし、その後、血行力学的作用の有意な増進およびその他の生理学的パラメーターの改善がもたらされたことを明らかにした。Ｌｅｖｉｎｅらは、アデノウイルスベクター、および脂肪組織の中へのコンストラクトの直接注射法を用いた、ヒト脂肪細胞およびウサギ脂肪細胞へのインビトロ、エクスビボ、およびインビボにおける遺伝子の送達および発現について記載している（Ｌｅｖｉｎｅら、１９９８，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．４４：５６９−５７２）。
【００８５】
神経細胞における遺伝子送達領域では、インビボにおける遺伝子移行に成功したことが複数報告されている。Ｍｉｌｌｅｃａｍｐｓらは、導入遺伝子のプロモーター（ホスホグリセリン酸プロモーター）の上流に設置した神経選択的エンハンサー因子（ｎｅｕｒｏｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を用いて、アデノウイルスベクターに神経細胞を標的させたことを報告している。このようなベクターを、マウスおよびラットのそれぞれ筋肉内および脳内に投与して、導入遺伝子をインビボで神経細胞特異的にトランスフェクションし発現させることに成功した（Ｍｉｌｌｅｃａｍｐｓら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：８６５−８６９）。上記で検討したように、Ｂｅｎｎｅｔｔらは、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて、網膜下注射により、遺伝子を神経網膜にインビボで送達し、一年よりも長い期間発現させたことを報告した（Ｂｅｎｎｅｔｔ，１９９９、同書）。
【００８６】
滑膜の内壁細胞および関節への遺伝子送達にも同様に成功している。Ｏｌｉｇｉｎｏらのチームは、前初期遺伝子であるＩＣＰ４、２２および２７に欠損をもつ単純ヘルペスウイルスベクターを用いて、２種類の異なったレセプターを、インビボで滑膜の内壁細胞に送達および発現したことを報告している（Ｏｌｉｇｉｎｏら、１９９９、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１７１３−１７２０）。これらのヘルペスベクターは、関節内注射によって投与された。Ｋｕｂｏｋｉらは、アデノウイルスベクターによる遺伝子導入法と関節内注射を用いて、インビボでモルモットの顎関節において遺伝子を特異的に発現させることに成功した（Ｋｕｂｏｋｉら、１９９９、Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．４４：７０１−７０９）。Ａｐｐａｒａｉｌｌｙらのチームは、ＩＬ−１０をコードするアデノウイルスベクターをマウスに全身投与して、遺伝子産物の発現に成功したこと、および実験的に誘発された関節炎の治療に非常に大きな治療効果があったことを明らかにした（Ａｐｐａｒａｉｌｌｙら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５２１３−５２２０）。別の研究では、マウス白血病ウイルスを利用したレトロウイルスベクターを用いて、エクスビボおよびインビボで、ヒト成長ホルモン遺伝子を送達（関節内注射によって）および発現させた（Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉら、１９９７、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：９７７−９８２）。この研究は、インビボでの遺伝子導入による発現が、エクスビボ遺伝子導入による発現と少なくとも同等であることを明らかにした。上記で検討したように、Ｓａｗｃｈｕｋらは、関節内注射によって、アデノウイルスベクターによる遺伝子のインビボでの送達に成功したこと、および、抗Ｔ細胞レセプターモノクローナル抗体で関節を前処理することによって、遺伝子を滑膜内で長時間発現させたことを報告している（Ｓａｗｃｈｕｋら、１９９６、同書）。最後に、レトロウイルスを用いた、ヒトインターロイキン−１レセプターアンタゴニストのエクスビボでの遺伝子導入によって、関節炎の治療において高レベルの関節内発現と治療効果が得られ、現在、ＦＤＡが認可するヒトの遺伝子治療試験に加えられていることに注目すべきである（ＥｖａｎｓとＲｏｂｂｉｎｓ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．８：２３０−２３４）。したがって、遺伝子治療における最新技術は、ヒトの遺伝子治療が、少なくとも関節炎の治療にとっては適当な方法であるとＦＤＡに考えさせるようになっている。まとめると、遺伝子治療における上記研究のすべてが、本発明に係る組換え核酸分子の送達および発現が実現可能であることを示している。
【００８７】
組換え分子を送達する別法は、非標的指向型担体（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｒｒｉｅｒ）である（例えば、Ｗｏｌｆｆら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１４６５−１４６８で教示されているような「裸」のＤＮＡなど）。このような組換え核酸分子は、一般的には、直接投与または筋内投与によって注射される。裸のＤＮＡ投与法によって投与される組換え核酸分子には、本発明に係る単離核酸分子などがあり、好適には、本発明に係る組換え分子であって、好適には、複製、または、さもなければ増幅する能力をもつ分子を含む。本発明に係る裸の核酸試薬は、ジシストロニックな組換え分子を含む、一種類以上の核酸分子を含むことができる。裸の核酸の送達は、筋肉内、皮下、皮内、経皮、鼻腔内、および経口という投与経路を含むが、標的組織への直接注射が最も好適である。裸の核酸ワクチンの好適な一回用量は、当業者が決定しうるが、投与経路および／または送達方法に応じて、約１ナノグラム（ｎｇ）から約１００μｇの範囲にある。適当な送達方法には、例えば、注射による、エアロゾル化されるおよび／または局所的に点薬とするなどがある。一つの態様において、精製されたＤＮＡコンストラクトは、金粒子（直径１〜３μｍ）の表面を覆い、「遺伝子銃」によって、皮膚細胞または筋肉の中に突き進んで行く。
【００８８】
本発明に係る方法において、治療用組成物は、霊長類、げっ歯類、家畜類、および家庭用ペットなど、脊椎動物の仲間である哺乳動物のメンバーに投与することができる。防御するのに好適な患者はヒトである。
【００８９】
以下の実施例は、例示目的で提示されるものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００９０】
（実施例）
下記の実施例１〜６において、以下の材料と方法を用いた。
【００９１】
試薬および材料：凍結乾燥された組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｒｘをＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手した。大腸菌ＴＲは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）から入手した。β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型（ＮＡＤＰＨ）、還元型ＧＳＨ、グルタチオンレダクターゼ、ジチオスレイトール、ジソプロピルフルロホスフェート（ｄｉｓｏｐｒｏｐｙｌｆｌｕｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アプロチニン、Ｎ−エチルマレイミド、シッフ試薬、サケ精子ＤＮＡ、およびヘキスト染料はすべてＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。Ｎ−アセチルシステインは、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から入手した。他の化学薬品はすべて、最高の等級のものであった。
【００９２】
痰の採集：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｅｗｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）およびＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ （Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ） においてＣＦを患う成人および小児の患者から痰を採取した。２つの別々のピロカルピンイオン導入発汗試験において、汗クロール値が６０ ｍＭを超え、その後の遺伝子解析において、２つの対立遺伝子がＣＦ−産生変異を示した患者をＣＦと診断した。すべての試料は、自発的喀痰によるか、または、高張食塩水による誘発によって提供された。唾液が含まれていることが目視によって検出できたときには、その痰試料は廃棄した。喀痰後、試料は、使用時まで−８０℃で保存した。痰の採集プロトコール、データ収集、および同意／受諾書式は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＯＭＩＲＢ）および提携病院の承認を得た。
【００９３】
コンパクションアッセイ法：−８０℃で保存したＣＦ痰を室温で融解して、ポジティブ・ディスプレイスメント・ピペット（Ｒａｉｎｉｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を用いて、１．５ｍｌエッペンドルフチューブの中に２７５μｌの容量で当量液とした。痰試料には、適当なモル濃度の各試薬を含む２５μｌのＨ２Ｏを加えて、希釈剤（Ｈ２Ｏ）、Ｔｒｘ＋ＴＲ＋ＮＡＤＰＨ、ＧＳＨ＋グルタチオンレダクターゼ＋ＮＡＤＰＨ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはＮ−アセチルシステインのいずれかによる処理を行った。短時間（〜１秒間）撹拌した後、試料入りチューブを微量チューブ用ロティセリー（ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ， Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ）に載せ、３７℃で２０分間インキュベーションした。そして、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １６：５５３−５５８，１９９５）によって始められた方法に従ってコンパクションアッセイのために試料を処理した。このアッセイ法を行うために、各試料の内容物を、ぴったりと嵌るよう予め２００μｌのピペットチップに溶接してある、１００μｌのガラス製マイクロキャピラリーチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中に装填した。各痰試料の９０％を上回る量を引き出すために３本の改造キャピラリーチューブを使用した。そして、キャピラリーチューブをピペットチップから取り出し、粘土で密封して、ヘマトクリット遠心機（ＩＥＣ、Ｎｅｅｄｈａｍ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＡ）で１０分間遠心分離した後、各チューブのゲル（固体）相および水（液体）相の長さをミリメートル単位で測定した。水相の長さを全体の長さ（ゲル相＋水相）で割り、１００を掛けて、各キャピラリーチューブの液体画分の割合を計算した。次に、各試料から得られた液体画分の３つの測定結果（％）を平均して、処理条件ごとに単一の値を算出した。
【００９４】
磁気マイクロレオメーター：Ｋｉｎｇ（Ｋｉｎｇ Ｍ．，Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｒｈｅｏｍｅｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ Ｍｕｃｏｌｏｇｙより、Ｂｒａｇａ ＰＣおよびＡｌｌｅｇｒａ Ｌ．編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８８，ｐ．７３−８３）によって開発された磁気マイクロレオメーターを用いて、処理に応じた粘弾性の変化を測定した。８０〜１２０μｍの鋼鉄製の球を１０ ｍｇの痰試料の中に入れた。電磁石を用いて、この球を振動させ、その画像を、顕微鏡を介して一対のフォトセル（ｐｈｏｔｏｃｅｌｌ）に映し出した。粘液は、この球の動きを遅れさせるため、磁石の駆動力に対して球の動きをプロットすることによって、オシロスコープ上でこの効果を明らかにし、そこからＧ＊を測定した。Ｇ＊は、粘性および弾性の機械インピーダンス（ｉｍｐｅｄａｎｃｅ）またはベクトルの和であった。ＴｒｘおよびＮＡＤＰＨの用量反応実験のために、いずれの処理をする前にも１０ ｒａｄ／ｓにおけるｌｏｇ Ｇ＊を測定し（基準値）、次に、還元系を用いて、未処理、希釈剤（Ｈ２Ｏ）またはＴｒｘと２０分間インキュベーションした後に測定した。すべての処理は、試料の全容量の１０％に相当する容量のＨ２Ｏに入れた試料の中で行った。試料の等量液ごとに一回の測定を行った。
【００９５】
痰からの糖蛋白質抽出：痰からの可溶性糖蛋白質の抽出を、Ｄａｖｉｅｓら（ＤａｖｉｅｓとＣａｒｌｓｔｅｄｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２５：３−１３，２０００）によって概説されている方法によって行った。２７５μｌのＣＦ痰を２５μｌのＨ２Ｏのみ、または、Ｔｒｘ（１０または３０μＭ）＋ＮＡＤＰＨ（２ｍＭ）およびＴＲ（０．１μＭ）を含むＨ２Ｏによって、３７℃で２０分間処理した。処理後、１ｍＭのジソプロピルフルロホスフェートおよび１０μｇｍｌのアプロチニンを含む１００μｌのＨ２Ｏを各試料に加えてから、４℃、２２，０００ｇで１５分間遠心分離した。各試料の得られた上清（水相）を新しいチューブに移して、−２０℃で保存した。各試料の残った固体ゲル部分は、２５０μｌのグアニジウム抽出バッファー（６Ｍ 塩化グアニジウム；５ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５；１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド；１００μＭジソプロピルフルロホスフェート；および１μｇ／ｍｌアプロチニン）存在下で、ピペットチップを用いて、注意深くチューブの底から取り出し、４℃で１４時間回転させた。遠心分離してから、このゲル相抽出から得られた上清をきれいなチューブに移し入れて、電気泳動を行う時まで−２０℃で凍結した。
【００９６】
糖蛋白質含量の解析：水相およびゲル相の試料の糖蛋白質の含有量を、Ｔｈｏｒｎｔｏｎらによって概説された方法（Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２５：７７−８５，２０００）に従って、過ヨウ酸シッフ試薬（ＰＡＳ）による染色によって評価した。水相およびゲル相の試料を融解し、それぞれ８０μｌ等量液を、Ｂｉｏｍａｘ水平式電気泳動装置（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）の中に格納された１．０％アガロースゲル（１５０ｍｍ×１２５ｍｍ）上にロードした。電気泳動用試薬は以下の通りである。電気泳動用バッファー：４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０、０．１％ＳＤＳ；サンプル・ローディングバッファー：６０％電気泳動用バッファー、４０％グリセロール（ｖ／ｖ）および０．００５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー。移動用溶液として０．６Ｍ ＮａＣｌ，６０ｍＭクエン酸ナトリウムを用い、バキュームブロッター（Ｂｏｅｃｋｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｅａｓｔｅｒｖｉｌｌｅ，ＰＡ）によって、ゲル内容物をポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた。移動後、水を３回換えて膜を洗浄し、２００ｍｌの１％過ヨウ酸（ｖ／ｖ）３％酢酸（ｖ／ｖ）溶液に、室温で３０分間移した。そして、この膜を、１ｍＭ ＨＣｌ中０．１％ナトリウム・メタブサルファイト（ｍｅｔａｂｓａｌｆｉｔｅ）で２回洗浄し、シッフ試薬の中に６分間置いた。
【００９７】
全ＤＮＡ含量の測定：２７５μｌのＣＦ痰を、未処理、２５μｌのＨ２Ｏ、またはＴｒｘ（３０μＭ）＋ＴＲ（０．１μＭ）およびＮＡＤＰＨ（２ｍＭ）を含む２５μｌのＨ２Ｏとともにインキュベートした。３７℃で２０分間インキュベーションした後、１００μｌのＨ２Ｏを各試料に加えてから、１０分間遠心分離（２２，０００ｘ ｇ）した。得られたゲル相および液相を分離して、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、および１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫからなる等量の分解溶液と、５０℃で４時間インキュベートした。フェノール／クロロフォルム抽出によって、液相およびゲル相からＤＮＡを精製し、１００μｌのＴＥバッファー、ｐＨ８．０に再懸濁した。Ｆ−２０００分光蛍光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）を用いて、５７５ｎＭの励起波長と５５５ｎｍの発光波長で、ヘキストアッセイ法（ＬａｂａｒｃａとＰａｉｇｅｎ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １０２：３４４−３５２，１９８０）によってＤＮＡ濃度を測定した。ＴＥバッファーに溶解したサケ精子ＤＮＡを用いて、標準曲線を定めた。
【００９８】
統計学：図中のデータは、平均値±標準偏差で表されている。ただし、図４Ａと４Ｂは、標準誤差を示している。線形混合効果モデル法を用いて、痰試料の液状化、粘弾性、およびＤＮＡ可溶性に対する処理の効果を解析した。単一の対照に対して複数の処理を比較するときには、ダネット補正を適用した。線形モデルで計算したクラス内相関係数によって、コンパクションアッセイの再現性を評価した。ＳＡＳバージョン８．２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて、すべての解析を行った。有意性をｐ＜０．０５と定義した。
【００９９】
（実施例１）
以下の実施例では、ＣＦ痰からの液体放出に対するＴｒｘ還元系の効果を説明する。
【０１００】
ＣＦＴＲ遺伝子の欠陥によって起こる異常なイオン輸送によって、ＣＦ患者の気道分泌物はしばしば乾燥している。その結果、膿状のＣＦ痰は、大部分が、しばしばゲル相と呼ばれる、硬くて非流動性の生体高分子のマトリックス、および、より少ない量の可溶性の液相からなる。痰における、これら２つの相の割合に対するＴｒｘの効果を評価するために、コンパクションアッセイによる測定を行った。最初の実験では、等量の痰試料を、０、１、１０、または３０μＭのＴｒｘ；０．１μＭ ＴＲ；および２ｍＭ ＮＡＤＰＨ（最終濃度）を含む２５μｌのＨ２Ｏで処理した。２０分間インキュベートした後、コンパクションアッセイによって、各試料の液体画分を測定した。
【０１０１】
液相に存在するＣＦ痰の平均（±ＳＤ）割合は、Ｔｒｘ曝露する前は３．５±２．９％であった（図１Ａ；数値は、５回の独立実験から得られた平均値である。＊Ｈ２Ｏ被曝試料に対してＰ＜０．０５）。痰の１０％に相当する希釈剤（Ｈ２Ｏ）で処理した等量液は、液相に存在する痰の割合に僅かで非有意な増加（６．２±６．６％）を示した。これに対し、ＣＦ痰の液相は、Ｔｒｘ還元系（Ｔｒｘ＋０．１μＭ ＴＲ、および２ｍＭ ＮＡＤＰＨ）で処理した後に有意に増加した。Ｔｒｘ（１μＭ）で痰を処理すると、痰の液体画分は、３７．８±１５．４％まで増加した。液体画分が最高に増加したのは、より高いＴｒｘ濃度（３０μＭ）でインキュベートした試料であった（７４．５±１５．６％）。
【０１０２】
ＮＡＤＰＨの効果を調べるために、別のドナーからさらなる試料を得て、３０μＭのＴｒｘ、０．１μＭ ＴＲ、および０、０．２、０．６、１．０または２ｍＭのＮＡＤＰＨで２０分間処理した。ＮＡＤＰＨなしでＴｒｘとＴＲで処理した試料では、液相に存在する痰の割合は低かった（２．９±１．３％）。ＮＡＤＰＨで処理した等量液は、用量依存的な液相の増加を示し、２ｍＭで最大の増加（７０．５５±１８．１３％）が起きた（図１Ｂ）。Ｔｒｘ不在下でＮＡＤＰＨによって痰を処理すると、液相に存在する痰の割合の増加は起きなかった（図なし）。
【０１０３】
（実施例２）
以下の実施例では、実施例１のコンパクションアッセイによる測定結果の再現性を明らかにする。
【０１０４】
コンパクションアッセイによる測定結果の再現性を評価するために、３人の別々のＣＦドナーから痰試料を分離して等量液にして凍結した。すなわち、３人の異なったドナー（Ａ、Ｂ、Ｃ）から単離されたばかりのＣＦ痰を２７５μｌの等量液に分けて凍結した。融解した後、等量液を未処理のままか、または、Ｈ２Ｏ、１０μＭ Ｔｒｘ（＋０．１μＭ ＴＲおよび２ｍＭ ＮＡＤＰＨ）、もしくはジチオスレイトール（ＤＴＴ、１または５ｍＭ）で２０分間インキュベートし、コンパクションアッセイ法で液体の割合を測定した。各ドナー試料について３回の独立実験を行って得られた結果を用いて、アッセイ法の再現性を評価した。３日間連続して、等量液を融解し、水、Ｔｒｘおよびその還元系、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理するか、未処理のままにした。
【０１０５】
図２に示すように、添加なし、または希釈液（Ｈ２Ｏ）で処理された、ドナーＡからの等量液は、その全量の１０％よりも少ない液相画分を有していた。ドナーＡからの痰の等量液をＤＴＴ（１ｍＭまたは５ｍＭ）、または還元系とともにＴｒｘ（３０μＭ）で処理すると、これら試料の液体画分が全試料容量の９０％よりも多くなった。ドナーＡからの痰試料の液体画分のこれらの比率の値は、その後の独立実験における第二および第三の測定値についても、同一の処理によっては、感知できる程度に変動することはなかった。ＴｒｘまたはＤＴＴ被曝に応じて、ドナーＢおよびＣの試料で起きた変化の程度は、ドナーＡの痰試料で起きた変化よりは範囲が狭かったが、対照と比べれば有意に違っていた。ドナーＣ由来の試料について、薬剤処理した後の液体状態で存在する痰の割合の３日間での変動範囲は以下の通りである。１ｍＭ ＤＴＴ―２４〜３１％；５ｍＭ ＤＴＴ―４２〜５７％、３０μＭ Ｔｒｘ―４６〜５１％。ドナーＢ由来の試料について、液体の割合値の範囲は以下の通りである。１ｍＭ ＤＴＴ―５７〜６１％；５ｍＭ ＤＴＴ―７７〜７９％、３０μＭ Ｔｒｘ―６２〜８１％。これらの結果は、コンパクションアッセイ法が、痰試料の不均質なグループにおいて、薬剤誘導による液状化を測定するための方法として用いることができると認められるほどの試料内再現性を示すことを明らかにしている。
【０１０６】
（実施例３）
以下の実施例では、Ｔｒｘが、グルタチオンまたはＮ−アセチルシステインよりも強力な痰液状化剤であることを明らかにする。
【０１０７】
痰の液状化におけるＴｒｘの効果を、他のモノチオールおよびジチオール還元剤と比較した。痰試料を等量液にして、ＴｒｘまたはＧＳＨで２０分間処理して、コンパクションアッセイ法によって液体の割合を測定した。最初のコンパクションアッセイ実験では、等モル濃度のＮＡＤＰＨ存在下で、痰の液状化におけるＴｒｘとＧＳＨの還元系の効力を比較した。対照（添加なし）と比較して、１０、３０、または６０μＭのＴｒｘで処理した痰では、液体画分の割合が連続的かつ有意に増加するのが観察された（図３Ａ）。これに対して、ＧＳＨを同じまたはそれよりも高い１ｍＭまでの濃度に曝露しても、痰の液体画分の有意な増加は見られなかった。別の研究では、Ｎ−アセチルシステインを一定の濃度範囲（図３Ｂ）で使用しても、痰の液状化をもたらす効果はＴｒｘより低いことが観察された。図３Ａおよび３Ｂについて、実際に示された割合は以下の通りである。未処理＝２．７±２．３％；Ｈ２Ｏ＝４．５±２．７％；１０μＭ Ｔｒｘ＝３４．８±６．６％；３０μＭ Ｔｒｘ＝５４．６±１０．４％；６０μＭ Ｔｒｘ＝６７．０±８．０％；３０μＭ ＧＳＨ＝７．８±５．７％；１００μＭ ＧＳＨ＝１５．９±９．３％；１ｍＭ ＧＳＨ＝２７．６±３．９％。ＴｒｘとＮＡＣの有効性の解析も、別の痰試料セットで、２０分間インキュベーションした後に測定された。数値は、５回（ＧＳＨ）または４回（ＮＡＣ）の実験の平均値である（＊未処理に対しＰ＜０．０５）。
【０１０８】
（実施例４）
以下の実施例では、痰の粘弾性に対するＴｒｘ還元系の効果を示す。
【０１０９】
磁気マイクロレオメトリーを行って、痰の粘性に対するＴｒｘとその還元系の効果を測定した。Ｔｒｘ還元系とインキュベートした前後に痰試料の測定を行って（表１）、ｌｏｇ Ｇ＊（粘性）の変化を判定した。
【０１１０】
（表１）
未処理、Ｈ２Ｏ、またはチオレドキシンに曝露したＣＦ痰の粘弾性データ（ｌｏｇ Ｇ＊）
【０１１１】
【表１】
ＣＦ痰の等量液を、未処理、Ｈ２Ｏ、またはＴｒｘ＋還元系（０．１μＭ ＴＲおよび２μＭ ＮＡＤＰＨ）とともに、３７℃で２０分間インキュベートした。データはすべて、４つの試料に対するｌｏｇ Ｇ＊（平均値±標準誤差）で示されている。
【０１１２】
図４Ａに示した実験では、ＣＦ痰試料をＨ２Ｏ、または３、１０、または３０μＭのＴｒｘ＋０．１μＭ ＴＲおよび２μＭ ＮＡＤＰＨとともに２０分間インキュベートし、磁気マイクロレオメトリーによってｌｏｇ Ｇ＊を測定した。データは、曝露する前後に記録したｌｏｇ Ｇ＊測定値の違いとして示されている（Ｙ軸に示される）。各列は、４つの試料についての平均値±標準誤差を示す（黒菱形Ｈ２Ｏ希釈値から統計的に有意）。痰を希釈剤（Ｈ２Ｏ）で２０分間インキュベートすると、前処理のときの値と比べて、ｌｏｇ Ｇ＊が僅かに下降した（０．１１ｌｏｇユニット）。Ｔｒｘ（３μＭ）、ＴＲ（０．１μＭ）およびＮＡＤＰＨ（２ｍＭ）に曝露すると、希釈剤だけで処理した場合に比べて、ｌｏｇ Ｇ＊の有意な減少（０．２６ｌｏｇユニット）が起きた（図４Ａ）。より高い濃度のＴｒｘに曝露された試料において、より実質的な低下（それぞれ、１０μＭのＴｒｘで０．３９ｌｏｇユニットの減少、また、３０μＭのＴｒｘで０．６５ｌｏｇユニットの減少）が明白になった。
【０１１３】
さまざまな濃度のＮＡＤＰＨの効果も調べた（図４Ｂ；Ｈ２Ｏ、または１０μＭ Ｔｒｘ、０．１μＭ ＴＲおよび０．２、０．６、または２ｍＭ ＮＡＤＰＨとのインキュベーション後におけるｌｏｇ Ｇ＊の変化）。Ｔｒｘ（３０μＭ）、ＴＲ（０．１μＭ）、および低濃度のＮＡＤＰＨ（０．２ｍＭ）に曝露された痰は、粘弾性の僅かな低下を示した（０．１６ｌｏｇユニット）。より高いＮＡＤＰＨ濃度、０．６ｍＭ（０．２６ｌｏｇユニット）および２ｍＭ（０．３９ｌｏｇユニット）に曝露すると、粘弾性のさらなる低下が起き、これは、痰の粘弾性をＴｒｘによって低下させる上で、還元当量を提供することの重要性を示している。
【０１１４】
（実施例５）
以下の実施例では、痰の糖蛋白質の可溶性に対するＴｒｘの効果を説明する。
【０１１５】
ムチン糖蛋白質重合体上のジスルフィド結合は、Ｔｒｘによる還元の標的である可能性がある。痰に存在する糖蛋白質に対するＴｒｘの効果を調べるために、痰の等量液をＨ２Ｏ、または１０、または３０μＭのＴｒｘとその還元系で２０分間インキュベートし、遠心分離によって水性画分（Ａｑ）とゲル画分に分離した。各不溶性ゲル画分は、さらに、グアニジウム（Ｇ）で１４時間処理した。処理後、各試料の得られた可溶相と不溶相を分離して、過ヨウ酸／シッフ試薬（ＰＡＳ）染色によって糖蛋白質含量について解析した。具体的には、材料と方法のところで説明したように、画分をロードして、１％アガロース（ｗ／ｖ）中で電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜に移動させ、過ヨウ酸／シッフ試薬で染色した。図５に関しては、分子量基準が離れた右側のレーンに示されている。結果は、３回の独立した実験の代表的なものである。
【０１１６】
図５に示すように、希釈剤で処理された痰の可溶画分およびゲル画分ともに、高分子量糖蛋白質の不連続な集団が検出された。これに対して、１０または３０μＭのＴｒｘで処理された痰から得られた両相において、ＰＡＳ反応性糖蛋白質の量が増加することが明らかとなった。これらの試料を処理する過程で、希釈剤で処理された痰からのゲル相マトリックスは、一晩グアニジウム処理したにもかかわらず、高度の不溶性を保持することが観察された。この不溶性が、希釈剤で処理した痰およびＴｒｘで処理した痰からのゲル相のレーンにおいて見られた糖蛋白質量の量的な違いの理由である可能性が高い。量が増えることに加えて、Ｔｒｘに曝露された試料におけるグリコフォームのかなりの割合も、希釈剤で処理された試料に存在するそれらの部分よりも大きな電気泳動移動度を示した。これらの知見は、Ｔｒｘが可溶性を高め、痰の中の糖蛋白質重合体の大きさを減少させることを示唆している。
【０１１７】
（実施例６）
以下の実施例では、痰におけるＤＮＡの可溶性に対するＴｒｘの効果を説明する。
【０１１８】
ＣＦ気道分泌物中に大量の細胞外ＤＮＡが存在すると、ＣＦ痰の過剰な粘弾性の原因となる。Ｔｒｘが、痰におけるＤＮＡの可溶性に対してどのような効果をもつのかを評価するために、痰試料（２７５μｌ）を、無添加、希釈剤（Ｈ２Ｏ）、またはＴｒｘ（３０μＭ）＋還元系のいずれかとともに、２０分間インキュベートしてから、ゲル（不溶）相と液（可溶）相に分けた。ヘキストアッセイ法によるＤＮＡ含量の測定によって、未処理の試料中に存在するＤＮＡのほとんどがゲル相中に保持されることが明らかになった（ゲル相＝０．９４±０．２６ｍｇ；液相＝０．０５±０．０３ｍｇ）（図６）。希釈剤処理された試料では、それらの液相における平均ＤＮＡ含量が僅かな増加を示した（ゲル相＝０．８０±０．２４ｍｇ；液相＝０．２１±０．２３ｍｇ）。Ｔｒｘ処理では、ＤＮＡのゲル相から液相へのさらなる移動（ゲル相＝０．５５±０．３１ｍｇ；液相＝０．５７±０．３７ｍｇ）が観察された。図６に関しては、示されているのは、各画分からの平均ＤＮＡ含量±Ｓ．Ｄ．である（ｎ＝５回実験）（＊未処理の可溶相に対してＰ＜０．０５）。
【０１１９】
（実施例７）
以下の実施例では、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰をもつ患者を、本発明に係る治療用組成物で治療することにについて説明する。
【０１２０】
４か月齢の女児患者が、低体重；頻繁、大量、かつ悪臭がする油っぽい大便；突き出したお腹；ならびに頻発する咳および喘鳴を示している。この患者は、定量的なピロカルピンイオン導入発汗試験を受けて、嚢胞性線維症と診断される。肺機能テストおよび胸部Ｘ線で診断結果を確認する。この患者は、定期的に評価、および、肺に問題が起こるとそれを予防および治療するなどの治療、十分な栄養補給、および身体活動を施される。１３歳までに、この患者は、成長の停滞、思春期の遅れ、および身体持久力の低下を示し、しばしば、肺感染症、呼吸の苦しさ、および胃腸管の不快感に苦しむ。この患者は、ひどい咳、喘鳴、および肺機能の障害とともに診療室に現れる。
【０１２１】
この患者の気道から採集した痰試料に対してコンパクションアッセイを行い、このアッセイと以前の嚢胞性線維症であるとの診断に基づいて、患者が、気道の中の過剰に粘性および粘着性の粘液による呼吸器疾患を患っていると判定する。肺のこの症状を治療するため、患者に、界面活性剤中、投薬単位あたり約２．５ｍｇのヒトチオレドキシン、および表面濃度約５μＭを達成するのに十分な投与量のＮＡＰＤＨを含む組成物をエアロゾル送達によって投与する。この患者は、引き続き、別のコンパクションアッセイによって、痰の液状化が増進したか、また、肺機能テストによって気道がきれいになったか観察される。上記したような組成物のその後の投与量を、患者の気道がかなりのクリアランスを示し、患者の症状および一般的な健康状態が改善するまでエアロゾルによって毎日投与される。
【０１２２】
本明細書において考察または引用した刊行物およびその他の参考文献は、その全文が、参考文献として本明細書に組み入れられる。
【０１２３】
本出願は、２００２年９月１０日に出願された米国仮出願第６０／４０９，９６０号、および２００３年４月１１日に出願された米国仮出願第６０／４６２，０８２号それぞれからの優先権を主張するものである。米国仮出願第６０／４０９，９６０号および第６０／４６２，０８２号の各々の全開示内容は、参考文献として本明細書に組み入れられる。
【０１２４】
本発明のさまざまな態様が、詳細に説明されているが、これらの態様の変更および適応が生じることは、当業者にとって明らかである。しかし、以下の請求項に示されているように、そのような変更および適応が、本発明の範囲に含まれることをはっきりと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１Ａは、Ｔｒｘ還元系への曝露によるＣＦ痰の液状化は用量依存的であることを示す折れ線グラフである。図１Ｂは、ＴｒｘによるＣＦ痰の液状化はＮＡＤＰＨに依存することを示す折れ線グラフである。
【図２】図２は、コンパクションアッセイ法（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）の再現性の評価を示す折れ線グラフである。
【図３】図３Ａは、Ｔｒｘ還元系（Ｔｒｘ＋０．１μＭ ＴＲ＋２ｍＭ ＮＡＤＰＨ）が、痰の液状化において、グルタチオン還元系（ＧＳＨ＋０．１μＭ Ｇｒ＋２ｍＭ ＮＡＤＰＨ）よりも強力であることを示す図である。図３Ｂは、Ｔｒｘ還元系（Ｔｒｘ＋０．１μＭ ＴＲ＋２ｍＭ ＮＡＤＰＨ）が、痰の液状化において、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）よりも強力であることを示す図である。
【図４】図４Ａは、インビトロにおけるＣＦ痰の粘弾性（ｌｏｇ Ｇ＊）に対するＴｒｘの用量の効果を示している。図４Ｂは、インビトロにおけるＣＦ痰の粘弾性（ｌｏｇ Ｇ＊）に対するＮＡＤＰＨの用量の効果を示している。
【図５】図５は、希釈液またはＴｒｘに曝露した後のＣＦ痰の糖蛋白質の質量プロファイルを示すデジタル画像である。
【図６】図６は、Ｔｒｘ曝露がＣＦ痰内に存在するＤＮＡの可溶性を高めることを示す図である。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、一般的に、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含むタンパク質またはペプチドを、粘液または痰の液化を誘導、促進および／または増加させるために使用することに関係する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、塩素イオンチャネルタンパク質であるＣＦ膜コンダクタンス制御因子をコードする遺伝子の変異によって起きる、珍しくない致死性の遺伝性疾患である。この欠陥の結果、体内の上皮が、塩素イオン輸送に対して不透過になる（Ｂｏｕｃｈｅｒ ら，Ｌｕｎｇ １６１：１−１７，１９８３；Ｗｅｌｓｈ，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．６７：１１４４３−１１８４，１９８７）。すい臓、腸および男性生殖管など、いくつかの器官が冒されるが、肺内における合併症が、罹病率および死亡率の９５％を占める（Ｄｏｄｇｅ ＪＡ，Ｂｒｏｃｋ ＤＪＨ，ａｎｄ Ｗｉｄｄｉｃｏｍｂｅ ＪＨ．Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ編 Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ Ｖｏｌｕｍｅ １より、 Ｍｅａｎｓ，Ｍ．Ｃｙｓｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ５０ ｙｅａｒｓ、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９２，ｐ．２１７−２５０）。本病によって損なわれた肺では、気道管腔内への塩素輸送によって、Ｎａ＋および液体の過剰吸収が起きて、気道表面にある液体の量が減少する（Ｊｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：４２４−４２７，１９９３）。気道表面にある液体が枯渇すると、粘液のゲル形成成分であるムチン高分子の濃縮が起こる（Ｍａｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ ９５：１００５−１０１５，１９９８）。正常な粘液の粘弾性は、ムチン重合体の濃度、分子量およびもつれ具合によって決まる（Ｖｅｒｄｕｇｏら、Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ ２０：２２３−２３０，１９８３）。死につつある炎症細胞から放出されるＤＮＡ（Ｐｏｔｔｅｒら、Ａｍ Ｊ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ １００：４９３−４９５，１９６０；Ｌｅｔｈｅｍら、Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ １００：４９３−４９５，１９９０；Ｌｅｔｈｅｍら、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ３：１９−２３，１９９０）およびｆ−アクチン重合体（Ｓｈｅｉｌｓら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈ １４８：９１９−９２７，１９９６；Ｂａｕｍ ＧＬ，Ｐｒｉｅｌ Ｚ，Ｒｏｔｈ Ｙ，Ｌｉｒｏｎ ＮおよびＯｓｔｆｅｌｄ ＥＪ編、Ｃｉｌｉａ，ｍｕｃｕｓ ａｎｄ ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓより、Ｔｏｍｋｉｅｗｉｃｚら、ＤＮＡ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｐｕｔｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，１９９８）とムチンとのさらなる相互作用が、ＣＦ痰に密集性と粘性をもたらす。このような粘液を咳や粘膜毛様体クリアランスによって排出することができないため、日和見性の病原体が肺に定住しやすくなる。
【０００３】
ＣＦ肺疾患の病因は、痰の流動性が変化することにあるといえるが、肺機能に障害があることは、誕生時にはほとんど明らかではない。それどころか、気管支拡張と気道閉塞は患者の年齢とともに進行する。この慢性的な肺損傷は、細菌感染と炎症反応との終わりのない循環によって起こる。気道損傷は、肺に補充された好中球が、エラスターゼなどのマトリックス分解酵素、および有害な活性酸素種を放出したときに起こる（ＫｏｎｓｔａｎとＢｅｒｇｅｒ，Ｐｅｄｉａｔｒ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ ２４：１３７−１４２，１９９７において概説されている）。
【０００４】
期待が持てそうな進歩がいくらかあるにもかかわらず、遺伝子治療によるＣＦの矯正は、未だ達成可能ではない。現在でも、膿状の気道分泌物の排出を促す薬物と併用される抗生物質療法が、相変わらず、進行性の気道疾患の主要な治療法となっている。ＣＦ患者の気道に存在する細胞外ＤＮＡを分解する精製ｒｈＤＮａｓｅ（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，米国）吸入が、呼吸器の鬱血除去剤として広く使用されている。このような治療は、痰の粘性を低下させ、強制呼気量（ＦＥＶ）を安定化させるために臨床上有効である（Ｆｕｃｈｓら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３１：６３７−６４２，１９９４）。他の研究的な治療法で、Ｎ−アセチルシステイン、ナシステリン（ｎａｃｙｓｔｅｌｙｎ：Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの誘導体）、およびゲルソリンのような、ムチンまたはアクチンのポリマーを分解するための方法も、実験的には痰の粘性を低下させることができたが、まだ、具体的には、ＣＦを治療するための臨床上の認可を米国内で得るには至っていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、当技術分野においては嚢胞性線維症、および、異常または過度に粘性または粘着性の粘液または痰を伴う他の疾患を治療するために改善された治療法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の一つの態様は、過度に粘性または粘着性の粘液または痰の出る患者の体内において粘液または痰の液状化を増進させる方法に関係する。本方法は、患者の粘液または痰を、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを含む組成物であって、接触前と比較して粘液または痰の液状化を増進させるのに有効な組成物に接触させるステップを含む。本態様の一局面において、患者は、嚢胞性線維症など、粘液または痰が異常または過度に粘性または粘着性になることが病気の症状または原因となる肺病を患っている。
【０００７】
一つの局面において、患者の粘液または痰を組成物と接触させるステップは、経鼻、気管内、気管支、肺内への直接設置、および吸入からなる群より選択された経路によって、組成物を患者に導入して実施される。一つの局面において、接触させる粘液または痰は、患者の呼吸管、胃腸管、または生殖管に存在する。別の局面において、組成物は、薬学的に許容される担体に入れて患者に投与される。好ましくは、患者からの粘液または痰の試料の全量の液相が、組成物を投与すると統計的に有意な増加を示す。
【０００８】
本態様の一局面において、蛋白質またはペプチドは、患者の体重１ｋｇ当り約１．５ミリモル（ｍｍｏｌｅｓ）から約１５０ミリモルの量で患者に投与される。別の局面において、該蛋白質は、患者の体内で約５分から約２４時間という半減期を有する。一つの局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃというアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にあり、Ｘ残基はいずれのアミノ酸残基でもよい。別の局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘというアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にあり、Ｘ残基はいずれのアミノ酸残基でもよい。別の局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）というアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にあり、Ｘ残基はいずれのアミノ酸残基でもよい。さらに別の局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｗ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｋ（配列番号：３）というアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にある。さらに別の局面において、蛋白質は原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物のチオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンからなる群より選択されるチオレドキシンを含む。好適な局面において、蛋白質はヒトチオレドキシンを含む。
【０００９】
本発明の一局面において、組成物は、さらに、蛋白質のチオレドキシン活性部位を還元するためにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（ＮＡＤＰＨ）を含む。さらなる局面において、組成物はチオレドキシンレダクターゼを含む。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、粘液または痰の液状化に使用するための組成物であって、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含み、さらに、過剰に粘性または粘着性のある粘液または痰を治療するための薬剤を少なくとも一つ含む組成物に関する。一つの局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘというアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にあり、Ｘ残基はいずれのアミノ酸残基でもよい。別の局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）というアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にあり、Ｘ残基はいずれのアミノ酸残基でもよい。さらに別の局面において、チオレドキシン活性部位は、Ｗ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｋ（配列番号：３）というアミノ酸配列を含むが、ここで、Ｃ残基は還元状態にある。さらに別の局面において、蛋白質は原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物のチオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンからなる群より選択されるチオレドキシンを含む。好適な局面において、蛋白質はヒトチオレドキシンを含む。
【００１１】
さらなる局面において、組成物はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（ＮＡＤＰＨ）を含むことができる。さらなる局面において、組成物は、さらにチオレドキシンレダクターゼを含む。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰が出る患者の体内で粘液または痰の液状化を増進させる方法に関係する。この方法は、患者の気道内にある粘液または痰を、Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘというアミノ酸配列であって、Ｃ残基が還元状態にある配列を含む蛋白質を含む組成物と接触させるステップであって、組成物を接触させることによって、患者からの粘液または痰の試料中の液相が、該組成物と接触させる前に比較して増加するステップを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般的には、粘液または痰の液状化を誘導、促進および／または増加させるために、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドの使用に関連する。より具体的には、本発明者らは、チオレドキシンが、痰または粘液の粘性および／または粘着性を低下させることができるため、痰または粘液を液状化させるための有効な因子であることを発見した。その結果、天然のチオレドキシン、還元状態にあるチオレドキシンの活性部位を含む蛋白質もしくはペプチド、またはそれらの蛋白質をコードする核酸分子を、単独または組成物にして、望ましくない粘液や粘着力があり粘性の痰を伴う症状または疾患を治療するために使用できるようになった。例えば、嚢胞性線維症などの呼吸器疾患が、特に、本発明に係る産物および方法を用いる治療法を行いやすい。従って、本発明は、還元状態にあるチオレドキシンの活性部位を含む蛋白質を、粘液または痰、特に、異常または過度に粘性および／または粘着性の粘液または痰の液状化を増進するために使用することに関する。この蛋白質は、このような異常または過度の粘液または痰に苦しんでいる、もしくは影響を受けている患者に、粘液または痰の液状化を増進させるような、好ましくは、患者に治療上の効果をもたらすような方法および用量で投与される。
【００１４】
チオレドキシン、およびチオレドキシン活性部位を含む蛋白質には、他の還元剤に比べ、嚢胞性線維症などの症状の治療に用いる上での利点がある。例えば、他の還元剤（例えばＮ−アセチルシステイン、ナシステリン（ＮＡＬ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ））とは異なり、チオレドキシンは、その有効（還元）型に繰り返し再還元することができる。また、チオレドキシンの自動酸化（例えばスーパーオキシド、過酸化水素ヒドロキシルラジカル、およびその他の有害酸素代謝物を産生する）は、ＮＡＣ、ＮＡＬおよびＤＴＴなど他の還元剤に比べ低量で起きる。さらに、チオレドキシンは、細胞外空間に普通に存在する天然の化合物であるから、気道内にチオレドキシンを導入しても、免疫応答を誘導したり、炎症を起こさせたりすることはない。また、チオレドキシンはグリコシル化されていないので、天然型または組換型の蛋白質を投与しても、自然免疫応答を誘導することはない。おそらくさらに一層顕著なのは、チオレドキシンは、他の還元剤とは対照的に、処理した粘液または痰を液体の状態に維持する点である。例えば、ＮＡＣおよびＤＴＴは、時間がたつうちに「消耗され」、すなわち酸化されて、その段階で、液状化された痰または粘液は元に戻り、さらに粘性の強い「ゲル」状になる。これに対し、チオレドキシンによって作り出された液状化は、たぶん、その還元系によって繰り返し再還元されるため、何時間も持続する。最後に、チオレドキシンは、他の還元剤よりも強力であるため、他の薬剤よりもかなり低用量で使用しても有益な効果を得ることができる。
【００１５】
上記の利点に加え、チオレドキシンには、病気の症状において、その有益性をさらに高める他の利点がある。例えば、チオレドキシンは、病気の痰（例えば嚢胞性線維症の痰）の中にある一定の細菌毒素（例えば、グラム陰性菌の細菌細胞壁から出るエンドトキシン、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏａｓ ａｅｒｕｇｕｎｏｓａ）のピオシアニン、その他）の毒性を低下させると推定されているＭｎＳＯＤ（例えば、その全体が本明細書において参考文献に組み入れられる、Ｗｈｉｔｅらに付与された米国特許第５，９８５，２６１号を参照）を誘導する。さらに、チオレドキシンは呼吸器の症状の全体的な治療を促進することができる抗炎性を有する。
【００１６】
チオレドキシン（Ｔｒｘ）は、数多くのチオール依存的な細胞の還元プロセスを触媒する、蛋白質のジスルフィドレダクターゼである。チオレドキシン（Ｔｒｘ）は、種横断的に高度に保存されている２個の酸化還元活性型システインを含む。それらは、酸化型になると、蛋白質の三次元構造から突き出したジスルフィド架橋を形成する（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：２３７−２７１，１９８５）。ＮＡＤＰＨ依存型チオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）によってこの活性中心が還元されると、Ｔｒｘが、ジチオール／ジスルフィド交換能力をもつ電子運搬体として作用することが可能になる（Ｏｂｌｏｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：７２７１−７２７７，１９９３）。蛋白質のジスルフィドは、Ｔｒｘ介在型還元作用にとって好適な基質である。嚢胞性線維症では気道分泌物が難分解性で粘性であるため、気道閉塞、日和見感染症、および肺機能の低下が生じる。呼吸器のムチンが、重合に必須の機能を果たすと考えられているシステインドメインをいくつか含んでいることを認めた（Ｂｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５７：２０３−２０９，２００１；Ａｓｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３３３：３８１−３８７，１９９８）上で、本発明者は、ムチンのジスルフィドを還元することによって、Ｔｒｘが効果的な粘液溶解剤として役立つか否かを判定しようとした。
【００１７】
本明細書で検討する実験において、本発明者らは、インビトロにおけるＣＦ痰の物理的性質および流動学的性質に対するＴｒｘ還元系（チオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、およびＮＡＤＰＨ）の効果を調べた。ＣＦ患者から得られた痰をＴＲＸ、およびその還元系［０．１μＭチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）＋２ｍＭ ＮＡＤＰＨ］で処理し、液相対ゲル相の割合（液相の割合）をコンパクションアッセイ法によって測定した。低濃度（１μＭ）のＴｒｘに曝露したところ、痰の液相の割合が有意に上昇した。液相の割合が最も上昇したのは、３０μＭのときであった。さらなる測定によって、Ｔｒｘ還元系による痰の液状化は、ＮＡＤＰＨ濃度に依存することが明らかになった。また、Ｔｒｘ還元系の相対的な有効性についても、他のジスルフィド還元剤と比較した。Ｔｒｘとは対照的に、グルタチオンおよびＮ−アセチルシステインは、１ｍＭよりも低い濃度で使用すると、痰を液状化する上で効果がなかった。マイクロレオメーターで測定したところ、３，１０または３０μＭのＴｒｘで２０分間処理した後に痰の粘弾性が有意に低下した。同様に、この粘弾性の低下もＮＡＤＰＨ濃度に依存していた。さらなる実験によって、Ｔｒｘ処理によって高分子量糖蛋白質の可溶性が増加し、痰の液相内への細胞外ＤＮＡの再分布がもたらされることが示された。本明細書に記載した実験は、触媒量Ｔｒｘとその還元系によるインビトロでの処理によって、膿状のＣＦ痰を液状化し、粘弾性を低下させ得ることを示している。Ｔｒｘ処理した痰の中に存在する高分子量の糖蛋白質の可溶性が高まることは、ムチン高分子が、ムコ多糖分解プロセスにおいてＴｒｘによって還元される基質である可能性を示している。
【００１８】
粘液による気道閉塞は、ＣＦ患者における重大な病状や死亡の原因となりうる。本発明者は、気道内においてこれらの分泌物が持続するのを助長する粘弾性が、Ｔｒｘによって顕著に低下することを実証した。この結果は、２つの実験的証拠によって裏付けられている。第一は、コンパクションアッセイの結果、Ｔｒｘとインキュベートすると、ＣＦ痰のゲル基質から大量の液体が放出されることが示されたことである。この放出と同時に固体の体積の減少が起こったことは、痰のゲル構成成分が可溶化したことを示すものである。ＣＦ痰のこのような液状化は、ＣＦ痰試料をインキュベートしている間に、しばしば、おおまかながら観察することができた。したがって、これは、による破壊といったアーティファクトではない。Ｔｒｘによる液体の遊離は、気道表面における水容量が回復すると、ＣＦ上皮の粘膜繊毛の輸送能力が回復される可能性があるため、重要な治療上の意味を持つと思われる（Ｊｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：４２４−４２７，１９９３）。第二は、磁気マイクロレオメーター測定値は、痰の粘弾性が、Ｔｒｘにより痰成分が還元される結果次第に低下するという直接の証拠を示している。
【００１９】
ＣＦ痰は、液体と固体の両方の特徴を示す非ニュートン性の流体である。重合体は、低濃度で液体中に存在するときには自由に回転することができる。重合体が、その回転を妨げられる程度まで濃縮または架橋されると、液体は、浸透閾値（ｐｅｒｃｏｌａｔｉｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる遷移相に到達する（Ｆｏｒｇａｃｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １０８：２１３１−２１４３，１９９５）。浸透閾値で、液体は固体の性質を獲得するようになり、架橋重合体間の相互作用（ｃｒｏｓｓ−ｐｏｌｙｍｅｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）が加わるにつれて、試料中の各繊維が基質の中に取り込まれるまで弾性率は増加しつづける。生化学的分析によって、呼吸管の内壁細胞によって分泌されるムチンであるＭＵＣ５ＡＣおよびＭＵＣ５Ｂが、気道粘液の主要なゲル形成重合体成分であることが明らかにされた（Ｈｏｖｅｎｂｅｒｇら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ １３：８３９−８４７，１９９６；Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３１６：９６７−９７５，１９９６；Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：９５６１−９５６６，１９９７）。これらムチンに存在するシステインドメインが、ジスルフィド結合形成によって、重合体形成、および、おそらく、隣接するムチン鎖との相互作用に寄与する（Ｂｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５７：２０３−２０９，２００１；Ａｓｋｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３３３：３８１−３８７，１９９８）。蛋白質上のジスルフィド結合は、Ｔｒｘの酵素活性にとって好適な基質であるため、本発明者は、Ｔｒｘによる痰の液状化の過程において、ムチン重合体が還元の標的であるとの仮説を立てた。この仮説は、Ｔｒｘで処理した痰における高分子量のグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）の可溶性の変化を明らかにしたＰＡＳ染色によって裏付けられた。Ｔｒｘに曝露した痰の液相中の糖蛋白質の濃度が高くなっていることが検出されると、さらに、黄色がより濃くなって示され、希釈剤で処理した試料から得た液相に比べて一層不透明になった。Ｔｒｘに曝露した痰におけるＰＡＳで検出可能な糖蛋白質の電気泳動での移動度が促進されることも、これらの高分子が、酵素による還元過程でサイズが減少しうることを示唆している。この電気泳動による解析からの知見は、液相内への糖蛋白質の遊離と、Ｔｒｘに曝露している間のゲル基質量の減少とが同時に起こることを明らかにしたことによって、コンパクションアッセイの測定結果と一致している。
【００２０】
病気のＣＦ肺の気道内において好中球の溶解が起こる結果、気道分泌物の中に細胞外ＤＮＡが沈積する（Ｌｅｔｈｅｍら、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ３：１９−２３，１９９０）。非共有結合的相互作用によって、このＤＮＡは、ムチン糖蛋白質の中でもつれ合うようになり、ムチンのゲル粘弾性を高める（Ｓａｃｈｄｅｖら、Ｃｈｅｓｔ８１：４１Ｓ−４３Ｓ，１９８２）。本明細書に記載する実験において、本発明者は、痰の中にあるＤＮＡが、Ｔｒｘ処理の後次第に可溶性になることを発見した。論理的な説明は、Ｔｒｘ活性によって、ＤＮＡと処理の影響を受けた高分子とがもつれ合う関係を解消させるのに十分な構造変化がゲル基質の中で起きるというものである。ＣＦ痰をＴｒｘに曝露したときに観察される粘弾性の変化に対し、このＤＮＡ可溶性上昇が、どのような相対的寄与をしているのかは明確ではない。それにもかかわらず、臨床的な見地からは、痰の不溶性のゲル相からＤＮＡを除去することは、ＣＦにおけるこのような治療の間、ＤＮａｓｅ活性に対してＤＮＡをより感受性にすることができるようにする。従って、本発明に係る方法は、ＣＦに対する他の既存の「最新技術」による療法と相乗効果を発揮する可能性が高い。
【００２１】
他のチオール還元剤の痰液状化能力と比較した研究において、Ｔｒｘは、グルタチオン（ＧＳＨ；還元型グルタチオン）還元系よりも高い有効性を示した。ＧＳＨが、たった１個のシステイン残基（モノチオール）しか持たないのに対し、Ｔｒｘは２個の酸化還元活性型システイン残基（ジチオール）を有するため、ＣＦ痰のゲル形成成分の中のジスルフィド結合を還元するのにより有効である可能性がある。非再生型粘液溶解薬（ｎｏｎ−ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｍｕｃｏｌｙｔｉｃ ｄｒｕｇｓ）については、等モル濃度で比べるとＤＴＴの方がＮＡＣ（またはＭｕｃｏｍｙｓｔ（著作権））溶液よりも有効であった（図２および３；データは示されていない）。これらの化合物の効力も、また、酸化還元活性型システイン残基の数によって決まり、ＤＴＴには２個あるが、ＮＡＣには１個しかない。これらのコンパクションアッセイ測定値に基づいて、二重に酸化還元活性型システインをもつ蛋白質、ペプチド、または別の化合物を用いた酵素によるジスルフィド結合の還元が、強力な粘液溶解法となることが期待されている。
【００２２】
要約すると、Ｔｒｘは、液体画分を増加させて、ＣＦ痰の粘弾性を低下させる。Ｔｒｘによって痰を処理する過程で、糖蛋白質の可溶性の上昇が起こるが、このことが、これらの流動性を変化させるメカニズムであるかもしれない。液体の遊離を促進し、気道分泌液の粘性を低下させる粘液還元系を開発すれば、ＣＦに対する治療法となり、また、他の呼吸器症状（例えば、慢性または急性の気管支炎、気管支拡張症、急性気管炎、急性または慢性の副鼻腔炎、粘膜による気道の急性または慢性の堰塞によって起こる肺拡張不全、細気管支炎）を伴うか、または、過剰または異常な粘液の粘性および／または粘着性を伴うか、もしくはそれによって悪化する、さまざまな胃腸または生殖器官の疾患（例えば、粘液の濃縮による急性、亜急性、または慢性の腸閉塞、重要な生殖器構造の閉塞による不妊）を伴う、過剰または異常な粘液の粘性および／または粘着性の治療に対する治療法となる可能性が期待される。Ｔｒｘは、グリコシル化および翻訳後修飾を受けない天然の蛋白質であり、通常は、細胞外の間隙に低濃度で存在するため、それを長期にわたって投与すると免疫系によって寛容されうる。
【００２３】
したがって、本発明の一つの態様は、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を有する患者の体内で粘液または痰の液状化を上昇させる方法に関する。この方法は、患者の粘液または痰を、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを含む組成物に接触させるステップを含む。この蛋白質は、接触ステップの前に比べて、粘液または痰の液状化を増進するのに効果的である。
【００２４】
本発明によれば、「粘液」という用語は、通常、呼吸管、胃腸管および生殖器官など、さまざまな身体の組織にある粘膜によって分泌される、大抵は透明で粘質の液体を意味する。粘液は、それを分泌する組織を湿らせ、滑らかにし、保護する。粘液は、ムチン高分子を含むが、これは粘液のゲル形成成分である。正常なムチンの粘弾性は、ムチン重合体の濃度、分子量、および縺れ具合によって決まる。「痰」という用語は、通常、唾液と、粘液などの気道からの排出物との混合物を意味する。一般的には、痰は、唾液と粘液の吐出物（および、呼吸組織からの他の排出物）である。従って、粘液は、痰の主要な成分であり、そのため、過剰に粘性の粘液が痰に存在すると、それ自体が過剰に粘性の痰になってしまう。「液状化」という用語は、液体になる作用を意味する。したがって、粘液または痰の液状化が増進するとは、粘液または痰の液相または液体状態が、より固いか、または粘性の相に比べて増加することを意味する。
【００２５】
体内における粘液および痰の通常の機能は、粘液（および、したがって痰の粘液成分）が粘弾性を有することを必要とする。正常な粘液および痰を有する個体（すなわち、健常な個体、より具体的には、粘液または痰の粘性または粘着性によって生じるか悪化する病徴または症状を患っていない個体）では、粘弾性はムチン重合体の濃度、分子量、および縺れ具合によって決まる（Ｖｅｒｄｕｇｏら、Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ ２０；２２３−２３０，１９８３）。粘液中のムチンが、死にかけている炎症細胞から放出されるＤＮＡ（Ｐｏｔｔｅｒら、Ａｍ Ｊ Ｄｉｓ Ｃｈｉｌｄ １００：４９３−４９５，１９６０；Ｌｅｔｈｅｍら、Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ １００：４９３−４９５，１９９０；Ｌｅｔｈｅｍら、Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ３：１９−２３，１９９０）およびｆ−アクチン重合体（ｆ−ａｃｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒ）（Ｓｈｅｉｌら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈ １４８：９１９−９２７，１９９６；Ｔｏｍｋｉｅｗｉｃｚら、ＤＮＡ ａｎｄ ａｃｔｉｎ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｐｕｔｕｍ，Ｃｉｌｉａ，ｍｕｃｕｓ，ａｎｄ ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓより、Ｂａｕｍ ＧＬ，Ｐｒｉｅｌ Ｚ，Ｒｏｔｈ Ｙ，Ｌｉｒｏｎ ＮおよびＯｓｔｆｅｌｄ ＥＪ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，１９９８）と相互作用すると、粘液（および、したがって痰）は、ＣＦ痰と同じように濃密で粘性になる。このような粘液は、咳や粘膜毛様体クリアランスによって排出することができないため、日和見性の病原体が肺に定住しやすくなる。したがって、異常または過剰に粘性および／または粘着性の粘液は、正常または健康な患者（好適には、年齢および性別が一致した患者）からの粘液よりも、測定可能または検出可能な程度に粘性または粘着性が強い粘液という特徴、および／または、その粘性および／または粘着性のせいで、患者に不快感や痛みをもたらすか、または、病状または病気を起こさせるか、悪化させる、一つ以上の症状を患者に生じさせるか、それを助長するという特徴を有する。すなわち、異常または過剰に粘性および／または粘着性の痰は、正常な粘液または痰から逸脱したものであって、患者には、その症状の軽減または他の治療上の利益を提供することが望ましい。
【００２６】
本発明に係る方法および組成物を用いて、粘液または痰の液状化を増進することが望ましい患者を治療することができる。特に、肺、洞（ｓｉｎｕｓ）、胃腸、または生殖器の病気または症状を有する患者が、本発明に係る方法および組成物を用いた治療による恩恵を受けることができる。本発明は、粘液または痰の異常または過剰な粘性および／または粘着性によって生じるか、悪化する病気または病状の一つ以上の症状を改善または軽減するのに最も役立つが、それには、当然ながら、肺関連疾患である嚢胞性線維症も含まれる。その他の病気も、少なくとも時には、粘液または痰の異常または過剰な粘性および／または粘着性を伴うことがあり、そのような症状が起きたときには、本発明に係る方法を用いて、粘液または痰の液状化を増進させることができ、患者に多少の緩和または治療上の恩恵をもたらすことができる。このような病気の例には、嚢胞性線維症、慢性または急性の気管支炎、気管支拡張症（非ＣＦ型およびＣＦ型の気管支拡張症）、急性気管炎（細菌性、ウイルス性、マイコプラズマ性、または別の生物が原因となる）、急性または慢性の副鼻腔炎、急性または慢性の粘膜性気道堰塞（時に、ぜんそくなど、さまざまな疾患で見られる）によって起こる肺拡張不全（肺または肺葉の虚脱）、細気管支炎（ウイルス性など）、ＣＦまたは同様の疾患における胎便性イレウス、またはその同等物など、粘膜の濃縮によって起こる急性、亜急性、または慢性の腸閉塞、頸管、精管、またはその他の重要な生殖構造（など）の閉塞が原因となる不妊などがある。また、本発明に係る組成物および方法は、ウイルス性および細菌性の感染症など、さまざまな呼吸器官の感染症に罹った患者において、粘液または痰の過剰な粘性および／または粘着性を伴う症状を軽減させるのに役立つ可能性がある。
【００２７】
したがって、治療上の恩恵とは、必ずしも、特定の病気または病状を治すことではなく、むしろ、好適には、最も典型的には、病気または病状の緩和、病気または病状の除去、病気または病状に関連した症状の軽減または除去、一次的な病気または病状の発生によって起こる二次的な病気または病状（例えば、気道にある過剰に粘性の粘液を利用する日和見病原生物によって引き起こされる感染症）の予防または緩和、および／または、病気または病状の予防、もしくは、その病気または病状を伴う症状の予防などの結果を含む。ここで、「病気から守る」という語句は、病気の症状を軽減させること、緩和療法（治癒をもたらさずに病気の症状を軽減または緩和すること）、病気の発生を低下させること、および／または、病気の重篤度を軽減することを意味する。患者を守るとは、本発明に係る組成物を患者に投与すると、病気の発生が防止され、および／または、その病気または病状の一つ以上の症状、徴候、または原因が治癒または緩和されることを意味することもある。したがって、患者を病気から守るとは、病気の発生を予防すること（予防的治療）、および病気に罹った患者を治療すること（治療的措置）とが含まれる。具体的には、患者を病気から守ることは、有益な効果が得られるように粘液または痰と、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドとを接触させることで、患者の粘液または痰の液状化を増進することによって実行される。有益な効果は、当業者、および／または、患者を治療している熟練した医師によって簡単に評価することができる。「病気」という用語は、患者の正常な健康状態からの逸脱を意味し、症状が存在するときの状態、および逸脱（例えば、感染、遺伝子変異、遺伝的欠陥など）は起きたが、まだ症状が現れていない病状を含む。
【００２８】
患者の粘液および／または痰を、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチド（または、そのような蛋白質を含む組成物）に接触させるのは、その組成物と接触させる前に比べて、粘液または痰の液状化を増進させる結果を意図してのことである。本発明によれば、粘液または痰の液状化の増進が、以前の液状化の程度と比較して、粘液または痰の液状化の程度が測定可能または検出可能な増加であることもあり、好適には、統計学的に有意な増加である（すなわち、患者試料と基準対照との間における液状化の測定レベルの違いが、信頼度ｐ＜０．０５以上で統計的に有意である）。一般的には、「基準対照」とは、治療を行う前の患者の試料である。なぜなら、正常で健康な個体は、通常、対照として用いるのに十分な量の痰を産生することができないからであるが、正常で健康な個体からの痰を基準対照から除外するわけではない。粘液または痰の液状化は、実施例の項で説明されているようなコンパクションアッセイ法など、当技術分野において公知の適当な技術を用いて測定することができる。このようなアッセイ法では、固相（ゲル）対水相（液体）における粘液または痰の量を測定する。本発明の別の局面において、粘液または痰の相対的な粘性または粘着性は、（例えば、磁気マイクロレオメーターによって測定された）粘弾性、糖蛋白質の含有量、またはＤＮＡ含有量など、別のパラメーターまたは指標を用いて測定することができる。本発明の一つの局面において、液状化の程度は、水（液）相にある所定の粘液または痰の量として、粘液または痰の試料の全量の百分率として記載される。嚢胞性線維症患者においては、例えば、粘液または痰の液状化程度は、全量の１０％よりも低く、さらには、５％よりも低い。好適には、本発明に係る蛋白質または組成物を粘液または痰に接触させると、粘液または痰の液状化に変化が生じ、全量の約１５％以上が液相になり、より好適には全量の約２０％以上が液相になり、より好適には全量の約２５％以上が液相になり、より好適には全量の約３０％以上が液相になり、より好適には全量の約３５％以上が液相になり、より好適には全量の約４０％以上が液相になり、より好適には、全量の約４５％以上が液相になり、より好適には全量の約５０％以上が液相になり、または、粘液によって生じた機能の遮断または阻害が解消されるに至る（例えば、液状物を吐き出し始めるのに十分なほど、患者の気道がきれいになる）。通常、痰または粘液の液状化は、気道、またはそれ以外の遮断された通路（例えば、胃腸管または生殖管）がきれいになるまで、痰を過剰に液状化することなく、小幅で段階的な増分で増進させるのが好適である。粘液または痰を過剰に液状化することは、患者に有害な場合もあるため（例えば、液状化した痰が逆流して、患者が痰を吐き出す前に、感染している濃度の低い液体で小さな気道を溢れさせる可能性があるため）望ましくない。好適には、本発明に係るタンパク質、ペプチド、または組成物を粘液または痰に接触させると、治療前に比べ、粘液または痰の液状化を容量にして約１％以上増加させ、より好適には、約２％以上というように、１％の増し分で、患者の気道やその他の詰まった通路がきれいになるまで続けてゆく。
【００２９】
一つの局面において、本治療は、患者の罹患組織（気道、胃腸管、生殖管など）から薄層化した物質を除去する方法とともに行われる。例えば、呼吸器系の場合には、本発明に係る方法を、体位ドレナージ、強制呼気（ｈｕｆｆ ｃｏｕｇｈｉｎｇ）、およびその他の呼吸運動、または、これら以外で、液状化した粘液または痰を吐き出すために適した方法とともに用いることができる。
【００３０】
本発明によれば、治療すべき患者の粘液または痰を、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質（または該蛋白質を含む組成物）に接触させる。この蛋白質は、粘液または痰の粘性および粘着性を低下させ、および／または、接触前の段階に比べ、痰または粘液の液状化を増進させるのに効果的である。前述したように、チオレドキシンは、ほとんどの生物に存在するジスルフィド還元酵素で、多くのチオール依存型細胞内還元作用に関与する蛋白質である。ヒトにおいて、チオレドキシンは、成人Ｔ細胞白血病由来因子（ＡＤＦ）とも呼ばれる。細胞内においては、この遍在性の低分子量（１１，７００）蛋白質のほとんどは還元されている。還元型または酸化型のチオレドキシンは、無傷の細胞に進入し、または細胞膜に吸着することができ、そこで、少量が、時間をかけて次第に内部移行してゆく。これは、活性部位に２個の近接するシステイン残基を有し、酸化型蛋白質では、この蛋白質の三次元構造からジスルフィド架橋が突き出している。フラビン蛋白質チオレドキシンレダクターゼは、このジスルフィドのＮＡＤＰＨ依存型還元を触媒する。チオレドキシンが僅かに増加すると、蛋白質におけるスルフヒドリル−ジスルフィド酸化還元状態に大きな変化をもたらすことがある。
【００３１】
細胞の蛋白質の還元をもたらすことができる以外に、チオレドキシンは、（例えば、活性酸素種をスカベンジすることによって、酸化されうる基質の酸化を防止することにより）抗酸化因子として直接的に作用することができるが、チオレドキシンは、他のチオール類とは異なり、一般的には、自己酸化によって（例えば、自己酸化によりスーパーオキシド・ラジカルを発生させて）細胞内の酸化ストレスに寄与することはない。前掲、Ｗｈｉｔｅらに付与された米国特許第５，９８５，２６１号は、チオレドキシンが、ＭｎＳＯＤの産生を直接誘導すること、および、この誘導が、還元状態にあるチオレドキシンによってもたらされることを明らかにした。
【００３２】
本発明に係る「チオレドキシン活性部位」は、Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃというアミノ酸配列を含む。ここで、「Ｃ」と表記されるアミノ酸残基はシステイン残基であり、「Ｘ」と表記されるアミノ酸残基は、どのアミノ酸残基でもよいが、具体的には、標準的な２０アミノ酸残基のいずれかである。このような本発明に係るチオレドキシン活性部位は、好適には、アミノ酸配列Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ（配列番号：１）を含む。さらに、チオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘを含むことがある。好適には、本発明に係るチオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）を含むが、ここで、「Ｇ」と表記されるアミノ酸残基はグリシン残基であり、「Ｐ」と表記されるアミノ酸残基はプロリン残基である。より好適には、本発明に係るチオレドキシン活性部位は、アミノ酸配列Ｗ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｋ（配列番号：３）を含むが、ここで、「Ｗ」と表記されるアミノ酸残基はトリプトファン残基であり、「Ｋ」と表記されるアミノ酸残基はリシン残基である。
【００３３】
本発明の一局面において、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質は、全長のチオレドキシン蛋白質、またはその断片で、構造的および機能的に上記に記載したとおりのチオレドキシン活性部位を含むものである。好適なチオレドキシン蛋白質は、原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物チオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンなどであるが、特にヒトチオレドキシンが好適である。多様な生物に由来するチオレドキシンの核酸配列およびアミノ酸配列が当技術分野において周知されており、本発明に包含される対象となる。例えば、配列番号：４〜１５は、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）（配列番号：４）、ポリフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（配列番号：５）、リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（配列番号：６）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（配列番号：７）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）（配列番号：８）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（配列番号：９）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（配列番号：１０）、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）（配列番号：１１）、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（配列番号：１２）、シロイズナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（配列番号：１３）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（配列番号：１４）、およびイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（配列番号：１５）に由来するチオレドキシンのアミノ酸配列を示している。これらの配列の各々について、Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）というモチーフ（配列番号：１のＣＧＰＣモチーフを含む）は以下のように存在する。配列番号：４（３３〜３８番目）、配列番号：５（２８〜３３番目）、配列番号：６（２７〜３２番目）、配列番号：７（２９〜３４番目）、配列番号：８（３１〜３６番目）、配列番号：９（３１〜３６番目）、配列番号：１０（３１〜３６番目）、配列番号：１１（３１〜３６番目）、配列番号：１２（３１〜３６番目）、配列番号：１３（５９〜６４番目）、配列番号：１４（８８〜９３番目）、および配列番号：１５（９４〜９９番目）。さらに、ヒトおよび細菌のチオレドキシンなど、いくつかのチオレドキシン蛋白質の三次元構造が解明されている。したがって、多数の生物に由来するチオレドキシンの構造および活性部位が、当技術分野において周知されており、当業者は、本発明において使用することができる、全長チオレドキシンの断片またはホモログを容易に同定および製作することができる。
【００３４】
「還元状態にある」という語句は、本発明に係る蛋白質またはペプチドの活性部位にあるシステイン残基の状態を具体的に述べている。還元状態にあると、これらシステイン残基はジチオール（すなわち、２個の遊離したスルフヒドリル基、−ＳＨ）を形成する。これに対し、酸化型では、これらのシステイン残基は、細胞内でジスルフィド架橋を形成し、このような分子はシスチンと呼ばれる。還元状態では、チオレドキシン活性部位が、その活性部位であるジチオールをジスルフィドに可逆的に酸化することによって酸化還元反応に関与することができ、ジチオール−ジスルフィド交換反応を触媒する。
【００３５】
ここで、チオレドキシン活性部位を含む、本発明に係る蛋白質は、チオレドキシン活性部位そのものであっても、グリコシド結合によって別のアミノ酸に結合しているチオレドキシンであってもよい。このように、本発明に係る蛋白質またはペプチドの最小サイズは、約４個から約６個のアミノ酸長であり、好適なサイズは、その蛋白質の全長体、融合体、多価体、または単なる機能的部位のいずれが所望なのかによって異なる。好適には、本発明に係る蛋白質またはペプチドの長さは、約４個から約１００個以上のアミノ酸残基まで延び、具体的には、整数（すなわち、４、５、６、７…９９、１００、１０１…）である中間的な長さのペプチドが想定されている。さらなる好適な態様において、本発明に係る蛋白質は、全長の蛋白質、またはこの蛋白質のホモログである。ここで、「ホモログ」という用語は、天然の蛋白質またはペプチド（すなわち、「プロトタイプ」または「野生型」の蛋白質）を改変したことによって、天然の蛋白質またはペプチドとは異なるが、天然型の基本的な蛋白質および側鎖の構造を維持しており、および／または、天然の蛋白質の少なくとも生物活性部位（すなわち、チオレドキシン活性部位）の基本的な三次元構造を維持している蛋白質またはペプチドを意味する。このような改変には、１個または数個のアミノ酸側鎖の変化、欠失（例えば、蛋白質またはペプチド（断片）の切断型）、挿入、および／または置換などの１個または数個のアミノ酸の変化、１個または数個の原子の立体配位の変化、および／または、メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化（ｐａｌｍｉｔａｔｉｏｎ）、アミド化、および／または、グリコシルホスファチジルイノシトールの付加など、軽微な誘導体化などがある。本発明によれば、天然のチオレドキシンタンパク質のホモログを含む、本発明において有用な蛋白質またはペプチドは、還元状態で、蛋白質またはペプチドがチオレドキシン活性部位を有するため、その活性部位であるジチオールをジスルフィドに可逆的に酸化することによって、酸化還元反応に関与することができ、ジチオール−ジスルフィド交換反応を触媒することができ、および／または、粘液または痰の粘性または粘着性を低下させるか、粘液または痰の液状化を増進することができる。ここで、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドは、チオレドキシンと同じ特徴をもつことができ、また、好適には、原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物のチオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンからなる群より選択されるチオレドキシンである。特に好適な態様において、この蛋白質はヒトチオレドキシンである。
【００３６】
ホモログは、自然対立遺伝子変異または自然突然変異によるものであってもよい。蛋白質をコードする核酸の自然対立遺伝子変異体とは、ゲノムにおいて、このタンパク質をコードする遺伝子と本質的には同じ遺伝子座（または複数の遺伝子座）に存在するが、例えば、突然変異または組換えによって生じた自然変異のために、似てはいるが同一ではない配列を有する遺伝子である。対立遺伝子変異体は、一般的には、比較の対象となる遺伝子によってコードされているタンパク質と同じ活性を有するタンパク質をコードしている。対立遺伝子変異体の一つの種類は、同一の蛋白質をコードすることができるが、遺伝子コードの縮退によって、異なった核酸配列を有する。また、対立遺伝子変異体は、遺伝子の５’側または３’側の非翻訳領域（例えば、調節制御領域）に変異を含む。対立遺伝子変異体は、当業者によく知られている。
【００３７】
単離された天然の蛋白質の直接改変、蛋白質の直接合成、または、例えば、ランダムもしくは標的された変異作出を行うための古典的ＤＮＡ技術もしくは組換えＤＮＡ技術を用いて、蛋白質をコードする核酸配列を改変するなど、当技術分野において蛋白質を作製するために既知の技術を用いて、ホモログを作製することができる。
【００３８】
野生型蛋白質と比較したときのホモログの改変部は、天然の蛋白質と比較したときにホモログの基本的な生物活性に作用または拮抗するか、または実質的な変化を与えないのいずれかである。通常、蛋白質の生物活性または生物作用とは、インビボ（すなわち、蛋白質の自然な生理学的環境において）またはインビトロ（すなわち、実験条件下において）測定または観察したときに、天然型の蛋白質だとされる蛋白質によって示され、行われる機能を意味する。ホモログまたはミメティクス（ｍｉｍｅｔｉｃ）（後述）などへの蛋白質の改変は、天然型の蛋白質と同じ生物活性をもつ蛋白質、または、天然型の蛋白質と比べて低下または上昇した活性を有する蛋白質をもたらす。蛋白質発現の低下、または蛋白質の活性の低下をもたらす改変は、（完全または部分的な）不活性化、下方制御または低下された作用と呼ぶことができる。同様に、蛋白質発現の上昇、または蛋白質の活性の上昇をもたらす改変は、蛋白質の増幅、過剰生産、活性化、促進、上方制御、または増進された作用と呼ぶことができる。
【００３９】
一つの態様において、チオレドキシンのペプチドおよび非ペプチドのホモログを含む、チオレドキシン蛋白質のホモログは、薬剤設計または選択の産物であってもよく、当技術分野において既知のさまざまな方法を用いて作製することができる。このようなホモログをミメティクスと呼ぶこともできる。ミメティクスは、天然のペプチドの基本構造を模倣する基本構造を持ち、および／または、天然のペプチドの主要な生物学的性質を有することから、ミメティクスとは、天然のペプチドの生物作用を模倣することができるペプチドまたは非ペプチドの化合物を意味する。ミメティクスには、天然のペプチドと側鎖類似性のないものなど、プロトタイプからの実質的な改変を有するペプチド（このような改変は、例えば、分解に対する感受性を低下させる可能性がある）、抗イディオタイプおよび／または触媒性の抗体、もしくはその断片、単離された蛋白質の非蛋白質部位（例えば、糖質構造）、または、例えば、コンビナトリアル化学法によって同定される核酸および薬剤などの合成または天然の有機分子などを含みうる。このようなミメティクスは、当技術分野において既知のさまざまな方法を用いて、設計、選択、および／または、さもなければ同定することができる。本発明において有用なミメティクス、またはそれ以外の治療化合物を設計または選択するのに役立つ、さまざまな薬剤設計法が、Ｍａｕｌｉｋら、１９９７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．に開示されており、ここに、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられる。
【００４０】
ミメティクスは、例えば、分子多様性作出法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｓｔｒａｔｅｇｙ）（大規模で、化学的に多様な分子ライブラリーを迅速に構築可能にする関連法を組み合わせたもの）から、特に、化学物質またはコンビナトリアルのライブラリー（すなわち、配列または大きさが異なるが、同じような構成単位を有する化合物のライブラリー）、または、合理的、特異的またはランダム薬剤設計によって、得ることができる。例えば、Ｍａｕｌｉｋら、前掲参照。
【００４１】
分子多様性作出法では、大きな化合物ライブラリーが、生物学的、酵素的、および／または科学的方法を用いて、例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、および／または有機分子から合成される。分子多様性作出法を開発する上で重要なパラメーターは、サブユニットの多様性、分子の大きさ、およびライブラリーの多様性である。このようなライブラリーをスクリーニングする通常の目標は、コンビナトリアル選択の連続的な適用を利用して、所望の標的に対する高親和性のリガンドを得た後、ランダムまたは特異的な設計法のいずれかによってリード分子を最適化することである。分子多様性作出法は、Ｍａｕｌｉｋら、前記の箇所に詳細に記載されている。
【００４２】
Ｍａｕｌｉｋらは、例えば、適当に選択された断片の断片ライブラリーから新規の分子を作出するプロセスを使用者が指示する指定設計法、使用者が、遺伝子アルゴリズムまたはその他のアルゴリズムを用いて、断片とそれらの組み合わせをランダムに変異させつつ、同時に、候補リガンドの適合性を評価するための選択基準を適用するランダム設計法、および、使用者が、三次元レセプター構造と小断片プローブとの間の相互作用エネルギーを計算した後、好ましいプローブ部位を一緒に連結するグリッド基準法（ｇｒｉｄ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ）も開示している。
【００４３】
本発明の一つの態様において、本発明で使用するのに適した蛋白質は、チオレドキシン蛋白質の全長配列、またはその断片であって、本明細書に記載されているとおりのチオレドキシン活性部位を有する断片を含むか、本質的にそれからなるか、または、それからなるアミノ酸配列を有する。例えば、配列番号：４〜１２のいずれか一つ、またはその断片もしくそのホモログであって、本明細書に記載されているとおりのチオレドキシン活性部位を有するものが、本発明に包含される。このようなホモログは、全長チオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列に約１０％以上一致するアミノ酸配列を有する、または約２０％以上、または約３０％以上、または約４０％以上、または約５０％以上、または約６０％以上、または約７０％以上、または約８０％以上、または約９０％以上、または約９５％以上全長チオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列に一致するアミノ酸配列を有する蛋白質を含むことができるが、このパーセントは、１０％から１００％の間のすべて整数であれば何パーセントでもよい（１０％、１１％、１２％、…９８％、９９％、１００％）。
【００４４】
ここで、特段の記載がない限り、一致率（％）とは、以下を用いて行われた相同性評価を意味する。（１）アミノ酸検索にはｂｌａｓｔｐ、核酸検索にはｂｌａｓｔｎを用いた、標準的なデフォルトのパラメーターによるＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴ相同性検索であって、クエリー配列を、デフォルト値による低複雑度領域（ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎ）についてフィルターをかけた検索（Ａｅｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｓｃｈａａｆｆｅｒ，ＡＡ．Ａ．，Ｚｈａｎｇ．，Ｊ．Ｚｈａｎｇ，Ｚ，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９７）“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に説明がある。本文献は、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられる）、（２）ＢＬＡＳＴ ２アラインメント（後述のパラメーターを使用）、（３）および／または、標準的なデフォルトのパラメーターによるＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ。（位置特異的）。ＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴ ２には標準的なパラメーターに幾分かの違いがあるため、２つの具体的な配列が、ＢＬＡＳＴ ２プログラムを用いたときには有意な相同性ありと識別されても、どちらか一方の配列をクエリー配列としてＢＬＡＳＴ ２．０ Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴで検索を行うと、もう一方の配列が最も一致すると同定されないことがあることが知られている。さらに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、「プロファイル」検索の自動簡易版を提供しており、配列相同性を求めるための感度のよい方法である。プログラムは、まず、ギャップを許す（ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴデータベース検索を実行する。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、返ってくる有意なアラインメントからの情報を利用して位置特異的スコアマトリックスを構築し、次回のデータベース検索のクエリー配列を置換する。したがって、当然ながら、これらのプログラムのいずれか一つを用いることによって、一致率を決定することができる。
【００４５】
２つの具体的な配列は、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられるＴａｔｕｓｏｖａとＭａｄｄｅｎ，（１９９９），“Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ - ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）に記載されているとおりに、ＢＬＡＳＴ ２配列を用いて互いにアラインメントすることができる。ＢＬＡＳＴ ２配列アラインメントは、ｂｌａｓｔｐまたはｂｌａｓｔｎで、ＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムを用いて、得られるアラインメントにギャップ（欠失および挿入）を導入することができる、２配列間におけるギャップ許容ＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴ ２．０）を実行して行われる。ここで明確にするために、以下のようにして、標準的なデフォルトのパラメーターを用いてＢＬＡＳＴ ２配列アラインメントが行われる。
【００４６】
ｂｌａｓｔｎの場合、０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを用いて、
一致したときの報酬スコア＝１
不一致のときのペナルティスコア＝−２
ギャップ間隔（５）および延長ギャップ（２）ペナルティ
ギャップＸ＿ドロップオフ（５０）、期待値（１０）単語数（１１）フィルター（ｏｎ）
ｂｌａｓｔｐの場合、０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを用いて、
ギャップ間隔（１１）および延長ギャップ（１）ペナルティ
ギャップＸ＿ドロップオフ（５０）、期待値（１０）単語数（３）フィルター（ｏｎ）
本発明において有用なタンパク質は、全長チオレドキシン蛋白質の１０個以上の連続したアミノ酸残基（例えば、配列番号：４〜１２）（すなわち、参照配列の１０個連続したアミノ酸に１００％一致する１０個連続したアミノ酸残基）を含むアミノ酸配列を有する蛋白質も含みうる。別の態様において、チオレドキシン蛋白質のホモログは、天然のチオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列の１５個以上、または２０個以上、または２５個以上、または３０個以上、または３５個以上、または４０個以上、または４５個以上、または５０個以上、または５５個以上、または６０個以上、または６５個以上、または７０個以上、または７５個以上、または８０個以上などの連続したアミノ酸残基を、すべて整数となる（１０、１１、１２、…）介在長も含んで、全長の蛋白質となるまで含む。
【００４７】
本発明によれば、本明細書に記載されている配列に関して「連続的な」または「連続した」という用語は、切れ目のない配列として結合していることを意味する。例えば、ある配列が、別の配列の３０個連続した（または連続的な）アミノ酸を含むとは、その第一の配列が、第二の配列中の切れ目のない３０個のアミノ酸残基の配列に１００％一致する、切れ目のない３０個のアミノ酸残基の配列を含んでいることを意味する。同様に、ある配列が別の配列に「１００％一致する」とは、その第一の配列が、ヌクレオチドやアミノ酸にギャップ０で、第二の配列に正確に一致することを意味する。
【００４８】
別の態様において、本発明において有用なタンパク質は、天然のチオレドキシンのアミノ酸配列に十分に類似するアミノ酸配列をもち、ホモログをコードする核酸配列が、中度、高度、または非常に高度なストリンジェンシー条件（後述）下で、天然のチオレドキシン蛋白質をコードする核酸分子（すなわち、天然のチオレドキシンのアミノ酸配列をコードする核酸の相補配列）に（すなわち、に対して）ハイブリダイズすることができる蛋白質を含む。このようなハイブリダイゼーション条件の詳細については後述する。
【００４９】
本発明に係るチオレドキシン蛋白質をコードする核酸配列の相補核酸配列とは、チオレドキシンをコードするストランドに相補的な核酸鎖の核酸配列を意味する。所定のアミノ酸配列をコードする二本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡと、その一本鎖ＤＮＡに相補的な配列を有する相補鎖を含む。そのため、本発明に係る核酸分子は、二本鎖でも一本鎖でもよく、ストリンカージェントなハイブリダイゼーション条件下で、チオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列をコードする核酸配列、および／または、そのようなアミノ酸配列をコードする核酸配列の相補鎖と安定したハイブリッドを形成する核酸分子を含む。相補鎖を推定する方法は、当業者にとって既知である。
【００５０】
ここで、ハイブリダイゼーション条件と言うときは、類似した核酸分子を同定するために核酸分子が用いられる標準的なハイブリダイゼーション条件を意味する。そのような標準的条件は、例えば、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に開示されている（特に、９．３１〜９．６２頁参照）。さらに、さまざまな程度のヌクレオチドのミスマッチを許容したハイブリダイゼーションを行うのに適したハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を計算するための式が、例えば、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられるＭｅｉｎｋｏｔｈら、１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４；Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、同書に開示されている。
【００５１】
より具体的には、ここで、中度にストリンジェントなハイブリダイゼーションと洗浄の条件とは、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして用いられる核酸分子に対し約７０％以上の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件（すなわち、約３０％以下のヌクレオチドミスマッチを許容する条件）を意味する。ここで、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションと洗浄の条件とは、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして用いられる核酸分子に対し約８０％以上の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件（すなわち、約２０％以下のヌクレオチドミスマッチを許容する条件）を意味する。ここで、非常に高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションと洗浄の条件とは、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして用いられる核酸分子に対し約９０％以上の核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする条件（すなわち、約１０％以下のヌクレオチドミスマッチを許容する条件）を意味する。上で検討したように、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、同書の式を用いて、これら特定の程度のヌクレオチドミスマッチを達成するのに適したハイブリダイゼーションと洗浄の条件を計算することができる。このような条件はさまざまなであり、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのどちらが形成されるかによって異なる。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのための計算融解温度は、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのそれよりも１０℃低い。具体的な態様において、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにとってストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ＋）というイオン強度、約２０℃から約３５℃という温度（より低いストリンジェンシー）、より好適には、約２８℃から約４０℃という温度（よりストリンジェント）、さらにより好適には、約３５℃から約４５℃という温度（さらに一層ストリンジェント）で、適当な洗浄条件によるハイブリダイゼーションを含む。具体的な態様において、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドにとってストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ＋）というイオン強度、約３０℃から約４５℃という温度、より好適には、約３８℃から約５０℃という温度、さらにより好適には、約４５℃から約５５℃という温度で、同様にストリンジェントな洗浄条件によるハイブリダイゼーションを含む。これらの値は、約１００ヌクレオチドよりも大きく、ホルムアミド０％、そしてＧ＋Ｃ含有率が約４０％の分子についての融解温度の計算に基づいている。あるいは、Ｔｍは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、９．３１〜９．６２頁に示されているような実験によって計算することもできる。通常、洗浄条件は、できるだけストリンジェントであるべきであり、そして、選択したハイブリダイゼーション条件に適合しているべきである。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、塩条件と、具体的なハイブリッドの計算上のＴｍよりもおよそ２０〜２５℃低い温度条件とを組み合わせることを含むことがあり、洗浄条件は、一般的に、ハイブリッドの計算上のＴｍよりも約１２〜２０℃低い温度条件とを組み合わせることを含む。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドで使用するのに適したハイブリダイゼーション条件の一例には、６×ＳＳＣ（５０％ホルムアミド）中、約４２℃で２〜２４時間ハイブリダイズした後、約２×ＳＳＣにおいて室温で一回以上洗浄することを含む洗浄工程を行った後、より高い温度とより低いイオン強度でさらに洗浄すること（例えば、約０．１×〜０．５×ＳＳＣ中約３７℃で一回以上洗浄した後、約０．１×〜０．５×ＳＳＣ中約６８℃で一回以上洗浄すること）を含む。
【００５２】
本発明に係る蛋白質は、チオレドキシン活性部位と、さまざまな作用をもつ融合セグメントとを含むセグメントを含む融合蛋白質でもよい。例えば、このような融合セグメントは、得られた融合蛋白質の精製を、アフィニティークロマトグラフィーを用いて可能にするなど、本発明に係る蛋白質の精製を簡単にするためのツールとして機能することができる。適当な融合セグメントは、所望の機能を有する、あらゆるサイズのドメインでもよい（例えば、蛋白質の安定性を強化する、タンパク質の免疫原性を強化する、および／または、蛋白質の精製を簡単にする）。一つ以上の融合セグメントを使用することは、本発明の範囲内にある。融合セグメントを、チオレドキシン活性部位を含むセグメントのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に結合させることができる。融合セグメントと、融合蛋白質のチオレドキシン活性部位含有ドメインとの間の結合は、この蛋白質のチオレドキシン活性部位含有ドメインを直接回復できるようにするため、切断されやすくなっていることもある。好適には、融合蛋白質は、チオレドキシン活性部位含有ドメインのカルボキシ末端および／またはアミノ末端に結合した融合セグメントを含む蛋白質をコードする融合核酸分子で形質転換した組換え細胞を培養して産生される。
【００５３】
一つの態様において、本発明に係る方法とともに使用するのに適した、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドは、該蛋白質が投与される動物種と実質的に類似する動物種に由来するチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを含む。別の態様において、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドは、微生物および植物など多様な由来原からのものを含み、所定の患者に用いることができる。
【００５４】
本発明の一つの態様において、天然のチオレドキシン蛋白質のアミノ酸配列など、本明細書に記載されたアミノ酸配列はいずれも、特定されたアミノ酸配列のＣ−および／またはＮ−末端のそれぞれに隣接する、１個以上で約２０個までの異種性の付加的アミノ酸とともに産生することができる。その結果得られる蛋白質またはポリペプチドは、特定されたアミノ酸配列から「本質的になる」と呼ぶことができる。本発明によれば、異種性のアミノ酸とは、自然には、特定されたアミノ酸配列に隣接して存在しない（すなわち、自然、すなわちインビボでは見られない）アミノ酸の配列であるか、または、特定されたアミノ酸配列の機能とは関連しないアミノ酸配列であるか、または、そのアミノ酸配列が由来する生物にとって標準的なコドン使用頻度を用いて翻訳されたならば、遺伝子内に存在するときには、特定されたアミノ酸配列をコードする天然の核酸配列に隣接しているヌクレオチドによってはコードされていないアミノ酸の配列である。同様に、「本質的になる」という語句は、本明細書において核酸配列に関して使用するとき、特定されたアミノ酸配列をコードする核酸配列の５’および／または３’末端のそれぞれに付加された、１個以上で、約６０個までの異種性のヌクレオチドが隣接していることがある、特定されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を意味する。異種性のヌクレオチドは、特定されたアミノ酸配列をコードする核酸配列が天然の遺伝子中に存在するときには、それに隣接しているのが自然には見られない（すなわち、自然界、インビボでは見られない）か、または、該蛋白質に付加的機能を付与するか、特定されたアミノ酸配列を有するタンパク質の機能を変化させる蛋白質をコードしていない。
【００５５】
別の態様において、本発明に係る方法とともに使用するのに適した、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドは、単離され、または生物学的に純粋な、その天然の環境から取り出してきた蛋白質を含む。したがって、「単離された」および「生物学的に純粋な」は、必ずしも、その蛋白質が精製されている限度を反映しているわけではない。本発明に係る単離蛋白質は、例えば、天然の由来原から得ることができ、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法、クロニーング）を用いて製造することができ、または、化学的に合成することができる。
【００５６】
好適には、本発明に係る方法で使用される、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質は、患者の体内で粘液または痰の液状化を測定可能または検出可能な程度増進させる（または、粘性または粘着性を低下させる）のに十分な、および／または、患者の粘液または痰を伴う患者に測定可能、検出可能または感知される治療上の恩恵をもたらすのに十分な半減期をインビボで有する。この半減期は、このような蛋白質の送達方法によってもたらされうる。本発明に係る蛋白質は、好適には、動物において約５分よりも長い半減期を有し、より好適には、動物において約４時間よりも長く、さらにより好適には、動物において約１６時間よりも長い。好適な態様において、本発明に係る蛋白質は、動物において約５分から約２４時間までの半減期を有し、好適には、動物において約２時間から約１６時間までであり、より好適には、動物において約４時間から約１２時間までである。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドをコードする核酸分子を含む。そのような核酸分子を用いて、本発明に係る方法においてインビトロまたはインビボで有用な蛋白質を製造することができる。本発明に係る核酸分子は、本明細書で既に説明した蛋白質のいずれかをコードする核酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる核酸分子を含む。本発明によれば、単離された核酸分子とは、その天然の環境から取り出された（すなわち、人間による操作を受けた）核酸分子（ポリヌクレオチド）であって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ｃＤＮＡなど、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体を含みうる。したがって、「単離された」とは、核酸分子がどの程度精製されているかを反映するものではない。「核酸分子」という語句は、一次的には、物理的な核酸分子意味し、「核酸配列」という語句は、一次的には、核酸分子上のヌクレオチドの配列を意味するが、この二つの語句は、特に、蛋白質をコードすることができる核酸分子、または核酸配列について互換的に使用することができる。本発明に係る単離された核酸分子は、その天然の由来原から単離し、または、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法、クロニーング）もしくは化学合成法を用いて製造することができる。単離された核酸分子は、例えば、遺伝子、自然対立遺伝子変異体、そのコード領域もしくは一部、および、改変によって、本発明に係る所望の蛋白質をコードするか、もしくは天然の遺伝子を単離したものとストリンジェントな条件下で安定したハイブリッドを形成する核酸分子の能力を実質的に阻害することがないようにヌクレオチド挿入、欠失、置換および、または逆位により改変されたコード領域および／または調節領域を含みうる。単離された核酸分子は縮退を含みうる。ここで、ヌクレオチドの縮退とは、一つのアミノ酸が、異なったヌクレオチドコドンによってコードされうるという現象を意味する。したがって、本発明において有用な所定の蛋白質をコードする核酸分子の核酸配列は、縮退によって変化しうる。
【００５８】
本発明によれば、遺伝子というとき、該遺伝子によってコードされる蛋白質の産生を調節する制御領域（転写、翻訳、または翻訳後の調節領域）、およびコード領域そのものなど、天然（すなわち野生型）の遺伝子に関係するすべての核酸配列を含む。別の態様において、遺伝子は、所定の蛋白質をコードする核酸配列に類似するが同一ではない配列を含む、天然の対立遺伝子変異体でもよい。対立遺伝子変異体は、既に上記で説明されている。「核酸分子」および「遺伝子」という語句は、核酸分子が、上記のような遺伝子を含むときには、互換的に使用することができる。
【００５９】
好適には、本発明に係る単離された核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法、クロニーング）を用いて製造することができ、または、化学的に合成することができる。単離された核酸分子は、天然の核酸分子、ならびに、そのホモログであって、天然の対立遺伝子変異体、および改変によって、蛋白質の生物活性に対し所望の効果が提供されるよう、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、および／または逆位されている改変核酸分子などを含むホモログを含む。対立遺伝子変異体および蛋白質ホモログ（例えば、核酸ホモログによってコードされる蛋白質）については、詳細に上述されている。
【００６０】
核酸分子ホモログは、当業者に既知のいくつかの方法を用いて作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら参照）。例えば、古典的な変異誘発法および組換えＤＮＡ技術（例えば、部位特異的変異誘発法、化学的処理、制限酵素切断法、核酸分子断片のライゲーション、および／またはＰＣＲ増幅法）による技術、または、オリゴヌクレオチド混合物の合成、混合物グループをライゲーションして、核酸分子の混合物、およびそれらを組み合わせたものを「構築」する技術など、さまざまな技術を用いて核酸分子を改変することができる。所定の蛋白質をコードする組換え核酸分子を改変するための別法は遺伝子シャッフリング法（すなわち分子育種（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ）である（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒに付与された米国特許第５，６０５，７９３号；ＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：２８４−２９０；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１参照。これらの文献は、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられる）。この技術を用いて、蛋白質に複数の変化を同時に効果的に導入することができる。所定の遺伝子とのハイブリダイゼーションによって、または、核酸分子によってコードされる蛋白質の機能（すなわち生物活性）をスクリーニングすることによって、核酸分子のホモログを選択することができる。
【００６１】
本発明の一つの態様は、一つ以上の転写調節配列に機能的に連結されている上記の単離された核酸分子を含む組換え核酸分子に関する。より具体的には、本発明によれば、組換え核酸分子は、本明細書に記載するような組換えベクターおよび単離核酸分子を一般的に含む。本発明によれば、組換えベクターは、選抜された核酸配列を操作し、および／または、その核酸配列を宿主細胞に導入するためのツールとして用いられる改造された（すなわち、人為的に作製された）核酸分子である。したがって、組換えベクターは、選抜された核酸配列を宿主細胞の中で発現および／または組換え細胞を形成させるために送達するなどして、選抜した核酸配列をクロニーング、シークエンシング、および／またはその他の操作を行うときに使用するのに適している。このようなベクターは、典型的には、異種性の核酸配列、すなわち、自然には、クロニーングされるか送達される核酸配列に隣接しているとは認められない核酸配列を含むが、このベクターは、自然界で、本発明に係る核酸配列に隣接していることが分かっているか、または、本発明に係る核酸分子を発現させるのに有用な調節核酸配列（例えば、プロモーター、非翻訳領域）を含むこともできる（詳細は後述）。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、原核生物または真核生物のいずれでもよいが、典型的にはプラスミドである。ベクターは、染色体外因子（例えばプラスミド）として維持するか、または、組換え宿主細胞の染色体の中に組み込むことができるが、ベクターが、ゲノムから離れたままになっていれば、本発明を適用する場面のほとんどにとって好適である。ベクターの全体を、宿主細胞の中の適当な場所で維持するか、一定の条件下では、本発明に係る核酸分子を残して、プラスミドＤＮＡは除去することもできる。組み込まれた核酸分子は、染色体のプロモーターによる調節下、天然もしくはプラスミドのプロモーターによる調節下、またはいくつかのプロモーターを組み合わせたものの調節下に置くことができる。核酸分子の一個または複数個のコピーを染色体の中に組み込むことができる。本発明に係る組換えベクターは、少なくとも１個の選抜マーカーを含むことができる。
【００６２】
一つの態様において、本発明に係る組換え核酸分子で使用される組換えベクターは発現ベクターである。ここで、「発現ベクター」という語句は、コードされている産物（例えば、目的とする蛋白質）を産生させるのに適したベクターを意味するために使用される。この態様において、産生すべき産物（例えばチオレドキシン活性部位を含む蛋白質）をコードする核酸配列を組換えベクターに挿入して、組換え核酸分子を作製する。ベクター内で核酸配列が調節配列に機能的に連結されて、組換え宿主細胞内での核酸配列の転写および翻訳が可能になるように、産生すべき蛋白質をコードする核酸配列をベクターの中に組み込む。
【００６３】
本発明の別の態様において、組換え核酸分子はウイルスベクターを含む。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムまたはその一部の中に組み込まれた本発明に係る単離核酸分子を含むが、その中で、核酸分子は、細胞の中にＤＮＡが進入できるよう、ウイルス外被にパッケージされている。アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスなどを利用したものなど、いくつかのウイルスベクターを使用することができる。
【００６４】
一般的には、組換え核酸分子は、一個以上の発現調節配列に機能的に連結した本発明に係る核酸分子を少なくとも一個含む。ここで、「組換え分子」または「組換え核酸分子」という語句は、一次的には、発現調節配列に機能的に連結された核酸分子または核酸配列を意味するが、核酸分子が、本明細書で検討されているような組換え分子であるときは、「核酸分子」という語句と互換的に使用することもできる。本発明によれば、「機能的に連結された」という語句は、宿主細胞中にトランスフェクトされた（すなわち、形質転換、形質導入、トランスフェクト、接合、または形質伝導（ｃｏｎｄｕｃｅｄ）された）ときに分子が発現されうるように、核酸分子を発現調節配列に連結することを意味する。転写調節配列は、転写の開始、伸長、または終結を調節する発現調節配列である。特に重要な転写調節配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列、およびリプレッサー配列など、転写開始を調節する配列である。適当な転写調節配列には、組換え核酸分子が導入される宿主細胞または生物の中で機能することができる転写調節配列が含まれる。また、本発明に係る組換え核酸分子は、さらに、翻訳調節配列、複製開始点、およびその他の調節配列であって、組換え細胞に適合するものなど、付加的な調節配列を含むこともできる。一つの態様において、宿主細胞の染色体に組み込まれている分子など、本発明に係る組換え分子は、発現された蛋白質が、蛋白質を産生する細胞から分泌されるようにする分泌シグナル（すなわち、シグナルセグメント核酸配列）も含む。適当なシグナルセグメントには、発現される蛋白質と自然界で結合しているシグナルセグメント、または、本発明に係る蛋白質の分泌を指令することができる異種性シグナルセグメントなどがある。別の態様において、本発明に係る組換え分子は、発現された蛋白質を宿主細胞の膜まで輸送して挿入することができるリーダー配列を含む。適当なリーダー配列には、その蛋白質と自然界で結合しているリーダー配列、または、蛋白質を宿主細胞の膜まで輸送して挿入することを指令できる異種性リーダー配列などがある。
【００６５】
本発明によれば、「トランスフェクション」という用語は、外来性核酸分子（すなわち組換え核酸分子）を細胞内に挿入しうる方法を意味するために使用される。「形質転換」という用語は、この語が、微生物細胞または植物の中に核酸分子を導入するという意味で使用される場合には、「トランスフェクション」という用語と互換的に使用することができる。微生物系においては、「形質転換」という用語を使用して、微生物による外来核酸の獲得によって生じる遺伝的変化を表現するが、本質的に、「トランスフェクション」という用語と同義である。しかし、動物細胞では、例えば、癌化した後の培養状態における細胞の増殖性の変化（上記）を意味するという第二の意味を得ている。したがって、混乱を避けるため、動物細胞への外来性核酸の導入については、好適には、「トランスフェクション」という用語を使用し、本明細書において、外来性核酸を細胞に導入する場合に関しては、この用語が、動物細胞のトランスフェクション、および植物細胞と微生物細胞の形質転換を一般的に包含するものとして使用される。したがって、トランスフェクション技術には、形質転換、粒子衝撃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、電子穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染、およびプロトプラスト融合などがある。
【００６６】
本発明に係る組換え分子を一個以上用いて、本発明に係るコードされた産物（例えば、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質）を生産することができる。一つの態様において、コードされた産物は、蛋白質を産生するのに効果的な条件下で、本明細書に記載されている核酸分子を発現させることによって生産することができる。コードされた蛋白質を生産するために好適な方法は、一個以上の組換え分子で宿主細胞をトランスフェクトして、組換え細胞を形成させる方法である。
【００６７】
好適な態様において、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを、組成物で処理すべき粘液または痰に接触させる。この組成物は、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質を含み、また、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を減少させるか、そのような粘液または痰の液状化を増進させるために使用することができる別の化合物など、一種類以上の付加的な化合物を含むこともできる。一つの態様において、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドをコードする核酸分子を、治療すべき患者の細胞（例えば、肺または気道中の上皮細胞）に送達するために組成物を使用して、細胞がトランスフェクトされて、蛋白質を発現できるようになり、また、蛋白質が、細胞の微小環境内で粘液または痰に接触できるようにさせることができる。
【００６８】
また、組成物は、例えば、蛋白質または核酸分子またはその他の調節用化合物を患者に送達するための薬学的に許容される賦形剤および／または輸送用媒体など、薬学的に許容される担体を含むこともできる。ここで、薬学的に許容される担体とは、本発明に係る方法において有用な治療用蛋白質、核酸、または、その他の化合物を、適当なインビボまたはエクスビボ部位に送達するのに適した物質を意味する。好適な薬学的に許容される担体は、蛋白質、核酸分子、または化合物が所望の部位（例えば、処理すべき粘液または痰が分泌または排出されている部位）に到達したとき、粘液または痰に接触することができる形状（蛋白質または化合物の場合）、または、細胞の中に進入して、細胞によって発現され、発現された蛋白質が粘液または痰に接触しうる形状（核酸分子の場合）に蛋白質、核酸分子、または化合物を維持することができる。本発明に係る適当な賦形剤には、治療剤（蛋白質、核酸、または化合物）を細胞、組織、または液状物（粘液または痰）に輸送するか、輸送を助けるが、特異的に標的しない賦形剤または処方薬（ここでは、非標的担体とも呼ばれる）などがある。薬学的に許容される賦形剤の例には、水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、血清含有溶液、ハンクス液、その他の生理学的平衡水溶液、油類、エステル、およびグリコール類などがある。水性担体は、例えば、科学的安定性および等張性を促進することによって、レシピエントの生理学的状態に近づけるために必要とされる適当な補助物質を含むことができる。
【００６９】
適当な補助物質には、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、および重炭酸緩衝液を作製するのに使用される他の物質などがある。また、補助物質は、チメロサール、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリン、およびベンゾールアルコールなどの保存剤を含むことができる。本発明に係る組成物は、常法を用いて滅菌、および／または凍結乾燥することができる。
【００７０】
薬学的に許容される担体の一つのタイプは、本発明に係る組成物を患者の体内にゆっくりと放出することができる放出制御型処方薬を含む。ここで、放出制御型処方薬は、一種類以上の本発明に係る治療剤を放出制御用媒体の中に含む。適当な放出制御用媒体には、生体適合性ポリマー、その他のポリマー基質、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス調製剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、リポスフィア（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）、および経皮送達系などがある。核酸の適当な送達媒体には、リポソーム、ウイルスベクター、または、リボザイムなど、その他の送達媒体がある。
【００７１】
リポソーム送達媒体は、蛋白質、化合物、または核酸分子を、患者の適当な細胞および／または組織に送達することができる脂質化合物を含む。リポソーム送達媒体は、細胞の中に組成物を送達するために、細胞の原形質膜に融合することができる脂質組成物を含むことができる。リポソーム送達媒体は、好適には、患者の体内の好適な部位に組成物を送達するのに十分な時間、患者の体内で安定に維持できる。本発明で使用するのに適したリポソームは、あらゆるリポソームを含む。
【００７２】
チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを患者に投与するのに適当または有効な量とは以下のことができる量である。活性部位のジチオールをジスルフィドに可逆的に酸化することによって酸化還元反応に関与すること、ジチオール−ジスルフィド交換反応を触媒すること、ならびに、具体的には、患者の体内で粘液または痰の粘性または粘着性を低下させること、および／または粘液または痰の液状化を増進すること、ならびに、より具体的には、患者に治療による恩恵を提供できるほど、患者の体内で粘液または痰の液状化を増進すること。粘性または粘着性の低下、または粘液または痰の液状化の増進は、本明細書において既に記載されているように、または、当業者に既知の適当な方法によって測定、検出、または判定することができる。
【００７３】
一つの態様において、患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドの好適な量は、患者の体重１ｋｇあたり約０．１マイクロモルから約１５０マイクロモルまでである。別の態様において、患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドの好適な量は、患者の体重１ｋｇあたり約１．５マイクロモルから約１５０マイクロモルまでである。患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドのより好適な量は、患者の体重１ｋｇあたり約２マイクロモルから約２５マイクロモルまでである。患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドのさらにより好適な量は、患者の体重１ｋｇあたり約３マイクロモルから約１０マイクロモルまでである。
【００７４】
別の態様において、送達経路がエアロゾルまたは同様の経路である場合には、患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドの好適な量は、投薬単位（例えば、ヒトへの投薬単位は、一般的に約２〜３ｍｌ）あたり約０．２５ｍｇ以上、および投薬単位あたり約２５ｍｇを含む。好適には、患者に投与されるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチド量は、投薬単位あたり約０．２５ｍｇ以上、また、より好適には、投薬単位あたり約０．３ｍｇ以上、また、より好適には、投薬単位あたり約０．３５ｍｇ以上というように、０．０５ｍｇの増し分で、投薬単位あたり約２５ｍｇ以上までを含む。エアロゾル送達では、一般的に、エアロゾルの約１０％の容量しか、実際には気道に送達されない。したがって、他の投薬経路で、その部位に送達される組成物の容量がこれよりも多い場合には、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドの用量を減らしたものを使用できることが簡単に理解できよう。
【００７５】
動物に投与される本発明に係る蛋白質の最適量は、投与経路によって変化する。例えば、蛋白質を吸入経路（エアロゾル）によって投与する場合、最適投与量は、気管内注射で投与するときの最適量とは異なる。このように投与経路に応じて、量を変化させることは当業者にとって可能である。本発明に係る蛋白質の適当量とは、動物にとって有毒でなく、所望の機能を発揮する量であるということに留意することが重要である。
【００７６】
本願発明の好適な態様において、チオレドキシン反応部位を含む蛋白質を含む本発明に係る組成物は、蛋白質のチオレドキシン活性部位を還元状態に維持または還元する還元系を含む一種類以上の薬剤とともにさらに調剤される。好適には、このような薬剤には、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（ＮＡＤＰＨ）、および／またはチオレドキシンレダクターゼなどがあるが、ＮＡＤＰＨとの調剤が特に好適である。本発明者は、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドとともに還元系が存在すると、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質が、本発明に係る方法において機能する能力が高まること（例えば、粘液または痰の液状化を増進すること）を発見した。さらに、本発明者は、還元系としては、ＮＡＤＰＨを含めば十分であり、そのため、この還元系にチオレドキシンレダクターゼは必要ではないが、所望の場合には含むこともできるということを発見した。本発明において他の還元系を用いることもでき、ＮＡＤＨ−依存型チオレドキシンレダクターゼ、リポ酸、および他の生物レダクターゼなどが含まれる。一般的には、本発明者は、還元当量の由来原である、たぶんＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨが、最適な治療効果を得るための、本発明に係る組成物の重要な成分であると考える。しかし、還元当量を（ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨからのＨ＋）、チオレドキシンまたはチオレドキシン活性部位を含む分子に移行させる仲介機能に役立つ付加的成分も使用することができる。
【００７７】
ＮＡＤＰＨが本発明に係る組成物に含まれるときには、ＮＡＤＰＨの表面濃度が約０．５μＭから約２０ｍＭになるよう調剤するのが好適であり、より好適には、ＮＡＤＰＨの表面濃度が約５μＭから約２ｍＭになるよう調剤し、さらにより好適には、ＮＡＤＰＨの表面濃度が約５０μＭから約２００μＭになるよう調剤する。別の態様において、組成物は、適当量のＮＡＤＰＨ、好適には、ＮＡＤＰＨの表面濃度が約０．５μＭから約２０ｍＭになるよう、０．１μＭの増し分（すなわち、０．５μＭ、０．６μＭ、…１９．９μＭ、２０μＭ）で調剤することができる。「なった表面濃度」とは、ＮＡＤＰＨなど、具体的な化学物質の濃度であって、細胞または組織の表面、例えば、肺上皮内壁の表面において達成または存在する濃度のことである。したがって、所定の表面濃度にならせるためには、実際には、具体的な化学物質をより高い濃度で投与する必要があろう。当業者は、このような濃度を適宜決定しえる。チオレドキシンレダクターゼを本発明に係る組成物に含むとき、チオレドキシンレダクターゼの表面濃度が、約０．００１μＭから約１μＭまでになるよう調剤するのが好適であり、より好適には、チオレドキシンレダクターゼの表面濃度が約０．００１μＭから約０．１μＭまでになるよう、０．００１μＭずつの増し分で約０．０００１μＭから約１μＭまでの量を含む量に調剤する。一つの態様において、本発明に係る組成物にチオレドキシンレダクターゼを含ませることが必要である。このような量のチオレドキシンレダクターゼおよび／またはＮＡＤＰＨを、当業者が、チオレドキシン活性部位の還元状態を維持または促進するために、このチオレドキシン活性部位または送達方式を含む蛋白質またはペプチドの量が指示するように修飾することは、本発明の範囲内である。
【００７８】
上記検討したように、本発明に係る組成物は、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を減少させるか、そのような粘液または痰の液状化を増進させるために使用することができる他の化合物など、一種類以上の付加的化合物を含むことができる。このような化合物の例は、当技術分野において既知であり、精製されたｒｈＤＮａｓｅ、Ｎ−アセチルシステイン、ナシステリン（Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの誘導体）、およびゲルソリンなどがある。
【００７９】
上記検討したように、本発明に係る組成物は、該組成物、特に、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子、および／または該組成物に含まれる他の化合物を標的部位（例えば、蛋白質および化合物については、処理すべき粘液または痰、組換え核酸分子については、処理すべき粘液または痰という環境に入れられる、またはその中に存在する標的宿主細胞）に送達するのに効果的な方法で患者に投与される。適当な投薬プロトコールには、インビボまたはエクスビボでの投薬プロトコールが含まれる。
【００８０】
本発明によれば、効果的な投薬プロトコール（すなわち、本発明に係る組成物を効果的な方法で投与すること）は、組成物に含まれる、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質および／または他の化合物を、処理すべき粘液または痰に接触させるのに適当な、または、患者の所望の宿主細胞において、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質をコードする組換え核酸分子のトランスフェクションまたは発現をもたらすのに適当な投薬量パラメーターおよび投薬方式を含み、その結果、好適には、このような投与から、患者は、測定可能、観察可能または感受できる恩恵を得る。状況によっては、患者から粘液または痰をサンプリングして、本明細書で論じた、粘液または痰の粘性または液状化を評価する方法を用いて、効果的な投薬量パラメーターを決定することができる。あるいは、インビトロの試料、インビボの動物モデル、および、患者がヒトであるときは、最終的には臨床試験を用いた実験によって効果的な投薬量パラメーターを決定することができる。具体的な病気または症状に対して、当技術分野で標準的な方法を用いて投薬量パラメーターを決定することができる。このような方法は、例えば、生存率、副作用（すなわち毒性）、および病気の進行および退行を測定することが含まれる。
【００８１】
本発明によれば、本発明に係る組成物を患者に投与するのに適した方法には、組成物を、患者の体内の所望の部位に送達するのに適したインビボ投与経路が含まれる。好適な投与経路は当業者にとって明らかであるが、化合物が蛋白質、核酸、または他の化合物（例えば薬物）のいずれであるかに応じて、身体のどの部位に組成物を投与するかによって、また、患者が患っている病気や症状に応じて異なる。通常、インビボ投与法には、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内投与（例えば、頸動脈内）、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、脳室内投与、吸入（例えばエアロゾル）、脳内、経鼻、経口、肺投与、カテーテルの注入、および組織への直接注射などがある。経耳到達には、点耳薬などが含まれ、鼻腔内送達には、点鼻薬または鼻腔内注射などがあり、また、眼内送達には、点眼薬などがある。エアロゾルの（吸入）送達は、当技術分野で標準的な方法を用いて行うこともできる（例えば、その全文が参考文献として本明細書に組み入れられるＳｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７−１１２８１，１９９２を参照）。経口送達は、例えば、錠剤またはカプセルとして、また、食品および飲料に処方されているものなど、口から取り込むことができる固体および液体などがある。粘膜組織にとって有用な他の投与経路には、気管支、皮内、筋肉内、鼻腔内、他の吸入経路、直腸、皮下、局所、経皮、膣、経頸管、頸管周囲（ｐｅｒｉｃｅｒｖｉｃａｌ）および尿道などの経路が含まれる。さらに、投薬プロトコールは、不妊などへの適用に使用するために、ペッサリーに入れた蛋白質、ペプチド、または組成物を（例えば、頸管への）適用するなど、前治療用装置を含むこともある。本発明の好適な態様において、本発明に係る蛋白質または組成物を、呼吸管（気道）内にある過剰または異常に粘性または粘着性の痰または粘液を処理するために投与する場合には、チオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチド（または組成物）、またはその他の化合物は、吸入（すなわち、例えば、界面活性剤の中の、またはそれとともにエアロゾルを吸入する）、気管支鏡、気管内チューブおよび／または人工的な換気装置による肺内への直接設置、鼻への投与（鼻腔内または経鼻）、気管支、または気管内（すなわち、気管の中に直接注射するか、気管開口）、直接的、もしくは脂質カプセル化または界面活性剤のいずれかによるなどの経路によって投与される。組成物または蛋白質を気道に導入して、そこに存在する粘液または痰に接触できるようにする方法で考えられるものが、本発明に包含される。
【００８２】
本明細書に開示されているさまざまな投与方法および送達媒体が、標的細胞に核酸分子を送達し、核酸分子が細胞をトランスフェクションして発現されるのに効果的であることが分かっている。多くの研究で、好適な細胞型において、および／または、好適な送達媒体、および本発明に係る投与方法を用いて、異種性遺伝子の送達と発現に成功している。
【００８３】
例えば、リポソーム送達法を用いて、１９９８年１月６日にＤｏｗらに発行された米国特許第５，７０５，１５１号は、カチオン性リポソーム送達媒体に入れたスーパー抗原をコードする核酸およびサイトカインをコードする核酸分子を、インビボで静脈内送達して、動物の組織の中、具体的には、肺組織において、コードされた蛋白質を発現させることに成功したことを明らかにした。さらに、Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１６７，１９９７は、遺伝子を含むコレステロール含有カチオン性リポソームの静脈内送達が、選択的に肺組織を標的として、該遺伝子のインビボで移動および発現を効果的にもたらすことを明らかにした。Ｄｚａｕとその共同研究者らによるいくつかの刊行物は、裸のＤＮＡおよびセンダイウイルス−リポソーム送達法を用いて、心膜内でのインキュベーションおよび冠動脈への注入（冠動脈内送達）の両方による投与によって、心臓の筋細胞および線維芽細胞、および血管平滑筋細胞などの心臓の細胞への遺伝子のインビボ送達と発現に成功したことを明らかにしている（例えば、Ａｏｋｉら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２９：９４９−９５９；Ｋａｎｅｄａら、１９９７，Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１１：２９９−３０８；およびｖｏｎ ｄｅｒ Ｌｅｙｅｎら、１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１３７−１１４１参照）。
【００８４】
数多くの核酸配列の送達が、その核酸配列をコードするウイルスベクターを投与して行われてきた。このようなベクターを用い、エクスビボ送達（多くの実例のうち、レトロウイルスについて、Ｂｌａｅｓｅら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０；Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７０−４７５参照）、鼻への投与（ＣＦＴＲ−アデノウイルス随伴ベクター）、冠動脈内投与（アデノウイルスベクターおよびセンダイウイルス、上記参照）、静脈内投与（アデノ随伴ウイルスベクター、Ｋｏｅｂｅｒｌら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１４２６−１４３１）を用いて、送達および発現に成功している。Ｍａｕｒｉｃｅらによる刊行物（１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：２１−２９）は、冠状動脈内送達によって投与されたβ２−アドレナリン作用性レセプターをコードするアデノウイルスベクターが、インビボでの複数の心室における心筋での広範な発現（ｄｉｆｆｕｓｅ ｍｕｌｔｉｃｈａｍｂｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）をもたらし、その後、血行力学的作用の有意な増進およびその他の生理学的パラメーターの改善がもたらされたことを明らかにした。Ｌｅｖｉｎｅらは、アデノウイルスベクター、および脂肪組織の中へのコンストラクトの直接注射法を用いた、ヒト脂肪細胞およびウサギ脂肪細胞へのインビトロ、エクスビボ、およびインビボにおける遺伝子の送達および発現について記載している（Ｌｅｖｉｎｅら、１９９８，Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．４４：５６９−５７２）。
【００８５】
神経細胞における遺伝子送達領域では、インビボにおける遺伝子移行に成功したことが複数報告されている。Ｍｉｌｌｅｃａｍｐｓらは、導入遺伝子のプロモーター（ホスホグリセリン酸プロモーター）の上流に設置した神経選択的エンハンサー因子（ｎｅｕｒｏｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を用いて、アデノウイルスベクターに神経細胞を標的させたことを報告している。このようなベクターを、マウスおよびラットのそれぞれ筋肉内および脳内に投与して、導入遺伝子をインビボで神経細胞特異的にトランスフェクションし発現させることに成功した（Ｍｉｌｌｅｃａｍｐｓら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：８６５−８６９）。上記で検討したように、Ｂｅｎｎｅｔｔらは、アデノ随伴ウイルスベクターを用いて、網膜下注射により、遺伝子を神経網膜にインビボで送達し、一年よりも長い期間発現させたことを報告した（Ｂｅｎｎｅｔｔ，１９９９、同書）。
【００８６】
滑膜の内壁細胞および関節への遺伝子送達にも同様に成功している。Ｏｌｉｇｉｎｏらのチームは、前初期遺伝子であるＩＣＰ４、２２および２７に欠損をもつ単純ヘルペスウイルスベクターを用いて、２種類の異なったレセプターを、インビボで滑膜の内壁細胞に送達および発現したことを報告している（Ｏｌｉｇｉｎｏら、１９９９、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１７１３−１７２０）。これらのヘルペスベクターは、関節内注射によって投与された。Ｋｕｂｏｋｉらは、アデノウイルスベクターによる遺伝子導入法と関節内注射を用いて、インビボでモルモットの顎関節において遺伝子を特異的に発現させることに成功した（Ｋｕｂｏｋｉら、１９９９、Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ．Ｂｉｏｌ．４４：７０１−７０９）。Ａｐｐａｒａｉｌｌｙらのチームは、ＩＬ−１０をコードするアデノウイルスベクターをマウスに全身投与して、遺伝子産物の発現に成功したこと、および実験的に誘発された関節炎の治療に非常に大きな治療効果があったことを明らかにした（Ａｐｐａｒａｉｌｌｙら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５２１３−５２２０）。別の研究では、マウス白血病ウイルスを利用したレトロウイルスベクターを用いて、エクスビボおよびインビボで、ヒト成長ホルモン遺伝子を送達（関節内注射によって）および発現させた（Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉら、１９９７、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：９７７−９８２）。この研究は、インビボでの遺伝子導入による発現が、エクスビボ遺伝子導入による発現と少なくとも同等であることを明らかにした。上記で検討したように、Ｓａｗｃｈｕｋらは、関節内注射によって、アデノウイルスベクターによる遺伝子のインビボでの送達に成功したこと、および、抗Ｔ細胞レセプターモノクローナル抗体で関節を前処理することによって、遺伝子を滑膜内で長時間発現させたことを報告している（Ｓａｗｃｈｕｋら、１９９６、同書）。最後に、レトロウイルスを用いた、ヒトインターロイキン−１レセプターアンタゴニストのエクスビボでの遺伝子導入によって、関節炎の治療において高レベルの関節内発現と治療効果が得られ、現在、ＦＤＡが認可するヒトの遺伝子治療試験に加えられていることに注目すべきである（ＥｖａｎｓとＲｏｂｂｉｎｓ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．８：２３０−２３４）。したがって、遺伝子治療における最新技術は、ヒトの遺伝子治療が、少なくとも関節炎の治療にとっては適当な方法であるとＦＤＡに考えさせるようになっている。まとめると、遺伝子治療における上記研究のすべてが、本発明に係る組換え核酸分子の送達および発現が実現可能であることを示している。
【００８７】
組換え分子を送達する別法は、非標的指向型担体（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃａｒｒｉｅｒ）である（例えば、Ｗｏｌｆｆら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１４６５−１４６８で教示されているような「裸」のＤＮＡなど）。このような組換え核酸分子は、一般的には、直接投与または筋内投与によって注射される。裸のＤＮＡ投与法によって投与される組換え核酸分子には、本発明に係る単離核酸分子などがあり、好適には、本発明に係る組換え分子であって、好適には、複製、または、さもなければ増幅する能力をもつ分子を含む。本発明に係る裸の核酸試薬は、ジシストロニックな組換え分子を含む、一種類以上の核酸分子を含むことができる。裸の核酸の送達は、筋肉内、皮下、皮内、経皮、鼻腔内、および経口という投与経路を含むが、標的組織への直接注射が最も好適である。裸の核酸ワクチンの好適な一回用量は、当業者が決定しうるが、投与経路および／または送達方法に応じて、約１ナノグラム（ｎｇ）から約１００μｇの範囲にある。適当な送達方法には、例えば、注射による、エアロゾル化されるおよび／または局所的に点薬とするなどがある。一つの態様において、精製されたＤＮＡコンストラクトは、金粒子（直径１〜３μｍ）の表面を覆い、「遺伝子銃」によって、皮膚細胞または筋肉の中に突き進んで行く。
【００８８】
本発明に係る方法において、治療用組成物は、霊長類、げっ歯類、家畜類、および家庭用ペットなど、脊椎動物の仲間である哺乳動物のメンバーに投与することができる。防御するのに好適な患者はヒトである。
【００８９】
以下の実施例は、例示目的で提示されるものであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００９０】
（実施例）
下記の実施例１〜６において、以下の材料と方法を用いた。
【００９１】
試薬および材料：凍結乾燥された組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴｒｘをＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から入手した。大腸菌ＴＲは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）から入手した。β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型（ＮＡＤＰＨ）、還元型ＧＳＨ、グルタチオンレダクターゼ、ジチオスレイトール、ジソプロピルフルロホスフェート（ｄｉｓｏｐｒｏｐｙｌｆｌｕｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アプロチニン、Ｎ−エチルマレイミド、シッフ試薬、サケ精子ＤＮＡ、およびヘキスト染料はすべてＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。Ｎ−アセチルシステインは、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から入手した。他の化学薬品はすべて、最高の等級のものであった。
【００９２】
痰の採集：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｅｗｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）およびＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ （Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ） においてＣＦを患う成人および小児の患者から痰を採取した。２つの別々のピロカルピンイオン導入発汗試験において、汗クロール値が６０ ｍＭを超え、その後の遺伝子解析において、２つの対立遺伝子がＣＦ−産生変異を示した患者をＣＦと診断した。すべての試料は、自発的喀痰によるか、または、高張食塩水による誘発によって提供された。唾液が含まれていることが目視によって検出できたときには、その痰試料は廃棄した。喀痰後、試料は、使用時まで−８０℃で保存した。痰の採集プロトコール、データ収集、および同意／受諾書式は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＯＭＩＲＢ）および提携病院の承認を得た。
【００９３】
コンパクションアッセイ法：−８０℃で保存したＣＦ痰を室温で融解して、ポジティブ・ディスプレイスメント・ピペット（Ｒａｉｎｉｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を用いて、１．５ｍｌエッペンドルフチューブの中に２７５μｌの容量で当量液とした。痰試料には、適当なモル濃度の各試薬を含む２５μｌのＨ２Ｏを加えて、希釈剤（Ｈ２Ｏ）、Ｔｒｘ＋ＴＲ＋ＮＡＤＰＨ、ＧＳＨ＋グルタチオンレダクターゼ＋ＮＡＤＰＨ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはＮ−アセチルシステインのいずれかによる処理を行った。短時間（〜１秒間）撹拌した後、試料入りチューブを微量チューブ用ロティセリー（ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ， Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ）に載せ、３７℃で２０分間インキュベーションした。そして、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １６：５５３−５５８，１９９５）によって始められた方法に従ってコンパクションアッセイのために試料を処理した。このアッセイ法を行うために、各試料の内容物を、ぴったりと嵌るよう予め２００μｌのピペットチップに溶接してある、１００μｌのガラス製マイクロキャピラリーチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の中に装填した。各痰試料の９０％を上回る量を引き出すために３本の改造キャピラリーチューブを使用した。そして、キャピラリーチューブをピペットチップから取り出し、粘土で密封して、ヘマトクリット遠心機（ＩＥＣ、Ｎｅｅｄｈａｍ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＡ）で１０分間遠心分離した後、各チューブのゲル（固体）相および水（液体）相の長さをミリメートル単位で測定した。水相の長さを全体の長さ（ゲル相＋水相）で割り、１００を掛けて、各キャピラリーチューブの液体画分の割合を計算した。次に、各試料から得られた液体画分の３つの測定結果（％）を平均して、処理条件ごとに単一の値を算出した。
【００９４】
磁気マイクロレオメーター：Ｋｉｎｇ（Ｋｉｎｇ Ｍ．，Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｍｉｃｒｏｒｈｅｏｍｅｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ Ｍｕｃｏｌｏｇｙより、Ｂｒａｇａ ＰＣおよびＡｌｌｅｇｒａ Ｌ．編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８８，ｐ．７３−８３）によって開発された磁気マイクロレオメーターを用いて、処理に応じた粘弾性の変化を測定した。８０〜１２０μｍの鋼鉄製の球を１０ ｍｇの痰試料の中に入れた。電磁石を用いて、この球を振動させ、その画像を、顕微鏡を介して一対のフォトセル（ｐｈｏｔｏｃｅｌｌ）に映し出した。粘液は、この球の動きを遅れさせるため、磁石の駆動力に対して球の動きをプロットすることによって、オシロスコープ上でこの効果を明らかにし、そこからＧ＊を測定した。Ｇ＊は、粘性および弾性の機械インピーダンス（ｉｍｐｅｄａｎｃｅ）またはベクトルの和であった。ＴｒｘおよびＮＡＤＰＨの用量反応実験のために、いずれの処理をする前にも１０ ｒａｄ／ｓにおけるｌｏｇ Ｇ＊を測定し（基準値）、次に、還元系を用いて、未処理、希釈剤（Ｈ２Ｏ）またはＴｒｘと２０分間インキュベーションした後に測定した。すべての処理は、試料の全容量の１０％に相当する容量のＨ２Ｏに入れた試料の中で行った。試料の等量液ごとに一回の測定を行った。
【００９５】
痰からの糖蛋白質抽出：痰からの可溶性糖蛋白質の抽出を、Ｄａｖｉｅｓら（ＤａｖｉｅｓとＣａｒｌｓｔｅｄｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２５：３−１３，２０００）によって概説されている方法によって行った。２７５μｌのＣＦ痰を２５μｌのＨ２Ｏのみ、または、Ｔｒｘ（１０または３０μＭ）＋ＮＡＤＰＨ（２ｍＭ）およびＴＲ（０．１μＭ）を含むＨ２Ｏによって、３７℃で２０分間処理した。処理後、１ｍＭのジソプロピルフルロホスフェートおよび１０μｇｍｌのアプロチニンを含む１００μｌのＨ２Ｏを各試料に加えてから、４℃、２２，０００ｇで１５分間遠心分離した。各試料の得られた上清（水相）を新しいチューブに移して、−２０℃で保存した。各試料の残った固体ゲル部分は、２５０μｌのグアニジウム抽出バッファー（６Ｍ 塩化グアニジウム；５ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．５；１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド；１００μＭジソプロピルフルロホスフェート；および１μｇ／ｍｌアプロチニン）存在下で、ピペットチップを用いて、注意深くチューブの底から取り出し、４℃で１４時間回転させた。遠心分離してから、このゲル相抽出から得られた上清をきれいなチューブに移し入れて、電気泳動を行う時まで−２０℃で凍結した。
【００９６】
糖蛋白質含量の解析：水相およびゲル相の試料の糖蛋白質の含有量を、Ｔｈｏｒｎｔｏｎらによって概説された方法（Ｔｈｏｒｎｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２５：７７−８５，２０００）に従って、過ヨウ酸シッフ試薬（ＰＡＳ）による染色によって評価した。水相およびゲル相の試料を融解し、それぞれ８０μｌ等量液を、Ｂｉｏｍａｘ水平式電気泳動装置（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）の中に格納された１．０％アガロースゲル（１５０ｍｍ×１２５ｍｍ）上にロードした。電気泳動用試薬は以下の通りである。電気泳動用バッファー：４０ｍＭトリス−酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０、０．１％ＳＤＳ；サンプル・ローディングバッファー：６０％電気泳動用バッファー、４０％グリセロール（ｖ／ｖ）および０．００５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー。移動用溶液として０．６Ｍ ＮａＣｌ，６０ｍＭクエン酸ナトリウムを用い、バキュームブロッター（Ｂｏｅｃｋｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆｅａｓｔｅｒｖｉｌｌｅ，ＰＡ）によって、ゲル内容物をポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた。移動後、水を３回換えて膜を洗浄し、２００ｍｌの１％過ヨウ酸（ｖ／ｖ）３％酢酸（ｖ／ｖ）溶液に、室温で３０分間移した。そして、この膜を、１ｍＭ ＨＣｌ中０．１％ナトリウム・メタブサルファイト（ｍｅｔａｂｓａｌｆｉｔｅ）で２回洗浄し、シッフ試薬の中に６分間置いた。
【００９７】
全ＤＮＡ含量の測定：２７５μｌのＣＦ痰を、未処理、２５μｌのＨ２Ｏ、またはＴｒｘ（３０μＭ）＋ＴＲ（０．１μＭ）およびＮＡＤＰＨ（２ｍＭ）を含む２５μｌのＨ２Ｏとともにインキュベートした。３７℃で２０分間インキュベーションした後、１００μｌのＨ２Ｏを各試料に加えてから、１０分間遠心分離（２２，０００ｘ ｇ）した。得られたゲル相および液相を分離して、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、および１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫからなる等量の分解溶液と、５０℃で４時間インキュベートした。フェノール／クロロフォルム抽出によって、液相およびゲル相からＤＮＡを精製し、１００μｌのＴＥバッファー、ｐＨ８．０に再懸濁した。Ｆ−２０００分光蛍光光度計（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）を用いて、５７５ｎＭの励起波長と５５５ｎｍの発光波長で、ヘキストアッセイ法（ＬａｂａｒｃａとＰａｉｇｅｎ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １０２：３４４−３５２，１９８０）によってＤＮＡ濃度を測定した。ＴＥバッファーに溶解したサケ精子ＤＮＡを用いて、標準曲線を定めた。
【００９８】
統計学：図中のデータは、平均値±標準偏差で表されている。ただし、図４Ａと４Ｂは、標準誤差を示している。線形混合効果モデル法を用いて、痰試料の液状化、粘弾性、およびＤＮＡ可溶性に対する処理の効果を解析した。単一の対照に対して複数の処理を比較するときには、ダネット補正を適用した。線形モデルで計算したクラス内相関係数によって、コンパクションアッセイの再現性を評価した。ＳＡＳバージョン８．２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて、すべての解析を行った。有意性をｐ＜０．０５と定義した。
【００９９】
（実施例１）
以下の実施例では、ＣＦ痰からの液体放出に対するＴｒｘ還元系の効果を説明する。
【０１００】
ＣＦＴＲ遺伝子の欠陥によって起こる異常なイオン輸送によって、ＣＦ患者の気道分泌物はしばしば乾燥している。その結果、膿状のＣＦ痰は、大部分が、しばしばゲル相と呼ばれる、硬くて非流動性の生体高分子のマトリックス、および、より少ない量の可溶性の液相からなる。痰における、これら２つの相の割合に対するＴｒｘの効果を評価するために、コンパクションアッセイによる測定を行った。最初の実験では、等量の痰試料を、０、１、１０、または３０μＭのＴｒｘ；０．１μＭ ＴＲ；および２ｍＭ ＮＡＤＰＨ（最終濃度）を含む２５μｌのＨ２Ｏで処理した。２０分間インキュベートした後、コンパクションアッセイによって、各試料の液体画分を測定した。
【０１０１】
液相に存在するＣＦ痰の平均（±ＳＤ）割合は、Ｔｒｘ曝露する前は３．５±２．９％であった（図１Ａ；数値は、５回の独立実験から得られた平均値である。＊Ｈ２Ｏ被曝試料に対してＰ＜０．０５）。痰の１０％に相当する希釈剤（Ｈ２Ｏ）で処理した等量液は、液相に存在する痰の割合に僅かで非有意な増加（６．２±６．６％）を示した。これに対し、ＣＦ痰の液相は、Ｔｒｘ還元系（Ｔｒｘ＋０．１μＭ ＴＲ、および２ｍＭ ＮＡＤＰＨ）で処理した後に有意に増加した。Ｔｒｘ（１μＭ）で痰を処理すると、痰の液体画分は、３７．８±１５．４％まで増加した。液体画分が最高に増加したのは、より高いＴｒｘ濃度（３０μＭ）でインキュベートした試料であった（７４．５±１５．６％）。
【０１０２】
ＮＡＤＰＨの効果を調べるために、別のドナーからさらなる試料を得て、３０μＭのＴｒｘ、０．１μＭ ＴＲ、および０、０．２、０．６、１．０または２ｍＭのＮＡＤＰＨで２０分間処理した。ＮＡＤＰＨなしでＴｒｘとＴＲで処理した試料では、液相に存在する痰の割合は低かった（２．９±１．３％）。ＮＡＤＰＨで処理した等量液は、用量依存的な液相の増加を示し、２ｍＭで最大の増加（７０．５５±１８．１３％）が起きた（図１Ｂ）。Ｔｒｘ不在下でＮＡＤＰＨによって痰を処理すると、液相に存在する痰の割合の増加は起きなかった（図なし）。
【０１０３】
（実施例２）
以下の実施例では、実施例１のコンパクションアッセイによる測定結果の再現性を明らかにする。
【０１０４】
コンパクションアッセイによる測定結果の再現性を評価するために、３人の別々のＣＦドナーから痰試料を分離して等量液にして凍結した。すなわち、３人の異なったドナー（Ａ、Ｂ、Ｃ）から単離されたばかりのＣＦ痰を２７５μｌの等量液に分けて凍結した。融解した後、等量液を未処理のままか、または、Ｈ２Ｏ、１０μＭ Ｔｒｘ（＋０．１μＭ ＴＲおよび２ｍＭ ＮＡＤＰＨ）、もしくはジチオスレイトール（ＤＴＴ、１または５ｍＭ）で２０分間インキュベートし、コンパクションアッセイ法で液体の割合を測定した。各ドナー試料について３回の独立実験を行って得られた結果を用いて、アッセイ法の再現性を評価した。３日間連続して、等量液を融解し、水、Ｔｒｘおよびその還元系、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理するか、未処理のままにした。
【０１０５】
図２に示すように、添加なし、または希釈液（Ｈ２Ｏ）で処理された、ドナーＡからの等量液は、その全量の１０％よりも少ない液相画分を有していた。ドナーＡからの痰の等量液をＤＴＴ（１ｍＭまたは５ｍＭ）、または還元系とともにＴｒｘ（３０μＭ）で処理すると、これら試料の液体画分が全試料容量の９０％よりも多くなった。ドナーＡからの痰試料の液体画分のこれらの比率の値は、その後の独立実験における第二および第三の測定値についても、同一の処理によっては、感知できる程度に変動することはなかった。ＴｒｘまたはＤＴＴ被曝に応じて、ドナーＢおよびＣの試料で起きた変化の程度は、ドナーＡの痰試料で起きた変化よりは範囲が狭かったが、対照と比べれば有意に違っていた。ドナーＣ由来の試料について、薬剤処理した後の液体状態で存在する痰の割合の３日間での変動範囲は以下の通りである。１ｍＭ ＤＴＴ―２４〜３１％；５ｍＭ ＤＴＴ―４２〜５７％、３０μＭ Ｔｒｘ―４６〜５１％。ドナーＢ由来の試料について、液体の割合値の範囲は以下の通りである。１ｍＭ ＤＴＴ―５７〜６１％；５ｍＭ ＤＴＴ―７７〜７９％、３０μＭ Ｔｒｘ―６２〜８１％。これらの結果は、コンパクションアッセイ法が、痰試料の不均質なグループにおいて、薬剤誘導による液状化を測定するための方法として用いることができると認められるほどの試料内再現性を示すことを明らかにしている。
【０１０６】
（実施例３）
以下の実施例では、Ｔｒｘが、グルタチオンまたはＮ−アセチルシステインよりも強力な痰液状化剤であることを明らかにする。
【０１０７】
痰の液状化におけるＴｒｘの効果を、他のモノチオールおよびジチオール還元剤と比較した。痰試料を等量液にして、ＴｒｘまたはＧＳＨで２０分間処理して、コンパクションアッセイ法によって液体の割合を測定した。最初のコンパクションアッセイ実験では、等モル濃度のＮＡＤＰＨ存在下で、痰の液状化におけるＴｒｘとＧＳＨの還元系の効力を比較した。対照（添加なし）と比較して、１０、３０、または６０μＭのＴｒｘで処理した痰では、液体画分の割合が連続的かつ有意に増加するのが観察された（図３Ａ）。これに対して、ＧＳＨを同じまたはそれよりも高い１ｍＭまでの濃度に曝露しても、痰の液体画分の有意な増加は見られなかった。別の研究では、Ｎ−アセチルシステインを一定の濃度範囲（図３Ｂ）で使用しても、痰の液状化をもたらす効果はＴｒｘより低いことが観察された。図３Ａおよび３Ｂについて、実際に示された割合は以下の通りである。未処理＝２．７±２．３％；Ｈ２Ｏ＝４．５±２．７％；１０μＭ Ｔｒｘ＝３４．８±６．６％；３０μＭ Ｔｒｘ＝５４．６±１０．４％；６０μＭ Ｔｒｘ＝６７．０±８．０％；３０μＭ ＧＳＨ＝７．８±５．７％；１００μＭ ＧＳＨ＝１５．９±９．３％；１ｍＭ ＧＳＨ＝２７．６±３．９％。ＴｒｘとＮＡＣの有効性の解析も、別の痰試料セットで、２０分間インキュベーションした後に測定された。数値は、５回（ＧＳＨ）または４回（ＮＡＣ）の実験の平均値である（＊未処理に対しＰ＜０．０５）。
【０１０８】
（実施例４）
以下の実施例では、痰の粘弾性に対するＴｒｘ還元系の効果を示す。
【０１０９】
磁気マイクロレオメトリーを行って、痰の粘性に対するＴｒｘとその還元系の効果を測定した。Ｔｒｘ還元系とインキュベートした前後に痰試料の測定を行って（表１）、ｌｏｇ Ｇ＊（粘性）の変化を判定した。
【０１１０】
（表１）
未処理、Ｈ２Ｏ、またはチオレドキシンに曝露したＣＦ痰の粘弾性データ（ｌｏｇ Ｇ＊）
【０１１１】
【表１】
ＣＦ痰の等量液を、未処理、Ｈ２Ｏ、またはＴｒｘ＋還元系（０．１μＭ ＴＲおよび２μＭ ＮＡＤＰＨ）とともに、３７℃で２０分間インキュベートした。データはすべて、４つの試料に対するｌｏｇ Ｇ＊（平均値±標準誤差）で示されている。
【０１１２】
図４Ａに示した実験では、ＣＦ痰試料をＨ２Ｏ、または３、１０、または３０μＭのＴｒｘ＋０．１μＭ ＴＲおよび２μＭ ＮＡＤＰＨとともに２０分間インキュベートし、磁気マイクロレオメトリーによってｌｏｇ Ｇ＊を測定した。データは、曝露する前後に記録したｌｏｇ Ｇ＊測定値の違いとして示されている（Ｙ軸に示される）。各列は、４つの試料についての平均値±標準誤差を示す（黒菱形Ｈ２Ｏ希釈値から統計的に有意）。痰を希釈剤（Ｈ２Ｏ）で２０分間インキュベートすると、前処理のときの値と比べて、ｌｏｇ Ｇ＊が僅かに下降した（０．１１ｌｏｇユニット）。Ｔｒｘ（３μＭ）、ＴＲ（０．１μＭ）およびＮＡＤＰＨ（２ｍＭ）に曝露すると、希釈剤だけで処理した場合に比べて、ｌｏｇ Ｇ＊の有意な減少（０．２６ｌｏｇユニット）が起きた（図４Ａ）。より高い濃度のＴｒｘに曝露された試料において、より実質的な低下（それぞれ、１０μＭのＴｒｘで０．３９ｌｏｇユニットの減少、また、３０μＭのＴｒｘで０．６５ｌｏｇユニットの減少）が明白になった。
【０１１３】
さまざまな濃度のＮＡＤＰＨの効果も調べた（図４Ｂ；Ｈ２Ｏ、または１０μＭ Ｔｒｘ、０．１μＭ ＴＲおよび０．２、０．６、または２ｍＭ ＮＡＤＰＨとのインキュベーション後におけるｌｏｇ Ｇ＊の変化）。Ｔｒｘ（３０μＭ）、ＴＲ（０．１μＭ）、および低濃度のＮＡＤＰＨ（０．２ｍＭ）に曝露された痰は、粘弾性の僅かな低下を示した（０．１６ｌｏｇユニット）。より高いＮＡＤＰＨ濃度、０．６ｍＭ（０．２６ｌｏｇユニット）および２ｍＭ（０．３９ｌｏｇユニット）に曝露すると、粘弾性のさらなる低下が起き、これは、痰の粘弾性をＴｒｘによって低下させる上で、還元当量を提供することの重要性を示している。
【０１１４】
（実施例５）
以下の実施例では、痰の糖蛋白質の可溶性に対するＴｒｘの効果を説明する。
【０１１５】
ムチン糖蛋白質重合体上のジスルフィド結合は、Ｔｒｘによる還元の標的である可能性がある。痰に存在する糖蛋白質に対するＴｒｘの効果を調べるために、痰の等量液をＨ２Ｏ、または１０、または３０μＭのＴｒｘとその還元系で２０分間インキュベートし、遠心分離によって水性画分（Ａｑ）とゲル画分に分離した。各不溶性ゲル画分は、さらに、グアニジウム（Ｇ）で１４時間処理した。処理後、各試料の得られた可溶相と不溶相を分離して、過ヨウ酸／シッフ試薬（ＰＡＳ）染色によって糖蛋白質含量について解析した。具体的には、材料と方法のところで説明したように、画分をロードして、１％アガロース（ｗ／ｖ）中で電気泳動を行い、ＰＶＤＦ膜に移動させ、過ヨウ酸／シッフ試薬で染色した。図５に関しては、分子量基準が離れた右側のレーンに示されている。結果は、３回の独立した実験の代表的なものである。
【０１１６】
図５に示すように、希釈剤で処理された痰の可溶画分およびゲル画分ともに、高分子量糖蛋白質の不連続な集団が検出された。これに対して、１０または３０μＭのＴｒｘで処理された痰から得られた両相において、ＰＡＳ反応性糖蛋白質の量が増加することが明らかとなった。これらの試料を処理する過程で、希釈剤で処理された痰からのゲル相マトリックスは、一晩グアニジウム処理したにもかかわらず、高度の不溶性を保持することが観察された。この不溶性が、希釈剤で処理した痰およびＴｒｘで処理した痰からのゲル相のレーンにおいて見られた糖蛋白質量の量的な違いの理由である可能性が高い。量が増えることに加えて、Ｔｒｘに曝露された試料におけるグリコフォームのかなりの割合も、希釈剤で処理された試料に存在するそれらの部分よりも大きな電気泳動移動度を示した。これらの知見は、Ｔｒｘが可溶性を高め、痰の中の糖蛋白質重合体の大きさを減少させることを示唆している。
【０１１７】
（実施例６）
以下の実施例では、痰におけるＤＮＡの可溶性に対するＴｒｘの効果を説明する。
【０１１８】
ＣＦ気道分泌物中に大量の細胞外ＤＮＡが存在すると、ＣＦ痰の過剰な粘弾性の原因となる。Ｔｒｘが、痰におけるＤＮＡの可溶性に対してどのような効果をもつのかを評価するために、痰試料（２７５μｌ）を、無添加、希釈剤（Ｈ２Ｏ）、またはＴｒｘ（３０μＭ）＋還元系のいずれかとともに、２０分間インキュベートしてから、ゲル（不溶）相と液（可溶）相に分けた。ヘキストアッセイ法によるＤＮＡ含量の測定によって、未処理の試料中に存在するＤＮＡのほとんどがゲル相中に保持されることが明らかになった（ゲル相＝０．９４±０．２６ｍｇ；液相＝０．０５±０．０３ｍｇ）（図６）。希釈剤処理された試料では、それらの液相における平均ＤＮＡ含量が僅かな増加を示した（ゲル相＝０．８０±０．２４ｍｇ；液相＝０．２１±０．２３ｍｇ）。Ｔｒｘ処理では、ＤＮＡのゲル相から液相へのさらなる移動（ゲル相＝０．５５±０．３１ｍｇ；液相＝０．５７±０．３７ｍｇ）が観察された。図６に関しては、示されているのは、各画分からの平均ＤＮＡ含量±Ｓ．Ｄ．である（ｎ＝５回実験）（＊未処理の可溶相に対してＰ＜０．０５）。
【０１１９】
（実施例７）
以下の実施例では、過剰に粘性または粘着性の粘液または痰をもつ患者を、本発明に係る治療用組成物で治療することにについて説明する。
【０１２０】
４か月齢の女児患者が、低体重；頻繁、大量、かつ悪臭がする油っぽい大便；突き出したお腹；ならびに頻発する咳および喘鳴を示している。この患者は、定量的なピロカルピンイオン導入発汗試験を受けて、嚢胞性線維症と診断される。肺機能テストおよび胸部Ｘ線で診断結果を確認する。この患者は、定期的に評価、および、肺に問題が起こるとそれを予防および治療するなどの治療、十分な栄養補給、および身体活動を施される。１３歳までに、この患者は、成長の停滞、思春期の遅れ、および身体持久力の低下を示し、しばしば、肺感染症、呼吸の苦しさ、および胃腸管の不快感に苦しむ。この患者は、ひどい咳、喘鳴、および肺機能の障害とともに診療室に現れる。
【０１２１】
この患者の気道から採集した痰試料に対してコンパクションアッセイを行い、このアッセイと以前の嚢胞性線維症であるとの診断に基づいて、患者が、気道の中の過剰に粘性および粘着性の粘液による呼吸器疾患を患っていると判定する。肺のこの症状を治療するため、患者に、界面活性剤中、投薬単位あたり約２．５ｍｇのヒトチオレドキシン、および表面濃度約５μＭを達成するのに十分な投与量のＮＡＰＤＨを含む組成物をエアロゾル送達によって投与する。この患者は、引き続き、別のコンパクションアッセイによって、痰の液状化が増進したか、また、肺機能テストによって気道がきれいになったか観察される。上記したような組成物のその後の投与量を、患者の気道がかなりのクリアランスを示し、患者の症状および一般的な健康状態が改善するまでエアロゾルによって毎日投与される。
【０１２２】
本明細書において考察または引用した刊行物およびその他の参考文献は、その全文が、参考文献として本明細書に組み入れられる。
【０１２３】
本出願は、２００２年９月１０日に出願された米国仮出願第６０／４０９，９６０号、および２００３年４月１１日に出願された米国仮出願第６０／４６２，０８２号それぞれからの優先権を主張するものである。米国仮出願第６０／４０９，９６０号および第６０／４６２，０８２号の各々の全開示内容は、参考文献として本明細書に組み入れられる。
【０１２４】
本発明のさまざまな態様が、詳細に説明されているが、これらの態様の変更および適応が生じることは、当業者にとって明らかである。しかし、以下の請求項に示されているように、そのような変更および適応が、本発明の範囲に含まれることをはっきりと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１Ａは、Ｔｒｘ還元系への曝露によるＣＦ痰の液状化は用量依存的であることを示す折れ線グラフである。図１Ｂは、ＴｒｘによるＣＦ痰の液状化はＮＡＤＰＨに依存することを示す折れ線グラフである。
【図２】図２は、コンパクションアッセイ法（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）の再現性の評価を示す折れ線グラフである。
【図３】図３Ａは、Ｔｒｘ還元系（Ｔｒｘ＋０．１μＭ ＴＲ＋２ｍＭ ＮＡＤＰＨ）が、痰の液状化において、グルタチオン還元系（ＧＳＨ＋０．１μＭ Ｇｒ＋２ｍＭ ＮＡＤＰＨ）よりも強力であることを示す図である。図３Ｂは、Ｔｒｘ還元系（Ｔｒｘ＋０．１μＭ ＴＲ＋２ｍＭ ＮＡＤＰＨ）が、痰の液状化において、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）よりも強力であることを示す図である。
【図４】図４Ａは、インビトロにおけるＣＦ痰の粘弾性（ｌｏｇ Ｇ＊）に対するＴｒｘの用量の効果を示している。図４Ｂは、インビトロにおけるＣＦ痰の粘弾性（ｌｏｇ Ｇ＊）に対するＮＡＤＰＨの用量の効果を示している。
【図５】図５は、希釈液またはＴｒｘに曝露した後のＣＦ痰の糖蛋白質の質量プロファイルを示すデジタル画像である。
【図６】図６は、Ｔｒｘ曝露がＣＦ痰内に存在するＤＮＡの可溶性を高めることを示す図である。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を有する患者における粘液または痰の液状化を増進させる方法であって、患者の粘液または痰を、接触させる工程の前と比較して粘液または痰の液状化を増進させるのに効果的な還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを含む組成物と接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
患者が、粘液または痰の異常または過剰な粘性または粘着性が病気の症状または原因である肺疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者が嚢胞性線維症に罹っている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
患者の粘液または痰を組成物と接触させる工程が、鼻、気管内、気管支、肺内への直接設置、および吸入からなる群より選択された経路によって、該組成物を患者に導入して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
接触させる粘液または痰が、患者の気道、胃腸管、または生殖管の中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組成物を薬学的に許容される担体において患者に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
蛋白質またはペプチドが、患者の体重１ｋｇあたり約１．５ｍｍｏｌｅから患者の体重１ｋｇあたり約１５０ｍｍｏｌｅの量で患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
蛋白質が、患者において約５分から約２４時間の半減期を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
患者からの粘液または痰の試料の全量の液相が、組成物を投与した後に統計的に有意な増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃを含み、Ｃ残基が還元状態にあり、かつ、Ｘ残基が任意のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘを含み、Ｃ残基が還元状態にあり、かつ、Ｘ残基が任意のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）を含み、Ｃ残基が還元状態にあり、かつ、Ｘ残基が任意のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｗ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｋ（配列番号：３）を含み、Ｃ残基が還元状態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
蛋白質が、原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物のチオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンからなる群より選択されるチオレドキシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
蛋白質がヒトチオレドキシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
組成物が、蛋白質のチオレドキシン活性部位を還元するために、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（ＮＡＤＰＨ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、チオレドキシンレダクターゼをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
粘液または痰の液状化に使用するための組成物であって、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチド、および過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を治療するための補助剤を少なくとも一つ含む組成物。
【請求項１９】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘを含み、Ｃ残基が還元状態にあり、かつ、Ｘ残基が任意のアミノ酸残基である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）を含み、Ｃ残基が還元状態にあり、かつ、Ｘ残基が任意のアミノ酸残基である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｗ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｋ（配列番号：３）を含み、Ｃ残基が還元状態にある、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
蛋白質が、原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物のチオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンからなる群より選択されるチオレドキシンを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
蛋白質がヒトチオレドキシンを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
組成物が、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（ＮＡＤＰＨ）をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
組成物が、チオレドキシンレダクターゼをさらに含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を有する患者における粘液または痰の液状化を増進させる方法であって、患者の気道にある粘液または痰を、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘを含み、Ｃ残基が還元状態にある蛋白質を含む組成物と接触させる工程を含み、組成物の接触によって、患者からの粘液または痰の試料における液相の容量が、組成物との接触の前と比較して増加する方法。
【請求項１】
過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を有する患者における粘液または痰の液状化を増進させる方法であって、患者の粘液または痰を、接触させる工程の前と比較して粘液または痰の液状化を増進させるのに効果的な還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチドを含む組成物と接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
患者が、粘液または痰の異常または過剰な粘性または粘着性が病気の症状または原因である肺疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者が嚢胞性線維症に罹っている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
患者の粘液または痰を組成物と接触させる工程が、鼻、気管内、気管支、肺内への直接設置、および吸入からなる群より選択された経路によって、該組成物を患者に導入して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
接触させる粘液または痰が、患者の気道、胃腸管、または生殖管の中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組成物を薬学的に許容される担体において患者に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
蛋白質またはペプチドが、患者の体重１ｋｇあたり約１．５ｍｍｏｌｅから患者の体重１ｋｇあたり約１５０ｍｍｏｌｅの量で患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
蛋白質が、患者において約５分から約２４時間の半減期を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
患者からの粘液または痰の試料の全量の液相が、組成物を投与した後に統計的に有意な増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃを含み、Ｃ残基が還元状態にあり、かつ、Ｘ残基が任意のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘを含み、Ｃ残基が還元状態にあり、かつ、Ｘ残基が任意のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）を含み、Ｃ残基が還元状態にあり、かつ、Ｘ残基が任意のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｗ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｋ（配列番号：３）を含み、Ｃ残基が還元状態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
蛋白質が、原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物のチオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンからなる群より選択されるチオレドキシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
蛋白質がヒトチオレドキシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
組成物が、蛋白質のチオレドキシン活性部位を還元するために、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（ＮＡＤＰＨ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
組成物が、チオレドキシンレダクターゼをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
粘液または痰の液状化に使用するための組成物であって、還元状態にあるチオレドキシン活性部位を含む蛋白質またはペプチド、および過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を治療するための補助剤を少なくとも一つ含む組成物。
【請求項１９】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘを含み、Ｃ残基が還元状態にあり、かつ、Ｘ残基が任意のアミノ酸残基である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｘ（配列番号：２）を含み、Ｃ残基が還元状態にあり、かつ、Ｘ残基が任意のアミノ酸残基である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
チオレドキシン活性部位が、アミノ酸配列Ｗ−Ｃ−Ｇ−Ｐ−Ｃ−Ｋ（配列番号：３）を含み、Ｃ残基が還元状態にある、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
蛋白質が、原核生物のチオレドキシン、酵母のチオレドキシン、植物のチオレドキシン、および哺乳動物のチオレドキシンからなる群より選択されるチオレドキシンを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
蛋白質がヒトチオレドキシンを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
組成物が、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（ＮＡＤＰＨ）をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
組成物が、チオレドキシンレダクターゼをさらに含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
過剰に粘性または粘着性の粘液または痰を有する患者における粘液または痰の液状化を増進させる方法であって、患者の気道にある粘液または痰を、アミノ酸配列Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ−Ｘを含み、Ｃ残基が還元状態にある蛋白質を含む組成物と接触させる工程を含み、組成物の接触によって、患者からの粘液または痰の試料における液相の容量が、組成物との接触の前と比較して増加する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００６−５１３１４７（Ｐ２００６−５１３１４７Ａ）
【公表日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３６５０９（Ｐ２００４−５３６５０９）
【出願日】平成１５年９月１０日（２００３．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２８５２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２４８６８
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【出願人】（５００３４３６１４）ナショナル ジューイッシュ メディカル アンド リサーチ センター (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月１０日（２００３．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２８５２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２４８６８
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【出願人】（５００３４３６１４）ナショナル ジューイッシュ メディカル アンド リサーチ センター (6)
【Ｆターム（参考）】
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